CN100549170C - 用于细胞融合的非均匀电场室 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于进行生物细胞(10)融合的装置，该装置包括底部构件(24)，其上支撑着导电的外部电极(18)，该外部电极具有外部电极半径(r2)并具有电极高度(19)。在底部构件(24)上支撑着导电的内部电极(20)，该内部电极具有内部电极半径(r1)并也具有电极高度(19)。所述外部和内部电极(18，20)通过限定融合室(14)的间隙相互隔开。根据从0.7至0.9的可选择比例(r1/r2)的预定范围选择所述的内部电极半径(r1)、外部电极半径(r2)和间隙，其中选择的间隙受限于可选择比例(r1/r2)的范围，而其中可选择比例中的确定比例(r1/r2)基于选择的间隙，以使生物细胞(10)之间的压缩和细胞膜之间的渗透性最大化并使温升最小化，用于提供在融合室(14)中的细胞融合。
Description
技术领域
本发明一般涉及用于将生物细胞彼此融合的方法和装置。
更具体地，本发明提供用电场处理生物细胞的方法和装置，以使所述生物细胞在经受细胞融合电场脉冲之前排列(aligned)并具有增加的细胞膜接触。
背景技术
如果将电中性的粒子，如生物细胞，置于如通过一对同样大小的平面电极(planar electrode)提供的均匀电场中，那么所述生物细胞不向任何一个电极或另一个电极移动，因为来自两个电极的吸引力是相同的。
在另一方面，如果将电中性的生物细胞置于如通过两个都不是平面的电极提供的非均匀电场中，如现有技术图1中所示，那么所述生物细胞形成偶极(dipole)，以比另一个电极更大的吸引力被一个电极吸引，并向具有更大吸引力的电极移动。
非均匀电场的这种用途被用于介电电泳(dielectrophoresis)，而且自从20世纪70年代早期以来，使用介电电泳排列活细胞，然后通过融合/电穿孔脉冲以融合细胞的概念已经在文献中描述。此过程用于产生两种不同细胞类型的杂合体用于治疗目的，用于生产杂交瘤细胞(hybridoma)以产生单克隆抗体(monoclonal antibody)，用于核融合(nuclear fusion)，并用于产生其他杂合体细胞(hybrid cell)。
介电电泳是对电中性的粒子如活细胞施加电动力(electrical force)的过程。该电动力导致邻近的活细胞彼此压缩，如图5所示。来自介电电泳的力(介电电泳力(dielectrophoretic force))起因于施加非均匀电场，所述非均匀电场由被施加电压的电极对产生。非均匀电场分离形成偶极的细胞内的电荷(离子)。在已形成偶极后，此时非均匀电场使细胞移向最高或最低的电场强度。此移动依赖于介质(medium)和生物细胞或粒子的相对电导率(relative conductivity)和介电常数(permittivity)。所述的活细胞也在非均匀电场中排列，如现有技术图2所示。
介电电泳力是电场平方的函数，所以电场极性是不重要的。介电电泳力也是介质和粒子或细胞的相对电导率和介电常数的函数。电导率和介电常数是施加电场的频率的函数。通常地，跨越电极施加交流电压波(AC voltagewave)，如正弦波，以产生交变(alternating)电场。对于具体的细胞类型优化所述正弦波电压、频率和持续时间。
施加交流电波以排列并压缩细胞之后，施加一种或多种融合/电穿孔脉冲以使邻近的细胞膜透化(permeabilize)(在邻近细胞膜之间形成通路(pathway))并使来自两个邻近细胞的细胞膜融合或混合(commingle)。这些通路允许细胞的内容物混合形成杂合的融合细胞。
透化作用通常在具有均匀电场强度的电场中完成以使该电场中的所有细胞以均匀的形式透化。所述均匀电场通过使用平行的平板电极获得。
在另一方面，已知在具有非均匀电场强度的电场中所有细胞的透化作用将导致细胞以非均匀的形式被透化。透化作用中的这种非均匀性是不合需要的。较少的通路在细胞膜中形成，导致较少细胞融合。
融合脉冲之后，在使融合的细胞稳定(成熟)的同时，可施加另一个交流电场以将细胞结合在一起。在一些情况下，所述交变电压已被线性增加或降低以防止由于电场的突然施加引起的对于细胞的破坏。
公开的PCT国际申请No.WO 03/020915 A2描述了能以低水平施加以排列细胞而不产生引起湍流的较大的力的交流电波形。将细胞排列后，那时施加的波形提供了较大的力，其恰在施加透化作用电场脉冲之前压缩细胞，在细胞之间产生较大的共同表面积。
细胞融合应用的实例包括杂交瘤细胞生产和核移植(nuclear transfer)。近来用于电融合的应用是产生治疗杂合体用于癌症免疫疗法。这些杂合体由癌肿瘤细胞和免疫系统树突细胞(dendritic cell)在离体(ex vivo)过程中产生。每种处理需要大量活杂合体，其导致对于杂合体产生过程中高效率的新需要。这些技术的商业和临床用途目前是重要的，它需要大量的杂合产物在单批中产生。
有许多技术(电学的、机械的和化学的)可用于实施细胞融合。本发明涉及电学方法。当前的电学技术领域使用与电极设备或室连接的电压波形发生器。关于已知电学、机械和化学技术，如下美国专利是特别受关注的而且并入本文作为参考：
4,326,934April 27，1982 Pohl
4,441,972April 10，1982 Pohl
