CA1179616A

CA1179616A - Preparation d'inoculums a faible activite de l'eau a resistance amelioree a la temperature et a la rehydratation

Info

Publication number: CA1179616A
Application number: CA000418643A
Authority: CA
Inventors: Gerard Jung; Jacques Mugnier
Original assignee: Rhone Poulenc SA
Current assignee: Rhone Poulenc SA
Priority date: 1981-12-29
Filing date: 1982-12-24
Publication date: 1984-12-18
Also published as: AU9193582A; US4755468A; ES8308925A1; EP0083267A1; AU560455B2; OA07289A; FR2519022B1; DE3263700D1; FR2519022A1; BR8207547A; EP0083267B1; ES518609A0

Abstract

La présente invention a trait à un procédé de préparation d'inoculums à faible activité de l'eau ayant une longue viabilité et une résistance améliorée à la température et à la réhydratation. Le procédé selon la présente invention se caractérisé en ce que après inclusion du micro-orga-nisme dans un gel de polymère l'on abaisse et on maintient l'activité de l'eau dans l'inoculum en-dessous de 0,1 et que la réhydratation est favorisée par la présence du gel et de la source hydrocarbonée présente dans le milieu. Ce procédé s'applique au préenrobage des graines et à l'inoculation du sol.

Description

~79~
La presen-te invention a pour objet un nouveau procede de preparation d'inoculums a faible activite de l'eau ainsi que les produits obtenus, lesquels presenten-t une longue viabilité et une résistance amelioree à la tem-perature et a la rehydra-tation.
Elle a -trait plus particulièrement a 1 ~ inclusion de micro-organismes du genre Rhizoblum dans une matrice constituee par un gel de polymère, a des ~ins ayronomiques.
Depuis de nombreuses annees, on a cherche à con-server les Rhizobium par deshydratation à l'aide d'adjuvantsdivers: sur des billes de porcelaine deshydratees ~HUNT, 1958 ~. Bacteriol. 76, ~53~454), dans des huiles liquides deshydratees (Brevet WS 3.034.968), dans de l'huile melangee avec du talc ou du kaolin (VS 3.168.796) sur du plâtre (GB
1 ~90 046), sur du gypse (FRASER, 1975 ~. Appl. Bacteriol.
39, 345), à l'aide de sulfate de sodium (NILSSON 1957 Rev.
Sci. Instrum. 11, 212).
Le procede de deshydratation selon les reférences ci-dessus est lent et hasardeux ce qui nuit à la survie du micro-organisme (Gault dans Newsletters, vol. 21 (1) Avril 1981, p. 34 et Vincent dans Rhizobium Newsletter, 25, 1981 et d'autres auteurs).
Les étapes conduisant ~ l'état déshydraté seraient la cause de la destruction du Rhizobium.
On a aussi proposé des procédés tels que la lyo-philisation (US n~ 3 168 796) ou l'atomisation (OCHIN 1980, these ~ille).
Mais dans ces deux derniers cas, différentes subs-tances protectrices ou supports sont utilisés: lactose, 30 . lait, chlorhydrate de cystéine, maltodextrine ou des subs- .
tances chimiquement inertes et finement divisees du type kaolin, charbon activé.
Mais même avec l'addition de ces substances pro-tectrices, le procedé de sechage, la conservation et la . . .:
- . , . : .
..
~l3Lt~
rehydratation sont tr~s dif~ici.les.
La réhydrata-tion est consideree comme un procede hasardeux.
Il est connu, en e~fet, que la reprise d'eau pro-gressive par un micro-organisme to-talemen-t déshydrate est lethale (Amarger, Arch. Mikrobiol 81, 361 - 366 (1972).
Lorsque par exemple une ampoule lyophilisée contenant des ~ micro-organismes est ouverte, en moins de huit jours a l'air ambiant tous les micro-organismes sont morts.
Il est donc possible de conserver une partie des micro-organismes par une déshydratation poussée mais lorsqu' il ~audra l'u-tiliser en plein champ, l'emploi d'une solution necessaire pour la rehydratation va poser de nombreux pro-blèmes.
Le but poursuivi depuis de nombreuses années est d'obtenir un micro-organisme inclus dans un polymère qui puisse se conserver indéfinimen-t sans conditions spéciales et qui se présente sous une forme solide au moment de son utilisation.
Ce problème étant difficile à résoudre, un préjuge consiste â considerer que pour assurer la survie des micro-~ organismes, il ~aut conserver dans les inoculums une certaine humidite.
De cette manière, le milieu de culture est apporte sur un support tel que la tourbe, ou dans un gel polymere tel quel o~ l'on essaie de reduire la perte en eau, ou tout au moins de maintenir une disponibilité de l'eau (ou une activite de l'eau) dans l'inoculum qui renferme, outre le micro-organisme, des eléments mineraux solubles, une source hydrocarbonee telle que mannitol et une source azotee telle que l'extrait de levure. ..
C'est ainsi que dans le brevet US n~ ~ 155 737, on a propose l'inclusion d'un micro-organisme dans un gel de polymère. Selon ce brevet, le gel polymere peut être cons-. 2 ~ , ,, : :, :~'7~
titue par un gel de polyacrylamide ou un gel de silice.
Or, l'on sait que pratiquement le polymère doit être biodégradable ou tout au moins non polluant.
