CA2182906C - Surfaces hautement specifiques pour reactions biologiques, procede pour leur preparation et procede pour leur utilisation - Google Patents

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Abstract

La présente invention concerne notamment une surface hautement spécifique po ur réactions biologiques, caractérisée en ce qu'elle comporte un support présentant en surface au moins une couche essentiellemen t compacte d'un composé organique présentant, à l'extéri eur de la couche, un groupement exposé comportant une double liaison éthylénique ayant une affinité pour un type de molécule à activité biologique dans certaines conditions de réaction, les autres éléments de la couche étant essentiellement non accessibles pour lesdit es molécules dans lesdites conditions de réaction.

Description

~ 1 ~2~~6 i W095/22USG PCTIFR95/OOIGJ

SURFACES HAUTEMENT SPECIFIQUES POUR REACTIONS BIOLOGIQUES, PROCEDE POUR LEUR
PREPARATION ET PROCEDE POUR LEUR UTILISATION.
' S La présente invention concerne notamment des surfaces très hautement spécifiques utilisables en biologie ainsi que leurs applications et des procédés pour leur préparation.
On connait deprüs longtemps la très grande spécificité et la très grande sëlectivitê de certaines réactions biologiques, notamment les 1ü rëactions antigéneslanticorps, les réactions d'hybridation d'ADN ou d'ARN, les réactions interpratéines ou de type avidine/streptavidine/biotine, de mëme que les réactions des ligands et de leurs récepteurs.
On sait maintenant tirer partie de ces spécificités, notamment 1i pour mettre en évidence la présence ou l'absence de l'un des éléments du couple réactionnel dans un échantillon ou bien éventuellement pour séparer l'un des éléments du couple d'un milieu plus complexe.
Toutefois, lorsque l'on souhaite détecter la présence d'une molécule à très faible concentration dans un milieu trës comglexe, les procédës actuellement connus donnent parfois des résultats très-aléatoires, compte tenu notamment du problème des bruits de fond intervenant lors des étapes de séparation etJau de détection.
C'est pourquoi, ce qui sera appelé ci-après "péche moléculaire", c'est-à-dire la possibilité de pouvoir mettre en évidence 25 chacune des molécules qui sont recherchëes lorsqu'elles sont' à des concentrations trës faibles, n'a jusqu'ici pas été passible.
A titre d'exemple, l'analyse d'un échantillon d'ADN passe par i'utilisation d'une sonde dite d' °hybridatian" correspondant à la séquence complémentaire de la séquence recherchée. Dans ces conditions, le 30 problème posé est d'isoler l'hybride du milieu et de détecter avec un ban rapport signal/bruit (S/N) le nombre ëventueliement réduit de réactions ' positives.

C'est pourquoi on utilise maintenant, dans la plupart des cas, une étape intermédiaire destinée à amplifier la séquence que l'on cherche à détecter, par exemple en utilisant la méthode PCR ou des méthodes d'amplification conduisant aux mémes résultats, dans ces conditions on augmente la concentration de la séquence à déterminer dans l'échantillon et cette détection est évidemment beaucoup plus commode.
Cependant, l'étape d'amplification est sensible aux contaminants et conduit à des erreurs qui lui sont propres.
I1 serait donc préférable, dans la mesure du possible, de pouvoir détecter la présence de la séquence d'acide nucléique sans phase d'amplification.
On a proposé d'utiliser, de façon à mettre en évidence la réaction d'hybridation spécifique, une étape intermédiaire d'ancrage du produit d'hybridation sur une surface solide présentant certaines spécificités. Par exemple, il est possible d'utiliser certaines surfaces prétraitées permettant de fixer certaines protéines ou de l'ADN, qu'il ait été ou non modifié.
De telles surfaces sont commercialement disponibles (Covalink, Costar*Estapor, Bangs, Dynal*par exemple) sous forme de billes ou de puits présentant à leur surface des groupements COOH, NH2 ou OH par exemple.
I1 a été proposé également pour obtenir de tels groupements d'utiliser une étape intermédiaire présentant un groupement vinyl qui est ensuite oxydé pour présenter des groupes COOH ou OH (USA 1.539.061 et EP
X35 785).
On peut alors fonctionnaliser l'ADN avec un groupement réactif, amine par exemple, et procéder à une réaction avec ces surfaces.
Ces méthodes nécessitent cependant une fonctionnalisation particulière de l'ADN à fixer.
On a également décrit une technique permettant l'ancrage sans traitement préalable de l'ADN. Ce procédé consiste à faire réagir le phosphate libre de l'extrémité S' de la molécule avec une amine secondaire (surface NH Covalink).
* (marques de commerce) . WQ 95!22056 PCT/FR95/OüIG4 On peut aussi fixer l'ADN à un groupement ou une protéine Pp pour la faire réagir avec une suface recouverte d'un groupement ou ' une protéine I't, susceptible de réagir spécifiquement avec P0. L.e couple Pp/Pt peut être un couple de type biotine/streptavidine ou â digoxigénine/antïcorps dirigé contre la digoxigénine, (anti-DIG) par exemple.
De telles surfaces sont, cependant, dans la plupart des cas insuffisamment spécifiques (VV. Lund et al., Nucl. Acids Kes., 16, 1861 (1988)). Ainsi, la présence d'interactions parasites, mëme faibles, de type adsorption non-spécifique conduit à des adsorptions efficaces pour des molécules langues, capables de contracter avec le solide un grand nombre de points d'interaction faible. Ces surfaces conduisent à des applications potentielles manquant de sensibilité et/ou avec un grand taux de bruit de tond dans le cas d'un petit nombre de molécules à pëcher. De plus, certaines de ces surfaces présentent un Fort taux de fluorescence parasite potentiellement gênante lors de la phase de dëtection.
Pour ce qui concerne la détection proprement dite, en particulier pour la mise en évidence de l'ADN, le brevet rrançais 78 10975 décrit un procédé couplant Ia sonde à une enzyme qui permet la révélation à l'aide d'un substrat chromogène. I( est, en outre, possible de quantifier la réaction par une mesure de colorimétrie.
Une telle technique n'est cependant pas adaptée directement à la détection de traces, c'est pourquoi, là aussi, elle doit ëtre précëdëe dans la plupart des cas d'une étape d'amplification de la quantité d'acide
2> nucléique recherchée, par exemple par la méthode PCft.
Ce procédé de détection dit "par sonde froide" a été développé
pour ëviter l'utilisation de marqueurs radioactifs qui donnent des résultats qui en sensibilité sont voisins mais qui évidemment présentent des problèmes de manipulation, comgte tenu de la présence de produits radioactifs et des problèmes de temps de révélation longs si on cherche une grande sensibilité.

