CN100334228C - 嵌合免疫调制化合物及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供免疫调制化合物和使用此免疫调制化合物对个体进行免疫调制的方法。
Description
相关专利申请的交叉引用
本申请书要求编号60/299,833的临时专利申请(2001年6月21日提交)和编号60/375,253的临时专利申请(2002年4月23日提交)的权益,它们的全部内容为所有目的被并入此处作为参考。
技术领域
本发明涉及含有核酸和非核酸结构部分的嵌合免疫调制化合物(“CIC”),同时涉及利用这类化合物调制免疫应答。本发明可应用在生物医学和免疫学领域。
发明背景
本节中提及到文献时不应理解为表示此文献是本发明的现有技术。
由感染或其他抗原攻击引起的免疫应答的类型一般可通过此应答中涉及的T辅助(Th)细胞的亚型来区别。Th1亚型负责经典的细胞介导的功能,如迟发型超敏反应和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活,而Th2亚型作为B-细胞激活的辅助细胞更加有效。针对抗原的免疫应答的类型一般受到应答抗原的细胞所产生的细胞因子的影响。据信,Th1和Th2细胞所分泌的细胞因子之间的差异可以反映这两种亚型的不同生物功能。实例参见Romagnani(2000)Ann.Allergy Asthma Imunol.85:9-18。
由于Th1亚型分泌可激活CTL的IL-2和IFN-γ,因此它尤其适于应答病毒感染、细胞内病原体和肿瘤细胞。而Th2亚型可能更适于对游离活细菌和蠕虫类寄生虫产生应答并可调制变态反应,这是因为IL-4和IL-5据知分别可诱导IgE合成和嗜酸性粒细胞活化。一般来说,Th1和Th2细胞可分泌不同模式的细胞因子,由此一种应答可以调制另一种应答的活性。举例来说,Th1/Th2平衡的变化可导致变态反应,或者,作为替代,可导致增强的CTL反应。
一段时间以来人们已认识到,通过施用某些免疫调制多核苷酸可在哺乳动物体内诱导出Th1型免疫应答。免疫调制多核苷酸包括称为免疫刺激序列(“ISS”)的序列,其中通常包含CG二核苷酸。实例参见PCT出版物WO98/55495,WO97/28259,U.S.Pat.Nos.6,194,388和6,207,646;及Krieg等(1995)Nature374:546-49。对许多感染性疾病,如结核病和疟疾来说,Th2型应答几乎没有抗感染的防护价值。蛋白质疫苗一般诱导Th2型免疫应答,其特征是高效价的中和抗体但不具备明显的细胞介导的免疫。而且,一些类型的抗体应答不适于某些适应症,最显著地是在变态反应中,IgE抗体应答能够导致过敏性休克。
鉴于对改进的免疫治疗方法的需要,有必要鉴定可用于调制免疫应答的化合物。
发明公开
一方面,本发明涉及具有免疫调制活性的嵌合化合物。本嵌合免疫调制化合物(“CIC”)一般含有一个或多个核酸结构部分(nucleic acidmoiety)和一个或多个非核酸结构部分(non-nucleic acid moiety)。含有一个以上核酸结构部分的CIC中的核酸结构部分可以是相同或是不同的。含有一个以上非核酸结构部分的CIC中的非核酸结构部分可以是相同或是不同的。因此,在一个实施方案中CIC包含两个或更多个的核酸结构部分和一个或多个的非核酸间隔体(spacer)结构部分,其中至少有一个非核酸间隔体结构部分与两个核酸结构部分共价连接。在一个实施方案中,至少一个核酸结构部分含有序列5’-CG-3’。在一个实施方案中,至少一个核酸结构部分含有序列5’-TCG-3’。
一方面,本发明提供了一种嵌合免疫调制化合物,它具有式“N1-S1-N2”的核心结构,其中N1和N2是核酸结构部分而S1是非核酸间隔体结构部分,并且此CIC显示出免疫调制活性。在一个实施方案中,核心结构是“N1-S1-N2-S2-N3”,其中N3是核酸结构部分而S2是非核酸间隔体结构部分。在一个实施方案中,CIC具有“N1-S1-N2-S2-[Nv-Sv]A”的核心结构,其中A是1至100的整数,[Nv-Sv]A表示与非核酸间隔体结构部分缀合的核酸结构部分的A次额外重复,其中S和N在每个[Nv-Sv]重复中都是独立地选择的。在一个实施方案中,A至少是2,而且CIC中至少4个核酸结构部分具有不同序列。
一方面,CIC含有式N1-S1-N2或N1-S1-N2-S2-N3的核心结构(其中N1,N2和N3是核酸结构部分,S1和S2是非核酸间隔体结构部分,并且S1和S2共价结合正好两个核酸结构部分)。可例举的这种CIC有含有式(5’-N1-3’)-S1-N2的核心结构的CIC。在一个实施方案中,N1具有序列5’-TCGAX-3’,其中X是0-20个核苷酸碱基(SEQ ID NO:1)。在一个实施方案中,X是0-3个核苷酸碱基。在一个实施方案中,X是CGT。在另一个实施方案中N1具有序列5’-TCGTCGA-3’。在一个实施方案中,CIC具有结构N1-S1-N2-S2-[Nv-Sv]A(其中A是1至100的整数,[Nv-Sv]A表示与非核酸间隔体结构部分缀合的核酸结构部分的A次额外重复,其中S和N在每个[Nv-Sv]重复中都是独立地选择的)。在一个实施方案中,A是1至3。
另一方面,本发明提供具有式[Nv]A---Sp的核心结构的CIC,其中Sp是与“A”个独立选择的核酸结构部分,即Nv,共价结合的多价间隔体,其中A至少是3,且所述CIC显示出免疫调制活性。在一个实施方案中,CIC具有核心结构[Sv-Nv]A---Sp,其中Sp是与“A”个独立选择的元件,即[Sv-Nv],共价结合的多价间隔体,而独立选择的元件[Sv-Nv]中包括与核酸结构部分共价结合的间隔体结构部分,而且其中A至少是3。在一个实施方案中,A为3至50。在另外一个实施方案中,A大于50。在一个实施方案中,CIC中至少有2个、3个或4个核酸结构部分具有不同序列。
一方面,CIC含有式[Nv]A-Sp或[Sv-NV]A-Sp的核心结构(其中Sp是与A个独立选择的核酸结构部分Nv或独立选择的元件[Sv-Nv]共价结合的多价间隔体,每个独立选择的元件[Sv-Nv]都含有与核酸结构部分共价结合的间隔体结构部分,而且其中A至少是3)。在实施方案中,A从3至约50或者从约50至约500。在一个实施方案中,Sp包含树状体(dendrimer)。在一个实施方案中,CIC的核酸结构部分具有选自如下的序列:TCGXXXX,TCGAXXX,XTCGXXX,XTCGAXX,TCGTCGA,TCGACGT,TCGAACG,TCGAGAT,TCGACTC,TCGAGCG,TCGATTT,TCGCTTT,TCGGTTT,TCGTTTT,TCGTCGT,ATCGATT,TTCGTTT,TTCGATT,ACGTTCG,AACGTTC,TGACGTT,TGTCGTT,TCGXXX,TCGAXX, TCGTCG, AACGTT, ATCGAT, GTCGTT, GACGTT,TCGXX,TCGAX,TCGAT,TCGTT,TCGTC,TCGA,TCGT,TCGX和TCG(其中“X”是任意核苷酸)。
另一方面,本发明提供具有式“N1-S1”的核心结构的CIC,其中N1是核酸结构部分而S1是非核酸间隔体结构部分,且此CIC显示出免疫调制活性。
CIC可包含如下非核苷酸间隔体结构部分,该结构部分含有如三聚乙二醇(三甘醇)、六聚乙二醇(六甘醇)、含有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯连接的低聚乙二醇结构部分的聚合物、C2-C10烷基(如,丙基、丁基、己基)、丙三醇或修饰的丙三醇(如,在1,2或3羟基位置衍生得到的丙三醇;如,3-乙酰丙酰基(levulinyl)-丙三醇)、季戊四醇或修饰的季戊四醇(在任何羟基位置经过修饰的季戊四醇,如“三倍增体(trebler)”)、2-(羟甲基)乙基、1,3-二氨基-2-丙醇、脱碱基核苷酸、多糖(如交联多糖)、树状体和/或其他本文公开的间隔体结构部分组成成分的各种组合。
在多种实施方案中,如上所述的CIC具有一种或多种下列特征:(i)CIC包括至少一个长度小于8个核苷酸(或碱基对)或者长度小于7个核苷酸的核酸结构部分;(ii)CIC中的全部核酸结构部分的长度都小于8个核苷酸,或者小于7个核苷酸;(iii)CIC包括至少一个含有序列5’-CG-3’的核酸结构部分(如,5’-TCG-3’);(iv)CIC包括至少两个具有不同序列的核酸结构部分;(v)CIC中的全部核酸结构部分具有相同序列;(vi)CIC包括至少一个如下非核酸间隔体结构部分,该部分是或含有三聚乙二醇、六聚乙二醇、丙基、丁基、己基、丙三醇或修饰的丙三醇(如,在1,2或3羟基位置衍生得到的丙三醇;如,3-乙酰丙酰基-丙三醇)、季戊四醇或修饰的季戊四醇(在任何羟基位置经过修饰的季戊四醇,如“三倍增体”)、2-(羟甲基)乙基、1,3-二氨基-2-丙醇、脱碱基核苷酸、多糖(如交联多糖)或树状体。在一些实施方案中,间隔体结构部分不是多肽。
在多种实施方案中,此处所述CIC具有一种或多种下列特征:(vii)CIC包括至少一个不具有“独立免疫调制活性”的CIC核酸结构部分;(viii)CIC不包括具有“独立免疫调制活性”的核酸结构部分;(ix)CIC包括至少一个具有“次独立免疫学活性”的CIC核酸结构部分。“独立免疫调制活性”和“次独立免疫学活性”参见本文描述。在多种实施方案中此处所述CIC包括至少一个具有双链或部份双链的核酸结构部分。可设计具有自身互补性核酸结构部分的CIC以便形成双螺旋。实例参见C-84、C-85、和C-87。
因此,在多个方面,本发明提供了包含两个或更多个核酸结构部分和一个或多个非核酸间隔体结构部分的CIC,其中至少一个间隔体结构部分与两个核酸结构部分共价连接且至少一个核酸结构部分含有序列5’-CG-3’,且其中所述CIC具有免疫调制活性。CIC可包含至少三个核酸结构部分,其中每个核酸结构部分与至少一个非核酸间隔体结构部分共价连接。CIC可具有至少一种免疫调制活性,如(a)刺激人外周血单核细胞产生IFN-γ的能力;(b)刺激人外周血单核细胞产生IFN-α的能力;和/或(c)刺激人B细胞增殖的能力。
CIC中的一个或多个核酸结构部分可包含诸如5’-TCGA-3’,5’-TCGACGT-3’,5’-TCGTCGA-3’和5’-ACGTTCG-3’这样的序列。在一个实施方案中,CIC中的一个或多个核酸结构部分可具有序列5’-X1X2CGX3X4-3’(其中X1是0至10个核苷酸;X2是空缺或是A、T或U;X3是空缺或是A;X4是0至10个核苷酸;且其中该核酸结构部分与间隔体结构部分缀合,如在3’末端缀合)。在一个实施方案中,X1、X2、X3和X4中的核苷酸总数可以小于8、小于7、小于6、小于5、或小于4。在一些实施方案中,CIC中的一个或多个核酸结构部分可具有诸如下列序列这样的核酸序列:TCGXXXX,TCGAXXX,XTCGXXX,XTCGAXX,TCGTCGA,TCGACGT,TCGAACG,TCGAGAT,TCGACTC,TCGAGCG,TCGATTT,TCGCTTT,TCGGTTT,TCGTTTT,TCGTCGT,ATCGATT,TTCGTTT,TTCGATT,ACGTTCG,AACGTTC,TGACGTT,TGTCGTT,TCGXXX, TCGAXX,TCGTCG,AACGTT, ATCGAT, GTCGTT, GACGTT, TCGXX, TCGAX,TCGAT,TCGTT, TCGTC, TCGA, TCGT,TCGX或TCG(其中“X”是任何核苷酸)。
在一个实施方案中,一个或多个核酸结构部分包含3至7个碱基。在一个实施方案中,核酸结构部分包含3至7个碱基且具有序列5’-[(X)0-2]TCG[(X)2-4]-3’,或5’-TCG[(X)2-4]-3’,或5’-TCG(A/T)[(X)1-3]-3’,或5’-TCG(A/T)CG(A/T)-3’,或5’-TCGACGT-3’或5’-TCGTCGA-3’,其中每个X都是独立地选择的核苷酸。在一些实施方案中,CIC包含至少3、至少10、至少30或至少100个具有如上所述序列的核酸结构部分。
CIC可包括至少一个长度小于8个核苷酸的核酸结构部分。任选地CIC中的所有核酸结构部分都小于8个核苷酸长。在一些实施方案中,CIC中含有序列5’-CG-3’的所有核酸结构部分都小于8个核苷酸长。CIC可包括至少两个具有不同序列的核酸结构部分。CIC可包含至少一个不含有序列5’-CG-3’的核酸结构部分。CIC可包括至少一个不具有独立免疫学活性或具有次独立免疫学活性的核酸结构部分。任选地CIC中没有一个核酸结构部分具有独立免疫调制活性。核酸结构部分中核苷酸之间的连接可包括磷酸二酯键、硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、其他共价键及其混合。同样,核酸结构部分和间隔体结构部分之间的连接或间隔体结构部分的组成成分之间的连接可包括磷酸二酯键、硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、其他键及其混合。
在一个实施方案中,CIC包括反应性连接基团(如,反应性含硫基团)。CIC可与多肽,如多肽抗原键合或非共价结合。
本发明还提供包含CIC以及可药用赋形剂和/或抗原和/或阳离子微载体(如乳酸和羟基乙酸的聚合物)的组合物。此组合物可基本上不含内毒素。
一方面,本发明提供一种组合物,它含有此处所述的CIC以及可药用赋形剂、抗原(例如,需要引起针对其的免疫应答的抗原)或两者。在一个实施方案中,组合物根据GMP标准进行配制。在一个实施方案中,组合物通过包括检测组合物中内毒素存在的方法进行制备。在一个实施方案中,组合物基本不含内毒素。在一个实施方案中,组合物不含脂质体。
一方面,本发明提供了此处所述CIC在药物制备中的用途。
一方面,本发明提供了一种调制个体免疫应答的方法,其通过施用本文所述的嵌合免疫调制化合物或组合物来实施,其中施用的量为足以调制个体的免疫应答的量。在一个实施方案中,所述个体患有与Th2型免疫应答相关的病症,如,变态反应或变态反应引起的哮喘。在一个实施方案中,所述个体患有感染性疾病。
一方面,本发明提供了增加个体中的干扰素γ(IFN-γ)的方法,其通过施用本文所述CIC或组合物来实施,其中施用的量为足以增加此个体的IFN-γ的量。在一个实施方案中,所述个体患有炎症。在一个实施方案中,所述个体患有特发性肺纤维化。
一方面,本发明提供了一种增加个体中的干扰素α(IFN-α)的方法,其通过施用本文所述CIC或组合物来实施,其中施用的量为足以增加此个体的IFN-α的量。在一个实施方案中,所述个体患有病毒感染。
一方面,本发明提供了通过给个体施用有效量的本文所述CIC或组合物改善个体的感染性疾病症状的方法,其中有效量是指足以改善感染性疾病症状的量。
一方面,本发明提供了通过给患有IgE相关病症的个体施用有效量的本文所述CIC或组合物来改善个体的IgE相关病症的方法,其中有效量是指足以改善IgE相关病症的症状的量。在一个实施方案中,IgE相关病症是变态反应或变态反应相关病症。
本发明还提供通过给个体施用CIC调制个体的免疫应答的方法,其中施用的量为足以调制所述个体中的免疫应答的量。在实施方案中,所述个体患有癌症和/或患有Th2型免疫应答相关病症(例如,变态反应或变态反应引起的哮喘)和/或患有感染性疾病。
附图简述
图1显示的是可用于合成CIC的非核酸间隔体结构部分的某些试剂的结构。所示的是用于HEG、丙基、TEG、HME、丁基和脱碱基间隔体结构部分的二甲氧基三苯甲基保护的亚磷酰胺间隔体结构部分前体。
图2显示的是可用于合成对称或非对称的CIC非核酸间隔体结构部分的某些试剂的结构。所示的是用于丙三醇[2](“对称分支”)、乙酰丙酰基-丙三醇[3](“不对称分支”)、“三倍增体”[9]和“对称双倍增体(doubler)”[10]间隔体结构部分的二甲氧基三苯甲基保护的亚磷酰胺间隔体结构部分前体。
图3A和3B图解分支CIC的合成。
图4显示的是C-105的合成方案。
图5显示的是用CIC进行鼻内处理之后小鼠肺中免疫相关基因的诱导。
图6A-C显示的是CIC对IL-12 p40(图6A),IL-6(图6B),和TNF-α(图6C)水平的影响。
图7A-B显示的是C-8(图7A)和C-101(图7B)的结构。
发明实施方式
I.一般方法
除非另有说明,本发明的实施将使用本领域内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学、及免疫学的常规技术。这些技术在文献中有充分说明,所述文献如分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第二版(Sambrook等,1989)和分子克隆:实验室手册,第三版(Sambrook和Russel,2001),(联合和单独地在本文中称为 Sambrook”);寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait,ed.,1984);动物细胞培养(AnimulCell Culture)(R.I.Freshney,ed.,1987);实验免疫学手册(Handbook ofExperimental Immunology)(D.M.Weir&C.C.Blackwell,eds);哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transer Vectors for Mammalian Cells)(J.M.Miller&M.P.Calos,eds.,1987);现代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987,包括直至2001年的增刊);PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase ChainReaction),(Mullis et al.,eds.,1994);现代免疫学方法(Cnrrent Protocols inImmunology)(J.E.Coligan et al.,eds.,1991);免疫实验手册(TheImmunoassay Handbook)(D.Wild,ed.,Stockton Press NY,1994);生物缀合技术(Bioconjugate Techniques)(Greg T.Hermanson,ed.,AcademicPress,1996);免疫分析方法(Methods of Immunological Analysis)(R.Masseyeff,W.H.Albert,和N.A.Staines,eds.,Weinheim:VCH Verlagsgesellschaft mbH,1993);Harlow和Lane(1988)抗体,实验室手册(Antibodies,A Laboratory Manual),Cold Spring Harbor Publications,New York,及Harlow和Lane(1999)利用抗体,实验室手册(UsingAntibodies:A Laboratory Manual),Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,NY(联合和单独地在本文中称为“Harlow和Lane”);Beaucage etal.eds.,现代核酸化学方法(Current Protocols in Nucleic AcidChemistry)John Wiley&SohS,Inc.,New York,2000);以及Agrawal,ed.,用于寡核苷酸和类似物的方法,合成及性质(Protocols for Oligonucleotidesand Analogs,Synthesis and Properties)Humana Press Inc.,New Jersey,1993)。
II.定义
除非另有说明或从上下文显见,本文中所用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数形式。例如,可从上下文显见,“a”嵌合免疫调制化合物(“CIC”)可包括一种或多种CIC。同样,以单数形式提及的CIC组成元件(即,核酸结构部分或非核酸间隔体结构部分)可包括多个元件。例如,CIC中的“核酸结构部分”的表述也可表示CIC中的两个或多个“核酸结构部分”。
本文中可互换使用的术语″多核苷酸″、″寡核苷酸″和“核酸”包括单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、单链RNA(ssRNA)和双链RNA(dsRNA)、修饰的寡核苷酸和寡核苷或其组合。核酸可为线性或环状构型,或寡核苷酸可同时包含线性和环状区段。核酸为核苷的聚合物,其中核苷通过例如磷酸二酯键或其它键如硫代磷酸酯键连接。核苷由与糖键接的嘌呤(腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)或它们的衍生物)或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)或它们的衍生物)碱基组成。在DNA中这四种核苷单元(或碱基)称为脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷和脱氧胞苷。核苷酸为核苷的磷酸酯。
术语″3_通常是指多核苷酸或寡核苷酸中的一个区域或位置位于此同一多核苷酸或寡核苷酸中的另一区域或位置的3′(下游)。
术语″5_通常是指多核苷酸或寡核苷酸中的一个区域或位置位于此同一多核苷酸或寡核苷酸中的另一区域或位置的5′(上游)。
当一个元件(如区域、部分(portion)、非核酸间隔体结构部分、核酸结构部分或序列)与另一个元件(如区域、部分(portion)、非核酸间隔体结构部分、核酸结构部分或序列)直接毗连时,则两者“邻近”。
术语“CIC-抗原缀合物”是指其中CIC和抗原相连接的复合体。所述缀合物的连接包括共价和/或非共价连接。
术语“抗原”指的是可被抗体或T细胞抗原受体特异性识别和结合的物质。抗原可包括肽、蛋白质、糖蛋白、多糖、复合糖、糖、神经节苷脂、脂类和磷脂;它们的部分和组合。抗原可以是天然的或者是合成的。适于与CIC一起施用的抗原包括能够引起B细胞或T细胞抗原特异性应答的任何分子。优选的是,抗原能引起特异性针对此抗原的抗体应答。半抗原包括在“抗原”范围内。半抗原是一种低分子量的化合物,它自身不具有免疫原性,但当它与含有抗原决定簇的免疫原性分子缀合时则可产生免疫原性。为使小分子产生抗原性,可能需要对小分子进行半抗原化。优选地,本发明抗原包括肽、脂类(如固醇、脂肪酸和磷脂)、多糖(如用于流感嗜血杆菌(Hemophilus influenza)疫苗中的那些多糖)、神经节苷脂和糖蛋白。
″佐剂″是指这样的物质,当其加入免疫原性剂如抗原中时可非特异增强或加强受者宿主暴露于该混合物后对该免疫原性剂的免疫应答。
术语″肽″为具有足以实现生物应答如抗体产生或细胞因子活性的长度和组成的多肽,而不管该肽是否为半抗原。一般,肽长至少为6个氨基酸残基。术语″肽″还包括修饰的氨基酸(天然或非天然存在的),此类修饰包括但不限于磷酸化、糖基化、PEG化(pegylation)、脂化和甲基化。
″抗原肽″可包括纯化的天然肽、合成肽、重组肽、粗肽提取物、或部分纯化的或未纯化的活性状态的肽(例如,属于减毒或灭活的病毒、细胞、微生物的一部分的肽)、或此类肽的片段。″抗原肽″或″抗原多肽″因此指显示出一种或多种抗原特性的多肽的全部或部分。这样,如″Amb a1抗原多肽″或″Amb a1多肽抗原″为来自Amb a1的显示出抗原特性(即特异性结合抗体或T细胞受体)的氨基酸序列,不管其是否为全长序列、序列的一部分和/或序列的修饰物。
″递送分子″或″递送载体″为利于、允许和/或增加CIC、CIC-抗原混合物或CIC-抗原缀合物递送至特定位点和/或在特定时间递送的化学结构部份。递送载体可以或不可以额外刺激免疫应答。
″针对抗原的变态反应″是指这样的免疫应答,其通常的特征在于嗜酸性粒细胞(常在肺中)和/或抗原特异性IgE的产生以及它们所导致的影响。如本领域熟知的那样,IgE结合肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的IgE受体。当随后暴露于IgE所识别的抗原时,该抗原将与肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的IgE交联,引起这些细胞脱粒,包括但不限于释放组胺。应理解并认识到在本发明一些方法的应用中,术语″针对抗原的变态反应″、″变态反应″和″变应性疾病″同等地适用。而且,应理解并认识到本发明的方法包括那些同样适用于防止变态反应及治疗已存在的变应性疾病的方法。
如此处所用,术语″变应原″是指暴露于对象后可引起变态反应的抗原或分子的抗原性部分,通常为蛋白质。一般地对象对变应原具变应性,这可以如通过水疱和潮红试验或任一本领域已知的方法指示。即使对象中只有一小群在暴露于分子后显示出变应性(例如IgE)免疫应答,该分子也被称为变应原。许多分离的变应原为本领域公知。它们包括但不限于此处表1中所提供的变应原。
术语″脱敏″是指给显示出对变应原具敏感性的对象施用渐增剂量的变应原的方法。用于脱敏的变应原剂量的实例为本领域公知,参见如Fornadley(1998)Otolaryngol.Clin.North Am.31:111-127。
″抗原特异的免疫治疗″是指涉及到抗原并可对免疫应答产生抗原特异性调制作用的任何免疫治疗形式。在变态反应中,抗原特异性免疫治疗包括但不限于脱敏治疗。
术语″微载体″是指不溶于水的微粒组合物,其尺寸小于约150、120或100μm,更通常小于约50-60μm,并可以小于约10μm或甚至小于约5μm。微载体包括″毫微载体″,其为尺寸小于约1μm,优选地小于约500nm的微载体。微载体包括固相粒子如由生物相容的天然聚合物、合成聚合物或合成共聚物形成的粒子,但此处定义的微载体及其它本领域公知的可生物降解材料可包括或不包括由琼脂糖或交联琼脂糖形成的微载体。固相微载体由在哺乳动物生理条件下不易蚀的和/或不可降解的聚合物或其它材料形成,如聚苯乙烯、聚丙烯、硅石、陶瓷、聚丙烯酰胺、金、胶乳、羟基磷灰石以及铁磁性和顺磁性材料。可生物降解的固相微载体可由在哺乳动物生理条件下可降解的聚合物(如聚(乳酸)、聚(羟基乙酸)及其共聚物,如聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯))或易蚀的聚合物(例如,聚(原酸酯如3,9-二亚乙基-2,4,8,10-四氧杂螺[5.5]十一烷(DETOSU)),或聚(酐)如癸二酸的聚(酐))形成。微载体也可为液相(例如,基于油或酯的液相),如脂质体、无抗原的iscom(免疫刺激复合体,其为胆固醇、磷脂和具有佐剂活性的皂甙的稳定复合体)或在水包油或油包水乳液中的微滴或微胶粒。可生物降解的液相微载体通常掺入可生物降解的油,它们中的一些为本领域公知,包括鲨烯和植物油。微载体一般为球状,但偏离球状的微载体也是可接受的(如椭圆形、棒状等)。鉴于微载体的不可溶性,固相微载体可从水和基于水的(含水的)溶液中过滤出来(例如,使用0.2微米滤器)。
术语″不可生物降解的″如此处所用是指在正常的哺乳动物生理条件下不被降解或腐蚀的微载体。通常,如果微载体在正常的人血清中37℃孵育72小时后不被降解(即其质量或平均聚合物长度的损失小于5%),则认为它不可生物降解。
如果微载体在正常的哺乳动物生理条件下可降解或易蚀,则认为它是″生物可降解的″。通常,如果微载体在正常的人血清中37℃孵育72小时后被降解(即其质量或平均聚合物长度至少损失5%),则认为它可生物降解。
术语″CIC/微载体复合体″或″CIC/MC复合体″是指CIC和微载体的复合体。复合体的成分可共价或非共价连接。非共价连接可通过任何非共价结合力介导,包括疏水作用、离子(静电)键、氢键和/或范德华引力。当为疏水连接时,该连接通常通过与CIC共价连接的疏水结构部分(如胆固醇)来实现。
″个体″或″对象″为脊椎动物,如鸟,并优选为哺乳动物,例如人。哺乳动物包括但不限于人、非人灵长类、农畜、体育用动物、实验动物、啮齿类动物(例如,大鼠和小鼠)和宠物。
物质的″有效量″或″足够量″是足以达到期望的生物学效果如有益结果(包括临床结果)的量,因而″有效量″取决于应用它的背景。在施用可调制针对共施用抗原的免疫应答的组合物的情况下,CIC和抗原的有效量为足以实现调制作用的量,其中所述调制作用是与单独施用抗原时所达到的免疫应答相比而言的。有效量可在一次施用或多次施用中施与。
术语″共施用″如此处所用是指在足够接近的时间内施用至少两种不同的物质以调制免疫应答。优选地,共施用是指同时施用至少两种不同的物质。
″刺激″免疫应答如Th1应答是指增强该应答,这可通过引发该应答和/或加强该应答产生。同样地,″刺激″细胞因子或细胞类型(如CTL)是指使细胞因子或细胞类型的量或水平升高。
″IgE相关病症″为生理学疾病,其特征部分地在于升高的IgE水平,这可为持续性的或可为非持续性的。IgE相关病症包括但不限于变态反应和变应性反应、变态反应相关病症(如下所述)、哮喘、鼻炎、结膜炎、风疹、休克、膜翅目昆虫叮咬引起的变态反应和药物变态反应、以及寄生虫感染。该术语也包括这些病症的相关表现。通常,在此类病症中IgE为抗原特异的。
″变态反应相关病症″是指由抗原特异性IgE免疫应答的结果导致的疾病。此类结果可包括但不限于低血压和休克。过敏反应是变态反应相关病症的一个例子,在过敏反应期间,组胺释放入循环,引起血管舒张及毛细血管通透性增加,结果导致循环中血浆的显著丢失。过敏反应可为全身性发生,整个身体都经历相关的影响,也可为局部发生,反应局限于特异的靶组织或器官。
术语″病毒性疾病″如此处所用是指病毒作为致病因子的疾病。病毒性疾病的实例包括乙型肝炎、丙型肝炎、流感、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)和带状疱疹。
如此处所用及本领域所熟知的,″治疗″为用于获得有益或所需结果(包括临床结果)的方法。为了本发明的目的,有益或所需临床结果包括但不限于减轻或改善一种或多种症状、减轻疾病的程度、稳定(即不加重)疾病的状态、防止疾病的扩散、延迟或减慢疾病进程、改善或缓和疾病状态、以及缓解(部分或全部)疾病,无论该结果是可检测的或是不可检测的。″治疗″也可指与不接受该治疗时的预期存活相比延长存活。
疾病或病症的″减轻″是指与不治疗该疾病相比,疾病或病状的程度和/或不想要的临床表现得以减轻和/或疾病进展的时程减慢或延长。尤其在变态反应中,正如本领域技术人员熟知的,减轻可通过调制针对变应原的免疫应答发生。而且,减轻不一定会在施用一剂后发生,它往往在施用一连串的剂量后产生。因此,足以减轻应答或病症的量可一次或多次施用。
由CIC和抗原“引发”的″抗体效价″或″抗体量″是指施用CIC和抗原后在某一时间点所测定到的指定抗体的量。
″Th1相关抗体″为其产生和/或增高与Th1免疫应答相关的抗体。如IgG2a为小鼠Th1相关抗体。为了本发明目的,Th1相关抗体的测定可为对一种或多种此类抗体的测定。如对人而言,Th1相关抗体的测定可能需要对IgG1和/或IgG3进行测定。
″Th2相关抗体″为其产生和/或增高与Th2免疫应答相关的抗体。如IgG1为小鼠Th2相关抗体。为了本发明目的,Th2相关抗体的测定可为对一种或多种此类抗体的测定。如对人而言,Th2相关抗体的测定可能需要对IgG2和/或IgG4进行测定。
″抑制″或″遏制″功能或活性如细胞因子产生、抗体产生或组胺释放是指与除了目的条件或参数外相同的条件比较或备选地与另一条件比较时功能或活性的降低。例如,与如仅用抗原时诱导的组胺释放相比,抑制组胺释放的包含CIC和抗原的组合物可减少组胺释放。作为另一实例,与如仅用抗原时产生的抗体的程度和/或水平相比,抑制抗体产生的包含CIC和抗原的组合物可降低抗体的程度和/或水平。
当涉及药物组合物时,如本文所用的“按照GMP标准”制备或配制是指将组合物配制成无菌、等渗的,并且使其完全符合美国食品药品管理局的所有生产质量管理(GMP)规定。
如本文所用的术语“免疫原性”具有本领域中的普通含义,是指这样一种药剂(如,多肽),当将它注射进入人或动物体中时它能引发适应性免疫应答。免疫应答可以是B细胞(体液)的和/或T细胞(细胞)的。
所有范围都旨在包括终端值。因此,具有“2至7个核苷酸”或具有“2个和7个之间个数的核苷酸”的聚合物包括具有2个核苷酸的聚合物和具有7个核苷酸的聚合物。在说到下限和独立选择的上限时,应理解上限高于下限。
III.嵌合免疫调制化合物
本发明提供可用于,特别是,调制个体如包括人类在内的哺乳动物中的免疫应答的嵌合免疫调制化合物(“CIC”)。本发明部分地基于这样的发现,即一些包含共价结合到非核酸间隔体结构部分上的核酸结构部分的嵌合分子具有免疫调制活性,尤其是在人类细胞中。令人惊奇的是,甚至当核酸结构部分具有的序列在作为单独的多核苷酸提供时不显示明显的免疫调制活性,这种活性也是明显的。
因此,本发明提供用于调制免疫应答--包括治疗和预防人和其他动物的疾病——的新药剂和方法。
下列各节描述了本发明CIC的结构和性质,以及其成分——核酸结构部分和非核酸间隔体结构部分的结构和性质。
1.CIC的核心结构
本发明CIC包含一个或多个核酸结构部分和一个或多个非核酸间隔体结构部分。具有各种结构的CIC都在考虑之列。举例来说,示例性CIC具有下式I-VII所示的核心结构。式I-III显示用于“线性CIC”的核心序列。式IV-VI显示用于“分支CIC”的核心序列。式VII显示用于“单间隔体的CIC”的核心结构。
在下列的每个式中,“N”表示核酸结构部分(取向为5’→3’或3’→5’方向),“S”表示非核酸间隔体结构部分。单划线(“-”)表示一个核酸结构部分与一个非核酸间隔体结构部分之间形成的共价键。双划线(“--”)表示一个非核酸间隔体结构部分与至少两个核酸结构部分之间形成的共价键。三划线(“---”)表示一个非核酸间隔体结构部分与多个(即,至少3个)核酸结构部分之间形成的共价键。下标用于表示于不同位置处的核酸结构部分或非核酸间隔体结构部分。然而,用下标区别的不同核酸结构部分并不表示这些核酸结构部分必定具有不同的结构或序列。同样,用下标区别的不同的间隔体结构部分并不表示这些间隔体结构部分必定具有不同结构。如在下文的式II中,N1和N2表示的核酸结构部分可具有相同或不同的序列,S1和S2表示的间隔体结构部分可具有相同或不同的结构。
A.线性CIC
在一个实施方案中,CIC包含核心结构
N1-S1-N2 (I)。
在一个实施方案中,CIC包含核心结构
N1-S1-N2-S2-N3 (II)。
在一个实施方案中,CIC包含核心结构
N1-S1-N2-S2-[Nv-Sv]A (III),
其中A是1至大约100的整数,[Nv-Sv]表示与非核酸间隔体结构部分缀合的核酸结构部分的A次额外重复。下标“v”表示N和S在每个“[Nv-Sv]”的重复中是独立地选择的。“A”有时为1至大约10,有时为1至3,有时正好是1、2、3、4或5。在一些实施方案中,A是处于下限为1、2、3、4或5而独立选择的上限为10、20、50或100的范围(如3至10)中的整数。
在本发明的一些实施方案中,CIC具有如式I、II或III所示的结构。然而,根据本发明,在一些实施方案中,线性CIC包含,但不必限于,式I-III提供的结构。也就是说,式I、II和III定义了这样一个核心结构,在该核心结构中非核酸间隔体结构部分与不超过两个的核酸结构部分共价结合。然而,在许多实施方案中,可以考虑将其它的化学结构部分(如,磷酸、单核苷酸、其它的核酸结构部分、烷基、氨基、含硫基团或二硫基团或连接基团,和/或间隔体结构部分)共价结合在核心结构的末端。例如,如果CIC中所有核酸结构部分均是5’-TCGTCGA-3’,并且间隔体结构部分选自六聚乙二醇(“HEG”)、硫代磷酸酯连接的HEG多聚体和丙三醇,那么具有如式I所示核心结构的CIC包括所有下式:
TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-OH (Ia)
TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-PO4 (Ib)
TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-HEG (Ic)
HFG-TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-HEG (Id)
TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-HEG-TCGTCGA (Ie)
TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-(HEG)4-TCGTCGA (If)
(TCGTCGA)2-丙三醇-TCGTCGA-HEG-TCGTCGA (Ig)
PO4-TCGTCGA-HEG-TCGTCGA (Ih)
TCGTCGA-(HEG)15-T (Ii)
(TCGTCGA-HEG)2-丙三醇-HEG-TCGTCGA (Ij)
TCGTCGA-HEG-T-HEG-T (Ik)
很明显这类含有如式I所示核心结构的CIC中包括了含有如式II或III所示核心结构的CIC。
在一些实施方案中,一个或多个间隔体包含连接在一起的较小单元(如,HEG、TEG、丙三醇、C3烷基等)。在一个实施方案中,所述连接是酯连接(如磷酸二酯或硫代磷酸酯)或其他连接,参见如下所述。
在某些实施方案中,CIC的末端结构共价连接在一起(如,核酸结构部分至核酸结构部分;间隔体结构部分至间隔体结构部分,或核酸结构部分至间隔体结构部分)从而形成环状构象。
B.
分支CIC
在一个实施方案中,CIC包含核心结构
[Nv] A---Sp (IV),
其中Sp是与“A”个独立选择的核酸结构部分Nv共价结合的多价间隔体,并且A至少为3,如正好是3、4、5、6或7或是大于7。在多种实施方案中,A是3至100(包括3和100)的整数。在一些实施方案中,A是处于下限为约3、5、10、50或100 而独立选择的上限为约5、7、10、50、100、150、200、250或500的范围中的整数。同样可考虑在一些实施方案中,A大于约500。
在一个相关的实施方案中,CIC包含核心结构
[Sv-Nv]A---SP (V),
其中Sp是与“A”个独立选择的元件,即Sv-Nv(包含共价结合到核酸结构部分的间隔体结构部分)共价结合的多价间隔体,并且A至少为3。在多种实施方案中,A是3至100(包括3和100)的整数。在一些实施方案中,A是处于下限为5、10、50或100而独立选择的上限为10、50、100、250或500的范围中的整数。同样可考虑在一些实施方案中,A大于500。在一个相关实施方案中,CIC包含核心结构:
(S1-N1)-Sp--(Nv)A (VI)
其中Sp是与“A”个独立选择的核酸结构部分Nv及至少一个和间隔体结构部分S1结合的核酸结构部分N1共价结合的多价间隔体,且其中A至少为2。在一个实施方案中,A是2。在多个实施方案中,A是3、4、5或3至100(包括3和100)的整数。在一些实施方案中,A是处于下限为5、10、50或100而独立选择的上限为10、50、100、150、200、250或500的范围中的整数。同样可考虑在一些实施方案中,A大于500。在本发明的一些实施方案中,CIC具有如式I、II或III所示的结构。然而,根据本发明,分支CIC可包含,但不限于,式IV、V和VI所提供的结构。即,式IV、V和VI定义了这样的核心结构,该结构中一个多价间隔体结构部分(Sp)与至少三个(3)核酸结构部分共价结合。可以考虑,在一些实施方案中,将其他的化学结构部分(如,磷酸、单核苷酸、其他核酸和/或间隔体结构部分)共价结合在核心结构的末端。例如,如果CIC中所有的核酸结构部分均是5’-TCGTCGA-3’,并且所有间隔体结构部分都是丙三醇或HEG,那么具有如式IV所示核心结构的CIC则包括:
(TCGTCGA)2-丙三醇-TCGTCGA (IVa)
(TCGTCGA-HEG)2-丙三醇-TCGTCGA (IVb)
(TCGTCGA-HEG-TCGTCGA)2-丙三醇-TCGTCGA (IVc)
[(TCGTCGA)2-丙三醇-TCGTCGA]2-丙三醇-TCGTCGA (IVd)
很明显,举例来说,这类含有如式IV所示核心结构的CIC中包括了含有如式V或VI所示核心结构的CIC。在本发明优选的实施方案中,CIC包含至少两个不同(即不同序列)的核酸结构部分。
在一些实施方案中,一个或多个间隔体包含连接在一起的较小单元(如,HEG、TEG、丙三醇、C3烷基等)。在一个实施方案中,所述连接是酯连接(如磷酸二酯或硫代磷酸酯)。
C.
