CA2126356C - Serum-albumine humaine, preparation et utilisation - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une préparation de sé- rum-albumine humaine ayant un indice de colorimétrie infé- rieur à 0,2, résultant de l'expression, dans un hôte eucaryote ou procaryote, d'une séquence d'ADN exogène.

Description

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_ ~1~635~i La présente invention concerne une prêparatian de sérum-albumine humaine, un procédé pour son obtentïon, et ses utilisations.
La sérum-albumine humaine (SAH) est une protéine monomérique non s glycosylêe de 585 acides aminés, d'un poids moléculaire de 66 KD. Sa structure globulaire est maintenue par 17 ponts disulfures qui créent une série séquentielle de 9 boucles doubles (Brown, J.R., "Albumin Structure, Fonction and Uses", Rosenoer, V.M. et al. (edsJ Pergamon Press, Oxford, (1977) 27-51). Les gènes codant pour la SAH sont connus pour être hautement polymorphes, et plus de 30 variants génétiques 1o apparemment différents ont été repérés par analyse électrophorétique dans des conditions variëes (Weitkarnp, L.R. et al., Ann. Hum. Genet. ~ (1973) 219-226). Le gène de la SAH est coupé en 15 exons par 14 séquences introniques et comprend 961 nucléotides, du site de "capping"~ supposé jusqu'au premier site d'addition de poly(A).
15 L'albumine humaine est synthétisée dans les hépatocytes du foie, puis sécrétée dans le flux sanguin. Cette synthèse conduit dans un premier temps à
un pt~urseur, la prépro-SAH, qui contient une séquence signal de 18 acides aminés dirigeant le polypeptide naissant dans la voie de sécrétion.
La SAH est la protéine la plus abondante du sang; avec une concentration 2o d'environ 40 g par litre de sérum. 11 y a donc environ 160 g d'albumine circulante dans le corps humain à tout moment. Le rôle le phis important de la SAH est de maintenir une osmolarité normale du flux sanguin. Elle présente également une capacité exceptionnelle de liaison pour diverses substances et joue un rôle aussi bien dans le transport endogêne de molécules hydrophobes (tels que les stéroïdes et les 2s sels biliaires) que dans celui de différentes substances thérapeutiques qui peuvent ainsi être transportées à leurs sites d'action respectifs. De plus, la SAH a été
recemment impliquée dans le catabolisme des prostaglandines.
La SAH représente 40 % du marché mondial des protéines plasmatiques.
Son intérêt commercial reside dans le fait que ce produit est largement utilisé, par 30 exemple dans des solutés dits de remplissage pour compenser les pertes de sang au cours d'actes chirurgicaux, d'accidents ou d'hémorragies, et à des doses pouvant .....
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W0 93/15204 P~,'T/FR93/00072 atteindre plusieurs dizaines de grammes par jour et par individu.
Actuellement, la consommation annuelle de SAH peut être estimée à plus de 300 tonnes.
Jusqu'à prësent, la SAH disponible sur le marché est produite par purification à partir de matëriel biologique d'origine humaine. En particulier, elle est obtenue par les techniques classiques de fractionnement du plasma provenant de dons de sang (Cohn et al., J. Am. Chem. Soc. ~$, (1946) 459 pp), ou par extraction à partir du placenta humain, selon la technique décrite par J. Liautaud et al. (l3ème Congès International d'IABS, Budapest; A: "Purification of proteins. Development of biological standard", Karger (ed.), Bale, ~ (1973) 107 pp).
1o Le développement du génie génétique et des nouvelles techniques d'extraction et de purification a ouvert la possibilité d'obtenir, à un prïx de revient plus faible, des produits améliorés de plus haute pureté, de meilleure stabilité et sans risque de contamination virale (par exemple hépatite B et SIDA). Compte tenu de l'ïmportance du marché de la SAH, la possibilité de produire cette protéine par voie recombinante a été largement étudiée. Ainsi, de nombreux systèmes d'expression ont été ëtudiës pour la préparation de la SAH recombinante.
. Plus particulièrement, en ce qui concerne les hôtes bactériens, les premières expériences de gënie génétique ont utilisé la bactérie E.çoli comme organisme hôte.
Ainsi, les brevets européens EP 236 210, EP 200 590, EP 198 745, ou EP 1 929 dëcrivent des procédés de production de la SAH chez ~ en utilisant différents vecteurs d'exprPSSion, différents promoteurs transcriptionnels, et différents signaux de sécrétion. Par la suite, des travaux concernant la sécrétion de la SAH dans ,~acillus dont également été realisés, même si les niveaux d'albumine obtenus dans ce système ne semblent pas encore satisfaisants (Saunders et al., J. Bacteriol. ~
(1987) 2917).
En ce qui concerne les hôtes eucaryotes, des procédés pour la production de la SAH ont été mis au point en utilisant des levures comme organisme hôte.
Ainsi, la sëcrétion de la SAH dirigée par son propre peptide signal sous le contrôle du promoteur de la chélatine a pu être mise en évidence dans S.cerevisiae (Etcheverry et 3o al., BiorTechnology 4_ (1986) 726). La production de la SAH a également été
mentionnée dans la levure de brasserie lors de la fabrication de la bière, en utilisant un procédé post-fermentaire (EP 201239). Plus récemment, la demande de brevet irP
361 991 décrit un système particulièrement performant utilisant la levure WO 93/15204 ' 212 6 ~ 5 s P~T/FR93/00072 Klvyy~mvces comme organisme hôte, transformée avec des vecteurs dérivés du plasmide pKDl. Des niveaux particulièrement élevés de SAH sécrétée dans le milïeu de culture ont pu être obtenus avec ce système. Enfin, la production de SAhI
recombinante a également été décrite dans . (EP' 344 459). En outre, la purification de la SAH a également fait (objet de nombreuses études (EP 319 067).
Pourtant, en dépit des efforts importants consacrés à (obtention de la SAH
par voie recombinante, ce produit n'est pas encore présent sur le marché. Ceci est lié
à la difficulté de mettre au point un procédé assez performant basé sur le génie génétique, permettant d'obtenir, à l'échelle industrielle et dans des conditions 1o économiquement rentables une SAH utilïsable au niveau pharmaceutique. En particulier, si les questions de productivité semblent à peu près résolues (production à
des niveaux élevés d'une albumine sécrétée, correctement maturée, et possédant une structure tertiaire conforme à celle de la sérum-albumine humaine native), les procédés décrits dans l'art antérieur ne permettent pas d'obtenir une SAH
utilisable au niveau pharmaceutique. Il est en effet indispensable que la SAH produite soit conforme à oenaines normes qualitatives. En particulier, compte tenu de son usage pharmaceutique, la SAH reeombinante doit posséder les propriétés physico-chüniques de l'albumine native et respeçter certains critères d'homogénéité, de pureté, et de stabilité. Ainsi, la pharmacopée fixe un certain nombre de paramètres pour les 2o solutions d'albumine plasmatique, à savoir une valeur de pH, une teneur en protéines.
une teneur en polymères et agrégats, une teneur en phosphàtase alcaline, en potassium, en sodium et une certaine composition en protéines. Elle impose de plus une certaine absorbante, la conformité à un test de stérilité, à un essai de pyrogènes et de toxicité (voir "Albumini humani solutio" pharmacopée Européenne (1984) 255).
L'un des problèmes majeurs des procédés de l'art antérieur faisant appel aux techniques du génie génétique, est qu'ils génèrent une SAH recombinante colorée. Ce phénomène est tout particulièrement important dans le cas de systèmes permettant (expression et la sécrétion de la SAH recombinante dans le milieu de culture.
A cet égard, les exemples B1 et B2 de la présente demande illustrent le problème de la 3o coloration dans le cas d'un système d'expression mettant en oeuvre, dans les conditions de l'art antérieur, une levure comme organisme hôte. L'exemple Bl n'est pas restrictif mais illustre un phénomène de coloration qui a été observé pour toutes les souches testées, quel que soit le mode de fermentation adopté (fed-batch, batch, continu). Par ailleurs, en dépit des efforts nombreux effectués dans ce but, cette ""'ç
~1~63~6 coloration n'a jamais pu être ëliminée par purification (voir exemple B2).
Dans ces conditions, il n'a jamais été décrit dans fart antérieur de SAH produite par voie recombinante, qui soit dépourvue de cette coloration. Or la présence de cette coloration constitue un obstacle à (exploitation pharmaceutique de la SAH
recombinante. En effet, les produits ainsi obtenus sont hétérogènes puisqu'ils comprennent les composants responsables de la coloration. De plus, leur composition est indéfinie puisque la coloration peut varier d'une préparation à une autre et que fart antërieur ne permet pas de contrôler cette coloration. Dans ces conditions, il est très difficile de définir un procédé reproductible, permettant d'obtenir à chaque fois des 1o préparations identiques de SAH recombinante. Enfin, en raison de la prësence des composants responsables de la colocation, la SAH recombinante de l'art antérieur est potentiellement immunogène.
