CA2228712A1 - Procede de detection d'acides nucleiques utilisant des sondes nucleotidiques permettant a la fois une capture specifique et une detection - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet un procédé de détection d'acides nucléiques caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: a) on réalise l'hybridation en solution d'une sonde d'acide nucléique de grande taille, notamment de plus de 100 nucléotides, capable de s'hybrider avec un ARN ou un ADN donné dans un échantillon contenant des acides nucléiques, ladite sonde portant des éléments de détection et des premiers éléments de capture sur support solide; b) on réalise la dégradation des séquences nucléotidiques non hybridées dans l'échantillon par un enzyme dégradant les acides nucléiques non hybridées; c) on effectue la capture des hybrides obtenus à l'étape b) en les mettant en présence d'un support solide revêtu des deuxièmes éléments de capture interagissant avec lesdits premiers éléments de capture de ladite sonde et d) on effectue la détection des hybrides ou des sondes après dénaturation des hybrides par l'intermédiaire desdits éléments de détection.

Description

PROCEDE DE DFIECIION D' 'DE~ NUCLEIQUI~ UTILISANT DES SOND}3 NUCLEOT~DIQUES PERMEl~ANT A ~ . FOIS UNE CAFI URE SPECIF~QUE EI UNE
Dkl~-llON

La présente invention concerne un procédé de détection d'acides nucléiques utilisant des sondes nucléo~idiques permettant à la fois une capture spécifique et une détection. La présente invention permet l'automatisation de la détection spécifique à grande échelle des acides nucléiques en utilisant une sonde ribonucléotidique simple brin complémentaire à une séquence nucléotidique cible, ladite sonde permettant à la fois la capture sur une surface appropriée et une détection rapide et sensible.
Par le biais des grands programmes de séquencage et d'analyse des génomes, la biologie est rentrée depuis quelques années dans une ère nouvelle, celle de l'acquisition m~ssive de données, basée sur l'utilisation intensive de techniques e.~;istantes améliorées. D'ici cinq à di.~; ans, le génome de plusieurs organismes modèles ainsi, que le génome humain seront totalement séquencés. Le nombre de gènes codés par le génome humain étant calculés entre 50.000 et 100.000, plusieurs milliers de ~0 séquences de régions codantes (cDNA) ainsi que de régions régulatrices (promoteurs) devront etrc répertoriées, analysccs et intégrées dans dcs bases de données, et leurs profils d'e~prcssion dans une centaine de tissus ou cellules pourront etre ctablis.
Le profil d'e~pression d'un gène consiste en l'étude de l'abondance relative de l'ARN messagcr (ARNm) correspondant e,~;primé dans des cellules particulières (par c,~;ample, appartenant à des tissus différents, ou répresentant differents stades du developement, des pathologies particulières, des inductions par des drogues, e~c). L'établissement des profils d'e~;pression des gènes requicrt donc la détection spécifique et sensible des ARNm.
La détection des ARNm spécifiques peut ctre cntreprise par dcu.~;
types d'approches différentes: cellcs basées sur des techniques d'amplification et celles basées sur des lechniqucs d'hybrida~ion.

W O 97/05277 PCTA~R96/01201 L'utilisation de techniques d'amplification, ~el que la RT-PCR
(Reverse transcriptase-Polymerase Chain Reaction), apparait peu utilisable dans un projet d'étude de prof~ls d'expression d'ARNm à grande échelle du fait du coût que demanderait la synthèse du grand nombre 5 d'oligonucléotides nécessaires à sa réalisation (pour 50.000 gènes différents, le nombre minimum serait de 100.000 oligonucléotides).
La technique d'hybridation "sand~ich" décrite pour la première fois par Dunn A.R. et l~assell J.A. (1977, cell, 12, 23-36) a été développée pour éviter la purification et l'immobilisation d'acides nucléiques cibles 10 qui nécessitaient auparavan~ une détection après une hybridation en phase solide. Cette technique est basée sur l'e~;istence de dew; sondes, non chevauchantes, dirigées contre le même acidc nucléique cible La première sonde est immobilisée sur une surface solide, et permet la capture de la cible. La deuxième sonde possède un traceur dans sa 15 séquence, et permet la détect~on de la cible. Cette technique est essentiellement utilisée pour la détection de produits d'amplification.
Effectivement les sondes utilisées SOIIt de petitcs tailles (de 20 à 25 nucléotides) et à la différences de sondes longucs, elles ne permettent pas l'obtention de forts signaux d'hybridation. Cette technique cst peu adaptée 20 à la détection simultanée d'un nombre important de cibles, car chaque sonde nécessite des temperatures d'hybridation qui peuvent être différentes La deuxième approche est basée sur des techniques d'hybridatio ne faisant pas appel à une amplification, et qui rcquièren~ donc une 25 grande sensibilité. Il existe plusieurs forma~s qui pcuven~ être utilisés pour détecter une hybridation spécifique: I'hybrida~ion en phase liquide;
I'hybridation en phase solide; I'hybridation in si~u sur des ~issus ou corps cellulaires. Dans tous les cas, la sonde est un acide nucléiquc (ADN ou ARN) capable de s'hybrider à une séquence d'acide nucléique complémcntaire:
30 la cible (ADN ou ARN). Les ciné~iques des différen~es réactions d'hybridation des acides nucléiques son~ bien conllucs (Britten et al., 197 1, Me~hods Enzymol, 29, p.363; Kohme et al., 197 7 Biochemistry, 16, p.S3~9-5341), et la connaissance des paramètres impliqucs dans le ~aux d'hybridation ainsi que dans la stabilité des hybrides cible-sonde perme~
35 de déterminer les condi~ions op~imales pour obtenir le meilleur rappor~
signal sur brui~.

W O 97/0~277 PCT~FR96/01201 L'hybridation en phase liquide est très efficace s~ a l'avantage d'offrir le taux d'hybridation le plus rapide. Cependant, il est difficile de séparer la sonde libre de la sonde hybridée. Les méthodes d'hybridation en phase solide qui impliquent l'immobilisation de la cible (ou de la sonde) S sur une surface solide (ex: nitrocellulose, nylon) sont plus faciles à mettre en oeuvre du point de vue de la séparation de la sonde non hybridée.
Cependant, par rapport à l'hybridation en solution, le tau~; d'hybridation est de 7 à 10 fois plus lent. Enfin, I'hybridation in situ permet l'e,~;amen microscopique de séquences ADN ou ARN présent dans des cellules ou des 10 tissus tout en préservant leurs localisations. C'est une méthode appropriée aux laboratoires de cytologie ou d'histologie Dans le cas précis de la détection des ARN, la technique en phase solide dit du "Northern blot" cons~itue la méthode d'hybridation la plus répandue, utilisée aussi bien en analyse médicale qu'en recherche 15 fondamentale Le "Northern blot", bien qu'étant la seule méthode capable de fournir des informations sur la taille des messagers, et donc, sur l'identité de la cible, ne peut pas être considerée pour des analyses à
grande échelle à cause de sa faible sensibilité et des difficultés d'automatisation Pour des raisons similaires, la technique d'hybridation 20 in situ ne parait pas non plus appropriéc à des études de profil d'e~;pression d'ARN à grande échelle.
Parmi les méthodes de détection d'ARN basées sur l'hybridation cn solution, la technique de protection au.~; nucléases préscnte l'intêret d'etre une méthode très sensible et spécifique. Dans cette technique, des sondes ~5 radioactives ARN ou ADN simple brin sont hybridés cn solution avec des préparations d'ARN contenant l'ARN cible. Après hybridation, les acides nucléiques non hybridés (aussi bien la sonde non hybridé que les ARNs de la préparation) sont dégradés par action des nucléases spécifiques des acides nucléiques simple brin (en général, RNases A et Tl pour les sondes 30 ARN, et nucléase Sl pour les sondes ARN ou ~DN). L'hybridation de la sonde avec sa cible ARN complémentaire "protègc" la sonde de la dégradation par la nuclcase, et donne comme résultat des molécules double brin dont la longueur est définie par la complémentarité sonde-cible.