C!est pourquoi, dans le ~revet:français n~ ~.453.~15 publis le 30 octobre 1980 au nom de la ~deresse, on a revenclique de choisir comme support une matrice à base d'au ~Dins un polymere du groupe des polysaccharides, ce procede se caracterisant par le fait que l'on fait subir audit gel contenant le micro-organisme un séchage qui laisse subsister au moins une partie de l'eau solvante. Ce séchage peut être améliore par addition d'une substance a forte absorption d'eau telle qu'une silice synthetique ou naturelle.
En genéral, afin de s'assurer d'une bonne survie des micro-organismes, l'on maintient une activite de l'eau à une valeur avantageusement supérieure ~ 0,85. Mais l'on sait que pour les humidites optimales requises dans les inoculums références dans ces brevets, par exemple pour la survie des Rhizobium, la germination des spores de champi-gnons et le developpement des moisissures et contaminants est a craindre pour des produits non steriles.
Plus genéralement pour la plupart des moisissures, l'activite de l'eau, limite au-delà de laquelle un deve-loppement microbien est possible est comprise entre 0,80 et 0,95 mais on trouve aussi certaines moisissures capables de se dievelopper ~ des activites de l'eau plus basses, celles-ci sont dites ~xerophiles~> ou ~osmotolerantes~ pour designer l'ensemble des micro-organismes capables de se developper dans un milieu a faible activite de l'eau taW = 0,6 - 0,7).
Il est donc necessaire pour assurer la stabilite microbiologique des inoculums, pour une teneur en eau opti-male, de preparer et de stocker les inoculums sterilement ou d'assurer leur conservation au froid; la stabilite des inoculums refrigeres resulte à la fois de l'abaissement de la temperature et du blocage d'une fraction d'eau disponible pour les contaminants; l'intégrite de l'inoculum est respec--tee, mais au prix cles lourdes con-traintes de la chaine de fro.id.
En ragle generale, ces inoculums demeurent fragiles vis-a-vis des contaminants et resistent mal au-dela d'une quarantaine de degres, ce qui est un inconvenient dans les pays chauds, ou de maniere generale, lors de la conservation du fait d'un risque certain de contamination.
Pour maltriser les differents processus de degra-dation: developpement de micro-organismes, reactions chi-miques, reactions enzymatiques, altera-tion de la texture, on peut agir plus ou moins selectivement sur chacun de ces phénomènes en jouant sur les parametres habituels de la physico-chimie, température, pH, potentiel redox, utilisation d'inhibiteurs specifiques.
Mais ces moyens se son-t averes limites. Ceci vient en particulier du fait que comme souligne precedemment, l'en-seignement de l'art anterieur repose sur le principe que l'eau disponible doit être suffisante pour assurer la survie ~.
du micro-organisme.
Des travaux importants de la demanderesse ont mis en evidence que partant des valeurs habituelles de l'activite de l'eau dans les inoculums, de l'ordre de 0,85 et plus, si l'on abaissait l'activite de l'eau, il y aurait bien, dans un premier temps, diminution du developpement des moisissures et des reactions enzymatiques, mais que l'on observait une plasmolyse importante des cellules, et des réactions de brunissement.
Le phenomene est similaire lorsque l'on passe d'une activité de l'eau très basse vers une activite de l'eau de l'ordre de 0,85 au plus.
En effet, le passage aux activites de l'eau inter-mediaires de l'ordre de 0,4 a 0,8 est lethal pour les hacte-ries que ce passage soit réalisé a la déshydratation ou à
.~ 4 -., ~ ; . ~ . : . .
la rehydratation.
Pour la deshydratation on est amene a vaincre ce phenomène par un passage extremement rapide de cette zone lethale a l'aide de la lyophilisation (brevet US n~ 3 168 796) ou à l'aide de l'atomisation.
Mais cet-te technique ne resout pas le probleme de la rehydrata-tion, dans les condi-tions d'application o~ la rehydratation es-t lente et progressive.
Le concept de l'invention consiste à extra:ire du produit la frac-tion d'eau la plus disponible, à éliminer toute l'eau solvante, telle que deEinie par (LEUNG.H.K 19~1 Structure and properties of water - Cereal food World 26 7-350-352) et a utiliser les caracteristiques du melange gel et substances solubles pour éviter de manière tout à Eait inattendue pour l'homme du metier l'apparition de ces phéno-mènes nefastes lors de la rehydratation.
La valeur de l'activite de l'eau au delà de laquelle on n'a plus de développement de moisissures, de réactions enzymatiques et de reactions de brunissement dépend egalement des conditions du milieu, de la nature du micro-organisme et du gel.
On peut admettre que d'une maniere generale, pour les valeurs minimales de l'aw, on conserve un nombre maximum de cellules viables.
Les differentes valeurs de l'activite de l'eau sont obtenues et determinees par la methode di-te des solutions aqueuses saturees (Multon 1981 Techniques d'analyses et de controle dans les industries agro-alimentaires - APRIA -).