单间隔体的CIC
在本发明的一个不同方面,CIC含有这样的结构,在此结构中存在与单个间隔体结构部分共价缀合的单个核酸结构部分,即,
N1-S1 (VII)
在一个实施方案中,S1具有包含多个较小单元(如,HEG、TEG、丙三醇、1′,2′-二脱氧核糖,C2烷基至C12烷基亚单元等)的多聚体(multimer)的结构,其中所述较小单元一般通过酯键(如磷酸二酯或硫代磷酸酯)连接,见如下所述。实例参见如下所示的式VIIa。多聚体可以是杂聚体(heteromer)或均聚体(homomer)。在一个实施方案中,间隔体是单体单元(如,HEG、TEG、丙三醇、1′,2′-二脱氧核糖,C2烷基至C12烷基接头等)通过酯键(如磷酸二酯或硫代磷酸酯)连接而成的杂聚体。实例参见如下所示的式VIIb。
例如,如果核酸结构部分是5’-TCGTCGA-3’,且间隔体结构部分是硫代磷酸酯连接的六聚乙二醇的多聚体[“(HEG)15”],则具有如式VII所示核心结构的CIC包括:
TCGTCGA-(HEG)15 (VIIa)
同样,如果核酸结构部分是5’-TCGTCGA-3’,间隔体结构部分是六聚乙二醇和丙基亚单元交替通过硫代磷酸酯键连接而成的多聚体,则具有如式VI所示核心结构的CIC包括:
TCGTCGA-HEG-丙基-HEG-丙基-HEG(VIIb)。
2.CIC的免疫调制活性
本发明的CIC具有免疫调制活性。如本文中所用的术语“免疫调制,”“免疫调制活性,”或“调制免疫应答”包括免疫刺激和免疫抑制作用。根据本发明进行免疫调制的免疫应答一般将朝向“Th1型”免疫应答转移而背离“Th2型”免疫应答。通常认为Th1型应答是细胞免疫系统(如细胞毒性淋巴细胞)应答,而Th2型应答一般是“体液的”或基于抗体的应答。Th1型免疫应答的通常特征是针对抗原的“延迟型超敏”反应。Th1型应答可在生化水平上通过增加的Th1相关细胞因子(如IFN-γ、IFN-α、IL-2、IL-12和TNF-β,以及IL-6,尽管IL-6也可与Th2型应答相关)的水平进行检测。Th2型免疫应答通常与高水平的抗体生成,包括IgE生成、没有或少量的CTL生成以及Th2相关细胞因子如IL-4和IL-5的表达有关。
本发明的免疫调制作用可通过体外(in vitro)、体内(in vivo)和/或离体(ex vivo)测定(试验)进行识别。可例举的能够指示免疫调制活性的可测量免疫应答包括,但不限于,抗原特异性抗体的生成、细胞因子的分泌、淋巴细胞群如NK细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、B淋巴细胞等的激活或扩增。实例参见WO97/28259;WO98/16247;WO99/11275;Krieg等(1995)Nature 374:546-549;Yamamoto等(1992)J.Immunol.148:4072-4076;Ballas等(1996)J.Immunol.157:1840-1845;Klinman等(1997)J.Immunol. 158:3635-3639;Sato等(1996)Science 273:352-354;Pisetsky(1996)J.Immunol.156:421-423;Shimada等(1986)Jpn.J.Cancer Res.77:808-816;Cowdery等(1996)J.Immunol.156:4570-4575;Roman等(1997)Nat Med.3:849-54;Lipford等(1997)Eur.J.Immunol. 27:2340-2344;WO98/55495,WO00/61151,Pichyangkul等(2001)J.Imm.Methods247:83-94。还可参见下文中的实施例。为举例说明而不是限制,下文中对某些有用试验进行描述。
试验一般通过使细胞、组织、动物体等接触测试样本或向它们施用测试样本(如,包含CIC、多核苷酸和/或其他试剂的测试样本)并测量应答来进行。含有CIC或多核苷酸的测试样本可以为多种不同的形式或浓度,只要本领域普通技术人员认为其适于此试验类型即可。例如,为进行基于细胞的试验,CIC或多核苷酸的常用浓度为20μg/ml或10μg/ml或2μg/ml。通常情况下,为进行这种试验,通过测量260nm的吸光度并利用0.5OD260/ml=20μg/ml进行转换来确定浓度。这可对测试样本中的总核酸量进行标准化并且举例来说,当间隔体结构部分在260nm没有明显的吸光度时,这是可应用的。作为替代的方案,浓度或重量可利用本领域已知的其他方法进行测量。如果需要的话,核酸结构部分的量可通过测量260nm的吸光度来确定,而CIC重量可利用CIC的分子式来计算。这种方法有时用在CIC中的间隔体结构部分所占重量与核酸结构部分所占重量的比率较高(即,大于1)的情况下。
同样可以理解,阳性和阴性对照在免疫调制活性试验中是有用的。对于免疫调制活性而言,适宜的阳性对照是具有序列5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:2)的免疫调制性硫代磷酸酯DNA,但对本领域普通技术人员来说其他适宜的具有免疫调制活性的阳性对照也是显而易见的。一种适用的阴性对照是无测试药剂(即,只有赋形剂或介质,对某些体外试验来说,也称为“只有细胞”)。作为替代的方案,具有序列5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’(SEQ ID NO:3)的硫代磷酸酯DNA在一些实施方案中用作阴性对照。其他阴性对照可由技术人员在此处的公开和常规试验设计的指导下来设计。
一类有用的试验是“细胞因子应答试验”。一个用于免疫调制活性的示例性试验测定人外周血单核的细胞(“PBMC”)的细胞因子应答(如在Bohle等,[1999] Eur.J.Immunol.29:2344-53;Verthelyi等[2001]J.Immunol.166:2372-77中的描述)。在此试验的一个实施方案中,从一名或多名健康人类志愿者采集外周血并分离出PBMC。一般来说,血液利用肝素化注射器经静脉穿刺进行采集,之后铺在FICOLL_(AmershamPharmacia Biotech)垫上并离心。然后从FICOLL_的界面收集PBMC并以冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次。将细胞以2×106细胞/mL的浓度在RPMI1640(含有10%热灭活的人AB血清、50单位/mL青霉素、50μg/mL链霉素、300μg/mL谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1×MEM非必需氨基酸(NEAA))中并且在测试样本或对照存在或不存在下重新悬浮和培养24小时(如,在48-或96孔培养板中)。
从每个孔中收集无细胞培养液并检测IFN-γ和/或IFN-α浓度。如果由接触过测试化合物的PBMC分泌的IFN-γ量显著地大于(如,至少大约3倍大于,通常至少大约5倍大于)由PBMC在缺少测试化合物时,或者,在一些实施方案中,在有无活性对照化合物(如5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’(SEQ ID NO:3))存在时所分泌的量,即检测出免疫调制活性。相反,如果由接触过测试化合物的PBMC分泌的IFN-γ量不显著地大于(如,少于2倍大于)由PBMC在缺少测试化合物时,或者,作为替代,在有无活性对照化合物(如,5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’(SEQ ID NO:3))存在时所分泌的量,则测试化合物不具有免疫调制活性。
如果测定IFN-α浓度,由接触过测试化合物的PBMC分泌的IFN-α量常常显著地大于(如,对于IFN-α,有时至少大约2倍或至少大约3倍大于)由PBMC在缺少测试化合物下,或者,在一些实施方案中,在有无活性对照化合物(如,5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’(SEQ IDNO:3))存在下所分泌的量。在一些实施方案中,显著增加的IFN-α分泌水平比对照高至少约5倍,至少约10倍,或甚至至少约20倍。相反,如果由接触过测试化合物的PBMC分泌的IFN-α量不显著地大于(如,少于2大于)由PBMC在缺少测试化合物下,或者,作为替代,在有无活性对照化合物(如,5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’(SEQ IDNO:3))存在下所分泌的量,则测试化合物不具有免疫调制活性。
如下文实施例中的举例说明,施用某些CIC可导致IFN-α和IFN-γ两者的显著分泌,而施用其他CIC对IFN-α分泌的影响较小或者,相反地,对IFN-γ分泌的影响较小。实例参见实施例49。
另一类有用的试验是细胞增殖试验,如B细胞增殖试验。药剂(如,CIC)对B细胞增殖的影响可利用本领域已知的多种试验中的任一种进行确定。实施例41中提供了B细胞增殖试验的一个实例。
考虑到供体的差异,如在基于细胞的试验如细胞因子和增殖试验中,优选利用来自多个不同供体的细胞(如PBMC)开展试验。一般供体的数目至少为2(如,2),优选至少为4(如,4),有时至少为10(如,10)。如果在测试化合物存在下IFN-γ的分泌量(如,在至少一半,优选至少75%,最优选至少85%被测健康供体中)与测试化合物不存在,或者,在一些实施方案中,存在无活性对照化合物(例如,上述对照化合物)时的分泌量相比高至少约3倍或至少约5倍,则检测到免疫调制活性。
体外试验还可利用如下文实施例42中所述的小鼠细胞或在其他哺乳动物细胞中进行。
可例举的体内试验参见实施例43、44和46(小鼠)以及实施例45(非人灵长类)中所述。
除非另有说明或显而易见,在下文实施例中描述的细胞因子试验基本上按照实施例28中所述的操作方法采用人类PBMC来实施。举例来说,利用多孔板或其他多室的分析材料,可同时检测大量的测试化合物。如需要,这些试验可利用本领域熟知的计算机控制的自动机械装置来进行。
3.核酸结构部分
本发明的CIC含有一个或多个核酸结构部分。如本文所用的术语“核酸结构部分”是指核苷酸单体(即,单核苷酸)或核苷酸聚合物(即,含至少2个连续核苷酸)。如本文所用,核苷酸包括(1)连接到糖的嘌呤或嘧啶碱基,其中糖通过酯键连接到磷酸基团上,或(2)碱基和/或糖和/或磷酸酯被类似物替代而形成的核苷酸类似物,参见下文。如果CIC中含有一个以上核酸结构部分,这些核酸结构部分可以是相同或不同的。
下面三节对核酸结构部分的特征,如在该结构部分中序列或序列基序的长度、存在和位置进行了描述,还描述了(无意于限制本发明)核酸结构部分和含有此结构部分的CIC的性质和结构。
A.
长度
通常,核酸结构部分长度为1至100个核苷酸,但在一些实施方案中此结构部分可以更长。在一些实施方案中,CIC中的一个或多个核酸结构部分的长度小于8个核苷酸(即,1、2、3、4、5、6、或7个核苷酸)。在多个实施方案中,核酸结构部分(如小于8个核苷酸长的核酸结构部分)为至少2个核苷酸长,通常至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或至少7个核苷酸长。在其他实施方案中,核酸结构部分长至少10个、至少20个、或至少30个核苷酸。
如下文实施例中所示,仅含有七聚体、六聚体、五聚体、四聚体和三聚体核酸结构部分的CIC在免疫调制活性的试验(如实施例36和37)中是有活性的。因此,可考虑在一些实施方案中,CIC包含至少一个短于8个核苷酸长的核酸结构部分。在一些实施方案中,CIC中的所有核酸结构部分都短于8个核苷酸(如,具有处于如下范围中的长度,所述范围的下限为2、3、4、5或6个核苷酸,独立选择的上限为5、6、或7个核苷酸,其中上限大于下限)。如在一个实施方案中,CIC中指定的核酸结构部分(包括此CIC中所有的核酸结构部分)可以是6或7个核苷酸长。在一个实施方案中,CIC含有两个间隔体结构部分和一个插入其中的长度小于8个碱基(如,5、6、或7个碱基长)的核酸结构部分。
在含多个核酸结构部分的CIC中,这些核酸结构部分的长度可以考虑相同或不同。在一个实施方案中,CIC中的一个或多个或多数(如,至少约2个、至少约4个、或至少约25%、至少约50%、至少约75%)或所有的核酸结构部分的长度为小于8个核苷酸,在一些实施方案中为小于7个核苷酸,在一些实施方案中为小于6个核苷酸,在一些实施方案中为2至6个核苷酸,在一些实施方案中为2至7个核苷酸,在一些实施方案中为3至7个核苷酸,在一些实施方案中为4至7个核苷酸,在一些实施方案中为5至7个核苷酸,在一些实施方案中为6至7个核苷酸。
如下文中的更详细讨论,常常CIC中至少一个核酸结构部分包括序列CG,如TCG或此处所述的含CG的基序。在一个实施方案中,至少一个核酸结构部分包含含CG的核酸基序并且小于8个核苷酸长(如,具有如上所述的小于8个核苷酸的特定长度)。在一个相关实施方案中,CIC中没有一个长于8个核苷酸的核酸结构部分含有序列“CG”或任选地序列“TCG”或“ACG”(即,CIC中所有含序列CG的核酸结构部分都小于8个核苷酸长)。在一个实施方案中,CIC中至少一个核酸结构部分不含有CG序列。
B.
序列和基序(motifs)
如上文指出,一个具体的核酸结构部分可具有多种长度。在一个实施方案中,核酸结构部分小于8个核苷酸长。在一个实施方案中,核酸结构部分有8个核苷酸长或更长。在多个实施方案中,本发明CIC中至少一个核酸结构部分含有如下所述的序列。
在下文的式中,所有序列都采取5’→3’的方向并使用下列缩写:B=5-溴胞嘧啶;bU=5-溴尿嘧啶;a-A=2-氨基-腺嘌呤;g=6-硫代-鸟嘌呤;t=4-硫代胸腺嘧啶;H=含有吸电子基团(如5位的卤素)的修饰的胞嘧啶。在多个实施方案中,下文涉及的序列中的胞嘧啶(C)被N4-乙基胞嘧啶或N4-甲基胞嘧啶或5-羟基胞嘧啶替换。在多个实施方案中,式中的鸟苷(G)被7-脱氮杂鸟苷替换。
在迄今被测的CIC中,CG的存在与细胞因子诱导活性相关。因此,在一个实施方案中,CIC中至少一个核酸结构部分包含至少一个5’-胞嘧啶,鸟嘌呤-3’(5’-CG-3’)序列。所述胞嘧啶在C-5位没有被甲基化,并且优选在任何位置上都未被甲基化。
在一个实施方案中,一个或多个核酸结构部分包含3至7个碱基。在一个实施方案中,核酸结构部分包含3至7个碱基并且具有序列5’-[(X)0-2]TCG](X)2-4 ]-3’,或5’-TCG[(X)2-4]-3’,或5’-TCG(A/T)[(X)1-3]-3’,或5’-TCG(A/T)CG(A/T)-3’,或5’-TCGACGT-3’,或5’-TCGTCGA-3’,其中每个X都是独立地选择的核苷酸。在一些实施方案中,CIC包含至少3个、至少10个、至少30个或至少100个具有前述序列的核酸结构部分。
在一个实施方案中,核酸结构部分包含序列5’-胸腺嘧啶,胞嘧啶,鸟嘌呤-3’(5’-TCG-3’),如(非限制)3聚体TCG,4聚体TCGX(如TCGA),5聚体TCGXX(如TCGTC和TCGAT),6聚体TCGXXX、XTCGXX和TCGTCG,及7聚体TCGXXXX、XTCGXXX,XXTCGXX和TCGTCGX,其中X是任意碱基。常常,至少一个核酸结构部分含有序列5’-胸腺嘧啶,胞嘧啶,鸟嘌呤,腺嘌呤-3’(5’-TCGA-3’),如含有序列5’-TCGACGT-3’。
在一些实施方案中,核酸结构部分包含序列5′-ACGTTCG-3′;
5′-TCGTCG-3′;5′-AACGTTC-3′;5′-AACGTT-3′;5′-TCGTT-3′;
5′-CGTTCG-3′;5′-TCGTCGA-3′;5′-TCGXXX-3′;5′-XTCGXX-3′;
5′-XXTCGX-3′;5′-TCGAGA-3′;5′-TCGTTT-3′;5′-TTCGAG-3′;
5′-TTCGT-3′;5′-TTCGC-3′;5′-GTCGT-3′;
5′-ATCGT-3′;5′-ATCGAT-3′;5′-GTCGTT-3′;5′-GTCGAC-3′;
5′-ACCGGT-3′;5′-AABGTT-3′;5′-AABGUT-3′,5′-TCGTBG-3′其中X是任意核苷酸。
在一些实施方案中,核酸结构部分含有序列5’-X1X2CGX3X4-3’,其中X1是0至10个核苷酸;X2是空缺或是A、T或U;X3是空缺或是A;且X4是0至10个核苷酸。在一个实施方案中,此核酸结构部分在3’末端缀合到间隔体结构部分上。在一些实施方案中,X1是0至5个核苷酸,或者是0至2个核苷酸;且X4是0至5个核苷酸,或者是0至2个核苷酸。
在一些实施方案中,核酸结构部分含有如下所示的序列:5’-嘌呤,嘌呤,C,G,嘧啶,嘧啶-3’;5’-嘌呤,嘌呤,C,G,嘧啶,嘧啶,C,G-3’;或5’-嘌呤,嘌呤,C,G,嘧啶,嘧啶,C,C-3’;例如(皆沿5’→3’方向),GACGCT;GACGTC;GACGTT;GACGCC;GACGCU;GACGUC;GACGUU;GACGUT;GACGTU;AGCGTT;AGCGCT;AGCGTC;AGCGCC;AGCGUU;AGCGCU;AGCGUC;AGCGUT;AGCGTU;AACGTC;AACGCC;AACGTT;AACGCT;AACGUC;AACGUU;AACGCU;AACGUT;AACGTU;GGCGTT;GGCGCT;GGCGTC;GGCGCC;GGCGUU;GGCGCU;GGCGUC;GGCGUT;GGCGTU,AACGTT,AGCGTC,GACGTT,GGCGTT,AACGTC,GACGTC,GGCGTC,AACGCC,AGCGCC,GACGCC,GGCGCC,AGCGCT,GACGCT,GGCGCT,GGCGTT,和AACGCC.
在一些实施方案中,核酸结构部分含有序列:5’-嘌呤,嘌呤,胞嘧啶,鸟嘌呤,嘧啶,嘧啶,胞嘧啶,胞嘧啶-3’或者5’-嘌呤,嘌呤,胞嘧啶,鸟嘌呤,嘧啶,嘧啶,胞嘧啶,鸟嘌呤-3’。
在一些实施方案中,核酸结构部分含有序列(皆沿5’-3’方向)AACGTTCG;AACGTTCC;AACGUTCG;AABGTTCG;AABGUTCG和/或AABGTTBG。
在多个实施方案中,核酸结构部分含有基序5’-X1X2AX3CGX4TCG-3’(SEQ ID NO:4),其中X1是T、G、C或B,X2是T、G、A或U,X3是T、A或C,X4是T、G或U,而且此序列不是5’-TGAACGTTCG-3’(SEQ ID NO:5)或5’-GGAACGTTCG-3’(SEQ IDNO:6)。实例包括(皆沿5’→3’方向):
TGAACGUTCG(SEQ ID NO:7);TGACCGTTCG(SEQ ID NO:8);
TGATCGGTCG(SEQ ID NO:9);TGATCGTTCG(SEQ ID NO:10);
TGAACGGTCG(SEQ ID NO:11);GTAACGTTCG(SEQ ID NO:12);
GTATCGGTCG(SEQ ID NO:13);GTACCGTTCG(SEQ ID NO:14);
GAACCGTTCG(SEQ ID NO:15);BGACCGTTCG(SEQ ID NO:16);
CGAACGTTCG(SEQ ID NO:17);CGACCGTTCG(SEQ ID NO:18);
BGAACGTTCG(SEQ ID NO:19);TTAACGUTCG(SEQ ID NO:20);
TUAACGUTCG(SEQ ID NO:21)和TTAACGTTCG(SEQ ID NO:22).
在多个实施方案中,核酸结构部分含有序列:
5’-TCGTCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3’(SEQ ID NO:23);
5’-TGACTGTGAACGUTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:24);
5’-TCGTCGAUCGUTCGTTAACGUTCG-3’(SEQ ID NO:25);
5’-TCGTCGAUCGTTCGTUAACGUTCG-3’(SEQ ID NO:26);
5’-TCGTCGUACGUTCGTTAACGUTCG-3’(SEQ ID NO:27);
5’-TCGTCGAa-ACGUTCGTTAACGUTCG-3’(SEQ ID NO:28);
5’-TGATCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3(SEQ ID NO:29);
5’-TGACTGTGAACGUTCGGTATGA-3’(SEQ ID NO:30);
5’-TGACTGTGACCGTTCGGTATGA-3’(SEQ ID NO:31);
5’-TGACTGTGATCGGTCGGTATGA-3’(SEQ ID NO:32);
5’-TCGTCGAACGTTCGTT-3’(SEQ ID NO:33);
5’-TCGTCGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:34);
5’-TCGTCGGTATCGGTCGGTATGA-3’(SEQ ID NO:35);
5’-CTTCGAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:36);
5’-CTGTGATCGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:37);
5’-TGACTGTGAACGGTCGGTATGA-3’(SEQ ID NO:38);
5’-TCGTCGGTACCGTTCGGTATGA-3’(SEQ ID NO:39);
5’-TCGTCGGAACCGTTCGGAATGA-3’(SEQ ID NO:40);
5’-TCGTCGAACGTTCGAGATG-3’ (SEQ ID NO:41);
5’-TCGTCGTAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:42);
5’-TGACTGTGACCGTTCGGAATGA-3’(SEQ ID NO:43);
5’-TCGTCGAACGTTCGAACGTTCG-3’(SEQ ID NO:44);
5’-TBGTBGAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:45);
5’-TCGTBGAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:46);
5’-TCGTCGACCGTTCGGAATGA-3’(SEQ ID NO:47);
5’-TBGTBGACCGTTCGGAATGA-3’(SEQ ID NO:48);
5’-TCGTBGACCGTTCGGAATGA-3’(SEQ ID NO:49);
5’-TTCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3’(SEQ ID NO:50);
5’-CTTBGAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:51);
5’-TGATCGTCGAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:52).
在一些实施方案中,核酸结构部分含有序列:5’-X1X2AX3BGX4TCG-3’(SEQ ID NO:53),其中X1是T、G、C或B,X2是T、G、A或U,X3是T、A或C,X4是T、G或U。在一些实施方案中,此核酸结构部分不是5’-TGAABGTTCG-3’(SEQ ID NO:54)。实例包括(皆沿5’-3’方向):TGAABGUTCG(SEQ ID NO:55)
TGACBGTTCG(SEQ ID NO:56);TGATBGGTCG(SEQ ID NO:57);
GTATBGGTCG(SEQ ID NO:58);GTACBGTTCG(SEQ ID NO:59);
GAACBGTTCG(SEQ ID NO:60);GAAABGUTCG(SEQ ID NO:61);
BGACBGTTCG(SEQ ID NO:62);CGAABGTTCG(SEQ ID NO:63);
BGAABGTTCG(SEQ ID NO:64);BGAABGUTCG(SEQ ID NO:65);
TTAABGUTCG(SEQ ID NO:66);TUAABGUTCG(SEQ ID NO:67)和
TTAABGTTCG(SEQ ID NO:68).
在一些实施方案中,核酸结构部分含有序列:
5’-TGACTGTGAABGUTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:69);
5’-TCGTCGAABGTTCGTTAABGTTCG-3’(SEQ ID NO:70);
5’-TGACTGTGAABGUTCGGTATGA-3’(SEQ ID NO:71);
5’-TGACTGTGAABGUTCGGAATGA-3’(SEQ ID NO:72);
5’-TCGTCGGAAABGUTCGGAATGA-3’(SEQ ID NO:73);
5’-TCGTBGAABGUTCGGAATGA-3’(SEQ ID NO:74).
在一些实施方案中,核酸结构部分含有序列:5’-X1X2AX3CGX4TCG-3’(SEQ ID NO:75),其中X1是T、C或B,X2是T、G、A或U,X3是T、A或C,X4是T、G或U。在一些实施方案中,此式不是5’-TGAACGTTCG-3’(SEQ ID NO:5)。
在其他实施方案中,核酸结构部分含有序列:
5’-TGACTGTGAABGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:76);
5’-TGACTGTGAABGTTBGAGATGA-3’(SEQ ID NO:77);
5’-TGACTGTGAABGTTCCAGATGA-3’(SEQ ID NO:78);
5’-TGACTGTGAACGTUCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:79);
5’-TGACTGTGAACGbUTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:80);
5’-TGACTGTGAABGTTCGTUATGA-3’(SEQ ID NO:81);
5’-TGACTGTGAABGTTCGGTATGA-3’(SEQ ID NO:82);
5’-CTGTGAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:83);
5’-TBGTBGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:84);
5’-TCGTBGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:85);
5’-TGACTGTGAACGtTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:86);
5’-TGACTGTGAACgTTCgAGATGA-3’(SEQ ID NO:87);
5’-TGACTGTGAACGTTCGTUATGA-3’(SEQ ID NO:88);
5’-TGACTGTGAACGTTCGTTATGA-3’(SEQ ID NO:89);
5’-TCGTTCAACGTTCGTTAACGTTCG-3’(SEQ ID NO:90);
5’-TGATTCAACGTTCGTTAACGTTCG-3’(SEQ ID NO:91);
5’-CTGTCAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:92);
5’-TCGTCGGAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:93);
5’-TCGTCGGACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:94);
5’-TCGTCGTACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:95);
5’-TCGTCGTTCGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:96).
在一些实施方案中,关于上述公开的任一序列,核酸结构部分还包含优选位于上述序列的5’端的一个、两个、三个或三个以上TCG和/或TBG和/或THG序列。此TCG和/或TBG可以与或可以不与所示序列直接相邻。例如,在一些实施方案中,核酸结构部分包括下列任一序列:5’-TCGTGAACGTTCG-3’(SEQ ID NO:97);5’-TCGTCGAAGTTCG-3’(SEQ ID NO:98);5’-TBGTGAACGTTCG-3’(SEQID NO:99);5-TBGTBGAACGTTCG3’(SEQ ID NO:100);5’-TCGTTAACGTTCG-3’(SEQ ID NO:101).
在一些实施方案中,此额外的TCG和/或TBG序列紧位于所涉及序列的5’与之相邻。在其他的实施方案中,分开一或两个碱基。
在一些实施方案中,核酸结构部分具有序列:5’-(TCG)wNyAX3CGX4TCG-3’(SEQ ID NO:102),其中w是1-2,y是0-2,N是任意碱基,X3是T、A或C,X4是T、G或U。
在一些实施方案中,核酸结构部分含有任一个如下序列:
TCGAACGTTCG(SEQ ID NO:103);
TCGTCGAACGGTTCG(SEQ ID NO:104);TCGTGAACGTTCG(SEQ IDNO:105);TCGGTATCGGTCG(SEQ ID NO:106);TCGGTACGTTCG(SEQID NO:107);TCGGAACCGTTCG(SEQ ID NO:108);TCGGAACGGTTCG(SEQID NO:109);TCGTCGGAACGTTCG(SEQ ID NO:110)TCGTAACGTTCG(SEQ ID NO:111);TCGACCGTTCG(SEQ ID NO:112);TCGTCGACCGTTCG(SEQ ID NO:113);TCGTTAACGTTCG(SEQ ID NO:114)
在一些实施方案中,核酸结构部分含有任一个如下序列:5’-(TBG)zNyAX3CGX4TCG-3’(SEQ ID NO:115),其中z是1-2,y是0-2,B是5-溴胞嘧啶,N是任意碱基,X3是T、A或C,X4是T、G或U。
在一些实施方案中,核酸结构部分含有:
TBGTGAACGTTCG(SEQ ID NO:116);TBGTBGTGAACGTTCG(SEQ IDNO:117);TBGAACGTTCG(SEQ ID NO:118);TBGTBGAACGTTCG(SEQ IDNO:100);TBGACCGTTCG(SEQ ID NO:119);TBGTBGACCGTTCG(SEQ IDNO:120).
在一些实施方案中,核酸结构部分含有任一个如下序列:5’-TCGTBGNyAX3CGX4TCG-3’(SEQ ID NO:121),其中y是0-2,B是5-溴胞嘧啶,N是任意碱基,X3是T、A或C,X4是T、G或U。在一些实施方案中,核酸结构部分含有任一个如下序列:
TCGTBGTGAACGTTCG(SEQ ID NO:122);TCGTBGAACGTTCG(SEQ IDNO:123);TCGTBGACCGTTCG(SEQ ID NO:124).
在一些实施方案中,核酸结构部分含有任一个如下序列:5’-(TCG)wNyAX3BGX4TCG-3’(SEQ ID NO:125),其中w是1-2,y是0-2,N是任意碱基,X3是T、A或C,X4是T、G或U。在一些实施方案中,此核酸结构部分含有任一个如下序列:TCGGAAABGTTCG(SEQ IDNO:126)或TCGAABGTTCG(SEQ ID NO:127)。
在一些实施方案中,核酸结构部分含有任一个如下序列:5’-(TBG)zNyAX3BGX4TCG-3’(SEQ ID NO:128),其中z是1-2,y是0-2,B是5-溴胞嘧啶,N是任意碱基,X3是T、A或C,X4是T、G或U。在一些实施方案中,此核酸结构部分含有任一个如下序列:
TBGAABGUTCG(SEQ ID NO:129)或TBGAABGTTCG(SEQ IDNO:130)。
在一些实施方案中,核酸结构部分含有任一个如下序列:5’-TCGTBGNyAX3BGX4TCG-3’(SEQ ID NO:131),其中y是0-2,B是5-溴胞嘧啶,N是任意碱基,X3是T、A或C,X4是T、G或U。在一些实施方案中,此核酸结构部分含有任一个如下序列:
TCGTBGAABGUTCG(SEQ ID NO:132)或TCGTBGAABGTTCG(SEQID NO:133)。
在一些实施方案中,核酸结构部分含有序列:AACGTTCC,AACGTTCG,GACGTTCC,GACGTTCG。
在一些实施方案中,核酸结构部分含有序列:
GGCGTTCG;GGCGCTCG;GGCGTCCG;GGCGCCCG;GACGTTCC;
GACGCTCC;GACGTCCC;GACGCCCC;AGCGTTCC;AGCGCTCC;
AGCGTCCC;AGCGCCCC;AACGTTCC;AACGCTCC;AACGTCCC;
AACGCCCC;GGCGTTCC;GGCGCTCC;GGCGTCCC;GGCGCCCC;
GACGTTCG;GACGCTCG;GACGTCCG;GACGCCCG;AGCGTTCG;
AGCGCTCG;AGCGTCCG;AGCGCCCG;AACGTTCG;AACGCTCG;
AACGTCCG;AACGCCCG;GACGCTCC;GACGCCC; AGCGTTCC;
AGCGCTCC;AGCGTCCC;AGCGCCCC;AACGTCCC;AACGCCCC;
GGCGTTCC;GGCGCTCC;GGCGTCCC;GGCGCCCC;GACGCTCG;
GACGTCCG;GACGCCCG;AGCGTTCG;AGCGTCCG;AGCGCCCG;
AACGTCCG;AACGCCCG.
在一些实施方案中,核酸结构部分含有序列:
(5’→3’)TCGTCGA;TCGTCG;TCGTTT;TTCGTT;TTTTCG;ATCGAT;
GTCGAC;GTCGTT;TCGCGA;TCGTTTT;TCGTC; TGTT;TCGT;TCG;
ACGTTT;CCGTTT;GCGTTT;AACGTT;TCGAAAA;TCGCCCC;
TCGGGGG
在一些实施方案中,核酸结构部分含有具有如下序列的RNA:AACGUUCC,AACGUUCG,GACGUUCC,和GACGUUCG。
在一些实施方案中,核酸结构部分具有这样的序列,该序列包含如在共同转让的共同待决美国专利申请09/802,685(于2002年3月7日公布为美国申请公开号20020028784A1和2001年9月20日公布为WO01/68077)、09/802,359(2001年9月20日公布为WO01/68144),和共同待决的美国申请系列号10/033,243中,或在PCT公布WO97/28259;WO98/16247;WO98/55495;WO99/11275;WO99/62923;及WO01/35991中所述的序列或序列基序。该核酸结构部分也可具有这样的序列,该序列包含任一或几个以前报道如果作为长度大于(常常实质上大于)8个核苷酸的多核苷酸进行施用时与免疫刺激活性相关的序列,参见Kandiimalla等,2001,Bioorg.Med.Chem.9:807-13;Krieg等(1989)J.Immunol.143:2448-2451;Tokunaga等(1992)Microbiol.Immunol.36:55-66;Kataoka等(1992)Jpn.J Cancer Res.83:244-247;Yamamoto等(1992)J.Immunol.148:4072-4076;Mojcik等(1993)Clin.Immuno.andImmunopathol.67:130-136;Branda等(1993)Biochem.Pharmacol.45:2037-2043;Pisetsky等(1994)Life Sci.54(2):101-107;Yamamoto等(1994a)Antisense Research and Development.4:119-122;Yamamoto等(1994b)Jpn.J.Cancer Res.85:775-779;Raz等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:9519-9523;Kimnra等(1994)J.Biochem.(Tokyo)116:991-994;Krieg等(1995)Nature374:546-549;Pisetsky等(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.772:152-163;Pisetsky(1996a)J.Immunol.156:421-423;Pisetsky(1996b)Immunity 5:303-310;Zhao等(1996)Biochem.Pharmacol.51:173-182;Yi等(1996)J.Immunol.156:558-564;Krieg(1996)Trcnds Microbiol.4(2):73-76;Krieg等(1996)Antisense Nucleic Acid Drug Dev.6:133-139;Klinman等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93:2879-2883;Raz等(1996);Sato等(1996)Science273:352-354;Stacey等(1996)J.Immunol.157:2116-2122;Ballas等(1996)J.Immunol.157:1840-1845;Branda等(1996)J.Lab.Clin.Med.128:329-338;Sonehara等(1996)J Interferon and CytokineRes.16:799-803;Klinman等(1997)J.Immunol.158:3635-3639;Sparwasse等(1997)Eur.J.Immunol.27:1671-1679;Roman等(1997)Nat Med.3:849-54;Carson等(1997)J.Exp.Med.186:1621-1622;Chace等(1997)Clin.Immunol.and Immunopathol.84:185-193;Chu等(1997)J.Exp.Med.186:1623-1631;Lipford等(1997a)Eur.J.Immunol.27:2340-2344;Lppford等(1997b)Eur.J.Immunol.27:3420-3426;Weiner等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:10833-10837;Macfarlane等(1997)Immunology 91:586-593;Schwartz等(1997)J.Clin.Invest.100:68-73;Stein等(1997)Antisense Technology,Ch.11 pp.241-264,C.Lichtenstein和W.Nellen,Eds.,IRL Press;Wooldridge等(1997)Blod89:2994-2998;Leclerc等(1997)Cell.Immunol.179:97-106;Kline等(1997)J Invest.Med.45(3):282A;Yi等(1998a)J.Immunol.160:1240-1245;Yi等(1998b)J.Immunol.60:4755-4761;Yi等(1998c)J.Immunol.60:5898-5906;Yi等(1998d)J.Immunol.161:4493-4497;Krieg(1998)Applied AntisenseOligonucleotide Technology Ch.24,pp.431-448,C.A.Stein和A.M.Krieg,Eds.,Wiley-Liss,Inc.;Krieg等(1998a)Trends Microbiol.6:23-27;Krieg等(1998b)J.Immunol.161:2428-2434;Krieg等(1998c)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:12631-12636;Spiegelberg等(1998)Allergy53(45S):93-97;Horner等(1998)Cell Immunol.190:77-82;Jakob等(1998)J.Immunol.161:3042-3049;Redford等(1998)J.Immunol.161:3930-3935;Weeratna等(1998)Antisense&Nucleic Acid Drug Development8:351-356;McCluskie等(1998)J.Immunol.161(9):4463-4466;Gramzinski等(1998)Mol.Med.4:109-118;Liu等(1998)Blood92:3730-3736;Moldoveanu等(1998) Vaccine16:1216-1224;Brazolot Milan等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:15553-15558;Briode等(1998)J.Immunol.161:7054-7062;Briode等(1999)Int.Arch.Allergy Immunol.118:453-456;Kovarik等(1999)J.Immunol.162:1611-1617;Spiegelberg等(1999)Pediatr. Pulmonol.Suppl.18:118-121;Martin-Orozco等(1999)Int.Immunol 11:1111-1118;EP468,520;WO96/02555;WO97/28259;WO98/16247;WO98/18810;WO98/37919;WO98/40100;WO98/52581;WO98/55495;WO98/55609和WO99/11275。也参见Elkins等(1999)J.Immunol.162:2291-2298,WO98/52962,WO99/33488,WO99/33868,WO99/51259和WO99/62923。还参见Zimmermann等(1998)J.Immunol.160:3627-3630;Krieg(1999)Trends Microbiol.7:64-65及美国专利号5,663,153、5,723,335和5,849,719。还可参见Liang等(1996)J.Clin.Invest.98:1119-1129;Bohle等(1999)Eur.J.Immunol.29:2344-2353和WO99/56755。还可参见WO99/61056;WO00/06588;WO00/16804;WO00/21556;WO00/54803;WO00/61151;WO00/67023;WO00/67787及美国专利号6,090,791。在一个实施方案中,CIC中至少一个核酸结构部分包含TG序列或富含嘧啶(如,富含T或富含C)的序列,如PCT公开WO01/22972所述。
在一些实施方案中,核酸结构部分与“如下”六聚体之一或多个不同:
5′-GACGTT-3′,5′-GAGCTT-3′,5′-TCCGGA-3′,
5′-AACGTT-3′,5′-GACGTT-3′,5′-TACGTT-3′,5′-CACGTT-3′,
5′-AGCGTT-3′,5′-ATCGTT-3′,5′-ACCGTT-3′,5′AACGGT-3′,
5′-AACGAT-3′,5′-AACGCT-3′,5′-AACGTG-3′,5′-AACGTA-3′和
5′-AACGTC-3′。
在一些实施方案中,CIC包含至少3个、至少10个、至少30个或至少100个具有上述序列的核酸结构部分。
C.
核酸结构部分的序列:异质性和位置效应
在含有多个核酸结构部分的CIC中,核酸结构部分可以考虑是相同的也可以是不同的。
在一个实施方案中,CIC中所有的核酸结构部分具有相同的序列。在一个实施方案中,CIC包含具有至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个或更多个不同序列的核酸结构部分。在一个实施方案中,CIC包含少于10个的不同核酸结构部分。在一个实施方案中,CIC中每个核酸结构部分具有不同的序列。
在一些实施方案中,单个核酸结构部分包含上述§3(B)中所列的序列基序的一个以上重复,或者包含两个或两个以上不同的序列基序。在单个核酸结构部分内这些基序可以相邻,重叠,或被核酸结构部分内的其他核苷酸碱基分开。在一个实施方案中,核酸结构部分包括一个或多个回文序列区。对单链寡核苷酸来说,术语“回文序列(palindromic)”指的是在该寡核苷酸与一个互补序列复合形成双链分子时将呈回文结构的序列。在另一个实施方案中,CIC中的一个核酸结构部分相对于第二核酸结构部分具有回文或部分回文的序列。在本发明的一个实施方案中,CIC的一个或多个核酸结构部分的序列不具回文结构。在本发明的一个实施方案中,CIC的一个或多个核酸结构部分的序列不包括大于四个碱基,任选地大于6个碱基的回文序列。
如上所述,在多个实施方案中,CIC中一个或多个(如全部)的核酸结构部分包含5’-CG-3’序列,或者,包含5’-TCG-3’序列。在一个实施方案中,此核酸结构部分的长度为5、6或7个碱基。在一个实施方案中,此核酸结构部分具有式5′-TCG[(X)2-4]-3′或5′-TCG(A/T)[(X)1-3]或5′-TCG(A/T)CG(A/T)-3′或5′-TCGACGT-3′(其中每个X都是独立地选择的核苷酸)。在一个实施方案中,前述的核酸结构部分是5-引发(prime)结构部分。
在一个实施方案中,核酸结构部分包含序列5’-TCGTCGA-3’。在一个实施方案中,核酸结构部分包含选自如下的序列(皆沿着5’→3’方向):
TCGXXXX,TCGAXXX,XTCGXXX,XTCGAXX,TCGACGT,
TCGAACG,TCGAGAT,TCGACTC,TCGAGCG,TCGATTT,
TCGCTTT,TCGGTTT,TCGTTTT,TCGTCGT,ATCGATT, TTCGTTT,
TTCGATT,ACGTTCG,AACGTTC,TGACGTT,TGTCGTT, TCGXXX,
TCGAXX, GTCGTT, GACGTT, ATCGAT, TCGTCG; TCGTTT;
TCGAGA; TTCGAG; TTCGTT; AACGTT; AACGTTCG;AACGUTCG,
ABGUTCG,TCGXX, TCGAX, TCGAT, TCGTT,TCGTC;TCGA,TCGT,和TCGX(其中X是A、T、G或C;U是2’-脱氧尿苷,B是5-溴-2’-脱氧胞苷)。
在一个实施方案中,核酸结构部分是具有序列TCGXXXX,
TCGAXXX,XTCGXXX,XTCGAXX,TCGTCGA,TCGACGT,
TCGAACG,TCGAGAT,TCGACTC,TCGAGCG,
TCGATTT,TCGCTTT,TCGGTTT,TCGTTTT,TCGTCGT,ATCGATT,
TTCGTTT,TTCGATT,ACGTTCG,AACGTTC,TGACGTT或TGTCGTT的7-聚体;或者是具有序列TCGXXX,TCGAXX,TCGTCG,AACGTT,ATCGAT,GTCGTT或GACGTT的6-聚体;或者是具有序列TCGXX,TCGAX,TCGAT,TCGTT或TCGTC的5-聚体;或者是具有序列TCGA,TCGT或TCGX的4-聚体;或者是具有序列TCG的3-聚体;其中X是A,T,G或C。
在一个实施方案中,CIC中至少约25%,优选至少约50%,或至少约75%,有时全部的核酸结构部分包含至少一个前述序列。在一个实施方案中,至少一个核酸结构部分不含有CG基序。在其他实施方案中,CIC中至少约25%,有时至少约50%,有时至少约75%的核酸结构部分是不具有CG基序或,可替换地,TCG基序的核酸结构部分。
序列或序列基序在CIC中的位置可影响此CIC的免疫调制活性,如在下文实施例中所述。谈及一个序列基序在CIC的核酸结构部分中的位置时,下列术语学是有用的:(1)在包含多个核酸结构部分的CIC中,带游离5’-端的结构部分称为“5-引发结构部分”。应理解单个CIC可具有多个5-引发结构部分。(2)在任何特定的核酸结构部分内,当此结构部分中一个序列或基序的5’端没有核苷酸碱基时,则此序列或基序处于此结构部分的“5-引发位置”。因此,在具有序列5’-TCGACGT-3’的结构部分中,序列T、TC、TCG和TCGA处于“5-引发位置”,而序列GAC则不是。举例来说,在核酸结构部分的“5-引发位置”含有序列TCG的CIC与除了TCG基序定位不同外相类似的CIC相比可以更具有活性。CIC在“5-引发结构部分”中,如在“5-引发结构部分”的“5-引发位置”具有TCG序列可以使此CIC特别有活性。实例参见实施例38。带有游离5’-端的核酸结构部分可用在式中位于此核酸结构部分碱基序列左侧的符号“5’F”来表示(如,5’F-TACG-3’)。如此处所用,术语“游离5’端”在核酸结构部分这一语境中具有通常的含义,即是指核酸结构部分的5’末端不与封端基团或非核苷酸间隔体结构部分缀合。
免疫刺激活性还可受到CG基序在核酸结构部分(如,在5’-结构部分)中的位置的影响。例如,在一个有用的实施方案中,CIC含有至少一个具有序列5’-X-CG-Y-3’的核酸结构部分,其中X是0、1、或2个核苷酸,Y是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或15个以上核苷酸长。在一个实施方案中,5’-X-CG-Y-3’序列位于CIC的5’-结构部分中,如,CIC的5’-引发位置。在一个实施方案中,CIC含有2、3或更多个具有式5’-X-CG-Y-3’序列的核酸结构部分。例如,在一个实施方案中,CIC的所有核酸结构部分都具有式5’-X-CG-Y-3’的序列。
同样,在核酸结构部分中含序列TCGA(如,包括TCGACGT的序列)的CIC具有免疫调制活性,并且在IFN-α诱导中是有效的。在5-引发结构部分(如在5-引发结构部分的5-引发位置)中的TCGA(如,包括TCGACGT的序列)可使CIC特别有活性。参见实施例38和49。因此,在一个实施方案中,CIC包含具有式(5’-N1-3’)-S1-N2(Ia)的核心结构,其中N1具有序列5’-TCGAX-3’,X是0至20个核苷酸碱基,常是0至3个碱基。在一个实施方案中,X是CGT。序列TCGTCGA在IFN-α诱导中也是特别有效的。
另外,游离的(非缀合的)核酸5’端的存在能够影响免疫刺激活性。实例参见实施例39。在多个实施方案中,本发明的CIC包含至少1、至少2、至少3、至少4、或至少5个游离5’端。在一些实施方案中,游离5’端的数目是1至10、2至6、3至5、或4至5。在一个实施方案中,游离5’端的数目是至少约50或至少约100。
D.
