CA2335734C

CA2335734C - Method for determining antibiotics with .beta.-lactam core in a biological liquid

Info

Publication number: CA2335734C
Application number: CA002335734A
Authority: CA
Inventors: Jacques Degelaen; Benoit Granier; Jean-Marie Frere; Bernard Joris
Original assignee: UCB SA
Current assignee: Neogen Corp
Priority date: 1998-06-25
Filing date: 1999-03-30
Publication date: 2005-10-04
Anticipated expiration: 2019-03-30
Also published as: DK1082451T3; CZ20004790A3; CN1311857A; KR20010034916A; ATE331808T1; JP2002518062A; AU3703299A; EP1082451A2; US20020164639A1; TR200003833T2; BE1012049A6; NO20006574L; DE69932161D1; NO20006574D0; BR9911500B1; CA2335734A1; PT1082451E; EP1082451B1; US8106155B2; KR100577700B1

Abstract

The invention concerns a method for detecting antibiotics with beta -lactam core in a biological fluid comprising the following steps: a) contacting a specific volume of said biological fluid with an amount of identifying agent and incubating the resulting mixture in conditions for forming a complex of the antibiotics possibly present in said biological fluid with the identifying agent; b) contacting the mixture resulting from step a) with at least a reference antibiotic immobilised on a support, in conditions for forming a complex of the reference antibiotic with the amount of identifying agent which has not reacted in step a); and c) determining the amount of identifying agent fixed on the support. The invention is characterised in that the identifying agent comprises a receptor sensitive to antibiotics with beta -lactam core obtained from Bacillus licheniformis.

Description

Procédé pour la détermination d'antibiotiques à noyau (i-lactame dans un liquide biologique.
La présente invention se rapporte à de nouveaux procédés rapides et sensibles pour la détermination d'antibiotiques à noyau (3-lactame dans un liquide biologique utilisant un récepteur sensible aux antibiotiques à noyau (3-lactame de Bacillus licheniformis. Elle se rapporte également â des kits pour la mise en oeuvre de ces procédés.
A heure actuelle, les antibiotiques sont très largement utilisés non seulement comme agents thérapeutiques dans le traitement des maladies infectieuses provoquées par les bactéries, mais également comme agents de conservation des aliments et comme additifs dans la nourriture des animaux pour stimuler la croissance. La nécessité se fait donc de plus en plus sentir de pouvoir détecter la présence d'antibiotiques, méme en très faibles concentrations, dans des liquides biologiques complexes, comme le lait, l'urine, le sang, le sérum, la salive, les extraits de viande, les liquides de fermentation, ou dans des milieux aqueux tamponnés.
Le cas de la production de lait en est un exemple. Il est bien connu en effet d'utiliser des antibiotiques pour traiter certaines maladies infectieuses du bétail producteur de lait.
Or, pour des raisons médicales évidentes, le lait destiné à la consommation humaine doit, en principe, étre exempt de toute trace d'antibiotiques. Par ailleurs, des concentrations en pénicilline de 0,005 U.L/ml ou moins peuvent avoir des incidences néfastes lors de la fabrication de produits dérivés du lait comme le fromage, le yaourt, etc.
Plusieurs situations peuvent ètre envisagées. Dans un premier cas, par exemple pour détecter la présence d'antibiotiques à la ferme avant de transvaser dans un camion, Ia priorité sera donnée à un test extrérnement rapide (inférieur à 5 minutes) et simple. On peut également envisager d'utiliser un tel test rapide lorsque par exemple l'antibiotique qui a été utilisé pour le traitement est connu et que par ailleurs ce test permet la détection de l'antibiotique en question à la norme légale.
Dans le deuxième cas, lorsque l'accent n'est pas mis sur la rapidité, l'importance est de détecter la majorité, si pas tous les antibiotiques aux normes légales.
La législation de certains pays impose en effet des normes de qualité bien précises. Par exemple, les autorités américaines exigent que les concentrations dans le lait des six antibiotiques suivants ne dépassent pas des valeurs bien précises pénicilline, 5 ppb; ampicilline, 10 ppb; amoxicilline, 10 ppb; cloxacilline, 10 ppb;
céphapirine, 20 ppb; ceftiofur, 50 ppb. L'Union Européenne impose, elle aussi, des COPIE DE CONFIRMATION Process for the determination of β-lactam ring antibiotics in a liquid organic.
The present invention relates to new rapid processes and sensitive for the determination of 3-lactam ring antibiotics in a liquid using a receptor sensitive to core antibiotics (3-lactam Bacillus licheniformis. It also refers to kits for the implementation of artwork of these methods.
At present, antibiotics are widely used only as therapeutic agents in the treatment of diseases infectious diseases caused by bacteria, but also as agents of food preservation and as additives in animal feed for stimulate growth. The need is therefore increasingly felt power detect the presence of antibiotics, even in very low concentrations, in complex biological fluids, such as milk, urine, blood, serum, saliva, meat extracts, fermentation liquids, or in media aqueous buffered.
The case of milk production is one example. It is well known indeed to use antibiotics to treat certain infectious diseases of the livestock milk producer.
However, for obvious medical reasons, milk intended for consumption in principle should be free from all traces of antibiotics. By elsewhere, Penicillin concentrations of 0.005 UL / mL or less may have adverse effects in the manufacture of milk-derived products such as the cheese, yoghurt, etc.
Several situations can be envisaged. In the first case, by example to detect the presence of antibiotics on the farm before decant in a truck, priority will be given to an extremely fast test (less than 5 minutes) and simple. One can also consider using such a quick test when for example the antibiotic that was used for the treatment is known and by elsewhere this test allows the detection of the antibiotic in question to the standard legal.
In the second case, when the emphasis is not on speed, the importance is to detect the majority, if not all antibiotics to legal standards.
The legislation of some countries imposes indeed good quality standards accurate. For example, US authorities require that concentrations in the milk of the following six antibiotics do not exceed values well accurate penicillin, 5 ppb; ampicillin, 10 ppb; amoxicillin, 10 ppb; cloxacillin, 10 ppb;
cephapirin, 20 ppb; ceftiofur, 50 ppb. The European Union imposes, too, of the CONFIRMATION COPY

2 normes de qualité: pénicilline 4 ppb; amoxicilline 4 ppb; ampicilline 4 ppb;
cloxacilline 30 ppb; dicloxacilline 30 ppb; oxacilline 30 ppb; céphapirine 10 ppb;
ceftiofur 100 ppb: cefquinone 20 ppb; nafcilline 30 ppb; céfazoline 50 ppb.
Il pourrait donc étre intéressant de disposer d'un test qui permettrait de détecter la majorité des antibiotiques. Par ailleurs, au niveau de l'industrie laitière, on peut considérer qu'à défaut d'avoir un test présentant toutes les caractéristiques de rapidité, de sensibilité et de simplicité, un test qui permettrait d'allier au mieux ces trois paramëtres, méme s'ils ne sont pas totalement couverts, serait intéressant.
Différents types de tests ont déjà été proposés pour la détection d'antibiotiques à noyau [3-lactame dans un liquide biologique. Ces tests utilisent généralement des méthodes de détection faisant appel à un agent de reconnaissance (récepteur ou anticorps) qui reconnait spécifiquement l'antibiotique ou un analogue de cet antibiotique, et à un agent de marquage (radioélément, enzyme, agent fluorescent, etc.). En fonction des éléments choisis, on parlera de I5 radio immuno essai (RIA), de radio récepteur essai (RRA), d'enzyme immuno essai (EIA) etc. Dans leur principe général, ces tests font appel à la combinaison minimale des deux éléments précités qui permettra d'obtenir un résultat dont la valeur est une indication de la quantité d'antibiotique présent.
Il convient de remarquer qu'en fonction de la méthode de détection choisie, l'agent de marquage peut être couplé soit à l'agent de reconnaissance soit à
l'antibiotique ou à une substance analogue de l'antibiotique du point de vue de sa reconnaissance par l'agent de reconnaissance. II existe également des procédés dans lesquels l'agent de reconnaissance ou l'antibiotique ou la substance analogue de l'antibiotique contient intrinsèquement l'agent de marquage (par exemple un antibiotique marqué radioactivement).
Le brevet US 4.239.852 décrit un procédé microbiologique pour la détection d'antibiotiques à noyau (3-lactame dans le lait. Selon ce procédé, (échantillon de lait est incubé, d'une part, en présence de parties de cellules d'un micro-organisme très sensible aux antibiotiques, en particulier Bacillus stearothermonhilus, et, d'autre part, en présence d'un antibiotique marqué par un élément radioactif ou par une enzyme. L'incubation est menée dans des conditions permettant aux antibiotiques éventuellement présents dans l'échantillon et à l'antibiotique marqué
de se lier aux parties de cellules.
Après incubation, les parties de cellules sont séparées du mélange, puis lavées. Ensuite, la quantité d'antibiotique marqué lié aux parties de cellules est déterminée et comparée à un standard. La quantité d'antibiotique marqué lié
aux parties de cellules est inversement proportionnelle à la concentration d'antibiotique présent dans l'échantillon de lait analysé. 2 quality standards: penicillin 4 ppb; amoxicillin 4 ppb; ampicillin 4 ppb;
cloxacillin 30 ppb; dicloxacillin 30 ppb; oxacillin 30 ppb; Cephapirin 10 ppb;
ceftiofur 100 ppb: cefquinone 20 ppb; nafcillin 30 ppb; Cefazolin 50 ppb.
It might therefore be interesting to have a test that would allow detect the majority of antibiotics. In addition, at the industry level dairy, it can be considered that without having a test presenting all the characteristics speed, sensitivity and simplicity, a test that would combine the best these three parameters, even if they are not fully covered, would interesting.
Different types of tests have already been proposed for detection of [3-lactam nucleus antibiotics in a biological fluid. These tests use generally detection methods using a recognition (receptor or antibody) that specifically recognizes antibiotic or an analogue of this antibiotic, and a labeling agent (radioelement, enzyme, fluorescent agent, etc.). Depending on the chosen elements, we will speak of I5 radio immunoassay (RIA), radio receptor assay (RRA), immunoassay trial (EIA) etc. As a general principle, these tests use the combination minimum of the two elements mentioned above which will make it possible to obtain a result the value is an indication of the amount of antibiotic present.
It should be noted that depending on the chosen detection method, the marking agent can be coupled either to the recognition agent or to the antibiotic or a substance analogous to the antibiotic from the point of view of his recognition by the recognition officer. There are also processes in which the recognition agent or the antibiotic or the substance similar of the antibiotic intrinsically contains the labeling agent (for example a radioactively labeled antibiotic).
U.S. Patent 4,239,852 discloses a microbiological method for detection of 3-lactam ring antibiotics in the milk.
(sample of milk is incubated, on the one hand, in the presence of parts of cells of a micro-organization very sensitive to antibiotics, especially Bacillus stearothermonhilus, and, on the other hand, in the presence of an antibiotic marked by a radioactive element or by an enzyme. Incubation is conducted under conditions that allow antibiotics possibly present in the sample and the antibiotic Mark to bind to the cell parts.
After incubation, the cell parts are separated from the mixture and then washed. Then, the amount of labeled antibiotic bound to the cell parts is determined and compared to a standard. The amount of bound labeled antibiotic to the cell parts is inversely proportional to the concentration antibiotic present in the milk sample analyzed.

