CN100490893C - 成骨组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及任选地存在于可药用载体例如生物可降解的聚合物中的含有协同量的至少一种骨形态发生蛋白(BMP)和协同量的至少一种吡咯烷酮的药物组合物。本发明还涉及对需要矫形外科及牙科包括牙周治疗的患者通过同时施用任选地存在于可药用载体中的协同量的至少一种骨形态发生蛋白(BMP)和协同量的至少一种吡咯烷酮而治疗矫形外科及牙科包括牙周疾病的方法。

Description

成骨组合物
发明领域
本发明涉及任选地存在于可药用载体例如生物可降解的聚合物中的含有协同量的至少一种骨形态发生蛋白(BMP)和协同量的至少一种吡咯烷酮的药物组合物。本发明还涉及对需要矫形外科及牙科包括牙周疾病治疗的患者同时施用任选地存在于可药用载体中的协同量的至少一种骨形态发生蛋白(BMP)和协同量的至少一种吡咯烷酮而治疗矫形外科及牙科包括牙周疾病的方法.
发明背景
在过去的十年里，引导骨再生术(GBR)已经成为了一种可预测的并且有效的促进骨愈合的方法，特别是与牙种植体植入术联合应用时，GBR是一种临床详细记载的且成功的方法[Dahlin，C.等，Int J PeriodonticsRestorative Dent 11(1991)273-281；
Figure C200480005562D0004151919QIETU
，C.H.和Karring，T.，Periodontol 2000 17(1998)151-175；Nyman，S.R.和Lang，N.P.，Periodontol 2000 4(1994)109-118]。在GBR中，采用了膜以隔离结缔组织并为骨填充维持空的间隙。
如在该空的间隙中填充用作新生骨支架的多孔材料，则可通过骨传导(Osteoconduction)原理加速骨填充过程[Reddi，H.，Cytokine & GrowthFactor Reviews 8(1997)11-20]。备选地，骨诱导(osteoinduction)可以加速骨修复，此方法则涉及到应用可将充质干细胞分化为成骨细胞的适当生长因子[Wozney，J.M.和Rosen，V.，Clin Orthop Rel Res 346(1998)26-37]。
骨诱导中最有用的生长因子为骨形态发生蛋白(BMPs)，骨形态发生蛋白为分化因子，且人们根据其诱导骨形成的能力已将其分离[Wozney，J.M.等，Science 242(1988)1528-1534]。它们与三十多个TGF-β超家族成员共同构成了BMP家族。BMP家族分成不同的亚家族，包括BMP(例如，BMP-2和BMP-4)、成骨蛋白(OPs)(例如，OP-1或BMP-7、OP-2或BMP-8、BMP-5、BMP-6或Vgr-1)、软骨来源的形态发生蛋白(CDMPs)(例如，CDMP-1或BMP-14或GDF-5)、生长/分化因子(GDFs)(例如，GDF-1、GDF-3、GDF-8、GDF-9、GDF-11或BMP-11、GDF-12及GDF-14)及其他亚家族(例如，BMP-3或成骨蛋白、BMP-9或GDF-2、以及BMP10)(Reddi等，1997，见上文)。
特别是在动物模型中，已经证明BMP为骨形成和骨修复的强力诱导物。然而，鉴于BMP与体液接触后的即时降解性及BMP的强形态发生作用，需要非生理性的高剂量BMP用于骨诱导的生物活性[Weber，F.E.等，Int JOral Maxillofac Surg 31(2002)60-65；Rose，F.R.A.和Oreffo，R.O.C.，Biochem Bio-phys Res Com 292(2002)1-7].由于必须采用局部施用途径，故而载体系统的选择至关重要，但是目前并无适合的载体系统。由于通常采用重组技术生产BMP，因此其价格昂贵、数量有限，所以尽管BMP具有公认的效果，但并未对患者的医学治疗产生任何的影响，且当前亦未应用于临床。
目前，控释系统所采用的材料是生物可降解的(亦称为可再吸收的、可吸收的、和易蚀性的)聚合物(包括由于其短暂异物反应及其再生组织能力可种植于所要治疗的患者体内的聚合物)(见，例如，The BiomedicalEngineering Handbook，Bronzino，J.D.编著，CRC Press Boca Raton 2000，41章，41-1页到41-22页)。研究最为深入的生物可降解聚合物包括：聚乳酸(PLA)、聚(丙交酯共乙交酯)-聚乙二醇(PLG-PEG)共聚物、PLG-PGA共聚物等。然而，合成的生物可降解聚合物是刚性的，缺乏应用于例如GBR，特别是牙科GBR所需之柔韧性。