Le procede selon l'invention se caracterise par le fait qu'on inclut le micro-organisme dans son milieu de cul-ture dans un gel de polymère et que l'on abaisse l'activite de l'eau dans l'inoculum en dessous de 0,1 et qu'on la main-tient à cette valeur.
Les difEerentes valeurs optimales de l'activite de .
, ... . ... . .. . . . .
~' ' , , ' .. ' . ''. ~ '' . ' " I' l'eau pour la protection du micro-organisme lors de son stockage et lors de sa rehydratation dependent notamment de la temperature, de la nature du micro-organisme, de la nature et de la concentration des composes presents, et du type de polymere utilisé.
La connaissance de la vitesse de destruction des micro-orqanismes à la température est un paramètre nécessaire pour la mise au point de procedes de preparation tres sûrs pour un inoculum. Les travau~ de :La demanderesse ont montré
que la résistance des micro-organismes dans les inoculums aux températures élevées (60~C) etait maximale pour les valeurs de l'activité de l'eau les plu~ faibles et que la perte de la survie intervenait rapidement ~ ces mêmes tempé-ratures quand ces valeurs allaient verx 0,5.
Les travaux de la demanderesse ont egalement montré
que lors de la réhydratation, la vitesse de destruction des micro-organismes aux activités de l'eau intermédiaires de l'ordre de 0,4-0,8 est fonction de la source hydrocarbonee du milieu de culture et du gel.
On peut avancer l'hypothese selon laquelle la sur-vie des micro-organismes est sous la dependance de la dispo-nibilite de l'eau qui jouerait le rôle de réacti~ en mettant en solution les composés solubles ou partiellement solubles présents dans le milieu.
La mobilite de ces composes, par suite de phénomène d'osmose, entra~nerait la destruction des micro-organismes.
Les travaux de la demanderesse ont, en plus, montre ~ue l'evolution des isothermes de sorption des inocu-lums, et par la l'activite de l'eau, était modifiée par le mode d'obtention de l'i~otherme (phénomane d'hysteresis), par la temperature, par la nature du gel, par la nature et la concentration des sources hydrocarbonees et des su~stances solubles du milieu d~ culture, par la modification du milieu de culture par le micro-organisme, par les phénomanes de A' - 6 -~ . ~ . . . . .
:
~ ~t7~
cristallisation des composes cristallisables presen-ts.
Ces travaux ont montre, en outre, les caracteris-tiques specifiques d'hygroscopicite de differents polymeres utilises selon leur nature ou leur mode d'obtention.
Le polymere utilise es-t avantageusement du groupe des pol~saccharides auquel on ~ait subir un traitement de reticulation au moins partiel.
Par traitement de reticulation au moins partiel, on entend un traitement susceptible de modi~ier la structure du polysaccharide, tel que traitemen-t thermique, traitement par un sel metallique ou alcalino-terreux ou au moyen d'un autre polymere et de preference par un autre polysaccharide.
Le sel metallique est tel que de fer ou d'alumi-nium.
I.e sel alcalino-terreux est tel que de calcium.
Avantageusement le polymère est à base d'un hetero-polysaccharide a haut poids moleculaire obtenu par ~ermenta-tion d'un hydrate de carbone par un micro-organisme du genre Xanthomonas ou Arthrobacter ou par des champignons apparte-nant au genre Sclerotium.
On peut egalement faire appel a des polysaccharides issus de gommes naturelles ou biosynthetiques, de provenance diverses: algues (alginates, carraghenanes, agar), exsudats de plantes (gommes karaya, adragante, arabique) et de graines ~guar, caroube).
- Comrne dejà dit, avantageusement on fait appel a des polymères à base de polysaccharides qui vont influer sur le devenir du micro-organisme dans le sol suite a l'inocuIa-tion:
- la taille des particules de polymère permet la meilleure dissémination des Rhizobium;
- la poudre de polysaccharide se rehumidifie rapidement;
- le polysaccharide se lie au~ particules de sols , .
,;
~1'7!~
et au-tres substrats et aux rac:ines;
- le polysaccharide es-t rapidement dégrade dans le sol, les Rhizobium sont liberes de leur matrice de polymère et infec-tent les racines de ],a legumineuse.
Selon l'invention, le milieu de culture renEerme au moins une source hydrocarbonee. Celle-ci est telle que du groupe des sucres, des polyols et des polysaccharides.
On peut citer par exemple comme sourGe hydrocarbonee le mannitol, le ylucose, la dextrine, l'amidon.
La source hydrocarbonée doit comporter de prefe-rence des sucres superieurs à C6 et tout particulièrement le mannitol, le sorbitol ou Le fructose.
Le milieu de culture renferme egalemen-t avantageu-sement au moins un sel mineral Le milieu de culture renferme egalement une source azotee minerale organique telle que l'extrait de levure par exemple de composition suivante:
Amino 5,5 ~ NaCl, o,5 Ca 0,08 Fe 0,20 K 3,4 Mg 0,07 : p 1,16 Hydrates de carbone 16,6 Arginine 3,5 Cystine ' 1,6 Histidine 1,5 Isoleucine 4,7 Leucine 6,4 Lysine 6,5 Methionine 2,0 Phenylalanine 3,5 Threonine 3,3 Tryptophane 1,0 Tyrosine 4,0 Valine ~,~