3 Ce procédé requiert des manipulations relativement délicates, notamment lors de la séparation des parties de cellules du mélange. En outre, dans sa version la plus sensible, permettant de détecter la pénicilline G jusqu'à 0,01 U.L/ml, voire méme 0,001 U.L/ml de lait, ce procédé utilise un antibiotique marqué par un élément radioactif (14C ou 125I). Dans ce cas, la détermination de la quantité
d'antibiotique éventuellement présent dans le lait nécessite d'avoir recours à
un appareil spécial, comme par exemple un compteur à scintillation. De plus, la manipulation de produits radioactifs, même en très faibles quantités n'est pas totalement exempte de danger pour la personne qui effectue (analyse.
La demande de brevet européen 593.112 décrit une autre méthode permettant la détection d'antibiotiques dans le lait. Cette méthode utilise une protéine isolée à partir d'un microorganisme sensible aux antibiotiques, tel que Bacillus stearothermophilus. Cette protéine est en outre marquée par une enzyme telle qu'une peroxydase.
Le test procède de la manière suivante: un échantillon de lait est incubé
dans un tube en présence de la protéine marquée; après incubation, le lait est transféré dans un second tube sur les parois duquel un antibiotique de référence a été immobilisé; on procëde à une seconde incubation, puis le contenu du tube est éliminé; les parois de ce second tube sont lavées trois fois au moyen d'une solution de lavage, qui est elle-méme éliminée, puis les résidus présents dans le second tube sont transférés sur un papier absorbant; on ajoute alors un substrat colorant dans le second tube qui est incubé une nouvelle fois, puis on ajoute une solution arrétant le développement de la couleur; la coloration du tube est comparée à
la coloration d'un test identique effectué parallèlement sur un échantillon standard d'antibiotique. La quantité de protéine marquée immobilisée sur le support, et donc, l'intensité de la coloration, est inversement proportionnelle à la quantité
d'antibiotique présent dans l'échantillon de lait analysé.
Selon l'exemple 1 de cette demande de brevet, ce test permet de détecter la pénicilline G jusqu'à des concentrations de l'ordre de 5 ppb et permet la détection de l'amoxicilline {5 ppb), de l'ampicilline ( 10 ppb), de la cephapirine (5 ppb) et du ceftiofur (5 ppb). Ce test ne permet pas de détecter la pénicilline, l'amoxicilline et l'ampicilline aux normes fixées par les réglementations européennes et, par ailleurs, ' ce test est extrémement complexe; il ne répond pas entièrement aux critères de sensibilité et de simplicité recherchés dans le contexte de la présente invention.
On connait également d'autres types de procédés enzymatiques permettant de déterminer de faibles concentrations d'antibiotiques dans le lait (J.M.
FRERE et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18(4), 506-510 { 1980) ainsi que les brevets EP 85.667 et EP 468.946) qui sont basés sur l'utilisation d'une enzyme 3 This process requires relatively delicate manipulations, in particular when separating the cell parts of the mixture. In addition, version most sensitive, to detect Penicillin G up to 0.01 UL / ml, indeed same as 0.001 UL / ml milk, this method uses an antibiotic labeled with a radioactive element (14C or 125I). In this case, the determination of the quantity antibiotic possibly present in the milk requires the use of a special apparatus, such as a scintillation counter. In addition, the manipulation of radioactive products even in very small quantities is not completely free from danger to the person performing (analysis.
European Patent Application 593,122 describes another method allowing the detection of antibiotics in the milk. This method uses a protein isolated from an antibiotic-sensitive microorganism, such than Bacillus stearothermophilus. This protein is further marked by a enzyme such as peroxidase.
The test proceeds as follows: a sample of milk is incubated in a tube in the presence of the labeled protein; after incubation, the milk is transferred to a second tube on the walls of which an antibiotic reference to been immobilized; a second incubation is carried out, then the contents of the tube is removed; the walls of this second tube are washed three times by means of a solution washing, which is itself eliminated, then the residues present in the second tube are transferred on an absorbent paper; then add a coloring substrate in the second tube that is incubated again and then we add a solution stopping the development of color; the coloring of the tube is compared to the staining of an identical test performed in parallel on a sample standard of antibiotic. The amount of labeled protein immobilized on the support, and therefore, the intensity of the coloration is inversely proportional to the quantity antibiotic present in the milk sample analyzed.
According to example 1 of this patent application, this test makes it possible to detect the penicillin G to concentrations of the order of 5 ppb and allows the detection amoxicillin (5 ppb), ampicillin (10 ppb), cephapirin (5 ppb) and ceftiofur (5 ppb). This test does not detect penicillin, amoxicillin and ampicillin to the standards laid down by European regulations and, elsewhere, ' this test is extremely complex; it does not fully meet the criteria for sensitivity and simplicity sought in the context of this invention.
Other types of enzymatic processes are known that allow to determine low concentrations of antibiotics in milk (JM
Brother and al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18 (4), 506-510 (1980) and the EP 85,667 and EP 468,946) which are based on the use of an enzyme

4 spécifique, en l'occurrence, la D-alanyl-D-alanine-carboxypeptidase exocellulaire soiuble, qui est produite par Actinomadura R39 (ci-après désignée "enzyme R39"). .
L'enzyme R39 possède une activité spécifique d~ydrolyse des groupements D-alanyl-D-alanine de divers peptides et est également capable d'hydrolyser des thioesters particuliers.
En outre, l'enzyme R39 réagit avec les antibiotiques à noyau p-lactame pour former très rapidement un complexe énzyme-antibiotique équimolaire, inactif et sensiblement irréversible.
Dans la version la plus récente de ce test (EP 468.946), un volume déterminé d'un échantillon du liquide à examiner est incubé avec une quantité
prédéterminée de l'enzyme R39 dans des conditions permettant à l'antibiotique ~-lactame éventuellement présent dans l'échantillon de réagir avec l'enzyme pour former un complexe enzyme-antibiotique équimolaire, inactif et sensiblement irréversible.
Ensuite, une quantité déterminée de substrat de type thioester est incubée avec le produit obtenu au premier stade dans des conditions permettant l'hydrolyse du substrat par l'enzyme R39 résiduelle qui n'a pas été complexée avec l'antibiotique lors de la première incubation. La quantité d'acide mercaptoalcanoïque ainsi formée est alors déterminée par dosage colorimétrique à
l'aide d'un réactif capable de produire une coloration par réaction avec le groupe SH
libre de l'acide mercaptoalcanoïque. L'intensité de la coloration est comparée à un étalon, préalablement établi à partir d'échantillons contenant des quantités connues d'antibiotiques. La détermination quantitative peut se faire par mesure au spectrophotomètre; dans le cas du lait, la clarification préalable de l'échantillon peut s'avérer nécessaire.
Selon les exemples de réalisation du brevet EP 468946, ce procédé permet de déterminer, dans le lait, 10 ppb de pénicilline G pour un temps total d'incubation de 5 minutes et de l'ordre de 2,5 ppb de pénicilline G pour un temps total d'incubation de 1 S minutes.
Etant donné les critères de rapidité, de simplicité et de sensibilité exigés des méthodes de détection d'antibiotiques dans les produits alimentaires, la demanderesse s'est fixé comme objectif de rechercher de nouvelles méthodes encore plus performantes permettant la détection d'antibiotiques dans un liquide biologique. En particulier, la demanderesse s'est fixé comme objectif de rechercher des méthodes permettant de détecter en un seul test la majorité des antibiotiques dont la teneur est réglementée par les autorités européennes et américaines.
De plus, les méthodes recherchées doivent permettre d'obtenir ce résultat en un nombre limité d'étapes, de préférence exécutables par du personnel non qualifié.

La demanderesse a également recherché des méthodes permettant d'atteindre ces objectifs avec un temps d'incubation réduit par rapport aux procédés existants.
La demanderesse vient de découvrir de nouveaux procédés pour la détection d'antibiotiques à noyau ~i-lactame dans un liquide biologique qui permettent d'atteindre de manière remarquable ces objectifs.
C'est pourquoi la présente invention se rapporte à un procédé pour la détection d°un antibiotique ou d'antibiotiques à noyau (i-lactame dans un liquide biologique comprenant les étapes suivantes:
(a) la mise en contact d°un volume déterminé dudit liquide biologique avec une quantité d'agent de reconnaïssance et l'incubation du mélange ainsi obtenu dans des conditions permettant la complexation de l'antibiotique ou des antibiotiques éventuellement présents dans ledit liquide biologique avec I'agent de reconnaissance, (b) la mise en contact du mélange obtenu à l'étape a) avec au moins un antibiotique de référence immobilisé sur un support, dans des conditions permettant la complexation de l'antibiotique de référence avec la quantité
d'agent de reconnaissance qui n°a pas réagi à l'étape a) avec l'antibiotique ou les antibiotiques présents dans le liquide biologique, et (c) la détection de l'antibiotique ou des antibiotiques en déterminant la quantité d'agent de reconnaissance liée à l'antibiotique de référence immobilisé
sur le support dans l'étape b), caractérisé en ce que l'agent de reconnaissance comprend un récepteur sensible aux antibiotiques à noyau ~i-iactame obtenu à partir de Bacillus licheniformis, ledit récepteur étant le récepteur BIaR ou le récepteur BIaR-CTD;
caractérisé en ce que la quantité d'agent de reconnaissance mise en contact avec l'antibiotique de référence à l'étape b) est inversement proportionnelle à la quantité d'antibiotiques éventuellement présents dans ledit Liquide biologique; et caractérisé en ce que l'antibiotique ou les antibiotiques sont détectés en 5 minutes ou moins.
_. .zw .. ,_ . ..u ..z. ,.:-.-h... ..,.,.,..v , ,.,xr,SaM ". . .., .~ .;,;,..4 ~.~na. zo--'art. .. w H W......
Sns.~3' ,:a,...3,fic.x...neu , . ," a ~".,... ...ra .xw.a _ r v-..,.ram.,.sez.
..-.awx~.,,.. ,.,."a......v.,a.., 5a La Figure 1 illustre un type de support utilisable selon la prësente invention, se présentant sous la forme d'un dispositif d'essai comprenant un support solide (lj sur lequel des membranes (2), (3) et (4) sont fixëes. La Figure la présente une vue frontale et Ia Figure lb présente une vue en section longitudinale du dispositif d'essai.
Les performances exceptionnelles du procédé selon la présente invention reposent sur l'utilisation d'un agent de reconnaissance particulier, qui comprend un récepteur sensible aux antibiotiques à noyau (i-lactame obtenu à partir de Bacillus licheniformis, à savoir la protéine BlaR dont l'isolement et la séquence qo peptidique sont décrits dans Y. ZHiJ et al., J. Bacteriol., l I37-2141, (1990), ou le polypeptide BlaR-CTD qui est le domaine carboxy terminal de BlaR dont l'isolement et la séquence peptidique sont décrits dans B. DORIS et al., FEMS Microbiology Ixtters, 107-114, (1990).
L'utilisation des récepteurs BlaR àu BIaR-CTD selon la présente invention pour la détection d'an.tibiotiques à noyaux (3-lactarr~e prësente des avantages importants par rapport aux agents de reconnaissance utilisés jusqu'à présent.
En effet, les récepteurs BIaR et BIaR-CTD sont capables de complexer très rapidement un nombre très élevé d'antibiotiques, et ce, à une température d'incubation WO 99/67416 PCTlEP99/02166 inférieure à celle nécessitée pour les agents de reconnaissance connus tels que, par exemple, les récepteurs obtenus à partir de Bacillus stearothermophilus.
A titre d'exemples d'antibiotiques détectables grâce aux procédés selon la présente invention, on peut citer les antibiotiques suivants :
benzylpénicilline (ou pénicilline Gj, ampicilline, amoxicilline, carbénicilline, méthylcilline, cloxacilline, 6-APA, monolactame, aztréoname, mécilliname, céphalexine, céphaloglycine, céphaloridine, nitrocéphine, céfatoxime, céfuroxime, ceftiofur, céphapyrine, 7-ACA.
Plus particulièrement, les procédés selon la présente invention permettent de détecter tous les antibiotiques cbntrblés par les autorités américaines et européennes, et ce, jusqu'aux seuils limites tolérés.
Les procédés selon l'invention permettent de détecter les antibiotiques à
noyau (i-lactame dans les liquides biologiques tels que le lait, l'urine, le sang, le sérum, la salive, les extraits de viande, les liquides de fermentation ou les milieux aqueux tamponnés.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré des procédés de l'invention, l'agent de reconnaissance est utilisé sous une forme couplée à un agent de marquage.
Cet agent de marquage peut étre de natures diverses. L'agent de marquage peut étre de type particulaire, comme les particules colloïdales métalliques (platine, or, argent, ...), les particules colloïdales de sélénium, carbone, soufre ou tellure, ou encore les particules colloïdales de latex synthétiques colorés. L'agent de marquage peut également étre une substance fluorescente, telles que la fluorescéine activée (disponible chez Boeringher-Mannheim Biochemica), l'isocyanate de fluorescéine, le tétraméthylisocyanate de rhodamine ou tout autre substance fluorescente connue de l'homme du métier. L'agent de marquage peut également étre enzymatique, par exemple une (3-lactamase, une peroxydase, une phosphatase, .... Dans ce cas, les récepteurs BIaR ou BIaR-CTD sont couplés par voie chimique ou génétique à cet agent de marquage enzymatique pour former une protéine de fusion.
Le couplage de l'agent de reconnaissance avec l'agent de marquage peut être effectué selon les méthodes conventionnelles connues de l'homme du métier.
L'agent de reconnaissance peut étre fixé soit directement sur l'agent de marquage, soit par la formation d'un complexe intermédiaire. Le couplage entre l'agent de reconnaissance et l'agent de marquage peut avoir lieu à différents moments lors de la mise en oeuvre des procédés de l'invention. Selon un premier mode de réalisation, le couplage entre l'agent de reconnaissance et l'agent de marquage a lieu avant la mise en contact de l'agent de reconnaissance et l'échantillon de liquide biologique à analyser. Selon d'autres modes de réalisation des procédés de l'invention, le couplage entre l'agent de reconnaissance et l'agent de marquage peut avoir lieu pendant ou après la mise en contact de l'agent de reconnaissance avec l'échantillon de liquide biologique. De préférence, le marquage de l'agent de reconnaissance a lieu avant la mise en contact de l'agent de reconnaissance avec l'échantillon à analyser.
La première étape a) des procédés selon l'invention consiste en la mise en contact d'un volume déterminé de liquide biologique avec une quantité d'agent de reconnaissance et l'incubation du mélange obtenu dans des conditions permettant la complexation des antibiotiques éventuellement présents dans le liquide biologique avec l'agent de reconnaissance.
L'incubation du liquide biologique avec le récepteur BIaR ou BIaR-CTD peut-ètre effectuée dans un intervalle de températures compris entre 4 et 60 °C. De préférence, cette température est de l'ordre de 47°C. Une augmentation de la température d'incubation aura pour effet une diminution de sa durée et inversement. Il est donc toujours possible de réduire la durée du procédé en augmentant la température.
Dans la seconde étape b) du procédé selon la présente invention, le mélange obtenu à l'étape a) est mis en contact avec au moins un antibiotique de référence immobilisé sur un support.
Les supports utilisables selon la présente invention peuvent étre de types très variés. Il peut s'agir de supports solides tels que tubes, plaques ou tiges recouverts d'une préparation d'antibiotique de référence. Il peut s'agir d'un dispositif d'essai se présentant sous la forme d'un support solide sur lequel des membranes sont fixées, une ou plusieurs substances de capture étant placées dans une zone de détection déterminée. Il peut s'agir de supports se présentant sous la forme de billes (agarose, polystyrène, ...) magnétiques ou non, capables de former un gel et sur lesquelles l'antibiotique de référence est immobilisé.
L'immobilisation de l'antibiotique de référence sur le support peut se faire par les méthodes connues de l'homme du métier, par exemple par absorption covalente ou non-covalente sur le support, éventuellement par l'intermédiaire d'un espaceur.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, les étapes a) et b) peuvent avoir lieu simultanément.
L'étape c) du procédé selon la présente invention consiste à déterminer les récepteurs qui se sont fixés sur le support sur lequel l'antibiotique de référence est immobilisé. La méthode utilisée pour cette détermination est directement liée au type d'agent de marquage utilisé. Si l'agent de marquage est enzymatique, l'étape de détermination fera appel à une réaction spécifique de cet enzyme associée, par exemple, à la production d'un coloration déterminée. Si l'agent de marquage est fluorescent, la détermination s'effectue simplement par mesure de la fluorescence du support. ~ Dans le cas de particules métalliques ou de latex colorés, la présence de récepteurs fixés sur le support se traduit par une coloration dont l'intensité est directement proportionnelle au nombre de récepteurs fixés sur le support. Quel que soit le type d'agent de marquage utilisé, l'intensité du signal détecté
est inversement proportionnelle à la quantité d'antibiotique présent dans l'échantillon analysé.
La présente invention concerne aussi des trousses d'essai pour la détection d'antibiotiques dans un liquide biologique comprenant au moins un agent de reconnaissance qui comprend un récepteur sensible aux antibiotiques à noyau (3-lactame obtenu à partir de Bacillus licheniformis, et au moins un antibiotique de référence immobilisé sur un support.
Les exemples qui suivent illustrent différents aspects et modes d'implémentation de la présente invention sans toutefois en limiter sa portëe.
Exemple 1. Détermination d'antibiotiques à noyau p-lactame dans le lait.
Cet exemple illustre la détection dans le lait d'antibiotiques à noyau (3-lactame contrôlés par les autorités sanitaires. Le test décrit dans cet exemple utilise le récepteur BIaR-CTD couplé à des billes d'or qui servent d'agents de marquage et utilise un support se présentant sous la forme d'un dispositif d'essai comprenant un support solide sur lequel des membranes sont fixées.
1.1. Couplage de BIaR-CTD aux billes d'or.
1. 1. 1. Biotinylation de BIaR-CTD.
3,79 ml d'une solution d'agent de reconnaissance BIaR-CTD à 6,6 mg/ml sont repris en tampon Phosphate de sodium 20 mM pH 7. On ajoute alors à cette solution de BIaR-CTD 41,71 ml de tampon bicarbonate (0,1 M en bicarbonate de sodium, pH 9) et 2 ml d'une solution d'ester 6-(biotinamido)caproïque de N-hydroxy-succinimide à 2,23 mg/ml également en tampon bicarbonate. Cette solution est agitée doucement sur agitateur pour tubes sur axe rotatif de type LABINCO
(disponible chez VEL, Belgique) à une vitesse de 2 tours/minute pendant 2 heures à
température ambiante et à l'abri de la lumière. 2,5 ml d'une solution de tampon Tris 1 M pH 8 sont incubés avec le mélange réactionnel dans les mémes conditions pendant 30 minutes. La solution ainsi obtenue est dialysée contre du tampon HNM
(Hepes 100mM, pH 8, NaCI 100 mM, MgClz 50 mM) pendant 24 heures. De cette manière, on obtient une solution de BIaR-CTD biotinylé que l'on dilue dans du tâmpon HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCl 500 mM, MgCl2 250 mM, BSA
10 mg/ml) jusqu'à une concentration de 250 ug de BIaR-CTD biotinylé par ml de tampon. Cette solution est stockée à -20 °C.

