CN100422342C - 检测人乳头瘤病毒mRNA的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供检查人类女性个体以评估她们发生宫颈癌风险的体外方法，所述方法包括检查所述个体的人乳突淋瘤病毒E6基因以及任选L1基因的mRNA转录物的表达情况，其中L1和/或E6 mRNA表达阳性的患者评定为有发生宫颈癌的风险。本发明还提供了实施所述方法的试剂盒。

Description

检测人乳头瘤病毒mRNA的方法
发明领域
本发明涉及检查人类个体以评估她们发生宫颈癌的风险的体外方法。
发明情况
宫颈癌是全世界最常见的恶性疾病之一，也是导致妇女生病和死亡的主要原因之一(Parkin DM，Pisani P，Ferlay J(1993)Int J Cancer54：594-606；Pisani P，ParkinDM，Ferlay J(1993)Int J Cancer 55：891-903)。据测美国1996年有15,700例侵袭性宫颈癌新病例，而世界卫生组织(1990)估计全世界每年发病率达450,000人。世界不同地区的年发病率各有不同，西亚为7.6/100,000，而南非为46.8/100,000(Parkin等，1993，同上)。
目前人们对宫颈癌的理解是，该病是一种多阶段疾病，通常发病时间长达10-25年。子宫颈侵袭性鳞状上皮细胞癌的特征是，癌症穿透基底膜并向基质或上皮中层扩散。宫颈癌的临床过程变化很大。其预后与临床阶段、淋巴结受累、原位肿瘤大小、组织学类型、侵袭深度和淋巴渗入有关(Delgado G等，(1990)Gynecol Oncol 38：352-357)。其肿瘤特征较少的一些患者结局相对较好，而其他患者对这种起初有限的疾病得到的却是致命的结局。这表明的确还需要另外的标记物，对刚诊断出来的宫颈癌作进一步的鉴别，以便根据风险程度给予相应的治疗方案(Ikenberg H等，Int.J.Cancer 59：322-61994)。
宫颈癌的流行病学表明其与宗教、婚姻和性行为具有很强的相关性。对HPV和宫颈癌形成的关系已作过近100例案例对照研究，结果几乎所有的研究例都发现正相关性(IARC专论，1995)。此相关性是强且一致，并对有限数量的病毒类型具有特异性(Munoz N，BoschFX(1992)HPV and cervical neoplasia：Review of case-control and cohortstudies(HPV和宫颈癌形成：案例对照和群组研究综述).IARC Sci Publ251-261)。在最能提供信息的研究当中，观察到侵袭性癌症和高级CIN病变与HPV 16DNA具有强相关性，且此相关性的一致性明显，这就排除了此相关性可用偶然、偏见或混淆来解释的可能性(IARC专论，1995)。间接证据表明，在癌细胞中检测到的HPV DNA是HPV感染在癌发生早期的作用的良好标记。不断增加的病毒负荷与宫颈癌的风险之间的剂量响应关系已有报道(Munoz和Bosch，1992同上)。在一些较大的系列中，高达100％的肿瘤为HPV阳性，但对病毒阴性宫颈癌的存在仍有争论(Meijer CJ等，1992 Detection of humanpapillomavirus in cervical scrapes by the polymerase chain reaction inrelation to cytology：possible implications for cervical cancer screening(相对于细胞学方法，用聚合酶链式反应检测子宫颈刮片中人乳头瘤病毒：宫颈癌检查的可能暗示).IARC Sci Publ 271-281；Das BC等，(1993)Cancer 72：147-153)。
在鳞状上皮细胞宫颈癌中最常发现的HPV类型是HPV 16(41％-86％)和18(2％-22％)。此外还发现HPV 31、33、35、39、45、51、52、54、56、58、59、61、66和68(IARC专论，1995)。在巴塞罗那举办的HPV2000国际会议中，认定HPV 16、18、31和45具有高风险，而HPV 33、35、39、51、52、56、58、59、68具有中等风险(Keerti V.Shan.P71)。这13个高风险和中等风险HPV一起通常被称为癌相关HPV类型。
有许多研究探讨了HPV检测在宫颈癌检查中的潜在作用(参看Cuzick等A systematic review of the role of human papillomavirustesting withing a cervical screening programme(关于宫颈癌检查计划中人乳头瘤病毒检测的作用的系统性综述).Health Technol Assess3：14.1999)。
Reid等(Reid R等，(1991)Am J Obstet Gynecol 164：1461-1469)最早证明HPV检测在宫颈癌检查中的作用。该研究是在来自性传播疾病诊所的高风险归女和妇科专科医生身上进行的，使用的是灵敏的(低严格性)Southern印迹杂交法进行HPV检测。该研究招募了1012名妇女，同时认为子宫颈记录法是辅助细胞学方法的一种可能手段。共发现23例CIN II/III病变，但只有12例通过细胞学方法检测到(灵敏度52％，特异性92％)。HPV检测发现16例高级病变。
Bauer等(Bauer HM等，(1991)JAMA 265：472-477)报告了一个基于PCR的使用MY09/11引物的早期研究(Manos M等，(1990)Lancet335：734)，该研究的对象是参加常规涂片检查的年轻妇女(大学生)。他们发现在467名妇女中阳性率达46％，这比斑点印迹检查的阳性率(11％)要高得多。
在一个用GP5/6引物应用PCR进行的研究中(Van Den Brule AJ，等，(1990)J Clin Microbiol 28：2739-2743)van der Brule等(Van DenBrule AJ等，(1991)Int J Cancer 48：404-408)表明，通过细胞学测试发现HPV阳性与宫颈癌发生之间有很强的相关性。在细胞学测试结果为阴性的年纪较大(35-55岁)的妇女中，HPV阳性率只有3.5％，且如果只考虑HPV类型16、18、31和33时HPV阳性率降低到1.5％，而患有原位组织癌的妇女均为HPV阳性，且其中90％携有上述四种HPV类型之一种。细胞学不正常现象较不严重的妇女以分级的方式显示HPV阳性率较低，这表明了一种明显的趋势。
Roda Housman等(Roda Housman AM等，(1994)Int J Cancer56：802-806)通过再观察1373名涂片不正常的妇女扩大了以上观察研究范围。他们的研究也确认，HPV阳性率随着涂片结果的严重性增加而提高。他们还注意到HPV不均匀性水平对低级涂片为22种类型，而对高级涂片则降到10种“高风险”类型。该文章没有包括任何细胞学检测阴性的妇女，也没有对细胞学疾病进行组织学确定。
Cuzick等(Cuzick J等，(1992)Lancet 340：112-113；Cuzick J等，(1994)Br J Cancer 69：167-171)首先报告HPV检测可为对随机检查测出的细胞学不正常现象的治疗类选提供有用的信息。在一个对133名妇女进行的研究中，查阅阴道镜检查结果他们发现阳性预报值为42％，这近似中度核异常的值。结果在HPV 16中表现得最明显。活检组织检查发现42名HPV 16阳性妇女中有39名患有高级CIN。该研究指出测试病毒负荷的重要性，且只认定高风险类型的高水平为阳性。
Cox等(Cox JT等，(1995)Am J Obstet Gynecol 172：946-954)证明采用Hybrid CaptureTM系统进行HPV检测对分选涂片疑似的妇女的作用。该试验在217名来自大学问讯处的上述妇女身上进行，发现CINII/III的灵敏度为93％，与之相比重复细胞学方法的灵敏度为73％。发现高病毒负荷可通过减低假阳性来进一步提高试验的效果。当以5RLU为取舍点时，发现约24％的PPV，同时不丧失灵敏度。
Cuzick等(Cuzick J等，(1995)Lancet 345：1533-1536)在1985名在计划生育诊所进行常规检测的妇女身上评估了作为初期检查的HPV检验。对四种普通HPV类型使用类型特异性PCR的灵敏度(75％)超过使用细胞学方法的灵敏度(46％)，阳性HPV检验的PPV(42％)近似于中度核异常的PPV(43％)。
WO 91/08312描述了确定感染HPV的患者个体的预后的方法，该方法包括通过检测样品中全部或部分E6和/或E7HPV基因的转录物来测定HPV活性水平，并将HPV活性测定值与预先确定的活性和发展为严重子宫颈异常增生或癌症的风险的关系相比较。
WO 99/29890描述了基于基因表达水平的测量和分析来评价HPV感染的方法。具体而言，WO 99/29890描述了这样的方法，该方法基于测量两种或多种HPV基因(如HPV E6、E7、L1和E2)的表达水平并比较这些基因的组合的表达比例，以给出对患者中HPV相关疾病的发展阶段的标志。
本发明发明人确认，有可能只基于对HPV L1和E6mRNA转录物的表达进行简单的阳性/阴性确定，而不需要对转录物的表达水平进行准确的定量测定或不需要确定两种转录物的表达水平的差异，就可以对HPV相关疾病作出在临床上有用的评价。这种方法在技术上简便，在优选的实施方案中，可进行中至高通量型的自动化操作。此外，在使用本发明方法获得的结果的基础上，本发明发明人制定了根据发生宫颈癌的风险对个体进行分类的新方案，该方案涉及HPV基因表达型式中与疾病相关的分子变化，而与CIN分类法无关。
因此，本发明第一方面提供了检查人类对象以评估她们发生宫颈癌的风险的体外方法，该方法包括检查人乳头瘤病毒L1基因和E6基因的mRNA转录物的表达，其中L1和/或全长E6mRNA表达阳性的个体认定为有发生宫颈癌的风险。
本发明方法的阳性检查结果表示子宫颈的细胞中L1mRNA和/或E6mRNA的阳性表达。这两种mRNA之一或两者的阳性表达可认为是个体有发生宫颈癌的风险的标志。表达E6mRNA的妇女发生细胞变化的风险高，因为致癌性E6和E7能结合细胞周期调节蛋白并作为细胞增殖的开关。E6mRNA的明显表达为子宫颈的细胞变化提供了一个直接的标志。无论在E6mRNA表达出现或不出现在情况下，L1mRNA的表达也表示活性HPV的存在。
在子宫颈检查的更广的情况中，可选出鉴定为L1和/或E6mRNA表达阳性的妇女作进一步的调查，例如用细胞学方法进行调查。因此，一方面本发明方法可提供对妇女人群进行预筛查的技术简便的方法，以鉴别HPV阳性个体来作进一步的调查。
在一个具体的实施方案中，本发明方法可用以基于L1和E6mRNA表达的阳性/阴性评分将个体分成四种不同的发生宫颈癌的类型。
因此，本发明的又一方面提供了检查人类个体以评估她们发生宫颈癌的风险的体外方法，该方法包括检查个体体内HPV L1基因的mRNA转录物和HPV E6mRNA转录物的表达，并根据L1和/或E6mRNA的表达按以下分类法将个体归类于四类发生宫颈癌的风险之
风险类型1：个体至少HPV类型16、18、31、33、35、39、45、52、56、58、59、66或68之一的L1mRNA表达阴性但E6mRNA表达阳性。至少HPV类型16、18、31或33之一的E6mRNA表达阳性的个体例如与这些HPV类型表达阴性但至少HPV类型35、39、45、52、56、58、59、66或68之一的E6mRNA表达阳性的患者相比，可认定为处于高风险。
风险类型2：个体至少HPV类型16、18、31、33、35、39、45、52、56、58、59、66或68之一的L1mRNA表达阳性且E6mRNA表达阳性。至少HPV类型16、18、31或33之一的E6mRNA表达阳性的患者例如与这些HPV类型表达阴性但至少HPV类型35、39、45、52、56、58、59、66或68之一的E6mRNA表达阳性的患者相比，可认定为处于高风险。
风险类型3：个体的癌相关HPV类型的L1mRNA表达阳性但E6mRNA表达阴性(如HPV类型16、18、31、33、35、39、45、52、56、58、59、66和68的E6mRNA表达阴性)。
风险类型4：个体L1mRNA表达阴性且E6mRNA表达阴性。
在优选实施方案中，每ml(或样品总体积)中存在超过50个拷贝的转录物表示阳性表达，每ml(或样品总体积)中存在少于1个拷贝的转录物表示阴性表达。
上述分类法基于与发生宫颈癌的风险有关的分子事件，而与个体的CIN状况无关。因此，此分类法可提供细胞学方法之外的另一方法，以对妇女进行常规检查，鉴别处于发生宫颈癌潜在风险的妇女。该方法也可用作细胞学方法的辅助方法，例如作为确证试验以确定基于细胞学方法作出的风险评价。
HPV类型16、18、31或33之一的高风险E6mRNA表达阳性但L1表达阴性的妇女发生严重细胞变化和细胞异常的风险水平很高。这是由于L1mRNA表达的阴性结果直接表明存在整合型HPV，因此也表明E6和E7的高水平和恒定表达的可能性更高。HPV病毒在人基因组中的整合对细胞的稳定性也有直接影响。HPV的整合还降低细胞变化恢复的可能性。
HPV类型16、18、31或33之一的E6mRNA表达阳性且L1mRNA表达阳性的妇女其HPV表达的“风险高”，HPV仍有可能被整合。但是，这些妇女的风险不分类得象L1阴性和E6阳性的妇女的风险那样高，因为有理由证明她们可能没有整合型HPV。
HPV类型16、18、31或33之一的E6mRNA表达阴性但另一HPV类型如类型35、39、45、52、56、58、59、66和68的E6mRNA表达阳性的妇女仍可认定是“有风险”，因此取决于她们的L1mRNA表达是阳性还是阴性，可将她们归入风险类型1或2(如上定义)。
对L1mRNA阳性但E6mRNA阴性的妇女评定为有中等风险。在样品中可能存在高风险HPV类型，L1表达则表明了裂解活性。也可能存在整合型HPV类型，但只有不常见的病毒类型整合。但是，裂解活性检测可表明细胞将很快发生某些变化。
在子宫颈检查更为广泛的情况下，本发明方法可用以根据发生宫颈癌的风险对妇女进行分类，从而为作出有关治疗和/或进一步检查的决定提供基础。举例说明：风险类型1的妇女、尤其是至少HPV类型16、18、31或33之一的E6mRNA表达阳性的妇女可鉴定为需要接受“立即行动”，即进行锥形切除术或阴道镜检查，包括活检组织检查和组织学检查。
如上定义的风险类型2的妇女可评定为需要立即关注，即只需要阴道镜检查或阴道镜检查及包括活检组织检查和组织学检查。
如上定义的风险类型3的妇女可评定为需要立即进行再检测，即立即或在相对较短的时间间隔之后(如6个月)召回进行进一步的HPV表达检测。
如上定义的风险类型4的妇女可返回检查计划，在较长的时间之后再进行HPV表达复检。
本发明又一个实施方案提供了检查人类个体中是否存在整合型HPV或修饰的游离型HPV基因组的体外方法，该方法包括检查个体中人乳头瘤病毒L1基因和E6基因的mRNA转录物的表达，其中L1mRNA表达阴性但E6mRNA表达阳性的个体评定为携带整合型HPV。
术语“整合型HPV”指整合到人基因组的HPV基因组。
术语“修饰的游离型HPV基因组”意指HPV基因组作为以游离体保留在人个体细胞中，也即没有整合到人基因组的HPV基因组，且其与相应的野生型HPV基因组相比携有修饰，所述修饰可导致E6和/或E7基因转录物的组成型表达或持续表达。“修饰”通常为缺失、游离体的多聚化或连环化、游离体的重排等，会影响E6/E7表达的调节。
如上所述，子宫颈细胞的L1mRNA表达的阴性结果和E6mRNA表达的阳性结果一起，表明存在整合型HPV基因组和修饰的游离型HPV基因组。因此，用本测试方法预测整合型HPV基因组或修饰的游离型HPV基因组存在的能力严格地取决于评价L1mRNA表达的阴性结果的能力。这需要一种灵敏度尽量高，而又能产生尽量少的假阴性结果的检测技术。在优选的实施方案中，这可通过使用灵敏的扩增和实时检测技术检查L1mRNA是否存在来实现。最优选的技术是使用分子信标探针的实时NASBA扩增技术，Leone等，NucleicAcids Research.，1998，Vol 26，2150-2155对此进行了描述。得益于此技术的灵敏度，假阴性结果的出现率减至最低，“阴性L1表达”的结果可以更高的置信度来评价。
在又一个实施方案中，检查人类个体是否存在整合型HPV或修饰的游离型HPV基因组的方法可基于只对E6mRNA的表达进行检查。因此，本发明涉及检查人类个体是否存在整合型HPV或修饰的游离型HPV基因组的体外方法，该方法包括检查个体的人乳头瘤病毒E6基因的mRNA转录物的表达，其中E6mRNA表达阳性的个体认定为携带整合型HPV或修饰的游离型HPV基因组。
此外，可只基于对E6mRNA的表达进行“开/关”确定，即可将各个体归类于发生宫颈癌的两类风险之一。因此，本发明提供了检查人类个体以评价她们发生宫颈癌的风险的体外方法，所述方法包括检查个体中HPV E6基因的mRNA转录物的表达并基于E6mRNA的表达将个体归类于发生宫颈癌的两类风险之一，其中E6mRNA表达阳性的个体认定为携带整合型HPV或修饰的游离型HPV基因组，因此归类为有发生宫颈癌的“高风险”，而E6mRNA表达阴性的个体认定为不携带整合型HPV或修饰的游离型HPV基因组，因此归类为发生宫颈癌“无可检测的风险”。
可基于对子宫颈细胞中E6mRNA的表达进行“开/关”确定，将个体归类于发生宫颈癌的两类风险之一。E6mRNA表达阳性的个体认定为携带整合型HPV或修饰的游离型HPV基因组，因此归类为有发生宫颈癌的“高风险”，而E6mRNA表达阴性的个体认定为不携带整合型HPV或修饰的游离型HPV基因组，因此归类为发生宫颈癌“无可检测的风险”。
在子宫颈检查的情况下，将个体分为发生宫颈癌“有高风险”或“无可检测的风险”这两类，可为作出有关治疗和/或进一步检查的决定提供基础。例如，归类于高风险类的个体可认定为需要立即进行进一步分析，如组织学阴道镜检查，而归类于无可检测的风险的个体可在三至五年后再参加检查计划。这些方法特别适用于评价已知感染HPV的个体(如HPV DNA检测阳性的个体)或先前通过细胞学方法或派普斯涂片显示子宫颈异常的个体发生宫颈癌的风险。根据E6mRNA表达归类于“无可检测的风险”一类的个体可能携有HPV DNA，但E6表达的阴性结果表明HPV与检测时癌基因的活性无关。
E6mRNA表达的阳性结果所表明的整合型HPV或修饰的游离型HPV基因组的存在本身就表明个体的子宫颈细胞发生异常。因此，本发明也涉及鉴定子宫颈细胞发生异常的人类个体的体外方法，该方法包括检查个体中HPV E6基因的mRNA转录物的表达，其中E6mRNA表达阳性的个体可鉴定为子宫颈细胞发生异常。
术语“子宫颈细胞异常”包括作为比低级子宫颈病变或低级鳞状上皮内病变更严重的疾病的特征的细胞变化，也包括作为与以下病变的严重性相当或更重的疾病特征的细胞变化：高级CIN(定义为转化细胞的瘤形成膨胀)、CIN(子宫颈上皮内瘤形成)III或高级鳞状上皮内瘤形成(HSIL)，包括具有多倍体DNA分布型的病变和平均DNA指数值提高、DNA-非整倍状态百分比及2.5c Exceeding Rates“恶性”CIN病变(Hanselaar等，1992，Anal Cell Pathol.，4：315-324；Rihet等，1996，J.Clin Pathol 49：892-896；和McDermott等，1997，Br.J.Obstet Gynaecol.104：623-625)。
子宫颈上皮内瘤形成(缩写“CIN”)也称子宫颈异常增生，是一种人乳头瘤病毒导致的宫颈癌症。根据其严重性，CIN可分为I、II和III类。其可认为是癌变前异常，但实际上不属于癌症。CIN I为严重性最轻的类型，通常能自发消失，但在少数情况下会发展为癌症。CIN II和CIN III为较为严重的类型，往往难以好转或随时间转移而恶化。此两类CIN可转变成癌症，但如能进行适当治疗，则基本上不会转变成癌症。
HPV已被鉴定为子宫颈细胞发生变化的诱因，而子宫颈细胞变化会导致发生宫颈癌。这些细胞变化与HPV病毒基因组的E6/E7蛋白的组成型表达或持续表达有关。因此，有可能作出以下结论，即可检出E6mRNA表达的个体，尤其是经过一段时间的评价表现出持续的E6表达的个体，其子宫颈已显示发生细胞变化。这些变化可能只在子宫颈的极少数细胞中发生，不能通过常规的细胞学方法检测出来。但采用用以检测E6mRNA的灵敏、特异而准确的方法，有可能在比采用常规细胞学检查方法可能得出结果时间更早的阶段鉴定子宫颈细胞显示发生变化的个体。这使得可以采用旨在预防宫颈癌发展的疗法进行早期干预。