4,578,168March 25，1986 Hofmann
4,695,547September 22，1987 Hillard
4,699,881October 13，1987 Matschke等
4,764,473August 16，1988 Matschke等
4,784,954November 15，1988 Zimmermann
4,804,450February 14，1989 Mochizuki
5,007,995April 16，1991 Takahashi
5,304,486April 19，1994 Chang
由上所述，已知使用产生非均匀电场的电极或室。一个这样的实例是形成室的两个同轴电极。Pohl在1978出版的书中详细描述了同轴室(coaxialchamber)。关于理论的介电电泳考虑讨论了所述同轴室。
然而，还没有对于任何具体的应用怎样有效设定同轴室尺寸规格的描述。使用电学方法的细胞融合需要非均匀电场以排列并压缩细胞及均匀电场以使细胞透化。为了在融合的杂合细胞生产中提供最大可能的效率，如在商业和临床应用中所要求的，必须小心选择室的几何尺寸。
起初在任何细胞融合过程中，必须使细胞排列成行并接触。在任何情况下，必须向每个细胞施加足够的力以克服负的表面电荷。如上所述，仅仅施加均匀电场将不移动细胞，因为细胞的净电荷为零。因此，由电场的定义，没有施加的力，因为电荷等于零：
力＝(电场)*(电荷)
然而，非均匀电场诱导每个细胞中的正离子移动到一端，而负离子移动到相反的一端而产生偶极，如现有技术图1所示。一旦偶极被诱导，由于非均匀电场的存在，净力(net force)被施加于细胞上，因为一端的场强大于另一端。细胞在一个方向的运动导致细胞发生排列。由于细胞现在是偶极，一个细胞的负电端将吸引克服负的表面电荷的另一个细胞的正电端，如现有技术图2所示。所述非均匀电场通过电极设备或室产生。非均匀性是电极构造的函数，其实例显示在现有技术图1和图2中。
通常，将待融合的细胞类型置于低导电性的介质中(例如100微西门子/cm)以使可伤害细胞并在介质中产生湍流的欧姆加热(ohmic heating)最小化，由此减少融合的杂合体的数目。在这方面，对于待经受细胞融合的生物细胞来说，被处理以便在细胞排列和细胞膜接触的过程中减少发热(heating)将是理想的。
波形发生器具有多重功能。第一种功能是产生交流电压波形，其通过电极对或室转变成交流电场。此交流电场使细胞排列成行/接触。第二种功能是通过简单地增加交流电波形的振幅(amplitude)来压缩细胞。第三种功能是产生脉冲电压，所述的脉冲电压产生电穿孔紧密接触的细胞膜的电场，从而融合细胞。第四种功能是施加低振幅交流电压以保持细胞排列成行直到融合产物变为活的或稳定的(成熟的)。
成功融合的因素之一是邻近细胞之间的膜接触。在施加融合脉冲之前此接触越紧密，融合的效率就越高。在U.Zimmermann等，″Electric Field-InducedCell-to-Cell Fusion″，J.Membrane Biol.67，165-182(1982)中，Zimmermann指出，恰在融合脉冲之前增加交流电波电场强度可为最佳方法。清楚地，对于将经受细胞融合的生物细胞来说，用预融合非线性电场波形进行预处理以产生足够的力引起细胞膜接触增加，然后立即施加使接触中的细胞膜透化的均匀电场脉冲，由此导致细胞融合将是理想的。
具有将通过在邻近的细胞上施加大的力(与非均匀电场成比例)来压缩细胞以在它们之间产生较大的表面积，然后立即从一个电极到另一个电极施加将使最大量的接触的细胞膜透化的均匀电场来产生大量融合产物的室将是非常理想的。
具有足够体积以产生大量杂合体产物的室也是理想的。
由上面看来，产生具有足够均匀和非均匀电场以提供最大量的融合的杂合体细胞的室也是理想的。
因此，虽然前述的现有技术部分指出使用同轴室是公知的，但上述的现有技术未教导或暗示方法以确定怎样选择室的几何形状，其具有如下所需特征的组合：(1)提供足够的力(非均匀场强度)压缩细胞以提供大的膜接触面积而无过热(excessive heating)；(2)提供足够的均匀场强度以使细胞透化；和(3)产生大量的杂合体产物。通过本发明独特的同轴的细胞融合室提供了上述所需特征，其通过如下说明将显而易见。本发明优于现有技术的其他优势也是显而易见的。
感兴趣的额外的美国专利和公开的美国专利申请包括：
4,561,961 December 31，1985 Hofmann
5,001,056 March 19，1991 Snyder等
5,589,047 December 31，1996 Coster等
5,650,305 July 22，1997 Hui等
US2003/0082163，May 1，2003 Shu
额外的参考文献包括：
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5.Coster，H.G.L.and Zimmermann，U.″Dielectric Breakdown in theMembranes of Valonia utricularis：the role of energy dissipation″.Biochimica etBiophysica Acta.382，410-418，1975.