W0 45!22Q56 PCTIFRySltlti tl~
q Pour certaines applications particulières, notamment des mëthodes dêrivées de l'imagerie ex-vivo, on a propose une mëthode directe d'observation de la réaction en couplant le produit de l'hybridation à des microbilles, notamment de PAfMIA, convenablement traitées chimiquement à leur surface. (.a méthode repose sur l'identification directe sous microscope à balayage électronique de la prësence de ces microbilles d"un diamètre typique de 60 nm et de plus repose sur les techniques d'ancrage sur solides connués mais insuffisamment spécifiques, ainsi qu'il a été
décrit plus haut.
Les techniques ci-dessus ne sont évidemment pas limitées à ia détection d'acides nucléïques. Dans le mémo esprit, on a. proposé par exemple la détection d'anticorps. Il s'agit des tests de type EIdSA que nous ne redécrirons pas ici et qui, pour résumer, permettent de coupler la présence d'un anticorps 3 un ancrage associé d'une molécule d'antïgène T5 sur un solide. A nouveau, les prablémes de spécificité et de rëactions parasites se posent. La phase de détection peut se baser ensuite sur un couplage à une réaction chromogène ayant ses propres problémes de sensibilité.
En résumé, les méthodes de la technique antérieure ou leurs ~3 combinaisons présentent un certain nombre d'inconvënïents, notamment - soit d'~tre potentiellement dangereuses par mise en oeuvre de produits radioactifs, - soit de nécessiter des temps de révélation trop longs, ?5 - soit d'étre génées par des problëmes spécifiques au niveau de la phase d'amplification, - soit de passer par des surfaces solides insuffisamment spécifiques, soit d'étre trop peu sensibles, - soit, enfin, de nécessiter en plus de la phase d'accrochage sur un solide l'utilisation peu commode, évidemment, d'un microscope électronique.
Enfin, dans la plupart des cas, les procëdés connus ne permettent pas de reconnaïtre sur une molécule donnée la position spécifique du motif recherché. Or ce type de reconnaissance est important lorsque l'on cherche à faire une cartographie, en particulier dans le cadre de la cartographie du génome, on cherche à connaitre dans un premier temps la position spatiale approximativé par rapport à ûne e~rtrémité de la molécule d'un gène donné sur un ADN ou un ARN.
La présente invention qui se propose de remédier aux inconvénients des procédés antérieurs repose sur l'utilisation de surfaces très hautement spécifiques qui lors de leur mise en oeuvre conduisent à
des bruits de fond excessivement limités, en particulier du fait qu'elles éliminent les fixations parasites.
Plus particulièrement, la présente invention concerne une surface hautement spécifique pour réactions biologiques, caractérisée en ce qu'elle comporte un support présentant en surface au moins une couche monomoléculaire et compacte d'un composé organique de structure allongée:
- ayant au moins un groupement de fixation présentant une affinité
pour le support, et un groupement exposé comprenant une double liaison éthylénique n'ayant pas ou peu d'affinité pour ledit support et ledit groupement de fixation dans les conditions de fixation, mais présentant une affinité pour un type de molécule biologique; et - ladite surface présentant, à l'extérieur de la couche, le groupement exposé comprenant la double liaison éthylénique ayant une affinité pour le type de molécule à activité biologique, ladite molécule étant un composé chimique présentant une activité biologique et étant capable de s'ancrer directement par absorption sur ladite surface pour un pH supérieur à 5 et strictement inférieur à
8.
Par "affinité", il faut entendre ici, aussi bien une réactivité
chimique qu'une adsorption d'un type quelconque, ceci dans les conditions de fixation desdites molécules biologiques.
Par "support", on entend désigner aussi bien un support solide qu'un support constitué par un élément non solide tel qu'une particule liquide ou gazeuse présentant, notamment, une couche compacte telle que décrite ci-dessus.

5a La surface est "essentiellement compacte", c'est-à-dire qu'elle limite l'accès de la molécule à activité biologique aux couches inférieures et/ou au support, étant entendu que des défauts de couverture de la surface sont tolérables. , ~i ~~~r~~
W0 9512205(, PC1'IFR95l001G4 Ces surfaces hautement spécïfiques pour réactions biologiques, comportent utx support présentant en surface des groupements à double liaison, notamment vinyl (-Cl-I=CH2, ci-après surfaces C = C) accessibles à la solution. Elles sont capables d'ancrer S directement des molécules d'intérët biologique (ADN, ARN, PNA, Protéines, ' lipides, saccharidesy dans certaines copditions de pH ou de teneur ionique du milieu. En particulier, ces surfaces ne nécessitent pas de modificatïan chimique particulière ni de la surface, ni des molécules bïologiques à
ancrer. Il n'existe pas de documents mentionnant une telle utilisation de surface à groupements v~nyl.
Par "ancrage", il faut entendre ici une fïxatïon par lien covalent résultant d'une rëactivité chimique, ou lien non covalent résultant d'interactions physico-chimiques telles qu'une adsorption de type quelconque, ceci d.tns les conditions de pH ou de teneur ionique du milieu de fixation desdites molécules biologiques.
Les surfaces selon la présente im=ention peuvent ëtre obtenues par la mise en oeuvre de divers procédés. On peut citer à, titre d'exemple (A~ une couche de polymère carboné, éventuellement branché, d'au 2ü mains 1 nm d'épaisseur, présentant des groupements comportant une double liaison éthylénique, . le reste de la couche étant constitué de groupements hydro-ou fluorocarbonés ;
(F3) des surfaces obtenues par déprit au ancrage sur un solide d'une ou plusieurs couches moléculaires, celles-ci peuvent étre obtenues par la formation de couches successives fixées par liaisons non covalentes, type film de Langmuir-131odgett, ou par auto-assemblage molëculaire; ceci permettant la formation d'une couche fixée par 3p liaison covalente.
Dans le premier cas, la surface peut ëtre obtenue par polymérisation d'au moïns un monomère générant en surface du ' polymëre ledit groupement comportant une double liaison ëthylénique, ou bien par dépolymérisation partielle de la surface d'urr polymère pour ' générer ledit groupement, ou encore par dépôt de poly°mère.

~~ 8~'i Dans ce procédé, le polymère formé présente des liaisons vinyls tel un dérivë polyénique, notamment des surfaces de type caoutchouc synthétique, tel que le polybutadiène, le poly~ïsogrène ou le caoutchouc naturel â Dans le deuxième cas, Ia surface hautement spécifique pour réactions biologiques selon la présente invention comporte - sur un support, une couche sensiblement monomoléculaire et compacte d'un composé organique de structure allongée ayant au moins 1ü . un groupement de fixation présentant une affinité pour le support, et un groupement exposé comportant une double liaison éthylénique, n'ayant pas ou peu d'affinité pour ledit support et ledit groupement de fixation dans les condïtïons de 1s fixation, mais présentant une affinité pour un type de molécule biologique.
Afïn d'obtenir une couche essentiellement compacte, les différents composés organiques sont, de préférence, susceptibles de réagir entre eux en dehors du groupement exposé pour créer des liaisons 20 transversales, an obtient ainsi une couche monomoléculaire "essentiellement" compacte grixce à laquelle le support devient pas ou peu accessible pour des réactions parasites.
De préférence, le composé organique présente un groupement de fixation â une extrémité et un groupement exposé à l'autre 25 extrémité. Il est bien entendu possible de prévoir des modes de réalisation différents dans lesquels, par exemple, le groupement de fixation serait situé au milieu de la molëcule, celui-ci disposant à chacune de ses extrémités d'un groupement exposé.
Les surfaces peuvent s'analyser selon :
30 a) le support, b) la molécule ayant un groupement exposé et un groupement de fixation sur le support, c) l'interaction entre le support et ladite molécule assurant la fixation.

W O 95J22U56 PCTlFR95J(I(i t ti.i La fixation peut ëtre tout d'abord de type non-covalent, notamment de type hydrophilelhydraphile et hydrophobe/hydrophobe, comme dans les films de Langmuir-Blodgett {K.Ii. ülodgett, j. Am. Chem. ' Scx. 57, 1007 (1935) et US 5.102.798).
Dans ce cas, le groupement de fixation sera, soit hydrophile, soit hydrophobe, notamment des groupements alkyles ou halogénoalkyles tels que Cl-I3, CF3, CHF3, CllyF.
La fixation peut être également de type covalent, le groupement de fixation va alors réagir chimiquement sur le support.
i0 Certaines surfaces de structure approchante ont dëjà été
mentionnées dans le domaine électronique, notamment iorsque les fixations sont covaientes, L. Netzer et j. Sagiv, j. Ant. Chem. Soc. 105, 674 { 1983) et IlS-A-~ 539 061.
L'homme de l'art dispose d'une très large gamme de 15 groupements. A titre d'exemple non limitatif on citera Ies groupements de type alkoxyde de métal, tel silane, chlorure de silane, éthoxysïlane, méthoxysilane.
Le groupement de fixation est évidemment choisi en fonction du support employé. Le support selon i'invention peut ëtre constïtué au 20 moins en surface, par un polymère, un métal, un oxyde de métal, un élément semi conducteur ou un oxyde d'élëment semi conducteur tel qu'un oxyde de silicium ou une de leur co:mbinaisnn. On cite en particulier le verre et le silicium oxydé on surface.
Parmi les groupements de fixation il faut citer plus 25 particuliérement les groupements de type aikoxyde de métal tel silane, chlorosilane, chlorosilane, silanoI, méthoxysiIane, ëthoxysilane, silazane, phosphate, hydroxy, hydrazide, hydrazine, amine, amide, diazonium, pyridine, sulfate, sulfonique, carboxylique, boronique, halogène, halogénure d'acide, aldéhyde.
30 Tout partïculièrement, comme groupement de îïxation on préfërera utilïser des groupements susceptibles de réagir transversalement avec un groupe équivalent, voisin, pour fournir Ies liaisons transversales, par exemple il s'agira de drives de type silanc, notamment dictxlorosilane, trichlorosilane, diméthoxysïlane, 35 triméthoxysilane, diéthoxysïlane et triéthoxysilane.

