CA2294793A1

CA2294793A1 - Amelioration du transfert d'acide nucleique dans le muscle strie et combinaison permettant la mise en oeuvre du procede

Info

Publication number: CA2294793A1
Application number: CA002294793A
Authority: CA
Inventors: Lluis Mir; Daniel Scherman; Michel Bureau
Original assignee: Individual
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Gustave Roussy (IGR); Aventis Pharma SA
Priority date: 1997-06-30
Filing date: 1998-06-30
Publication date: 1999-01-14
Also published as: CZ299473B6; DE69826124D1; JP2002507985A; US20030073653A1; DE69826124T3; HUP0004589A1; DE69826124T2; KR20010020571A; CN1261807A; IL133710A0; WO1999001158A1; NO996542D0; ATE275423T1; EP0991426B2; NO996542L; CZ475599A3; EP0991426B1; EP0991426A1; AU8444798A; NO328102B1

Abstract

La présente invention se rapporte à une amélioration du transfert in vivo dans les cellules des muscles striés d'acides nucléiques ou d'acides nucléiques associés à des produits permettant d'augmenter le rendement de tels transferts, et à la combinaison d'un acide nucléique et du procédé de transfert selon l'invention pour leur utilisation en thérapie génique.

Description

WO 99/01158 PCT/FR98l01400 AMELIORATION DU TRANSFERT D'ACIDE NUCLEIQUE DANS LE MUSCLE STRIE
ET COMBINAISON PERMETTANT LA MISE EN OEUVRE DU PROCEDE
. La présente invention se rapporte à une amélioration très remarquable du transfert in vivo dans les cellules des muscles striés d'acides nucléiques ou d'acides nucléiques associés à des produits permettant d'augmenter le rendement de tels transferts, et à la combinaison d'un acide nuciéique et du procédé de transfert selon l'invention pour leur utilisation pour la thérapie génique.
Le transfert de gènes dans une cellule donnée est à la base de la thérapie génique. Cependant, l'un des problèmes est de parvenir à faire pénétrer une quantité
d'acide nucléique suffisante dans des cellules de l'hôte à traiter ; en effet, cet acide nucléique, en général un gène d'intérêt, doit être exprimé dans des cellules transfectées. L'une des approches retenue à cet égard a été l'intégration de l'acide nucléique dans des vecteurs viraux, en particulier dans des rétrovirus, des adénovirus ou des virus associés aux adénovirus. Ces systèmes mettent à profit les mécanismes de pénétration cellulaire développés par les virus, ainsi que leur protection contre la dégradation. Cependant, cette approche présente des inconvénients, et en particulier un risque de production de particules virales infectieuses susceptibles de dissémination dans l'organisme hôte, et, dans le cas des vecteurs rétroviraux, un risque de mutagénèse insertionnelle. De plus, la capacité d'insertion d'un gène thérapeutique ou vaccinal dans un génome viral demeure restreinte.
En tout état de cause, le développement de vecteurs viraux utilisables en thérapie génique impose d'avoir recours à des techniques complexes de virus défectifs et de lignées cellulaires de complémentation.
Une autre approche (Wolf et al. Science 247, 1465-68, 1990 ; Davis et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7213-18, 1996) a donc consisté à administrer dans le muscle ou dans la circulation un acide nucléique de nature plasmidique, associé ou non à des composés destinés à favoriser sa transfection, comme des protéines, des liposomes, des lipides chargés ou des polymères cationiques tels que le polyéthylènimine, qui sont de bons agents de transfection in vitro (Behr et al. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6, 1989 ; Felgner et al. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 84, 7413-7, 1987 ; Boussif et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7297-301, 1995).
- Depuis la publication initale de J.A. Wolff et al. montrant la capacité du tissu musculaire à incorporer de l'ADN injecté sous forme de plasmide libre (Wolff et al. Science 247, 1465-1468, 1990) de nombreux auteurs ont tenté d'améliorer ce FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)

2 processus (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419-431 ; Wolff et al., 1991, BioTechniques 11, 474-485). Quelques tendances se dégagent de ces essais, comme notamment ~ l'utilisation de solutions mécaniques pour forcer l'entrée de l'ADN dans les cellules, en adsorbant l'ADN sur des billes propulsées ensuite sur les tissus (« Bene gun ») (Sanders Williams et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2726-2730 ;
Fynan et al., 1993, BioTechniques 11, 474-485). Ces procédés se sont avérés efficaces dans des stratégies de vaccination, mais ne touchent que les couches superficielles des tissus. Dans le cas du muscle, leur utilisation nécessiterait un abord chirurgical pour permettre d'accëder au muscle, car les particules ne traversent pas les tissus cutanés ;
~ l'injection d'ADN, non plus sous forme de plasmide libre, mais associé à des molécules susceptibles de servir de véhicule facilitant l'entrée des complexes dans les cellules. Les lipides cationiques, utilisés dans de nombreux autres procédés de transfection, se sont avérés jusqu'à l'heure actuelle décevants quant à une application dans le tissu musculaire, car ceux qui ont été testés se sont montrés inhibiteurs de la transfection (Schwartz et al., 1996, Gene Ther. 3, 405-411).
Il en est de même pour les peptides et polymères cationiques (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419-431). Le seul cas d'association favorable semble être le mélange polyvinylalcool ou polyvinylpyrrolidone avec l'ADN. L'augmentation résultant de ces associations ne reprësente qu'un facteur inférieur à 10 par rapport à
l'ADN injecté nu (Mumper et al., 1996, Pharmaceutical Research 13, 701-709) ;
~ le prétraitement du muscle à injecter avec des solutions destinées à
améliorer la diffusion et/ou la stabilité de l'ADN (Davis et aL, 1993, Hum. Gene Ther. 4, 159), ou à favoriser l'entrée des acides nucléiques, par exemple l'induction de phénomènes de multiplication ou de régénération de cellules. Les traitements ont concerné en particulier l'utilisation d'anesthésiques locaux ou de cardiotoxine, de vasoconstricteurs, d'endotoxine ou d'autres molécules (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419-431 ; Danko et al., 1994, Gene Ther. l, 114-121 ;
Vitadello et al., 1994, Hum. Gene Ther. 5, 11-18). Ces protocoles de prétraitement sont difficiles à gérer, la bupivacâine en particulier nécessitant pour être efficace d'être injectée à des doses très proches des doses létales. La préinjection de sucrose

3 hyperosmotique, destinée à améliorer la diffusion, n'augmente pas le niveau de la transfection dans le muscle (Davis et al.,1993).
L'électroporation, ou utilisation de champs électriques pour perméabiliser des cellules, est également utilisée in vitro pour favoriser la transfection d'ADN dans des cellules en culture. Toutefois, il était jusqu'à présent admis que ce phénomène répondait à un effet dépendant d'un seuil et que cette électroperméabilisation ne pouvait être observée que pour des champs électriques d'intensité relativement élevée, de l'ordre de 800 à 1 200 Volts/cm pour les cellules animales. Cette technique a également été proposée in vivo pour améliorer l'efficacité d'agents antitumoraux, comme la bléomycine, dans des tumeurs solides chez l'homme (brevet américain n° 5 468 228, L.M. Mir). Avec des impulsions de très courte durée (100 microsecondes), ces conditions électriques (800 à 1 200 Volts/cm) sont très bien adaptées au transfert intracellulaire de petites molécules. Ces conditions (impulsions de 100 microsecondes) ont été appliquées sans amélioration pour le transfert d'acides nucléiques in vivo dans le foie, où des champs inférieurs à 1 000 Voltslcm se sont révélés totalement inefficaces, et même inhibiteurs par rapport à l' injection d' ADN en l' absence d'impulsions électriques (brevet WO 97/07826 et Heller et al. FEBS Letters, 389, 225-8, 1996).
Cette technique présente d'ailleurs des difficultés d'application in vivo, car l'administration de champs d'une telle intensité peut provoquer des lésions tissulaires plus ou moins étendues, qui ne représentent pas un problème pour le traitement de tissus tumoraux mais qui peuvent représenter un inconvénient majeur pour le sujet sain ou pour le sujet malade lorsque l'acide nucléique est administré dans des tissus autres que les tissus tumoraux, en particulier dans le muscle strié.
Alors que toutes les études citées mentionnent la nécessité de champs électriques élevés, de l'ordre de 1 000 Volts/cm, pour être efficace in vivo, de manière vraiment inattendue et remarquable, les demandeurs ont à présent montré que le transfert d' acides nucléiques dans des muscles in vivo pouvait être augmenté
de façon très importante, sans effets indésirables, en soumettant le muscle à des impulsions électriques d'intensité faible, par exemple de 100 ou de 200 Volts/cm, et d'une durée relativement longue. De plus, les demandeurs ont constaté que la grande variabilité
d'expression du transgène observée dans l'art antérieur de transfert d'ADN
dans le muscle était notablement réduite par le procédé selon l'invention.

4 C'est pourquoi, la présente invention concerne un procédé de transfert d'acides nucléiques dans un ou plusieurs muscles striés in vivo, dans lequel les cellules des muscles sont mises en contact avec l'acide nucléique à transférer, par administration directe dans le tissu ou par administration topique ou systémique, et dans lequel le transfert est assuré par application auxdits muscles d'une ou de plusieurs impulsions électriques d'une intensité comprise entre 1 et 800 Volts/cm.
De préférence, l' intensité du champ est comprise entre 4 et 400 Voits/cm et la durée totale d'application est supérieure à 10 millisecondes. Le nombre d'impulsions utilisées est par exemple de 1 à I00 000 impulsions et la fréquence des impulsions est comprise entre 0,1 et 1000 Hertz. De préférence la fréquence des impulsions est comprise entre 0,2 et 100 Hertz. Les impulsions peuvent être aussi délivrées de manière irrégulière et la fonction qui décrit l' intensité du champ en fonction du temps peut être variable. A titre d'exemple, le champ électrique délivré
peut résulter de la combinaison d'au moins un champ d'une intensité > à 400 V/cm et de préférence comprise entre 500 et 800 Volts/cm, de durée unitaire courte (<
I
msec), suivi de une ou plusieurs impulsions d'intensité plus faible , par.
exemple < 400 Volts/cm, et de préférence < 200 Volts /cm et de durée unitaire plus longue ( > 1 msec). L'intégrale de ia fonction décrivant la variation du champ électrique avec le temps est supérieure à 1 kVxmsec/cm. Selon un mode préféré de l'invention, cette intégrale est supérieure ou égale à 5 kVXmse%m.
Selon un mode préféré de l'invention, l'intensité de champ des impulsions est comprise entre 30 et 300 Volts/cm.
Les impulsions électriques sont choisies parmis les impulsions à ondes carrées, les champs électriques générant des ondes à décroissance exponentielle, des ondes unipolaires oscillantes de durée limitée, des ondes bipolaires oscillantes de durée limitée, ou d'autres formes d'ondes. Selon un mode préféré de l'invention, les impulsions électriques sont des impulsions à ondes carrées.
L'administration d'impulsions électriques peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple ~ système d'électrodes externes placées de part et d'autre du tissu à traiter, notamment électrodes non invasives placées au contact de la peau, ~ système d'électrodes implantées dans les tissus, ~ système d'électrodes/injecteur permettant l'administration simultanée des acides nucléiques et du champ électrique.
Dans le cadre de la présente invention les termes transfert d'ADN ou d'acides nucléiques par application d'une ou plusieurs impulsions électriques, ainsi que

5 les termes électrotransfert ou encore électrotransfection doivent être considérés comme équivalents et désignent le transfert d'acides nucléiques ou d'ADN par application ou en présence d'un champ électrique.
L'administration étant réalisée in vivo, il est parfois nécessaire d'avoir recours à des produits intermédiaires assurant la continuité électrique avec des électrodes externes non invasives. Il s'agira par exemple d'électrolyte sous forme de gel.
Les acides nucléiques peuvent être administrés par tout moyen approprié, mais sont de préférence injectés in vivo directement dans le muscle ou administrés par une autre voie, locale ou systémique, qui les rend disponibles à l'endroit d'application du champ électrique. Les acides nucléiques peuvent être administrés avec des agents permettant ou facilitant le transfert, comme cela a été mentionné
.précédemment.
Notamment, ces acides nucléiques peuvent être libres en solution ou associés â
des agents synthétiques, ou portés par des vecteurs viraux. Les agents synthétiques peuvent être des lipides ou des polymères connus de l'homme du métier, ou bien encore des éléments de ciblage permettant la fixation sur la membrane des tissus cibles.
Parmi ces éléments, on peut citer des vecteurs portant des sucres, des peptides, des anticorps ou des récepteurs hormonaux.
On conçoit, dans ces conditions de l'invention, que l'administration des acides nucléiques puisse précéder, être simultanée ou même suivre l'application des champs électriques.
C'est pourquoi, la présente invention a également pour objet un acide nucléique et un champ électrique d'une intensité comprise entre 1 et 800 Volts/cm, comme produit de combinaison pour leur administration simultanée, séparée ou étalée dans le temps, au muscle strié in vivo. De préférence, l'intensité du champ est comprise entre 4 et 400 Volts/cm et, de manière encore plus préférée, l'intensité du champ est comprise entre 30 et 300 Volts/cm.
Le procédé selon la présente invention est utilisable dans la thérapie génique, c'est-à-dire la thérapie dans laquelle l'expression d'un gène transféré, mais

6 également la modulation ou le blocage d'un gène, permet d'assurer le traitement d'une pathologie particulière.
De préférence, les cellules musculaires sont traitées dans le but d'une thérapie génique permettant ~ soit la correction des dysfonctionnements des cellules musculaires elles-mêmes (par exemple pour le traitement des myopathies liées à des déficiences génétiques), ~ soit la sauvegarde et/ou la régénération de la vascularisation ou de l'innervation du muscle et d'autres muscles ou organes par des facteurs trophiques, neurotrophiques et angiogéniques produits par le transgène, ~ soit la transformation du muscle en organe sécréteur de produits conduisant à un effet thérapeutique tels que le produit du gène lui-même (par exemple facteurs de régulation de thrombose et d'hémostase, facteurs trophiques, hormones comme l'insuline ou autres) ou tels qu'un métabolite actif synthétisé dans le muscle grâce à
l' adj onction du gène thérapeutique, ~ soit une application vaccinale ou immunostimulante.
Un autre objet de l'invention est l'association des impulsons électriques d'un champ à des compositions contenant les acides nucléiques formulées en vue de toute administration permettant d'accéder à un muscle strié par voie topique, cutanée, orale, vaginale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intra-oculaire, transdermique, etc. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l' invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour toute autre administration. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses d'acide nucléique utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations et le volume des injections peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée.
Les acides nucléiques peuvent être d'origine synthétique ou biosynthétique, ou extraits de virus ou de cellules procaryotes ou de cellules eucaryotes provenant d'organismes unicellulaires (par exemple, levures) ou

7 pluricellulaires. Ils peuvent être administrés en association de tout ou partie des composants de l'organisme d'origine et/ou du système de synthèse.
L'acide nucléique peut être un acide désoxyribonucléique ou un acide . ribonucléique. Il peut s'agir de séquences d'origine naturelle ou artificielle, et notamment d' ADN génomique, d' ADNc, d' ARNm, d' ARNt et d' ARNr, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semisynthétiques d'oligonucléotides modifiés ou non. Ces acides nucléiques peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par ciblage de banques, par synthèse chimique ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par ciblage de banques. Ils peuvent être modifiés chimiquement.
En particulier, l' acide nucléique peut être un ADN ou un ARN sens ou antisens ou à propriété catalytique comme un ribozyme. Par « antisens », on entend un acide nucléique ayant une séquence complémentaire à une séquence cible, par exemple une séquence d'ARNm dont on cherche à bloquer l'expression par hybridation sur la séquence cible. Par « sens », on entend un acide nucléique ayant, une séquence homologue ou identique à une séquence cible, par exemple une séquence qui se lie à
un facteur de transcription protéique et impliqué dans l'expression d'un gène donné.
Selon un mode de réalisation préféré, l'acide nucléique comporte un gène d'intérêt et des éléments permettant l'expression dudit gène d'intérêt. Avantageusement, le fragment d'acide nucléique est sous forme d'un plasmide.
Les acides désoxyribonucléiques peuvent être simple ou double brin, de même que des oligonucléotides courts ou des séquences plus longues. Ils peuvent porter des gènes thérapeutiques, des séquences régulatrices de la transcription ou de la réplication, au des régions de liaison à d'autres composants cellulaires, etc.
Au sens de l' invention, on entend par « gène thérapeutique » notamment tout gène codant pour un ARN ou pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique codé peut être une protéine, un peptide, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement - 30 exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, l'expression du transgène permet par exemple de pallier à une expression insuffisante dans la cellule ou à l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou permet encore de surexprimer ladite protéine.