“独立免疫调制活性”
核酸结构部分的一个性质是与核酸结构部分的核苷酸序列相关的“独立免疫调制活性”。如上文所述,本发明人发现,令人惊奇地是,甚至当CIC的所有核酸结构部分均不具有如果以单独多核苷酸形式呈递可显示出相当的免疫调制活性的序列时,CIC仍显示出免疫调制活性。
在一些实施方案中,如下所述,CIC的核酸结构部分不具有“独立免疫调制活性”,或其具有“次独立免疫调制活性”(即,与此CIC相比)。
核酸结构部分的“独立免疫调制活性”可通过测量具有核酸结构部分的一级序列并具有相同的核酸主链(如,硫代磷酸酯,磷酸二酯,嵌合主链)的独立多核苷酸的免疫调制活性来确定。例如,具有结构“5’-TCGTCG-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-AGATGAT-3_的CIC包含三个核酸结构部分。举例来说,为测定CIC中第一个核酸结构部分的独立免疫调制活性,首先利用常规方法合成一个具有相同序列(即,5’-TCGTCG-3’)和相同主链结构(如,硫代磷酸酯)的测试多核苷酸,再测定它的免疫调制活性(如果有的话)。免疫调制活性可利用能够指示免疫应答的不同方面的标准试验,如上文§2所述的那些试验进行测定。优选利用上文§2中所述的人PBMC试验。如上所述,考虑到供体的差异,一般利用从多个供体获得的细胞进行该试验。如果在大多数供体中由接触过多核苷酸的PBMC所分泌的IFN-γ量不显著大于(如,小于约2倍大于)在没有测试化合物存在下或(在一些实施方案中)在无活性对照化合物(如,5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’)(SEQ ID NO:3))存在下的IFN-γ分泌量,则此多核苷酸不具有免疫调制活性(及相对应的核酸结构部分不具有“独立免疫调制活性”)。
为比较CIC和独立多核苷酸的免疫调制活性,优选利用如上文§2中所述的人PBMC试验测量免疫调制活性。一般来说,通过在相同条件下(如,利用同种细胞),一般以约20μg/ml浓度,对两种化合物进行平行测试来比较它们的活性。如上所述,浓度一般可通过测定260nm下的吸光度并利用0.5 OD260/ml=20μg/ml这一转换进行确定。这一操作可对试验样本中的核酸总量进行标准化。作为替代的方案,浓度或重量可利用本领域已知的其他方法测定。如果需要,核酸结构部分的量可通过测量260nm的吸光度确定,而利用CIC的分子式可计算出CIC的重量。这种方法有时用在CIC中间隔体结构部分所占重量相对于核酸结构部分所占重量的比率较高(即,大于1)的情况下。
作为替代的方案,可使用3μM浓度,特别是当相比较的两种样本的计算分子量差异超过20%时。
如果测试的多核苷酸具有的活性小于相比的CIC的活性,则CIC的核酸结构部分可表征为具有“次免疫调制活性”。优选地,测试的多核苷酸的独立免疫调制活性不超过CIC活性的约50%,更优选不超过CIC活性的约20%,最优选不超过CIC活性的约10%,或在一些实施方案中,甚至更少。
对于具有多个(如,多个不同)核酸结构部分的CIC,也可以测定相应于此多个核酸结构部分的测试多核苷酸混合物的免疫调制活性(如果有的话)。这一试验可利用总量等于所用CIC的量的测试多核苷酸(即,在混合物中)来进行。作为替代的方案,在此试验中,混合物中每个测试多核苷酸或每个不同的测试多核苷酸的量可等于CIC的量。如§2所述,考虑到供体差异,优选利用来自多个供体的PMBC进行试验和分析。
在一个实施方案中,CIC中的一个或多个核酸结构部分(如,至少约2个、至少约4个、或至少约25%、至少约50%、或者全部核酸结构部分,它们被单独测定或,作为替代的方案,被组合测定)不具有独立免疫调制活性。在一个实施方案中,CIC中一个或多个的核酸结构部分(如,至少约2个、至少约4个、或至少约25%、至少约50%、或者全部的核酸结构部分,被单独测定或,作为替代的方案,被组合测定)相对于此CIC具有次独立免疫调制活性。
在一个相关实施方案中,CIC包含一个或多个具有独立免疫调制活性的核酸结构部分。例如,在一些实施方案中,全部或几乎全部(如,至少90%,优选至少95%)的核酸结构部分具有独立免疫调制活性。例如,一个含有多价间隔体的CIC可包含多于4个,经常多于10个,时常是至少约20个,至少约50个,至少约100个,至少约400个或至少约1000个(如,至少约2500个)具有独立免疫调制活性(如,具有序列5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:2))的核酸结构部分。
因此,在特定的CIC中,具有独立免疫调制活性的核酸结构部分的数目可以是0、1、2或2以上、3或3以上、小于3、4或4以上、小于4、5或5以上、小于5、至少10、至少约20、至少约50、至少约100、至少约400或至少约1000、全部,或小于全部的CIC核酸结构部分。
E.
核酸结构部分的结构
CIC的核酸结构部分可包含相对于天然核酸的结构修饰。所述修饰包括本领域已知的任一种可用于多核苷酸的修饰,但不限于3’OH或5’OH基团的修饰、核苷酸碱基的修饰、糖成分的修饰、以及磷酸酯基团的修饰。下面对各种此类修饰进行说明。
核酸结构部分可以是DNA、RNA或混合的DNA/RNA、单链、双链或部分双链,并且可包含其他的修饰多核苷酸。可考虑双链的核酸结构部分和CIC,而且除非另有说明,术语“碱基(base)”或“核苷酸(nucleotides)”的说法意指包括碱基对或碱基对核苷酸。核酸结构部分可包含天然存在的或修饰的、非天然存在的碱基,并可包含修饰的糖、磷酸酯和/或末端。例如,磷酸酯的修饰包括但不限于甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(桥接或非桥接)、磷酸三酯和二硫代磷酸酯,并且可以任意组合使用。也可使用其它非磷酸酯连接。优选地,本发明的CIC和核酸结构部分包含硫代磷酸酯主链。也可制备本领域公知的糖修饰,如2′-烷氧基-RNA类似物、2′-氨基-RNA类似物和2′-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合体及此处描述的其它糖修饰,并与任意磷酸酯修饰组合。碱基修饰的实例(以下进一步讨论)包括但不限于向胞嘧啶的C-5和/或C-6添加吸电子结构部分(如5-溴胞嘧啶,5-氯胞嘧啶,5-氟胞嘧啶,5-碘胞嘧啶)和向尿嘧啶的C-5和/或C-6添加吸电子结构部分(如5-溴尿嘧啶,5-氯尿嘧啶,5-氟尿嘧啶,5-碘尿嘧啶)。参见如PCT公开号WO99/62923。
核酸结构部分还可包含磷酸酯被修饰的核苷酸。包含修饰的磷酸酯键或非磷酸酯键的核酸的合成也为本领域公知。综述参见《作为治疗剂的寡核苷酸》(Oligonucleotides as Therapeutic Agents)(D.J.Chadwick和G.Cardew编辑)John Wiley and Sons,New York,NY一书中的Matteucci(1997)“寡核苷酸类似物:总览”(″Oligonucleotide Analogs:anOverview″)。可与本发明核酸中的糖或糖类似物结构部分连接的磷衍生物(或修饰的磷酸酯基)可为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或氨基磷酸酯等。上述磷酸酯类似物的制备及它们向核苷酸、修饰的核苷酸和寡核苷酸中的掺入本身也是公知的并无需在此详述。Peyrottes等人(1996)核酸研究(Nucleic Acids Res.)24:1841-1848;Chaturvedi等人(1996)核酸研究(Nucleic Acids Res.)24:2318-2323;和Schultz等人(1996)核酸研究(Nucleic Acids Res.)24:2966-2973。例如,硫代磷酸酯寡核苷酸的合成类似于上述天然寡核苷酸的合成,除了氧化步骤用硫化步骤替换外(用于寡核苷酸和类似物的方法、合成和特性(Protocols for Oligonucleotides and Analogs,Synthesis andProperties)(Agrawal编辑)Humana Press一书中的Zon(1993)“寡核苷硫代磷酸酯”(″Oligonucleoside Phosphorothioates″)165-190页)。同样,其它磷酸酯类似物的合成如磷酸三酯的合成(Miller等人(1971)JACS93:6657-6665)、非桥接氨基磷酸酯的合成(Jager等人(1988)生物化学(Biochem.)27:7247-7246)、N3′至P5′phosphoramidiates的合成(Nelson等人(1997)JOC62:7278-7287)和二硫代磷酸酯的合成(美国专利号5,453,496)也已有描述。也可使用其它基于非磷的修饰核酸(Stirchak等人(1989)核酸研究(Nucleic Acids Res.)17:6129-6141)。具硫代磷酸酯主链的核酸在注射入宿主后似乎更抗降解。Braun等人(1988)免疫学杂志(J.Immunoi.)141:2084-2089;和Latimer等人(1995)分子免疫学(Mol.Immunol.)32:1057-1064。
用于本发明的核酸结构部分可包含核糖核苷酸(包含核糖作为唯一或主要的糖成分)和/或脱氧核糖核苷酸(包含脱氧核糖作为主要的糖成分)。可以在核酸结构部分中掺入修饰的糖或糖类似物。因此,糖结构部分除了核糖和脱氧核糖外,还可为戊糖、脱氧戊糖、己糖、脱氧己糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖和糖″类似物″环戊基基团。糖可为吡喃型或呋喃型。糖结构部分优选为核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖或2′-O-烷基核糖的呋喃糖苷,且糖可以以α或β端基异构构型和各杂环碱基连接。糖的修饰包括但不限于2′-烷氧基-RNA类似物、2′-氨基-RNA类似物和2′-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合体。例如在CIC中糖的修饰包括但不限于2’-氨基-2’-脱氧腺苷。这些糖或糖类似物以及相应″核苷″(其中此类糖或类似物与杂环碱基(核酸碱基)连接)的制备本身是公知的,并无需在此描述,除非此类制备可能涉及到任何具体的实施例。在制备CIC时也可进行糖修饰并与任何磷酸酯修饰结合。
掺入核酸结构部分中的杂环碱基或核酸碱基可为天然存在的主要嘌呤和嘧啶碱基(即尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤,如上所述),以及所述主要碱基的天然和合成的修饰物。
本领域技术人员将意识到包含各种杂环碱基和各种糖部分(和糖类似物)的大量″合成的″非天然核苷在本领域中是现成的,并且只要满足本发明的其它要求,核酸结构部分可包括不属于此主要五种天然核酸碱基成分的一种或几种杂环碱基。但优选地,此杂环碱基是,但不限于,尿嘧啶-5-基、胞嘧啶-5-基、腺嘌呤-7-基、腺嘌呤-8-基、鸟嘌呤-7-基、鸟嘌呤-8-基、4-氨基吡咯并[2.3-d]嘧啶-5-基、2-氨基-4-氧代吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基或2-氨基-4-氧代吡咯并[2,3-d]嘧啶-3-基,其中嘌呤通过9-位、嘧啶通过1-位、吡咯并嘧啶通过7-位而吡唑并嘧啶通过1-位与核酸结构部分中的糖结构部分连接。
核酸结构部分可包含至少一种修饰碱基。如此处所用,术语″修饰的碱基″与″碱基类似物″同义,如″修饰的胞嘧啶″与″胞嘧啶类似物″同义。类似地,″修饰的″核苷或核苷酸在此处定义为与核苷或核苷酸″类似物″同义。碱基修饰的实例包括但不限于向核酸结构部分中的胞嘧啶的C-5和/或C-6添加吸电子结构部分。优选地,该吸电子结构部分为卤素。此类修饰的胞嘧啶可包括但不限于氮杂胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、氯化胞嘧啶、环胞嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟胞嘧啶、氟嘧啶、5,6-二氢胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-硝基胞嘧啶和任何其它嘧啶类似物或修饰的嘧啶。碱基修饰的其它实例包括但不限于向核酸结构部分中的尿嘧啶的C-5和/或C-6添加吸电子结构部分。优选地,该吸电子结构部分为卤素。此类修饰的尿嘧啶可包括但不限于5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-碘尿嘧啶。还可参见Kandimalia等,2001,Bioorg.Med.Chem.9:807-13。
碱基修饰的其它实例包括添加一个或多个含硫基团至碱基上,包括,但不限于6-硫代鸟嘌呤、4-硫代胸腺嘧啶和4-硫代尿嘧啶。
具有修饰碱基的核苷的制备和使用所述具有修饰碱基的核苷作为前体进行的修饰寡核苷酸的合成已在例如美国专利4,910,300、4,948,882和5,093,232中描述。这些具有修饰碱基的核苷经设计以致可通过化学合成掺入寡核苷酸的末端或内部。此类存在于寡核苷酸末端或内部的具有修饰碱基的核苷可作为连接肽或其它抗原的位点。糖结构部分被修饰的核苷也已有描述(包括但不限于例如,美国专利4,849,513、5,015,733、5,118,800、5,118,802)并可类似地使用。
4.非核酸间隔体结构部分
本发明的CIC化合物包含一个或多个与核酸结构部分共价结合的非核酸间隔体结构部分。为方便起见,非核酸间隔体结构部分有时在本文中简称为“间隔体”或“间隔体结构部分”。
间隔体一般具有从约50至约500,000(如约50至约50,000),有时从约75至约5000,有时从约75至约500的分子量,在不同实施方案中此间隔体与一个、两个、三个、或三个以上的核酸结构部分共价结合。有多种试剂适用于连接核酸结构部分。例如,在科学文献中被称作“非核酸接头”、“非核苷酸接头”、或“价平台分子(valency platform molecule)”的多种化合物可用作CIC中的间隔体。如果说一个间隔体结构部分含有特定间隔体成分(如,六聚乙二醇),则此间隔体包含该成分(或取代的衍生物)作为间隔体的亚单元或部分。例如,实施例49中所示的间隔体可描述为包含多糖成分、六聚乙二醇成分、和衍生的硫醚接头成分。如下所述,在某些实施方案中,间隔体包含多个共价连接在一起的亚单元并且可以具有均聚体结构或杂聚体结构。常常这些亚单元通过接头、磷酸二酯键、和/或硫代磷酸酯酯键进行连接。参见下文实施例。包含多个此类单元或由它们衍生得到的CIC非核苷酸间隔体结构部分可以称为“复合间隔体”。在一个实施方案中,为举例说明而非限制目的,CIC包含复合间隔体,该间隔体含有经磷酸二酯键和/或硫代磷酸酯酯键连接在一起的任意两个或更多个(如,3个或3个以上、4个或4个以上、或5个或5个以上)如下化合物:低聚乙二醇单元(如,三聚乙二醇间隔体;六聚乙二醇间隔体;);烷基单元(如,丙基间隔体;丁基间隔体;己基间隔体);分支间隔体(如,2-(羟甲基)乙基间隔体;丙三醇间隔体;三倍增体(trebler)间隔体;对称双倍增体(doubler)间隔体)。
应明了的是单核苷酸和多核苷酸不包括在非核酸间隔体的定义之内,否则核酸结构部分和相邻的非核酸间隔体结构部分之间将无法区分。
本文描述了许多不同间隔体,但仅为举例说明起见并不限于此,。读者应了解的是,为便于说明,间隔体结构部分(或间隔体结构部分的成分)有时以间隔体结构部分或其成分的来源化合物的化学名称(如,六聚乙二醇)来提及,并应理解CIC实际上包含这些化合物与核酸结构部分的缀合物。正如本领域技术人员明了的(并如下文进一步详述的),非核酸间隔体可以(并通常是)从间隔体结构部分前体形成,此前体包含允许一个或多个核酸(如,寡核苷酸)可以偶联到间隔体结构部分前体上形成CIC的反应基团且可以包含保护基团。间隔体前体上的反应基团可以是相同的或不同的。
可例举的非核酸间隔体包括低聚-乙二醇(如,三聚乙二醇、四聚乙二醇、六聚乙二醇间隔体,和其他含有多达约10个、约20个、约40个、约50个、约100个或约200个乙二醇单元的聚合物)、烷基间隔体(如,丙基、丁基、己基和其他C2-C12烷基间隔体,如一般为C2-C10烷基,最常见为C2-C6烷基)、从丙三醇、季戊四醇、1,3,5-三羟基环己烷或1,3-二氨基-2-丙醇衍生得到的对称或不对称间隔体(如,此处所述的对称双倍增体和三倍增体间隔体结构部分)。任选地这些间隔体成分被取代。举例来说,丙三醇和1,3-二氨基-2-丙醇可在1、2和/或3位进行取代(例如,以下列的一个基团置换一个或多个与碳连接的氢),这是本领域普通技术人员所了解的。同样,季戊四醇可以在任意的或全部的亚甲基位置被如下任何基团取代。取代基包括醇、烷氧基(如甲氧基、乙氧基、和丙氧基)、直链或支链烷基(如C1-C12烷基)、胺、氨基烷基(如氨基C1-C12烷基)、亚磷酰胺、磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、酰肼、肼、卤素(如F、Cl、Br、或I)、酰胺,烷基酰胺(如C1-C12烷基酰胺)、羧酸、羧酸酯、羧酸酐、羧酸酰卤、醚、磺酰卤、亚氨酸(imidate)酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、卤代甲酸酯、碳二亚胺加合物、醛、酮、巯基、卤代乙酰基、烷基卤化物、磺酸烷基酯、NR1R2(其中R1R2是-C(=O)CH=CHC(=O))(顺丁烯二酰亚胺)、硫醚、氰基、糖(如甘露糖、半乳糖和葡萄糖)、α,β-不饱和羰基、烷基汞、α,β-不饱和砜。
在一个实施方案中,间隔体可含有一个或多个脱碱基核苷酸(即,缺少核苷酸碱基但有糖和磷酸部分)。可例举的脱碱基核苷酸包括1’2’-二脱氧核糖、1’-脱氧核糖、1’-脱氧阿拉伯糖以及它们的聚合物。
间隔体可包含此处所述的非核酸成分的均聚的或杂聚的低聚物和聚合物(如,通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯酯键或,作为替代,酰胺键、酯键、醚键、硫醚键、二硫键、氨基磷酸酯键、磷酸三酯键、二硫代磷酸酯键、甲基磷酸酯键或其他键进行连接)。例如,在一个实施方案中,间隔体结构部分含有经磷酸二酯键或硫代磷酸酯键缀合到低聚乙二醇如HEG上的分支间隔体成分(如,丙三醇)(实例参见,C-94)。另一个例子是包含与低聚乙二聚如HEG缀合的多价间隔体成分的间隔体。
其他适宜的间隔体包括取代的烷基、取代的聚二醇、任选取代的聚胺、任选取代的聚醇、任选取代的聚酰胺、任选取代的聚醚、任选取代的聚亚胺、任选取代的聚磷酸二酯(如聚(1-磷酸-3-丙醇)),等。任选的取代基包括醇、烷氧基(如,甲氧基、乙氧基、和丙氧基),直链或支链烷基(如C1-C12烷基)、胺、氨基烷基(如氨基C1-C12烷基)、亚磷酰胺、磷酸酯、硫代磷酸酯、酰肼、肼、卤素(如F、Cl、Br、或I)、酰胺,烷基酰胺(如C1-C12烷基酰胺)、羧酸、羧酸酯、羧酸酐、羧酸酰卤、醚、磺酰卤、亚氨酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、卤代甲酸酯、碳二亚胺加合物、醛、酮、巯基、卤代乙酰基、烷基卤化物、磺酸烷基酯、NR1R2(其中R1R2是-C(=O)CH=CHC(=O))(顺丁烯二酰亚胺)、硫醚、氰基、糖(如甘露糖、半乳糖和葡萄糖)、α,β-不饱和羰基、烷基汞、α,β-不饱和砜。
其他适用的间隔体可包括多环分子,如那些含有苯基或环己基环的多环分子。间隔体可以是聚醚如聚磷酸丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇,双官能(biofunctional)多环分子如双官能并环戊二烯、茚、萘、甘菊环、庚搭烯、亚联苯基、不对称indacene、对称indacene、苊、芴、phenalene、菲、蒽、荧蒽、acephenathrylene、醋蒽烯、苯并菲、芘、
并四苯、噻蒽、异苯并呋喃、色烯、呫吨、苯并氧硫杂环己二烯——它们可以是取代的或修饰的,或可以是聚醚和多环分子的组合。多环分子可利用C1-C75烷基、C6烷基、链烯基、羟烷基、卤素或卤代烷基基团进行取代或多取代。含氮多杂环分子(如,中氮茚)一般不是适用的间隔体。间隔体还可以是聚醇,如丙三醇或季戊四醇。在一个实施方案中,间隔体包括(1-磷酸丙烷)3-磷酸酯或(1-磷酸丙烷)4-磷酸酯(也称四磷酸丙二醇和戊磷酸丙二醇)。在一个实施方案中,间隔体包括2,2’-亚乙基二氧基二乙胺(EDDA)的衍生物。
其他可例举的用于CIC的非核酸间隔体包括如下文献中描述的“接头”:Cload和Schepartz,J.Am.Chem.Soc.(1991),113:6324;Richardson和Schepartz,J.Am.Chem.Soc.(1991),113:5109;Ma等,Nucleic AcidsResearch(1993),21:2585;Ma等,Biochemistry(1993),32:1751;McCurdy等,Nucleosides & Nucleotides(1991),10:287;Jaschke等,Tetrahedron Lett.(1993),34:30l;Ono等,Biochemistry(1991),30:9914;和Arnold等,国际公开号WO89/02439和EP0313219B1标题“用于核苷酸探针的非核酸连接试剂”;Salunkhe等,J.Am.Chem.Soc.(1992),1l4:8768;Nelson等,Biochemistry,35:5339-5344(1996);Bartley等,Biochemistry36:14502-511(1997);Dagneaux等Nucleic Acids Research24:4506-12(1996);Durand等,Nucleic Acids Research 18:6353-59(1990);Reynolds等,Nucleic Acids Research,24:760-65(1996);Hendry等Biochemica et Biophysica Acta,1219:405-12(1994);Altmann等,NucleicAcids Research,23:4827-35(1995),和美国专利号6,117,657(Usman等)。
适宜的间隔体结构部分可为CIC提供电荷和/或疏水性,提供有利的药物代谢动力学性质(如,提高的稳定性、血液中更长的滞留时间),和/或导致CIC靶向特定细胞或器官。可对间隔体结构部分进行选择或修饰以使CIC适合所需要的药物代谢动力学性质、特定免疫应答的诱导或适用于所需要的施用方式(如,口服)。
在包含一个以上间隔体结构部分的CIC中,间隔体可以是相同或不同的。因此,在一个实施方案中CIC中全部非核酸间隔体结构部分具有相同结构。在一个实施方案中,CIC包含具有至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、或至少6种或更多种不同结构的非核酸间隔体结构部分。
在本发明考虑的一些实施方案中,规定CIC的间隔体结构部分不包括某些结构。因此,在本发明的一些实施方案中,间隔体不是脱碱基核苷酸或脱碱基核苷酸的聚合物。在本发明的一些实施方案中,间隔体不是低聚(乙二醇)(如,HEG、TEG等)或聚(乙二醇)。在一些实施方案中间隔体不是C3烷基间隔体。在一些实施方案中间隔体不是烷基或取代的间隔体。在一些实施方案中间隔体不是多肽。因此,在一些实施方案中,免疫原性分子,如蛋白质或多肽不适于作为间隔体结构部分的成分。然而,如下文所述,可考虑在某些实施方案中,CIC是“蛋白质样的CIC”,即,包含含有多肽(即,氨基酸的低聚物或聚合物)的间隔体结构部分。例如,如下文所述,在一些实施方案中,多肽抗原可作为平台(多价间隔体)缀合多个核酸结构部分。然而,在一些实施方案中,间隔体结构部分不是蛋白质样的和/或不是抗原(即,间隔体结构部分,如果从CIC中分离出来,不是抗原)。
适宜的间隔体结构部分不会使将其作为组成成分的CIC不溶于水溶液(如,PBS,pH7.0)。因此,间隔体的定义排除了微载体或毫微载体。此外,低溶解性的间隔体结构部分,如十二烷基间隔体(当作为二醇前体1,12-二羟基十二烷测定时,溶解性<5mg/ml)不是优选的,这是因为它能减少CIC的亲水性和活性。优选地是,间隔体结构部分在例如作为二醇前体测定时具有远大于5mg/ml的溶解性(如,溶解性至少约20mg/ml、至少约50mg/ml、或至少约100mg/ml)。检测间隔体结构部分水溶性时所用的间隔体结构部分的形式一般是最紧密相关的无活性且无保护的间隔体前体分子。例如,C-19包含这样一个间隔体结构部分,其中包括在C-1和C-12位置上有硫代磷酸酯二酯键的十二烷基基团,从而使该间隔体结构部分连接到核酸结构部分。在这种情况下,检测二醇形式的十二烷基间隔体(1,12-二羟基十二烷)的水溶解性,发现小于5mg/ml。具有较高水溶性(在以它们的二醇前体进行检测时)的间隔体可导致具有更大免疫刺激性的CIC。这类较高水溶性的间隔体包括,不限于,丙烷-1,3-二醇、丙三醇、丁烷-1,4-二醇、戊烷-1,5-二醇、己烷-1,6-二醇、三聚乙二醇、四聚乙二醇和HEG。
A.
带电荷的多单元间隔体结构部分
CIC的电荷可由核酸结构部分中的磷酸酯、硫代磷酸酯、或其他基团以及非核酸间隔体结构部分中的基团来提供。在本发明的一些实施方案中,非核酸间隔体结构部分带有净电荷(如,在pH7测定时带有净正电荷或净负电荷)。在一个有用的实施方案中,CIC具有净负电荷。在一些实施方案中,CIC间隔体结构部分的负电荷可通过衍生此处所述的间隔体亚单元增加其电荷来得到增加。例如,丙三醇可共价结合两个核酸结构部分,而余下的醇可与活化的亚磷酰胺反应,然后经过氧化或硫化作用分别形成磷酸酯或硫代磷酸酯。在某些实施方案中,由CIC非核酸间隔体结构部分提供的负电荷(即,在有一个以上间隔体时的电荷总量)大于由CIC的核酸结构部分提供的负电荷。电荷可根据分子式计算出来或通过实验方法,如通过毛细管电泳来测定(Li,ed.,1992,毛细管电泳,原理、操作和应用(Electrophoresis,Principles,Practice and Application),Elsevier SciencePublishers,Amsterdam,The Netherlands,pp202-206)。
如上文所述,适宜的间隔体可以是较小非核酸(如,非核苷酸)化合物的聚合物,这些化合物参见本文所述的那些,它们本身可作为间隔体,其中包括一般称为非核苷酸“接头”的化合物。此类聚合物(即,“多单元间隔体”)可以是杂聚体或均聚体,并且常包含通过酯键(如,磷酸二酯或硫代磷酸酯)连接的单体单元(如,HEG、TEG、丙三醇、1′,2′-双脱氧核糖等)。因此,在一个实施方案中间隔体含有非核苷酸单元(如,2至约100个单元、或者2至约50,如2至约5,或者如约5至约50,如约5至约20个单元)的聚合物(如,杂聚物)结构。
为举例说明,含有多单元间隔体的CIC包括
5′-TCGTCG-(C3)15-T
5′-TCGTCG-(丙三醇)15-T
5′-TCGTCG-(TEG)8-T
5′-TCGTCG-(HEG)4-T
其中(C3)15是指经硫代磷酸酯连接的15个丙基接头;(丙三醇)15是指经硫代磷酸酯连接的15个丙三醇接头;;(TEG)8是指经硫代磷酸酯连接的8个三聚乙二醇接头;(HEG)4是指经硫代磷酸酯连接的4个六聚乙二醇接头。应该明了,某些多单元间隔体具有净负电荷,并且负电荷量可通过增加如酯连接的单体单元的数目来增加。
B.多价间隔体结构部分
在某些实施方案中,间隔体结构部分是多价的非核酸间隔体结构部分(即,“多价间隔体”)。如本文中所用,含多价间隔体的CIC包含与三(3)个或更多个核酸结构部分共价结合的间隔体。在本领域中多价间隔体有时称为“平台分子(platform molecules)”。多价间隔体可以是聚合物或非聚合物。可例举的适宜分子包括丙三醇或取代的丙三醇(如,2-羟甲基丙三醇、乙酰丙酰基-丙三醇);四氨基苯、七氨基-β-环糊精、1,3,5-三羟基环己烷、季戊四醇和季戊四醇衍生物、四氨基季戊四醇、1,4,8,11-四氮杂环十四烷(Cyclam)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷(Cyclen)、聚乙烯亚胺、1,3-二-氨基-2-丙醇和取代衍生物(如,“对称双倍增体”)、[丙基氧基甲基]乙基化合物(如“三倍增体”)、聚乙二醇衍生物如所谓的“StarPEG”和“bPEG”(实例参见Gnanou等,1988,Makromol.Chem.189:2885;Rein等,1993,Acta Polymer44:225,Merrill等,美国专利号5,171,264;Shearwater Polymers Inc.,Huntsville AL)、树状体和多糖。
树状体(Dendrimer)是本领域已知的,是以化学方法定义的球状分子,一般通过多官能单体的逐步反应或反复反应以得到一个分支结构来制备(实例参见Tomalia等,1990,Angew.Chem.Int.Ed.Engl 29:138-75)。许多树状体是已知的,如以胺封端的聚氨基胺、聚乙烯亚胺和聚丙烯亚胺树状体。可例举的适用于本发明的树状体包括“密集星形(dense star)”聚合物或“星爆形(starburst)”聚合物,如在美国专利号4,587,329;5,338,532;和6,177,414中所述的那些聚合物,其中包括所谓“聚(氨基胺)(“PAMAM”)树状体”。此外其他适用于本发明的多聚体间隔体分子包括以化学方法定义的非聚合的价平台分子,如在美国专利5,552,391;和PCT申请PCT/US00/15968(以WO00/75105公布);PCT/US96/09976(以WO96/40197公布),PCT/US97/10075(以WO97/46251公布);PCT/US94/10031(以WO95/07073公布);和PCT/US99/29339(以WO00/34231公布)中公开的那些分子。许多其他合适的多价间隔体也可利用并且它们将是本领域的技术人员所已知的。
使核酸结构部分缀合到平台分子上可通过多种方式实现,典型地涉及到一个或多个交联剂以及核酸结构部分和平台分子上的官能团。连接基团可利用标准合成化学技术添加到平台上。连接基团可利用标准合成技术添加到核酸结构部分上。
本发明实施中可使用具有各种效价的多价间隔体,在多个实施方案中CIC的多价间隔体与约3至约400个核酸结构部分,有时约100至约500个、有时约150至约250个、有时3-200个、有时3至100个、有时3-50,时常3-10,并有时多于400个核酸结构部分结合。在许多不同实施方案中,多价间隔体与多于10、多于25、多于50、多于100或多于500个的(可以相同或不同的)核酸结构部分缀合。应该理解的是,在某些实施方案中,当CIC含有多价间隔体时,本发明提供的是一组分子结构略有差异的CIC。例如,当利用具有高效价的树状体、多糖或其他多价间隔体制备CIC时,可产生稍具异质性的分子混合物,即,包含不同数量的(在或主要在可测定的范围内)核酸结构部分被连接到此多价间隔体结构部分上形成的分子。如果树状体、多糖等被用作多价间隔体的元件,则核酸结构部分可直接或间接连接到此元件(如,树状体)。例如,CIC可包含通过低聚乙二醇元件连接到树状体的核酸结构部分(其中树状体+低聚乙二醇构成间隔体结构部分)。应该认识到核酸结构部分可与一个以上间隔体结构部分缀合,如在上文§III(1)B中所述。
经衍生能够连接核酸结构部分的多糖可用作CIC中的多价间隔体。适宜的多糖可以是天然多糖或合成多糖。可例举的多糖包括,如葡聚糖、mannin、脱乙酰壳多糖、琼脂糖和淀粉。举例来说,可利用mannin,因为在免疫学相关的细胞类型,如单核细胞和肺泡巨噬细胞上有mannin(甘露糖)受体,所以此多糖间隔体结构部分可用于靶向特定细胞类型。在一个实施方案中,多糖是交联的。一个适宜的化合物是表氯醇交联的蔗糖(如,FICOLL_)。FICOLL_是通过用表氯醇交联蔗糖得到高分支的结构而合成的。例如,如实施例49所示,氨基乙基羧甲基-ficoll(AECM-Ficoll)可利用Inman,1975,J.Imm.114:704-709的方法制备。在含多糖的CIC中核酸结构部分的数目可以是如此处针对于CIC(如,多价CIC)所述的任何范围。例如,在一个实施方案中,多糖包含约150至约250个核酸结构部分。这样,AECM-Ficoll可与异双官能(heterobiofunctional)交联剂,如6-顺丁烯二酰亚胺基己酰基N-羟基琥珀酰亚胺酯进行反应,再缀合到经巯基衍生的核酸结构部分上(参见Lee等,1980,Mol.Imm.17:749-56)。其他多糖可进行类似修饰。
5.CIC的合成
根据本说明书和本领域知识,利用常规方法制备CIC是本领域技术人员力所能及的。用于制备核酸结构部分(如,寡核苷酸和修饰的寡核苷酸)的技术是已知的。合成核酸结构部分可利用的技术包括,但不限于酶学方法和化学方法以及酶学和化学方法的组合。例如,含磷酸二酯键的DNA或RNA可通过化学方法来合成,即通过将适当的核苷亚磷酰胺依次偶联到生长中的3’-末端附着于载体上的寡核苷酸的5’-羟基上,然后经氧化作用使中间体亚磷酸三酯变成磷酸三酯来合成。可用于DNA合成的固相载体包括可控多孔玻璃(Applied Biosystems,Foster City,CA),聚苯乙烯珠基体(Primer Support,Amersham Pharmacia,Piscataway,NJ)和TentGel(Rapp Polymere GmbH,Tubingen,Germany)。一旦合成所需要的寡核苷酸序列,可将此寡核苷酸序列从载体上除下,磷酸三酯基团经脱保护变成磷酸二酯而核苷碱基利用氨水或其他碱进行脱保护。
举例来说,含磷酸二酯键的DNA或RNA多核苷酸(核酸结构部分)一般通过反复重复下列步骤进行合成:a)从3’与固相载体结合的核苷或核酸的5’-羟基上去除保护基团,b)将活化的核苷亚磷酰胺偶联到此5’-羟基上,c)氧化亚磷酸三酯为磷酸三酯,和d)给未反应的5’-羟基基团加帽。含硫代磷酸酯键的DNA或RNA可按如上所述进行制备,除了将氧化步骤换成硫化步骤。一旦合成所需要的寡核苷酸序列,可将此寡核苷酸序列从载体上除下,磷酸三酯基团脱保护变成磷酸二酯而核苷碱基利用氨水或其他碱进行脱保护。实例参见Beaucage(1993)PROTOCOLS FOROLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGS,SYNTHESIS ANDPROPERTIES(Agrawal,ed.)一书中的″寡脱氧核糖核苷酸的合成″Humana Press,Totowa,NJ;Warner等(1984)DNA 3:401;Tang等(2000)Org.Process Res.Dev.4:194-198;Wyrzykiewica等(1994)Bioorg.&Med.Chem.Lett.4:1519-1522;Radhakrishna等(1989)J.Org Chem.55:4693-4699和美国专利号4,458,066。能自动合成具有特定序列的核酸结构部分的可编程设备已普遍存在。实例包括Expedite8909自动DNA合成仪(Perseptive Biosystem,Framington MA)、ABI 394(Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA)、和OligoPilot II(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)。
举例来说,利用含有酸不稳定性5’-保护基团和3’-亚磷酰胺且碱基被保护的核苷(单体),多核苷酸可沿着3’到5’方向进行组装。可例举的此类单体包括5’-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-保护的核苷-3′-O-(N,N-二异丙基氨基)2-氰乙基亚磷酰胺,其中可例举的被保护核苷包括,但不限于N6-苯甲酰基腺苷、N4-苯甲酰基胞苷、N2-异丁酰基鸟苷、胸苷和尿苷。在此情况下,所用的固相载体包含3’-连接的被保护核苷。作为替代方案,多核苷酸可利用含有酸不稳定3’-保护基团和5’-亚磷酰胺的碱基被保护核苷沿着5’到3’方向进行组装。可例举的此类单体包括3’-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-保护的核苷-5′-O-(N,N-二异丙基氨基)2-氰乙基亚磷酰胺,其中可例举的被保护核苷包括,但不限于N6-苯甲酰基腺苷、N4-苯甲酰基胞苷、N2-异丁酰基鸟苷、胸苷和尿苷(Glen Researeh,Sterling,VA)。在此情况下,所用的固相载体包含5’-连接的被保护核苷。可分离或利用重组方法合成或化学方法合成环状核酸成分。化学合成可利用文献中描述的任一种方法进行,实例参见Gao等(1995)Nucleic Acids Res.23:2025-2029和Wang等(1994)Nucleic Acids Res.22:2326-2333。
根据待制备的特定CIC的不同,核酸结构部分和间隔体结构部分可通过多种方法缀合。添加特定间隔体结构部分的方法是本领域已知的,例如在上文引用的参考文献中对此方法进行了描述。实例参见Durand等,Nucleic Acids Research 18:6353-59(1990)。间隔体结构部分和核酸结构部分之间的共价连接可以是多种连接形式中的任一种,其中包括磷酸二酯键、硫代磷酸酯键、酰胺键、酯键、醚键、硫醚键、二硫键、亚磷酰胺键、磷酸三酯键、二硫代磷酸酯键、甲基磷酸酯键和其他类型的键。如上所述,可任选地利用活化末端的基团修饰间隔体结构部分前体以便与核酸偶联。可例举的被活化的间隔体结构部分参见图1,其中已加入适于自动合成时使用的保护基团。其他的间隔体结构部分前体包括,例如但不限于,(1)HOCH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2OH,其中n=0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45或大于45;(2)HOCH2CHOHCH2OH;(3)HO(CH2)nOH,其中n=1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或11。
在一个实施方案中,所利用的间隔体结构部分前体包括第一和第二反应基团以允许逐步与核酸结构部分进行缀合,其中第一反应基团具有能够使其有效偶联到核酸生长链的末端的特性,而第二反应基团能够逐步地进一步延伸CIC中混合的核苷酸和非核苷酸结构部分的生长链。利用与核酸结构部分合成所用相同的亚磷酰胺型化学使间隔体结构部分和核酸结构部分进行结合,这常常是方便的。例如,借助利用亚磷酰胺化学的自动DNA合成仪(如,Expedite 8909;Perseptive Biosystems,Framington,MA)(参见Beaucage,1993,同上引文;Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,同上引文)可方便地合成本发明的CIC。然而,本领域技术人员将明了,如果需要,也可人工实施自动DNA合成仪所进行的相同(或等价)合成步骤。结果产生的核酸和间隔体前体之间的连接可以是硫代磷酸酯键或磷酸二酯键。在此类合成中,典型地,间隔体(或多聚体间隔体的间隔体亚单元)的一个末端利用4,4’-二甲氧基三苯甲基进行保护,而另一末端包含亚磷酰胺基团。
许多具有有用的保护基团和反应基团的间隔体已※上市,例如:
三聚乙二醇间隔体或“TEG间隔体”9-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)三聚乙二醇-1-O-[(2-氰乙基)N,N-二异丙基亚磷酰胺](Glen Research,22825Davis Drive,Sterling,VA);
六聚乙二醇间隔体或“HEG间隔体”18-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)六聚乙二醇-1-O-[(2-氰乙基)N,N-二-异丙基亚磷酰胺](Glen Research,Sterling,VA);
丙基间隔体3-(4,4′-二甲氧基三苯甲基氧基)丙氧基-1-O-[(2-氰乙基)N,N-二异丙基亚磷酰胺](Glen Research,Sterling,VA);
丁基间隔体4-(4,4′-二甲氧基三苯甲基氧基)丁氧基-1-O-](2-氰乙基)N,N-二异丙基亚磷酰胺](Chem Genes Corporation,Ashland TechnologyCenter,200 Homer Ave,Ashland,MA);
己基间隔体:6-(4,4′-二甲氧基三苯甲基氧基)己氧基-1-O-[(2-氰乙基)N,N-二异丙基亚磷酰胺](Biosearch Technologies,Novoto,CA)
2-(羟甲基)乙基间隔体或″HME间隔体″1-(4,4′-二甲氧基三苯甲基氧基)-3-(乙酰丙酰氧基)-丙氧基-2-O-[(2-氰乙基)N,N-二异丙基亚磷酰胺];还称为″不对称分支″间隔体(参见图.2)(Chem Genes Corp.,Ashland Technoklgy Center,Ashland MA.);
″脱碱基核苷酸间隔体″或″脱碱基间隔体″5-O-(4,4′二甲氧基三苯甲基)-1,2-二脱氧核糖-3-O-[(2-氰乙基)N,N-二异丙基亚磷酰胺](GlenResearch,Sterling,VA);
″对称分支间隔体″或″丙三醇间隔体″1,3-O,O-二-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)丙三醇-2-O-[(2-氰乙基)N,N-二异丙基亚磷酰胺](Chem Genes,Ashland,MA)(参见图2);
″三倍增体间隔体″(参见图.2)2,2,2-O,O,O-三[3-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基氧基)丙氧基甲基]乙基-1-O-[(2-氰乙基)N,N-二异丙基亚磷酰胺](Glen Research,Sterling,VA);
″对称双倍增体间隔体″(参见图,2)1,3-O,O-二[5-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基氧基)戊酰氨基]丙基-2-O-[(2-氰乙基)N,N-二异丙基亚磷酰胺](Glen Research,Sterling,VA);
″ 十二烷基间隔体″12(4,4′-二甲氧基三苯甲基氧基)十二烷氧基-1-O-[(2-氰乙基)N,N-二异丙基亚磷酰胺](Glen Research,Sterling,VA)。
这些和大量其他被保护的间隔体结构部分前体(如,含有DMT和亚磷酰胺基保护基团)可购买获得或可利用本文公开的用于制备CIC的常规方法进行合成。可根据厂商说明书对仪器进行程序化以依照所需要的顺序添加核苷酸单体和间隔体。
在DNA合成仪上“原位(in situ)”制取CIC需要经保护的核苷和经保护的间隔体单体,两者都含有反应性的或可激活的官能团。间隔体结构部分的反应形式和/或受保护形式可称作“间隔体前体成分”。偶联之后间隔体前体中的反应基团形成稳定的键而间隔体前体上的保护基团在所得的CIC间隔体结构部分中被除去,这是本领域技术人员明了的。保护基团一般在逐步合成CIC的过程中被除去,以允许反应在此位点进行。如果其他反应基团上有保护基团的话,这些保护基团可在逐步合成CIC之后被去除(如在图2结构3中所示用于制备C-25的间隔体前体上的乙酰丙酰基基团)。
