CN101072793A - 具有降低的免疫原性的il－7变体 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及经修饰以降低它们的免疫原性的IL－7分子。这些分子也包括包含所述经修饰的IL－7分子和免疫球蛋白分子或其部分的融合蛋白质。

Description

具有降低的免疫原性的IL-7变体
相关申请的交互参考
本申请要求2004年12月9日提交的美国临时专利申请号60/634,470的优先权和权益，其中所述美国临时专利申请号60/634,470以其全部公开内容引入本文作为参考。
发明领域
本发明总体上涉及经修饰以降低它们免疫原性的IL-7分子。这些分子也包括包含所述经修饰的IL-7分子和免疫球蛋白分子或其部分的融合蛋白质，尤其是相应的Fc融合蛋白质。
背景
细胞因子是免疫系统的刺激因子，因此可以用作药物。例如，干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、白细胞介素2(IL-2)和粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)都是已批准用来治疗病毒传染、癌、免疫系统错误调节例如自身免疫疾病以及用来在癌化学疗法之后促进免疫系统恢复的药物。不幸地是，这些蛋白质会刺激针对它们自身的免疫反应，导致患者产生针对治疗性蛋白质的抗体。这些抗体也会抑制患者体内内源产生的相同蛋白质的功能，从而对病人健康产生潜在的长期后果。
白细胞介素-7是促进T细胞、B细胞和其它免疫细胞存活和增殖的细胞因子。其也是潜在的治疗受癌化学疗法、HIV感染或其它疾病、病症或暴露于化学药品而损害了免疫系统的患者的治疗性蛋白质。然而，基于其免疫刺激性质，预期在治疗上施用IL-7会诱导针对其自身的抗体反应。因此，在本领域中需要免疫原性更低但保持刺激免疫系统性质的改良形式的IL-7。
发明概述
本发明涉及与野生型IL-7相比经修饰降低了其免疫原性的白细胞介素-7(IL-7)。更加具体地，本发明的IL-7蛋白质经修饰去除了潜在的T细胞表位。因此，本发明的IL-7蛋白质(包括免疫球蛋白-IL7融合蛋白质、优选Fc-IL7融合蛋白质)具有比野生型IL-7改进的生物学性质。
因此，在一方面，本发明描述了与人IL-7部份(IL-7 moiety)或其活性部分至少80％同一的多肽，其中在对应Gln22、Leu24、Ile30、Phe39、Met54、Phe57、Arg58、Ala60、Leu63、Lys68、Met69、Leu77、Ile88、Val96、Leu104、Leu128、Met147、Thr149或Lys150的一个或多个残基处包含氨基酸替换。这些氨基酸修饰可以单独或者组合用来降低抗IL-7的T细胞反应。因此，本发明包含在选自Gln22、Leu24、Ile30、Phe39、Met54、Phe57、Arg58、Ala60、Leu63、Lys68、Met69、Leu77、Ile88、Val96、Leu104、Leu128、Met147、Thr149和Lys150的位置具有例如一个、至少两个、至少四个或者至少八个氨基酸修饰的IL-7部份。在另一实施方案中，IL-7部份引入了一个、两个、三个、四个、五个或者多个下列替换：Gln22Asp、Leu24Asp、Ile30Thr、Phe39Pro、Met54Ala、Phe57Lys、Phe57Asn、Arg58Asp、Ala60Ser、Arg61Glu、Leu77Asp、Leu104Ser、Leu104Val、Leu128Ala、Leu128Val、Leu128Pro、Leu128Ser、Met147Lys、Thr149Ser或者Lys150终止。
在一个实施方案中，多肽在Phe39、Phe57、Leu77和Leu128的一处或多处包含替换。在另一实施方案中，多肽具有一个或多个如下替换：Phe39Pro、Phe57Asn、Leu77Asp和Leu128Ser。在另一实施方案中，多肽包括替换：Phe39Pro、Phe57Asn、Leu77Asp和Leu128Ser，而在更多实施方案中，多肽包括替换：Phe39Pro、Phe57Asn和Leu128Ser。根据本发明的替换优选位置：Phe39或Phe57或Leu77或Leu128、Phe39和Phe57、或Phe39和Leu77、或Phe57和Leu77、或Phe39和Leu128、或Phe57和Leu128、或Leu77和Leu128、Phe39和Phe57和Leu77、或Phe39和Phe57和Leu128、或Phe57和Leu77和Leu128、或Phe39和Leu77和Leu128、Phe39和Phe57和Leu77和Leu128。根据本发明优选的特定替换为：Phe39Pro或Phe57Lys或Leu77Asp、或Leu128Ser；Phe39Pro和Phe57Lys、或Phe39Pro和Leu77Asp、或Phe57Lys和Leu77Asp、或Phe39Pro和Leu128Ser、或Phe57Lys和Leu128Ser、或Leu77Asp和Leu128Ser、Phe39Pro和Phe57Lys和Leu77Asp、或Phe39Pro和Phe57Lys和Leu128Ser、或Phe57Lys和Leu77Asp和Leu128Ser、或Phe39Pro和Leu77Asp和Leu128Ser；Phe39Pro和Phe57Lys和Leu77Asp和Leu128Ser。
在本发明的某些实施方案中，具有与人IL-7部份至少80％同一的多肽还包含免疫球蛋白(Ig)部份，例如人Ig部份。在一实施方案中，Ig部份为IgG2。在一些实施方案中，Ig部份为Fc部分。本发明也涉及包含编码本发明经修饰的多肽的核酸序列的细胞。在一个实施方案中，细胞为原核细胞。
在进一步的实施方案中，多肽具有与人IL-7部份或其活性部分至少90％的同一性，而在另一实施方案中，多肽具有与人IL-7部份或其活性部分至少95％的同一性。
本发明也描述了治疗患者的方法，其中所述方法包括向例如诊断为癌或HIV的患者施用治疗有效量的本发明多肽。在一实施方案中，本发明提供了施用大约0.01至大约10mg/kg/天或0.01-10.00mg/kg/天的本发明多肽。
附图简述
图1描述了人IL-7的氨基酸序列。加粗显示的是信号序列。粗斜体显示的是可以从IL-7序列中删除的18个氨基酸的一段序列。
图2描述了奶牛IL-7的氨基酸序列。加粗显示的是信号序列。
图3描述了绵羊IL-7的氨基酸序列。加粗显示的是信号序列。
图4描述了示例性的去免疫的(deimmunied)人IL-7的氨基酸序列，其中修饰了T细胞表位序列。
图5描述了细菌产生的去免疫的人IL-7的氨基酸序列。
图6描述了编码成熟IL-7的引入了F39P、F57N和L128S突变的密码子的核酸序列。
图7描述了具有突变F39P、F57N和L128S的成熟IL-7的氨基酸序列。
图8描述了编码成熟IL-7的引入了F39P、F57N、L77D和L128S突变的密码子的核酸序列。
图9描述了具有突变F39P，F57N，L77D和L128S的成熟IL-7的氨基酸序列。
图10描述了编码细菌产生的去免疫的IL-7(bDel-IL-7)的核酸序列，其中密码子针对大肠杆菌(E.coli)进行了优化，具有进行K68D，M69D，I88T，V96G氨基酸突变的密码子。
图11描述了编码成熟的IL-7变体-去免疫的IL-7(Del-IL-7)的核酸序列，其中所述的序列具有K68D、M69D、I88T、V96G氨基酸突变的密码子。
图12描述了Fcγ1-IL-7的氨基酸序列，其中Fc部分由γ1绞合部、γ1CH2和γ1CH3区域组成。
图13描述了人Fcγ2(h)(FN＞AQ)-IL-7的氨基酸序列，其为具γ1绞合部、γ2CH2结构域和γ2CH3结构域的Fc部分。Fc部分中引入了氨基酸突变F296A和N297Q。
图14描述了人Fcγ1-(接头1)-IL-7的氨基酸序列，其是通过氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS的多肽接头与IL-7部分连接的由γ1绞合部、CH1和CH2区域组成的Fc部分。
图15描述了人Fcγ1(YN＞AQ)-(接头2)-IL-7的氨基酸序列，其为具γ1绞合部、CH1和CH2区域、引入了Y296A和N297Q突变、通过氨基酸序列GGGGSGGGG的多肽接头与IL-7部分连接的γ1Fc部分。
图16描述了人Fcγ1(YN＞AQ，d)-(接头2)-IL-7的氨基酸序列，其为具有γ1铰合部、CH1和CH2结构域、引入了突变Y296A和N297Q、以及删除了Fc部分C端的赖氨酸和前面的甘氨酸的γ1Fc部分。Fc部分通过氨基酸序列为GGGGSGGGG的多肽接头与IL-7连接。
图17描述了Fcγ1的核酸序列，其中所述Fcγ1为具绞合部、CH1结构域和CH2结构域(均来自IgG1)的Fc部分。
图18描述了Fcγ1(YN＞AQ)的核酸序列，其为具绞合部、CH1结构域和CH2结构域(均来自IgG1)的Fc部分。Fc部分引入突变Tyr296Ala和Asn297Gln。
图19描述了Fcγ2(h)的核酸序列，其为具有IgG1绞合部和IgG2 CH2和CH3结构域的Fc部分。
图20描述了Fcγ2(h)(FN＞AQ)的核酸序列，其为具有IgG1绞合部和IgG2 CH2和CH3结构域的Fc部分。Fc部分引入了突变F296A和N297Q。
图21描述了成熟的人去免疫的IL-7.1的氨基酸序列，其中所述的IL-7引入了替换L24D、M54A、F57K、A60S、R61E、M147K、T149S，并且删除了残基K150、E151和H152。
图22描述了编码图21的氨基酸序列的核酸序列。
图23描述了成熟的人去免疫的IL-7.2的氨基酸序列，其中引入了替换D76N、L77D、T87Q、I88T、V96G、L119S、L128V、M147K、T149S，并删除了K150、E151和H152。
图24描述了编码图23的氨基酸序列的核酸序列。
图25描述了成熟的人去免疫的IL-7.3的氨基酸序列，其中引入了替换L24D、I30T、F39P、M54A、F57K、A60S、R61E、M68D、N69D、L77D、T87Q、I88T、V96G、L119S、L128A、M147K、T149S，并删除了K150、E151和H152。
图26描述了图25的氨基酸序列的核酸序列。
图27描述了编码接头序列GGGGSGGGG、紧随着成熟的人IL-7的核酸序列，其中所述人IL-7包含氨基酸替换F39P、F57N和L128S(PNS)，并且分别在5′和3′末端包含侧翼的限制性位点Xma I和Xho I。
图28描述了成熟的huFcγ2(h)(FN＞AQ)(接头2)-IL-7(F39P，F57N，L77D，L128S)的核酸序列，其中所述的huFcγ2(h)(FN＞AQ)(接头2)-IL-7(F39P，F57N，L77D，L128S)为具引入了突变F296A和N297Q的IgG1绞合部和IgG2 CH2和CH3结构域的人Fc部分与引入了突变F39P、F57N、L77D和L128S的人IL-7部份的N端连接。Fc部分和IL-7部份通过接头序列GGGGSGGGG连接。
图29描述了成熟的huFcγ2(h)-(接头2)-IL-7(F39P，F57N，L77D，L128S)的核酸序列，其中所述的huFcγ2(h)-(接头2)-IL-7(F39P，F57N，L77D，L128S)为具IgG1绞合部和IgG2 CH2和CH3结构域的人Fc部分与引入了突变F39P、F57N、L77D和L128S的人IL-7部份的N端连接。Fc部分和IL-7部份通过接头序列GGGGSGGGG连接。
图30描述了成熟的huFcγ2(h)-(接头2)-IL-7(F39P，F57N，L128S)的核酸序列，其中所述的huFcγ2(h)-(接头2)-IL-7(F39P，F57N，L128S)为具IgG1绞合部和IgG2 CH2和CH3结构域的人Fc部分与引入了突变F39P、F57N和L128S的人IL-7部分的N端连接。Fc部分和IL-7部分通过接头序列GGGGSGGGG连接。
图31描述了成熟的huFcγ2(h)(FN＞AQ)-(接头2)-IL-7(F39P，F57N，L128S)的氨基酸序列，其为具IgG1绞合部和IgG2的CH2和CH3结构域的人Fc部分。Fc部分包含突变F296A和N297Q。Fc部分通过序列为GGGGSGGGG的接头与IL-7部分连接。IL-7部分包含突变F39P、F57N和L128S。
图32描述了成熟的huFcγ2(h)(FN＞AQ)-(接头2)-IL-7(F39P，F57N，L77D，L128S)的氨基酸序列，其中所述的huFcγ2(h)(FN＞AQ)-(接头2)-IL-7(F39P，F57N，L77D，L128S)为具IgG1的绞合部和IgG2的CH2和CH3结构域的人Fc部分。Fc部分包含突变F296A和N297Q。Fc部分通过序列为GGGGSGGGG的接头与IL-7部分连接。IL-7部分包含突变F39P、F57N、L77D和L128S。
图33描述了成熟的huFcγ2(h)-(接头2)-IL-7(F39P，F57N，L77D，L128S)的氨基酸序列，其中所述huFcγ2(h)-(接头2)-IL-7(F39P，F57N，L77D，L128S)为具IgG1的绞合部和IgG2的CH2和CH3结构域的人Fc部分。Fc部分通过序列为GGGGSGGGG的接头与IL-7部分连接。IL-7部分包含突变F39P、F57N、L77D和L128S。
图34描述了huFcγ2(h)(接头2)-IL-7(F39P，F57N，L128S)的氨基酸序列，其中所述的huFcγ2(h)(接头2)-IL-7(F39P，F57N，L128S)为具IgG1的绞合部和IgG2的CH2和CH3结构域的人Fc部分。Fc部分通过序列为GGGGSGGGG的接头与IL-7部分连接。IL-7部分包含突变F39P、F57N、L77D和L128S。
图35为来自人、黑猩猩、狒狒、猕猴、牛、猪、绵羊、大鼠和鼠源的IL-7蛋白质的氨基酸序列比对。
图36描述了皮下施用Fc-IL-7的试验小鼠和对照小鼠两者的Fc-IL-7的血浆浓度(μg/ml)。
图37显示在皮下(SC)施用Fc-IL-7的试验小鼠中第0天和第2天之间以及第2天和第4天之间血浆中Fc-IL-7浓度的平均倍数变化值。
图38描述了取自第7天处死的试验小鼠的器官的平均器官重量与对照组小鼠的平均器官重量相比较。
图39描述了对照组、0.5mg/kg剂量组、5.0mg/kg剂量组和25mg/kg剂量组第7天小鼠外周血中粒细胞Gr-1+细胞频率(个细胞/微升)的比较。
图40描述了对照组、0.5mg/kg剂量组、5.0mg/kg剂量组和25mg/kg剂量组第7天小鼠外周血中CD19+细胞频率(个细胞/微升)的比较。
图41描述了对照组、0.5mg/kg剂量组、5.0mg/kg剂量组和25mg/kg剂量组第7天外周血测试中CD4+细胞频率(个细胞/微升)的比较。
图42描述了对照组、0.5mg/kg剂量组、5.0mg/kg剂量组和25mg/kg剂量组第7天外周血测试中CD8+细胞频率(个细胞/微升)的比较。
图43描述了在标准的细胞增殖测试中Fc-IL-7与野生型IL-7相比较的活性，其中所述活性基于每分钟计数掺入的氚化胸苷相对IL-7/Fc-IL-7浓度。
发明详述
本发明涉及与野生型IL-7相比较降低了免疫原性的IL-7蛋白质以及制备和使用该蛋白质的方法。更加具体地，本发明提供了IL-7部分内具有降低IL-7自身免疫原性效果的突变，其中所述突变主要通过去除IL-7内刺激免疫反应的T细胞表位。本发明也包含引入了根据本发明教导的经修饰IL-7部分的融合蛋白质。
T细胞表位可以通过多种计算机方法和非计算机方法鉴定，其中包括以基于结构的计算机建模为基础的预测或者通过合成肽并进行结合特定MHC II类分子的检测或者在免疫原性测定中进行的预测。根据本发明，当认为T细胞表位为分离的肽时，潜在的T细胞表位为预测为与MHC II类分子或非人物种中的等价物结合的序列。确定潜在的T细胞表位而不考虑抗原加工的其它方面，例如蛋白质摄入抗原呈递细胞的效率、在完整蛋白质中的位点切割产生能结合MHC II类的肽的效率等等。因此，在向动物施用蛋白质之后真正出现在MHC II类之上的T细胞表位集合为潜在的T细胞表位的子集。根据本发明，T细胞表位是蛋白质上与MHC II类分子相互作用的表位。不受理论约束，将T细胞表位理解为是在T细胞发育过程中蛋白质中未受到T细胞负选择过程作用的氨基酸序列，并因此预期其将被MHC II类分子呈递并被T细胞受体识别。
B细胞表位也通过多种计算机和非计算机方法鉴定，其中包括以基于结构的计算机建模为基础的预测、或者通过合成肽并检测与特定B细胞抗原受体分子的结合或者在免疫原性测试中进行的预测。根据本发明，当认为潜在的B细胞表位为独立的肽时，潜在的B细胞表位为预测为与B细胞抗原受体或非人物种中的等价物结合的序列。B细胞表位为确实结合B细胞抗原受体或者确实被B细胞抗原受体识别的表位，并且是潜在的B细胞表位的子集。
本发明提供了涉及降低IL-7免疫原性的方法。根据本发明的一个实施方案，在IL-7序列中鉴定潜在的非自身T细胞表位。例如通过基于模拟结合MHC II类分子的肽的计算方法在IL-7的序列中鉴定潜在的非自身T细胞表位。然后进行替换来降低或者消除包含潜在T细胞表位的肽结合MHC II类分子的能力。将这种鉴定和修饰结合MHC II类分子的肽的方法命名为“去免疫”，并将所得经修饰的蛋白质分子命名为“去免疫的”。
根据本发明，MHC II类结合可以在蛋白质于细菌或者在不产生哺乳动物糖基化模式的生物体例如酵母或昆虫细胞中产生的情况下去除。
本发明提供了降低或者消除IL-7中的T细胞表位数量而不需要精细的计算机模拟或者蛋白质三维结构的非计算机方法。在一实施方案中，本发明的方法利用了下列事实，即在抗原呈递过程中九氨基酸的核心片段与MHC II类分子和T细胞受体两者均相互作用。最N末端的氨基酸即“锚”位置与MHC II类分子中的深口袋结合。出现在对于结合MHC II类分子很重要的锚位置的一般为下列氨基酸之一：亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。根据本发明，邻近核心9氨基酸的其它2-3个氨基酸也影响与MHC分子的相互作用。
本发明的一般方法包括突变IL-7中出现的任意亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。在一实施方案中，将候选T细胞表位中的一个或多个这些氨基酸突变为苏氨酸、丙氨酸或者脯氨酸，从而保持被替换的氨基酸的疏水性质。在本发明更多的实施方案中，将一个或多个上述氨基酸从候选T细胞表位或潜在的T细胞表位中删除，或者用适当的氨基酸类似物进行替代。根据本发明，如果删除氨基酸来破坏潜在的T细胞表位，那么需要注意不能产生包括删除附近氨基酸的新的T细胞表位。
因此，本发明提供了在构建更低致免疫性IL-7蛋白质中有用的核酸序列和蛋白质。具体地，本发明提供了具有亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸突变的蛋白质。任何脂肪族或芳香族残基(亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸)都呈现产生MHC结合肽的高风险，其中所述MHC结合肽具结合MHC口袋的第一个位置(锚位置)的氨基酸。因此，用非上述氨基酸或者用丙氨酸、脯氨酸或苏氨酸替换任意上述氨基酸都将去除候选的T细胞表位。