由于HPV整合到人基因组或由于修饰的游离型HPV基因组中的“修饰”，病毒E6/E7癌基因转录的正常控制丧失(Durst等，1985，JGen Virol，66(Pt 7)：1515-1522；Pater和Pater，1985 Virology 145：313-318；Schwarz等，1985，Nature 314：111-114；Park等，1997，同上)。相反，在前恶性(premalignant)病变和HPV感染的正常上皮中乳突淋瘤病毒主要以“非修饰的”游离型形式存在，因此癌基因(E6/E7)转录可能不存在或被有效向下调节(Johnson等，1990，J Gen Virol，71(Pt 7)：1473-1479；Falcinelli等，1993，J Med Virol，40：261-265)。据观察，人乳头瘤病毒类型16DNA整合到人基因组导致细胞活性/基因组更加不稳定，而E6和E7mRNA稳定性却提高(Jeon和Lambert，1995，ProcNatl Acad Sci USA 92：1654-1658)。因此，通常见于宫颈癌但只偶见于CIN病变的HPV整合(Carmody等，1996，Mol Cell Probes，10：107-116)似乎是宫颈癌发展中的一个重要事件。
本发明方法检测子宫颈中的E6/E7病毒mRNA表达而不是DNA。子宫颈细胞中E6/E7病毒表达是对发生癌症的风险的更为准确的评估标准，而不是仅仅表明存在HPV病毒，此外，HPV病毒癌基因转录物的检测是癌症发生中病毒癌基因的直接参与的一个更为灵敏的标志(Rose等，1994，Gynecol Oncol，52：212-217；Rose等，1995，Gynecol Oncol，56：239-244)。通过扩增检测法检测E6/E7转录物是对尤其是存在ASCUS和CIN I、感染高风险HPV类型的个体的CIN发展及演化为宫颈癌进行风险评估的一个有用的诊断工具(Sotlar等，1998，Gynecol Oncol，69：114-121；Selinka等，1998，Lab Invest，78：9-18)。
HPV-16/18的E6/E7转录物的表达一律与HPV DNA的物理状态有关(Park等，1997，Gynecol Oncol，Vol：65(1)，121-9)。在大多数宫颈癌细胞中特定人乳头瘤病毒的E6和E7基因是从整合到宿主细胞染色体的病毒序列转录而来的(von Kleben Doeberitz等，1991，Proc NatlAcad Sci U S A.Vol：88(4)，1411-5)。已对一大系列的CIN病变的病毒负荷和整合进行过评估(Pietsaro等，2002，J Clin Microbiol，Vol：40(3)，886-91)。只有一个样品独独含有游离型HPV 16DNA，而此病变能自发回复。37个侵袭性宫颈癌样品中有17个先前通过对整个E1/E2进行PCR鉴定为含有完全整合型HPV 16基因组，这在16个病例中通过rliPCR得以确证。但有一个病例除显示出占主要地位的整合形式外，还显示低水平的游离型脱氧核糖核酸。在余下的20个先前分析显示游离型形式的癌样品中，使用rliPCR发现有14个样品含有整合形式，还有4个样品含有多聚(修饰的)游离型形式。因此，37个癌样品中共有31个(84％)显示整合型HPV 16基因组，而整合不存在的情况不能被检出(Kalantari等，2001，Diagn Mol Pathol，Vol：10(1)，46-54)。
基本上没有观察到不含整合型HPV或修饰的游离型HPV DNA的宫颈癌细胞(Kalantari等，2001；Pietsaro等，2002，同上)。另显示E6和E7可只从整合的或修饰的游离型HPV DNA转录而来(von KlebenDoeberitz等，1991，同上)。因此，本发明发明人猜测，对E6/E7表达的检测能提供有关整合型HPV或修饰的游离型HPV和高癌基因活性的直接指示，同时得出以下结论，即临床上只对E6(E6/E7)表达进行检测就足以鉴定有发生宫颈癌的“高风险”的个体。换句话说，如果在子宫颈样品中能检出E6/E7mRNA表达，这直接表明子宫颈细胞发生异常，且由于持续的HPV癌基因活性，存在很高的发生宫颈癌的风险。因此，在人类个体中检测出E6/E7mRNA表明该个体有很高的发生宫颈癌的风险，需要立即进行进一步的检查，如阴道镜检查。
如果个体未检出E6/E7 mRNA表达，她仍可能感染HPV。但是由于不存在整合现象和癌基因活性，HPV感染可自发缓解(Pietsaro等，2002，同上，他们观察到此现象)。
临床上，只依赖于对E6mRNA表达进行检查的方法的效果严格地取决于以以一定的置信度评价E6mRNA表达的阴性结果的能力。而这要求具有最大灵敏度、产生的假阴性结果又最少的检测技术。在一个优选的实施方案中，这通过使用灵敏的扩增和实时检测技术检查E6mRNA是否存在来实现。最优选的技术为使用分子信标探针的实时NASBA扩增技术，这在Leone等，Nucleic Acids Research.，1998，Vol 26，2150-2155中有描述。由于这个技术的灵敏度，假阴性结果的出现率减至最少，且“阴性E6表达”结果可以更高的置信度加以评价。如果测试需要用在临床检查情况下，这一点尤为重要。
在只基于检测E6mRNA的方法当中，优选至少检测HPV类型16、18、31、33和45，且在优选的实施方案中所进行的测试可只检测这些HPV类型。在超过87％的宫颈癌样品中已检出HPV类型16、18、31和33的DNA(Karlsen等，1996，J Clin Microbiol，34：2095-2100)。其他研究表明E6和E7几乎总存在于宫颈癌中，因为它们的表达可能是转化到恶性状态并维持该状态所必须的(Choo等，1987，J MedVirol 21：101-107；Durst等，1995，Cancer Genet Cytogenet，85：105-112)。与基于检测未受损害的基因组或L1基因序列的HPV检测系统相反，对从E6/E7区域表达得到的HPV mRNA进行检测可检出高于90％的患者直接有发生宫颈癌的风险。
临床上，基于检测E6mRNA的方法优选用于后筛选检查，即对先前诊断患有ASCUS、CIN I或湿疣的患者进行进一步的分析。该方法可用来从先前诊断患有ASCUS、CIN I或湿疣的患者中选出有发生宫颈癌高风险的患者。ASCUS、湿疣和CIN I的诊断结果可能或多或少会相同，因为不同的细胞学者和不同的细胞学部门之间的再现性很低。
Figure C0380538000161
(Int J.Gyn Path.12：186-192.1993)发现只有约1％的CIN I病例会演化成宫颈癌。因此，真正需要一个有效的方法来鉴定患有ASCUS、CIN I或湿疣且有很高的发生宫颈癌的风险的个体群。Karlsen等，1996进行的宫颈癌病例研究中有近87％的病例检出HPV类型16、18、31或33之一。如加上HPV 45，则发现近90％的宫颈癌样品与这五种HPV类型有关。因此，从
Figure C0380538000171
(Int J.Gyn Path.12：186-192.1993)提供的数据可计算出，超过99.9％的病例检测到ASCUS、CIN I或湿疣病变，为其被我们的HPV-Proofer试剂盒漏检。
本发明方法中，mRNA“阳性表达”意指高于情况的表达。没有严格要求对mRNA表达水平进行准确的定量确定，也没有严格要求对L1和E6mRNA的相对表达水平进行准确的测定。
在一些实施方案中，本发明方法可包括对mRNA表达的定量测定。在优选的实施方案中，为对“阳性表达”和“阴性表达”进行明确的区分，需要存在多于50个拷贝的相关mRNA(每ml样品或样品的每个总体积)才能确定为“阳性表达”，而“阴性表达”需要少于1个拷贝的相关mRNA(每ml样品或样品的每个总体积)才能确定。
本发明方法优选涉及采用能特异性检测癌症相关HPV类型，更优选“高风险”癌相关HPV类型的E6mRNA的技术对E6mRNA进行检查。在最优选的实施方案中，本发明方法涉及采用能检测HPV类型16、18、31和33，优选还有HPV 45的E6mRNA的技术对E6mRNA进行检查。最优选本发明方法能特异性检测至少HPV类型16、18、31和33、优选还有HPV 45之一的E6mRNA的表达，最优选能特异性检测这五种类型的E6mRNA的表达。但是，除类型16、18、31、33和45之外的类型(如类型35、39、45、52、56、58、59、66和68)的E6表达阳性的妇女可能仍有发生宫颈癌的风险。因此，本发明方法最优选除检查HPV类型16、18、31、33和45的E6mRNA外，还包括对上述HPV类型之一种或多种的E6mRNA表达进行检查。某些HPV类型表现出明显的地区/人口分布规律。因此，除对HPV类型16、18、31、33和45进行检查外，还可适当包括对测试人口/地区流行的HPV类型特异的引物。
为避免产生疑问，除非另有指定，本文所用术语“E6mRNA”包括所有天然存在的包含全部或部分E6开放阅读框的mRNA转录物，包括天然存在的剪接变体，并因此包括另外还含有全部或部分E7开放阅读框(确实是另外的开放阅读框)的mRNA转录物。术语“E6/E7mRNA”、“E6/E7转录物”等可与术语“E6mRNA”、“E6转录物”互用，同时还包括含有全部或部分E6开放阅读框(包括天然存在的剪接变体)的天然存在的mRNA转录物，以及含有全部或部分E7开放阅读框的转录物。术语“癌基因表达”除非另有指定，也指含有全部或部分E6开放阅读框(包括天然存在的剪接变体)的天然存在的mRNA转录物，以及含有全部或部分E7开放阅读框的转录物。
至今已证明在感染HPV 16的细胞中有四种E6/E7mRNA类型，即一种非剪接的E6转录物和三种剪接的转录物E6*I、E6*II和E6*III(Smotkin D等，J Virol.1989 Mar 63(3)：1441-7；Smotkin D，Wettstein FO.Proc Natl Acad Sci USA.1986 Jul 83(13)：4680-4；DoorbarJ.等，Virology.1990 Sep 178(1)：254-62；Cornelissen MT等，J Gen Virol.1990 May 71(Pt 5)：1243-6；Johnson MA等，J Gen Virol.1990 Jul 71(Pt7)：1473-9；Schneider-Maunoury S等，J Virol.1987 Oct 61(10)：3295-8；Sherman L等，Int J Cancer.1992 Feb 50(3)：356-64)。所有四种转录物都从例如位于E6 ORF的第二个ATG上游的单一启动子(p97)转录获得。
本发明方法的一个实施方案可包括检查含有全部或部分E7开放阅读框的E6转录物。这可例如通过使用对E7编码区特异的引物和探针来实现。
在另一个实施方案中，本发明方法可包括检查是否存在“全长”E6转录物。在HPV 16的情况下术语“全长E6转录物”指含有E6ORF中核苷酸(nt)97至nt880(包括nt97和nt880)区域全部的转录物。核苷酸位置按标准HPV命名法进行编码(参看Human PapillomavirusCompendium Online，可通过因特网获取，或通过HV数据库获取纸本文件：HV Database，Mail Stop K710，Los Almos National Laboratory，Los Almos，NM 87545，USA)。对全长E6转录物的特异性检测可例如通过使用对只出现于全长E6转录物而不出现于剪接变体的区域特异的引物或探针来实现。不同的HPV类型表现出不同的E6/E7mRNA表达型式。可用以辅助设计用于检测E6/E7转录物的探针或引物的各种HPV类型(包括HPV类型16和31)的转录物图可通过HumanPapillomavirus Compendium公开获得(见上)。
本文描述的E6寡核苷酸引物适用于通过NASBA或PCR对各种HPV类型的E6mRNA的各区域进行扩增。
在优选的实施方案中，涉及检查L1 mRNA表达的方法可包括使用能检测几乎所有已知HPV类型或至少主要的癌相关HPV类型(如优选HPV类型16、18、31和33全部)的L1mRNA的技术检查L1mRNA的表达。本文描述的L1引物和探针能检测子宫颈样品中HPV类型6、11、16、18、31、33、35和51的L1mRNA。
检测L1转录物可以说就是检测HPV的“毒力”，即检测HPV裂解活性的存在。检测E6/E7转录物可以说就是检测HPV的“发病机理”，因为这些mRNA的表达能说明与发生宫颈癌的风险相关的分子事件。
在对4589名妇女的研究中，采用基于检查E6和L1mRNA表达的方法，能检测到只有一例例外的CIN III病变或癌症病例(参看附带的实施例)。
在进一步的实施方案中，本发明上述方法除包括检查HPV L1和/或E6转录物的表达外，还包括检查人p16ink4a基因的mRNA转录物的表达。
p16ink4amRNA表达的阳性结果可作为发生宫颈癌风险的又一指标。
p16ink4a及相关家族成员起到调节视网膜母细胞瘤基因产物(RB)的磷酸化和生长抑制活性的作用。作为支持这一观点的证据，已发现在经选择的癌细胞系中p16ink4a蛋白的表达和正常RB之间存在相反的关系；RB变异、缺失或失活时可检出p16ink4a蛋白，而在含正常RB的细胞系中，p16ink4a明显减少或不存在。Kheif等(Kheif SN等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：4350-4354.1996)发现p16ink4a蛋白在含变异RB或被E7功能性地失活的野生型RB的人宫颈癌细胞中表达。他们还表示，RB的失活与p16ink4a的向上调节有关，证实了存在涉及p16ink4a和RB的反馈回路。Milde-Langosch等(Milde-Langosch K等，(2001)Virchows Arch 439：55-61)发现p16强表达和HPV 16/18感染之间以及p16强表达和HPV 16/18E6/E7癌基因表达之间有明显的相关性。Klaes等(Klaes R等，(2001)Int J Cancer 92：276-284)观察到152例高级子宫颈异常增生病变(从CIN II到侵袭性癌症)中有150例的p16ink4a基因产物存在强过量表达，而正常子宫颈上皮或炎症或组织转化病变用p16ink4a特异性单克隆抗体E6H4不能染色。所有与LR-HPV类型有关的认定为CIN I的病变都没显示反应性或只显示病灶性的或零星的反应性，而LR-HPV类型有关的认定为CIN I的病变中除两例外其余全部显示对p16ink4a的强而扩散性染色现象。
本文公开的检查方法可在从临床样品中分离得到的核酸制品上进行，或在含采自受试对象的子宫颈细胞的活检组织上进行。可用作核酸来源的合适样品包括(但不限于)子宫颈拭样、子宫颈活检组织、子宫颈刮样、皮肤活检组织/疣，以及石蜡包埋的组织和福尔马林或甲醇固定的细胞。
用本文公开的方法进行检查的核酸制品必须包含mRNA，该制品不需要是纯化的polyA+mRNA制品和总RNA制品或含RNA和基因组DNA的总核酸粗制品，甚至粗细胞裂解物也都可适用作NASBA反应的原料。基本上本领域公知的任何分离核酸(包括mRNA)制品的技术都可用于分离测试样品中的核酸。优选的技术是US-A-5,234,809和EP-B-0389-063中描述的“Boom”分离方法。该方法可用以分离包含RNA和DNA的核酸制品，其根据是在离液剂硫氰酸胍(GuSCN)存在下二氧化硅颗粒吸附核酸的性质。
本发明方法基于对子宫颈细胞中HPV基因组的活性转录的评价。本发明方法并不限制使用用以检测mRNA表达的精确技术。许多检测特定mRNA序列的技术为本领域所公知，可根据本发明加以采用。例如，特定mRNA可通过杂交、扩增或测序技术进行检测。
最优选通过扩增技术检测mRNA表达，所述扩增技术最优选等温扩增，如NASBA、转录介导扩增、RNA技术中的信号介导扩增、等温溶液相扩增等。所有这些方法均为本领域所公知。更优选mRNA表达能通过等温扩增并结合对扩增产物的实时检测来检测。最优选的结合方式是通过NASBA进行扩增，同时用分子信标技术对扩增产物进行实时检测，这在Leone等，Nucleic Acids Research，1998，Vol 26，2150-2155中有描述。
使用NASBA技术对测试样品中的HPV进行检测的方法通常包括以下步骤：
(a)配制反应介质，所述介质包括合适的引物对、RNA定向性DNA聚合酶、水解RNA-DNA杂交体的RNA链但不水解单链或双链RNA或DNA的核糖核酸酶、能识别所述启动子的RNA聚合酶，以及核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸。
(b)在能进行NASBA扩增反应的反应条件下，将反应介质与从怀疑含HPV的测试样品中分离的核酸制品一起温育。
(c)检测和/或定量测量NASBA扩增反应的任何HPV特异性产物。
对NASBA反应的特异性产物(即目标RNA的正义和/或反义拷贝)的检测可通过多种不同方法进行。其中一个方法是，NASBA产物可通过使用能特异性退火到NASBA产物的HPV特异性杂交探针来检测。杂交探针可以连接到显示标记，如荧光化合物标记、发光化合物标记、放射性化合物标记、化学发光化合物标记或酶标记，或本领域普通技术人员公知的其它标记类型。标记本身不需要很精确，但其本身或其与一种或多种另外的物质(如酶底物)应能产生可通过外部手段检出的信号。
优选的检测方法是所谓的“实时NASBA”，该方法可连续监测NASBA反应过程中产物的形成。在优选的实施方案中，这可通过使用“分子信标”探针来实现，所述探针包括能退火到NASBA产物的HPV特异性序列、形成茎-双链体的寡核苷酸序列和一对荧光剂/猝灭剂部分，这对本领域来说是公知的，且在本文中已作描述。如果在扩增前将分子信标探针加入反应混合物中，则可对NASBA产物的形成进行实时监测(Leone等，Nucleic Acids Research，1998，Vol 26，2150-2155)。进行实时NASBA检测的试剂盒和仪器可通过商业途径获得(如Organon Teknika的NucliSensTM EasyQ System)。
另一方法是，分子信标技术可结合到引物2寡核苷酸，使得不需要独立的杂交探针就可对NASBA反应进行实时监测。
又一方法是，NASBA反应产物可使用能与引物2寡核苷酸的5′末端的核苷酸序列杂交的通用标记检测探针来监测。这相当于Organon Teknika提供的“NucliSensTM”检测系统。在此系统中，通过使用包括如本文所述连接到固体载体如磁微珠的探针寡核苷酸的HPV特异性捕捉探针，可获得对衍生于目标HPV mRNA的NASBA产物的特异性。最优选通用标记检测探针为Organon Teknika提供的ECLTM检测探针。NASBA扩增子与HPV特异性捕捉探针和通用ECL探针杂交(通过引物2上的互补序列)。杂交后微珠/扩增子/ECL探针复合物可在自动ECL阅读器(如Organon Teknika提供的NucliSensTM阅读器)的磁电极上被捕获。然后电压脉冲触发ECLTM反应。
HPV mRNA检测对宫颈癌之外的癌症(包括例如头颈部癌症、口腔和舌头癌症、皮肤癌、肛门和阴道癌)也有临床意义。HPV mRNA检测对身体下部的淋巴结微小转移的诊断也十分有用。因此，本发明还考虑了根据对HPV L1和E6转录物表达的检查而检查对上述癌症的易感性。
根据本发明的另一方面，提供了用于检测HPV的L1和E6基因转录物的试剂盒，该试剂盒包括至少一种适用于扩增至少HPV类型16、18、31和33、优选还有HPV 45的L1转录物的某个区域的引物对，以及一种或多种促使扩增HPV类型16、18、31和33，优选还有HPV 45的E6转录物的某个区域的引物对。
“引物对”意指通过使用任何已知的核酸技术可组合用于扩增L1或E6mRNA的特定区域的任何一对引物。在优选的实施方案中，试剂盒中所包括的引物对适用于NASBA扩增或类似的等温扩增技术。
构成试剂盒所包括的每个引物对的各引物可分开提供(如各引物由单独的容器提供)，或更优选可混合在一个容器中提供。两种或多种引物的组合可在试剂盒的单个容器中现成混合来提供。如果两种或多种扩增反应要“多重”，即在单个反应容器中同时进行，在单个容器中提供两种或多种引物对较为方便。
适用于扩增E6转录物的某个区域的引物对应能扩增至少主要的癌相关HPV类型16、18、31和33，优选还有HPV 45的E6mRNA的某个区域。有几种不同的方法可实现此目的。