可例举的一个不具其他反应官能团的间隔体前体是18-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)六聚乙二醇-1-O-[(2-氰乙基)N,N-二异丙基亚磷酰胺],其包含保护基团--4,4′-二甲氧基三苯甲基基团和反应基团--(2-氰乙基)N,N-二异丙基亚磷酰胺基团。在DNA合成仪上利用亚磷酰胺化学制取CIC的过程中,间隔体前体中的(2-氰乙基)N,N-二异丙基亚磷酰胺基团被弱酸,如1H-四唑激活,并且与核苷碱基受保护的核酸结构部分的游离5’-羟基反应形成亚磷酸三酯。然后亚磷酸三酯基团经氧化或硫化作用分别形成稳定的磷酸三酯或硫代磷酸三酯基团。所得到的三酯基团在CIC的剩余合成中是稳定的并保持此形式直到最后的脱保护。间隔体前体上的4,4′-二甲氧基三苯甲基基团将被除去以便偶联另一个间隔体前体或激活的核苷单体,所述核苷单体将成为下一个核酸结构部分的一部分。经过偶联反应和氧化或硫化反应之后,此基团也分别地变成稳定的磷酸三酯或硫代磷酸三酯基团。受保护的CIC完成组装后,CIC可以从固相载体上切下来,磷酸三酯或硫代磷酸三酯基团上的氰乙基基团被去除,而且核苷碱基保护被去除。在此实例中,CIC包含其中包括连接核酸结构部分的稳定的磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键的间隔体结构部分。间隔体前体的反应性亚磷酰胺基团和被保护的羟基基团都在间隔体结构部分中转变成稳定的磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键。由于间隔体的每一末端的反应都是独立的,所以一个键可以是磷酸二酯而另一个键是硫代磷酸二酯,或其任意的组合。具有其他磷酸酯修饰,如二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯和氨基磷酸酯的CIC也可通过这种方法利用具有适当反应基团的间隔体前体、恰当的助剂及为该类连接设计的方案来制取。这些方案与所述用于制取具有修饰的磷酸酯键的核酸结构部分的那些方案相似。
虽然利用亚磷酰胺化学对制取某些CIC是方便的,但是应该知道本发明的CIC不局限于通过任一种特定的合成和制备方法制取的化合物。例如,含有与DNA合成和脱保护条件不相容的基团——如(但不限于)肼或顺丁烯二酰亚胺的核酸结构部分,可通过使含有氨基接头的核酸结构部分与适当的异双官能交联剂——如SHNH(烟酸琥珀酰亚胺基肼)或磺基-SMCC(4-[N-顺丁烯二酰亚胺基甲基]-环己烷-l-羧酸磺基琥珀酰亚胺基酯)进行反应来制取。
使蛋白质、肽、寡核苷酸和小分子以各种组合进行缀合的方法在文献中有描述,并且这些方法可以经改进用于实现含反应性连接基团的核酸结构部分与间隔体结构部分前体的缀合。实例参见,生物缀合技术(Bioconiugate Techniques),Greg T.Hermanson,Academic Press,Inc.,San Diego,CA,1996。在一些实施方案中,先合成核酸结构部分,然后利用标准的合成化学技术加入反应性连接基团(如,氨基、羧基、含硫基团、二硫基等)。反应性连接基团(被认为可形成最终间隔体结构部分中的一部分)可与其他非核酸化合物(如,不限于,在上文§4中列出的化合物)缀合,以形成间隔体结构部分的一部分。利用核酸合成的标准方法将反应性连接基团加到核酸上,这一过程可使用本领域已知的多种试剂进行。实例包括含有保护的氨基、羧基、巯基、二硫基、醛基、二醇基、二烯基和亚磷酰胺基的试剂。一旦这些化合物通过活化的亚磷酰胺基团掺入核酸并被去保护后,它们就分别为核酸提供了氨基、羧酸、醛、二醇、二烯或硫醇反应活性。可例举的用于使含反应性连接基团的核酸结构部分与含反应基团的间隔体结构部分前体缀合的反应基团如下所示。
核酸反应基团
间隔体结构部分前体反应基团
形成的稳定连接
巯基 顺丁烯二酰亚胺、卤代乙酰基 硫醚键
顺丁烯二酰亚胺 巯基 硫醚键
巯基 吡啶二硫化物 二硫键
吡啶二硫化物 巯基 二硫键
胺 NHS或其他活性酯 酰胺键
胺 羧基 酰胺键
羧基 胺 酰胺键
醛、酮 肼、酰肼 腙、酰肼键
肼、酰肼 醛、酮 腙、酰肼键
二烯 亲双烯体 脂肪族环或杂环环
反应性连接基团和间隔体前体反应形成稳定键并且两个(或多个)核酸结构部分之间的整个原子基团被定义为间隔体结构部分。例如,所合成的其上通过硫代磷酸酯基团连接有巯己基基团的核酸结构部分可与含有一个(或多个)顺丁烯二酰亚胺基团的间隔体前体进行反应,形成硫醚键。此CIC的间隔体结构部分包括来自核酸结构部分上的接头的硫代磷酸酯基团和己基基团、新形成的硫醚键以及原来为间隔体前体的一部分的间隔体其余部分。
虽然线性CIC可利用这些缀合策略制取,但是这些方法最常用于制备分支结构的CIC。此外,可制备具有几个正交反应基团的间隔体前体分子以允许添加一种以上核酸结构部分(如,不同序列基序)。
在一个实施方案中,对具有缀合有一种以上核酸结构部分的多价间隔体的CIC进行制备。例如,含有两个顺丁烯二酰亚胺基团(它可以与含疏基的多核苷酸反应)和两个活化的酯基团(它可以与含氨基的核酸反应)的平台已有描述(实例参见PCT/US94/10031,公布为WO95/07073)。这两种活化基团可彼此独立进行反应。这就产生包含总计4个核酸结构部分——每种序列2个——的CIC。
多价间隔体中含有两种不同核酸序列的CIC也可利用对称分支间隔体、如上所述方法和常规的亚磷酰胺反应(如,利用人工操作或自动化操作方法)进行制备。对称分支间隔体包含一个亚磷酰胺基团和两个相同的并可被同时除去的保护基。例如在一种方法中,第一核酸合成出来后偶联到对称分支间隔体上,之后从间隔体上除去保护基。然后在间隔体上合成另两个(同序列)核酸(每一步骤中使用的试剂量为合成单个核酸结构部分时所用量的两倍)。在下文实施例15中对这一方法进行了详细说明。
可利用类似方法将三个不同的核酸结构部分(以下称核酸I、II、III)连接到一个多价平台(如,不对称分支间隔体)上。此操作利用自动DNA分析仪来实行是最方便的。在一个实施方案中,不对称分支间隔体包含一个亚磷酰胺基团和两个可独立地被除去的正交保护基。首先,合成核酸I,将不对称分支间隔体偶联到核酸I,然后在选择性去除保护基中的一个之后加上核酸II。核酸II被去保护并进行加帽,之后除去间隔体上的另一个保护基。最后,合成核酸III。在下文实施例17中对这一方法进行了详细说明。
不同长度的亲水接头可用于如连接核酸结构部分和平台分子。多种适宜的接头是已知的。适宜的接头包括,不限于:乙二醇的直链低聚物或聚合物。此类接头包括式R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2的接头,其中n=0-200,m=1或2,R1=H或保护基如三苯甲基,R2=H或烷基或芳基,如4-硝基苯基酯。这些接头可用于使含巯基反应基团的分子如haloaceyi、maleiamide等(通过硫醚)与含有氨基基团的另一个分子(经酰胺键)连接起来。连接的顺序可以变化,即,硫醚键可在酰胺键形成之前或之后形成。其他有用的接头包括磺基-SMCC(4-[N-顺丁烯二酰亚胺基甲基]-环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺基酯)Pierce Chemical Co.product22322;磺基-EMCS(N-[ε-顺丁烯二酰亚胺基己酰氧基]磺基琥珀酰亚胺酯)Pierce Chemical Co.product22307;磺基-GMBS(N-[γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酰氧基]磺基琥珀酰亚胺酯)Pierce Chemical Co.product22324(Pierce Chemical Company,Rockford,IL),及通式为顺丁烯二酰亚胺基-R-C(O)NHS酯的相似化合物,其中R=烷基、环烷基、乙二醇聚合物等。
特别有用的共价连接核酸结构部分和多价间隔体的方法参见上文所引用参考文献和实施例中的描述。
因此,一方面,本发明提供一种方法用于制备对调制哺乳动物免疫应答有用的CIC,此方法通过共价地连接多核苷酸和化合物,从而得到包含核酸结构部分和间隔体结构部分区域并且具有免疫调制活性的嵌合化合物。在不同实施方案中,核酸区可以具有此处所述的任何核酸结构部分的结构和序列,间隔体区可以具有此处所述的任何间隔体结构部分的结构。经常,存在一个以上连接步骤,如连接至少重复进行一次以使两个多核苷酸共价连接到一个或两个间隔体上,而通常连接至少重复两次或三次。此方法还包括使CIC与可药用赋形剂混合形成组合物。在一个实施方案中,组合物是无菌的,如适用于给人类患者施用,如按照GMP标准生产或配制。在一个实施方案中,使CIC和如此处所述微载体和/或抗原联合。也可考虑,在一些实施方案中,本发明的CIC制剂中不含有下列物质的一种或多种:(i)胶态分散系统,(ii)脂质体,(iii)微载体,(iv)多肽,(v)抗原,和(vi)内毒素。
6.蛋白样CIC
在某些实施方案中,多肽——如蛋白质抗原或抗原片断被用作多价间隔体结构部分,多个核酸结构部分可以直接地或经接头共价缀合到此间隔体上形成“蛋白样CIC”。此多肽可以是抗原或免疫原——针对它可产生所需的适应性免疫应答,或者可以是载体(如,白蛋白)。蛋白样CIC一般包含至少一个、通常几个或多个核酸结构部分,所述核酸结构部分(a)长度是2个至7个,更常见4个至7个核苷酸,或者2个至6个、2个至5个、4个至6个或4个至5个核苷酸和/或(b)具有次独立免疫调制活性或不具有独立免疫调制活性。在参阅本公开的基础上,制备蛋白样CIC的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。例如,利用本领域已知的方法可以使核酸共价缀合到多肽间隔体结构部分,包括核酸结构部分的3’或5’末端(或核酸结构部分内部的适当修饰碱基)和带有适当反应基团(如,可与胞嘧啶残基的N4氨基基团直接反应的N-羟基琥珀酰亚胺酯)的多肽之间的连接。再例举一例,多肽可通过掺入到核酸结构部分中的胺、巯基或羧基连接到核酸结构部分的游离5’末端。或者,如此处所述,多肽可缀合到间隔体结构部分上。此外,在一端含有被保护的胺、巯基或羧基并包含亚磷酰胺的连接基团可被共价连接到多核苷酸的羟基基团上,然后在去保护后,该官能团可用于CIC与肽的共价连接。
7.纯化
本发明的CIC可利用任何常规方法,如高效液相色谱、电泳、核酸亲和层析、分子大小排阻层析和离子交换层析进行纯化。在一些实施方案中,CIC是实质上纯的,举例来说,按重量计至少约80%纯、常常按重量计至少约90%纯、更常见地是至少约95%纯、最常见是至少约85%纯。
8.组合物
在多种实施方案中,本发明的组合物包含一个或多个CIC(即,单一CIC或两个或多个CIC的组合),其中所述CIC任选地与另一免疫调制剂--如肽、抗原(如下所述)和/或另外的佐剂联合。本发明的组合物可包含CIC和可药用赋形剂。“可药用”是指载体、稀释剂或赋形剂必须与制剂中的其他成分相容并且对受体无害。可药用赋形剂在本领域是熟知的,其包括无菌水、等渗溶液如盐水和磷酸缓冲盐水以及其他本领域已知的赋形剂。实例参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy(19thedition,1995,Gennavo,ed.)。佐剂(可例举的一个实例是明矾)是本领域已知的。可制备具有其他免疫治疗剂——如细胞因子和抗体的CIC制剂。在一些实施方案中,组合物是等渗和/或无菌的,如适用于给人类患者施用,如按照GMP标准生产或配制。
A.
CIC/MC复合体
CIC可以以CIC/微载体(CIC/MC)复合体的形式进行施用。因此,本发明提供了含CIC/MC复合体的组合物。
CIC/MC复合体包含结合在微载体表面的CIC(即,CIC不是被包裹在MC中),并优选每一微载体结合有多个CIC分子。在某些实施方案中,不同CIC的混合物可与一种微载体复合,这样该微载体将结合有一种以上的CIC。CIC和MC之间的键可为共价或非共价的(例如,由离子键和/或疏水作用介导)。本领域技术人员理解可以修饰或衍生CIC,并且可以选择和/或修饰微载体的组成以适应期望用于形成CIC/MC复合体的结合类型。
共价结合的CIC/MC复合体可用本领域公知的任何共价交联技术连接。一般,对CIC部分进行修饰,以掺入额外结构部分(如游离胺、羧基或巯基)或掺入修饰的(如硫代磷酸酯)核苷酸碱基,从而提供CIC部分可与微载体连接的位点。复合体中CIC和MC部分之间的连接可发生在CIC的3′或5′端,或发生在CIC内部经合适修饰的碱基处。通常也修饰微载体以掺入通过其可形成共价连接的结构部分,但也可利用正常存在于微载体上的官能团。通过将CIC与微载体在允许共价复合体形成的条件下(如在存在交联剂时或通过使用包含可与CIC形成共价键的活化结构部分的活化微载体)孵育,可形成CIC/MC。
大量的交联技术为本领域所公知,并包括与氨基、羧基和巯基反应的交联剂。对本领域技术人员显而易见的是:交联剂和交联法的选择取决于CIC和微载体的构型及所期望的CIC/MC复合体的最终构型。交联剂可为同双官能(homobifunctional)交联剂或异双官能交联剂。当使用同双官能交联剂时,交联剂利用CIC和MC上的相同部分(如当CIC和MC均包含一个或多个游离胺时,可使用醛交联剂来共价连接CIC和MC)。异双官能交联剂利用CIC和MC上的不同部分(如顺丁烯二酰亚胺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯可用于其价连接CIC上的游离巯基和MC上的游离胺),并且其在使微载体间最少键合方面是优选的。在大多数情况下,优选通过在微载体上的第一交联结构部分和在CIC上的第二交联结构部分来交联,其中第二交联结构部分不存在于微载体上。产生CIC/MC复合体的一种优选方法是通过与异双官能交联剂孵育来活化微载体,然后将CIC与活化的MC在适于反应的条件下孵育而形成CIC/MC复合体。交联剂可在两个反应性结构部分之间掺入″间隔臂″,或交联剂中的两个反应性结构部分可直接连接。
在一个优选的实施方案中,CIC部分包含至少一个游离巯基(如由5′-巯基修饰的碱基或接头提供)用于交联微载体,同时微载体包含游离氨基。可以使用与这两个基团反应的异双官能交联剂(如包含顺丁烯二酰亚胺基团和NHS-酯的交联剂),诸如4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环已烷-1-羧酸琥珀酰亚胺基酯活化MC,然后共价交联CIC以形成CIC/MC复合体。
非共价CIC/MC复合体可通过任何非共价结合或相互作用连接,其中非共价结合或相互作用包括离子(静电)键、疏水相互作用、氢键、范德华引力、或两种或多种不同相互作用的组合,当利用结合对连接CIC和MC时通常就是这样。
优选的非共价CIC/MC复合体一般通过疏水或静电(离子)相互作用或它们的组合(例如,通过CIC和连接至MC上的多核苷酸之间的碱基配对)而复合。由于多核苷酸主链的亲水特性,依赖疏水相互作用形成复合体的CIC/MC复合体通常需要修饰复合体的CIC部分以掺入高度疏水结构部分。优选地,疏水结构部分为生物相容的、非免疫原性的并天然存在于该组合物欲施用的个体体内(例如,该疏水结构部分可在哺乳动物,尤其是人体内找到)。优选的疏水结构部分的实例包括脂类、类固醇类、固醇类如胆固醇和萜类。当然,将疏水结构部分连接至CIC的方法取决于CIC的构型和疏水结构部分的特性。可在CIC中的任何适宜位点添加此疏水结构部分,优选地在5′或3′端添加;在将胆固醇结构部分添加至CIC时,优选地使用常规化学反应将该胆固醇结构部分添加至CIC的5′端(参见如Godard等人(1995),欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)232:404-410)。优选地,用于通过疏水键连接的CIC/MC复合体中的微载体由疏水材料如油滴或疏水聚合物制成,但也可使用经修饰掺入了疏水结构部分的亲水材料。当该微载体为脂质体或其它包含腔的液相微载体时,在制备MC后通过混合CIC和MC而形成CIC/MC复合体,从而避免在MC制备过程中对CIC的包裹。
通过静电结合的非共价CIC/MC复合体一般利用多核苷酸主链的高负电荷。因此,用于非共价结合的CIC/MC复合体中的微载体通常在生理pH(如约pH6.8-7.4)下为带正电荷的。微载体可本身就具有正电荷,但使用一般不具有正电荷的化合物制备的微载体可通过衍生或修饰而成为带正电荷的。例如,可衍生用于制备微载体的聚合物,以添加带正电荷的基团,如伯胺。或者,可在生产过程中将带正电的化合物掺入微载体制剂中(例如,在聚(乳酸)/聚(羟基乙酸)共聚物的生产过程中可使用带正电荷的表面活性剂,以在所得的微载体粒子上赋予正电荷)。见,例如,下文实施例28和34。
通过核苷酸碱基配对连接的非共价CIC/MC复合体可用常规方法制备。通常,用包含结合有,优选地共价结合有至少部分互补于CIC的多核苷酸(″捕捉多核苷酸″)的微载体制备碱基配对的CIC/MC复合体。CIC和捕捉核苷酸之间的互补片段优选至少有6、8、10或15个相邻碱基对,更优选至少20个连续碱基对。捕捉核苷酸可通过本领域公知的任何方法结合至MC,且优选共价结合至CIC的5′或3′端。
在其它实施方案中,可使用结合对连接CIC/MC复合体中的CIC和MC。结合对可为受体和配体、抗体和抗原(或表位)、或任何其它以高亲和性结合的结合对(例如,Kd小于约10-8)。一类优选的结合对为生物素和链亲和素或为生物素和亲和素,它们可形成紧密的复合体。当使用结合对介导CIC/MC复合体的结合时,用结合对中的一员衍生CIC,一般通过共价键合衍生,且用结合对中的另一员衍生MC。这两种衍生化合物的混合将导致CIC/MC复合体的形成。
许多CIC/MC复合体的实施方案不包括抗原,而某些实施方案排除与疾病或病症相关的抗原,其中所述疾病或病症为CIC/MC复合体的治疗目标。在另外的实施方案中,CIC还结合一个或多个抗原分子。抗原可以以多种方式(包括共价和/或非共价相互作用)与CIC/MC复合体中的CIC部分偶联,或者,抗原可与微载体连接。CIC上结合有抗原的CIC/MC复合体中,抗原与CIC的连接可通过本文中描述的技术和本领域公知的技术来实现。
B.共施用的抗原
在一些实施方案中,CIC与抗原共施用。任何抗原都可与CIC共施用,和/或用于包含CIC和抗原的组合物的制备。
在一些实施方案中,抗原为变应原。重组变应原的实例在表1中提供。许多变应原的制备在本领域是熟知的,包括但不限于豚草花粉变应原Antigen E(Amb aI)(Rafnar等人(1991)生物化学杂志(J Biol.Chem.)266:1229-1236)、草变应原Lol p1(Tamborini等人(1997)欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)249:886-894)、主要尘螨变应原Der pI和Der PII(Chua等人(1988)实验医学杂志(J.Exp.Med.)167:175-182;Chua等人(1990)Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.91:124-129)、家猫变应原Fel dI(Rogers等人(1993)分子免疫学(Mol.Immunol.)30:559-568)、白桦花粉Bet vl(Breiteneder等人(1989)EMBO J8:1935-1938)、柳杉变应原Cry j1和Cry j2(Kingetsu等人(2000)免疫学(Immunology)99:625-629)和来自其它树木花粉的蛋白质抗原(Elsayed等人(1991)Scand.J.Clin.Lab.Invest.Suppl.204:17-31)的制备。已报导了用于体内施用的来自草花粉的蛋白质抗原的制备。
在一些实施方案中,变应原为食物变应原,包括但不限于花生变应原如Ara hI(Stanley等人(1996)Adv.Exp.Med.Biol.409:213-216);胡桃变应原如Jug rI(Tueber等人(1998)J.Allergy Clin.Immunol.101:807-814);巴西坚果变应原如白蛋白(Pastorello等人(1998)J Allergy Clin.Immunol.102:1021-1027);虾变应原如Pen aI(Reese等人(1997)Int.Arch.AllergyImmunol.113:240-242);卵变应原如类卵粘蛋白(Crooke等人(1997)免疫学杂志(J.Immunol.)159:2026-2032);奶变应原如牛β-乳球蛋白(Selot等(1999)临床与实验变态反应(Clin.Exp.Allergy)29:1055-1063);鱼变应原如小白蛋白(Van Do等人(1999)Scand.J Immunol.50:619-625;Galland等人(1998)J Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.706:63-71.)。在一些实施方案中,变应原为胶乳变应原,包括但不限于Hev b7(SoWka等人(1998)欧洲生物化学杂志(Eur.J Biochem.)255:213-219)。表1列出了可使用的变应原的名单。
表1
重组变应原
组别 | 变应原 | 参考文献 |
动物: | ||
甲壳动物 | ||
虾/龙虾 | 原肌球蛋白PansI | Leung等人(1996)J.Allergy Clin.Immunol.98:954-961Leung等人(1998)Mol.Mar.Biol.Biotechnol.7:12-20 |
昆虫 | ||
蚂蚁 | Soli2(毒液) | Schmidt等人,J Allergy Clin Immunol.,1996,98:82-8 |
蜜蜂 | 磷脂酶A2(PLA)透明质酸酶(Hya) | Muuller等人,J Allergy Clin Immunol,1995,96:395-402Forster等人,J Allergy Clin Immunol,1995,95:1229-35Muller等人,临床与实验变态反应(Clin Exp Allergy),1997,27:915-20Soldatova等人,J Allergy Clin Immunol,1998,101:691-8 |
蟑螂 | Blag Bd9OKBlag4(calycin)谷胱甘肽S转移酶Pera3 | Helm等人,J Allergy Clin Immunol,1996,98:172-180Vailes等人,J Allergy Clin Immunol,1998,101:274-280Arruda等人,生物化学杂志(J Biol Chem),1997,272:20907-12Wu等人,分子免疫学(MolImmunol),1997,34:1-8 |
尘螨 | Derp2(主要变应原)Der p2变体Der f2Der p10Tyr p2 | Lynch等人,J Allergy Clin Immunol,1998,101:562-4;Hakkaart等人,Clin Exp Allergy,1998,28:169-74;Hakkaart等人,ClinExp Allergy,1998,28:45-52;Hakkaart等人,Int Arch AllergyImmunol,1998,115(2):150-6Mueller等人,生物化学杂志(J Biol Chem),1997,272:26893-8Snmith等人,J Allergy Clin Immunol,1998,101:423-5Yasue等人,临床与实验免疫学(Clin Exp Immunol),1998,113:1-9Yasue等人,细胞免疫学(Cell Immunol),1997,181:30-7Asturias等人,Biochim Biophys Acta,1998,1397:27-30Eriksson等人,欧洲生物化学杂志(Eur J Biochem),1998 |
大胡蜂 | 抗原5aka DolmV(毒液) | Tomalski等人,Arch Insect Biochem Physio,1993,22:303-13 |
蚊子 | Aed aI(唾液腺苷三磷酸双磷酸酶) | Xu等人,Int Arch Allergy Immunol,1998,115:245-51 |
黄蜂 | 抗原5,透明质酸酶和磷脂酶(毒液) | King等人,J Allergy Clin Immunol,1996,98:588-600 |
哺乳动物 | ||
猫 | Fel dI | Slunt等人,J Allergy Clin Immunol,1995,95:1221-8Hoffmann等人(1997)J Allergy Clin Immunol 99:227-32Hedlin Curr Opin Pediatr,1995,7:676-82 |
奶牛 | Bos d2(dander;lipocalin)β-乳球蛋白(BLG,主要牛奶变应原) | Zeiler等人J Allergy Clin Immunol,1997,100:72 1-7Rautiainen等人Biochem Bioph.Res Comm.,1998,247:746-50Chatel等人,分子免疫学(Mol Immunol),1996,33:1113-8Lehrer等人Crit Rev Food Sci Nutr,1996,36:553-64 |
狗 | Can fI和Canf2,唾液lipocalin | Konieczny等人,免疫学(Immunology),1997,92:577-86Spitzauer等人,J Allergy Clin Immunol,1994,93:614-27Vrtala等人,免疫学杂志(J Immunol),1998,160:6137-44 |
马 | Equ cl(主要变应原,lipocalin) | Gregoire等人J Biol Chem,1996,271:32951-9 |
小鼠 | 小鼠尿蛋白(MUP) | Konieczny等人,免疫学(Immunology),1997,92:577-86 |
其它哺乳动物变应原 | ||
胰岛素 | Ganz等人J Allergy Clin Immunol,1990,86:45-51Grammer等人,J Lab Clin Med,1987,109:141-6Gonzalo等人,变态反应(Allergy),1998,53:106-7 | |
干扰素 | 干扰素α2c | Detmar等人Contact Dermatis,1989,20:149-50 |
软体动物 | topomyosin | Leung等人J Allergy Clin Immunol,1996,98:954-61 |
植物变应原: | ||
大麦 | Hor v9 | Astwood等人Adv Exp Med Biol,1996,409:269-77 |
桦 | 花粉变应原,Bet v4rBet v1 Betv2:(抑制蛋白) | Twardosz等人Biochem Bioph.Res Comm.,1997,239:197Pauli等人,J Allergy Clin Immunol,1996,97:1100-9van Neerven等人Clin Exp Allergy,1998,28:423-33Jahn-Schmid等人Immunotechnology,1996,2:103-13Breitwieser等人Biotechniques,1996,21:918-25Fuchs等人J Allergy Clin Immunol,1997,100:356-64 |
巴西坚果 | 球蛋白 | Bartolome等人Allergol Immunopathol,1997,25:135-44 |
樱桃 | Pru aI(主要变应原) | Scheurer等人,分子免疫学(Mol Immunol),1997,34:619-29 |
玉米 | Zml 3 (花粉) | Heiss等人FEBS Lett,1996,381:217-21Lehrer等人Iht Arch Allergy Immunol,1997,113:122-4 |
草 | Phlp1,Phlp2,Phlp5(梯牧草花粉)Hol 15绒毛草花粉早熟禾变应原Cynd7狗牙草Cynd12(一种抑制蛋白) | Bufe等人Am J Respir Crit Care Med,1998,157:1269-76Vrtala等人,免疫学杂志(J Immunol)1998年6月15日,160:6137-44Niederberger等人J Allergy Clin Immun.,1998,101:258-64Schramm等人,欧洲生物化学杂志(Eur J Biochem),1998,252:200-6Zhang等人,免疫学杂志(J Immunol),1993,151:791-9Smith等人Int Arch Allergy Immunol,1997,114:265-71Asturias等人,Clin Exp Allergy,1997,27:1307-13Fuchs等人,J Allergy Clin Immunol,1997,100:356-64 |
柳杉 | Jun a2(阿希刺柏,Juniperusashei)Cryj1,Cryj2(孔雀杉,Cryptomeriajaponiea) | Yokoyama等人Biochem.Biophys.Res.Commun.,2000,275:195-202Kingetsu等人Immunology,2000,99:625-629 |
杜松 | Jun o2(花粉) | Tinghino等人J Allergy Clin Immunol,1998,101:772-7 |
胶乳 | Hev,b7 | Sowka等人,欧洲生物化学杂志(Eur J Biochem),1998,255:213-9Fuchs等人J Allergy Clin Immunol,1997,100:356-64 |
山靛(Mercurialis) | MeraI(抑制蛋白) | Vallverdu等人J Allergy Clin Immunol,1998,101:363-70 |
芥(黄色) | SinaI(种子) | Gonzalez de la Pena等人Biochem Bioph.Res Comm.,1993,190:648-53 |
油籽油菜 | Bra rI花粉变应原 | Smith等人Int Arch Allergy Immunol,1997,114:265-71 |
花生 | Ara hI | Stanley等人Adv Exp Med Biol,1996,409:21-6Burks等人J Clin Invest,1995,96:1715-21Burks等人Int Arch Allergy Immunol,1995,107:248-50 |
草地早熟禾 | Poa p9 | Parronchi等人,欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol),1996,26:697-703Astwood等人Adv Exp Med Biol,1996,409:269-77 |
豚草 | Amb aI | Sun等人Biotechnology Aug,1995,13:779-86Hirschwehr等人J Allergy Clin Immunol,1998,101:196-206Casale等人J Allergy Clin Immunol,1997,100:110-21 |
黑麦 | Lol pI | Tamborini等人,欧洲生物化学杂志(Eur J Biochem),1997,249:886-94 |
胡桃 | Jug rI | Teuber等人J Allergy Clin Immun.,1998,101:807-14 |
小麦 | 变应原 | Fuchs等人J Allergy Clin Immunol,1997,100:356-64Donovan等人,电泳(Electrophoresis),1993,14:917-22 |
真菌 | ||
曲霉属(Aspergillus) | Asp f1,Asp f2,Asp f3,Asp f4,rAsp f6锰超氧化物歧化酶(MNSOD) | Crameri等人Mycoses,1998,41 Suppl 1:56-60Hemmann等人,欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol),1998,28:1155-60Banerjee等人J Allergy Clin Immunol,1997,99:821-7Crameri Int Arch Allergy Immunol,1998,115:99-114Crameri等人Adv Exp Med Biol,1996,409:111-6Moser等人J Allergy Clin Immunol,1994,93:1-11Mayer等人Int Arch Allergy Immunol,1997,113:213-5 |
Blomia | 变应原 | Caraballo等人Adv Exp Med Biol,1996,409:81-3 |
青霉属(Penicillinium) | 变应原 | Shen等人,临床与实验变态反应(Clin Exp Allergy),1997,27:682-90 |
裸盖菇属(Psilocybe) | Psi c2 | Horner等人Int Arch Allergy Immunol,1995,107:298-300 |
在一些实施方案中,抗原来自感染物,包括原生动物、细菌、真菌(包括单细胞和多细胞)和病毒感染物。合适的病毒抗原的实例于文中描述并为本领域公知。细菌包括流感嗜血杆菌(Hemophilus influenza)、分枝结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和百日咳杆菌(Bordetella pertussis)。原生动物感染物包括疟原虫、利什曼原虫、锥虫和血吸虫。真菌包括白色念珠菌(Candida albicans)。
在一些实施方案中,抗原为病毒抗原。病毒多肽抗原包括但不限于HIV蛋白如HIV gag蛋白(包括但不限于膜锚定(MA)蛋白、核心壳(CA)蛋白和核衣壳(NC)蛋白)、HIV聚合酶、流感病毒基质(M)蛋白和流感病毒核衣壳(NP)蛋白、乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心蛋白(HBcAg)、肝炎e蛋白(HBeAg)、乙肝DNA聚合酶、丙肝抗原等。讨论流感接种的文献包括Scherle和Gerhard(1988),美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85:4446-4450;Scherle和Gerhard(1986),实验医学杂志(J.Exp.Med.)164:1114-1128;Granoff等(1993),疫苗(Vaccine)11:S46-51;Kodihalli等人(1997),病毒学杂志(J.Virol.)71:3391-3396;Ahmeida等人(1993),疫苗(Vaccine)11:1302-1309;Chen等人(1999),疫苗(Vaccine)17:653-659;Govorkova和Smirnov(1997)Acta Virol.(1997)41:251-257;Koide等人(1995),疫苗(Vaccine)13:3-5;Mbawuike等人(1994),疫苗(Vaccine)12:1340-1348;Tamura等人(1994),疫苗(Vaccine)12:310-316;Tamura等人(1992)欧洲免疫学杂志(Eur.J Immunol.)22:477-481;Hirabayashi等人(1990),疫苗(Vaccine)8:595-599。抗原多肽的其它实例为组或亚组特异性抗原,许多感染物的这些抗原多肽是已知的,其中所述感染物包括但不限于腺病毒(adenovirus)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)、乳头状瘤病毒(papilloma virus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytialvirus)和痘病毒(poxviruse)。
许多抗原肽和蛋白质是公知的,并在本领域中是现成的;其它的可用常规技术鉴定。对于通过免疫抵抗肿瘤形成或治疗已存在的肿瘤,免疫调制肽可包括肿瘤细胞(活的或辐射过的)、肿瘤细胞提取物或肿瘤抗原的蛋白质亚单位如Her-2/neu、Mart1、癌胚抗原(CEA)、神经节苷酯、人乳脂肪球(HMFG)、粘蛋白(MUC1)、MAGE抗原、BAGE抗原、GAGE抗原、gp100、前列腺特异抗原(PSA)和酪氨酸酶。基于免疫的避孕疫苗可通过包括与CIC共施用的精子蛋白而形成。Lea等人(1996)Biochim.Biophys.Acta1307:263。
减毒和灭活病毒适用于本文中作为抗原。这些病毒的制备为本领域熟知并且许多可通过商业途径获得(参见如Physicians′Desk Reference(1998)第52版,Medical Economics Company,Inc.)。例如,脊髓灰质炎病毒(poliovirus)可以以1POL_(Pasteur Merieux Connaught)和ORIMUNE_(LederleLaboratories)获得,甲肝病毒可以以VAQTA_(Merck)获得,麻疹病毒(measles virus)可以以ATTENUVAX_(Merck)获得,腮腺炎病毒(mumps virus)可以以MUMPSVAX_(Merck)获得,及风疹病毒(rubellavirus)可以以MERUVAX_II(Merck)获得。此外,如HIV-1、HIV-2、单纯疱疹病毒、乙肝病毒、轮状病毒(rotavirus)、人和非人乳头状瘤病毒和脑慢病毒(slow brain virus)的减毒和灭活病毒可提供肽抗原。
在一些实施方案中,抗原包含病毒载体,如痘苗病毒、腺病毒和金丝雀痘病毒载体。
抗原可从它们的来源中用本领域公知的纯化技术分离,或更方便地,可用重组方法产生。
抗原肽可包括纯化的天然肽、合成肽、重组蛋白质、粗蛋白提取物、减毒或灭活病毒、细胞、微生物或此类肽的片段。免疫调制肽可为天然肽,或为化学或酶法合成的肽。本领域公知的任何化学合成法均适用。液相肽合成可用于构建中等大小的肽,或肽的化学构建可采用固相合成来进行。Atherton等人(1981)Hoppe Seylers Z.Physiol.Chem.362:833-839。也可使用蛋白水解酶来偶联氨基酸而产生肽。Kullmann(1987)EnzymaticPeptide Synthesis,CRC Press,Inc。或者,可通过使用细胞的生物化学机器或通过从生物源分离来获得肽。可采用重组DNA技术产生肽。Hames等人(1987),转录和翻译:实用方法(Transcription and Translation:APractical Approach),IRL Press。也可用标准技术如亲和层析分离肽。
优选地,抗原为肽、脂类(如除胆固醇外的固醇类、脂肪酸和磷脂)、多糖(如那些用于流感嗜血杆菌疫苗中的多糖)、神经节苷脂和糖蛋白。它们可通过本领域公知的几种方法获得,包括使用化学和酶法分离和合成。在某些情况下,例如对于许多固醇类、脂肪酸和磷脂,分子的抗原性部分可通过商业途径得到。
用于本发明组合物和使用该组合物的方法中的病毒抗原的实例包括但不限于HIV抗原。此类抗原包括但不限于那些来自HIV包膜糖蛋白的抗原,其中所述HIV包膜糖蛋白包括但不限于gp160、gp120和gp41。许多HIV基因和抗原的序列是公知的。例如Los Alamos National LaboratoryHIV Sequence Database收集、管理和注释HIV核苷酸和氨基酸序列。该数据库通过互联网网址http://hiv-web.lanl.gov/可进入,并且每年公布,参见Human Retroviruses and AIDS ComDendium(如2000版)。
来自感染物的抗原可用本领域公知的方法获得,如从天然病毒或细菌提取物获得、从感染物感染的细胞获得、从纯化的多肽获得、从重组产生的多肽获得和/或以合成肽的形式获得。
CIC可以以多种方式与抗原一起施用。在一些实施方案中,CIC和抗原以相互空间接近的方式施用。如下所述,可以以多种方式实现空间接近,包括缀合、包囊化、添加至平台上或吸附至表面上。在一个实施方案中,CIC和抗原以混合物的形式(例如,在溶液中)施用。特别可以考虑,在某些实施方案中,CIC和免疫原或抗原不发生缀合。
在一些实施方案中,CIC与多肽如抗原连接。CIC部分可以以多种方式,包括共价和/或非共价相互作用,通过核酸结构部分或非核酸间隔体结构部分与缀合物的抗原部分连接。在一些实施方案中,连接通过反应基,例如但不限于含硫基团、胺、羧基、醛、肼、腙、二硫基等实现。
这些部分间的连接可在核酸结构部分的3′或5′末端,或在核酸结构部分中间位置的适当修饰的碱基处进行。例如,如果抗原为肽并包含合适的反应基团(如N-羟基琥珀酰亚胺酯),则它可直接与胞嘧啶残基的N4氨基反应。根据CIC中胞嘧啶残基的数量和位置,可在一个或多个残基处实现特异性偶联。
或者,可将诸如本领域所公知的修饰寡核苷掺入CIC的末端或内部位置。它们可包含被封闭的官能团,当去封闭后,这些官能团可与多种可能存在于或结合在目的抗原上的官能团反应。
当抗原为肽时,缀合物的该部分可通过固相载体化学连接至核酸结构部分或间隔体结构部分。例如,可将CIC的核酸结构部分添加至已在载体上预合成的多肽部分上。Haralambidis等人(1990)核酸研究(Nucleic AcidsRes.)18:493-499;和Haralambidis等人(1990)核酸研究(Nucleic AcidsRes.)18:501-505。
或者,可以合成CIC使其通过从核酸结构部分的3′-端延伸出的可切割接头连接固相载体。当CIC从载体上化学切割下来后,在核酸结构部分的3’-端留下一个末端巯基或末端氨基基团(Zuckermann等人(1987)核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:5305-5321;和Corey等人(1987)科学(Science)238:1401-1403;Nelson等人(1989)核酸研究(Nucleic AcidsRes.)17:1781-1794)。氨基修饰的CIC与肽的氨基的缀合可如Benoit等人(1987)Neuromethods 6:43-72中所述进行。巯基修饰的CIC与肽的羧基的缀合可如Sinah等人(1991),寡核苷酸类似物:实用方法(OligonucleotideAnalogues:A Practical Approach),IRL Press中所述进行。携带有附加的顺丁烯二酰亚胺的核酸结构部分或间隔体与肽的半胱氨酸残基的硫醇侧链的偶联也已有描述。Tung等人(1991)Bioconjug Chem.2:464-465。