Vitamines 2,7 cg/g.
Il est a noter que la source azotee ne contient pas de molecules de haut poids moléculaire. Sa concentration dans le milieu avant toute culture est de l'ordre de 0,1 %
mais l'extrait es-t partiellement consommé au cours de la culture.
L'ensemhle gel, sel minéral, source hydrocarbonee i~
et source azotee constitue entre 2 et 10 ~ en poids de la suspension à secher.
Le polym~re represente entre 1 et 2 ~ de la sus-pension a secher. La source hydrocarbonée représente entre 0,5 % et 1 ~ et l'extrait de levure entre 0,05 ~ et 0,1 %
du milieu de culture.
On peut ajouter a la solution avant sechage des additifs tels que ceux précedemment cites ou tout autre produit inerte tout en restant dans les limites precédemment donnees (2 à 10 % de la suspension a secher).
Le micro-organisme utilise dans la presente in-vention est notamment du genre Rhizobium.
Parmi les micro-organismes du genre Rhizobium utilises pour la presente invention, on peut citer: Rhizo-bium Japonicum, Rhizobium mel _oti, Rhizobium phaseoll, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium_trifolii.
Les Rhizobium sont parmi les micro-organismes les plus sensibles a la temperature et a la deshydratation. Il est connu que les bacteries gram negati~ sont particulière-ment sensibles a la dessication (Soil Biol. Biochem. Vol. 14 p. 13-14 1982), et les Rhizobium conEirment cette affirma-tion.
Parmi les espèces de Rhizobium, le Rhizobium Japonicum USDA 138 a ete decrit par F. Munevar (Applied and ~ 9 ~
~'\
7~
Environmental Microbiology, ~uy. 1981 p. 272-276) comme ayant une temperature maximale de survie de 39,1~ Celsius.
Ce micro-organisme contrairement à de nombreux autres qui sont thermorésistants comme par exemple les sacillus ne peut à la lecture de l'art antérieur e-tre séché
à haute température sans risque.
Le milieu de culture privilegie utilisé pour la croissance du Rhizobium Japonicum est le milieu YEM, milieu classique bien connu de l'homme de l'art.
La concentration bactérienne peut etre augmentée par centrifugation prealable du milieu de cu]ture et remise en suspension du culot bacterien.
Le milieu de culture ou la suspension bacterienne est ensuite apporte à un gel de polysaccharide dans lequel le micro-organisme est inclus, puis le gel est séche.
On peut aussi, selon une autre forme de mise en oeuvre, dissoudre le polysaccharide dans le milieu de cul-ture.
Le sechage peut se faire de diverses manières, en une ou plusieurs etapes.
Selon l'invention, un simple contact a l'air dans les conditions habituelles de temperature e-t d'humidite relative n'est pas suffisant.
L'on doit faire appel à des techniques qui per mettent d'obtenir une dessication plus poussee telles que:
- flux d'air chaud et sec, évidemment dans les conditions compatibles avec la survie du micro-organisme.-- solution saturée, en un compose presentan-t l'activite de l'eau requise, evoluant vers l'equilibre avec l'inoculum.
Par ailleurs, on peut apporter l'inoculum sur un support tel que a base de silice.
Dans le cas où l'on fait appel à une méthode im-pliquant un absorbant tel que la silice, cet absorbant peut :~ -- 1 0 7~ 6 en plus remplir une fonc-tion de support et charye inerte, facilitant la mise en oeuvre et la manipulation de l'inoculum.
On peut en par-ticulier faire appel à une technique de sechage par atomisa-tion, qui, de maniere inattendue con-duit à des inoculums dans lesquels la survie du micro-organisme est preservee alors même que les temp~ratures des gaz de traitement sont largement superieures à celles que le micro-organisme peut subir.
Dans le cas de l'atomisation, le gel a s~cher doit poss~der des propri~tes de ~coulabilite>~.
Dans ce cas éventuellement, la reticulation du polymère peut être provoquée par le traitement thermique lors du sechage.
Bien ~videmment, on peut combiner plusieurs de ces techniques.
Du point de vue ~conomique, il est preEerable d'adopter un système de s~chage bi-etage comme celui utilise pour la deshydratation du lait. Ce système se compose d'un s~chage par atomisation qui lorsqu'il est effectu~ avec une temp~rature de sortie d'environ 95~C conduit à une activite de l'eau de l'ordre de 0,2 à 0,4 puis un s~chage par lit fluidise jusqu'à une activite de l'eau inferieure à 0,1.
L'utilisation d'un système bi-etag~ permet d'aug-menter le debit de la substance à secher, par consequent l'ecart de temperature entre la sortie et l'entree. La solution entrant dans l'atomiseur peut contrairement à un prejuge etabli être soumise a une temperature de 250~C et plus sans aucune perte de survie des micro-organismes. La temperature de sortie est maintenue au-dessus du point de rosee ce qui evite une rehydratation des produits~ Cette temperature est notamment de l'ordre de 75~C à 95~C.
Le lit fluidis~ utilis~ pour terminer le sechage et atteindre une activit~ de l'eau inf~rieure à 0,1 consomme