D'autre part, l'hybridation non spécifique de la sonde avec des ARN
autres que la cible, donne comme résultat des molécules double brin plus courtes que celles provenant de l'hybridation spécirlque. Le deu~; types des produits, spécifique et non-spécifique, peuvent donc etre distingués selon 5 la taille, l'analyse la plus habituelle étant l'electrophorèse en gel de polyacrylamide. Une technique alternative d'analyse par séparation chromatographique a été proposé dans WO 95/113116.
Si la technique de protection au~; nucléases présente l'avantage d'etre sensible et spécifique, la méthode analytique consistant à une 10 séparation électrophorétique ou chromatographique est incompatible avec une automatisation de la méthode et l'utilisa~ion d'un grand nombre d'échantillons.
La présente invention est destinée ~i perme~tre une détec~ion spécifique d'acides nucléiques, notamment d'ARN dans un format qui 15 rende possible la manipulat~on simultanée d'un grand nombre - d'échantillons par une procédure entièrement automatisable, tout en étant sensible, spéci~lque et reproductible.
Un autre but de la présente invention est en particulier de rournir une méthode qui permet-e la détection spécifique des ARNm a partir des ~0 ARN totau~;.
L'invention repose sur l'utilisatioll d'une méthode d'hvbridation en solution des acides nucléiques avec une sonde nucléo~idique qui, en plus d'une spécificité de reconnaissance apportée par sa sequence, possede des modifications lui permettant d'accomplir deu.~; fonctions différentes La 2S première fonction permet la fi~:atioll à un support solide de l'hybride sonde-cible ou de la sonde provenant d'un hybride sonde-cible préalablement dénaturé. La deu.~;ième fonction de la sonde permet une détection spécifique par des méthodes de détection radioactive ou froide.
De facon générale l'invention implique une méthodologie 30 comprenant:
( 1 ) une hybridation en phase liquide u-ilisant une sonde d'acide nucléique doublement marquee s'hybridant specifiquement avec un ARN
ou un ADN donné.

(2) une dégradation par des nucleases des séquences nucléo~idiques

3~ non hybridées W O 97/05277 PCTA~R96/01201 -S
(3) la séparation des hyb. ides par une capture spécifique sur un support solide des hybrides formés, par l'intermédiaire d'une modification de la sonde.

(4) une détection des hybrides grace à la modification précité, ou S par l'intermédiaire d'une autre modi~lcation présent sur la sonde.
Plus précisément la présente invention a pour objet un procédé de détection d'acides nucléiques caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: ' a) on réalise l'hybridation en solution d'une sonde d'acide 10 nucléique de grande taille, notamment de plus de 100 nucléotides, capable de s'hybrider avec un ARN ou un ADN donné dans un échantillon contenant des acides nucléiques, ladite sonde comprenant des éléments de détection et des premiers éléments de capture sur support solide;
b) on réalise la dégradation des séquences nucléotidiques non 15 hybridées dans l'échantillon ~3ar un enzyme dégradant les acides nucléiques non hybridées, c) on effectue la capture des hybrides obtenus ~ I'étape b) en les mettant en présence d'un support solide revetu des deu~;ièmes éléments de capture interagissant avec lesdits premiers élcments de capture de ladite ~0 sonde, et d) on effectue la détection des hybrides ou des sondes provenant des hybrides après dénaturation, par l'intermediaire dcsdits éléments de détection.
L'utilisation de sondcs de taille importante, notamment de plus de ~5 100 nucléotides, confère une plus grande spécificité d'hybridation et la possibilité d'introduire des modifications suffisantes pour la détection et la capture de la sonde tout en conservant la stabilité de l'hybridation.
En particulier la sonde comporte de 100 à 1000 nucléotides, de préférence de 250 à 500 nucléotides.
Un aspect de l'invention est lié à l'utilisation, après incubation avec des nucléases, d'une ou plusieurs techniques d'élimination d'oligonucléotides (moins de 100 bases), tels que la precipitation différentielle, la filtration à travers des membranes, la filtration sur gel (chromatographie d'e,~;clusion), ou toute autre technique permettant la 3~ séparation des hybrides cible-sonde des produits de dégradation des acides nucléiques notamment de la sonde non hybridée W O 97/05277 PCTA~R96/01201 En général, les deux fonctions de la sonde sont accomplis par deu:~
modifications nucléotidiques différentes. Cependant, il est à noter que la meme modification peut etre utilisée pour la capture et pour la détection.
Selon la présente invention, la sonde comprend une quantité

5 suffisante d'éléments de détections et d'éléments de capture pour assurer une capture puis une détection sumsante Toutefois, la quantité desdits éléments de détection et desdits premiers éléments de capture fi~:és sur la - sonde est optimisée pour être compatible avec l'hybridation de l'étape a) et la non dégradation des hybrides à l'étape b).
11 faut considérer que l'introduction de nucléo~ides modifiés dans les sondes bifonctionnelles peut provoquer une déstabilisation des hybrides spécifiques au niveau des appariements proches des modifications. Il ressort en effet des e.~emples illustrant l'invention décrits ci-après, que si la quantité des modifications de la sonde est trop 15 importante, l'hybrid~tion n'est pa-s suffisamment stable de sorte que meme les hybrides peuvent se trouver dégradés par les enzymes utilisés à l'étape b) ~
De préférence, lorsque les éléments de détec~ion et premiers éléments de capture sont des molécules biologiques substituées sur des ~0 nucléotides constituant la sonde, celle-ci ne doit pas comporter plus de 15 Yo, de préférence pas plus de 10 96 de nucleotides modifiés par lesdits éléments de détection et lesdits prmiers cléments de capture On comprendra également que ces quantités sont dependantes de la taille des molécules constituant les éléments de détection et éléments de capture. Si 25 I'encombrement stérique est trop grand, ils fragiliseront la stabilité de 1 'hybridation.
Les sondes nucléotidiques selon la présente invention peuvent etre des sondes ADN ou, de préférence, des sondes ARN. Lcs sondes ARN peuvent être obtenues par transcription in vitro et posscdent quelques avantages 30 par rapport au:~ sondes ADN. Les sondes ARN se trouvent directement sous la forme d'un simple brin, ainsi elles ne nccessitent pas de dénaturation.
D'autre part il n'c,~;iste pas d'interférence avcc un brin complémentaire comme pour les sondes ADN. Aussi, les sondes ARN forment des hybrides plus stables avec leurs cibles que ceu~ obtenus avec les sondes ADN.
De facon avantageuse, pour détectcr un ARNm e~;primé à partir d'un gène donné, on utilise une sonde d'ARN obtenue par transcription in vitro de fragments d'ADNc clonés du-dit gène W O 97/05277 PCT~FR96/01201 De façon avantageuse, on utilise une sonde d'ARN obtenue par transcription in vitro à l'aide de nucléotides dont certains sont modifiés par couplage à undit élément de détection et/ou undit élément de capture.
De nombreuses modifications peuvent etre incorporées dans les 5 ARN transcrits par les ARN polymérases SP6, T3, et T7. Par e,~;emple, des ribonucléotides comportant des groupements biotine (tels que biotine-UTP
et DIG-UPT), ou fluorescéine (tels que Fl-11-UTP, Fl-12-UTP) existent qui peuvent remplacer l'UTP dans les réactions de transcription in vitro catalisées par les ARN polymérases SP6, T3, ou T7, Aussi, d'autres types de 10 modifications peuvent etre incorporées au.~; ribonucléotides selon les techniques connues de l'homme de l'art, Après hybridation de la sonde bifonc~ionnelle avec la préparation contenant l'ARN cible, la sonde non hybridée doit etre dégradée dans des conditions qui n'entrainent pas une dégradation des hybrides spécifiques 15 sonde-cible, 1;~ méthode choisi p~ur éliminer la sonde non hybridée doit aussi tenir compte de la possible existence de régions simple brin dans l'hybride sonde-cible, afin de ne pas perdre une partie du signal spécifique, Il existe plusieurs enzymes ayant la capacité d'hydrolyser spécifiquement des acides nucléiques simple brin, Entre autres, on peut ZO citer la nucléase Sl, la nucléase de "mung bean" ou l'c.~;onucléase Vll, qui n'ont pas de spécificité de séquence, ct la RNasc A, la RNase CL3, la RNase Phy M, la RNase T1 ou la RNase U7, qui coupent seulement en amont et/ou en aval de certains nucléotides, Fait partie de la présente invention l'utilisation d'une ou plusieurs enzymes nucléolytiques spécifiques des Z5 régions simple brin ct n'étant pas spécifiques des nucléotides modifiés incorporés dans la sonde, Par e.~emple, si les ribosondes comportent des modifications liées à l'UTP, il faut de préférence utiliser la RNase T1 (qui coupe en 3' de G) e~/ou la RNase CL3 (qui coupe en 3' de C) et/ou la RNase UZ (qui coupe en 3' de A), de façon à diminuer la probabilité de coupure 30 autour des UTP modifiés dans l'hybride sonde-cible, De façon avantageuse lorsque l'on détecte dcs ARNm à l'étape a) on utilise une sonde d'~RN et à l'étape b) on réalise la dégradation enzymatique avec une RNase.