蛋白质可以是具一般与人体中发现的序列对应的序列的人蛋白质。本发明也提供了编码该蛋白质的核酸序列。本发明这个方面的核酸序列可以以质粒、PCR产生的片断或者化学合成产生的核酸存在。
如本文所用，术语“白细胞介素-7”或“IL-7”表示IL-7多肽以及具有与野生型成熟的哺乳动物IL-7相当大的氨基酸序列同一性的其衍生物和类似物。例如，IL-7指的是具有下列氨基酸序列的重组或非重组的多肽的氨基酸序列：i)IL-7多肽的天然或自然存在的等位变体、ii)IL-7多肽的生物学活性片段、iii)IL-7多肽的生物学活性多肽类似物或者iv)IL-7多肽的生物学活性变体。
根据本发明的经修饰的IL-7多肽可以来自任何物种，例如人、奶牛或绵羊。本领域已知IL-7的核酸和氨基酸序列。例如，人IL-7的氨基酸序列的Genbank登录号为NM 000880(SEQ ID NO：1)，并且如图1所示；小鼠IL-7氨基酸序列的Genbank登录号为NM 008371；大鼠IL-7氨基酸序列的Genbank登录号为AF 367210；奶牛IL-7氨基酸序列的Genbank登录号为NM 173924(SEQ ID NO：2)，并且如图2所示；并且绵羊IL-7氨基酸序列的Genbank登录号为U10089(SEQ ID NO：3)，并且如图3所示。每个多肽物种的信号序列在每个图中都加粗显示，并且当IL-7部分融合在载体蛋白质C末端时，一般不包括信号序列。
此外，在图35中，显示了多种哺乳动物IL-7序列的比对。非人灵长类的IL-7通常与人IL-7具有高于90％的同一性。虽然鼠的IL-7序列与人IL-7序列最趋异，具有低于70％的同一性，但是其也能够或者激活人IL-7受体。因此，大范围物种的IL-7部分根据本发明的教导尤其有用。
IL-7蛋白质的“变体”定义为与野生型IL-7相比较改变了一个或多个氨基酸的IL-7氨基酸序列。变体可以具有“保守的”改变，其中替换的氨基酸具有相似的结构或化学性质，例如将亮氨酸替换为异亮氨酸。更加稀少地，变体可以具有“非保守的”改变，例如将甘氨酸替换为色氨酸。相似的较小变化也可以包括氨基酸删除或插入，或包括两者。
变体IL-7蛋白质也包括具有与野生型IL-7至少大约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的多肽。要确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分数同一性，序列要进行最佳比对目的的排列(例如，可以在第一个氨基酸序列或核酸序列中引入缺口来与第二个氨基酸或核酸序列进行最佳排列)。两个序列之间的百分数同一性是序列共享的同一位置数的函数(即％同源性＝(同一位置数/总位置数)×100)。两个序列之间百分数同源性的确定可以使用数学算法完成。用于两个序列比较的数学算法的非限制性实例是Karlin和Altschu，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：2264-68，如Karlin和Altschul，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-77中改进的算法。将该算法整合入Altschul等人，(1990)J.MoI.Biol..215：403-10的NBLAST和XBLAST算法。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序分值＝100、字长＝12进行。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序分值＝50、字长＝3进行。要获得比较目的的缺口比对，可以如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Research，25(17)：3389-3402中所述地使用Gapped BLAST。当使用BLAST和GappedBLAST程序时，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。
此外，本发明也包括IL-7融合蛋白质，其中所述的IL-7部分包含删除，并且与相应未修饰的IL-7融合蛋白质相比较保留了相当的活性。例如，本发明提供了其中IL-7部分包含内部删除相应于野生型人IL-7的VKGRKPAALGEAQPTKSL(SEQ ID NO：25)序列的18个氨基酸的Ig-IL-7或IL-7形式(见SEQ ID NO：1)。此外，本发明提供了活性形式的IL-7，其中删除了Lys150。Glu151和His152也可以与Lys150一起删除，而仍然保留活性形式的IL-7。
遍及这个申请，IL-7序列中氨基酸残基的位置参考成熟的人IL-7蛋白质给出。例如，细菌产生的人IL-7蛋白质的N末端序列MDCDIEGK...(SEQ ID NO：22)中的半胱氨酸仍然称为Cys2，其中所述细菌产生的人IL-7蛋白质包括起始的甲硫氨酸。
修饰IL-7蛋白质
本发明的一个方面来自对由细菌表达产生的IL-7将不包含翻译后修饰的认识，其中所述的翻译后修饰为真核生物如哺乳动物的特征。例如，IL-7在位置70、91和116处包含三个预计的N连接的糖基化位点。在哺乳动物细胞中表达的Fc-IL-7融合蛋白质中，位置70和91处的天冬酰胺被糖基化，而位置116处的天冬酰胺未被糖基化。可能人体中产生的内源IL-7至少在位置70和91、并且可能在位置116处也是N-糖基化的。这些N连接的糖基化在细菌产生的IL-7中不存在，并且代表可能被人免疫系统识别为“非自身的”即不是人体中正常存在的序列。如此，本发明包含在IL-7上去免疫化这些潜在的表位区域来降低IL-7和相关蛋白质的免疫原性。
根据本发明，存在于IL-7中的T细胞表位包括位置70和91，如表1所述。表1中显示的表位限定为在第一个位置具强MHC II类锚残基的最小的9-mer肽。
表1
包括位置70的T细胞表位 包括位置91的T细胞表位
LRQFLKMNS(SEQ ID NO：4)FLKMNSTGD(SEQ ID NO：5)LKMNSTGDF(SEQ ID NO：6)MNSTGDFDL(SEQ ID NO：9) ILLNCTGQV(SEQ ID NO：7)LLNCTGQVK(SEQ ID NO：8)
根据本发明，一种用于降低细菌产生的IL-7的免疫原性的方法为引入一个或多个下列突变：Leu63Ala、Leu63Val、Leu63Pro、Leu63Thr、Lys68Asp、Met69Asp、Lys68Glu、Met69Glu、Ile88Thr、Ile88Ala、Ile88Val和Val96Gly。可在位置63、68、69、88和/或94引入其它突变。一些突变在组合中尤其有用，如Lys68Asp与Met69Asp的组合对和/或Ile88Thr与Val96Gly的组合对。
当将这些突变引入IL-7或包含IL-7的融合蛋白质时，所得的突变蛋白质通常具有足够用作治疗性蛋白质的IL-7生物学活性。事实上，IL-7部分的生物学活性与野生型IL-7的生物学活性相比较至少是10％、20％、50％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。本发明的IL-7的活性可以在体外或体内测试中检测。实施例9显示了检测本发明IL-7变体生物学活性的测试。
此外，突变通常允许IL-7部分正确折叠以便可以分离纯净的蛋白质、很大程度上不含高分子量聚集体和错误的二硫键合形式。然而，需要例如如实施例所述测试任意特定组合产生的折叠和生物学活性来证实获得了目的活性。
根据本发明，降低细菌产生的IL-7的免疫原性的备选策略是将Asn70和Asn91变成天冬氨酸。不希望受理论约束，将Asn70和Asn91突变成天冬氨酸因为下列原因有用。
外源施用的治疗性蛋白质的免疫原性部分通过呈递源于治疗性蛋白质的T细胞表位介导。认为这种呈递通过下列机制发生。治疗性蛋白质由抗原呈递细胞(APC)例如树突细胞、巨噬细胞或B细胞通过胞吞作用摄入。蛋白质转运入一系列名为内体的小泡，其中包括早期、中期和晚期内体。在这些小泡中，环境逐渐变得更加恶劣，并且变得更加不利于在中性pH能稳定折叠的细胞外二硫键化的蛋白质。称为组织蛋白酶的蛋白酶将内化的蛋白质降解成为小肽。然后部分这些蛋白质片段与MHC II类蛋白质结合，其中所述的MHC II类蛋白质将片段转运到细胞表面作为MHC II类/肽复合体。该复合体由CD4+T细胞上的T细胞受体识别。
在肽源自外源蛋白质的情况中，MHC II类/肽复合体的呈递可以刺激免疫反应。然而，在肽源自自身蛋白质的情况中，有多种机制将T细胞识别的MHC II类/肽复合体消除或者防止其激活免疫反应。
以前面两段作为背景，重要的是考虑N糖基化的蛋白质在内体里将如何被加工。此种蛋白质可降解为能与MHC II类分子结合的、包含N连接的寡糖的肽。根据本发明的认识，内体也包含有时从天冬酰胺移去寡糖的内切糖苷酶，并且通过这样做将天冬酰胺转变成为天冬氨酸。因此，包含天冬酰胺连接的寡糖的自身蛋白质序列可以通过MHC II类呈递为包含与寡糖连接的天冬酰胺的肽、或者呈递为包含天冬氨酸而非天冬酰胺的相应的肽。
作为本发明的部分，也认识到，这种降低细菌中表达的哺乳动物蛋白质免疫原性的策略可以以一般方式进行应用。具体地，将在N连接的糖基化位点处的天冬酰胺替换为天冬氨酸通常具有降低在原核生物中表达的哺乳动物蛋白质的免疫原性的效果。
本发明包含降低在细菌或哺乳动物细胞中表达的IL-7和包含IL-7的融合蛋白质免疫原性的额外的突变。这些突变包括下文表2例出的那些。IL-7或包含IL-7的融合蛋白质可以包含一个或多个这些突变。例如，在一实施方案中，将IL-7修饰为引入了一个或多个L24D、M54A、F57K、A60S、R61E、M147K和T149S、删除了K150，E151和H152。在另一实施方案中，将IL-7修饰为引入了一个或多个D76N、L77D、T87Q、I88T、V96G、L119S、M147K和T149S、删除了K150、E151和H152。在更多实施方案中，将IL-7修饰为引入一个或多个L24D、I30T、F39P、M54A、F57K、A60S、R61E、M68D、N69D、L77D、T87Q、I88T、V96G、L119S、L128A、M147K和T149S、删除K150、E151和H152。
在另一实施方案中，IL-7分子或包含IL-7的融合蛋白质可以包括IL-7的39、57、77和/或128残基中的一个或多个突变。例如，在一实施方案中，IL-7包括残基39的突变。在另一实施方案中，IL-7包括残基57的突变。在更多实施方案中，IL-7包括残基39和57两者的突变。在另一实施方案中，IL-7包括残基39、57和128的突变，而在另一实施方案中，IL-7包括残基39、57和77的突变。在另一实施方案，IL-7包括残基39、57、77和128的突变。在更多的实施方案中，将位置39的苯丙氨酸残基替换为脯氨酸残基(F39P)。在另一实施方案中，将57位的苯丙氨酸残基替换为天冬酰胺残基(F57N)。在另一实施方案中，将位置77的亮氨酸替换为天冬氨酸(L77D)。在另一实施方案中，将位置128的亮氨酸残基替换为丝氨酸(L128S)。
表2
成熟的人IL-7中的最初位置 替代
Gln22Leu24Ile30Phe39 AspAspThrPro
Met54Phe57Arg58Ala60 AlaLys、AsnAspSer
Arg61Leu63Lys68Met69 GluAla、Val、ProAspAsp
Leu77Ile88Val96Leu104 AspThrGlySer、Val
Leu128Met147Thr149Lys150 Ala、Val、Pro、SerLysSer终止密码
证实本发明蛋白质降低的免疫原性
为了确定本发明的突变的确导致了降低的免疫原性，可以采用本领域熟知的标准的实验测试。例如，可以使用T细胞刺激测试(例如，Jones等人，(2004)，J.Interferon Cytokine Res.，24：560)。在该测试中，根据标准条件获得人外周血单核细胞(PBMC)并进行培养。在任选的预刺激后，向PBMC的培养物中加入对应于潜在的MHC II类表位的肽；进一步孵育PBMC，并在稍后时间加入氚标记的胸苷。肽可以是最小的9-mer、或者具有大约10-15或更多的氨基酸。在进一步孵育细胞之后，然后通过标准技术测定氚标记的胸苷掺入的DNA。
认为T细胞刺激测试通过下列机制工作。首先，如果肽用作刺激剂，那么肽必须先与PBMC中细胞上存在的MHC II类分子结合。其次，MHC II类/肽复合体必须有结果地与CD4+T细胞上的T细胞受体相互作用。如果测试的肽不能与MHC II类分子结合得足够紧密的话，那么将不会产生信号。如果肽能够结合MHC II类分子，并且有表达适当重排的能识别特定MHC II类/肽复合体的T细胞受体的T细胞，那么将产生信号。然而，如果该类T细胞已经作为负选择过程的结果被去除了的话，那么也不会产生信号。根据通过特定肽的刺激或缺乏刺激进行的推断，认为这些机制与蛋白质序列的免疫原性相关。
如果由于随机原因识别T细胞以非常低的数量出现在PBMC群体中，那么虽然会期望信号，但也可能没有信号，其中所述的随机原因涉及不能发生适当的T细胞受体或者其它、无关的T细胞增殖、随后T细胞总数自身稳定。因此，可能发生错误的阴性结果。基于这些考虑，使用大量不同来源的PBMC并且独立地测试这些样品就很重要。通常，测试不同人种集合的PBMC、并测定每个PBMC群体中存在的MHC II类等位基因也是有用的。
标准的T细胞测试具有氚掺入信号通常只比背景掺入高两倍的缺点。本发明的蛋白质和肽也可以在改良的T细胞测试中进行检测，在其中所述的改良的T细胞测试中，例如将纯化的CD4+T细胞和纯化的树突细胞在存在测试肽的情况下共培养，随后暴露于氚标记的胸苷，然后检测氚标记的胸苷的掺入。第二种测试具有基本消除了掺入无关细胞例如CD8+T细胞的氚标记的胸苷、因此降低背景的优点。
第三种测试涉及在动物例如灵长类中检测具降低免疫原性的候选蛋白质。该测试通常涉及检测整个IL-7蛋白质或包含IL-7的融合蛋白质，其中所述的包含IL-7的融合蛋白质中的IL-7部分通过在基于细胞的测试例如上文描述的测试中检测各组分肽潜在的免疫原性而进行了设计。一旦设计并表达了该候选的包含IL-7的蛋白质，就通过注射入动物来检测免疫原性。
注射经修饰的包含IL-7的蛋白质通常以与在人中治疗用途中的预期的递送途径相同的方式进行。例如，可以使用皮内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射或者静脉内输注。如果不只一次施用，可以通过不同途径施用。
对于免疫原性测试目的，共施用佐剂来增加信号并最小化必需使用的动物数量是有用的。如果使用佐剂，可能使用缺乏蛋白质组分的佐剂，例如具未甲基化CpG二核苷酸的非编码性DNA、细菌的脂质A、N-甲酰甲硫氨酸或其它的细菌性非蛋白质组分。不希望受理论约束，避免包含蛋白质的佐剂的原理是其它蛋白质可能提供最终参与针对候选蛋白质的抗体反应的T细胞表位。
在一次或多次施用候选的包含IL-7的蛋白质之后，根据标准技术例如ELISA方法检测抗IL-7的抗体的存在。发现本发明改变的包含IL-7的分子与相应的包含正常人IL-7的分子相比较更低频率地诱导抗体形成、并且程度较低。
本发明的许多蛋白质改变了IL-7的表面残基。考虑到本发明的蛋白质虽然致免疫原性比相应的包含人IL-7的蛋白质更低，仍然会偶然地诱导形成抗体。因为本发明的蛋白质的B细胞表位通常与未修饰的IL-7的B细胞表位不同，所以本发明的蛋白质的抗体通常不与内源的IL-7交叉反应，而且本发明的蛋白质的抗体的形成不对病人健康具有长期后果。
Fc-IL-7融合蛋白质
本发明的关键方面是，根据本发明修饰的IL-7可以与载体蛋白质融合来产生融合蛋白质。在一实施方案中，将载体蛋白质置于融合蛋白质的N端，并将IL-7置于C端。在另一实施方案中，将IL-7置于融合蛋白质的N端，并将载体蛋白质置于C端。
载体蛋白质可以是任意与IL-7蛋白质共价融合的多肽。在一实施方案中，载体蛋白质为白蛋白，例如人血清白蛋白。白蛋白部分可以融合在IL-7部分的C末端或N末端。在另一实施方案中，载体蛋白质为免疫球蛋白(Ig)部分，例如Ig重链。Ig链可以源自IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。根据本发明，Ig部分可以是完整的抗体，并且可以将IL-7融合蛋白质导向至身体中的特定靶位点。使用抗体靶向的融合蛋白质为本领域技术人员所公知。
在一实施方案中，Ig部分包含Fc区域。如本文所用，“Fc部分”包含源自免疫球蛋白例如人免疫球蛋白恒定区的结构域，其包括恒定区的片段、类似物、变体、突变体或者衍生物。合适的免疫球蛋白包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和其它类。免疫球蛋白的恒定区定义为与免疫球蛋白C端区域同源的自然存在或合成产生的多肽，并且可以单独或者以任意组合地包括绞合部、CH2结构域、CH3结构域或CH4结构域。在本发明中，Fc部分一般至少包括CH2结构域。例如，Fc部分可以包括绞合部-CH2-CH3。备选地，Fc部分可以包括全部或部分的绞合部区域、CH2结构域和/或CH3结构域。美国临时专利申请60/533,406中公开了制备Fc-IL-7融合蛋白质的方法。
免疫球蛋白的恒定区负责许多重要的抗体功能，其中所述的抗体功能包括Fc受体(FcR)结合和补体固定。重链恒定区有五个主要类别，分类为IgA、IgG、IgD、IgE和IgM。例如，IgG分为四个γ亚类：γ1、γ2、γ3和γ4，也分别已知为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
IgG分子与许多种类的细胞受体相互作用，其中所述的细胞受体包括三类特异针对IgG类抗体的Fcγ受体(FcγR)，即FcγRI、FcγRII和FcγRIII。已有报道将对IgG与FcγR受体结合重要的序列定位于CH2和CH3结构域中。抗体的血清半衰期受抗体与Fc受体(FcR)的结合能力影响。类似地，免疫球蛋白融合蛋白质的血清半衰期也受与该类受体结合能力的影响(Gillies等人，(1999)Cancer Res.59：2159-66)。与IgG1的CH2和CH3结构域相比较，IgG2和IgG4的CH2和CH3结构域与Fc受体具有生物化学上不能检测到的或降低的结合亲和性。已经报道，包含IgG2或IgG4的CH2和CH3结构域的免疫球蛋白融合蛋白质具有比包含IgG1的CH2和CH3结构域的相应融合蛋白质更长的血清半衰期(美国专利号5,541,087；Lo等人，(1998)Protein Engineering，11：495-500)。因此，在本发明的一些实施方案中，CH2和CH3结构域源自具降低的受体结合亲和性和效应子功能的抗体同种型例如IgG2或IgG4。
绞合部区域通常定位在重链恒定区CH1结构域的C端。在IgG同种型中，一般在这个绞合部区域中存在二硫键，从而允许形成最终的四聚体分子。这个区域主要是脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸。当包括在本发明之中时，绞合部区域一般至少与天然存在的包括半胱氨酸残基的免疫球蛋白的区域同源以便形成连接两个Fc部分的二硫键。人和小鼠免疫球蛋白绞合部区域的代表性序列为本领域所已知，并且可以在Borrebaeck，C.A.K.，ed.，(1992)Antibody Engineering，A Practical Guide，W.H.Freeman and Co中找到。对本发明合适的绞合部区域可以源自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和其它免疫球蛋白类。