2 à 4 fois moins d'energie pour l'elimination de la derniere . . ' :: - , . .
, . . .: ~ ,.: . . .
:

3~
fraction d'eau que l'atomisation. Globalement l'économie d'energie realisee par rapport a un atomiseur simple est de l'ordre de 20 ~.
Les polymeres séches peuvent se presenter sous diverses formes: gels~ billes, fibres.
Avantageusement, on cherche à presenter les inocu-lums obtenus sous forme de poudre ou microgranulés pour faciliter leur mise en oeuvre.
La limitation des transferts d'eau entre l'inoculum polymère à faible activite de l'eau et l'atmosphère environ-nante doit être réalisée par le choix d'un mode d'emballage adapté.
La c~ractéristique principale de l'emballage se-lectionné est son imperméabilité à la vapeur d'eau. Cela suppose que l'emballage ait ete parfaitement realise, c'est-à-dire qu'il ne presente ni microporosite, ni microcanaux de fuite aux soudures. Dans l'emballage, il s'etablit un equilibre de pression d'eau entre l'atmosphere interne et l'inoculum; une fois l'equilibre atteint, la capacite d'ab sorption d'eau de l'inoculum devient negligeable (rapport kg d'air / kg de produit très faible~. Pour le type de protection que l'on veut assurer, les films de polypropylène correspondent à un materiau d'emballage approprie tel que Pryphane commercialise par R.P.Films. Les films de poly-propylène assurent une bonne stabilite thermique (non con-ductivite~ non reflectivite), une ~aible transmission de la lumière, une bonne permeabilite aux gaz.
Il est possible d'associer un deshydratant dans le sachet d'emballage.
Au moyen de la presente invention, il a ete possi-ble de conserver des Rhizobium pendant une periode d'au moins deux annees sans aucune perte decelable.
Un avantage de l'invention est de pouvoir inserer dans l'inoculum des produits du type antifongiques sans * (marque de commerce) - : , .; .
aucun~ alteration de la cellule bacterienne. Les produits pouvant ~tre utilises ~ l'interieur de l'inoculum sont notamment du genre thirame, ethyl phosphite d'aluminium. A
des activités de l'eau inferieures a 0,1 il n'y a aucune perte due à la presence de l'antifongique.
TABLEAU I
Log du nombre de Rhizobium /g apr~s 30 ~ours de stockage (25~C) TRAITEMENTS
Activite de l'eau . _ 0,06 0,22 0,39 0,43 0,52 0,75 .. .___ ., __ _ Inoculum A
sans thirame 7,8~7,747,437,39 0 0 Inoculum A
avec thirame dans les propor-tions (1/2) 8,838,628,047,975,65 0 Inoculum A
ethyl phosphite d'aluminium (1/1) 8,81 0 0 0 0 0 2~
thirame: Disulfure de bis (bimethyl-thiocarbamyl) m.a. 90 % - solubilite: 30 ppm.
Log du nombre de Rhizobium /g d'inoculum avant stockage: 9,04 PREPARATIONS DES INOCULUMS
I~) Preparation d'un inoculum gel Xanthane-caroube On obtient les inoculums suivants:
- un inoculum A, Xanthane-caroube-mannitol si le mannitol a ete utilise comme source hydro-,. - 13 -; - , . - - . . . . . .
, ,~ , . . , , ,i , , . , ~ .- . : , ,:
, , . - . . . ~ ~: , , , 9~
carbonee du milieu de culture;
- ou un inoculum B~ Xanthane-caroube-glycérol si le glycerol a été utilisé comme source carbonee du milieu de culture;
- ou un inoculum C Xanthane-caroube-DE-~0 si le sirop de glucose DE-40 a eté utilisé comme source carbonee du milieu de culture;
- ou un inoculum D, Xanthane-caroube DE-33 si le sirop de glucose DE-33 a eté utilisé comme source hydrocarbonée du milieu de culture;
- ou un inoculum E, Xanthane-caroube dextrine, si la dextrine a éte utilisée comme source hydrocarbonee du milieu de culture;
- ou un inoculum F, Xanthane-caroube-amidon, si de l'amidon soluble a eté utilise comme source carbonée du milieu de culture.
Mode de preparation de l'inoculum A g/l - milieu de culture - milieu YEM.
- mannitol 10,0 - extrait de levure DIFCO l,0 - K2HPO4 0,5 - Mg SO4, 7~2~ 0,2 ~eCl3 0,004 - NaCl 0,2 - le pH est ajusté a 6,8 avec HClN
- stérilisation 120~C
- selon une variante on remplace le mannitol par une autre source carbonée linoculum B~ C, D, E ou F).
- la souche utilisee de Rhizobium japonicum est la souche G3 USDA 138 Beltswille dans laquelle le nombre de Rhizobium par ml de culture après incubation (6 jours) est de l'ordre de 2-13 109 avec le mannitol ou les di~ferentes sources carbonées utilisées.
On prépare deux solutions (les valeurs sont données * (marque de commerce3 :, , ~ , , -9~
pour la preparation de 300 g cl'inoculum).
a) Solution de polysaccharide de type anionique resultant de la fermentation d'hydrates de carbone par un micro-organisme du genre Xanthomonas de PM > 2.106, que l'on designera par produit 1.
On amène 100 ml d'eau distillee a 70-~0~C, on ajoute 1,5 g du produit 1, on maintient cette temperature 20 a 30 minutes, sous agitation pui.s on le ram~ne entre 40 et 50~C.
b) Solution de farine de graine de caroube =
polysaccharide constitue d'unites ~-D-manno pyranosyl (liaisons 1,4) une sur quatre ou cinq ëtant substituée en C6 par un ~-D-galacto-pyranosyl PM = 3,1 10 que l'on dési-gnera par la suit.e par produit 2.
On procède de la même facon en remplacant le pro-duit 1 par 1,5 g de farine de graine de caroube (produit 2).
Lorsque les deux solutions sont a 40-45~C, on ajoute, sous agitation, à chacune d'elle~ 50 ml de la cul-ture bacterienne. On verse alors, en agitant vigoureusement le melange culture + polysaccharide dans le melange culture +
farine de graine de caroube. L'obtention d'un gel consistant est instantanee si les deux solutions sont melangees vigou-reusement.
2~) Preparation d'un inoculum polymère alginate CaC12 On obtient un inoculum G (alginate-CaC12) si on utilise le mannitol comme source du milieu YEM.
.
Trois etapes sont necessaires.
a) Preparation de la suspension de Rhizobium dans l'alginate.
On dissout dans 100 ml de culture bacterienne 2 g d'alginate de sodium faible viscosite (130-240 cpsl.
b) Gelification. On fait tomber la suspension de Rhizobium dans l'alginate dans une solution de CaC12.2H2O