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如下面相对于本发明所说明的，现有技术比例r1/r2和已知的现有技术的室的间隙在本发明的各自的范围之外。所述的现有技术如下：
1.细胞大小脂质体的介电电泳(Dielectricophoresis of cell size liposomes)，13 December 1993.r1/r2＝0.25，间隙＝0.75mm.
2.Hofmann 4,578,168，Mar 25，1986，r1/r2＝0.139，间隙＝0.155mm.
3.Hillard 4,695,547，SEP 22，1987，r1/r＝0.162，间隙＝13mm
4.Matschke 4,699,881，Oct 13，1987，r1/r2＝0.98，间隙＝0.4mm.
5.Zimmerman 4,764,473，Aug 16，1988，无尺寸。
6.Mochizuki，4,804,450，Feb 14，1989，r1/r2＝0.962，间隙＝2mm.
7.Takahashi，5,007,995，Apr 16，1991，r1/r2＝0.263，间隙＝2.8mm
8.Chang，5,304,486，Apr 19，1994，r1/r2未给出，间隙＝0.5至2.0mm
9.Shu，US2003/0082163，May 1，2003，r1/r2未给出，间隙2至5mm.
发明内容
本发明提供了进行生物细胞融合的装置，其包括：具有第一电极半径(r1)和电极高度的内部电极，具有第二电极半径(r2)和同样电极高度的外部电极。所述的内部电极和外部电极是同心的。在所述内部电极和外部电极之间提供了间隙，而且所述间隙的尺寸是所述第二电极半径和第一电极半径之差。通过所述的电极高度、间隙、第一电极半径和第二电极半径定义了细胞融合体积。根据所述第一电极半径与第二电极半径的可选择比例(r1/r2)的预定范围选择第一电极半径、第二电极半径和间隙，其中可选择比例(r1/r2)的范围是0.7至0.9，其中选择的间隙受到可选择比例(r1/r2)范围的限制，而且可选择比例的确定比例(r1/r2)是基于选择的间隙，以使生物细胞之间的压缩和细胞膜之间的渗透性最大化并使温升最小化，用于提供在所述细胞融合体积中的细胞融合。
可以理解，为内部电极和外部电极两者提供用于连接电缆或来自电波形发生器的其他导电体的装置。
如下更详细地进一步讨论，当比例r1/r2将小于0.7时，电场强度中的变化百分数将大于30％，这将导致不希望的低细胞透化和不希望的低细胞融合。
此外，当比例r1/r2将大于0.9时，所述电场强度将变得非常均匀，这将导致对于固定的交流电压来说非常低的压缩力。这将导致低细胞融合。如果要补偿，将增加交流电压以保持不变的压缩力，将出现不希望的介质加热，这将引起不希望的温升，所述温升将杀死细胞。
通过本发明，可选择同轴室的几何参数以产生室，该室将同时提供细胞压缩和透化作用而无过热，以产生大量融合的杂合细胞。
提供足够信息以确定室参数的所有现有技术明显低于或明显高于本发明的优选参数。所有都是非常小的体积，小于几百微升(与本发明形成对比，本发明被按比例放大至若干毫升)，并且没有考虑压缩力和透化作用之间的平衡(trade-off)(这是本发明的原理所教导的)。
根据本发明的另一个方面，提供了选择用于融合生物细胞的细胞融合室的内部电极、外部电极和内部电极与外部电极之间的间隙的方法。所述方法包括如下步骤：
确定所述内部电极的第一电极半径、所述外部电极的第二电极半径和所述内部电极和外部电极之间的间隙中的两个；将所述第一电极半径与第二电极半径的比例(r1/r2)设定为0.7至0.9的范围内的值，和计算所述内部电极的第一电极半径、所述外部电极的第二电极半径和所述内部电极和外部电极之间的间隙中的第三个，以使生物细胞之间的压缩和细胞膜之间的渗透性最大化并使温升最小化，用于提供在所述细胞融合室中的细胞融合。
更具体地，以所述方法，将所述第一电极半径与第二电极半径的比例设定为0.80至0.85范围内的值，并对于2-10微米的细胞半径，间隙为2至10毫米。
考虑到可按比例调整(scalability)的概念，使用本发明，可通过简单增加电极高度并保持比例r1/r2和间隙不变来增加细胞融合室的体积。此外，通过简单地增加电极高度并保持r1/r2不变，介质中的温度不变。
附图说明