在已公开的美国专利申请第20030104029号中，申请者公开了通过用已知的增塑剂N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)处理可软化生物可降解聚合物的刚性并增加其柔韧性，从而使其得以应用于GBR。另外，人们还发现，NMP其本身亦具有意外的骨形成诱导作用。
在应用BMP及应用生物可降解聚合物作为医药载体方面仍然需要新方法。
本发明之目的即是为了满足该需要并提供克服上述缺点和缺陷的新方法。
本发明的一个目的就是利用BMP的骨形成诱导活性对牙科包括牙周病学以及其他医学领域，例如矫形外科中患者的治疗。
本发明的另一个目的是提供降低BMP，特别是重组生产的BMP的使用剂量，并由此可以安全且经济有效的使用BMP对牙科包括牙周病学以及其他医学领域例如矫形外科方面的患者进行治疗的方法。
本发明的另一个目的就是提供使用引导骨再生术(GBR)的新方法。
本发明的另一个目的就是提供在GBR中使用生物可降解膜从而避免二次手术阶段的新方法。
本发明的另一个目的就是提供以协同方式利用BMP的骨形态发生性质和吡咯烷酮(例如NMP)的骨形成诱导性质的药物组合物，该药物组合物可用于治疗牙科和牙周疾病，包括牙种植体整合及拔牙后的牙槽填充。
本发明的另一个目的就是提供以协同方式利用BMP的骨形态发生性质、吡咯烷酮(例如NMP)的骨形成诱导性质及生物可降解聚合物的药物组合物，该药物组合物可用于治疗，特别是通过引导骨再生术(GBR)治疗牙科和牙周疾病，包括牙种植体整合及拔牙后的牙槽填充。
本发明的另一个目的就是提供一种对需要骨形成诱导的受试者进行治疗的方法，在该方法中以协同方式利用BMP的骨形态发生性质、吡咯烷酮(例如NMP)的骨形成诱导性质及任选地生物可降解聚合物，以治疗牙科和牙周疾病，包括牙种植体整合及拔牙后的牙槽填充，及治疗需要加强骨折愈合和骨增高的矫形外科疾病和缺损，例如牙槽嵴增高术、窦底提升术和骨不连合的治疗，包括改善外科骨手术或偶然性骨折患者康复。
发明概述
目前人们惊奇地发现，将BMP仅与吡咯烷酮或与任选地吡咯烷酮(例如，NMP)预处理的生物可降解的植入体(尤其是膜)联合施用，则能以协同方式将骨形成增强至基于现有技术所报道的BMP或NMP或NMP与生物可降解聚合物的联合的单一骨形成诱导活性所意想不到的水平。
本发明涉及任选地存在于可药用载体中的含有至少一种骨形态发生蛋白(BMP)和至少一种吡咯烷酮的药物组合物，其中该BMP和该吡咯烷酮均为对骨形成有协同治疗作用的量。
在本发明的一个实施方案中，吡咯烷酮是N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)并且BMP是重组BMP，其中该NMP和该重组BMP均为对骨形成有协同治疗作用的量。
在本发明的另一个实施方案中可药用载体是一种生物可降解的聚合物。
在本发明的另一个实施方案中可药用载体是一生物可降解的聚合物，该生物可降解的聚合物已经过吡咯烷酮预处理。
本发明实施方案的一个实例就是含有至少一种骨形态发生蛋白(BMP)、一种吡咯烷酮及一种生物可降解的聚合物的药物组合物，其中该BMP、该吡咯烷酮和该生物可降解的聚合物以对骨形成有协同治疗作用的量存在。
本发明一个实施方案的另一个实例是含有至少一种重组骨形态发生蛋白(rBMP)、甲基-2-吡咯烷酮(NMP)和已用NMP预处理的生物可降解聚合物的药物组合物，其中该重组骨形态发生蛋白(rBMP)、该NMP和该预处理的生物可降解的聚合物以对骨形成有协同治疗作用的量存在。
本发明还涉及对需要骨形成诱导的受试者进行治疗的方法，该方法包括对该受试者同时施用任选地存在于可药用载体中的至少一种骨形态发生蛋白(BMP)和至少一种吡咯烷酮，其中该BMP和该吡咯烷酮以对骨形成有协同治疗作用的量存在。
附图简述
图1表明引导骨再生术和NMP可提高骨修复：将颅盖骨内6毫米(直径)的缺损分别以3种不同的膜(E1M-11，Osseoquest和E1M-11 NMP)处理或不经处理(作为对照)。术后四周，测定缺损处的骨再生情况。上侧部分(图1A)显示了缺损中出现骨再生区域与原缺损区域的百分比。各数值代表了8个独立缺损的结果，并给出了相应的P值。用Goldener-Trichrome染色后缺损的中截面进行评估。在下侧部分(图1B)，显示了对照和E1M-11NMP处理过的缺损的中截面的一个实例。Goldener-Trichrome染色后，骨呈色为暗绿及类骨红，并指明了缺损范围。
