CA1265756A - Supports, la preparation de ces supports les intermediaires obtenus, leur application a la synthesed'oligonucleotides et les nucleosides et oligonucleotides relies aux supports ainsi obtenus - Google Patents
Supports, la preparation de ces supports les intermediaires obtenus, leur application a la synthesed'oligonucleotides et les nucleosides et oligonucleotides relies aux supports ainsi obtenusInfo
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- CA1265756A CA1265756A CA000511344A CA511344A CA1265756A CA 1265756 A CA1265756 A CA 1265756A CA 000511344 A CA000511344 A CA 000511344A CA 511344 A CA511344 A CA 511344A CA 1265756 A CA1265756 A CA 1265756A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
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Abstract
La présente invention concerne de nouveaux supports de formule (1): <IMG> (I) dans laquelle ? est un matériau constitué de microbilles de verre, de silice, de kieselguhr, de polytétrafluoroéthylène, d'oxydes métalliques ou de cellulose, - m est un entier de 1 à 20, - A est une chaîne alkyle, linéaire ou ramifiée, (1 à 20 carbones), un radical cyclique saturé (3 à 12 carbones), un phényle ou un radical hétérocyclique à 5 ou 6 chaînons, - x est un entier de 0 à 20, - x1 est un entier de 0 à 10, les fonctions-amines sur les noyaux phényle sont en para, méta ou ortho. L'invention concerne également la préparation de ces supports,les intermédiaires obtenus, leur application à la synthèse d'oligonucléotides et de nouveaux nucléosides et oligonucléotides reliés auxdits supports de formule (I).
Description
L'invention concerne de nouveaux supports, la préparation de ces supports, les intermédiaires nouveaux ainsi obtenus, leur application à la synthèse d'oligonucléotides et les nouveaux nucléosides et oligonucléotides reliés aux supports ainsi obtenus.
De nombreux supports ont déjà été décrits dans la litterature pour la synthese en ~hase solide d'oligonucleotides.
Ces supports sont par exemple uniquement constitués de polymères, tels aue le polystyrène (Nucleic. rC~ ~es. 1980, volume 8)~ le polyacrylamide acryloylmorpholide, le 10 polydimethylacrylam;de polymérisé sur kieselguhr /Nucleic Ac. Res. 9 ~7) 1691 (1981)/ de formule kieselguhr polyacrylamide CH2 ICl NH CH2-CH2-NH-~-CH2-NH-c-cH2-~H2-Ces supports se sont révelés insuffisants, car ils ont 15 tendance à gonfler excessivement et à retenir certains réactifs.
D'autres supports déja decrits sont de nature inorganique.On peut citer~ par exemple, le support :
-si-(cH2)3-o-cH2-lclH-cH2-oll-NH~cH2)6NH2 OCOC~3
De nombreux supports ont déjà été décrits dans la litterature pour la synthese en ~hase solide d'oligonucleotides.
Ces supports sont par exemple uniquement constitués de polymères, tels aue le polystyrène (Nucleic. rC~ ~es. 1980, volume 8)~ le polyacrylamide acryloylmorpholide, le 10 polydimethylacrylam;de polymérisé sur kieselguhr /Nucleic Ac. Res. 9 ~7) 1691 (1981)/ de formule kieselguhr polyacrylamide CH2 ICl NH CH2-CH2-NH-~-CH2-NH-c-cH2-~H2-Ces supports se sont révelés insuffisants, car ils ont 15 tendance à gonfler excessivement et à retenir certains réactifs.
D'autres supports déja decrits sont de nature inorganique.On peut citer~ par exemple, le support :
-si-(cH2)3-o-cH2-lclH-cH2-oll-NH~cH2)6NH2 OCOC~3
2 i2~5756 /J.Am.Chem.Soc.,1Q5, 661 ~1983) / ou le sup~ort a base de silice fonctionnalisée par un groupement 3-aminopropyltriethoxysilane, dont l'utiLisation en synthèse phosphite et phosphoramidite r,our l3 préparation d'oligo-nucléotides a été décrite r,our la première fois 5 dans le brevet européen N~ 0035719.
Cependant, ce support utilisé en synthèse phosphotriester donne de mauvais rendements, notamment lors des premiers couplages.
L'invention a pour objet des supports de formule (I) :
10 ~ ) O 5~ _(C~ C ~ C0 _(A)-(I) dans laquelle ~ est un matériau constitué de microbilles de verre, de silice, de kieselguhr, de polytétrafluoroéthylène, d'oxydes métalliques ou de cellulose, - m est un nombre entier pouvan~ varier de 1 à 2~, 20 - A représente soit une chaîne alkyle linéaire ou ramifièe renfermant de 1 ~ 20 atomes de carbone, soit un radical cyclique saturé
renfermant de 3 à 12 atomes de carbone, soit un radical phenyle, soit un radical hétérocyclique renfermant 5 ou 6 chaînons, - x est un nombre entier pouvant varier de 0 à 20, 25 - x1 est un nombre entier pouvant varier de 0 à 1n, les fonctions amines sur les noyaux phényle pouvant être en para, mé~a ou en ortho.
Dans la formule (I), lorsque A est une chaîne alkyle linéaire, A est représenté par le groupement -(CH~)-n, n étant un 30 nombre entier pouvant varier de 1 à 20.
Lorsque A est une chaîne alkyle ramifiée, il s'agit de preférence d'une chaîne substituée par un ou ~lusieurs radicaux méthyle ou éthyle. Il s'agit, par exemple, de la chaîne mèthyl-1 mèthane diyl ; méthyl-1 éthane diyl-1,2 ; méthyl-1 35 ou -2 propane diyl-1,3 ; méthyl-1,2 propane diyl-1,3 ; éthy~ 1 éthane diyl-1,2.
Lorsque A représente un radical cyclique saturé, il s'agit de préférence du radical cyclopropane, cyclobutane, cyclopentane cyclohexane, cycloheptane, cyclooctane, cyclononane, cyclodecane, 40 cycloundécane, cyclododécane.
Cependant, ce support utilisé en synthèse phosphotriester donne de mauvais rendements, notamment lors des premiers couplages.
L'invention a pour objet des supports de formule (I) :
10 ~ ) O 5~ _(C~ C ~ C0 _(A)-(I) dans laquelle ~ est un matériau constitué de microbilles de verre, de silice, de kieselguhr, de polytétrafluoroéthylène, d'oxydes métalliques ou de cellulose, - m est un nombre entier pouvan~ varier de 1 à 2~, 20 - A représente soit une chaîne alkyle linéaire ou ramifièe renfermant de 1 ~ 20 atomes de carbone, soit un radical cyclique saturé
renfermant de 3 à 12 atomes de carbone, soit un radical phenyle, soit un radical hétérocyclique renfermant 5 ou 6 chaînons, - x est un nombre entier pouvant varier de 0 à 20, 25 - x1 est un nombre entier pouvant varier de 0 à 1n, les fonctions amines sur les noyaux phényle pouvant être en para, mé~a ou en ortho.
Dans la formule (I), lorsque A est une chaîne alkyle linéaire, A est représenté par le groupement -(CH~)-n, n étant un 30 nombre entier pouvant varier de 1 à 20.
Lorsque A est une chaîne alkyle ramifiée, il s'agit de preférence d'une chaîne substituée par un ou ~lusieurs radicaux méthyle ou éthyle. Il s'agit, par exemple, de la chaîne mèthyl-1 mèthane diyl ; méthyl-1 éthane diyl-1,2 ; méthyl-1 35 ou -2 propane diyl-1,3 ; méthyl-1,2 propane diyl-1,3 ; éthy~ 1 éthane diyl-1,2.
Lorsque A représente un radical cyclique saturé, il s'agit de préférence du radical cyclopropane, cyclobutane, cyclopentane cyclohexane, cycloheptane, cyclooctane, cyclononane, cyclodecane, 40 cycloundécane, cyclododécane.
3 ~.265756 Lorsque A représente un radical cyclique saturé, il s'agit de preférence du radical cycloprG~ane, cyclobutane, cyclopentane cyclohexane, cycloheptane, cyclooctane, cyclononane, cyclodécane, cyclo undécane, cyclododécane.
Lorsque A represente un radical h~terocyclique renfermant 5 ou 6 cha;nons, il s'agit de preférence du radical thiazolyle, pyridinyle, 4,5-dihydrothiazolyle, oxazolyle, isoxazolyle, imidazolyle, pyrimidyle, thiényle.
L'invention concerne notamment les supnorts de formule (I) 10 pour lesquels ~ est un materiau constitue de silice ayant une granulomètrie homogène et pour lesquels les fonctions aminées sur les noyaux phényl sont soit en méta, soit en para.
On peut utiliser une silice commerciale, par exemole la silice VYDAC A ~ ayant des grains dont le dianètre est de 20 15 et des pores de 300 A.
Toute autre silice comparable à la silice \!Y~AC A ~ peut etre utilisée.
On peut employer également une silice pour chromotagraphie , une silice HPLC, par exemple la silice commercialisee sous le 20 nom de porosil B ~, dont le diamètre des grains est compris entre 37et 75 L'invention concerne notamment des nouveaux supports de formule (I), pour lesquels m est un nombre entier pouvant varier de 1 à 5 et pour lesquels A est un radical -C~2 et plus particulièrement de nouveaux supports de formule (I) pour lesquels x 25 est un nombre entier pouvant varier de û à 10 et x1 un nombre entier pouvant varier de O à 5 et pour lesc!uels m = 3.
L'invention a tout particulierement pour objet des supports dont les formules suivent :
O
~ o,, (CH ~)3 _ ~ H - C
3 ~ (CH ~j3 - ~ ~ - C~
\ C- /~ 3 ~ ~ C - ~ ~ N H ~ C ~ H
Lorsque A represente un radical h~terocyclique renfermant 5 ou 6 cha;nons, il s'agit de preférence du radical thiazolyle, pyridinyle, 4,5-dihydrothiazolyle, oxazolyle, isoxazolyle, imidazolyle, pyrimidyle, thiényle.
L'invention concerne notamment les supnorts de formule (I) 10 pour lesquels ~ est un materiau constitue de silice ayant une granulomètrie homogène et pour lesquels les fonctions aminées sur les noyaux phényl sont soit en méta, soit en para.
On peut utiliser une silice commerciale, par exemole la silice VYDAC A ~ ayant des grains dont le dianètre est de 20 15 et des pores de 300 A.
Toute autre silice comparable à la silice \!Y~AC A ~ peut etre utilisée.