IgG1绞合部区域具有三个半胱氨酸，其中的两个参与免疫球蛋白两条重链之间的二硫键。这些相同的半胱氨酸允许Fc部分有效并持久地形成二硫键。因此，本发明的绞合部区域在一实施方案中源自IgG1，例如人IgG1。当使用IgG1绞合部时，可以将第一个半胱氨酸突变为其它的氨基酸例如丝氨酸。
IgG2同种型的绞合部区域具有四个二硫键，其中所述的二硫键倾向于促进寡聚化、以及促进在重组体系中分泌时可能错误的二硫键化。适当的绞合部区域可以源自IgG2绞合部。在一实施方案中，将IgG2绞合部的前两个半胱氨酸突变为其它的氨基酸。
已知IgG4的绞合部区域不能有效地形成链间的二硫键。然而，对本发明适当的绞合部区域可以源自IgG4绞合部区域，并且可以包含增强重链衍生的部分之间正确形成二硫键的突变(Angal等人，(1993)Mol.Immunol.，30：105-8)。
根据本发明，Fc部分可以包含源自不同抗体同种型的CH2和/或CH3和/或CH4结构域以及绞合部区域，即杂化Fc部分。例如，在一实施方案中，Fc部分包含源自IgG2或IgG4的CH2和/或CH3结构域和源自IgG1的突变绞合部区域。备选地，在杂化Fc部分中使用来自另一IgG亚类的突变绞合部区域。例如，可以使用能在两条重链之间有效地二硫键化的突变形式的IgG4绞合部。突变的绞合部也可以源自IgG2绞合部，在其中所述的IgG2绞合部中将前两个半胱氨酸每个都突变为另外的氨基酸。此类杂化Fc部分促进Fc-IL-7融合蛋白质的高水平表达，并且提高Fc-IL-7融合蛋白质的正确装配。此类杂化Fc部分的装配为本领域所已知，并且在美国公开的专利申请号2003-0044423中进行了描述。
在一些实施方案中，Fc部分包含通常延伸Fc融合蛋白质血清半衰期的氨基酸修饰。这些氨基酸修饰包括基本减少或消除Fc受体结合或补体固定活性的突变。例如，可以去除免疫球蛋白重链Fc部分中的糖基化位点。在IgG1中，糖基化位点为氨基酸序列Gln-Tyr-Asn-Ser(SEQ ID NO：26)中的Asn297。在其它的免疫球蛋白同种型中，糖基化位点对应IgG1的Asn297。例如，在IgG2和IgG4中，糖基化位点为氨基酸序列Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ ID NO：28)中的天冬酰胺。因此，IgG1的Asn297突变去除了源自IgG1的Fc部分中的糖基化位点。在一实施方案中，将Asn297替换为Gln。在其它实施方案中，将氨基酸序列Gln-Tyr-Asn-Ser(SEQ ID NO：26)中的酪氨酸进一步突变来消除由于天冬酰胺突变产生的潜在的非自身T细胞表位。例如，IgG1重链中的氨基酸序列Gln-Tyr-Asn-Ser(SEQ ID NO：26)可以用Gln-Ala-Gln-Ser(SEQ IDNO：27)氨基酸序列进行替换。
同样地，在IgG2或IgG4中，氨基酸序列Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ IDNO：28)中的天冬酰胺突变去除了源自IgG2或IgG4重链的Fc部分的糖基化位点。在一实施方案中，将天冬酰胺替换为谷氨酰胺。在其它实施方案中，进一步突变氨基酸序列Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ ID NO：28)中的苯丙氨酸来消除由于天冬酰胺突变产生的潜在的非自身T细胞表位。例如，可以将IgG2或IgG4重链中的氨基酸序列Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ ID NO：28)用氨基酸序列Gln-Ala-Gln-Ser(SEQ ID NO：27)进行替换。美国专利申请号09/256,156中公开了对于降低Fc受体结合有用的其它突变。
也发现改变Fc部分和非Fc部分的接头附近的氨基酸可以显著地增加Fc融合蛋白质的血清半衰期。(美国公开的专利申请号2002-0147311)。因此，本发明的Fc-IL-7或IL-7-Fc融合蛋白质的接头区域相对天然存在的免疫球蛋白重链和IL-7的序列可以在位于接点大约10个氨基酸之内包含改变。这些氨基酸变化可以通过将Fc部分的C端赖氨酸改变为疏水性氨基酸例如丙氨酸或亮氨酸而导致疏水性增加。(见例如SEQ ID NO：34)。在本发明的另一实施方案中，删除了Fc部分的C端赖氨酸和之前的甘氨酸。(见例如SEQ ID NO：35)
在其它实施方案中，Fc部分在免疫球蛋白重链Fc部分C端附近的Leu-Ser-Leu-Ser片段中包含氨基酸改变。Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ IDNO：29)片段的氨基酸替换消除了潜在的接头T细胞表位。在一实施方案中，将Fc部分C端附近的氨基酸序列Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO：29)替换为氨基酸序列Ala-Thr-Ala-Thr(SEQ ID NO：30)。在其它实施方案中，将Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO：29)片段中的氨基酸替换为其它的氨基酸例如甘氨酸或脯氨酸。美国公开的专利申请号2003-0166877中描述了详细的在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其它免疫球蛋白类分子的C端附近的Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO：29)片段中产生氨基酸替换、以及其它改变接头的T细胞表位的示例性修饰的方法。
在一实施方案中，在载体蛋白质和IL-7蛋白质之间插入间隔肽或接头肽。间隔或接头肽可以是不带电荷或者非极性或者疏水性的。间隔或接头肽的长度介于1至大约100个氨基酸、或者介于1至大约50个氨基酸、或者介于1至大约25个氨基酸、或者介于1至大约15个氨基酸。在一实施方案中，间隔包含序列(G4S)n，其中n小于10。在另一实施方案中，接头序列为GGGGSGGGG(SEQ ID NO：67)。又在另一实施方案中，间隔包含被识别为N连接的糖基化位点的基序。在本发明的另一实施方案中，载体蛋白质和IL-7融合蛋白质通过间隔或接头肽连接。在本发明备选的实施方案中，载体蛋白质和IL-7融合蛋白质通过合成的间隔例如PNA间隔分开。间隔可以是不带电荷或非极性或疏水性的。
产生IL-7融合蛋白质
包含根据本发明教导修饰的IL-7的融合蛋白质可以通过上文描述的非限制性方法合成。本文也描述了用于在体内检测包含根据本发明修饰的IL-7的融合蛋白质的药物代谢动力学活性的测试。
本发明的IL-7融合蛋白质可以使用本领域已知的重组表达载体产生。术语“表达载体”指的是用来表达编码目的IL-7融合蛋白质的DNA的可复制的DNA构建体，其中所述的DNA构建体包括包含装配了(1)在基因表达中具有调控作用的遗传元件例如启动子、操纵子或增强子，与其有效连接的(2)转录成为mRNA并翻译成为蛋白质的编码目的IL-7融合蛋白质的DNA序列，以及(3)适当的转录和翻译起始和终止序列的转录单位。启动子和其它调控原件的选择通常根据目的宿主细胞而不同。
利用重组DNA技术将编码IL-7融合蛋白质的核酸转染入宿主细胞。在本发明上下文中，外源DNA包括编码本发明蛋白质的序列。适当的宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞或高等的真核细胞。在一实施方案中，宿主为原核生物。
重组的IL-7融合蛋白质可以在酵母宿主例如酵母属(Saccharomyces)例如酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达。也可以使用其它属的酵母例如毕赤酵母属(Pichia)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)。酵母载体一般包含来自酵母质粒的复制起点或自主复制序列(ARS)、启动子、编码IL-7融合蛋白质的DNA、聚腺苷酸化和转录终止的序列以及选择基因。酵母载体中适当的启动子序列包括金属硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-4-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡糖异构酶和葡萄糖激酶的启动子。
多种哺乳动物或昆虫细胞培养系统可以用来表达重组蛋白质。在昆虫细胞中产生蛋白质的杆状病毒系统为本领域所熟知。适当的哺乳动物宿主细胞系的实例包括NS/0细胞、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、HeLa和BHK细胞系。其它适当哺乳动物宿主细胞包括均源自猴肾的CV-1细胞(ATCCCCL70)和COS-7细胞。另一合适的猴肾细胞系CV-1/EBNA通过用编码Epstein-Barr病毒核抗原-1(EBNA-1)的基因和用包含CMV调控序列的载体转染CV-1细胞系衍生得到(McMahan等人，(1991)，EMBQ J..10：2821)。EBNA-1基因允许包含EBV复制起点的表达载体例如HAV-EO或pDC406进行附加型复制。
哺乳动物表达载体可以包含不转录的元件例如复制起点、与待表达的基因相连的适当启动子和增强子、以及其它5’或3’侧翼的非转录序列、以及5’或3’非翻译序列例如必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、以及转录终止序列。常用的启动子和增强子源自多瘤病毒、腺病毒-2、猿猴病毒40(SV40)和人类巨细胞病毒。可以用源自SV40病毒基因组的DNA序列例如SV40起点、早期和晚期启动子、增强子、剪接和聚腺苷酸化位点来提供表达异源DNA序列所需的其它遗传元件。
当期望IL-7融合蛋白质从宿主细胞中分泌时，表达载体可以包含编码信号或前导肽的DNA。在本发明中，可以使用IL-7天然的信号序列，或者备选地加入异源的信号序列例如来自白细胞介素-4的信号序列。
本发明也提供了制备本发明重组体蛋白质的方法，包括在促进表达的条件下培养用包含编码IL-7融合蛋白质的DNA序列的表达载体转染的宿主细胞。然后从培养基或细胞提取物中纯化目的蛋白质。例如，可以先用商品化的蛋白质浓缩滤器例如Amicon或Millipore Pellicon超滤设备浓缩将重组蛋白质分泌入培养基的表达系统的上清。在浓缩步骤之后，如本领域已知地将浓缩物应用于适当的纯化基质。
“分离”或“纯化”的IL-7融合蛋白质或其生物学活性部分基本没有来自细胞或组织来源的细胞物质或其它污染性蛋白质，其中IL-7融合蛋白质源自所述的细胞或组织来源，或者当化学合成时基本没有化学前体或其它化学试剂。术语“基本没有细胞物质”包括这样的IL-7融合蛋白质制品，其中蛋白质从其分离自或者重组产生自的细胞的细胞组分中分离。在一实施方案中，术语“基本没有细胞物质”包括具有低于大约30％(干重)的非IL-7融合蛋白质(在本文也称为“污染性蛋白质”)、低于大约20％的非IL-7融合蛋白质、低于大约10％的非IL-7融合蛋白质或者低于大约5％的非IL-7融合蛋白质的IL-7融合蛋白质制品。当从重组来源纯化IL-7融合蛋白质或其生物学活性部分时，在一实施方案中，其基本没有培养基，即培养基低于蛋白质制品体积的大约20％、低于大约10％或者低于大约5％。
术语“基本纯的Ig-IL-7融合蛋白质”或“基本纯的IL-7融合蛋白质”指的是其中包含IL-7的融合蛋白质至少占制品中的60％、70％、80％、90％、95％或99％的蛋白质。
使用IL-7蛋白质治疗的方法
本发明的IL-7蛋白质包括融合蛋白质在治疗免疫缺陷和在例如本质上免疫抑制的疾病或治疗后出现的加速免疫系统自然重建中有用。例如，IL-7蛋白质可以用来治疗病毒传染、免疫病、以及用来增强特定细胞类型的生长(包括增殖)。此外，IL-7蛋白质可以用在癌症例如膀胱癌、肺癌、脑癌、乳腺癌、皮肤癌和前列腺癌的治疗中。在一实例中，用如上所述的IL-7蛋白质治疗经历了一个或多个循环的化学疗法的患者来帮助他们补充免疫细胞是有效的。备选地，向HIV患者、老年人、接受植入物的患者或其它患有抑制了免疫系统功能的患者施用IL-7蛋白质也是有用的。
施用
本发明的IL-7和IL-7融合蛋白质都可以掺入适合施用的药物组合物。此类药物组合物一般包含IL-7或IL-7融合蛋白质和可药用载体。如本文所用，术语“可药用载体”旨在包括任何以及所有适合药物施用的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。对药学活性物质使用此类介质和试剂为本领域所熟知。
将本发明的药物组合物制剂成适合其预期的施用途径。施用途径的实例包括肠胃外的例如静脉内的、真皮内的、皮下的、经口的(例如吸入)、经皮的(局部的)、跨粘膜的和直肠的施用。用来进行肠胃外、真皮内或者皮下应用的溶液或悬浮液可以包括下列组分：无菌的稀释剂例如注射用水、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶剂；抗细菌剂如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲液例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及调节张力的试剂例如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱例如盐酸或氢氧化钠调节。肠胃外制剂可以包装在安瓿、用完即弃的注射器或用玻璃或塑料制备的多剂量小瓶中。
包含本发明的IL-7蛋白质的药物可以具有0.01-100％(w/w)的浓度，该量根据药物的剂型发生变化。
施用的剂量依赖于患者的体重、疾病的严重性以及医生的建议。然而，通常施用大约0.01至大约10mg/kg体重每天、在注射的情况下施用大约0.02至大约2mg/kg体重每天或者施用大约0.5mg/kg体重每天是适当的。剂量可以根据疾病的严重性和医生的建议而每天一次或每天几次地施用。
当本发明的组合物与一种或多种其它治疗剂例如同样已知为对补充血细胞有用的分子共同施用时，其是有用的。例如，分子可以是已知用来补充血红细胞的促红细胞生成素、用来补充嗜中性粒细胞的G-CSF或者用来补充粒细胞和巨噬细胞的GM-CSF。
本发明的方面进一步通过下列实施例阐明。
实施例
实施例1：通过计算机方法鉴定T-细胞表位
根据本发明，可采用将突变引入蛋白质的方法来修饰IL-7的表位从而调节它们与免疫系统的相互作用。这些方法与美国公开的专利申请号2003-0166877中公开的那些方法类似。根据本发明，可采用的本领域已知方法包括现有技术(WO 92/10755和WO 96/40792(Novo Nordisk、EP 0519596(Merck & Co.)、EP 0699 755(Centro de lmmunologia Moelcular)、WO98/52976和WO 98/59244(Biovation Ltd.)中描述的方法或相关方法。
然而，如果所述表位通过在此详细描述地并应用于IL-7的下列方法得以鉴定，那么可获得有利的突变蛋白质。有多种因素对决定蛋白质或多肽的总体结构起重要作用。首先是肽键，即将氨基酸连接在一起形成链的键，它是一种共价键。这种键是平面结构的，实质上是一种替换的酰胺。“酰胺”指含-CONH-基团的一组有机化合物中的任何一个化合物。
连接相邻氨基酸的Cα的平面肽键如下所示：
由于O＝C和C-N原子位于一个相对刚性的平面中，所以不会发生沿这些轴的自由旋转。因此，图中虚线所示的平面有时被称作“酰胺”平面或“肽平面”，肽主链中的氧(O)、碳(C)、氮(N)和氢(H)原子位于其中。Cα原子位于酰胺平面中相对的角上。由于肽或酰胺平面中的O＝C和C-N原子基本上不发生旋转，所以多肽链包含一系列连接Cα原子的平面肽键。
第二个对决定多肽或蛋白的整体结构或构象起重要作用的因素是每一酰胺平面绕共有Cα键的转角。此后术语″转角″和″扭转角″是等同的术语。假定O、C、N和H原子保留在酰胺平面中(这通常是一种正确的假设，尽管在一些构象中这些原子会轻微的偏移平面)，这些转角确定了N和R多肽主链构象，即相邻残基之间的结构。这两个转角称为φ和Ψ。因此，一套φi和Ψi角(其中，脚标i代表多肽链中的特定残基)有效地规定了多肽链的二级结构。在文献中定义了用于确定φ和Ψ角的惯例，即在给定的多肽中酰胺平面形成0度角的参考点，以及哪个角是φ角，哪个角是Ψ角的定义。参见Ramachandran等，Adv.Prot.Chem.23：283-437(1968)，285-94页，这些页中的内容在此引入作为参考。
本发明的方法可应用于任何蛋白，并部分基于下述发现，即人MHC II类分子结合沟的主要口袋1锚定位点对特定氨基酸侧链具有设计好的特异性。这一口袋的特异性由MHC II类分子β链第86位的氨基酸的身份来确定。这一位点位于口袋1的底部并决定可容纳于这一口袋中的氨基酸侧链的大小。Marshall，K.W.，J.Immunol.，152：4946-4956(1994)。如果这一残基是甘氨酸，则所有的疏水性脂肪族和芳香族氨基酸(疏水性脂肪族氨基酸是：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸，芳香族氨基酸是：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)均可容纳于所述的口袋中，优选芳香族侧链。如果这一口袋残基是缬氨酸，则该氨基酸的侧链伸到口袋中并限制了可容纳的肽侧链的大小，所以只有疏水性脂肪族侧链可容纳进去。因此在氨基酸残基序列中，无论哪里发现了带有疏水性脂肪族或芳香族侧链的氨基酸，即有存在MHC II类限制性T-细胞表位的可能性。但是，如果所述的侧链是疏水性脂肪族侧链，其与T-细胞表位相关的可能性约是芳香族侧链的两倍(假定1型口袋近似平均地分布于全球种群中)。
一个示例性的计算机方法描绘出IL-7肽区域包含T-细胞表位的可能性，该方法如下：(1)扫描预定长度肽片段的一级序列，并鉴定存在的所有疏水性脂肪族和芳香族侧链。(2)对疏水性脂肪族侧链赋予比芳香族侧链高的值；优选约两倍于赋予芳香族侧链的值，例如，给疏水性脂肪族侧链赋值为2，给芳香族侧链赋值为1。(3)将所述肽中的预定统一长度的每一重叠氨基酸残基片段(窗口)中确定存在的值总和起来，再将某一特定片段(窗口)的总值赋予该片段(窗口)中间位置的某个单个氨基酸残基，优选赋予大约处于抽样片段(窗口)中间点的氨基酸。将这一过程对每一抽样的重叠氨基酸残基片段(窗口)重复进行。因此，所述肽的每一氨基酸残基均被赋予了一个值，该值与T-细胞表位存在于此特定片段(窗口)中的可能性相关。(4)用按照上述步骤3中的描述计算、赋予的值对被评估的整个氨基酸残基序列的氨基酸坐标作图。(5)序列中具有预定值(例如该值为1)的所有部分均被认为可能包含T细胞表位，并且在需要时可进行修饰。
在这一特定方面本发明提供了通用的方法，由此可描述IL-7的T细胞表位。在这些区域中对所述的肽进行修饰有可能改变MHC II类的结合特性。
