CN101069085A - 分光光度计 - Google Patents

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Abstract

分光光度计(2)包括辐射源(6)，优选地为光学辐射源，该源被放置以向样品容器(4)内的样品发射多个波长下的辐射，还包括用于探测和样品相互作用后的辐射的探测装置8。该样品容器(4)适用于对于发射的辐射给出多个穿过样品的不同波程长度。可操作性地连接运算单元(10；10b)，以接收来自探测装置(8)的取决于强度的输出，以及适用于存储所探测到的多个不同波程长度中两个或更多个波程长度下发射的辐射的强度值，该强度值和波长挂钩，以及适用于计算取决于两个波程长度中每一个波程长度下挂钩的强度值的比率的值，借此可以获取所存放的样品内感兴趣物质存在的指示。

Description

分光光度计
本发明涉及分光光度计。
众所周知的是，运用分光光度计来定量和/或定性确定试验样品材料中的，特别是溶液中的感兴趣物质。这样的分光光度计在和诸如槽或透明容器之类的样品容器中存放的试验样品相互作用后探测一个或多个限定波长下的电磁能量，通常为光学能量。可以将该分光光度计设备配置成在一个或多个众所周知的透射、反射或透反射模式下工作，以及可以，例如，包括色散元件单色仪，或者可以，例如，配置成诸如傅里叶变换干涉仪之类的干涉仪。
这也可以通过，例如，US 5,602,647获悉，其内容在此通过援引的方式被纳入，以提供光学分光分度计，其中的样品容器有可变的内部光程。为了优化所探测的特定波长的强度，改变该分光光度计内的波程长度。将该分光光度计配置成根据峰值强度位置处的透射光辐射强度和光程值来进行定量和/或定性确定。
在已知的分光光度计中，随机的瞬间强度漂移是个问题。它可能是由，例如，不稳定的操作条件引起的，诸如样品或器械温度的变化；周围环境相对湿度的变化；或者探测器灵敏度的变化。作为该问题的解决办法之一，众所周知的是在有规律的操作时间间隔下对分光光度计进行所谓的“置零”。在置零期间，用诸如水样品之类的校准样品来代替试验样品。在整个感兴趣的光谱范围内监测光在和校准样品相互作用后到达探测器的强度(Iwλ)。然后利用该强度给出整个那个光谱范围的，取决于波长的零级。将所接收的和试验样品相互作用后的光的强度(Isλ)除以同一波长(λ)下校准样品的光的强度(Iwλ)。以这种方式，可以获取与强度相关的透射值(Tλ)，其中消除了所有系统效应，这些系统效应对于校准样品和试验样品来说可被看成是基本相同的。该操作可以由以下方程来表示，该方程在分光光度计相关联的运算单元内解出：
Tλ＝Isλ/Iwλ                                       (1)
可以理解的是，可将Tλ看作是对来自试验样品的光的强度相对于来自校准样品的光的强度的偏离的测量。
这引发的问题是，万一试验样品内的感兴趣物质在校准样品具强吸收能力的区域内有吸收带，那么物质的任何确定的精确性都将受到负影响。
还有个问题是，为了更精确地进行确定，对于校准样品和试验样品两者，其辐射波程长度必须在十分之几微米的程度内相同。这是很难实现的，特别是当为了便于在取样之间进行清扫而将容纳样品的透明容器或槽构造成可打开时，或者当对校准样品和试验样品采用不同的容器时。
此外，只有在强度漂移可忽略期间，置零才是有效的。这样，要么频繁地进行置零校准，而这非常耗时，要么不得不为了控制分光光度计内的温度和湿度或其中之一而配置环境稳定元件，而该环境稳定元件非常昂贵。
本发明的目标是缓和至少一些上述问题和缺点。
相应地，本发明第一方面给出如本权利要求1所描述和表征的分光光度计。将沿两个不同路径传播穿过同一样品后被探测到的同一波长的光的强度相除，可以消除与强度相关的不稳定性。因此可以简单而有效地避免借助于校准样品的置零。
有利地，由于不必为了消除这些不稳定性而交换试验样品和校准样品，因而可以将运算单元配置成在超出用户通常力所能及的，更有规律的时间间隔内，优选地对于每一个试验样品，执行这种比率运算。这样，有效置零之间的时间将远小于通常与可能存在的环境变化相关的时间常数，而且也在分光光度计设备中省去了昂贵的稳定元件。