On peut employer également une silice pour chromotagraphie , une silice HPLC, par exemple la silice commercialisee sous le 20 nom de porosil B ~, dont le diamètre des grains est compris entre 37et 75 L'invention concerne notamment des nouveaux supports de formule (I), pour lesquels m est un nombre entier pouvant varier de 1 à 5 et pour lesquels A est un radical -C~2 et plus particulièrement de nouveaux supports de formule (I) pour lesquels x 25 est un nombre entier pouvant varier de û à 10 et x1 un nombre entier pouvant varier de O à 5 et pour lesc!uels m = 3.
L'invention a tout particulierement pour objet des supports dont les formules suivent :
O
~ o,, (CH ~)3 _ ~ H - C
3 ~ (CH ~j3 - ~ ~ - C~
\ C- /~ 3 ~ ~ C - ~ ~ N H ~ C ~ H
4 1265~56 _ ~ - G - 5~ _ (C~ C _ _ ~ _ D ~ (c~ Cl _ C H ~ H
~ H _ C _C~/
le matériau ~ étant une silice VYDAC A ~ ou une silice éouivalente.
L'invention concerne auss; un procédé de préparation des supports de formule (I), caracterisé en ce que l'on fait réagir un support de formule II :
)\~3S; (CH2)m N112 (II) P et m ayant les significations déjà indiquées,avec un composé de formule III:
~ NR
HOOC-(A~X1~ (III) R etant un groupement protecteur de la fonction amine mono ou divalent et A et x1 ayant les signif;cations précédentes, en présence d'un agent d'activation et d'une base tert;aire, pour obtenir un support intermédiaire de formule :
~ ~ - 0 / S~ - (CH~)r~ R
que l'on traite, selon la nature de R, par un acide ou une base ~our libérer son groupement -NH2 terminal et ainsi obtenir un support de formule I dans laquelle ~ , m, A et x1 ont les significations données precedemment et dans laquelle x = o, support de forr.1ule (I), que l'on traite de nouveau, le cas échant, par le composé de formule III dans les memes conditions que précedemment, pour obtenir un
~ H _ C _C~/
le matériau ~ étant une silice VYDAC A ~ ou une silice éouivalente.
L'invention concerne auss; un procédé de préparation des supports de formule (I), caracterisé en ce que l'on fait réagir un support de formule II :
)\~3S; (CH2)m N112 (II) P et m ayant les significations déjà indiquées,avec un composé de formule III:
~ NR
HOOC-(A~X1~ (III) R etant un groupement protecteur de la fonction amine mono ou divalent et A et x1 ayant les signif;cations précédentes, en présence d'un agent d'activation et d'une base tert;aire, pour obtenir un support intermédiaire de formule :
~ ~ - 0 / S~ - (CH~)r~ R
que l'on traite, selon la nature de R, par un acide ou une base ~our libérer son groupement -NH2 terminal et ainsi obtenir un support de formule I dans laquelle ~ , m, A et x1 ont les significations données precedemment et dans laquelle x = o, support de forr.1ule (I), que l'on traite de nouveau, le cas échant, par le composé de formule III dans les memes conditions que précedemment, pour obtenir un
5 support interméd;a;re de formule :
~ ) - G ~ H -C~ _(A) ~ A) -intermédia;re que l'on tra;te de nouveau par un ac;de ou une base 15 pour obten;r un support de formule I dans laquelle x = 1, procedé que le cas échéant, l'on continue ains; de su;te en passant par des supports intermédiaires de formule :
/~ P`
CO~ _C~
dans laquelle R, ~ , m et x1 ont les sign;f;cat;ons précédentes et dans laquelle x est un nombre ent;er pouvant var;er de 2 a 20, jusqu'à obtention, le cas échant, d'un support de formule (I), dans laquelle x = 20.
3û Le groupement protecteur de la fonction amino R est par exemple un radical acyle dérivant d'un acide carbonique, tel que le radical éthoxy-carbonyle, benzyloxy-carbonyle, ter-butyloxy-carbonyle (= ~oc), paraméthyloxy-ben~yl oxy-carbonyle, fluorenyl méthoxy carbonyle (= FMOC). On peut aussi utiliser d'autres radicaux 35 tels que des radicaux aryle ou aralkyle substitués ou non, par exemple les radicaux benzyle ou triphénylméthyle ou o-nitrophényl sulfenyle.
Lorsque R a toutes les valeurs citées ci-dessus, la fonction amine est une amine secondaire, R est alors avantageusement une imine 40 stable et notamment le groupement :
~ ) - G ~ H -C~ _(A) ~ A) -intermédia;re que l'on tra;te de nouveau par un ac;de ou une base 15 pour obten;r un support de formule I dans laquelle x = 1, procedé que le cas échéant, l'on continue ains; de su;te en passant par des supports intermédiaires de formule :
/~ P`
CO~ _C~
dans laquelle R, ~ , m et x1 ont les sign;f;cat;ons précédentes et dans laquelle x est un nombre ent;er pouvant var;er de 2 a 20, jusqu'à obtention, le cas échant, d'un support de formule (I), dans laquelle x = 20.
3û Le groupement protecteur de la fonction amino R est par exemple un radical acyle dérivant d'un acide carbonique, tel que le radical éthoxy-carbonyle, benzyloxy-carbonyle, ter-butyloxy-carbonyle (= ~oc), paraméthyloxy-ben~yl oxy-carbonyle, fluorenyl méthoxy carbonyle (= FMOC). On peut aussi utiliser d'autres radicaux 35 tels que des radicaux aryle ou aralkyle substitués ou non, par exemple les radicaux benzyle ou triphénylméthyle ou o-nitrophényl sulfenyle.
Lorsque R a toutes les valeurs citées ci-dessus, la fonction amine est une amine secondaire, R est alors avantageusement une imine 40 stable et notamment le groupement :
6 1.265756 ~,~
., HG
5 Il est év;dent que dans le cas ou R est un radical monovalent~ un atome d'hydrogène est lié à l'azote.
L'invention concerne donc particulierement un procede caractérisé
en ce que R est le groupement :
C~
/
H~
15 dans le composé de formule III.
Dans les conditions préférentielles de mise en oeuvre du Drocédé
de l'invention :
- l'agent d'activation utilise pour obtenir les supports intermédiaires est soit le phényl phosphoramido c~loridate de ~hényle 2û de formule :
Cl \ NH _ soit le dicyclohexylcarbodiimide;
- la base tertiaire est de préférence la triéthylamine ou la pyridine ;
- la réaction s'effectue éventuellement au sein d'un solvant tel que le 30 chlorure de méthylène le diméthyl formamide le tétrahydrofuranne la pyridine.
Les conditions de déblocage de la fonction amine terminale des supports intermédiaires sont variables suivant les groupes protecteurs utilisés :
Lorsque R est un groupement :
., HG
5 Il est év;dent que dans le cas ou R est un radical monovalent~ un atome d'hydrogène est lié à l'azote.
L'invention concerne donc particulierement un procede caractérisé
en ce que R est le groupement :
C~
/
H~
15 dans le composé de formule III.
Dans les conditions préférentielles de mise en oeuvre du Drocédé
de l'invention :
- l'agent d'activation utilise pour obtenir les supports intermédiaires est soit le phényl phosphoramido c~loridate de ~hényle 2û de formule :
Cl \ NH _ soit le dicyclohexylcarbodiimide;
- la base tertiaire est de préférence la triéthylamine ou la pyridine ;
- la réaction s'effectue éventuellement au sein d'un solvant tel que le 30 chlorure de méthylène le diméthyl formamide le tétrahydrofuranne la pyridine.
Les conditions de déblocage de la fonction amine terminale des supports intermédiaires sont variables suivant les groupes protecteurs utilisés :
Lorsque R est un groupement :
7 iZ657~6 on utilise avantageusement l'acide chlorhydrique. D'autres acides tels que l'acide sulfurique, l'acide d;chloroacetique ou trichloroaceti~ue peuvent aussi être utilisés.
L'invention a aussi pour ohjet les supports intermediaires ~e 5 formule :
/~R
) \ C ~ ~ - [CC -(A)~
dans laquelle R, ~, m, A, x et x1 sont définis comme précedemment.
Les supports de formule II utilisés comme produits de depart dans le procédé de l'invention sont préparés comme indiqué dans le 15 brevet européen n~ ûû35719.
Lorsque R représente le groupement :
ce --,~
~
les produits de formule III sont préparés comme indique dans J.C. Sheemar et U.S. Grenida Am~ Soc. 84 2457 19~2 selon le schéma suivant :
~f H~ e Les supports de formule (I) de l'invention permettent de réaliser, sans inconvénient, la synthese d'oligonucléotides.
126S7S~;
L'invention a donc pour objet l'application des supoorts de formule ~I) dans ~a synthèse en phase solide d'oligonucléotides par la méthode aux phosphoram;dites, aux phosphites, 3UX phosphodiesters et aux phosphotriesters.
Ils permettent notam~ent d'obten;r un titre élevé en premiers nucléosides et des intermediaires stables. Ils peuvent être utilisés facilement dans les deux méthodes les plus classiques de synthèse solide d'oligonucléotides ~méthode au phosphoramidite, au phosphite, au phosphod;ester, au phosphotriester), aussi bien en 3' )5' 10 qu'en 5' 33'et pour toutes les bases puriques ou pyrinidiques usuelles.
Par ailleurs, l'hydrolyse finale séparant le support du polynucléotide est réalisée facilement et en même temps que la déprotection des liaisons phosphates et des groupements protecteurs 15 des bases puriques et pyrimidiques.
L'invention concerne tout particulièrement l'application des supports de formule (I) dans la synthèse solide par la méthode au phosphotriester.
L'invention a aussi pour objet les désoxyribonucléosides 2û et ribonucléosides obtenus lors de la synthèse d'oligonucléotides mettant en jeu les suprort de formule (I).
L'invention a ainsi pour objet de nouveaux désoxyribonucléosides et ribonucléosides sur supports de formule : -h2)~ C.-(P')X~ z-~ R r~ ~ C 1 ~
3~
dans laquelle le support de formule (I) est relie à un ribonucléoside ou à un désoxyribonucléoside, soit en 3', soit en 5', par l'intermédiaire d'un groupement ~ Z-b-, Z
étant un groupement hydrocarboné renfermant de 2 a 2û atornes de carbone, ou un groupement phényle~ la fonction hydroxyle étant éventuellement protégee soit en 3', soit en 5' et dans laque~le A' est soit un atome d'hydrogène si le support de formule (I) est relié à un 40 désoxyribonucléoside~ soit OR1 si le support de formule ~I) est 9 ~Z657~6 relie à un ribonucléoside, R1 étant soit un atome d'hydrogène, soit un groupement protecteur usuel de la fonction hydroxyle, a1 est une base purique ou pyrimidique dont la fonction amine est ~ventuellement protégée. L'invention a plus particulièrement pour objet de nouveaux 5 désoxyribonucleosides sur supports de formule :
R~C
) ~, ~ [ ~ G--( A ~ H - c ~
, FOR ~ 1~
15 dans lasuelle le support de formule (I) est relié à un désoxyribonuclèoside en 3' par l'intermédiaire d'un groupement -&-Z-C-, dans lequel Z est un groupement hydrocarbone renfermant de Z
O O
à 20 atomes de carbone ou un groupement phényle et la fonction 20 hydroxyle en 5' est éventuellement protègée par un groupement protecteur R2 usuel, B1 est une base purique ou pyrimidique, dont la fonction amine est éventuellement protegée.