21 ~2~~
WO 95!22056 FCTIFIt95/OOlG4 Ces liaisons transversales peuvent aussi être effectuées à un point quelconque dans l'ëpaisseur de la monocouche. en la polymérisant à
' l'aide de groupements réactifs éventuellement présents sur la draine entre le site de fixation et le groupement exposë. Aïnsi, les groupements p diacétyléniques sont connus pour permettre une polymérisation uni- ou bi-dimensionnelle de la monocouche.
Le choix du groupement de Rxatian dépendra évidemment de la nature du support, les groupements de type silane sont bien adaptés pour la fixation covalente sur le verre ec la silice.
De préférence, les chaines reliant le groupement e:,posé au groupement de I'matïon sont des chaïnes comportant au moins 1 atome de carbone, de prëfërence plus de 6 et en général de 3 à 30 atomes de carbone.
Lorsqu'il y a formation d'un couplage latéral à l'intérieur mème de la couche, que ce couplage soit ionique, de coardinance ou cavalent, on 1~ obtient des couches hautement ordonnées obtenues par auto-assemblage, mème si la surface initiale ne présente qu'un nombre réduit de sites d'ancrage actifs comparé au nombre de molécules obtenues dans une manocouche compacte.
On peut avantageusement utiliser, dans Le cas du verre ou de la silice, les techniques connues de fonctiannalisation de surface utilisant des dérivés silanes, par exemple : Si-OI-I + CL3-Si-R-CH=CI-IZ donne Si-O-Si-R-C1-f=CHZ, R consïstant par exemple en (CH 2 ).y. Une telle réaction est connue dans la littérature, avec utilisation de solvant ultra-purs. La rëaction conduit à un tapis de molécules présentant leur extrémité C=C â la surface ?5 exposée à l'extérieur.
Dans le cadre de l'obtention de surface à très haute spécificité, la présente invention concerne aussi pour de telles réactions de greffage de molécule â double liaison C=C l'utilisation d'une phase gazeuse, permettant d'éviter l'utilisation de solvant.
30 Dans le cas de l'or, celui-ci étant éventuellement sous la forme d'une couche mince sur un substrat, les techniques connues de t'~'O !t5122t156 PCT1FR94/Ot) 16.1 fonctionnaIisation de surface utilisent des dërivés thittls, par exemple : Au + HS-R-CH=CH2 donne Au-S-R-CH=C1I2, lt consïstant par exemple en (CH2).t.
Line telle réaction est dëcrite en milieu liquide et conduit, de rnëme que la réaction précédente trichlorosilane-silice, à un tapis de molécules 5 présentant leur extrémitë C=C à la surface exposée â l'extërieur.
Bien entendu la terminologie de "support" englobe aussi bien une surface unique telle qu'une lame, mars également des particules qu'il s'agisse de poudre de silice ou de billes de polymère, et aussi des formes quelconques telles que barre, fibre ou support structuré, lesquelles 10 peuvent d'ailleurs sire rendues magnétiques, fluorescentes ou colorées, comme cela est connu dans différentes technologies de dosage.
De préférence, le support sera choisï pour ëtre pas ou peu fluorescent lorsque la détection sera effectuée par fluorescence.
Les surfaces obtenues selon les modes (A) ou (B) ci-dessus présentent une grande spécificité grâce à la présence de sites réactifs spëciftqtees provenant, soit des groupes exposes, coït de Ia molëcule fixée.
En outre, les surfaces obtenues selon les modes (A) au (B) présentent les caractéristiques inattendues et remarquables suivantes (i) un ancrage spëcifique fortement pH dépendant de l'ADN
par ses extrémités sans nécessité d'une fonctionnalisation particulière de la molêcule, accompagné d'un très faible taux d'interactions non-spécifiques ;
(ü) lot possibilité d'y ancrer des protéines et d'autres molécules d'intérét biologique, sans modification chimique particulière ;
(iii) la possibilité de préparer des surfaces spécifiques vis â
vis d'un antigène (par exempte digoxigënine) ou d'un ligand (par exemple biotine) ;
(iv) un très faible taux de fluorescence intrinsèque, lorsque cela est requis, un bruit de fond de fluorescence (d'une aire typique de 100 x 100 tam) plus faible que le signal de fluorescence d'une seule molécule à détecter ;
(v) la possibilité de détecter des molécules isolées avec un rapport S/N indépendant du nombre de molécules, qui est passible grâce â dïfférentes techniques à grand rapport S/N
décrites plus bas et basées sur l'identification de Ia présence d'un marqueur macroscopique présentant une faible interaction non-spécïfique avec la surface.
Les surfaces ainsi obtenues sont, de préférence, revétues d'une molécule à activité biologique choisie parmi - les protéines, - les acides nucléiques, - les Lipides, - les polysaccharides et leurs dérivés, Parmi les protéines, il faut citer les antigènes et les anticorps, les ligands, les récepteurs, mais également des produits de type avidine ou streptavidine ainsi que les dérivés de ces composés.
Parmi les ARN et les ADN, il faut également citer les dérivés h a, p ainsi que les dérivés thio et les composés mixtes tels que les PNA.
On peut également fixer des composés mixtes tels que les glycopeptides et les lipopolysaccharides par exemple, ou bien d'autres éléments tels que virus, cellules notamment, ou composés chimiques tels que la biotine.
2U La fixation des molécules biologiques peut étre covalente ou non-covalente, par exemple par adsorption, liaisons hydrogènes, interactions hydrophobes, ioniques, par exemple, auquel cas on pourra procéder avantageusement à un pontage ("cross-linking") entre les molécules greffées par Ies méthodes connues ("Chemîstry of Protein 25 Conjugation anl Cross-linking~, S.C. Wong, CRC Press (1991jj et ceci afin de renforcer leur cohésion.
Avec un groupement exposé comportant un radical -CH=Cflz qui sera nommé ci-après "surface C=C" ou "surface à liaïsori éthylénique~, un ancrage direct, en particulier de l'ADN ou des protéines, est possible.
30 Dans Le cadre de la présente inventïon, il a été démontré que ces surfaces présentent une réactivité très fortement gH dépendante. Cette particularité permet d'ancrer les acides nucléiques ou les protéines, notamment par leurs) excrémité(s), en utilisant une zone de pH
déterminëe et souvent avec une vitesse de réaction qui peut ëtre contrdlée 35 par le pH.