I.1.2. Agent de marquage.
Comme agent de marquage, on utilise des particules d'or ayant un diamètre de 40 nm, sur lesquelles un anticorps de chèvre anti-biotine a été déposé sous la forme de suspensions dans une solution aqueuse de tétraborate de sodium à 2 mM
à pH 7,2, stabilisée par de l'azoture de sodium à 0,1% (disponible chez BRITISH
BIOCELL (Réf. GAB40). La densité optique de ces suspensions à 520 nm est d'environ 10 et la concentration en protéine est d'environ 24 pg/ml.
1.1.3. Couplage de BlaR-CTD biotinylé aux billes d'or.
La solution de BlaR-CTD biotinylé préparée à l'exemple 1.1.1 est diluée 114,7 fois par du tampon HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCI 500 mM, MgCl2 250 mM, BSA 10 mg/ml). On mélange à température ambiante 22,5 parties en volume de cette solution diluée de BIaR-CTD biotinylé, 7,5 parties en volume de tampon HNM-BSA, 9,27 parties en volume de suspension de particules d'or servant à marquer BIaR-CTD biotinylé et 6 parties en volume de suspension de particules d'or de référence (voir exemple 1.1.4 ci-dessous).
1.1.4. Référence indépendante.
Dans ce test, on utilise également une substance de référence qui fournit une bande dont l'intensité permet de quantifier rapidement la quantité
d'antibiotique présent dans l'échantillon.
Pour cela, on utilise des particules d'or de 40 nm sur lesquelles un anticorps de chèvre anti-Immunoglobuline de lapin a été déposé. Ces particules sont disponibles chez BRITISH BIOCELL (Réf. GAR40), sous la forme de suspensions dans une solution aqueuse de tétraborate de sodium à 2 mM à pH 7,2, stabilisée par de l'azoture de sodium à 0,1%. La densité optique de ces suspensions à 520 nm est d'environ 3 et la concentration en protéine est d'environ 6 Ng/ml.
1.2. Dispositif d'essai.
Le dispositif d'essai utilisé comprend un support solide (1) qui possède une première et une seconde extrémité, sur lequel sont fixées, successivement, en partant de la première extrémité, - une membrane (2) permettant la purification du liquide analysé, - une membrane (3) sur laquelle deux substances de capture (antibiotique de référence et substance capable de fixer la référence indépendante) sont immobilisées, et - une membrane (4) absorbante.

1.2.1. Assemblage du dispositif d'essai.
Des cartes ayant une taille de 300 x 76,2 mm sont d'abord assemblées au moyen d'un laminateur de type Chlamshell Laminator (disponible chez Bio Dot, 4 specific, in this case, D-alanyl-D-alanine-carboxypeptidase exocellular which is produced by Actinomadura R39 (hereinafter referred to as "enzyme R39 ").
The enzyme R39 has a specific activity of hydrolyzing groups D-alanyl-D-alanine of various peptides and is also capable of hydrolyzing of the special thioesters.
In addition, the R39 enzyme reacts with p-lactam antibiotics to very quickly form an equimolar enzyme-antibiotic complex, which is inactive and substantially irreversible.
In the most recent version of this test (EP 468.946), a volume determined from a sample of the test liquid is incubated with a quantity predetermined level of the enzyme R39 under conditions allowing the antibiotic ~ -Lactam possibly present in the sample to react with the enzyme for forming an equimolar enzyme-antibiotic complex, inactive and substantially irreversible.
Then, a determined amount of thioester-type substrate is incubated with the product obtained in the first stage under conditions allowing hydrolysis of the substrate by the residual R39 enzyme which has not been complexed with the antibiotic during the first incubation. The amount of acid mercaptoalkanoic acid thus formed is then determined by colorimetric at using a reagent capable of producing a coloration by reaction with the SH group free from mercaptoalkanoic acid. The intensity of the coloring is compared has a standard, previously established from samples containing quantities known antibiotics. The quantitative determination can be made by measure at spectrophotometer; in the case of milk, the prior clarification of the sample may be necessary.
According to the exemplary embodiments of patent EP 468946, this process allows to determine, in the milk, 10 ppb of penicillin G for a total time incubation time of 5 minutes and of the order of 2.5 ppb penicillin G for one time incubation total of 1 S minutes.
Given the criteria of speed, simplicity and sensitivity required of the methods of detecting antibiotics in food products, the applicant has set itself the goal of finding new methods again more effective for the detection of antibiotics in a liquid organic. In particular, the plaintiff has set itself the objective of search methods to detect in a single test the majority of antibiotics whose content is regulated by European and US authorities.
Of Moreover, the methods sought must make it possible to obtain this result in one limited number of steps, preferably executable by non-staff qualified.