在研究如下对本发明的详细说明之后，将更好地理解本发明而且上述目的以及除上述列出的那些以外的目的将变得更加明显。所述说明引用如下附图，其中：
图1显示在现有技术中，在由非对称电极产生的非均匀电场的影响下生物细胞中的偶极形成。
图2显示在现有技术中，在由非对称电极产生的非均匀电场中生物细胞的运动轨迹，还显示生物细胞的珍珠链(pearl chain)排列和形成。
图3显示在施加相对低振幅、长持续时间的预融合电场波形之前独立的生物细胞10。
图4显示在施加相对低振幅、长持续时间的预融合电场波形的过程中，以珍珠链排列的切线接触的生物细胞10。
图5显示在施加图4中所施加的相对低振幅、长持续时间的预融合电场波形之后，在施加相对高振幅、短持续时间的预融合电场波形的过程中紧密接触并压缩的生物细胞10。
图6显示由施加电场引起的跨膜电压(TMV)的方程式。也显示了同轴室的电场方程式。透化作用开始的临界点出现在TMV为大约0.5至1.5伏。用于细胞融合所需的电场强度大于透化作用开始所需的电场强度。
图7涉及使用被输送入生物细胞的siRNA(小干扰RNA)的基因沉默(genesilencing)，其中基因表达％的减少依赖于细胞透化作用的效率，这也是细胞融合中的基本步骤。
图8显示通过非均匀电场施加于中性细胞的介电电泳力的方程式。也显示了同轴室的非均匀电场强度的方程式。
图9A显示对于1微米的细胞直径的Clausius-Mossotti函数.图9B显示对于4微米的细胞直径的Clausius-Mossotti函数。
图10显示K562细胞的自动融合百分数对施加的交流电压和交流电压持续时间的关系。
图11A、11B和11C显示对于0.1纳达因的生物细胞之间的压缩力而言，作为比例r1/r2的函数的电场变化百分数和温升。更具体地，图11A是2微米细胞半径的情况；图11B是6微米细胞半径的情况；和图11C是10微米细胞半径的情况。
图12A、12B和12C显示对于1.0纳达因的生物细胞之间的压缩力而言，作为比例r1/r2的函数的电场变化百分数和温升。更具体地，图12A是2微米细胞半径的情况；图12B是6微米细胞半径的情况；和图12C是10微米细胞半径的情况。
图13A和图13B合起来显示具有水平操作取向(horizontal operatingorientation)的同轴电极设计的第二个实施方案。图13B的一部分，如下面说明的，显示具有水平操作取向的同轴电极设计的第一个实施方案。
图14显示同轴电极设计的第三个实施方案，其中所述的第三个实施方案具有垂直操作取向。
图15显示接近内部电极的较强的电场区域和接近外部电极的较弱的电场区域。
具体实施方式
通过施加电场将细胞膜透化。在现有技术图6中提供并说明了该方程式。所述的透化作用与电场强度成正比。
同轴的细胞融合室产生具有非均匀电场强度的电场，而且如上所述，具有非均匀电场强度的电场导致非均匀的透化作用。如图15所示，具有较大透化作用的较强电场强度的区域32更接近内部电极20，而具有较小透化作用的较弱的电场强度的区域30更接近外部电极18。参考前面图6中对于同轴室的电场公式，随着比例r1/r2减小，电场的强度变得更加不均匀。再次参考图15，r1是内部电极20的半径；而r2是外部电极18的半径。
为了本发明的目的，从一个电极到第二个同轴电极的电场强度的变化百分数(变化百分数)定义为：
变化百分数＝100*[E(在内部)-E(在外部)]/E(在内部)
＝100*(1-r1/r2)其中(r2＞r1)
其中r1是内部电极的半径，而r2是外部电极的半径。
从内部到外部电极的电场强度的变化百分数只是比例r1/r2的函数，而且不依赖于间隙(G)。
电极间隙定义为：
间隙＝r2-r1
通过r1/r2、间隙和电极高度或通过r1、r2和电极高度唯一地定义了同轴室的尺寸。电场在内部电极处最强而且在外部电极处最弱。随着间隙减少，比例r1/r2接近″1″，而且从内部电极到外部电极的电场变化越均匀(不均匀性越小)。在叙述上有些不同，本文定义的″电场强度的变化百分数″是电场强度的非均匀性的量度(measure)。
相关的问题就是电场从内部电极到外部电极应为怎样非均匀的以使最大量的细胞在间隙中透化？此问题的一个答案可在图7的研究中找到，在图7中siRNA转染数据的检验提供了实例。虽然转染不涉及细胞融合，但转染依赖于细胞膜透化作用，与细胞融合一样。更具体地，siRNA转染必须只通过细胞膜输送而不进入细胞核(nucleus)，所以此转染数据代表了细胞融合中需要的膜透化作用。