L'invention concerne aussi les nucléotides obtenus par application des supports de formule (I) à leur synthèse.
L'invention a donc pour objet de nouveaux oligo désoxyribonucléotides ou oligoribonucléotides sur supports pour lesquels le nucléoside est attaché soit en 3', soit en 5', au support de formule (I), répond à la formule suivante :
? L ~ o~ .
. _ , ~o ~r~ C I ) et est lui-même relié par des liaisons phosphodiesters ou triesters du type :
o\ ,7,o R -0 / \ 0 dans lesquelles R3 est soit un atome hydrogène, soit un groupement 5 protecteur, ~ d'autres nucleotides portant les bases ~7, ..~. ~ty-1), jusqu'au dern;er nucléoside de formule :
~ _ 5 ~
- 1-`~
1 0 , ~ ' I
By étant la dernière base de l'oligodésoxy ou oligoribonucléotide, la fonction hydroxyle du dernier nucleoside en 5' ou en 3' étant éventuellement protégée et les differentes bases puriques ou 15 pyrimidiques ayant leurs fonctions amines éventuellement protegees.
L'invention a plus particulièrement pour objet de nouveaux oligo-désoxyribonucléotides sur supports de formule :
R~0 R. / \ ~ C ~
~p ~o o/ \~
O~ ~C~O~
R~o~ ~lo i ~JII ~ N~ II z c ~H rOr~u~
~ I
(C~
S.~, /1\
D 0 ~
~ -dans laquelle le support de formule (I) est relié en 3' ~ un oligo-désoxyribonucléotide portant des bases ~ 2~~~~~eY et dans laquelle R2 est soit un atome d'hydrogéne, soit un groupement protecteur, R3 est soit un atome d'hydrogène, soit un groupement 5 protecteur, les bases puriques ou pyrimidiques ayant leurs fonc~ions amines éventuellement protégées.
Dans les désoxyribonucléosides, ribonucléosides, oligodésoxy-ribonucléotides ou oligoribonucléotides sur supoorts défin;s precédemment Z est de préference un radical phenyle ou un radical 10 -(CH2)n, n étant un nombre entier pouvant varier entre 2 et 20.
L'invention concerne tout particulièrement ceux pour lesquels Z
est un radical -~CHz)2.
Dans les ribonucléosides ou oligoribonucléosides, définis ci-dessus, R1 est un groupement protecteur usuel de 15 la fonction hydroxyle, tel qu'un groupement pyranyle, silyle ou benzyle.
Dans les nucléosides ou nucleotides définis précédemment, les bases B1, B2 ~~~ By représentent l'adénine, la guanine (bases puriques), la cytosine, l'uracile ou la thymine (bases 2û pyrimidiques).
Ces bases peuvent aussi etre des bases puriques ou pyrimidiques substituées telles que par exemple la 6-méthylaminopurine ou la 6-diméthyl-aminopurine, la 1-méthyl guanine, la 5-méthyl-cytosine, la 5-hydroxyméthyl-cytosine, le dihydro-uracile.
Toutes les bases dites rares ou mineures que l'on trouve dans certains acides nucléiques peuvent être utilisées.
Les groupements protecteurs des fonctions amines de ces bases sont par exemple des groupements benzoyle ou isobutyryle.
Le groupement protecteur R2 de la fonction hydroxyle en 5' 30 est par exemple un radical trityle, monométhoxytrityle diméthoxytrityle, pixyle.
Le groupement protecteur R3 des fonctions hydroxyle des groupements phosphate est par exemple le radical ortho ou para chlorophényle.
Les méthodes de synthèse d'oligonucléotides mentionnées précédemment sont très usue~les et parfaitement connues de l'homme de l'art. On peut les trouver resumèes par exemple dans l'article The Chemical Synthesis of DrlA, Aldrichimica Acta, vol. 106, N~ 3-1983.
Il est rappellé briévement ci-après les différentes étapes de la 40 synthese 3' >5' d'oligo désoxyribonucleotides par la méthode aux ~1265756 phosphotriesters. Il va de soi que les étapes sont strictement les mêmes pour la synthèse d'oligo ribonucléotides et/ou si la synthese se fait en 5' ~3', le groupement protecteur de l'hydroxyle en 3' devant être dans ce cas convenablement choisi.
5 1. Preparation d'un désoxynucléoside activé :
L C ~ anhydride _ ~ I succinique ~
-- diméthylamino CH pyridi~e ( ~-C-c~ C~2-CG~ ~
On peut utiliser l'acide libre ou active par un groupement pentachloro phenyle (Itakura et al. ~lucl. Ac. Res. 8, 22, 5473, 1~80) ou 15 paranitro phényle : (MH Caruthers, Chemical and Enzymatic Synthesis of gene fragments H.Cr Gassen et A. Lang, Verlag Chemie (1982) p. 71).
2. Condensation du desoxynucléoside préparé Drécédemment sur un support de formule (I) dénommé schématiquement ci-après :
Cette condensation s'effectue en solution dans le dimethylformamide en utilisant comme catalyseur soit la triethylamine pendant 20 à 24 heures, soit le dicyclohexylcarbodiimide dans la pyridine (1 nuit a 3 jours), soit la dimethylamino pyridine dans la pyridine.
On obtient :
R,~ ~ al ~o~
O C--CH,~--C~2-C-O11H _~-S~ ~
On deprotege la fonction hydroxyle en 5' par traitement avec un 40 acide de Le~is, par exemple avec le bromure de zinc ou avec un acide ~26~756 di ou trichloroac~tique.
3. Allongement de la cha;ne désoxyoligonucléotidique -On utilise soit des nucléotides monomères soit des nucléotides dimères sous forme de leurs sels de triéthylammonium.
Les dimères sont stockés sous forme de dérivés cyanoéthylés. On pr~pare le sel de triéthylammonium juste avant la synthèse.
Après avoir éliminé le groupement protecteur de l hydroxyle 5 du premier nucleoside fixé sur le support on condense ce dimére en présence de mésitylsulfonyl 3-nitro 1 2 4-triazole ou MS~T ou 1û du mélange chlorure de mésitylsulfonyl-méthyl imidazole dans l3 pyridine.
~, R~O ~ fO~¦
R3 ~ ~ ~~ \
20 R3 ~ \ O \~
~1 \, C~~-C o~ \o,~
'S ~ ~ ~ ~Y~o ~O
o R o ' ~ ~ O
R35 ~ -~
c ~ ~c ~, ~C ~I ~1 ~0\ 0 \O---S~ -C~ c~ C~-~
O o ~Z657~;6 ~ 14 Avant chaque couplage, on élimine le groupement protecteur en 5' du dernier nucléotide accroché sur la cha;ne.
4. Séparation du support et de la chaine oligonucléotidique On utilise, par exemple, le mélange para-nitro-benzaldoxime et N,N,N',N'-tétraméthylguanidine dans le mé-lange dioxane et eau (1/1) qui coupe l'oligonucléotide au support.
Ce réactif très doux permet aussi de cliver sélec-tivement les liaisons phosphates aryliques par rapport aux phosphates aliphatiques réalisant ainsi le déblocage des phosphates sans casser la cha;ne synthétisée.
Il faut ensuite traiter l'oligonucléotide ainsi obtenu, de façon à libérer toutes les fonctions protégées lors de la synthèse.
Plusieurs traitements de purification (électropho-rèse HPLC) sont alors nécessaires pour obtenir le polynucléo-tide désiré.
Seule, une ultime étape de séquençage permet de connaitre de facon certaine, si cela s'avère nécessaire, la structure de l'oligonucléotide.
Les supports de formule (I) de l'invention peuvent également être appliqués à la synthèse peptidique et l'inven-tion a également pour objet cette application.
Les exemples donnés ci-dessous illustrent l'inven-tion, sans toutefois la limiter.Exemple 1 : Préparation du support :
Silice / ~ Si-(cH2)3-NH r~ NH2 STADE A : Préparation du support de départ : y o Silice \ ~ ( 2)3 NH2 ~Z6~i756 14a On opère comme indiqué au début de l'exemple 1 du brevet européen n 0035719 à partir de 10 g de silice VYDAC A
(granulométrie 20 ~--Pores 300 ~) et de 11,5 g de 3-amino propyltriéthoxy silane.
On obtient le support attendu présentant un titre en NH2 de 3.10 4 équivalent/gramme (dosage par la méthode à
l'acide picrique).
STADE B : Préparation du support.
On agite pendant une nuit :
- 600 mg de support obtenu au stade A, - 550 mg d'acide 4 /(5-chloro 2-hydroxy benzylidene)-amino/benzo;que (préparation donnée à la fin de l'exemple 1), - 534 mg de phényl phosphoramido chloridate de phényle (préparation donn~e à la fin de l'exemple 1), 5 - 10 cm3 de chlorure de m~thylène, - 0,54 cm3 de tri~thylam;ne.
On essore le précipité obtenu, empâte avec du diméthylformamide chaud (100~C~, jusqu'à absence de coloration du filtrat. On effectue sur la silice un test à la ninhydrine qui est négatif (absence de 10 groupement -NH2 libre).
On obtient un support pesant 583 mg que l'on met en suspension dans 5 cm3 de méthanol à 50% dans l'eau. On ajoute de l'acide chlorhydrique 0,1 ~ pour maintenir le pH à 1, agite 1 heure, essore, lave successi~ement avec :
15 - 20 cm3 d'un mélange méthanol-eau (1-1), - 100 cm3 de méthanol anhydre, - 1QO cm3 de chlorure de méthylène.
On sèche sous pression réduite, à temperature ambiante pendant une nuit et obtient 563,5 mg de support attendu.
20 1/.Pr~paration de l'acide 4 -/(5-chloro 2-hydroxy benzylidène) amino/
benzoSque.
On opère comme indique dans J.C. Sheenam et U.S. Grenda Am. Soc.
84 2457 t1982) à partir de 1~37 9 d'acide para-amino benzo;que, de 2,35 9 de 5 chloro-salicylaldehyde, de 240 cm3 d'éthanol et de 17 cm3 25 de méthanol anhydre.