PCTA~R96/01201 _ _ Lorsque les éléments de détection et lesdits premiers éléments de capture sont substitués sur des nucléotides donnés, on utilise de préférence à l'étape b) un enzyme qui couple les acides nucléiques simple brin au niveau d'un nucleotide autre que lesdits nucléotides substitués.
En particulier les éléments de détection et lesdits premiers éléments de capture sont substitués sur des nucléotides d'Uridine et l'enzyme de l'étape b) est une RNase T1.
Le groupement de capture permet une fi.~;ation spécifique de la sonde sur la phase solide.
Dans un mode de réalisation, lesdits premiers éléments de capture de ladite sonde sont constitués par une première molécule biologique fi,~;ée de façon covalente à ladite sonde et lesdits deu.~;ièmes éléments de capture dudit support solide sont constitués par une deu,~;ième molécule biologique fi,~;ée sur le support solide, deu,~ième molécule biologique qui interagit et lS se lie de façon non covalente ave~ ladite premiere molécule.
On cite en particulier le mode de réalisation dans lequel lesdites première et deu,~ieme molécules constituent le couple biotine/streptavidine ou un couple antigène / anticorps ou encore plus particulièrement les premiers et deu.~;iemes elements de capture peuvent etre le couple digo.~igénine (DIG) et un anticorps anti-DlG ou la fluorescéine et un anticorps anti-fluoresceine, plus généralement, n'importe quel couple ligand- recepteur ou haptene-anticorps.
Selon l'invention, la capture des acides nucléiques hybrides sonde-cible ou de la sonde provenant d'un hybride sonde-cible préalablement dénaturée est faite sur une surface solide. Cette surface est de préférence, mais ne se limite pas, à une microplaque. La capture peut etre faite sur la surface d'un détec~eur de resonance plasma (Surface plasmon résonance Fisher et al. 1994, Curr. o~ Biotech. 5. 389-395). La surface choisie permet une fi.~;ation specifique de la sonde grâce à
I'immobilisation des molécules ayant une haute affinité pour les groupements de capture présents dans la sonde.
Le groupement de detection permet une mise en évidence spécifique de la sonde, Par e~;emple, la biotine peut etre reconnue par la streptavidine ou par un anticorps anti-biotine couplé à un enzyme; la DIG

W O 97/05Z77 PCTA~R96/01201 -par des anticorps arl~ OIG couplés à un enzyme, ou la Quoresceine par des anticorps anti-fluorescéine couplés à un enzyme. La détection peut etre également médiée par la présence d'un nucléotide radioactif dans la sonde.
L'élément de détection de la sonde peut etre un élément directement 5ou indirectement détectable. En effet, on entend par "élément de détection" une molécule pouvant être détectee, directement ou indirectement c'est-à-dire dans le dernier cas après liaison par interaction ou couplage covalent avec une autre molécule et/ou une particule solide. Par adétection directe" on entend notamment les cas où
10ladite molécule comporte elle-meme un élément détectable tel qu'un élément radioactif ou fluorescent, où ladite molécule est couplée à un enzyme que l'on peut détecter à l'aide d'un substrat ou encore ladite molécule est couplée à une molécule fluorescente Par "dé~ection indirecte", on entend notamment les cas où ladite molécule est une 15molécule biologique susceptible-de réagir de manière physico-chimique par une interaction non covalente ou par couplage covalent avec une autre molécule biologique elle-meme comportant un élément détectable directement tel qu'un atome radioactif ou fluorescenl, un enzyme ou une molécule fluorescente 20L'élément de détection indirectement détectable peut étre constitué
par une molécule biologique susceptiblc dc rcagir de manière non covalente avec une autre molécule biologiquc comportant un élément directement détectable tcl qu'un enzyme On cite en particulier les couples streptavidine/biotine ou antigène/anticorps. En particulier, I'élément de ;~5détection indirectement détectable est choisi parmi la biotine, la fluoresceine ou la DIG.
Dans le cas de la détection radioactive, la présence d'un nucléotide radioactif dans la sonde peut être par e.~emple décélée par comptage dans un détecteur de radioactivité adaptée à des microplaques~ Dans le cas de la 30détection froide, le groupemen~ de détection incorporé dans la sonde à cet effet peut etre reconnue à l'aide d'un ligand/anticorps spécifique conjugué à une enzyme, suivi d'une incuba-ion avec un substrat. Ainsi, la biotine peut etre reconnue par la streptavidinc ou par un anticorps anti-biotine couplé à un enzyme; la DIG par des anticorps anti-DlG couplés W O 97/05277 PCTA~R96/01201 _ .

à un enzyme, ou la fluoresceine par des anticorps anti-fluorescéine couplés à un enzyme. Les enzymes utilisées pour les détections froides peuvent etre, entre autres, la phosphatase alcaline, la pero,~idase ou la b galactosidase. Il e~;iste pour ces enzymes de nombreu~ substrats 5 colorimétriques, Fluorescents ou chemiluminescents. La mésure d'activité
enzymatique peut se faire par lecture automatique dans un colorimètre, fluorimètre ou luminomètre adapté au,~; microplaques.
Alternativement, si la surface de capture choisie est celle d'un biosensor de résonance de plasma, la présence de groupements de 10 détection dans la sonde peut etre déterminée par mesure directe de l'interaction avec des ligands/anticorps spécifiques.
Lorsque les éléments de capture et de dctec~ion sont des molécules biologiques substituées sur un nucléotide notamment de l'Uridine, on cite comme élément de détection ou de capture la biotine, la fluoresceine ou la 15 digoxigénine. Plus particulièr~ment l'élément de détection est la digo?~igénine et/ou la biotine el ledit premier élément de capture est choisi respectivement parmi la biotine ou la digo~;igénine. Dans un mode de réalisation, ledit premier élément de capture est la biotine ou la digo,;igénine, et les nucléotides portant ces modifications sont des Uridine 20 et ledit élément de détection est l~ DIG ou la biotine respectivement.
De préférence, le groupement de détection cs~ la DIG, le conjugué
est un anticorps anti-DlG couplé à la phosphatase alcaline, et le substrat permet une détection chemoluminescente.
Dans un mode de réalisation illustré par les e~;emples de la 25 description détaillée qui va suivre, la sonde comporte de 2 à 5% des nucléotides modifiés par couplage à undit élémcnt de détection consistant en une molécule de biotine, notamment 3 à 4%, et de 2 à 5% des nucléotides modifiés par couplage à undit premier élément de capture consistant en une molécule de digo~;igénine, notamment 2 à 3%.

La présente invention a égalemen~ pour objet une méthode de diagnostic dans laquelle on utilise une mé-hode de détection selon la présente invention comprenant la détec-ion d'acides nucléiques impliqués dans une pathologie La présente invention a également pour objet un l;it utile pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection ou de diagnostic selon la présente invention, caractérisé en ce qu'il comporte des sondes d'ARN de taille importante, notamment de plus de 100 nucléotidcs, portant des S éléments de détection et desdits premiers éléments de cap~ure sur support solide et un support solide revêtu desdits deu~;ièmes éléments de capture.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention appara tront à la lumière de la description et des e~;emples qui vont suivre faisant référence au,~ figures 1 à 10.
La figure lA représente les résultats de la fi,~;ation de 1 fmole de ribosonde biotine-DlG marquée au (32aP)CTP et permet de connaitre le pourcentage de biotine mis à incorporée dans la ribosonde nécessaire à
une bonne fi,~;ation sur plaque. Les ribosondes étudiées sont obtenues par transcription inverse à l'aide d'une proportion variable de biotine-UTP
(5,10,15,25,100%) et d'une quanti~é fixe de DIG-UTP (10%). La détection des ribosondes est effectuée par mesure de la radioactivité.
La figure lB représente la détection de 300 amoles dc ribosondes a l'aide d'anticorps anti-DlG (sytème de détcc~ion froid). Les ribosondes étudiées sont constituées à partir d'un pourcentage variable de biotine-UTP (5,10,15,25%), et de 10% de DIG-UTP.
La figure 2A montre la fi~;ation de ribosondes biotine-UTP (25 et 100%) marquées au (~32P)CTP avec une forte activité specifique(2 105 cpm/ fmole) . Ce qui permet de détermincr de facon plus précise la sensibilité de la fi~ation. Le ribosondes sont diluées de 2 en 2 à partir de 2,5jusqu'à 0,01 fmoles.
La figure 2B montre les résultats de la détection de ribosondes biotine-DlG en fonction du pourcentage de DIG dans la ribosonde, en utilisant un anticorps anti-DlG couplé à la phosphatase alcaline suivi d'une mesure de fluorescence.
La figure 3A représente la capture de ribosondes (biotine-UTP) hvbridées avec une séquencc nucleotidiquc complémentaire marquée au (~32P)CTP. Ce qui permet l'étude de la fh;alion des ribosondes sous ~orme double brim Les ribosond~s étudiées Sonl preparées à partir d'un - pourcentage variable de biotine-UTP (5, 15, 25, 35%). Les hybrides sont W O 97/05277 PCTAFR96/OlZOI