在一个实施方案中，试剂盒可含有单独的对各HPV类型16、18、31和33，优选还有HPV 45特异的引物对。这些引物对可在试剂盒中的不同容器中提供，或在一个容器中作为两种或多种引物对的混合物来提供，例如以促使扩增反应多重化。
在另一个实施方案中，试剂盒可包含能扩增HPV 16、18、31和33，优选还有HPV 45的E6基因的某个区域的单个引物对，因此所述引物对可在单个扩增反应中扩增四种(优选五种)HPV类型。这可例如通过使用一对简并引物或通过选择对各HPV类型高度保守的E6mRNA的某个区域来实现。
E6引物对可对应于E6mRNA的任何区域，且可促使扩增全部或部分E6开放阅读框和/或E7开放阅读框。
所述试剂盒可进一步包括适用于扩增HPV类型16、18、31和33，优选还有HPV 45之外的HPV类型的E6mRNA的引物对。例如，所述试剂盒可附加有用以检测在特定地区或人口中地方性流行的HPV类型的E6引物。
适用于扩增L1转录物的某个区域的引物对应能扩增至少主要的癌相关HPV类型16、18、31和33，优选还有HPV 45的L1mRNA的某个区域，并优选适用于扩增基本上所有已知HPV类型的L1mRNA的某个区域。使用这样的引物，则有可能在单个扩增反应中检测多个HPV类型的L1mRNA的活性转录。
通过选择高度保守的L1转录物区域，有可能设计能检测多种HPV类型的L1转录物的引物。
在另一个方法中，对多种HPV类型的特异性可通过使用具有较小的序列变异、且变异优选对应于不同HPV基因型之间序列变异位点的简并寡核苷酸引物或多核苷酸复合混合物来实现。使用这样的简并引物或引物混合物的基本原理在于引物混合物含有至少一个能检测各HPV类型的引物对。
在又一个方法中，对多个HPV类型的特异性可通过优选在引物的不同HPV基因型之间的序列变异位点加入一个或多个肌苷来实现。
E6和L1引物对可在试剂盒中的不同容器中提供，或L1引物对可在单个容器中与一种或多种E6引物对混合提供。
试剂盒可进一步包含一种或多种适用于使用试剂盒所包含的引物对进行的扩增反应的产物进行检测的探针。所述探针可作为试剂盒中的单独试剂来提供。另外，所述探针也可作为与一种或多种引物对的混合物来提供。
试剂盒所包含的引物和探针优选单链DNA分子。也可使用保留与互补核酸分子进行碱基配对的能力的非天然的合成多核苷酸，包括添加了修饰碱基的合成寡核苷酸和其中各核苷酸之间的连接键包括除磷酸二酯键之外的键的合成寡核苷酸。引物和探针可按本领域公知的技术生产，如使用用以合成寡核苷酸的标准仪器和方案通过化学方法合成。
引物和探针通常为长度不大于100个碱基的分离单链多核苷酸，更通常为长度不大于55个碱基。为避免发生疑问，在此指出术语“引物”和“探针”不算天然存在的全长HPV基因组。
在试剂盒中可包括几种包含HPV特异型序列的普通类型的寡核苷酸引物和探针。通常，这样的引物和探针可包含另外的非HPV序列，例如扩增反应所需的序列或促进对扩增反应产物进行检测的序列。
第一类引物为引物1寡核苷酸体发明也称为NASBA P1引物)，这种寡核苷酸通常长度约为50个碱基，在与目标mRNA的某个区域互补的3′末端平均含有约20个碱基。适用作NASBA P1引物的寡核苷酸在表1中表示为“P1/PCR”。P1引物寡核苷酸的一般结构为X1-SEQ，其中SEQ表示HPV特异性序列，X1为包含能被特异性RNA聚合酶识别的启动子的序列。噬菌体启动子，如T7、T3和SP6启动子优选用于本发明寡核苷酸中，因为它们有转录水平高的好处，且转录只取决于合适的RNA聚合酶的结合情况。在优选的实施方案中，序列“X1”包括序列AATTCTAATACGACTCACTATAGGG或序列AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG。这些序列含有T7启动子，包括T7RNA聚合酶的转录启始位点。在表1中表示为“P1/PCR”的引物中的HPV特异性序列也适合用于标准PCR引物。当这些序列用作NASBA P1引物的基础时，它们如上所述具有X1-SEQ的一般结构。启动子序列X1在NASBA P1引物中是必需的。但是，当同样的序列用作标准PCR引物的基础时，没有必要包括X1。
第二种类型的引物为NASBA引物2寡核苷酸(在本文也称为NASBA P2引物)，其通常包含长约20个碱基、基本上与目标mRNA的某个区域等同的序列。表1中表示为“P2/PCR”的寡核苷酸序列适用于NASBA P2引物和标准PCR引物。
计划用作NASBA P2引物的寡核苷酸在特定的但非限制性的实施方案中可进一步包含与目标mRNA无关但能与通用检测探针杂交的5′末端核苷酸序列。检测探针可优选例如用荧光标记、发光标记或酶标记进行标记。在一个实施方案中，检测探针用容许使用ECLTM技术进行检测的标记进行标记，但应理解本发明并不限于这个特定的检测方法。在优选的实施方案中，引物2寡核苷酸的5′末端可包含序列GATGCAAGGTCGCATATGAG。这个序列能够与OrganonTeknika所售的通用ECLTM探针杂交，所述探针具有以下结构：
Ru(bpy)3 2+-GAT GCA AGG TCG CAT ATG AG-3’
在另一不同的实施方案中，引物2寡核苷酸可结合“分子信标”技术以允许对NASBA反应进行实时监测，所述技术为本领域所公知，且在例如WO 95/13399及Tyagi和Kramer，Nature Biotechnology.14：303-308，1996中有描述。
目标特异性探针寡核苷酸也可包括在试剂盒中。探针寡核苷酸通常包含长约20-25个碱基且与目标mRNA或其补体的某个区域基本等同的序列。适用作探针的示例性HPV特异性寡核苷酸序列在表1中表示为“PO”。探针寡核苷酸可用作目标特异性杂交探针，以检测NASBA或PCR反应的产物。就此而言探针寡核苷酸可与固体载体如顺磁珠相耦合形成捕捉探针(见下)。在优选的实施方案中，探针寡核苷酸的5′末端可用生物素标记。加入生物素标记可促使探针通过生物素/链霉亲和素或生物素/抗生物素蛋白连接结合到固体载体上。
能对扩增产物进行实时检测的目标特异性探针可采用“分子信标”技术，所述技术为本领域所公知且在例如Tyagi和Kramer，NatureBiotechnology.14：303-308，1996及WO 95/13399中有描述。适用作分子信标探针的示例性HPV特异性寡核苷酸序列在表1中表示为“MB”。
本文所用术语“分子信标探针”意指具有以下结构的分子：
X2-arm1-target-arm2-X3
其中“target”表示核苷酸的目标特异性序列，“X2”和“X3”分别表示荧光部分和猝灭剂部分，其中猝灭剂部分当与荧光部分紧靠在一起时能基本上或完全猝熄荧光部分的荧光，“arm1”和“arm2”表示能形成茎-双链体的互补序列。
优选的“arm1”和“arm2”序列的组合如下，但以下意在举例而不是限制本发明：
cgcatg-SEQ-catgcg
ccagct-SEQ-agctgg
cacgc-SEQ-gcgtg
cgatcg-SEQ-cgatcg
ccgtcg-SEQ-cgacgg
cggacc-SEQ-ggtccg
ccgaagg-SEQ-ccttcgg
cacgtcg-SEQ-cgacgtg
cgcagc-SEQ-gctgcg
ccaagc-SEQ-gcttgg
ccaagcg-SEQ-cgcttgg
cccagc-SEQ-gctggg
ccaaagc-SEQ-gctttgg
cctgc-SEQ-gcagg
ccaccc-SEQ-gggtgg
ccaagcc-SEQ-ggcttgg
ccagcg-SEQ-cgctgg
cgcatg-SEQ-catgcg
分子信标技术的应用使得可以对扩增反应例如NASBA扩增进行实时监测(参看Leone等，Nucleic Acids Research.，1998，vol：26，第2150-2155页)。分子信标探针通常包括位于HPV特异性序列之侧的互补序列，其在本文中用符号arm1和arm2表示，它们能相互杂交形成茎-双链体结构。arm1和arm2的精确序列对本发明并不重要，但要求当探针没有结合到目标HPV序列时这些序列必须能形成茎-双链体。
分子信标探针也包括荧光部分和猝灭剂部分，这两部分在本文用符号X2和X3表示。有关技术人员应可理解，要这样选择荧光部分和猝灭剂部分，使得当这两部分紧靠在一起时，如在无目标序列的情况下探针处于发夹“封闭”构象时，猝灭剂部分应能基本上或完全猝熄荧光部分的荧光。当结合到目标序列时，荧光部分和猝灭剂部分分开，这样荧光部分的荧光不再被猝熄。
可根据本发明使用的合适的配对猝灭剂/荧光剂部分的许多实例为本领域所公知(参看WO 95/13399，Tyaqi和Kramer，同上)。可使用有许多不同颜色的多种荧光团，包括例如5-(2′-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、荧光素、FAM和得克萨斯红(参看Tyaqi，Bratu和Kramer，1998，Nature Biotechnology，16，49-53。使用用不同颜色的荧光团标记的探针使得可在单个反应器中对两个或多个不同的探针进行“多重”检测。优选的猝灭剂为4-(4′-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)，这是一个非荧光发色团，可用作多种荧光团的“通用”猝灭剂。荧光部分和猝灭剂部分可以两种方向共价结合到探针，即荧光部分位于或靠近5′末端而猝灭剂部分位于或靠近3′末端，或与此相反。合成分子信标探针的方案为本领域所公知，题为“MolecularBeacons：Hybridization Probes for Detection of Nucleic Acids inHomogenous Solutions”(“分子信标：检测均匀溶液中的核酸的杂交探针”)的文章提供了详细的合成方案，该文章作者为Sanjay Tyagi等，Department of Molecular Genetics，Public Health Research Institute，455First Avenue，New York，NY 10016，USA，可通过PHRI网站(www.phri.nyu.edu或www.molecular beacons.org)从网上获取。
NASBA P1引物和NASBA P2引物的适当组合可用以驱动NASBA扩增反应。为驱动NASBA扩增反应，引物1寡核苷酸和引物2寡核苷酸必须能从mRNA的目标区域引导双链DNA的合成。为此，引物1寡核苷酸和引物2寡核苷酸必须包含分别与目标mRNA的正义链和反义链的区域互补的目标特异性序列。
在NASBA扩增循环的第一阶段，即所谓的“非循环”阶段，引物1寡核苷酸退火到目标mRNA的互补序列，而其3′末端通过RNA依赖性DNA聚合酶(如逆转录酶)的作用而延伸，完成第一链cDNA的合成。所得RNA:DNA杂交体的RNA链随后可例如通过RNA酶H的作用消化，以得到单链DNA。引物2寡核苷酸退火到此单链DNA近3′末端的互补序列，其3′末端(通过逆转录酶的作用)被延伸，形成双链DNA。然后RNA聚合酶可从双链DNA中的现具有转录活性的启动子序列转录多个RNA拷贝。此RNA转录物与原始目标mRNA反义，可作为下一轮NASBA反应的模板，其中引物2退火到RNA并引导第一cDNA链的合成，引物1引导第二cDNA链的合成。NASBA反应的一般原理为本领域所公知(参看Compton，J.Nature.350：91-92)。
本文所述目标特异性探针寡核苷酸也可结合到固体载体如磁微珠上并用作“捕捉探针”将NASBA扩增反应的产物(单链RNA)固定化。本文所述目标特异性“分子信标”探针可用以对NASBA反应进行实时监测。
本发明的试剂盒也可包括含已知HPV类型的E6和/或L1mRNA的阳性对照。合适的对照包括例如从感染已知HPV类型的细胞系(如HeLa、CaSki)制备的核酸提取物。
试剂盒还可进一步含有内部对照扩增引物，如对人U1A RNA特异的引物。
含适用于NASBA扩增的引物(任选含有探针)的试剂盒也可进一步包含NASBA反应所需的酶混合物，如含RNA定向DNA聚合酶(例如逆转录酶)、水解RNA-DNA杂交体的RNA链但不水解单链或双链RNA或DNA的核糖核酸酶(如RNA酶H)和RNA聚合酶的酶混合物。RNA聚合酶应能识别位于试剂盒所提供的NASBA P1引物的5′末端区域的启动子序列。试剂盒还可提供有含RNA和DNA合成所需的核苷和脱氧核苷的NASBA缓冲剂。标准NASBA反应缓冲剂的组成为本领域技术人员所熟知(参看Leone等，同上)。
表1：引入到NASBA/PCR引物和探针中的E6特异性序列
  SEQ ID   引物/探针类型   序列  HPV类型   nt
  1   P2/PCR   CCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTA   16   116
  2   P1/PCR   X<sub>1</sub>-ACGGTTTGTTGTATTGCTGTTC   16   368
  3   P2/PCR   CCACAGGAGCGACCCAGAAA   16   116
  4   P1/PCR   X<sub>1</sub>-GGTTTGTTGTATTGCTGTTC   16   368
  5   P1/PCR   X<sub>1</sub>-ATTCCCATCTCTATATACTA   16   258
  6   P1/PCR   X<sub>1</sub>-TCACGTCGCAGTAACTGT   16   208
  7   P1/PCR   X<sub>1</sub>-TTGCTTGCAGTACACACA   16   191
  8   P1/PCR   X<sub>1</sub>-TGCAGTACACACATTCTA   16   186
  9   P1/PCR   X<sub>1</sub>-GCAGTACACACATTCTAA   16   185
  10   P2/PCR   ACAGTTATGCACAGAGCT   16   142
  11   P2/PCR   ATATTAGAATGTGTGTAC   16   182
  12   P2/PCR   TTAGAATGTGTGTACTGC   16   185
  13   P2/PCR   GAATGTGTGTACTGCAAG   16   188
  SEQ ID   引物/探针类型   序列  HPV类型   nt
  14   PO   ACAGTTATGCACAGAGCT   16   142
  15   PO   ATATTAGAATGTGTGTAC   16   182
  16   PO   TTAGAATGTGTGTACTGC   16   185
  17   PO   GAATGTGTGTACTGCAAG   16   188
  18   PO   CTTTGCTTTTCGGGATTTATGC   16   235
  19   PO   TATGACTTTGCTTTTCGGGA   16   230
  20   MB   X<sub>2</sub>-arm<sub>1</sub>-TATGACTTTGCTTTTCGGGA-arm<sub>2</sub>-X<sub>3</sub>   16   230
  21   P2/PCR   CAGAGGAGGAGGATGAAATAGTA   16   656
  22   P1/PCR   X<sub>1</sub>-GCACAACCGAAGCGTAGAGTCACAC   16   741
  23   PO   TGGACAAGCAGAACCGGACAGAGC   16   687
  24   P2/PCR   CAGAGGAGGAGGATGAAATAGA   16   656
  25   P1/PCR   X<sub>1</sub>-GCACAACCGAAGCGTAGAGTCA   16   741
  26   PO   AGCAGAACCGGACAGAGCCCATTA   16   693
  27   P2/PCR   ACGATGAAATAGATGGAGTT   18   702
  28   P1/PCR   X<sub>1</sub>-CACGGACACACAAAGGACAG   18   869
  28   PO   AGCCGAACCACAACGTCACA   18   748
  30   P2/PCR   GAAAACGATGAAATAGATGGAG   18   698
  31   P1/PCR   X<sub>1</sub>-ACACCACGGACACACAAAGGACAG   18   869
  32   PO   GAACCACAACGTCACACAATG   18   752
  33   MB   X<sub>2</sub>-arm<sub>1</sub>-GAACCACAACGTCACACAATG-arm<sub>2</sub>-X<sub>3</sub>   18   752
  34   P2/PCR   TTCCGGTTGACCTTCTATGT   18   651
  35   P1/PCR   X<sub>1</sub>-GGTCGTCTGCTGAGCTTTCT   18   817
  36   P2/PCR   GCAAGACATAGAAATAACCTG   18   179
  37   P1/PCR   X<sub>1</sub>-ACCCAGTGTTAGTTAGTT   18   379
  38   PO   TGCAAGACAGTATTGGAACT   18   207
  39   P2/PCR   GGAAATACCCTACGATGAAC   31   164
  40   P1/PCR   X<sub>1</sub>-GGACACAACGGTCTTTGACA   31   423
  41   PO   ATAGGGACGACACACCACACGGAG   31   268
  42   P2/PCR   GGAAATACCCTACGATGAACTA   31   164
  43   P1/PCR   X<sub>1</sub>-CTGGACACAACGGTCTTTGACA   31   423
  44   PO   TAGGGACGACACACCACACGGA   31   269
  45   P2/PCR   ACTGACCTCCACTGTTATGA   31   617
  46   P1/PCR   X<sub>1</sub>-TATCTACTTGTGTGCTCTGT   31   766
  47   PO   GACAAGCAGAACCGGACACATC   31   687
  48   P2/PCR   TGACCTCCACTGTTATGAGCAATT   31   619
  49   P1/PCR   X<sub>1</sub>-TGCGAATATCTACTTGTGTGCTCT GT   31   766
  50   PO   GGACAAGCAGAACCGGACACATCCAA   31   686
  51   MB   X<sub>2</sub>-arm<sub>1</sub>-GGACAAGCAGAACCGGACACATCCAA-arm<sub>2</sub>-X<sub>3</sub>   31   686
  52   P2/PCR   ACTGACCTCCACTGTTAT   31   617
  53   P1/PCR   X<sub>1</sub>-CACGATTCCAAATGAGCCCAT   31   809
  54   P2/PCR   TATCCTGAACCAACTGACCTAT   33   618
  55   P1/PCR   X<sub>1</sub>-TTGACACATAAACGAACTG   33   763
  56   PO   CAGATGGACAAGCACAACC   33   694
  57   P2/PCR   TCCTGAACCAACTGACCTAT   33   620
  58   P1/PCR   X<sub>1</sub>-CCCATAAGTAGTTGCTGTAT   33   807
  59   PO   GGACAAGCACAACCAGCCACAGC   33   699
  60   MB   X<sub>2</sub>-arm<sub>1</sub>-GGACAAGCACAACCAGCCACAGC-arm<sub>2</sub>-X<sub>3</sub>   33   699