缀合物的肽部分可通过已经掺入(例如,通过游离的5’-端、3’-端,通过修饰的碱基,等等)核酸结构部分或间隔体的胺、巯基或羧基基团连接至核酸结构部分的游离5’-端。
方便地,一端包含被保护的胺、巯基或羧基且包含亚磷酰胺的连接基团可与CIC的羟基共价结合。Agrawal等人(1986)核酸研究(Nucleic AcidsRes.)14:6227-6245;Connolly(1985)核酸研究(Nucleic Acids Res.)13:4485-4502;Kremsky等人(1987),核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:2891-2909;Connolly(1987)核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:3131-3139;Bischoff等人(1987)Anal.Biochem.164:336-344;Blanks等人(1988),核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:10283-10299;以及美国专利号4,849,513、5,015,733、5,118,800和5,118,802。去保护后,这些胺、巯基和羧基官能团可用于使CIC与肽共价连接。Benoit等人(1987);和Sinah等人(1991)。
CIC-抗原缀合物也可通过非共价相互作用如离子键、疏水相互作用、氢键和/或范德华引力而形成。
非共价连接的缀合物可包括非共价相互作用,如生物素-链亲和素复合体。生物素基团可例如连接至CIC的修饰碱基上。Roget等人(1989),核酸研究(Nucleic Acids Res.)17:7643-7651。将链亲和素部分掺入肽部分将允许链亲和素缀合的肽和生物素化寡核苷酸形成非共价结合复合体。
也可通过涉及到CIC和抗原内的残基如带电荷氨基酸的离子相互作用,或通过使用包含有可与寡核苷酸和抗原均发生相互作用的带电荷残基的接头部分来产生非共价连接。例如,非共价缀合可以在通常带负电荷的CIC和肽中带正电荷的氨基酸残基如多聚赖氨酸、多聚精氨酸和多聚组氨酸残基之间发生。
CIC和抗原间的非共价缀合可通过与DNA相互作用的分子中的DNA结合基序而实现,其中该分子为DNA的天然配体。例如,此类DNA结合基序可在转录因子和抗DNA抗体中找到。
CIC与脂的连接可通过标准方法形成。这些方法包括但不限于合成寡核苷酸-磷脂缀合物(Yanagawa等人(1988)Nucleic Acids Symp.Ser.19:189-192)、寡核苷酸-脂肪酸缀合物(Grabarek等人(1990)生物化学年鉴(Anal.Biochem.)185:131-135;和Staros等人(1986)生物化学年鉴(Anal.Biochem.)156:220-222)、和寡核苷酸-固醇缀合物。Boujrad等人(1993),美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:5728-5731。
寡核苷酸与寡糖的连接可通过标准的已知方法形成。这些方法包括但不限于合成寡核苷酸-寡糖缀合物,其中寡糖为免疫球蛋白的一部分。O′Shannessy等人(1985),应用生物化学杂志(J.Applied Biochem.)7:347-355。
用于将肽和其它分子连接至寡核苷酸上的其它方法可在美国专利号5,391,723;Kricka(编辑),非同位素DNA探针技术(Nonisotopic DNA ProbeTechniques),Academic Press一书中的Kessler(1992),“核酸的非放射性标记法”(″Nonradioactive labeling methods for nucleic acids″);和Geoghegan等人(1992)Bioconjug.Chem.3:138-146中找到。
CIC可以以其它方式与抗原紧密联结。在一些实施方案中,CIC和抗原通过包囊化而紧密联结。在其它实施方案中,CIC和抗原通过与平台分子连接而紧密联结。″平台分子″(也称为″平台″)为包含允许CIC和抗原附着的位点的分子。在其它实施方案中,CIC和抗原通过吸附在表面,优选载体粒子上而紧密联结。
在一些实施方案中,本发明的方法使用了包囊剂(或包含此包囊剂的组合物),其中所述包囊剂可维持CIC和第一抗原的紧密联结,直至该复合体到达靶。优选地,包含CIC、抗原和包囊剂的组合物为佐剂水包油乳剂、微粒子和/或脂质体形式。更优选地,包封有CIC的佐剂水包油乳剂、微粒子和/或脂质体为约0.04μm至约100μm大小的颗粒形式,优选地其大小为任一以下范围:约0.1μm至约20μm;约0.15μm至约10μm;约0.05μm至约1.00μm;约0.05μm至约0.5μm。
胶体分散体系如微球、珠、大分子复合体、毫微胶囊和基于脂的体系如水包油乳剂、微胶粒、混合微胶粒和脂质体可有效地包封含有CIC的组合物。
包囊组合物还可包含多种成分中的任何成分。这些成分包括但不限于明矾、脂类、磷脂、脂膜结构(LMS)、聚乙二醇(PEG)和其它聚合物如多肽、糖肽和多糖。
适用作包囊成分的多肽包括本领域公知的任何多肽,并包括但不限于脂肪酸结合蛋白。修饰的多肽可包含如下多种修饰中的任何修饰,所述修饰包括但不限于糖基化、磷酸化、肉豆蔻基化、硫酸化和羟化。如此处所用,合适的多肽为能保护含有CIC的组合物以保留其免疫调制活性的多肽。结合蛋白的实例包括但不限于白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)和豌豆白蛋白。
其它合适的聚合物可为制药领域公知的任何聚合物,其包括但不限于天然存在的聚合物(如葡聚糖、羟乙基淀粉和多糖)和合成的聚合物。天然存在的聚合物的实例包括蛋白质、糖肽、多糖、葡聚糖和脂类。其它聚合物可为合成的聚合物。适用于本发明的合成聚合物的实例包括但不限于聚烷基二醇(PAG)如PEG、聚氧乙基化多元醇(POP)如聚氧乙基化丙三醇(POG)、聚三亚甲基二醇(PTG)、聚丙二醇(PPG)、聚异丁烯酸羟乙基酯、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酸、聚乙基_唑啉、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氨基酸、聚氨基甲酸酯和聚磷腈。合成的聚合物也可为直链或支链的、取代或未取代的均聚物、两种或多种不同的合成单体的共聚物或嵌段共聚物。
用于本发明包囊组合物中的PEG可购自化学供应商或用本领域公知的技术合成。
术语″LMS″如此处所用是指这样的层状脂粒子,其中极性脂的极性头部基团面向界面的水相排列以形成膜结构。LMS的实例包括脂质体、微胶粒、螺旋体(即通常的圆柱状脂质体)、微乳、单层脂质体、多层脂质体等。
可用于施用CIC的一种胶体分散体系为脂质体。用脂质体包封的抗原免疫小鼠,脂质体表现出可促进针对抗原的Th1-型免疫反应。Aramaki等人(1995),疫苗(Vaccine)13:1809-1814。如此处所用,″脂质体″或″脂质小泡″为被至少一个且可能多于一个的双层脂膜包裹的小泡。可以从磷脂、糖脂、脂类、类固醇如胆固醇、相关分子或其组合通过本领域公知的任何技术人工制备脂质体,所述技术包括但不限于超声处理、挤出或从脂-去污剂复合体中去除去污剂。脂质体也可任选地包含其它成分如组织靶向成分。应理解″脂膜″或″脂双层″不一定仅由脂类组成,只要膜的总体结构为两个亲水表面夹着一个疏水核的片层,″脂膜″或″脂双层″还可包含任何合适的其它成分,所述成分包括但不限于胆固醇和其它类固醇、溶于脂的化学物质、任何长度的蛋白质以及其它两亲性分子。对膜结构的综合讨论参见J.Kendrew(1994)的分子生物学百科全书(The Encyclopedia ofMolecular Biology)。合适的脂类参见如Lasic(1993)″Liposomes:fromPhysics to Applications″Elsevier,Amsterdam。
用于制备含有包含CIC的组合物的脂质体的方法为本领域公知。脂质小泡可通过本领域公知的任何合适技术制备。方法包括但不限于微囊化、微流化、LLC法、醇注射、氟利昂注射、″发泡″法、去污剂透析、水合作用、超声处理和反相蒸发。综述见Watwe等人(1995)Curr.Sci.68:715-724。可组合多种技术以提供具最理想性质的小泡。
本发明包括含有组织或细胞靶向成分的LMS的用途。此类靶向成分为LMS中的成分,当此LMS施用于完整的动物、器官或细胞培养物时,该成分可促进LMS优先积聚在特定组织或细胞位点而非其它组织或细胞位点。靶向成分通常从脂质体外部来接近,因此其优选结合在外表面或插入外部的脂双层中。靶向成分尤其可为肽、较大肽的区域、细胞表面分子或标记物的特异性抗体或其抗原结合片段、核酸、糖类、复合糖的区域、特异的脂、或与任一上述分子结合的小分子如药物、激素或半抗原。对细胞类型特异性细胞表面标记物具特异性的抗体为本领域公知,并易于通过本领域公知的方法制备。
可使LMS靶向治疗欲指向的任何细胞类型,如可调制和/或参与免疫反应的细胞类型。此类靶细胞和器官包括但不限于APC如巨噬细胞、树突细胞和淋巴细胞、淋巴结构如淋巴结和脾、以及非淋巴结构,尤其是那些存在树突细胞的非淋巴结构。
本发明的LMS组合物还可包含表面活性剂。表面活性剂可为阳离子的、阴离子的、两亲的或非离子的表面活性剂。表面活性剂的一种优选类型为非离子表面活性剂;而尤其优选那些水溶性的。
在CIC和抗原通过与平台分子的连接而紧密联结的实施方案中,平台可为蛋白样或非蛋白样(例如,合成的)价平台(valency platform)。适宜平台的实例描述参见上文中有关用作CIC的间隔体结构部分的价平台的讨论。抗原和价平台可通过常规方法连接。例如,多肽含有带官能团如氨基、羧基或巯基基团的氨基酸侧链结构部分时,这些官能团可以作为多肽与平台偶联的位点。如果多肽不包含这些基团,可将具有此类官能团的残基添加至该多肽。此类残基可通过固相合成技术或重组技术掺入,这两种技术为肽合成领域所熟知。当多肽具有糖侧链(或当抗原为糖)时,可通过常规化学向其中掺入官能团氨基、巯基和/或醛基。例如,通过在氰基硼氢化钠存在下使氧化糖与乙二胺反应,可掺入伯氨基基团;通过与半胱胺二盐酸盐的反应然后用标准的二硫化物还原剂还原可掺入巯基;而醛基可在高碘酸氧化后产生。如果平台分子不具有合适的官能团,也可以以类似方式衍生平台分子以包含官能团。
在另一实施方案中,通过将CIC和抗原吸附至表面,例如毫微粒子或微载体表面来实现两者的共施用。CIC和/或抗原可以通过非共价相互作用(包括离子的和/或疏水的相互作用)吸附至表面。将多核苷酸和多肽吸附至表面以便将所吸附的分子递送到细胞是本领域所熟知的。参见如Douglas等人(1987)Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Syst.3:233-261;Hagiwara等人(1987)In Vivo1:241-252;Bousquet等人(1999)Pharm.Res.16:141-147;和Kossovsky等人,美国专利5,460,831。优选地,含有吸附表面的材料是可生物降解的。
总之,毫微粒子的特征如表面电荷、粒子大小和分子量取决于聚合过程中的聚合条件、单体浓度和稳定剂的存在(Douglas等人,1987,同上引文)。载体粒子的表面可通过如表面包被来修饰,以允许或促进CIC和/或抗原的吸附。吸附了CIC和/或抗原的载体粒子可进一步用其它物质包被。此类其它物质的添加如此处所述可例如在将粒子施用于对象后延长粒子的半衰期,和/或可将粒子靶向特定的细胞类型或组织。
可吸附CIC和抗原的毫微结晶表面已有描述(参见如美国专利5,460,831)。毫微结晶核心粒子(直径为1μm或更小)可以用促进多肽、多核苷酸和/或其它药剂吸附的表面能量修饰层包被。如在美国专利5,460,831中所述,例如核心粒子可以用促进寡核苷酸吸附的表面包被,接下来用抗原制品包被,其中所述抗原制品为例如脂-抗原混合物形式。此类毫微粒子为毫微米大小粒子的自我组装复合体,一般为0.1μm级,其带有CIC内层和抗原外层。
另一吸表面为通过聚合烷基氰基丙烯酸酯而制备的毫微粒子。烷基氰基丙烯酸酯可在酸化的水性介质中通过阴离子聚合法而聚合。根据聚合条件,这些小粒子趋向于具有20至3000nm的尺寸,并且可制备具有特定表面特征和特定表面电荷的毫微粒子(Douglas等人,1987,同上引文)。例如,在存在疏水阳离子如氯化四苯_或季铵盐如溴化十六烷基三甲基铵时,寡核苷酸可被吸附至聚异丁基氰基丙烯酸酯和聚异己基氰基丙烯酸酯毫微粒子上。寡核苷酸吸附在这些毫微粒子上似乎是通过核酸链的带负电荷磷酸基团和疏水阳离子之间形成的离子对介导的。参见如Lambert等人(1998),生物化学(Biochimie)80:969-976,Chavany等人(1994)Pharm.Res.11:1370-1378;Chavany等人(1992)Pharm.Res.9:441-449。多肽也可吸附在聚烷基氰基丙烯酸酯毫微粒子上。参见如Douglas等人,1987;Schroeder等人(1998)肽(Peptides)19:777-780。
另一吸表面为通过丙二酸亚甲酯聚合而制备的毫微粒子。例如,如Bousquet等人,1999所述,多肽吸附至聚(丙二酸亚甲酯2.1.2)毫微粒子上似乎最初是通过静电力然后是通过疏水力稳定来实现的。
C.其它佐剂
CIC也可与佐剂联用。与仅包含CIC和抗原的组合物所导致的免疫应答相比,抗原与CIC和佐剂联合施用可导致对抗原的免疫应答增强,并由此导致增强的免疫应答。佐剂为本领域公知,其包括但不限于水包油乳液、油包水乳液、明矾(铝盐)、脂质体和微粒子(包括但不限于聚苯乙烯、淀粉、聚磷腈和聚交酯/聚糖苷)。其它合适的佐剂还包括但不限于MF59、DETOXTM(Ribi)、鲨烯混合物(SAF-1)、胞壁酰肽、皂甙衍生物、分枝杆菌细胞壁制品、单磷酰酯A、霉菌酸衍生物、非离子嵌段共聚物表面活性剂、Quil A、霍乱毒素B亚单位、聚磷腈及衍生物、以及免疫刺激复合体(ISCOM)如Takahashi等人(1990)自然(Nature)344:873-875中描述的那些免疫刺激复合体、以及基于脂的佐剂和本文描述的其它佐剂。对于兽医用及在动物体内产生抗体,可使用弗氏佐剂(完全和不完全弗氏佐剂)的促有丝分裂成分。
IV.本发明方法
本发明提供了调制个体免疫应答的方法,其中个体优选地为哺乳动物,更优选地为人,该方法包括施与个体此处所述的CIC。免疫调制可包括刺激Th1-型免疫应答和/或抑制或降低Th2-型免疫应答。CIC以足以调制免疫应答的量施用。如本文所述,免疫应答的调制可为对体液和/或细胞免疫应答的调制,并且该调制可用本领域的标准技术及按此处所述测定。
许多个体适于接受本文所述的CIC。优选地(但非必需),个体为人。
在某些实施方案中,个体患有与Th2-型免疫应答相关的病症,例如(不限于)变态反应或变态反应-诱导的哮喘、特应性皮炎、嗜酸性胃肠炎症、嗜酸性食管炎和变应性支气管肺曲霉病。CIC的施用将导致免疫调制,提高一种或多种与Th1-型应答相关的细胞因子的水平,这可导致与个体的变应原应答相关的Th2-型应答特征的减少。对患有Th2-型应答相关病症的个体的免疫调制可导致减轻或改善一个或多个疾病症状。如果病症为变态反应或变态反应-诱导的哮喘,一个或多个症状的改善包括减轻一个或多个以下症状:鼻炎、变应性结膜炎、循环IgE水平、循环组胺水平和/或对′抢救性′吸入疗法(例如,通过计量给药吸入器或喷雾器而施用的吸入舒喘灵)的需要。
在进一步的实施方案中,接受本发明免疫调制治疗的个体为接受疫苗的个体。疫苗可为预防性疫苗或治疗性疫苗。预防性疫苗包含与个体可能有危险罹患的病症相关的一个或多个表位(例如,分枝结核杆菌抗原作为疫苗用于预防结核病)。治疗性疫苗包含与影响个体的特定病症相关的一个或多个表位,如结核病患者体内的分枝结核杆菌或牛结核分枝杆菌(M.bovis)表面抗原、在产生变态反应的个体体内使个体产生变应性的抗原(即变态反应脱敏疗法)、来自癌症患者的肿瘤细胞(例如,在美国专利号5,484,596中所述)、或癌症患者的肿瘤相关抗原。CIC可以与疫苗联用(例如,与疫苗一同注射或同时但分别注射)或CIC可分开施用(例如,在疫苗施用前或后至少12小时)。在某些实施方案中,疫苗的抗原是CIC的一部分,该抗原共价或非共价连接至CIC。与接受不包含CIC的疫苗的个体比较,对接受疫苗的个体施用CIC治疗导致对疫苗的免疫应答移向Th1-型。向Th1-型应答的偏移可通过如下来识别,即,出现对疫苗中抗原的迟发型超敏(DTH)反应、升高的IFN-γ和其它Th1-型应答相关细胞因子、特异针对疫苗中抗原的CTL的产生、特异针对疫苗中抗原的IgE水平的下降或减少、特异针对疫苗中抗原的Th2-相关抗体的减少、和/或对疫苗中抗原具有特异性的Th1-相关抗体的升高。在治疗性疫苗的情况下,CIC和疫苗的施用也可导致疫苗所欲治疗的病症的一种或多种症状得以改善。正如本领域技术人员显而易见的,改进的确切症状和改进的方式取决于所欲治疗的病症。例如,当治疗性疫苗针对结核病时,用CIC与疫苗治疗导致咳嗽、胸膜或胸壁痛、发烧和/或本领域公知的其它症状减轻。当疫苗为用于变态反应脱敏疗法中的变应原时,所述治疗导致变态反应症状的减轻(例如,鼻炎、变应性结膜炎减轻、循环IgE水平和/或循环组胺水平降低)。
本发明的其它实施方案涉及对已患有疾病或病症如癌症或感染性疾病的个体的免疫调制治疗。癌症是有吸引力的进行免疫调制的靶标,因为大多数癌表达肿瘤相关抗原和/或肿瘤特异性抗原,这些抗原在体内其它细胞上不存在。刺激针对肿瘤细胞的Th1-型应答将导致免疫系统通过直接和/或旁观者方式杀伤肿瘤细胞,导致肿瘤细胞减少和/或症状减轻。将CIC施用给患有癌的个体可导致刺激针对肿瘤细胞的Th1-型免疫应答。此免疫应答通过细胞免疫系统的细胞(如CTL)或体液免疫系统的成分的直接作用,或通过对免疫系统(包括巨噬细胞和天然杀伤(NK)细胞)的靶向细胞的邻近细胞产生旁观者效应来杀伤肿瘤细胞。参见如Cho等人(2000),自然生物技术(Nat.Biotechnol.)18:509-514。在治疗已经存在的疾病或病症时,CIC可以与其它免疫治疗剂,如细胞因子、佐剂和抗体联用。例如,CIC可以作为治疗方案的一部分给药,所述治疗方案包括施用结合肿瘤细胞展示抗原的结合剂。结合剂的实例包括多克隆和单克隆抗体。靶抗原的实例包括CD20、CD22、HER2和本领域已知的或有待将来发现的其它抗原。不期望受理论的束缚,CIC被认为可以增强对结合剂相关肿瘤细胞的杀伤作用(例如,通过增强抗体依赖性细胞毒性和/或效应子功能)。结合剂可以任选地用例如可破坏结合剂所结合的细胞的放射性同位素或毒素标记。CIC可以与该药剂联合(例如,同时)或在之前或之后(例如,施用该药剂之前或之后不到24小时)给药。例如,在癌症的情况下,CIC可以与已知或怀疑可用于治疗癌症的化疗剂联合施用。再如,CIC可以与放疗或基因疗法等联合施用。此CIC可以是本文所述任何CIC。
根据本发明的免疫调制治疗也可用于患有感染性疾病的个体,其中感染性疾病尤其是抵抗体液免疫应答的感染性疾病(例如,由分枝杆菌感染和胞内病原体引起的疾病)。免疫调制治疗可用于治疗由细胞病原体(如细菌或原生动物)或亚细胞病原体(如病毒)引起的感染性疾病。可将CIC治疗施与患有分枝杆菌疾病的个体,其中所述疾病如结核病(例如,分枝结核杆菌和/或牛结核分枝杆菌感染)、麻风病(即麻风分枝杆菌(Mleprae)感染)或海分枝杆菌(M.marinum)或溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)感染。CIC治疗也可用于治疗病毒性感染,包括流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒尤其是单纯疱疹病毒和乳头瘤病毒感染。由胞内寄生虫引起的疾病也可受益于CIC治疗,所述疾病如疟疾(例如,间日疟原虫(Plasmodium vivax)、卵形疟原虫(P.ovale)、恶性疟原虫(P.falciparum)和/或三日疟原虫(P.malariae)引起的感染)、利什曼病(例如,杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、热带利什曼原虫(L.tropica)、墨西哥利什曼原虫(L.mexicana)、巴西利什曼原虫(L.braziliensis)、秘鲁利什曼原虫(L.peruviana)、婴儿利什曼原虫(L.infantum)、L.chagasi和/或埃塞俄比亚利什曼原虫(Leishmania aethiopica)引起的感染)、以及弓形体病(即鼠弓形体(Toxoplasmosis gondii)引起的感染)。CIC治疗也可用于治疗寄生虫病如血吸虫病(即由血吸虫属血吸虫如埃及血吸虫(S.haematobium)、曼氏血吸虫(S.mansoni)、日本血吸虫(S.japonicum)和湄公血吸虫(S.mekongi)引起的血吸虫感染)和枝睾吸虫病(即由华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)引起的感染)。将CIC施与患有感染性疾病的个体可导致感染性疾病的症状改善。在一些实施方案中,感染性疾病非病毒性疾病。
本发明还提供了升高或刺激个体的至少一种Th1-相关细胞因子的方法,其中所述Th1-相关细胞因子包括IL-2、IL-12、TNF-β、IFN-γ和IFN-α。在某些实施方案中,本发明提供了升高或刺激个体体内的IFN-γ的方法,所述个体尤其是需要增高IFN-γ水平的个体,其方式是通过给个体施用有效量的CIC使IFN-γ升高。需要增高IFN-y水平的个体为那些患有一般对施用IFN-γ有反应的病症的个体。此类病症包括许多炎症,包括但不限于溃疡性结肠炎。此类病症也包括许多纤维化病症,包括但不限于特发性肺纤维化(IPF)、硬皮病、辐射引发的皮肤纤维化、肝纤维化(包括血吸虫病引发的肝纤维化)、肾纤维化以及其它可通过施用IFN-γ而改善的疾病。施用本发明的CIC将导致IFN-γ水平升高,并导致响应IFN-γ的病症的一种或多种症状得以改善、一种或多种症状得以稳定和/或病症发展得以防止(例如,减轻或消除额外的损伤或症状)。本发明的方法可与组成疾病护理标准的其它疗法联用,如在IPF中与施用抗炎剂诸如全身皮质类固醇疗法(如考的松)联合。
在某些实施方案中,本发明提供了升高个体体内的IFN-α的方法,所述个体尤其是需要增高IFN-α水平的个体,其方式是通过给个体施用有效量的CIC从而升高IFN-α水平。需要增高IFN-α的个体为那些患有对施用IFN-α(包括重组IFN-α)有反应的病症的个体,此类病症包括但不限于病毒性感染和癌症。
施用本发明的CIC可导致IFN-α水平升高,并导致响应IFN-α的病症的一种或多种症状得以改善、一种或多种症状得以稳定或病症的发展得以防止(例如,减轻或消除额外的损伤或症状)。本发明的方法可与组成疾病护理标准的其它疗法联用,如对于病毒性感染可与施用抗病毒剂联合。
基于本公开显而易见的是,CIC的间隔体组成可以影响CIC施用所引起的免疫应答。实际上所有测试的间隔体(除了十二烷基外)均可以用于CIC中有效地诱导人PBMC中的IFN-γ。然而,已经观察到线性CIC的间隔体组成对IFN-α的诱导有不同影响。例如,含有如HEG、TEG或C6间隔体的CIC与含有C3、C4或脱碱基间隔体的CIC相比倾向于在PBMC中造成更高的IFN-α诱导(和减少的B细胞增殖)(参见,例如,下文实施例34)。
本发明还提供了降低患有IgE-相关病症的个体体内的IgE水平,尤其是血清IgE水平的方法,其方式是向个体施用有效量的CIC。在此类方法中,CIC可单独施用(如,无抗原)或与抗原如变应原联合施用。IgE相关病症是通过降低IgE水平可改善的疾病、病症或一组症状。IgE的降低将导致IgE-相关病症的症状得以改善--此类症状包括变态反应症状(如鼻炎、结膜炎)、对变应原的敏感性降低、发生变态反应的个体的变态反应症状减轻或变态反应的严重程度降低。
本发明的方法包括以CIC/微载体复合体形式施用CIC的实施方案。
在一些实施方案中,本发明提供了刺激个体产生CTL的方法,该方法包括给个体施用有效量的CIC从而提高CTL的产生。
对本领域技术人员显而易见的是,对于施用CIC治疗的特定适应症,本发明的方法可与其它疗法联用。例如,CIC疗法可与抗疟疾药如氯喹联用施与疟疾患者、可与杀利什曼原虫药如戊烷脒和/或别嘌呤醇联用施与利什曼病患者、可与抗分枝杆菌药如雷米封、利福平和/或乙胺丁醇联用施与结核病患者、或可与变应原脱敏疗法联用施与特应性(变态反应)患者。
A.施用和评估免疫反应
如此处所述,CIC可与药剂和/或免疫原性剂和/或其它免疫刺激剂联合施用,并可与其生理可接受载体组合。
例如,本发明CIC或组合物可以和其它免疫治疗剂如细胞因子、佐剂和抗体联合施用。CIC可以与该药剂联合给药(例如,同时,或之前或之后(例如,该药剂给药之前或之后不超过24小时)。CIC可以是此处所述任何CIC。
如所有的免疫刺激性组合物一样,特定的CIC制剂的免疫学有效量和施用方法可根据个体、欲治疗的疾病和为本领域技术人员显而易见的其它因素的不同而不同。待考虑的因素包括共施用抗原的存在、CIC是否与佐剂或递送分子联合施用或与它们共价连接、施用途径和欲施用的免疫给药次数。此类因素为本领域公知,并且不用过多试验而对它们作出确定也属于本领域技术人员的技术范围。合适的剂量范围是能为针对抗原的免疫应答提供所需调制的剂量范围。通常,剂量由施用于患者的CIC的量而不是由CIC的总量来确定。CIC的有用剂量范围(以递送的CIC的量给出)可以例如大约为下列任一个:1至500μg/kg,100至400μg/kg,200至300μg/kg,1至100μg/kg,100至200μg/kg,300至400μg/kg,400至500μg/kg。施与每一患者的绝对量取决于药理学特性如生物利用度、清除率和施用途径。
特定的CIC制剂的有效量和施用方法可以根据患者个体和疾病阶段及本领域技术人员明了的其它因素而改变。具体应用时的施用途径对本领域技术人员是显而易见的。施用途径包括但不限于局部的、皮肤的、经皮肤的、经粘膜的、表皮的、肠胃外的、肠胃的以及鼻咽的和肺的(包括经支气管的和经肺泡的)施用途径。合适的剂量范围为这样的剂量范围,其可提供足够的含有CIC的组合物,以致通过测定血液水平达到约1-10μM的组织浓度。施与每一患者的绝对量取决于药理学特性如生物利用度、清除率和施用途径。
如此处所述,APC和具有高浓度APC的组织为CIC的优选靶。因此,将CIC施用至APC以相对高的浓度存在的哺乳动物皮肤和/或粘膜处是优选的。
本发明提供了适用于局部应用的CIC制剂,包括但不限于生理可接受的植入物、软膏、霜剂、洗剂和凝胶。局部施用可以例如通过其中分散有递送系统的敷料或绷带来施用、或将递送系统直接施用入切口或开放性伤口、或通过定向于目标位点的经皮肤施用装置来施用。其中分散有CIC的霜剂、洗剂、凝胶或软膏适于用作局部软膏或伤口充填剂。
优选的皮肤施用途径为那些侵害最小的途径。这些方式中优选经皮递送、表皮施用和皮下注射。在这些方式中,由于预计皮内组织中存在较高浓度的APC,优选表皮施用。
经皮施用通过应用可使CIC透过皮肤并进入血流的霜剂、洗剂、凝胶等来实现。适于经皮施用的组合物包括但不限于直接应用于皮肤或掺入保护性载体如经皮载置(所谓″贴剂″)中的可药用混悬液、油、霜剂和软膏。合适的霜剂、软膏等的实例可例如在Physician′s Desk Reference中找到。
对于经皮递送,离子电渗是一合适的方法。离子电渗递送可通过市售的贴剂而完成,其中贴剂可以通过未破损皮肤持继递送它们的产物几天或更长时间。该方法的使用使得药物组合物能以相对大的浓度受控递送、并允许输注组合药物及同时使用吸收促进剂。
用于该方法中的示例性贴剂产品是Los Angeles,CA的GeneralMedical Company的商标为LECTRO PATCH的产品。该产品通过电子方式维持贮库电极在中性pH并能适应于提供改变浓度的剂量以及连续地和/或周期性地给药。贴剂的准备和使用应按照与LECTRO PATCH产品在一起的、厂商印制的说明书进行;这些说明书在此引用作为参考。其它封闭式贴剂体系也是合适的。
对于经皮肤递送,低频超声递送也是一合适的方法。Mitragotri等人(1995)科学(Science)269:850-853。低频超声频率(约1MHz)的应用允许治疗组合物(包括那些具有高分子量的治疗组合物)的总体受控递送。
表皮施用基本上涉及机械刺激或化学刺激最外层表皮,而且所述刺激将足以激发对该刺激的免疫应答。具体而言,该刺激应足以将APC吸引至刺激位点。
一个示例性的机械刺激方式使用多个直径非常狭窄的短齿,其可用于刺激皮肤并将APC吸引至刺激位点以摄取从齿的末端转移出的CIC。例如,法国Lyon的Pasteur Merieux生产的MONO-VACC旧结核菌素试验包含适于导入包含CIC的组合物的装置。
该装置(由Swiftwater,PA的Connaught Laboratories,Inc.在美国供销)由在一端具有注射器推进器和在另一端具有齿盘的塑料容器组成。齿盘上固定着具有一定长度的多个直径狭窄的齿,以致其恰好能刮搔表皮的最外层细胞。MONO-VACC试剂盒中的每个齿都包被有旧结核菌素;在本发明中,每个针都包被有CIC制剂的药物组合物。该装置的使用优选按照包括在该装置产品中的、厂商所写的说明书进行。在此实施方案中也可使用的类似装置为目前用于实施变态反应试验的那些。
表皮施用CIC的另一合适方法是使用化学品,该化学品能刺激表皮的最外层细胞,因此激发可吸引APC至该区域的足够的免疫应答。一个实例为角质裂解剂,如由Noxema Corporation以商标NAIR卖出的市售局部脱毛霜中使用的水杨酸。该方法也可用于实现粘膜的上皮施用。化学刺激剂也可与机械刺激物联合应用(例如,如果MONO-VACC类齿也包被有化学刺激剂,则存在此联合应用)。CIC可悬于还包含化学刺激剂的载体中或与该化学刺激剂共施用。
肠胃外的施用途径包括但不限于电注射(离子电渗)或直接注射如直接注射入中央静脉、静脉内注射、肌内注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射。适用于肠胃外施用的CIC制剂通常配制在USP水或注射用水中,并且还可包含pH缓冲剂、盐填充剂、防腐剂和其它可药用赋形剂。用于肠胃外注射的CIC可配制在可药用无菌等渗溶液如注射用盐水和磷酸盐缓冲盐水中。
胃肠施用途径包括但不限于吞咽和直肠途径。本发明包括适于胃肠施用的CIC制剂,包括但不限于用于吞咽给药的可药用粉剂、片剂或液体及用于直肠施用的栓剂。对本领域技术人员显而易见的是:片剂或栓剂还将包含可药用固体如淀粉,以填充组合物。
鼻咽的和肺的施用可通过吸入实施,并包括递送途径如鼻内途径、经支气管途径和经肺泡途径。本发明包括适于吸入施用的CIC制剂,包括但不限于用于形成气雾的液态悬浮剂及用于干粉吸入递送系统的粉剂。对于吸入施用CIC制剂,适用的装置包括但不限于喷雾器、蒸发器、雾化器和干粉吸入递送装置。
递送途径的选择可用于调制所引发的免疫应答。例如,当流感病毒载体通过肌内或表皮(基因枪)途径施用时,IgG效价和CTL活性是相同的;但是,肌肉接种主要产生IgG2a,而表皮途径主要产生IgG1。Pertmer等人(1996),病毒学杂志(J.Virol.)70:6119-6125。因此,本领域技术人员可利用本发明免疫调制性多核苷酸的不同施用途径所引发的免疫原性的轻微差别。
上述组合物和施用方法旨在描述而不用于限制本发明CIC制剂的施用方法。制备各种组合物和装置的方法在本领域技术人员的能力范围内,在此不再详述。
针对CIC的免疫应答可以按任何本领域公知的方法进行分析(定性和定量分析),包括但不限于测定抗原特异性的抗体产生(包括测定特异的抗体+亚类)、特异淋巴细胞群如CD4+T细胞、NK细胞或CTL的活化、细胞因子如IFN-γ、IFN-α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10或IL-12的产生和/或组胺的释放。测定特异性抗体应答的方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA),并且为本领域熟知。特定类型淋巴细胞如CD4+T细胞数目的测定可例如用荧光激活的细胞分选法(FACS)完成。细胞毒性和CTL试验可例如如Raz等人(1994),美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91:9519-9523和Cho等人(2000)所述进行。细胞因子浓度可例如通过ELISA测定。这些和其它用于评估针对免疫原的免疫应答的试验为本领域熟知。参见如细胞免疫学中的选择方法(Selected Methods in CellularImmunology)(1980)Mishell和Shiigi编辑,W.H.Freeman and Co.。
优选地,刺激,即引发和/或增强Th1-型应答。关于本发明,对Th1-型免疫应答的刺激可通过体外或离体测定用CIC处理的细胞的细胞因子产生并与未用CIC处理的对照细胞相比来确定。确定细胞的细胞因子产生的方法包括那些本文中描述的方法及本领域公知的任何方法。响应CIC处理产生的细胞因子的类型表明了细胞产生的是偏向Th1-型或Th2-型的免疫应答。如此处所用,术语″偏向于Th1-型的″细胞因子产生是指在存在刺激剂时Th1-型免疫应答相关细胞因子的产生与缺乏刺激时此类细胞因子的产生相比,前者可测量地升高。此类偏向于Th1-型的细胞因子的实例包括但不限于IL-2、IL-12、IFN-γ和IFN-α。相反,″偏向于Th2-型的细胞因子″是指那些与Th2-型免疫应答相关的细胞因子,其包括但不限于IL-4、IL-5和IL-13。可用于测定CIC活性的细胞包括免疫系统的细胞、分离自宿主的原代细胞和/或细胞系,优选地为APC和淋巴细胞,甚至更优选地为巨噬细胞和T细胞。
对Th1-型免疫应答的刺激也可在使用CIC处理的宿主中测定,并且可用本领域公知的任何方法测定,包括但不限于:(1)与接触过抗原的或接触过抗原并被攻击过的、未用CIC处理的对照比较,在CIC处理的宿主中抗原攻击前后测定到IL-4或IL-5的水平降低;或检测到较低(或甚至没有检测到)IL-4或IL-5水平;(2)与接触过抗原的、或接触过抗原并被攻击过的未用CIC处理的对照比较,在CIC处理的宿主中抗原攻击前后IL-12、IL-18和/或IFN(α、β或γ)的水平升高;或检测到较高的IL-12、IL-18和/或IFN(α、β或γ)水平;(3)与未用CIC处理的对照比较,在CIC处理的宿主中产生″偏向于Th1-型的″抗体;和/或(4)与接触过抗原的或接触过抗原并被攻击过的、未用CIC处理过的对照比较,在CIC处理的宿主中抗原攻击前后检测到抗原特异性IgE的水平降低;或检测到较低(或甚至没有检测到)抗原特异性IgE的水平。这些测定中的许多可通过使用此处描述的方法或任何本领域公知的方法体外或离体测量由APC和/或淋巴细胞,优选地由巨噬细胞和/或T细胞产生的细胞因子来实现。这些测定中的一些测定可通过使用此处描述的方法或任何本领域公知的方法测量抗原特异性抗体的类和/或亚类来实现。
应答CIC处理所产生的抗原特异性抗体的类和/或亚类表明细胞产生的是偏向于Th1-型或偏向于Th2-型的免疫应答。如此处所用,术语″偏向于Th1-型的″抗体产生是指与Th1-型免疫应答相关的抗体(即Th1-相关抗体)的产生可测定地升高。可测定一种或多种Th1相关抗体。此类偏向于Th1-型的抗体的实例包括但不限于人IgGI和/或IgG3(参见如Widhe等人(1998)Scand.J Immunol.47:575-581和de Martino等人(1999)Ann.Allergy Asthma Immunol.83:160-164)和鼠IgG2a。相反,″偏向于Th2-型的抗体″是指那些与Th2-型免疫应答相关的抗体,其包括但不限于人IgG2、IgG4和/或IgE(参见如Widhe等人(1998)和de Martino等人(1999))以及鼠IgG1和/或IgE。
由于施用CIC而发生的对偏向于Th1-型的细胞因子的诱导可导致增强的细胞免疫应答,如那些由NK细胞、细胞毒杀伤细胞、Th1辅助细胞和记忆细胞实施的免疫应答。这些应答用在抗病毒、真菌、原生动物寄生虫、细菌、变应性疾病、哮喘及肿瘤的预防性或治疗性疫苗接种上尤其有益。
在一些实施方案中,Th2应答被抑制。Th2应答的抑制可通过如Th2相关细胞因子(诸如IL-4和IL-5)水平的降低及应答变应原的IgE的降低和组胺释放的减少来确定。
V.本发明试剂盒
本发明提供了试剂盒。在某些实施方案中,本发明的试剂盒包含一个或多个含有CIC的容器。试剂盒还可包含一套有关CIC的预期治疗应用(例如,免疫调制、改善感染性疾病的症状、升高IFN-γ水平、升高IFN-α水平、或改善IgE-相关病症)的适当说明书,通常为书面说明书。
试剂盒可包含包装在任何方便合适的包装中的CIC。例如,如果CIC为干燥制剂(例如,冷冻干燥的或干粉),通常使用带弹性塞的小瓶,这样通过弹性塞注入液体可容易地将CIC重悬。带有无弹性可摘取封口(如封口玻璃)的安瓿或带有弹性塞的安瓿最适用于CIC的液体制剂。也可考虑使用与特定的装置如吸入器、鼻施用装置(如喷雾器)或输注装置如微型泵组合应用的包装。
有关CIC的应用的说明书通常包括针对预期治疗的剂量、给药方案及施用途径的信息。CIC的容器可为单位剂量、大包装(如多剂量包装)或亚单位剂量。本发明试剂盒中提供的说明书一般为书写在标签或包装插入物(如,包括在试剂盒中的纸片)上的书面说明书,但可机读的说明书(如在磁盘或光存储盘上携带的说明书)也可接受。
在一些实施方案中,试剂盒还包含抗原(或包含一种或多种抗原),该抗原可与或不与CIC包装在同一容器(制剂)中。文中已描述了抗原。
在某些实施方案中,本发明的试剂盒包含以CIC/微载体复合体(CIC/MC)形式存在的CIC,并还可包含一套涉及该CIC/MC复合体的预期治疗应用(例如,免疫调制、改善感染性疾病的症状、升高IFN-γ水平、升高IFN-α水平、或改善IgE-相关病症)的说明书,通常为书面说明书。
在一些实施方案中,本发明的试剂盒包含用于产生CIC/MC复合体的材料,通常包括分开装有CIC和MC的容器,但在某些实施方案中提供的是用于产生MC的材料而不是预形成的MC。CIC和MC优选以如下形式提供,所述形式允许所提供的CIC和MC在混合后可形成CIC/MC复合体。当CIC/MC复合体通过非共价键连接时,优选这种配置。当CIC和MC待通过异双官能交联剂交联时;当CIC或MC以″活化″形式(例如,连接在异双官能交联剂上,这样可获得与CIC反应的结构部分)提供时,也优选这种配置。
对于包含液相MC的CIC/MC复合体,试剂盒优选地包含一个或多个容器,容器中含有用于产生液相MC的材料。例如,对于水包油的乳液MC,CIC/MC试剂盒可包含一个或多个含有油相和水相的容器。乳化容器中的内容物以产生MC,然后其可与CIC混合,优选地与已修饰而掺入了疏水结构部分的CIC混合。此类材料包括用于产生水包油乳液的油和水,或者包括含有冷冻干燥的脂质体成分(如磷脂、胆固醇和表面活性剂的混合物)的容器加上含有水相(例如,可药用的水性缓冲液)的一个或多个容器。
VI.实施例
提供下列实施例来举例阐述而非限制本发明。
实施例1:多核苷酸和嵌合化合物的结构
表2显示的是实施例涉及的多核苷酸和嵌合分子的结构。″HEG″是六聚乙二醇间隔体结构部分;″TEG″是三聚乙二醇;″C3″是丙基间隔体结构部分;″C4″是丁基间隔体;″C6″是己基间隔体;″C12″是十二烷基间隔体;“HME”是2-羟甲基乙基;″abasic″或″ab″是1′2′-二脱氧核糖。其他间隔体见本说明书和附图中的描述。
除在表2和特定实施例中特别指出之处外,所有核苷酸连接及核酸结构部分和间隔体结构部分间的连接都是硫代磷酸酯。例如,在包含具有多个HEG或C3单元的复合(多亚单元)间隔体结构部分的CIC(如,C-13,C-14,C-15,C-15,C-91,C-92,C-36,C-37,和C-38)中,C3或HEG单元以硫代磷酸酯接头连接。类似地,所示的分支CIC(如,C-93,C-94,C-95,C-96,C-97,C-98,C-100,C-101,C-103,C-104,C-121,C-122,C-123,C-124,C-125,C-126,C-127,C-129,C-130)在间隔体的分支亚单元和线性亚单元之间包含硫代磷酸酯接头。所示的其他分支CIC(如,C-26,C-99,C-102,C-105,和C-137)是通过缀合策略制备的,具有如实施例中所述的连接基团。
表2还包括具有末端连接基团(如,HS(CH2)6-和HO(CH2)6SS(CH2)6)的CIC(如,C-128,C-106,C-113),此末端连接基因可用于连接这些CIC分子和分支的间隔体部分以构建分支CIC。实例参见实施例18。这些连接基团利用硫代磷酸酯键连接到CIC。
表2
测试化合物和多核苷酸
实施例2:合成具有线性结构和六聚乙二醇间隔体的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-10。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的DNA,间隔体结构部分是六聚乙二醇(HEG),后者通过硫代磷酸酯键连接到核酸结构部分。
C-10:5′-TCGTCG-3′-HEG-5′-ACGTTCG-3′-HEG-5′-AGATGAT-3′
C-10分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在PerseptiveBiosystems Expedite 8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯DNA的厂商操作程序进行合成。将核苷单体和间隔体结构部分前体——4,4′-O-二甲氧基三苯甲基-六聚乙二醇-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自Glen Research,Sterling,VA)溶解于无水乙腈,终浓度0.05M。(对本领域普通的技术人员来说显然的是,本文有时(如在CIC合成的上下文中)所用的术语“核苷单体”或“间隔体结构部分”指的是这样的前体试剂——如果利用如此处公开的合成方法使其脱保护并连接到其他成分上后可生成CIC的核酸和非核酸结构部分)。将HEG间隔体前体置于仪器的辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体和HEG间隔体并使核酸结构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用3′与载体结合的“T”固相载体
2.合成5′-AGATGA-3′结构部分
3.添加HEG间隔体
4.合成5′-ACGTTCG-3′结构部分
5.添加HEG间隔体
6.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
此合成循环由脱三苯甲基步骤、偶联步骤(亚磷酰胺单体加1H-四唑)、加帽步骤、利用0.05M的3H-1,2-苯并二硫杂环戊烷-3-酮1,1-二氧化物(Beaucage试剂)进行的硫化步骤和最后的加帽步骤组成。完成组装后,将脱掉三苯甲基的化合物从可控多孔玻璃上切离下来并用浓氨水58℃反应16小时对碱基脱保护。此化合物利用制备性聚丙烯酰胺电泳进行纯化,在Sep-pak Plus柱(Waters,Milord,MA)上脱盐,再以2.5体积的95%乙醇从1M氯化钠水溶液中沉淀出来。将分子溶于Milli Q水中,从260nm下的吸光度确定其产量。最后,将此化合物冻干形成粉末。通过毛细管凝胶电泳、电喷射质谱分析法、和RP-HPLC对此化合物进行表征以确证其组成和纯度。此外,还进行内毒素含量测试试验(LAL试验,Bio Whittaker),结果显示内毒素水平<5EU/mg化合物(即,基本上无内毒素)。
