CA2182905A1 - Procede d'alignement de macromolecules par passage d'un menisque et applications - Google Patents

Procede d'alignement de macromolecules par passage d'un menisque et applications

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CA2182905A1
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Abstract

La présente invention a pour objet un procédé d'alignement de macromolécule(s) sur la surface (S) d'un support, caractérisé en ce que l'on fait se déplacer sur ladite surface (S) la ligne triple S/A/B (ménisque) résultant du contact d'un solvant (A) avec la surface (S) et un milieu (B), lesdites macromolécules ayant une partie, notamment une extrémité, ancrée sur la surface (S), l'autre partie, notamment l'autre extrémité, étant en solution dansle solvant (A). La présente invention a également pour objet un procédé de mise en évidence, de mesure de distance intra-moléculaire, de séparation et/ou dosage d'une macromolécule dans un échantillon dans lequel on met en oeuvre un procédé d'alignement selon l'invention.

Claims (49)

1. Procédé d'alignement de macromolécule(s) sur la surface S
d'un support, caractérisé en ce que l'on fait se déplacer sur ladite surface S la ligne triple S/A/B/ (ménisque) résultant du contact d'un solvant A
avec la surface S et un milieu B, lesdites macromolécules ayant une partie, notamment une extrémité, ancrée sur la surface S, l'autre partie, notamment l'autre extrémité, étant en solution dans le solvant A.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le déplacement du ménisque se fait par évaporation du solvant A.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le déplacement du ménisque se fait par déplacement relatif de l'interface A/B par rapport à la surface S.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que pour déplacer le ménisque, la surface S est retirée du solvant A ou le Solvant A
est retiré de la surface S.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le ménisque est un ménisque eau-air.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le support est constitué au moins en surface par un polymère organique ou inorganique, un métal, un oxyde ou un sulfure de métal, un élément semi-conducteur tel que le silicium ou un oxyde d'élément semi-conducteur, ou une de leurs combinaisons.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le support est constitué au moins en surface par du verre, du silicium oxydé en surface, de l'or, du graphite, du sulfure de molybdène ou du mica.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le support est sous forme de plaque, de bille, de fibre ou de particules.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le solvant A dans lequel les macromolécules à aligner sont en solution est placé entre deux supports, dont un au moins correspond audit support de surface S, et le ménisque est déplacé par évaporation.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisé en ce que l'ancrage de la macromolécule se fait par interaction physicochimique, notamment adsorption ou par lien covalent, soit l entre la surface et la macromolécule, soit indirectement entre la surface et une autre molécule reconnaissant et/ou interagissant avec ladite macromolécule.
11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'on utilise un support présentant en surface un groupement réactif exposé ayant une affinité pour ladite macromolécule ou une molécule à
activité biologique capable de reconnaître ladite macromolécule.
12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la surface est recouverte d'un groupe choisi parmi les groupes vinyle, amine, carboxyle, aldéhyde ou hydroxyle.
13. Procédé selon l'une des revendications 10 ou 12, caractérisé
en ce que la surface comporte:
- sur un support une couche sensiblement monomoléculaire d'un composé organique de structure allongée ayant au moins:
- un groupement de fixation présentant une affinité pour le support, et - un groupement exposé n'ayant pas ou peu d'affinité pour ledit support et ledit groupement de fixation dans les conditions de fixation, mais présentant éventuellement, après une modification chimique suivant la fixation, une affinité pour ladite macromolécule ou molécule à activité
biologique.
14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13 caractérisé en ce que l'on réalise l'ancrage d'une partie d'une macromolécule par adsorption sur une surface, en mettant ladite macromolécule en présence de ladite surface dans une zone de pH ou de teneur ionique du milieu déterminée ou en appliquant une tension électrique déterminée sur la surface d'ancrage.
15. Procédé selon les revendications 1 à 14 caractérisé en ce que le pH pour réaliser l'ancrage est choisi dans une plage comprise entre un pH favorisant un état d'adsorption complet et un pH favorisant une absence d'adsorption.
16. Procédé selon l'une des revendications 1 à 15 dans lequel on réalise l'ancrage d'un acide nucléique ou d'une protéine par adsorption sur une surface présentant des groupes comportant des doubles liaisons éthyléniques ou des groupes amines, en mettant l'acide nucléique ou la protéine en présence de la surface dans une zone de pH ou de teneur ionique du milieu, déterminée.
17. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce qu'on réalise l'ancrage d'ADN non fonctionnalisée par adsorption sur des surfaces recouvertes de molécules terminées par un groupement vinyl ou amine.