  SEQ ID  引物/探针类型   序列  HPV类型   nt
  61   P2/PCR   GACCTTTGTGTCCTCAAGAA   33   431
  62   P1/PCR   X<sub>1</sub>-AGGTCAGTTGGTTCAGGATA   33   618
  63   PO   AGAAACTGCACTGTGACGTGT   33   543
  64   P2/PCR   ATTACAGCGGAGTGAGGTAT   35   217
  65   P1/PCR   X<sub>1</sub>-GTCTTTGCTTTTCAACTGGA   35   442
  66   PO   ATAGAGAAGGCCAGCCATAT   35   270
  67   P2/PCR   TCAGAGGAGGAGGAAGATACTA   35   655
  68   P1/PCR   X<sub>1</sub>-GATTATGCTCTCTGTGAACA   35   844
  69   P2/PCR   CCCGAGGCAACTGACCTATA   35   610
  70   P1/PCR   X<sub>1</sub>-GTCAATGTGTGTGCTCTGTA   35   770
  71   PO   GACAAGCAAAACCAGACACCTCCAA   35   692
  72   PO   GACAAGCAAAACCAGACACC   35   692
  73   P2/PCR   TTGTGTGAGGTGCTGGAAGAAT   52   144
  74   P1/PCR   X<sub>1</sub>-CCCTCTCTTCTAATGTTT   52   358
  75   PO   GTGCCTACGCTTTTTATCTA   52   296
  76   P2/PCR   GTGCCTACGCTTTTTATCTA   52   296
  77   P1/PCR   X<sub>1</sub>-GGGGTCTCCAACACTCTGAACA   52   507
  78   PO   TGCAAACAAGCGATTTCA   52   461
  79   P2/PCR   TCAGGCGTTGGAGACATC   58   157
  80   P1/PCR   X<sub>1</sub>-AGCAATCGTAAGCACACT   58   301
  81   P2/PCR   TCTGTGCATGAAATCGAA   58   173
  82   P1/PCR   X<sub>1</sub>-AGCACACTTTACATACTG   58   291
  83   PO   TGAAATGCGTTGAATGCA   58   192
  84   PO   TTGCAGCGATCTGAGGTATATG   58   218
  85   P2/PCR   TACACTGCTGGACAACAT   B(11)   514
  86   P1/PCR   X<sub>1</sub>-TCATCTTCTGAGCTGTCT   B(11)   619
  87   P2/PCR   TACACTGCTGGACAACATGCA   B(11)   514
  88   P1/PCR   X<sub>1</sub>-GTCACATCCACAGCAACAGGTCA   B (11)   693
  89   PO   GTAGGGTTACATTGCTATGA   B(11)   590
  90   PO   GTAGGGTTACATTGCTATGAGC   B(11)   590
  91   P2/PCR   TGACCTGTTGCTGTGGATGTGA   B(11)   693
  92   P1/PCR   X<sub>1</sub>-TACCTGAATCGTCCGCCAT   B(11)   832
  93   PO   ATWGTGTGTCCCATCTGC   B(11)   794
  94   P2/PCR   CATGCCATAAATGTATAGA   C(1839 45)   295
  95   P1/PCR   X<sub>1</sub>-CACCGCAGGCACCTTATTAA   C(1839 45   408
  96   PO   AGAATTAGAGAATTAAGA   C(1839 45   324
  97   P2/PCR   GCAGACGACCACTACAGCAAA   39   210
  98   P1/PCR   X<sub>1</sub>-ACACCGAGTCCGAGTAATA   39   344
  99   PO   ATAGGGACGGGGAACCACT   39   273
  100   P2/PCR   TATTACTCGGACTCGGTGT   39   344
  101   P1/PCR   X<sub>1</sub>-CTTGGGTTTCTCTTCGTGTTA   39   558
  102   PO   GGACCACAAAACGGGAGGAC   39   531
  103   P2/PCR   GAAATAGATGAACCCGACCA   39   703
  104   P1/PCR   X<sub>1</sub>-GCACACCACGGACACACAAA   39   886
  105   PO   TAGCCAGACGGGATGAACCACAGC   39   749
  106   P2/PCR   AACCATTGAACCCAGCAGAAA   45   430
  SEQ ID   引物/探针类型   序列   HPV类型   nt
  107   P1/PCR   X<sub>1</sub>-TCTTTCTTGCCGTGCCTGGTCA   45   527
  108   PO   GTACCGAGGGCAGTGTAATA   45   500
  109   P2/PCR   AACCATTGAACCCAGCAGAAA   45   430
  110   P1/PCR   X<sub>1</sub>-TCTTTCTTGCCGTGCCTGGTCA   45   527
  111   P2/PCR   GAAACCATTGAACCCAGCAGAAAA   45   428
  112   P1/PCR   X<sub>1</sub>-TTGCTATACTTGTGTTTCCCTACG   45   558
  113   PO   GTACCGAGGGCAGTGTAATA   45   500
  114   PO   GGACAAACGAAGATTTCACA   45   467
  115   P2/PCR   GTTGACCTGTTGTGTTACCAGCAAT   45   656
  116   P1/PCR   X<sub>1</sub>-CACCACGGACACACAAAGGACAAG   45   868
  117   P2/PCR   CTGTTGACCTGTTGTGTTACGA   45   654
  118   P1/PCR   X<sub>1</sub>-CCACGACACACACAAAGGACAAG   45   868
  119   P2/PCR   GTTGACCTGTTGTGTTACGA   45   656
  120   P1/PCR   X<sub>1</sub>-ACGGACACACAAAAGGACAAG   45   868
  121   PO   GAGTCAGAGGAGGAAAACGATG   45   686
  122   PO   AGGAAAACGATGAAGCAGATGGAGT   45   696
  123   PO   ACAACTACCAGCCCGACGAGCCGAA   45   730
  124   P2/PCR   GGAGGAGGATGAAGTAGATA   51   658
  125   P1/PCR   X<sub>1</sub>-GCCCATTAACATCTGCTGTA   51   807
  126   P2/PCR   AGAGGAGGAGGATGAAGTAGATA   51   655
  127   P1/PCR   X<sub>1</sub>-ACGGGCAAACCAGGCTTAGT   51   829
  128   PO   GCAGGTGTTCAAGTGTAGTA   51   747
  129   PO   TGGCAGTGGAAAGCAGTGGAGACA   51   771
  130   P2/PCR   TTGGGGTGCTGGAGACAAACATCT   56   519
  131   P1/PCR   X<sub>1</sub>-TTCATCCTCATCCTCATCCTCTGA   56   665
  132   P2/PCR   TGGGGTGCTGGAGACAAACATC   56   520
  133   P1/PCR   X<sub>1</sub>-CATCCTCATCCTCATCCTCTGA   56   665
  134   P2/PCR   TTGGGGTGCTGGAGACAAACAT   56   519
  135   P1/PCR   X<sub>1</sub>-CCACAAACTTACACTCACAACA   56   764
  136   PO   AAAGTACCAACGCTGCAAGACGT   56   581
  137   PO   AGAACTAACACCTCAAACAGAAAT   56   610
  138   PO   AGTACCAACGCTGCAAGACGTT   56   583
  139   P1/PCR   X<sub>1</sub>-TTGGACAGCTCAGAGGATGAGG   56   656
  140   P2/PCR   GATTTTCCTTATGCAGTGTG   56   279
  141   P1/PCR   X<sub>1</sub>-GACATCTGTAGCACCTTATT   56   410
  142   PO   GACTATTCAGTGTATGGAGC   56   348
  143   PO   CAACTGAYCTMYACTGTTATGA   A (1631 35)
  144   MB   X<sub>2</sub>-arm<sub>1</sub>-CAACTGAYCTMYACTGTTATGA-arm<sub>2</sub>-X<sub>3</sub>   A(1631 35)
  145   PO   GAAMCAACTGACCTAYWCTGCTAT   A(3352 58)
  146   MB   X<sub>2</sub>-arm<sub>1</sub>-GAAMCAACTGACCTAYWCTGCTAT-arm<sub>2</sub>-X<sub>3</sub>   A(3352 58)
  147   PO   AAGACATTATTCAGACTC   C(1845 39)
  148   MB   X<sub>2</sub>-arm<sub>1</sub>-AAGACATTATTCAGACTC-arm<sub>2</sub>-X<sub>3</sub>   C(1845 39)
表2：引入到NASBA/PCR引物和探针中的L1特异性序列
SEQ ID   引物/探针类型   序列
  149   P2/PCR   AATGGCATTTGTTGGGGTAA
  150   P1/PCR   X<sub>1</sub>-TCATATTCCTCCCCATGTC
  151   PO   TTGTTACTGTTGTTGATACTAC
  152   P2/PCR   AATGGCATTTGTTGGSRHAA
  153   P1/PCR   X<sub>1</sub>-TCATATTCCTCMMCATGDC
  154   PO   TTGTTACTGTTGTTGATACYAC
  155   PO   TTGTTACTGTTGTTGATACCAC
  156   P2/PCR   AATGGCATTTGTTGGSIIAA
  157   P2/PCR   AATGGCATTTTGTTGGIIHAA
  158   P2/PCR   AATGGCATTTGTTGGIRIAA
  159   P2/PCR   AATGGCATTTGTTGGGGTAA
  160   P2/PCR   AATGGCATTTGTTGGGGAAA
  161   P2/PCR   AATGGCATTTGTTGGCATAA
  162   P2/PCR   AATGGCATTTGTTGGGGCAA
  163   P2/PCR   AATGGCATTTGTTGGCACAA
  164   P1/PCR   X<sub>1</sub>-TCATATTCCTCMICATGIC
  165   P1/PCR   X<sub>1</sub>-TCATATTCCTCAACATGIC
  166   P1/PCR   X<sub>1</sub>-TCATATTCCTCIICATGTC
  167   P1/PCR   X<sub>1</sub>-TCATATTCCTCIICATGGC
  168   P1/PCR   X<sub>1</sub>-TCATATTCCTCIICATGAC 3’
  169   P1/PCR   X<sub>1</sub>-TCATATTCCTCIICATGCC 3’
适用于通过NASBA检测HPV L1和E6 mRNA的优选引物在以下各表中列出。但是，这些引物只是用以举例说明，并不代表本发明的范围应限于这些特定的引物分子。
在以下各表中NASBA P2引物(p2)包括位于5′末端的序列GATGCAAGGTCGCATATGAG；NASBA P1引物(p1)包括位于5′末端的序列AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG。适用作探针的寡核苷酸用符号“po”表示。P2引物通常含有来自正链的HPV序列，而P1引物通常含有来自负链的HPV序列。nt指相应HPV基因组序列中核苷酸的位置。
表3-优选的E6 NASBA引物和探针
  引物名称   序列   HPV类型   nt
  HAe6701p2   GATGCAAGGTCGCATATGAGCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTA   16   116
  HAe6701p1   AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGACGGTTTGTTGTATTGCTGTTC   16   368
  HAe6702p2   GATGCAAGGTCGCATATGAGCCACAGGAGCGACCCAGAAA   16   116
  HAe6702p1   AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGGTTTGTTGTATTGCTGTTC   16   368
  HPV16p1   AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGATTCCCATCTCTATATACTA   16   258
  HAe6702Ap1   AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCACGTCGCAGTAACTGT   16   208
  HAe6702Bp1   AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTTGCTTGCAGTACACACA   16   191
  HAe6702Cp1   AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTGCAGTACACACATTCTA   16   186
  HAe6702Dp1   AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCAGTACACACATTCTAA   16   185
  H16e6702Ap2   GATGCAAGGTCGCATATGAGACAGTTATGCACAGAGCT   16   142
  H16e6702Bp2   GATGCAAGGTCGCATATGAGATATTAGAATGTGTGTAC   16   182
  H16e6702Cp2   GATGCAAGGTCGCATATGAGTTAGAATGTGTGTACTGC   16   185
  H16e6702Dp2   GATGCAAGGTCGCATATGAGGAATGTGTGTACTGCAAG   16   188
  H16e6702Apo   ACAGTTATGCACAGAGCT   16   142
  H16e6702Bpo   ATATTAGAATGTGTGTAC   16   182
  H16e6702Cpo   TTAGAATGTGTGTACTGC   16   185
  引物名称   序列  HPV类型   nt
  H16e6702Dpo   GAATGTGTGTACTGCAAG   16   188
  HAe6701po   CTTTGCTTTTCGGGATTTATGC   16   235
  HAe6702po   TATGACTTTGCTTTTCGGGA   16   230
  HAe6702mb1   X<sub>2</sub>-cgcatgTATGACTTTGCTTTTCGGGAcatgcg-X<sub>3</sub>   16   230
  HAe6702mb2   X<sub>2</sub>-ccagctTATGACTTTGCTTTTCGGGAagctgg-X<sub>3</sub>   16   230
  HAe6702mb3   X<sub>2</sub>-cacgcTATGACTTTGCTTTTCGGGAgcgtg-X<sub>3</sub>   16   230
  H16e6702mb4   X<sub>2</sub>-cgatcgTATGACTTTGCTTTTCGGGAcgatcg-X<sub>3</sub>   16   230
  HAe6703p2   GATGCAAGGTCGCATATGAGCAGAGGAGGAGGATGAAATAGTA   16   656
  HAe6703p1   AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCACAACCGAAGCGTAGAGTCACAC   16   741
  HAe6703po   TGGACAAGCAGAACCGGACAGAGC   16   687
  HAe6704p2   GATGCAAGGTCGCATATGAGCAGAGGAGGAGGATGAAATAGA   16   656
  HAe6704p1   AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCACAACCGAAGCGTAGAGTCA   16   741
  HAe6704po   AGCAGAACCGGACAGAGCCCATTA   16   693
  H18e6701p2   GATGCAAGGTCGCATATGAGACGATGAAATAGATGGAGTT   18   702
  H18e6701p1   AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCACGGACACACAAAGGACAG   18   869
  H18e6701po   AGCCGAACCACAACGTCACA   18   748
  H18e6702p2   GATGCAAGGTCGCATATGAGGAAAACGATGAAATAGATGGAG   18   698
  H18e6702p1   AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGACACCACGGACACACAAAGGACAG   18   869