图7涉及使用被输送入生物细胞的siRNA(小干扰RNA)的基因沉默，其中天然基因的表达％的减少依赖于细胞渗透性的效率，这也是细胞融合中的基本步骤。这是细胞透化作用的模型。所述的siRNA通过引起定向的RNA破坏由此使基因表达的作用沉默来起作用。随着更多的siRNA被输送，这导致天然基因表达的减少。它是细胞透化作用的好模型，因为其作用发生在细胞质中，而且细胞质是使用电场的透化作用(电穿孔和电融合(electrofusion))输送物质的地方。与此相反，使用质粒的基因输送(另一个可能的模型)需要DNA向细胞核运动，这成为不直接涉及透化作用程度的二阶效应(secondorder effect)。重要的是注意到基于透化作用用于电穿孔的电场与用于电融合的电场相同。
例如在图7中，电场强度从1500V/cm至2000V/cm有25％变化(增加)(100×(2000-1500)/2000)。此外，在相同的时间间隔中，表达百分数有大约42％(95％-53％)的变化(减少)(暗示细胞膜透化作用增加42％)。虽然此实例是具体的细胞类型和物质的特性，但它仍然是非常显著的。通过外推(extrapolation)，电场强度增加大约10％导致如通过天然基因表达减少(暗示细胞膜透化作用增加)所显示的输送效率大约增加15％。
清楚地，从上述实例可以断定，必须非常小心地选择参数(r1/r2和间隙)以使非均匀电场强度的非均匀性最小化以在用于细胞融合的完整的细胞群体当中获得理想的细胞膜渗透性。
与透化作用对比，通过在图8中提供并说明的公式给出作用于细胞的介电电泳力(在上述的细胞排列和压缩中是重要的)。这个来自Pohl和Jones的公式具有四个感兴趣的元素。所述的力与下述成比例：
1.细胞半径的立方
2.细胞外介质的介电常数。
3.K，其为Clausius-Mossotti函数。
4.电场平方的倒三角(del)。
细胞半径的立方和细胞外介质的介电常数不需要进一步的解释。
Clausius-Mossotti函数在图9A和图9B中说明。它是介质的介电常数和细胞内和细胞外电导率的函数。提供的实例是10microS/cm的外部电导率(以实线表示)和100microS/cm的内部电导率(以虚线表示)的情况。所述的Clausius-Mossotti函数随频率变化。接直流电并且在低的直流电频率下，该函数是负的；这是指作用于细胞的力朝着外部电极的方向。在0.2至2MHz频率范围内，该函数是正的，而且作用于细胞的力朝着内部电极的方向。这是优选的操作方式。K在100microS/cm的外部介质电导率且细胞半径大于4微米时为大约0.95。由上述看来，对于细胞半径大于4微米且外部介质具有大于100microS/cm的电导率的情况，Clausius-Mossotti函数不是同轴室几何形状中的因子。
电场函数delE2仅是同轴室几何形状的函数。该电场函数意思是电场平方的微分(一阶导数)。如果该电场是均匀的，那么电场函数是零，而且没有力作用于细胞。
如在电场强度的情况下，本发明也定义了力的变化百分数，如同电场函数的变化百分数。此公式为：
delE2的变化百分数＝[1-(r1/r2)3]*100
如同上述电场强度的变化百分数一样，电场函数的变化百分数也只涉及比例r1/r2。
从本文定义的电场变化百分数和本文定义的电场函数的变化百分数来看，比例r1/r2越小，上述两者变化百分数就越小。此外，所述电场函数(delE2)具有第二个特性，当比例r1/r2接近1时，delE2的绝对量接近零。
总之，有两种相反的考虑：
1.当比例r1/r2接近1，电场强度变得更均匀，这对于细胞透化作用而言是理想的。
2.当比例r1/r2接近0，作用于细胞的力增加，这对于细胞排列和压缩而言是理想的。
遵循本发明的原理，可以容易地选择比例r1/r2，其为选择用于细胞透化和细胞排列和压缩的细胞融合室的几何尺寸的最佳折衷方案。
为了选择同轴电极参数(r1/r2和间隙)以提供足够的压缩力，需要确定足够的压缩力的大小。为了确定该力的大小，以两套经验数据使用Fdep方程式(图8中)。结果在下面表I中。