The Applicant has also researched methods to achieve these goals with a reduced incubation time compared to the processes existing.
The applicant has just discovered new processes for the detection of antibiotics with a ~ i-lactam nucleus in a biological fluid which to achieve these objectives in a remarkable way.
This is why the present invention relates to a method for detection of an antibiotic or antibiotics with a nucleus (i-lactam in liquid comprising the following steps:
(a) contacting a determined volume of said biological fluid with a quantity of recognition agent and the incubation of the mixture thus obtained under conditions that allow the complexation of the antibiotic or antibiotics possibly present in said biological fluid with the Agent of recognition, (b) contacting the mixture obtained in step a) with at least one Reference antibiotic immobilized on a support, under conditions allowing the complexation of the reference antibiotic with the quantity recognition agent which has not reacted in step a) with the antibiotic or the antibiotics present in the biological fluid, and (c) the detection of the antibiotic or antibiotics by determining the amount of recognition agent linked to the reference antibiotic immobilized on the support in step b), characterized in that the recognition agent comprises a receiver Antibiotic sensitive to ~ i-iactam nucleus obtained from Bacillus licheniformis, said receptor being the BIaR receptor or the BIaR-receptor CTD;
characterized in that the amount of recognition agent contacted with the reference antibiotic in step b) is inversely proportional to the amount of antibiotics possibly present in said liquid organic; and characterized in that the antibiotic or antibiotics are detected in 5 minutes or less.
_. .zw .., _. ..u ..z. .: -.- h ... ..,.,., .. v,,., xr, SaM "..,. ~.;,;, .. 4 ~. ~ Na. zo - art. .. w H W ......
Sns. ~ 3 ',: a, ... 3, fic.x ... neu,. , "a ~"., ... ... ra .xw.a _ r v - ..,., ram.,. sez.
..-. awx ~. ,, ..,.,. "a ...... v., a .., 5a Figure 1 illustrates a type of support usable according to the present invention, in the form of a test device comprising a support solid (lj on which membranes (2), (3) and (4) are fixed. Figure shows this A sight FIG. 1b shows a longitudinal sectional view of the device test.
The outstanding performance of the process according to the present invention rely on the use of a particular recognition agent, which comprises an antibiotic sensitive receptor with a nucleus (i-lactam obtained from Bacillus licheniformis, namely the BlaR protein whose isolation and sequence Peptide numbers are described in Y. ZHiJ et al., J. Bacteriol., No. I37-2141, (1990), or BlaR-CTD polypeptide which is the terminal carboxy domain of BlaR whose isolation and the peptide sequence are described in B. DORIS et al., FEMS Microbiology Ixtters, 107-114, (1990).
The use of BlaR receivers with BIaR-CTD according to the present invention for the detection of nucleic acid (3-lactose) present advantages important to the recognition agents used so far.
In Indeed, the BIaR and BIaR-CTD receptors are capable of quickly a very high number of antibiotics at an incubation temperature WO 99/67416 PCTlEP99 / 02166 less than that required for known recognition agents such as by for example, receptors obtained from Bacillus stearothermophilus.
As examples of antibiotics detectable by the methods according to the present invention include the following antibiotics:
benzylpenicillin (or penicillin Gj, ampicillin, amoxicillin, carbenicillin, methylcillin, cloxacillin, 6-APA, monolactam, aztreonam, mecillinam, cephalexin, cephaloglycine, cephaloridine, nitrocelephine, cefatoxime, cefuroxime, ceftiofur, cephapyrine, 7-TO THAT.
More particularly, the methods according to the present invention make it possible detect all the antibiotics collected by the US authorities and up to the tolerated thresholds.
The methods according to the invention make it possible to detect antibiotics at nucleus (i-lactam in biological fluids such as milk, urine, blood, the serum, saliva, meat extracts, fermentation liquids or environments aqueous buffered.
According to a preferred embodiment of the methods of the invention, the agent recognition is used in a form coupled to a labeling agent.
This The marking agent may be of various natures. The marking agent can be of particulate type, such as colloidal metal particles (platinum, gold, money, ...), colloidal particles of selenium, carbon, sulfur or tellurium, or still the colloidal particles of colored synthetic latex. The marking agent can also be a fluorescent substance, such as activated fluorescein (available from Boeringher-Mannheim Biochemica), isocyanate fluorescein, the rhodamine tetramethylisocyanate or any other known fluorescent substance of the skilled person. The labeling agent can also be enzymatic, by example a (3-lactamase, a peroxidase, a phosphatase, .... In this case, the BIaR or BIaR-CTD receptors are chemically or genetically coupled to this enzymatic labeling agent to form a fusion protein.
Coupling of the recognition agent with the labeling agent can be performed according to conventional methods known to those skilled in the art.
The recognition officer may be attached either directly to the marking, either by the formation of an intermediate complex. The coupling between the agent of recognition and the marking agent can take place at different times during the implementation of the methods of the invention. According to a first mode of implementation, the coupling between the recognition agent and the agent of marking a place before the contact of the recognition agent and the sample of liquid biological analysis. According to other embodiments of the methods of the invention, the coupling between the recognition agent and the agent of marking can occur during or after the contact of the Recognition Officer with the biological fluid sample. Preferably, the labeling of the agent of recognition takes place before contact of the recognition officer with the sample to be analyzed.
The first step a) of the methods according to the invention consists in the implementation contact of a determined volume of biological fluid with a quantity of agent of recognition and incubation of the resulting mixture under conditions allowing the complexation of the antibiotics possibly present in the liquid biological with the recognition agent.
Can the incubation of the biological fluid with the BIaR or BIaR-CTD receptor be carried out in a temperature range of 4 to 60 ° C. Of preferably, this temperature is of the order of 47 ° C. A raise of the incubation temperature will result in a decrease in its duration and Conversely. It is therefore always possible to reduce the process time by increasing the temperature.
In the second step b) of the process according to the present invention, the mixture obtained in step a) is brought into contact with at least one antibiotic of reference immobilized on a support.
The supports that can be used according to the present invention can be of types very varied. It can be solid supports such as tubes, plates or rods covered with a reference antibiotic preparation. It can be a test device in the form of a solid support on which of the membranes are fixed, one or more capture substances being placed in a determined detection zone. It can be media presenting itself under the form of beads (agarose, polystyrene, ...) magnetic or not, capable of form a gel and on which the reference antibiotic is immobilized.
The immobilization of the reference antibiotic on the support can be done by the methods known to those skilled in the art, for example by absorption covalent or non-covalent on the support, possibly via a spacer.
According to one particular embodiment of the invention, the steps a) and b) can take place simultaneously.
Step c) of the process according to the present invention consists in determining the receptors that are attached to the support on which the antibiotic reference is immobilized. The method used for this determination is directly related at type of marking agent used. If the labeling agent is enzymatic, the stage of determination will make use of a specific reaction of this associated enzyme, by for example, to the production of a determined coloration. If the marking agent is fluorescent, the determination is simply carried out by measuring the fluorescence of the support. ~ In the case of metallic particles or colored latex, the presence of receptors fixed on the support results in a coloration of which the intensity is directly proportional to the number of receivers fixed on the support. What whatever the type of marking agent used, the intensity of the detected signal is inversely proportional to the amount of antibiotic present in the sample analysis.
The present invention also relates to test kits for the detection of antibiotics in a biological fluid comprising at least one recognition that includes a receptor sensitive to core antibiotics (3-lactam obtained from Bacillus licheniformis, and at least one antibiotic of reference immobilized on a support.
The following examples illustrate different aspects and modes implementation of the present invention without limiting its scope.
Example 1. Determination of p-lactam antibiotics in milk.
This example illustrates the detection in milk of core antibiotics (3-lactam controlled by health authorities.) The test described in this example uses the BIaR-CTD receiver coupled with gold beads that act as agents of marking and uses a support in the form of a device trial comprising a solid support on which membranes are fixed.
1.1. Coupling of BIaR-CTD with gold beads.
1. 1. 1. Biotinylation of BIaR-CTD.
3.79 ml of a BIaR-CTD 6.6 mg / ml recognition agent solution are taken up in buffer 20 mM sodium phosphate pH 7. This is then added to this BIaR-CTD solution 41.71 ml of bicarbonate buffer (0.1 M bicarbonate) sodium, pH 9) and 2 ml of a solution of 6- (biotinamido) caproic acid ester of N-hydroxy succinimide at 2.23 mg / ml also in bicarbonate buffer. This solution is gently agitated on agitator for rotating tubes of type LABINCO
(available at VEL, Belgium) at a speed of 2 rpm for 2 hours to ambient temperature and protected from light. 2.5 ml of a solution of buffer 1M Tris pH 8 are incubated with the reaction mixture in the same terms during 30 minutes. The solution thus obtained is dialyzed against buffer MNH
(100mM Hepes, pH 8, 100mM NaCl, 50mM MgCl 2) for 24 hours. Of this In this way, a biotinylated BIaR-CTD solution is obtained which is diluted in HNM-BSA stain (500 mM Hepes, pH 8, 500 mM NaCl, 250 mM MgCl 2, BSA
10 mg / ml) to a concentration of 250 μg biotinylated BIaR-CTD per ml of buffer. This solution is stored at -20 ° C.

I.1.2. Marking agent.
As marking agent, gold particles having a diameter are used 40 nm, on which a goat anti-biotin antibody has been deposited under the form of suspensions in an aqueous solution of 2 mM sodium tetraborate at pH 7.2, stabilized with 0.1% sodium azide (available from BRITISH
BIOCELL (Ref GAB40). The optical density of these suspensions at 520 nm is of about 10 and the protein concentration is about 24 μg / ml.
1.1.3. Coupling of biotinylated BlaR-CTD with gold beads.
The biotinylated BlaR-CTD solution prepared in Example 1.1.1 is diluted 114.7 times with HNM-BSA buffer (500 mM Hepes, pH 8, 500 mM NaCl, MgCl 2 250 mM, BSA 10 mg / ml). 22.5 parts are mixed at room temperature volume of this diluted Biotinylated BIaR-CTD solution, 7.5 parts by volume of HNM-BSA buffer, 9.27 parts by volume of gold particle suspension for to mark biotinylated BIaR-CTD and 6 parts by volume of suspension of particles reference gold (see example 1.1.4 below).
1.1.4. Independent reference.
In this test, a reference substance is also used which provides a band whose intensity makes it possible to quickly quantify the quantity antibiotic present in the sample.
For this purpose, 40 nm gold particles are used, on which an antibody is goat anti-rabbit immunoglobulin has been deposited. These particles are available at BRITISH BIOCELL (Ref GAR40), in the form of suspensions in an aqueous solution of 2 mM sodium tetraborate at pH 7.2, stabilized with 0.1% sodium azide. The optical density of these suspensions at 520 nm is about 3 and the protein concentration is about 6 Ng / ml.
1.2. Test device The test device used comprises a solid support (1) which has a first and second ends, on which, successively, from the first end, a membrane (2) allowing the purification of the analyzed liquid, a membrane (3) on which two capture substances (antibiotic of reference and substance capable of setting the independent reference) are immobilized, and an absorbent membrane (4).

1.2.1. Assembly of the test device.
Cards with a size of 300 x 76.2 mm are first assembled at the using a Chlamshell Laminator type laminator (available from Bio Dot,

5 Inc.) selon la méthode suivante:
On découpe un rectangle de support plastique de type ArCare 8565 (disponible chez Adhesive Research) de dimension 300 x 76,2 mm (support solide (1)). On découpe ensuite un rectangle de membrane Leukosorb LK4 (disponible chez Pall Gelman Sciences) de dimension 300 x 20 mm (membrane (2)), un 10 rectangle de membrane Hi-Flow SX (disponible chez Millipore) de dimension 300 x 25 rnm (membrane (3)), un rectangle de membrane de cellulose 3 mm (disponible chez Whatmann) de dimension 300 x 40 mm (membrane (4)).
On loge successivement les membranes (2) et (4), puis (3) dans un emplacement spécifique du moule inférieur du laminateur. Le support solide (1) recouvert d'adhésif est quant à lui maintenu dans le couvercle de l'appareil, le côté
adhésif étant exposé à l'air. Les membranes logées dans le moule inférieur sont mises en contact avec le support adhésif en refermant le laminateur; les membranes sont maintenues exactement en place au moyen d'une succion d'air réalisée par une pompe à vide. Lorsque le vide est rompu, on récupère une carte constituée du support solide (1) sur lequel les membranes (2), (3) et (4) sont fixées.
On dépose ensuite les solutions suivantes sur la membrane (3): côté
proximal: première substance de capture; bande n° 1; côté distal:
deuxième substance de capture; bande n°2. Ces substances de capture sont déposées au moyen d'un "Dispenser" de type X-Y Platform Biojet Quanti-3000 de Bio Dot, Inc.
Les solutions déposées sont immédiatement évaporées en plaçant l'ensemble de la carte pendant une minute sous un air pulsé chaud à 60°C.
Les cartes obtenues après assemblage sont découpées en lamelles à l'aide d'un appareil de type guillotine ou à l'aide d'un appareil rotatif (disponible chez Bio Dot, Kinematic ou Akzo). Les lamelles des extrémités sont écartées, les autres lamelles étant prétes à l'emploi.
La Figure 1 illustre un tel dispositif d'essai.
Pour leur conservation, les dispositifs d'essai sont placés dans un récipient opaque et hermétique en présence d'un agent dessicant (Air Sec, France).
1.2.2. Première substance de capture - Antibiotique de référence.
8 ml d'une solution contenant 213 mg de Gamma Globuline Humaine (G4386, Sigma) et 8,6 mg de chlorhydrate de 2-Iminothiolane (Aldrich, 33056-6) WO 99/67415 Inc.) according to the following method:
A plastic support rectangle of type ArCare 8565 is cut out (available from Adhesive Research) 300 x 76.2 mm (solid support (1)). Then cut a membrane rectangle Leukosorb LK4 (available at Pall Gelman Sciences) of dimension 300 x 20 mm (membrane (2)), a 10 Hi-Flow SX membrane rectangle (available from Millipore) 300 x 25 nm (membrane (3)), a 3 mm cellulose membrane rectangle (available at Whatmann) of dimension 300 x 40 mm (membrane (4)).
Membranes (2) and (4) are successively housed, then (3) in a specific location of the lower mold of the laminator. The solid support (1) covered with adhesive is kept in the cover of the device, the side adhesive being exposed to air. Membranes housed in the lower mold are brought into contact with the adhesive support by closing the laminator; the membranes are held in place exactly by means of an air suction performed by a vacuum pump. When the vacuum is broken, we recover a map consisting of the solid support (1) on which the membranes (2), (3) and (4) are fixed.
The following solutions are then deposited on the membrane (3):
proximal: first capture substance; Tape No. 1; distal side:
second capture substance; Tape No. 2 These capture substances are deposited at means of a "Dispenser" type BioPlus Biojet Quanti-3000 Bio Dot, Inc.
The deposited solutions are immediately evaporated by placing the assembly of the card for one minute under hot pulsed air at 60 ° C.
The cards obtained after assembly are cut into strips using a guillotine type device or using a rotating device (available at Bio Dot, Kinematic or Akzo). The lamellae of the extremities are spread apart, the others lamellae are ready for use.
Figure 1 illustrates such a test device.
For their preservation, the test devices are placed in a container opaque and hermetic in the presence of a desiccant (Air Sec, France).
1.2.2. First capture substance - Reference antibiotic.
8 ml of a solution containing 213 mg of human gamma globulin (G4386, Sigma) and 8.6 mg of 2-Iminothiolane hydrochloride (Aldrich, 33056-6) WO 99/6741

6 PCT/EP99/02166 dans du tampon carbonate de sodium (100 mM, pH 9) sont incubés pendant une heure à 25°C.
Par ailleurs, 20 ml d'une solution contenant 119,8 mg de céphalosporine-C
et 54 mg de sulfosuccinimidyl 4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane-1-carboxylate (sSMCC, 22322 Pierce)dans du tampon carbonate de sodium ( 100 mM, pH 9) sont incubés pendant une heure à 25°C.
Les deux solutions préparées précédemment sont ensuite mélangées. On ajuste le pH de la solution résultante à 7,1 par ajout de 3 ml NaH2P04 500 mM
et l'on incube pendant deux heures à 25°C. Le mélange obtenu après incubation est dialysé trois fois contre 1 litre de tampon phosphate de sodium (10 mM, pH 6 PCT / EP99 / 02166 in sodium carbonate buffer (100 mM, pH 9) are incubated for one hour at 25 ° C.
In addition, 20 ml of a solution containing 119.8 mg of cephalosporin-C
and 54 mg of 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate sulfosuccinimidyl (sSMCC, 22322 Pierce) in sodium carbonate buffer (100 mM, pH 9) are incubated for one hour at 25 ° C.
The two solutions prepared previously are then mixed. We adjust the pH of the resulting solution to 7.1 by adding 3 ml 500 mM NaH2PO4 and incubated for two hours at 25 ° C. The mixture obtained after incubation is dialyzed three times against 1 liter of sodium phosphate buffer (10 mM, pH