  H18e6702po   GAACCACAACGTCACACAATG   18   752
  H18e6702mb1   X<sub>2</sub>-cgcatgGAACCACAACGTCACACAATGcatgcg-X<sub>3</sub>   18   752
  H18e6702mb2   X<sub>2</sub>-ccgtcgGAACCACAACGTCACACAATGcgacgg-X<sub>3</sub>   18   752
  H18e6702mb3   X<sub>2</sub>-cggaccGAACCACAACGTCACACAATGggtccg-X<sub>3</sub>   18   752
  H18e6702mb4   X<sub>2</sub>-cgatcgGAACCACAACGTCACACAATGcgatcg-X<sub>3</sub>   18   752
  H18e6703p2   GATGCAAGGTCGCATATGAGTTCCGGTTGACCTTCTATGT   18   651
  H18e6703p1   AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGGTCGTCTGCTGAGCTTTCT   18   817
  H18e6704p2   GATGCAAGGTCGCATATGAGGCAAGACATAGAAATAACCTG   18   179
  H18e6704p1   AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGACCCAGTGTTAGTTAGTT   18   379
  H18e6704po   TGCAAGACAGTATTGGAACT   18   207
  H31e6701p2   GATGCAAGGTCGCATATGAGGGAATACCCTACGATGAAC   31   164
Figure C0380538000371
Figure C0380538000381
  引物名称   序列   HPV类型   nt
  TCTGAGCTGTCT
  HBe6702p2   GATGCAAGGTCGCATATGAGTACACTGCTGGACAACATGCA   B(11)   514
  HBe6702p1   AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGTCACATCCACAGCAACAGGTCA   B(11)   693
  HBe6701po   GTAGGGTTACATTGCTATGA   B(11)   590
  HBe6702po   GTAGGGTTACATTGCTATGAGC   B(11)   590
  HBe6703p2   GATGCAAGGTCGCATATGAGTGACCTGTTGCTGTGGATGTGA   B(11)   693
  HBe6703p1   AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTACCTGAATCGTCCGCCAT   B(11)   832
  HBe6703po   ATWGTGTGTCCCATCTGC   B(11)   794
  HCe6701p2   GATGCAAGGTCGCATATGAGCATGCCATAAATGTATAGA   C(1839 45)   295
  HCe6701p1   AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCACCGCAGGCACCTTATTAA   C (1839 45   408
  HCe6701po   AGAATTAGAGAATTAAGA   C(1839 45   324
  H39e6701p2   GATGCAAGGTCGCATATGAGGCAGACGACCACTACAGCAAA   39   210
  H39e6701p1   AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGACACCGAGTCCGAGTAATA   39   344
  H39e6701po   ATAGGGACGGGGAACCACT   39   273
  H39e6702p2   GATGCAAGGTCGCATATGAGTATTACTCGGACTCGGTGT   39   344
  H39e6702p1   AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTTGGGTTTCTCTTCGTGTTA   39   558
  H39e6702po   GGACCACAAAACGGGAGGAC   39   531
  H39e6703p2   GATGCAAGGTCGCATATGAGGAAATAGATGAACCCGACCA   39   703
  H39e6703p1   AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCACACCACGGACACACAAA   39   886
  H39e6703po   TAGCCAGACGGGATGAACCACAGC   39   749
  HPV45p2   GATGCAAGGTCGCATATGAGAACCATTGAACCCAGCAGAAA   45   430
  HPV45p1   AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCTTTCTTGCCGTGCCTGGTCA   45   527
  HPV45po   GTACCGAGGGCAGTGTAATA   45   500
  H45e6701p2   GATGCAAGGTCGCATATGAGAACCATTGAACCCAGCAGAAA   45   430
  H45e6701p1   AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCTTTCTTGCCGTGCCTGGTCA   45   527
  H45e6702p2   GATGCAAGGTCGCATATGAGGAAACCATTGAACCCAGCAGAAAA   45   428
  H45e6702p1   AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTTGCTATACTTGTGTTTCCCTACG   45   558
  H45e6701po   GTACCGAGGGCAGTGTAATA   45   500
  H45e6702po   GGACAAACGAAGATTTCACA   45   467
Figure C0380538000401
  引物名称   序列   HPV类型   nt
  31 35)
  HPVApo1Amb1   X<sub>2</sub>-cgcatgCAACTGAYCTMYACTGTTATGAcatgcg-X<sub>3</sub>   A(1631 35)
  HPVApo1Amb2   X<sub>2</sub>-ccgtcgCAACTGAYCTMYACTGTTATGAcgacgg-X<sub>3</sub>   A(1631 35)
  HPVApo1Amb3   X<sub>2</sub>-ccacccCAACTGAYCTMYACTGTTATGAgggtgg-X<sub>3</sub>   A(1631 35)
  HPVApo1Amb4   X<sub>2</sub>-cgatcgCAACTGAYCTMYACTGTTATGAcgatcg-X<sub>3</sub>   A(1631 35)
  HPVAPO4A   GAAMCAACTGACCTAYWCTGCTAT   A(3352 58)
  HPVAPO4Amb1   X<sub>2</sub>-ccaagcGAAMCAACTGACCTAYWCTGCTATgcttgg-X<sub>3</sub>   A(3352 58)
  HPVAPO4Amb2   X<sub>2</sub>-ccaagccGAAMCAACTGACCTAYWCTGCTATggcttgg-X<sub>3</sub>   A(3352 58)
  HPVAPO4Amb3   X<sub>2</sub>-ccaagcgGAAMCAACTGACCTAYWCTGCTATcgcttgg-X<sub>3</sub>   A(3352 58)
  HPVAPO4Amb4   X<sub>2</sub>-ccagcgGAAMCAACTGACCTAYWCTGCTATcgctgg-X<sub>3</sub>   A(3352 58)
  HPVAPO4Amb5   X<sub>2</sub>-cgatcgGAAMCAACTGACCTAYWCTGCTATcgatcg-X<sub>3</sub>   A(3352 58)
  HPVCPO4   AAGACATTATTCAGACTC   C(1845 39)
  HPVCPO4Amb1   X<sub>2</sub>-ccaagcAAGACATTATTCAGACTCgcttgg-X<sub>3</sub>   C(1845 39)
  HPVCPO4Amb2   X<sub>2</sub>-cgcatgAAGACATTATTCAGACTCcat gcg-X<sub>3</sub>   C(1845 39)
  HPVCPO4Amb3   X<sub>2</sub>-cccagcAAGACATTATTCAGACTCgctggg-X<sub>3</sub>   C(1845 39)
  HPVCPO4Amb4   X<sub>2</sub>-cgatcgAAGACATTATTCAGACTCcgatcg-X<sub>3</sub>   C(1845 39)
具有相同前缀的P1和P2引物对(如HAe6701p1和HAe6701p2)要组合使用。但也可使用其它组合，以下概括了HPV类型16、18、31、33和45的组合。
适合用于扩增HPV 16E6mRNA的引物对如下：
HAe6701p2或HAe6702p2(两者nt 116)和HAe6701p1或HAe6702p1(两者nt 368)。
HAe6701p2或HAe6702p2(两者的nt为116)和HPV 16p1(nt 258)。
H16e6702Ap2(nt 142)、H16e6702Bp2(nt 182)、H16e6702Cp2(nt185)或H16e6702Dp2(nt 188)和HAe6701p1或HAe6702p1(两者nt368)。
HAe6701p2或HAe6702p2(两者nt 116)和HAe6702Ap1(nt 208)、HAe6702Bp1(nt 191)、HAe6702Cp1(nt 186)或HAe6702Dp1(nt 185)。这些组合适用于扩增所有E6剪接变体。
HAe6703p2或HAe6704p2(两者nt 656)和HAe6703p1或HAe6704p1(两者nt 741)。这些组合适用于扩增所有含E7编码区的转录物(至少至nt741)。
以下引物对优选用于扩增HPV 18E6mRNA：
H18e6701p2(nt 702)或H18e6702p2(nt 698)和H18e6701p1或H18e6702p1(两者nt 869)。
H18e6703p2(nt 651)和H18e6703p1(nt 817)。
H18e6704p2(nt 179)和H18e6704p1(nt 379)。
以下引物对优选用于扩增HPV 31E6mRNA：
H31e6701p2或H31e6702p2(两者nt 164)和H31e6701p1或H31e6702p1(两者nt 423)。
H31e6703p2(nt 617)、H31e6704p2(nt 619)或H31e6705p2(nt 617)和H31e6703p1(nt 766)、H31e6704p1(nt 766)或H31e6705p1(nt 809)。
以下引物对优选用于扩增HPV 33E6mRNA：
H33e6701p2(nt 618)或H33e6703p2(nt 620)和H33e6701p1(nt 763)或H33e6703p1(nt 807)。
H33e6702p2(nt 431)和H33e6702p1(nt 618)。
以下引物对优选用于扩增HPV 45：
HPV 45p2(nt 430)和HPV 45p1(nt 527)。
表4-E6PCR引物
  引物名称   序列  HPV类型   nt
  HAe6701PCR2   CCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTA   16   116
  HAe6701PCR1   ACGGTTTGTTGTATTGCTGTTC   16   368
  HAe6702PCR2   CCACAGGAGCGACCCAGAAA   16   116
  HAe6702PCR1   GGTTTGTTGTATTGCTGTTC   16   368
  HAe6703PCR2   CAGAGGAGGAGGATGAAATAGTA   16   656
  HAe6703PCR1   GCACAACCGAAGCGTAGAGTCACAC   16   741
  HAe6704PCR2   CAGAGGAGGAGGATGAATAGA   16   656
  HAe6704PCR1   GCACAACCGAAGCGTAGAGTCA   16   741
  H18e6701PCR2   ACGATGAAATAGATGGAGTT   18   702
  H18e6701PCR1   CACGGACACACAAAGGACAG   18   869
  H18e6702PCR2   GAAAACGATGAAATAGATGGAG   18   698
  H18e6702PCR1   ACACCACGGACACACAAAGGACAG   18   869
  H18e6703PCR2   TTCCGGTTGACCTTCTATGT   18   651
  H18e6703PCR1   GGTCGTCTGCTGAGCTTTCT   18   817
  H18e6704PCR2   GCAAGACATAGAAATAACCTG   18   179
  引物名称   序列   HPV类型   nt
  H18e6704PCR1   ACCCAGTGTTAGTTAGTT   18   379
  H31e6701PCR2   GGAAATACCCTACGATGAAC   31   164
  H31e6701PCR1   GGACACAACGGTCTTTGACA   31   423
  H31e6702PCR2   GGAAATACCCTACGATGAACTA   31   164
  H31e6702PCR1   CTGGACACAACGGTCTTTGACA   31   423
  H31e6703PCR2   ACTGACCTCCACTGTTATGA   31   617
  H31e6703PCR1   TATCTACTTGTGTGCTCTGT   31   766
  H31e6704PCR2   TGACCTCCACTGTTATGAGCAATT   31   619
  H31e6704PCR1   TGCGAATATCTACTTGTGTGCTCT GT   31   766
  H31e6705PCR2   ACTGACCTCCACTGTTAT   31   617
  H31e6705PCR1   CACGATTCCAAATGAGCCCAT   31   809
  H33e6701PCR2   TATCCTGAACCAACTGACCTAT   33   618
  H33e6701PCR1   TTGACACATAAACGAACTG   33   763
  H33e6703PCR2   TCCTGAACCAACTGACCTAT   33   620
  H33e6703PCR1   CCCATAAGTAGTTGCTGTAT   33   807
  H33e6702PCR2   GACCTTTGTGTCCTCAAGAA   33   431
  H33e6702PCR1   AGGTCAGTTGGTTCAGGATA   33   618
  H35e6701PCR2   ATTACAGCGGAGTGAGGTAT   35   217
  H35e6701PCR1   GTCTTTGCTTTTCAACTGGA   35   442
  H35e6702PCR2   TCAGAGGAGGAGGAAGATACTA   35   655
  H35e6702PCR1   GATTATGCTCTCTGTGAACA   35   844
  H35e6703PCR2   CCCGAGGCAACTGACCTATA   35   610
  H35e6703PCR1   GTCAATGTGTGTGCTCTGTA   35   770
  H52e6701PCR2   TTGTGTGAGGTGCTGGAAGAAT   52   144
  H52e6701PCR1   CCCTCTCTTCTAATGTTT   52   358
  H52e6702PCR2   GTGCCTACGCTTTTTATCTA   52   296
  H52e6702PCR1   GGGGTCTCCAACACTCTGAACA   52   507
  H58e6701PCR2   TCAGGCGTTGGAGACATC   58   157
  H58e6701PCR1   AGCAATCGTAAGCACACT   58   301
  H58e6702PCR2   TCTGTGCATGAAATCGAA   58   173
  H58e6702PCR1   AGCACACTTTACATACTG   58   291
  HBe6701PCR2   TACACTGCTGGACAACAT   B(11)   514
  HBe6701PCR1   TCATCTTCTGAGCTGTCT   B(11)   619
  HBe6702PCR2   TACACTGCTGGACAACATGCA   B(11)   514
  HBe6702PCR1   GTCACATCCACAGCAACAGGTCA   B(11)   693
  HBe6703PCR2   TGACCTGTTGCTGTGGATGTGA   B(11)   693
  HBe6703PCR1   TACCTGAATCGTCCGCCAT   B(11)   832
  HCe6701PCR2   CATGCCATAAATGTATAGA   C(1839 45   295
  HCe6701PCR1   CACCGCAGGCACCTTATTAA   C(1839 45   408
  H39e6701PCR2   GCAGACGACCACTACAGCAAA   39   210
  H39e6701PCR1   ACACCGAGTCCGAGTAATA   39   344
  H39e6702PCR2   TATTACTCGGACTCGGTGT   39   344
  H39e6702PCR1   CTTGGGTTTCTCTTCGTGTTA   39   558
  H39e6703PCR2   GAAATAGATGAACCCGACCA   39   703
  H39e6703PCR1   GCACACCACGGACACACAAA   39   886
  H45e6701PCR2   AACCATTGAACCCAGCAGAAA   45   430
  H45e6701PCR1   TCTTTCTTGCCGTGCCTGGTCA   45   527
  H45e6702PCR2   GAAACCATTGAACCCAGCAGAAAA   45   428
  H45e6702PCR1   TTGCTATACTTGTGTTTCCCTACG   45   558
  引物名称   序列  HPV类型   nt
  H45e6703PCR2   GTTGACCTGTTGTGTTACCAGCAAT   45   656