8 PCT/FR98/01400 Le gène thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule (traitement des myopathies au des déficits enzymatiques), ou permettre de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire.
Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les gènes codant pour - les enzymes, comme l'a-1-antitrypsine, les proteinase (métalloproteinases, urokinase, uPA, tPA,...streptokinase}, les protéases clivant des précurseurs pour libérer des produits actifs (ACE, ICE,...}, ou leurs antagonistes (TIMP-1, tissue plasminogen activator inhibitor PAI, TFPI
- les dérivés sanguins comme les facteurs impliqués dans la coagulation :
facteurs VII, VIII, IX, les facteurs du complement, la thrombine, - les hormones, ou les enzymes impliquées dans la voie de synthèse de$
hormones, ou les facteurs impliqués dans le contrôle de la synthèse ou de (excrétion ou de la sécrétion des hormones, telles que l'insuline, les facteurs proches de (insuline (IGF), ou l'hormone de croissance, fACTH, les enzymes de synthèse des hormones sexuelles, - les lymphokines et cytokines : interleukines, chemokines (CXC et CC), interférons, TNF, TGF, facteurs chimiotactiques ou activateurs comme MIF, MAF, PAF, MCP-1, l'eotaxine, LIF, etc. (brevet français n° 92 03120), - les facteurs de croissance, par exemple les IGF, EGF, FGF, KGF, NGF, PDGF, PIGF, HGF, proliferin - les facteurs angiogéniques tels que les VEGF ou FGF, angiopoietine 1 ou 2, l'endotheline - les enzymes de synthèse de neurotransmetteurs, - les facteurs trophiques, en particulier neurotrophiques pour le traitement des maladies neurodégénératives, des traumatismes ayant endommagé le système nerveux, ou des dégénerescences rétiniennes, tels que les membres de la famille des neurotrophines tels que le NGF, BDNF, NT3, NT4/5, NT6 leurs dérivés et gènes apparentés - les membres de la familles du CNTF tels que le CNTF, l'axokine, le LIF
et leurs dérivés - l'IL6 et ses dérivés - la cardiotrophine et ses dérivés -le GDNF et ses

9 dérivés - Les membres de la famille des IGF, tels que l'IGF 1, I'IFGF-2 et Leurs dérivés - les membres de la famille de FGF, tels que le FGF 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et leurs dérivés, le TGF(3 - les facteurs de croissance osseuse, - ies facteurs hématopoïétiques, comme erythropoietine, les GM-CSF, M-CSF, LIF, etc., - les protéines de (architecture cellulaire comme la dystrophine ou une minidystrophine (brevet français n° 91 11947), , les gènes suicides (thymidine kinase, cytosine déaminase, enzymes à cytochrome P450), les gènes de l'hémoglobine ou d'autres transporteurs protéiques, - les gènes correspondant aux protéines impliquées dans le métabolisme des lipides, de type apolipoprotéine choisie parmi les apolipoprotéines A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J et apo(a), les enzymes du métabolisme comme par exemple Les lipases, la lipoprotéine lipase, la lipase hépatique, la lécithine cholestérol acyltransférase, la 7 alpha cholestérol hydroxylase, Ia phosphatidyl acide phosphatase, ou encore des protéines de transfert de lipides comme la protéine c~e transfert des esters de cholestérol et la protéine de transfert des phospholipides, une protéine de liaison des HDL ou encore un récepteur choisi par exemple parmi les récepteurs aux LDL, les récepteurs des chylomicrons-remnants et les récepteurs scavenger, etc. On peut, de plus, ajouter la leptine pour le traitement de l'obésité.
- les facteurs régulant la pression sanguine, comme les enzymes impliquées dans le métabolisme du N0, (angiotensine, la bradykinine, vasopressine, FACE, la rénine, les enzymes codant pour les mécanismes de synthèse ou de relargage des prostaglandines, du thromboxane, ou de fadenosine, les récepteurs de (adénosine, les kallikreines et kallistatines, ANP, ANF, les facteurs diurétiques ou antidiurétiques, les facteurs impliqués dans la synthèse, le métabolisme ou le relargage des médiateurs comme l'histamine, la sérotonine, les cathécholamines, les neuropeptides, - les facteurs anti-angiogéniques comme le ligand de Tie-1 et de Tie-2, fangiostatine, le facteur ATF, les dérivés du plasminogène, fendothéline, les thrombospondines 1 et 2, le PF-4, l'interféron a ou (3, l'interleukine 12, le TNFa, le récepteur de (urokinase, fltl, KDR, PAIl, PAI2, TIMPl, le fragment prolactine - les facteurs protégeant contre l'apoptose, comme la famille AKT, - les protéines susceptible d'induire une mort cellulaire, soit actives par elles-mêmes comme les caspases, soit de type "pro-drogues" nécéssitant une activation par d'autres facteurs, soit les protéines activant des pro-drogues en agent provoquant une mort cellulaire, comme la thymidine kinase du virus herpétique, les désaminase, permettant 5 en particulier d'envisager des thérapies anti-cancéreures, - les protéines impliquées dans les contacts et fadhésian inter-cellulaires :
VCAM, PECAM, ELAM, ICAM, intégrines, cathenines, - les protéines de la matrice extra-cellulaire, - les protéines impliquées dans la migration des cellules

10 - les protéines de type transduction du signal, type FAK, MEKK, p38 kinase, tyrosines kinases, serines- threonines kinases, - les protéines impliquées dans la régulation du cycle cellulaire (p21, p16, cyclines, ...) ainsi que les protéines mutantes ou dérivées dominant négatif bloquant le cycle cellulaire et pouvant le cas échéant induire 1'apoptose.
- les facteurs de transcription : jun, fos, APl, p53,...et lesprotéines dela cascade de signalisation de p53. .
- les protéines de structure de la cellule, comme les filaments intermédiaires (vimentine, desmine, keratines), la dystrophine, les protéines impliquées dans la contractilité et le contrôle de la contractibilité musculaire, en particulier Ies protéines impliquées dans le métabolisme calcique et les flux de calcium dans les cellules (SERCA, ...).
Dans les cas de protéines fonctionnant par des systèmes ligand et récepteurs, il est envisagable d'utiliser le ligand ou le récepteur (ex. FGF-R, VEGF-R, ...). On peut également citer des gènes codant pour des fragments ou des mutants de protéines de ligands ou de récepteurs, notamment des protéines précitées, présentant soit une activité supérieure à la protéine entière, soit une activité antagoniste, voire même de type " dominant négatif" par rapport à la protéine initiale (par exemple fragments de récepteurs inhibant la disponibilité de protéines circulantes, associés ou non avec des séquences induisant une sécrétion de ces fragments par rapport à un ancrage dans la membrane cellulaire, ou d'autres systèmes de modification du trafic intracellulaire de ces systèmes ligand- récepteurs de façon à détourner la disponibilité d'un des éléments) soit même possédant une activité propre distincte de celle de la protéine totale (ex.
ATF) .

11 Parmi les autres protéines ou peptides pouvant être sécrétés par le muscle, il est important de souligner les anticorps, les fragments variables d'anticorps simple chaîne (ScFv) ou tout autre fragment d'anticorps possédant des capacités de reconnaissance pour son utilisation en immunothérapie, par exemple pour le traitement des maladies infectieuses, des tumeurs, des maladies auto-immunes telles que la sclërose en plaques (anticorps antüdiotype), ainsi que les ScFv se fixant sur les cytokines pro-inflammatoires telles que par exemple ILl et TNFcx pour le traitement de (arthrite rhumatoïde. D'autres protéines d'intérêt sont, de façon non limitative, des récepteurs solubles, comme par exemple le récepteur CD4 soluble ou le récepteur soluble du TNF pour la thérapie anti-HIV, le récepteur TNFa ou le récepteur soluble ILl pour le traitement de (arthrite rhumatoïde, le récepteur soluble de l'acétylcholine pour le traitement de la myasthénie ; des peptides substrats ou inhibiteurs d'enzymes, ou bien des peptides agonistes ou antagonistes de récepteurs ou de protéines d'adhésion comme par exemple pour le traitement de l'asthme, de la thrombose de la resténose, des métastases ou de (inflammation ; des protéines artificielles, chimériques ou tronquées. Parmi les hormones d'intérêt essentiel, on peut citer l'insuline dans le cas du diabète, l'hormone de croissance et la calcitonine. On peut citer encore des protéines capables d'induire une immunité antitumorale ou stimuler la réponse immunitaire (IL2, GM-CSF, IL12, etc.). Enfin on peut citer les cytokines qui diminuent la réponse THl telles que IL10, IL4 et IL13.
Les nombreux exemples qui précèdent et ceux qui suivent illustrent l'étendue potentielle du champ d'application de la présente invention.
L' acide nucléique thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent, par exemple, être transcrites dans la cellule cible en ARN
complémentaire d'ARNrn cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet européen n° 140 30$. Les gènes thérapeutiques comprennent également les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN cibles (brevet européen n° 321 201).
Comme indiqué plus haut, l'acide nucléique peut également comporter un ou plusieurs gènes codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez

12 l'homme ou l'animal une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, l'invention permet donc la réalisation soit de vaccins, soit de traitements immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notamment contre des microorganismes, des virus ou des cancers. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (brevet européen n° 185 573), du virus de la pseudo-rage, du «
syncitia forming virus », d'autres virus ou encore d'antigènes spécifiques de tumeurs comme les protéines MAGE (brevet européen n° 259 212), telles que les protéines MAGE 1, MAGE 2, ou des antigènes pouvant stimuler une réponse anti-tumorale telles que des 7.0 protéines heat shock bactériennes.
Préférentiellement, l'acide nucléique comprend également des séquences permettant et/ou favorisant l'expression dans le muscle du gène thérapeutique et/ou du gène codant pour le peptide antigénique. Il peut s'agir des séquences qui sont naturellement responsables de l'expression du gène considéré lorsque ces sëquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule transfectée. Il peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s' agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire transfecter. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser tout promoteur ou séquence dérivëe stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non, forte ou faible. Il peut s'agir en particulier de promoteurs ubiquitaires (HPRT, vimentine, a-active, tubuline, etc.) , de promoteurs de gènes thérapeutiques (type MDR, CFTR, etc.), de promoteurs spécifiques de tissus (type promoteurs des gènes de la desmine, des myosines, de créatine kinase, de phophoglycérate kinase) ou encore de promoteurs répondant à un stimulus tels que des promoteurs répondant aux hormones naturelles (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de (acide rétinoïque, etc.) ou un promoteur régulé par les antibiotiques {tétracycline, rapamycine, etc ), de promoteurs répondant à
un régime alimentaire comme les promoteurs répondant aux fibrates, ou d'autres promoteurs répondant à d'autres molécules d'origine naturelle ou synthétique. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes EIA de fadénovirus, MLP, ou de

13 promoteurs issus des génomes des virus CMV, RSV, SV40, etc. Il peut s'agir de promoteurs inductibles ou répressibles. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, permettant une expression conditionnelle, transitoire, une expression tissu-spécifique ou majoritaire, etc.
Par ailleurs, l' acide nucléique peut également comporter, en particulier en amont du gène thérapeutique, une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être ia séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle.
L'acide nucléique peut également comporter une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé vers un compartiment particulier de la cellule, comme par exemple ies peroxisomes, les lysosomes, et les mitochondries pour le traitement par exemple des maladies génétiques mitochondriales.
D'autres gènes présentant un intérêt ont été notamment décrits par McKusick, V.A. Mendelian (Inheritance in man, catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes. Eighth edition. John Hopkins University Press (1988)), et dans Stanbury, J.B. et al. (The metabolic basic of inherited disease, Fith edition. McCrraw-Hill (1983)). Les gènes d'intérêt recouvrent les protéines impliquées dans le métabolisme des acides aminés, des lipides et des autres constituants de la cellule.
On peut ainsi citer de manière non limitative les gènes associés aux maladies du métabolisme des carbohydrates comme par exemple fructose-1-phosphate aldolase, fructose-1,6-diphosphatase, glucose-6-phosphatase, a-1,4-glucosidase lysosomale, amylo-1,6-glucosidase, amylo-(1,4:1,6)-transglucosidase, phosphorylase musculaire, phosphofructokinase musculaire, phosphorylase-b-kinase, galactose-phosphate uridyl transférase, toutes les enzymes du complexe pyruvate déshydrogénase, pyruvate carboxylase, 2-oxoglutarate glyoxylase carboxylase, D-glycérate déhydrogénase.
. 30 On peut également citer - les gènes associés avec des maladies du métabolisme des amino-acides comme par exemple phénylalanine hydroxylase, dihydrobioptérine synthétase, tyrosine aminotransférase, tyrosinase, histidinase, fumarylacéto-acétase, glutathion synthétase,