7,5).
La solution résultante est filtrée sur un filtre à 0,22 Nm, puis elle est aliquotée et congelée à -20°C jusqu'à utilisation.
Lors de l'utilisation, les aliquotes sont décongelées, et on y ajoute un colorant alimentaire avant d'effectuer le dépôt sur la membrane afin d'apprécier à
tout moment la position exacte du dépôt et la qualité du trait.
La première substance de capture permet de fixer BIaR-CTD couplé aux billes d'or présent en excédent par rapport à la quantité d'antibiotique présent dans l'échantillon.
1.2.3. Deuxième substance de capture - Substance capable de fixer la référence indépendante.
Pour la deuxième substance de capture, on utilise une solution d'immunoglobuline de lapin (Sigma I 5006) à une concentration de 0,5 mg/ml en immunoglobuline dans du tampon phosphate de sodium 10 mM, pH 7,5, gamma globuline humaine 5 mg/ml. Cette seconde substance de capture arréte la référence indépendante lors de la migration du liquide sur le dispositif d'essai.
1.3. Détermination des antibiotiques dans le lait.
1.3.1. Test en 3 minutes - Test rapide On prépare 7 échantillons de lait frais contenant respectivement 0;1;2;3;4;5 et 6 ppb de pénicilline G. Chacune de ces solutions est alors analysée de la manière suivante On prélève un aliquot de 200 ul d'échantillon de lait et 45.27 ~l de solution préparée à l'exemple 1.1.3 que l'on place dans une fiole en verre. Ce mélange est incubé pendant 1 minute à 47°C. On prend un dispositif d'essai que l'on place verticalement dans la fiole en verre de manière à ce que la première extrémité
du dispositif d'essai soit en contact avec le mélange et de manière à ce que la seconde extrémité repose sur la paroi de la fiole en verre. On laisse migrer le mélange sur le dispositif d'essai tout en incubant l'ensemble pendant 2 minutes à
47°C.
Le Tableau 1 ci-dessous reprend les résultats obtenus pour les 7 échantillons testés. Une valeur d'intensité allant de 0 à 10 est attribuée aux bandes détectées, la valeur 10 étant donnée pour la bande la plus intense et la valeur 0 étant donnée pour la bande la moins intense. Selon cette échelle, on attribue une valeur de 6 à la bande de référence. L'intensité du signal observé dans la première bande est inversement proportionnelle à la quantité de Pénicilline G présente dans l'échantillon.
Tableau 1 Pénicilline G Intensité
lppbl lère bande 2ème bande Dans cet exemple, lorsque la première bande a une intensité inférieure à
celle de la deuxième bande, le test est considéré comme positif. Les résultats présentés dans le Tableau 1 montrent que ce test permet de détecter en 3 minutes moins de 4 ppb de pénicilline G dans un échantillon de lait.
Des essais ont également été réalisés avec d'autres antibiotiques à noyau (3-lactame dans les mémes conditions. Ce test réalisé en 3 minutes permet de détecter l'amoxicilüne jusqu'à 5 ppb, l'ampicilline jusqu'à 5 ppb, la cloxacilline à
moins de 10 ppb, la dicloxacilline à moins de 20 ppb, l'oxacilline à moins de 20 ppb et la céphapirine jusqu'à 20 ppb dans un échantillon de lait.
1.3.2. Test en 5 minutes On prépare 6 échantillons de lait frais contenant respectivement 0;2;4;6;8 et 10 ppb de cloxacilline. Chacune de ces solutions est alors analysée de la manière suivante.
On prélève un aliquot de 200 ~l d'échantillon de lait et 45.27 ~1 de solution préparée â l'exemple 1.1.3 que l'on place dans une fiole en verre. Ce mélange est incubé pendant 3 minutes à 47°C. On prend un dispositif d'essai que l'on place verticalement dans la fiole en verre de manière à ce que la première extrémité
du dispositif d'essai soit en contact avec le mélange et de manière à ce que la seconde extrémité repose sur la paroi de la fiole en verre. On laisse migrer le mélange sur le dispositif d'essai tout en incubant l'ensemble pendant 2 minutes à
47°C.
Le Tableau 2 ci-dessous reprend les résultats obtenus pour les 6 échantillons testés. Une valeur d'intensité allant de 0 à 10 est attribuée aux bandes détectées, la valeur 10 étant donnée pour la bande la plus intense et la valeur 0 étant donnée pour la bande la moins intense. Selon cette échelle, on attribue une valeur de 6 à la bande de référence. L'intensité du signal observé dans Ia première bande est inversement proportionnelle à la quantité de Cloxacilline présente dans l'échantillon.
Tableau 2 Cloxacilline Intensité
i(,ppbj, lère bande 2ème bande 7.5).
The resulting solution is filtered through a 0.22 Nm filter and then aliquoted and frozen at -20 ° C until use.
In use, the aliquots are thawed, and one food coloring prior to depositing on the membrane so to appreciate at at any time the exact position of the deposit and the quality of the line.
The first capture substance makes it possible to bind BIaR-CTD coupled to gold beads present in excess of the amount of antibiotic present in the sample.
1.2.3. Second capture substance - Substance capable of setting the reference independent.
For the second capture substance, a solution is used rabbit immunoglobulin (Sigma I 5006) at a concentration of 0.5 mg / ml in immunoglobulin in 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5, gamma human globulin 5 mg / ml. This second capture substance stops the independent reference during fluid migration on the device test.
1.3. Determination of antibiotics in milk.
1.3.1. Test in 3 minutes - Quick test Seven samples of fresh milk containing 0; 1; 2; 3; 4; 5 are prepared respectively.
and 6 ppb of penicillin G. Each of these solutions is then analyzed from the way next An aliquot of 200 μl of milk sample and 45.27 μl of solution are taken.
prepared in Example 1.1.3 which is placed in a glass vial. This mixture is incubated for 1 minute at 47 ° C. We take a test device that we square vertically in the glass vial so that the first end of the test device is in contact with the mixture and in such a way that the second end rests on the wall of the glass vial. We let the mix on the test device while incubating the assembly for 2 minutes to 47 ° C.
Table 1 below shows the results obtained for the 7 samples tested. An intensity value ranging from 0 to 10 is assigned to bands detected, the value 10 being given for the most intense band and the value 0 being given for the least intense band. According to this scale, we attribute a value of 6 to the reference band. The signal intensity observed in the first band is inversely proportional to the amount of Penicillin G present in the sample.
Table 1 Penicillin G Intensity lppbl 1st band 2nd band In this example, when the first band has a lower intensity than the second band, the test is considered positive. The results presented in Table 1 show that this test can detect in 3 minutes less than 4 ppb penicillin G in a milk sample.
Trials have also been performed with other core antibiotics (3-lactam under the same conditions.) This test performed in 3 minutes allows detect amoxicillene up to 5 ppb, ampicillin up to 5 ppb, cloxacillin to less than 10 ppb, dicloxacillin less than 20 ppb, oxacillin less than 20 ppb and cephapirin up to 20 ppb in a milk sample.
1.3.2. Test in 5 minutes Six fresh milk samples containing 0, 2, 4, 6, 8 10 ppb of cloxacillin. Each of these solutions is then analyzed from the way next.
An aliquot of 200 ~ 1 of milk sample and 45.27 ~ 1 of solution is taken.
prepared in Example 1.1.3 which is placed in a glass vial. This mixture is incubated for 3 minutes at 47 ° C. We take a test device that we place vertically in the glass vial so that the first end of the test device is in contact with the mixture and in such a way that the second end rests on the wall of the glass vial. We let the mix on the test device while incubating the assembly for 2 minutes to 47 ° C.
Table 2 below shows the results obtained for the 6 samples tested. An intensity value ranging from 0 to 10 is assigned to bands detected, the value 10 being given for the most intense band and the value 0 being given for the least intense band. According to this scale, we attribute a value of 6 to the reference band. The signal intensity observed in Ia first band is inversely proportional to the amount of Cloxacillin present in the sample.
Table 2 Cloxacillin Intensity i (, ppbj, 1st band 2nd band

8 3 6 Dans cet exemple, lorsque la première bande a une intensité inférieure à
celle de la deuxième bande, le test est considéré comme positif. Les résultats présentés dans le Tableau 2 montrent que ce test permet de détecter en 5 minutes jusqu'à 4 ppb de cloxacilline dans un échantillon de lait.
Des essais ont également été réalisés avec d'autres antibiotiques à noyau p-lactame dans les mémes conditions. Ce test réalisé en S minutes permet de détecter la pénicilline G jusqu'à 3 ppb, l'amoxicilline jusqu'à 4 ppb, l'ampicilline jusqu'à 4 ppb, la dicloxacilline jusqu'à 8 ppb, l'oxacilline jusqu'à 8 ppb, la céphapirine jusqu'à 16 ppb, le ceftiofur jusqu'à 100 ppb, la cefquinone à
moins de 20 ppb, la nafcilline jusqu'à 20 ppb et la céfazoline jusqu'à 60 ppb dans un échantillon de lait.
Ce test convient particulièrement bien comme test de tri avant le dépotage des camions de lait dans les silos.
1.3.3. Test en 9 minutes On prépare 6 échantillons de lait frais contenant respectivement 0;4;6;8;10 et 12 ppb de céphapirine. Chacune de ces solutions est alors analysée de la manière suivante.

On prélève un aliquot de 200 ~1 d'échantillon de lait et 45.27 ~1 de solution préparée à l'exemple 1.1.3 que l'on place dans une fiole en verre. Ce mëlange est incubé pendant 7 minutes à 47°C. On prend un dispositif d'essai que l'on place verticalement dans la fiole en verre de manière à ce que la première extrémité
du dispositif d'essai soit en contact avec le mélange et de manière â ce que la seconde extrémité repose sur la paroi de la fiole en verre. On laisse migrer le mélange sur le dispositif d'essai tout en incubant l'ensemble pendant 2 minutes à
47°C.
Le Tableau 3 ci-dessous reprend les résultats obtenus pour les 6 échantillons testés. Une valeur d'intensité allant de 0 à 10 est attribuée aux bandes détectées, la valeur 10 étant donnée pour la bande la plus intense et la valeur 0 étant donnée pour la bande la moins intense. Selon cette échelle, on attribue une valeur de 6 à la bande de référence. L'intensité du signal observé dans la première bande est inversement proportionnelle à la quantité de Céphapirine présente dans l'échantillon.
Tableau 3 Cépha~irine Intensité
(ppl7) lère bande 2ème bande Dans cet exemple, lorsque la première bande a une intensité inférieure à
celle de la deuxième bande, le test est considéré comme positif. Les résultats présentés dans le Tableau 3 montrent que ce test permet de détecter en 9 minutes jusqu'à 6 ppb de céphapirine dans un échantillon de lait.
Des essais ont également été réalisés avec d'autres antibiotiques à noyau (i-lactame dans les mémes conditions. Ce test réalisé en 9 minutes permet de détecter la pénicilline G jusqu'à 3 ppb, l'amoxicilline jusqu'à 4 ppb, l'ampicilline jusqu'à 4 ppb, la cloxacilline jusqu'à 4 ppb, la dicloxacilline à moins de 8 ppb, l'oxacilline à moins de 8 ppb, le ceftiofur jusqu'à 80 ppb, la cefquinone à
moins de 20 ppb, la nafcilline à moins de 20 ppb et la céfazoline jusqu'à 45 ppb dans un échantillon de lait.
Ce test réalisé en 9 minutes permet donc de détecter tous les antibiotiques contrôlés actuellement par les autorités européennes, et ce, jusqu'aux limites légales imposées par ces autorités.

1.3.4. Test en 20 minutes On prépare 6 échantillons de lait frais contenant respectivement 0;20;30;40;50 et 60 ppb de ceftiofur. Chacune de ces solutions est alors analysée de 5 la manière suivante.
On prélève un aliquot de 200 ~1 d'échantillon de lait et 45.27 ~1 de solution préparée à l'exemple 1.1.3 que l'on place dans une fiole en verre. Ce mélange est incubé pendant 18 minutes à 47°C. On prend un dispositif d'essai que l'on place verticalement dans la fiole en verre de manière à ce que la première extrémité
du 10 dispositif d'essai soit en contact avec le mélange et de manière à ce que la seconde extrémité repose sur la paroi de la fiole en verre. On laisse migrer le mélange sur le dispositif d'essai tout en incubant l'ensemble pendant 2 minutes à
47°C.
Le Tableau 4 ci-dessous reprend les résultats obtenus pour les 6 échantillons testés. Une valeur d'intensité allant de 0 à 10 est attribuée aux bandes 15 détectées, la valeur 10 étant donnée pour la bande la plus intense et la valeur 0 étant donnée pour la bande la moins intense. Selon cette échelle, on attribue une valeur de 6 à la bande de référence. L'intensité du signal observé dans la première bande est inversement proportionnelle à la quantité de Ceftiofur présente dans l'échantillon.
Tableau 4 Ceftiofur Intensité
(ppb) lère bande 2ème bande Dans cet exemple, lorsque la première bande a une intensité inférieure à celle de la deuxième bande, le test est considéré comme positif. Les résultats présentés dans le Tableau 4 montrent que ce test permet de détecter en 20 minutes jusqu'à
30 ppb de ceftiofur dans un échantillon de lait.
Ce test en 20 minutes permet donc de détecter en un seul test tous les antibiotiques contrôlés actuellement par ies autorités européennes et américaines, et'ce, jusqu'aux limites légales imposées par ces autorités.