C-8,C-21,C-22,C-23,C-24,C-32和M-1以及其他线性HEG-CIC类似地进行合成。
实施例3:合成具有线性结构和丙基间隔体的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-11。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的DNA,间隔体结构部分是丙基(C3),后者经硫代磷酸酯键连接到核酸结构部分。
C-11:5′-TCGTCG-3′-C3-5′-ACGTTCG-3′-C3-5′-AGATGAT-3′
C-11分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在PerseptiveBiosystems Expedite8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯DNA的厂商操作程序进行合成。将核苷单体和间隔体结构部分前体——4,4′-O-二甲氧基三苯甲基-丙基-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自Glen Research,Sterling,VA)溶解于无水乙腈,终浓度0.05M。将C3间隔体前体置于仪器的辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体和C3间隔体,并使核酸结构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“T”固相载体
2.合成5′-AGATGA-3′结构部分
3.添加C3间隔体
4.合成5′-ACGTTCG-3′结构部分
5.添加C3间隔体
6.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
合成、脱保护、后处理、以及分析都按照实施例2中所述来进行。
C-9和其他含C3的CIC类似地进行合成。
实施例4:合成具有线性结构和丁基间隔体的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-17。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的DNA,间隔体结构部分是丁基(C4),后者经硫代磷酸酯键连接到核酸结构部分。
C-17:5′-TCGTCG-3′-C4-5′-ACGTTCG-3′-C4-5′-AGATGAT-3′
C-17分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在PerseptiveBiosystems Expedite8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯DNA的厂商操作程序进行合成。将核苷单体和间隔体结构部分前体——4,4′-O-二甲氧基三苯甲基-丁基-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自ChemGenes,Ashland,MA)溶解于无水乙腈,终浓度0.05M。将C4间隔体前体置于仪器的辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体和C4间隔体并使核酸结构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“T”固相载体
2.合成5′-AGATGA-3′结构部分
3.添加C4间隔体
4.合成5′-ACGTTCG-3′结构部分
5.添加C4间隔体
6.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
合成、脱保护、后处理、以及分析都按照实施例2中所述来进行。
实施例5:合成具有线性结构和三聚乙二醇间隔体的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-18。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的DNA,间隔体结构部分是三聚乙二醇(TEG),后者经硫代磷酸酯键连接到核酸结构部分。
C-18:5′-TCGTCG-3′-TEG-5′-ACGTTCG-3′-TEG-5′-AGATGAT-3′
C-18分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在PerseptiveBiosystems Expedite8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯DNA的厂商操作方案进行合成。将核苷单体和间隔体结构部分前体——4,4′-O-二甲氧基三苯甲基-三聚乙二醇-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自Glen Research,Sterling,VA)溶解于无水乙腈,终浓度0.05M。将TEG间隔体前体置于仪器的辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体和TEG间隔体并使核酸结构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“T”固相载体
2.合成5′-AGATGA-3′结构部分
3.添加TEG间隔体
4.合成5′-ACGTTCG-3′结构部分
5.添加TEG间隔体
6.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
合成、脱保护、后处理、以及分析都按照实施例2中所述来进行。
实施例6:合成具有线性结构和十二烷基间隔体的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-19。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的DNA,间隔体结构部分是十二烷基(C12),后者经硫代磷酸酯键连接到核酸结构部分。
C-19:5′-TCGTCG-3′-C12-5′-ACGTTCG-3′-C12-5′-AGATGAT-3′
C-19分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在PerseptiveBiosystems Expedite8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯DNA的厂商操作程序进行合成。将核苷单体和间隔体结构部分前体——4,4′-O-二甲氧基三苯甲基-十二烷基-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自Glen Research,Sterling,VA)溶解于无水乙腈,终浓度0.05M。将C12间隔体前体置于仪器的辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体和C12间隔体并使核酸结构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“T”固相载体
2.合成5′-AGATGA-3′结构部分
3.添加C12间隔体
4.合成5′-ACGTTCG-3′结构部分
5.添加C12间隔体
6.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
合成、脱保护、后处理、以及分析都按照实施例2中所述来进行。
实施例7:合成具有线性结构和脱碱基间隔体的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-20。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的DNA,间隔体结构部分是1′,2′-二脱氧核糖(脱碱基,abasic),后者经硫代磷酸酯键连接到核酸结构部分。
C-20:
5′-TCGTCG-3′-abasic-5′-ACGTTCG-3′-abasic-5′AGATGAT-3′
C-20分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在PerseptiveBiosystems Expedite8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯DNA的厂商操作程序进行合成。将核苷单体和间隔体结构部分前体——5′-O-(4,4′-O-二甲氧基三苯甲基)-1′,2′-二脱氧核糖-3′-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自Glen Research,Sterling,VA)溶解于无水乙腈,终浓度0.05M。将脱碱基间隔体前体置于仪器的辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体和脱碱基间隔体并使核酸结构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“T”固相载体
2.合成5′-AGATGA-3′结构部分
3.添加脱碱基间隔体
4.合成5′-ACGTTCG-3′结构部分
5.添加脱碱基间隔体
6.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
合成、脱保护、后处理、以及分析都按照实施例2中所述来进行。
实施例8:合成具有线性结构和六聚乙二醇及三聚乙二醇间隔体的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-29。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的DNA,间隔体结构部分是经硫代磷酸酯键连接到核酸结构部分的六聚乙二醇(HEG),而3′-末端基团是经硫代磷酸酯键连接到核酸结构部分的三聚乙二醇(TEG)。
C-29:
5′-TCGTCG-3′-HEG-5′-ACGTTCG-3′-HEG-5′-AGATGAT-3′-TEG
C-29分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在PerseptiveBiosystems Expedite8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯DNA的厂商操作程序进行合成。作为固相载体用于合成的三聚乙二醇-可控多孔玻璃来自Glen Research(Sterling,VA)。将核苷单体和间隔体结构部分前体4,4′-O-二甲氧基三苯甲基-六聚乙二醇-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自Glen Research,Sterling,VA)溶解于无水乙腈,终浓度0.05M。将HEG间隔体置于仪器的辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺序加入核苷单体和HEG间隔体并使核酸结构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用三聚乙二醇固相载体
2.合成5′-AGATGAT-3′结构部分
3.添加HEG间隔体
4.合成5′-ACGTTCG-3′结构部分
5.添加HEG间隔体
6.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
合成、脱保护、后处理、以及分析都按照实施例2中所述来进行。
实施例9:合成具有线性结构和六聚乙二醇及三聚乙二醇间隔体的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-30。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的DNA,间隔体结构部分和5′-末端基团是经硫代磷酸酯键连接到核酸结构部分的六聚乙二醇(HEG),而3′-末端基团是经硫代磷酸酯键连接到核酸结构部分的三聚乙二醇(TEG)。
C-30:
HEG-5′-TCGTCG-3′-HEG-5′-ACGTTCG-3′HEG-5′-AGATGAT-3′-TEG
C-30分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在PerseptiveBiosystems Expedite8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯DNA的厂商操作程序进行合成。作为固相载体用于合成的三聚乙二醇-可控多孔玻璃来自Glen Research(Sterling,VA)。将核苷单体和间隔体结构部分前体4,4′-O-二甲氧基三苯甲基-六聚乙二醇-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自Glen Research,Sterling,VA)溶解于无水乙腈,终浓度0.05M。将HEG间隔体前体置于仪器的辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体和HEG间隔体并使核酸结构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用三聚乙二醇固相载体
2.合成5′-AGATGAT-3′结构部分
3.添加HEG间隔体
4.合成5′-ACGTTCG-3′结构部分
5.添加HEG间隔体
6.合成S′-TCGTCG-3′结构部分
7.添加HEG间隔体
合成、脱保护、后处理、以及分析都按照实施例2中所述来进行。
实施例10:合成具有线性结构和六聚乙二醇及三聚乙二醇间隔体并具有磷酸二酯键的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-31。核酸结构部分是具有磷酸二酯键的DNA,间隔体结构部分和5′-末端基团是经磷酸二酯键连接到核酸结构部分的六聚乙二醇(HEG),而3′-末端基团是经磷酸二酯键连接到核酸结构部分的三聚乙二醇(TEG)。
C-31:
HEG-5′-TCGTCG-3′-HEG-5′-ACGTTCG-3′-HEG-5′-AGATGAT-3′-TEG
C-31分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在PerseptiveBiosystems Expedite8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol磷酸二酯DNA的厂商操作程序进行合成。作为固相载体用于合成的三聚乙二醇-可控多孔玻璃来自Glen Research(Sterling,VA)。将核苷单体和间隔体结构部分前体4,4′-O-二甲氧基三苯甲基-六聚乙二醇-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自Glen Research,Sterling,VA)溶解于无水乙腈,终浓度0.05M。将HEG间隔体置于仪器的辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体和HEG间隔体并使核酸结构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用三聚乙二醇固相载体
2.合成5′-AGATGAT-3′结构部分
3.添加HEG间隔体
4.合成5′-ACGTTCG-3′结构部分
5.添加HEG间隔体
6.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
7.添加HEG间隔体
此合成循环由脱三苯甲基步骤、偶联步骤(亚磷酰胺单体加1H-四唑)、加帽步骤、氧化步骤和最后的加帽步骤组成。完成组装后,将脱掉三苯甲基的化合物从可控多孔玻璃上切离下来并用浓氨水58℃反应16小时对碱基脱保护。此化合物利用制备性聚丙烯酰胺电泳进行纯化,在Sep-pak Plus萃取柱(Waters,Milford,MA)上脱盐,再用25体积的95%乙醇从1M氯化钠水溶液中沉淀出来。将此化合物溶于Milli Q水中,从260nm下的吸光度确定其产量。最后,将此化合物冻干形成粉末。通过毛细管凝胶电泳、电喷射质谱分析法、和RP-HPLC对此化合物进行表征以确证其组成和纯度。此外,还进行内毒素含量测试试验(LAL试验,Bio Whittaker),结果显示内毒素水平<5 EU/mg化合物。
实施例11:合成具有线性结构和2-(羟甲基)乙基间隔体的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-25。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的DNA,而间隔体结构部分是2-(羟甲基)乙基(HME),后者经硫代磷酸酯键连接到核酸结构部分。
C-25:
5′-TCGTCG-3′-HME-5′-ACGTTCG-3′-HME-5′-AGATGAT-3′
C-25分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在PerseptiveBiosystems Expedite8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯DNA时的厂商操作程序进行合成。将核苷单体和间隔体结构部分前体1-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-3-O-乙酰丙酰基-丙三醇-2-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自ChemGenes,Ashland,MA)溶解于无水乙腈,终浓度0.05M。将HME间隔体置于仪器的辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体和HME间隔体并使核酸结构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“T”固相载体
2.合成5′-AGATGA-3′结构部分
3.添加HME间隔体
4.合成5′-ACGTTCG-3′结构部分
5.添加HME间隔体
6.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
合成、脱保护、后处理、以及分析都按照实施例2中所述来进行。在用氨进行处理的过程中乙酰丙酰基基团被除去。
实施例12:合成具有线性结构和带负电荷的间隔体结构部分的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-13。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的DNA,而间隔体结构部分是经硫代磷酸酯键连接的丙基(C3)聚合物。
C-13:5′-TCGTCG-3′-(C3)15-5′-T-3′
C-13分子在Perseptive Biosystems Expedite8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯DNA时的厂商操作程序进行合成。将核苷单体和间隔体结构部分前体4,4′-O-二甲氧基三苯甲基-丙基-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自Glen Research,Sterling,VA)溶解于无水乙腈,终浓度0.1M。将C3间隔体置于仪器的辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体和C3间隔体并使核酸结构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“T”固相载体
2.添加15个C3间隔体
3.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
此合成循环由脱三苯甲基步骤、偶联步骤(亚磷酰胺单体加1H-四唑)、加帽步骤、在9:1乙腈:吡啶中用0.02M 3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(ADTT)进行的硫化步骤和最后的加帽步骤组成。组装完成后,将带有三苯甲基的化合物从可控多孔玻璃上切离下来并用浓氨水58℃反应16小时对碱基脱保护。此化合物利用0.1M醋酸三乙基铵中的逐渐增加的乙腈梯度在Hamilton PRP-1柱上通过HPLC进行纯化。将纯化的化合物浓缩至干燥,用80%醋酸水溶液处理去除4,4’-二甲氧基三苯甲基基团,然后用2.5体积95%乙醇从1M氯化钠水溶液中将此化合物沉淀两次。将此化合物溶于Milli Q水中,从260nm下的吸光度确定其产量。最后,将此化合物冻干形成粉末。
通过毛细管凝胶电泳、电喷射质谱分析法、和RP-HPLC对此化合物进行表征以确证其组成和纯度。此外,还进行内毒素含量测试试验(LAL试验,Bio Whittaker),结果显示内毒素水平<5EU/mg化合物。
C-14,C-15和C-16类似地合成。
实施例13:合成具有线性结构和带负电荷的间隔体结构部分的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-38。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的DNA,而间隔体结构部分是经硫代磷酸酯键连接的六聚乙二醇(HEG)。
C-38:5′-TCGTCGA-3′-(HEG)4-5′-TCGTCGA-3′
C-38分子按照实施例2中所述进行合成。间隔体结构部分前体是4,4′-O-二甲氧基三苯甲基-六聚乙二醇-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自Glen Research,Sterling,VA)。合成通过实施下列步骤来完成:
1.利用3′-结合载体的“A”固相载体
2.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
3.添加4个HEG间隔体
4.合成5′-TCGTCGA-3′结构部分
利用如实施例12中所述的HPLC对此化合物进行纯化。按照实施例2中所述对此化合物进行表征及内毒素含量测定。
实施例14:合成具有线性结构和通过3’-末端连接两个核酸结构部分的带负电荷间隔体结构部分的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-37。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的DNA,而间隔体结构部分是经硫代磷酸酯键连接的六聚乙二醇(HEG)。
C-37:5′-TCGTCGA-3′-(HEG)-3′-AGCTGCT-5′
C-37分子按照实施例2中所述进行合成,但合成中利用了5′-结合载体的核苷和3′-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-保护的核苷-5′-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(Glen Research,Sterling,VA)来合成第一个核酸结构部分。间隔体结构部分前体是4,4′-O-二甲氧基三苯甲基-六聚乙二醇-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自Gleh Research,Sterling,VA)。合成通过实施下列步骤来完成:
1.利用5′-结合载体的“T”固相载体
2.用3′-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-保护的核苷-5′-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺合成3′-AGCTGC-5′结构部分(5′至3′合成)
3.添加4个HEG间隔体
4.用5′-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-保护的核苷-3′-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺合成5′-TCGTCGA-3′结构部分(3′至5′合成)
利用如实施例12中所述的HPLC对此化合物进行纯化。按照实施例2中所述对此化合物进行表征及内毒素含量测定。
实施例15:合成具有分支结构的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-27。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的DNA,而间隔体结构部分是丙三醇,后者经硫代磷酸酯键连接到核酸结构部分。
C-27:(5′-TCGTCGA-3′)2-丙三醇-5′-AACGTTC-3′
C-27分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在PerseptiveBiosystems Expedite8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯DNA时的厂商操作程序进行合成。将核苷单体和间隔体结构部分前体1,3-二-(4,4′-O-二甲氧基三苯甲基)-丙三醇-2-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自ChemGenes,Ashland,MA的对称分支亚磷酰胺,图2)溶解于无水乙腈,终浓度0.05M。将丙三醇间隔体置于仪器上的辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体和丙三醇间隔体并使核酸结构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“C”固相载体
2.合成5′-AACGTT-3′结构部分
3.添加基于丙三醇的对称分支亚磷酰胺
4.同时合成两个5′-TCGTCGA-3′结构部分
此分支化合物的制备按照与实施例2中所述同样的程序进行,除了在步骤4中由于同时构建两个核酸链所以合成循环中每种试剂的递送量加倍。如图2所示的对称分支亚磷酰胺要求在加入该对称分支亚磷酰胺之后合成的核酸序列必须是相同的,但在它加入之前合成的核酸序列与稍后合成的序列可以是相同或不同的。
按照实施例2中所述对分支化合物进行纯化和表征。
C-28类似合成。
实施例16:合成具有分支结构且全部核酸结构部分通过3′-末端连接的嵌合化合物。
合成具有如下所示结构的C-95。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的DNA,而间隔体结构部分是丙三醇和HEG,它们经硫代磷酸酯键连接到核酸结构部分。
C-95:(5′-TCGTCGA-3′-HEG)2-丙三醇-HEG-3′-AGCTGCT-5′
C-95分子按照实施例2中所述进行合成,但第一个核酸结构部分利用5′-结合载体的核苷和3′-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-保护的核苷-5′-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(Glen Research,Sterling,VA)合成。分支间隔体结构部分的前体是1,3-二-(4,4′-O-二甲氧基三苯甲基)-丙三醇-2-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自Chem Genes,Ashland,MA的对称分支亚磷酰胺,图2)。合成通过实施下列步骤来完成:
1.利用5′-结合载体的“T”固相载体
2.用3′-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-保护的核苷-5′-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺合成3′-AGCTGC-5′结构部分(5′至3′合成)
3.添加HEG间隔体
4.添加基于丙三醇的对称分支亚磷酰胺
5.同时添加两个HEG间隔体
6.用5′-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-保护的核苷-3′-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺同时合成两个5′-TCGTCGA-3′结构部分(3′至5′合成)
此分支化合物的制备按照与实施例2中所述同样的程序进行,除了在步骤5和6中由于同时构建两个核酸链所以输入合成循环中的每种试剂是双倍量。如图2所示的对称分支亚磷酰胺要求在该对称分支亚磷酰胺加入之后合成的核酸序列必须是相同的,但在它加入之前合成的核酸序列与稍后合成的序列可以是相同或不同的。
利用如实施例12中所述的HPLC对此化合物进行纯化。按照实施例2中所述对此化合物进行表征及内毒素含量测定。
实施例17:合成具有分支结构且含有三个不同核酸结构部分的嵌合化合物。
合成具有如下所示结构的C-35。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的DNA,而间隔体结构部分是经硫代磷酸酯键连接到核酸结构部分的丙三醇。
C-35分子按照实施例2中所述进行合成。将核苷单体和间隔体结构部分前体1-(4,4′-O-二甲氧基三苯甲基)-3-O-乙酰丙酰基-丙三醇-2-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自ChemGenes,Ashland,MA的不对称分支亚磷酰胺,图2)溶解于无水乙腈,终浓度0.05M。将丙三醇间隔体置于仪器上辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体和丙三醇间隔体并使核酸结构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“T”固相载体
2.合成5′-AGATGA-3′结构部分
3.添加基于丙三醇的不对称分支亚磷酰胺
4.在二甲氧基三苯甲基端合成5′-AACGTTC-3′结构部分
5.脱三苯甲基并对AACGTTC结构部分加帽。
6.除去乙酰丙酰基保护基团
7.合成5′-TCGTCGA-3′结构部分
合成基本上按照实施例2中所述进行,但是在步骤4之后,使5′-AACGTTC-3′结构部分脱三苯甲基并用乙酸酐/N-甲基咪唑进行加帽以将此核酸结构部分封端。下一步,在3∶2吡啶∶乙酸/pH5.1中用0.5M水合肼处理5分钟除去乙酰丙酰基保护基团。含化合物的固相载体用无水乙腈充分洗涤,并利用实施例2中所述的方案添加5′-TCGTCGA-3′结构部分。
按照实施例2中所述对此分支化合物进行纯化和表征。
实施例18:通过缀合策略合成分支结构的嵌合化合物。
如图3所示合成C-36。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的DNA,间隔体结构部分基于STARBURST_树状体。合成带有5′-C6-二硫化物间隔体(巯基修饰剂C6 S-S,Glen Research,Sterling,VA产品编号10-1926-xx)的核酸结构部分,此二硫化物间隔体一经还原可提供能够与树状体上的顺丁烯二酰亚胺基团反应的巯基。
5 ′-C6-二硫化物-TCGTCGA(4)的合成:
5′-C6-二硫化物-TCGTCGA可以使用Perseptive Biosystems Expedite8909自动DNA合成仪并利用合成1μmol硫代磷酸酯DNA的厂商操作程序进行合成。将核苷单体和巯基修饰剂C6 S-S(Glen Research,Sterling,VA)溶解于无水乙腈,终浓度0.1M。将巯基修饰剂置于仪器的辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体和巯基修饰剂并使核酸结构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“A”固相载体
2.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
3.添加巯基修饰剂前体(S-三苯甲基-6-巯基己基-(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)亚磷酰胺)。
此合成循环由脱三苯甲基步骤、偶联步骤(亚磷酰胺单体加1H-四唑)、加帽步骤、在9∶1乙腈∶吡啶中用0.02M 3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(ADTT)进行的硫化步骤和最后的加帽步骤组成。组装完成,将带有三苯甲基的化合物从可控多孔玻璃上切离下来并用浓氨水58℃反应16小时对碱基脱保护。此化合物利用0.1M醋酸三乙基铵中的乙腈的递增梯度在Hamilton PRP-1柱上通过HPLC进行纯化。将纯化的化合物浓缩至干燥,用80%醋酸水溶液处理去除4,4’-二甲氧基三苯甲基基团,然后以2.5体积95%乙醇从1M氯化钠水溶液中将此化合物沉淀两次。将此化合物溶于Milli Q水中,从260nm下的吸光度确定其产量。最后,将此化合物冻干形成粉末。
通过毛细管凝胶电泳、电喷射质谱分析法、和RP-HPLC对此化合物进行表征以确证其组成和纯度。此外,还进行内毒素含量测试试验(LAI试验,Bio Whittaker),结果显示内毒素水平<5EU/mg化合物。
5 ′-巯基-C6-TCGTCGA(5)的合成:
利用三(2-羧乙基膦)盐酸盐(TCEP;Pierce,Rockford,IL)将二硫化物修饰的核酸(4)还原成硫醇。使核酸以20mg/ml的浓度溶解于含有0.1M磷酸钠/0.15M氯化钠/pH7.5的缓冲液中。在另一小瓶中,使TCEP以0.17M的浓度溶解于0.1M磷酸钠/0.15M氯化钠/pH7.5中。将5当量TCEP加入核酸中并轻轻混合。此溶液在40℃孵育120分钟,然后通过分子大小排阻层析(Pharmacia P2柱)进行纯化产生5′-巯基-C6-TCGTCGA(5)。
顺丁烯二酰亚胺修饰的STARBURST_树状体(7)的合成:
具有不同数目(4,8,16,32,64等)胺的STARBURST_树状体可从Aldrich(Milwaukee,WI)获得。将具有四个氨基基团的STARBURST_树状体(6)以0.2M的浓度溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中。然后加入三乙基胺(10当量)和4-(N-顺丁烯二酰亚氨基甲基)-环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺基酯(磺基-SMCC;Pierce,Rockford,IL,8当量)并对溶液进行搅拌2小时或直到反应完成,这一点可利用薄层层析(TLC;10%甲醇/二氯甲烷)来确定。反应用水淬灭30分钟之后在真空状态下除去DMF。将剩余物溶解于二氯甲烷,用饱和重碳酸钠水溶液洗涤两次再用水进行洗涤。使有机相经过MgSO4干燥、过滤、并在真空状态下浓缩至干。产物经硅胶层析纯化产生出
7。
STARBURST_树状体-(5′-TCGTCGA-3′)4(8)的合成:
将顺丁烯二酰亚胺修饰的STARBURST_树状体(6)溶解于DMSO(5mg/ml)并向此溶液中滴加以10mg/ml浓度溶于0.1M磷酸钠/0.15M氯化钠/pH7.5中的纯化5′-C6-巯基-TCGTCGA(5)(10当量)。所得混合物在40℃下搅拌过夜。通过分子大小排阻层析(Sephadex G-25)纯化缀合物产生出化合物
8。
实施例19:合成具有分支结构的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-94。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的DNA,而间隔体结构部分是经硫代磷酸酯键连接到核酸结构部分的丙三醇。
C-94:(5′-TCGTCGA-3′-HEG)2-丙三醇-HEG-5′-TCGTCGA-3′
C-94分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在PerseptiveBiosystems Expedite8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯DNA的厂商操作程序进行合成。将核苷单体和间隔体结构部分前体[1,3-二-(4,4′-O-二甲氧基三苯甲基)-丙三醇-2-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自ChemGenes,Ashland,MA的对称分支亚磷酰胺,图2)和4,4′-O-二甲氧基三苯甲基-六聚乙二醇-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自Glen Research,Sterling,VA)]溶解于无水乙腈,终浓度0.05M。将丙三醇和HEG间隔体置于仪器上辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体、HEG间隔体和丙三醇间隔体并使核酸结构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“A”固相载体
2.合成5′-TCGTCGA-3′结构部分
3.添加HEG间隔体
4.添加基于丙三醇的对称分支亚磷酰胺
5.同时添加两个HEG间隔体
6.同时合成两个5′-TCGTCGA-3′结构部分
此分支化合物的制备按照与实施例2中所述同样的方案进行,除了在步骤5和6中由于同时构建两个核酸链所以输入合成循环中的每种试剂是双倍量。如图2所示的对称分支亚磷酰胺要求在加入该对称分支亚磷酰胺之后合成的核酸序列必须是相同的,但在它加入之前合成的核酸序列与稍后合成的序列可以是相同或不同的。
此分支化合物通过实施例12中所述HPLC进行纯化并按照实施例2中所述进行表征。
C-96和C-101类似地进行合成。
C-103和C-104也通过相同方法合成,但其中分别利用三聚乙二醇或丙基间隔体代替六聚乙二醇间隔体。
实施例20:合成具有分支结构的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-98。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的DNA,而间隔体结构部分是经硫代磷酸酯键连接到核酸结构部分的丙三醇。
C-98:(5′-TCGTCGA-3′-HEG)3-三倍增体-HEG-5′AACGTTC-3′-H EG-5′-TCGA-3′
C-98分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在PerseptiveBiosystems Expedite8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯DNA的厂商操作方案进行合成。将核苷单体和间隔体结构部分[三倍增体亚磷酰胺(来自Glen Research,Sterling,VA)和4,4′-O-二甲氧基三苯甲基-六聚乙二醇-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自Glen Research,Sterling,VA)]溶解于无水乙腈,终浓度0.05M。将三倍增体和HEG间隔体置于仪器的辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体、HEG间隔体和三倍增体间隔体并使核酸结构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“A”固相载体
2.合成5′-TCGA-3′结构部分
3.添加HEG间隔体
4.合成5′-AACGTTC-3′结构部分
5.添加HEG间隔体
6.添加三倍增体亚磷酰胺(参见图2)
7.同时添加三个HEG间隔体
8.同时合成三个5′-TCGTCGA-3′结构部分
此分支化合物的制备按照与实施例2中所述同样的方案进行,但是在步骤7和8中由于同时构建3个核酸链所以输入合成循环中的每种试剂是三倍的量。如图2所示的对称三倍增体亚磷酰胺要求在加入该对称三倍增体亚磷酰胺之后合成的核酸序列必须是相同的,但在它加入之前合成的核酸序列与稍后合成序列可以是相同或不同的。
此分支化合物通过实施例12中所述HPLC进行纯化并按照实施例2中所述进行表征。
实施例21:合成具有六聚乙二醇间隔体和3′-巯基接头的线性嵌合化合物
首先合成含3′-巯基接头的CIC并以其二硫化物衍生物的形式进行纯化。然后还原二硫基产生出反应性巯基基团。举例来说,为合成C-116,首先按照实施例2所述合成C-8,但此合成中以3′-巯基修饰剂C3S-SCPG(Glen Research,Sterling,VA)代替“T”固相载体作为固相载体。
C-116:5′-TCGTCGA-3′-HEG-5′-ACGTTCG-3′-HEG-5′-AGATGAT-3′-(CH2)3SS(CH2)3OH
应明了,C-116可表示为[C-8]-3′-二硫化物。此CIC通过如实施12中所述的HPLC进行纯化。此化合物按照实施例2所述进行表征。
利用三(2-羧基乙基膦)盐酸盐(TCEP;Pierce,Rockford,IL)将C-116还原成硫醇。使C-116以30.5mg/ml的浓度(0.8ml,24.4mg;3.14umol)溶解于100mM磷酸钠/150mM氯化钠/1mM EDTA/pH7.4缓冲液中。在另一瓶中,使TCEP以0.167M的浓度溶解于100mM磷酸钠/150mM氯化钠/1mM EDTA/pH7.4缓冲液中。将5当量(100ul,4.8mg,17umol)的TCEP储液加入到CIC溶液中。轻轻混合此溶液,在40℃孵育120分钟,并在Sephadex G-25柱(5ml,Amersham Pharmacia,Piscataway,NJ)上纯化产生出C-117(13.2mg)。应明了,C-117可表示为[C-8]-3′-巯基。此CIC通过如实施12中所述的HPLC进行纯化。
C-115类似地从C-114合成出来。
实施例22:合成具有丙基间隔体和5′-巯基接头的线性嵌合化合物
首先合成含5′-巯基接头的CIC并以其二硫化物衍生物的形式进行纯化。然后还原二硫基产生出反应性巯基基团。化合物C-110(如下)可表示为5′-二硫化物-C-11。化合物C-111可表示为5′-巯基-C-11.