依照本发明的另一方面，可利用考虑了肽与MHC II等位基因模型之间的相互作用的更复杂计算方法来更精确地预测T-细胞表位。
根据这一方面，对肽中存在的T细胞表位的计算预测考虑到：基于所有已知MHC II类分子的结构构建至少42个MHC II类等位基因模型；使用这些模型计算鉴定T细胞表位的方法；对每一模型构建肽主链文库以允许在相关肽主链α碳(Cα)位置具有已知的变异性；在肽和MHC II类分子间相互作用关键的位置处，对与每一模型对接(dock)的每一主链，相对于20种氨基酸选项中每一种构建氨基酸侧链构象文库；以及将这些主链和侧链构象文库与评分函数结合用于选择与特定MHC II类分子对接的特定肽的最佳主链和侧链构象并得出该相互作用的结合分值。
MHC II类分子模型可从Brookhaven蛋白数据库(″PDB″)中的许多类似的结构出发通过同源建模推导得出。它们可通过使用引入了模拟退火算法的半自动同源建模软件(Modeller，Sali A.& Blundell TL.，1993.J.MolBiol 234：779-815)并结合用于能量最小化的CHARMm力场(购自Molecular Simulations Inc.，San Diego，Ca.)来制备。也可以应用其他的建模方法。
本发明的方法与下述的其他计算方法有着显著的不同，这些方法在于：利用从实验中得来的关于一小组MHC II类分子结合沟中每一位点的每一种氨基酸选项的结合数据文库(Marshall，K.W.等，Biomed.Pept.ProteinsNucleic Acids，1(3)：157-162)(1995)；或利用类似的实验结合数据以定义所述的沟中特定结合口袋类型的结合特性(同样利用相对小的MHC II类分子亚组)然后将这一口袋文库中的口袋类型进行‘混合和匹配’以人工构建更“实际的”MHC II类分子(Sturniolo T.等，Nat.Biotech，17(6)：555-561(1999)。这两种现有方法的主要缺陷在于实验的复杂性和需要合成大量的肽变体造成仅有少量的MHC II类分子可通过实验扫描。因此第一种已知的方法仅能预测少量的MHC II类分子。第二种已知的方法还假设在不同II类等位基因的背景下在一个分子中衬有类似氨基酸的口袋将具有相同的结合特性，故其另外的缺陷在于，仅仅可“实际地”地构建出那些包含口袋文库中所包含的口袋的MHC II类分子。利用本发明的建模方法可推导出任意数量和类型的MHC II类分子的结构，因此可特异性地选择等位基因以代表全球种群的特征。此外，扫描的MHC II类分子的数量可通过构建更多的模型而增加而无需通过复杂的实验获得额外的数据。
利用主链文库使得被扫描的各种肽在与特定的MHC II类分子结合时其Cα原子位置处可进行变化。这也与上述现有技术中的计算机方法不同，在那些方法中依赖于利用简化的肽主链来扫描结合在特定口袋中的氨基酸。这些简化的主链不可能代表在“真正的”肽中存在的主链构象，从而导致对肽结合的预测不准确。本发明的主链文库是通过叠加蛋白数据库中所有与MHC II类分子结合的肽的主链，并考虑到位于结合沟内的11个氨基酸的每个氨基酸的Cα原子之间的均方根(RMS)差而构建的。尽管该文库可来自少量合适的可获得的小鼠和人的结构(当前为13种)，但为了允许存在甚至更大变异的可能性，将每一C″-α位点的RMS数提高50％。然后确定每一氨基酸的平均Cα位置，围绕这一点划一个球，其半径等于在该位置的RMS差加50％。该球体代表所有可允许的Cα位置。
自具有最小RMS差的Cα(上述口袋1中氨基酸残基的Cα，等同于结合沟中11个残基的位置2)起运作，将所述的球三维网格化，网格内的每个顶点作为该氨基酸的Cα的可能位置。将后续的酰胺平面(相应于与后续氨基酸的肽键)移动到这些Cα的每一个上面，将φ和Ψ角以设定的间隔逐步地转动以便于安置后续的Cα。如果后续的Cα落入对这一Cα而言‘可被允许的位置球’中，则此二肽的方向即可被接受，如果其落入所述球之外则所得的二肽不能被接受。对每一后续Cα位置均重复这一过程，使肽从所述的口袋1Cα‘种子’开始生长，直到全部9个后续的Cα的位置均根据之前Cα的所有可能排列确定下来。然后对口袋1前的单个Cα重复上述步骤1次以上以构建定位于结合沟内的主链Cα位置文库。
生成的主链数目取决于几种因素：‘可被允许的位置球’的大小；对口袋1位点处′最初的球′网格化的细度；用于定位后续Cα的φ和Ψ角逐步旋转的细度。利用这一程序可以构建大的主链文库。主链文库越大越可能发现对MHC II类分子结合沟内的特定肽而言的最适主链。鉴于和结合结构域的氨基酸可能存在冲突，所以不是所有的主链均适合于与所有MHC II类分子模型‘对接’(docking)，故对每个等位基因建立亚文库以包含适合被该等位基因容纳的主链。利用所述的主链文库并结合MHC II类分子模型可以构建出由与每一容许主链对接的每一MHC II类分子结合沟的每一位点中的每一氨基酸的容许侧链构象所组成的详尽数据库。可以利用简单的立体重叠函数构建这一数据组，其中，主链与MHC II类分子对接，氨基酸侧链在所需位置被嫁接到主链上。将侧链上可旋转的键以设定的间隔逐步旋转，记录下依赖于该键的原子的最终定位。将所述原子与结合沟侧链原子间的相互作用记录下来，根据下述的标准确定是否接受这些位置：如此定位的所有原子的重叠总量不能超过预定值。因此，构象搜索的严谨度是在键的逐步旋转中所用的间隔及对总重叠的预定限度的函数。如果已知特定的口袋是刚性的，则后一值可较小，但若已知口袋侧链的位置相对灵活则严谨度可放松。这样便可以模拟结合沟口袋内灵活性的变化。针对与每一MHC II类分子对接后每一主链的所有位点上的所有氨基酸重复这种构象搜索以建立详尽的侧链构象数据库。
用适当的数学表达式评价MHC II类分子模型与肽配体构象的结合能量，所述的肽配体构象需通过扫描上述的主链/侧链构象大数据库根据经验获得。这样，通过对每一长度在9-20个氨基酸范围内变化(尽管对于每一次扫描长度是一定的)的可能肽进行下述计算，可以扫描蛋白以搜索潜在的T-细胞表位：选择MHC II类分子及适合于该分子的肽主链，将相应于所需肽序列的侧链移植到其上。对于氨基酸的每一容许构象(由上述数据库获得)，收集与主链上特定位点的特定侧链相关的原子身份和原子间距数据。沿主链对每一侧链重复此过程，利用评分函数推导肽得分。保留该主链的最佳得分，对所选模型的每一容许主链重复该过程。比较所有容许主链的得分，最高的得分被认为是该MHC II类模型中所需肽的得分。对每一模型用从扫描的蛋白得到的所有可能肽重复上述过程，列出肽相对于模型的得分。
在本发明中，用于结合亲和力计算的每种配体都是选自上述肽或蛋白的氨基酸片段。因此所述配体为来自已知序列的肽、多肽或蛋白的长度为约9到20个氨基酸的选定氨基酸链。此后术语“氨基酸”和“残基”视为等同的术语。将移植到选自上述主链文库的主链上的待检测肽中的连续氨基酸形式的配体，通过肽主链上C″-α原子坐标定位到来自MHC II类分子模型库的MHC II类分子的结合裂缝中，并从容许构象的数据库中选择每一侧链的容许构象。相关的原子身份和原子间距也可以从这一数据库获得并用于计算肽结合分数。将对MHC II类结合口袋具有高亲和力的配体作为侯选者标记出来用于定点诱变。在标记的配体中(也由此在目的蛋白中)进行氨基酸替代，然后用评分函数重新测定以确定使结合亲和力降低到预定的阈值以下的变化。这些变化即可引入到目的蛋白中以去除T-细胞表位。
肽配体与MHC II类分子结合沟的结合涉及非共价键相互作用，其包括但不限于：氢键、静电相互作用、疏水(亲脂)相互作用和范德华相互作用。它们被包括在下面将详细描述的肽评分函数中。应当理解，氢键是非共价键，其可在极性或带电的基团之间形成，由被两个其他原子共享的氢原子构成。氢供体中的氢带正电荷，而氢受体带有部分负电荷。为肽/蛋白相互作用的目的，氢键供体可以是连接氢的氮，或连接在氧或氮上的氢。氢键受体原子可以是没有连接氢的氧、没有连接氢并具有一或两个连接的氮或仅有一个连接的硫。某些原子，如连接了氢的氧或亚胺氮(如C＝NH)，既可以是氢受体也可以是氢供体。氢键的能量在3-7Kcal/mol，大大强于范德化键，但弱于共价键。氢键具有高度的方向性，且当供体原子、氢原子和受体原子共线时最强。静电键是在带有相反电荷的离子对间形成的，根据库仑定律这种相互作用的强度与原子间距离的平方成反比。离子对间的最佳距离是约2.8。在肽/蛋白相互作用中，可在Arg、组氨酸或Lys和Asp或Glu之间形成静电键。该键的强度依赖于电离基团的pKa和介质的介电常数，尽管其与氢键的强度类似。
亲脂相互作用是蛋白和肽配体之间发生的有利疏水-疏水相互作用。这种相互作用通常出现在埋于结合沟口袋中的肽的疏水性氨基酸侧链间，以使它们不暴露在溶剂中。将疏水残基暴露于溶剂中是非常不利的，因为周围的溶剂分子将被迫在彼此间形成氢键而形成笼状结构。所致的熵值降低是非常不利的。亲脂性原子可以是既非极性又不是氢受体的硫和非极性的碳原子。
范德华键是相距3-4的原子间的非特异性的力。它比氢键和静电键弱、特异性低。原子周围的电荷分布随时间变化，并且在任何瞬间电荷分布均是不对称的。这种瞬间的电荷不对称性诱导临近原子中的类似不对称性。在范德华接触距离中所导致的原子之间的吸引力达到最大，而在约1到2处迅速消失。相反，当原子间隔的距离小于此接触距离时，由于原子外部的电子云重叠使不断增强的斥力成为主导。尽管与静电和氢键相比较，此吸引力相对较弱(约0.6Kcal/mol)，但所述斥力对于决定肽配体是否能与蛋白成功结合可能非常重要。
在一个实施方案中，利用Bhm评分函数(SCORE1方法)评估结合常数(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8(3)：243-256(1994)，该文献在此全文引入作为参考)。在另一个实施方案中，用评分函数(SCORE2方法)评估结合亲和力作为配体含有T-细胞表位的指示物(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，12(4)：309-323(1998)，该文献在此全文引入作为参考)。但是上述文献中描述的Bhm评分函数是用于评估下述情况中配体对蛋白的结合亲和力的，即已知所述的配体可成功地与所述蛋白结合，且蛋白/配体复合物的结构已解析，这一结构已列于蛋白数据库(″PDB″)中。因此，利用已知的阳性结合数据对评分函数作了发展。为了区分阳性和阴性的结合体，需向方程中加入排斥项。此外，可通过以成对的方式计算亲脂相互作用，而非利用上述Bhm函数中基于面积的能量项来进行更理想的结合能量评估。因此，在一个优选实施方案中，用经修饰的Bhm评分函数评估结合能。在经修饰的Bhm评分函数中，在评估蛋白和配体之间的结合能(ΔGbind)时考虑了下述参数：由于配体的平移和转动熵的整体损失造成的结合能减低(ΔG0)；理想氢键的贡献(ΔGhb)，其中至少一个配对物是中性的；无扰离子相互作用的贡献(ΔGionic)；亲脂配体原子和亲脂受体原子之间的亲脂相互作用(ΔGlipo)；由于配体中内在自由度的冻结，即绕每一C-C键的旋转自由度降低而造成的结合能损失(ΔGrot)；蛋白和配体之间相互作用的能量(Evdw)。考虑到这些项给出等式1：
(ΔGbind)＝(ΔG0)+(ΔGhb×Nhb)+(ΔGionic×Nionic)+(ΔGlipo×Nlipo)+(ΔGrot+Nrot)+(EvdW)
其中N是对于特定项符合的相互作用的数目，在一个实施方案中，ΔG0、ΔGhb、ΔGionic、ΔGlipo和ΔGrot是常数，其值分别为：5.4、-4.7、-4.7、-0.17和1.4。
Nhb项依照等式2计算：
Nhb＝∑h-bondf(ΔR，Δα)×f(Nneighb)×Fpcs
f(ΔR，Δα)是罚分函数，其解决氢键自理想情况的大偏离，其依照等式3计算：
f(ΔR，Δ-α)＝f1(ΔR)×f2(Δα)
其中：
如果ΔR＜＝TOL      则f1(ΔR)＝1，或者
如果ΔR＜＝0.4+TOL  则f1(ΔR)＝1-(ΔR-TOL)/0.4，或者
如果ΔR＞0.4+TOL    则f1(ΔR)＝0
并且：
如果Δα＜30°      则f2(Δα)＝1，或者
如果Δα＜＝80°    则f2(Δα)＝1-(Δα-30)/50，或者
如果Δα＞80°      则f2(Δα)＝0
TOL是氢键键长中所能允许的偏差＝0.25
ΔR是H-O/N氢键键长与理想值＝1.9的偏差
Δα是氢键键角∠N/O-H..O/N与180°理想值的偏差
f(Nneighb)区分蛋白表面的凹凸部分，并因此赋予口袋中的极性相互作用比蛋白表面的极性相互作用更高的权重。这一函数根据下述等式4计算：
f(Nneighb)＝(Nneighb/Nneighb，0)α，其中α＝0.5
Nneighb为蛋白中与任意给定蛋白原子之间的距离小于5的非氢原子的数量。
Nneighb，0是常数＝25
fpcs是考虑到每氢键的极性接触表面面积的函数，由此可以区分强和弱的氢键，其值由下述的标准确定：
当Apolar/NHB＜102时    fpcs＝β或
当Apolar/NHB＞102时    fpcs＝1
Apolar是极性蛋白-配体接触面的大小
NHB是氢键的数目
β是常数＝1.2
由于假定了相同的几何相关性，在实施经修饰的Bhm评分函数时，离子相互作用的贡献ΔGionic用与上述有关氢键的类似方式计算。
Nlipo项按下述的等式5计算：
Nlipo＝∑ILf(rIL)
根据下述标准，对于所有亲脂配体原子I和所有亲脂蛋白原子L，计算f(rIL)：
当rIL＜＝R1时      f(rIL)＝1
当R2＜rIL＞R1时    f(rIL)＝(rIL-R1)/(R2-R1)
当rIL＞＝R2时      f(rIL)＝0
其中：R1＝rI vdw+rL vdw+0.5
R2＝R1+3.0
rI vdw是原子I的范德华半径
rL vdw是原子L的范德华半径
Nrot项是氨基酸侧链中可旋转的键的数目，其被视为无环的sp3-sp3及sp3-sp2键的数目。末端-CH3或-NH3的旋转未考虑进去。
最终，项Evdw依照如下等式6计算：
Evdw＝ε1ε2((r1 vdw+r2 vdw)12/r12-(r1 vdw+r2 vdw)6/r6)，
其中：ε1和ε2是取决于原子身份的常数
r1 vdw+r2 vdw是范德华原子半径
r是原子对间的距离。
关于式6，在一个实施方案中，ε1和ε2常数被赋予如下原子值，分别为：C：0.245，N：0.283，O：0.316，S：0.316(即分别对于碳、氮、氧和硫原子)。对于式5和6，给予范德华半径如下原子值，分别为C：1.85，N：1.75，O：1.60，S：2.00。
应当理解上述等式中所有预定的值和给定的常数都是在现有的对蛋白配体相互作用的理解局限内具体相对于此处所用的计算类型确定的。
如上所述，所述的评分函数应用于由上述侧链构象、原子身份和原子间距数据库中提取的数据。为本说明书的目的，该数据库中包含的MHC II类分子数是42个模型加上4个已解析的结构。从上述描述中可清楚地了解到，本发明的计算构建方法的模块性质意味着，可简单地添加新的模型，并利用肽主链文库和侧链构象搜索功能进行扫描以创建其它的可通过上述的肽评分函数处理的数据集。这使得被扫描的MHC II类分子库可以很容易地增加，或者如果可以获得相关数据，则可以替换结构和相关数据以创建现有等位基因的更精确的模型。
本发明的预测方法可以相对于包含大量已通过实验确定了其对不同MHC II类分子的亲和力的肽的数据集进行校准。将计算值与实验数据相比较，可确定一截断值，已知该值之上所有经实验确定的T-细胞表位都得以正确的预测。
应当理解，尽管上述评分函数与现有的一些复杂方法相比相对简单，但计算进行得非常迅速。还应当理解的是，其目的并不在于计算出对接到所选择的MHC II类蛋白结合沟内的每种肽的真正结合能本身。根本的目的在于获得相对的结合能数据以助于根据所选蛋白的一级结构(即氨基酸序列)预测T-细胞表位的定位。相对高的结合能或结合能高于选定的阈值意味着在配体中存在T-细胞表位。然后可以将所述配体进行至少一轮氨基酸替代，并再次计算结合能。由于计算可迅速进行，对肽序列的这些操作可在现有成本划算的计算机硬件上于程序用户界面中互动进行。由此不需要对计算机硬件进行大量投资。
本领域的技术人员应当了解，也可使用其他软件达到相同的目的。特别是可以使用能将配体对接入蛋白结合位点的更复杂的软件，并与能量最小化相结合。对接软件的例子包括：DOCK(Kuntz等，J.Mol.Biol.，161：269-288(1982))，LUDI(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8：623-632(1994))和FLEXX(Rarey M.等，ISMB，3：300-308(1995))。分子建模和操作软件的例子包括：AMBER(Tripos)和CHARMm(MolecularSimulations Inc.)。使用这些计算方法将严重限制本发明方法的信息吞吐量，这是由于进行必要的计算所需的处理时间导致的。但是可行的方式为，将这些方法作为‘二级筛选’以获得关于通过本发明的方法发现为‘阳性结合体’的肽的更精确的肽结合能计算值。用于复杂的分子机械或分子动力学计算的处理时间的限制性是由进行所述计算的软件设计和目前计算机硬件技术的限制共同确定的。可以预期在将来，随着编写更高效的代码和计算机处理器速度的不断提高，在更易控制的时间框架内进行上述计算是可行的。有关用于大分子的能量函数的其他信息和有关在折叠蛋白结构内发生的多种相互作用的考虑可参考下述文献：Brooks，B.R.，等.，J.Comput.Chem.，4：187-217(1983)，有关蛋白-配体一般相互作用的信息参见：Dauber-Osguthorpe等，Proteins 4(1)：31-47(1988)，这些文献均全文引入作为参考。其他有用的背景资料也可参见Fasman，G.D.编，Prediction ofProtein Structure and the Principles of Protein Conformation，PlenumPress，New York，ISBN：0-306 4313-9。
实施例2：通过未分级的PBMC培养物在体外分析IL-7衍生肽是潜在的CD4+T辅助细胞表位
基于在硅片上的(in silico)预测，IL-7蛋白质N-连接的糖基化位点周围的序列是免疫原性的，分析成熟的人IL-7蛋白质中包含这些区域的肽例如跨Leu63至Ser71(LRQFLKMNS SEQ ID NO：4)或Ile88至Val96(ILLNCTGQV SEQ ID NO：7)的肽的免疫原性，其中所述免疫原性通过它们在体外诱导T细胞增殖的能力来检测。大体上，将从人血液中分离的PBMC与各重叠的15-mer肽孵育，并通过掺入3H-胸苷检测增殖反应。原则上，如果PBMC混合物中的T-细胞识别自体APC(抗原呈递细胞)上单独的肽-MHC复合体，那么只有它们增殖，因此增殖是肽免疫原性的指征。
例如，合成(Pepscan Systems，Netherlands)以三个氨基酸错开并且横跨例如人IL-7中的Met54至Leu60区域的15-mer肽，在DMSO(SigmaChemical，St.Louis，MO，U.S.A.)中重悬，并以5μM溶于0.5％DMSO的终浓度在培养基中使用。