On obtient 2,59 9 de produit attendu.
2/.Pr~paration du phenyl phosphoramido chloridate de ph~nyle.
On opère comme indiqué dans Synthésis 288 (1982) à partir de 22,2 cm3 de phosphorodichloridate de phényle, de 175 rm3 de benzène 30 anhydre, d'une solution renfermant 12,5 cm3 d'aniline dans 75 cm3 de benzène anhydre.
On obtient 24,8 9 de produit attendu.
Exemple 2 : Préparation du support :
ce. _O~ (c~ h~ _C _~H--i2~ 6 On op~re comme au stade H de l'exemple 1 à partir du support obtenu a l'exemple 1 et obtient 490 mg de support attendu ayant un titre en NHz de 2.10 4 equivalent/gramme (dosage à l'acide picrique3.
Exemple 3 : Préparation de support.
5- I C~ ~ o ~ ~ _(C~12)3 - ~H-C ~ l-C -~ _C ~
On opère comme au stade B de l'exemple 1 à partir du suDport 10 obtenu à l'exemple 2.
On obtient 462 mg de support attendu ayant un titre en ?~H2 de 1 5.10-4 équivalent/gramme (dosage à l'acide picrique).
Exemple 4 : Préparation du support.
5 ~ l, c ~ ~ ( C ~ 2 ) 3 ~ c _ c ~ - Q
~2 On agite pendant 48 heures à température ambiante :
- 200 mg de support obtenu au stade A de L'exemple 1 20 - 5 cm3 de pyridine anhydre - 275 mg d'acide 3 /(5-chloro 2-hydroxy benzylidéne) amino/ phenyl acétique (préparation donnée à la fin de l'exemple 4 - 200 mg de dicyclohexyl carbodiimide.
On essore puis lave successivement avec du dioxane du methano~
25 du dim~thylformamide chaud du méthanol.
On sèche sous pression réduite a température ambiante et obtient 195 mg de support attendu.
Le test à la ninhydrine est négatif.
La silice precédemment obtenue est mise en suspension dans 30 2 cm3 d'acide chlorhydrique 0 1 N 5 CQ3 de methanol 3 cm3 d'eau.
On agite 1 heure à température ambiante essore lave avec le mélange methanol-eau (1-1~.
On obtient 190 mg de support attendu ayant un titre en -NH2 de 1 95.10 4 equivalent/gramme (titre obtenu par dosage photométrique 35 en W du 2-hyclroxy 5-chloro benzaldéhyde libéré contenu dans le filtrat~. -Pr~Daration de l'acide 3-/(5-chLoro 2-hydroxybenzylidène~ amino/
phenyl acétique.
On opère comme indiqué dans J.C. Sheemann Am. Soc. ~4 2457 (1982 126S7~
3 partir de 1,5 9 d'acide 3-aminophényl acétique, de 1,72 9 de 5-chloro ~-hydroxy benzaldéhyde, de 480 cm3 cl'éthanol 10n~ et de 35 cm3 de méthanol.
On obtient 2 9 de produit attendu.
5 Exemple 5 : Pr~parat;on du support ~ ~ (C~2)3 ~ ~--C -C~ 2 ~ ~ ~ C ~
On agite pendant 72 heures le support obtenu à l'exemple 4 avec 5 cm3 de pyridine anhydre, 2ûO mg d'acide 3-/(5-chloro 2-hydroxy benzylidène) a~ino/ phényl acétique et 2ûû mg de dicyclohexyl carbodiimide.
On essore et lave successivement avec d~l diméthylformamide, du méthanol, du chlorure de méthyléne, de l'oxyde d'éthyle.
On sèche sous pression rèduite. On reprend le produit obtenu avec 2 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N, 5 cm3 de méthanol, 3 cm3 d'eau, agite 1 heure, essore, lave avec un mélange méthanol-eau (1-1).
20 On obtient 180 mg de support attendu et ayant un t;tre en NH2 de 1,97.10-4 équivalent/gramme (titre obtenu par dosage photométrique en UV du 2-hydroxy 5-chloro benzaldéhyde libéré contenu dans le filtrat).
Synthese d'oli~onucl~eotides par la methode au phosphotriester 25 Le support de formule (I) est disposé dans une minicolonne entre deux filtres en polyfluoroéthylène. Les deux filtres sont maintenus dans une position fixe par deux pistons creux. L'ensemble est fermé en haut par un bouchon à vis muni d'un septum par lequel on introduit à la seringue le mélange de couplage. L'appareil utilisé est semblable à
30 celui décrit dans Chemical and Enzymatic Synthésis of fragments ~.Cr Gassen A. Lang Verlag Chemie 82, p. 14.
Toutes les opérations répétitives de lava~e et d'introduction de réactifs sont automatisees. Le nombre de nucléotides à introduire pour la totalité de la synthése peut etre programmé. L'introduction du 35 nucléotide est la seule opération manuelle à effectuer a la seringue.
On place dans le réacteur la quantité de support de formule (I) condense avec le premier nucléoside portant la première base 9~
nécessaire pour la synthèse envisagée (25 à 150 mg~. Gn programme convenablement les paramètres souhaités, en particulier le nombre de 40 nucleotides à accrocher, puis on commence le cycle automatique suivant :
~26S756 Etape 1 :
: Solvant : Type d'introduction : Temps : Pyridine : Flux continu : 5 mn : : 1cm3/mn 10 : ~socyanate de : Fractions programmées : 10 mn : phenyle 3 10 %
: dans la pyridine - : Pyridine : Flux continu : 5 mn 15 : : 1 cm3/mn :
: Chlorure de methylène Flux continu : 3 mn : : environ 2 cm3/mn 20 : acide dichloro : Flux con.inu : 4,5 mn : ac~tique à 10 X dans: environ 2 cm3/mn : le chlorure de : methylène 25 : DMF : Flux continu : 5 mn : : environ 1 cm3/mn : Pyr;dine : Flux continu : 5 mn : : environ 1 cm3/rnn : Couplage : à la seringue : 15 mn à 1 h Etape 2 :
On effectue autant de cycles identiques au premier, qu'il est nécessaire pour obtenir le nucleotide souhaité.
Les solvants utilises dans ce cycle de synthèse doivent être tres purs et anhydres.
Le dosage UV de la quantité des ions tritylium effectue après 40 detritylation permet de connaître le rendement de chaque couplage.
19 ~26~;7~;~
Le mélange de couplage est prépare juste au moment de l'e~ploi, il comprend :
- 10 équivalents de sels de triéthylammoniun du nucléotide monomère ou dimère ~par rapport à la quantité du premier nucléoside pr~sent sur le 5 support sol;de).
- 30 équivalents de mésityl sulfonyl 3-nitro 1,2,4-triazole ou MSNT
dans la pyridine anhydre (0,3 cm3 pour 50 mg de dimère environ).
Ce mélange est transféré dans une seringue sous atmosphere d'argon anhydre, on l'ajoute en trois fois à intervalles réguliers.
Pour obtenir l'oligonucléotide totalement déprotégé, il est ensuite nécessaire d'effectuer un certain nombre de traitements qui sont très usuels et décrits, par exemple, dans Chemical and Enzymatic Synthesis of gene fragments H. Cr. Gassen and A. Lang Verlag Chemie 82, pages 2 à
42.
Ces traitements sont les su;vants ~
1/. Cliver le nucléotide de son support solide.
On effectue un traitement par une solution 0,3 ~l d'o-nitro-benzaldoximate de 1, 1, 3, 3_tétraméthyl guanidinium dans un mélange dioxane-eau 1-1.
On procède de manière très usuelle, comme indiqué dans Nucleic Acids Research. Vol. 9 n~ 18 1981, p. 4611.
Ce réactif très doux permet aussi de cliver selectivement les liaisons phosphates aryliques par rapport aux phosphates aliphatiques réalisant ainsi le déblocage des phosphates sans casser la cha;ne 25 synthétisée.
2/. Débloquer les fonctions amines des bases azotées.
On effectue un traitement par NH40H saturé ( 37~) et libère ainsi toutes les amines des bases azotées.
3/. Débloquer la fonction en 5' du dernier nucleotide.
3û On effectue un traitement par un mélange CH3COOH-eau (4-1).
Après concentration à sec, sous pression réduite, on reprend avec de l'eau et extrait à l'éther pour éliminer tous les réactifs et les produits de clivage.
L'oligonucléotide à y maillons ainsi obtenu, contient de 35 nombreuses impuretés ~nucléotides à y-2, y-4--- maillons, produits de diverses dégradations).
L'obtention du produit recherché nécessite plusieurs étapes successives de purification :
- chromatographie sur gels, - HPLC, - lectrophorèse, - Sequençage : Cette dernière méthode donne sans ambiguité, dans l'ordre, la suite des nucléotides monomères.
Ces méthodes sont très usuelles.
La demanderesse ne fait donc que les citer.
Exemple 6 : Oligo-dèsoxyribonucléotides synthétisés en utilisant le support de l'exemple 2.
1/. Pr~paration du 5'-dimethoxytrityl 2'-d~eoxy thynid;ne 3'-paranitro phényl succinate On utilise la méthode décrite par MH Caruthers, ChemicaL and Enzymatic Synthetis of gene fragments, H.Cr. Gassen et A Lang Verlag Chemie ~1982) p. 71, à partir de 1,557 9 d'acide 5'-dimèthoxytrityle 2'-déoxy thymidine 3'-succinique, de 10 cm3 de dioxane anhydre, de 0,5 cm3 de pyridine anhydre, de 369 mg de para nitrophénol, de 585 mg de 15 dicyclohexyl carbodiimide en solution dans 2,5 cm3 de dioxane anhydre.
On obtient 1,150 9 de produit attendu.
2/. Condensation entre le support de l'exemple 2 et le succinate de thymidine active pr~par~ ci-dessus.
On agite à l'obscurité, pendant 72 heures, 99 mg de support 20 de l'exemple 2 titrant en NH2 2.10 4 eq/g, 80 mg de succinate de thymidine activé préparé ci-dessus, soit environ 6,3 équivalents, 80 mg de dicyclohexyl carbodiimide, 2 cm3 de pyridine. On essore et lave successivement avec de la pyridine, un mélange chlorure de methylène-méthanol~du chlorure de méthyléne, puis seche sous pression reduite.
On obtient 95 mg de support condensé attendu, ayant un titre en diméthoxytrityl de 8,8 10 5 eq/g.