~~ ~'~~~~
WQ ~JS12205f, PCTIFI295fOk1ld ]7 Ainsi, pour l'ADN à pH 5,5, 1a réaction d'ancrage est totale en une heure (si pas limitée par la diffusion) et se produit par les eW rëmités.
A pli 8, par contre, l'accrochage est trës faible (vitesse de rêaction do 5 à

ordres de grandeur plus faibles). Cet effet d'accrochage pH dépendant et spécïfique des extrémités, présente une amélioration par rapport aux autres surfaces qui nécessitent une fonctionnalisation de l'ADN (biotine, DIG, NHS, ...) ou des réactifs spécifiques (carbodümide, dirnéthy'le pïmélidate) qui réalisent une liaison peptidique ou phosphorimide entre -Nliz et -COOH ou -POOII.
Les surfaces selon l'invention peuvent ancrer des protéines directement (protéine A, anti-DIG, anticorps, streptavidine, etc.). Il a été
observé que (i) l'activité de la molécule peut ètre préservée et (ü) que la réactivité de la surface préparée (initialement C=C) est totalement occultëe pour faire place à Ia seule réactivité de la molécule d'intérét. II est donc possible, à partir d'une rëactivité initiale relativement large, de passera une surface possédant une réactivité trés hautement spéeifique, par exemple celle de sites spécifiques sur une protéine.
En ancrant un anticorps spécifique sur la surface (par exemple anti-DIG), on crée une surface dont la réactivité est limitée à
l'antigêne (par éxemple ie groupement DIG). Ceci indïque que les groupements chimiques initiaux ont tous été occultés par les anticorps ancrés.
On peut aussi ancrer sur Ies surfaces réactives (chimiquement ois biochimiquement} d'autres molécules à activité
"S biologique, notamment des virus ou d'autres composants : membranes, récepteurs membranaires, polysaccharides, PNA, notamment.
II est également possible de fixer le produit d'une réacûon d'intérét biologique (par exemple la PCit) sur les surfaces préparées.
La présente invention concerne également les surfaces 30 obtenues par la mise en oeuvre des procédés selon la présente invention et tous les procédés mettant en oeuvre ce type de surface, qu'il s'agisse de procédés permettant la mise en évidence etlou la quantification de molécules biologiques, mais également la séparation de certaines molécules biologiques, notamment un prélévement par mise en oeuvre des 35 techniques de couplage antigène/anticorps et/ou ADN, ADN/Ai2N.

WO 95122056 PCTIFR95/001(ia La présente invention concerne également des procédés de préparation des surfaces hautement spécifiques pour rêactions biologiques tels que décrits précédemment pour l'obtention des couches selon (A) et (B) et, en particulier, le procédé caractérisé en ce que - on fixe sur un support une couche sensiblement monomoléculaïre et compacte d'un composé organique de structure allongée ayant au moins un groupement de fixation présentant une affinité pour le support, et . un groupement expasé comportant une double liaison éthylénique, n'ayant pas ou peu d'affinité pour ledit support et le groupement de fixation dans les conditions de fixation, mais présentant une affinité pour un type de molécule biologique.
La présente invention concerne également les applications des surfaces traitées à la détection de molécules isolées à l'aide de réactifs spécifiques et de méthodes de détection à rapport S/N indépendant du nombre de molécules détectées.
Aia= de façon générale, la présente inventian concerne un procédé de mise en évidence et/ou de dosage d'une molécule â activité
biologique dans un échantillon, caractérisé en ce qu'on utilise une surface telle yue décrite précédemment, sur laquelle se trouve fixée une molécule à activité biologique capable de reconnaitre Ia molécule de l'échantillon, et en ce que la mise en évidence ou le dosage sont effectués grâce à un réactif fluorescent ou non détectant la présence de la molécule fixée.
Parmi les réactifs on distingue les réactifs Iluorescents et les réactifs non-fluorescents.
Les réactifs fluorescents contiennent des molécules fluorescentes, choisies avec avantage pour étre des molécules longues de taule supérieure â 0,1 wm et réagissant de manière spécifique directement ou indirectement avec les surfaces prétraitées. Par exemple, mais sans pour autant s'y limiter, une molécule d'ADN double brin teintée â l'aide de sondes fluorescentes (ethidium bromide, YOYO, nucléotides fluorescents, etc.) pouvant s'ancrer directement sur une suface C=C, au par une modification de la molécule {DIG, biotine, etc.) sur une surface présentant des protéines complémentaires {anti-DIG, streptavidine, etc.).

1~
Les réactifs non-fluorescents consistent, notamment, en des billes ancrées par L'intermédiaire d'une molécule fixée de manière.
spécifique directement ou indirectement à une surface prétraitée. Grâce au traitement des surfaces, ces billes présentent une faible interaction S non-spécifique avec la surface. Par exemple, mais sans pour autant s'y limiter, des billes Dyna~ recouvertes de streptavidine et ancrées par l'intermédiaire d'un ADN biotynilé à une surface selon la présente invention, présentant des sites capables de réagir avec l'autre extrémité
de la molécule d'ADN.
Selon que la molécule recherchée est détectée directement par fluorescence ou indirectement à l'aide des réactifs ci-dessus, on parlera de "détection directe" ou "par drapeau".
Afin de limiter les problèmes associés à des temps de réaction prohibitivement lents, on peut avantageusement réduire les temps de 1~ diffusion des réactifs vers la surface en utilisant de petits volumes de réaction. Par exemple, mais sans s'y limiter en conduisant la réaction dans un volume de quelques microlitres déterminé par l'espacement entre deus surfaces dont l'une est traitée pour présenter des sites réactifs selon la présente invention et l'autre est inerte ou traitée pour ne pas présenter de sites réactifs.
La détection du nombre de réactions spécifiques s'étant produites peut étre réalisée sur un petit nombre de molécules (typiquement 1 à 1 000), par un test physique macroscopique faible bruit ne nécessitant ni microscope électronique ni radioactivité ni 2~ nécessairement la PCR.
Les procédés de détection sont susceptibles d'étre mis en oeuvre. par des personnes n'ayant qu'une expérience de laboratoire réduite.
Selon le réactif, deux mises en oeuvre de la présente invention (mode X et mode Y) sont utilisables pour la détection macroscopique faible bruit d'un petit nombre de réactions d'ancrage du réactif.
* (marque de commerce) Dans la mise en oeuvre dite de mode X de la présente invention, un test du nombre de réactions spécifiques s'étant produites est.
obtenu directement par une technique de fluorescence, permettant pour certaines formes de la réalisation de la présente invention d'identifier individuellement le nombre de sites ayant réagi. Dans ce cas, la surface hautement spécifique est prise avantageusement pour présenter un taux très faible de fluorescence, notamment le support doit présenter une faible fluorescence.
Après ancrage du réactif fluorescent, la détection et le comptage du nombre éventuellement petit de réactions d'ancrage peut se faite avantageusement avec l'aide d'un microscope optique à fluorescence utilisant un objectif à grande ouverture numérique, permettant de 10 repérer soit directement à l'oeil, soit après acquisition de signal, le nombre de molécules fluorescentes ancrées.
On peut avantageusement procéder à un balayage du champ d'observation pour explorer une plus grande surface que le seul champ fixe.
Dans la mise en oeuvre dite de mode Y de la présente invention, on détecte un ' réactif macroscopique de type bille (fluorescente, magnétique, colorée, par exemple).
La technique telle que décrite ci-dessus permet à la réaction d'être révélée par la présence ou l'absence de microbilles.
L?ans un mode de réalisation un nouveau procédé comprend (i) l'utilisation de billes à réactivité spécifique, (ü) l'utilisation de billes de tailles non pas nanoscopiques mais se situant dans la gamme 0,1 ~m-200 wm, décelables par une technique macroscopique, et (iii) l'absence de réaction non-spécifique entre billes et surface due à l'utilisation du produit selon la présente invention.
Le nombre de ces billes macroscopiqûes caractérisant chacune une réaction d'ancrage est ensuite déterminé par une méthode physique macroscopique au rang desquelles, mais sans s'y limiter, on peut citer la diffusion de lumière sur les billes, la microscopie optique et la fluorescence des billes.