~ dilués de 2 en 2 de 2 à 0,015 fmoles. La détection des hybrides est effectuée par mesure de la radioactivité. Ces courbes montrent l'optimum de biotine-UTP dans la ribosonde (sous forme double brin) pour obtenir une bonne fixation.
La figure 3B représente la capture de ribosondes (5,15,25,35%
biotine-UTP) hybridées avec une séquence nucléotidique (35% DIG-UTP) marquée au (~32P)CTP. Ce qui permet l'étude de la fixation des ribosondes sous forme double brin. La détection des hybrides est effectuée par mesure de la radioactivité.
La figure 4 montre l'influence du pourcentage de DIG-UTP sur l'importance du signal de détection à l'aide d'anticorps anti-DlG. Les sondes étudiées sont constituées de 15% biotine-UTP et de (5,15,20,25% de DIG-UTP) .
La figure 5 montre l'utilisation de ribosondes DIG-UTP dans un test fonctionel de protection aux nuc~ases.
Les ribosondes étudiées sont constituées de DIG-UTP (0, 5,15, ~5 et 35 %). E~lles sont radiomarquées au (~32P)CTP.
Chaque ribosonde est hybridée avec une séquence ribonucléotidique complémentaire (10 ou lng) en présence de 10 ~g de ARN de levure (+). Il a été cffcctué pour chaques sondes un controle sans digestion par la Rnase Tl (-), et un controlc RNase sans sonde complémentaire (0).
La figure 6 représente l'autoradiographie d'un gel de polyacrylamide et montre la sensibilité de détection à l'aide d'une ribosonde radiomarquée constituée de 15% de biotine-UTP et de 10% de DIG-UTP par rapport à la mcme ribosonde radiomarquée non modifiée~
Les deu~; ribosondes radiomarquées utilisées à 1 fmole (45000 cpm) ont été mise avec une quantité décroissante d'une séquence ribonucléotidique complémentaire froide (diluée de 10 en 10 à partir de 101 à 103 pg) en présence de 10 ~g de ARN de levure (+) ll a été effectué
pour chaques sondes un controle sonde sans digestion par la Rnase Tl (-), et un controle RNase sans sonde complémenuire (0) La bande visible sur le gel correspond à la ribosonde qui n'a pas ~tc dégradce (car sous forme d'hybride) lors de la digestion par la Rnase T1.

W O 97/OS277 PCTn~R96/01201 La figure 7 représente l'autoradiographie d'un gel de polyacrylamide. Elle montre la détection du messager du gène de la ~ actine dans différentes cellules humaines ou de rat à l'aide d'une ribosonde (complémentaire à un 250 nucléotides du messager du gène de la S ~ actine de souris) constituée de 15% de biotine-UTP et de 10% de DIG-UTP
et radiomarquée au (Q32P)CTP. L'ordre des différentes cellules ou tissus testés est: cerveau (rat), rein (rat), foie (rat), Jur};at (humain), HepG2 (humain), H411 (rat), placenta (humain), Levure, Hela (humain).Pour chaque échantillon il à été réalisé un contrôle de la ribosonde sans Rnase T1 (-) et une détection du ARNm du gène de la ~ actine (+). Le contrôle de la spécificité de la réaction est réalisé à l'aide de la levure.
La figure 8 représente une détection sur plaque (après protection de la digestion à la ribonucléase Tl) du messager de la ,~ actine par une ribosonde constituée de 15% de biotine-UTP et de 10% de DIG-UTP, radiomarquée au (~3ZP)CTP (3 10 cpm/fmole).
1~ détection de la présence de la ribosonde est réalisée après découpage des puits et comptage de la radioactivité sur un compteur LS60001C Becl;man. L'ARNm de la ~ actine est recherché dans 10 llg, 5 ~g et 1 ~g des ARN totaux extrait à partir de différents tissus (voir légende).
La figure 9 représente une détection sur plaque d'un messager rare, celui de HNFl (Facteur Nuclcaire ~lépa~iquc 1 ) à l'aide d'une ribosonde (15% biotine-UTP,lOYo DlG-UTl') radiomarquée au Q3ZP-CTP (5 10~ cpm/fmole). Les échantillons testés corresponden~ à 10, 5 et 1 llg de ARNt provenant de rein, foie, placenta et levure.
La figure 10 représente une détection sur plaque du messager de la ~ actine par une ribosonde constituée de 15% de biotine-UTP et de 10% de DIG-UTP. La détection de la ribosonde est réalisée à l'aide d'un anticorps anti-DlG couplé à la phosphatase alcaline. L~ mesure est réalisée en luminescence.
Dans les e,~emples on utilise des ribosondes modifiécs obtenues par transcription à partir de monomères nucléotidiqucs nommées NTP
comprenant des nucléotidcs modifiées UTP-biotine (Bochringer, Réf.
1388908) et UTP-DIG (Boehringer Réf 1709256).

' 14 Lorsque l'on dit que la ribosonde est obtenue à partir de n% de biotine-UTP ou DIG-UTP, cela signifie que le pourcentage de biotine-UTP
par rapport à la quantité totale d'UTP modifiés et non modifiés utilisés pour la transcription est de n%. Ceci correspond à un pourcentage de 5 nucléotide modifié correspondant dans la ribosonde obtenue d'environ n/4%.
L'e,~emple 1 montre l'aspect bifonctionnelle des ribosondes biotine-UTP et DIG-UTP. L'e,~;emple 2 souligne l'importance du taux de modification au niveau du test de protection dc la digestion par les 10 ribonucléases RPA. L'e,~;emple 3 illustre une application de l'invention - comme méthode de détection de l'expression des gènes.

- EXEI~PLE 1: ~IISE EN ~VIDENCE DE LA CAPTURE ET DE LA DÉTECT~ON D'UNE
RIBOSONDE CONSTITUÉE DE BIOTINE--UTP Fl DE DlG-UTP SUR UNE
15 MICROPLAQU~

Avec les projets concernant le séquenca~e du gcnome humain un effort considérable a été effectué au niveau de l'automatisation des méthodes de séquencage de l'ADI~. Cependant, les méthodes classiques 20 d'analyses de l'expression des gènes ne sont pas adaptées à la détection d'un nombre de plus en plus croissant de messagcrs. Ainsi un avantage majeur d'une nouvelle méthode de dctection des ARN messagers réside dans sa possibili~é d'au~omatisation, Et doit pouvoir etre réalisée sur Ull support solide comme une microplaque qui est particulièrement adaptée à
~5 I'étude de grandes séries d'échantillons. L'utilisation d'une ribosonde possédant une partie fonctionnelle permettant d'une part sa capture et possédant une propriété de reconnaissance spécifique apparaît bien adaptée à la détection des ARN messagers. Dans l'e.~;emple présen~é la capture est faite par la biotine et la détection par la DIG.
1, Principe général dc l'utilisation d'une ribosonde.
Un segment d'ADN correspondant à une parlie d'un gène est inséré
au niveau d'un site de clonage immédiatcment cn aval d'un promoteur de l'ARN polymérase de bactériophage (T3, T7 ou SP6), dans unc orientation qui conduit à la production d'un ARN antisens. Le plasmide recombinant est ensuite coupé par une enzyme de restriction en 3' de l'insert. Le plasmide linéarisé est alors transcrit en présence de ribonucléotides comprenant des ribonucléotides modifiés par e.~;emple la biotine-UTP et la 5 DIG-UTP. Un excès de cet ARN doublement marqué est hybridé en solution avec les ARN m à tester. Les hybridations sont réalisées dans des conditions stringentes standards à T~40-50~C, durant la nuit (16 heures) dans un tampon 80 % formamide NaCl 0,4M à pH entre 7 et 8. La sonde non hybridée est ensuite supprimée par digestion à l'aide des ribonucléases 10 spécifiques de l'ARN simple brin comme les RNases CL3, Tl,Phy M,U2 ou A.
La présence de la première modification, par e,~iemple la biotine-UTP, dans l'hybride ARNm:ribosonde (biotine-DlG) permet sa capture sur une microplaque de titration dont la surface est recouverte de streptavidine. La présence d'une autre modification, par e,~;emple la DIG, permet la détection 15 et la quantification de l'hybrid~ par une méthode ELISA utilisant un anticorps anti-DIG couplé à la phosphatase alcaline~ Par ailleurs il est également possible de réaliser une transcription en présence de (~32P)CTP
afin de pouvoir détecter et quantifier l'hybride (ARNm:ribosonde) après dépot sur plaque~
2~ Système modèle: HNFl (I-lepa~ic Nuclcar ~:actor 1)~
Un fragment Pvull de ~90 pb d'un ADNc codant pour HNI:l de rat (992 à 1482, Chouard et al 1990, NAR 18, 58S3-5863) est sous cloné au site SmaI du vecteur pBS (Stratagene)~ La ribosonde antisens est obtenue après 25 linéarisation du vecteur par coupure avec EcoR1, suivi d'une transcription réalisée par la ARN polymérase T3 La synthèse de la ribosonde sens est accomplie après coupure du vecteur par Hindlll, suivi d'une transcription par la ARN polymérase T7.