.
- - , , . - , . . - ., . .
~170 g/l). La gélificatiorl se ~ait en bilJ.es si l'on fait tomber gou-tte à goutte la suspension dans la solution de CaC12.H2O en agitant cette solu-tion. La gelification se fai-t en fibres si l'on verse 20 ml de la solu-tion de CaC12, sous agitation, dans la solu-tion dlalginate.
c) Lavage. Aussitô-t après la geliEication, on lave l'inoculum polymère en billes ( ou en fibres), dans l'eau courante.
3~) Preparation d'un inoculum_polymère alqina-te CaSO4 ~gel) On obtient un inoculum H alginate CaSO4 si on utilise le mannitol comme source carbonee du milieu YEM.
Deux etapes sont necessaires:
a) Prepara-tion de la suspension de Rhizobium dans un alginate de viscosite comprise entre 750 et 1000 cps. On dissout dans 80 ml de culture bacterienne 1 g d'alginate.
Pour cela, on disperse la poudre en pluie fine sur la cul- -ture en l'agitant continuellement jusqu'à solubilisation complète de l'alginate.
b) Gelification On ajoute à la suspension de Rhizobium dans l'alginate 20 ml d'une solution de CaSO4.2H2O à 6 g/l. I,a prise en masse du gel est instan-tanee.
Dans les exemples suivants, on a regle l'activite de l'eau au moyen de solutions saturees dont les valeurs des activites de l'eau aw à une temperature de 25~C sont exposees dans le tableau II.