通过Ficoll-Hypaque梯度离心从健康供体的外周血分离PBMC，并在液氮中冻存。此外，在用QiaAmp组织试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)分离的DNA上用SSP PCR分型试剂盒(Bio-Synthesis，Lewisville，TX)对每个PBMC样品进行了HLA分型。
在一般的增殖测试中，每个重叠的15-mer肽在相同六份源自40个首次用于实验的供体的PBMC培养物中进行测试。简要地，将2×105个PBMC在使用前快速解冻，与5μM的每种肽混合，并在37℃、5％CO2中孵育7天。作为阳性对照，将样品与破伤风毒素衍生肽MQYIKANSKFIGI(SEQID NO：15)孵育，而阴性对照样品与0.5％的DMSO孵育。在孵育的最后12小时期间，将培养物用[甲基-3H]胸苷(0.5μCi/孔)(NEN Life ScienceProducts，Boston，MA)进行脉冲，在过滤垫(filter mats)上收集培养物，并用Wallac微量培养板β顶层平板闪烁计数器(Perkin Elmer，Boston，MA)将胸苷掺入量测定为每分钟的计数(CPM)。每一肽的刺激指数通过用给定肽的CPM值除以源自阴性对照的CPM值来计算。
发现阳性对照肽的刺激指数显著高于1(阴性对照的刺激指数)。而且包含核心序列LRQFLKMNS(SEQ ID NO：4)、FLKMNSTGD(SEQ IDNO：5)或LKMNSTGDF(SEQ ID NO：6)的肽例如肽ARKLRQFLKMNSTGD(SEQ ID NO：10)、LRQFLKMNSTGDFDL(SEQID NO：11)、或FLKMNSTGDFDLHLL(SEQ ID NO：12)在刺激指数上有增加。因此，肽序列例如LRQFLKMNS(SEQ ID NO：4)或LKMNSTGDF(SEQ ID NO：6)确实代表潜在的T-细胞表位。
对一系列包含由核心肽ILLNCTGQV(SEQ ID NO：7)和LLNCTGQVK(SEQ ID NO：8)定义的区域的15-mer肽进行同样的分析，发现这些肽序列也代表潜在的T-细胞表位。
实施例3：在体外使用分化的人树突细胞(DC)绘制CD4+T辅助细胞表位
成熟的树突细胞(DC)是有效的抗原递呈细胞(APC)，其有效地将抗原肽或整个蛋白质呈递至T-细胞。用分离的在体外用抗原肽脉冲的DC来诱导初级T-细胞反应，其中所述的初级T-细胞反应可以在体外增殖测试中检测。分化的DC可以通过例如下列方法产生：首先，通过让PBMC粘附在塑料组织培养瓶或用磁标记的抗体(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)纯化CD14+PBMC来产生人单核细胞。然后将纯化的单核细胞(0.5-1.5×106个细胞/毫升)在含有1000U/ml GM-CSF(Endogen；Woburn，MA)和500U/ml IL-4(Endogen；Woburn，MA)的AIM V培养基(GIBCO BRL，GrandIsland，NY，U.S.A.)中培养3天。随后，用5微克/毫升的试验肽或对照肽脉冲这些未成熟的DC，并进一步与1000U/ml TNF-α(Endogen；Woburn，MA)、1000U/ml GM-CSF和500U/ml IL-4的组合孵育48小时。成熟的DC通过高表面表达水平的CD80+、CD86+和HLA-DR来监测。
将这些抗原-脉冲的成熟的DC用4200Rad照射，并与纯化的自体CD4+T细胞用于增殖测试中。(CD4+T细胞使用来自提供单核细胞进行体外DC分化的相同供体的冻存PBMC等份用磁标记的抗体(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)纯化)。在一般测试中，将抗原脉冲的DC(2×105个/毫升)与自体CD4+T细胞(2×106个细胞/毫升)一起在圆底96孔板中在37℃、5％CO2中孵育7天，在孵育的最后12小时期间以0.5μCi/孔加入[甲基-3H]胸苷(NEN Life Science Products，Boston，MA)，收集样品，在玻璃滤纸上裂解，并在闪烁计数器中检测3H-胸苷的掺入。
将如实施例1中所述的15-mer肽在该测试中检测并与参考肽和其他对照比较。发现这个测试比实施例1中所述的测试更加灵敏，使得更好地区分单独的肽诱发T-细胞增殖的能力的差异。发现包含核心序列LRQFLKMNS(SEQ ID NO：4)、FLKMNSTGD(SEQ ID NO：5)、LKMNSTGDF(SEQ ID NO：6)、ILLNCTGQV(SEQ ID NO：7)或LLNCTGQVK(SEQ ID NO：8)的IL-7肽确实诱导显著的T-细胞增殖，因此这些序列确实代表潜在的T-细胞表位。
实施例4：体外分析IL-7中去免疫的氨基酸替换
将在上文所述的肽区域中认为赋予IL-7蛋白质更低免疫原性的氨基酸替换如实施例1和实施例2所述地在体外测试中进行了检测。例如，预计包含序列LRQFLDDNS(SEQ ID NO：13)的变体IL-7肽产生比包含序列LRQFLKMNS(SEQ ID NO：4)的野生型亲本肽显著降低的T-细胞增殖反应。同样地，预计包含序列TLLNCTGQG(SEQ ID NO：14)的变体IL-7肽产生比包含序列ILLNCTGQV(SEQ ID NO：7)的野生型亲本肽显著降低的T-细胞增殖反应。
如实施例1中所述，合成一系列包含变体IL-7序列LRQFLDDNS(SEQ ID NO：13)或TLLNCTGQG(SEQ ID NO：14)的IL-7衍生的15-mer肽。此外，在原核或真核的表达系统(Del-IL-7′s)中产生包含本发明替换的变体IL-7蛋白质或包含变体IL-7的融合蛋白质。例如，产生包含氨基酸替换K68D、M69D、I88T和V94G的变体IL-7。(此外，原核产生的IL-7蛋白质包括起始的甲硫氨酸。)如实施例1中所述地在用全PBMC培养物的测试中或者如实施例2所述地通过脉冲人DC检测这些肽和纯化的蛋白质以及它们的亲本对应物诱导T-细胞增殖的能力。用25微克/毫升的蛋白质刺激PBMC或脉冲DC。
发现源自变体IL-7序列的肽通常在诱导T-细胞增殖上具有比相应的源自野生型人IL-7蛋白质的肽显著降低的能力。因此，这些变体肽序列是更弱的潜在T-细胞表位。同样地，细菌产生的变体IL-7蛋白质在诱导T-细胞增殖上也具有比野生型IL-7降低的能力，表明这些突变的区域可能对原核产生的IL-7的免疫原性有显著作用。
实施例5：IL-7衍生肽作为潜在的B-细胞表位的分析
对于细菌产生的非糖基化的人IL-7蛋白，人的免疫系统可能将IL-7N连接的糖基化位点周围的序列识别为“非自身的”，并引发抗体反应。基本上，为了评估这些序列是否代表线性的B细胞表位，用跨越这些序列的肽免疫兔子，并检测所得抗体对细菌产生的天然的人IL-7和变性的人IL-7的反应性。作为进一步的对照，使用真核生物天然产生的糖基化huFc-IL-7融合蛋白质。
一般地，本领域技术人员熟知在例如兔子中产生针对特定肽抗原的多克隆抗体的方法和材料，而且例如在Antibodies：A Laboratory Manual，E.Harlow和D.Lane，Cold Spring Harbor Press中可以找到相关参考。
简要地，在一实例中，使用偶联剂例如SMCC(Pierce，Rockford，IL)将含有核心序列FLKMNSTGD(SEQ ID NO：5)的肽例如LRQFLKMNSTGDFDL[C](SEQ ID NO：18)或[C]LRQFLKMNSTGDFDL(SEQ ID NO：19)经由添加的末端半胱氨酸偶联至三种不同的载体蛋白：匙孔血蓝蛋白(KLH，EMD Biosciences，SanDiego，CA)、BSA(EMD Biosciences，San Diego，CA)和卵清蛋白(Pierce，Rockford，IL)，并通过连续注射存在佐剂的每种肽偶联物免疫多只兔子。进一步地每月间隔地注射一种肽-载体偶联物来加强免疫反应，并过偶联了肽的Sulfo-Link柱(Pierce，Rockford，IL)来亲和纯化自每只兔子所得的抗血清，抗体过羟磷灰石柱进行进一步浓缩(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)。
在ELISA测试中遵循标准方法检测纯化的抗体对细菌产生的天然人IL-7、变性的人IL-7和真核生物产生的糖基化的huFc-IL-7融合蛋白的反应性。简要地，将包被了纯化的蛋白质制品的ELISA平板与测试的抗体样品孵育，洗涤平板，与二抗例如辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG孵育，再次洗涤，并与显色性底物溶液孵育来显示所结合的抗体的浓度。
同样地，产生人IL-7中包含...MNSTG...(SEQ ID NO：20)糖基化位点(Asn70)的其它肽、或者包含...LNCTG...(SEQ ID NO：21)糖基化位点(Asn91)的肽的抗体。使用这个方法，发现抗体通常很好地识别变性的细菌产生的人IL-7，而不识别糖基化的huFc-IL-7融合蛋白。产生与细菌产生的天然人IL-7蛋白反应的抗体的肽表明识别了糖基化位点处的线性B细胞表位。进一步发现，在如实施例9中所述的基于细胞的增殖测试中，产生的针对这个实施例的肽的抗体具有抑制IL-7刺激的细胞增殖的作用。这个结果表明这些抗体具有中和活性。
实施例6：构建缺乏潜在T-细胞表位的人IL-7变体
构建编码适合细菌表达或真核生物表达的人IL-7变体形式例如融合蛋白质的核酸。例如，使用本领域技术人员熟悉的标准方法构建编码包含替代K68D、M69D、I88T、和V96G(Del-IL-7 SEQ ID NO：16)的成熟人IL-7变体的核酸。图11显示了该DNA序列的实例，其中所述的DNA序列编码具有氨基酸残基K68D、M69D、188T、和V96G的密码子替换的成熟人IL-7变体Del-IL-7(SEQ ID NO：24)。
对于细菌表达，包括起始甲硫氨酸的Del-IL-7的蛋白质序列(bDel-IL-7 SEQ ID NO：17)是使用适合最佳大肠杆菌表达的密码子偏好反向翻译的。进一步调整所得的核酸序列来包括期望的(或者排除不希望的)特征，例如终止密码子或限制性位点，并加入利于克隆入细菌表达载体例如pET系列的适当载体(EMD生物科学，San Diego，CA)的序列。核酸序列通过全基因合成(Blue Heron Biotechnology，Bothell，WA)来合成，并插入表达载体。图10显示了编码bDel-IL-7的对于大肠杆菌优化了密码子的具氨基酸残基K68D、M69D、I88T、V96G的密码子替换的DNA序列(SEQ ID NO：23)。
对于真核表达huFc-Del-IL-7融合蛋白，如上所述地将成熟的人IL-7核酸序列修饰为引入了本发明的目的氨基酸突变的密码子。(见例SEQ IDNO：24)。进一步调整序列来引入具唯一限制性位点的侧翼序列，用来将Xma I/Xho I片段框内插入编码IgG1的铰合部、CH2和CH3区域的pdCs-huFc表达载体(见Lo等人，(1998)，Protein Engineering 11：495)，并通过全基因合成(Blue Heron Biotechnology，Bothell，WA)合成序列。然后将合成的Xma I/Xho I Del-IL-7片段克隆入pdCs-huFc载体，得到编码huFc-Del-IL-7的表达质粒。本发明的其它IL-7和Fc-IL-7变体可以通过类似方法产生。
具体地，如下产生编码人去免疫的Fc-IL-7融合蛋白huFcγ2(h)(FN＞AQ)-(接头2)-IL-7(PNS)和huFcγ2(h)(FN＞AQ)-(接头2)-IL-7(PNDS)的核酸。huFcγ2(h)(FN＞AQ)-(接头2)-IL-7(PNS)是这样的人Fc-IL-7融合蛋白质，其包含通过连接序列GGGGSGGGG连接的N端人IL-7和遗传融合的C端具IgG1绞合部的人IgG2Fc结构域。Fc部分包含突变Phe296Ala和Asn297Gln。IL-7部分包含突变F39P、F57N和L128S。huFcγ2(h)(FN＞AQ)-(接头2)-IL-7(PNDS)与huFcγ2(h)(FN＞AQ)-(接头2)-IL-7(PNS)相同，但在IL-7部分包含额外的突变L77D。序列也包含将Fc部分C端附近的LSLS序列替换为ATAT的突变的密码子。
从头合成图27中给出的核酸序列(Blue Heron Biotechnology，Bothell，WA)，其中所述的核酸编码接头序列GGGGSGGGG、紧接着包含氨基酸替换F39P、F57N、和L128S(IL-7(PNS))的成熟的人IL-7，并且分别在5′和3′末端包含侧翼的限制性位点Xma I和Xho I。将这个纯化的XmaI/Xho I片段连接至同样消化并纯化的pdCs-huFc系列pdC10-huFcγ2(h)(FN＞AQ)的载体片段，产生编码huFcγ2(h)(FN＞AQ)-(接头2)-IL-7(PNS)的质粒。Lo等人，(1998)，Protein Engineering 11：495。编码序列通过测序确定。
通过标准的PCR诱变法，使用诱变引物M(s)(5’-TGACTTTGAT GACCACCTGTTAAAAGTTTC-3’(SEQ ID NO：50)(下划线为突变的密码子)和M(a)(5′-AACAGGTG GTCATCAAAGTCACCAGTGC-3’)(SEQ ID NO：51)进一步向IL-7(PNS)中引入替换L77D。简要地，分别在包含(接头2)-IL-7(PNS)的质粒模板上进行PCR反应，其中一个PCR反应用M(s)和下游引物5’-CTCGAGTCAGTGTTCTTTAGTGCCCATC-3’(SEQ IDNO：52)，另一个PCR反应用M(a)和上游引物5’-CCCGGGTGCTGGAGGTGGAGGATCAGGTG-3’(SEQ ID NO：53)，纯化PCR片段并合并作为第二轮PCR的模板，其中所述的第二轮PCR使用上游引物5’-CCCGGGTGCTGGAGGTGGAGGATCAGGTG-3’(SEQ ID NO：54) 和下游引物 5’-CTCGAGTCAGTGTTCTTTAGTGCCCATC-3’(SEQ ID NO：55)。将所得的纯化片段插入TA克隆载体pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，并确定其序列。将编码(接头2)-IL-7(PNDS)的Xma I/Xho I片段切下，并连接至同样消化并纯化的pdCs-huFc系列pdC10-huFcγ2(h)(FN＞AQ)的载体片段，产生编码huFcγ2(h)(FN＞AQ)-(接头2)-IL-7(PNDS)的质粒。
类似地，获得编码在Fc部分不同的这些融合蛋白质的变体的质粒；例如通过将编码(接头2)-IL-7(PNDS)的Xma I/Xho I片段连接至同样消化并纯化的pdCs-huFc系列pdC10-huFcγ2(h)的载体片段来获得编码huFcγ2(h)(接头2)-IL-7(PNDS)的质粒。
实施例7：表达和纯化IL-7变体
为了真核表达huFc-Del-IL-7融合蛋白质，使用电穿孔法将编码融合蛋白质的DNA导入小鼠骨髓瘤NS/O细胞系。为了进行电穿孔法，将NS/O细胞培养在添加了10％热灭活的胎牛血清、2mM谷氨酰胺和青霉素/链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基中。将大约5×106个细胞用PBS洗一次，并在0.5毫升PBS中重悬。然后将10微克线性化的huFc-Del-IL-7质粒DNA与细胞在Gene Pulser Cuvette(0.4cm电极距离，BioRad)中冰上孵育10分钟。电穿孔法用Gene Pulser(BioRad，Hercules，CA)进行，设置为0.25V和500μF。在冰上让细胞恢复10分钟，然后将它们重悬在生长培养基中，并置于两个96孔板上。
稳定转染的克隆通过将它们在存在100nM氨甲蝶呤(MTX)下的生长来选择，其中所述的氨甲蝶呤在转染后2天加到培养基中。细胞每3天传代，传代两次或多于三次，并且在2到3周后出现MTX抗性克隆。通过抗-Fc的ELISA检测克隆上清来鉴定产生大量IL-7融合蛋白质的克隆。将高产量的克隆分离并在含有100nM MTX的生长培养基中繁殖。一般地，使用无血清培养基例如H-SFM或CD培养基(Life Technologies)。
基于Fc蛋白质部分对蛋白A的亲和性，对包含Fc的融合蛋白质进行标准的纯化。简要地，在组织培养基中培养表达融合蛋白质例如huFc-Del-IL-7的NS/O细胞，并收集包含所表达蛋白的上清，并上样于预平衡的Fast Flow Protein A Sepharose柱。然后用大量缓冲液(例如中性pH的100mM磷酸钠、150mM NaCl)洗涤柱子。在与上文相同的缓冲液中以低pH(pH2.5-3)洗脱所结合的蛋白质，并立即中和级分。
对于细菌产生的IL-7，基本按Cosenza等人所述进行bDel-IL-7的细菌表达和纯化(见Cosenza等人，(1997)JBC，272：32995)。基本地，将bDel-IL-7从包含体中分离、变性并重折叠。简要地，将转化了编码例如bDel-IL-7的表达载体的细菌表达培养物生长至对数中期，并诱导重组蛋白质表达。诱导之后，收集细菌并通过超声处理裂解，并在缓冲液A(50mMTris HCI(7.5)、5mM EDTA、20％蔗糖)中分离包含体。大量洗涤之后，将包含体在胍变性缓冲液(50mM Tris-HCI(pH8.0)、5M盐酸胍、5mMEDTA)中重悬，简单地超声处理，并在6mM DTT中还原。然后通过变性大小排阻HPLC进一步纯化变性的bDel-IL-7蛋白质。然后将蛋白质在重折叠缓冲液(50mM甘氨酸、30mM NaOH、0.4ML-Arg、1mM DTT、pH10)中重折叠，透析入磷酸缓冲液，并进一步通过大小排阻HPLC纯化。
实施例8：IL-7变体的生化分析
引入的突变对于IL-7蛋白质完整性的影响通过常规的还原和非还原SDS-PAGE分析和大小排阻层析进行评估。
例如，将在NS/0细胞中表达的融合蛋白质huFc-Del-IL-7从它分泌入的组织培养基中捕获至蛋白A琼脂糖珠(Repligen、Needham、MA)上，并通过在含有或不含有还原剂例如β-巯基乙醇的蛋白质样品缓冲液中煮沸来洗脱。通过SDS-PAGE分离样品，并通过考马斯蓝染色来显现蛋白质条带。预计包含充分干扰正确折叠的IL-7突变的融合蛋白质更有可能通过SDS-PAGE显示降解产物。
也通过大小排阻层析(SEC)来对纯化的huFc-Del-IL-7进行分析以评估融合蛋白质聚集的程度。简要地，将细胞培养物上清上样于预平衡的Fast-Flow Protein A Sepharose柱上，在大量生理缓冲液(例如中性pH的100mM磷酸钠、150mM NaCl)中洗涤柱子，并在与上文相同的盐缓冲液中以大约2.5-3的pH洗脱结合的蛋白质。立即中和级分，合并峰级分，并将等份过分析性SEC柱进行分级分离。
实施例9：IL-7变体的体外活性
为了确定包含本发明突变的IL-7变体是否在体外保留它们的细胞因子活性，进行了细胞增殖生物测试。通过PHA-P激活人PBMC(外周血单核细胞)来产生应答IL-7的细胞。在标准的胸苷掺入测试中检测增殖。
