CN100497641C - 生物芯片电穿孔仪及其在全方位单细胞电穿孔中应用 - Google Patents

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Abstract

将基因材料导入或者生物分子嵌入细胞在为了实验和应用目都增加吸引力的程序，因此电穿孔是一个被广泛使用的技术，但是单粘附细胞的电穿孔仍然很弱，本申请描述为一个用于处于任何发展阶段的粘附于基质的任何细胞的电穿孔设备，其中电信号被驱动并应用在一个在培养中的单粘附的细胞以便获得其电击穿。用发明的设备来电击一个单粘附细胞的方法也被描述。

Description

生物芯片电穿孔仪及其在全方位单细胞电穿孔中应用
技术领域：
本发明涉及在任何发展阶段的粘附于基质的任何细胞个体的电穿孔的方法和设备。
背景技术：
电穿孔是一个被广泛使用的技术，其被用于将基因材料导入或者生物分子嵌入细胞。向细胞实施一个电信号使得细胞膜上的孔开启，允许细胞外溶液中的分子进入细胞。
一些电穿孔技术已被确立。他们被分为两类：
(i)细胞群的电穿孔技术；
(ii)单细胞的电穿孔技术。
细胞群的电穿孔
悬浊液中细胞群的电穿孔(是最多使用的并且代表第一类)常规是在细胞从培养基中通过使用酶(例如胰岛素)分离之后被执行。然后细胞在电穿孔介质中悬浮，在典型的间隔为2或4毫米的两个大的金属电极之间使用高电压(高至1000伏或者更多)。细胞的悬浊液然后转入一个合适的培养室，在这里细胞自由沉淀下来并且粘附在基质底部，在那里他们被培养。
这一技术暗含着一些缺点：
-偶遇每一个细胞的实际电压不能被控制，一些靠近电极细胞在高电压应用期间死亡，其它细胞由于他们在电极之间的电场中位置并且电场的局部变化的不均衡性，其被电穿孔成不同深度。
-这一方法仅仅能够被应用于大的细胞群。
-细胞必须从粘着的基质脱离，这样细胞被加压且在这一阶段被毁坏。
单细胞电穿孔
单细胞电穿孔技术由罗宾斯基(Rubinsky et al.)等人开发并且被描述在6300108号美国专利中。
这个技术使用一个和一个硅微芯片一体的细胞大小的电穿孔室。细胞首先被引入室里并且被放置在硅基质的开口上，然后它被电穿孔并使得基因结构渗入。
以上技术有一些缺点：
-这一系统的建立比较复杂，此外，大批“单细胞电穿孔仪”集成进入一个微芯片还没有被实现并且根据现在技术发展水平将是昂贵的。
-细胞膜不能广泛的粘着到基质上，因此对于要求所有粘着的细胞生长和发展是不可能的(这是大部分类型细胞的情况)；
-细胞不得不被放置进入一个微室；这是一个困难的步骤并且远离用于细胞培养的常规步骤。
从上文中清楚得知：需求可以克服上述的那些缺点的电穿孔设备。
发明内容：
申请人现在发现一个对于粘附到基质任何种类的的细胞的个别的电穿孔的装置，以解决所有以上提及的缺点。
因此本发明的一个目的是提供包括一个波发生器的、一个包括一列微电极的生物芯片和一个允许传递信号给生物芯片的预选单微电极的控制系统的电穿孔设备。
本发明进一步的目的是生物芯片，其包括一列安置在在一个固体基质上并包含在适合绝缘层的微电极；用以电连接该微电极到一个开关系统的装置；一个细胞培养室，在这里细胞能够成长并且通过所述的包裹位于所述固体基质上的所述微电极列的所述绝缘层粘附到表面上的该列微电极。
本发明进一步的目标是用该设备进行细胞电穿孔的方法，这个方法进一步对至少一个粘附的单细胞执行电穿孔并同时得到被电穿孔的细胞。
本发明的这些和其它目标以及特点和优点在下面的详细叙述中将被更好的理解。
附图说明：
图1显示装置示意图；
图2显示基于发明的一个生物芯片；俯视图(图2b)和横向剖视图(图2a)；
图3显示一个基于本发明的导体类微电极的横向剖视图；
图4显示了基于本发明的一列金属氧化物场控晶体管(MOSFET)导体类微电极的俯视图和横向剖视图；
图5显示了基于本发明的一列MOSFET导体类微电极的示意图；
图6显示基于本发明的电容类微电极的横向剖视图；
图7和图8显示了两个特定电穿孔驱动信号的波形。参数值，例如时间和振幅在实验描述中被给出。
具体实施方式：