.
7~
TABLEAU II
. . _ ._ . . . _ _ _ _ SOLUTES Valeur de aw tSolutions saturées) 25~C
..
NaOH 0,0695 Actigel 0,11 KC2H3O2(l~5 H2O) 0,226 MgC12 o,392673 0,332 2 3 2 0,438 0,4276 Mg (NO3)2 0,5288 Na2Cr2O7 0,535 NaBr 0,5770 C~ICl2 0,886 NaNO3 0~7373 NaCl 0,7532 KCl 0,8432 KNO3 0,920 _~ ~ _ . . 0,927 ~, On a illustre dans les di.vers tableaux et courbes ci-joints l'influence dlun certain nombre de parama-tres.
Exemple 1 Il represente la valeur de l'activite de l'eau en relation avec le taux d'humidi-té pour differen-ts types : d'inoculums en ionction du gel et de la source hydrocarbonee (figure 1~.
.

.
.
.
' ' . ~ ,~
~7~
. _ ~ __ N~ Courbe Source ._ _ _ .et type hydro- Gel Type de séchaye d ' inoculum carbonee _ 1 (B) Glycerol Gomme Xanthane a l'air Caroube 2 ~G) Mannitol Alginate a l'air 3 IA) Manni-tol Xanthane Caroube à l'air 4Mannitol sansLyophilisa-tion 5Mannitol sansDeshydra-tation sous vide 6Mannitol sans sur tourbe - . _ _ .
Les petites flèches mon-trent le phenomène de cristallisation du mannitol.
Exemple 2 Il mo~tre l'effet de la temperature (55~C) sur la survie des Rhizobium au cours du stockage dans l'inoculum A
(figure 2 A) contenant comme source hydrocarbonee le mannitol et dans l'innoculum B (figure 2 B) contenant comme source hydrocarbonee le glycerol en fonction de l'activi-te de l'eau (trace 1, aw = 0,09; trace 2, a~ = 0,11; trace 3, aw = 0,22; tracé 4~ aw = 0,32; tracé 5~ aw = 0r43; -trace 6, : aw = 0,52)-Ces deux figures montrent que la conservation des ~
- micro-organismes est bien meilleure avec un sucre en C6 --qu'avec un sucre en C3.
Exemple 3 Il represente les courbes de su~vie du Rhizobium ~-dans l'inoculum A (xanthane caroube et mannitol) en fonction de l'aw après differents temps de stockage a 25~C (trace 1 =
10 j; trace 2 = 20 j; trace 3 = 30 j; trace 4 = 80 j;
~ .:
- ,:
.
-., , ~ , , : , , ": . ~ : . . . .
",, , , : ~
1~7~ 16 trace 5 = 110 j; trace 6 = 180 j). (Flgure 3) Exemple 4 Il represente la survie ~u Rhizobium au cours du stockage à 28~C dans l'inoculum A (xanthane carou~e et mannitol) et dans l'inoculum H (alginate et mannitol) en fonction du temps et de différents aw, courbe I aw = 0,06, courbe II aw = 0,42 ~figure 4).
Elle permet de voir qu'il n'existe aucune diffe-rence significative dans la survie du Rhizobium en-tre les différents polysaccharides.
Exemple 5 Il illustre les courbes de survie du Rhizobium en fonction de la source hydrocarbonee presente dans le milieu de culture.
trace A = mannitol trace B = glycerol trace C = glucose DE 40 trace D = glucose DE 33 -trace E = dextrine trace F = amidon pendant un stockage de 10 jours à 28~C aux differents aw.
(Figure 5) Exemple 6 Il represente les courbes de survie de trois souches de Rhizobium inclus dans le polymère A apres 10 jours de stockage (28~C) (trace 1 Rhizobium ~aponicum USDA
138 Beltswille; trace 2 Rhizobium melilo-ti 2011, INRA
. .
DIJON; trace 3, Rhizobium phas_oli souche Olivia Universite Minnesota, USA). (Figure 6) Exemple ?
Il represente les courbes de survie du Rhizobium japonicum dans l'inoculum A pour les graines de soja (ex. Kingsoy) preenrobees en fonction de l'a et à deux w temperatures (trace 1, 28~C; trace 2, 4~C) après 60 jours . .
.. . . . . .
, - ~ , .:
de stockaye. (Figure 7 Exemple 8 On a séché les inoculums A et H dans un atomiseur tel que decrit dans l'ouvrage de Masters Spray Drying -second edition John Wiley & Sons 1976-, en mettant en oeuvre un atomisateur à turbine.
En u~ilisan-t une temperature de sortie de 75~C et en faisant varier la temperature d'entree entre 150 et 250~C, on a pu constater que le log n Rhizobium vivant par gramme de poudre atomisee demeurait stable et egal a la valeur de depart c'est a-dire 101~ _izobium par gra~me. Il n'y a donc pas destruction du _h zobium et l'on peut obtenir une presentation en poudre.