14 y-glutamylcystéine synthétase, ornithine-8-aminotransférase, carbamoylphosphate synthétase, ornithine carbamoyltransférase, argininosuccinate synthétase, argininosuccinate lyase, arginase, L-lysine déhydrogénase, L-lysine kétoglutarate réductase, valine transaminase, leucine isoleucine transaminase, décarboxylase des 2-céto-acides à chaîne ramifiée, isovaléryl-CoA déhydrogénase, acyl-CoA
déhydrogénase, 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-CoA lyase, acétoacétyl-CoA 3-kétothiolase, propionyl-CoA carboxylase, méthylmalonyl-CoA mutase, ATP :cobalamine adénosyltransférase, dihydrofolate réductase, méthylène tétrahydrofolate réductase, cystathionine (3-synthétase, le complexe sarcosine déshydrogénase, les protéines appartenant au système de clivage de la glycine, (3-alanine transaminase, carnosinase sérique, homocarnosinase cérébrale.
- Les gènes associés avec des maladies du métabolisme des graisses et des acides gras, comme par exemple Lipoprotéine lipase, apolipoprotéine C-II, apolipoprotéine E, d'autres apolipoprotéines, lécithine cholestérolacyltransférase, récepteur des LDL, stérol hydroxylase du foie, « acide phytanique » a-hydroxylase.
- Les gènes associés avec des déficiences lysosomales, comme par exemple a-L-iduronidase lysosomale, iduronate sulfatase lysosomale, héparan N-sulfatase lysosomale, N-acétayl-a-D-glucosaminidase lysosomale, acétyl-CoA : a-glucosamine N-acétyltransférase lysosomale, N-acétyl-a-D-glucosamine 6-sulfatase lysosomale, galactosamine 6-sulfate sulfatase Iysosomale, (3-galactosidase lysosomale, arylsulfatase B lysosomale, (3-glucuronidase lysosomale, N-acétylglucosaminyl-phosphotransférase, a-D-mannosidase lysosomale, a-neuraminidase lysosomale, aspartylglycosaminidase lysosomale, a-L-fucosidase lysosornale, lipase acide lysosomale, céramidase acide lysosomale, sphingomyelinase lysosomale, glucocérébrosidase lysosomale et galactocérébrosidase lysosomale, galactosylcéramidase lysosomale, arylsulfatase A
lysosomale, a-galactosidase A, (3-galactosidase acide lysosomale, chaîne a de l'hexosaminidase A lysosomale.
On peut également citer, de façon nan restrictive, les gènes associés avec des maladies du métabolisme des stéroïdes et des lipides, les gènes associés avec des maladies du métabolisme des purines et des pyrimidines, les gènes associés à
des maladies du métabolisme de la porphyrine et de l'hème, les gènes associés à
des maladies du métabolisme du tissu conjonctif, des s et des os ainsi que les gènes associés avec des maladies du sang et des organes hématopoïétiques, des muscles (myopathie), du système nerveux (maladies neurodégénératives) ou de l'appareil circulatoire (traitement des ischémies et de la sténose par exemple) et les gènes impliqués dans les maladies génétiques mitochondriales.
5 Dans le procédé suivant l'invention, l'acide nuciéique peut être associé à
tout type de vecteurs ou toute combinaison de ces vecteurs permettant d'améliorer le transfert de gènes, par exemple, de façon non limitative, à des vecteurs tels que des virus, des agents synthétiques ou biosynthétiques (par exemple lipidiques, polypeptidiques, glycosidiques ou polymériques), ou encore des billes propulsées ou 10 non. Les acides nucléiques peuvent aussi être injectés dans un muscle qui a été soumis à un traitement visant à améliorer le transfert de gènes, par exemple un traitement de nature pharmacologique en application locale ou systémique, ou un traitement enzymatique, perméabilisant (utilisation de tensioactifs), chirurgical, mécanique, thermique ou physique.

15 L'avantage de l'utilisation du muscle en thérapie génique réside dans de nombreux facteurs ~ ia stabilité remarquable de l'expression des transgènes, supérieure à
plusieurs mois, et permettant donc la production stable et soutenue d'une protéine thérapeutique intramusculaire ou sécrétée, ~ la facilité d' accès au tissu musculaire, permettant une administration directe, rapide et non dangereuse dans un organe non vital, ~ le volume important de la masse musculaire, permettant de multiples sites d' administration, ~ la capacité sécrétrice amplement démontrée du muscle.
A ces avantages, s'ajoute la sécurité apportée par le traitement local lié à
l'utilisation de champs électriques locaux et ciblés.
De par l'ensemble de ces avantages et la sécurité liée à l'utilisation de champs faibles, la présente invention pourrait s'appliquer au niveau du muscle cardiaque pour le traitement de cardiopathies, par exemple en utilisant un défibrilateur adapté. Elle pourrait s'appliquer aussi au traitement de la resténose par (expression de gènes inhibiteurs de la prolifération des cellules musculaires lisses comme la protéine GAX.

16 La combinaison de champs peu intenses et de durées d'administration longues appliquée notamment aux muscles in vivo améliore la transfection des acides nucléiques sans amener de détériorations notables des tissus. Ces résultats améliorent le rendement des transferts d'ADN dans le cadre de la thérapie génique mettant en oeuvre les acides nucléiques.
En conséquence, les avantages du tissu musculaire associés au procédé
selon l'invention permettent, pour la première fois, d'envisager de produire par thérapie génique un agent à des doses physiologiques et/ou thérapeutiques, soit dans les cellules musculaires, soit sécrété dans leur voisinage ou dans la circulation sanguine ou lymphatique. De plus, le procédé selon l'invention permet, pour la première fois, la modulation fine et le contrôle de la quantité efficace de transgène exprimé
par la possibilité de moduler le volume du tissu musculaire à transfecter, par exemple avec des sites multiples d'administration, ou encore la possibilité de moduler le nombre, la forme, la surface et la disposition des électrodes. Un élément de contrôle supplémentaire provient de la possibilité de moduler l'efficacité de la transfection par la variation de l'intensité de champ, du nombre de la durée et de la fréquence des impulsions, et évidemment suivant l'état de l'art, la quantité et le volume d'administration des acides nucléiques. On peut ainsi obtenir un niveau de transfection approprié au niveau de production ou de sécrétion désiré. Le procédé permet enfin un surcroît de sécurité par rapport aux méthodes chimiques ou virales de transfert de gènes in vivo, pour lesquelles l'atteinte d'organes autres que l'organe cible ne peut pas être totalement exclue et maîtrisée. En effet, le procédé selon l'invention permet le contrôle de la localisation des tissus transfectés (strictement fiée au volume de tissu soumis aux impulsions électriques locales) et apporte donc la possibilité d'un retour à
la situation initale par l'ablation totale ou partielle du muscle, rendue possible par le caractère non vital de ce tissu et par ses capacités de régénération. Cette grande souplesse d'utilisation permet d'optimiser le procédé suivant l'espèce animale (applications humaines et vétérinaires), l'âge du sujet, son état physiologique et/ou pathologique.
Le procédé selon l' invention permet, en outre, pour la première fois, de transfecter des acides nucléiques de grande taille contrairement aux méthodes virales qui sont limitées par la taille de la capside. Cette possibilité est essentielle pour le transfert de gènes de très grande taille comme celui de la dystrophine ou de gènes

17 avec des introns et/ou des éléments régulateurs de grande taille, ce qui est nécessaire par exemple pour une production physiologiquement régulée d'hormones. Cette possibilité est essentielle pour le transfert d'épisomes ou de chromosomes artificiels de levure ou de minichromosomes.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer de manière non limitative l ' invention.
Dans ces exemples, on se réfèrera aux figures suivantes ~ Figure 1: Effets d'impulsions électriques d'intensité de champ élevé sur la transfection d'ADN plasmidique pXL2774 dans le muscle tibial cranial chez la souris; valeurs moyennes + SEM, ~ Fi ure 2 : Effets d'impulsions électriques d'intensité de champ intermédiaire sur la transfection d'ADN plasmidique pXL2774 dans le muscle tibial cranial chez la souris; valeurs moyennes + SEM, ~ Figure 3: Effets d'impulsions électriques d'intensité de champ faible et de différentes durées sur la transfection d'ADN plasmidique pXL2774. dans le muscle tibial cranial chez la souris; valeurs moyennes ~ SEM, ~ Figure 4: Effets d'impulsions électriques d'intensité de champ faible et de différentes durées sur la transfection d'ADN plasmidique pXL2774 dans le muscle tibial cranial chez la souris; valeurs moyennes ~ SEM, ~ Fi ure 5 : Efficacité de l'électrotransfeetion de l'ADN plasmidique pXL2774 dans le muscle tibial cranial de la souris aux intensités de champs électriques faibles valeurs moyennes ~ SEM.
~ Fi ure 6 :Cinétique d'expression de la lucifërase dans le muscle tibial cranial de souris. Administration du plasmide pXL2774 avec électrotransfert (~ ) et sans électrotransfert ( X) ; valeurs moyennes ~ SEM.
~ Figure 7_ : Niveau d'expression du transgène en fonction la dose d'ADN
administrée, avec électrotransfert (t ) et sans électrotransfert ( D).
~ Fi re 8 : Effet de différents type d'électrodes sur l'efficacité de félectrotransfert.
~ Fi ug-re 9_ : Cinétique de la concentration sérique en phophatase alcaline sécrëtée.
Administration du plasmide pXL3010 avec électrotransfert (~ ) et sans électrotransfert ( ~) ; valeurs moyennes ~ SEM.

18 ~ Fi urge 10 : Cinétique d'expression du FGFl dans le muscle avec électrotransfert (barres d'histogramme blanches), et sans électrotransfert (barres d'histogramme noires).
Figure 11 : cartes des plasmides pXL3179 et pXL3212.

Figure : cartes des plasmides pXL3388 12 et pXL3031.

Fi u~ re : cartes des plasmides pXL3004 13 et pXL3010.

Fi ~ure 14 : cartes des plasmides pXL3149 et pXL3096.

Figure 15 : cartes des plasmides pXL3353 et pXL3354.

Fi ure 16 : carte du plasmide pXL3348 Exemple 1 : expérience effectuée dans Ies conditions de l'état de la technique antérieure dans laquelle les champs électriques se montrent inhibiteurs de la transfection Les conditions standards d'électroporation, telles que celles utilisées dans l'art antérieur et qui ont été discutées ci-avant, ont été testées et se sont avérées être inefficaces, voire même avoir une action inhibitrice sur le transert d'acides nucléiques (ADN plasmidique) dans le muscle strié.
Matériel et Méthodes - Conditions opératoires générales Dans cet exemple, les produits suivants ont été utilisés ADN pXL2774 (brevet PCT/FR 96/01414) est un ADN plasmidique comportant le gène rapporteur de la luciférase. Les autres produits sont disponibles auprès de fournisseurs du commerce : Kétamine, Xylazine, Sérum physiologique (NaCI 0,9 %).
Un oscilloscope et un générateur d'impulsions électriques (rectangulaires ou carrées) du commerce (Electro-pulsateur PS 15, Jouan, France) ont été
utilisés. Les électrodes utilisées sont des électrodes plates en acier inoxydable distantes de 1 à 15 mm.
L'expérience est rëalisée chez la souris C57 Bl/6. Les souris provenant de différentes cages sont réparties au hasard avant l'expérience ("randomisation").

19 Les souris sont anesthésiées par un mélange kétamine, xylazine. La solution de plasmide (30 ~I d'une solution â 500 ~g/ml de NaCI 0,9%) est injectée longitudinalement à travers la peau dans le muscle tibial cranial des pattes gauche et droite à (aide d'une seringue hamilton. Les deux électrodes sont enduites d'un gel conducteur et la patte injectée est placée entre les électrodes au contact de celles-ci.
Les impulsions électriques sont appliquées perpendiculairement à l'axe du muscle â (aide d'un générateur d'impulsions carrées, une minute après l'injection. Un oscilloscope permet de contrôler l'intensité en Volts (les valeurs indiquées dans les exemples représentent les valeurs maximales), la durée en millisecondes et la fréquence en hertz des impulsions délivrées, qui est de 1 Hz. 8 impulsions consécutives sont délivrées.
Pour l'évaluation de Ia transfection du muscle, les souris sont euthanasiées 7 jours après (administration du plasmide. Les muscles tibial cranial des pattes gauche et droite sont alors prélevés, pesés, mis dans du tampon de lyse et broyés. La suspension obtenue est centrifugée afin d'obtenir un surnageant clair. La mesure de (activité
luciférase est réalisée sur 10 ~.1 de surnageant à (aide d'un luminomètr~ du commerce dans lequel le substrat est ajouté automatiquement à la solution. L'intensité
de la réaction lumineuse est donnée en RLU (Relative Luminescence Unit) pour un muscle connaissant le volume total de suspension (1.106 RLU sont équivalents à 30 pg de luciférase). Chaque condition expérimentale est testée sur 10 points : 5 animaux injectés en bilatéral. Les comparaisons statistiques sont réalisées à l'aide de tests non paramétriques.
Résultats et discussion.
Deux figures, dont l'échelle est linéaire ou logarithmique, illustrent les résultats.
Dans cette première expérience on a testé les effets d'un champ électrique de 800 à 1200 Volts/cm qui permet félectroporation de tumeurs (Mir et al. Eur. J.
Cancer 27, 68, 1991).
On constate, d'après la figure l, que, relativement au groupe contrôle, où
l'ADN est injecté sans impulsion électrique WO 99!01158 PCT/FR98/01400 ~ avec 8 impulsions de 1200 Volts/cm et d'une durée de 0,1 msec, la valeur moyenne de l' activité Iuciférase est beaucoup plus faible, ~ avec des impulsions de 1200 Volts/cm et de 1 rnsec, 3 animaux sont morts, la valeur moyenne de l'activité luciférase est beaucoup plus faible, 5 ~ avec des impulsions de 800 Volts/cm et de 1 msec la valeur moyenne de l'activité
luciférase est aussi significativement réduite.
La plupart des muscles ayant subi l'action du champ électrique sont visiblement altérés (friables et d' aspect blanchâtre).
10 Exemple 2 : expérience d'électrotransfert d'acides nucléiques à des champs électriques modérés Cette expérience est réalisée avec des souris C57 Bl/6. Mis à part l'intensité
de champ électrique des impulsions et leur durée, les conditions de réalisation sont celles 15 de l'exemple 1.
Les résultats sont montrés à la figure 2. On reproduit le résultat de l'exemple 1, c'est-à-dire l'effet inhibiteur d'une série de 8 impulsions à 800 Volts/cm d'une durée de 1. msec sur l'activité luciférase détectée dans le muscle. Avec un champ de 600 Volts/cm, on observe la même inhibition et la même altération du tissu musculaire.