本发明的特征在接下来的描述过程中将变得显而易见并且从优选实施例中这些将给出的图示并没有限制性的意图。
本发明通过一种设备，其包括一个电波形发生器，一个包含一列微电极的生物芯片和可以将信号传递给生物芯片的一个预选单微电极的控制系统，来克服现存的技术问题。
优选的控制系统包括一个个人电脑，其装备有一个能够在波发生器里设计不同波形信号并且通过一个开关系统使用选取微电极的软件程序。
图1给出基于本发明的设备的示意图，其中显示了一台个人电脑10，一个开关系统11，一个信号发生器12和一个生物芯片13。
个人电脑10装备有一个软件程序允许操作者全面控制电穿孔过程，编制送给生物芯片的波形信号的形状和定时。
用在基于本发明的设备中的电波形发生器12是一个常规装置，在市场里可以容易得到；开关系统11能够容易被本领域技术人员设计和实施。
下文将基于优选实施例详细描述生物芯片13，其包括一列微电极，一个合适的绝缘层，其中所述绝缘层位于一个固体基质上，电连接所述微电极到一个开关系统的装置，一个细胞培养室，在其中细胞能够成长并与所述一列微电极连接并且粘附在一个表面上，所述表面通过包在所述固体基质上的所述列微电极的所述绝缘层而形成。
基于本发明，生物芯片的布局作为一个优选实施例在图2a和2b显示并且参照两个图来描述，在这里提及的标号表明两个视图的同一或相应部分。
在图2a里，所述生物芯片被架在一个电介质托架21上，依次，带有开口26的细胞培养室24置于中间，其底表面由绝缘层形成，生物芯片包括尺寸可与被电穿孔的细胞相比的一列微电极，在固体基质上27上。所述微电极列20整合固体基质27上的绝缘层上，在固体基质上置有带开口26的细胞培养室24，所述开口26底部是生物芯片13的上表面，在这里细胞成长粘着并且与所述微电极列接触。所述微电极列经由导线28电连接到导电垫29，依次，该导电垫通过并被细胞培养室24外部覆盖并环绕开口26的导线接头23连接到一对外部平行连接头22。
生物芯片13电连接到开关系统11(如图1所示)，其是通过适当的方式连接，例如，一个电缆插接到插头22接通电源。
在一个本发明的优选实施例里，电解质托架21由万绸乃特(VETRONITE，一种材料名称)做成。象玻璃或者陶瓷那样的其它相等材料也不被排除。
在本发明的优选实施例里，生物芯片13的固体基质由半导体基质构成，例如硅基质，有合适形式，例如正方形，有合适的横向尺寸(优选为大约10毫米)，并且覆盖一层绝缘层(优选为SiO2)。硅不是这样一个设备唯一可能的基质，例如，玻璃和其它透明的基质也能够被使用。然而，硅有从微电子技术工业得到的很好的统一和可重复的生产技术优势，允许精确控制每个设备参数。
无论如何透明基质是优选的，允许为了细胞观察使用倒置显微镜。
两个大尺寸电极25(大约1平方毫米)，整合到被绝缘层27所覆盖的固体基质中，作为地线参考。可替换的，上述电极可作为电穿孔电流的冷端，由Ag/AgCl制成的电线，作为参考地电位。
尺寸与将被电穿孔的细胞相若的微电极列20包含在覆盖固体基质的绝缘层中，由于单独连接到开关系统11，每一个微电极能被分成单独的并彼此可分，因此允许非常精确和准时地控制电穿孔过程。被使用的微电极可为导体和电容类。
图2b显示(不按比例)二十个微电极的布局，每一个带有一个20μm长、20μm宽的活性区域(在这个区域把信号传递给细胞)。这个布局在多个激励点、微电极、以及在被要求用于微电极的外部供给的生物芯片的微电极之间的相互连接之间提供一个相对好的平衡。更高的数目和密度的微电极也能够实现，这取决于将被电穿孔的细胞类型。
为了生物芯片上利于细胞粘着，在细胞开始培养之前生物芯片细胞培养室24的上述的开口26的表面被粘性分子覆盖(例如，多聚赖氨酸)。一些不同的粘着分子能够被用做覆盖基质允许合适的细胞粘着以几十纳米的距离在细胞膜和半导体基质之间，这一基质被一个包括在培养室开口26中的绝缘层27覆盖。
微电极具有不同的形状与尺寸只要它们的尺寸与细胞尺寸相当，通常它们是平的，一般的，被设计成使得细胞膜很好粘着在其表面上(通常，至少10％的细胞膜必定是与电极接触)，它们的尺寸范围从1μm到50μm。该微电极由生物相容导电材料制成能够传送必要的电流/电压、交流/直流电信号给细胞。