L'un des aspects de l'invention est de fournir une préparation de SAH
recombinante de bonne qualité, possédant les propriétés de la SAH
d'extraction, et utilisable dans le domaine pharmaceutique.
En particulier, un aspect de (invention est de fournir une préparation de SAH recombinante possédant, après purification par les méthodes connues (concentration, précipitation, chromatographies, etc), un indice de colorimétrie inférieur à 0,2. Au sens de la présente invention, on entend par indice de colorimétrie le rapport de l'absorbance à 300 nm sur fabsorbance à 280 nm (i =,D03oo /
D028o).
Ce rapport caractérise particulièrement bien la colorimétrie de la SAH
puisqu'il reflète, pour une solution donnée, son absorbance indépendemment de sa concentration.
Un objectif de l'invention est de permettre l'obtention en quantités industrielles et à un niveau économiquement rentable d'une préparation de SAH
recombinante utilisable pharmaceutiquement.
La demanderesse a maintenant montré qu'il est possible d'obtenir une solution de SAH non colorée en quantités industrielles par voie recombinante.
La _ présente invention repose sur la mise en évidence que la qualité de la SAH
produite 3o n'est pas uniquement liée à l'hôte ou au vecteur choisi, ou au procédé de purification de la SAH à partir du milieu, mais en grande partie à la composition même du milieu de production. Ainsi, en modifiant notamment les sources carbonées et les conditions WO 93/15204 _ 212 6 3 ~ ~ PC1'/FR93/00072 de préparation du milieu de production, des solutions de SAH recombinante possédant un indice de colorimétrie inférieur à 0,2 ont pu être obtenues.
Un premier objet de l'invention réside donc dans une sérum-albumine humaine caractérisée en ce qu'elle possède un indice de colorimétrie inférieur à 0,2 et 5 en ce qu'elle résulte de l'expression dans un hôte eucaryote ou procaryote d'une séquence d'ADN exogène.
La présente invention fournit pour la première fois une SAH recombinante ayant un indice de colorimétrie inférieur à 0,2. Elle fournit ainsi une SAH
recombinante utilisable dans le domaine pharmaceutique, avec des risques très faibles 1o de ~actïons immunogènes. De plus, par rapport à la SAH plasmatique, la SAH
de l'invention offre (avantage d'être homogène et de composition parfaitement définie.
En effet, en raison de son polymorphisme, de nombreux variants de la SAH
existent.
Ainsi, parmi ceux qui ont été identifiés, certains variants conservent un peptide pro substitué (Brennen et Carrell, Nature ~ (1978) 9U8; Galliano et al., Rev. Fr.
i5 Transfos. Immuno-Hématol. ~ (1984) 59?), d'autres possèdent des mutations ponctuelles (Winter et al., Biochemistry ~1 (1972) 889; Franklin et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA ~"l (1980) 2505; Brennan. Biochim.Biophys.Acta $~Q
(1985) 320; Calliano et al., Protides Bioi. Fluids Proc. Colloq. ~4 (1986) 815;
Takahashi et al., J. Chromatogr. ~Q (1986) 181) ou des délétions au niveau de 20 l'extrémité C-terminale (Galliano et al., J. Biol. Chem. ,~ (1986) 4283).
De plus, nombreux sont les variants dont les changements structuraux n'ont pas été
identifiés.
De ce fait, la SAH plasmatique obtenue par extraction de matériel biologique issu d'un très grand nombre de donneurs humains renferme potentiellement tous les variants de la SAH résultant de son polymorphisme. La presente invention fournit 25 une SAH homogène et définie, en raison de sa préparation par voie génétique, par expression d'une ou plusïeurs séquences d'ADN identifiées.
Préférentiellement, la SAH de la présente invention possède un indice de colorimétrie inférieur à 0,15.
Encore plus préférentiellement, la SAN de la présente invention possède un 3o indice de colorimétrie inférieur à 0,1.
D'autres caractëristiques physico-chimiques de la SAH de la présente invention sont données dans l'exemple B5, à savoir notamment son spectre de _. ~ . ".: ,.,,~,.:~. . .~,v.~ ~'~: .,,.'. ~ r . '..~~ .; ,.. . .:.. , .;,,, .~~~3~ 6 fluorescence. L'ensemble de ces paramètres témoigne de la qualité de la SAH de l'invention.
Au sens de la présente invention, on entend par séquence d'ADN exogène toute séquence d'ADN introduite artificiellement dans l'hôte utilisé et codant pour la SAH. En particulier, il peut s'agir, selon (hôte, de séquences génomiques, d'ADNc, de séquences hybrides, etc. Pour une meilleure mise en oeuvre de (invention, on préfère cependant utilis; r un ADNc. De telles séquences ont déjà été décrites dans l'art antérieur (Cf notamment EP 361 991 et Dugaiczyk et al., J. Supramol.
Struct. &
Cell Biochem., Suppl. 5 (1981)). Par ailleurs, cet ADN exogène comprend 1o généralement une région de démarrage de ~1a transcription et de la traduction jointe à
(extrémité 5' terminale de la séquence codante, de façon à diriger et à
réguler la transcription et la traduction de ladite séquence. Le choix de ces régions promotrices peut varier en fonction de (hôte utilisé.
Dans le cadre de la présente invention, l'ADN exogène fait préférentiellement partie d'un vecteur, qui peut être à rëplication autonome ou intégratif. Plus particulièrement, des vecteurs à réplication autonome peuvent être préparés en utïlisant des sëquences à réplication autonome chez (hôte choisi.
A titre d'exemple, chez la levure, il peut s'agir d'origines de réplication dérivées de plasmides : pKDI (EP 241 435), 2,N. (Beggs, Nature ~ 57 (1978) 104-109), etc;
ou bien de séquences chromosomiques (ARS). S'agissant des vecteurs.intégratifs, ceux ci peuvent ëtre pc~éparés par exemple en utilis<1nt des séquences homologues à
certaines régions du génome de l'hôte, permettant, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur. A cet égard, (utilisation d'ADNr permet une intégration multiple de 1°ADN exogène, et donc sa présence en plus grand nombre de copies par cellules.
Dans un mode prëféré, la SAH de l'invention rësulte de l'expression dans un hôte eucaryote ou procaryote d'une séquence d'ADN exogène et de la sécrétion du produit d'expression de ladite séquence dans le milieu de culture. I1 est en effet particulièrement avantageux de pouvoir obtenir par voie recombinante une SAH
de qualité pharmaceutique directement dans le milieu de culture. Dans ce cas, la séquence d'ADN exogène comprend, en amont de la séquence codant pour la SAH, ou, le cas ëchéant, entre la région de démarrage de la transcription et de la traduction et la séquence codante, une séquence "leader" dirigeant la protéine naissante dans les .~,y r , ~ay . a . _ .i~ :r;x~ . ~' _ ,.;~
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W0 93/15204 , 212 ~ 3 ~ ~ PCT/FR93/00072 voies de sécrétion de l'hôte utilisé. Cette séquence "leader" peut être la séquence "leader" naturelle de la SAH, mais il peut également s'agir d'une séquence hétérologue (issue d'un gène codant pour une autre protéine) ou même artificielle. Le choix de l'une de ces séquences est notamment guidé par (hôte utilisé. A titre d'exemple, lorsque l'hôte utilisé est une levure, il est possible d'utiliser comme séquence "leader" hétërologue celle de la phéromone facteur a, de l'invertase ou de la phosphatase acide.
Parmi les hôtes eucaryotes utilisables dans le cadre de 'la prësente invention, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre ~ç
m,~, ~'c~ hia , ~çjom~ces, ou ~. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, C127, etc. Parmi les champignons susceptibles d'être utilisës dans la présente invention, on peut citer plus particulièrement ~~~ ssp. ou ~ ssp.
Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes ~,ç~, Bacilius, ou Streptomvces.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de préparation de SAH
ayant un indice de colorimétrie inférieur à 0.2 selon lequel on realise les étapes suivantes - dans une première étape, on introduit dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote un ADN exogène codant pour la sérum-albumine -humaine sous contrôle de signaux de transcription et de traduction appropriés à l'hôte utilisë, - dans une deuxième ëtape, on cultive la cellule ainsi obtenue dans un milieu de composition définie contenant au moins une source carbonée choisie parmi les alcools, les sucres non-réducteurs, les acides organiques ou les dérivés du glucose substitués sur l'oxygène du carbone C4; ou dans un milieu préparê de façon à
éliminer ou à limiter la formation d'impuretés de type aldéhydique, et, - dans une troisième étape, on récupère la SAH produite.
Plus particulièrement, lors de la première étape du procédé de l'invention, l'ADN exogène peut être introduit dans la cellule hôte par différentes techniques.
Notamment, l'introduction. peut être effectuée par transformation, conjugaison, ou électroporation.