而且，通过布置运算单元在每次新样品被引入样品容器时执行所述的比率计算，穿过样品的光程中的任何意外变化都可以被考虑到，诸如在为替换样品而开启和关闭透明容器时所可能发生的，或者由粘在容器内部的污垢或其他残留物引起的。
根据本发明的第二方面，给出一种利用本发明第一方面的分光光度计来确定试验样品中感兴趣物质的定量和定性指示或其中之一的方法。因此，本方法固有地具有与分光光度计相关的优点。
现在将通过参考附图来描述本发明实施方案，其中
图1示意性地示出了本发明分光光度计的第一实施方案；以及
图2示意性地示出了本发明分光光度计的第二实施方案。
现在考虑图1示出的分光光度计2的第一示例性实施方案。分光光度计2包括样品容器4；多色光源6，探测装置8；运算单元10以及致动器12。在本实施例中，源6，槽4以及探测装置8相对放置，以便在使用中，来自源6的光在被探测装置8探测之前，沿光轴14传播透过槽4的对立表面4a和4b。聚焦光学器件16，此处示为一对透镜，可以以已知的方式给出以及被利用，以形成所需的光束形状，光束从源6开始，穿过样品容器4，到达探测装置8。
将本实施方案的样品容器4配置成在沿光轴14的方向上有对立表面4a和4b，该表面全部或部分由光透射材料制成，并且可相对于彼此移动。为了在一个或两个对立表面4a、4b上施加作用力，以便改变它们的相对间隔(图中用双向箭头示出)，从而改变穿过样品槽4的光程，将致动器12可操作性地连接到一个或两个对立表面4a、4b上。
此处将多色光源6配置成同时生成和发射所有特定的感兴趣的波长。为了配套这种情况，此处由分光计8a和相关联的光子探测器8b组成探测装置8。以已知的方式相互配置这些元件8a和8b，以便能够生成样品槽4内样品材料的取决于波长的透射光谱。
运算单元10可操作性地连接光子探测器8b的输出，以及在本实施例中还连接致动器12。将该运算单元10配置成接收以及优选地存储透射谱，该透射谱在两面4a、4b的多个，优选地至少两个不同的间隔下生成。可以将单元10配置成存储光谱以及由致动器12的输出所指示的相应间隔，并且该单元10可以包括多个独立的但是相互连接的单元，而不是本实施方案所示的单个功能的单元10。
在操作中，本实施方案的运算单元10记录来自探测装置8的相应于槽壁4a和4b第一间隔下的光谱数据。然后操作致动器12以改变槽壁4a和4b之间的间隔，运算单元10记录来自探测装置8相应于槽壁4a和4b不同于第一间隔的第二间隔下的光谱数据。以这种方式，运算单元10可对于至少两个穿过样品材料的不同光程，获取来自多色光源6并透过样品材料的光的强度值，该强度值与它们的波长挂钩。运算单元10被配置成：根据对相同波长下在两个不同的波程长度的每个波程长度下所获取的强度值的比率计算，来定量或定性确定样品材料内感兴趣物质的存在。还将单元10配置成对所进行的确定输出指示。该指示可以是，例如，以感兴趣物质的定量测量的形式，或者可以是，例如，样品内感兴趣物质存在的定性指示。
更具体地，将运算单元10配置成在进行确定时利用以下方程所涵盖的方法：
传播波程长度b1，穿过具有吸收系数aλ(包括了样品和容器吸收系数)和其中包含了浓度为C的感兴趣物质的样品之后，在探测器8b处被接收的波长为λ的光的强度(I1λ)，可以根据已知的方程表示成：
I1λ＝I0λexp(aλ·C·b1)                             (2)
其中I0λ是入射到容器4表面4a上的波长为λ的光的强度。
类似地，对于较短的波程长度b2，由探测器8b接收的同一波长λ下的强度可以表示成：
I2λ＝I0λexp(aλ·C·b2)                             (3)
回忆方程(1)，于是可将样品置零(现在有效地相对于空气)表示成：
Tλ＝I1λ/I2λ                                        (4)
或者取决于波长的吸收Aλ可以表示成：
Aλ＝log(I2λ/I1λ)＝aλ·C·(b1-b2)                  (5)