20 Par contre, de façon remarquable et surprenante, la diminution du voltage permet de ne plus altérer visiblement les muscles, et, de plus, à 400 et 200 Volts/cm le niveau de transfection des muscles est en moyenne supérieur à celui obtenu sur les muscles non soumis à un champ. Il est à noter que, relativement au groupe témoin (non soumis à un champ électrique), la dispersion des valeurs de (activité luciférase est diminuée à
200 Volts/cm (SEM = 20,59% de la valeur moyenne contre 43,32% en l'absence de champ électrique (figure 2A)).
Exemple 3 . expérience d'électrotransfert d'acides nucléiques avec des impulsions de faible intensité de champ montrant une très forte stimulation de l'expression du transgène

21 Cette expérience est réalisée avec des souris C57 Bl/6. Mis à part l'intensité
de champ électrique des impulsions et leur durée, et le fait que les impulsions sont délivrées 25 secondes après l'injection de l'ADN, les conditions de réalisation sont celles des exemples précédents.
Les résultats sont montrés à la figure 3. La valeur moyenne de l'expression du transgène luciférase est nettement augmentée avec une durée d'impulsion de 20 msec à
100 Volts/cm, et â partir d'une durée d'impulsion de 5 msec à 200 Volts/cm.
Cette expérience montre aussi clairement que la valeur moyenne de (activité
luciférase obtenue par électrotransfection de l'ADN dans le muscle est une fonction de la durée des impulsions électriques, lorsqu'on emploie des voltages de 200 et Volts/cm. On note aussi que la dispersion des valeurs est notablement réduite pour les groupes de muscles électrotransfectés (figure 3A) . En l' absence d' impulsions électriques (contrôle), la SEM représente 77,43% de la valeur moyenne alors que la SEM relative de la moyenne est réduite à 14% (200 Volts/cm, 5 msec), 41,27%
(200 Volts/cm, 20 msec) et entre 30% et 48% pour l'électrotransfert à 100 Volts/cm de champ électrique.
Dans la meilleure condition de cette expérience, on améliore par un facteur de 89,7 l'expression du transgène par rapport au contrôle injecté en l'absence d'impulsions électriques.
Exemple 4 : expérience d'électrotransfert d'acides nucléiques dans le muscle à
200 Volts/cm montrant une augmentation de l'expression du transgène d'un facteur supérieur à 200 Cette expérience est effectuée chez les souris DBA 2, avec des impulsions électriques d'une intensité de champ de 200 Volts/cm et de durée variable, les autres conditions de cette expérience étant celles de l'exemple 3.
Cet exemple confirme qu'à 200 Volts/cm la transfection de (activité luciférase est augmentée à partir d'une durée d'impulsion de 5 msec puis continue à
croître pour des durées plus longues (figures 4 et 5). Là encore, on observe avec l'ëlectrotransfection une réduction de la variabilité inter-individuelle indiquée par la SEM par rapport au contrôle non électrotransfecté (la. valeur relative de la SEM est

22 égale à 35% pour le contrôle et 25, 22, 16, 18, 16 et 26% pour des séries d'impulsions de 1, 5, 10, 15, 20 et 24 msec respectivement).
Dans la meilleure condition de cette expérience, on améliore par un facteur de 205 l'expression du transgêne par rapport au contrôle injecté en l'absence d'impulsions électriques. Il apparaît ainsi que la variation dde la durée de chaque impulsion délivrée est un moyen de moduler l'efficacité du transfert d'acides nucléiques et d' ajuster le niveau d' expression du transgène.
Exemple 5 : efficacité de l'électrotransfert d'acides nucléiques en fonction du produit « nombre des impulsions x intensité du champ x durée de chaque impulsion »
La figure 5 exemplifie l'importance du paramètre correspondant au produit « nombre des impulsions x intensité du champ x durée de chaque impulsion ». Ce paramètre correspond en fait à l'intégrale en fonction du temps de la fonction qui décrit la variation du champ électrique.
La représentation en figure 5 des résultats obtenus au cours des expériences 2, 3 et 4 avec des intensités de champ électrique de 200 V/cm, 100 V/cm ou en absence des champs électriques montre que l'efficacité de transfection augmente en fonction du produit de la durée totale d'exposition au champ électrique par l'intensité de champ.
Un effet de stimulation est obtenu pour une valeur supérieure à 1 kV,~msec/cm du produit « champ électrique x durée totale des impulsions ». Selon un mode préféré, une stimulation est obtenue pour une valeur supérieure ou égale à 5 kVxmsec/cm du produit « champ électrique x durée totale des impulsions ».
Exemple 6 . effet de l'augmentation de la durée des impulsions électriques.
Cet exemple illustre que l'on peut augmenter Ia durée unitaire des impulsions bien au delà des valeurs testées dans l'exemple 4.

23 Cette expérience est réalisée avec des souris C57B1/6. Le plasmide utilisé est le plasmide pXL 2774, la quantité d'ADN administrée est de 15 ~g.
L'électropulsateur utilisé pour délivrer les impulsions électrique d'une durée supérieure à 20 msec est un électropulsateur du commerce (Genetronics, modële T 820, USA, San Diego, CA).
Les impulsions électriques sont de nombre et de durée variable mais d'une intensité de champ constante de 200 Volts/cm ; les autres conditions de cette expérience sont celles décrites dans l'exemple 1. Les résultats sont présentés dans le tableau 1.
dure Impulsion 0 1 5 IO 20 30 40 50 60 80 (msec) Exprience 11 39 211 288 1158 14872386 A

8 impulsions t t t t 238 t t Exprience 11 26,8 123 246 575 704 3440 A

4 impulsions t t t 32 t t 11077 Exprience 15 2885 2626 1258 B

4 impulsions t + + t Tableau 1 : valeurs moyennes +/- SEM de l'activité luciférase en millions de RLU par muscle . N = 10 pour chaque groupe. Conditions électrotransfert :
intensité
de champ 200 V/cm, 8 ou 4 impulsions (durée unitaire variable), fréquence 1 Hz.
On constate une augmentation de (expression du transgène avec (allongement de la durée unitaire des impulsions (au mains jusqu'à 40 msec pour une série de 8 impulsions et au moins jusqu'à 50 msec pour une série de 4 impulsions d'une intensité
de 200 Volts/cm). Cet exemple montre que l'optimum de la durée des impulsions dépend du nombre d'impulsions utilisées et que la durée unitaire des impulsions peut atteindre au moins 80 msec, cette valeur de durée n'étant pas limitative.

24 Exemple 7 . et~cacité de l'électrotransfert en fonction du nombre d'impulsions électriques Cette exemple met en évidence (effet de (augmentation du nombre d'impulsions électriques sur l'efficacité du transfert d'acides nucléiques.
Cette expérience est réalisée avec des souris C57B1/6. Le plasmide utilisé est le plasmide pXL, 2774, la quantité d'ADN administrée est de 15 p.g. Les impulsions électriques sont variables en nombre. La durée de chaque impulsion est de 20 msec.
L'intensité de champ est de 200 Volts/cm. Les autres conditions de cette expérience sont celles décrites dans l'exemple 1. Les résultats sont présentés dans Ie tableau 2.
Nombre 0 1 2 4 6 8 12 16 impulsions RLU total Tableau 2 : valeurs moyennes +/- SEM de l'activité luciférase en millions RLU
par muscle. N = 10 par groupe. Conditions : intensité de champ 200 V/cm, nombre variable d'impulsions de 20 msec, frëquence 1 Hz.
On observe que (expression de la iuciférase augmente de manière très importante dès l'application d'une seule impulsion, et qu'elle continue d'augmenter en fonction du nombre d'impulsions. Il apparaît ainsi que la variation du nombre d'impulsions délivrées est un moyen de moduler l'efficacité du transfert d'acides nucléiques et d'ajuster le niveau d'expression du transgène.
On confirme également une diminution de la variabilité de la réponse mise en évidence par la diminution de la valeur de la SEM par rapport à la moyenne pour tous les groupes soumis à l'électrotransfert.

Exemple 8 : effet de l'augmentation de la fréquence des impulsions électriques.
Cet exemple montre que l'augmentation de la fréquence des impulsions permet de manière inattendue d'améliorer l'efficacité de la transfection. D'autre part et dans 5 une perspective clinique, l'augmentation de la fréquence doit améliorer le confort du patient en diminuant la durée totale du traitement.
Cette expérience est réalisée avec des souris C57B1/6. Le plasmide utilisé est le plasmide pXL. 2774, la quantité d'ADN administrée est de 15 p,g. La fréquence des impulsions électriques est variable (de 0,1 à 4 Hertz). La durée de chaque impulsion 10 est de 20 msec, (intensité de champ est de 200 Volts/cm, les autres conditions de cette expérience sont celles décrites dans l'exemple 1. Les résultats sont présentés dans le tableau 3.
Frquence 0 0,1 0,2 0,5 1 2 3 4 Hertz ' Exprience5 54 95 405 996 1528 A

8 impulsionst 2 t 13 t 16 t 60 t 156 t 257 Exprience 114 163 175 337 587 A

4 impulsions t 14 ~ t 26 t 53 t 90 Exprience21 1294 2141 3634 2819 B

$ impulsionst 14 t 189 t 387 t 868 493 Exprience 1451 1572 1222 2474 B

4 impulsions t 228 t 320 t 126 t 646 15 Tableau 3 : valeurs moyennes +/- SEM de l' activité luciférase en millions de RLU par muscle. N = 10 pour chaque groupe. Conditions : intensité de champ 200 . V/crn, 8 ou 4 impulsions de 20 msec. , fréquence variable.

Les résultats obtenus dans l'expérience « A » , tableau 3 montrent que les fréquences plus élevées (>1 Hz) sont plus efficaces que les fréquences faibles qui correspondent à une durée plus longue entre deux impulsions consécutives (10 secondes à O.I Hertz). L'efficacité de la transfection augmente avec la fréquence sur la plage de valeurs testées de 0.1 à 4 Hertz pour 4 impulsions et de 0.1 à 3 Hertz pour 8 impulsions.
Exemple 9 : effet de l'applica.tion d'un champ électrique variant selon une exponentielle décroissante en fonction du temps.
Cette exemple met en évidence (effet de l'application d'un champ électrique variant selon une exponentielle décroissante sur l'efficacité du transfert d'acides nucléiques.
Cette expérience est réalisée avec des souris C57B1/6.
Le plasmide utilisé est Ie plasmide pXL 3031. Le plasmide pXL3031 (Figure 12) est un vecteur dérivé du plasmide pXL2774 (W097/20343) dans lequel le gène luc+ codant pour la Iuciférase de Photinus- pyralis modifiée (cytoplasmique) provenant de pGL3basic (Genbank: CVU47295) a été introduit sous contrôle du promoteur provenant de la région précoce du cytomegalovirus humain {hCMV IE, Genbank HSSIEE) et du signal de poly-adénylation de la région tardive du virus SV40 (Genbank SV4CG). La quantité d'ADN administrée est de 10 ~.g.
Le générateur d'impulsions électriques utilisé permet de délivrer des impulsions d'une intensité de champ électrique variant selon une exponentielle décroissante en fonction du temps (électropulsateur Equibio, modèle easyjectT plus, Kent UK).
Le voltage imposé est le voltage au pic de l'exponentielle. Le deuxième paramètre ajustable est la capacitance (pFarads) qui permet de faire varier la quantité
d'énergie délivrée et la constante de temps de l'exponentielle. Les résultats sont présentés dans le tableau 4.

Capa Capa Capa Capa Capa Capa Capa pF F pF p.F N.F N.F N.F

40 V/cm 1,23 11 100 V/cm 16,5 2,8 6,5 23,9 150 V/cm 1,8 3,5 6,1 200 V/cm 5,1 15,8 18,8 121,5 189,7 300 V/cm 32,1 90,5 48,7 760,4 56,2 400 V/cm 795 600 V/cm 62 800 V/cm 3,1 1,1 Tableau 4 : facteur d'augmentation de L'expression (activité luciférase) obtenu par application d'une impulsion à décroissance exponentielle. Le facteur d'augmentation est calculé par référence à (activité luciférase obtenue avec l'administration du plasmide pXL3031 sans électrotransfert. (valeurs moyennes du facteur d'augmentation, N = 4 à 6 par condition).
A titre comparatif, Ie facteur d'augmentation de (expression obtenu pour Ie transfert de pXL3031 en présence d'un champ électrique avec des impulsions de formes carrées (intensité de champ de 200 V/cm, 8 impulsions de 20 msec, à une fréquence de 1 Hertz) était de 44 dans la même expérience.
Ces résultats montrent que l'on peut utiliser des impulsions électriques de forme carrée ou d'une intensité décroissant de manière exponentielle en fonction du temps. De pïus, dans ce dernier cas, une augmentation importante de l'expression peut être obtenue pour une valeur de champ faible et une capacitance élevée (e.g.

V/cm, capacitance 3000 p.Farad) ou une valeur de champ élevée et une capacitance faible (e.g. 400 V/cm, capacitance 300 Farad).

Exemple 10 : effet de la combinaison d'une impulsion brève de voltage élevé et de plusieurs impulsions longues de voltage faible.
Cet exemple montre que le champ électrique délivré peut être une combinaison d'au moins un champ compris entre 500 et 800 Volts/cm pendant une courte durée, par exemple 50 ou 100 p.sec, et d'au moins un champ faible ( < 100Volts/cm) pendant une durée plus longue, par exemple > 1 msec et jusqu'à 90 msec dans cette expérience.
Les valeurs de champ électrique faible sont ici de 80 V/cm appliquées en 4 impulsions d'une durée de 90 msec avec une fréquence de 1 Hertz. Pour cette expérience deux électropulsateurs sont utilisés. Les impulsions électriques sont appliquées par fun puis (autre appareil, le changement s'effectuant en moins d'une seconde à l'aide d'une commande manuelle.
Le plasmide utilisé est le plasmide pXL3031. La quantité d'ADN administrée est de 3 ~.g. Les valeurs de champ électrique sont indiquées dans le~ tableau 5 ; les autres conditions de cette expérience sont celles décrites dans l'exemple 1.
Conditions d'application Exprience 1 Exprience 2 du champ lectrique (3 pg pXL3031)(3 ~g pXL3031) Contrle (absence de champ 320 +/-126 75 +/- 27 lectrique) Al : 500 V/cm , 1 x 0,1 msec- 169 +/- 63 A3 : 800 V/cm , 1 x 0,1 msec416 +/- 143 272 +/- 84 B : 80 V/cm , 4 x 90 msec 1282 +/- 203 362,21 +/- 85,17 Conditions A1 puis B - 1479 +/- 276 Conditions A3 puis B 3991 +/- 418 1426 +/- 209 Conditions B puis A3 - 347 +/- 66 Tableau 5 : valeurs moyenne +/- SEM de (activité Iuciférase en millions de RLU par muscle. N = 10 muscles par groupe.
Le tableau 5, résumant les résultats obtenus pour deux séries d'expériences, montre qu'une brève impulsion de voltage élevé ou que quatre impulsions successives longues et de faible voltage améliorent peu la transfection relativement au groupe contrôle ayant reçu une injection de pXL3031 mais non soumis à un champ électrique.
Il en est de même lorsque les impulsions de champ faible sont appliquées avant l'impulsion de champ élevé.
Par contre, dans les deux séries d'expériences, la combinaison d'une brève impulsion de haut voltage suivie de quatre impulsions successives longues et de faible voltage augmente très nettement l'efficacité du transfert de l'ADN.
Les résultats obtenus dans les exemples 1 et 2 ont montré que 8 impulsions de 600, 800 ou 1200 volts d'une durée unitaire de 1 msec à 1 Hz étaient lésionnelles et inhibaient la transfection. Les résultats obtenus dans l'exemple 10 montrent que, dans des conditions particulières, il est possible d'utiliser des intensités de champ de voltage élevées de façon non lésionnelle, en effet d'un point de vu macroscopique les muscles ne sont jamais visiblement altérés. L'utilisation de champs électriques élevés de durée brève combinés à des champs faibles de durée plus longue apparaît comme un moyen supplémentaire de moduler l'efficacité du transfert de l'ADN.
Exemple 11 : électrotransfert avec des plasmides de tailles différentes, des gènes sous contrôle de différents promoteurs ou avec des sites d'adressage variable de la protéine exprimée par le transgëne.
11. a - électrotransfert avec des plasmides de tailles différentes Des plasmides de taille différente (2.8 Kb, 3.8 Kb, 8.6 Kb, 20 Kb, et 52,5 Kb) comprenant le gène codant pour la luciférase ont été testés. La quantité de plasmide administrée est de 10 ~g par muscle. Un champ électrique d'une intensité de 200 V/cm en 8 impulsions de 20 msec à 2 Hz est appliqué , les autres conditions de cette expérience étant celles décrites dans l'exemple 1.
On observe une augmentation de (expression du transgène d'environ 50 fois 5 avec les plasmides de 2,8 Kb et 3,8 Kb, d'environ 80 fois avec le plasmide de 8,6 Kb et de 3 à 6 fois avec les plasmides de 20 et 52,6 Kb.
Cet exemple démontre ainsi la possibilité de transférer des plasmides de taille importante, allant jusqu'à 20 Kb et au delà.
11. b : contrôle du signal de luminescence en absence de gène codant pour la 10 luciférase.
A titre de contrôle, et pour exclure la possibilité que les signaux de luminescence observés pour le dosage de l'activité luciférase soient dûs à des radicaux produits dans le tissu suite au traitement électrique, l'activité luciférase a été testée sur des muscles traités avec un plasmide ne codant pas pour la luciférase 'et soumis à un 15 champ électrique.
Electrotransfert _ Plasmide pXL 3004 ( 0,016 +/- 0,0050,015 +/- 0,006 15 pg) codant pour la (3-galactosidase(n=6) (n=6) Plasmide pXL 2774 (15~g)7,33 +/- 3,53 491,71 +/- 122,28 codant pour la lucifrase(n=10) (n=10) Tableau 6 : activité luciférase dans des muscles injectés avec différents plasmides, avec ou sans application d'un champ électrique. Conditions : 200 V/cm, 8 impulsions de 20 msec, fréquence 1 Hz. Valeurs moyennes +/- SEM de l'activité
20 luciférase en millions de RLU par muscle.