图2显示NMP于体外诱导加大成骨细胞前体细胞系(MC3T3-E1)的成熟。图2A：以增加量的NMP处理MC3T3-E1细胞并于6天后以碱性磷酸酶活性检测细胞的成熟状况。当NMP施用量在0至5mM范围时MC3T3-E1细胞的成熟随NMP施用量以浓度依赖的形式增加。图2B：Alizarin S-染色法显示接种于6孔板内的MC3T3-E1细胞的矿化情况。在5mM磷酸甘油和1μg/ml rhBMP存在的条件下，将MC3T3-E1细胞培养四周。在整个实验过程中，上方的一排培养孔内未加入NMP，下方的一排培养孔内加入2.5μM NMP。与上方一排相比下方一排的红色染色区域的增加，这表明当有2.5mM NMP存在时由矿化确定的成熟增加。
图3显示了通过碱性磷酸酶活性检测的NMP和rhBMP-2对MC3T3-E1细胞成熟的协同作用。在培养基内存在或缺少1μg/ml rhBMP-2的条件下以NMP处理MC3T3-E1细胞。为了计算协同效应，将BMP单独处理诱导的ALP活性和NMP单独处理诱导的ALP活性自BMP和NMP同时存在而诱导的ALP活性中减除。标准差已在图表中指出。
图4显示了不同吡咯烷酮溶解rhBMP-2二聚体的能力与相同物质对成骨细胞前体细胞系(MC3T3-E1)的成熟的影响之间的相关性。图4A：将rhBMP-2二聚体颗粒置于溶有增加量的不同吡咯烷酮的磷酸缓冲盐溶液中溶解2小时。(NMP：1-甲基-2-吡咯烷酮；NEP：1-乙基-2-吡咯烷酮；PB：2-吡咯烷酮；CP：1-环己基-2-吡咯烷酮)。显示了溶解rhBMP-2的吡咯烷酮浓度依赖性。图4B显示了NMP、NEP、PB和CP对MC3T3-E1细胞成熟的影响。培养基中四种吡咯烷酮的浓度均为5mM。
发明详述
本发明建立在申请人关于吡咯烷酮，特别是NMP，增强骨再生的作用机制的进一步研究的基础之上。由一种合成的生物可降解的聚合物即聚丙交酯/乙交酯(PLGA)组成的吡咯烷酮处理过的膜，对于在GBR中应用而言过于坚硬，但当以增塑剂N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)软化该膜后，该膜与未处理的或质地柔韧的PLGA膜相比具有较好的体内骨再生能力，在大鼠体内和产生BMP的细胞中都具有良好的骨再生能力，但在不产生BMP的细胞系中不具有所述能力。
选择颅盖缺损模型作为动物模型，因为骨的低血液供给和骨的膜(皮层的)结构不利于骨愈合，故使颅盖缺损模型成为了最佳选择模型。缺损尺寸需低于缺损临界尺寸并应选择与上颌面手术中切骨术缺口和牙科缺损的典型尺寸相似的缺损尺寸(Klinge，B.，等为，J Oral Maxillofac Surg 50(1992)241-249)。在此动物模型中，对两种商业膜E1M-11和Osseoquest以及经NMP处理的E1M-11膜进行了检测，结果表明其均可改善骨再生(图1)。
然而，经NMP处理的膜的效果明显较好并且人们推断这是由于经BMP受体的信号转导的增强。成骨细胞前体细胞系(MC3T3-E1)的体外研究数据支持了这种解释，对该细胞系施用低剂量NMP可促进其成熟(图2)。已知此细胞系可分泌BMP，将其沉淀于细胞外基质并通过细胞外BMP排他性地作用于经Smads的BMP信号转导而成熟[Suzawa，M.等，Endocrin 140(1999)2125-2133]。C3H10T1/2细胞中也存在同样的信号转导通路[Katagiri，T.，等，Biochem Biophys Res Com 172(1990)295-300]，但对该细胞施用NMP后并无任何反应。因此，NMP的作用位点并不在BMP的受体水平上或其下游，而是NMP直接作用于细胞外的BMP。因此，NMP诱导的见于体内的骨再生的改善以及于体外促进MC3T3-E1细胞成熟，是由NMP介导的存在于两种体系中自体BMP生物活性/生物利用率的增高所致。
在GBR中，联合使用经NMP处理的合成的生物可降解的聚合物膜，例如PLGA膜，将该膜的功用由纯粹地将结缔组织与骨向内生长所需的空隙分离开的机械隔离物扩展至NMP的递送装置。通过这种联合使用，GBR与骨诱导产生了直接关联，因为体内的自体BMP的生物活性/生物利用率发生了实质性的增高。为了在相同动物模型中获得具有可比性的骨再生数值，则需使用15μg的rhBMP-2(未显示结果)，此剂量相当于一只家兔体内存在的BMP总量(由小牛体内BMP含量计算所得；Reddi等，1997，见上)。
因此，在此模型内使用NMP也是加强自体愈合的良好实例，在本情况中，所述加强是通过自体BMP。
这些结果激励申请人针对NMP对加入的BMP的作用进行了进一步的研究，并期望降低临床应用所需的外部BMP量。
然而令人吃惊的是，进一步的研究发现BMP与吡咯烷酮，例如NMP，联合施用则能以协同方式将骨形成提高至基于现有技术所报道的BMP或NMP的单一骨形成诱导活性所意想不到的水平(图3)。