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y S'agissant de la transformation, diffërents protocoles ont été dëanits dans l'art antérieur. En particulier, elle peut être réalisée en traitant les cellules entières en pc~ésence d'acétate de lithium et de polyéthylène glycol selon la technique dëcrite par Ito et al. (J. Bacteriol. ,~ (1983) 163-168), ou en présence d'éthylène glycol et de diméthylsulfoxyde selon la techniqvè de Durnens et al. (Curr. Genet. 1,$
(1990) 7).
Un protocole alternatif a également été décrit dans la demande de brevet EP
361991.
Plus spécifiquement, pour les cellules procaryotes, la transformation peut être effectuée selon la technique décrite par Dagert at al. (Gene ~ (1979) 23-28) par traitement avec une solution de CaCl2 puis choc thermique. Pour les cellules animales, elle peut également être réalisëe par la technique au phosphate de calcium selon Haynes (Nucleic Acids Res., l l (1983) 687-706).
S'agissant d'électroporation, la technique décrite par Karube et al. (F'EBS
Letters 182 (1985) 90) peut avantageusement être utilisée.
Le choix de l'une ou de (autre de ces méthodes est établi notamment en fonction de (hôte choisi et de (ADN exogène utilisé.
Parmi les hôtes eucaryotes utilisables dans le procëdé de l'invention, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons qui ont été
mentionnés ci-avant. Parmi les hôtes procaryotes, on peut utiliser toute bactérie définie plus haut.
2o Dans un mode préfére de l'invention, le procédé est mis en oeuvre en utilisant comme cellule hôte une cellule eucaryote.
Encore plus .préférentiellement, le procédé de l'invention est mis en oeuvre .en utilisant comme cellule hôte une levure.
L'ADN exogène codant pour la SAH utilisable dans le pcncédé est défini comme précédemment. Préférentiellement, il s'agit d'un ADNc, d'un ADN
génomique ou d'un ADN hybride. Pour une meilleure mise en oeuvre de (invention, on prêfère cèpendant utiliser un ADNc. Par ailleurs, cet ADN exogène comprend généralement une région de démarrage de la transcription et de la traduction jointe à
l'extrëmité 5' terminale de la séquence codante, de façon à diriger et à
réguler la 3o transcription et la traduction de ladite séquence. Le choix de cette région peut varier en fonction de l'hôte utilisé.
Dans un mode particulièrement avantageux de (invention, l'ADN exogène comprend, en amont de la séquence codant pour la SAH mature, une séquence

2 6 ~ ~ ~ PCi'/FR93/00072 "leader" dirigeant la protéine naissante dans les voies de sécrétion de l'hôte utilisé. De telles séquences ont été définies plus haut. Par ailleurs, dans le cadre de la prêsente invention, l'ADN exogène fait préfëc~entiellement partie d'un vecteur, qui peut être à
réplication autonome ou intégratif, tel qu'indiqué plus haut.
Dans un mode préféré de l'invention, le procédé de production est caractérisé
en ce que la SAH est sécrétée dans le milieu de culture. Il est en effet particulièrement avantageux de pouvoir obtenir par voie recombinante une SAH
de qualité pharmaceutique directement dans le milieu de culture.
La seconde étape du procédé de l'invention consiste à cultiver les cellules 1o recombinées dans des conditions permettant l'expression de la séquence d'ADN
exogène codant pour la SAH. Cette étape est particulièremem importante puisqu'elle influence directement la quantité et la qualité de la SAH produite. La présente invention décrit pour la première fois des conditions de culture permettant la production d'une sérum-albumine de qualité pharmaceutique.
Parmi les alcools utilisables dans le procédé de l'invention, on peut citer Imëféc~entiellement les alcools simples comportant au moins 2 atomes de carbone (éthanol, ete), ou les polyalcools (glycérol, sorbitol, etc). Comme sucres non réducteurs, on peut citer par exemple le saccharose, et comme acides organiques les acétates ou les lactates. Les dérivés du glucose utilisables dans la présente invention 2o répondent plus précisément à ia formule suivante CH~OH
OH
OH
RO
OH
dans laquelle R est différent de l'hydrogène. A titre d'exemple on peut citer les disaccharides, et de préférence les disaceharides présentant une liaison osidique de type 1-4 tels que le maltose, le cellobiose, ou le lactose.
II est entendu que le choix de l'un ou de plusieurs de ces composés est guidé
par l'hôte utilisé. Toutefois, il est également possible de modifier un hôte pour le rendre capable d'assimiler une source carbonée préférée.
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'a, Ces différentes sources carbonées peuvent être utilisées séparément ou en association. Par exemple, l'association d'un dérivé du glucose et d'un alcool donne de treks bons resultats. De même, l'association d'un alcool simple et d'un polyalcool donne également une albumine de très haute qualité. En outre, un résultat inattendu est que ce type d'association permet également, dans certains cas, d'augmenter les niveaux de production de la SAH, et donc d'améliorer les rendements du pré de fabrication.
Le procédé de l'invention peut égàlement être mis en oeuvre dans un milieu 1 o préparé de façon à éliminer ou à limiter la formation d'impuretés de type aldéhydiques. Ce type de préparation est généralement inutile lorsque l'on utilise, dans un milieu de composition définie, une ou plusieurs des sources carbonëes énoncées ci-avant. Différents moyens peuvent être employês pour limiter la formation de telles impuretés, dont Ie choix dépend du milieu (nature de la source carbonée) et de l'hôte considérés. A titre d'exemple, il peut être avantageux de stériliser la source carbonée à froid (par exemple par filtration comme illustré dans l'exemple B4).
La troisième étape de l'invention permet d'extraire du milieu de culture Ia SAH produite. Dans le cas où la SAH est sécrêtée dans le 'milieu par les cellules recombinées, cette extraction peut se faire directement à partir du surnagéant de 2 o culture obtenu par centrifugation. Dans le cas où la SAH n'est pas sëcretêe, il est nécessaire, prealablement à l'extraction, de casser les cellules en culture afin de libérer la SAH qu'elles contiennent. Cette étape préalable peut être réalisée par différents moyens physiques ou physico-chimiques (sonication, broyage, choc osmotique, choc thermique, etc).
L'extraction peut être réalisée par différentes techniques connues de l'homme du métier et décrites dans la littérature. Généralement, ces techniques font appel à des étapes de concentration, de précipitation et de chromatographie. Certaines de ces différentes techniques sont illustrées dans les exemples.
Un autre objet concerne un extrait d'un milieu de 30 culture d'une levure du genre Kluyveromyces pour la production de la sérum-albumine humaine (SAH). Ce milieu de culture est caractérisé en ce que:

v9 r 10a - il comprend de la sérum-albumine humaine (SAH) recombinante sécrétée par une levure du genre Kluyveromyces, cette SAH recombinante ayant, une fois purifiée, un indice de colorimétrie inférieur à 0.2;
et - il est substantiellement exempt d'impuretés de type aldéhydique produites par la levure.
L'invention concerne également une méthode pour inhiber la coloration de sérum-albumine humaine (SAH) recombinante produite par une. levure du genre Kluyveromyces, la mëthode étant caractérisée en ce que cette levure est cultivëe dans un milieu de culture tel que défini précédemment.
Un autre objet de la présente invention oencerne un milieu de culture pour la production de la sérum-albumine humaine (SAH) recombinante par une levure du genre Kluyveromyces, ledit milieu de culture étant exempt d'adsorbant capable de capter des impuretés de type aldéhydique produites par ladite levure, ledit milieu de culture comprenant au moins une source carbonêe choisie parmi les alcools, les sucres non-rêducteurs, les acides organiques et les dérivês du glucose substitués sur l'oxygène du carbone C4, ladite au moins une source carbonée éliminant ou limitant la production d'impuretés de type aldéhydique par ladite levure mais permettant la production d'une SAH recombinante ayant, une fois purifiée, un indice de colorimétrie inférieur à 0,2.
Enfin, un autre objet concerne toute composition pharmaceutique comprenant de la sérum-albumine humaine (SAH) telle que décrite prêcédemment, et plus particu 10b lièrement de la SAH recombinante purifiée à partir d'un extrait de milieu de culture tel que dêfini précédemment.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