于是，在最简单的配置中，可以将运算单元10配置成从方程(5)和两个波程长度b1、b2的信息(至少它们的差)；感兴趣的波长λ下，相关探测强度I1λ、I2λ和吸收系数aλ的值来确定浓度C。
然而，更一般的是，可以将化学统计科学以一种通常所知的方式应用于该问题，其中为了产生校准运算利用了多元统计分析，该校准算法建立了吸收Aλ与感兴趣物质的浓度C的关联。如众所周知的，这涉及使用一套“训练”或校准样品，优选地，将该“训练”或校准样品选择为覆盖整个浓度范围和有可能感兴趣的物质范围。本发明新的地方是，对每个校准样品获取光谱，并进而还覆盖可能的光程差(b1-b2)。从这些光谱建立校准方程或算法，该校准方程或运算法则利用波长为取决于光程的光谱数据和感兴趣物质的定量存在建立联系。可以理解的是，以这种方式，就不必为了运算单元10能对一个或更多个特定的感兴趣物质进行预测而去了解任何试验样品下的实际光程或光程差。
图2示出了本发明分光光度计18的第二实施方案。此处，多色光源20以已知的方式可调，以沿光轴14并朝向样品容器22连续发射感兴趣的特定波长的光。光源20可以，例如，包括已知的激光二极管装置，该激光二极管装置可调地输出已知波长，或者可以包括色散元件(诸如在光栅单色仪中的之类)或者包括滤光元件，该滤光元件可调整地从多色入射光束中选取已知波长用于发射。
放置探测装置24以对来自源20的光在其透过样品容器22内的样品材料后对其进行收集。将探测装置24配置成向运算单元10提供输出，该输出指示所收集光的强度。
此外或者可替换地，可以将该输出提供给发送单元26，以便，例如，借助因特网或其他通信网络将该输出继续传送至运算单元10b，该运算单元10b位于分光光度计18的外部，例如，位于远程中央设备(remote central facility)处，该运算单元可以处理来自多个相连的相似分光光度计的信息。可以理解的是运算单元10b可以只是位于分光光度计18附近的标准个人电脑上的元件，以及其传送可借助于硬线联结。
在本实施例中，由横截面为直角三角形的透明槽组成样品容器22，该样品容器22被放置用来提供多个不同的光程，该光程取决于从源20发射的光在槽22第一面22a上的入射位置。在本实施方案中，为了在槽22的第一面22a上生成横截面面积比源20最初发射的光束大的准直光束，配以光学器件28。
探测装置24包括探测表面30，该表面被放置成平行于槽22的第二面22b，该第二面22b为直角三角形斜边，光和槽22内存放的样品材料相互作用后透过该第二面22b。利用该装置，不管光是在探测表面30上的何处被探测到的，其在槽22外部传播的光程是相同的。在本实施方案中，该探测表面30适用于生成具有区分能力的对位置敏感的强度信号，并且可以，例如包括两个或更多个独立探测元件24a，24b的线性阵列。使用该配置，来自探测装置24的输出可以同时以及以一种可区分的方式将属于来自多个(此处为两个)光程的光强的值有利地提供给运算单元10(以及可能是10b)。
运算单元10(以及可能是10b)接收来自探测装置24的输出，以及在本实施方案中，接收来自源20的指示发射波长λ的输出，以及以此方式，该运算单元10被配置成可同时获取至少两个不同波程长度下的，和波长挂钩的强度值。为根据上面的方程给出指示槽22中样品内感兴趣物质的存在的输出，可以存储这些值以进行稍后处理，或者以上述涉及图1运算单元10的操作时所描述的方式对其进行实时处理。
在其中配备了多于两个探测元件24a，b......的实施方案中，有利地将运算单元10，10b配置成通过在不同对波程长度下获取的强度值(相应于不同对探测元件24a，b...)和借助上述方程(5)来得出多个指示同一样品中的感兴趣物质的值。可以将以此得出的多个值简单结合以提供平均值，该平均值定量指示感兴趣物质的存在，或者为给出这类定量指示，诸如通过将每个值赋以合适的权重来进行结合。
可以理解的是，简单地通过配置致动器12使其以一种可以提供三个或更多个不同的两面4a、4b间隔的方式操作，可以将根据图1的实施方案配置成可提供多个这类指示，其中光谱在这些间隔下被运算单元10记录和存储。