WO 95!22054 PCTIFR95101)lba La spécificité de certaïnes réactions biologiques peut ëtre limitée. Ainsi, dans ie cadre de l'hybridation, les hybrides peuvent Vitre imparfaits (rëactions avec d'autres sites) tout en présentant un nombre réduit d'appariement et donc une qualité de liaison moïndre. I~ présente invention couvre également l'utilisation possible d'une étape de test de la qualïté des liaïsons obtenues. Ce test permet de dissocier les produits appariés de façç.n non-spécifique faible, par adsorptïon, forces hybrophobes, liaisons hydrogènes imparfaites, hybridatian ïmparfaite, notamment.
ï0 C'est pourquoi, l'invention concerne également dans un procédé de mise en évidence ou de dosage tel que décrit prëcëdemment, un procédé où I'on soumet Ie produit de réaction entre la molécule à activité
biologique et Ia molécule de l'ëchantillon â une contrainte afin de détruire les mauvais appariements avant la détection.
Ce procédë offre, outre la possibilité de détruire les couples misappariés, la possibilité d'orienter les produïts du couplage, ce qui facilite les mesures ou les observ~atïons.
On peut ainsi applïquer aua surfaces, après fixation des éléments complémentaires, une contrainte qui peut ëtre constituée par ?0 l'utilisation sïmpIe vu combinée de - cenirïfugation, - gradient de champ magnétique appliqué aux réactifs nvn-fluorescents pris alors pour inclure des microbilles magnétisables ou magnétiques, - agitation, écoulement liquide, - passage de ménisque, - électrophorèse - variation de température, et/vu gradient de tempërature.
On détermine alors par Ies techniques de détectïon faible bruit décrites ci-après le nombre de systèmes ëtant restés intégres ou s'étant détruits.