2m6~5s LEGENDE DES FIGURES
Consynictïon du promoteur hybride PGK/GAL. P = promoteur; UAS =
"Upstream Act:v 3ting Sequence".
s Fig,~r_~ . Stratégie de construction et représentation du vecteur pYG401.
P = promoteur; T = Terminateur de transcription; ~ = gène confërant la résistance à
l'ampicilline; ,~, = gène conférant la résistance à la génëticine (G418).
Fil : Construction et représentation du plasmide pP4-33.
figure 4 : Construction et reprësentation du plasmide pYG65.
,~ : Construction et représentation du plasmide pYG70.
Construction et représentation du plasmide pYG72 Figure 7 : Construction et repre"sentation du plasmidepYG4040HindIII.
Fi dure 8 : Construction et représentation du plasmide pYG 128.
'~ j~r : Construction et représentation des plasmides pYG 131 et pYG 132.
Fi u~rg e 10 : Carte de restriction du plasmide pYG600, bla = gène de la &lactamase confërant la résistance à l'ampicilline.
~j,g~~ : Stratégie de construction du plasmide pYG70-2. aph = gène de la 3'-aminoglycoside phosphotransférase conférant la resistance à la généticine (G418);
prom = promoteur; IR = séquence rëpëtée inversée; ORI = origine de réplication;
LacZ' = gène de structure de la &galactosidase. Les sites marqués d'une (*) possèdent des extrêmités compatibles avec les sites correspondants sans reconstituer, après ligation, de sites de coupure reconnus par lesdites enzymes.
Fi ~gu,~~e 12 : Séquence des oligodësoxynucléotides de synthèse A-F ayant servi à la construction des adaptateurs 1 à 3.
F r~ e 13 : Stratégie de construction du plasmide pYG70-3. Pour la légende, voir figure 11. terrn = terminateur : Stratégie de construction du plasmide pYG1003. Pour la légende, voir figure 11.
rg~ : Stratégie de construction du plasmide pYG 1023. Pour la légende, voir 3o figure 11.
Fi~,res l6 et 17 : Spectres UV de diffërentes préparations d'albumine : Figure (1) albumine BC~7S9 des exemple Bl et B2; (2) albumine BCQ804LE de l'exemple B5; (3) albumine témoin (IM). Figure 17 : albumine BCQ835GE de l'exemple B5.
~i_gures 18 et 19 : Spectres de fluorescence de différentes préparations d'albumine à
430 nm (figure 18) et 360 nm (figure 19).

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TECHNIQUES GENERALES DE CLONAGE
Les mëthodes classiques de biologie moléculaire telles que la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlonue de césium - bromure d'éthidium, la digestion par les enzymes de restriction, félectrophorèse sur gel, l'électroélution des fragments d'ADN à partir de gels d'agarose, la transformation dans ~, etc, sont décrites dans la littérature (Maniatis et al., "Molecular Cloning : a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986;
Ausubel 1o et al., (eds.), "Cutrent Protocols in Molecular Biology". John Wiley &
Sons, New York 1987).
La mutagënèse dirigée in vitro par oligodésoxynucléotides est effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. (Nucleic Acids Res. ~ (1985) 8764) en utilisant le kit distribué par Amecsham. Le séquençage de nucléotides est rëalisé selon la technique des didéoxy décrite par Sanger et al. (Proc. Natl.
Acad.
Sri. USA, ~ (I9?7) 5463-5467). L'amplification enzymatique de fragments d'ADN
spécifiques est effectuée par réaction de PCR ("Polymerase-catalyzed Chain Reaction") dans les conditions décrites par Mollis et Faloona (Mette. Enzym., ~
(1987) 335-350) et Saiki et al (Science ~Q (1985) 1350-1354), en utilisant un "DNA
2o thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) en suivant les recommandations du fabricant.
EXEMPLES
A - Construction de vecteurs d'expression de la sérum-albumine humaine 1. Construction d'un vecteur d'expression de SAH sous contrble d'un promoteur hybride PGKJGAL : piasmide pYG401.
Un vecteur d'expression de la sérum-albumine humaine a été préparé à
partir du plasmide pYGl9 (EP 361 991). Ce dernier comprend les éléments suivants:
- la séquence du plasmide pKDl, qui fait de pYGl9 un plasmide à copies multiples, stable, et capable de se répliquer chez les levures du genre j luyveromv~es (EP 361 991), - une cassette d'expression de la sérum-albumine humaine comportant le gène de structure codant pour la forme prépro sous contrôle du promoteur du gène de S.cerevisiae;

WO 93/1521)4 , 212 6 3 5 ~ P~/~93/00072 - un réplicon et un marqueur de sélection (gène l~ conférant la résistance à (ampicilline) bactériens; et, - le gène ~1 conférant la résistance au 6418 à la levure.
Le vecteur pYG401 a été construit à partir du plasmide pYGl9 par modification au niveau de la cassette d'expression de la sérum-albumine humaine.
Dans pYG401, le gène de l'albumine n'est plus sous contrôle du promoteur du gène ~ de ~~lg, mais sous contrôle d'un promoteur hybride entre les promoteurs des gènes ~ et ~1/~ de ~. Ce promoteur hybride a ëtë obtenu en remplaçant la région UAS ("Upstream Activating Sequence" ) du 1o promoteur PGK (Stanway et al., Nucl.Acid.Res. ~ (1987) 6855) par la région UAS
du promoteur GALl/GAL10 (Johnston et Davies, Mol.Cell.Biol. 4 (1984) 1440;
West et al., MoI.CeII.Biol. 4_ (1984) 2467).
Ce promoteur hybride a ëtë construit de la manière suivante (Cf figure 1) L'obtention du plasmide pYG29 a été décrite en dêtail dans la demande EP361991: Ce plasmide comporte le promoteur du gène p,~,~ de S.çgrevisiae isolé â
partir du plasmide pYGl9 sous forme d'un fragment Sali-HindIII, et cloné dans le bactériophage M13mp18. Il a ensuite été modifié par mutagénèse dirigée pour introduire les sites de restriction suivants 1 site HindIII supplémentaire en position -25 par rapport à l'ATG.
2o L'introduction de ce site permet de c~estaurer après les différentes étapes de clonage, une région nucléotidique proche de l'ATG identique à la région native du promoteur PGK. L'environnement du codon ATG est en effet connu pour influencer de manière sensible l'efficacité de (initiation de la traduction des gènes eucaryotes (Kozak, M., Microbiol. Rev. 47 (1983) 1-45: Hamilton, R., Nucl.Acid.Res 15 (1987) 3581-3593).
- 2 sites NotI de part et d'autre de la région UAS.
L'UAS du promoteur GALl/GAL10 a été isolée à partir du plasmide pGl décrit par Miyajima et al. (Nucl. Acid. Res 12 (1984) 6397-6414; Cloning Vectors, Pouwels et al., Elsevier (1985) VI-B-ü-2). Ce plasmide est déposé à l'ATCC
sous le numéro 37305.
Le plasmide pGl comporte un fragment de 0,8 kb contenant le promoteur GALl/GAL10 de ~,.cerevisiae, inséré dans le site HindII du plasmide pUCB, duquel il peut être excisé sous forme d'un fragment BamHI-PstI (figure 1).
Ce fragment a été excisé de pGl, purifié, puis digéré avec les enzymes RsaI et AIuI, dont les sites de coupure respectifs sont localisés de part et d'autre de la ~c~ëgion UAS. Un fragment de 143 pb a ainsi été isolé par electroélution, puis mis sous fi<1 forme d'un fragment NotI en ajoutant un linker 5'-GCGGCCGC-3'. Ce fragment a ensuite été cloné dans le plasmide pYG29, préalablement digéré par NotI.
Le plasmide résultant est appelé pYG32 (figure 1).
Pour obtenir le vecteur d'expression portant ce promoteur hybride, le fragment SaII-HindIII postant le promoteur hybride a été isolé de pYG32 et ligaturé
avec un adaptateur synthétique HindIII-BstEII composé des 2 brins complémentaires suivants : 5'-AGC TTT ACA ACA AAT ATA AAA ACA ATG AAG TGG-3' et 5' GT TAC CCA C'TT CAT TGT TTT TAT ATT TGT TGT AA-3' (le codon d'initiation de la transcription est représenté en caractères gras). Cet adaptateur 1o re~nstitue les 22 pb situées immédiatement en amont du gène de structure p~
de ~y,~g, et comprend les premiers codons du gène codant pour la préproHSA, jusqu'â un site BstEII présent dans le gène natif (figure 1).
La cassette d'expression de l'albumine humaine a ensuite été reconstituée en ligaturant le fragment SaII-BstEII ainsi obtenu portant le promotew hybride et Z5 1'extrêminté 5' du gène de structure de l'albumine, avec le fragment BstEII-SacI isolé
du plasmide pYGl9, portant le reste du gène de l'albumine, et le terminatew du gène de S.cerevisiae (figure 2).
La cassette ainsi obtenue a été utilisée pour remplacer la cassette d'expression SaII-SacI portée par le plasmide pYGl9.
2o Le vecteur résultant est appelé pYG401 (figwe 2).
2. Construction d'un vecteur d'expression de 5AH sous controle du promoteur Iü~ : plasmide~pYG132.
2.1. Isolement du promoteur Kl~ de ~,l,~t~.
25 Le promotew KlADH4 a été obtenu par criblage d'une banque d'ADN
génomique total de Kl~~rve~..laritis CBS2359/152 au moyen d'une sonde hêtérologue provenant du gène ~ de S. cerevisiae. Pius précisément, la banque a été obtenue par clonage au site BamHI du vectew de remplacement Lambda-L47 du produit d'une digestion partielle par l'enzyme Sau3A de l'ADN de 3o CBS2359/152 . La sonde utilisée pow l'hybridation est un fragment EcoRV-BamHI
de 980 bp comprenant la région codante du gène de structure de ~~. cerevisiae, à l'exception des ?0 premières pb (sonde A). Ce fragment est obtenu par digestion enzymatique à partir d'un plasmide nommé pBR322,ADR2.BSa (Williamson et al., Cell ~ (1981) 605-614; Russell et al., J. Biol,Chem. ~$ (1983) 2674-2682).