Exemple 2. Détermination de 6 antibiotiques dans le lait.
Cet exemple illustre la détection dans le lait des 6 antibiotiques à noyau (i-lactame contrôlés par les autorités américaines. Le test décrit dans cet exemple utilise le récepteur BlaR-CTD sous la forme d'une protéine de fusion avec la (3-lactamase et utilise un support sé présentant sous la forme de billes magnétiques.
2.1. Protéine de fusion BlaR-CTD- (3-iactamase.
La protéine de fusion BIaR-CTD- (3-lactamase est obtenue par couplage génétique entre le récepteur BIaR-CTD (B. JORIS et al., FEMS Microbiology Letters, 107-114, 1990) et la (3-lactamase â Zn de Bacillus cereus (M. Hussain et al., 1985, J. Bact., 164:1, 223-229, 1985).
Le couplage est réalisé de la manière suivante:
2.1.1. Construction du plasmide: un couplage 1 / 1 a été réalisë entre les gènes du polypeptide BlaR-CTD et de la j3-lactamase: le gène codant pour la (i-lactamase a été
introduit en phase et derrière le gène de BIaR-CTD. Le plasmide porteur de la fusion génétique présente la résistance à la kanamycine. La protéine de fusion est ci-après dénommée Fus 1.
2.1.2. Production:
- Souche: le plasmide portant les gène fusionnés a été introduit dans E. Coli.
Les clones porteurs du plasmide recombinant sont sélectionnés sur LB + Km (50 Ng/ml).
- Sélection: le marquage de l'extrait cellulaire avec un antibiotique radioactif, suivi d'une électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant, montre que la majeure partie de la protéine est produite sous forme d'un produit de fusion dont la masse molaire est d'environ 50.000. Cependant, une protéolyse post-traductionnelle semble dissocier un très faible pourcentage (2%) de ces molécules en deux activités distinctes.
- Culture: 500 ml de milieu LB + Km (50 Ng/ml) sont inoculés à partir de cellules recombinantes conservées à -70°C. La préculture est incubée à
37°C et agitée une nuit à 225 tours par minute. 18 litres de milieu LB + Km (50 ~g/ ml) sont inoculés avec 500 ml de cette préculture dont la densité optique à 600 nm est de 4. La culture de 18 litres est arrétée lorsque la densité optique atteint la valeur de 6.

2.1.3. Extrâction: Immédiatement après arrét de la culture, les cellules sont filtrées puis centrifugées. Le surnageant du culot cellulaire lysé au désintégrateur est gardé. Il contient la protéine de fusion FUS1.
2.1.4. Purification:
- Tampons utilisé:
~ Tampon A: Tris 20 mM pH 8,0, éthylène glycol 10%, DTT 50 uM;
~ Tampon B: tampon A + NaCI 1M.
La protéine de fusion est partiellement purifiée par chromatographie ionique et sur tamis moléculaire. Après dépbt de l'extrait et lavage sur une colonne QSFF
(Pharmacia, Upsala) en tampon A, FUS1 est éluée par un gradient linéaire en tampon B. Les fractions actives (~ 0,25 M en NaCl) sont ensuite rassemblées et déposée sur tamis moléculaire G-100 (Pharmacia, Upsala); elles sont éluées en tampon A. L'activité spécifique moyenne du lot récupéré est estimée à 30%.
2.1.5. Inhibition de la (i-lactamase: la protéine de fusion (9/ 10 volume) est incubée en EDTA 50 mM ( 1 / 10 volume) pendant 45 minutes à 37°C. On vérifie l'inhibition à l'aide de nitrocéfine en tampon cacodylate 10 mM pH 6,0. En présence ou absence de Zn, le signal doit respectivement ètre positif ou négatif. Après inhibition, la concentration effective, mesurée sur base de l'activité j3-lactamasique est de ?,74 pmole/Nl.
2.2. Support solide: billes magnétiques - céphalosporine C (antibiotique de référence).
On utilise des particules BioMag 4100 (disponibles chez DRG Instrument Gmbh, Marburg, Germany, sous la référence AM 4100 B.) dont les extrémités NH2 ont été activées au glutaraldéhyde de la manière suivante:
- un volume de solution initiale de particules BioMag 4100 est rincé 4 fois à
l'aide de 5 volumes de tampon pyridine O,O1M pH b,0. Les particules sont reprises dans 2,5 volumes de glutaraldéhyde à 5% en tampon pyridine et sont agitées par rotation pendant trois heures â température ambiante. Elles sont ensuite rincées 10 fois à l'aide de deux volumes de tampon Kpi 0,01 M à
pH 7,0. Les particules sont ensuite remises en suspension dans un volume de céphalosporine C à 0,1 M en tampon Kpi et agitées par rotation pendant une nuit à +4°C. Le rinçage final se fait jusqu'à élimination complëte de la céphalosporine C dans le tampon Kpi 0,1 M pH 7,0.
2.3. Détermination des 6 antibiotiques pénicilline G, ampicilline, amoxicilline, cloxacilline, céphapirine et ceftiofur dans le lait.

2.3.1. Solutions utilisées:
- solution 1: 700 picomoles de protéine de fusion lyophilisée en Tris 100 mM, pH 8, BSA 1 mg/ml, EDTA 50 mM, DTT 50 pM sont réhydratés avec 5 ml d'eau Milli-Q; 50 lrl de cette solution sont nécessaires pour réaliser une mesure. f - solution 2: 2 ml de particules BioMag-céphalosporine C préparées à l'exemple 1.2 dans isopropanol à 100%; 20 pl sont nécessaires pour réaliser une mesure.
solution 3: tampon cacodylate 10 mM, pH 6, NaCI 1M lyophilisé est réhydraté
avec 500 ml d'eau Milli-Q.
- solution 4: 400 ml de nitrocéfine 10 mM en DMF sont dilués à 40 ml dans la solution 3; 400 pl sont nécessaires pour une détection.
2.3.2. Procédé de détection:
50 cul de la solution 1 sont placés en présence de 500 ml d'échantillons de lait dopés et incubés à 47°C pendant 2 minutes. 20 pl de la solution 2 sont mis en suspension dans le lait qui est de nouveau incubé pendant 2 minutes à
47°C. Les particules sont attirées contre la paroi du récipient à l'aide d'un aimant paramagnétique pendant que le surnageant est vidé du tube. Les particules sont rincées à deux reprises avec la solution 3 en procédant de manière similaire avec l'aimant. Enfin, 400 Nl de la solution 4 sont incubés en présence des particules pendant 3 minutes à 47°C. On mesure alors fabsorbance de la solution résiduelle à 482 nm par rapport à la solution de nitrocéfme.
Ce procédé permet de détecter les 6 antibiotiques repris dans la réglementation américaine à des concentrations inférieures aux normes imposées par les autorités, à savoir, la pénicilline â 5 ppb, l'ampicilline â 10 ppb, l'amoxicilline à 10 ppb, la cloxacilline à 10 ppb, la céphapirine à 20 ppb et le ceftiofur à 50 ppb.
Exemple 3. Détermination de 3 antibiotiques (pénicilline G, cloxacilline, ceftiofur) dans le lait.
Cet exemple illustre la détection dans le lait de 3 antibiotiques à noyau p-lactame contrôlés par les autorités sanitaires. Le test décrit dans cet exemple utilise le récepteur BIaR-CTD sous la forme de deux protéines de fusion avec la phosphatase alcaline et la peroxydase, respectivement, et utilise un support se présentant sous la forme d'une microplaque.

3.1. Protéine de fusion BIaR-CTD-phosphatase alcaline.
La protéine de fusion BIaR-CTD-phosphatase alcaline est obtenue par couplage chimique entre le récepteur BlaR-CTD (B. DORIS et al., FEMS
Microbiology Letters, 107-114, ( 1990)) et la phosphatase alcaline activée disponible chez Boehringer Mannheim Biochemica sous la référence 1464752.
Le couplage est réalisé de la manière suivante:
3.1.1. Conjugaison: BIaR-CTD et la phosphatase alcaline sont dialysées dans du tampon carbonate/hydrogénocarbonate de sodium 100 mM à pH 9,8.
15 nanomoles de BlaR-CTD sont incubées en présence de 100 ~1 de phosphatase alcaline activée (20 mg/ml) pendant deux heures à 25°C.
3.1.2. Arrêt de la réaction: On ajoute 40 Nl d'une solution de triéthanolamine à
2mM, pH 8, puis 50 ul d'une solution de borohydrure de sodium à 200 mM. Le mélange est incubé pendant 30 min. à +4°C. On ajoute alors 25 gl d'une solution de triéthanolamine à 2 mM, pH 8, puis on incube à nouveau le mélange pendant 2 heures à + 4°C.
3.1.3. Stabilisation du couplage: on ajoute 10 Nl d'une solution de glycine à
1 M, pH 7,0.
3.1.4. Transfert dans le tampon de stockage: Le mélange réactionnel (environ 300 ul) est dialysé trois fois 8 heures contre 0,5 litre de tampon triéthanolamine 50 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM, MgCl2 1 mM, ZnCl2 0,5 mM, glycine 10 mM à
+4°C.
3.1.5. Titre final: le titre final du couplage est de l'ordre de 50 pmole de BIaR-CTD
actif par ~1 de solution.
3.2. Protéine de fusion BIaR-CTD-peroxydase La protéine de fusion BIaR-CTD-peroxydase est obtenue par couplage chimique entre le récepteur BIaR-CTD (B. DORIS et al., FEMS Microbiology Letters, 107-114, (I990)) et la peroxydase activée disponible chez Boehringer Mannheim Biochemica sous la référence 1428861.
Le couplage est réalisé de la manière suivante:
3:2.1. Conjugaison: BIaR-CTD et la peroxydase sont dialysées dans du tampon carbonate/hydrogénocarbonate de sodium 100 mM à pH 9,8. 40 nanomoles de BIaR-CTD sdnt incubées en présence de 100 ul de peroxydase activée (16 mg/ml) pendant deux heures à 25°C.
3.2.2. Arrêt de la réaction: On ajoute 40 Nl d'une solution de triéthanolamine à
5 2mM, pH 8, puis 50 ~1 d'une solution de borohydrure de sodium à 200 mM. Lek mélange est incubé pendant 30 min. à +4°C. On ajoute alors 25 Nl d'une solution de triéthanolamine à 2 mM, pH 8, puis on incube à nouveau le mélange pendant 2 heures à + 4°C.
10 3.2.3. Stabilisation du couplage: on ajoute 10 ul d'une solution de glycine à 1M, pH 7,0.
3.2.4. Transfert dans le tampon de stockage: Le mélange réactionnel (environ 400 ul) est dialysé trois fois 8 heures contre 0,5 litre de tampon phosphate de 15 potassium 10 mM, pH 7,5, NaCI 200 mM, glycine 10 mM à +4°C.
3.2.5. Titre final: le titre final du couplage est de l'ordre de 100 pmole de BlaR-CTD
actif par ul de solution.
20 3.3. Support solide: microplaque-céphalosporine C.
3.3.1. Préparation de la solution d'antibiotique de référence.
8 ml d'une solution contenant 213 mg de Gamma Globuline Humaine (G4386, Sigma) et 8,6 mg de chlorhydrate de 2-Iminothiolane (Aldrich, 33056-6) dans du tampon carbonate de sodium ( 100 mM, pH 9) sont incubés pendant une heure à
25°C.
Par ailleurs, 20 ml d'une solution contenant 119,8 mg de céphalosporine-C
et 54 mg de sulfosuccinimidyl 4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane-1-carboxylate (sSMCC, 22322 Pierce) dans du tampon carbonate de sodium ( 100 mM, pH 9) sont incubés pendant une heure à 25°C.
Les deux solutions préparées précédemment sont ensuite mélangées. On ajuste le pH de la solution résultante à 7,1 par ajout de 3 ml NaH2P04 500 mM
et l'on incube pendant deux heures à 25°C. Le mélange obtenu après incubation est dialysé trois fois contre 1 litre de tampon phosphate de sodium (10 mM, pH
7,5).
La solution résultante est filtrée sur un filtre à 0,22 um.
3.$.2. Recouvrement des microplaques par l'antibiotique de référénce.
On utilise des microplaques en polystyrène à haute adsorption protéique de la marque NUNK (lmmuno Plate : type Maxisorp) ou de la marque GREINER (en WO 99/67416 PCT/EP99/021b6 microlon 600, référence 705071). Les cuvettes des microplaques sont lavées avec du tampon PBS 150 mM, pH 7,2. Ensuite un aliquot de la solution préparée à
l'exemple 3.3.1. est incubé pendant 24 heures à 4°C dans les cuvettes.
Après incubation, les cuvettes sont lavées trois fois avec du tampon PBS 150 mM, pH
7,2, Tween-20 0,1%. Le tube est alors saturé pendant deux heures à 20°C
avec du ~
tampon de saturation PBS 150 mM, pH 7,2, BSA 5%. Après trois lavages avec du tampon de lavage , les tubes sont séchés et stockés à 4°C à l'abri de l'humidité.
Pour les cuvettes destinées à l'agent de reconnaissance BIaR-CTD-phosphatase alcaline, le tampon. de lavage utilisé est la diéthanolamine 1 M, pH 9,8, MgCl2 0,5 mM; pour les cuvettes destinées à l'agent de reconnaissance BIaR-CTD-peroxydase, le tampon de lavage utilisé est le phosphate de potassium 50 mM, pH 5.
3.4. Détermination de trois antibiotiques dans le lait.
1,4 picomoles d'agent de reconnaissance marqué sont incubés en présence de 100 pl de lait dopé pendant 5 minutes à 47°C. Le lait est transvasé
au moyen d'une pipette dans une cuvette préalablement traitée comme indiqué à l'exemple 2.3. Le lait est alors incubé pendant 2 minutes à 47°C. Après élimination du lait, suivie de deux lavages par du tampon de lavage (cfr, exemple 2.3.2.), 300 ul de tampon contenant le substrat révélateur est incubé pendant 2 minutes dans la cuvette (substrat révélateur pour l'agent de reconnaissance BlaR-CTD-peroxydase:
phosphate de potassium 50 mM, pH 5, ABTS 9,1 mM, H202 0,002%; substrat révélateur pour l'agent de reconnaissance BIaR-CTD-phosphatase alcaline:
diéthanolamine 1 M, pH 9,8, MgCl2 0,5 mM, 4-NPP 10 mM). La plaque est alors placée dans un spectrophotomètre automatique pour plaque ELISA, la longueur d'onde étant fixée à 405 nm.
Ce test permet de détecter les trois antibiotiques pénicilline G, cloxacilline et ceftiofur aux seuils de contrôle exigés par les autorités américaines (pénicilline G à
5 ppb, cloxacilline à 10 ppb et ceftiofur à 50 ppb).
Exemple 4. Détermination des 6 antibiotiques pénicilline G, ampicilline, amoxicilline, cloxacilline, céphapirine et ceftiofur dans le lait.
Cet exemple illustre la détection dans le lait des 6 antibiotiques à noyau (i-lactame contrôlés par les autorités américaines, jusqu'aux normes exigées actuellement par ces autorités. Le test décrit dans cet exemple utilise le récepteur BiaR-CTD sous la forme d'une protéine de fusion avec la phosphatase alcaline ou la peroxydase, et utilise un support se présentant sous la forme d'un tube recouvert.