例如，测定了huFc-Del-IL-7和bDel-IL-7的细胞因子活性。简要地，首先将PBMC与10微克/毫升的PHA-P孵育五天，洗涤细胞，然后在培养基中与制成稀释系列的huFc-Del-IL-7或bDel-IL-7孵育总计48小时。在最后的12小时期间，样品用0.3μCi的[甲基-3H]胸苷(Dupont-NEN-027)进行脉冲。然后对细胞进行充分洗涤，收集并在玻璃滤纸上裂解。用闪烁计数器测定掺入DNA的3H-胸苷。作为标准，检测了源自R&D系统(Minneapolis，MN)或者源自国家生物学标准和控制研究所(NIBSC)的野生型huIL-7蛋白质。
huFc-Del-IL-7或bDel-IL-7的细胞增殖ED50值通过根据标准技术绘制剂量反应曲线并测定导致最大反应一半的蛋白质浓度获得。
实施例10：通过野生型IL-7和IL-7变体在猴体内诱导抗人IL-7抗体
已知将来自细菌的野生型人IL-7施用至猴通常导致中和抗人IL-7抗体效价(Storek等人，(2003)，Blood，101：4209；Fry等人.，(2003)，Blood，101：2294)。因此，对原核生物产生的变体IL-7和野生型IL-7蛋白质以及真核产生的包含野生型或变体IL-7多肽的融合蛋白质在非人灵长类中诱导中和抗体的倾向进行评估。在一般实验中，每天一次向猕猴皮下注射40微克/千克的蛋白质样品，持续4周。例如，蛋白质样品为商品化的原核产生的IL-7(PeproTech，Rocky Hill，NJ)、原核产生的变体IL-7(K68D，M69D，I88T，V94G)以及在哺乳动物表达系统中产生的等效的Fc-IL-7融合蛋白质。以有规律的间隔，从动物获得血清，并通过ELISA用人IL-7包被的96孔板(Nunc，Naperville，IL)测定抗人IL-7的抗体的血清浓度。一般地，将每个血清样品的系列稀释物一式三份地加至每个孔中，并维持2小时，用在PBS中的0.05％吐温(吐温20)洗涤，并用在PBS中的1％BSA/1％山羊血清封闭。向每个样品中加入偶联有辣根过氧化物酶的抗猕猴IgG(在样品缓冲液中1∶60,000)，在37℃孵育2小时，并用在PBS中的0.05％吐温洗涤8次。然后用比色底物溶液OPD(邻苯二胺二盐酸盐)通过测定490nm处的OD、减去650nm处读取的背景OD来测定样品。
发现原核产生的野生型IL-7蛋白质确实引起高的抗IL-7抗体效价。相反，原核产生的变体IL-7的抗体效价引起显著更低的抗IL-7抗体的效价。也发现由施与了哺乳动物产生的野生型和变体Fc-IL-7融合蛋白质(在N-连接的糖基化位点周围具有突变)的动物产生的抗IL-7抗体效价的水平差异不显著。这个结果表明，在原核产生的蛋白质中这些位点处的糖基化缺乏在这些蛋白质的免疫原性中发挥作用。
实施例11：在免疫活性的小鼠中Fc-IL-7的急性耐受
根据实施例6所述的方法制备Fc-IL-7融合蛋白质huFcγ2(h)(N＞Q)(接头2)-hulL-7，纯化，然后在50mM磷酸盐、150mM氯化钠、pH7.00、0.05％(v/v)的吐温80中制剂。基于已知的蛋白质序列，用在280nm的吸光度和0.98mg/OD280的理论消光系数确定稀释溶液的蛋白质浓度。对于施用于小鼠，将等份的每个样品从储存瓶中移出，并在施用的1小时内用0.9％的盐水进行稀释。
将17周龄的C57B1/6小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)分成每组2只小鼠的组别，并连续皮下施用Fc-IL-7融合蛋白质5天。每天各组接受0.5、5.0、25mg/kg的剂量或者载体对照。在处理7天时处死所有存活的小鼠。
通过在施用的第0、2、4天和第7天从眼球后静脉获得血样来测定Fc-IL-7的血浆水平。将血样收集在含有肝素的试管中以避免凝固。通过离心去除细胞，并用标准的ELISA方法测定血浆中完整的Fc-IL-7融合蛋白质的浓度。图36中显示了试验小鼠Fc-IL-7的血浆水平(微克/微升)。在所有测定的时间点，小鼠的血浆对Fc-IL-7浓度都显示出剂量依赖性的增加以及每个剂量之后进一步增加。然而，如图37所示，在每次施用后，增加的幅度减少。
Fc-IL-7的功能活性在起始施用后的第7天通过测定B细胞和T细胞的增加来确定。由于IL-7促进产生免疫效应细胞例如B细胞和T细胞，所以预计脾的细胞和重量会增加。在第7天处死小鼠，并将器官移出和称重。图38显示第7天的平均器官重量。如预计的那样，在起始剂量1周后脾的重量增加3-5倍。由于淋巴细胞浸润，在2个较高剂量的Fc-IL-7后，肺重量增加2倍。在肾脏或肝脏中未观察到重量变化。
所有组别在第7天都观察到B细胞(CD19+、CD4+、CD8+和粒细胞(Gr-1+))反应。图39显示在每组两只小鼠的外周血中Gr-1+细胞的频率。如数据所示，粒细胞一般不应答Fc-IL-7。图40显示在每组两只小鼠的外周血中CD19+细胞的频率。图41显示在每组两只小鼠的外周血中CD4+细胞的频率，而图42显示在每组两只小鼠的外周血中CD8+细胞的频率。在B细胞(图40)和T细胞(图41和42)的数量增加中5mg/kg剂量组是最大的，在其中所述的5mg/kg剂量组中每只测试的小鼠都显示出比对照组和0.5mg/kg剂量组显著增加的T细胞和B细胞数量。然而，在25mg/kg剂量组中小鼠的T细胞数量减少或增加。细胞的所有度量以细胞每微升血液显示。
实施例12：评估人Fc-IL-7的活性
根据Yokota等人，(1986)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：5894和Stern等人，(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6808-6812中所述的方法用人IL-7作为标准，通过在用外周血单核细胞(PBMC)PHA blasts的标准细胞增殖测试中氚标记的胸苷的摄入来测定实施例11中检测的Fc-IL-7融合蛋白质的生物学活性。如图43所示，对于Fc-IL-7分子，通过氚标记的胸苷摄取测定的细胞增殖与标准的NIBSC人IL-7(世界健康组织)相似，表明Fc-IL-7分子的活性与野生型的人IL-7相似。
等价物
本发明可以以其它特定形式实现而不脱离其本质或基本特征。因此认为上述的实施方案均为示例性方面，而不限制本文描述的发明。因此本发明的范围通过附加的权利要求书给出，而不是通过上述描述，并且旨在将所有在权利要求的意义和等价物范围之内的变化都包含其中。
序列表
<110>默克专利有限公司
<120>具有降低的免疫原性的IL-7变体
<130>LEX-035
<150>US 60/634,470
<151>2004-12-09
<160>72
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>177
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile
1               5                   10                  15
Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys
            20                  25                  30
Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu
        35                  40                  45
Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe
    50                  55                  60
Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe
65                  70                  75                  80
Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser
                85                  90                  95
Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr
            100                 105                 110
Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala
        115                 120                 125
Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys  Ser Leu
    130                 135                 140
Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu
145                 150                 155                 160
Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu
                165                 170                 175
His
<210>2
<211>176
<212>PRT
<213>牛(Bos taurus)
<400>2
Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Ile Pro Pro Leu Ile
1               5                   10                  15
Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Ser Gly Arg
            20                  25                  30
Asp Gly Gly Ala Tyr Gln Asn Val Leu Met Val Asn Ile Asp Asp Leu
        35                  40                  45
Asp Asn Met Ile Asn Phe Asp Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn
    50                  55                  60
Phe Phe Lys Lys His Ser Cys Asp Asp Asn Lys Glu Ala Ser Phe Leu
65                  70                  75                  80
Asn Arg Ala Ser Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser
                85                  90                  95
Asp Asp Phe Lys Leu His Leu Ser Thr Val Ser Gln Gly Thr Leu Thr
            100                 105                 110
Leu Leu Asn Cys Thr Ser Lys Gly Lys Gly Arg Lys Pro Pro Ser Leu
        115                 120                 125
Ser Glu Ala Gln Pro Thr Lys Asn Leu Glu Glu Asn Lys Ser Ser Arg
    130                 135                 140
Glu Gln Lys Lys Gln Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Ile Leu Leu Gln
145                 150                 155                 160
Lys Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Arg Gly Ile Lys Glu His
                165                 170                 175
<210>3
<211>176
<212>PRT
<213>绵羊(Ovis aries)
<400>3
Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Ile Pro Pro Leu Ile
1               5                   10                  15
Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Phe Ser Gly Lys
            20                  25                  30
Asp Gly Gly Ala Tyr Gln Asn Val Leu Met Val Ser Ile Asp Asp Leu
        35                  40                  45
Asp Asn Met Ile Asn Phe Asp Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn
    50                  55                  60
Phe Phe Lys Lys His Ser Cys Asp Asp Asn Lys Glu Ala Ser Phe Leu
65                  70                  75                  80
Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Lys Gln Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser
                85                  90                  95
Asp Asp Phe Lys Leu His Leu Ser Thr Val Ser Gln Gly Thr Leu Thr
            100                 105                 110
Leu Leu Asn Cys Thr Ser Lys Gly Lys Gly Arg Lys Pro Pro Ser Leu
        115                 120                 125
Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Asn Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys
    130                 135                 140
Glu Gln Arg Lys Gln Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Ile Leu Leu Gln
145                 150                 155                 160
Lys Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Arg Gly Ile Thr Glu His
                165                 170                 175
<210>4
<211>152
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>去免疫的人IL-7氨基酸序列.
<400>4
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1               5                   10                  15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
            20                  25                  30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
        35                  40                  45
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
    50                  55                  60
Gln Phe Leu Asp Asp Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65                  70                  75                  80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Thr Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Gly
                85                  90                  95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
            100                 105                 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
        115                 120                 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
    130                 135                 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145                 150
<210>5
<211>153
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>细菌产生的去免疫的人IL-7氨基酸序列.