3. Synthèse de la ribosonde.
Chaque réaction de transcription avcc la T7 ou la T3 ARN
polymérase est réalisée dans un tube Eppendorf avec les conditions suivantes: HZO DEPC q.s.p. 20 ~1; 40 ml-l Tris-HCl pH 7,5; 6 mMI MgC12; 2 m~l spermidine; 5 mM l\laCl; 10 mM DTT; 100 llg/ml sérum albumine bovine (SAB) (fraction V, Sigma); 500 ~1 CTP, ATP, GTP; des quantités variables de CA 02228712 l99X-01-29 W O 97/05277 PCTrFR96/01201 UTP, biotine-UTP et DIG-UTP selon le pourcentage de modification souhaité
(par exemple, pour obtenir une ribosonde 15~6 biotine et 10% DIG: 75 ~lM
biotine-UTP; 50 ~lM DIG-UTP, 375 IlM UTP); I U/ml d'inhibiteur de ribonucléase; 40 U de T7 ou T3 ARN polymérase; 1 llg ADN plasmidique linéarisé après digestion par une endonucléase de restriction appropriée (EcoR1 ou Hind Iil). Le mélan~c est incubé 2 heures à 37~C. La - transcription terminée, l'ADN plasmidique est digéré en ajoutant 1 ~
- unité) de DNase RQl (Promega) La réaction est incubée 15 minutes à 37'C
Les ribonucléotides non incorporés sont éliminés par passage sur une colonne de chromatographie d'exclusion Biospin30 (Biorad).
Afin de quantifier la synthèse de la ribosonde ou de déterminer radioactivement la présence d'un hybride (ARNm:ribosonde) la transcription est réalisée avec 1-7 Ill de (a3~P)CTP (800 Ci/ml; 20 mCi/ml), selon l'activité spécifique désirée. La qualitc de la ribosonde est - 15 déterminée par migration sur un~el d'électrophorèse d'acrylamide 5% en conditions dénaturantes.

4. Capture des ribosondes sur microplaque.
Les puits de microplaques liés avec de la strcptavidine (Boehringer 1602853) sont recouverts par 100 ~-l d'hybride diluc dans du tampon lX PBS;
1% SAB (sérum albumine bovine) pendant 1 heurc a 37 C. Les plaques sont ensuite lavées S fois avec du tampon de lavage: 0,1~ laCl; 0,1 ~[ Tris I~Cl;
0,1% T~veen 20; 3 mM ~IgCl2, pH 7,5. Puis 100 ~l (70 mU) d'anticorps anti-DlG couplé à la phosphatase alcaline (Boehringcr) sont additionnés et incubés 1 heure à 37~C dans du tampon de lavage contenant 1% SAB.

5. Détection des ribosondes sur microplaque.
Selon la modification de la sonde, la dctection peut être froide (Quorescente ou luminescente) ou radioactivc.
5.1. Détection nuorescente La réaction est réalisée avcc 100 ~ l de substrat 4-méthylumbelliféryl phosphate (Si~ma) à 0,~ m~/ml dans du tampon diéthanolamine 0,1M, pH 9,8. L'incubation est faite pendant la nuit a température ambiante. La mesure de la nuorescencc est faite par un ~uorimètre (Dynatech) avec une longeur d'onde d'e~;citation de 365 nm ct une longeur d~emission de 450 nm.

5.Z. Détection luminescente La réaction est réalisée avec 100 ~LI de substrat AMPPD (Tropi,Y) dilué
au 1/59 en présence d'amplificateur Sapphire (Tropi.~;) au 1/10 dans du tampon diéthanolamine 0,1 ~I, pH 9,8. La mesure de la luminescence est 5 faite après 20 minutes à température ambiante sur luminomètre l~/licro Beta Trilux (Wallac).

5.3 Détection radioactive Elle implique l'utilisation de ribosondes radiomarquées. Après 10 découpage, chaque cupule est mise en présence de 3 ml de liquide scintillant. La mesure de la radioactivité est réalisée sur un compteur LS60001C Becl~man.

6. Résultats De la biotine-UTP a été incerporée au niveau de la ribosonde, ce qui lui permet d'être capturée de façon spécifique par de la streptavidine préalablement immobilisée sur une microplaque Pour toutes les études de fi~;ation sur plaque on a utilisé comme controle de spécificité une ribosonde radiomarquée ne possèdant pas de 20 biotine-UTP dans sa séquence.

6.1 Influence du pourcentage de biotine sur Ie tau.~; de capture d'une ribosonde simple brin.
Comme le montre la Figure lA, la capture de la ribosonde simple 25 brin (biotine-UTP, (a32P) CTP) est corrélée à la quantité de biotine incorporée dans la ribosonde. La plus faible fi~;ation à été obtenue avec 5%
de biotine. Puis augmente de fa~on linéaire jusqu'a 25% de biotine, pour arriver à un plateau. La détection est faite par mesure de la radioactivité.
Lorsqu'on utilise une ribosonde comportant 100% de biotine-UTP, le tau~;
30 de capture ma~imale est de 80%.
L'influence du poucentage de biotine-UTP sur Ie tau~; de capture peut également etre décelée par un systeme de detection froid. Cependant, il est nécessaire d'incorporer de la DIG-UTP dans la ribosonde. La Figure 1 B montre un tel système de detection. En accord avec les résultats 35 précédants, le tau~ de capture augmente avec le pourcentage de biotine-UTP.