在图2的分光光度计18的可替换配置中，槽22安装在支撑32上，用于在垂直于入射光束传播方向(即，垂直于沿光轴14)的平面内平移。图中用双向箭头指示该平移。可操作性地连接诸如滚珠螺旋致动器之类的致动器34(虚线结构)以平移槽22。在这种配置下，槽22相对于光源20发射的束的平移使对于入射光束内的同一个点，连续地呈现穿过槽22的不同光程。准直透镜28可以省去，探测装置24无需被构造为提供具有区分能力的对位置敏感的强度信号。当然，通过平移光源20和探测装置24或其中之一结合或取代槽22的平移，可以实现类似目的。
本领域普通技术人员可以理解的是，样品容器4、22可以被包含进其他分光光度计装置中，诸如包含进已知的傅立叶变换红外(FTIR)分光光度计装置的一个臂的光程中，但这不脱离所要求保护的发明。
还可以理解的是，可以利用光学波长范围(从紫外到红外)之外其他波长范围内的辐射，只要该辐射和实验样品的相互作用可由上述方程(1)-(5)来描述。

Claims (8)

1.一种分光光度计(2；18)，它包括样品容器(4；22)，该样品容器适用于对于源发射的一个或多个波长的辐射内在地提供多个不同波程长度；探测装置(8；24)，该装置用于探测所发射的辐射在经过了多个波程长度中的其中一个后的依赖于波长的强度以及用于提供指示了该强度的输出；和运算单元(10；10b)，该运算单元被可操作性地连接，以接收该输出以及从该输出生成样品内感兴趣物质的定量和定性指示或其中之一；其特征在于，运算单元(10；10b)适用于计算值，该值取决于：所接收的一个或多个发射波长中相同的一个波长在多个不同波程长度的其中两个波程长度下的输出的比率，并继此生成定量和定性指示或其中之一。
2.根据权利要求1的分光光度计(2)，其特征在于：样品容器(4)包括配有两个对立表面(4a，4b)的槽，这两个对立表面可相对移动以便提供多个波程长度，以及还在于其中进一步配有可和槽(4)一起运作的致动器(12)，以在槽上施加作用力，用于实现两个对立表面(4a，4b)的相对移动。
3.根据权利要求1的分光光度计(18)，其特征在于：样品容器(22)上配有两个对立表面(22a，22b)，其中至少一个表面相对轴(14)形成倾斜角，该轴平行于所发射的辐射的传播方向。
4.根据权利要求3的分光光度计(18)，其特征在于：进一步配有可操作性地连接到样品容器(22)的致动器(34)，以实现样品容器在垂直于轴(14)方向上的平移。
5.根据前述任何一项权利要求的分光光度计(2；18)，其特征在于：样品容器(4；22)和探测装置(8；24)共同配置在一个透射分光光度计装置中。
6.一种利用分光光度计(2；18)确定试验样品中感兴趣物质定量和定性指示或其中之一的方法，所述方法包括以下步骤：
a)借助分光光度计，记录一个或多个波长(λ1；λ2)中每个波长在样品内传播了第一波程长度(b1)后的辐射的强度值(I1λ)；以及
b)对一个或多个波长(λ1；λ2)中每个波长在样品内传播了又一不同波程长度(b2)后的辐射，重复步骤a)至少一次；其特征在于：该方法还包括以下步骤：
c)在运算单元(10；10b)内计算取决于强度值(I1λ；I2λ)比率的值(Tλ；Aλ)，该强度值是对一个或多个波长(λ1；λ2)中每一个相同波长在两个波程长度(b1；b2)的每个波程长度下所记录的值；以及
d)根据步骤c)所计算的一个或多个值，在运算单元(10；10b)内确定物质指示(C)。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于：
多次重复步骤b)，每次处于样品内的又一不同光程下；以及其特征还在于：
多次重复步骤c)，其中每次使用步骤b)中所用的多个波程长度中的两个不同波程长度来计算值。
8.根据权利要求6或权利要求7的方法，其特征在于：
确定指示(C)包括使用多元统计分析建立的校准参数来计算感兴趣物质浓度的步骤。
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