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4 _ 212 6 3 5 ~ P~/~3/00072 Un fragment de 8 kb environ a ainsi été isolé et sous-cloné au site BamHI du plasmide pBR322 pour générer le plasmide pG-4-98 (figure 3). L'insert BamHI
porté
par ce plasmide a ensuite été cartographié au moyen d'enzymes de restriction, et la région promotrice du gène KIADH4 a été localisée sur ce fragment par hybridations

5 différentielles en utilisant la sonde A ainsi qu'une deuxième sonde correspondant au fragment BamHI-EcoRV de 1100 pb environ du plasmide pBR322.ADR2.BSa (sonde B).
Dans une seconde étape, le plasmide p6-4-98 a été digéré par l'enzyme HindIII et un fragment de 2,2 kb a été isolé. Ce fragment a ensuite ëté
purifié par des l0 techniques standard et sous-cloné au site HindIII du plasmide pTZ 19 pour génëcer le plasmide pG-2200-2 (figure 3). L'analyse du fragment sous-clonë révèle qu'il contient les 14 premiers codons du gène KlApH4 et la région située en amont de celui-ci, comprenant les éléments de régulation de (expression.
La partie comprise entre le site BgIII et le codon d'initiation de la traduction 15 ATG (fragment de 1,2 kb environ) ~ a ëté séquencée en utilisant la méthode de terminaison de chaire (Songer et al., Proc.Nat.Acad.Sci. ~ (1977) 5463).
2.2. Construction d'un promoteur K1ADH4 portable (BgIII-BamHI) Un promoteur portable a étë préparé par insertion sur le fragment HindIII de 2,2 kb présent sur le plasmide p6-2200-2 d'un site de restriction BamHI en position 16 par rapport au codon ATG du gène KI~,.
L'insertion de ce site permet de générer un fragment BgIII-BamHI de 1,2 kb comprenant exclusivement la région promotrice K1ADH4. Elle permet également d'introduire en aval du promoteur ainsi obtenu tout gène que l'on désire exprimer.
Le site BamHI a ëté introduit en position -1G par rapport au site d'initiation de - la traduction (ATG) du gène Kl~ par mutagénèse dirigée en utilisant la technique de double amorce (Sambrook, Fritsch, Maiûatis, Molecular Gloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab Press, 1989). La séquence des oligodésoxynucléotides synthétiques utilisés pour cette mutagénèse est donnée ci dessous. Le site BamHI génërë est souligné, fATG est indiqué en italiques et les 3o astërisques désignent les bases modifiées par rapport à la séquence initiale. SI =
Sëquence initiale; SM = Séquence modifiée.
5'-CTCCCCCACCAACAACACAACATACAACACACGCAATGTTCAGATT-3' (SI) **
5' -CTCCCCCACCAACAACA_A~, ~A't' AACACACGCAATGTTCAGATT-3' ( SM) 3'-GAGGGGGTGGTTGTTGTGTCCTAGGTTGTGTGCGTTACAAGTCTAA-5' iSM) ~~71 ,~~,~ë , ,'1 , ,, .. . . . ~ .. .. . , . ... .. , , , ' . . , _ ~6~,~6 Le plasmide ainsi obtenu est appelé pP4-33 (figure 3).
2.3, Construction d'un vecteur d'expression de la sérum albumine humaine s (HSA) Pour construire un vecteur d'eXpmssion de la sérum-albumine humaine, un dérivé du plasmide pYG4(l4 (Cf EP 361991) a été préparé, contenant - un réplicon de levure (séquence quasiment entière du plasmide naturel pKDl), - le gène codant pour la prépro-albumine humaine (HSA) sous contrôle du promoteur du gène LAC4 de jS. lattis et suivi du terminateur du gène ~K de S. cerevisiae; le gène de structure codant pour ia HSA est précédé
par une séquence de 25 nucléotides correspondant à la région directement en amônt du gène ~ de S. cerevisiae, 1s - le gène ~ conférant la résistance à la généticine (G418) à la levure, et - un re'plicon et un marqueur de sélection (gène ~ conférant la resistance à
l'ampicilline) pour E.E. çoli.
Ce plasmide, nommé pYG404~H, diffère de pYG4U4 uniquement par la destruction du site HindIII, localisé dans le gène , par mutagénèse dirigée.
Cette modification a ensuite permis de substituer le promoteur LAC4 présent dans le plasmide pYG4U4~H sous forme d'un fragment SaII-HindIII par le promoteur KlADH4 également construit sous forme d'un fragment SaII-HindIII.
(a) Canstructïon du plasmide pYG404~H (figures ~4-î).
Pour effectuer la dêlétion .du site HindIII dans le vecteur de clonage pYG404, différentes ëtapes de sous-clonage ont étë effectuées, donnant lieu à
une construction intermédiaire : pYGî2 (figure 6). Ce vecteur correspond au plasmide pKanîa7 (EP 361 991) dans lequel le fragment Sacl contenant le gène ~ a été
ëliminé ainsi que le site unique HindIil présent dans le gène ,~. Pour effectuer la mutagénèse dirigée sur ce site, le fragmem PstI de 1,3 kb portant le gène ~ a ëté
sous-clonë à pariir du plasmide pKanî07 dans le bactériophage Ml3mpî pour donner le vecteur pYG64 (figure 4). Le site HindIII a été détruit par mutagénèse dirigée (Cf ,~ ~,, i'"~~ ~' ,.~ !' ~,~ ~' : , ... a~ ' .....
.: .. w, . . .;i . . , '.. ,.. ~. :, .., WO 93/15204 212 6 3 5 6 P~/~9a/00072 techniques générales de clonage) en utilisant l'oligodésoxynucléotide suivant : 5'-GAA ATG CAT AAG CTç TTG CCA TTC TCA CCG-3', permettant le remplacement du triplet CTT codant pour la leucine 185 par le triplet CTC. Ce changement ne modifie pas la séquence protéique rêsultante. Le plasmide obtenu a été appelé pYG65 (figure 4). Pour construire le plasmide pYG72, la partie contenant le réplïcon bactérien du vecteur pKan707 a ëté isolée par digestion avec l'enzyme EcoRI et recircularisation avec la T4 DNA ligase, génêrant le plasmide intermédiaire pYG69. Le fragment PstI présent dans celui-ci contenant le gène ~ a ensuite été
remplacé par le fragment équivalent muté provenant du plasmide pYG65. Cette construction a été appelée pYG70 (figure 5). La séquence de pKDl de 4,7 kb comprise entre les sites EcoRI et Sacl a ensuite été introduite dans ce vecteur pour obtenir pYG72 (figure 6).
Le vecteur pYG4040H a ëté obtenu en insérant la cassette d'expression provenant du plasmide pYG404 ()_.P 361 991) sous forme d'un fragment SaII-Sacl aux sites correspondants de pYG72 (figure 7).
(b) Construction d'un promoteur KIADH4 portable [SaII-HindIII] (figure 8).
Le promoteur K1ADH4 porté sur le fragment BgIII-BamHI provenant du 2o plasmide pP4-33 (Cf 2.1,) a été modifié de la manière suivante pour l'adapter à
l'utilisation dans des vecteurs d'expression dérivés du plasmide pYG404~H:
Après digestion du plasmide pP4-33 par les enzymes BgIII et BamHI suivi d'un traitement à la nucléase 'Mung Bean' pour rendre les extrémités franches, le fragment de 1,2 kb portant le promoteur K1BDH4 a été isolé à partir d'un gel d'agarose et sous-cloné dans le vecteur pBC SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA) préalablement linéarisé avec l'enzyme CIaI et traité à la nucléase 'Mung Bean' ainsi qu'à la phosphatase alkaline de veau (CIP). Le plasmide obtenu de cette manière (pYG128, figure 8) permet l'isolement du promoteur K1ADH4 sous forme d'un fragment Sali-HindIII de 1,2 kb.
(c) Construction du vecteur pYG132 (figure 9).
La digestion du vecteur d'expression pYG4040H (Cf 2,3.(a)) par les enzymes SaII et HindIII .permet le remplacement du promoteur L.AC4 par le promoteur KI~4_ décrit ci-dessus.