C-110:HO(CH2)6SS(CH2)6-5′-TCGTCG-3′-C3-5′-ACGTTCG-3′-C3-5′-AGATGAT-3′
C-110按照实施例3中所述进行合成,但合成中利用巯基修饰剂C6S-S(Glen Research,Sterling,VA)进行最后的偶联。此CIC通过实施例12中所述的HPLC进行纯化。按照实施例2中所述对此化合物进行表征。按照实施例22中所述利用三(2-羧基乙基膦)盐酸盐(TCEP;Pierce,Rockford,IL)将C-110还原成硫醇。
C-107,C-113和P-16类似地进行合成。
实施例23:通过缀合策略合成分支结构的嵌合化合物。
C-105按照图4所示进行合成。三(2-顺丁烯二酰亚氨基乙基)胺(TMEA,Pierce,Rockford,IL)以浓度4.3mg/ml溶解于二甲基甲酰胺(DMF)。将TMEA溶液(12ul,52ug,1.0当量)添加到溶于100mM磷酸钠/150mM氯化钠/1mM EDTA/pH7.4缓冲液中的C-117溶液(237ul,4.0mg,4.0当量)中并充分混合。此溶液在室温下放置过夜之后在Superdex200柱(24ml, Amersham Pharmacia,Piscataway,NJ)上在10mM磷酸钠/141mM氯化钠/pH7.0缓冲液中进行纯化。产品经真空干燥,溶于0.4ml的Milli Q水中,并用1.0ml的95%乙醇进行沉淀。在-20℃冷冻1小时后,混合物离心(14KRPM下2分钟),小心去除上清液。将沉淀溶于0.35ml的Milli Q水并测定C105的浓度(分离出0.4mg)。按照实施例2中所述对此化合物进行分析。
C-99类似地进行合成。
实施例24:通过缀合策略合成分支结构的嵌合化合物。
A.顺丁烯二酰亚氨基-STARBURST树状体_2代的合成
含有16个羟基基团的STARBURST树状体_2代以20%甲醇溶液的形式购自Aldrich(Milwaukee,WI)。树状体(191ul,38.2mg,11.7umol)经真空干燥,重新溶于200ul的DMF中并再次经过真空干燥以除去最后的微量甲醇。为制备顺丁烯二酰亚氨基-树状体,在单独的玻璃瓶中将N-(对顺丁烯二酰亚氨基苯基)异氰酸酯(PMPI,50mg,233.5umol)溶于200ul的DMF,然后快速将其添加到树状体中。涡旋混合物直到树状体被溶解。将溶液置于旋转式混合仪上室温下过夜。溶液经真空浓缩,溶于20%甲醇/二氯甲烷(1ml),并在7.5g硅胶柱(70-230目,60A)上在20%甲醇/二氯甲烷中进行纯化。顺丁烯二酰亚氨基-树状体产物在第一个级分(由于存在残余的DMF)中从柱上洗脱下来并且不含PMPI副产物。此产物经浓缩变成棕褐色固体(10mg,13%产率)。
B.STARBURST树状体_-(5′-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA)X=3-16(SEQ ID NO:2)(C-102)的合成
顺丁烯二酰亚氨基-树状体(5.7mg)溶于二甲基亚砜(DMSO)形成浓度2.5mg/ml的储液。将顺丁烯二酰亚氨基-树状体储液(100ul,0.25mg,0.0375umol)加入到溶于100mM磷酸钠/150mM氯化钠/lmMEDTA/pH7.4缓冲液的C-107(9.1mg,1.2umol)的溶液(0.7ml)中。将溶液置于旋转混合仪上室温下过夜,产物在Superdex200柱(24ml,AmershamPharmacia,Piscataway,NJ)上在10mM磷酸钠/141mM氯化钠/pH7.0缓冲液中进行纯化。产物在10.4分钟在空隙体积中洗脱(1.3mg)。经在1.2%琼脂糖E-凝胶(Invitrogen,Carlsbad,CA)上的分析发现此化合物是多种高分子量物质的混合物,其代表着树状体上多核苷酸的不同载荷量。C-102跑电泳呈现为1kb至大于15kb(与双链DNA标记分子比较的有效大小)的产物的混合物。
实施例25:合成具有丙基间隔体和混合的磷酸二酯键/硫代磷酸酯键的线性嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-84。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键(以小写字母“s”表示)或磷酸二酯键(所有其他的键)的DNA,间隔体结构部分是经磷酸二酯键连接到核酸结构部分的丙基(C3)。
C-84:5′-GsGs-3′-C3-5′-TGC-3′-C3-5′-ATCGAT-3′-C3-5′-GCA-3′-C3-5′-GGsGsGsGsG-3′(其中小写字母″s″表示硫代磷酸酯键而其他键是磷酸二酯键)
C-84分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在PerseptiveBiosystems Expedite8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯DNA的厂商方案进行合成。利用大写字母为碱基安排硫代磷酸酯键程序,利用小写字母为碱基安排磷酸二酯键程序,辅助位置含有丙基间隔体亚磷酰胺。
将核苷单体和间隔体结构部分前体4,4′-O-二甲氧基三苯甲基-丙基-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自Glen Research,Sterling,VA)溶解于无水乙腈,终浓度0.05M。将C3间隔体置于仪器上辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体和C3间隔体并使核酸结构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“G”固相载体
2.合成5′-GGsGsGsGsG-3 ′
3.添加C3间隔体
4.合成5′-GCA-3′
5.添加C3间隔体
6.合成5′-ATCGAT-3′
7.添加C3间隔体
8.合成5′-TGC-3′
9.添加C3间隔体
10.合成5′-GsGs-3′
合成、脱保护、后处理、以及分析都按照实施例2中所述来进行。
C-85和C-87类似地进行合成。
实施例26:合成含有少于8个核苷酸的寡核苷酸
在Perseptive Biosystems Expedite8909自动DNA合成仪上合成含有少于8个碱基的并且含有硫代磷酸酯键的多核苷酸。此多核苷酸利用0.1M乙酸三乙基铵中的乙腈递增梯度在Polymer Labs PLRP-S柱上通过RP-HPLC进行纯化。纯化的多核苷酸浓缩至干燥,用80%醋酸水溶液处理去除4,4’-二甲氧基三苯甲基基团,然后用3体积异丙醇从0.6M乙酸钠水溶液/pH5.0中将此化合物沉淀两次。将此多核苷酸溶于MilliQ水中,从260nm下的吸光度确定其产量。最后,将多核苷酸冻干成粉末。按照实施例2中所述对此多核苷酸进行表征,并测定内毒素含量。
实施例27:制备可生物降解的阳离子微载体
如下制备阳离子聚(乳酸,羟基乙酸)微载体(cPLGA)。将本身粘度为0.41dl/g(0.1%,氯仿,25℃)的0.875g聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)50∶50聚合物(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)以10%w/w的浓度与0.3gDOTAP一起溶解于7.875g二氯甲烷中。然后将澄清的有机相在500mlPVA水溶液(0.35%w/v)中用实验室混合器(Silverson L4R,SilversonInstruments)室温下以4000转/分钟均化30分钟而乳化。然后用通过混合器套管的循环热水升高系统温度至40℃。同时,将搅拌速率降低至1500转/分钟,并维持这些条件2小时以萃取和蒸发二氯甲烷。用循环冷水将微球体悬液冷却至室温。
室温下8000转/分钟离心(Beckman Instruments)10分钟分离微载体并通过温和的浴内超声处理将其重悬于去离子水中。该离心洗涤再重复两次,以从粒子表面去除过量的PVA。将粒子的最终离心沉淀悬于约10ml水中,并过夜冷冻干燥。鉴定干燥阳离子微载体粉末的大小和表面电荷:平均大小(所称重的数目,μ)=1.4;ζ电位(mV)=32.4。
实施例28:CIC对人类细胞的免疫调制
试验的进行旨在评定(1)含有间隔体结构部分的嵌合分子和(2)多核苷酸的免疫调制活性。
嵌合化合物和多核苷酸按照上述方法或通过常规硫代磷酸酯化学进行合成。多核苷酸P-6和P-7由Hybridon Specialty Products(Milford MA)合成。免疫调制活性通过此处所述的常规试验来测定。
用肝素化注射器通过静脉穿刺从自愿者收集外周血。将血液置于FICOLL_(Amersham Pharmacia Biotech)垫层上并离心。收集位于FICOLL_分界处的PBMC,然后用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗两次。在48孔板(实施例29-32)或96-孔板(实施例33-40)中以2×106个细胞/mL在含10%热灭活的人AB血清加上50单位/mL青霉素、50μg/mL链霉素、300μg/mL谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1×MEM非必需氨基酸(NEAA)的RPMI1640中重悬细胞并于37℃培养。
细胞在不存在测试样本时、在存在20μg/ml(0.5OD/ml)测试样本时或在存在与100μg/ml cPLGA(如果利用)预混合的20μg/ml测试样本时培养24小时。然后从每孔收集无细胞培养基并检测IFN-γ和IFN-α浓度。SAC(Pansorbin CalBiochem,1/5000稀释物)用作阳性对照。SAC内容物是金黄色葡萄球菌(Staph.aureus)(cowan)细胞物质。
利用BioSource International,Inc.的CYTOSCREENTM ELISA试剂盒,按照厂商操作说明书对IFN-γ和IFN-α进行检测。
在人PBMC试验中,IFN-γ的背景水平可随着供体的不同而不同,甚至是明显不同。IFN-α的水平在非刺激条件下一般显示出低的背景水平。
在下面的实施例29-40中给出了此类试验的结果。
在每个所示实验中,“只有培养基”和″P-7″是阴性对照。″P-7″以前已被证实不具有免疫调制活性。SAC和″P-6″是阳性对照。“P-6″以前已被证明具有明显的免疫调制活性。
实施例29:CIC的免疫调制活性
本实施例表明四种不同的CIC具有显著的免疫调制活性,这由对IFN-γ和IFN-α分泌的刺激作用而证实(表3)。正如所意料,P-7不具有活性。此外,P-1,一种含有TCG的7聚体,不具有活性。有趣地是,具有HEG和丙基间隔体结构部分的CIC显示出不同程度的对IFN-α分泌的刺激作用。虽然两种类型的CIC都刺激IFN-α分泌,但含HEG的CIC的效果更显著。
表3
IFN-γ(pg/ml) | IFN-α(pg/ml) | |||||
测试化合物 | 供体1 | 供体2 | 平均值 | 供体1 | 供体2 | 平均值 |
只有培养基 | 8 | 0 | 4 | 0 | 0 | 0 |
P-7 | 410 | 51 | 231 | 0 | 0 | 0 |
SAC | 2040 | 1136 | 1588 | 393 | 43 | 218 |
P-6 | 2180 | 669 | 1425 | 401 | 39 | 220 |
P-1 | 8 | 0 | 4 | 0 | 0 | 0 |
C-8 | 1916 | 696 | 1306 | 1609 | 44 | 827 |
C-9 | 2157 | 171 | 1164 | 142 | 0 | 71 |
C-10 | 1595 | 952 | 1273 | 1662 | 50 | 856 |
C-11 | 2308 | 270 | 1289 | 119 | 0 | 59 |
实施例30:多核苷酸的活性
本实施例表明多核苷酸P-1,P-2,P-3,P-4和P-5不具有免疫调制活性(表4)。这些多核苷酸具有C-10和C-11的核酸结构部分的序列,如在实施例29中所示C-10和C-11具有免疫调制活性。
表4
IFN-γ(pg/ml) | IFN-α(pg/ml) | |||||
测试化合物 | 供体3 | 供体4 | 平均值 | 供体3 | 供体4 | 平均值 |
只有培养基 | 0 | 3 | 2 | 0 | 18 | 9 |
P-7 | 3 | 8 | 5 | 0 | 31 | 15 |
SAC | 1179 | 2000 | 1589 | 50 | 969 | 510 |
P-6 | 99 | 223 | 161 | 28 | 106 | 67 |
P-1 | 1 | 4 | 2 | 0 | 32 | 16 |
P-3 | 1 | 3 | 2 | 0 | 32 | 16 |
P4 | 0 | 3 | 1 | 0 | 58 | 29 |
P-5 | 0 | 3 | 2 | 0 | 57 | 29 |
P-2 | 0 | 4 | 2 | 0 | 40 | 20 |
实施例31:多核苷酸混合物的活性
本实施例表明多核苷酸P-1和P-3的混合物及P-1、P-3、P-4和P-5的混合物不具有免疫调制活性(表5)。这些多核苷酸具有C-10和C-11的核酸结构部分的序列,而该C-10和C-11具有免疫调制活性。所述混合物包含等量的每种多核苷酸,总浓度为20μg总多核苷酸/ml。
表5
测试化合物 | IFN-γ(pg/ml) | IFN-α(pg/ml) | ||||
只有培养基 | 供体5 | 供体6 | 平均值 | 供体5 | 供体6 | 平均值 |
3 | 52 | 28 | 20 | 20 | 20 | |
P-7 | 7 | 66 | 37 | 20 | 94 | 57 |
SAC | 903 | 284 | 593 | 458 | 8215 | 4337 |
P-6 | 73 | 1170 | 621 | 54 | 482 | 268 |
(P-1)+(P-3) | 3 | 36 | 19 | 20 | 40 | 30 |
(p-1)+(P-3)+(P-4)+(P-5) | 1 | 99 | 50 | 70 | 65 | 68 |
C-10 | 102 | 806 | 454 | 91 | 1700 | 896 |
C-11 | 25 | 792 | 409 | 76 | 175 | 126 |
实施例32:CIC的免疫调制活性
本实施例在利用与实施例29和31不同的供体的试验中表明C-10和C-11的免疫调制活性(表6)。
表6
IFN-γ(pg/ml) | IFN-α(pg/ml) | |||||
测试化合物 | 供体7 | 供体8 | 平均值 | 供体7 | 供体8 | 平均值 |
只有培养基 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 |
P-7 | 2 | 2 | 2 | 0 | 0 | 0 |
SAC | 594 | 1100 | 847 | 22 | 303 | 163 |
P-6 | 15 | 367 | 191 | 4 | 59 | 32 |
C-10 | 23 | 198 | 111 | 46 | 539 | 293 |
C-11 | 5 | 419 | 212 | 6 | 56 | 31 |
实施例33:CIC的免疫调制活性
本实施例在利用与实施例29不同的供体的试验中表明C-8和C-9的免疫调制活性(表7)。P-2,一种含TCG的6聚体,不具有活性。
表7
IFN-γ | IFN-α | |||||||||
供体9 | 供体10 | 供体11 | 供体12 | 平均值 | 供体9 | 供体10 | 供体11 | 供体12 | 平均值 | |
只有培养基 | 17 | 1 | 1 | 10 | 7 | 4 | 2 | 2 | 15 | 6 |
P-7 | 5 | 2 | 3 | 2 | 3 | 0 | 3 | 1 | 5 | 2 |
SAC | 380 | 688 | 159 | 73 | 325 | 2246 | 364 | 1129 | 1029 | 1192 |
P-6 | 66 | 20 | 72 | 23 | 45 | 12 | 28 | 12 | 12 | 16 |
P-2 | 2 | 3 | 1 | 2 | 2 | 0 | 2 | 1 | 4 | 2 |
C-8 | 312 | 35 | 31 | 28 | 102 | 58 | 30 | 18 | 49 | 39 |
C-9 | 134 | 7 | 56 | 30 | 56 | 8 | 10 | 1 | 15 | 8 |
实施例34:CIC的免疫调制活性
表8中所示试验证明本发明几种CIC,即以各种不同短核酸结构部分和各种不同间隔体结构部分为特征的CIC的免疫调制活性。表8还表明化合物M-1,即具有混合的HEG/核酸结构但缺少任何5′-C,G-3′序列(参见表2)的化合物,以及某些其他化合物(C-19)未显示活性。具有cPLGA的CIC制剂显著增强了对IFN-α的诱导。在一些情况下,IFN-γ水平也提高了。
数字″28---″表示各个供体。
表8
刺激物 | 浓度ug/ml | IFN-γ(pg/ml) | IFN-α(pg/ml) | |||||||||
28065 | 28066 | 28067 | 28068 | 平均值 | 28065 | 28066 | 28067 | 28068 | 平均值 | |||
只有细胞P-6P-7P-2P-3P-4P-2+P-3+P-4C-8C-9C-10C-17C-18C-19C-20C-21C-23C-24C-25M-1C-27C-28PLGAP-6+PLGAP-7+PLGAP-2+PLGAP-3+PLGAP-4+PLGAP-2+P-3+P-4+PLGAC-8+PLGAC-9+PLGAC-10+PLGAC-17+PLGAC-18+PLGAC-19+PLGAC-20+PLGAC-21+PLGAC-23+PLGAC-24+PLGAC-25+PLGAM-1+PLGAC-27+PLGAC-28+PLGASAC | 0202020202020总共;6.7每个20202020202020202020202020200202020202020总共;6.7每个20202020202020202020202020200 | 9643939779949399100010001000100010008435465343833754115747510825597519357134191225273346195087321000105568221623642778888601000 | 212112710198961028131652613511912713811428013915218410878025687416147179120588339 | 128811115657513227116246419402442128761040142453435575873557302703901201882893235489511 | 29061500104195105594596952505960238116337222641055731144343703574564203554484664884813777074995466415355 | 253461052031242537339440537445624222413172115226501823851650615261356533523184374084117445176072192953484448463551 | 014000001231311621510212275228110330388098230734182023951093204919142188599710442468789314140136216284 | 41783000606091524300000219457080505381303692403753753191784189208704473156 | 045005989622107221601318319822324291256502100004354380168635152729351314359126533721573772108283884011544 | 61263000035864340951621364769137677901652102000023360010646252045358627747141707920004962200034013355259520350 | 35031122146251423459426300532628111216787115327710590298512392380191433047797112528971138291T303207303583 |
从表8可明显看出,供体28065在IFN-γ试验中显示出高背景。给出的数值“1000”表示测量值超出试验灵敏度的范围。
实施例42:CIC对小鼠细胞的免疫调制
在鼠脾细胞上检测多核苷酸和嵌合化合物的免疫调制活性。免疫调制作用通过测量分泌到培养基中的细胞因子进行评估。培养基上清液中的细胞因子水平通过酶联免疫吸咐试验(ELISA)进行测定。
利用标准技术对细胞进行分离和制备。收获8至20周龄BALB/c小鼠的脾并且利用标准切片方法(teasing)及用BioWhittaker Inc.的ACK裂解缓冲液处理分离出脾细胞。本实验中合并四个脾。分离的细胞在补充有2%热灭活胎牛血清(FCS)、50μM2-巯基乙醇、1%青霉素-链霉素和2mML-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中进行洗涤并以大约7×105个细胞/ml重悬浮于10%FCS/RPMI(含有10%热灭活FCS、50μM 2-巯基乙醇、1%青霉素-链霉素和2mML-谷氨酰胺的RPMI1640培养基)。
细胞培养物通过将大约7×105个细胞/孔的细胞一式三份地接种于96孔平底微量滴定板的100μl 10%FCS/RPMI中建立,平板接种后让细胞休息至少1小时。与所示的测试化合物(在所示浓度下)在37℃孵育24小时。收获细胞上清液并在-80℃冷冻。通过ELISA测定细胞产生的细胞因子,结果如表9所示。
表9
测试化合物 | 剂量 | IL-6 | IL-12 | IFNγ |
P-6 | 5.0μg/ml1.0μg/ml0.1μg/ml | 93115760121 | 537445651665 | 25052175187 |
C-10 | 5.0μg/ml1.0μg/ml0.1μg/ml | 334217619 | 23291738122 | 1991049 |
C-11 | 5.0μg/ml1.0μg/ml0.1μg/ml | 1009811814458 | 427949143359 | 33423220960 |
P-7 | 5.0μg/ml1.0μg/ml | 97 | 177143 | 2330 |
SAC | 734 | 1343 | 18843 | |
只有培养基 | 9 | 124 | 9 |
实施例35:含有3核苷酸核酸结构部分的CIC的活性以及cPLGA对活性的增强
本实施例显示几种CIC在有和没有cPLGA存在下利用人PBMC测定的免疫调制活性。有趣地是,磷酸二酯型的C-30(C-31)作为单独的CIC是无活性的,但当与cPLGA配制在一起时就具有很好的活性。实际上,一般趋势是仅包含磷酸二酯键的CIC(C-31,C-36,和C-93)作为单独的CIC是无活性的,但当与cPLGA配制在一起时其活性显著增加。
C-32,一种只含有三聚体核酸结构部分的CIC,单独使用时具有活性并且当与cPLGA配制在一起时显示出更大活性。参见表10。
表10
IFN-γ(pg/ml) | IFN-α(pg/ml) | ||||||||||
刺激物 | 28089 | 28090 | 28098 | 28099 | 平均值 | 28089 | 28090 | 28098 | 28099 | 平均值 | |
只有细胞P-6P-7C-10C-21C-22C-8C-9C-29C-30C-31C-32C-33C-93C-28PLGAP-6+PLGAP-7+PLGAC-10+PLGAC-21+PLGAC-22+PLGAC-8+PLGAC-9+PLGAC-29+PLGAC-30+PLGAC-31+PLGAC-32+PLGAC-33+PLGAC-93+PLGAC-28+PLGASAC | 08403561316212630000014156061218041138772668103682597256454171427683195 | 0255444681552750605001521443373454244332330477233327192186628306489 | 0745017421811020515012011001831632779115011612127118631536447159725924917072252101 | 41252114012491116177202353345101605301630357506341414065796323224306 | 130219811862109101109013116411104755745958661842683795205647240176771866273 | 250017560211075134158285560081977523134761910053089094469628165899013667 | 796227611574612467922926312230643810385256102038668336371111691228912201738155239 | 331051918728697314359526246342542393403650910016049348554910282181764268114192 | 281053730446624736233247295930296749914713172302133916801419331361131130440007070 | 416821142241972053921465691063621433318344651141873710753359736099923012372352126117 |
实施例36:含5′TCG的CIC的免疫调制活性
本实施例显示由包含不同核酸结构部分的CIC产生的免疫调制作用(参见表11)。一般来说,含5′-TCG-3′(C-8、C-21、C-50、C-51、等)或5′-NTCG(C-46)(其中N是任何核苷)的序列比其他含CG的CIC(C-24,C-52)有更大活性。另外,尽管大多数CIC诱导显著量的IFN-γ,但对IFN-α诱导来说结果变异较大,这说明IFN-α诱导对基序的要求可能比IFN-γ诱导对基序的要求更加严紧。尤其,含5′-TCGA-3′的CIC(C-50,C-51,C-45)比含5′-TCGT-3′的CIC(C-41,C-42,C-52)产生更多的IFN-α。
除C-8和C-21(包含基序5′-TCGTCGA-3′)以外,最佳IFN-α诱导是由在5′位置具有TCGA的CIC产生的。
仅含有六聚体(C-22)、五聚体(C-43)、和四聚体(C-44)核酸结构部分的CIC被发现如果单独利用可诱导出IFN-γ。此外,这些CIC中的每个CIC以及仅含有三聚体核酸结构部分的C-32当与cPLGA配制在一起时诱导出相当大量的IFN-γ和IFN-α。C-39,一种具有两个六聚体核酸结构部分的CIC,单独利用时是有活性的。而C-40,一种具有一个六聚体和一个四聚体核酸结构部分的CIC,在本实验中是无活性的。这两种CIC当与cPLGA配制在一起时都显示出显著的活性。
表11
刺激物 | IFN-γ(pg/ml) | 1FN-α(pg/ml) | ||||||||
28042 | 28043 | 28044 | 28045 | 平均值 | 28042 | 28043 | 28044 | 28045 | 平均值 | |
只有细胞P-6P-7C-8C-24C-21C-42C-41C-45C-46C-47C-50C-51C-52M-1C-22C-43C-44C-32C-39C-40PLGAP-6+PLGAP-7+PLGAC-8+PLGAC-24+PLGAC-21+PLGAC-42+PLGAC-41+PLGAC-45+PLGAC-46+PLGAC-47+PLGAC-50+PLGAC-51+PLGAC-52+PLGAM-1+PLGAC-22+PLGAC-43+PLGAC-44+PLGAC-32+PLGAC-39+PLGAC-40+PLGASAC | 15495664681487901981745903991121324795238452061282389134326192138215213671017400015157101380220135792969201811722154000221014522211180014381618 | 411897693915615191067107514668145371292134921429343536359194885582153832425471380120414171940229223524000120940001726159297525944000400040004981271 | 39252610003121198400084198448014250911142127736566484782812055258117414901362187021901910192014321137146510001551231085135420062759227518131053 | 52121323426177374525363171924112834016511713723317812286523253724966344721614024631173136194276133274160123 | 77054566016192113265348234392028299171732133131228351312318314201661423953185013741264155716142219151118701142100204915881934227620879771016 | 02702005700622420361120012000310010602182029594255352408502461548183712032535898620421672758285 | 4485115107229312373013724530181412018726038722193312024108119874000130927128183241341118612934000114240004000110 | 9362232879242315226019324035136720608463103710716658862955341693257301242115434022640217687712613155657 | 02120501500143035364823001036283822110191691196421000327536004249192127363700 | 1342132725613788315100158224328182751522261132524151546879421865428714841692200445526173653223792171113 |
实施例37CIC的免疫调制活性
本实施例显示的是对另一些线性CIC(一些同时含有硫代磷酸酯键(PS)和磷酸二酯键(PO))和分支CIC进行的免疫调制测试试验(表12和13)。对比C-94(一种分支CIC)和C-21(含有相同核酸结构部分的线性CIC)表明,分支CIC诱导出的IFN-α比线性CIC的多四倍。每种CIC与cPLGA配制在一起后,诱导的IFN-γ和IFN-α量都显著增加。磷酸二酯型的C-94和C-93只有在配制时才具有活性。C-87显示可明显地诱导IFN-α。
表12
刺激物 | IFN-γ(pg/ml) | IFN-α(pg/ml) | ||||||||
28042 | 28043 | 28044 | 28045 | 平均值 | 28042 | 28043 | 28044 | 28045 | 平均值 | |
只有细胞P-6P-7C-8C-53C-49C-84C-85C-94C-93C-21C-9PLGAP-6+PLGAP-7+PLGAC-8+PLGAC-53+PLGAC-49+PLGAC-84+PLGAC-85+PLGAC-94+PLGAC-93+PLGAC-21+PLGAC-9+PLGA | 11324346233936729174438572691960113284211471235313241288040001451 | 41036197532743323131981460268535813551121219232294755316690763 | 052948646387676931514174140005905914744617812174000291554400086940004000 | 1365335604263532321348881716441306721941653113210206195611673379125125331804 | 6363465632480881207361716697143510933414321152188428582263782928062005 | 89078030003027146397115559519904177721161883778712389 | 234025080025239400116039604609149211640471577199 | 3224520100528664811911198515010130400040004000400020452572397 | 6410854256588222241855613496411212984322594210403641241340009881571477 | 194315103157571376838195295451112106615160125832362288110711358366 |
表13
刺激物 | IFN-g(pg/ml) | IFN-α(pg/ml) | ||||||||
28218 | 28219 | 28220 | 28221 | 平均值 | 28218 | 28219 | 28220 | 28221 | 平均值 | |
只有细胞P-6P-7C-87C-94SAC | 513583152552 | 5752439621 | 525538441383 | 51415977269647 | 5475281921301 | 323232307532483 | 32323232167105 | 323232426963332 | 323232265412452 | 3232321910311268 |
实施例38:CIC中序列基序的位置效应
本实施例描述了对多种CIC(其中一些在前面的实施例中在不同的供体中进行过检测)的免疫调制测试试验并举例说明核酸序列在CIC中的位置效应。
被检测的CIC包括在核酸结构部分中含有两个不同的含CG的核酸序列(TCGTCGA和ACGTTCG)并含有一个不含CG序列的核酸结构部分(AGATGAT)的CIC。在含CG的核酸序列中,含TCGTCGA序列的CIC将比仅含ACGTTCG序列的CIC具有更大的活性。在这两者中,具有TCGTCGA的CIC确有更大活性。可利用本实施例中所用CIC的一般结构,N1-S1-N2-S2-N3来说明基序在CIC内的位置。将活性最大的基序TCGTCGA放置在N1位置导致产生出活性最大的CIC(C-8,C-56)。放置在N2位置也赋予了活性。例如,在N2位置具有TCGTCGA的C-57与在N3位置具有TCGTCGA的C-58相比活性稍大。在N1位具有ACGTTCG序列的CIC,虽然比具有TCGTCGA序列的相似CIC活性小,但却比在N1位具有AGATGAT序列的CIC活性大(C-57和C-58与C-59和C60相比较)。在本实验中,C-61包含其中含有CG基序但不含TCG基序的核酸结构部分,当与cPLGA配制一起时诱导IFN-γ。参见表14。
表14
刺激物 | IFN-γ(pg/ml) | IFN-α(pg/ml) | ||||||||
28156 | 28157 | 28158 | 28159 | 平均值 | 28156 | 28157 | 28158 | 28159 | 平均值 | |
只有细胞P-6P-8C-8C-9C-23C-54C-55C-56C-57C-58C-60C-61PLGAP-6+PLGAP-8+PLGAC-8+PLGAC-9+PLGAC-23+PLGAC-54+PLGAC-55+PLGAC-56+PLGAC-57+PLGAC-58+PLGAC-60+PLGAC-61+PLGASAC | 125113225516121162733297511122341940430492431070951083814825838104879210278046501265780 | 387220742729576378566543323288209179632643115186214128651150960604814106585815081184 | 4207313401922028855203675926355251262693071821572473211011355623883 | 523131197329295218186563262843863114963411299921423175123564000305610211014864659 | 346118472360345224532963326820914492301115671086881824974115314291250756645969677 | 35216102262689985135385582434000139810207525054000555179714208 | 348497551422359654155230220246294884877177816211265801400014769321188055 | 17246178598635761293470418285741 8240147788521033216 | 83281602016913313142231033592315734835972782112433252139506334 | 414414270671223120175402481383107719282710198696113992821573313683776 |
本实验还比较了两种分支CIC的免疫调制活性:C-94在分支的丙三醇成分和核酸结构部分之间具有HEG结构部分,而C-28具有直接连接到丙三醇间隔体的核酸结构部分。参见表15。有趣地是,尽管两种分支CIC对IFN-γ的诱导作用相似,但含HEG间隔体的CIC对IFN-α的诱导作用却高得多。包含三个通过5-末端连接到顺丁烯二酰亚氨基活化的三乙基胺间隔体上的P-6序列的分支CIC(C-99),当与cPLGA配制在一起时只诱导IFN-γ而不诱导IFN-α。一般来说,最大IFN-α产量是利用如下CIC产生出来的,此CIC具有通过分支结构连接的核酸结构部分,并具有多个未连接的或“游离的”核酸结构部分5′-末端,且包括可在核酸结构部分之间提供构象灵活性和间距的间隔体。
表15
刺激物 | IFN-γ(pg/ml) | IFN-α(pg/ml) | ||||||||
110 | 112 | 119 | 120 | 平均值 | 110 | 112 | 119 | 120 | 平均值 | |
只有细胞P-6P-7C-8C-59C-63C-50C-51C-45C-41C-42C-46C-52C-39C-40C-94C-28C-99PLGAP-6+PLGAP-7+PLGAC-8+PLGAC-59+PLGAC-63+PLGAC-50+PLGAC-51+PLGAC-45+PLGAC-41+PLGAC-42+PLGAC-46+PLGAC-52+PLGAC-39+PLGAC-40+PLGAC-94+PLGAC-28+PLGAC-99+PLGA | 4415081241152256153610961528880512150812244726041805168556427632164072194868012088121240273631681612304810322024136026682104768 | 2434424540523762642401921002044004811612284521289681612208241580368411216302418082032201212361332124431882568672 | 20144161362880525252325668401084104441672960321188620234014322896305616000102123720234482285364884035725316 | 281044048406048403632563628322012060401202300316238418282092992924247236561908360817241244186433961320472 | 29525514699451336546529016945643214721554141914308658146710916859881805173040692822615839413097158432072458452323911807 | 20502196229471614084465825058267461608382210948146674234414837685244553235423462237264376423625658302114 | 20017232306388472130226222619814444226014113827381414126015447461030638208466841839280 | 223447426424648382200107418215620829244415226105686601298222130762796416151045474207421182372252307837948000284344 | 27224222286366224286364822502878262921470226502782298340261484206209420542682206265826166346198260 | 56132128133325656910765206211779753499013103129419941331481482495318644394189211421662016136258723645461197200 |
实施例39 分支CIC的活性
本实施例证明,具有多个游离5′末端并具有由HEG间隔体提供的构象灵活性的分支CIC,相对于具有HEG间隔体的线性CIC(C-94与C-21比较以及C-96和C-23比较)或未加入(HEG)间隔体的分支CIC(C-94与C-28比较以及C-96和C-27比较)来说,诱导出更多的IFNα。给C-96再添加一个HEG间隔体和一个4碱基的核酸结构部分引起IFNα诱导减少(C-96与C-97比较)。参见表16。
对含有三聚体5′-TCG-3′基序的两种CIC的免疫调制活性进行了检测(C-91和C-68)。两种CIC本身都不具有活性,但C-91在与cPLGA配制在一起后具有显著活性。
缀合有多个P-6序列的亲水性含聚酰胺的STARBURST树状体_(C-102)与单独的P-6序列就等量的P-6(基于每条链的P-6链)相比,它具有显著更大的IFN-α活性。这一结果证实,利用与上述不同的组合物和合成方法,在柔性亲水核心上以多聚体方式递送含5′-CG-3′的核酸结构部分显著提高对IFN-α的诱导。
表16
刺激物 | IFN-g(pg/ml) | IFN-α(pg/ml) | ||||||||||
28185 | 28186 | 28187 | 28188 | 平均值 | ×4 | 28185 | 28186 | 28187 | 28188 | 平均值 | ×2 | |
只有细胞P-6P-7C-8C-94C-28C-21C-23C-27C-96C-97C-9C-86C-91C-68C-102PLGAP-6+PLGAP-7+PLGAC-8+PLGAC-94+PLGAC-28+PLGAC-21+PLGAC-23+PLGAC-27+PLGAC-96+PLGAC-97+PLGAC-9+PLGAC-86+PLGAC-91+PLGAC-68+PLGAC-102+PLGASAC | 5205015418116224442491632591891301581031573193913953331992924003563841116131774195 | 117425612437143221624444434643127118654967170186177823101813222 | 1314819123384751252921195125953062101131281524228017517710295244124938411424380274 | 18291757331251157164392243413201514413919414715 | 59467816166103221998101801052778137717820616214596142218174145259417323127 | 20378253116442664138875392405319402073073054627712823649579382570872696579101377671293506 | 36120419618951444383425503072579418804710415996761843581599542750422644793388014209473 | 4412531239464274446711644613187411646461955314531692505855726684514494513974 | 32452021360159391184443725109078460139491513401104246428519343164221151 | 443141344554402146314444493520713642139173483544426102 | 194216108571612856137889648112411545322757207618642038245398928816290114231868482 | 38843221711421125611225157719295224823109064541014411523512840774907817857163257922847371369165 |
实施例40
本实验检测一系列CIC的活性,这些CIC中包含六聚体核酸基序5′-TCGTCG-3′和连接到此核酸结构部分3’-末端的多个间隔体(C-13,C-14,C-15和C-16)。参见表17。这些CIC如果单独使用都没有活性,然而当配制在cPLGA上时则全部具有显著的活性。
表17
刺激物 | IFN-γ(pg/ml) | IFN-α(pg/ml) | ||||||||
28057 | 28058 | 28059 | 28060 | 平均值 | 28057 | 28058 | 28059 | 28060 | 平均值 | |
只有细胞P-6P-7C-13C-14C-15C-16PLGAP-6+PLGAP-7+PLGAC-13+PLGAC-14+PLGAC-15+PLGAC-16+PLGASAC | 1831235140200040200020002000172673 | 2103231323220002712623595852072000 | 112303121004920001622173220002772000 | 398545316254452401682000258712000 | 113752622294161392663127312111821668 | 062103100035200005865393729911842920 | 39600000222200052779946871628225292000 | 014502490004117471615912637141382333387 | 01230000004031081437295317311362146 | 3210700007415371995302503337862017863 |
实施例41:CIC在B-细胞增殖试验中的作用
从两名正常受试者的乙酰肝素化血液中分离出人PBMC。将一些PBMC保存而将剩余的与CD19+MACS珠(Miltenyi Biotec)一起孵育。然后使这些细胞通过一个磁体,经正选择分离出CD19+B细胞。经FACS分析确定,这一群体具有>98%CD19+。然后B细胞以1×105/200μl/孔的浓度在96-孔圆底培养板中进行培养。在一些情况下,还对PBMC进行培养,但以2×105/200μl/孔浓度进行。细胞以2μg/ml多核苷酸或CIC进行刺激(三次重复)。培养期是37℃下48小时。培养期结束后,用3H-胸苷(1μCi/孔)脉冲培养板,并再孵育8小时。然后,利用标准液体闪烁技术收获培养板并以每分钟计数(cpm)收集数据。
实验A:实验A的结果(表18)证明多核苷酸(P-6)和含有5′-C,G-3′基序的CIC(C-8,C-9,C-21,C-28)可引起B细胞增殖。对照化合物,P-7和M-1,以及七聚体多核苷酸P-1几乎不至完全不引起B细胞增殖。分支CIC(C-28)及含有丙基间隔体的CIC(C-9),与含有六聚乙二醇间隔体的CIC(C-8和C-21)相比,引起了更大的B细胞增殖。PBMC的增殖反映出B细胞的增殖。
表18
供体146 | 供体147 | 两者的平均值 | |||||||||
细胞类型 | 刺激 | cpm1 | cpm2 | cpm3 | 平均值 | cpm1 | cpm2 | cpm3 | 平均值 | ||
B细胞 | 只有细胞 | 538 | 481 | 795 | 605 | 482 | 360 | 296 | 379 | 492 | |
B细胞 | P-6 | 29280 | 33430 | 30056 | 30922 | 35729 | 18032 | 21166 | 34976 | 27949 | |
B细胞 | P-7 | 4858 | 5810 | 7079 | 5916 | 4364 | 4066 | 2774 | 3735 | 4825 | |
B细胞 | P-1 | 761 | 608 | 721 | 697 | 569 | 460 | 687 | 572 | 634 | |
B细胞 | C-8 | 23815 | 30066 | 22969 | 25617 | 20914 | 22370 | 23659 | 22314 | 23966 | |
B细胞 | C-9 | 35365 | 42705 | 45231 | 41100 | 55543 | 49035 | 44985 | 49854 | 45477 | |
B细胞 | C-21 | 28467 | 16074 | 19258 | 21266 | 17604 | 18851 | 19887 | 18781 | 20024 | |
B细胞 | M-1 | 1514 | 2815 | 1173 | 1834 | 1679 | 1667 | 1436 | 1594 | 1714 | |
B细胞 | C-28 | 50999 | 54630 | 46418 | 50682 | 65593 | 51040 | 50357 | 55663 | 53173 | |
PBMCs | 只有细胞 | 2744 | 2303 | 2284 | 2444 | 1301 | 2402 | 2143 | 1949 | 2196 | |
PBMCs | P-6 | 22067 | 23740 | 28099 | 24635 | 26436 | 23830 | 17531 | 22599 | 23617 | |
PBMCs | P-7 | 7620 | 8362 | 9686 | 8556 | 9783 | 9841 | 10476 | 10033 | 9295 | |
PBMCs | P-1 | 9724 | 3041 | 2425 | 5063 | 1706 | 1960 | 324 | 1330 | 3197 | |
PBMCs | C-8 | 47202 | 40790 | 4481 | 44268 | 38845 | 39733 | 27981 | 35520 | 39894 | |
PBMCs | C-9 | 55348 | 24857 | 39953 | 40053 | 88106 | 65413 | 90665 | 81395 | 60724 | |
PBMCs | C-21 | 30338 | 22685 | 22383 | 25135 | 28819 | 530 | 37088 | 22146 | 23641 | |
PBMCs | M-1 | 8753 | 5203 | 4496 | 6151 | 1034 | 3298 | 1674 | 2002 | 4076 | |
PBMCs | C-28 | 94977 | 121595 | 84977 | 100516 | 103916 | 91439 | 100905 | 98753 | 99635 |
实验B:实验B(表19)评价了间隔体组成以及CIC结构(线性对比分支)对B细胞增殖的影响。含有丙基、丁基、脱碱基、和羟甲基乙基间隔体的线性CIC,与含有六聚乙二醇间隔体或三聚乙二醇间隔体的相应CIC(比较C-10,C-11,C-17,C-18,C-20,C-25)相比,倾向于诱导更大的B细胞增殖。十二烷基间隔体使得CIC(C-19)无活性。值得注意的是,B细胞增殖数据不一定反映如上所示的细胞因子数据,尤其是在B细胞增殖和IFN-α诱导之间存在差异。
表19
增殖试验
121 194
样品 | 细胞 | 刺激物 | cpm1 | cpm2 | cpm3 | 平均值 | cpm1 | cpm2 | cpm3 | 平均值 | 两者的平均值 | |
1234567891011121314151617 | B细胞B细胞B细胞B细胞B细胞B细胞B细胞B细胞B细胞B细胞B细胞B细胞B细胞B细胞B细胞B细胞B细胞 | 只有细胞P-6P-7C-8C-9C-10C-11C-22C-94C-28C-17C-18C-19C-20C-23C-24C-25 | 4511999616232604219381514230367171471141835393279758583127610628820634360 | 75715031182112078354001413630412140141440626954304261708510993085116221678935016 | 29719804290117696238771615818528684411110267809895146539262853220087279926480 | 5021827721151079327072151452643612668123112970922765158699613022015645593131952 | 20313678199293331366074801696764727361215881746710028371180828730397916060 | 22812732159393911671754582089855408505136911489012217403187056532340719509 | 1519003168676021786659431125338945349156911051810538312174819596346817384 | 19411804175787751608162941637353027072169901429210928362180898286361817651 | 3481504119369784215761072021404898596922335018529133986622415511966477524802 |
实施例43:用CIC进行鼻内处理之后在小鼠肺中免疫相关基因的诱导
对C-9、C-23和P-6(阳性对照)在小鼠肺中诱导75种不同基因的mRNA表达的能力进行了研究。所评价的基因包括编码细胞因子、趋化因子、细胞表面分子、转录因子、金属蛋白酶和其他分子的基因。本研究利用来自Jackson Labs(Bar Harbor,ME)的6-8周龄雌性BALB/c小鼠在Northview Pacific实验室(Hercules,CA)进行。在轻度isoflorine麻醉下,以50uL盐水中的20ug C-9、C-23、P-6(阳性对照)或P-7(阴性对照)对每组5只小鼠进行鼻内处理。早先实验证明大多数基因的最佳诱导时间是在处理后6小时。因此,在6小时收获肺并在液氮中速冻并贮藏在-80℃以备后用。总RNA利用RNeasy微型试剂盒(Qiagen Inc.,Valencia,CA)分离出来。RNA样本用DNAse处理(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)并利用Superscipt II RNase H-逆转录酶(Invitrogen,Rockville MD)转化为cDNA,如在Scheerens et al.,2001,Eur.J.oflmmunology31:1465-74中所述。合并每组的cDNA样本,在每个合并的样本中利用实时定量PCR(ABIPrism5700,Perkin Elmer Applied Biosystems)和sybergreen(Qiagen Inc.)测定75个基因的mRNA表达。除目的基因之外,在每个样本中,还测定了管家基因(HPRT或泛素)的mRNA表达。为了校正每个样本中的RNA量,所有数据都相对于管家基因的表达进行计算。如图5所示选出最大上调的基因,数据表示为超过对照处理(P-7)小鼠中的应答的诱导倍数。此数据证明C-9、C-23和P-6可有效地诱导包括IL-6、IL-12p40、IFN-α、IP-10和IL-10在内的多种基因的表达。然而,用C-9处理小鼠,与C-23或P-6处理组相比,诱导出显著更高的IFN-αmRNA表达。
实施例44:CIC的体内活性
体内研究通过在小鼠(10只/组)后颈部皮下注射20ug(200ul体积)的P-6(阳性对照)、P-7(阴性对照)、C-9、C-23、P-1或P-11来进行。2小时后收集血样。对于LPS阳性对照组来说,小鼠经腹膜内注射200ul体积,并在1.5小时后(即,在LPS诱导的TNF-α活性峰处)收集血样。使血液凝结并制备血清于-80℃贮藏直至试验开始。利用检测TNF-α的Biosource cvtoscreen试剂盒和检测mIL-6和mIL-12的Pharmingen抗体对血清细胞因子进行测定。所有样本都一式两份地进行测试。
P-6和两种CIC(C-9和C-23)每个都诱导IL-12p40、IL-6和TNF-α,而对照寡核苷酸(P-7)是无活性的(图6A-C)。在本实验中,CIC C-23比C-9和P-6更有效。正如所预计的,六聚体(P-11:5′-AACGTT)和七聚体(P-1:5′-TCGTCGA)是无活性的。
实施例45:灵长类动物针对抗原和CIC的免疫应答
检测了狒狒对存在CIC时施用的乙肝表面抗原(HBsAg)的免疫反应。
HBsAg为酵母中产生的重组HBsAg。在研究开始时,狒狒的组(每组8只)中包括雄性和雌性狒狒,体重范围为8-31kg(组平均体重为13-16kg)。
通过肌内注射(IM)1ml体积的20μg HBsAg免疫狒狒两次,间隔期为两个月(第0和2月)。如下所列出的,一些组还接受了CIC(C-8或C-9)或阳性对照(P-6)加HBsAg。
在免疫前和免疫后2周收集所有动物的血。如下测定抗HBsAg IgG效价。用包被有来自人血浆的HBsAg的小珠,使用AUSAB EIA商业试剂盒(Abbott Labs Cat.#9006-24和1459-05)分析狒狒血清样本。一组范围在0-150mIU/ml的来自人血浆的HBsAg阳性和阴性标准品与试验样本一起进行测试。生物素偶联的HBsAg和兔抗-生物素-HRP偶联的抗体用作检测用的二级抗体复合体。该试验用邻苯二胺(OPD)显色,并在492nm处测定吸光值,在600nm处扣除本底(Quantum II分光光度计,Abbott Labs)。根据厂商确立的参数从标准曲线,应用样本的吸光值确定相应的抗HBsAg浓度,以毫国际单位/ml(mIU/ml)表示。对于稀释的样本,以导致0-150mIU/ml值的样本吸光度为基础来定量,然后乘以稀释系数可得到终浓度。
用具事前比较的单因素方差分析(α=0.05),通过方差分析(NCSS97统计软件程序,Kaysville,UT)对对数变换数据进行统计学分析。认为p≤0.05时具有显著性。
试验动物组如下进行免疫:
组1-20μg HBsAg;
组2-20μg HBsAg+1000μg P-6;
组3-20μg HBsAg+1000μg C-8;
组4-20μg HBsAg+1000μg C-9
研究结果如下面的表20所示。CIC或阳性对照P-6与HbsAG联合施用,与单独施用HBsAg相比,提高了抗-HBsAg抗体的效价。在成对比较中,组2、3、和4中检测到的免疫应答显著异于组1中检测到的免疫应答(二次免疫后,对于组2为p<0.05,对于组3和4为p<0.005)。在组2、3、和4之间没有发现统计学上的差异。
表20
狒狒的抗体应答(AUSAB EIA)
HBsAg+CIC
# | 组号#疫苗 | 抗HBsAg(mIU/ml)第一次免疫后 | 第二次免疫后 |
B339B340B341B342B343B344B345B346 | 1HBV(20ug) | 00000000 | 763158055502824 |
平均值标准差 | 00 | 4026 | |
B347B348B349B350B351B352B353B354 | 2HBV(20ug)P-6(1000ug) | 06017001521 | 32912110813,569315381,4461,675 |
平均值标准差 | 79 | 2200*4,637 | |
B379B380B381B382B383B384B385B386 | 3HBV(20ug)C-8(1000ug) | 20012505200 | 1843,03841,7063,71825013,75011,62679 |
平均值标准差 | 2245 | 9294**14,121 | |
B387B388B389B390B391B392B393B394 | 4HBV(20ug)C-9(1000ug) | 0420040526750 | 5,6058,9783122,99212,6631122,36452 |
平均值标准差 | 68139 | 4135**4.633 |
*p<0.05,**p<0.005与只有HBV(组1)相比
实施例46:由CIC-抗原缀合物引起的体内应答
本实施例显示通过CIC-抗原缀合物的施用在小鼠体内诱导出抗体-介导的免疫应答。
如下所述,以两周的间隔期,通过皮内(尾部)途径用C-11/Amb a1缀合物(如下所述合成)(lug或10ug)、P-6/Amb a1(1ug)或Amb a1(1ug),对10只小鼠/组进行两次免疫。从每次注射后两周获得的血清中测定抗-Amb a1特异性IgGI和IgG2a的效价。第二次免疫之后于第6周对脾细胞进行体外再刺激以确定Amb a1特异性IFNγ和IL-5应答。
经C-11-Amb a1缀合物免疫的小鼠显示出在使用P-6-Amb a1参照物免疫时所观察到的特征性免疫应答模式,具体来说,从Th2向Th1-型Amb a1特异性免疫应答转移。经C-11或P-6缀合物免疫的小鼠形成强IgG2a应答并减少了IgGl应答。缀合物处理组还显示出IL-5应答停止而IFNγ应答增加。此外,针对C-11-Amb a1缀合物的免疫应答显示出以剂量依赖性方式增加,这可通过比较1ug和10ug剂量组来证明。C-11-Amb a1缀合物引发的免疫应答与使用P-6-Amb a1时所观察到的性质相似。
结果如表21-23所示。
一般方法
动物研究在Northview Pacific实验室(Hercules,CA)利用来自Charles River实验室(Hollister,CA)的8-12周龄雌性BAILB/c小鼠进行。以2周为间隔,给10只鼠/组在尾部两次皮内(ID)注射下列一种物质:C-11/Amb a1缀合物(1ug),C-11/Amb a1缀合物(10ug),P-6/Amb a1缀合物(1ug)或Amb a1抗原(1ug)。在每次注射之后两周经眼眶后途径采集血样并制备血清用于抗体测定。在第二次注射后6周,收获脾脏用于体外再刺激试验以测定IFNγ和IL-5的细胞因子应答。脾脏进行单独的检测。利用25和5ug/ml的Amb a1对5×105细胞/孔的细胞进行再刺激,第4天收获上清液并在-80℃贮藏直至进行检测。体外试验用的对照包括0.01%的SAC和分别为10ng/ml和1uM的PMA/IO。
小鼠抗-Amb a1 IgG1和IgG2a试验
在用1μg/ml Amb a1抗原以50μl/孔包被的96-孔圆底板中,通过ELISA分析小鼠血清样本。山羊抗-小鼠IgG1(或IgG2a)生物素偶联抗体用作二级抗体。利用链霉抗生物素-辣根过氧化物酶偶联物进行检测。
试验用TMB显色并测定450nm的吸光度值,在650nm扣除本底(Emax精确微量平板读数器,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)。效价定义为利用4-参数分析(Softmax Pro97,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)给出0.5OD的ELISA吸光度值的血清稀释倍数的倒数。所有样本都一式两份于两孔中在不同板上进行检测,以两个值的平均值作为效价值。
小鼠IL-5和IFN-γ试验
在包被有抗-细胞因子单克隆抗体的平板上通过捕获ELISA检测上清液的IL-5和IFN-γ水平。生物素酰化的抗-细胞因子MAb用作二级抗体。利用链霉抗生物素-辣根过氧化物酶缀合物进行检测并以TMB显色试验。从每个平板上测定的标准曲线计算出浓度。测定450nm的吸光度值,在650nm扣除本底(Emax精确微量平板读数器,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)。所有样本都一式两份于两孔中在不同平板上进行检测,以两个值的平均值作为浓度值。
用具事前比较的单因素方差分析(One-Way ANOVA with PlannedComparions)(α=0.05),通过NCSS97程序(NCSS97统计软件,Kaysville,Utah)对对数变换数据进行统计学分析。对于如下研究,认为p<0.05时具有显著性。
C-11/Amb a1缀合物的合成
活化的C-11(C-111)的合成:
将5′-二硫化物-C-11(C-110)溶解于活化缓冲液(100mM磷酸钠/150mM氯化钠/pH7.5)并通过TCEP的还原作用激活。利用5ml SephadexG25柱(Pharmacia)以相同活化缓冲液为流动相纯化活化的CIC(C-111)。以基线开始上升为起点,以0.5分钟间隔手动收集各级分。纯化后,各级分的浓度利用A260来测定,且消光系数25.6OD/mg。
活化的Amb a1的合成:
通过如下方式对Amb a1进行激活:首先封闭其游离的巯基,然后加入异官能交联剂。利用HiTrap G-25脱盐柱(Pharmacia Catalog#17-1408-01)脱盐除去过量试剂。所得的活化Amb a1中每个被激活的蛋白有平均9.3个位点。
C-11/Amb a1缀合物的合成:
使活化的C-11(C-111)和活化的Amb a1结合,所得的C-11/Amb a1缀合物利用Superdex200分子大小排阻层析柱(PharmaciaCat.#;17-1088-01;1cm×30cm)进行分级分离。制剂缓冲液(10mM磷酸盐,150mM NaCl,pH7.2)用作流动相。基线开始上升为起点,以1分钟间隔收集各级分。
缀合物样本利用4-12%NuPAGE凝胶(Invitrogen,Catalog#NP0322)和MOPS缓冲液(Invitrogen,Catalog#NP0001)通过SDS-PAGE进行分析,同时利用BioSep SEC-S3000柱(Phenomenex,Catalog#;OOH-2146-EO)通过分子大小排阻层析(SEC-HPLC)进行分析。SDS-PAGE后,蛋白质通过考马斯蓝(GelCode,Pierce Catalog#24596)染色观察。通过利用DNA-银染色(Pharmacia,Catalog#17-6000-30)确证CIC的存在。SDS-PAGE和SEC-HPLC都用来限定合并标准,和用于表征得到的合并物。蛋白质浓度利用二辛可宁酸(Bicinchoninic acid)法(BCA,Sigma Catalog#BCA-1)进行测定。
表21
C-11/Amb a1缀合物在小鼠体内的活性IgG1和IgG2a抗-Amb a1效价
组别 | 动物# | 免疫 | 第一次免疫后2周 | 第二次免疫后2周 | ||
IgG1 | IgG2a | IgG1 | IgG2a | |||
1 | 12345678910 | C-11/Amb a1缀合物(1ug)ID | 30303030383030305630 | 148221943641,8949435702593030 | 7,90013,0379465,4853,80560010,3376002,5758,381 | 19,88619,73523,91810,4879,9455,24920,1568,3505,74728,971 |
平均值标准差 | 33**8 | 510599 | 5,367**4,400 | 15,244*8,285 | ||
2 | 11121314151617181920 | C-11/Amb a1缀合物(10ug)ID | 51307730303055999930 | 3456674451,662674501,1371,1198,2271,613 | 8,982201,0086,73922,578190,8355,97129,64670,15980,0526,235 | 27,877612,73986,672121,77088,74517,600105,398183,152250,20663,616 |
平均值标准差 | 53*29 | 1,5732,399 | 62,22175,298 | 155,778*174,925 | ||
3 | 21222324252627282930 | P-6/Amb a1参照缀合物(1ug)ID | 301,42248517090388333011330 | 373032651,1822,0272,298321558939 | 3,43715,65284,92737,37938,12132,4993,01124,30743,06037,116 | 65,3066,198177,28156,07476,572240,09824,40420,79619,5867,317 |
平均值标准差 | 330475 | 662862 | 31,95123,568 | 69,36378,697 | ||
4 | 31323334353637383940 | Amb a1(1ug)ID | 3,4057,3312,8474,0218,3331,2141,2794,3325692,696 | 34930353021228630803030 | 172,827164,673112,766100,281156,037118,407396,404187,33563,536161,039 | 6,2441,0037,1741,3994,9692,1256004,599600902 |
平均值标准差 | 3,603**2,554 | 111*123 | 163,331**90,406 | 2,962**2,530 |
值30用于第一次免疫后值<30的样品
值600用于第二次免疫后值<600的样品
*p<0.05,**p<0.005与P-6/Amb a1相比
表22
C-11/Amb a1缀合物在小鼠体内的活性
体外IFNγ应答(pg/ml)
动物 | 免疫 | Amb a1 | PMA | 只有培养基 | |
25ug/ml | 5ug/ml | ||||
12345678910 | C-11/Amb a1缀合物(1ug)ID | 225011629185341692523136249004383死亡1608825067 | 16320100545084832211298254892716死亡628512431 | 125058433583537969225215258855死亡2772228201 | 454545454518545死亡4545 |
平均值标准差 | 175367289 | 108896839 | 140119353 | 6147 | |
1112131415161718 | C-11/Amb a1缀合物(10ug)ID | 1999450732547529641783356880188783949763 | 1346625103284227801743505512995907928468 | 3370236467217702460120021406043156258062 | 4545123130515182983211 |
19 | 102646 | 60332 | 32669 | 3366 | |
20 | 61939 | 29505 | 53393 | 756 | |
平均值标准差 | 65868**24860 | 3965220160 | 3557613331 | 394455 | |
21222324252627282930 | P-6/Amb a1参照缀合物(1ug)ID | 42754307407614076435645408952553815884421563276 | 3083996169562364330164310271434912432460846897 | 3655023742154078961159151335515515116237106643680 | 454545118209308734545734 |
平均值标准差 | 2755620099 | 1841614603 | 2558119548 | 167218 | |
31323334353637383940 | Amb a1(1ug)ID | 3016119351121301687911874492617020992209 | 2585277623925129726732840376511523895 | 10800094345975678962377808772998925370169108000103131 | 452104461495689282187132309 |
平均值标准差 | 3366**2143 | 24651915 | 9152013239 | 212156 |
值18用于<18的值
值不包括在计算中,因为只有培养基时的值>3个标准差+所有只有培养基时的值的平均值(即,2014pg/ml)**p<0.005对于25μg/ml的再刺激而言与P-6/Amb a1值相比
表23
C-11/Amb a1缀合物在小鼠体内的活性体外IL-5应答(pg/ml)
动物 | 免疫 | Amb a1 | PMA | 只有培养基 | |
25ug/ml | 5ug/ml | ||||
12345 | C-11/Amb a1缀合物(1ug) | 67492642468 | 10653242445 | 2202240696829792851 | 4124242446 |
6 | ID | 104 | 121 | 2547 | 129 |
78910 | 24死亡2424 | 24死亡24203 | 3935死亡13831837 | 24死亡2453 | |
平均值标准差 | 6886 | 6363 | 2320948 | 3312 | |
11121314151617181920 | C-11/Amb a1缀合物(10ug)ID | 24411692611342537224334213 | 33731372212211871093523155 | 1655225889291865877896636561238751 | 248424332429242414524 |
平均值标准差 | 153111 | 13080 | 1377940 | 4440 | |
21222324252627282930 | P-6/Amb a1参照缀合物(1ug)ID | 242415796883921810324110 | 24602771523637217654459102 | 1514372517024473141412351037138221942990 | 24242424242424242424 |
平均值标准差 | 8864 | 171151 | 21671174 | 240 | |
31323334353637383940 | Amb a1(1ug)ID | 72491930375109312062808144112401373 | 33157125967476349021159091228481 | 1332318615742506219737151727165513671683 | 24245624242767582468 |
平均值标准差 | 1128**734 | 831588 | 2094808 | 4020 |
值24用于<24的值
实施例47:间隔体结构部分对CIC活性的影响
本实施例显示不同间隔体结构部分对IFN-α诱导的影响。C-90(C3CIC)和C-51(HEG CIC)的比较结果显示C-51诱导的IFN-α比C-90的多8倍,尽管每种CIC诱导的IFN-γ量相近。同样,含不同接头的分支CIC的比较结果显示出对于IFN-α的诱导,HEG(C-94)>TEG(C-103)>C3(C-104)=无接头(C-28).