4.1. Protéine de fusion BIaR-CTD-phosphatase alcaline.
Voir exemple 3.1.
4.2. Support solide: tube recouvert par un antibiotique de référence.
Dans cet exemple, on utilise des tubes en polystyrène à haute adsorption protéique de la marque NUNK (type Maxisorp) traités par une solution d'antibiotique de référence comme indiqué à l'exemple 3.3.2.
4.3. Détermination des 6 antibiotiques dans le lait.
7 picomoles d'agent de reconnaissance sont incubés en présence de 500 pl de lait pendant 5 minutes à 47°C dans un tube Eppendorf. Le lait est alors transvasé au moyen d'une pipette dans un tube traité comme expliqué à
l'exemple 3.2. Le lait est alors incubé pendant 2 minutes à 47°C. Après élimination du lait, le tube est lavé deux fois par 1 ml de tampon diéthanolamine 1 M, pH 9,8, MgCl2 0,5 mM. On ajoute alors 500 ul de tampon contenant le substrat révélateur diéthanolamine 1 M, pH 9,8, MgCl2 0,5 mM, 4-NPP 10 mM et le substrat est incubé
pendant 2 minutes â 47°C. On mesure ensuite l'absorbance du surnageant au moyen d'un spectrophotomètre dont la longueur d'onde est fixée à 405 nm.
Cette méthode permet de déterminer les 6 antibiotiques jusqu'aux normes exigées par les autorités américaines: pénicilline G à moins de 5 ppb;
ampicilline à
moins de 10 ppb; amoxicilline à moins de 10 ppb; cloxacilline à moins de 10 ppb;
céphapirine à moins de 20 ppb; ceftiofur à moins de 50 ppb. 8 3 6 In this example, when the first band has a lower intensity than the second band, the test is considered positive. The results presented in Table 2 show that this test can detect in 5 minutes up to 4 ppb of cloxacillin in a milk sample.
Trials have also been performed with other core antibiotics p-lactam in the same conditions. This test carried out in S minutes allows detect penicillin G up to 3 ppb, amoxicillin up to 4 ppb, ampicillin up to 4 ppb, dicloxacillin up to 8 ppb, oxacillin up to 8 ppb, cephapirin up to 16 ppb, ceftiofur up to 100 ppb, cefquinone less of 20 ppb, nafcillin up to 20 ppb and cefazolin up to 60 ppb in one milk sample.
This test is particularly suitable as a sorting test before unloading milk trucks in the silos.
1.3.3. Test in 9 minutes Six fresh milk samples containing 0, 4, 6, 8, 10 are prepared respectively.
and 12 ppb of cephapirin. Each of these solutions is then analyzed from the way next.

An aliquot of 200 ~ 1 of milk sample and 45.27 ~ 1 of solution is taken.
prepared in Example 1.1.3 which is placed in a glass vial. This mixture is incubated for 7 minutes at 47 ° C. We take a test device that we place vertically in the glass vial so that the first end of the test device is in contact with the mixture and in such a way that the second end rests on the wall of the glass vial. We let the mix on the test device while incubating the assembly for 2 minutes to 47 ° C.
Table 3 below shows the results obtained for the 6 samples tested. An intensity value ranging from 0 to 10 is assigned to bands detected, the value 10 being given for the most intense band and the value 0 being given for the least intense band. According to this scale, we attribute a value of 6 to the reference band. The signal intensity observed in the first band is inversely proportional to the amount of cephapirin present in the sample.
Table 3 Cepha ~ irine Intensity (ppl7) 1st band 2nd band In this example, when the first band has a lower intensity than the second band, the test is considered positive. The results presented in Table 3 show that this test can detect in 9 minutes up to 6 ppb of cephapirin in a milk sample.
Trials have also been performed with other core antibiotics (i-lactam under the same conditions.This test carried out in 9 minutes allows detect penicillin G up to 3 ppb, amoxicillin up to 4 ppb, ampicillin up to 4 ppb, cloxacillin up to 4 ppb, dicloxacillin less than 8 ppb, oxacillin less than 8 ppb, ceftiofur up to 80 ppb, cefquinone less of 20 ppb, nafcillin less than 20 ppb and cefazolin up to 45 ppb in a milk sample.
This test performed in 9 minutes allows to detect all antibiotics currently controlled by the European authorities, up to the limits imposed by these authorities.

1.3.4. Test in 20 minutes Six fresh milk samples are prepared containing respectively 0, 20, 30, 40, 50 and 60 ppb of ceftiofur. Each of these solutions is then analyzed from The following way.
An aliquot of 200 ~ 1 of milk sample and 45.27 ~ 1 of solution is taken.
prepared in Example 1.1.3 which is placed in a glass vial. This mixture is incubated for 18 minutes at 47 ° C. We take a test device that we place vertically in the glass vial so that the first end of 10 test device is in contact with the mixture and in such a way that the second end rests on the wall of the glass vial. We let the mix on the test device while incubating the assembly for 2 minutes to 47 ° C.
Table 4 below shows the results obtained for the 6 samples tested. An intensity value ranging from 0 to 10 is assigned to bands 15 detected, the value 10 being given for the most intense band and the value 0 being given for the least intense band. According to this scale, we attribute a value of 6 to the reference band. The signal intensity observed in the first band is inversely proportional to the amount of Ceftiofur present in the sample.
Table 4 Ceftiofur Intensity (ppb) 1st band 2nd band In this example, when the first band has a lower intensity than in the second band, the test is considered positive. The results presented in Table 4 show that this test can detect in 20 minutes until 30 ppb of ceftiofur in a milk sample.
This test in 20 minutes thus makes it possible to detect in a single test all the antibiotics currently controlled by the European authorities and American, and up to the legal limits imposed by these authorities.

Example 2. Determination of 6 antibiotics in milk.
This example illustrates the detection in the milk of the 6 core antibiotics (i-lactam controlled by the US authorities.) The test described in this example uses the BlaR-CTD receptor as a fusion protein with the (3-lactamase and uses a support in the form of beads magnetic.
2.1. Fusion Protein BlaR-CTD- (3-lactamase.
The fusion protein BIaR-CTD- (3-lactamase is obtained by coupling between the BIaR-CTD receptor (B. JORIS et al., FEMS Microbiology Letters, 107-114, 1990) and Bacillus cereus Zn-3-lactamase (M. Hussain et al.

J. Bact., 164: 1, 223-229, 1985).
The coupling is carried out as follows:
2.1.1. Plasmid construction: 1: 1 coupling was performed between genes from polypeptide BlaR-CTD and β-lactamase: the gene coding for the lactamase has been introduced in phase and behind the BIaR-CTD gene. The plasmid carrying the genetic fusion exhibits resistance to kanamycin. The fusion protein is hereinafter referred to as Fus 1.
2.1.2. Production:
Strain: the plasmid carrying the fused genes was introduced into E. coli.
The clones carrying the recombinant plasmid are selected on LB + Km (50 Ng / ml).
- Selection: the labeling of the cell extract with an antibiotic radioactive monitoring denaturing polyacrylamide gel electrophoresis shows that the most of the protein is produced as a fusion product whose the molar mass is about 50,000. However, post-proteolysis translation seems to dissociate a very small percentage (2%) of these molecules into two distinct activities.
Culture: 500 ml of medium LB + Km (50 Ng / ml) are inoculated from cell recombinant stored at -70 ° C. Preculture is incubated at 37 ° C and agitated one night at 225 rpm. 18 liters of medium LB + Km (50 ~ g / ml) are inoculated with 500 ml of this preculture whose optical density at 600 nm is of 4. The 18 liter culture is stopped when the optical density reaches the value of 6.

2.1.3. Extraction: Immediately after stopping the culture, the cells are filtered and centrifuged. The supernatant of the cell pellet lysed at disintegrator is kept. It contains the FUS1 fusion protein.
2.1.4. Purification:
- Buffers used:
~ Buffer A: 20 mM Tris pH 8.0, 10% Ethylene Glycol, 50 μM DTT;
~ Buffer B: buffer A + NaCl 1M.
The fusion protein is partially purified by ion chromatography and on molecular sieve. After removal of the extract and washing on a column QSFF
(Pharmacia, Upsala) in buffer A, FUS1 is eluted by a linear gradient in buffer B. The active fractions (~ 0.25 M NaCl) are then pooled and deposited on molecular sieve G-100 (Pharmacia, Upsala); they are elected in Buffer A. The average specific activity of the recovered lot is estimated at 30%.
2.1.5. Inhibition of β-lactamase: the fusion protein (9/10 volume) is incubated 50 mM EDTA (1/10 volume) for 45 minutes at 37 ° C. We check inhibition using nitrocele in 10 mM cacodylate buffer pH 6.0. In presence or absence of Zn, the signal must respectively be positive or negative. After inhibition, the effective concentration, measured on the basis of the activity lactamasique is 74 μmol / Nl.
2.2. Solid support: magnetic beads - cephalosporin C (antibiotic reference).
BioMag 4100 particles are available (available from DRG Instrument Gmbh, Marburg, Germany, under the reference AM 4100 B.) whose ends NH2 were activated with glutaraldehyde as follows:
a volume of initial solution of BioMag 4100 particles is rinsed 4 times with using 5 volumes of pyridine buffer O, O1M pH b, 0. The particles are contained in 2.5 volumes of 5% glutaraldehyde in pyridine buffer and are rotated for three hours at room temperature. They are then rinsed 10 times with two volumes of 0.01 M Kpi buffer to pH 7.0. The particles are then resuspended in a volume of 0.1 M cephalosporin C in Kpi buffer and rotated for a night at + 4 ° C. The final rinse is done until complete elimination of the cephalosporin C in 0.1 M Kpi buffer pH 7.0.
2.3. Determination of 6 penicillin G antibiotics, ampicillin, amoxicillin, cloxacillin, cephapirin and ceftiofur in milk.

