CA2200627A1 - Procede d'amplification de sequences d'acide nucleique par deplacement, a l'aide d'amorces chimeres - Google Patents

Procede d'amplification de sequences d'acide nucleique par deplacement, a l'aide d'amorces chimeres

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Abstract

Pour amplifier une séquence d'acide nucléique cible (12), en présence d'un système enzymatique comprenant des activités d'ADN polymérase, de déplacement de brin et de RNAse H, on utilise une amorce chimère (A1, A2) comprenant successivement, dans le sens 5' ? 3', un segment de type ARN capable de s'hybrider avec un segment de l'extrémité 3' de la cible et un segment de type ADN capable de s'hybrider avec un segment contigu audit segment d'extrémité 3' de la cible, et une amorce B1, de type ADN ou ARN, capable de s'hybrider avec ledit segment de l'extrémité 3' de la cible. On obtient une amplification cyclique pouvant être mise en oeuvre de façon isotherme et réalisable indifféremment à partir d'une cible ADN ou ARN, même lorsque les extrémités ne sont pas définies.

Claims (9)

1. Procédé d'amplification d'une séquence d'un acide nucléique cible, ladite séquence comprenant, à partir de son extrémité 5', une région amont et, à partir de son extrémité 3', une région aval, ledit procédé comprenant les étapes consistant:
- à obtenir un polynucléotide monobrin de type ADN comprenant un premier segment correspondant à la séquence cible à amplifier et comprenant en outre un deuxième segment de séquence arbitraire, situé en aval de l'extrémité dudit premier segment, et - à mettre en contact ledit polynucléotide monobrin, en présence d'un système enzymatique ayant une activité d'ADN polymérase ADN- dépendante, une activité de déplacement de brin et une activité RNAse H, et en présence d'un excès de désoxyribonucléosides triphosphates, avec un ensemble d'amorces, présentes en excès, comprenant:
a) une première amorce chimère comprenant successivement, dans le sens 5' -> 3':
- un segment de type ARN, de séquence complémentaire d'au moins une partie de la séquence du second segment dudit polynucléotide monobrin, ladite partie contenant l'extrémité 5' dudit second segment, - et un segment de type ADN capable de s'hybrider avec au moins une partie de ladite région aval, ladite partie contenant l'extrémité 3' de ladite région aval, et/ou b) une seconde amorce chimère comprenant successivement, dans le sens 5' -> 3':
- un segment de type ARN de séquence arbitraire, - et un segment de type ADN, homologue d'au moins une partie de ladite région amont, ladite partie contenant l'extrémité 5' de ladite région amont, étant entendu que:
soit la première amorce contient, en amont du segment de type ARN, un second segment de type ADN de séquence arbitraire, mais dont au moins une partie contenant son extrémité 3' est capable de s'hybrider avec une partie contenant l'extrémité 3' dudit polynucléotide lorsque ledit segment d'ARN est plus court que ledit second segment dudit polynucléotide simple brin, soit la première amorce ne contient pas un tel second segment de type ADN et dans ce cas, ledit ensemble d'amorces contient alors une troisième amorce dont au moins une partie, contenant l'extrémité 3' de ladite troisième amorce, est capable de s'hybrider avec au moins une partie du second segment dudit polynucléotide simple brin, et étant entendu que:
soit la seconde amorce contient, en amont du segment de type ARN, un second segment de séquence arbitraire de type ADN, soit la seconde amorce ne contient pas un tel second segment de type ADN et dans ce cas ledit ensemble d'amorces comprend une quatrième amorce dont au moins une partie, contenant l'extrémité 3' de ladite quatrième amorce, est homologue d'au moins une partie de la séquence du segment de type ARN de la seconde amorce.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on utilise des première et seconde amorces ne comportant pas de second segment de type ADN, ainsi qu'une troisième et quatrième amorce.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que lesdites troisième et quatrième amorces sont de type ADN.
4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que lesdites troisième et quatrième amorces sont de type ARN.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le produit de départ est un acide nucléique contenant la séquence à amplifier et se prolongeant, au-delà de l'extrémité 3' de ladite séquence, par un segment polynucléotidique aval contenant une zone oligonucléotidique dite zone aval, et se prolongeant éventuellement au-delà de l'extrémité 5' de ladite séquence par un segment polynucléotidique amont, caractérisé par le fait que pour obtenir ledit polynucléotide monobrin de type ADN, on ajoute une cinquième amorce capable de s'hybrider avec ladite zone aval.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que l'on ajoute en outre une sixième amorce homologue d'une zone oligonucléotidique dudit segment REVENDICATIONS MODIFIEES

polynucléotidique amont.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que le produit de départ est un ARN contenant la séquence à amplifier, et que pour obtenir ledit polynucléotide monobrin de type ADN, on met en contact ledit ARN avec lesdites première et seconde amorces et le cas échéant avec lesdites troisième et quatrième amorces.
8. Nécessaire pour la mise en oeuvre d'un procédé d'amplification d'une séquence d'acide nucléique cible, caractérisé par le fait qu'il comprend un système enzymatique ayant une activité de RNAse H et au moins une amorce chimère comprenant successivement, dans le sens 5'~ 3':
- un segment, facultatif, de type ADN, - un segment de type ARN, - et un segment de type ADN.
9. Nécessaire selon la revendication 8, caractérisé par le fait qu'il contient en outre un système enzymatique ayant une activité d'ADN polymérase ADN-dépendante et une activité de déplacement de brin.
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