W O 97/05277 PCTA~R96/01201 6.2 Seuil de sensibilité des différents systèmes de détection.
Différents types de détection peuvent etre utilisés, radioactive ou froide.
La détection radioactive est réalisée après l'incorporation d'un ribonucléotide radiomarqué par le (a32P) UTP ou le (a32P) CTP.
La détection froide est possible grace à l'incorporation d'un nucléotide modifié tel que la biotine, la di~o.~;igénine, ou la fluorescéine, détecté par un conjugué constitué d'un ligand spécifique (la streptavidine pour la biotine) ou d'un anticorps spécifique (anti-biotine, anti-DlG, 10 anti-fluorescéine) couplé avec une enzyme (phosphatase alcaline, pero,~;idase). La révélation est faite par la mesure de l'apparition d'un produit fluorescent ou luminescent.
Dans la suite la détection est faite soit par l'incorporation d'un nucléotide radioactif (a32P) CTP, ou par l'incoporation de DIG-UTP suivi 15 d'une mesure de fluorescence ou-de chemiluminescence.
Dans le cas de la détection radioactive, pour obtenir la plus grande sensibilité possible, on a utilisé des ribosondes ayant une forte activité
spécifique (2 105 cpm/fmole). Dans ces conditions, la ~:igure 3~ montre qu'il est possible de detecter jusqu'à 1 attomole de ribosonde sur la plaque.
Pour la détection froide, comme lors de la détection radioactive, le seuil de sensibilité dépend du niveau d'incorporation du nucléotide modifié servant à la détection (DIG-UTP).
Par exemple, la figure 2B montre que l'intensité du signal augmente avec le pourcentage de DIG-UTP présent dans la ribosonde: une 25 sonde constituée de 25 % de DIG-UTP est détectée 2,5 fois plus qu'une sonde ayant 5% de DIG-UTP. Dans des conditions d'incorporation de DIG-UTP
correspondant au ma,~imum de détection (35 % DIG-UTP) le seuil de détection est de 10 attomoles en fluorescence et de 5 attomoles en luminescence.
Ces résultats montrent qu'il est possible de dé~ecter avec des systèmes différents (radioactif ou froid) des ribosondes capturées sur microplaque. Dans tous les cas le seuil de detection dépend du niveau de modification de la sonde 6.3 Capture et détection des mo~écules d~RN double brin.
Après avoir vérifié qu'il était possible de capturer et de détecter sur une microplaque une molécule d'ARN simple brin, on a étudié la possibilité de capture de molécules doubles brins. Effectivement, la présence d'un ARNm donné dans un échantillon est verifiée par hybridation avec une ribosonde. L'hybride formé est protégé de la dégradation par les ribonucléases, alors que les molécules simples brins sont éliminées par digestion. C'est donc la détection de molécules hybrides qui révèle la présence d'un ARNm. Les molécules doubles brins étudiées comportent différent pourcentage de modifications.
La Figure 3A montre l'étude de la fixation des ribosondes (5,15,25,35Yo biotine-UTP) après formation d'un hybride avec une séquence ribonucléotidique complémentaire radiomarquée au (C~32P) CTP.
Il est à noter qu'afin de pouvoir suivre le comportement sur plaque de l'hybride seul le brin complémen~aire est radiomarqué.
Il apparait que l'optimum de fixation de l'hybride se trouve entre 15 et ~5% de biotine-UTP.
Comme pour la ribosonde simple brin Sg6 de biotine-UTP est insuffisant pour fixer correctement l'hybride.
La figure 3B montre l'influence du tau.~: dc biotine-UTP sur la capture d'un hybride constitué de (S, 15, Z5, 35 %) biotine-UTP et de 35%
DIG-UTP.
Le maximum de capture de l'hybridc biotine-UTP, DIG-UTP est obtenu avec 15% de biotine-UTP.
Ces résultats confirment ceu~ obtenus précédemment Par ailleurs, une sonde comportant 35% de biotine-UTP entraine une très faible fixation de l'hybride. Probablement en raison d'une plus faible stabilité
du duplex obtenu en présence de 35% DIG-UTP. Ce résultat met en évidence qu'une trop forte modification de la ribosonde déstabilise l'hybride, et se traduit par une très faible capture.
Il est également possible de détecter les molécules d'ARN double brin à l'aide d'anticorps anti-DlG couplés a la phosphatase alcaline suivi d'une mesure de fluorescence (résultats non montrés).
Par exemple, la figure ~ met en évidence que l'optimum de détection de l'hybride est atteint lorsque la ribosonde contenant lS % de biotine-UTP
comporte aussi 15 Yo de DlG-UTP.

=W O 97/OS277 PCTA~R96/01201 L'ensemble des résultats indiquent une très bonne fi,~;ation de la -ribosonde comportant 15~6 de biotine-UTP aussi bien sous forme simple brin que double brin.
Les résultats obtenus montrent la possibilité qu'ont les ribosondes 5 biotine-UTP, DIG-UTP (sous forme simple et double brin) de se fixer et d'être détectées sur microplaque. Ces ribosondes possédant à la fois des propriétés de capture et de détection, apparaissent trés adaptées à une détection automatisable des ARN messa~ers. Cependant on a observé Ull comportement différent de rn~ation sur plaque entre une molécule simple 10 et double brin. Pour une molécule simple brin le tau,~; de capture est lié
directement à la quantité de biotine-UTP incorporée dans la ribosonde.
Alors que pour une molécule double brin, le tau,~ dc capture passe par un optimum qui est atteint lorsque la ribosonde est constituée de 15% de biotine-UTP. Ainsi pour les molecules doubles brins, le tau,; de fixation 15 n'est pas directement corrélé à ~a quantité de biotine contenu dans l'hybride, mais est une résultante entre la stabilité de l'hybride et le pourcentage de modification. Ceci implique la nécessité d'effectuer une oprimisation de la fi,~;ation des molécules doubles brins.

~0 EXEMPLE ~: EFFET DE L'INCORPORATION DANS UNE RIBOSONDE DE
NUCLEODIDES ~IODIFIES SUR LA STABILITE A 1~ DEGRADATION PAR DES
RIBONUCLF'ASES SP~'CIFIQUES DE SII~IPLES BRINS.

L'e,~;emple 1 montre qu'une trop forte proportion de modification ;~5 entraine une déstabilisation des ARN doubles brins. Il est donc indispensable de connaître les conséquences de telles modifications au niveau de l'essai de protection de la digestion au,~; ribonucléases, Par ailleurs dans cet essai, I'appariement des deu.~; brins de l'hybride doit ètre très stable, car tout désappariement entraine une coupure par les 30 ribonucléases et une perte du si~nal spécifiquc. D'autre part, les modifications se situant sur l'uridine, il est probablc quc les ribonucléases qui coupent au niveau de cc nucléotide soient moins tolérantes que celles qui coupent après un autre nucleotide.

W O 97/05277 PCTA~R96/01201 Différents types de ribon~ éases sont disponibles dans le commerce (Cl3, T1, A, PhyM, U7). ~lles ont en commun de dégrader uniquement une molécule d'ARN sous forme simple brin et de laisser inctates les molécules double brin. Ces enzymes se distinguent par la 5 spécificité de leur sites de coupure.
Classiquement le test de protection au,~; ribonucléases est réalisé
avec le mélange des ribonucléases A et T1. Cependant on a vérifié que la ribonucléase A qui coupe après les résidus uridine, cytidine et thymidine est moins utilisable que la ribonucléase T1 qui coupe seulement après la 10 guanosine (non montré). Ceci a permis d'éliminer la ribonucléase A du test, et de garder uniquement la ribonucléase Tl qui offre un meilleur compromis en~re la conservation du signal spécifique (molécule double brin) et la dégradation du signal non spécifique (simple brin). Afin d'éviter la présence d'un bruit de fond élevé lors de la révélation sur 15 microplaque, il est nécessaiI e que la sonde non hybridée soit complétement digérée 1. Synthèse des sondes La synthèse des sondes et antisondes HNF1 à été realisée comme dans 20 l'e~;emple 1.

7. Hybridation Une fmole de sonde antisens HNPl comportant différentes modifications (biotine et/ou DIG) est mise à hybrider avec 10 et 1 ng de ~5 séquences complémentaires sens en présence de 10 ~g d'ARN t de levure~
Le tampon d'hybridation est constitué de 40 mM PIPES pH6,4; 1 mM EDTA
pH8,0; 0,4 ~I NaCl; 80Yo formamide déionisée~ Apres dénaturation du mélange à 93~C pendant 4 minutes, l'hybridation est réalisée à 43~C
pendant 16 heures.
3~ Protection de la digcstion par la RNase T1 La digestion par la RNase T1 est réaliséc aprcs l'hybridation afin dc dégrader la ribosondc et les ARNm non hybridés W O 97/05277 PCT~FR96/01201 La digestion à la RNase T1 est réalisée en ajoutant 300 ~11 de tampon de digestion: 300 mM NaCl; 10 m~I Tris HCI pH7,4; 5 mM EDTA pH7,5; 20 U
RNase T1 (Boehringer). La digestion des ARN non hybridés est réalisé à
37~C pendant 30 minutes. Puis la RNase T1 est inactivée à l'aide de 20 ~l S d'une solution 10% SDS et 10 Ill d'une solution de protéinase K à 10 mg/ml.
Le mélange est incubé 30 minutes à 37~C. Les hybrides sont extraits avec 400 ~11 de mélange phénol:chloroforme:alcool isoamilique (Amesco). Après - centrifugation à 12000 rpm pendant 5 minutes la phase supérieure est transférée dans un nouveau tube. Les hybrides sont précipités en présence de 200 ~li d'acétate d'ammonium 4~1 e~ de 750 ~ l d'éthanol absolu pendant 30 minutes à-20~C.
Selon le protocole d'analyse des hybrides le culot est repris:
- soit dans 10 Ill de tampon de charge comprenant 80% formamide;
0,1~ ,~;ylène cyanol; 0,1% bleu de bromophénol; 2 ml~I EDTA. Puis le culot est analysé sur gel d'acrylamide en conditions dénaturantes, - soit dans 100 ~I de tampon de capture: lX PBS; 1% albumine bovine sérique. Par la suite l'échantillon est analysé après fi,~;ation sur microplaque recouverte de streptavidine (Boehringer) 4. Analyse sur gel d'électrophorese de polyacrylamide Après dénaturation de l'échantillon par chauffage à 93 C pendant 4 minutes, celui-ci est soumis à une migra~ion électrophorétique à
40-45V/cm dans un gel dénaturant à 5% de polyacrylamide; 7M urée contenant 1 X TBE
La radioactivité est détectée par autoradiographie. La taille de la bande correspondant à la ribosonde est déterminee par comparaison à la migration de fragments d'ADN de tailles connues radiomarqués.
-5. Résultats:
Les essais visaient à déterminer si Ies modifications de capture (biotine) ou de détection (DIG) de la ribosonde sont compatibles avec les tests de protection au~ nucléases Le test utilisé est une protection de la digestion par la RNase T ~ , suivi par une analyse classique sur gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes. La taille de la ribosonde 35 HNF1 est de 500 nucléotides.