表24
刺激物 | IFN-g(pg/ml) | IFN-g(pg/ml) | ||||||||
28234 | 28235 | 28236 | 28237 | 平均值 | 28234 | 28235 | 28236 | 28237 | 平均值 | |
只有细胞P-6P-7C-90C-51C-71C-101C-96C-97C-100C-88C-33C-21C-28C-94C-103C-104PLGAP-6+PL6AP-7+PLGAC-90+PLGAC-51+PLGAC-71+PLGAC-101+PLGAC-96+PLGAC-97+PLGAC-100+PLGAC-88+PLGAC-33+PLGAC-21+PLGAC-28+PLGAC-94+PLGAC-103+PLGAC-104+PLGASAC | 415137173014211027523410721144574139881011101436817610211815928174192401845 | 452411812316820523911918321861071416144431514467364479765910707371299512444411131623643731250 | 451749719344862735426949017247308882392508718105211831106412548791167988174211489681089100513521388641924 | 4116741586158016632612139698019074772076164512291116185412510377513461837483899694454715327780450553947405638684034506349305350 | 43217552478577865503345652130608516335381542581613508156513861513214819631780275517041369142912581546182214212342 | 165862161617161616169516161616161616161611753257308546794107474215208035511369164145895162374 | 1616164677302491201616161616161182129122694166962168224444883237421610926135661561164653148616327 | 1616161173525381354608140398212167316548126161571163164544800080008000666080004074240935145366184719744561281149 | 16741634537981665856699316193111916781636312131635344416510380008000800080008000377764126727800013480005405023744 | 16412813110615632546434471561093519616107894198313291628805356533262925501624026162559284040748859993061631899 |
实施例48:评定对应于核酸结构部分序列的多核苷酸的独立免疫调制活性
本实施例进一步例证了含有不具有独立免疫调制活性的核酸结构部分的CIC的免疫调制活性。对与CIC核酸结构部分的序列对应的多核苷酸的活性进行单独检测,或与游离间隔体组合后进行检测,并且与包含等量核酸和间隔体的CIC的活性进行比较。例如,3uM的CIC C-101与9uMP-14或9uM P-14和9uM六聚乙二醇及3uM丙三醇(由于C-101含有3当量的P-14,3当量的六聚乙二醇,和1当量的丙三醇)的混合物进行比较。在所有情况下,CIC都具有活性而短链多核苷酸,不论单独的或与间隔体混合的,都是无活性的。参见表25。在浓度9uM检测单独间隔体的活性,所有间隔体都是完全无活性的。
表25
刺激物 | IFN-g(pg/ml) | IFN-a(pg/ml) | ||||||||
28250 | 28251 | 28252 | 28253 | 平均值 | 28250 | 28251 | 28252 | 28253 | 平均值 | |
只有细胞P-6P-7丙基间隔体丁基间隔体三聚乙二醇六聚乙二醇丙三醇C-51C-101P-14P-14/HEG/丙三醇C-21C-94P-1P-1/HEG/三醇C-45P-13P-13/HEGC-10P-2P-3P-4P-2/P-3/P-4/HEG | 181211041381512161352241014122340541510718403377327268 | 5181151112456334195160219261328163252111 | 93439117121641801110155287561995224577653724338 | 13711111511671461010203128118118981111 | 85236446781281531613133204331159142854422312927 | 161616161616161618154016163124516161616161616161616 | 16161616161616162461472161669645161610916162316291616 | 30161616161616169550916164132316165516162525381616 | 1916161616163516122626451616264119816163 82161612416311616 | 201616161616211643712911616101603161614016164718291616 |
实施例49:(5′-TCGACGT-3′HEG)平均=185-Fic0ll400(C-137)的制备
A.顺丁烯二酰亚氨基-Ficoll400的制备
利用Inman(J.Imunology,1975,114:704-709)的方法制备氨基乙基羧甲基(AECM)180-Ficoll400。平均每摩尔Ficoll(MW=400,000Da)有180个氨基乙基基团。将溶于300ul DMSO的27.6mg(62.6umol)4-(N-顺丁烯二酰亚氨基甲基)-环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺基酯滴加到溶于1.0ml0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.66)中的23.2mg(0.058umol)AECM180-Ficoll400中,边加边不断搅拌。将反应混合物置于摇床上2小时然后在Sephadex G-25柱上脱盐得到20mg顺丁烯二酰亚氨基-Ficoll400。平均每摩尔Ficoll有大约165个顺丁烯二酰亚胺基团。
B.5′-TCGACGT-3′-HEG-(CH2)3-SH(C-136)的制备
利用合成C-116的类似方法合成出5′-TCGACGT-3′-HEG-(CH2)3-SS-(CH2)3-OH(C-135)。向溶于0.4mL0.1M磷酸钠/150mM氯化钠/pH7.5缓冲液的10mg(3.57umol)C-135中加入溶于0.7ml同样缓冲液的5.7mg(20umol)TCEP。对混合物进行充分涡旋之后置于40℃水浴中2小时。利用乙酸三乙基铵缓冲液(TEAA)/pH7.0中的乙腈递增梯度通过RP-HPLC(Polymer Labs PLRP-S柱)对硫醇(C-136)进行纯化并立即应用于下一步反应中。
C.(5′-TCGACGT-3′-HEG)x-Ficoll400(C-137)的制备
向溶于0.7ml 0.1M磷酸钠/pH6.66的5.5mg(0.014umol)顺丁烯二酰亚氨基-Ficoll400中加入溶于3.45mL约30%乙腈/TEAA/pH7.0缓冲液的6.8mg(2.5umol)C-136。将混合物置于摇床上室温过夜然后在Superdex200柱(Pharmacia)上对产物进行纯化。利用分离产物的总重量和260nm吸光度值计算,结果显示产物平均包含每摩尔Ficoll大约185个寡核苷酸。还得到了含较低寡核苷酸荷载量的第二级分。
D.C-137活性
如表26中所示,基于多糖的CIC在细胞因子应答试验中具有引入注意的活性,尤其显示出明显的IFN-α刺激作用。
表26
刺激化合物 | IFN-g(pg/ml) | IFN-a(pg/ml) | |||||||||
28313 | 28314 | 28315 | 28316 | 平均值 | ×4 | 28313 | 28314 | 28315 | 28316 | 平均值 | |
只有细胞P6P7C-137SAC | 111187 | 938112277 | 1147121356 | 1130920544000 | 89911221055 | 3239543904220 | 3131313612346 | 1221301765468192 | 100122107624114 | 9813412140001172 | 881041093426456 |
***
虽然为了清楚和理解的目的,对前述发明以阐述和实施例方式较详细地进行了描述,但对本领域技术人员来讲,显然可实施某些变化和改变。因此,发明详述和实施例不构成对本发明范围的限制,本发明范围由所附权利要求限定。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物为所有目的特此完整地并入作为参考,就如同具体地单独指出每份出版物、专利或专利申请如此并入作为参考一样。
序列表
<110>戴纳瓦克斯技术公司(Dynavax Technologies Corporation)
<120>嵌合免疫调制化合物及其使用方法
<130>377882002043
<140>PCT/US02/20025
<141>2002-06-21
<150>US60/299,883
<151>2001-06-21
<150>US60/375,253
<151>2002-04-23
<160>141
<170>FastSEQ for Windows Version4.0
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<222>(5)...(24)
<223>n=任何核苷酸
<221>变异
<222>(5)...(24)
<223>n可以存在或可以不存在
<400>1
tcgannnnnn nnnnnnnnnn nnnn 24
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
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tgactgtgaa cgttcgagat ga 22
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
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tgactgtgaa ccttagagat ga 22
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<220>
<223>合成的构建体
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<223>n=t,g,c,或5-溴胞嘧啶
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<222>2
<223>n=t,g,a,或u
<221>变异
<222>4
<223>n=t,a,或c
<221>变异
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nnancgntcg 10
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>5
tgaacgttcg 10
<210>6
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>
ggaacgttcg 10
<210>7
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>7
tgaacgutcg 10
<210>8
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>8
tgaccgttcg 10
<210>9
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>9
tgatcggtcg 10
<210>10
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>10
tgatcgttcg 10
<210>11
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>11
tgaacggtcg 10
<210>12
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>12
gtaacgttcg 10
<210>13
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>13
gtatcggtcg 10
<210>14
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>14
gtaccgttcg 10
<210>15
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<222>合成的构建体
<400>15
gaaccgttcg 10
<210>16
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>1
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>16
ngaccgttcg 10
<210>17
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>17
cgaacgttcg 10
<210>18
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>18
cgaccgttcg 10
<210>19
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>1
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>19
ngaacgttcg 10
<210>20
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>20
ttaacgutcg 10
<210>21
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>21
tuaacgutcg 10
<210>22
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>22
ttaacgttcg 10
<210>23
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>23
tcgtcgaacg ttcgttaacg ttcg 24
<210>24
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>24
tgactgtgaa cgutcgagat ga 22
<210>25
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>25
tcgtcgaucg utcgttaacg utcg 24
<210>26
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>26
tcgtcgaucg ttcgtuaacg utcg 24
<210> 27
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>27
tcgtcguacg utcgttaacg utcg 24
<210>28
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>7
<223>n=2-氨基-腺嘌呤
<400>28
tcgtcgnacg utcgt taacg utcg 24
<210>29
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>29
tgatcgaacg ttcgttaacg ttcg 24
<210>30
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>30
tgactgtgaa cgutcggtat ga 22
<210>31
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>31
tgactgtgac cgttcggtat ga 22
<210>32
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>32
tgactgtgat cggtcggtat ga 22
<210>33
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>33
tcgtcgaacg ttcgtt 16
<210>34
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>34
tcgtcgtgaa cgttcgagatga 22
<210>35
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>35
tcgtcggtat cggtcggtat ga 22
<210>36
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>36
cttcgaacgt tcgagatg 18
<210>37
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>37
ctgtgatcgt tcgagatg 18
<210>38
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>38
tgactgtgaa cggtcggtat ga 22
<210>39
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>39
tcgtcggtac cgttcggtat ga 22
<210>40
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>40
tcgtcggaac cgttcggaat ga 22
<210>41
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>41
tcgtcgaacg ttcgagatg 19
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>42
tcgtcgtaac gttcgagatg 20
<210>43
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>43
tgac tgtgac cgttcggaat ga 22
<210>44
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>44
tcgtcgaacg ttcgaacgtt cg 22
<210>45
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>2,5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>45
tngtngaacg ttcgagatg 19
<210>46
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>46
tcgtngaacg ttcgagatg 19
<210>47
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>47
tcgtcgaccg ttcggaatga 20
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>2,5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>48
tngtngaccg ttcggaatga 20
<210>49
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>49
tcgtngaccg ttcggaatga 20
<210>50
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>50
ttcgaacgtt cgttaacgtt cg 22
<210>51
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>4
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>51
cttngaacgt tcgagatg 18
<210>52
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>52
tgatcgtcga acgttcgaga tg 22
<210>53
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>1
<223>n=t,g,c,或5-溴胞嘧啶
<221>变异
<222>2
<223>n=t,g,a,或u
<221>变异
<222>4
<223>n=t,a,或c
<221>变异
<222>5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<221>变异
<222>7
<223>n=t,g,或u
<400>53
nnanngntcg 10
<210>54
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>54
tgaangttcg 10
<210>55
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>55
tgaangutcg 10
<210>56
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>56
tgacngttcg 10
<210>57
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>57
tgatnggtcg 10
<210>58
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>58
gtatnggtcg 10
<210>59
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>59
gtacngttcg 10
<210>60
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>60
gaacngttcg 10
<210>61
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>61
gaaangutcg 10
<210>62
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>1,5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>62
ngacngt tcg 10
<210>63
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>63
cgaangttcg 10
<210>64
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>1.5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>64
ngaangttcg 10
<210>65
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>1.5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>65
ngaangutcg 10
<210>66
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>66
ttaangutcg 10
<210>67
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>67
tuaangutcg 10
<210>68
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>68
ttaangttcg 10
<210>69
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>11
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>69
tgactgtgaa ngutcgagat ga 22
<210>70
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>9.19
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>70
tcgtcgaang ttcgttaang ttcg 24
<210>71
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>11
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>71
tgactgtgaa ngutcggtat ga 22
<210>72
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>1 1
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>72
tgact gtgaa ngutcggaat ga 22
<210>73
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>11
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>73
tcgtcggaaa ngutcggaat ga 22
<210>74
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>5,9
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>74
tcgtngaang utcggaatga 20
<210>75
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>1
<223>n=t,c,或5-溴胞嘧建
<221>变异
<222>2
<223>n=t,g,a,或u
<221>变异
<222>4
<223>n=t,a,或c
<221>变异
<222>7
<223>n=t,g,或u
<400>75
nnancgntcg 10
<210>76
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>11
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>76
tgac tgtgaa ngt tcgagat ga 22
<210>77
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>11,15
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>77
tgactgtgaa ngttngagat ga 22
<210>78
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>11
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>78
tgactgtgaa ngttccagat ga 22
<210>79
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>79
tgac tgtgaa cgtucgagat ga 22
<210>80
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>13
<223>n=5-溴尿嘧啶
<400>80
tgactgtgaa cgntcgagat ga 22
<210>81
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>11
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>81
tgactgtgaa ngttcgtuat ga 22
<210>82
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>11
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>82
tgactgtgaa ngttcggtat ga 22
<210>83
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>83
ctgtgaacgt tcgagatg 18
<210>84
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>2,5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>84
tngtngtgaa cgttcgagat ga 22
<210>85
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>85
tcgtngtgaa cgttcgagat ga 22
<210>86
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>13
<223>n=4-硫代-胸腺嘧啶
<400>86
tgac tgtgaa cgntcgagat ga 22
<210>87
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>12,16
<223>n=6-硫代-鸟嘌呤
<400>87
tgactgtgaa cnttcnagatga 22
<210>88
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>88
tgactgtgaa cgttcgtuat ga 22
<210>89
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>89
tgactgtgaa cgttcgttat ga 22
<210>90
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>90
tcgttcaacg ttcgttaacg ttcg 24
<210>91
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>91
tgattcaacg ttcgttaacg ttcg 24
<210>92
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<222>合成的构建体
<400>92
ctgtcaacgt tcgagatg 18
<210>93
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>93
tcgtcggaac gttcgagatg 20
<210>94
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>94
tcgtcggacg ttcgagatg 19
<210>95
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>95
tcgtcgtacg ttcgagatg 19
<210>96
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>96
tcgtcgttcg ttcgagatg 19
<210>97
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>97
tcgtgaacgt tcg 13
<210>98
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>98
tcgtcgaacg ttcg 14
<210>99
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>2
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>99
tngtgaacgt tcg 13
<210>100
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>2,5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>100
tngtngaacg ttcg 14
<210>101
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>101
tcgttaacgttcg 13
<210>102
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>misc_feature
<222>(4)...(6)
<223>tcg可以存在或可以不存在
<221>变异
<222>7,8
<223>n=任何核苷酸
<221>变异
<222>7,8
<223>n可以存在或可以不存在
<221>变异
<222>10
<223>n=t,a,或c
<221>变异
<222>13
<223> n=t,g,或u
<400>102
tcgtcgnnan cgntcg 16
<210>103
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>103
tcgaacgttc g 11
<210>104
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>104
tcgtcgaacg ttcg 14
<210>105
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>105
tcgtgaacgt tcg 13
<210>106
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>106
tcggtatcgg tcg 13
<210>107
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>107
tcggtaccgt tcg 13
<210>108
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>108
tcggaaccgt tcg 13
<210>109
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>109
tcggaacgtt cg 12
<210>110
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>110
tcgtcggaac gttcg 15
<210>111
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>111
tcgtaacgtt cg 12
<210>112
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>112
tcgaccgttc g 11
<210>113
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>113
tcgtcgaccg ttcg 14
<210>114
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>114
tcgttaacgt tcg 13
<210>115
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>2
<223>n=5-溴胞嘧啶
<221>变异
<222>5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<221>变异
<222>4-6
<223>tng可以存在或可以不存在
<221>变异
<222>7,8
<223>n=任何核苷酸
<221>变异
<222>7,8
<223>n可以存在或可以不存在
<221>变异
<222>(10)...(10)
<223>n=t,a,或c
<221>变异
<222>(13)...(13)
<223>n=t,g,或u
<400>115
tngtngnnan cgntcg 16
<210>116
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>2
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>116
tngtgaacgt tcg 13
<210>117
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>2,5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>117
tngtngtgaa cgttcg 16
<210>118
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>2
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>118
tngaacgttc g 11
<210>119
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>2
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>119
tngaccgttc g 11
<210>120
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>2,5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>120
tngtngaccg ttcg 14
<210>121
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<221>变异
<222> 7,8
<223>n=任何核苷酸
<221>变异
<222>7,8
<223>n可以存在或可以不存在
<221>变异
<222>10
<223>n=t,a,或c
<221>变异
<222>13
<223>n=t,u,或g
<400>121
tcgtngnnan cgntcg 16
<210>122
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>122
tcgtngtgaa cgttcg 16
<210>123
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>123
tcgtngaacg t tcg 14
<210>124
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>124
tcgtngaccg ttcg 14
<210>125
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>misc_feature
<222>(4)...(6)
<223>tcg可以存在或可以不存在
<221>变异
<222>7,8
<223>n=任何核苷酸
<221>变异
<222>7,8
<223>n可以存在或可以不存在
<221>变异
<222>10
<223>n=t,a,或c
<221>变异
<222>11
<223>n=5-溴胞嘧啶
<221>变异
<222>(13)...(13)
<223>n=t,g,或u
<400>125
tcgtcgnnan ngntcg 16
<210>126
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>8
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>126
tcggaaangt tcg 13
<210>127
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>6
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>127
tcgaangttc g 11
<210>128
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>2
<223>n=5-溴胞嘧啶
<221>变异
<222>(4)...(6)
<223>tng可以存在或可以不存在
<221>变异
<222>5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<221>变异
<222>7,8
<223>n=任何核苷酸
<221>变异
<222>7,8
<223>n可以存在或可以不存在
<221>变异
<222>(10)...(10)
<223>n=t,a,或c
<221>变异
<222>(13)...(13)
<223>n=t,g,或u
<400>128
tngtngnnan ngntcg 16
<210>129
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>2,6
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>129
tngaangutc g 11
<210>130
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>2,6
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>130
tngaangttc g 11
<210>131
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>5
<223>n=5-溴胞嘧啶
<221>变异
<222>7,8
<223>n=任何核苷酸
<221>变异
<222>7,8
<223>n可以存在或可以不存在
<221>变异
<222>10
<223>n=t,a,c
<221>变异
<222>11
<223>n=5-溴胞嘧啶
<221>变异
<222>(13)...(13)
<223>n=t,g,或u
<400>131
tcgtngnnan ngntcg 16
<210>132
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>5,9
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>132
tcgtngaang utcg 14
<210>133
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>变异
<222>5,9
<223>n=5-溴胞嘧啶
<400>133
tcgtngaang ttcg 14
<210>134
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>134
tgactgtgaa cgttcgagat ga 22
<210>135
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>135
tgactgtgaa ccttagagat ga 22
<210>136
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>136
tgactgtgaa ggttagagat ga 22
<210>137
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>修饰的碱基
<222>1
<223>n=与反应性连接基团结合的胸腺嘧啶
<400>137
ngactgtgaa ccttagagat ga 22
<210>138
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>修饰的碱基
<222>1
<223>n=与反应性连接基团结合的胸腺嘧啶
<400>138
ngactgtgaa cc ttagagat ga 22
<210>139
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>139
tgactgtgaa cgttcgagat gatgactgtg aacgttcgag atgatgactg tgaacgttcg 60
agatga 66
<210>140
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>修饰的碱基
<222>1
<223>n=与反应性连接基团结合的胸腺嘧啶
<400>140
ngactgtgaa cgttcgagat ga 22
<210>141
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<221>修饰的碱基
<222>1
<223>n=与反应性连接基团结合的胸腺嘧啶
<400>141
ngactgtgaa cgttcgagat ga 22
Claims (48)
1.包含两个或两个以上核酸结构部分以及一个或多个非核酸间隔体结构部分的嵌合免疫调制化合物(CIC),
其中至少一个非核酸间隔体结构部分与两个核酸结构部分共价连接,
其中所述间隔体不是多肽,
其中至少一个核酸结构部分包含序列5′-CG-3′,并且
其中所述CIC具有至少一种选自如下的免疫调制活性:
(a)刺激人外周血单核细胞产生IFN-γ的能力;
(b)刺激人外周血单核细胞产生IFN-α的能力;
(c)刺激B细胞增殖的能力。
2.如权利要求1所述的CIC,其中至少一个核酸结构部分包含序列5′-TCG-3′。
3.如权利要求1或2所述的CIC,其包含具有下式的核心结构:
N1-S1-N2或N1-S1-N2-S2-N3
其中N1、N2和N3是核酸结构部分,S1和S2是非核酸间隔体结构部分,并且S1和S2与恰好两个核酸结构部分共价结合。
4.如权利要求1或2所述的CIC,其包含具有下式的核心结构:
[Nv]x-Sp,
其中Sp是与X个独立地选择的核酸结构部分,即Nv,共价结合的多价间隔体,且其中X至少是3。
5.如权利要求4所述的CIC,其中X是3至约50。
6.如权利要求4所述的CIC,其中X是约50至约500。
7.如权利要求4所述的CIC,其中Sp包含树状体或多糖。
8.如权利要求7所述的CIC,其中Sp包含交联的多糖。
9.如权利要求1或2所述的CIC,其包含至少3个核酸结构部分,其中每个核酸结构部分都与至少一个非核酸间隔体结构部分共价连接。
10.如权利要求1或2所述的CIC,其包含含有低聚乙二醇、丙三醇、C2-C10烷基、脱碱基核苷酸、季戊四醇、1,3-二氨基-2-丙醇、2-(羟甲基)乙基、多糖或树状体的非核苷酸间隔体结构部分。
11.如权利要求1或2所述的CIC,其包含复合非核苷酸间隔体结构部分。
12.如权利要求10或11所述的CIC,其中非核苷酸间隔体含有HEG亚单元。
13.如权利要求10或11所述的CIC,其中非核苷酸间隔体含有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯连接的低聚乙二醇结构部分。
14.如权利要求4所述的CIC,其包含含有树状体、多糖、丙三醇、季戊四醇或2-(羟甲基)乙基的第一间隔体亚单元,并且还包含至少一个HEG亚单元,其中所述HEG亚单元与第一间隔体亚单元共价结合并与核酸结构部分共价结合。
15.如权利要求14所述的CIC,其中HEG亚单元和第一间隔体元件之间的连接是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键,HEG亚单元和核酸结构部分之间的连接是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键。
16.如权利要求1或2所述的CIC,其中至少一个核酸结构部分包含序列5′-TCGA-3′。
17.如权利要求1或2所述的CIC,其中至少一个核酸结构部分包含序列5′-[(X)0-2]TCG[(X)2-4]-3’,其中每个X都是独立地选择的核苷酸。
18.如权利要求14所述的CIC,其中至少一个核酸结构部分具有序列5′-TCG[(X)2-4]-3′;5′-TCG(A/T)[(X)1-3]-3′;或5′-TCG(A/T)[(X)1-3]-3′,其中每个X都是独立地选择的核苷酸。
19.如权利要求18所述的CIC,其中至少一个核酸结构部分具有序列5′-TCGACGT-3′或5′-TCGTCGA-3′。
20.如权利要求1或2所述的CIC,其中CIC的所有核酸结构部分都具有式 5′-TCG[(X)2-4]-3′;5′-TCG(A/T)[(X)1-3]-3′;或5′-TCG(A/T)[(X)1-3]-3′的序列,其中每个X都是独立地选择的核苷酸。
21.如权利要求1或2所述的CIC,其中至少一个含有序列5′-CG-3′的核酸结构部分小于8个核苷酸长。
22.如权利要求1或2所述的CIC,其中含有序列5′-CG-3′的所有核酸结构部分都小于8个核苷酸长。
23.如权利要求1或2所述的CIC,其中所有的核酸结构部分都是相同的。
24.如权利要求1或2所述的CIC,其中CIC的至少一个核酸结构部分(i)不具有独立免疫学活性或(ii)具有次独立免疫学活性。
25.如权利要求24所述的CIC,其中CIC的核酸结构部分没有一个具有独立免疫调制活性。
26.如权利要求13所述的CIC,其具有选自下式的结构:
5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’
5’-TCGTCG-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’
5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-TCGTCGA-3’
5’-TCGTCG-3’-HEG-5’-TCGTCG-3’-HEG-5’-TCGTCG-3’
5’-TCGTCG-3’-HEG-5’-AACGTT-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’
5’-TCGTCG-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’-TEG
HEG-5’-TCGTCG-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’-TEG
5’-TCGTTTT-3’-HEG-5’-TCGTTTT-3’-HEG-5’-TCGTTTT-3’
5’-TCGTCGT-3’-HEG-5’-TCGTCGT-3’-HEG-5’-TCGTCGT-3’
5’-TCGAGAT-3’-HEG-5’-TCGAGAT-3 ’-HEG-5’-TCGAGAT-3’
5’-TCGTCGT-3’-HEG-5’-TGTCGTT-3’-HEG-5’-TGTCGTT-3’
5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-TCGTCGA-3’
5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-GGGGGG-3’
5’-TCGAACG-3’-HEG-5’-TCGAACG-3’-HEG-5’-TCGAACG-3’
5’-TCGACGT-3’-HEG-5’-TCGACGT-3’-HEG-5’-TCGACGT-3’
5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’
5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGTCGA-3’
5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’
5’-TCGACTC-3’-HEG-5’-TCGAGCG-3’-HEG-5’-TTCTCTT-3’
5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-TCGTCGA-3’-HEG-3’-AGCTGCT-5’
5’-TCGAT-3’-HEG-5’-TCGAT-3’-HEG-5’-TCGAT-3’-HEG-5’-TCGAT-3’
5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-AGAT-3’
5’-TCGACGT-3’-HEG-5’-TCGACGT-3’-HEG-5’-TCGACGT-3’-HEG-5’-TCGACGT-3’
5’-TCGATTT-3’-HEG-5’-TCGATTT-3’-HEG-5’-TCGATTT-3’
5’-TCGCTTT-3’-HEG-5’-TCGCTTT-3’-HEG-5’-TCGCTTT-3’
5’-TCGGTTT-3’-HEG-5’-TCGGTTT-3’-HEG-5’-TCGGTTT-3’
(5’-TCGTCGA-3’-HEG)2-丙三醇-HEG-5’-TCGTCGA-3’
(5’-TCGTCGA-3’-HEG)2-丙三醇-HEG-3’-AGCTGCT-5’
(5’-TCGTCGA-3’-HEG)2-丙三醇-HEG-5’-AACGTTC-3’
(5’-TCGTCGA-3’-HEG)2-丙三醇-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGA-3’
(5’-TCGTCGA-3’-HEG)3-三倍增体-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGA-3’
(5’-TCGTCGA-3’-HEG)2-丙三醇-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGACGT-3’
(5’-TCGACGT-3’-HEG)2-丙三醇-HEG-5’-TCGACGT-3’
(5’-TCGTCGA-3’-TEG)2-丙三醇-TEG-5’-TCGTCGA-3’
(5’-TCGTCGA-3’-HEG-HEG)2-丙三醇-HEG-HEG-5’-TCGTCGA-3’
(5’-TCGACGT-3’-HEG)2-对称双倍增体-HEG-5’-TCGACGT-3’
(5’-TCGACGT-3’-HEG)3-三倍增体-HEG-5’-TCGACGT-3’
((5’-TCGACGT-3’-HEG)2-丙三醇-HEG)2-丙三醇-HEG-5’-TCGACGT-3’
(5’-TCGACGT-3’-HEG)2-丙三醇-HEG-5’-AACGTTC-3’
((5’-TCGACGT-3’-HEG)2-丙三醇-HEG)2-丙三醇-HEG-5’-T-3’
(5’-TCGACGT-3’-HEG)3-三倍增体-HEG-5’-T-3’
(5’-TCGACGT-3’-HEG)x-Ficoll400
27.如权利要求1或2所述的CIC,其中核酸结构部分的核苷酸之间的连接选自磷酸二酯键和硫代磷酸酯键。
28.如权利要求1或2的CIC,其中核酸结构部分的核苷酸之间、核酸结构部分和间隔体结构部分之间、以及间隔体结构部分的亚单元之间的连接是磷酸二酯和/或硫代磷酸酯。
29.如权利要求1所述的CIC,其中间隔体结构部分包含树状体。
30.如权利要求1所述的CIC,其中间隔体结构部分包含多糖。
31.包含前述任一权利要求所述的CIC和可药用赋形剂的组合物。
32.如权利要求31所述的组合物,其中此组合物基本上不含内毒素。
33.如权利要求31或32所述的组合物,其还包含抗原。
34.如权利要求31或32所述的组合物,其还包含阳离子微球体。
35.如权利要求34所述的组合物,其中微球体含有乳酸和羟基乙酸的聚合物。
36.如权利要求1-30之任一项所述的CIC或如权利要求31-35之任一项所述的组合物在制备用于调制个体的免疫应答的药物中的用途。
37.如权利要求36所述的用途,其中所述个体患有与Th2型免疫应答相关的病症。
38.如权利要求37所述的用途,其中所述与Th2型免疫应答相关的病症是变态反应或变态反应引起的哮喘。
39.如权利要求36所述的用途,其中所述个体患有感染性疾病。
40.如权利要求1-30之任一项所述的CIC或如权利要求31-35之任一项所述的组合物在制备用于增加个体体内干扰素-γ(IFN-γ)的药物中的用途。
41.如权利要求40所述的用途,其中所述个体患有特发性肺纤维化。
42.如权利要求1-30之任一项所述的CIC或如权利要求31-35之任一项所述的组合物在制备用于增加个体体内干扰素-α(IFN-α)的药物中的用途。
43.如权利要求42所述的用途,其中所述个体患有病毒感染。
44.如权利要求1-30之任一项所述的CIC或如权利要求31-35之任一项所述的组合物在制备用于改善个体的感染性疾病症状的药物中用途。
45.如权利要求1-30之任一项所述的CIC或如权利要求31-35之任一项所述的组合物在制备用于改善个体的IgE相关病症的药物中的用途。
46.如权利要求45所述的用途,其中所述IgE相关病症是变态反应。
47.如权利要求45所述的用途,其中所述IgE相关病症是与变态反应相关的病症。
48.如权利要求1-30之任一项所述的CIC或如权利要求31-35之任一项所述的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
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