这两个实验方案对于使用的细胞和培养基来说产生最多的细胞融合杂合体。在Cyto Pulse，Inc.，Hanover，MD，USA完成K562自融合实验，参见图10。在Arizona Cancer Center(AZCC)完成A549自融合实验并通过2002年4月在美国癌症研究协会(American Association of Cancer Researchers)(AACR)的海报公开。AZCC/AACR数据使用较低的交流电压来排列并使用较高的电压交流电来压缩。上表中只包含压缩数据。在两个实验中都使用Cyto PulsePA-4000/PA-101细胞融合系统和6ml室(具有等于0.83的r1/r2)。总之，对这些细胞的压缩力在0.1至1.0纳达因范围内。
同轴电极的比例r1/r2和间隙的最佳尺寸通过如下面表II列出的参数和它们各自的特性来确定。
为了找到对于上述条件的最佳尺寸值，以1纳达因作为开始点使用了比例r1/r2和间隙作为参数。当比例r1/r2接近1时，产生所需的力所需的交流电压变得非常大。施加很多秒的高电压交流电波将非常快地加热电极中的介质并破坏细胞。
已计算了两套实例。对于0.1纳达因的力已经计算实例中的一套，如图11A、11B和11C所示。对于1.0纳达因的力已经计算实例中的第二套，如图12A、12B和12C所示。对于这两套实例而言，给出了0.7至0.9的可选择比例r1/r2和2至10mm的间隙。
具体地，如图11A、11B、11C和12A、12B和12C所示，在本发明的装置中所述第一电极半径与所述第二电极半径的所述比例在0.75至0.9的范围内。
对于0.1纳达因，图11A是2微米细胞半径的情况。图11B是6微米细胞半径的情况。图11C是10微米细胞半径的情况。
对于1.0纳达因，图12A是2微米细胞半径的情况。图12B是6微米细胞半径的情况。图12C是10微米细胞半径的情况。
如图12A所示，对于2微米的细胞半径来说，所需的交流电压是如此之高以致于对于所有实际的间隙值而言加热为40deg.C以上。这可通过冷却该室稍微得到补偿。如图12B和12C所示，分别对于6微米和10微米的半径来说，显著的加热仍然发生。一些过热可通过外部冷却得到补偿。若以0.9以上的比例r1/r2进行操作，介质中的温度升高是如此显著以致于对于10微米或更小的细胞半径而言它不是理想的操作范围。
对于图11A和11B而言，介质加热较少而且室冷却是降低加热的一种选择。
在具有大于10微米的细胞半径的粒子或生物细胞的情况下，需要较低的交流电压，而且非常小的比例r1/r2是可能的。
在含有大多数肿瘤和免疫系统细胞的细胞半径的中间范围(mid range)内，必须给予仔细的考虑。通常应使用0.8至0.85的比例r1/r2及2至10mm范围内的间隙。Cyto Pulse 6ml实验室(experimental chamber)中的一个具有0.83的比例r1/r2和4mm的间隙。此电极与各种细胞类型一起用于杂交瘤细胞生产和癌症-免疫细胞治疗杂合体生产的用途已产生良好的功效。
本发明的一个实施方案是图13A和13B中说明的同轴室。此室可由一块方形的导电材料和一块方形的不导电材料构建。导电材料和等高的不导电材料的中心电极。
关于图13B，基本上显示了相互堆叠的三层。最底层包括不导电的底部构件24。中间层包括内部电极20、融合室14和外部电极20。最顶层包括不导电的外部电极覆盖部件12、进入通道22和不导电的内部电极覆盖部件16。
注意到最底层和中间层合在一起说明了本发明的装置的第一个实施方案。更具体地，提供该装置的第一个实施方案用于进行生物细胞融合，并且该实施方案包括不导电的底部构件24。导电的外部电极18支撑在底部构件24上，其中所述外部电极18包括凹入的外部电极表面28，其具有外部电极半径(r2)并具有电极高度19。导电的内部电极20支撑在底部构件24上，其中所述内部电极20包括凸出的内部电极表面26，其具有内部电极半径(r1)并具有电极高度19。外部电极表面28和内部电极表面26由限定融合室14的间隙相互隔开。
如上面讨论，根据所述第一电极半径与第二电极半径的可选择比例(r1/r2)的预定范围选择第一电极半径(r1)、第二电极半径(r2)和间隙，其中可选择比例(r1/r2)的范围是0.7至0.9，其中选择的间隙受到可选择比例(r1/r2)范围的限制，而且其中可选择比例的预定比例(r1/r2)是基于选择的间隙，以使生物细胞10之间的压缩和细胞膜之间的渗透性最大化并使温升最小化，用于提供在融合室14中的细胞融合。
根据本发明的第二个实施方案，也在图13B及图13A中显示，最顶层被固定于中间层。在这点上，本发明的第二个实施方案包括图13B中最底层、中间层和最顶层的全部。