On a testé des ribosondes biotine-UTP (35 % et 100: ~ (résultats non représentés) et DIG-UTP (S, 15, 20 et 35 %) (résultats representés figure S).
Il apparalt que, plus le pourcentage de modification augmente, moins la ribosonde est utilisable dans le test de protection au,~;
S ribonucléases. Ainsi, il n'est pas possiblc d'utiliser les ribosondes constituées de 35% de biotine-UTP et de 35% DIG-UTP, car il y a une perte complète du signal spécifique dûe à une dégradation par les ribonucléases, probablement en raison des contraintes qu'entrainent ces modifications au niveau de l'hybride~ De la même facon, 100% de modification au niveau 10 de UTP n'est pas toléré, et ceci quelque soit la modification (biotine-UTP, DIG-UTP) .
L'analyse fine de la dégradation de l'hybride en fonction du pourcentage de DIG-UTP incorporé dans la ribosonde révèle que l'augmentation du tau~; de modification entraîne une perte progressive de 15 la sensibilitê~ Le seuil maxima~ de modification DIG-UTP sans perte significatif de signal spécifique, est obtenu avec une sonde comportant 10 % de DIG-UTP (figure S).
La figure 6 montre une étude comparative de la sensibilité entre une ribosonde (15% biotine-UTP, 10% DIG-UTP) et la même ribosonde non 20 modifiée. Le test utilisé est unc protection de la digcstion par la Rnase T1, suivi par une analyse classique sur gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes Dans cette e.~:périence lcs deu.~; ribosondcs radiomarquées possèdent une activité spécifique de 4 10~ cpm par fmole. La ribosonde (15% biotine-UTP, 10% DIG-UTP) est capable comme l~ sonde non modifiée 25 de détecter 100 pg de séquence complémentaire mais avec un signal plus faible.
Ces résultats montrent que dans le cas de l'utilisation de la biotine comme modification de capture et DIG cn détection, 15% de biotine et 10%
de DIG sembent appropriés pour une bonne détection dcs ARN cibles. Avec 30 d'autres modification il, sera nécessaire dc faire une optimisation.

LXEMPLE 3 : UTIL~SATION D'UNE RIBOSONDE ( 15% BIOTINE-UTP, 10%
DIG-UTP) POUR Dl~TECTER LE MESSAGER DU GENE DE IA b ACTINE OU DE
HNF1 SUR MICROPLAQU~

La synthèse de la ribosonde HNI:1, la capture et la détection ont été
réalisées comme pour l'e,~;emple 1.

1. synthèse de la sonde ~ actine Un fragment de 250 pb d'un ADNc codant pour la ,~ ac~ine de souris (5 82-831 ) est cloné au site KpnI/Xbal du vecteur pBS (Stratagene). La ribosonde ~ actine est obtenue après linéarisation du vecteur par coupure avec HindllI suivi d'une transcription par la ARN polymérase T7.

2. E~;traction des ARN totau,~
Les ARN totau,~ sont isolés ~-partir de 107 cellules ou de 10 à 100 mg de tissus à l'aide de 2 ml de RNAzol B (Biotec,~;). Le tissu doit etre plongé
congelé dans le RNAzol B, l'homogénéisation se fait dans un broyeur ~varing blender" pendant 30 à 60 secondes avant que le tissu ne décongèle, sinon les ARN seront dégradés par les Rnases. Puis 0,2 ml de chloroforme sont ajouté à l'homogénat. Apres mélange et repos 5 minutes dans la glace, la solution est centrifugée à 12000 g pendant 15 minutes à
4~C. Après avoir prélevé la phase acqueuse un meme volume d'isopropanol est ajouté. Le mélange est mis à précipité à -Z0 C pendant 30 minutes.
Après centrifugation à 12000 g pendant 15 minutes à 4 C Ie culot est lavé
avec de l'alcool à 70%. Puis les ARN totau.~; son~ resuspendus dans de l'eau DEPC. 1~ concentration de l'échantillon est déterminée par mesure de la densité optique à 280 nm. La qualité de la préparation est vérifiée sur gel d'agarose 0,8%

3. Hybridation La quantité des ARN totau,~; nécessaire ~i la réaction d'hybridation dépend de la concentration de la séquencc nucléotidique qui est recherchée et de l'activité spécifique de la ribosonde radiomarquée. Avec une ribosonde ayant une forte activité spéci~lque (>109 cpm/llg) 10 ~lg de ARN totau.~; sont habituellement suffisant pour pcrmettre la détection de ARNm qui sont présent au niveau de 1 à 5 copies par cellule, W O 97/05277 PCTrFR96/01201 _ 25 Les ARN totaux (10 llg) à analyser sont précipités en ajoutant 0,1 volume d'une solution 3 M d'acetate de sodium ph5,2 et 2,5 volumes d'éthanol froid. La solution est laisser 30 minutes à -20~C. Les ~RNt sont récupérés par centrifugation à 12000 rpm pendant 15 minutes à 4~C. Puis 5 le culot est lavé avcc une solution d'éthanol à 70% et recentrifugé~ Après élimination de l'éthanol, le culot est mis à sécher. Les ~RNt sont ensuite dissous dans 20 ml de tampon d'hybridation contenant: 40 mM PIPES ph6,4;
1 mM EDTA ph8,0; 0,4 I~I NaCl; 80% formamide déionisée. Puis 1 fmole dc la ribosonde biotine-DIG radiomarquée ou non est rajoutée. La solution est 10 pipetée plusieurs fois pour permettre une solubilisation complète du culot.
Le mélange est dénaturé par une incubation à 93~C pendant 4 minutes.
Puis les tubes sont transférés rapidement dans Ull bain marie réglé à la température d'hybridation~ Dans la plupart des cas, des résultats satisfaisant sont obtenus quand les ARN sont hybridés entre 45 et 50~C
15 pendant 16 heures.

4. Résultats La Figure 7 montre l'utilisation d'une ribosonde (15% biotine-UTP, 10% DIG-UTP,(Q32P)CTP) correspondant à une séquence complémentaire du messager de la ,~ actine de la souris. La taille de la ribosonde est de 250 paires de bases.
La ribosonde ( 15% biotine-UTP, 10% DlG-UTP, ( ~3 2 P)CTP à été
capable de détecter dans 10 llg de ARN totau,~; le messager de la ~ actine. Le teste utilisé est une protection de la digestion par la Rnase T1 suivi d'une analyse par électrophorèse sur gel d'acrylamide en conditions dénaturantes, L'intégrité de la taille de la ribonsonde est déterminée grace la présence de marqueurs radiomarqués, La ribosonde apparait protégée dans tous les échantillons testés (voir flèche sur la figure 7). Cependant il est à noter pour les échantillons 30 humains la présence d'une deu,~;ième bande dc taille inférieure (flèche) qui est due à l'e~;istance d'une différence dans la séquencc du ~ène de la b actine entre l'homme et la s; uris au niveau d'un site de coupure de la Rnase T1. Le messager de la ~ actine à été revclé dans toutes les cellules testées. La spécificité de la détection ees donnée par la levure qui 35 n'e,~prime pas de ~ actine.