Les résultats montrent que l'activité basale de la luciférase dans des muscles injectés avec un plasmide ne codant pas pour la luciférase est tout a fait négligeable.
11. c - électrotransfert de gènes sous contrôle de différents promoteurs L'influence de différents promoteurs a été testée sur le niveau d'expression des gènes transférés, avec et sans, application du champ électrique.
La quantité de plasmide injecté par muscle est de 2 ~.g. Le champ électrique appliqué est de 200 V/crn en 8 impulsions de 20 msec â 1 Hz , les autres conditions de cette expérience sont celles décrites dans l'exemple 1. Les résultats sont présentés dans le tableau 7. Le plasmide testé est le plasmide pXL3031 pour la construction CMV-LUC. La construction PGK correspond à la substitution du promoteur CMV
par le promoteur PGK dans le pXL3031.
Promoteur PGK CM V
~

Electrotransfert. + - +

~-U 8 2,8 1070 157 83 20350 1112 Facteur x 133,7 x 129,3 d'am lification Tableau 7 : valeurs moyennes +/- SEM de l'activité luciférase en millions de RLU par muscle.
Ces résultats montrent que, lorsque l'ADN est transféré en présence d'un champ électrique, le facteur d'augmentation de l'expression du transgène est comparable quelle que soit l'origine ou la force du promoteur.
11. d - électrotransfert de gène avec différents sites J'adressa eg_ de la-protéine exprimée par le trans ,gène.

Cet exemple illustre le transfert de gène codant pour des protéines ayant différentes localisations cellulaires. Le plasmide pXL3031 code pour une luciférase synthétisée dans le cytosol et le plasmide pXL2774 code pour une luciférase adressée dans les peroxysomes.
La quantité de plasmide injectée par muscle est de 10 ~.g. Le champ électrique appliqué est de 200 V/cm en 8 impulsions de 20 msec à 1 Hz , les autres conditions de cette expérience sont celles décrites dans l'exemple 1. Les résultats sont présentés dans le tableau 8.
pXL 2774 pXL 3031 ElectrotransfertElectrotransfertElectrotransfertElectrotransfert - + - +

Tableau 8 : valeurs moyennes +/- SEM de (activité luciférase en millions de RLU.
Ces résultats mettent en évidence que le procédé selon (invention s'applique pour le transfert de gènes codant pour des protéines de localisations cellulaires différentes, et notamment pour des protéines péroxisomales ou des protéines cytosoüques.
Exemple 12 . analyse cinétique et histologique de l'expression du transgène.
12. a - cinétique d' expression du transgène Cet exemple montre que le transfert d'acides nucléiques en présence d'un champ électrique dans les conditions selon (invention permet d'obtenir l'expression d'un transgène à un niveau élevé et stable pendant une durée d'au moins 4 mois.

Cette expérience est réalisée avec des souris C57B1/b. Le plasmide utilisé est le plasmide pXL 2774, la quantité d'ADN administrée est de 15 ~.g. L'injection d'ADN
est suivie, ou non (groupe contrôle), de (application d'un champ électrique dans les conditions suivantes : intensité 200 V/cm , 8 impulsions de 20 msec, fréquence I Hz.
Les autres conditions de cette expérience sont celles décrites dans l'exemple 1.
L'activité lucifërase est déterminée sur des groupes de 10 souris sacrifiées à
différents temps. Les résultats sont présentés dans la figure 6.
On observe, pour le groupe contrôle, que l'expression de la luciférase est détectable dès la 3 ème heure après l'injection du plasmide et augmente jusqu'au 3 ème jour (J3) puis décroît de manière notable après 35 jours.
On constate, pour le groupe soumis aux impulsions électriques, que (expression du transgène se maintient à un niveau très nettement supérieur à
celui du groupe contrôle. De plus, et de manière remarquable, on observe que ce niveau d'expression reste élevé et constant au delà de 35 jours et au moins jusqu'à
120 jours.
I5 Ce niveau d'expression élevé et durable du transgène est un résultat particulièrement avantageux dans la perspective de traitements cliniques à long terme avec des gènes thérapeutiques.
12. b - analyse histologigue Une étude histologique a été conduite dans les mêmes conditions mais en administrant le plasmide pCOR CMV-lacZ (pXL3004) codant pour la (3-galactosidase à localisation nucléaire.
Le plasmide pXL3004 (Figure 13) est un vecteur dérivé du plasmide pXL2774 (W097/10343) dans lequel le gène lacZ additionné d'une séquence de localisation nucléaire (nls) (Nouvel et al.. 1994, Virology 204:180-189)) a été introduit sous contrôle du promoteur CMV du plasmide pCDNA3 (Invitrogen, Pays-Bas) et du signal de poly-adénylation de la région précoce du virus SV40 (Genbanl.
SV4CG).
Les animaux sont sacrifiés sept jours après administration du plasmide.
L'analyse histologique permet de détecter les cellules exprimant la (3-galactosidase et dont le noyau est situé dans le plan de coupe (histochimie Xgal).

Le nombre de fibres musculaires présentant des noyaux positifs au niveau des coupes examinées est en moyenne de 76 dans le groupe (n=8) ayant reçu le plasmide pXL3004 puis soumis aux impulsions électriques contre une moyenne de 8.5 dans le groupe contrôle (n=8) (animaux ayant reçu le plasmide pXL3004 mais n'ayant pas été
soumis aux impulsions électriques).
On observe que le nombre de fibres musculaires exprimant le transgène est en moyenne neuf fois plus élevé par rapport au groupe contrôle. La plupart de ces fibres musculaires sont quiescentes avec des noyaux situés en périphérie. De très rares fibres musculaires centronuclées expriment la (3-galactosidase. On observe également que, le long du trajet d'injection du plasmide, la densité de fibres musculaires positives par unité de surface est plus importante dans le groupe traité par électrotransfert par rapport au groupe contrôle.
L'ensemble de ces résultats montrent que, relativement à des muscles non soumis au champ électrique, félectrotransfert permet une très nette augmentation du nombre de fibres musculaires exprimant le trans~ène ainsi n»',~nP trde natta augmentation de la surface de la zone exprimant le transgène. Il est observé
également que l'application du champ électrique n'entraîne pas de réaction inflammatoire notable.
Exemple 13 : Effet du moment d'injection de l'acide nucléique par rapport à l'application du champ électrique.
Cet exemple illustre le fait que (acide nucléique peut être administré au moins minutes, et même au moins une heure, avant l' application du champ électrique.
Cette expérience est réalisée avec des souris C57BI/6. Le plasmide utilisé est le plasmide pXL 2774. La quantité d'ADN administrée est de 15 ~g ou 1,5 ~.g.

25 L'injection d'ADN est suivie, ou précédée, de (application d'un champ électrique dans les conditions suivantes : intensité 200 V/cm , 8 impulsions de 20 msec, fréquence 1 Hz. Les autres conditions de cette expérience sont celles décrites dans l' exemple 1. Un groupe contrôle est constitué d'animaux ayant reçu une injection du plasmide mais n' ayant pas été sounvs aux impulsions électriques. Les résultats sont présentés dans le 30 tableau 9 Tableau 9 A : Injection ADN en absence de champ électrique EXp 1 Exp 2 Ex~~ 3 Exp 4 EXp $

pXL2774 pXL 2774 pXL 2774 pXL 2774 pXL 2774 (15 E,ig)15 pg) (1,5 pg) (15 pg) (1,5 ~.ig) Contrle 7 t 4 8 t 6 0,4 t 22 t 15 1 t 1 0,2 Tableau 9 B : Injection ADN avant application du champ électrique te, mps Ex~A I Exp 2 Exp 3 Exn 4 Exp S

- 120 min 2015 2 t l - 60 min 106122 lO t 3 - 30 min 303136 237161 713 184122 1514 - S min 41017 - 60 sec 253 t - 20 sec 492 t 201 t 9 t 3 123 t 12 t 2 Tableau 9 C : Injection ADN aprës application du champ électrique temps Exp 1 Exp 2 Exp 3 Exp 4 EXp $

+lOsec 717 + 20 sec 11 t 6 0,4 t 0,1 + 60 sec 817 17115 Tableau 9: valeurs moyennes +/- SEM de l' activité luciférase en millions de RLU par muscle. N = 10 muscles par groupe.
5 La présence de l'ADN au moment de l'application du champ électrique est une condition de l'efficacité de félectrotransfection. De façon remarquable, il est observé

que l'injection du plasmide peut être réalisée au moins 30 minute et même 1 heure (expériences 4 et 5) avant l'application du champ électrique et ce, sans modification notable du niveau d'expression. Un résultat similaire est obtenu aussi bien avec avec une dose de 15 ~.g de plasmide par muscle qu'avec une dose 10 fois plus faible de 1,5 ~g.
Ces observations permettent notamment d'envisager de multiples injections à
des temps variables du même plasmide, ou de différents plasmides, dans le muscle préalablement à (application du champ électrique. Il est également possible de faire de multiples injections sur une zone étendue du muscle puis d'appliquer une série d'impulsions électriques sur l'ensemble du territoire injecté à traiter.
Exemple 14 : Etude statistique sur la relation entre la dose d'ADN injecté
et le niveau d'expression.
L'étude statistique présentée dans cet exemple permet de comparer la relation effet/dose d'un transgène administré en présence, ou en absence, d'un champ électrique. Cette étude confirme également que le procédé selon (invention réduit considérablement la variabilité d'expression du transgène.
Des souris C57B16 âgées de 5 semaines ont reçu une injection de plasmide pXL3031 dans le muscle tibial cranial et de manière bilatérale. Les doses de plasmide varient de 0,25 à 32~g d'ADN. Chaque dose est testée sur 10 animaux.
Immédiatement après l'injection du plasmide, on soumet l'une des deux pattes à
un champ de 250V/cm, avec 4 impulsions de 20ms et une fréquence de 1 Hz.
Les animaux sont -sacrifiés 5 jours après le traitement et l'expression du transgène est recherchée dans l'extrait tissulaire de chaque muscle. Les résultats sont présentés dans la figure 7.
La comparaison de l'évolution des variances en fonction de celle des moyennes pour chaque série de 10 répétitions montre clairement que la distribution de l'expression du transgène est log-normale. L'analyse graphique des résultats de la figure 7, confirmée par le calcul, montre que l'expression varie linéairement avec le logarithme de la dose d'ADN injecté.
Le test de Cochran montre qu'il existe une homogénéité des variances pour chaque régression (avec et sans électrotransfert) ce qui permet d'utiliser les variances résiduelles pour effectuer l'ensemble des calculs.
Un test d'écart à la Iinëarité est non significatif au risque 5% dans le cas où il y a eu électrotransfert, par contre il existe un écart à la linéarité très significatif (p <
0,01), ce qui traduit une importante hétérogénéité des réponses en l'absence d'électrotransfert. La variance résiduelle est 5 fois plus faible avec l'électrotransfert.
Compte tenu des valeurs estimées des variances résiduelles, il est possible d'utiliser 5 fois moins d'animaux pour obtenir la même puissance dans un test de comparaison d'efficacité de transfection, selon que fon applique ou non l'électrotransfert. Ainsi pour mettre en évidence une différence d'expression d'un facteur 2, 5 ou 10, avec un intervalle de confiance P=95%, il faudra respectivement 33, 8 ou 5 animaux si le transgène est administré par électrotransfert et 165, 40 ou 25 animaux en absence d'électrotransfert. Un tableau est présenté ci-dessous résumant ce type de calcul dans le cas où l'électrotransfert est utilisé.
Rapport P = 95% P = 90% P = 85% P =75%
d'efficacité
ou d' Ainsi la diminution de la variabilité interindividuelle obtenue avec l'électrotransfert permet d'effectuer des études analytiques précises sur la comparaison de l'expression de différents gènes. Elle autorise également une meilleure définition des doses de traitement et doit prévenir le risque lié au dépassement des doses acceptables dans la fenétre thérapeutique.