21~6.~5 G
Pour effectues ce clonage, le fragment SaII-HindIII de 8,7 kb contenant la partie pKDl et les marqueurs de sélection ainsi que le fragment HindIII-HindIII de 1,9 kb portant le gène codant pour la prépro-HSA ont été isolës à partir du vecteur pYG4040H et religués en présence du fragment SaII-HindIII de 1,2 kb provenant du plasmide pYG128 et portant le promoteur Kl~. Deux plasmides ont été obtenus de cette manière:
- pYG131 (figure 9). correspondant à un vecteur de clonage permettant l'insertion au site HindIII unique de tout gène que l'on désire exprimer sous contrôle du promoteur KIADH4, et - pYG132 (figure 9), qui est identique au plasmide pYG131 sauf qu'il contient le gène de la prépro-HSA inuoduit au site HindIII.
3. Construction d'un vecteur d'expression de SAH sous contrble du promoteur du gène j~AÇ4 de : plasmide pYG1023.
3.1. Isolement du gène p,~K de K.lactis.
Le gène ~ a été isolé chez CBS2359 par criblage d'une banque génomique partielle avec une sonde hétérologue correspondant à la partie N-terminale du gène ~ de ~cerevisiae (Dobson et al., Nucl.Acid.Res. 1Q (1982) 2625-2637). Plus précisément, la sonde utilisée correspond au fragment PwI-EcoRI
de 1,3 kb.
En Southem Blot (Southern et al., J.Biol.Chem. Q$ (1975) 503), la sonde utilisée s'hybride notamment à une séquence d'ADN contenue dans un fragment HindIII-HindIII de 4 kb. Cette séquence a été isolée par hybridation sur colonies au moyen de la sonde précédente: Pour cela, une banque restreinte d'ADN génomique de la souche CBS2359. constituée de fragments HindIII d'une taille comprise entre 3 et 5 kb introduits su site HindIII du plasmide pUCï8, a été préparée et criblée.
Un clone portant le plasmide pYG600 (figure 10) a ainsi été isolë. La séquence du gène ~ porté par ce plasmide a été décrite par Fournier et al.
(Nucl.Acid.Res. ,1,$ (1990) 369).
3.2. Construction d'un vecteur d'expression de la sérum-albumine humaine portant le gène p~ de K.lactis.
Le plasmide pYG70 dëcrit sur la figure ~ a été modifié comme suit.
(a) Modification des sites de resuiction du plasmide pYG70 (figure 11).

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~ s ~~~'.a.. . . " , . . . ' " . .,.. .. .. . .. . " , . ~ . .. ~, WO 93/15204 2 ~ ~ 6 ~ ~ 6 PC°T/FR93/00072 Pour faciliter les étapes ultérieures de clonage, certains sites de res-triction ont été supprimés G) et 2 adaptateurs ont été ajoutés (ü et üi) sur le plasmide pYG70.
(i) Elimination du site SphI.
Le plasmide pYG70 a été digéré par SphI, et les extrêmités cohésives ont ensuite été éliminées par digestion en présence d'ADN polymérase du phage T4.
Après ligation en présence de ligase, le plasmide pYG700SphI a été obtenu (voir figure 11).
(ü) Insertion de l'adaptateur 1.
l0 , L'adaptateur 1 a été obtenu par hybridation des oligodésoxynucléotides de synthèse A et B présentés sur la figure 12. Pour cela, 2 ~g de chaque oli godésoxynucléotide ont été incubés dans un tampon d'hybridation qsp 20E.i1 (tampon Tris-HCl 30 mM pH 7,5; NaCI 30 mM; MgCl2 ?,5 mM; ATP 0,25 mM: DTT 2 mM;
EDTA 0,2 mM), puis la température a été élevée à 80°C pendant 10 minutes, et ramenée lentement à température ambiante.
L'adaptateur ainsi obtenu contient des sites de coupure pour les enzymes suivantes : Sacl; SaII; Mlul; BssHII et SfiI, et permet d'éliminer, lors de son introduction, le site SaII présent sur le plasmide pYG70~,SphI. Cet adaptateur a été
introduit par ligation dans le plasmide pYG700SphI préalablement digéré par les enzymes SaII et SacI.
Le plasmide obtenu est appelé pYG70-1.
(iii) Insertion de l'adaptateur 2.
L'adaptateur 2 a été re' alisé en suivant le protocole décrit pour l'adapta-teur 1, en utilïsant les oligodésoxynucléotides C et D dëcrits sur la figure 12. Cet adaptateur contient des sites de coupure pour les enzymes suivantes : SfiI;
AatIl;
SphI; NarI et SacI et permet d'éliminer, lors de son introduction, le site EcoRI
présent sur le plasmide pYG70-1. II a été introduit par ligation dans le plasmide pYG70-1 préalablement digéré par les enzymes EcoRI et Sacl, pour former le plasmide pYG70-2 (figure 11).
(b) Introduction d'une cassette d'expression de la sérum-albumine humaine.

!~A
La cassette d'expression de la sérum-albumine humaine utilisée com-prend - le promoteur inductible du gène LAC4 de ,~j~ç~, - le gène de structure codant pour la sérum-albumine humaine (forme 5 prépro), et - le terminateur du gène p~ de ~,~P vi iae.
Cette cassette a étë isolée du plasmide pYG404 (EP361 991) sous forme d'un fragment SaII-SacI, puis introduite par ligation dans le plasmide pYG?0-2 préalablement digére par les enzymes correspondantes.
1o Le plasmide obtenu est appelé pYG70-3 (figure 13).
(c) Insertion du gène P.~ de K.iactis.
Le gène ~ ,~,.a été isolé du plasmide pYG600 (figure 10), sous-cloné dans le plasmide pYG1002 pour générer le plasmide pYG1003, puis isolé de ce dernier sous forme d'un fragment MIuI-BssHII.
15 Le sous-clonage dans pYG1002 a permis d'obtenir le gène ~ K-lastis dépourvu de son promoteur, et sous forme d'un fragment MIuI-BssHII.
Le plasmide pYG1003 a été obtenu de la manière suivante (,figure 14) Le plasmide pIC20H (Marsh et al., Gene ,~ (1984) 481) a été digéré par BgIII et EcoRI de façon à introduire l'adaptateur 3. Get adaptateur, qui apporte les 2o sites EcoRI, BssHII, CIaI, NheI, MIuI et BgIII a été obtenu comme , décrit précédemment (2.(a)(ü)), par hybridation des oligodésoxynucléotides E et F
(figure 12). Le plasmide résultant est appeié pYG1002. Le gène ' r ' de ~,,]~ctis a été
introduit dans ce nouveau plasmide sous forme d'un fragment CIaI-NheI, issu du plasmide pYG600. Le plasmide obtenu est appelé pYG1003 (figure 14).
Le fragment MIuI-BssHII issu du plasmide pYG1003 portant le gène de ~C.laçtis a ensuite été introduit dans les sites correspondants sur le plasmide pYG?0-3, pour générer le plasmide pYG70-4 (figure 15).
Sur ce plasmide, le gène ~ de j~,,~ç~ est désormais placé sous le contrôle du promoteur bidirectionnel k1 de la toxine Killer.
(d) Insertion du réplican levure.
Les plasmides pYG?0-4 (figure 1~) et pKDl (EP 361 991) ont été
digérés par Sphl et ligués ensemble en présence de ligase. A l'issue de cette ligation, 4 vecteurs peuvent être obtenus, selon la conformation du plasmide pKDl (forme A