3/. On obtient, à partir du support condensé avec le succinate de thymidine, en utilisant tro;s monomères, l'oligo-desoxyribonucléotide 5'-d ~T C T A) et en utilisant trois diméres, l'oligo-désoxyribonucléotide 30 5'-d (TCC TT AC)~
Exemple 7 : oligo-désoxyribonucléotide synthétise en utilisant le support de l'exemple 3.
1/. Preparation du 5'-diffléthoxytrityl 2'-N ben~oyl désoxycytidine 3'-para nitro phényl succinate.
On utilise la méthode décrite par MH Caruthers, Chemical and Enzymatic Synthesis of gene fragments, H-Cr Gassen et ~. Lang, Yerag Chemie (1982) p. 71, à partir de 4,16 9 d'acide 5'-diméthoxytrityl 2'-déoxy N-benzoyl cytidine 3'-succinique, 25 cm3 de dioxane anhydre, 0,8 cm3 de pyridine, 1,16 9 de paranitrophénol, 1,83 a de dicyclohexyl-40 carbodiimide dans ~,33 cm3 de pyridine.
21 1~6575~
On obtient 3,6 9 de produit attendu.
2/. Condensat;on entre le support de l'exemple 3 et le succ;nate de cytosine act;ve prepare c;-dessus.
On mélange pendant deux jours à l'obscurite 100 mg de support de S l'exemple 3 titrant en ~JH2 1,5 10 4 eq/g, 11~ mg de succinate de cytosine activé prépare ci-dessus, soit environ 10 équ;valents et 37 mg de dicyclohexylcarbodiim;de. On lave et sèche comme à l'exemple précédent et obtient 95 mg de support condens~ attendu ayant un titre en diméthoxytrityle de 7,10 eq/g.
10 3/. On obtient, à partir du support condensé avec le succinate de cytosine en utilisant 3 dimères, l'oligodésoxyribonucleotide 5'-d(CCC TTAC).
Exemple 8 : oligo désoxyribonucleotides synthetisés en utilisant le support de l'exemple 5.
On condense 145 mg de support de l'exemple 5 avec 220 mg de 15 succinate de cytosine activé en présence de 150 mg de dicyclohexyl carbodiimide et de 2 cm3 de pyridine de la même façon qu'à l'exemple 7. On obtient 140 mg de support condensè attendu titrant 5,55 10 5 eq/g en dimethoxytrityle.
On obtient à partir de ce support condense en utilisant 3 dimères, 20 l'oligodésoxyribonucléotide 5'-d (CCC TTAC) et en utilisant deux dimères, l'oligodésoxyr;bonucléotide 5'-d (CCCTT).
L'invention a aussi pour ohjet les supports intermediaires ~e 5 formule :
/~R
) \ C ~ ~ - [CC -(A)~
dans laquelle R, ~, m, A, x et x1 sont définis comme précedemment.
Les supports de formule II utilisés comme produits de depart dans le procédé de l'invention sont préparés comme indiqué dans le 15 brevet européen n~ ûû35719.
Lorsque R représente le groupement :
ce --,~
~
les produits de formule III sont préparés comme indique dans J.C. Sheemar et U.S. Grenida Am~ Soc. 84 2457 19~2 selon le schéma suivant :
~f H~ e Les supports de formule (I) de l'invention permettent de réaliser, sans inconvénient, la synthese d'oligonucléotides.
126S7S~;
L'invention a donc pour objet l'application des supoorts de formule ~I) dans ~a synthèse en phase solide d'oligonucléotides par la méthode aux phosphoram;dites, aux phosphites, 3UX phosphodiesters et aux phosphotriesters.
Ils permettent notam~ent d'obten;r un titre élevé en premiers nucléosides et des intermediaires stables. Ils peuvent être utilisés facilement dans les deux méthodes les plus classiques de synthèse solide d'oligonucléotides ~méthode au phosphoramidite, au phosphite, au phosphod;ester, au phosphotriester), aussi bien en 3' )5' 10 qu'en 5' 33'et pour toutes les bases puriques ou pyrinidiques usuelles.
Par ailleurs, l'hydrolyse finale séparant le support du polynucléotide est réalisée facilement et en même temps que la déprotection des liaisons phosphates et des groupements protecteurs 15 des bases puriques et pyrimidiques.
L'invention concerne tout particulièrement l'application des supports de formule (I) dans la synthèse solide par la méthode au phosphotriester.
L'invention a aussi pour objet les désoxyribonucléosides 2û et ribonucléosides obtenus lors de la synthèse d'oligonucléotides mettant en jeu les suprort de formule (I).
L'invention a ainsi pour objet de nouveaux désoxyribonucléosides et ribonucléosides sur supports de formule : -h2)~ C.-(P')X~ z-~ R r~ ~ C 1 ~
3~
dans laquelle le support de formule (I) est relie à un ribonucléoside ou à un désoxyribonucléoside, soit en 3', soit en 5', par l'intermédiaire d'un groupement ~ Z-b-, Z
étant un groupement hydrocarboné renfermant de 2 a 2û atornes de carbone, ou un groupement phényle~ la fonction hydroxyle étant éventuellement protégee soit en 3', soit en 5' et dans laque~le A' est soit un atome d'hydrogène si le support de formule (I) est relié à un 40 désoxyribonucléoside~ soit OR1 si le support de formule ~I) est 9 ~Z657~6 relie à un ribonucléoside, R1 étant soit un atome d'hydrogène, soit un groupement protecteur usuel de la fonction hydroxyle, a1 est une base purique ou pyrimidique dont la fonction amine est ~ventuellement protégée. L'invention a plus particulièrement pour objet de nouveaux 5 désoxyribonucleosides sur supports de formule :
R~C
) ~, ~ [ ~ G--( A ~ H - c ~
, FOR ~ 1~
15 dans lasuelle le support de formule (I) est relié à un désoxyribonuclèoside en 3' par l'intermédiaire d'un groupement -&-Z-C-, dans lequel Z est un groupement hydrocarbone renfermant de Z
O O
à 20 atomes de carbone ou un groupement phényle et la fonction 20 hydroxyle en 5' est éventuellement protègée par un groupement protecteur R2 usuel, B1 est une base purique ou pyrimidique, dont la fonction amine est éventuellement protegée.
L'invention concerne aussi les nucléotides obtenus par application des supports de formule (I) à leur synthèse.
L'invention a donc pour objet de nouveaux oligo désoxyribonucléotides ou oligoribonucléotides sur supports pour lesquels le nucléoside est attaché soit en 3', soit en 5', au support de formule (I), répond à la formule suivante :
? L ~ o~ .
. _ , ~o ~r~ C I ) et est lui-même relié par des liaisons phosphodiesters ou triesters du type :
o\ ,7,o R -0 / \ 0 dans lesquelles R3 est soit un atome hydrogène, soit un groupement 5 protecteur, ~ d'autres nucleotides portant les bases ~7, ..~. ~ty-1), jusqu'au dern;er nucléoside de formule :
~ _ 5 ~
- 1-`~
1 0 , ~ ' I
By étant la dernière base de l'oligodésoxy ou oligoribonucléotide, la fonction hydroxyle du dernier nucleoside en 5' ou en 3' étant éventuellement protégée et les differentes bases puriques ou 15 pyrimidiques ayant leurs fonctions amines éventuellement protegees.
L'invention a plus particulièrement pour objet de nouveaux oligo-désoxyribonucléotides sur supports de formule :
R~0 R. / \ ~ C ~
~p ~o o/ \~
O~ ~C~O~
R~o~ ~lo i ~JII ~ N~ II z c ~H rOr~u~
~ I
(C~
S.~, /1\
D 0 ~
~ -dans laquelle le support de formule (I) est relié en 3' ~ un oligo-désoxyribonucléotide portant des bases ~ 2~~~~~eY et dans laquelle R2 est soit un atome d'hydrogéne, soit un groupement protecteur, R3 est soit un atome d'hydrogène, soit un groupement 5 protecteur, les bases puriques ou pyrimidiques ayant leurs fonc~ions amines éventuellement protégées.
Dans les désoxyribonucléosides, ribonucléosides, oligodésoxy-ribonucléotides ou oligoribonucléotides sur supoorts défin;s precédemment Z est de préference un radical phenyle ou un radical 10 -(CH2)n, n étant un nombre entier pouvant varier entre 2 et 20.
L'invention concerne tout particulièrement ceux pour lesquels Z
est un radical -~CHz)2.
Dans les ribonucléosides ou oligoribonucléosides, définis ci-dessus, R1 est un groupement protecteur usuel de 15 la fonction hydroxyle, tel qu'un groupement pyranyle, silyle ou benzyle.
Dans les nucléosides ou nucleotides définis précédemment, les bases B1, B2 ~~~ By représentent l'adénine, la guanine (bases puriques), la cytosine, l'uracile ou la thymine (bases 2û pyrimidiques).
Ces bases peuvent aussi etre des bases puriques ou pyrimidiques substituées telles que par exemple la 6-méthylaminopurine ou la 6-diméthyl-aminopurine, la 1-méthyl guanine, la 5-méthyl-cytosine, la 5-hydroxyméthyl-cytosine, le dihydro-uracile.
Toutes les bases dites rares ou mineures que l'on trouve dans certains acides nucléiques peuvent être utilisées.
Les groupements protecteurs des fonctions amines de ces bases sont par exemple des groupements benzoyle ou isobutyryle.
Le groupement protecteur R2 de la fonction hydroxyle en 5' 30 est par exemple un radical trityle, monométhoxytrityle diméthoxytrityle, pixyle.
Le groupement protecteur R3 des fonctions hydroxyle des groupements phosphate est par exemple le radical ortho ou para chlorophényle.
Les méthodes de synthèse d'oligonucléotides mentionnées précédemment sont très usue~les et parfaitement connues de l'homme de l'art. On peut les trouver resumèes par exemple dans l'article The Chemical Synthesis of DrlA, Aldrichimica Acta, vol. 106, N~ 3-1983.
Il est rappellé briévement ci-après les différentes étapes de la 40 synthese 3' >5' d'oligo désoxyribonucleotides par la méthode aux ~1265756 phosphotriesters. Il va de soi que les étapes sont strictement les mêmes pour la synthèse d'oligo ribonucléotides et/ou si la synthese se fait en 5' ~3', le groupement protecteur de l'hydroxyle en 3' devant être dans ce cas convenablement choisi.
5 1. Preparation d'un désoxynucléoside activé :
L C ~ anhydride _ ~ I succinique ~
-- diméthylamino CH pyridi~e ( ~-C-c~ C~2-CG~ ~
On peut utiliser l'acide libre ou active par un groupement pentachloro phenyle (Itakura et al. ~lucl. Ac. Res. 8, 22, 5473, 1~80) ou 15 paranitro phényle : (MH Caruthers, Chemical and Enzymatic Synthesis of gene fragments H.Cr Gassen et A. Lang, Verlag Chemie (1982) p. 71).