更具体地，关于本发明的第二个实施方案，不导电的外部电极覆盖部件12由外部电极18支撑。不导电的内部电极覆盖部件16由内部电极20支撑，其中所述外部电极覆盖部件12和内部电极覆盖部件16限定进入通道22，而且其中所述进入通道22与融合室14连通。
优选地，不导电的外部电极覆盖部件12包括凹入的外部覆盖部件表面29，其具有外部覆盖部件半径。而且，优选地，不导电的内部电极覆盖部件16包括凸出的内部覆盖部件表面31，其具有内部覆盖部件半径。优选地，外部覆盖部件半径等于外部电极半径，而且内部覆盖部件半径等于内部电极半径，由此进入通道22与融合室14对准。
可使用不导电的尼龙螺丝(nylon screw)将内部电极20连接到底板(baseplate)24，并将内部电极覆盖部件16连接到内部电极。可使用导电的金属螺丝将外部电极18连接到底板24，并将外部电极覆盖部件12连接到外部电极18。
外部电极18和内部电极20可由不锈钢制成。
图14中说明了同轴室的第三个实施方案。通常，此室为垂直安装的同轴室的一半。当施加校准交流电压(alignment AC voltage)时，细胞运动将与重力相反。这防止细胞在施加波形时沉降到室的底部。此室可以以无菌口(sterileport)和过滤放气口(filter relief port)开启或关闭以填充和排空该室。
更具体地，所述装置的此第三个实施方案包括不导电的支撑构件40。导电的外部电极43在水平方向上由支撑构件40支撑。外部电极43包括导电的凹入的外部电极表面42，其具有外部电极半径(r2)并具有电极宽度。导电的内部电极45在水平方向上由支撑构件40支撑在外部电极43的上方。内部电极45包括导电的凸出的内部电极表面44，其具有内部电极半径(r1)并具有电极宽度。一对不导电的垂直定向的端壁位于外部电极43和内部电极45的端部。外部电极表面42和内部电极表面44通过间隙相互隔开。所述间隙和垂直定向的端壁限定融合室46。融合室46中细胞融合介质的水平面是在水平面56。
优选地，外部电极43包括不导电的外部电极支撑部分48，其支撑导电的外部电极表面42，而且内部电极45包括不导电的内部电极支撑部分50，其支撑导电的内部电极表面44。导电的电极表面42和44可为镀在各自的不导电的支撑部分48和50上的金膜。
此外，所述装置可进一步包括由支撑构件40支撑的输入/输出口52，其中所述输入/输出口52与融合室46连通。
此外，所述装置可进一步包括由支撑构件40支撑的过滤器减压阀54，其中所述过滤器减压阀与融合室46连通。
优选地，将不导电的支撑构件40、不导电的外部电极支撑部分48、不导电的内部电极支撑部分50和不导电的垂直定向的端壁制成整体模塑的塑料元件(integrated molded plastic unit)。
通过上述方法确定比例r1/r2和间隙的值。该室可开启或关闭。将待融合的细胞置于一定量的低电导率介质中，然后置于两个导电的电极材料之间的间隙中。然后将交流电波形发生器和脉冲发生器连接于中心(内部)导电电极和外部导电电极。
电压波形发生器如Cyto Pulse PA-4000/PA-101计算机控制波形发生器用于产生电场。在施加排列波形(alignment waveform)、压缩波形、融合波形和保持波形(holding waveform)之后，在电极的不导电的体积中加入细胞培养基。当回收融合的细胞时，此培养基增加了细胞生存力。
所述装置可进行大体积研究、临床和商业应用。可将该装置包装在无菌包装中。而且，该装置可制成一次性使用后可丢弃的元件。在所有的实施方案中，可通过增加电极高度来增加体积。温度升高并不是电极高度的函数。
尽管已在附图中显示本发明并通过特性和细节连同目前被认为是本发明最可行且优选的实施方案在前面充分描述了本发明，但对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，在不背离本文中列出的原理和概念的前提下，可对本发明进行许多修改，所述修改包括但不限于操作组件(operation assembly)的大小、材料、形状、形式(form)、功能和方式以及用途的变化。
Claims (13)
1.进行生物细胞融合的装置，其包括：
具有第一电极半径(r1)和电极高度的内部电极，