这有利于以较少量的材料达到预期的效果，这一点对于繁重的生产，特别是rBMP的生产是至关重要的。同时，当使用较小量外源物质时，也可以显著降低副作用的风险。总之，本发明第一次使利用BMP(特别是rBMP)的骨诱导能力进行经济有效的治疗成为可能。
对于本目的而言，术语BMP或rBMP分别指以二聚体自然产物或重组产物形式存在的BMP家族成员。因此，例如，当使用重组技术进行生产时，术语rBMP包括BMP亚家族成员(例如，BMP-2和BMP-4)、成骨蛋白(OPs)亚家族成员(例如，OP-1或BMP-7、OP-2或BMP-8、BMP-5、BMP-6或Vgr-1)、软骨形态发生蛋白(CDMP)亚家族成员(例如，CDMP-1或BMP-14或GDF-5)、生长分化因子(GDF)亚家族成员(例如，GDF-1、GDF-3、GDF-8、GDF-9、GDF-11或BMP-11、GDF-12及GDF-14)及其他BMP亚家族成员(例如，BMP-3或成骨蛋白、BMP-9或GDF-2、BMP-10、BMP-15与BMP-16)。本发明药物组合物中的BMP和rBMP的优选实例包括天然和重组BMP-2、BMP-4、BMP-6和BMP-7，目前已知这些BMP均明确参与新骨形成。然而，本发明范围也意欲涵括含有骨形成中作用未明的BMP的组合物。
本发明中的天然BMP可以，例如，如Johnson EE等[Clin Orthop 250(1990)234-240]所述自人骨或本领域专业人员可轻易认识到的其他哺乳动物骨源中获取。
本发明中的rBMP可以通过标准重组技术利用原核和真核表达体系以常规方法进行制备。在这方面，可参考(例如)Cerletti等(欧洲专利申请0433 225 A1号)与Israel D.I.等人(Growth Factors 7(1992)139-150)。以原核表达体系，例如大肠杆菌(Escherichia coli)株系及其他适当的细菌株系生产具有产量方面的优势。原核表达体系尤其适合于生产rBMP单体，然后可以如Cerletti等(见上)所述将rBMP单体二聚体化。另一方面，真核表达体系，例如哺乳动物细胞或昆虫细胞，尤其是哺乳动物细胞和使用无蛋白质培养基的真核表达体系，在产品安全性方面具有优势。适当的哺乳动物细胞实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。哺乳动物表达体系特别优选生产rBMP。然而，选择适当的生产系统在本领域技术人员的知识范围内。
本发明药物组合物中所用的吡咯烷酮是化学领域公知的具有增塑或溶解性质但并无组织损伤作用或毒性作用的任何吡咯烷酮。此类吡咯烷酮包括，例如，烷基-或环烷基-取代的吡咯烷酮，例如，1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、1-乙基-2-吡咯烷酮(NEP)、2-吡咯烷酮(PB)、和1-环己基-2-吡咯烷酮(CP)，NMP和NEP为优选实例。另外，基于吡咯烷酮的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮，也可用于本发明药物组合物中。
本发明的药物组合物可以含有可药用载体。该载体可以是任何适当的液体、固体或半固体载体，包括水、盐水、缓冲液(例如磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐和类似的缓冲液)，以形成溶液或悬浮液，或天然的或合成的生物可降解的聚合物或共聚物。鉴于组合物中吡咯烷酮组分的增溶性质，通常无需另加入佐剂以提高BMP组分的溶解性。然而，液体载体则可以含有通常用以制备药物溶液和悬浮液的佐剂，例如共溶剂、去污剂、稳定剂、抗氧化剂、粘性改善剂、防腐剂等。必要时可以采用任何适当的消毒方法，例如膜过滤，对组合物予以消毒处理。
在本发明的一个优选实施方案中，可药用载体是一种基于合成的生物可降解聚合物的缓释系统，该生物可降解聚合物是例如聚乙醇酸交酯、聚丙交酯、聚己酸内酯、聚碳酸亚丙基酯、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯、聚二噁烷酮、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚酪氨酸碳酸酯(polytyrosinecarbonates)、聚原碳酸酯、聚草酸亚烷基二醇酯、聚琥珀酸亚烷基二醇酯、聚苹果酸、聚马来酐、多肽、聚缩酚肽(polydepsipeptide)、聚乙烯醇、聚酯酰胺、聚酰胺、聚酐、聚氨酯、聚磷腈、聚氰基丙烯酸酯、聚富马酸酯、聚氨基酸)、改性多糖(如纤维素、淀粉、葡聚糖、几丁质、脱乙酰壳多糖等)、改性蛋白质(如胶原、酪蛋白、纤维蛋白等)及它们的共聚物、三元共聚物或组合物或混合物或聚合物混合物。