导电微电极由一些材料制成，这些材料在一些生物相容金属和合金之中选择并且能是单层或多层。
使用在根据此发明的设备中的生物芯片中的导电微电极的优选实施例被描述在图3。该微电极为被SiO2绝缘层32覆盖的硅基质31。微电极和它们的连接线38被做成“三明治”，其中包括两个氮化钛(TiN)层33和一个铝层34，并被一个金层37覆盖。这个方案有一些优点，把高热效应预算和生物相容性的氮化钛同低电阻的Al结合在一起。微电极被SiO2绝缘层35分割。没有被直接暴露于细胞的芯片部分(包括连接微电极的导线38)被一个氮硅化物(Si3N4)层36覆盖，它使得仅仅暴露微电极的活性部分。不同的材料(例如，SiO2或者有机聚合物)也可用于此目的。
在本发明的其它实施例中，电容类微电极是通过引入一个薄的绝缘材料来覆盖微电极本身的活性部分。参见图6，微电极通过使用一个导电层61(可由金属和半导体或者以上提到的“三明治”-TiN/Al/TiN，或者其它等同材料或其结合制成)和一个通过一个电容耦合来管理电穿孔细胞的薄绝缘层64(典型的薄于25nm)被置在绝缘基质60上。微电极被绝缘材料62分离并且通过一个惰性层63覆盖在不暴露的区域里。
基于本发明的进一步的生物芯片的微电极的实施例，该微电极能被使用金属氧化物半导体(MOS)技术以便实现一个较高的电极密度，并且他们的每一个以类似于半导体储存细胞的方式定址。
参见图4，一列MOSFET(金属氧化物场控晶体管)通过常用的微电子技术定位于硅基质40上，也就是通过植入在一个p-型基质40，两个n-型掺杂的区域里，41和42，这些分别构成了晶体管的漏极和源极。这些MOSFET的门电路43是n+掺杂多硅并且通常所有设备成一排(字线)。所有的设备的漏极通过使用一个金属连接插头(通常是钨)和一个金属线44(位线)连接成一列。所述金属被绝缘氧化物45包围。晶体管的源极42通过一个金属(通常是钨)连接接头46连接到一个薄的金层47(其作为一个活性微电极)。没有暴露的芯片部分被一个惰性层所覆盖。
由n-类区域转化p-类区域，由p掺杂转化n掺杂，它可能使得pMOSFET代替上述的nMOSFET，并有类似的整合效果。
由于这项技术，在两个微电极之间的最小距离能达到1微米，以此方式得到高空间分辩率电穿孔单细胞。
参见图5，一列微电极的示意图如其所示。微电极50被连接到MOSFET源极51，其漏极52连接到字线53，门电路54连接到位线55。如果一个MOSFET的门电路保持在一个高于阀值电压VTH的电压VG，漏极保持在VD，并且源极保持开启，后者终端的电压是VD-VTH。这个机理可被用作通过控制字线电压53和位线电压55(其限定了在列中位置)来控制连接到一个选定的MOSFET的源极51的微电极50的电压。
基于本发明的电穿孔设备不要求特定的粘着分子，并且从细胞涂层(plated)、定位和培养这些过程中独立出来。
根据此发明的设备使得实施电穿孔技术有以下的优点：
-在粘着细胞上电穿孔；
-在的同一培养环境内的不同单细胞上电穿孔；
-为每个标靶细胞任意选择电穿孔时间；
-每个标靶细胞的电穿孔程度(即，孔的数量、尺寸和持续时间)通过经由个体细胞/微电极的电耦合控制穿膜电压来控制；，
-如果细胞足够大以覆盖不同的微电极，在同一细胞的不同部位使用不同的微电极进行电穿孔。
由于它的特征，根据此发明的方法对于高处理量的不能透细胞膜的分子筛选格外有用。药物、基因结构和蛋白质能被在相同晶片的一些单细胞单独测试。不同分子定时传递和结合可被设置给每一个标靶细胞。
根据此发明，这一方法能被用在一个基础研究里(例如，基因功能的筛选)和在新药的“发现”的阶段中。试验产量的大规模增加和试验费用的减少被期待。由于高效和控制细胞电穿孔，它不被排除这一技术甚在从来自转移的细胞的药物的“生产”过程和基因治疗中将变得有用。
使用前述设备进行电穿孔的方法包括以下步骤：
-当到达粘着阶段时培养细胞
-在培养基中添加至少一个将被电穿孔到所述细胞里的至少一个单细胞中的化合物
-选定至少一个单细胞和至少一个选定的单细胞粘着其上的微电极