具有第二电极半径(r2)和所述电极高度的外部电极，其中所述的内部电极和所述外部电极是同心的，
位于所述内部电极和所述外部电极之间的间隙，其中所述间隙的尺寸是所述第二电极半径和所述第一电极半径之差，而且其中细胞融合体积由所述电极高度、所述间隙、所述第一电极半径(r1)和所述第二电极半径(r2)限定，其中根据所述第一电极半径与所述第二电极半径的可选择比例(r1/r2)的预定范围选择所述第一电极半径、所述第二电极半径和所述间隙，其中所述的可选择比例的范围是0.7至0.9，选择的间隙受所述可选择比例范围的限制，而且所述可选择比例的确定比例是基于所选择的间隙，以使生物细胞之间的压缩和细胞膜之间的渗透性最大化并使温升最小化，用于提供在所述细胞融合体积中的细胞融合。
2.权利要求1的装置，其中所述第一电极半径与所述第二电极半径的所述比例在0.75至0.9的范围内。
3.权利要求1的装置，其中：
所述第一电极半径与所述第二电极半径的所述比例在0.8至0.85的范围内，而且
所述间隙在2至10毫米的范围内。
4.权利要求1的装置，其中：
所述第一电极半径与所述第二电极半径的比例是0.83，而且
所述间隙是4毫米。
5.选择用于融合生物细胞的细胞融合室的内部电极、外部电极和所述内部电极和外部电极之间的间隙的方法，包括以下步骤：
确定所述内部电极的第一电极半径、所述外部电极的第二电极半径和所述内部电极和外部电极之间的间隙中的两个，
将所述第一电极半径与第二电极半径的比例(r1/r2)设定为0.7至0.9的范围中的值，而且
根据所述比例的设定值，计算所述内部电极的第一电极半径、所述外部电极的第二电极半径和所述内部电极和外部电极之间的间隙中的第三个，以使生物细胞之间的压缩和细胞膜之间的渗透性最大化并使温升最小化，用于提供在所述细胞融合室中的细胞融合。
6.权利要求5的方法，其中：
将所述第一电极半径与所述第二电极半径的比例设定为0.8至0.85的范围内的值，而且
所述间隙在2至10毫米的范围内。
7.进行生物细胞融合的装置，其包括：
不导电的底部构件，
支撑在所述底部构件上的导电的外部电极，其中所述外部电极包括凹入的外部电极表面，其具有外部电极半径(r2)并具有电极高度，
支撑在所述底部构件上的导电的内部电极，其中所述内部电极包括凸出的内部电极表面，其具有内部电极半径(r1)并具有所述电极高度，其中所述外部电极表面和所述内部电极表面通过间隙相互隔开，所述间隙限定融合室，
由所述外部电极支撑的不导电的外部电极覆盖部件，和
由所述内部电极支撑的不导电的内部电极覆盖部件，其中所述外部电极覆盖部件和所述内部电极覆盖部件限定进入通道，其中所述进入通道与所述融合室连通。
8.权利要求7的装置，其中：
所述不导电的外部电极覆盖部件包括凹入的外部覆盖部件表面，其具有外部覆盖部件半径，
所述不导电的内部电极覆盖部件包括凸出的内部覆盖部件表面，其具有内部覆盖部件半径，而且
所述外部覆盖部件半径等于所述外部电极半径，而且所述内部覆盖部件半径等于所述内部电极半径，由此所述进入通道与所述融合室对准。
9.进行生物细胞融合的装置，其包括：
不导电的支撑构件，
在水平方向上由所述支撑构件支撑的导电的外部电极，其中所述外部电极包括导电的凹入的外部电极表面，其具有外部电极半径(r2)并具有电极宽度，
在所述外部电极上方，在水平方向上由所述支撑构件支撑的导电的内部电极，其中所述内部电极包括导电的凸出的内部电极表面，其具有内部电极半径(r1)并具有所述电极宽度，和
位于所述外部电极和所述内部电极端部的不导电的垂直定向的端壁，
其中所述外部电极表面和所述内部电极表面通过间隙相互隔开，而且其中所述间隙和所述垂直定向的端壁限定融合室。
10.权利要求9的装置，其中：
所述外部电极包括不导电的外部电极支撑部分，其支撑所述导电的外部电极表面，而且
所述内部电极包括不导电的内部电极支撑部分，其支撑所述导电的内部电极表面。
11.权利要求9的装置，其中将所述不导电的支撑构件、所述不导电的外部电极支撑部分、所述不导电的内部电极支撑部分和所述不导电的垂直定向的端壁制成整体模塑元件。
12.权利要求9的装置，还包括由所述支撑构件支撑的输入/输出口，其中所述输入/输出口与所述融合室连通。
13.权利要求9的装置，还包括由所述支撑构件支撑的过滤器减压阀，其中所述过滤器减压阀与所述融合室连通。
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