Claims

Les réalisations de l'invention, au sujet des-quelles un droit exclusif de propriété ou de privilège est revendiqué, sont définies comme il suit:

1. Procédé de préparation d'inoculum à longue viabilité et à résistance à la température améliorée, carac-térisé en ce que l'on inclut le(s) micro-organisme(s) dans son milieu de culture dans un gel de polymère et que l'on abaisse l'activité de l'eau dans l'inoculum en-dessous de 0,1 et qu'on la maintient à cette valeur.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que le polymère est du groupe des polysaccharides auquel on fait subir une réticulation au moins partielle.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé
en ce que le polysaccharide est réticulé par l'un des modes de traitement suivants: thermique, à l'aide d'un sel métallique ou au moyen d'un autre polymère.

4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac-térisé en ce que le polymère est un hétéropolymère à base de gomme xanthane et de farine de caroube.

5. Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac-térisé en ce que le polymère est un polymère à base d'algi-nate.

6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que le milieu de culture contient une source hydro-carbonée choisie parmi les sucres, les polyols et les poly-saccharides.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé
en ce que la source hydrocarbonée est choisie parmi les sucres, les polyols d'au moins 6 carbones.

8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé
en ce que la source hydrocarbonée est du groupe mannitol, sorbitol, fructose, dextrine et amidon.

9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que le milieu de culture renferme une source azotée minérale ou organique constituée par l'extrait de levure.

10. Procédé selon la revendication 1 ou 9, carac-térisé en ce que le milieu de culture renferme au moins un sel minéral.

11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que le micro-organisme est du genre Rhizobium.

12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé
en ce que le micro-organisme est le Rhizobium Japonicum.

13. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que l'activité de l'eau est abaissée par atomisation.

14. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que l'activité de l'eau est abaissée par atomisation et passage sur un lit fluidisé.

15. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que l'on insère dans l'inoculum un antifongique.

16. Inoculum à longue viabilité et à résistance à la température améliorée comprenant un (ou des) micro-organisme(s) dans son milieu de culture dans un gel de polymère, l'activité de l'eau dans l'inoculum étant maintenue en-dessous de 0,1.

17. Inoculum selon la revendication 16, caracté-risé en ce que le polymère est du groupe des polysaccharides au moins partiellement réticulé, que la source hydrocarbonée est du groupe du mannitol, sorbitol, fructose, glucose, dextrine, amidon et que le micro-organisme est un Rhizobium.

18. Méthode de préenrobage des graines caracté-risée en ce que l'on utilise l'inoculum défini selon la revendication 16 ou 17.

19. Méthode d'inoculation du sol caractérisée en ce que l'on utilise l'inoculum défini selon la revendication 16 ou 17.