  H45e6703PCR1   CACCACGGACACACAAAGGACAAG   45   868
  H45e6704PCR2   CTGTTGACCTGTTGTGTTACGA   45   654
  H45e6704PCR1   CCACGGACACACAAAGGACAAG   45   868
  H45e6705PCR2   GTTGACCTGTTGTGTTACGA   45   656
  H45e6705PCR1   ACGGACACACAAAGGACAAG   45   868
  H51e6701PCR2   GGAGGAGGATGAAGTAGATA   51   658
  H51e6701PCR1   GCCCATTAACATCTGCTGTA   51   807
  H51e6702PCR2   AGAGGAGGAGGATGAAGTAGATA   51   655
  H51e6702PCR1   ACGGGCAAACCAGGCTTAGT   51   829
  H56e6701PCR2   TTGGGGTGCTGGAGACAAACATCT   56   519
  H56e6701PCR1   TTCATCCTCATCCTCATCCTCTGA   56   665
  H56e6702PCR2   TGGGGTGCTGGAGACAAACATC   56   520
  H56e6702PCR1   CATCCTCATCCTCATCCTCTGA   56   665
  H56e6703PCR2   TTGGGGTGCTGGAGACAAACAT   56   519
  H56e6703PCR1   CCACAAACTTACACTCACAACA   56   764
  H56e6704PCR2   GATTTTCCTTATGCAGTGTG   56   279
  H56e6704PCR1   GACATCTGTAGCACCTTATT   56   410
HPV类型16、18、31和33的优选PCR引物对与NASBA引物对类似。
表5-优选的L1 NASBA引物和探针
  引物名称   序列
  Onc2A2   5’GATGCAAGGTCGCATATGAGAATGGCATTTGTTGGGGTAA 3’
  Onc2A1   5’AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCATATTCCTCCCCATGTC 3’
  Onc2PoA   5’TTGTTACTGTTGTTGATACTAC 3’
  Onc2B2   5’GATGCAAGGTCGCATATGAGAATGGCATTTGTTGGSRHAA 3’
  Onc2B1   5’AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCATATTCCTCMMCATGDC 3’
  Onc2PoB   5’TTGTTACTGTTGTTGATACYAC 3’
  Onc2PoC   5’TTGTTACTGTTGTTGATACCAC 3’
  Onc2C2   5’GATGCAAGGTCGCATATGAGAATGGCATTTGTTGGSIIAA 3’
  Onc2D2   5’GATGCAAGGTCGCATATGAGAATGGCATTTGTTGGIIHAA 3’
  Onc2E2   5’GATGCAAGGTCGCATATGAGAATGGCATTTGTTGGIRIAA 3’
  Onc2F2   5’GATGCAAGGTCGCATATGAGAATGGCATTTGTTGGGGTAA 3’
  Onc2G2   5’GATGCAAGGTCGCATATGAGAATGGCATTTGTTGGGGAAA 3’
  Onc2H2   5’GATGCAAGGTCGCATATGAGAATGGCATTTGTTGGCATAA 3’
  Onc2I2   5’GATGCAAGGTCGCATATGAGAATGGCATTTGTTGGGGCAA 3’
  Onc2J2   5’GATGCAAGGTCGCATATGAGAATGGCATTTGTTGGCACAA 3’
  Onc2K1   5’AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCATATTCCTCMICATGIC 3’
  Onc2L1   5’AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCATATTCCTCAACATGIC 3’
  Onc2M1   5’AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCATATTCCTCIICATGTC 3’
  Onc2N1   5’AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCATATTCCTCIICATGGC 3’
  Onc2O1   5’AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCATATTCCTCIICATGAC 3’
  Onc2P1   5’AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCATATTCCTCIICATGCC 3’
表6-优选的L1PCR引物
  引物名称   序列
  Onc2A1-PCR   5’AATGGCATTTGTTGGGGTAA 3’
  Onc2A2-PCR   5’TCATATTCCTCCCCATGTC 3’
  Onc2B1-PCR   5’AATGGCATTTGTTGGSRHAA 3’
  Onc2B2-PCR   5’TCATATTCCTCMMCATGDC 3’
  Onc2C1-PCR   5’AAGGCATTTGTTGGSIIAA 3’
  Onc2D1-PCR   5’AATGGCATTTGTTGGIIHAA 3’
  Onc2E1-PCR   5’AATGGCATTTGTTGGIRIAA 3’
  Onc2F1-PCR   5’AATGGCATTTGTTGGGGTAA 3’
  Onc2G1-PCR   5’AATGGCATTTGTTGGGGAAA 3’
  Onc2H1-PCR   5’AATGGCATTTGTTGGCATAA 3’
  Onc2I1-PCR   5’AATGGCATTTGTTGGGGCAA 3’
  Onc2J1-PCR   5’AATGGCATTTGTTGGCACAA 3’
  Onc2K2-PCR   5’TCATATTCCTCMICATGIC 3’
  Onc2L2-PCR   5’TCATATTCCTCAACATGIC 3’
  Onc2M2-PCR   5’TCATATTCCTCIICATGTC 3’
  Onc2N2-PCR   5’TCATATTCCTCIICATGGC 3’
  Onc2O2-PCR   5’TCATATTCCTCIICATGAC 3’
  Onc2P2-PCR   5’TCATATTCCTCIICATGCC 3’
SEQ ID NO：149和150的HPV特异性序列(引物Onc2A2/Onc2A1-PCR和Onc2A1/Onc2A2-PCR)与HPV类型16基因组序列中位置6596-6615的片断(SEQ ID NO：149；Onc2A2/Onc2A1-PCR)以及位置6729-6747的片断(SEQ ID NO：150；Onc2A1/Onc2A2-PCR)等同。
SEQ ID NO：152和153的HPV特异性序列(Onc2B2/Onc2B1-PCR和Onc2B1/Onc2B2-PCR)分别为上述序列的变异体，包括几个简并碱基。本文提供的简并寡核苷酸分子序列的代表符号使用的是混合碱基位点的标准IUB编码：N＝G，A，T，C；V＝G，A，C；B＝G，T，C；H＝A，T，C；D＝G，A，T；K＝G，T；S＝G，C；W＝A，T；M＝A，C；Y＝C，T；R＝A，G。
也有可能使用HPV特异性序列SEQ ID NO：152(Onc2B2/Onc2B1-PCR)和SEQ ID NO：153(Onc2B 1/Onc2B2-PCR)的变异体，其中靠近序列的3′末端的任何两个核苷酸“SRH”如下所示被肌苷(I)所置换。
5′AATGGCATTTGTTGGIIHAA 3′
5′AATGGCATTTGTTGGSIIAA 3′
5′AATGGCATTTGTTGGIRIAA 3′
HPV特异性序列SEQ ID NO：156-163(存在于引物Onc2C2、Onc2D2、Onc2E2、Onc2F2、Onc2G2、Onc2H2、Onc2I2、Onc2J2、Onc2C1-PCR、Onc2D1-PCR、Onc2E1-PCR、Onc2F1-PCR、Onc2G1-PCR、Onc2H1-PCR、Onc2I1-PCR和Onc2J1-PCR)是基于HPV特异性序列SEQ ID NO：152(Onc2B2/Onc2B1-PCR)的变异体，而HPV特异性序列SEQ ID NO：164-169(存在于引物Onc2K1、Onc2L1、Onc2M1、Onc2N1、Onc2O1、Onc2P1、Onc2K2-PCR、Onc2L2-PCR、Onc2M2-PCR、Onc2N2-PCR、Onc2O2-PCR和Onc2P2-PCR)是基于HPV特异性序列SEQ ID NO：153(Onc2B1/Onc2B2-PCR)的变异体。这些变异体包括简并碱基以及肌苷(I)残基。这个序列变异使得嵌入变异体序列的寡核苷酸，能与多种HPV类型结合。肌苷碱基不会对杂交产生干涉，因此可嵌入不同HPV类型之间的变异位点，从而构建能与多种HPV类型结合的“共有”引物。
引物Onc2A2、Onc2B2、Onc2C2、Onc2D2、Onc2E2、Onc2F2、Onc2G2、Onc2H2、Onc2I2和Onc2J2之一种或多种可与引物Onc2A1、Onc2B 1、Onc2K1、Onc2L1、Onc2M1、Onc2N1、Onc2O1和Onc2P1之一种或多种组合使用，以对HPV L1mRNA进行NASBA扩增。
引物Onc2A1-PCR、Onc2B1-PCR、Onc2C1-PCR、Onc2D1-PCR、Onc2E1-PCR、Onc2F1-PCR、Onc2G1-PCR、Onc2H1-PCR、Onc2I1-PCR和Onc2J1-PCR之一种或多种可与引物Onc2A2-PCR、Onc2B2-PCR、Onc2K2-PCR、Onc2L2-PCR、Onc2M2-PCR、Onc2N2-PCR、Onc2O2-PCR和Onc2P2-PCR之一种或多种组合使用，以对HPV L1mRNA进行PCR扩增。
通过以下实验性实施例和示图，可进一步理解本发明，其中：
图1A表示使用针对HPV 16的FAM分子信标对患者样品进行单一反应实时NASBA测试的结果，而图1B表示使用图1A的FAM分子信标及针对UIA的得克萨斯红标记的分子信标进行的“多重”实时NASBA测试，
图2A表示对患者样品使用针对HPV 18的FAM分子信标进行的单一反应实时NASBA，而图2B表示使用针对HPV 18的得克萨斯红标记的分子信标和针对HPV 33的FAM标记的信标进行的多重实时NASBA，
图3A表示使用针对HPV 31的FAM标记分子信标进行的单一反应实时NASBA，而图3B表示使用针对HPV 45的得克萨斯红标记的分子信标进行的多重实时NASBA，
图4A表示使用针对HPV 33的FAM标记分子信标进行的单一反应实时NASBA，而图4B表示使用针对HPV 18的得克萨斯红标记的分子信标进行的多重实时NASBA，
图5A表示使用针对HPV 45的FAM分子信标进行的单一反应实时NASBA，而图5B表示使用针对HPV 45的得克萨斯红标记的分子信标和针对HPV 31的FAM标记的分子信标进行的多重实时NASBA，
图6表示通过PreTect HPV-Proofer和PCR检测HPV(与细胞学检查或组织学检查相比)。
实施例1通过基于NASBA的核酸扩增和实时检测法检测HPV mRNA
收集和制备临床样品
从挪威奥斯陆参与子宫颈检查计划的5970名妇女收集派普斯涂片和HPV样品。如下处理用于提取RNA/DNA的样品。
用细胞刷(cytobrush)(Rovers Medical Devices，荷兰)收集参与子宫颈检查计划的各妇女的子宫颈样品。然后将细胞刷浸入9ml裂解缓冲液(5M硫氰酸胍)中。因为RNA在-70℃的5M硫氰酸胍中保存得最好，每一轮提取中只用1ml样品即可。裂解缓冲液中的样品在-20℃下保存不超过一个星期，然后在-70℃下保存，直至进行RNA/DNA分离。
在第一轮提取中，使用9ml裂解缓冲液总样品的1ml，自动分离5300名妇女的RNA和DNA。RNA和DNA按照Organon Teknika的“Booms”分离方法(Organon Teknika B.V.，Boselind 15，P.O.Box 84，5280AB Baxtel，荷兰；现Biomérieux，69280 Marcy 1’Etoile，法国)，使用NuclisensTM提取器按照自动提取方案进行提取。
细胞系
Hela(HPV 18)、SiHa(HPV 16)和CaSki(HPV 16)细胞系的DNA和RNA用作PCR和NASBA反应的阳性对照。这些细胞在敏感性研究(实例2)中也用作样品材料。SiHa细胞每细胞含有1-2个拷贝的整合型HPV 16，而CaSki细胞每细胞含有60-600个拷贝的整合的和游离型的HPV 16。Hela细胞每细胞约含10-50个拷贝的HPV 18。
HPV的PCR检测和分型
用共有Gp5+/6+引物对从子宫颈刮片分离的DNA进行PCR(EP-B-0517704)。PCR在50ml反应体积中进行，所述体积中含有75mMTris-HCl(pH8.8，25℃)、20mM(NH4)2SO4、0.01％Tween 20TM、200mM各dNTP、1.5MmMgCl2、1U重组Taq DNA聚合酶(MBI Fermentas)、3μl DNA样品和50pmol各Gp5+和Gp6+引物。在94℃下进行2分钟的变性步骤，然后用PCR处理器(Primus96，HPL block MWG，德国)进行40轮扩增。每轮扩增包括1分钟的变性步骤，40℃下2分钟的引物退火步骤和72℃下1.5分钟的链延长步骤。最后一个延长步骤延时4分钟，以确保扩增的DNA完全延伸。
如下对Gp5+/6+阳性样品进行HPV类型16、31和33PCR方案：HPV 16、31和33：PCR在50ml体积中进行，所述体积中含有75mMTris-HCl(pH8.8，25℃)、200mM各dNTP、1.5mM MgCl2、2.5U重组TaqDNA聚合酶(MBI Fermentas)、3μl DNA样品和25pmol各引物。在94℃进行2分钟的变性步骤，然后用PCR处理器(Primus96，HPL block，MWG，德国)进行35轮的扩增。各轮扩增包括30秒的变性步骤，57℃下30秒的引物退火步骤和72℃下1分钟的链延长步骤。最后一个步骤延时10分钟，以确保扩增的DNA完全延伸。HPV 33的方案有一个52℃下的引物退火步骤。HPV 18方案：设计引物以鉴别HPV类型18。PCR在50ml体积中进行。所述体积中含有75mM Tris-HCl(pH8.8，25℃)、20mM(NH4)2SO4、0.01％Tween20、200mM各dNTP、2.0mM MgCl2、2.5U重组Taq DNA聚合酶(MBI Fermentas)、3μlDNA样品和25pmol各引物。在94℃进行2分钟的变性步骤，然后用PCR处理器(Primus96，HPL block，MWG，德国)进行35轮的扩增。各轮扩增包括30秒的变性步骤，57℃下30秒的引物退火步骤和70℃下1分钟的链延长步骤。最后一个延长步骤延时10分钟，以确保扩增的DNA完全延伸。
将导向人β-珠蛋白基因的引物组用作DNA质量的对照(Operatingprocedure，University Hospital Vrije Universiteit，荷兰阿姆斯特丹)。PCR在50ml体积中进行，所述体积中含有75mM Tris-HCl(pH8.8，25℃)、200mM各dNTP、1.5mM MgCl2、1U重组Taq DNA聚合酶(MBIFermentas)、3μl DNA样品和25pmol各引物。在94℃进行2分钟的变性步骤，然后用PCR处理器(Primus96，HPL block，MWG，德国)进行35轮的扩增。各轮扩增包括94℃下1分钟的变性步骤，55℃下1.5分钟的引物退火步骤和72℃下2分钟的链延长步骤。最后一个步骤延时4分钟，以确保扩增的DNA完全延伸。HeLa用作HPV 18的阳性对照，而SiHa或Caski用作HPV 16的阳性对照。水用作阴性对照。
用于HPV PCR的引物：
  类型   引物 引物序列   位置   长度(bp)
  HPV16   Pr1Pr2 5’TCA AAA GCC ACT GTG TCC TGA 3’5’CGT GTT CTT GAT GAT CTG CAA 3’   421-440521-540   119
  HPV18   Pr1Pr2 (5’TTC CGG TTG ACC TTC TAT GT 3’)(5’GGT CGT CTG CTG AGC TTT CT 3’)   651-670817-836   186
  HPV31   Pr1Pr2 5’CTA CAG TAA GCA TTG TGC TAT GC 3’5’ACG TAA TGG AGA GGT TGC AAT AAC CC 3’   3835-38753963-3988   153
  HPV33   Pr1Pr2 5’AAC GCC ATG AGA GGA CAC AAG 3’5’ACA CAT AAA CGA ACT GTG TGT 3’   567-587758-778   211
  Gp+   Gp5+Gp6+ 5’TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC 3’5’GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C   6624-66496719-6746   150
  BGPCO3BGPCO5   Pr1Pr2 5’ACA CAA CTG TGT TCA CTA GC5’GAA ACC CAA GAG TCT TCT CT
在DNA500芯片(Agilent Technologies，美国)上按其操作手册对PCR产物进行显示。所述DNA芯片采用微量凝胶电泳，其最佳检测限为0.5-50ng/ml。结果用Bioanalyzer 2100软件(Agilent Technologies，美国)解析。
下表确认用以对患者样品进行HPV PCR的引物，并指出另外的适用于HPV35、39、45、51、52、58和HPV6/11的PCR引物。
用于HPV检测的PCR引物。
NASBA RNA扩增
避免发生污染的预防措施：
1.在独立的实验室场所进行核酸释放、分离和扩增/检测操作。
2.在将进行核酸释放、分离和扩增/检测操作的实验室场所分别保存和制备用以进行核酸释放、分离和扩增/检测操作的试剂。
3.试管和小瓶不用时保持密封。
4.在一个实验室场所使用的移液管和其它仪器不得在其它场所使用。
5.每次移液操作时使用干净的移液管和移液头。
6.对可能含有核酸的流体使用带有防气溶胶的管头的移液管。必须用专用、分离的试管进行移液操作。所有其它试管和小瓶应对所处理的试管或小瓶保持密封或隔离。
7.当处理可能含有目标mRNA或扩增的材料的临床材料时，要戴一次性手套。如有可能，在完成测试过程中各移液步骤后，要更换手套，尤其在与可能的污染物接触后更要更换手套。
8.将用过的一次性物品收集到一容器中。每次测试后要密封和移走该容器。
9.每次测试后，将在核酸分离或扩增/检测过程中使用的试管架浸于洗涤剂(如Merck Extran MA01 alkaline)中至少一小时。
以下程序是使用Organon Teknika提供的NuclisensTM Basic Kit的试剂进行的。
n＝10样品的程序：
1.制备酶溶液。
往3个冻干的酶球(NuclisensTM Basic Kit；含AMV-RT、RNA酶H、T7 RNA聚合酶和BSA)分别加入55μl酶稀释液(自NuclisensTMBasic Kit；含山梨糖醇水溶液)。将此酶溶液置于室温下至少20分钟。将酶溶液收集到一个试管中，用手指轻弹试管以使完全混合。略加离心沉淀并在1小时内使用。酶混合液的终浓度为375mM山梨糖醇、2.5μgBSA、0.08U RNA酶H、32U T7RNA聚合酶和6.4U AMV逆转录酶。