18. Procédé selon la revendication 17 dans lequel on réalise l'ancrage de l'ADN par son extrémité sur une surface présentant des groupements à double liaison éthylénique, en mettant l'ADN en présence de la surface à un pH inférieur à 8.
19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que la réaction est conduite à un pH compris entre 5 et 6 puis est stoppée à pH 8.
20. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'on réalise l'ancrage d'ADN par son extrémité sur une surface recouverte de polylysine ou d'un groupement silane terminé par un groupe amine.
21. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'on réalise l'ancrage de l'ADN par son extrémité sur une surface recouverte par un groupement amine en mettant l'ADN en présence de la surface à
pH entre 8 et 10.
22. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'on réalise l'ancrage d'ADN par son extrémité sur une surface de verre traité
auparavant dans un bain d'acide, en mettant l'ADN en présence de ladite surface à pH entre 5 et 8.
23. Surface avec macromolécule(s) alignée(s) obtenue par le procédé selon l'une des revendications 1 à 22.
24. Procédé de mise en évidence, de séparation et/ou de dosage d'une macromolécule dans un échantillon, caractérisé en ce qu'on utilise un procédé d'alignement selon l'une des revendications 1 à 23 dans lequel se trouve fixée sur la surface S une molécule à activité biologique capable de reconnaître ladite macromolécule de l'échantillon et en ce que la mise en évidence, la séparation ou le dosage sont effectués grâce à un réactif fluorescent ou non détectant la présence de la molécule fixée ou ladite macromolécule.
25. Procédé selon l'une des revendications 1 à 24, caractérisé en ce que lesdites macromolécule et molécule à activité biologique sont choisies parmi les protéines, les acides nucléiques, les lipides, les polysaccharides et leurs dérivés.
26. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que lesdites macromolécule et molécule à activité biologique sont choisies parmi, les anticorps, les antigènes, les ADN et ARN, les ligands ou leurs récepteurs ainsi que leurs dérivés.
27. Procédé selon les revendications 24 à 26, caractérisé en ce que l'ADN fixé comporte la séquence complémentaire d'une séquence d'ADN à isoler d'un échantillon.
28. Procédé selon les revendications 24 à 26, caractérisé en ce que la protéine fixée est capable de reconnaître et fixer spécifiquement une protéine à isoler d'un échantillon.
29. Procédé selon les revendications 24 à 26, caractérisé en ce que ladite molécule à activité biologique est choisie parmi la biotine, l'avidine, la streptavidine, leurs dérivés ou un système antigène-anticorps.
30. Procédé selon les revendications 24 à 26, caractérisée en ce que la surface est à faible fluorescence et en ce que le réactif est fluorescent.
31. Procédé selon les revendications 24 à 26, caractérisée en ce que le réactif est constitué par des billes.
32. Procédé selon l'une des revendications 24 à 26, caractérisé en ce que la détection est faite par microscopie optique ou à champs proche.
33. Procédé selon l'une des revendications 24 à 26, caractérisé en ce qu'on soumet le produit de réaction entre la molécule à activité
biologique et la macromolécule de l'échantillon à une contrainte afin de détruire les mauvais appariements avant la détection.
34. Procédé de mise en évidence d'une macromolécule consistant en une séquence d'ADN ou d'une protéine dans un échantillon, selon l'une des revendications 24 à 33, caractérisé en ce que:
- on met l'échantillon correspondant au solvant A, dans lequel ladite macromolécule est en solution, en contact avec la surface du support dans des conditions de formation d'un hybride ADN/ADN, ADN/ARN ou de formation du produit de réaction protéine/protéine, l'hybride ou une macromolécule de marquage de l'hybride ou du produit de réaction étant ancré en une partie, le reste étant en solution, on l'étire par déplacement du ménisque créé par le contact du solvant avec la surface pour orienter les hybrides ou lesdites macromolécules de marquage et on effectue la mesure ou l'observation des hybrides ou desdites macromolécules de marquage ainsi orientés.
35. Procédé selon l'une des revendications 24 à 34, caractérisé en ce que l'ADN fixé et l'ADN de l'échantillon sont "colorés" de façon différente et, après étirement, on mesure la position de la séquence par rapport à l'extrémité de l'ADN de l'échantillon.
36. Procédé selon l'une des revendications 24 à 35, caractérisé
en ce qu'on utilise une méthode de détection ELISA ou FISH.
37. Procédé selon l'une des revendications 24 à 36, caractérisé en ce que l'échantillon est le produit ou le substrat d'une amplification enzymatique d'acide nucléique.
38. Procédé selon l'une des revendications 24 à 37, caractérisé en ce que l'ADN est étiré, puis dénaturé puis hybridé avec des sondes spécifiques pour déterminer la position ou la taille d'une ou plusieurs séquences d'ADN déterminées.
39. Procédé de cartographie physique d'un gène sur un ADN
génomique dans lequel l'ADN est aligné et/ou mis en évidence selon un procédé d'une des revendications 1 à 38.
40. Procédé selon la revendication 39, caractérisé en ce que la position et la taille du gène recherché sur l'ADN génomique sont déterminées par hybridation avec des sondes spécifiques dudit gène à
cartographier.
41. Coffret utile pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 39 ou 40 comprenant:

- de l'ADN génomique total d'un hôte de référence, - un support présentant une surface permettant l'ancrage et l'alignement de l'ADN, - des sondes spécifiques du gène à cartographier, et - des réactifs pour l'hybridation et la détection de l'ADN.
42. Procédé selon l'une des revendications 34 à 37, caractérisé en ce que l'ADN est étiré, puis dénaturé puis hybridé avec des sondes spécifiques pour déterminer la présence ou l'absence d'une ou plusieurs séquences d'ADN données.
43. Procédé de diagnostic d'une pathologie lié à la présence ou à
l'absence d'une séquence d'ADN donnée spécifique de ladite pathologie dans lequel on utilise un procédé selon la revendication 42.
44. Coffret utile pour la mise en oeuvre d'un procédé de diagnostic selon la revendication 43 caractérisé en ce qu'il comporte:
- un support dont la surface permet l'ancrage et l'alignement de l'ADN du patient, - des sondes spécifiques du gène impliqué dans la pathologie recherchée, et - des réactifs pour l'hybridation et la détection de l'ADN.
45. Coffret utile pour la mise en oeuvre d'un procédé de diagnostic selon la revendication 43 caractérisé en ce qu'il comporte:
- un support dont la surface présente des sondes spécifiques du gène impliqué dans la pathologie recherchée, lesdites sondes étant ancrées et alignées sur la surface;
- des réactifs pour le marquage de l'ADN, notamment de l'ADN
du patient;
- des réactifs pour l'hybridation et la détection de l'ADN.
46. Procédé de préparation d'un gène à partir d'ADN génomique caractérisé en ce que l'on identifie la position dudit gène sur l'ADN
génomique aligné par le procédé de l'une des revendications 1 à 37 à l'aide d'une sonde spécifique dudit gène et on procède à l'amplification enzymatique de la séquence dudit gène et/ou de ses séquences flanquantes et on isole le produit amplifié.
47. Construction d'ADN contenant un gène préparé par le procédé de la revendication 46 éventuellement associé à une séquence régulatrice homologue ou hétérologue.
48. Utilisation d'un gène obtenu par un procédé selon la revendication 46 pour préparer une construction d'ADN utile dans un procédé de remplacement d'un gène dans le génome d'une cellule eucaryote par insertion ciblée d'un gène étranger, ledit gène étranger étant obtenu par le procédé de la revendication 46.
49. Vecteur utile dans un procédé de remplacement d'un gène dans le génome d'une cellule eucaryote par insertion ciblée dudit gène étranger, caractérisé en ce que ledit gène étranger est préparé selon le procédé de la revendication 46.
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