Le test de comparaison des pentes obtenues pour chaque régression est non significatif. On peut donc considérer au risque de 5% qu'il y a parallélisme des deux régressions.
Le calcul de la puissance relative montre que pour atteindre un niveau d'expression comparable à celui obtenu en présence d'électrotransfert il faut, en absence d'électrotransfert, environ 250 fois plus d'ADN injecté par muscle (243 +/- 85 intervalle de confiance P = 95%).
Le calcul de la puissance relative montre corrélativement que, pour une quantité d'ADN donnée, le niveau d'expression est environ 500 fois plus élevé
en présence d'électrotransfert par comparaison au niveau d'expression obtenu en l'absence d'électrotransfert.
Exemple 15 : comparaison de différents types d'électrodes.
Cet exemple a pour but de comparer (effet de deux types d'électrodes, électrodes plaques et électrodes aiguilles, sur (efficacité du transfert d'acides nucléiques. Les électrodes aiguilles ont également été testées selon différentes orientations d'implantation.
La plasmide pXL 2774 (150 ~.g) est injecté dans le muscle triceps chez le rat.
Les électrodes plaques sont placées comme indiqué dans l'exemple 1. La distance inter-électrode pour les électrodes plaques est de 1,2 cm. Pour les électrodes aiguilles, la distance inter-électrodes est de 0,9 cm. Les électrodes aiguille sont enfoncées dans le tissu musculaire sur une longueur équivalente, soit perpendiculairement, soit parallèlement à Taxe des fibres, de part et d'autre du site d'injection. Quel que soit le type d'électrodes, ou leur orientation, les conditions d'application du champ électrique sont les suivantes : intensité 200 V/cm , 8 impulsions de 20 msec à 2 Hz. Les résultats sont présentés dans la figure 8.
Les résultats obtenus montrent que l'application du champ électrique à l'aide de deux aiguilles parallèles implantées dans le muscle donne des résultats comparables à ce qui est obtenu avec des électrodes plaques mises au contact de la peau entourant Ie muscle. Il est également montré que l'efficacité de l'électrotransfert est indépendante de la direction d'implantation des électrodes aiguilles relativement à
l'axe des fibres musculaires.
Cet exemple montre que le procédé selon l'invention permet l'électrotransfert d' acides nucléiques à l' aide d' électrodes externes ou invasives et ce, quelle que soit Leur orientation. L'utilisation des électrodes aiguilles est particulièrement avantageuse pour assurer le transfert d'acides nucléiques dans les muscles de grande tailie tout en conservant des impulsions électriques de voltage modéré (par exemple 100 V
avec un espacement de 0,5 cm pour délivrer un champ électrique de 200 V/cm) Exemple 16 : efficacité de l'électrotransfert sur différents muscles de la souris, du rat, du lapin et du singe.
Cet exemple illustre que félectrotransfert d'acides nucléiques est applicable à
différents types de muscles, dans différentes espèces de mammifères (souris, lapin, rat et singe).
Les conditions d'application du champ électrique sont définies dans le tableau 10 A en regard de chaque espèce. Les résultats sont présentés dans Ie tableau 10 A.
impulsions MuscleMuscleMuscleMuscle Muscle Espce plasmidelectriques TibialGastroc-RectusTricepsQuadriceps cranialnmien femorisbrach Souris10 ~tg 8 x 200 x 28 x 196 x 342 x 1121 V/cm pXL303120 msec, 2 Hz Rat 150 8 x 200 x 31 x 160 x 13,2 ~g V/cm pXL303120 msec, 2 Hz Lapin 200 4 x 200 x 25417 x 724 x 3595 ltg V/cm pXL277420 msec, 1 Hz Tableau 10 A : facteur d'augmentation de l'expression de la luciférase obtenu avec félectrotransfection. Ce facteur est calculé par référence à (activité
luciférase obtenue pour (injection du plasmide pXL3031 ou pXL2774 sans électrotransfert.
Moyennes sur 10 muscles par groupe. L'activité luciférase est dosée 7 jours après 5 l'administration du plasmide.
L'électrotransfert a également été testé chez le singe (Macaca fascicularir).
Le plasmide utilisé est le plasmide pXL3179 comprenant le gène codant pour le facteur de croissançe de fibroblastes 1 (FGFl ou aFGF).
10 Le plasmide pXL3179 (Figure 11) est un vecteur dérivé du plasmide pXL2774 (W097/10343) dans lequel le gène codant pour une fusion entre le peptide signal de l'interféron de fibroblastes humain et l'ADNc du FGFI (Fibroblast Growth Factorl) (sp-FGFl, Jouanneau et al., 1991 PNAS 88:2893-2897) a été introduit sous contrôle du promoteur provenant de la région précoce du cytomegalovirus humain (hCMV
IE) 15 et du signal de poly-adénylation de la région tardive du virus SV40 (Genbank SV4CG).
La présence de FGFl est déterminée par immuno-histochimie. Les valeurs indiquent le nombre de coupes positives 3 jours après injection intra musculaire de 500 ~.g du plasmide pXL3179. Les conditions d'application du champ électrique sont les 20 suivantes : intensité du champ électrique 200 V/cm , 8 impulsions de 20 msec à 1 Hz.
Les résultats sont présentés dans le tableau ci dessous.
__ Electrotransfert Muscle _ Trice s 0 0 Tibial cranial 0 30 Bice s 0 4 Quadrice s 0 Tableau 10 B : révélation par immuno-histochimie de l'expression de FGF1 25 dans différents muscles de singe (Macaca fascicularis). Les valeurs indiquent le nombre de coupes positives 3 jours après injection intra musculaire de 500 p.g du plasmide pXL3179 codant pour FGFl avec ou sans électrotransfert.
Ces résultats démontrent que l'électrotransfert augmente de manière remarquable (expression d'un transgène, dans différents types de muscles, dans différentes espèces de mammifères.
Exemple 17 : efficacité de l'electrotransfert sur le muscle du diaphragme de rat La possibilité d'exprimer de façon durable et stable des gènes d'intérêt thérapeutique directement au niveau du diaphragme est une approche thérapeutique particuliêrement intéressante dans le cadre du traitement de certaines maladies dégénératives qui affectent le fonctionnement de ce muscle, telle que notamment la myopathie de Duchenne.
Les rats sont anesthésiés avec un mélange largactyl, kétamine ( I rng/kg largactyl, 150 rng/kg ketamine). Dans ces expériences le diaphragme est rendu accessible par une incision le long du sternum. L'injection est réalisée dans fhémidiaphragme (50 pg de plasmide pXL 2774 dans 50 wl de NaCI 20 mM et glucose 5 %). Les électrodes plaques sont ensuite placées de part et d'autre du plan du diaphragme le long du trajet d'injection (distance inter électrodes = 1 mm).
Les conditions d'électrotransfert sont les suivantes : intensité du champ 160 V/cm ou 300 V/cm, 8 impulsions de 20 msec, fréquence 1 hertz. Le champ électrique est appliqué
moins d'une minute après l'injection. L'animal est ensuite recousu.
V/cm 0 160 300 RLU total 48 920 51 Tableau 11 : valeurs moyennes +/- SEM de (activité luciférase en millions de RLU par muscle. N = 12 pour chaque groupe.

Cette exemple montre une amélioration significative de (expression du transgène dans le diaphrame après application de 8 impulsions de 20 msec d'une intensité de champ de 160 V/cm (p < 0,003 avec le test non paramétrique de Mann-Whitney).
Exemple 18 : transfert d'un gène codant pour la phosphatase alcaline sécrétée (SeAP) et cinétique d'expression de la SeAP.
Cet exemple illustre la capacité du procédé selon (invention de transformer le muscle en un organe sécréteur d'un polypeptide d'intérêt thérapeutique ou vaccinal et d'assurer la présence dans la circulation sanguine d'une concentration élevée et stabie du polypeptide d'intérêt.
Dans cet exemple le procédé d'électrotransfert à été testé sur .ia souris adulte avec un plasmide comprenant le gène codant pour la phosphatase alcaline sécrétée placentaire humaine. Des souris C57BL6 adultes ont reçu, dans le muscle tibial cranial et de manière unilatérale, une injection de plasmide pXL3010.
Le plasmide pXL3010 (Figure 13) est un vecteur dérivé de ColEl dans lequel le gène codant pour la phosphatase alcaline sécrétée provenant de pSEAP-basic (Clontech, Genbank: CVU09660) a été introduit sous contrôle du promoteur CMV
provenant du plasmide pCDNA3 (Invitrogen, Pays-Bas) et du signal de poiy-adénylation de la région tardive du virus SV40 (Genbank SV4CG}.
Les conditions d'électrotransfert sont les suivantes : champ électrique 200 V/cm, 8 impulsions de 20 msec, fréquence 1 Hz. Le champ électrique est appliqué 20 secondes après injection. Les prélèvement sanguins sont réalisés 7 jours plus tard au niveau du plexus rétroorbitaire. La concentration en phosphatase alcaline dans le sérum est réalisée est mesurée à l'aide d'un test de chemiluminescence (Phospha-light, Tropix, Bedford, MA 01730). L'injection dans le muscle d'un plasmide non codant (pUCl9), suivie ou non de l'application d'un champ électrique, permet de vérifier l'absence de signal correspondant à l'activité phosphatase alcaline endogène.
Les résultats sont présentés dans le tableau 12.
Plasmide pXL3010Plasmide pUCl9ElectrotransfertElectrotransfert wg !~g - +

0,1 0 0,03 O,OI (n=5)1,23 0,21 (n=10) 0,3 0 0,05 0,02 (n=5)1,92 t 0,33 (n=10) 1 0 0,16 0,04 (n=5)7,58 1,18 (n=10) 0 1,52 0,59 (n=10)262,87 54,97 (n=10) 400 0 15,64 10,77 2203,11 332,34(n=5) (n=5) 0,1 9,9 0,088 0,015 21,39 3,54 (n=10) (n=5) 0,3 9,7 0,90 0,49 {n=5)95,67 16,15 (n=10) 1 9 0,26 0,09 (n=5)201,68 32,38 (n=10) 10 0 0,21 0,05 (n=10)357,84 77,02 {n=10) 5 Tableau 12 : valeurs moyennes ~ SEM de la concentration de phosphatase alcaline (SeAP) circulante dans le sang en ng/ml de sérum.
Lorsque le plasmide pXL3010 est administré par électrotransfection, on constate une augmentation d'un facteur 140 ou 170 de la concentration de SeAP
dans 10 le sang.
L'injection de 400 ~,g de plasmide (injection de 100 ~Zg d'ADN dans le muscle tibial cranial en bilatéral et en deux fois à 30 minutes d'intervalle avant application du champ électrique) permet d'atteindre avec félectrotransfert une concentration sérique de 2200 ng/ml en phosphatase alcaline contre 16 ng/m1 en l'absence d'ëlectrotransfert.

Il faut noter que l'ajout d'un ADN non codant (pUCl9) qui permet de travailler à quantité d'ADN constante (10 p,g d'ADN total par souris) permet encore d'améliorer le niveau d'expression de la phosphatase alcaline pour de faibles quantités de plasmide pXL3010 injectées Llpg).
Une cinétique d'expression de la SeAP a été réalisée. La dose de plasmide administrée est de 15 ~,g par macle en bilatéral, soit 30 ~.g par souris. Les résultats sont présentés dans la figure 9. On observe, dès 7 jours après injection, une augmentation importante et durable (au moins pendant 2 mois) de la concentration de SeAP détectée dans le sang lorsque le plasmide pXL3010 est administré par électrotransfert.
L'ensemble de ces résultats confirme que le transfert d'acides nucléiques dans le muscle avec le procédé selon (invention permet d'obtenir un niveau d'expression élevé
et durable, aussi bien pour des protéines localisées dans le muscle que pour des protéines sécrétées et qu'il est ainsi possible de transformer le muscle en un organe secréteur de polypeptide d' intérêt.
Exemple 19 : transfert d'un gène codant pour I'érythropoiëtine (EPO) Des souris C57B1/6 adultes ont reçu, dans le muscle tibial cranial et de manière unilatérale, une injection de plasmide pXL3348. Le plasmide pXL3348 (Figure 16) est un vecteur dérivé du plasmide pXL2774 dans lequel le gène marin de l'erythropoïetine (NCBI : 193086) a été introduit sous contrôle du promoteur provenant de la région précoce du cytomegalovirus humain (hCMV IE) et du signal de poly-adénylation de la région tardive du virus SV40 (Genbank SV4CG).
Les conditions d'électrotransfert sont les suivantes : intensité champ électrique 200 V/cm, 8 impulsions de 20 msec, fréquence 1 Hz. Le champ électrique est appliqué
immédiatement après injection de l'ADN plasmidique.

Erythropoetine Erythropoetine srique srique (mIU/ml) (m~/~) Plasmide ElectrotransfertElectrotransfertElectrotransfertElectrotransfert _ + _ +

pXL3348 0 3,0 1,6 0 1,12 0,8 (1 ) pXL3348 0,9 0,9 61,8 15,8 0 74,1 28,9 (10 ~g) pUCl9 (1 ) Hmatocrite Hmatocrite % %

Prlvement Prlvement Plasmide ElectrotransferrElectrotransfertElectrotransfertElectrotransfert _ + _ +

pXL3348 38,5 0,5 35,0 3,6 50,8 2,3 81 0,5 1 ~.g) pXL3348 32,0 3,2 26,0 4,1 69,0 5,1 83,0 1,0 ( 10 ~.g) PUC 19 30,8 2,3 43,2 0,9 (1 f~g) 5 Tableau 13 : valeurs moyennes ~ SEM. N = 4 à 5.

On observe, avec félectrotransfert, une très nette augmentation de la quantité
d'érythropoiëtine dans le sang à J7 et J24 pour fadministration de 10 p.g de pXL3348.
De plus, (effet physiologique de (augmentation d'érythropoiëtine qui se traduit par une augmentation de l'hématocrite est très important (85 %), dès J7 et ce, même pour une très faible quantité de plasmide (1 p.g).
Exemple 20 : transfert d'un gène codant pour le facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF) Des souris C57B16 ou SCID adultes ont reçu, dans le muscle tibial cranial et de manière bilatérale, une injection de pCOR hVEGF (pXL3212 , 15 ~.
Le plasmide pXL3212 (Figure 11) est un vecteur dérivé du plasmide pXL2774 (W097/I0343) dans lequel l'ADNc codant pour le VEGF165 (Vascular Endothelial Growth Factor, Genbank: HUMEGFAA) a été introduit sous contrôle du promoteur provenant de la région précocé du cytomegalovirus humain (hCMV IE) et du signal de I5 poly-adénylation de la région tardive du virus SV40 (Genbank SV4CG).
Les conditions d'électrotransfert sont les suivantes : intensité champ électrique 250 V/cm, 8 impulsions de 20 msec., fréquence 2 Hz. Les prélèvements sanguins ont été réalisés au niveau du plexus rétroorbitaire. Les prélèvements ont été
effectués un jour avant, et sept jours après, (injection du plasmide. Le dosage immuno-enzymatique du VEGF humain a été réalisé à l'aide du kit Quantikine (R&D System). Le test a été
étalonné avec du VEGF humain dans du sérum de souris. Les résultats sont présentés dans le tableau 14 Ligne de sourisJour du dosageElectrotransfertVEGF humain (ng/litre) C57BL6 J -1 - non dtectable C57BL6 J +7 + 393 + I10 SCID J -1 - _ non dtectable SCID J +7 + 99 + 26 Tableau 14 : concentration sérique (ng/litre) en VEGF chez des souris C57B16 et SCID.

Exemple 21 : transfert d'un gène codant pour le facteur IX.
Des souris C57BI6 ou SCID adultes ont reçu, dans le muscle tibial cranial et de manière bilatérale, une injection de pXL3388 (15 ~.g).
Le plasmide pXL3388 (Figure 22) est un vecteur dérivé du plasmide pXL2774 (W097/10343) dans lequel l'ADNc codant pour ie facteur IX humain {facteur Christmas), Genbank: HUMFIXA) a été introduit sous contrôle du vromoteur provenant de la région précoce du cytomegalovirus humain (hCMV IE, Genbank HSSIEE) et du signal de poly-adénylation de la région tardive du virus SV40 (Genbank SV4CG).
Les conditions d'électrotransfert sont les suivantes : intensité champ électrique 200 V/cm, 8 impulsions de 20 msec., fréquence 2 Hz. Les prélèvements sanguins ont été réalisés au niveau du plexus rétroorbitaire. Les prélèvements ont été
effectués sept jours après injection du plasmide. Les résultats sont présentés dans ie tableau 15.
Ligne de injection ElectrotransfertFacteur IX hiunain souris {~) C57BL/6 pXL3388 + 69 + 12 C57BL/6 pXL3388 - non dtectable C57BL/6 NaCI 0,9 + non dtectable %

SCID pXL3388 + 66 5 SCID pXL3388 - non dtectable Tableau 15 : concentration plasmatique en facteur IX chez des souris C57B16 et SCID.