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,. .. . , WO 93/15204 , 2 ~ ~ ~ ~ ~ PGTlFR93/00072 ou forme B) et l'orientation de la parle correspondant au plasmide pYG70-4 par rapport à pKDl.
L'une de ces constructions à été sélectionnée et appelé pYG1023 (figure 15). Ce vecteur comprend - la sêquence entière du plasmide pKDl, qui fait de pYG1023 un plasmide à copies multiples, stable, et capable de se répliquer chez les levures et préférentiellement les levures du genre ~~ceS-- aire cassette d'expression de la sërum-albumine humaine comportant le gène de structure codant pour la forme prépro sous contrôle du promoteur inductible du gène LAC4 de ~, et du terminateur du gène p~ de S.cerevisiae, - un réplicon et un marqueur de sëlection (gène ]~ conférant la rësis-tance à l'ampicilline) pour E.éoli, - deux marqueurs de sélection pour une souche K.lactis ~c : le gène ~
muté sous contrôle du promoteur bidirectionnel k1 de la toxine Killer et le gène ~
de sous contrôle du même promoteur mais transcrit de façon divergente par rapport au gène ~.
B - Production par voie recombïnante de sérum~albumine humaine Bl. Cet exemple décrit un procédé classique de production de SAH
recombinante utilisant la levure j~.laçtis CBS683 transformée par le vecteur pYG401 (exemple Al). Cet exemple illustre l'art antërieur.
La culture a été réalisée en fermenteur de 2 litres à 28°C en mode fed-batch.
Initialement, le fermenteur contient 0.7 litre de milieu de base (glucose 2 g!1, extrait de levure 3 g!1, sels). Une culture de 50 ml en phase exponentielle de croissance (inoculée à partir d'une suspension congelée) est utilisée pour inoculer le fermenteur.
Après une phase préliminaire de croissance de type batch, la charge complémentaire (glucose, corn steep, sels d'ammonium . 40%/13%/7% [w/v]) est ajoutëe exponentiellement. Après 64 heures de culture, le moût est centrifugé et le surnageant microfiltrë sur membrane ?.~. Le protocole de purification comprend une étape de chromatographie d'affinité sur Bleu Trisacryl (IBF, France) d'où l'albumine est ëluée . 3o par une forte concentration saline (NaCI 3,5 M), puis, après concentration et diafîltration, un passage sur . échangeur d'ion de type Q-sépharose "fast flow". La SAH ainsi purifiée présenté une bande homogène en électrophorèse SDS-PAGE et ne se distingue pas d'albumines naturelles prises comme référence dans de nombreux ,:

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~1~6'3 tests de caractérisation biochimique. Pourtant, une solutïon de la SAH obtenue présente une coloration jaune avec un indice de colorimétrie i = 0,26 qu'il n'est pas possible d'éliminer par une purification plus poussëe etlou des traitements tels que l'utilisation de charbons activés, ainsi qu'une fluorescence anormale après excitation à
360 nm (voir figures 16,18 et 19).
B2. Un lot d'albumine recombinante BCQ 759 obtenu dans les conditions décrites dans l'exemple Bl présente un indice de coloration i = 0,26 après purification (figure 16). De nombreux essais de chromatographie supplémentaires et de traitements physicochimiques ne permettent pas de diminuer cette coloration.
1o Afin d'analyser la nature de la liaison de cette coloration à. l'albumine, un cycle de dénaturation-renaturation a été réalisé comme suit 50 mg de BCQ 759 sont dénaturés par incubation dans 2 ml de guanidine-HCl 7M et 0,3M de (3-mercaptoëthanol. bette solution est chauffée 1 heure à
100°C.
Après refroidissement, 500 E.~l de rSAH dènaturée sont injectës sur une colonne TSK
3000SVV équilibrëe avec de l'urée 8M et 0.3M de (3-mercaptoéthanol pour éliminer les petites molécules qui pourraient être fixées fortement (mais non covalemment) à
la SAH. Les fractions absorbant à 280 nm sont dialysées contre une solution Tris HCl 50 mM, urée 8M, pH 8,0 pendant une nuit sous azote puis contre 1 1 de tampon de renaturation Tris HCl 50 mM, pH 9,5 contenant 50 mM NaCI, 1 mM de glutathion 2o rêduit et O,1 mM de glutathion oxydé sous azote pendant 48 heures. Après dialyse finale contre de l'eau, un spectre UV est réalisé et l'on calcule un indice de coloration i2 = 0,22. Dans les mêmes conditions une albumine placentaire témoin (Institut Mérieux, i = 0,07) donne après renaturation i2 = 0.14. Cet exemple met clairement en évidence la nature essentiellement covalente de la liaison du pigment à
l'albumine. Il est donc vain d'essayer de décolorer significativement une albumine recombinante par le procédé de purification.
B3. Dans cet exemple est décrite une expérience simple qui permet de mettre en évidence que la source de carbone est une cause essentielle du développement de la coloration.
3o L'albumine témoin (i = 0,07) est incubée dans différents milieux de culture en erlen sans inoculation par la levure. Les milieux testés sont constitués d'un milieu de base Bo défini comme suit ~,~a :; . , ' , .
W0 93!15204 ' - ~ ~ ~ PCTlFR93lü0072 Sels Actate d'ammonium 7 g/1 Na2HPO4 4,4 g/1 KH2P04 4 g/1 MgS04, 7H2O 0,5 g/1 CaCl2, 2H20 0.1 g/1 MnSQ4~ Hz0 10 mg/1 ZnS04, 7H20 100 mgh FeS04~ 7H20 15 mg/1 AlCl3, bH20 1 mg/1 1o CoCl2, 6H20 2 mg/1 CuS04~ 5H2O 0,13 mg/1 ICI 0,33 mg/1 H3BO3 1,47 mg/1 Na2Mo04 0,67 mgil Vitamines Msoinositol 2 mg/1 Acide nicotinique 2 mgfl Biotine 2 mg/1 Pantothnate de calcium 2 mg/1 Acides amins L-Glu 0.b g/1 L-Phe 0,1 S
g/1 DL-Ala 0,7 g/1 L-Leu 0.35 g/1 L-Lys, HCl 0.30 g/1 DL-Is, HCl 0,30 gf l 2S L-Ile 0,10 g!1 DL-Met 0,15 g/1 L-Pro 0.3 g/1 et d'une source de carbone erlen El : Glucose (microfiltré) 20 g/1 3o E2 : Lactose 20 g/1 E3 : contrôle 4sans source de carbone) Les trois erlens sont incubés avec HSA à 50 mg/1 et agités à 28°C
pendant 3 jours.