<400>5
Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val
1               5                   10                  15
Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly
            20                  25                  30
Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys
        35                  40                  45
Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu
    50                  55                  60
Arg Gln Phe Leu Asp Asp Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu
65                  70                  75                  80
Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Thr Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln
                85                  90                  95
Gly Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys
            100                 105                 110
Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp
        115                 120                 125
Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn
    130                 135                 140
Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145                 150
<210>6
<211>456
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码具有密码子替换F39P、F57N和L128S的成熟IL-7的核酸序列
<400>6
gattgtgata ttgagggtaa ggatggcaaa cagtacgaga gtgttctaat ggtgagcatc    60
gaccagttat tggacagcat gaaggagatt gggagcaatt gcctgaataa cgaacccaac    120
ttctttaaga gacacatctg cgatgccaat aaggaaggga tgtttttaaa ccgtgctgcc    180
cgcaagttga ggcaattcct taaaatgaac agcactggtg actttgatct ccacctgtta    240
aaagtttcag aaggcaccac aatcctgttg aactgcactg gccaggtgaa aggaaggaaa    300
cctgctgccc tgggtgaagc tcaaccaaca aagagtttgg aggagaataa atctttaaag    360
gaacagaaaa aactgaatga cagctgtttc ctaaagagac tactgcaaga gataaaaact    420
tgctggaata aaatcttgat gggcactaaa gaacac                              456
<210>7
<211>152
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>具有氨基酸替换F39P、F57N和L128S的密码子的成熟IL-7的氨基酸序列
<400>7
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1               5                   10                  15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
            20                  25                  30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
        35                  40                  45
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
    50                  55                  60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65                  70                  75                  80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
                85                  90                  95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
            100                 105                 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Ser
        115                 120                 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
    130                 135                 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145                 150
<210>8
<211>456
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码具有氨基酸替换F39P，F57N，L77D，和L128S的密码子的成熟IL-7的核酸序列
<400>8
gattgtgata ttgagggtaa ggatggcaaa cagtacgaga gtgttctaat ggtgagcatc     60
gaccagttat tggacagcat gaaggagatt gggagcaatt gcctgaataa cgaacccaac    120
ttctttaaga gacacatctg cgatgccaat aaggaaggga tgtttttaaa ccgtgctgcc    180
cgcaagttga ggcaattcct taaaatgaac agcactggtg actttgatga ccacctgtta    240
aaagtttcag aaggcaccac aatcctgttg aactgcactg gccaggtgaa aggaaggaaa    300
cctgctgccc tgggtgaagc tcaaccaaca aagagtttgg aggagaataa atctttaaag    360
gaacagaaaa aactgaatga cagctgtttc ctaaagagac tactgcaaga gataaaaact    420
tgctggaata aaatcttgat gggcactaaa gaacac                              456
<210>9
<211>152
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>具有氨基酸替换F39P，F57N，L77D，和L128S的密码子的成熟IL-7的氨基酸序列
<400>9
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1               5                   10                  15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
            20                  25                  30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
        35                  40                  45
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
    50                  55                  60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Asp His Leu Leu
65                  70                  75                  80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
                85                  90                  95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
            100                 105                 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Ser
        115                 120                 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
    130                 135                 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145                 150
<210>10
<211>462
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码对大肠杆菌密码子优化的具有氨基酸替换K68D，M69D，I88T，V96G的密码子的、细菌产生的去免疫IL-7的核酸序列.
<400>10
atggactgcg acatcgaagg taaagacggc aaacagtacg aatccgttct gatggtttcc     60
atcgaccagc tgctggactc catgaaagaa atcggctcca actgcctgaa caacgaattc    120
aacttcttca aacggcacat atgcgacgct aacaaagaag gcatgttcct gttccgcgct    180
gctcgcaaac tgcgccagtt cctggatgat aactctaccg gtgacttcga cctgcacctg    240
ctgaaagttt ctgaaggtac tactaccctg ctgaactgca ctggccaggg taaaggccgc    300
aagccggccg ctctgggcga agctcagccg actaaatctc tagaagaaaa caaatccctg    360
aaagaacaga agaagctgaa cgacctgtgc ttcctgaaac gcctgctgca ggaaatcaaa    420
acttgctgga acaaaatcct gatgggcact aaagaacact ag                       462
<210>11
<211>459
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码具有氨基酸替换K68D，M69D，I88T，V96G的密码子的成熟的去免疫IL-7变体的核酸序列.
<400>11
gattgtgata ttgaaggtaa agatggcaaa caatatgaga gtgttctaat ggtcagcatc     60
gatcaattat tggacagcat gaaagaaatt ggtagcaatt gcctgaataa tgaatttaac    120
ttttttaaaa gacatatctg tgatgctaat aaggaaggta tgtttttatt cgtgctgct     180
cgcaagttga ggcaatttct tgacgataat agcactggtg attttgatct ccacttatta    240
aaagtttcag aaggcacaac aaccctgttg aactgcactg gccagggcaa aggaagaaaa    300
ccagctgccc tgggtgaagc ccaaccaaca aagagtttgg aagaaaataa atctttaaag    360
gaacagaaaa aactgaatga cttgtgtttc ctaaagagac tattacaaga gataaaaact    420
tgttggaata aaattttgat gggcactaaa gaacactga                           459
<210>12
<211>384
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人Fcγ1-IL-7的氨基酸序列
<400>12
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
            20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
        35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
    50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
            100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
        115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
    130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
                165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
            180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
        195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
    210                 215                 220
Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp
225                 230                 235                 240
Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu
                245                 250                 255
Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn
            260                 265                 270
Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu
        275                 280                 285
Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr
    290                 295                 300
Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile
305                 310                 315                 320
Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu
                325                 330                 335
Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys
            340                 345                 350
Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln
        355                 360                 365
Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
    370                 375                 380
<210>13
<211>383
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人Fcγ2(h)(FN>AQ)-IL-7的氨基酸序列.
<400>13
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
            20                  25                  30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
        35                  40                  45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
    50                  55                  60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Ala
65                  70                  75                  80
Gln Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp
                85                  90                  95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg
        115                 120                 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
    130                 135                 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145                 150                 155                 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
                165                 170                 175
Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
            180                 185                 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
        195                 200                 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
    210                 215                 220
Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly
225                 230                 235                 240
Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp
                245                 250                 255
Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe
            260                 265                 270
Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe
        275                 280                 285
Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly
    290                 295                 300
Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu
305                 310                 315                 320
Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly
                325                 330                 335
Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu
            340                 345                 350
Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu
        355                 360                 365
Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
    370                 375                 380
<210>14
<211>398
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人Fcγ1-(接头1)-IL-7的氨基酸序列
<400>14
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
            20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
        35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
    50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
            100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
        115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
    130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
                165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser phe Phe Leu Tyr
            180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
        195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
    210                 215                 220
Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys
                245                 250                 255
Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser
            260                 265                 270
Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe
        275                 280                 285
Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg
    290                 295                 300
Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp
305                 310                 315                 320
Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu
                325                 330                 335
Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu
            340                 345                 350
Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln
        355                 360                 365
Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile
    370                 375                 380
Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
385                 390                 395
<210>15
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>多肽接头.
<400>15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<210>16
<211>393
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人Fcγ1(YN＞AQ)-(接头2)-IL-7的氨基酸序列.
<400>16
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
            20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
        35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
    50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Ala Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
            100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
        115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
    130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
                165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
            180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
        195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
    210                 215                 220
Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Gly Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val
                245                 250                 255
Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly
            260                 265                 270
Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys
        275                 280                 285
Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu
    290                 295                 300
Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu
305                 310                 315                 320
Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln
                325                 330                 335
Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys
            340                 345                 350
Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp
        355                 360                 365
Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn
    370                 375                 380
Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
385                 390
<210>17
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>多肽接头.
<400>17
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1               5
<210>18
<211>391
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人Fcγ1(YN＞AQ，d)-(接头2)-IL-7的氨基酸序列.
<400>18
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
            20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
        35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
    50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Ala Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
            100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
        115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
    130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
                165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
            180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
        195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
    210                 215                 220
Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp
225                 230                 235                 240
Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met
                245                 250                 255
Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn
            260                 265                 270
Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala
        275                 280                 285
Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln
    290                 295                 300
Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys
                325                 330                 335
Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu
            340                 345                 350
Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys
        355                 360                 365
Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile
    370                 375                 380
Leu Met Gly Thr Lys Glu His
385                 390
<210>19
<211>911
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人Fcγ1的核酸序列
<400>19
gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaggtaa gccagcccag      60
gcctcgccct ccagctcaag gcgggacagg tgccctagag tagcctgcat ccagggacag     120
gccccagccg ggtgctgaca cgtccacctc catctcttcc tcagcacctg aactcctggg     180
gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac     240
ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa     300
ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta     360
caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg     420
caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat    480
ctccaaagcc aaaggtggga cccgtggggt gcgagggcca catggacaga ggccggctcg    540
gcccaccctc tgccctgaga gtgaccgctg taccaacctc tgtccctaca gggcagcccc    600
gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cacgggagga gatgaccaag aaccaggtca    660
gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca    720
atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct    780
tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct    840
catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc gccaccgcga    900
ccccgggcgc c                                                         911
<210>20
<211>911
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人Fcγ1(YN>AQ)的核酸序列.
<400>20
gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaggtaa gccagcccag     60
gcctcgccct ccagctcaag gcgggacagg tgccctagag tagcctgcat ccagggacag    120
gccccagccg ggtgctgaca cgtccacctc catctcttcc tcagcacctg aactcctggg    180
gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac    240
ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa    300
ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcaggc    360
ccagagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg    420
caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat    480
ctccaaagcc aaaggtggga cccgtggggt gcgagggcca catggacaga ggccggctcg    540
gcccaccctc tgccctgaga gtgaccgctg taccaacctc tgtccctaca gggcagcccc    600
gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cacgggagga gatgaccaag aaccaggtca    660
gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca    720
atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct    780
tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct    840
catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc gccaccgcga    900
ccccgggcgc c                                                         911
<210>21
<211>908
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人Fcγ2(h)的核酸序列.
<400>21
gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaggtaa gccagcccag     60
gcctcgccct ccagctcaag gcgggacagg tgccctagag tagcctgcat ccagggacag    120
gccccagctg ggtgctgaca cgtccacctc catctcttcc tcagcaccac ctgtggcagg    180
accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc    240
tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtcc agttcaactg    300
gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccacgggagg agcagttcaa    360
cagcacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgttgtgcac caggactggc tgaacggcaa    420
ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc    480
caaaaccaaa ggtgggaccc gcggggtatg agggccacat ggacagaggc cggctcggcc    540
caccctctgc cctgagagtg accgctgtac caacctctgt ccctacaggg cagccccgag    600
aaccacaggt gtacaccctg cccccatcac gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc    660
tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg    720
ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac ggctccttct    780
tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat    840
gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcgcc accgcgaccc    900
cgggcgcc                                                             908
<210>22
<211>908
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人Fcγ2(h)(FN＞AQ)的核酸序列.
<400>22
gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaggtaa gccagcccag     60
gcctcgccct ccagctcaag gcgggacagg tgccctagag tagcctgcat ccagggacag    120
gccccagctg ggtgctgaca cgtccacctc catctcttcc tcagcaccac ctgtggcagg    180
accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc    240
tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtcc agttcaactg    300
gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccacgggagg agcaggccca    360
gagcacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgttgtgcac caggactggc tgaacggcaa    420
ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc    480
caaaaccaaa ggtgggaccc gcggggtatg agggccacat ggacagaggc cggctcggcc    540
caccctctgc cctgagagtg accgctgtac caacctctgt ccctacaggg cagccccgag    600
aaccacaggt gtacaccctg cccccatcac gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc    660
tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg    720
ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac ggctccttct    780
tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat    840
gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcgcc accgcgaccc    900
cgggtgca                                                             908
<210>23
<211>149
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>成熟的人去免疫的-IL-7.1的氨基酸序列.
<400>23
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1               5                   10                  15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Asp Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
            20                  25                  30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
        35                  40                  45
Ala Asn Lys Glu Gly Ala Phe Leu Lys Arg Ala Ser Glu Lys Leu Arg
    50                  55                  60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65                  70                  75                  80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
                85                  90                  95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
            100                 105                 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
        115                 120                 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
    130                 135                 140
Ile Leu Lys Gly Ser
145
<210>24
<211>450
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码成熟的人去免疫的IL-7.1的核酸序列.
<400>24
gattgtgata ttgaaggtaa agatggcaaa caatatgaga gtgttctaat ggtcagcatc     60
gatcaattag acgacagcat gaaagaaatt ggtagcaatt gcctgaataa tgaatttaac    120
ttttttaaaa gacatatctg tgatgctaat aaggaaggtg cctttttaaa gcgtgcttcc    180
gagaagttga ggcaatttct taaaatgaat agcactggtg attttgatct ccacttatta    240
aaagtttcag aaggcacaac aatactgttg aactgcactg gccaggttaa aggaagaaaa    300
ccagctgccc tgggtgaagc ccaaccaaca aagagtttgg aagaaaataa atctttaaag    360
gaacagaaaa aactgaatga cttgtgtttc ctaaagagac tattacaaga gataaaaact    420
tgttggaata aaattttgaa aggcagctga                                     450
<210>25
<211>149
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>成熟的人去免疫的IL-7.2的氨基酸序列.
<400>25
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1               5                   10                  15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
            20                  25                  30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
        35                  40                  45
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
    50                  55                  60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asn Asp His Leu Leu
65                  70                  75                  80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Gln Thr Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Gly
                85                  90                  95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
            100                 105                 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Ser Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Val
        115                 120                 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
    130                 135                 140
Ile Leu Lys Gly Ser
145
<210>26
<211>450
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码成熟的人去免疫的IL-7.2的核酸序列.
<400>26
gattgtgata ttgaaggtaa agatggcaaa caatatgaga gtgttctaat ggtcagcatc     60
gatcaattat tggacagcat gaaagaaatt ggtagcaatt gcctgaataa tgaatttaac    120
ttttttaaaa gacatatctg tgatgctaat aaggaaggta tgtttttatt ccgtgctgct    180
cgcaagttga ggcaatttct taaaatgaat agcactggtg attttaacga tcacttatta    240
aaagtttcag aaggcacaca gacactcttg aactgcactg gccagggcaa aggaagaaaa    300
ccagctgccc tgggtgaagc ccaaccaaca aagagtttgg aagaaaataa atcttctaag    360
gaacagaaaa aactgaatga cgtgtgtttc ctaaagagac tattacaaga gataaaaact    420
tgttggaata aaattttgaa aggcagctga                                     450
<210>27
<211>149
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>成熟的人去免疫的IL-7.3的氨基酸序列.
<400>27
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1               5                   10                  15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Asp Asp Ser Met Lys Glu Thr Gly Ser
            20                  25                  30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
        35                  40                  45
Ala Asn Lys Glu Gly Ala Phe Leu Lys Arg Ala Ser Glu Lys Leu Arg
    50                  55                  60
Gln Phe Leu Asp Asp Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Asp His Leu Leu
65                  70                  75                  80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Gln Thr Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Gly
                85                  90                  95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
            100                 105                 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Ser Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Ala
        115                 120                 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
    130                 135                 140
Ile Leu Lys Gly Ser
145
<210>28
<211>450
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码成熟的人DeI-IL-7.3的核酸序列.
<400>28
gattgtgata ttgaaggtaa agatggcaaa caatatgaga gtgttctaat ggtcagcatc     60
gatcaattag acgacagcat gaaagaaacc ggtagcaatt gcctgaataa tgaacctaac    120
ttttttaaaa gacatatctg tgatgctaat aaggaaggtg cctttttaaa gcgtgcttcc    180
gagaagttga ggcaatttct tgacgataat agcactggtg attttgatga ccacttatta    240
aaagtttcag aaggcacaca gacactcttg aactgcactg gccagggcaa aggaagaaaa    300
ccagctgccc tgggtgaagc ccaaccaaca aagagtttgg aagaaaataa atcttctaag    360
gaacagaaaa aactgaatga cgcctgtttc ctaaagagac tattacaaga gataaaaact    420
tgttggaata aaattttgaa aggcagctga                                     450
<210>29
<211>502
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>核酸序列，编码GGGGSGGGG接头序列和其后的含有氨基酸替换F39P，F57N，和L128S的成熟的人IL-7序列
<400>29
cccgggtgct ggaggtggag gatcaggtgg tggcggtgat tgtgatattg agggtaagga     60
tggcaaacag tacgagagtg ttctaatggt gagcatcgac cagttattgg acagcatgaa    120
ggagattggg agcaattgcc tgaataacga acccaacttc tttaagagac acatctgcga    180
tgccaataag gaagggatgt ttttaaaccg tgctgcccgc aagttgaggc aattccttaa    240
aatgaacagc actggtgact ttgatctcca cctgttaaaa gtttcagaag gcaccacaat    300
cctgttgaac tgcactggcc aggtgaaagg aaggaaacct gctgccctgg gtgaagctca    360
accaacaaag agtttggagg agaataaatc tttaaaggaa cagaaaaaac tgaatgacag    420
ctgtttccta aagagactac tgcaagagat aaaaacttgc tggaataaaa tcttgatggg    480
cactaaagaa cactgactcg ag                                             502
<210>30
<211>1394
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>成熟的人Fcγ2(h)(FN＞AQ)-(接头2)-IL-7(F39P，F57N，L77D，L128S)的核酸序列.
<400>30
gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaggtaa gccagcccag     60
gcctcgccct ccagctcaag gcgggacagg tgccctagag tagcctgcat ccagggacag    120
gccccagctg ggtgctgaca cgtccacctc catctcttcc tcagcaccac ctgtggcagg    180
accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc    240
tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtcc agttcaactg    300
gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccacgggagg agcaggccca    360
gagcacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgttgtgcac caggactggc tgaacggcaa    420
ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc    480
caaaaccaaa ggtgggaccc gcggggtatg agggccacat ggacagaggc cggctcggcc    540
caccctctgc cctgagagtg accgctgtac caacctctgt ccctacaggg cagccccgag    600
aaccacaggt gtacaccctg cccccatcac gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc    660
tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg    720
ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac ggctccttct    780
tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat    840
gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcgcc accgcgaccc    900
cgggtgctgg aggtggagga tcaggtggtg gcggtgattg tgatattgag ggtaaggatg    960
gcaaacagta cgagagtgtt ctaatggtga gcatcgacca gttattggac agcatgaagg   1020
agattgggag caattgcctg aataacgaac ccaacttctt taagagacac atctgcgatg   1080
ccaataagga agggatgttt ttaaaccgtg ctgcccgcaa gttgaggcaa ttccttaaaa   1140
tgaacagcac tggtgacttt gatgaccacc tgttaaaagt ttcagaaggc accacaatcc 1200
tgttgaactg cactggccag gtgaaaggaa ggaaacctgc tgccctgggt gaagctcaac 1260
caacaaagag tttggaggag aataaatctt taaaggaaca gaaaaaactg aatgacagct 1320
gtttcctaaa gagactactg caagagataa aaacttgctg gaataaaatc ttgatgggca 1380
ctaaagaaca ctga                                                   1394
<210>31
<211>1394
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>成熟的人Fcγ2(h)-(接头2)-IL-7(F39P，F57N，L128S)的核酸序列.