-产生至少一个适合将至少一个所述的化合物的电穿孔到所述至少一个单细胞的电信号，将所述电信号传到被选定单细胞粘着的所述微电极上。
在下文中，四个试验使用基于本发明的设备来实现这一方法被描述在如下的例子中。
例1：由寡核苷酸转染Cos-7细胞
本实验的目的是用双链DNA寡核甘酸转染标靶细胞。
标有荧光标签的寡核苷酸被使用并且在电穿孔后渗透进入标靶细胞之后由于细胞内荧光的存在而被检测到。
Cos-7细胞通过使用一个常规的培养基保持培养。保持培养两天之后，其被胰蛋白酶化，悬浮在培养基里，并且以芯片表面密度大约35,000细胞/cm2涂层在基于本发明的生物芯片细胞培养室。
在涂层之前，芯片表面被仔细清洗，漂洗，干燥并且用紫外线消毒。生物芯片随后通过在20μg/ml的水℃摄氏度，5％CO2的环境下培养。
87-113碱基对的双链DNA寡核苷酸和包含标有一个荧光染料(不是NED就是FAM)的残基随后被合成。寡核苷酸在合成期间被溶解在水里最后浓缩到大约40ng/μl。在电穿孔之前寡核苷酸溶液以1：1被稀释在HBS 2X中。在移除培养基后，在电穿孔之前培养室有大约60μl的寡核苷酸溶液。
与一个单微电极接触的个体细胞的成长通过显微镜观察被确认。在用控制系统选择与一个单细胞接触的微电极之后，一个适当的电穿孔信号被传送并且同样的操作在每一个标靶细胞中被重复。
被一台个人电脑驱动的波形发生器产生传递给基于本发明的生物芯片的电信号。该信号通过一个50Ω的同轴电缆传到一个开关系统，其使得传递信号给一个基于本发明的生物芯片的预选单电极。外部平行的接头通过一个印刷电路与生物芯片连接。参考地电压通过连接前述的开关接地到一个Ag/AgCl电极(浸在电解液中且培养的细胞位于该处)来实现。
电穿孔信号的波形在图7被显示。5列(train)25正方形脉冲(1ms持续时间，10μs升/落时间)在500ms的时间间隔重复，这是被发现适合于成功的Cos-7细胞转染。
在电穿孔后，细胞用标准生理盐水清洗并由荧光显微镜观察。成功转染的标靶细胞通过细胞荧光性的存在被探测到。在转染之后通过细胞形的观测监测细胞存活24小时。
大约80％的标靶细胞被成功转染并且在6-10v振幅脉冲和1-10μs的升/落时间条件下有很好的细胞存活比例(50-80％)。
从细胞内荧光的强度判定的转染程度，与振幅成正比并与上升时间成反比。相反的，细胞存活随着电压幅度而减少，随着上升时间而增加。在列之间的时间间隔是至关重要的：大于500ms的时间间隔，转染不会发生。时间间隔小于500ms细胞存活大大的减少。以此做为最好的方案以便得到最高百分比的转染和细胞存活，我们常规使用9v的振幅和10μs的上升时间。
例2：由DNA质体媒介转染Cos-7细胞
基于本发明的方法的另一个实施实验的目标是由DNA质体媒介转染单个标靶细胞。
使用基于本发明的设备，单个Cos-7标靶细胞由质体媒介转染编码得到GFP(绿色荧光蛋白)。GFP在细胞质里的合成被一个荧光显微镜观测并且将能显示出成功的转染。
在研究基因功能的一些实验室里质体媒介的转染是一个常规技术。
Cos-7标靶细胞和与前述实验中完全相同。
包含5kB GFP编码基因的DNA质体媒介被使用。在扩增和提纯后这一DNA被溶解为50μg/ml水溶液。电穿孔前DNA溶液1:1被稀释在HBS 2x中。在移除培养基后，在电穿孔之前培养室有大约60μl的DNA溶液(25μg/ml)。
标靶细胞如同前述实验一样被选择。电穿孔信号的波形的使用与前述的实验相同除了每列脉冲的量被提高到50。在48小时后被转染的标靶细胞在进行复制周期分裂成两个细胞表达GFP。
典型的胞质型GPF表达在两个细胞里可见。这两个细胞，由于复制和固有的细胞自动性，已经从被原母细胞单独覆盖的微电极中稍微移出。
例3：用荧光素电穿孔大鼠海马神经元
第三个实验使用基于本发明的设备用荧光素电穿孔大鼠海马神经元。