聚乙醇酸交酯、聚(L-丙交酯共乙交酯)、聚(D，L-丙交酯共乙交酯)、聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)、聚(L-丙交酯共D，L-丙交酯)、聚己酸内酯、聚(L-丙交酯共己酸内酯)、聚(D，L-丙交酯共己酸内酯)、聚碳酸亚丙基酯、聚(L-丙交酯共聚碳酸亚丙基酯)、聚(D，L-丙交酯共碳酸亚丙基酯)、聚二噁烷酮和它们的共聚物、三元共聚物以及聚合物混合物是多聚物的高度优选的实例。聚丙交酯与乙交酯的共聚物，例如聚-DL-丙交酯共乙交酯(PLGA)，是最优选的载体。
本发明中有用的可药用载体的其他实例包括蛋白质(如胶原蛋白和纤维蛋白)、磷酸钙(磷酸三钙、羟基磷灰石)、骨接合剂、生物玻璃、珊瑚矿物质(Algipore
Figure C200480005562D0012152312QIETU
)、珍珠质、蛋壳、牛源羟基磷灰石(Bio-Oss
Figure C200480005562D0012152312QIETU
)和所有的骨传导性(多孔的)材料。
本发明的药物组合物可以通过任何能够同时施用BMP组分和吡咯烷酮组分的适当的方式进行配制。在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以通过混合适当的骨形成诱导量的BMP和吡咯烷酮组分以及任选地可药用载体加以制备。
另外，在本发明的另一个实施方案中，使用了一种以吡咯烷酮预处理的生物可降解的聚合物，该生物可降解的聚合物以膜的形式为优选。处理过程仅仅是将已塑型的聚合物浸入含有所需吡咯烷酮的溶液中一段时间(软化聚合物所需的时间)，例如15秒到3分钟，或使聚合物中的吡咯烷酮浓度实现恒定，继而将聚合物风干。然后，通过载体膜的肝素化[Ruppert，R.等Eur J Biochem 237(1996)295-302]导入BMP。聚合物应该足够长时间保持柔韧性以便于插入植入物。另外，以吡咯烷酮和BMP的混合物对已塑型的聚合物进行相似的预处理，借此BMP通过简单的吸收作用吸附于聚合物之上。另外，BMP也可以分开但是同时应用于不同载体，例如纤维蛋白、胶原蛋白、聚乙二醇、生物玻璃、羟基磷灰石、磷酸钙和类似的载体材料，如上述。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物以植入物的形式存在，包括膜、薄膜膜、板、网眼板、螺旋片(screws tabs)及其他有形物体。
本发明的药物组合物中含有骨形成诱导量的至少一种BMP或rBMP和骨形成诱导量的至少一种吡咯烷酮。该量可能是例如每剂组合物中含有大约0.001毫克到大约4毫克的BMP或rBMP和大约0.005％到大约50％(重量百分数)的吡咯烷酮。然而，骨形成诱导量对于不同的应用也各有不同，特别是对于BMP而言。因此，某些情况施用较少量即可，例如，牙科应用，然而某些情况则可能需要较大量才能获得所需效果，例如，单边和多边的脊柱融合术、治疗骨不连合、治疗骨质疏松症和(髋)植入物的向内生长。
本发明中组合物的剂量需视患者个体和病症情况而定。本发明组合物的示范单剂量是在大约0.001毫克到大约4毫克。然而，某些情况施用较少量即足够，例如对牙科患者进行治疗，而对于其他的治疗则可能需要较大量才能获得预期效果。
本发明的治疗方法是基于同时使用至少一种骨形态发生蛋白(BMP)和骨形成诱导量的至少一种吡咯烷酮之上，由此而实现协同作用.在本发明的方法中，对需要骨形成诱导的患者同时施用任选地可用药载体中的骨形成诱导量的至少一种骨形态发生蛋白(BMP)和骨形成诱导量的至少一种吡咯烷酮，其中该BMP和该吡咯烷酮均以对骨形成有协同治疗作用的量予以施用。鉴于本发明中所述方法，所表述的＂同时施用＂包括同时施用和顺序施用两层含义。因此，在本发明的方法的一个实施方案中，BMP组分和吡咯烷酮组分可以以本发明药物组合物的形式予以施用。在本发明方法的另一个实施方案中，BMP可以顺序予以施用，先将以吡咯烷酮(例如NMP)预处理过的可药用载体引至治疗部位，继而施用适当的协同量的BMP。
该方法中所用的BMP组分量和吡咯烷酮组分量依据待治疗的情况而变化并由进行治疗的医师予以决定。示范剂量如上所给。
本发明由以下实施例加以说明，这些实施例仅用于说明用途。
通过商业途径可获得的软件包(SSPE，Chicago，II)采用非配对斯氏t检验进行统计分析。所有数值均以“平均值±该平均值标准误”的形式给出。