2.制备试剂球/KCl溶液。
对于10个样品：往冻干的试剂球(自NuclisensTM Basic Kit；含核苷酸、二硫苏糖醇(dithiotreitol)和MgCl2)加入80μl试剂球稀释剂(自NuclisensTM Basic Kit；含Tris/HCl(pH8.5)、45％DMSO)，立即旋拌均匀。对3种试剂球进行以上处理并将各溶液混合在一个试管中。
往上述再生的试剂球溶液加入3μl NASBA水(自NuclisensTMBasic Kit)并混合均匀。
加入56μl KCl储液(自NuclisensTM Basic Kit)并混合均匀。使用此KCl/水混合液，结果NASBA反应的KCl终浓度为70mM。试剂/KCl溶液的终浓度为1mM各dNTP、2mM ATP、UTP和CTP、1.5mM GTP，以及0.5mM ITP、0.5mM二硫苏糖醇、70mM KCl、12mM MgCl2、40mM Tris-HCl(pH 8.5)。
3.制备含目标特异性引物和分子信标探针的引物/探针溶液。
对各目标反应，将91μl试剂球/KCl溶液(步骤2中制备)转移到干净的试管中。加入25μl引物/分子信标探针溶液(使每个反应的各正义和反义引物的终浓度为～0.1-0.5μM，各分子信标探针的终浓度为～15-20pmol)。旋拌混合均匀。不要离心。
如进行不到10个的目标RNA扩增，参考下表所示试剂球溶液、KCl/水溶液和引物的合适用量。引物溶液应在制备后30分钟内使用。
 反应(n) 试剂球溶液(μl) KCl/水(μl) 引物混合液(μl)
  10   80   30   10
  9   72   27   9
  8   64   24   8
  7   56   21   7
  6   48   18   6
  5   40   15   5
  4   32   12   4
  3   24   9   3
  2   16   6   2
  1   8   3   1
4.加样
对各目标RNA反应：
往96孔微量滴定板中的10各孔每孔各移加10μl的引物/探针溶液(步骤3中制备)。往每孔中加入5μl核酸提取物。在65±1℃温育微量滴定板4分钟。冷至41±0.5℃4分钟。然后往每孔加入5μl酶溶液。立即将微量滴定板置于荧光检测仪器(如NuclisensTM EasyQAnalyzer)中开始扩增。
临床研究结果
表7显示相对于细胞学检测结果实时NASBA HPV阳性(L1和/或E6表达)病例和PCR HPV阳性病例的分布。PCR扩增如Karlsen等，J Clin Microbiol.34：2095-2100，1996所描述的进行。预期的组织学检测结果的数值基于对CIN III病变所进行的类似研究的平均结果(Clavel等，Br J Cancer，84：1616-1623，2001)。表8列出几个示例性病例的结果。
表7：
  正常   良性  湿疣   CIN III
  细胞学检测   4474   66  16   15
  PCR   9.0％   44.6％  87.5％   73.3％
  实时NASBA   1％   24.6％  37.5％   73.3％
  预期的组织学检测   0.2％   5-15％  15-20％   71％
表8：
  内部编号   细胞学检测   PCR   L1NASBA   E6NASBA
  84   阴性   阴性   阴性   31
  289   阴性   31   阳性   31
  926   阴性   阴性   阳性   16
  743   良性   阴性   阴性   33
  1512   良性   16   阳性   16
  3437  良性   阴性   阴性   18
  3696  良性   16   阳性   阴性
  2043  湿疣   16，51   阳性   16
  3873  湿疣   16，51   阳性   16
  3634  CIN II   33   阴性   33
  4276  CIN III   阴性   阴性   18
  4767  CIN III   18   阴性   18
  1482  CIN III   阴性   阳性   16
  5217  CIN III   31   阴性   31
  4696  CIN III   阴性   阴性   阴性
实施例2-实时NASBA对对照细胞系的灵敏度
在用Organon Teknika/bioMerieux的Boom’s提取法进行核酸自动提取前(平行试样1和3)或在核酸提取后(平行试样2)，将宫颈癌细胞系CaSki、SiHa和Hela稀释于裂解缓冲液中。按上述方案使用用得克萨斯红(16、L1和18)或FAM(U1A、33和31)标记的分子信标探针进行实时NASBA。
表9：
Figure C0380538000561
因此，用实时NASBA有可能在少于1个细胞中检出HPV E6mRNA。
实时NASBA是作为多重测试法和作为单一反应同时进行测试的。以下灵敏度研究的结果基于对CaSki、SiHa和Hela细胞系的平行试验，也基于对HPV类型16、18、31和33的合成DNA oligos的三个平行试验。检测限的定义是，平行试验中的两个样品均为阳性。括号中的数字(x)表示在一些试验中也检出的细胞的指定数量。灵敏度定义为在两个平行试验中检出HPV所需的细胞量。HPV类型从PCR结果确定，而特异性基于NASBA与PCR的比较结果。
灵敏度
PCR：采用Gp5+/6+的HPV共有PCR只能检测低至104个SiHa和Hela细胞，以及低至103个CaSki细胞。但是，类型特异性PCR引物组更加灵敏，HPV 16类型特异性PCR引物组可检测103(102)个SiHa细胞和0.1个CaSki细胞，而HPV 18类型特异性引物组可检测102个HeLa细胞。
实时NASBA：实时NASBA采用对U1A特异的引物，可检出反应混合物中10(1)个SiHa和Caski细胞和1个Hela细胞。对于HPV16特异性引物，检测下限为(10)(102，1)个SiHa细胞和10(1)个CaSki细胞，而对HPV 18特异性引物，检测下限为1(0.1)个HeLa细胞。通用L1引物能检测10个CaSki细胞。HeLa细胞和SiHa细胞不被通用L1引物检出。
实时多重NASBA采用U1A特异性引物并组合HPV特异性引物(检测下限为10(1)个SiHa细胞和10(1)个CaSki细胞)，检测下限为102(10)个SiHa细胞和10(1)个CaSki细胞。L1特异性引物和HPV 33特异性引物组合可检测103(102)个CaSki细胞。反应中没有竞争性HPV33样品。HPV 18特异性引物与HPV 31特异性引物组合应用时的检测下限为1(0.1)个HeLa细胞。反应中没有竞争性HPV 31样品。由于没有带HPV 31和HPV 33的细胞系，这些HPV类型的特异性引物的灵敏度没有进行测试。这些引物只对含HPV 31和HPV 33的样品进行测试，但细胞数量和这些细胞中HPV 31和HPV 33的拷贝数未知，在不同样品中很可能会不同。
表10：与PCR相比实时NASBA的灵敏度
Figure C0380538000581
对1999-2001年间进入stfold中心医院接受CIN治疗的妇女的样品进行实时NASBA(参看实施例3)。在上述核酸提取和NASBA方案同时采用了以FAM和得克萨斯红标记的分子信标探针。结果在图1A和1B(HPV 16-患者样品205)、图2A和2B(HPV 18-患者样品146)、图3A和3B(HPV 31-患者样品236)、图4A和4B(HPV 33-患者样品218)和图5A和5B(HPV 45-患者样品343)显示。在各病例中，“A”图为单一反应，“B”图为多重测试。
特异性：实时NASBA的交叉反应性。用实时NASBA引物组合对从奥斯陆研究中经PCR检测为HPV 6/11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、58或HPV X阳性的490个子宫颈样品进行测试，以检查使用NASBA时各HPV类型之间的交叉反应性。已通过共有PCR和除HPV类型39(2)、52(1)和58(2)之外的各HPV类型的类型特异性PCR对所有样品进行分型。这些样品通过PreTect HPV-Proofer加样测试。共有Gp5+/6+PCR检出HPV X阳性，但类型特异性PCR检出HPV 6/11、16、18、31、33、35、45和51阴性。没发现交叉反应性。表14中选定数目的病例的序列确认在表14a中表示。
PCR：用PCR和PreTect HPV-Proofer(实时多重NASBA)共检测了773个子宫颈样品，Gp5+/6+共有PCR引物检出共有24.6％(190/773)的样品为阳性。经分型，74.1％(83/112)的样品为HPV 16，13％(15/112)为HPV 18，17％(19/112)为HPV 31和12％(13/112)为HPV 33，包括多重HPV感染。共有103个样品有单一或多重HPV感染，而91.3％(94/103)的样品只有单一HPV感染。8.7％(9/103)的样品发生双HPV感染。所有样品首先用共有Gp5+/6+PCR引物测试。然后用β-珠蛋白对照引物测试共有Gp5+/6+得到的HPV PCR阴性样品，以对完整DNA进行确证。HPV PCR阳性样品不进行此DNA对照试验。本研究的HPV阴性样品对β-珠蛋白对照PCR引物均为阳性。只有在Gp5+/6+PCR中为阳性的DNA样品才进行HPV类型特异性PCR。HPV类型的研究目标所在是HPV 16、18、31和33。
实时多重NASBA：对于实时NASBA反应，U1A基因产物的引物和探针用作完整DNA的性能对照。弃去对U1A阴性的样品。共有14.2％(110/773)的样品对HPV类型特异性NASBA引物中至少一个为阳性，包括显示多重HPV感染的样品。这些样品中有54.5％(60/110)对HPV 16NASBA引物阳性，13.6％(15/110)对HPV 18引物阳性，21.8％(24/110)对HPV 31引物阳性和13.6％(15/110)对HPV33引物阳性。共有45个样品对L1共有引物阳性，通常其中有82.2％(37/45)同时显示HPV 16E6/E7癌基因表达。在2.2％(1/45)的样品中检出共有L1，同时分别检出HPV 18、31或33。另在8.9％(4/45)的样品中只检出L1，这些样品对Gp5+/6+引物PCR均为阳性。共有108个样品具有单一或多重HPV感染，而98.1％(106/108)的样品只有单一HPV感染。在1.9％(2/108)的样品中出现双mRNA表达。
实时多重NASBA与PCR比较：通过HPV 16PCR或PreTectHPV-Proofer共有87个样品显示存在HPV 16DNA或RNA。通过PCR和实时NASBA确定有64.4％(56/87)的样品为HPV 16阳性。通过PCR发现只有39.1％(34/87)的样品为阳性，而通过实时NASBA发现只有3.4％(3/87)的样品为阳性。对于HPV 18，通过PCR或实时NASBA发现共有20个样品显示存在HPV 18DNA或RNA。这20个样品当中，在PCR和实时NASBA这两个测试中发现有50％(10/20)的样品为阳性，通过PCR发现只有35％(7/20)的样品为阳性，而通过实时NASBA发现只有15％(3/20)的样品为阳性。通过PCR或实时NASBA发现共有27个样品显示存在HPV 31 DNA或RNA。在这27个样品当中，在PCR和实时NASBA测试中发现有59.3％(16/27)的样品为阳性，通过PCR发现只有11.1％(3/27)的样品为阳性，通过实时NASBA测试发现只有18.5(5/27)的样品为阳性。对于HPV 33，通过PCR或PreTect HPV-Proofer发现共有18个样品显示存在HPV DNA或RNA，而通过PCR和实时NASBA这两个测试发现有55.6％(10/18)的样品为阳性。通过PCR发现只有16.7％(3/18)的样品为阳性，而通过实时NASBA发现只有22.2％(4/18)的样品为阳性。
表11：PCR和实时NASBA样品中HPV的统计分布
 PCR   ％  NASBA   ％
  总样品数  773   773
  总阳性样品数  190   24.6   110   14.2
  HPV16  83   74.1   60   54.5
  HPV18  15   13   15   13.6
  HPV31  19   17   24   21.8
  HPV33  13   12   15   13.6
  HPVX  78   69.6   -   -
表12：PCR和实时NASBA之间的对应关系
  总数   两种测试   ％   仅PCR+   ％(PCR)   ％(总数)  仅NASBA   ％NASBA   ％(总数)
  HPV 16   87   56   64.4   34   41.0   39.1   3   5   3.4
  HPV 18   20   10   50.0   7   46.7   35.0   3   20   15.0
  HPV 31   27   16   59.3   3   15.8   11.1   5   20.8   18.5
  HPV 33   18   10   55.6   3   23.1   16.7   4   26.7   22.2
表13：L1的实时NASBA结果
  总数   ％
  L1(NASBA)   45   100
  L1+HPV16   37   82.2
  L1 alone   4   8.9
  L1+HPV18   1   2.2
  L1+HPV31   1   2.2
  L1+HPV33   1   2.2
表14：实时多重NASBA与PCR比较的遗传特异性
Figure C0380538000611
表14a：通过Gp5+/6+PCR引物的DNA测试序(不包括在本文中)
  Int No   PCR测定的HPV类型  PreTect HPV-Proofer测定的HPV类型   测序(BLAST)确定的HPV类型
  1272   16  16   16
  152   35   35
  2655   58   58
  2924   33  33   33
  2942   18  18   18
  2987   16  16   16
  3016   33  33   33
  3041   35   35
  3393   35   35
  3873   16  16   16
  4767   18  18   18
  5707   18  18   18
  845   X   39
讨论
实时NASBA的灵敏度通常比PCR的灵敏度要好。实时NASBA对所有标记的一般灵敏度为1至102个细胞的范围，这比PCR反应102至104个细胞的灵敏度范围要好得多。正如所料到的那样，特异性引物和探针的灵敏度要比通用引物和探针的灵敏度要好。实时NASBA与实时多重NASBA相比同样灵敏或更加灵敏。
导向U1A(人管家基因)的实时NASBA引物和分子信标探针在实时NASBA反应中用作样品材料的性能对照物，以确保样品材料中的RNA的完整性。实时NASBA反应的阳性信号是对此反应进行确证所必需的。
通用实时NASBA对L1(HPV的主要衣壳蛋白)的灵敏度比同样针对L1的通用Gp5+/6+PCR的灵敏度要好得多，其灵敏度为10个CaSki细胞，而通用Gp5+/6+PCR的灵敏度为103(102)个CaSki细胞。这两个引物组(PCR和NASBA)的靶标位于不同HPV类型的保守L1基因的相同区域。两者灵敏度的差别可能是由于每个细胞中每个基因通常有一个拷贝，而mRNA的拷贝数可能为几百。实时NASBA L1引物不能象Gp5+/6+PCR引物那样检出SiHa和HeLa细胞，说明这些细胞系中缺少L1表达。Gp5+/6+PCR引物能检出104个SiHa或HeLa细胞。考虑到各细胞中的HPV拷贝数量，可以理解CaSki细胞能被检出的数量为SiHa和HeLa细胞的十分之一，因为每个CaSki细胞有60-600个整合的和游离型的HPV拷贝，而每个SiHa细胞有1-2个整合型HPV拷贝，每个HeLa细胞有10-50个整合型HPV拷贝。L1引物组只能检测具有整合的和游离型的HPV的CaSki细胞，而不能检测只有整合型HPV的SiHa或HeLa细胞，这可说明L1基因只在HPV感染的游离型状态下表达，因此L1可作为HPV感染的整合和持续现象的有价值的标志。
HPV类型特异性NASBA引物是针对全长E6/E7转录物的，由于癌细胞中缺乏E2基因产物，所述转录物在癌细胞中大量表达。实时NASBA 16类型特异性引物能检出10(1)个SiHa细胞和10(1)个CaSki细胞，而HPV 16PCR引物能检出103(102)个SiHa细胞。对此的解释是可能由于各细胞系中HPV拷贝数量不同。CaSki细胞具有整合的和游离型的HPV，而SiHa只有整合型HPV。这可能是由于从E6/E7基因表达的mRNA比较多。对于CaSki细胞的检测，NASBAHPV 16引物的检测限为10(1)个CaSki细胞，而HPV 16PCR引物的检测限为0.1个CaSki细胞。这有点奇怪，但可能的解释是CaSki细胞含60-600个HPV 16DNA拷贝，因此对于6-60个HPV 16DNA拷贝，可检出0.1个CaSki细胞。与PCR相比，实时NASBA的低灵敏度说明CaSki细胞中E6/E7的表达中等/低下。不稳定的mRNA的降解也可作为一种解释说法。CaSki细胞中的HPV拷贝量约比SiHa细胞中的大60-600倍，对CaSki细胞更灵敏的检测显示了这一点。
类型特异性HPV 18PCR引物能检出102个HeLa细胞。这比HPV共有Gp5+/6+引物大100倍，说明特异性引物通常比共有引物更灵敏。类型特异性HPV 18NASBA引物的灵敏度为1(0，1)个HeLa细胞，说明HeLa细胞中E6/E7表达量高。
U1A NASBA引物的灵敏度为10个SiHa或CaSki。U1A引物组的靶标为在每个人细胞中都有表达的人管家基因。
对于不同的引物组和样品材料，PCR和NASBA的灵敏度不同，且通常类型特异性引物比共有引物更灵敏，原因在于共有引物组中存在碱基错配。在PCR反应中可对引物的退火温度进行优化，为引物提供最适的反应条件。与PCR的退火温度相反，NASBA引物的退火温度必须固定在41℃。这样缺乏温度灵活性会使NASBA引物比PCR引物的灵敏度和特异性差。
PCR扩增双链DNA，而DNA靶标通常在每个细胞中只有一个拷贝，这使得PCR对样品材料中的细胞数目很敏感。NASBA反应的靶标为DNA，而每个细胞中mRNA可以多重拷贝存在，取决于基因的表达。通过选择能高度表达的基因，每个细胞中mRNA的拷贝数可达几百，从而更易检测。
dsDNA在细胞中相对稳定，可完整保持较长时间。与dsDNA相比，mRNA通常不很稳定，且取决于细胞，mRNA的降解会很快。在裂解缓冲液中无DNA酶和RNA酶活性检出，因此dsDNA和ssRNA应该稳定。自催化活性可降解DNA和RNA。子宫颈样品中的DNA/RNA在裂解缓冲液中于15-30℃下保存24小时，在2-8℃下保存7天或在-70℃下长期保存时，应该能保持完整。
实时NASBA反应的一个限制是分子信标探针的浓度。产物的数量会超过分子信标探针的浓度，因此不能被检出，因为高浓度的分子信标探针会使反应混合物变得更加复杂并抑制扩增反应。核苷酸也可能是对PCR和NASBA反应中扩增产物最终数量的一个限制。由于产物的数量和反应混合物的复杂性的原因，扩增产物的终浓度本身会抑制扩增的进一步进行。在分子信标存在下的NASBA反应过程中，探针可通过与模板杂交而与扩增反应相竞争，使得其在随后的RNA合成中不能进行。这样，RNA被用作逆转录步骤和随后的通过T7RNA聚合酶进行的RNA合成的底物。当分子信标量少时，此竞争关系不明显，而当分子信标量大时，此抑制作用可通过输入更多的RNA拷贝量来克服。
对不同HPV细胞系的10倍系列稀释液测试RNA输入量与时间-阳性信号之间的线性关系。结果明显表明，阳性信号取决于RNA的输入量和时间。多重反应比单一反应需要更多的时间才能显示阳性信号。这可能是由于多重反应器中更复杂的混合物中的竞争现象，也可能是由于多重反应具有不同和较低浓度的引物和探针。目标RNA的数量和时间-阳性信号之间的关系揭示了各反应器中以RNA为内标的实时多重定量扩增反应规律。