神经元是从18天孕期的Wistar大鼠的海马中分离的(Banker andCowan，1977)。他们被预先涂层两次以去掉神经胶质细胞并且悬浮在带有glutamax I的DMEM里(no.61965026，Gibco，Eggenstein，德国)补充以10％(vol)胎牛血清(10106078，Gibco)和1％(vol)青霉素(15140114，Gibco)(Brewer et al.，1993；Vassanelli and Fromherz，1998)。最终浓缩为350000细胞/ml。
芯片表面仔细涂上一层1％的液体盘子清洁剂溶液，用超纯水冲洗(Millipore，Bedford，MA)，干燥，并且用紫外线消毒。通过吸附作用浸在20ug/ml水溶液达1小时后芯片涂上一层多聚赖氨酸(分子重量>300,000；Sigma，Heidelberg，Germany)，烘干。我们在培养室中施加350μl的细胞悬浊液。在含有glutamax I的Leibovitz-15的培养基(100μl)(31415029，Gibco)补充加入5％胎牛血清。细胞密度是100,000cm2。芯片保持在37℃和10％CO2下2小时。然后移除培养基，随之细胞被培养在无血清介质里(Brewer etal.，1993；Evans etal.，1998；Vassanelli andFromherz，1998)使用450μl的neurobasal介质(Gibco，21103049其补充有2％(vol)B27介质(17504036，Gibco)和1％(vol)glutamax I(35050038，Gibco)达4-7天。
对保持培养最少6天-最多12天的神经元实施电穿孔。
荧光素在标准生理盐水(10μM)里溶解并在电穿孔前且应用在培养室。在用生理盐水清洗两次之后细胞在荧光显微镜下被观测到。
单鼠海马神经元的电穿孔通过应用三角电压列的微电极被获得，每个三角波振幅为4v的并且单个三角持续时间相当于1ms且上升时间等同于下降时间(图8)。
还要注意，相对于Cos-7细胞和许多其它细胞列，神经元是可兴奋细胞在电穿孔期间它们的不需要的电活动刺激将被限制。我们减少不需要的刺激(i)通过减少每列脉冲的量(相对于Cos-7细胞使用的25或50脉冲，采用10脉冲)，(ii)通过增加列与列之间的间隔(5s代替500ms)和(iii)通过使用三角电压。
例4：电穿孔期间细胞电生理活性(Cos-7和鼠海马神经元)。
一个标靶细胞与一个夹片电极连接。在确定整个细胞构造之后，细胞的内电位被监控。施加适当的电穿孔信号给相应的微电极导致细胞内电压瞬变升至0mV(细胞电位是负的，在-70mV左右)。由于电穿孔的形状和随之而来的与接地的外部电解质的电联系，这一瞬变逐渐缓慢减少，细胞在1-2分钟完全恢复了静止电位。这是可能的所需重新封孔时间。孔的结构也通过荧光素(少量荧光素染色)从外部电解液进入细胞的渗透作用被显示。
根据此发明被设备实施的电穿孔，和适当的电穿孔信号，能够在整个夹片记录期(典型地20-30min)被重复而没有任何细胞何电生理信号被破坏。
像期待的那样，细胞内的电压振幅瞬时通过电穿孔被引起并且根据所用的电穿孔信号恢复静止电位的时间是多变的。
根据此发明在此描述的结果证明设备和方法科研使得用各种化合物单独电穿孔各种细胞，从而实现本发明的目的。对于实施例的进一步修改和补充对于本领域技术人员是可见的，也属于本发明的保护范围。

Claims (23)

1.一种用于电穿孔的设备，包括一个波发生器，一个包括一列微电极的生物芯片和一个控制系统
其特征在于：
所述生物芯片包括一列尺寸与将被电穿孔的细胞相当的微电极以及一个细胞培养室，在所述细胞培养室中细胞生长并粘附在所述微电极的表面上，所述表面是由包含所述微电极的绝缘层形成的，
所述控制系统将信号传递给生物芯片的一个单独且与其他分离的生物芯片的预选信号驱动微电极。
2.根据权利要求1所述的设备，其特征在于：所述控制系统装备由装配有可编程设计不同波形信号的软件程序的个人电脑和控制波发生器输出的开关系统组成。
3.根据权利要求1和2所述的设备，其特征在于：所述微电极具有一个尺寸至少为总细胞膜10％的表面。
4.生物芯片，包括一列单独驱动的微电极(20)，所述微电极的尺寸与包含在固体基质上绝缘层上的将被电穿孔的细胞相当；将所述微电极电连接所述微电极到开关系统的装置；一个细胞培养室，在其中细胞能够生长并在所述固体基质上的包含所述微电极列的所述绝缘层所形成的表面上粘着接触所述微电极。