数据分析
为了定位宽度为6毫米的缺损边缘，以毫米为刻度自缺损中部摄取纵断面的数字图象。结合周围骨的颅盖骨厚度，可以重构出缺损总面积。缺损区域的总像素数可以利用Adobe Photoshop 5.0程序加以测定。也可以测定总缺损中由骨填充的部分并表达为骨面积的像素数。骨愈合的百分比计算如下：
骨愈合(％)＝骨面积的像素数X100/缺损的总像素数。
细胞培养技术和碱性磷酸酶测定。
以含有10％胎牛血清(Life Technologies，Inc.)、50μg/ml庆大霉素和50μg/ml抗坏血酸的α-改良极限必需培养基(Life Technologies，Inc.，格陵兰岛，纽约)培养MC3T3-E1细胞。以含有50μg/ml庆大霉素的Eagle基本培养基培养C3H10T1/2细胞。为了检测NMP对两种细胞系的作用，在6孔板的每个孔内种养1 x 105个细胞，随后加入NMP。三天后更换培养基，并依据Lowry，O.等[J.Biol.Chem.207(1954)19-37]的方法测定碱性磷酸酶(ALP)：通过加入400μl浓度为1M的NaOH将释放的对硝基苯酚转化为对硝基苯酚盐，并于410纳米(ε＝17500/摩尔x厘米)测量吸光度以对对硝基苯酚盐进行定量。碱性磷酸酶活性对总蛋白归一化并表示为每分钟每毫克蛋白质所产生硝基苯酚盐的纳摩尔数。
用已补充有5mM磷酸甘油和1μg/ml rhBMP-2的相同培养基培养MC3T3-E1细胞，并测定矿化。依照Bodine，P.V.N.等人[J Bone MineralRes 11(1996)806-819]，四周后进行茜素红-S染色。
实施例1：NMP处理后的PLGA膜对骨再生的作用
为了评估骨再生情况，在家兔的颅盖骨内产生出一些标准缺损。依照地方管理机构的准则对新西兰白兔(3.5到4.0公斤)进行处理。这些研究计划由苏黎士的Kantonalem 
Figure C200480005562D0015152442QIETU
所批准和监控。镇静后，利用牙科机头中6毫米的环钻产生一个6毫米的开颅缺损。为了自两侧封闭缺损，将一个直径为6.1毫米的膜插入颅盖骨。通过硬膜压力将该膜固定。将另一个10x10毫米的矩形膜置于缺损之上。将上面的四层膜缝合到一起并将整个部分缝合至残存骨膜的侧面。四周后将动物处死，将颅盖骨切除、放射照像、甲基丙烯酸酯包埋，并按Weber，F.E等人[Biochem.BiophysRes.Commun.286(2001)554-558]所述进行Goldner-Trichrome染色。
对均由PLGA组成的三种不同的膜：OsseoQuest(Gore Tex，美国)，E1M-11(Inion OY，芬兰)和NMP处理过的E1M膜(E1M-11NMP)进行检测。NMP处理包括将膜浸入NMP 30秒继而风干15分钟。如Weber，F.E.等人(2001，见上)所述产生骨诱导性rhBMP-2。
家兔颅盖骨内产生的标准缺损的骨再生估价表明，与未经处理的对照缺损相比3种膜均可显著提高骨愈合(图1)。NMP处理的E1M-11NMP膜对缺损的骨愈合最为有效，其缺陷的骨愈合率为79.06±5.6％。
与另外两种膜相比，经NMP处理的E1M-11NMP膜的骨再生的显著提高并不能仅仅归功于NMP对E1M-11膜的软化作用，因为参考膜OsseoQuest由于其织物样结构同样是软而柔韧的。因此，对邻近两个E1M-11NMP处理缺损的两个未处理对照缺损的结构进行了附加实验。由于这些未处理的缺损附近存在施用膜所带来的NMP，所以将这些未处理的缺损称为假对照缺损。结果表明，假对照缺损处的修复要明显好于真对照缺损(假对照修复率为60.05±5.4％；真对照修复率为30.3±4.1％；P<0.038)。因此，所有体内数据均表明NMP对骨愈合有促进作用。
实施例2：NMP处理的PLGA膜和rhBMP-2一起对骨再生的协同效应
首先，为了验证NMP的骨诱导活性，如上所述使用并培养一种鼠胚间充质干细胞系C3H10T1/2和一种成骨细胞前体细胞系MC3T3-E1。C3H10T1/2细胞可以分化为软骨、骨或脂肪细胞，而MC3T3-E1细胞可以产生并释放自体BMP。以碱性磷酸酶活性作为分化成为成骨细胞的标记。
如图2所示，低剂量的NMP可以将碱性磷酸酶活性提高到2.5-3.0倍，并促进MC3T3-E1中成骨前体细胞成熟为成骨细胞。成熟的加速也将持续较长时间，因为通过茜素-S染色检测发现，以NMP处理MC3T3-E1细胞将增强由成熟成骨细胞所进行的矿化作用(图2B)。另一方面，以高达5mMNMP处理的C3H10T1/2细胞的碱性磷酸酶活性并未发生提高(数据未显示)。因此NMP本身并无骨诱导作用。