2. Condensation du desoxynucléoside préparé Drécédemment sur un support de formule (I) dénommé schématiquement ci-après :
Cette condensation s'effectue en solution dans le dimethylformamide en utilisant comme catalyseur soit la triethylamine pendant 20 à 24 heures, soit le dicyclohexylcarbodiimide dans la pyridine (1 nuit a 3 jours), soit la dimethylamino pyridine dans la pyridine.
On obtient :
R,~ ~ al ~o~
O C--CH,~--C~2-C-O11H _~-S~ ~
On deprotege la fonction hydroxyle en 5' par traitement avec un 40 acide de Le~is, par exemple avec le bromure de zinc ou avec un acide ~26~756 di ou trichloroac~tique.
3. Allongement de la cha;ne désoxyoligonucléotidique -On utilise soit des nucléotides monomères soit des nucléotides dimères sous forme de leurs sels de triéthylammonium.
Les dimères sont stockés sous forme de dérivés cyanoéthylés. On pr~pare le sel de triéthylammonium juste avant la synthèse.
Après avoir éliminé le groupement protecteur de l hydroxyle 5 du premier nucleoside fixé sur le support on condense ce dimére en présence de mésitylsulfonyl 3-nitro 1 2 4-triazole ou MS~T ou 1û du mélange chlorure de mésitylsulfonyl-méthyl imidazole dans l3 pyridine.
~, R~O ~ fO~¦
R3 ~ ~ ~~ \
20 R3 ~ \ O \~
~1 \, C~~-C o~ \o,~
'S ~ ~ ~ ~Y~o ~O
o R o ' ~ ~ O
R35 ~ -~
c ~ ~c ~, ~C ~I ~1 ~0\ 0 \O---S~ -C~ c~ C~-~
O o ~Z657~;6 ~ 14 Avant chaque couplage, on élimine le groupement protecteur en 5' du dernier nucléotide accroché sur la cha;ne.
4. Séparation du support et de la chaine oligonucléotidique On utilise, par exemple, le mélange para-nitro-benzaldoxime et N,N,N',N'-tétraméthylguanidine dans le mé-lange dioxane et eau (1/1) qui coupe l'oligonucléotide au support.
Ce réactif très doux permet aussi de cliver sélec-tivement les liaisons phosphates aryliques par rapport aux phosphates aliphatiques réalisant ainsi le déblocage des phosphates sans casser la cha;ne synthétisée.
Il faut ensuite traiter l'oligonucléotide ainsi obtenu, de façon à libérer toutes les fonctions protégées lors de la synthèse.
Plusieurs traitements de purification (électropho-rèse HPLC) sont alors nécessaires pour obtenir le polynucléo-tide désiré.
Seule, une ultime étape de séquençage permet de connaitre de facon certaine, si cela s'avère nécessaire, la structure de l'oligonucléotide.
Les supports de formule (I) de l'invention peuvent également être appliqués à la synthèse peptidique et l'inven-tion a également pour objet cette application.
Les exemples donnés ci-dessous illustrent l'inven-tion, sans toutefois la limiter.Exemple 1 : Préparation du support :
Silice / ~ Si-(cH2)3-NH r~ NH2 STADE A : Préparation du support de départ : y o Silice \ ~ ( 2)3 NH2 ~Z6~i756 14a On opère comme indiqué au début de l'exemple 1 du brevet européen n 0035719 à partir de 10 g de silice VYDAC A
(granulométrie 20 ~--Pores 300 ~) et de 11,5 g de 3-amino propyltriéthoxy silane.
On obtient le support attendu présentant un titre en NH2 de 3.10 4 équivalent/gramme (dosage par la méthode à
l'acide picrique).
STADE B : Préparation du support.
On agite pendant une nuit :
- 600 mg de support obtenu au stade A, - 550 mg d'acide 4 /(5-chloro 2-hydroxy benzylidene)-amino/benzo;que (préparation donnée à la fin de l'exemple 1), - 534 mg de phényl phosphoramido chloridate de phényle (préparation donn~e à la fin de l'exemple 1), 5 - 10 cm3 de chlorure de m~thylène, - 0,54 cm3 de tri~thylam;ne.
On essore le précipité obtenu, empâte avec du diméthylformamide chaud (100~C~, jusqu'à absence de coloration du filtrat. On effectue sur la silice un test à la ninhydrine qui est négatif (absence de 10 groupement -NH2 libre).
On obtient un support pesant 583 mg que l'on met en suspension dans 5 cm3 de méthanol à 50% dans l'eau. On ajoute de l'acide chlorhydrique 0,1 ~ pour maintenir le pH à 1, agite 1 heure, essore, lave successi~ement avec :
15 - 20 cm3 d'un mélange méthanol-eau (1-1), - 100 cm3 de méthanol anhydre, - 1QO cm3 de chlorure de méthylène.
On sèche sous pression réduite, à temperature ambiante pendant une nuit et obtient 563,5 mg de support attendu.
20 1/.Pr~paration de l'acide 4 -/(5-chloro 2-hydroxy benzylidène) amino/
benzoSque.
On opère comme indique dans J.C. Sheenam et U.S. Grenda Am. Soc.
84 2457 t1982) à partir de 1~37 9 d'acide para-amino benzo;que, de 2,35 9 de 5 chloro-salicylaldehyde, de 240 cm3 d'éthanol et de 17 cm3 25 de méthanol anhydre.
On obtient 2,59 9 de produit attendu.
2/.Pr~paration du phenyl phosphoramido chloridate de ph~nyle.
On opère comme indiqué dans Synthésis 288 (1982) à partir de 22,2 cm3 de phosphorodichloridate de phényle, de 175 rm3 de benzène 30 anhydre, d'une solution renfermant 12,5 cm3 d'aniline dans 75 cm3 de benzène anhydre.
On obtient 24,8 9 de produit attendu.
Exemple 2 : Préparation du support :
ce. _O~ (c~ h~ _C _~H--i2~ 6 On op~re comme au stade H de l'exemple 1 à partir du support obtenu a l'exemple 1 et obtient 490 mg de support attendu ayant un titre en NHz de 2.10 4 equivalent/gramme (dosage à l'acide picrique3.
Exemple 3 : Préparation de support.
5- I C~ ~ o ~ ~ _(C~12)3 - ~H-C ~ l-C -~ _C ~
On opère comme au stade B de l'exemple 1 à partir du suDport 10 obtenu à l'exemple 2.
On obtient 462 mg de support attendu ayant un titre en ?~H2 de 1 5.10-4 équivalent/gramme (dosage à l'acide picrique).
Exemple 4 : Préparation du support.
5 ~ l, c ~ ~ ( C ~ 2 ) 3 ~ c _ c ~ - Q
~2 On agite pendant 48 heures à température ambiante :
- 200 mg de support obtenu au stade A de L'exemple 1 20 - 5 cm3 de pyridine anhydre - 275 mg d'acide 3 /(5-chloro 2-hydroxy benzylidéne) amino/ phenyl acétique (préparation donnée à la fin de l'exemple 4 - 200 mg de dicyclohexyl carbodiimide.
On essore puis lave successivement avec du dioxane du methano~
25 du dim~thylformamide chaud du méthanol.
On sèche sous pression réduite a température ambiante et obtient 195 mg de support attendu.
Le test à la ninhydrine est négatif.
La silice precédemment obtenue est mise en suspension dans 30 2 cm3 d'acide chlorhydrique 0 1 N 5 CQ3 de methanol 3 cm3 d'eau.
On agite 1 heure à température ambiante essore lave avec le mélange methanol-eau (1-1~.
On obtient 190 mg de support attendu ayant un titre en -NH2 de 1 95.10 4 equivalent/gramme (titre obtenu par dosage photométrique 35 en W du 2-hyclroxy 5-chloro benzaldéhyde libéré contenu dans le filtrat~. -Pr~Daration de l'acide 3-/(5-chLoro 2-hydroxybenzylidène~ amino/
phenyl acétique.
On opère comme indiqué dans J.C. Sheemann Am. Soc. ~4 2457 (1982 126S7~
3 partir de 1,5 9 d'acide 3-aminophényl acétique, de 1,72 9 de 5-chloro ~-hydroxy benzaldéhyde, de 480 cm3 cl'éthanol 10n~ et de 35 cm3 de méthanol.
On obtient 2 9 de produit attendu.
5 Exemple 5 : Pr~parat;on du support ~ ~ (C~2)3 ~ ~--C -C~ 2 ~ ~ ~ C ~
On agite pendant 72 heures le support obtenu à l'exemple 4 avec 5 cm3 de pyridine anhydre, 2ûO mg d'acide 3-/(5-chloro 2-hydroxy benzylidène) a~ino/ phényl acétique et 2ûû mg de dicyclohexyl carbodiimide.
On essore et lave successivement avec d~l diméthylformamide, du méthanol, du chlorure de méthyléne, de l'oxyde d'éthyle.
On sèche sous pression rèduite. On reprend le produit obtenu avec 2 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N, 5 cm3 de méthanol, 3 cm3 d'eau, agite 1 heure, essore, lave avec un mélange méthanol-eau (1-1).
20 On obtient 180 mg de support attendu et ayant un t;tre en NH2 de 1,97.10-4 équivalent/gramme (titre obtenu par dosage photométrique en UV du 2-hydroxy 5-chloro benzaldéhyde libéré contenu dans le filtrat).
Synthese d'oli~onucl~eotides par la methode au phosphotriester 25 Le support de formule (I) est disposé dans une minicolonne entre deux filtres en polyfluoroéthylène. Les deux filtres sont maintenus dans une position fixe par deux pistons creux. L'ensemble est fermé en haut par un bouchon à vis muni d'un septum par lequel on introduit à la seringue le mélange de couplage. L'appareil utilisé est semblable à
30 celui décrit dans Chemical and Enzymatic Synthésis of fragments ~.Cr Gassen A. Lang Verlag Chemie 82, p. 14.
Toutes les opérations répétitives de lava~e et d'introduction de réactifs sont automatisees. Le nombre de nucléotides à introduire pour la totalité de la synthése peut etre programmé. L'introduction du 35 nucléotide est la seule opération manuelle à effectuer a la seringue.