2.3.1. Solutions used:
solution 1: 700 picomoles of lyophilized fusion protein in 100 mM Tris, pH 8, 1 mg / ml BSA, 50 mM EDTA, 50 μM DTT are rehydrated with 5 ml of water Milli-Q; 50 lrl of this solution are needed to perform a measurement. f solution 2: 2 ml of BioMag-cephalosporin C particles prepared according to the example 1.2 in 100% isopropanol; 20 μl are needed to make a measurement.
solution 3: 10 mM cacodylate buffer, pH 6, freeze-dried 1M NaCl is rehydrated with 500 ml of Milli-Q water.
solution 4: 400 ml of 10 mM nitrocele in DMF are diluted to 40 ml in the solution 3; 400 μl are needed for detection.
2.3.2. Detection method:
50 μl of solution 1 are placed in the presence of 500 ml of samples of milk spiked and incubated at 47 ° C for 2 minutes. 20 μl of solution 2 are put in suspension in the milk which is incubated again for 2 minutes at 47 ° C. The particles are drawn against the wall of the container by means of a magnet paramagnetic while the supernatant is emptied from the tube. The particles are rinsed twice with solution 3 in a similar way with the magnet. Finally, 400 Nl of solution 4 are incubated in the presence of particles for 3 minutes at 47 ° C. The absorbance of the solution is then measured residual at 482 nm with respect to the nitrocele solution.
This process makes it possible to detect the 6 antibiotics included in the US regulations at concentrations below imposed standards by the authorities, namely penicillin at 5 ppb, ampicillin at 10 ppb, amoxicillin at 10 ppb, cloxacillin at 10 ppb, cephapirin at 20 ppb and the ceftiofur at 50 ppb.
Example 3. Determination of 3 antibiotics (penicillin G, cloxacillin, ceftiofur) in the milk.
This example illustrates the detection in milk of 3 core antibiotics p-lactam controlled by the health authorities. The test described in this example uses the BIaR-CTD receptor in the form of two fusion proteins with the alkaline phosphatase and peroxidase, respectively, and uses a carrier himself presenting in the form of a microplate.

3.1. BIaR-CTD-alkaline phosphatase fusion protein.
The BIaR-CTD-alkaline phosphatase fusion protein is obtained by chemical coupling between the BlaR-CTD receptor (B. DORIS et al., FEMS
Microbiology Letters, 107-114, (1990)) and activated alkaline phosphatase available from Boehringer Mannheim Biochemica under the reference 1464752.
The coupling is carried out as follows:
3.1.1. Conjugation: BIaR-CTD and alkaline phosphatase are dialysed in 100 mM carbonate / sodium hydrogencarbonate buffer at pH 9.8.
15 nanomoles of BlaR-CTD are incubated in the presence of 100 ~ 1 of phosphatase activated alkaline (20 mg / ml) for two hours at 25 ° C.
3.1.2. Stopping the reaction: 40 Nl of a solution of triethanolamine is added at 2 mM, pH 8, then 50 μl of a 200 mM sodium borohydride solution. The mixture is incubated for 30 min. at + 4 ° C. 25 gl of a solution of 2 mM triethanolamine, pH 8, and the mixture is again incubated 2 hours at + 4 ° C.
3.1.3. Stabilization of the coupling: one adds 10 Nl of a solution of glycine to 1M, pH 7.0.
3.1.4. Transfer in the storage buffer: The reaction mixture (approximately 300 μl) is dialyzed three times 8 hours against 0.5 liter of buffer triethanolamine 50 mM, pH 7.6, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl 2, 0.5 mM ZnCl 2, 10 mM glycine + 4 ° C.
3.1.5. Final title: the final title of the coupling is of the order of 50 pmol of Biar-CTD
active by ~ 1 of solution.
3.2. BIaR-CTD-peroxidase fusion protein The BIaR-CTD-peroxidase fusion protein is obtained by coupling between the BIaR-CTD receptor (B. DORIS et al., FEMS Microbiology Letters, 107-114, (I990)) and activated peroxidase available from Boehringer Mannheim Biochemica under the reference 1428861.
The coupling is carried out as follows:
3: 2.1. Conjugation: BIaR-CTD and peroxidase are dialyzed in buffer 100 mM sodium carbonate / hydrogen carbonate at pH 9.8. 40 nanomoles of BIaR-CTD are incubated in the presence of 100 μl of activated peroxidase (16 mg / ml) for two hours at 25 ° C.
3.2.2. Stopping the reaction: 40 Nl of a solution of triethanolamine is added at 2mM, pH 8, then 50 ~ 1 of a 200mM sodium borohydride solution. Lek mixture is incubated for 30 min. at + 4 ° C. 25 Nl of one solution of 2 mM triethanolamine, pH 8, and then the mixture is incubated again for 2 minutes.
hours at + 4 ° C.
3.2.3. Stabilization of the coupling: 10 μl of a glycine solution is added at 1M, pH 7.0.
3.2.4. Transfer in the storage buffer: The reaction mixture (approximately 400 μl) is dialyzed three times 8 hours against 0.5 liter of phosphate buffer of 10 mM potassium, pH 7.5, 200 mM NaCl, 10 mM glycine at + 4 ° C.
3.2.5. Final title: the final title of the coupling is of the order of 100 pmol of BlaR-CTD
active by solution ul.
3.3. Solid support: microplate-cephalosporin C.
3.3.1. Preparation of the reference antibiotic solution.
8 ml of a solution containing 213 mg of human gamma globulin (G4386, Sigma) and 8.6 mg of 2-Iminothiolane hydrochloride (Aldrich, 33056-6) in sodium carbonate buffer (100 mM, pH 9) are incubated for one hour at 25 ° C.
In addition, 20 ml of a solution containing 119.8 mg of cephalosporin-C
and 54 mg of 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate sulfosuccinimidyl (sSMCC, 22322 Pierce) in sodium carbonate buffer (100 mM, pH 9) are incubated for one hour at 25 ° C.
The two solutions prepared previously are then mixed. We adjust the pH of the resulting solution to 7.1 by adding 3 ml 500 mM NaH2PO4 and incubated for two hours at 25 ° C. The mixture obtained after incubation is dialyzed three times against 1 liter of sodium phosphate buffer (10 mM, pH
7.5).
The resulting solution is filtered on a 0.22 μm filter.
3. $. 2. Overlay of microplates by reference antibiotic.
Polystyrene microplates with high protein adsorption of the brand NUNK (lmmuno Plate: type Maxisorp) or the brand GREINER (in WO 99/67416 PCT / EP99 / 021b6 microlon 600, reference 705071). The cuvettes of the microplates are washed with 150 mM PBS buffer, pH 7.2. Then an aliquot of the solution prepared for Example 3.3.1. is incubated for 24 hours at 4 ° C in the cuvettes.
After incubation, the cuvettes are washed three times with 150 mM PBS buffer, pH
7.2 Tween-20 0.1%. The tube is then saturated for two hours at 20 ° C.
with ~
150 mM PBS saturation buffer, pH 7.2, 5% BSA. After three washes with washing buffer, the tubes are dried and stored at 4 ° C away from moisture.
For bowls intended for BIaR-CTD-recognition agent alkaline phosphatase, the buffer. washing used is 1 M diethanolamine, pH 9.8, 0.5 mM MgCl 2; for cuvettes for the recognition officer BIaR-CTD-peroxidase, the washing buffer used is potassium phosphate 50 mM, pH 5.
3.4. Determination of three antibiotics in the milk.
1.4 picomoles of labeled recognition agent are incubated in the presence 100 μl of milk spiked for 5 minutes at 47 ° C. The milk is decanted thanks to of a pipette in a bowl previously treated as indicated in the example 2.3. The milk is then incubated for 2 minutes at 47 ° C. After milk elimination, followed by two washes with washing buffer (cf. Example 2.3.2), 300 ul of buffer containing the developer substrate is incubated for 2 minutes in the cuvette (revealing substrate for BlaR-CTD-recognition agent) peroxidase:
50 mM potassium phosphate, pH 5, 9.1 mM ABTS, 0.002% H 2 O 2; substratum developer for the BIaR-CTD alkaline phosphatase recognition agent:
1 M diethanolamine, pH 9.8, 0.5 mM MgCl 2, 4-MPP 10 mM). The plate is then placed in an automatic spectrophotometer for ELISA plate, the length wavelength being set at 405 nm.
This test can detect the three antibiotics penicillin G, cloxacillin and ceftiofur at the control thresholds required by the US authorities (penicillin G to 5 ppb, 10 ppb cloxacillin and 50 ppb ceftiofur).
Example 4. Determination of 6 penicillin G antibiotics, ampicillin, amoxicillin, cloxacillin, cephapirin and ceftiofur in milk.
This example illustrates the detection in the milk of the 6 core antibiotics (i-lactam controlled by US authorities, up to the required standards currently by these authorities. The test described in this example uses the receiver BiaR-CTD in the form of a fusion protein with alkaline phosphatase or the peroxidase, and uses a support in the form of a tube covered.

4.1. BIaR-CTD-alkaline phosphatase fusion protein.
See example 3.1.
4.2. Solid support: tube covered by a reference antibiotic.
In this example, high-adsorption polystyrene tubes are used protein of the NUNK brand (Maxisorp type) treated with a solution Reference antibiotic as indicated in Example 3.3.2.
4.3. Determination of 6 antibiotics in the milk.
7 picomoles of recognition agent are incubated in the presence of 500 μl of milk for 5 minutes at 47 ° C in an Eppendorf tube. The milk is so transferred by pipette into a treated tube as explained in The example 3.2. The milk is then incubated for 2 minutes at 47 ° C. After milk elimination, the tube is washed twice with 1 ml of 1 M diethanolamine buffer, pH 9.8, MgCl2 0.5 mM. 500 μl of buffer containing the developer substrate is then added 1 M diethanolamine, pH 9.8, 0.5 mM MgCl 2, 10 mM 4-NPP and the substrate is incubated for 2 minutes at 47 ° C. The absorbance of the supernatant is then measured at medium of a spectrophotometer whose wavelength is fixed at 405 nm.
This method makes it possible to determine the 6 antibiotics up to the standards required by US authorities: penicillin G at less than 5 ppb;
ampicillin to less than 10 ppb; amoxicillin less than 10 ppb; cloxacillin less than 10 ppb;
cephapirin less than 20 ppb; ceftiofur at less than 50 ppb.

Claims

1. Method for detecting an antibiotic or core antibiotics .beta.-lactam in a biological fluid comprising the following steps:
(a) bringing a determined volume of said biological fluid into contact with a quantity of recognition agent and the incubation of the mixture thus obtained under conditions allowing the complexation of the antibiotic or of the antibiotics possibly present in said biological fluid with the agent of recognition, (b) bringing the mixture obtained in step a) into contact with at least one reference antibiotic immobilized on a support, under conditions allowing the complexation of the reference antibiotic with the quantity of recognition agent which has not reacted in step a) with the antibiotic Where antibiotics present in the body fluid, and (c) detecting the antibiotic or antibiotics by determining the amount of recognition agent bound to the reference antibiotic immobilized on the support in step b), characterized in that the recognition agent comprises a receptor susceptible to .beta.-lactam nucleus antibiotics obtained from Bacillus licheniformis, said receptor being the BlaR receptor or the BlaR-CTD;
characterized in that the amount of recognition agent brought into contact with the reference antibiotic in step b) is inversely proportional to the quantity of antibiotics possibly present in said liquid organic; and characterized in that the antibiotic or antibiotics are detected in 5 minutes or less.

2. Method according to claim 1, characterized in that the receiver sensitive to .beta.-lactam nucleus antibiotics is coupled to a labeling chosen from colloidal metal particles, particles colloids of selenium, carbon, sulfur or tellurium, and particles colloidal colored synthetic latex.

3. Method according to claim 1, characterized in that the receiver sensitive to .beta.-lactam nucleus antibiotics is coupled to a marking which is a fluorescent substance.

4. Method according to claim 1, characterized in that the receiver sensitive to .beta.-lactam nucleus antibiotics is coupled to a marking which is an enzyme.

5. Method according to claim 4, characterized in that the enzyme is selected from the group consisting of alkaline phosphatase, peroxidases, and .beta.-lactamases.

6. Method according to claim 4 or 5, characterized in that the receiver susceptible to antibiotics is coupled to the enzyme labeling agent by chemical or genetic way.

7. Method according to any one of claims 2 to 6, characterized in what the coupling of the .beta.-core antibiotic-sensitive receptor lactam to the marking agent takes place before step a).

8. Method according to any one of claims 2 to 6, characterized in what the coupling of the .beta.-core antibiotic-sensitive receptor lactam to the labeling agent takes place during or after step a).

9. Method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that steps a) or b) take place simultaneously.

10. Method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the support used in step b) is chosen from tubes, plates and rods covered with a reference antibiotic.

11. Method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the support used in step b) is a test device comprising a solid support (1) which has a first and a second end, on which are fixed, successively, starting from the first end, - a membrane (2) allowing the purification of the biological liquid, - a membrane (3) on which one or more reference antibiotics is or are immobilized, and - an absorbent membrane (4).

12. Method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the support used in step b) consists of a set of balls magnetic or non-magnetic.

13. Test kit for detection of antibiotics in liquid biological by the method according to any one of claims 1 to 12, comprising at least one antibiotic-sensitive recognition agent at .beta.-lactam nucleus obtained from Bacillus licheniformis, and at least one reference antibiotic immobilized on a support.