由于上述两细胞系之间的主要差异就是是否存在BMP，只有MC3T3-E1细胞可以产生BMP，因此又在相同的测试系统内使用MC3T3-E1细胞对外来BMP的作用进行了研究。具体而言，在实验第一天将细胞在4ml培养基中铺板内并于第六天进行ALP检测。在第一天，于细胞内加入来自储备液(1mM HCl中2mg/ml rhBMP-2)的BMP至1μg/ml浓度。在同一时间点向细胞加入未稀释的NMP溶液从而使其浓度达到0.1-20mM。施用后，轻轻旋转整个六孔板以混合NMP和rhBMP。在单独的实验中，仅以NMP处理细胞。为了计算协同效应，将BMP单独处理诱导的ALP活性和NMP单独处理诱导的ALP活性自rhBMP和NMP同时存在而诱导的ALP活性中减除。结果如图3所示。
实施例3：不同吡咯烷酮同rhBMP-2的相互作用
由于NMP是一种众所周知的多种有机物和无机物的良好溶剂，因此对＂是否由于NMP对rhBMP的增溶作用而导致已观察到的NMP和BMP的协同效应＂进行了推测和分析。将二到二十微克的rhBMP蛋白于speed-vac冻干机内冻干以形成固体rhBMP片(disc)。加入含有增量的1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、1-乙基-2-吡咯烷酮(NEP)、2-吡咯烷酮(PB)和1-环己基-2-吡咯烷酮(CP)的50μl磷酸缓冲盐溶液，并于搅动下进行混合、溶解。两小时后，将残存片内的蛋白质沉降(22,000xg，30分钟)，并以狭线印迹方法(Weber，F.E.等，2002，见上)检测20微升上清液中所含的蛋白质含量。
如图4中所示，与实施例2中描述的体外研究所用的NMP浓度相同的吡咯烷浓度足够溶解否则不溶的rhBMP。结果如图4A所示，将不同的吡咯烷酮按其溶解rhBMP-2的能力以降序进行分级：1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)>1-乙基-2-吡咯烷酮(NEP)>2-吡咯烷酮(PB)>1-环己基-2-吡咯烷酮(CP)。
当以相同的吡咯烷酮如实施例2所述在MC3T3-E1细胞中进行试验时，碱性磷酸酶活性的增加也遵循相同的分级(图4B)。因此，吡咯烷酮溶解rhBMP的能力与吡咯烷酮对MC3T3-E1细胞成熟的影响之间存在着直接的联系。
将纯NMP对成骨细胞前体细胞系(MC3T3-E1)的作用进行了研究。结果表明，低剂量NMP促进成骨细胞前体细胞成熟为成骨细胞很可能是由于NMP结合和溶解自体骨形态发生蛋白(BMP)的能力引发BMP生物活性/利用率的增高所致。因此，NMP或其他吡咯烷酮可用于药物中以增强自体蛋白质的生物活性和和应用低溶解度重组蛋白质。另外，我们将GBR膜的功能从组织的机械隔离物扩展到生物活性物质的递送装置。
序列表
<110>苏黎世大学
<120>成骨组合物
<130>2021249US
<160>1
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>381
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
Figure C200480005562D00181
Figure C200480005562D00191

Claims (16)

1.含有存在于可药用载体中的至少一种重组骨形态发生蛋白(rBMP)和至少一种吡咯烷酮的用于增强骨形成的药物组合物，其中所述至少一种rBMP以0.001到4mg的量存在，所述至少一种吡咯烷酮以1到20mmol/l的量存在，所述两种量以协同方式增强骨形成。
2.权利要求1的药物组合物，其中吡咯烷酮选自以烷基或环烷基基团任选取代的吡咯烷酮和聚吡咯烷酮。
3.权利要求2的药物组合物，其中吡咯烷酮选自1N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、1-乙基-2-吡咯烷酮(NEP)、2-吡咯烷酮(PB)和1-环己基-2-吡咯烷酮(CP)。
4.权利要求3的药物组合物，其中吡咯烷酮是N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。
5.权利要求1的药物组合物，其中重组BMP选自rBMP-2、rBMP-3、rBMP-4、rBMP-5、rBMP-6、rBMP-7、rBMP-8、rBMP-9、rBMP-10、rBMP-11、rBMP-14、rBMP-15、rBMP-16、rGDF-1、rGDF-3、rGDF-8、rGDF-9、rGDF-12、rGDF-14及它们的混合物.