~W09512205G ~ PCTIFR951001Gd 1r Il convient de remarquer que gràce aux surfaces selon la présente invention, il est possible d'orienter les molécules après leur fixation par au moins un point par passage du mënisque airJeau, notamment sur de l'ADN. Ainsi, an a remarqué que le passage du ménique air/eau sur de l'ADN en solution et ancré à la surface, résultait en une ewension régulière des molécules ancrées. Elles se présentent alors à l'air libre sous forme de bàtonnets fluorescents allongés. Ces molécules allongées sont stables à l'air libre et peuvent étre obsen~ées méme après plusieurs semaines, sans présenter de dégradation apparente.
Ces observations remarquables et inattendues suggèrent une possibilité de compter le nombre de molécules d'ADN ancrées à la surface d'une part, les surfaces étant très peu fluorescentes, le rapport signallbruit (S/N} est bon, d"autre part, recherchant un objet très corrélé
(forme de bâtonnets), il est très facile d'augmenter le rapport S/N. C'est-à-dire, ignorer les poussières, les inhomogénéités, qui ne présentent pas de corrélation spatiale particulière. Il faut noter qu'en solution, les molécules en pelote fluctuent thermiquement, ce qui entraine des variations très importantes de leur signal de fluorescence recueilli, en général, avec une faible profondeur de champ et limite leur observation.
1.a présente invention couvre aussi cette technique d'alignement et d'immobilisation qui permet donc l'ohsen~ation de molécules isolées avec un très grand rapport S/N.
Il est remarquable que ce rapport est indcpendant du nombre de rëactions d'ancrage. Le rapport S/N posë par 1a détection d'une ?S molécule est le méme que pour 10 000. De plus cette technique d'étirement permet de discriminer aisément entre des molécules de longueurs variées.
On peut avantageusement procéder aux étapes suivantes pour améliorer encore le rapport S/N
- La molécuie étant immobile, on peut intégrer son signal de fluorescence.
- L'observation au microscope présente un champ réduit (typiquement 100 wm x 100 wm avec un objectif x 100 à immersion, N.A. = 1.25). Pour un échantillon de 1 cmz on peut soit procéder à un balayage, soit envisager l'utilisation d'objectifs d'agrandissements moindres (x 10 ou x 20) mais d'ouverture numérique élevée.

~~~~i wo 9srzzas6 pcr>rx~rsrmrtsa 1s - Les bâtonnets êtant toujours parallèles, on peut envisager une méthode de fïltrage spatial optique pour augmenter encore le rapport SlN.
- D'autres méthodes de fluorescence globale sont envisageables {~P »
10342f~).
- Ia linéarisation des molêcules s'obsen~e aussi bïen dans le cadre d'un greffage chimique {C=C) que dans le cas de liaisons de type immunologïque (DIClanti-DIG).
- Une fais la surface à l'air libre, les molécules d'ADN sont stables (restent intëgres, mëme après plusieurs semaines) et fluorescentes.
On peut avantageusement utiliser cette propriétë pour différer l'étape d'ancrage de l'étape de repërage/comptage des molécules ancrées, si cette détection se faït par exemple, mais sans s'y lîmiter, par microscopie â fluorescence. Une telle utilisation est couverte par la présente ïnvention.
- Une technique de doubla (ou multi) fluorescence peut éventuellement sewir à améliorer le rapport SIN ou à détecter une double ou multi fonctionnalité.
- Il est possible d'étendre le ménisque airlcau utilisé ici afin d'étirer 2() la molécule à d'autres systi'mes tels que huileleau ou eaulsurfactant/air, notamment.
On peut aussi utiliser une orientation dynamique des molécules en solution ancrées à une extrémité, par élcctrophorese ou écoulement dans une ou plusieurs directions successïvcs, une tells' 2S technique pouvant ainsi conduire à une détection synchrone de la présence de molécules dans une direction donnée, pa,r analyse des variations temporelles du signal de fluorescence correspondant à une direction donnée {par exemple, mais sans sy limiter pour autant, par utilisatîon d'un Litre spatial optique convenablement disposé, permettant 30 d'obtenir un signal préférentiel pour certaines orïentations des molécules observées).
Néanmoins, les résultats observés montrent que cette technique, dans sa version la plus simple (étirement dans une seule direction, sans détection synchrone) est beaucoup moins performante que 35 l'utilisation du ménisque.

~~ ~~~~~3 R'O 95122056 PCTIFR95/OO1G4 Les surfaces et/ou les rëactifs et/ou les techniques de détection décrits dans Ia prësente inventian peuvent ëtre utilisés paur de nombreuses applications parmi lesquelles, mais sans s'y restreindre - l'identificatïan d'un ou plusieurs éléments de séquençage d'ADN ou ' S d'ARN que l'on peut utiliser avec avantage pour le diagnostic de pathogènes ou la cartographie génëtique ;
- la mesure de la taille de fragments d'ADN que l'on peut utiliser avec avantage pour la cartographie génétique ;
- l'amélioration de Ia sensibïlité des techniques d');LISA avec la possibilité de détecter un faible nombre (éventuellement inférieur à I 000) de réactions immunologiques.
L'identification de séquences d'ADNIARN peut se faire d'abord par réaction dans le volume de la solution des molécules d'ADN/ARN avec des sondes complémentaires (par exemple par l i hybridation ou à l'aide de protéines spécifiques du segment recherché).
L?eut modes d'opération sont alors possibles.
Les descriptions qui vont suivre seront, pour certaines, faites en se référant aw figures annexées sur lesquelles - la figure 1 schématise la détection d'un pathogène dans une molécule d'ADN fluorescente par hybridation avec une molécule ancre ;
- la figure ? schématise ta cartographie génétique par extension de l'ADN et l'utilisation d'un ADN marqueur ;
- Ix figure 3 schématise la détection d'une réaction immunologique ?> (ELISA) à l'aide d'une molécule "drapeau" : un ADN fluorescent utilisé comme marqueur de réactïon ;
- la figure ~i est une microphotographîe de fluorescence montrant l'e:aension d'ADN de phxge 5, par l'avancée du ménisque, à gauche on aperçoit des molécules d'ADN en soiution étirées par l'écoulement d'évaporation parallèle au ménisque, à droite des molécules d'ADN à l'air libre après leur étirement perpendiculairement au ménisque ;

~~ ~~~~~a wa ssrz~ass rcTrlix~sloot6.s - les figures 5(a) et 5(b) sont des microphotagrap.hies de fluorescence montrant, respectivement; un ADN marqué à la digogixénine (DIG) sur une surface recouverte d'anti-DIG et étiré par le ménisque, et, en contrôle, un ADN non marqué sur une surface anti-DIG, an remarquera 3a très grande spécificité. des surfaces et l'absence d'ancrage non-spécifique ;
- 1a figure 6 est une microphotographie de fluorescence montrant une surface eam,merciale classique telle que NUNC, on remarquera les très grandes inhamogénitis de fluorescence qui rendent ces surfaces impossibles à utiliser pour la détection fluorescente d'une seule molécule.
Dans le mode "diagnostic", les sondes (las "ancres") possèdent un groupement réactif (DIG, butine, etc.) capable de s'ancrer de maniëre spécifique à une surface selon la présente ïnventïota (ayant par exemple comme site d'ancrage un anticorps anti-D1G ou la streptavidin~).
La dëtection de la réaction d'ancrage peut se faire directement par détection de la fluorescence de la molécule d'ADN teintée par des molécules fluorescentes (ethidium brornide, YOYO, nucléotides fluorescents) (Figure I ). Elle peut aussi se faire indirectement par dëtection d'une; "molécule drapeau" : un réactif selon la présente invention capable de se fixer sur la molécule d'ADNIAItN (par exemple par hybridation, interaction pratéine-ADN, etc.), mais ne présentant pas d'affinité pour les sites d'ancrage de la sonde.
Dans le mode "cartographie", les sondes complémentaires ~5 peuvent étre directement couplées à un réactif fluorescent selon la présente invention. Il peut s'agir par exemple d'un simple brin d'ADN
complémentaire possédant des bases modifiées pour ëtre fluorescentes ou d'un long double brin d'ADN teinté avec un fluorophore A et se terminant par un segment simple brin complémentaire de la séquence recherchée.
30 Pour des sondes différentes, des fluorophores de différentes couleurs peuvent ëtre utilisés. On peut aussi, avec avantage, teindre la molécule d'ADN sur laquelle les sondes viennent s'hybrider avec un fluoraphore d'une autre couleur. L'hybride ADN-sondes est ancré en l'une de ses extrémités et êtiré par une des méthodes décrites précédemment. La 3S distance du point d"ancrage aux points d'hybridation,ou entre les points d'hybridations, est déterminée par la détection de la fluorescence de la sonde, suivant les méthodes décrites précédemment (figure 2).

Par exemple, sans pour autant s'y limiter, un ADN marqueur, d'environ 3 000 paires de bases et ayant .en une de ses extrémités un segment simple brin complémentaire du gène recherché, est teinté avec un fluorophore A (par exemple YOY01 ). Cet ADN est hybridé puis ligué
avec l'ADN simple brin à cartographier, puis ce dernier est teinté avec un deuxième fluorophore B (POPO1) (après réaction par "random primming", pour le transformer en ADN double brin). La molécule est alors ancrée par une de ses e~.~trémités (par exemple par liaison DIG/anti-DIG) et étirée par l'action du ménisque. La distance entre l'extrémité de la molécule et la postion du gène marqué, observable en microscopie par double fluorescence (2 couleurs A et B) permet d'établir la position du gène recherché avec une précision de l'ordre de 1 000 paires de bases (0,3 gym).
L'identification de séquences d'ADN/ARN peut aussi se faire par réaction entre la séquence recherchée et les sites réactifs d'une surface selon la présente invention (par exemple des oligonucléotides complémentaires ou le site de réaction d'une protéine spécifique du segment recherché). La détection de la réaction d'ancrage peut alors se faire directement ou indirectement (à l'aide d'une "molécule drapeau") comme décrit précédemment.
II est bien entendu que l'identification de séquences d'ADN/ARN suivant la présente invention peut aussi bien servir à des fins de diagnostic (par exemple la détection de la présence ou l'absence d'un pathogène viral ou chromosomique) qu'à des fins de cartographie génétique. Elle peut ètre précédée d'une étape d'amplification par une méthode quelconque, notamment la PCR.