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~~35 G
2~i Après 3 jours, le milieu est centrifugé et filtré sur une membrane 0,21.1. On ajoute 5 ml de support d'affinité Bleu Trisacryl M (IBF France) et on agite doucement. Après 1 heure, les eaux-mères sont séparées sur verre fritté et l'albumine ëluée par une solution NaCI 3,5M. L'éluat est ensuite concentré et diafiltré
par de l'eau sur membrane d'ultrafiltration 10 kD.
Une analyse spectrophotométrique donne les résultats suivants pour l'indice de coloration de l'albumine erlen El i = 0,16 E2 i = 0,12 E3 i = 0,09 SAI-i témoin i = 0,07 Cet exemple montre donc clairement que la source de carbone induit une augmentation de la coloration de l'albumine dans les conditions de culture sans levure.
B4. Pour compléter les résultats obtenus dans l'exemple précédent, l'albumine de référence a étë incubëe dans les mêmes conditions en présence de erlen E4 milieu Bo + glucose autoclavé 20 g/1 E5 milieu Bo + glucose microfiltré 20 g/1 2o E6 1 mïlieu Bo + saccharose microfiltré 20 gIl Après concentration et diafiltration du milieu pour éliminer les petites molécules, l'indice de coloration a été déterminé en LïV
E4 i = 0,22 E5 i = 0,15 E6 i = 0,14 B5. Afin de vérifier les conclusions obtenues dans les exemples précédents lors d'une culture réelle, la coloration de l'albumine recombinante produite en erlen par la levure ~.laçtis a été analysëe. w a) Souche K.lactis ~1 ' CBS 295.91 transformée par le vecteur pYG1023 décrit dans l'exemple A3 Erlens : E7 = Bo + lactose 10 g/1 + éthanol 10 gJl y~ :,; : : ~;. . ....
W0 93/15204 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ PC'T/Fit93/00072 E8 = Bo + lactose 20 g/1 E9 = Bo + glucose microfiltré 20 g/1 EI O = Bo + lactose 10 g/1 + glucose 10 g/1 L'albumine recombinante produite après 72 heures de culture en mode batch 5 en erlenmeyers de 250 ml à 28°C est purifiée sur colonne d'échange d'anions Mono Q
HRSlS (Pharmacia) et traitée au charbon activé pour éliminer la coloration qui n'est pas fixée de manière covalente à la protëine. Les resultats obtenus après analyse UV
sont les suivants E7 i = 0,11 BCQ 804 LE (voir figures 16, 18 et 19) 10 E8 i = 0,14 BCQ 804 L
E9 i = 0,1? BCQ 804 G
E10 i = 0,15 BCQ 804 LG
b) Souche K.iactis CBS 293.91 transformée par le vecteur pYG132 décrit dans l'exemple A2 15 Erlen : El l = Bo + glycérol 10 g/1 + éthanol 10 g!l Dans les mêmes conditions que précédemment, l'albumine recombinante produite donne après simple purification sur Mono Q un indice de coloration i = 0,09 (BCQ
83â GE) : voir figure 17.

Claims (28)

REVENDICATIONS

1. Un extrait d'un milieu de culture d'une levure du genre Kluyveromyces utilisé pour la production de la sérum-albumine humaine (SAH), caractérisé en ce que:
- il comprend de la sérum-albumine humaine (SAH) recombinante sécrétée par une levure du genre Kluyveromyces, ladite SAH recombinante ayant, une fois purifiée, un indice de colorimétrie inférieur à 0.2;
- il est substantiellement exempt d'impuretés de type aldéhydique produites par ladite levure.

2. L'extrait de la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend de plus au moins une source carbonée choisie parmi les alcools, les sucres non réducteurs, les acides organiques et les dérivés du glucose substitués sur l'oxygène du carbone C4, ladite au moins une source carbonée éliminant ou limitant substantiellement la production desdites impuretés par ladite levure.

3. L'extrait de la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce caractérisé en ce qu'il est exempt d'adsorbant permettant de capter lesdites impuretés.

4. Un milieu de culture pour la production de la sérum-albumine humaine (SAH) recombinante par une levure du genre Kluyveromyces, ledit milieu de culture étant exempt d'adsorbant capable de capter des impuretés de type aldéhydique produites par ladite levure, ledit milieu de culture comprenant au moins une source de carbonée choisie parmi les alcools, les sucres non réducteurs, les acides organiques et les dérivés du glucose substitués sur l'oxygène du carbone C4, ladite au moins une source carbonée éliminant ou limitant la production d'impuretés de type aldéhydique par ladite levure mais permettant l production d'une SAH recombinante ayant, une fois purifiée, un indice de colorimétrie inférieur à 0.2.

5. Une méthode pour inhiber la coloration de sérum-albumine humaine (SAH) recombinante produite par une levure du genre Kluyveromyces, caractérisée en ce que ladite levure est cultivée dans un milieu de culture tel que défini à la revendication 4.

6. Une méthode pour inhiber la coloration de sérum-albumine humaine (SAH) recombinante produite par une levure du genre Kluyveromyces, caractérisée en ce que ladite levure est cultivée dans un milieu de culture éliminant ou limitant substantiellement la production par ladite levure d'impuretés de type aldéhydique.

7. La méthode de la revendication 6, dans laquelle ledit milieu de culture comprend au moins une source carbonée choisie parmi les alcools, les sucres non-réducteurs, les acides organiques et les dérivés du glucose substitués sur l'oxygène du carbone C4.

8. La méthode de la revendication 6 ou 7, dans laquelle la SAH recombinante produite possède, une fois purifiée, un indice de colorimétrie inférieur à 0.2.

9. La méthode selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, dans laquelle ladite levure comprend une séquence d'ADN exogène choisi dans le groupe constitué par les séquences d'ADNc, les séquences d'ADN génomique et les séquences hybrides codant pour la SAH.

10. La méthode selon la revendication 9, dans laquelle l'ADN exogène comprend une région de démarrage de la transcription et de la traduction jointe à l'extrémité 5' de la séquence codant pour la SAH.

11. La méthode selon la revendication 9 ou 10, dans laquelle l'ADN exogène fait partie d'un vecteur, qui peut être à réplication autonome ou intégratif.

12. La méthode selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisée en ce que la séquence d'ADN exogène comprend, en amont de la séquence codant pour la SAH
mature, une séquence "leader" dirigeant la protéine naissante dans les voies de sécrétion de l'hôte utilisé.

13. La méthode selon la revendication 12, caractérisée en ce que la séquence "leader" peut être la séquence "leader"
naturelle de la SAH, une séquence "leader" hétérologue, ou une séquence "leader" artificielle.

14. La méthode selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisée en ce que ladite SAH résulte de l'expression dans ladite levure d'une séquence d'ADN
exogène et de la sécrétion du produit d'expression de ladite séquence dans le milieu de culture.

15. Procédé de préparation de sérum-albumine humaine (SAH) ayant un indice de colorimétrie inférieur à 0,2 caractérisé
en ce que l'on effectue les étapes suivantes:

- dans une première étape, on introduit dans une cellule-hôte eucaryote ou procaryote un ADN exogène codant pour la sérum-albumine humaine sous contrôle de signaux de transcription et de traduction appropriés à l'hôte utilisé;
- dans une deuxième étape, on cultive la cellule ainsi obtenue dans un milieu de culture de composition défini contenant au moins une source carbonée choisie parmi les alcools, les sucres non réducteurs, les acides organiques et les dérivés du glucose substitués sur l'oxygène du carbone C4 ; ou dans un milieu préparé de façon à éliminer ou à limiter la formation d'impuretés de type aldéhydique, et, - dans une troisième étape, on récupère la SAH produite.

16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'ADN exogène est défini comme dans l'une quelconque des revendications 9 à 13.

17. Procédé selon la revendication 15 ou 16, caractérisé
en ce que la SAH est sécrétée dans le milieu de culture.

18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à
17, caractérisé en ce que l'hôte eucaryote est choisi parmi les cellules animales, les levures et les champignons.

19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que la levure est choisie parmi les levures du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces et Hansenula.

20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'hôte est choisi parmi les levures du genre Kluyveromyces.

21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à
17, caractérisé en ce que l'hôte procaryote est choisi parmi les bactéries E.coli, Bacillus et Streptomyces.

22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à
21, caractérisé en ce que l'alcool est choisi dans le groupe constitué par les alcools simples comportant au moins 2 atomes de carbone et les polyalcools.

23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à
21, caractérisé en ce que les dérivés du glucose sont choisis parmi les disaccharides.

24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que le disaccharide présente une liaison osidique de type 1-4.

25. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à
24, caractérisé en ce que le milieu de culture comprend une combinaison de plusieurs sources carbonées.

26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que la source carbonée est composée de l'association d'un dérivé du glucose et d'un alcool, ou de l'association d'un alcool simple et d'un polyalcool.

27. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à
26, caractérisé en ce que le milieu de culture est préalablement stérilisé à froid.

28. Une composition pharmaceutique, comprenant de la sérum-albumine humaine (SAH) recombinante purifiée à partir d'un extrait de milieu de culture tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3, et un diluant pharmaceutique acceptable.