实时NASBA：单一反应与多重反应。实时NASBA通常比实时多重NASBA更灵敏。这是可预料到的，因为多重反应中存在引物和探针之间的竞争。对多重反应中引物和分子信标探针的终浓度进行优化，使得对于至少一个引物和探针组其浓度能低于在单一反应中的浓度。据此有以下规律，即引物浓度越低，反应灵敏度越低，或至少反应越慢。达到扩增反应的指数阶段需要更长的时间，因此对产物进行检测也需要更长的时间。NASBA反应中引物的浓度不会成为对产物终浓度的限制，因为从引物制得的双链DNA可不断循环作为RNA聚合酶的模板。多重实时NASBA与单一实时NASBA对HPV 16和HPV 18的灵敏度是一样的，但对于L1则灵敏度从单一反应的10(1)的检测限剧烈下降到多重反应的103(102)个CaSki细胞。对于U1A NASBA引物，灵敏度从10(1)个SiHa细胞降至102(10)个SiHa细胞，但对于CaSki细胞检测限保持不变。检测限的降低可能由于多重反应中引物和分子信标探针之间更加复杂的竞争关系。引物和分子信标探针的终浓度可能不是最佳的，且多重反应中不同的引物和分子信标探针会相互干扰。U1ANASBA引物能检出1个HeLa细胞。有人可能会猜想在所有的细胞系中检测水平会一样，但HeLa细胞的灵敏度为SiHa和CaSki细胞的检测水平的十分之一。这些细胞系为癌细胞，对上述HeLa、SiHa和CaSki细胞会有不同的影响，因此U1A的表达也不同。表达的差别也可能由于收获细胞时的计数错误而导致的各反应中细胞数量的不同。
实时NASBA没有显示HPV 16、18、31和33之间，或HPV 6/11、35、39、45、51、52、58或HPV X的交叉反应性。
PCR反应的特异性可能优于实时NASBA反应的特异性，因为NASBA反应是在41℃下进行的等温反应，不可能改变引物的退火温度。NASBA引物与PCR引物在设计上基本相同。与NASBA反应相比，在PCR反应中，有可能改变退火温度，因此可为两引物选择最适合的退火温度。这使得引物的退火更具特异性。PCR结果用凝胶电泳显示。但与PCR反应相比，实时NASBA反应的分子信标探针是另外的一个参数，因此可使总NASBA反应更具特异性。要发现DNA序列上不同的引物退火区域也更容易，因为PCR引物的长度(应少于250bp)比NASBA产物的长度更具灵活性。为了NASBA反应的特异性，选择在不同HPV类型中非保守的独特区域是很重要的。几个碱基对的错配仍可使靶标发生扩增或杂交。
用通用L1NASBA引物能检出CaSki(整合的和游离型的)细胞但不能检出SiHa或HeLa(两者均为整合的)细胞，说明整合型HPV不显示任何L1表达，而游离型的HPV可显示L1表达。
总而言之，已开发针对HPV类型16、18、31和33的鉴定测试法，用该法能准确地鉴定这些HPV类型的癌基因的E6/E7表达。该法还可鉴定主要衣壳蛋白L1的表达。
实施例3-在190名患者中进行的进一步临床研究
患者/临床样品
采用在1999-2001年间到
Figure C0380538000661
stfold中心医院接受CIN治疗的190名妇女的活检组织。本研究中这190名妇女的平均年龄为37.4岁(年龄范围在22-74岁)。活检组织收集后立即冻存于-80℃。
对样品的细胞学检查
用常规细胞学检查报告记录细胞学检查发现结果。没有对玻片进行再评价。各玻片显示CIN II-III，即高级异常增生或HSIL，其是入院、阴道镜检查和活检组织检查的基础。
对样品的组织学检查
经细胞学检查报告为高级后，收集活检组织(本文称为活检组织1)。如其确证存在高级病变(CIN II或III)，患者要再次入院，这次要进行阴道镜指导下的锥形切除术。在进行锥形切除术前但在进行局部麻醉后，从按大体检查发现结果判断异常增生最可能集中的部位收集第二份活检组织(活检组织2)。在2分钟内将此活检组织(2×2mm)冻存于-80℃冷冻器中。
活检组织2在冷冻时分成两部分，其中一部分用以进行DNA/RNA提取。另一部分固定于10％缓冲甲醛并处理以作组织病理学检查。一些病变不能在石蜡块中正确定向，为显示相关的表面上皮细胞，必须进行重新定向或进行系列切片。因此，不能保证提取和组织病理学评价中使用的是刚好一样的组织。最后，锥形切除样品由当地病理学者评价，病理学者在任何情况下均能确证存在异常增生。锥样本与原来的活检组织不总是属同一等级，且在许多情况下与活检组织2不是属同一等级。
核酸的提取
采用前述(Boom等，1990)的自动Nuclisens Extractror分离核酸。将各活检组织分成两半，一半用以进行组织学检查，另一半用以进行RNA分析。用以进行RNA分析的材料在干冰上(-80℃)细分成碎片，然后加入到1ml的裂解缓冲液(如上所述)中，再用一次性研杵研匀20秒。用裂解缓冲液将100ml的样品稀释10倍，再取100ml进行DNA/RNA提取。提取的DNA/RNA用～40ml的洗提缓冲液(Organon Teknika)洗提并在-70℃下保存。
本研究中所用的所有分子信标探针在其结构的5′末端具有荧光团FAM(6-羧基荧光素)。FAM与耦合到3′末端的通用猝灭剂4-(4′二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)的可变茎-环序列相结合。上述探针由比利时Eurogentec提供。反应中使用的MB的终浓度为2.5mM。对于实时NASBA我们采用Nuclisens Basic Kit试剂盒(Organon Teknika，Netherland)，该试剂盒可用来开发用户定义的RNA扩增法。NASBA扩增在20μl的体积中进行。将引物组和探针导向高风险HPV 16、18、31和33的全长E6/E7mRNA。为避免核酸降解出现假阴性结果，作为性能对照，我们使用了导向人U1核内小核糖核蛋白(snRNP)特异性A蛋白(U1 mRNA)(Nelissen等，1991)的引物组和探针。所有样品都在不同仪器(测量荧光度和吸光度的微型板阅读器，自MWG的Bio-tek FL-600FA)上进行重复试验。从CaSki/SiHa或HeLa细胞分离得到的mRNA分别用作HPV 16和HPV 18转录物的阳性对照。在每7个反应中有一个使用除mRNA以外的所有试剂的反应作为阴性对照。
HPV DNA分析；聚合酶链式反应
PCR使用的提取物及其量与NASBA反应中使用的一样。用L1共有引物Gp5+/6+检测含HPV DNA的所有样品。PCR扩增按上述方法进行。第一次DNA变性在94℃下进行2分钟，然后进行40轮PCR：94℃下变性1分钟，40℃下退火2分钟，72℃下延长1.5分钟，最后在72℃下延长4分钟。如上所述，使用针对HPV 16、18、31和33(6/11、35、45、51、52、58)的PCR类型特异性引物对HPV进行分型。
结果
最初，在通过细胞学检查确诊CIN I、CIN II或CIN III后，收集了190名患者的活检组织。通过组织学检查确认高级病变，其中有150个样品诊断为CIN III(78.9％)。在进行锥形切除术前收集的活检组织2用以进行RNA分析。但是，对此活检组织进行的组织学检查，结果在原确诊为CIN III的150个样品中只诊断出53个样品[54个样品无诊断结果，24个样品诊断为CIN II，18个样品诊断为CIN I，另4个样品诊断为HPV/湿疣]。CIN II样品的数量从16个(8.4％)增加到30个(15.8％)[通过组织学检查I有24个样品诊断为CIN III，4个样品为CIN II，1个样品为癌，还有1个样品为CIN I。组织学检查I确诊的12个CIN II病例在组织学检查II中的确诊率下降]。CIN I的确诊数量从6个样品(3.2％)升至32个样品(16.8％)。两个鳞状细胞癌在组织学检查II中被诊断为CIN III，腺癌则被诊断为CIN II。在71个样品(38.4％)当中没检出高级病变。
在190名患者中有69名(36％)检出HPV致癌性RNA。在经组织学检查II确诊为CIN III的53个(28％)样品中，我们发现有40个(76％)样品显示HPV 16、18、31或33癌基因表达。此外，我们发现，在30个CIN II病例中有9个(30％)存在癌基因表达，同样在32个CIN I病例中有4个(13％)、在71个不显示细胞异常的病例中有14个(20％)、在4个诊断为HPV/湿疣的病例中有2个(50％)存在癌基因表达。
在190名患者中发现42名有HPV 16RNA，7名(3.7％)有HPV18，15名(7.9％)有HPV 31，8名(4.2％)有HPV 33。1名患者同时感染HPV 16和HPV 18，还有1名患者同时感染HPV 16和HPV 31。
使用导向编码主要衣壳蛋白的L1基因的共有Gp5+/6+引物，通过PCR在190个子宫颈活检组织中有81个(43％)存在HPV。在第二次组织学检查进行诊断的119个病例(115个病例诊断为CIN，4个病例诊断为HPV/湿疣)中，发现有63个病例含HPV DNA。接受检测的另外18个病例没有得出任何组织学诊断结果。在81个病例中有20个不是通过NASBA检测的，这20个病例中有7个诊断为CIN III，2个诊断为CIN II，4个诊断为CIN I，7个没有确诊结果。
类型特异性PCR检出有85个病例存在HPV；有66个病例存在HPV 16，有10病例存在HPV 18，有14个病例存在HPV 31，有7个病例存在HPV 33。有12个病例存在多重感染：3个感染HPV16+18，4个感染HPV 16+33，5个感染HPV 16+31。有20个病例无确诊结果。
实施例4
通过PrTect HPV-Proofer和PCR检测HPV(与细胞学检查和组织学检查相比较)：
正常样品和ASCUS样品(包括疑似涂片)用细胞学方法进行检查。所有样品都用共有PCR和PreTect HPV-Proofer测试，但只有共有阳性样品通过PCR进行分型。CIN 3样品和癌症样品通过组织学方法进行检查，所有样品均用三种方法进行测试。结果在图6中显示。下表15显示与细胞学检查和组织学检查相比实时多重NASBA和PCR之间的一致性。
表15：与细胞学检查或组织学检查相比实时多重NASBA和PCR之间的一致性
  细胞学检查/组织学检查   一致性<sup>a</sup>(数量)   一致性<sup>b</sup>(数量)
  正常   98.2％(4043)   42.8％(138)
  ASCUS<sup>c</sup>   94.5％(55)   78.6％(14)
  CIN 3   94.3％(53)   93.2％(44)
  癌症   99.0％(196)   98.8％(170)
只对通过Gp5+/6+PCR证明阳性的样品进行分型。
a包括PCR和实时多重NASBA阳性和阴性样品。b只包括PCR和/或实时多重NASBA阳性样品。cASCUS，排除疑似涂片。
实施例5
本发明提供了用以检测HPV E6基因的mRNA转录物的试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种、两种或多种并优选所有以下引物对和伴随的鉴定探针。
HPV 16：HPV16.txt 7905b.p
HPV16P2：
p2：116(20)GATGCAAGGTCGCATATGAGCCACAGGAGCGACCCAGAAA
16p1(no7)
AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG ATT CCC ATC TCT ATA TAC TA(51baer)
HPV16PO2：
po：230(20)TATGACTTTGCTTTTCGGGA
H16e6702po
HPV 18：HPV18.txt 7857b.p
HPV 18P2：
p2：698(22)GATGCAAGGTCGCATATGAGGAAAACGATGAAATAGATGGAG
H18e6702p2
HPV18P4：
p1：817(20)
AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGGTCGTCTGCTGAGCTTTCT
H18e6703p1(Multiplex)
HPV18PO2：
po：752(21)GAACCACAACGTCACACAATG
H18e6702po
HPV 31：HPV31.txt 7912b.p
HPV31P3：
p2：617(20)GATGCAAGGTCGCATATGAGACTGACCTCCACTGTTATGA
H31e6703p2
p1：766(20)
AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTATCTACTTGTGTGCTCTGT
H31e6703p1
HPV31PO4：
po：686(26)GGACAAGCAGAACCGGACACATCCAA
H31e6704po
HPV 33：HPV33.txt 7909b.p
HPV33P1：
p2：618(22)GATGCAAGGTCGCATATGAGTATCCTGAACCAACTGACCTAT
H33e6701p2
p1：763(19)
AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTTGACACATAAACGAACTG
H33e6701p1
HPV33PO3：
po：699(23)GGACAAGCACAACCAGCCACAGC
H33e6703po
所述试剂盒还可任选包括一种或多种以下分子信标探针，作为上述探针的替代物：
分子信标探针：
H16e6702mb2-FAM         ccagetTATGACTTTGCTTTTCGGGAagctgg
H18e6702mb1-TxR         cgcatgGAACCACAACGTCACACAATGcatgcg
H31e6704mb2-FAM         ccgtcgGGACAAGCAGAACCGGACACATCCAAcgacgg
H33e6703mb1-FAM         ccaagcGGACAAGCACAACCAGCCACAGCgcttgg
优选本发明试剂盒还包括以下引物对和探针：
HPV45：HPV45.txt 7858bp(X74479)
HPV45P1：
p2：430(21)：GATGCAAGGTCGCATATGAGAACCATTGAACCCAGCAGAAA
H45e6701p2
p1：527(22)：
AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCTTTCTTGCCGTGCCTGGTCA
H45e6701p1
HPV45PO1：
po：500(20)：GTACCGAGGGCAGTGTAATA
H45e6701po
上述HPV 45探针可如下用HPV分子信标探针取代：
H45e6701mb1 cgatcgGTACCGAGGGCAGTGTAATAcgatcg
此外，取决于使用所述试剂盒的地区，所述试剂盒可包括一种或多种以下引物对和伴随的鉴定探针。
HPV52P1：
p2：144(22)：GATGCAAGGTCGCATATGAGTTGTGTGAGGTGCTGGAAGAAT
H52e6701p2
p1：358(18)：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCCCTCTCTTCTAATGTTT
H52e6701p1
HPV52PO1：
Po：296(20)：GTGCCTACGCTTTTTATCTA
H52e6701po
HPV58HPV58.txt 7824bp (D90400)
HPV58P2：
p2：173(18)：GATGCAAGGTCGCATATGAGTCTGTGCATGAAATCGAA
H58e6702p2
p1：291(18)：
AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGAGCACACTTTACATACTG
H58e6702p1
HPV58PO2：
po：218(22)：TTGCAGCGATCTGAGGTATATG
H58e6702po
HPV51HPV51.txt 7808bp (M62877)
HPV51PA/P：
p2：655(23)：GATGCAAGGTCGCATATGAG AGA GGA GGA GGA TGA AGT AGA TA
H51e6702p2
p1：807(20)：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG GCC CATTAA CAT CTG
CTG TA H51e6701p1
HPV51POA：
po：771(24)：TGG CAG TGG AAA GCA GTG GAG ACA
H51e67o2po
在试剂盒中，上述探针可用以下分子信标探针取代：
H52e6701mb1  cgatcgGTG CCTACGCTTTTTATCTAcgatcg
H58e6702mb1  ccgtcgTTGCAGCGATCTGAGGTATATGcgacgg
H51e6702mb1  cgatccgTGG CAG TGG AAA GCA GTG GAG ACAcgatcg。

Claims (13)

1. HPV E6基因的mRNA转录物在制备通过使用等温扩增并结合对所述扩增产物的实时检测对E6 mRNA表达进行检查，来检查人类个体以评估她们发生宫颈癌的风险的试剂盒中的应用。
2. HPV E6基因的mRNA转录物在制备通过使用等温扩增并结合对所述扩增产物的实时检测对E6 mRNA表达进行检查，来鉴定宫颈细胞异常改变的人类个体的试剂盒中的应用。
3. 权利要求1或2的应用，其中等温扩增为NASBA、转录介导性扩增、RNA的信号介导性扩增或等温溶液相扩增。
4. 权利要求3的应用，其中对E6 mRNA表达的检查是通过使用实时NASBA来进行的。
5. 权利要求1或2的应用，其中人类个体为以前曾被鉴定为子宫颈细胞感染人乳突淋瘤病毒DNA的个体。
6. 权利要求1或2的应用，其中人类个体为以前曾被诊断为ASCUS、CIN1病变或湿疣的个体。
7. 权利要求1或2的应用，其中所述E6 mRNA为至少一种癌相关HPV类型的E6 mRNA。
8. 权利要求7的应用，其中所述E6 mRNA为HPV类型16、18、31、33、45的E6 mRNA。
9. 权利要求8的应用，其中所述E6 mRNA为HPV类型45的E6mRNA。
10. 一种用于检测HPV E6基因的mRNA转录物的试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种能通过NASBA扩增HPV类型16、18、31和33的E6转录物某区域的引物对以及一种或多种分子信标探针。
11. 权利要求10的试剂盒，所述试剂盒包含分别对HPV类型16、18、31和33具有特异性的引物对。
12. 权利要求10或11的试剂盒，所述试剂盒包含一种或多种、两种、多种或所有种类的以下引物对及相应的分子信标鉴定探针：
5′gatgcaaggtcgcatatgagCCACAGGAGCGACCCAGAAA和5′AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGATTCCCATCTCTATATACTA，以及探针TATGACTTTGCTTTTCGGGA
5′gatgcaaggtcgcatatgagGAAAACGATGAAATAGATGGAG和5′AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGGTCGTCTGCTGAGCTTTCT，以及探针GAACCACAACGTCACACAATG
5′gatgcaaggtcgcatatgagACTGACCTCCACTGTTATGA和5′AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTATCTACTTGTGTGCTCTGT，以及探针GGACAAGCAGAACCGGACACATCCAA
5′GATGCAAGGTCGCATATGAGTATCCTGAACCAACTGACCTAT和5′AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTTGACACATAAACGAACTG，以及探针GGACAAGCACAACCAGCCACAGC。
13. 权利要求12的试剂盒，所述试剂盒包含所有种类的所述引物对及相应的分子信标鉴定探针。
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