6.权利要求5的药物组合物，其中重组BMP选自rBMP-2、rBMP-4、rBMP-5、rBMP-6、rBMP-7及它们的混合物。
7.权利要求5的药物组合物，其中重组BMP选自rBMP-2、rBMP-4、rBMP-7及它们的混合物。
8.权利要求1的药物组合物，其中吡咯烷酮是N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，rBMP选自rBMP-2、rBMP-4、rBMP-7及它们的混合物。
9.权利要求1的药物组合物，其中可药用载体是生物可降解的聚合物。
10.权利要求9的药物组合物，其中生物可降解的聚合物选自聚乙醇酸交酯、聚丙交酯、聚己酸内酯、聚碳酸亚丙基酯、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯、聚二噁烷酮、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚酪氨酸碳酸酯、聚原碳酸酯、聚草酸亚烷基二醇酯、聚琥珀酸亚烷基二醇酯、聚苹果酸、聚马来酐、多肽、聚缩酚肽、聚乙烯醇、聚酯酰胺、聚酰胺、聚酐、聚氨酯、聚磷腈、聚氰基丙烯酸酯、聚富马酸酯、聚氨基酸、改性多糖、改性蛋白质、及它们的共聚物、及其混合物。
11.权利要求9的药物组合物，其中生物可降解的聚合物选自聚乙醇酸交酯、聚丙交酯、聚己酸内酯、聚碳酸亚丙基酯、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯、聚二噁烷酮、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚酪氨酸碳酸酯、聚原碳酸酯、聚草酸亚烷基二醇酯、聚琥珀酸亚烷基二醇酯、聚苹果酸、聚马来酐、多肽、聚缩酚肽、聚乙烯醇、聚酯酰胺、聚酰胺、聚酐、聚氨酯、聚磷腈、聚氰基丙烯酸酯、聚富马酸酯、聚氨基酸、改性多糖、改性蛋白质、及它们的三元共聚物、及其混合物。
12.权利要求9的药物组合物，其中生物可降解的聚合物选自聚乙醇酸交酯、聚(L-丙交酯共乙交酯)、聚(D，L-丙交酯共乙交酯)、聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)、聚(L-丙交酯共D，L-丙交酯)、聚己酸内酯、聚(L-丙交酯共己酸内酯)、聚(D，L-丙交酯共己酸内酯)、聚碳酸亚丙基酯)、聚(L-丙交酯共碳酸亚丙基酯)、聚(D，L-丙交酯共碳酸亚丙基酯)、聚二噁烷酮和它们的共聚物及其混合物。
13.权利要求9的药物组合物，其中生物可降解的聚合物选自聚乙醇酸交酯、聚(L-丙交酯共乙交酯)、聚(D，L-丙交酯共乙交酯)、聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)、聚(L-丙交酯共D，L-丙交酯)、聚己酸内酯、聚(L-丙交酯共己酸内酯)、聚(D，L-丙交酯共己酸内酯)、聚碳酸亚丙基酯)、聚(L-丙交酯共碳酸亚丙基酯)、聚(D，L-丙交酯共碳酸亚丙基酯)、聚二噁烷酮和它们的三元共聚物及其混合物。
14.权利要求12或13的药物组合物，其中生物可降解的聚合物是聚-DL-丙交酯共乙交酯(PLGA)。
15.权利要求1的药物组合物，其中可药用载体选自纤维蛋白、胶原蛋白、聚乙二醇、生物玻璃、
Figure C200480005562C0003083021QIETU
磷酸钙。
16.权利要求9的药物组合物，其中所述吡咯烷酮是NMP，所述生物可降解的聚合物是聚-DL-丙交酯共乙交酯(PLGA)。
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