W O 97/05277 PCT~R96/01201 Ceci démontre que la ribosonde ( 1556 biotine-UTP, 109~ D~G-UTP) s'apparie correctement avec une séquence complémentaire située dans un ARN m. Et qu'elle est donc utilisable dans les tests fonctionnels de protection de la digestion par la RNase Tl.
I~ figure 8 montre les résultats obtenus après protection de la digestion par la Rnase T1 suivi d'une détection de la radioactivicé après capture sur microplaque. La meme quantité de ribosonde ~ actine (15%
biotine-UTP,10% DIG-UTP) 1 fmole (4 10~ cpm) a été utilisée ~our la détection sur gel et sur plaque. Comme dans l'analyse par gel d'électrophorèse de polyacrylamide la ribosonde ( 15% biotine-UTP, 10%
DIG-UTP, (a32P)CTP est capable de détecter la présence du messager de la ~
actine à partir de 1 llg de ARN to~au.~; La levure utilisée comme témoin négatif de réaction donne un bruit de fond très bas (250 cpm) comparé aw;
1800--lO00 cpm obtenus avec 5 et 10 ~g de ARNt de cellules e~;primant la ~
actine. Bien que beaucoup plus fa~ble (400-680 cpm) le signal reste positif avec 1 ~lg de ARNt.
La figure 9 montre les résutats obtenus avec unc ribosonde (S00 nucléotides) dirigée contre un messager faiblement e,~;primé celui de HNFl. ~ sonde utilisée comportant 15% de bio~ine-UTP et 10% de DIG-UTP
est radiomarquée avec du (Q3~P)CTP (5 1055cpm/fmole) [~ mesure de la radioactivité associée avec les deu~: cellules e~;primant HNI:l (rein et foie) est significativement plus forte que celle associéc au.~; échantillons qui - n'e,~;priment pas HN~1 (placcnta et levure). Ce résultat démontre la possibilité d'une détection par une ribosonde (biotine-UTP, DIG-UTP) d'un ARN m faiblement représenté
Cependant pour etre tout a fait automatisable cette méthode d'analyse sur microplaque doit s'affranchir de la radioactivité.
La figure 10 montre les résultats obtenus avec une ribosonde ,~
actine (15% biotine-UTP, lOYo DIG-UTP) suivi d'une détection sur microplaque par un anticorps anti-DlG, ct une Iccture en luminescence.
Les cellules testées sont: Jurkat, Placenta, Ccrvcau, Lcvure.
A partir de cellules Jurkat il a été possiblc dc détectcr le messager de la ~ actine dans 0,5 ~lg de ARNt. Pour le placenta ct lc ccrvcau le messager de la ~ actine à été mis en évidence dans 2 ~ g dc ARNt. Ces résultats indiquent la très bonne sensibilité de la mcthodc dc detection.

Ainsi comme en radioactivité la ribosonde est capable de détecter le messager de la ~ actine à partir de 10, 5,2 ou 0,S ~g de ARN totaux.
Des résultats similaires sont obtenus avec une détection fluorescente (non montré).
S L'ensemble de ces travaux montrent que les ribosondes (biotine-UTP, DIG-UTP) tout en gardant leur spécificité de reconnaissance par l'intermédiaire de leurs séquences ribonucléotidiques sont capables de se fixer sur plaque et d'etre détectées specifiquement. Leurs util~sation dans des tests de protection aux nucléases a nécessité un ajustement du 10 tau,~: de leurs modifications.
Bien que la technique de protection au,~ nucléases soit fréquement utilisée dans les études de détection et de quantification des ARNm. Elle reste néanmoins peu adaptée à l'analyse de grandes séries d'échantillons.
Car les produits des cxpériences de protection aux nucléases sont 15 habituellement analysés sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes. La possibilité de détecter sur microplaque des ARN
messagers à l'aide de ribosonde (biotine-UTP, DIG-UTP) constitue un outil d'une trés grande puissance d'analyse, et rend la technique de protection aux nucléases applicable à l'étude des grand nombres.

Claims (20)

REVENDICATIONS

1. Procédé de détection d'acides nucléiques caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes:
a) on réalise l'hybridation en solution d'une sonde d'acide nucléique capable de s'hybrider avec un ARN ou un ADN donné dans un échantillon contenant des acide nucléiques, ladite sonde comprenant des éléments de direction et des premiers éléments de capture sur support solide;
b) on réalise la dégradation des séquences nucléotidiques non hybridées dans l'échantillon par un enzyme dégradant les acides nucléiques non hybridées, c) on effectue la capture des hybrides obtenus à l'étape b) en les mettant en présence d'un support solide revêtu des deuxièmes éléments de capture interagissant avec lesdits premiers éléments de capture de ladite sonde, et d) on effectue la détection des hybrides ou des sondes provenant des hybrides après dénaturation par l'intermédiaire desdits éléments de détection.

2. Méthode de détection d'ARN messagers selon revendication 1, caractérisée en ce qu'à l'étape a) on utilise une sonde d'ARN et à l'étape b) on réalise la dégradation enzymatique avec une RNase.

3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que lesdits premiers éléments de capture de ladite sonde sont constitués par une première molécule biologique fixée de façon covalente à ladite sonde et lesdits deuxièmes éléments de capture dudit support solide sont constitués par une deuxième molécule biologique fixée sur le support solide, deuxième molécule biologique qui interagit et se lie de façon non covalente avec ladite première molécule.

4. Méthodes selon l'une des revendications 1 a 3, caractérisée en ce que pour détecter un ARNm exprimé à partir d'un gène donné, on utilise une sonde d'ARN obtenue par transcription in vitro de fragments d'ADNc clonés dudit gène.

5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'on utilise une sonde d'ARN obtenue par transcription in vitro à l'acide de nucléotides dont certains sont modifiés par couplage à undit élément de détection et/ou undit premier élément de capture.

6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la sonde comporte de 100 à 1000 nucléotides, de préférence de 250 à 500 nucléotides.

7. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'après l'étape b) on élimine les produits de dégradation des acides nucléiques non hybrides.

8. Méthode selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la sonde ne comporte pas plus de 15 %, de préférence pas plus de 10 %
de nucléotides modifiés par lesdits éléments de détection et lesdits premiers éléments de capture constitués par des molécules biologiques.

9. Méthode selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que lorsque les éléments de détection et lesdits premiers éléments de capture sont substitués sur des nucléotides donnés, on utilise à l'étape b) un enzyme qui coupe les acides nucléiques simple brin au niveau d'un nucléotide autre que lesdits nucléotides substitués.

10. Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que les éléments de détection et lesdits premiers éléments de capture sont substitués sur des nucléotides d'Uridine et l'enzyme de l'étape b) est une RNase T1.

11. Méthode selon l'une des revendications 3 à 10, caractérisée en ce que lesdites première et deuxième molécules de capture constituent un couple biotine/streptavidine.

12. Méthode selon l'une des revendications 3 à 10, caractérisée en ce que ladite première molécule de capture est la digoxigénine (DIG) et ladite deuxième molécule de capture est un anticorps anti-digoxigénine.

13. Méthode selon les revendications 1 à 12, caractérisée en ce que ledit élément de détection est un élément directement détectable radioactif ou fluorescent tel qu'un élément.

14. Méthode selon la revendication 1 à 12 caractérisée en ce que ledit élément de détection est un élément indirectement détectable est constitué par une molécule biologique susceptible de réagir de manière non covalente avec une autre molécule comportant un élément directement détectable.

15 Méthode selon la revendication 13 caractérisée en ce que l'élément de détection indirectement détectable est choisi parmi la biotine, la fluoresceine ou la digoxigénine.

16. Méthode selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que ledit premier élément de capture est choisi parmi la biotine, la fluoresceine ou la digoxigénine.

17. Méthode selon l'une des revendications 1 à 16 caractérisée en ce que l'élément de détection est la digoxigénine et/ou la biotine et ledit premier élément de capture est choisi respectivement parmi la biotine ou la digoxigénine,

18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en que la sonde comporte de 2 à 5% des nucléotides substitués par une molécule de biotine notamment 3 à 4%, et de 2 à 5% des nucléotides substitués par une molécule de digoxigénine, notamment 2 à 3%.

19. Méthode de diagnostic dans laquelle on met en oeuvre une méthode de détection selon l'une des revendications 1 à 18 dans laquelle on détecte un acide nucléique impliqué dans une pathologie.

20. Kit utile pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 19, caractérisé en ce qu'il comporte des sondes d'acide nucléique de taille importante, notamment de plus de 100 nucléotides, portant des éléments de détection et desdits premiers éléments de capture sur support solide et un support solide revêtu desdits deuxièmes éléments de capture.