Le facteur IX humain n'est détectable dans le sang que lorsque le plasmide a été administré dans les conditions du procédé selon (invention.
Exemple 22 : transfert d'un gène codant pour le facteur de croissance des fibroblastes 1 (FGFI).
Des souris C57BL6 ou SCID adultes ont reçu, dans le muscle tibial cranial et de manière bilatérale, une injection de pCOR FGFl (pXL3096, 15 ~.
Le plasmide pXL3096 (Figure 14} est un vecteur dérivé du plasmide pXL2774 (W097/10343) additionné d'une séquence capable de former une triple hélice (TH, Wils et al., 1997.Gene Ther 4:323-330) dans lequel le gène codant pour une fusion entre le peptide signal de l'interféron de fibroblastes humain et l'ADNc du FGFl (Fibroblast Growth Factorl) (sp-FGFl, Jouanneau et al., 1991 PNAS-88:2893-2897) a êté introduit sous contrôle du promoteur provenant de la région précoce du cytomegalovirus humain (hCMV IE) suivi de la séquence leader (transcrite, non traduite) du gène TK de HSV1 et du signal de poly-adënylation de la région tardive du virus SV40 (Genbank SV4CG).
Les conditions d'électrotransfert sont les suivantes : intensité champ électrique 200 V/cm, 8 impulsions de 20 msec., fréquence 2 Hz. La présence de FGFl est ensuite révélée par immuno-histochimie.
Les résultats pour les souris C57BL6 sont présentés sur la figure 10. On constate que le nombre de fibres positives est très largement supérieur pour le groupe sounùs au champ électrique par rapport au groupe contrôle (ayant reçu une injection de pXL3096 mais non soumis au champ électrique). La présence de FGFl pour le groupe contrôle est quasiment indétectable à J21 et J35 alors qu'un nombre important de fibres positives reste observable pour les groupes traités par électrotransfert.
Les résultats pour les souris SCID sont présentés dans le tableau 16.

ElectrotransfertTibial cranialTibial cranial gauche droit pXL 3096 + 600 450 (lSN,g) + 700 300 pXL 3096 - 3 0 (lSN,g) - 3 0 pXL 3096 + 80 70 (1,5pg) + 20 35 + 110 100 pXL 3096 - 0 0 (1,5~g) - 0 1 Tableau 16 : expression de FGF, étude immunohistochimique et nombre de fibres positives sur une section musculaire prise dans la partie médiane du muscle L'expression de FGFl, telle que déterminée par le nombre de fibres positives révélées par irnmuno-histochimie, est détectée uniquement dans les muscles soumis au champ électrique. Il est à noter que (expression de FGFl est détectée même pour une faible dose de plasmide administré (1,5 N.g).
Exemple 23 : transfert d'un gène codant pour le facteur neurotrophique Le procédé selon (invention a été appliqué sur la souris adulte (C57B16) et le souriceau Xtlpmn pour le transfert du gène codant pour la neurotrophine 3 {NT3). Les souris pmn constituent un modèle marin de la sclérose amyotrophique latérale (SLA) caractérisé par une dégénerescence précoce et rapide des motoneurones et par une durée de vie moyenne de 40 jours environ.

23. 1- transfert du gène codant pour NT3 dans des souris adulte Des souris C57B1/6 âgées de 5 semaines ont reçu, dans le muscle tibial cranial et de manière unilatërale, une injection de plasmide pXL3149 (12,5 ~g) comprenant le 5 gène codant pour la neurotrophine 3 (NT-3) marine.
Le plasmide pXL3149 (Figure 14) est un vecteur dérivé du plasmide pXL2774 (W097/10343) dans lequel le gène codant pour la neurotrophine 3 (NT-3) marine (Genbank MMNT3) a été introduit sous contrôle du promoteur provenant de Ia région précoce du cytomegalovirus humain (hCMV IE) et du signal de poly-adénylation de la 10 région tardive du virus SV40 (Genbank SV4CG).
Les conditions d'électrotransfert sont les suivantes : intensité champ électrique 250 V/cm, 4 impulsions de 20 msec., fréquence 1 Hz. Le champ électrique est appliqué immédiatement après injection de l'ADN plasmidique. La présence de est recherchée dans le surnageant 12000 g des broyats musculaires en tampon PBS, 7 15 jours après le traitement des souris. La quantité de NT3 est mesurée par un dosage ELISA [Kit Promega].
Les valeurs moyennes (~ intervalle de confiance 95 %) sur 20 muscles sont de 77 +/- 11 pg/muscle (ADN plasmidique administré sans électrotransfert) et de +/- 900 pg/muscle (ADN plasmidique administré avec électrotransfert).
20 On observe ainsi une augmentation d'un facteur 55 de la quantité de NT3 produite dans le muscle lorsque Ie plasmide pXL3149 est transféré dans les conditions du procédé selon l'invention.
23. 2- transfert du gène codant pour NT3 dans des souriceaux 25 Une expérience comparable a été réalisée sur des souris Xt pmn hétérozygotes agées de 4 à 5 jours avec le plasmide pXL3149. Les doses injectées sont 130 ~.g par animal et les injections sont réalisées en multisite dans différents muscles de I' animal (gastrocnémien 25 ~g, tibial cranial 12,5 ~g).

Les conditions d'électrotransfert sont les suivantes : intensité champ électrique 500 V/cm, 4 impulsions de 20 msec., fréquence 1 Hz.
La présence de NT3 est recherchée 7 jours après administration du plasmide dans le plasma et dans le muscle (gastrocnémien ou tibial cranial). Un témoin du niveau basal de NT3 est réalisé par administration d'une solution de NaCI 0,9 %. La quantité de NT3 est déterminée par un dosage ELISA [Kit Promega]. Les résultats sont présentés dans le tableau 17.
NaCI 0,9 pXL3149 %

Electrotransf- + - +
ert Plasma 0 0 46 10 1599 639 (n=2) (n=2) (n=4) (n=4) Muscle 3619 102 1619 150 3647 107$ 19'754 3818 gastrocnmien (n=4) (n=2) (n=8) (n=8) Muscle tibial1415 363 1453 375 1400 155 16 826 3135 cranial (n=4) (n=2) (n=8) (n=8) Tableau 17 : valeurs moyennes ~ SEM de la quantité de NT3 (pg par muscle et pg par ml de plasma).
Dans les conditions de l'expérience, on observe un niveau basal du signal de détection de NT3 dans le muscle gastrocnémien et dans le muscle tibial cranial. En l' absence d'électrotransfert, le niveau d' expression du gène NT3 obtenu pour l'injection du plasmide pXL3149 n'est pas supérieur au niveau basal de détection de NT3 dans le muscle. Lorsque le plasmide est administré avec le procédé selon l'invention, on constate que la quantité de NT3 détectëe dans le muscle est très significativement augmentée. On observe également que la quantité de NT3 sécrétée par le muscle et détectée dans le plasma est très nettement augmentée dans ces conditions (facteur augmentation ~ x 35) .
Ces résultats démontrent, que pour une quantité d'ADN donnée, le procédé
selon l'invention permet d'augmenter le façon très significative l'efficacité
du transfert d'ADN et d'obtenir, non seulement dans le muscle mais également dans le plasma, une augmentation importante la quantité d'une neurothrophine telle que NT3.
Exemple 24 : transfert du gène codant pour l'hormone de croissance humaine.
Des souris C57B1/6 ont reçu, dans le muscle tibial cranial et de manière unilatérale, une injection de plasmide pXL3353 (10 pg) ou de plasmide pXL3354 (10 ~g). Le plasmide pXL3353 (figure 15) est un vecteur dérivé du plasmide pXL2774 dans lequel le gène entier de (hormone de croissance humaine (fragment XbaI/SphI
hGH qui s'étend du signal de début de transcription, site BamHl , jusqu'à 224 bp après le site poly A) a été introduit sous contrôle du promoteur provenant de la région précoce du cytomegalovirus humain (hCMV IE) et du signal de poly-adénylation de la région tardive du virus SV40.
Le cDNA du gène de l'hormone de croissance humaine a été obtenu par transcription réverse d'une banque de mRNA poly(A+) de la glande pituitaire humaine suivie de 30 cycles d'amplification PCR avec les oligonucléotides suivants Oligonucléotide complémentaire de la région 5' 5'- GGGTCTAGAGCCACCATGGCTACAGGCTCCCGGAC -3' Cet oligonucléotide contient un site XbaI et la séquence kozak.
Oligonucléotide complémentaire de la région 3':
5'- GGGATGCATl'TACTAGAAGCCACAGCTGCCTC-3' Cet oligonucléotide contient un site NsiI et le codon stop.

Le fragment amplifié a été introduit dans Ie plasmide pCR2.l (TA Cloning kit, Invitrogen) et séquencé. Un fragment XbaI/Nsil de 681 bp contenant le cDNA de hGH a été ligaturé avec le fragment XbaI/Nsil de pXL3353 pour générer le plasmide pXL3354 (figure 15).
Les conditions d'électrotransfert sont Ies suivantes : intensité champ électrique 200 V/cm, 8 impulsions de 20 msec., fréquence 1 Hz. Le champ électrique est appliqué immédiatement après injection de l' ADN plasmidique. La présence de hGH
est recherchée, 7 jours après le traitement des souris, dans le surnageant des broyats musculaires en tampon PBS centrifugés à 12 000 g. La quantité de hGH est mesurée i0 par un dosage ELISA (Boehringer Manheim).
Injection Injection hGH gnomique hGH cDNA

_~XL3353) -__ 0X1..3354) Electrotransfert- + - +

Muscle 87,1 9,3 1477,6 2820,0 15739,1 915,5 67,6 487,5 Tibial Cranial(n=10) (n=10) (n=10) (n=10) Tableaul8 . valeurs moyennes ~ SEM de la protéine hGH
(picogrammes)/muscle Ces résultats montrent que félectrotransfert permet d'obtenir une augmentation très importante (hormone de croissance humaine. Il est à noter que cette amplification est également observée avec le plasmide contenant le gëne entier avec toutes ses séquences de rëgulation.
Exemple 25 : Eiiet de l'électrotransfert sur l'expression de transgènes vaccinaux Cet exemple met en évidence que le procédé selon (invention est également applicable au transfert de gènes codant pour des polypeptides d'intérêt vaccinal.
L'expérience est réalisée chez des souris Balb/c femelles agées de 9 semaines.
Les électrodes utilisées sont des électrodes piates en acier inoxydable distantes de 5 mm. Le VR-HA est un ADN plasmidique comportant le gène de l'hémagglutinine du virus de la grippe (souche A/PR/8/34). Le VR-gB est un ADN plasmidique comportant le gène de la glycoprotéine B (gB) du cytomégalovirus humain (souche Towne) .
La solution de plasmide (50 ~.1 d'une solution à 20 ~g /ml ou 200 p.g /ml dans NaCI 0,9 %) est injectée longitudinalement à travers la peau dans le muscle tibial cranial de manière unilatérale. Les impulsions électriques sont appliquées 20 sec après l' administration du plasmide, perpendiculairement à l' axe du muscle à l' aide d'un générateur d'impulsions carrées ( intensité champ électrique 200 V/cm, 8 impulsions consécutives d'une durée de 20 msec, fréquence 1 Hz).
Pour l'évaluation de la stimulation de la réponse immunitaire, le protocole d'immunisation suivant a été suivi J 0 prélévement du sérum préimmun J 1 primo-injection, plus ou moins électrotransfert J 2 prélèvement du sérum immun J 2 injection de rappel, plus ou moins électrotransfert J 42 prélèvement de sérum immun J 63 prélèvement de sérum immun Les prélèvements sanguins sont effectués au niveau du sinus rétro-orbital. Les dosages des anticorps spécifiques sont réalisés par ELISA. Chaque condition expérimentale est testée sur 10 animaux injectés en unilatéral.
Les résultats concernant les titres en anticorps dirigés contre l'hémagglutinine du virus de la grippe sont présentés dans le tableau 19A.

ElectrotransfertJO J21 J42 J63 VR-HA (1 - < 50 132 t 739 1201 t 1314 t ~g) 4380 2481 VR-HA (1 + < 50 1121 t 10441 t 8121 t ~g) 1237 7819 5619 (P) (O,OI35) (0,0022) (0,0033) VR-HA (10 - < 50 781 t 666 5113 t 4673 t Ng) 16015 8238 VR-HA (10 + < 50 4153 t 74761 t 41765 t ~g) 2344 89228 52361 (p) (0,0002) (0,0005) (0,0007) Tableau 19-a : titres en anticorps dirigés contre l'hémagglutinine du virus de la grippe, obtenus après injection de 1 ou 10 ~.g d'ADN (VR-HA) en absence ou en 5 présence d'impulsions électriques. Les résultats sont ies moyennes géométriques de 10 animaux (8 animaux pour le groupe injecté avec 1 pg d'ADN en présence d'impulsions électriques et prélevés à J63) ~ écart-type. La valeur de p a été
obtenue par comparaison deux à deux des groupes injectés en présence et en absence d'impulsions électriques en utilisant le test non paramétrique de Mann-Whitney.
Ces résultats montrent que les titres en anticorps dirigés contre l'hémagglutinine du virus de la grippe sont augmentés d'un facteur 10 environ dans les groupes soumis aux impulsions électriques. Ainsi les souris ayant reçu 1 p.g d'ADN en présence d'impulsions électriques présentent un titre moyen en anticorps légèrement supérieur à celui des souris ayant reçu 10 ~g d'ADN en absence d'impulsion électrique.
Les résultats concernant les titres en anticorps dirigés contre la glycoprotéine B
du cytomégalovirus humain sont présentés dans le tableau 19B.

ElectrotransfertJ 0 J 21 J 42 J 63 VR-gB (10 - < 50 73 138 755 t 1766 809 t 1363 ~g) VR-gB (10 + < 50 200 t 3057 t 17472112 t ~.g) 119 1330 (p) (0,0558) (0,0108) (0,0479) Tableau 19 B : titres en anticorps dirigés contre la glycoprotéine B (gB) du cytomagalovirus humain obtenus après injection de 10 pg d'ADN (VR-gB) en absence ou en présence d'impulsions électriques. Les résultats sont les moyennes géométriques de 10 animaux (9 animaux pour le groupe injecté en présence d'impulsions électriques) ~ écart-type. La valeur de p a été obtenue par comparaison deux à deux des groupes injectés en présence et en absence d'impulsions électriques en utilisant le test non paramétrique de Mann-Whitney.
Ces résultats montrent que les titres en anticorps dirigés contre la glycoprotéine B du cytomégalovirus humain sont augmentés d'un facteur 4 à J42, dans le groupe soumis aux impulsions électriques. On note également que le coefficient de variation est en moyenne trois fois plus faible dans les groupes d'animaux soumis aux impulsions électriques.

Claims

1) Procédé de transfert d'acide nucléique dans un ou plusieurs muscles striés in vivo dans lequel les cellules du muscle sont mises en contact avec l'acide nucléique à
transférer par administration directe dans le tissu ou par administration topique ou systémique et dans lequel le transfert est assuré par application au dit muscle d'une ou plusieurs impulsions électriques d'une intensité comprise entre 1 et 800 volts/cm.

2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'intensité du champ est comprise entre 4 et 400 volts/cm.

3) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'intensité du champ est comprise entre 30 et 300 volts/cm.

4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la durée totale d'application du champ électrique est supérieure à 10 millisecondes.

5) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'application au muscle du champ électrique comprend une ou plusieurs impulsions de fréquence régulière.

6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'application au muscle du champ électrique comprend entre 1 et 100 000 impulsions de fréquence comprise entre 0,1 et 1000 hertz.

7) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les impulsions électriques sont délivrées de façon irrégulière les unes par rapport aux autres et en ce que la fonction décrivant l'intensité du champ électrique en fonction du temps d'une impulsion est variable.

8) Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'intégrale de la fonction décrivant la variation du champ électrique avec le temps est supérieure à 1 kVxmsec/cm.

9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que cette intégrale est supérieure ou égale à 5 kVxmsec/cm.

10) Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les impulsions électriques sont choisies parmi les impulsions à ondes carrées, les champs électriques générant des ondes à décroissance exponentielle, des ondes unipolaires oscillantes de durée limitée, des ondes bipolaires oscillantes de durée limitée, ou d'autres formes d'ondes.

11) Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les impulsions électriques comprennent des impulsions à ondes carrées.

12) Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que les impulsions électriques sont appliquées avec des électrodes placées de part et d'autre du muscle ou placées au contact de la peau.

13) Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que les impulsions électriques sont appliquées avec des électrodes introduites à
l'intérieur du muscle.

14) Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que l'acide nucléique est injecté dans le muscle.

15) Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que l'acide nucléique est injecté par voie systémique.

16) Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'acide nucléique est injecté par voie intra-artérielle ou intra-veineuse.

17) Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que l'acide nucléique est administré par voie topique, cutanée, orale, vaginale, intranasale, sous cutanée ou intra-oculaire.

18) Procédé selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que l'acide nucléique est présent dans une composition contenant, en outre, des excipients pharmaceutiquement acceptables pour les différents modes d'administration.

19) Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que la composition est adaptée à l'administration parentérale.

20) Procédé selon l'une des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que l'acide nucléique est un acide désoxyribonucléique.

21) Procédé selon l'une des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que l'acide nucléique est un acide ribonucléique.

22) Procédé selon l'une des revendications 1 à 21, caractérisé en ce que l'acide nucléique est d'origine synthétique ou biosynthétique, ou extrait d'un virus ou d'un organisme procaryote ou eucaryote unicellulaire ou pluricellulaire.

23) Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'acide nucléique administré est associé à tout ou partie des composants de l'organisme d'origine et/ou du système de synthèse.

24) Procédé selon l'une des revendications 1 à 23, caractérisé en ce que l'acide nucléique code pour un ARN ou une protéine d'intérêt.

25) Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que l'ARN est un ARN
catalytique ou antisens.

26) Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que l'acide nucléique code pour une protéine choisie parmi les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines, les facteurs de croissance, les facteurs trophiques, les facteurs angiogéniques, les facteurs neurotrophiques, les facteurs de croissance osseuse, les facteurs hématopoïétiques, les facteurs de coagulation, les antigènes et les protéines impliquées dans le métabolisme des acides aminés, des lipides et des autres constituants essentiels de la cellule.

27) Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que l'acide nucléique code pour les facteurs angiogéniques VEGF et FGF, les facteurs neurotrophiques BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, FGF1, NT3, NT5, la protéine Gax, l'insuline pour le traitement du diabète, l'hormone de croissance, une cytokine, l'.alpha.-1-antitrypsine, la calcitonine, la leptine et les apolipoprotéines, les enzymes de biosynthèse des vitamines, des hormones et des neuromédiateurs.

28) Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que l'acide nucléique code pour un anticorps, un fragment variable d'anticorps simple chaîne (ScFv) ou tout autre fragment d'anticorps possédant des capacités de reconnaissance dans un but d'immunothérapie, ou code pour un récepteur soluble, pour un peptide agoniste ou antagoniste d'un récepteur ou d'une protéine d'adhésion, pour une protéine artificielle, chimérique ou tronquée.

29) Procédé selon la revendications 28, caractérisé en ce que l'acide nucléique code pour un anticorps antiidiotype, un fragment soluble du récepteur CD4 ou du récepteur du TNFa ou du récepteur de l'acétylcholine.

30) Procédé selon l'une des revendications 26 à 29, caractérisé en ce que l'acide nucléique code pour un précurseur d'une protéine thérapeutique.

31) Procédé selon l'une des revendications 1 à 30, caractérisé en ce que l'acide nucléique est sous forme d'un plasmide.

32) Procédé selon l'une des revendications 1 à 30, caractérisé en ce que l'acide nucléique contient un gène de grande taille et/ou des introns et/ou des éléments régulateurs de petite ou de grande taille.

33) Procédé selon l'une des revendications 1 à 30, caractérisé en ce que l'acide nucléique est un ADN épisomal ou un chromosome artificiel de levure ou un minichromosome.

34) Procédé selon l'une des revendications 1 à 33, caractérisé en ce que l'acide nucléique contient des séquences permettant et/ou favorisant l'expression du transgène dans le muscle.

35) Procédé selon l'une des revendications 1 à 34, caractérisé en ce que l'acide est associé à tout type de vecteurs ou à toute combinaison de vecteurs permettant d'améliorer le transfert d'acide nucléique tels que des virus, des agents synthétiques ou biosynthétiques, ou encore des billes propulsées ou non.

36) Procédé selon l'une des revendications 1 à 35, caractérisé en ce que le muscle est soumis à un traitement visant à améliorer le transfert de gène, un traitement de nature pharmacologique en application locale ou systémique, ou un traitement enzymatique, perméabilisant, chirurgical, mécanique, thermique ou physique.

37) Procédé selon l'une des revendications 1 à 36, caractérisé en ce qu'il permet de faire produire par le muscle un agent à des doses physiologiques et/ou thérapeutiques, soit dans les cellules musculaires, soit sécrété.

38) Procédé selon l'une des revendications 1 à 37, caractérisé en ce qu'il permet de moduler la quantité de transgène exprimé en modulant le volume de tissu musculaire transfecté.

39) Procédé selon la revendication 38, caractérisé en ce qu'il permet de moduler le volume de tissu musculaire transfecté par l'utilisation de sites multiples d'administration.

40) Procédé selon l'une des revendications 1 à 39, caractérisé en ce qu'il permet de moduler la quantité de transgène exprimé en modulant le nombre, la forme, la surface et la disposition des électrodes, et en variant l'intensité, le nombre, la durée, la fréquence et la forme des impulsions, ainsi que la quantité et le volume d'administration de l'acide nucléique.

41) Procédé selon l'une des revendications 1 à 40, caractérisé en ce qu'il permet de contrôler la localisation des tissus transfectés par le volume de tissu soumis aux impulsions électriques locales.

42) Procédé selon l'une des revendications 1 à 41, caractérisé en ce qu'il permet un retour à la situation initiale par l'ablation de la zone de tissu transfectée.

43) Acide nucléique et champ électrique d'une intensité comprise entre 1 et Volts/cm, comme produit de combinaison pour leur administration séparée ou étalée dans le temps in vivo au muscle strié et pour la thérapie génique reposant sur l'électrotransfection in vivo dans le muscle strié, après administration de l'acide nucléique.

44) Produit de combinaison selon la revendication 43, caractérisé en ce que l'intensité du champ est comprise entre 4 et 400 volts/cm.

45) Produit de combinaison selon la revendication 43, caractérisé en ce que l'intensité du champ est comprise entre 30 et 300 volts/cm.

46) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 45, caractérisé
en ce que la durée totale d'application du champ électrique est supérieure à 10 millisecondes.

47) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 46, caractérisé
en ce que l'application au muscle du champ électrique comprend une ou plusieurs impulsions de fréquence régulière.

48) Produit de combinaison selon la revendication 47, caractérisé en ce que l'application au muscle du champ électrique comprend entre 1 et 100 000 impulsions de fréquence comprise entre 0,1 et 1000 hertz.

49) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 46, caractérisé
en ce que les impulsions électriques sont délivrées de façon irrégulière les unes par rapport aux autres et en ce que la fonction décrivant l'intensité du champ électrique en fonction du temps d'une impulsion est variable.

50) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 49, caractérisé
en ce que l'intégrale de la fonction décrivant la variation du champ électrique avec le temps est supérieure à 1 kVxmsec/cm.

51) Produit de combinaison selon la revendication 50, caractérisé en ce que cette intégrale est supérieure ou égale à 5 kVxmsec/cm.

52) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 51, caractérisé
en ce que les impulsions électriques sont choisies parmi les impulsions à ondes carrées, les champs électriques générant des ondes à décroissance exponentielle, des ondes unipolaires oscillantes de durée limitée, des ondes bipolaires oscillantes de durée limitée, ou d'autres formes d'ondes.

53) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 52, caractérisé
en ce que les impulsions électriques comprennent des impulsions à ondes carrées.

54) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 53, caractérisé
en ce que les impulsions électriques sont appliquées avec électrodes placées de part et d'autre du muscle ou placées au contact de la peau.

55) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 53, caractérisé
en ce que les impulsions électriques sont appliquées avec des électrodes introduites à l'intérieur du muscle.

56) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 55, caractérisé
en ce que l'acide nucléique est injecté dans le muscle.

57) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 55, caractérisé
en ce que l'acide nucléique est injecté par voie systémique.

58) Produit de combinaison selon la revendication 57, caractérisé en ce que l'acide nucléique est injecté par voie intra-artérielle ou intra-veineuse.

59) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 55, caractérisé
en ce que l'acide nucléique est administré par voie topique, cutanée, orale, vaginale, intranasale, sous cutanée ou intra-oculaire.

60) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 59, caractérisé
en ce que l'acide nucléique est présent dans une composition contenant, en outre, des excipients pharmaceutiquement acceptables pour les différents modes d'administration.

61) Produit de combinaison selon la revendication 60, caractérisé en ce que la composition est adaptée à l'administration parentérale.

62) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 61, caractérisé
en ce que l'acide nucléique est un acide désoxyribonucléique.

63) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 61, caractérisé
en ce que l'acide nucléique est un acide ribonucléique.

64) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 63, caractérisé
en ce que l'acide nucléique est d'origine synthétique ou biosynthétique, ou extrait d'un virus ou d'un organisme procaryote ou eucaryote unicellulaire ou pluricellulaire.

65) Produit de combinaison selon la revendication 64, caractérisé en ce que l'acide nucléique administré est associé à tout ou partie des composants de l'organisme d'origine et/ou du système de synthèse.

66) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 65, caractérisé
en ce que l'acide nucléique code pour un ARN ou une protéine d'intérêt.

67) Produit de combinaison selon la revendication 66, caractérisé en ce que l'ARN
est un ARN catalytique ou antisens.

68) Produit de combinaison selon la revendication 66, caractérisé en ce que l'acide nucléique code pour une protéine choisie parmi les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines, les cytokines, les facteurs de croissance, les facteurs trophiques, les facteurs angiogéniques, les facteurs neurotrophiques, les facteurs de croissance osseuse, les facteurs hématopoïétiques, les facteurs de coagulation, les antigènes et les protéines impliquées dans le métabolisme des acides aminés, des lipides et des autres constituants essentiels de la cellule.

69) Produit de combinaison selon la revendication 68, caractérisé en ce que l'acide nucléique code pour les facteurs angiogéniques VEGF et FGF, les facteurs neurotrophiques BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, FGF1, NT3, NT5, la protéine Gax, l'insuline pour le traitement du diabète, l'hormone de croissance, l'.alpha.-1-antitrypsine, la calcitonine, la leptine et les apolipoprotéines, les enzymes de biosynthèse des vitamines, des hormones et des neuromédiateurs.

70) Produit de combinaison selon la revendication 66, caractérisé en ce que l'acide nucléique code pour un anticorps, un fragment variable d'anticorps simple chaîne (ScFv) ou tout autre fragment d'anticorps possédant des capacités de reconnaissance dans un but d'immunothérapie, ou code pour un récepteur soluble, pour un peptide agoniste ou antagoniste d'un récepteur ou d'une protéine d'adhésion, pour une protéine artificielle, chimérique ou tronquée.

71) Produit de combinaison selon la revendications 70, caractérisé en ce que l'acide nucléique code pour un anticorps antiidiotype, un fragment soluble du récepteur CD4 ou du récepteur du TNFa ou du récepteur de l'acétylcholine.

72) Produit de combinaison selon l'une des revendications 68 à 71, caractérisé
en ce que l'acide nucléique code pour un précurseur d'une protéine thérapeutique.

73) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 72, caractérisé
en ce que l'acide nucléique est sous forme d'un plasmide.

74) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 72, caractérisé
en ce que l'acide nucléique contient un gène de grande taille et/ou des introns et/ou des éléments régulateurs de petite ou de grande taille.

75) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 72, caractérisé
en ce que l'acide nucléique est un ADN épisomal ou un chromosome artificiel de levure ou bactérien ou un minichromosome.

76) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 75, caractérisé
en ce que l'acide nucléique contient des séquences permettant et/ou favorisant l'expression du transgène dans le muscle.

77) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 76, caractérisé
en ce que l'acide est associé à tout type de vecteurs ou à toute combinaison de vecteurs permettant d'améliorer le transfert d'acide nucléique tels que des virus, des agents synthétiques ou biosynthétiques, ou encore des billes propulsées ou non.

78) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 77, caractérisé
en ce que le muscle est soumis à un traitement visant à améliorer le transfert de gène, un traitement de nature pharmacologique en application locale ou systémique, ou un traitement enzymatique, perméabilisant, chirurgical, mécanique, thermique ou physique.

79) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 78, caractérisé
en ce qu'il permet de faire produire par le muscle un agent à des doses physiologiques et/ou thérapeutiques, soit dans les cellules musculaires, soit sécrété.

80) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 78, caractérisé
en ce qu'il permet de moduler la quantité de transgène exprimé en modulant le volume de tissu musculaire transfecté.

81) Produit de combinaison selon la revendication 80, caractérisé en ce qu'il permet de moduler le volume de tissu musculaire transfecté par l'utilisation de sites multiples d'administration.

82) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 81, caractérisé
en ce qu'il permet de moduler la quantité de transgène exprimé en modulant le nombre, la forme, la surface et la disposition des électrodes, et en variant l'intensité de champ, le nombre, la durée, la fréquence et la forme des impulsions, ainsi que la quantité et le volume d'administration de l'acide nucléique.

83) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 82, caractérisé
en ce qu'il permet de contrôler la localisation des tissus transfectés par le volume de tissu soumis aux impulsions électriques locales.

84) Produit de combinaison selon l'une des revendications 43 à 83, caractérisé
en ce qu'il permet un retour à la situation initiale par l'ablation de la zone de tissu transfectée.

85) Utilisation d'acide nucléique pour la fabrication d'un médicament pour le traitement par thérapie gènique par mise en contact des cellules d'un ou plusieurs muscles striés avec l'acide nucléique à transférer in vivo puis application au dit muscle d'une ou plusieurs impulsions électriques d'une intensité comprise entre 1 et 800 volts/cm.

86) Utilisation selon la revendication 85 caractérisée en ce que la mise en contact est effectuée par administration directe dans le tissu ou par administration topique ou systémique.

87) Utilisation selon l'une des revendications 85 et 86 caractérisée en ce que les ondes sont unipolaires.

88) Utilisation selon l'une des revendications 85 à 87 caractérisée en ce que l'intensité du champ est comprise entre 4 et 400 volts/cm.

89) Utilisation selon l'une des revendications 85 à 88, caractérisée en ce que l'intensité du champ est comprise entre 30 et 300 volts/cm.

90) Utilisation selon l'une des revendications 85 à 89 caractérisée en ce que la durée totale d'application du champ électrique est supérieure à 10 millisecondes.