On place dans le réacteur la quantité de support de formule (I) condense avec le premier nucléoside portant la première base 9~
nécessaire pour la synthèse envisagée (25 à 150 mg~. Gn programme convenablement les paramètres souhaités, en particulier le nombre de 40 nucleotides à accrocher, puis on commence le cycle automatique suivant :
~26S756 Etape 1 :
: Solvant : Type d'introduction : Temps : Pyridine : Flux continu : 5 mn : : 1cm3/mn 10 : ~socyanate de : Fractions programmées : 10 mn : phenyle 3 10 %
: dans la pyridine - : Pyridine : Flux continu : 5 mn 15 : : 1 cm3/mn :
: Chlorure de methylène Flux continu : 3 mn : : environ 2 cm3/mn 20 : acide dichloro : Flux con.inu : 4,5 mn : ac~tique à 10 X dans: environ 2 cm3/mn : le chlorure de : methylène 25 : DMF : Flux continu : 5 mn : : environ 1 cm3/mn : Pyr;dine : Flux continu : 5 mn : : environ 1 cm3/rnn : Couplage : à la seringue : 15 mn à 1 h Etape 2 :
On effectue autant de cycles identiques au premier, qu'il est nécessaire pour obtenir le nucleotide souhaité.
Les solvants utilises dans ce cycle de synthèse doivent être tres purs et anhydres.
Le dosage UV de la quantité des ions tritylium effectue après 40 detritylation permet de connaître le rendement de chaque couplage.
19 ~26~;7~;~
Le mélange de couplage est prépare juste au moment de l'e~ploi, il comprend :
- 10 équivalents de sels de triéthylammoniun du nucléotide monomère ou dimère ~par rapport à la quantité du premier nucléoside pr~sent sur le 5 support sol;de).
- 30 équivalents de mésityl sulfonyl 3-nitro 1,2,4-triazole ou MSNT
dans la pyridine anhydre (0,3 cm3 pour 50 mg de dimère environ).
Ce mélange est transféré dans une seringue sous atmosphere d'argon anhydre, on l'ajoute en trois fois à intervalles réguliers.
Pour obtenir l'oligonucléotide totalement déprotégé, il est ensuite nécessaire d'effectuer un certain nombre de traitements qui sont très usuels et décrits, par exemple, dans Chemical and Enzymatic Synthesis of gene fragments H. Cr. Gassen and A. Lang Verlag Chemie 82, pages 2 à
42.
Ces traitements sont les su;vants ~
1/. Cliver le nucléotide de son support solide.
On effectue un traitement par une solution 0,3 ~l d'o-nitro-benzaldoximate de 1, 1, 3, 3_tétraméthyl guanidinium dans un mélange dioxane-eau 1-1.
On procède de manière très usuelle, comme indiqué dans Nucleic Acids Research. Vol. 9 n~ 18 1981, p. 4611.
Ce réactif très doux permet aussi de cliver selectivement les liaisons phosphates aryliques par rapport aux phosphates aliphatiques réalisant ainsi le déblocage des phosphates sans casser la cha;ne 25 synthétisée.
2/. Débloquer les fonctions amines des bases azotées.
On effectue un traitement par NH40H saturé ( 37~) et libère ainsi toutes les amines des bases azotées.
3/. Débloquer la fonction en 5' du dernier nucleotide.
3û On effectue un traitement par un mélange CH3COOH-eau (4-1).
Après concentration à sec, sous pression réduite, on reprend avec de l'eau et extrait à l'éther pour éliminer tous les réactifs et les produits de clivage.
L'oligonucléotide à y maillons ainsi obtenu, contient de 35 nombreuses impuretés ~nucléotides à y-2, y-4--- maillons, produits de diverses dégradations).
L'obtention du produit recherché nécessite plusieurs étapes successives de purification :
- chromatographie sur gels, - HPLC, - lectrophorèse, - Sequençage : Cette dernière méthode donne sans ambiguité, dans l'ordre, la suite des nucléotides monomères.
Ces méthodes sont très usuelles.
La demanderesse ne fait donc que les citer.
Exemple 6 : Oligo-dèsoxyribonucléotides synthétisés en utilisant le support de l'exemple 2.
1/. Pr~paration du 5'-dimethoxytrityl 2'-d~eoxy thynid;ne 3'-paranitro phényl succinate On utilise la méthode décrite par MH Caruthers, ChemicaL and Enzymatic Synthetis of gene fragments, H.Cr. Gassen et A Lang Verlag Chemie ~1982) p. 71, à partir de 1,557 9 d'acide 5'-dimèthoxytrityle 2'-déoxy thymidine 3'-succinique, de 10 cm3 de dioxane anhydre, de 0,5 cm3 de pyridine anhydre, de 369 mg de para nitrophénol, de 585 mg de 15 dicyclohexyl carbodiimide en solution dans 2,5 cm3 de dioxane anhydre.
On obtient 1,150 9 de produit attendu.
2/. Condensation entre le support de l'exemple 2 et le succinate de thymidine active pr~par~ ci-dessus.
On agite à l'obscurité, pendant 72 heures, 99 mg de support 20 de l'exemple 2 titrant en NH2 2.10 4 eq/g, 80 mg de succinate de thymidine activé préparé ci-dessus, soit environ 6,3 équivalents, 80 mg de dicyclohexyl carbodiimide, 2 cm3 de pyridine. On essore et lave successivement avec de la pyridine, un mélange chlorure de methylène-méthanol~du chlorure de méthyléne, puis seche sous pression reduite.
On obtient 95 mg de support condensé attendu, ayant un titre en diméthoxytrityl de 8,8 10 5 eq/g.
3/. On obtient, à partir du support condensé avec le succinate de thymidine, en utilisant tro;s monomères, l'oligo-desoxyribonucléotide 5'-d ~T C T A) et en utilisant trois diméres, l'oligo-désoxyribonucléotide 30 5'-d (TCC TT AC)~
Exemple 7 : oligo-désoxyribonucléotide synthétise en utilisant le support de l'exemple 3.
1/. Preparation du 5'-diffléthoxytrityl 2'-N ben~oyl désoxycytidine 3'-para nitro phényl succinate.
On utilise la méthode décrite par MH Caruthers, Chemical and Enzymatic Synthesis of gene fragments, H-Cr Gassen et ~. Lang, Yerag Chemie (1982) p. 71, à partir de 4,16 9 d'acide 5'-diméthoxytrityl 2'-déoxy N-benzoyl cytidine 3'-succinique, 25 cm3 de dioxane anhydre, 0,8 cm3 de pyridine, 1,16 9 de paranitrophénol, 1,83 a de dicyclohexyl-40 carbodiimide dans ~,33 cm3 de pyridine.
21 1~6575~
On obtient 3,6 9 de produit attendu.
2/. Condensat;on entre le support de l'exemple 3 et le succ;nate de cytosine act;ve prepare c;-dessus.
On mélange pendant deux jours à l'obscurite 100 mg de support de S l'exemple 3 titrant en ~JH2 1,5 10 4 eq/g, 11~ mg de succinate de cytosine activé prépare ci-dessus, soit environ 10 équ;valents et 37 mg de dicyclohexylcarbodiim;de. On lave et sèche comme à l'exemple précédent et obtient 95 mg de support condens~ attendu ayant un titre en diméthoxytrityle de 7,10 eq/g.
10 3/. On obtient, à partir du support condensé avec le succinate de cytosine en utilisant 3 dimères, l'oligodésoxyribonucleotide 5'-d(CCC TTAC).
Exemple 8 : oligo désoxyribonucleotides synthetisés en utilisant le support de l'exemple 5.
On condense 145 mg de support de l'exemple 5 avec 220 mg de 15 succinate de cytosine activé en présence de 150 mg de dicyclohexyl carbodiimide et de 2 cm3 de pyridine de la même façon qu'à l'exemple 7. On obtient 140 mg de support condensè attendu titrant 5,55 10 5 eq/g en dimethoxytrityle.
On obtient à partir de ce support condense en utilisant 3 dimères, 20 l'oligodésoxyribonucléotide 5'-d (CCC TTAC) et en utilisant deux dimères, l'oligodésoxyr;bonucléotide 5'-d (CCCTT).
Claims (19)
1. Supports de formule (I):
(I) caractérisés en ce que ? est un matériau constitué de micro-billes de verre, de silice, de kieselguhr, de polytétrafluoro-éthylène, d'oxydes métalliques ou de cellulose, - m est un nombre entier pouvant varier 1 à 20, - A représente soit une chaîne alkyle, linéaire ou ramifiée, renfermant de 1 à 20 atomes de carbone, soit un radical cy-clique saturé renfermant de 3 à 12 atomes de carbone, soit un radical phényle, soit un radical hétérocyclique renfermant 5 ou 6 chaînons, - x est un nombre entier pouvant varier de 0 à 20, - x1 est un nombre entier pouvant varier de 0 à 10, les fonc-tions amines sur les noyaux phényles pouvant être en para, méta ou en ortho.
(I) caractérisés en ce que ? est un matériau constitué de micro-billes de verre, de silice, de kieselguhr, de polytétrafluoro-éthylène, d'oxydes métalliques ou de cellulose, - m est un nombre entier pouvant varier 1 à 20, - A représente soit une chaîne alkyle, linéaire ou ramifiée, renfermant de 1 à 20 atomes de carbone, soit un radical cy-clique saturé renfermant de 3 à 12 atomes de carbone, soit un radical phényle, soit un radical hétérocyclique renfermant 5 ou 6 chaînons, - x est un nombre entier pouvant varier de 0 à 20, - x1 est un nombre entier pouvant varier de 0 à 10, les fonc-tions amines sur les noyaux phényles pouvant être en para, méta ou en ortho.
2. Supports de formule (I) tels que définis dans la revendication 1, caractérisés en ce que ? est un matériau constitué de silice ayant une granulométrie homogène et en ce que les fonctions aminées sur les noyaux phényles sont soit en méta, soit en para.
3. Supports de formule (I) tels que définis dans la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce que m est un nombre entier pouvant varier de 1 à 5.
4. Supports de formule (I), tels que définis dans la revendication 1, caractérisés en ce que A est un radical -CH2-.
5. Supports de formule (I) tels que définis dans la revendication 1, 2 ou 4, caractérisés en ce que x est un nombre entier pouvant varier de 0 à 10 et x1 un nombre entier pouvant varier de 0 à 5.
6. Supports de formule (I) tels que définis dans la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce que m = 3.
7. Supports selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont choisis dans le groupe constitué par les formules qui suivent:
le matériau ? étant une silice VYDAC A (marque de commerce) ou un silice équivalente.
le matériau ? étant une silice VYDAC A (marque de commerce) ou un silice équivalente.