Par ailleurs, la cartographie génétique peut procéder par une mesure de fa taille de fragments d'ADN. Or le couplage entre les surfaces selon la présente invention et les techniques originales d'étirement des molécules décrites plus haut (en particulier et avec avantage l'étirement par le ménisque) permet une mesure de la longueur des molécules étirées et cela sur un très petit échantillon (quelques milliers de molécules).
On peut, par exemple, mais sans sy restreindre, procéder de la manière suivante wo ~snzosc rcz'rFxvsromsa zt Un échantillon d'ADN est fragmenté (à l'aide d'enzymes de restriction), teinté avec un fluoroghore guis ancré sur une surface présentant des groupements réactifs (par exemple les surfaces C=C). Les molëcuies sont ensuite ëtirées par le ménisque et la taille des fragments S étirés déterminée par microscopie optique à fluorescence avec une rësolution et une taille limite de l'ordre de 1 000 bp (0,3 gym).
Les surfaces selon la présente invention peuvent étre utilïsées pour la mise en ocuvre des procédés connus permettant la mise en évidence etlau la quantification d'un antigène ou d'un anticorps, notamment les méthodes ELISA mettant en oeuvre des systémes enzymatiques ou des méthodes de type RIA mettant en oeuvre des marqueurs radioactifs. 1t s'agit là de technologies qui ne seront pas redécrites en détail.
On peut aussi et avantageusement utiliser les surfaces selon la présente invention comme support des réactions immunologiques d'un procédé EL1SA possédant une étape d'ancrage d'un réactiF selon la présente invention ("drapeau") sur l'un des rëactifs de l'ELISA (figure 3).
La détection peut naturellement se faire de façon globale par mesure de fluorescence. Il est possible aussi de procéder au comptage du nombre de réactions, ceci peut avantageusement s'effectuer suivant les méthodes de détection décrites dans 1a présente invention, en particulier 1'etrtension par le mënïsque, et ceci gràce au faible taus de fluorescence et d'interaction non-spécifique du produit de la présente mention. Ceci permet la détection d'un petit nombre de réaction, éventuellement ?5 inférieur à 1 000) avec un excellent rapport S/N.
On geut donc, par une modification mineure des méthodes ELISA en sandwich (anticorps-antigène-anticorps modifié, par exemgle biotynilé), venir greffer sur la surface un réactif selon la présente invention, par exemple de l'ADN fluorescent ancré à la streptavidïne.
Toutes les variantes de la technique EI1SA s'apgliquent avec une sensibilitë bien meilleure. Des techniques de mesure de fluorescence giobale sont dé3à utilisées pour déterminer la quaIitë des réactions d'FLISA. Cependant, le procédé selon l'invention permet une détection bien meilleure car sensible au signal de fluorescence d'une seule 35 molécule.

WO 9512056 PCTlFR95I0016~t Bïen entendu, il est possible d'utiliser ces surfaces comme surfaces de fixation d'au moins un produit d'une réaction d'intérêt biologique, à titre d'exemple sans pour autant s'y limiter, des produits de la réaction d'amplification, qu"il s'agisse de PCI2 ou d'une méthode S apparentée et, enim, il est possible d'utiliser ce type de surfaces comme support pour une chromatographie d'affinité, quelle soit préparative ou de détection.
Dans ce cas, on peut par exemple greffer une population d'olîgonucléotides donnée sur des billes de sïlice qui constitueront la phase stationnaire d'une colonne de chromatographie.
L'étape de chromatographie doit permettre une spécificité
particuliére de ia colonne vis à vis d'ëluants, par exemple un mélange d'ADN dont certains présentent des séquences romplémentaires ou très voisines de l'oligonucléotide greffé.
1~ La présente invention concerne enfin l'utilisation des surfaces selon la présente invention dans des trousses de diagnostic ou de séparation.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaitront à la lecture des exemples ci-après.
~(atériels et méthodes L'ADN->' et l'armicorps monoclonal (Anti-DIG) proviennent de Boehringer-Mannheim. Les trichlorosilanes proviennent de Roth-Sachiel. Les sondes nucléiques fluorescentes (YOYO1, YOYO3 et POPO1) proviennent de Molecular Probes. Les lamelles de verre ultrapropres proviennent de Erie Scientific (Lamelles (ESCO). Les particules magnétiques proviennent de Dynal. Le màcroscope est un microscope inversé Diaphot de NIKKON, équipé d'une lampe Xenon pour I"épi-fluorescence et d'une caméra CCD intensifiée Hamamatsu pour la visualisation.
Traitement de surface Des lamelles de verre saut nettoyées pendant une heure par irradiation UV sous atmosphère d'oxygène (par formation d'ozone). Elles sont ensuite immédiatement déposées dans un dessicateur préalablement purgé de traces d'eau par un courant d'argon. Un volume d'environ L00 à
3S 50O w1 du trichlorosilane approprié (HZC=CH-(Cli2)xr-SiCl3 est introduit dans le dessicateur, d'où les surfaces sont retirées après envïron 12 heures ( n =
6) ou 1 heure (n = 1). Au sortir les surfaces sont nettes et non-mouillantes.

WO 95122051 PCTlFit9Slüü764 2=t les lamelles ainsi fonctionnalisées peuvent réagir avec des protéines. Un volume de 300 Ixl d'une solution aqueuse (2O ~g/ml) de protéines (protéine A, streptavidine, etc.) est déposé sur une lamelle fonctionnalisée en groupement (112C=CH-). Cette lamelle est incubée S environ deux heures ~ température ambiante, puis rincée trais fais dans de l'eau ultrapur~. Les surfaces aïnsi traitées sont nettes et mouillants.
Les surfaces traitées à la protéine A peuvent ensuite réagir avec un anticorps, par exemple âttti-DIG, par incubation dans une solution de 20 ~g/ml d'anticorps.
Ancraee d'ADN natif sur surface double liaïson Une goutte de 2 ~1 d'une solution d'ADN->,, marqué par fluorescence (YOYO1, POPOI au YOY03, mais sans terminaison particuliëre) du concentration variable et dans différents tampons (nombre total de malëcules < 107) est déposé sur une iamelle prétraitée (HIC=CH-) et recouverte d'unè lamelle de verre non traitëe (diamètre 15 mm). La préparation est incubée environ 1 heure â tempërarure ambiante dans une atmosphêre saturée en vapeur d'eau. Dans un tampon de 0,05 M MES
(pH = 5,5), on obsewe un ancrage quasi-général des molécules d'ADN. Par contre dans un tampon de 0,01 hl Tris (pH = &) il n'y a presqu'aucune molécule d'ancrée (rapport > 10E'. Cette dépendance peut permettre le contrôle de l'activatianldésactivatian des surfaces (vis-à-vis de l'ADN) par l'intermédiaire du pH.
I îétewicm de l'a~tcra2e oar l'action du ménisoue En transférant la préparation précédente dans une Z; atmosphère sèche:, la solution en s'évaporant va étirer les molécules d :ADN, ancrées a la surface, perpendiculairement au ménisque. La force capillaire sur la molécule d'rIDN (quelques dizaines de pïcoNewtons) est en effet suffisante pour étirer complètement la molécule (plus grande que les forces d'ëlasticité entropique), mais trop faible pour briser la liaison entre l'extrémité de la molécule et la surface traitée. L'ADN étant marqué
par fluorescence, an obsen~e individuellement et aisément les molëcules étirées (longueur totale environ ?Z gym). L'ancrage entre ia surface et l'ADN étant limité aux extrémités, on a pu aussi bien étirer des ADN de phage x, de YAC au de E coli (longueur totale supérieure ~ 400 um). Cette préparation d'ADN étirés, fluorescents et à l'air WO 95/22056 PCTfFFt95I0016d libre est stable pendant plusieurs jours et peut étre observëe de façon non destructive, par épilluorescence (miçroscope inversé Nikkon Diaphot avec objectif x100, O.N.: 1.25).
Détection de l'ancrage nar électroohorèse 5 Une cellule électrophorétique est formée par un anneau de paraffine (épaisseur environ 100 gym) pris entre une lamelle traitée et une lamelle de verre non-traitée entre lesquelles deux électrodes de platine sont insérées. L'ensemble est rendu solidaire en fondant brïèvement l'anneau de paraffine. Grâce à deux ouvertures laissées dans l'anneau de 10 paraffine on introduit la solution d'ADN dans cette cellule par capillarité, puïs on scelle les deux ouvertures â la paraffine. On incube, comme précédemment, â température ambiante. En appliquant une faible tension (quelques volts) entre les deux électrodes de platine, on observe par fluorescence un mouvement des molécules d'.ADN libre(quelques dizaines 15 de microns par seconde) et une extension dans la direction de l'écoulement des molécules ancrées que l'on peut ainsi identifier aisément et individuellement par microscopie en épifluorescence.
Ancrage et détection soécifioues En traitant les surfaces comme dëcrit précédemment avec un 20 anticorps monoclonal spécifique, on peut contrôler très précisëment leur spécificité. Ainsi, on a testé la spécificité de surfaces traitées anti-DIG
vis-â-vis d'ADN-hybridés avec un oligonuclëotide complémentaire d'une des extrémités Cos et possédant un groupement digoxigénine (DIG) et vis-â-vis d'A17N non hybridës. Dans Ie premier cas, an a observé une extension, par 7â action du ménisque, quasi-générale des molécules ancrées. Dans le second cas, on n'a observë que quelques molécules d'ADN (< 10) ancrées dans tout l'échantillon. On estime donc que la spécificitë de la méthode selon l'invention est meilleure que 10~.
Se s' jtïtë de la détection Afin de déterminer la sensibilïté de la méthode de dêtection par extension du ménisque, on a déposé sur des surfaces double liaison des gouttes de 2,5 w1 d'une solution d'ADN-~ dans 0,05 M MES (pI-i = 5,5) contenant un total de 105, 10a et 1 000 molécules. L'ancrage s'effectue comme décrit précédemment. Les lamelles sont ensuite observées en microscopie par épifluorescence, pour déterminer la densité de molécules ~~ B~~C
wo asraaass rcr~i~srooma ancrées- Celle-ci correspond bien à celle estimée : environ 4-6 molëcules d'ADN par eham,g de vision (100 wm t 100 ~.m) pour un total de 105 molécules d'ADN. Pour la plus faible concentration, on a pu observé une dizaine de molécules étendues par action du ménisque. Ce nombre est essentiellement limité par le grand nombre de champs de vision nécessaires à couvrïr tout l'échantillon (environ ?5 000), ce qui rend une recherche manuelle difficile, mais peut âtre avantageusement effectue automatiquement et avec un objectif plus faible, mais à plus grand champ.
En conclusion, la sensibilité de la méthode selon l'invention permet une détection et un comptage individuel de moins de 1 000 molécules d'ADN.

Claims (49)

REVENDICATIONS
1) Surface hautement spécifique pour réactions biologiques, caractérisée en ce qu'elle comporte un support présentant en surface au moins une couche monomoléculaire et compacte d'un composé organique de structure allongée:
- ayant au moins un groupement de fixation présentant une affinité
pour le support, et un groupement exposé comprenant une double liaison éthylénique n'ayant pas ou peu d'affinité pour ledit support et ledit groupement de fixation dans les conditions de fixation, mais présentant une affinité pour un type de molécule biologique; et - ladite surface présentant, à l'extérieur de la couche, le groupement exposé comprenant la double liaison éthylénique ayant une affinité pour le type de molécule à activité biologique, ladite molécule étant un composé chimique présentant une activité biologique et étant capable de s'ancrer directement par absorption sur ladite surface pour un pH supérieur à 5 et strictement inférieur à
8.
2) Surface selon la revendication 1, caractérisée en ce que le support est un support solide.
3) Surface hautement spécifique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le groupement exposé est un groupement vinyl.
4) Surface selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par polymérisation d'au moins un monomère générant en surface du polymère à double liaison éthylénique ledit groupement exposé, par dépôt de polymère sur le support ou par dépolymérisation partielle de la surface d'un polymère pour générer ledit groupement exposé.
5) Surface selon la revendication 4, caractérisée en ce que le polymère est une polyoléfine ou un dérivé polyénique.
6) Surface selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la fixation est de type non-covalente.
7) Surface selon la revendication 6, caractérisée en ce que la fixation est effectuée par des interactions hydrophiles ou hydrophobes.
8) Surface selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le groupement de fixation est choisi parmi les groupements alkyle et alkyle halogène pour réaliser des liaisons hydrophobes.
9) Surface selon la revendication 8, caractérisée en ce que le groupement de fixation est choisi parmi : -CH3, CF3, -CH2F, CHF2.
10) Surface selon la revendication 1, caractérisée en ce que la fixation est de type covalent.
11) Surface selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que le composé organique est susceptible de réagir avec un autre composé
organique en dehors du groupement exposé pour créer des liaisons transversales.
12) Surface selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que le composé organique présente le groupement de fixation à une extrémité
et le groupement exposé à l'autre extrémité.
13) Surface selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que le groupement de fixation est choisi parmi les groupements de type alkoxyde de métal, silanol, silazane, phosphate, hydroxy, hydrazide, hydrazine, amine, amide, diazonium, pyridine, sulfate, sulfonique, carboxylique, boronique, halogène, halogénure d'acide et aldéhyde.
14) Surface selon la revendication 13, caractérisée en ce que le groupement de type alkoxyde de métal est choisi parmi le silane, le chlorosilane, le méthoxysilane et l'éthoxysilane.
15) Surface selon la revendication 14, caractérisée en ce que le silane est choisi parmi le mono, di ou tri-chlorosilane, mono, di ou tri-éthoxysilane et mono, di ou tri-méthoxysilane.
16) Surface selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que le groupement exposé est soit relié directement au groupement de fixation, soit par des chaînes comportant au moins un atome de carbone.
17) Surface selon la revendication 16, caractérisée en ce que les chaînes comportent de 3 à 30 atomes de carbone.
18) Surface selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisée en ce que le support est constitué au moins en surface par un polymère, un métal ou un oxyde de métal, un élément semi-conducteur, un oxyde d'élément semi-conducteur, notamment un oxyde de silicium, ou une de leur combinaison.
19) Surface selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisée en ce que le support est constitué au moins en surface par du verre ou de la silice.
20) Surface selon l'une des revendications 1 à 19, caractérisée en ce que le support est sous forme de plaque de bille, de fibre, ou de particules.
21 ) Surface selon la revendication 20, caractérisée en ce que lesdites particules sont magnétiques, fluorescentes ou colorées.
22) Surface selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisée en ce que la molécule à activité biologique est choisie parmi - les protéines, - les acides nucléiques, - les lipides, - les polysaccharides et leurs dérivés.
23) Surface selon la revendication 22, caractérisée en ce que la molécule à activité biologique est choisie parmi ;
- les anticorps, - les antigènes, - les ADN, - les ARN et leurs dérivés, et - les ligands ou leurs récepteurs et leurs dérivés.
24) Procédé de préparation d'une surface hautement spécifique pour réactions biologiques selon l'une des revendications 1 à 23, caractérisé en ce que on fixe sur le support solide la couche monomoléculaire et essentiellement compacte du composé organique de structure allongée ayant au moins .cndot. le groupement de fixation présentant une affinité pour le support, et .cndot. le groupement exposé n'ayant pas ou peu d'affinité pour ledit support et le groupement de fixation dans les conditions de fixation, mais présentant une affinité pour un type de molécule à activité biologique.
25) Surface revêtue d'une molécule à activité biologique, caractérisée en ce qu'elle comporte une surface hautement spécifique pour réactions biologiques selon l'une des revendications 9 à 23 sur laquelle est fixée ladite molécule à activité biologique.
26) Surface selon la revendication 25, caractérisée en ce que la molécule à activité biologique est choisie parmi - les protéines, - les acides nucléiques, - les lipides, - les polysaccharides et leurs dérivés.
27) Surface selon la revendication 26, caractérisée en ce que l'ADN
fixé comporte la séquence complémentaire d'une séquence d'ADN à isoler d'un échantillon.
28) Surface selon a revendication 26, caractérisée en ce que la protéine fixée est capable de reconnaître et fixer spécifiquement une protéine à
isoler d'un échantillon.
29) Surface selon l'une des revendications 26 et 27, caractérisée en ce que ladite molécule à activité biologique est choisie parmi la biotine, l'avidine, la streptavidine ou leurs dérivés.
30) Procédé de mise en évidence et/ou de dosage d'une molécule à
activité biologique dans un échantillon, caractérisé en ce qu'on utilise une surface selon l'une des revendications 25 à 29 sur laquelle se trouve fixée une molécule à activité biologique, selon l'une quelconque des revendications 22 et 23, capable de reconnaître la molécule de l'échantillon, et en ce que la mise en évidence ou le dosage sont effectués grâce à un réactif fluorescent ou non détectant la présence de la molécule fixée.
31) Procédé selon la revendication 30, caractérisée en ce que la surface est à faible fluorescence et en ce que le réactif est fluorescent.
32) Procédé selon la revendication 31, caractérisée en ce que le réactif est constitué par des billes.
33) Procédé selon l'une des revendications 30 à 32, caractérisé en ce que la détection est faite par microscopie.
34) Procédé selon l'une des revendications 30 à 33, caractérisé en ce qu'on soumet le produit de réaction entre la molécule à activité biologique et la molécule de l'échantillon à une contrainte afin de détruire les mauvais appariements avant la détection.
35) Procédé de mise en évidence d'une séquence d'ADN ou d'une protéine dans un échantillon, caractérisé en ce que :
on utilise une surface hautement spécifique selon l'une des revendications 1 à 23;
on met l'échantillon en contact avec la surface dans des conditions de formation d'un hybride ADN/ADN, ADN/ARN ou protéine/protéine;
l'hybride étant marqué, on l'étire par tout moyen physico-chimique pour orienter les molécules et on effectue la mesure ou l'observation des molécules ainsi orientées.
36) Procédé selon la revendication 34, caractérisé en ce qu'on étire le produit de réaction par passage d'un ménisque dans le sens de l'étirement.
37) Procédé selon la revendication 35, caractérisé en ce qu'on étire l'hybride par passage d'un ménisque dans le sens de l'étirement.
38) Procédé selon l'une quelconque des revendications 36 et 37, caractérisé en ce que le ménisque est un ménisque air/eau.
39) Procédé selon l'une des revendications 34 et 35, caractérisé en ce que l'étirement est effectué par un champ électrique agissant sur les molécules ou un champ magnétique agissant sur une : particule magnétisable ou magnétique.
40) Procédé selon l'une des revendications 34 et 35, caractérisé en ce que l'étirement est effectué par voie mécanique.
41) Procédé selon l'une des revendications 34 à 40, caractérisé en ce que l'ADN fixé et l'ADN de l'échantillon sont "colorés" de façon différente et en ce que, après étirement, on mesure la position de la séquence complémentaire par rapport à l'extrémité de l'ADN de l'échantillon.
42) Procédé selon la revendication 41, destiné à la cartographie des gènes.
43) Procédé selon l'une des revendications 41 à 42, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une méthode ELISA ou RIA.
44) Procédé selon l'une des revendications 41 à 42, caractérisé en ce que l'échantillon est le produit d'une amplification d'acide nucléique.
45) Procédé de fixation d'un acide nucléique ou d'une protéine sur une surface telle que définie selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, dans lequel on réalise un ancrage par adsorption de l'ADN ou de la protéine notamment par une extrémité en mettant l'ADN ou la protéine en présence de la surface dans une zone de pH déterminée.
46) Procédé de fixation de l'ADN sur une surface présentent des groupements à double liaison éthylénique selon la revendication 45, caractérisé
en ce qu'on met l'ADN en présence de la surface à un pH inférieur à 8.
47) Procédé de fixation selon la revendication 46, caractérisé en ce que la réaction est conduite à un pH compris entre 5 et 6 puis est stoppée à
pH
8.
48) Trousse de diagnostic, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une surface hautement spécifique selon l'une des revendications 1 à 23.
49) Trousse de diagnostic selon la revendication 48, caractérisée en ce qu'elle comporte, en outre, un réactif fluorescent ou un réactif comportant des billes.
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