5.根据权利要求4所述的生物芯片，包含做为固体基质的半导体基质，其覆盖有绝缘层(27)，所述绝缘层包含所述尺寸与被电穿孔的细胞相当的单独驱动的微电极(20)列，依次安装有开口(26)的细胞培养室(24)在电介质材料制成的托架(21)上，所述微电极(20)经由导线(28)被电连接到导电垫(29)上，所述导电垫经由被细胞培养室(24)环绕开口(26)的外部覆盖的导线接头(23)电连接到一对外部平行接头(22)，所述有开口(26)的细胞培养室(24)被安装在覆盖有绝缘层(27)的所述半导体基质的顶部，这些都附着在电介质托架(21)上。
6.根据权利要求5所述的生物芯片，进一步包括两个电极(25)，其整合在覆盖有绝缘层(27)的半导体基质上，并且作为参考地电位。
7.根据权利要求5所述生物芯片，其中覆盖有绝缘层(27)的半导体基质是覆盖有绝缘层的硅基质。
8.根据权利要求5所述的生物芯片，其中所述固体基质是透明的。
9.根据权利要求5所述的生物芯片，其中电介质托架是万绸乃特材料，玻璃或者陶瓷的。
10.根据权利要求5所述的生物芯片，其中微电极列(20)具有尺寸为至少总细胞膜10％的一个表面。
11.根据权利要求4-10中任一所述的生物芯片，其中微电极为导体类或电容类。
12.根据权利要求11所述的生物芯片，其中微电极包括由覆盖有绝缘层(32)的硅基底(31)所得的导体微电极，所述微电极及其连接导线(38)由双氮化钛层(33)夹一个铝层(34)层叠制得，其活性表面覆盖有金层。
13.根据权利要求11所述的生物芯片，其中微电极通过使用金属氧化物半导体技术实现。
14.根据权利要求13所述的生物芯片，其中所述微电极包括硅p-型基质(40)，在其中两个n-掺杂的区域里，漏极(41)和源极(42)由常规微电极工艺植入，这些电极的门电路(43)实现在n+掺杂多硅并且通常所有设备成一排，即字线，和成一列的所有设备的漏极(41)经由金属连接插头连接在一起，一个金属线44和晶体管的源极(42)经由通常是钨的金属连接接头(46)连接到作为一个活性电极的金层(47)。
15.根据权利要求11所述的生物芯片，其中所述微电极包括一个绝缘基底(60)、金属(61)和薄绝缘层(64)组成的电容型微电极，所述微电极将被绝缘材料(62)分隔并有惰性层(63)覆盖非暴露区域。
16.电穿孔方法，其特征在于使用根据权利要求1-3中任一所述的设备。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于对至少一个单粘着细胞进行电穿孔。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于所使用的设备包括根据权利要求4所述的生物芯片。
19.根据权利要求16所述的方法，其特征在于所述波发生器向电极发送不同振幅和持续时间的脉冲列。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于所述波发生器送5列25个脉冲至微电极，所述脉冲为1ms持续期，在500ms时间间隔重复。
21.根据权利要求19所述的方法，其特征在于多列包括10脉冲的三角电压被应用在电极上，列之间时间间隔为5s。
22.根据权利要求16-21中任一权利要求所述的方法，其特征在于包括如下步骤：
-当到达粘着阶段时培养细胞
-在培养基中添加至少一个将被电穿孔到所述细胞里的至少一个单细胞中的化合物
-选定至少一个单细胞和至少一个选定的单细胞粘着其上的微电极
-产生至少一个适合将至少一个所述的化合物的电穿孔到所述至少一个单细胞的电信号，将所述电信号传到被选定单细胞粘着的所述微电极上。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述将被电穿孔的化合物是药物、基因结构和蛋白质。
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