8. Procédé de préparation des supports tels que définis dans la revendication 1, caractérisé en ce que l'on fait réagir un support de formule (II):
(II) dans lesquelles ? et m ont les significations déjà indiquées dans la revendication 1, avec un composé de formule (III):
HOOC-(A)x1 (III) dans laquelle R est un groupement protecteur de la fonction amino, mono ou divalent,et A et x1 ont les significations déjà
indiquées dans la revendication 1, en présence d'un agent d'activation et d'une base tertiaire, pour obtenir un support intermédiaire de formule :
que l'on traite, selon la nature de R, par un acide ou une base pour libérer son groupement -NH2 terminal et ainsi obte-nir un support de formule (I) dans laquelle ? , m, A et x1 ont les significations données précédemment et dans laquelle x = 0, support de formule (I), que l'on traite de nouveau, le cas échéant, par le composé de formule (III) dans les mêmes conditions que précédemment, pour obtenir un support intermédiaire de formule:
intermédiaire que l'on traite de nouveau par un acide ou une base pour obtenir un support de formule (I) dans laquelle x = 1, procédé que, le cas échéant, l'on continue ainsi de suite en passant par des supports intermédiaires de formule:
dans laquelle R, ? , m et x1 ont les significations précé-dentes et dans laquelle x est un nombre entier pouvant varier de 2 à 20, jusqu'à obtention, le cas échéant, d'un support de formule (I), dans laquelle x = 20.
(II) dans lesquelles ? et m ont les significations déjà indiquées dans la revendication 1, avec un composé de formule (III):
HOOC-(A)x1 (III) dans laquelle R est un groupement protecteur de la fonction amino, mono ou divalent,et A et x1 ont les significations déjà
indiquées dans la revendication 1, en présence d'un agent d'activation et d'une base tertiaire, pour obtenir un support intermédiaire de formule :
que l'on traite, selon la nature de R, par un acide ou une base pour libérer son groupement -NH2 terminal et ainsi obte-nir un support de formule (I) dans laquelle ? , m, A et x1 ont les significations données précédemment et dans laquelle x = 0, support de formule (I), que l'on traite de nouveau, le cas échéant, par le composé de formule (III) dans les mêmes conditions que précédemment, pour obtenir un support intermédiaire de formule:
intermédiaire que l'on traite de nouveau par un acide ou une base pour obtenir un support de formule (I) dans laquelle x = 1, procédé que, le cas échéant, l'on continue ainsi de suite en passant par des supports intermédiaires de formule:
dans laquelle R, ? , m et x1 ont les significations précé-dentes et dans laquelle x est un nombre entier pouvant varier de 2 à 20, jusqu'à obtention, le cas échéant, d'un support de formule (I), dans laquelle x = 20.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que R est le groupement:
dans le composé de formule (III).
dans le composé de formule (III).
10. Supports de formule:
dans laquelle ?, m, A et x1 sont définis comme dans la re-vendication 1, et R représente un groupement protecteur de la fonction amino, mono ou divalent.
dans laquelle ?, m, A et x1 sont définis comme dans la re-vendication 1, et R représente un groupement protecteur de la fonction amino, mono ou divalent.
11. Méthode pour la synthèse en phase solide d'oligonucléotides par la méthode aux phosphoramidites, aux phosphites, aux phosphodiesters et aux phosphotriesters, caractérisée en ce que l'on utilise des supports de formule (I)tels que définis dans la revendication 1, 2 ou 7.
12. Méthode pour la synthèse en phase solide d'oligonucléotides par la méthode aux phosphotriesters, ca-ractérisée en ce que l'on condense un désoxynucléotide ac-tivé sur support de formule(I)tels que définis dans la re-vendication 1, 2 ou 7, procède à l'allongement de la chaîne désoxyoligonucléotidique puis sépare et isole la chaîne oligonucléotidique du support de formule (I).
13. Désoxyribonucléosides ou ribonucléosides sur supports de formule (I) tels que définis dans la revendica-tion 1, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule:
formule (I) dans laquelle ledit support de formule (I) où ? , m, A, x et x1 sont tels que définis dans la revendication 1, est relié à
un ribonucléoside ou un désoxyribonucléoside, soit en 3', soit en 5', par l'intermédiaire d'un groupement , Z étant un groupement hydrocarboné renfermant de 2 à 20 atomes de car-bone, ou un groupement phényle, la fonction hydroxyle étant non-protégée ou protégée soit en 3', soit en 5', et dans laquelle A' est soit un atome d'hydrogène si le support de formule (I) est relié à un désoxyribonucléoside, soit OR1 si le support de formule (I) est relié à un ribonucléo-side, R1 étant soit un atome d'hydrogène, soit un groupement protecteur usuel de la fonction hydroxyle, B1 est un base purique ou pyrimidique dont la fonction amine est non-protégée ou protégée.
formule (I) dans laquelle ledit support de formule (I) où ? , m, A, x et x1 sont tels que définis dans la revendication 1, est relié à
un ribonucléoside ou un désoxyribonucléoside, soit en 3', soit en 5', par l'intermédiaire d'un groupement , Z étant un groupement hydrocarboné renfermant de 2 à 20 atomes de car-bone, ou un groupement phényle, la fonction hydroxyle étant non-protégée ou protégée soit en 3', soit en 5', et dans laquelle A' est soit un atome d'hydrogène si le support de formule (I) est relié à un désoxyribonucléoside, soit OR1 si le support de formule (I) est relié à un ribonucléo-side, R1 étant soit un atome d'hydrogène, soit un groupement protecteur usuel de la fonction hydroxyle, B1 est un base purique ou pyrimidique dont la fonction amine est non-protégée ou protégée.
14. Désoxyribonucléosides tels que définis dans la revendication 13, de formule:
formule (I) dans laquelle le support de formule (I)où ? , A, m, x et x1 sont tels que définis dans la revendication 13,est relié à un désoxyribo-nucléoside en 3' par l'intermediaire d'un groupement , dans lequel Z est un groupement hydrocarboné
renfermant de 2 à 20 atomes de carbone ou un groupement phényle et la fonction hydroxyle en 5' est non-protégée ou protégée par un groupement protecteur R2 usuel, B1 est une base purique ou pyrimidique, dont la fonction amine est non-protégée ou protégée.
formule (I) dans laquelle le support de formule (I)où ? , A, m, x et x1 sont tels que définis dans la revendication 13,est relié à un désoxyribo-nucléoside en 3' par l'intermediaire d'un groupement , dans lequel Z est un groupement hydrocarboné
renfermant de 2 à 20 atomes de carbone ou un groupement phényle et la fonction hydroxyle en 5' est non-protégée ou protégée par un groupement protecteur R2 usuel, B1 est une base purique ou pyrimidique, dont la fonction amine est non-protégée ou protégée.
15. Oligodésoxyribonucléotides ou oligoribonucléo-tides sur des supports de formule (I) tels que définis dans la revendication 1, pour lesquels le nucléoside est attaché soit en 3', soit en 5', au support de formule (I), caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule suivante:
formule (I) dans laquelle ?, A, m, x et x1 sont définis comme dans la re-vendication 1, Z représente un groupement hydrocarboné renfermant de 2 à
20 atomes de carbone ou un groupement phényle, A' est soit un atome d'hydrogène si le support de formule (I) est relié à un désoxyribonucléoside, soit OR1 si le support de formule (I) est relié à un ribonucléoside, R1 étant soit un atome d'hydrogène, soit un groupement protecteur usuel de la fonction hydroxyle, B1 est une base purique ou pyrimidique dont la fonction amine est non-protégée ou protégée, ledit nucléoside étant lui-même relié par des liaisons phosphodiesters ou triesters du type:
dans lesquelles R3 est soit un atome d'hydrogène, soit un grou-pement protecteur, à d'autres nucléotides portant les bases B2, .... B(y-1), jusqu'au dernier nucléoside de formule:
By étant la dernière base de l'oligodésoxy ou oligoribonucléo-tide, la fonction hydroxyle du dernier nucléoside en 5' ou en 3' étant non-protégée ou protégée et les différentes bases pu-riques ou pyrimidiques ayant leurs fonction amines non-protégées ou protégées.
formule (I) dans laquelle ?, A, m, x et x1 sont définis comme dans la re-vendication 1, Z représente un groupement hydrocarboné renfermant de 2 à
20 atomes de carbone ou un groupement phényle, A' est soit un atome d'hydrogène si le support de formule (I) est relié à un désoxyribonucléoside, soit OR1 si le support de formule (I) est relié à un ribonucléoside, R1 étant soit un atome d'hydrogène, soit un groupement protecteur usuel de la fonction hydroxyle, B1 est une base purique ou pyrimidique dont la fonction amine est non-protégée ou protégée, ledit nucléoside étant lui-même relié par des liaisons phosphodiesters ou triesters du type:
dans lesquelles R3 est soit un atome d'hydrogène, soit un grou-pement protecteur, à d'autres nucléotides portant les bases B2, .... B(y-1), jusqu'au dernier nucléoside de formule:
By étant la dernière base de l'oligodésoxy ou oligoribonucléo-tide, la fonction hydroxyle du dernier nucléoside en 5' ou en 3' étant non-protégée ou protégée et les différentes bases pu-riques ou pyrimidiques ayant leurs fonction amines non-protégées ou protégées.
16. Oligodésoxyribonucléotides tels que définis à
la revendication 15, caractérisé en ce qu'ils répondent à la formule:
dans laquelle ? , A, m, x, z, et B1 à By sont tels que défi-nis dans la revendication 15, le support de formule (I) est relié en 3' à un oligodésoxyribonucléotide portant des bases B1, B2-----By et dans laquelle R2 est soit un atome d'hydrogène, soit un groupement protecteur, R3 est soit un atome d'hydrogène, soit un groupement protecteur, les bases puriques ou pyrimidi-ques ayant les fonctions amines non-protégées ou protégées.
la revendication 15, caractérisé en ce qu'ils répondent à la formule:
dans laquelle ? , A, m, x, z, et B1 à By sont tels que défi-nis dans la revendication 15, le support de formule (I) est relié en 3' à un oligodésoxyribonucléotide portant des bases B1, B2-----By et dans laquelle R2 est soit un atome d'hydrogène, soit un groupement protecteur, R3 est soit un atome d'hydrogène, soit un groupement protecteur, les bases puriques ou pyrimidi-ques ayant les fonctions amines non-protégées ou protégées.
17. Désoxyribonucléosides ou ribonucléosides sur supports tels que définis dans la revendication 13 ou 14, ca-ractérisés en ce que Z est le radical -(CH2?2.
18. Oligodésoxyribonucléotides ou oligoribonucléo-tides sur supports tels que définis dans la revendication 15 ou 16, caractérisés en ce que Z est le radical -(CH2?2.
19. Méthode pour la mise en oeuvre de synthèses peptidiques, caractérisée en ce que l'on utilise des supports de formule (I) tels que définis dans la revendication 1, 2 ou 7.
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