<400>31
gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaggtaa gccagcccag   60
gcctcgccct ccagctcaag gcgggacagg tgccctagag tagcctgcat ccagggacag  120
gccccagctg ggtgctgaca cgtccacctc catctcttcc tcagcaccac ctgtggcagg  180
accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc  240
tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtcc agttcaactg  300
gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccacgggagg agcagttcaa  360
cagcacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgttgtgcac caggactggc tgaacggcaa  420
ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc  480
caaaaccaaa ggtgggaccc gcggggtatg agggccacat ggacagaggc cggctcggcc  540
caccctctgc cctgagagtg accgctgtac caacctctgt ccctacaggg cagccccgag  600
aaccacaggt gtacaccctg cccccatcac gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc  660
tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg  720
ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac ggctccttct  780
tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat  840
gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcgcc accgcgaccc  900
cgggtgctgg aggtggagga tcaggtggtg gcggtgattg tgatattgag ggtaaggatg  960
gcaaacagta cgagagtgtt ctaatggtga gcatcgacca gttattggac agcatgaagg 1020
agattgggag caattgcctg aataacgaac ccaacttctt taagagacac atctgcgatg 1080
ccaataagga agggatgttt ttaaaccgtg ctgcccgcaa gttgaggcaa ttccttaaaa   1140
tgaacagcac tggtgacttt gatctccacc tgttaaaagt ttcagaaggc accacaatcc   1200
tgttgaactg cactggccag gtgaaaggaa ggaaacctgc tgccctgggt gaagctcaac   1260
caacaaagag tttggaggag aataaatctt taaaggaaca gaaaaaactg aatgacagct   1320
gtttcctaaa gagactactg caagagataa aaacttgctg gaataaaatc ttgatgggca   1380
ctaaagaaca ctga                                                     1394
<210>32
<211>1394
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>成熟的huFcγ2(h)-(接头2)-IL-7(F39P，F57N，L77D，和L128S)的核酸序列.
<400>32
gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaggtaa gccagcccag     60
gcctcgccct ccagctcaag gcgggacagg tgccctagag tagcctgcat ccagggacag    120
gccccagctg ggtgctgaca cgtccacctc catctcttcc tcagcaccac ctgtggcagg    180
accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc    240
tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtcc agttcaactg    300
gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccacgggagg agcagttcaa    360
cagcacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgttgtgcac caggactggc tgaacggcaa    420
ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc    480
caaaaccaaa ggtgggaccc gcggggtatg agggccacat ggacagaggc cggctcggcc    540
caccctctgc cctgagagtg accgctgtac caacctctgt ccctacaggg cagccccgag    600
aaccacaggt gtacaccctg cccccatcac gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc    660
tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg    720
ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac ggctccttct    780
tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat    840
gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcgcc accgcgaccc    900
cgggtgctgg aggtggagga tcaggtggtg gcggtgattg tgatattgag ggtaaggatg    960
gcaaacagta cgagagtgtt ctaatggtga gcatcgacca gttattggac agcatgaagg   1020
agattgggag caattgcctg aataacgaac ccaacttctt taagagacac atctgcgatg   1080
ccaataagga agggatgttt ttaaaccgtg ctgcccgcaa gttgaggcaa ttccttaaaa   1140
tgaacagcac tggtgacttt gatgaccacc tgttaaaagt ttcagaaggc accacaatcc   1200
tgttgaactg cactggccag gtgaaaggaa ggaaacctgc tgccctgggt gaagctcaac   1260
caacaaagag tttggaggag aataaatctt taaaggaaca gaaaaaactg aatgacagct   1320
gtttcctaaa gagactactg caagagataa aaacttgctg gaataaaatc ttgatgggca   1380
ctaaagaaca ctga                                                     1394
<210>33
<211>392
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>成熟的人Fcγ2(h)(FN＞AQ)-(接头2)-IL-7(F39P，F57N，L77D，L128S)的氨基酸序列.
<400>33
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
            20                  25                  30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
        35                  40                  45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
    50                  55                  60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Ala
65                  70                  75                  80
Gln Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp
                85                  90                  95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg
        115                 120                 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
    130                 135                 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145                 150                 155                 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
                165                 170                 175
Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
            180                 185                 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
        195                 200                 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
    210                 215                 220
Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
                245                 250                 255
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
            260                 265                 270
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
        275                 280                 285
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
    290                 295                 300
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Asp His Leu Leu
305                 310                 315                 320
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
                325                 330                 335
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
            340                 345                 350
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Ser
        355                 360                 365
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
    370                 375                 380
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
385                 390
<210>34
<211>392
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>成熟的人Fcγ2(h)(FN＞AQ)-(接头2)-IL-7(F39P，F57N，L128S)的氨基酸序列.
<400>34
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
            20                  25                  30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
        35                  40                  45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
    50                  55                  60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Ala
65                  70                  75                  80
Gln Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp
                85                  90                  95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg
        115                 120                 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
    130                 135                 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145                 150                 155                 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
                165                 170                 175
Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
            180                 185                 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
        195                 200                 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
    210                 215                 220
Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
                245                 250                 255
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
            260                 265                 270
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
        275                 280                 285
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
    290                 295                 300
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
305                 310                 315                 320
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
                325                 330                 335
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
            340                 345                 350
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Ser
        355                 360                 365
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
    370                 375                 380
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
385                 390
<210>35
<211>392
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>成熟的人Fcγ2(h)-(接头2)-IL-7(F39P，F57N，L77D，L128S)的氨基酸序列.
<400>35
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
            20                  25                  30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
        35                  40                  45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
    50                  55                  60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
65                  70                  75                  80
Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp
                85                  90                  95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg
        115                 120                 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
    130                 135                 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145                 150                 155                 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
                165                 170                 175
Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
            180                 185                 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
        195                 200                 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
    210                 215                 220
Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
                245                 250                 255
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
            260                 265                 270
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
        275                 280                 285
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
    290                 295                 300
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Asp His Leu Leu
305                 310                 315                 320
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
                325                 330                 335
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
            340                 345                 350
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Ser
        355                 360                 365
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
    370                 375                 380
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
385                 390
<210>36
<211>392
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>成熟的人Fcγ2(h)(接头2)-IL-7(F39P，F57N，L128S)的氨基酸序列.
<400>36
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
            20                  25                  30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
        35                  40                  45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
    50                  55                  60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
65                  70                  75                  80
Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp
                85                  90                  95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg
        115                 120                 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
    130                 135                 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145                 150                 155                 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
                165                 170                 175
Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
            180                 185                 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
        195                 200                 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
    210                 215                 220
Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
                245                 250                 255
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
            260                 265                 270
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
        275                 280                 285
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
    290                 295                 300
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
305                 310                 315                 320
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
                325                 330                 335
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
            340                 345                 350
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Ser
        355                 360                 365
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
    370                 375                 380
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
385                 390
<210>37
<211>152
<212>PRT
<213>人
<400>37
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1               5                   10                  15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
            20                  25                  30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
        35                  40                  45
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
    50                  55                  60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65                  70                  75                  80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
                85                  90                  95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
            100                 105                 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
        115                 120                 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
    130                 135                 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145                 150
<210>38
<211>126
<212>PRT
<213>黑猩猩(Pan troglodytes)
<400>38
Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe
1               5                   10                  15
Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg
            20                  25                  30
Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp
        35                  40                  45
Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu
    50                  55                  60
Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu
65                  70                  75                  80
Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln
                85                  90                  95
Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile
            100                 105                 110
Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
        115                 120                 125
<210>39
<211>152
<212>PRT
<213>狒狒(Papio sp.)
<400>39
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1               5                   10                  15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
            20                  25                  30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Leu Cys Asp
        35                  40                  45
Asp Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
    50                  55                  60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65                  70                  75                  80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Lys Val
                85                  90                  95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Pro Gln Pro Thr Lys Ser
            100                 105                 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Ser
        115                 120                 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Lys Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
    130                 135                 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145                 150
<210>40
<211>152
<212>PRT
<213>猕猴(Macaca mulatta)
<400>40
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1               5                   10                  15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
            20                  25                  30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Leu Cys Asp
        35                  40                  45
Asp Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
    50                  55                  60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65                  70                  75                  80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Lys Val
                85                  90                  95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Pro Gln Pro Thr Lys Ser
            100                 105                 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Ser
        115                 120                 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Lys Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
    130                 135                 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145                 150
<210>41
<211>151
<212>PRT
<213>牛
<400>41
Asp Cys Asp Ile Ser Gly Lys Asp Gly Gly Ala Tyr Gln Asn Val Leu
1               5                   10                  15
Met Val Asn Ile Asp Asp Leu Asp Asn Met Ile Asn phe Asp Ser Asn
            20                  25                  30
Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn Phe Phe Lys Lys His Ser Cys Asp Asp
        35                  40                  45
Asn Lys Glu Ala Ser Phe Leu Asn Arg Ala Ser Arg Lys Leu Arg Gln
    50                  55                  60
Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser Asp Asp Phe Lys Leu His Leu Ser Thr
65                  70                  75                  80
Val Ser Gln Gly Thr Leu Thr Leu Leu Asn Cys Thr Ser Lys Gly Lys
                85                  90                  95
Gly Arg Lys Pro Pro Ser Leu Ser Glu Ala Gln Pro Thr Lys Asn Leu
            100                 105                 110
Glu Glu Asn Lys Ser Ser Lys Glu Gln Lys Lys Gln Asn Asp Leu Cys
        115                 120                 125
Phe Leu Lys Ile Leu Leu Gln Lys Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile
    130                 135                 140
Leu Arg Gly Ile Lys Glu His
145                 150
<210>42
<211>151
<212>PRT
<213>猪(Sus scrofa)
<400>42
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Gly Val Tyr Gln Asn Val Leu
1               5                   10                  15
Met Val Ser Ile Asp Asp Leu Asp Arg Met Ile Asp Phe Asp Ser Asn
            20                  25                  30
Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn Phe Leu Lys Lys His Ser Cys Asp Asp
        35                  40                  45
Asn Lys Glu Ala Ser Phe Leu Tyr Arg Ala Ala Arg Lys Leu Lys Gln
    50                  55                  60
Phe Ile Lys Met Asn Ile Ser Glu Glu Phe Asn His His Leu Ser Thr
65                  70                  75                  80
Val Ser Gln Gly Thr Leu Thr Leu Phe Asn Cys Thr Ser Lys Val Lys
                85                  90                  95
Gly Arg Lys Pro Pro Ser Leu Gly Glu Ala Gln Leu Thr Lys Asn Leu
            100                 105                 110
Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Arg Gln Gly Asp Leu Cys
        115                 120                 125
Phe Leu Lys Ile Leu Leu Gln Lys Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile
    130                 135                 140
Leu Arg Gly Ala Lys Glu Tyr
145                 150
<210>43
<211>151
<212>PRT
<213>绵羊
<400>43
Asp Cys Asp Phe Ser Gly Lys Asp Gly Gly Ala Tyr Gln Asn Val Leu
1               5                   10                  15
Met Val Ser Ile Asp Asp Leu Asp Asn Met Ile Asn Phe Asp Ser Asn
            20                  25                  30
Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn Phe Phe Lys Lys His Ser Cys Asp Asp
        35                  40                  45
Asn Lys Glu Ala Ser Phe Leu Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Lys Gln
    50                  55                  60
Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser Asp Asp Phe Lys Leu His Leu Ser Thr
65                  70                  75                  80
Val Ser Gln Gly Thr Leu Thr Leu Leu Asn Cys Thr Ser Lys Gly Lys
                85                  90                  95
Gly Arg Lys Pro Pro Ser Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Asn Leu
            100                 105                 110
Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Arg Lys Gln Asn Asp Leu Cys
        115                 120                 125
Phe Leu Lys Ile Leu Leu Gln Lys Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile
    130                 135                 140
Leu Arg Gly Ile Thr Glu His
145                 150
<210>44
<211>129
<212>PRT
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400>44
Asp Cys His Ile Lys Asp Lys Asp Gly Lys Ala Phe Gly Ser Val Leu
1               5                   10                  15
Met Ile Ser Ile Asn Gln Leu Asp Lys Met Thr Gly Thr Asp Ser Asp
            20                  25                  30
Cys Pro Asn Asn Glu Pro Asn Phe Phe Lys Lys His Leu Cys Asp Asp
        35                  40                  45
Thr Lys Glu Ala Ala Phe Leu Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln
    50                  55                  60
Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser Glu Glu Phe Asn Asp His Leu Leu Arg
65                  70                  75                  80
Val Ser Asp Gly Thr Gln Thr Leu Val Asn Cys Thr Ser Lys Glu Glu
                85                  90                  95
Lys Thr Ile Lys Glu Gln Lys Lys Asn Asp Pro Cys Phe Leu Lys Arg
            100                 105                 110
Leu Leu Arg Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Lys Gly Ser
        115                 120                 125
Ile
<210>45
<211>129
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>45
Glu Cys His Ile Lys Asp Lys Glu Gly Lys Ala Tyr Glu Ser Val Leu
1               5                   10                  15
Met Ile Ser Ile Asp Glu Leu Asp Lys Met Thr Gly Thr Asp Ser Asn
            20                  25                  30
Cys Pro Asn Asn Glu Pro Asn Phe Phe Arg Lys His Val Cys Asp Asp
        35                  40                  45
Thr Lys Glu Ala Ala Phe Leu Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Lys Gln
    50                  55                  60
Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser Glu Glu Phe Asn Val His Leu Leu Thr
65                  70                  75                  80
Val Ser Gln Gly Thr Gln Thr Leu Val Asn Cys Thr Ser Lys Glu Glu
                85                  90                  95
Lys Asn Val Lys Glu Gln Lys Lys Asn Asp Ala Cys Phe Leu Lys Arg
            100                 105                 110
Leu Leu Arg Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Lys Gly Ser
        115                 120                 125
Ile
<210>46
<211>18
<212>PRT
<213>人
<400>46
Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys
1               5                   10                  15
Ser Leu
<210>47
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>细菌产生的人IL-7蛋白的N-端序列.
<400>47
Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys
1               5
<210>48
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IL-7中的包括位置70的T细胞表位.
<400>48
Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser
1               5
<210>49
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IL-7中的包括位置70的T细胞表位.
<400>49
Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp
1               5
<210>50
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IL-7中的包括位置70的T细胞表位.
<400>50
Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe
1               5
<210>51
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IL-7中的包括位置70的T细胞表位.
<400>51
Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu
1               5
<210>52
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IL-7中的包括位置91的T细胞表位.
<400>52
Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
1               5
<210>53
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IL-7中的包括位置91的T细胞表位.
<400>53
Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys
1               5
<210>54
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IgGl Fc部分中的糖基化位点.
<400>54
Gln Tyr Asn Ser
1
<210>55
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IgG1 Fc部分中的糖基化位点
<400>55
Gln Phe Asn Ser
1
<210>56
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IgG1 Fc部分中的糖基化位点.
<400>56
Gln Ala Gln Ser
1
<210>57
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>靠近Fc部分c端的序列.
<400>57
Leu Ser Leu Ser
1
<210>58
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>靠近Fc部分c端的经修饰序列.
<400>58
Ala Thr Ala Thr
1
<210>59
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>破伤风毒素衍生的肽.
<400>59
Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile
1               5                   10
<210>60
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有T细胞表位的肽.
<400>60
Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp
1               5                   10                  15
<210>61
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有T细胞表位的肽.
<400>61
Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu
1               5                   10                  15
<210>62
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有T细胞表位的肽.
<400>62
Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
1               5                   10                  15
<210>63
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>变体IL-7肽序列.
<400>63
Leu Arg Gln Phe Leu Asp Asp Asn Ser
1               5
<210>64
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>变体IL-7肽序列.
<400>64
Thr Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Gly
1               5
<210>65
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有T细胞表位的肽.
<400>65
Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu Cys
1               5                   10                  15
<210>66
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有T细胞表位的肽.
<400>66
Cys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu
1               5                   10                  15
<210>67
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有糖基化位点的序列.
<400>67
Met Asn Ser Thr Gly
1               5
<210>68
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有糖基化位点的序列.
<400>68
Leu Asn Cys Thr Gly
1               5
<210>69
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物M(s).
<400>69
tgactttgat gaccacctgt taaaagtttc    30
<210>70
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物M(a).
<400>70
aacaggtggt catcaaagtc accagtgc      28
<210>71
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>下游引物.
<400>71
ctcgagtcag tgttctttag tgcccatc      28
<210>72
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>上游引物.
<400>72
cccgggtgct ggaggtggag gatcaggtg     29

Claims (19)

1.包含经修饰的人IL-7分子或其活性部分的多肽，其中所述经修饰的人IL-7分子或其活性部分具有经修饰的T细胞表位以降低抗IL-7 T细胞反应，其中所述经修饰的IL-7在野生型IL-7对应于Gln22、Leu24、Ile30、Phe39、Met54、Phe57、Arg58、Ala60、Arg61、Leu63、Lys68、Met69、Leu77、Ile88、Val96、Leu104、Leu128、Met147、Thr149、或Lys150的一个或多个残基处包含氨基酸替换。
2.权利要求1的多肽，其至少包含两处所述的氨基酸替换。
3.权利要求1的多肽，其至少包含四处所述的氨基酸替换。
4.权利要求1-3中任意一项所述的多肽，其中所述替换为在一个或多个残基Phe39、Phe57、Leu77和Leu128处的替换。
5.权利要求1-4中任意一项所述的多肽，其包含一种或多种下列替换：Gln22Asp、Leu24Asp、Ile30Thr、Phe39Pro、Met54Ala、Phe57Lys、Phe57Asn、Arg58Asp、Ala60Ser、Arg61Glu、Leu77Asp、Leu104Ser、Leu104Val、Leu128Ala、Leu128Val、Leu128Pro、Leu128Ser、Met147Lys、Thr149Ser、或Lys150终止。
6.权利要求5的多肽，其中所述多肽包含一种或多种替换：Phe39Pro、Phe57Asn、Leu77Asp和Leu128Ser。
7.权利要求6的多肽，其中所述多肽包含替换：Phe39Pro、Phe57Asn、Leu77Asp和Leu128Ser。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的多肽，其中所述多肽至少80％同一于人野生型IL-7。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的多肽，其中所述多肽还包含与所述经修饰的IL-7分子或其活性片段融合的免疫球蛋白分子或其部分。
10.权利要求9的多肽，其中所述免疫球蛋白分子或其部分通过其C端融合至所述经修饰的IL-7分子或其活性片段的N端。
11.权利要求9或10的多肽，其中所述免疫球蛋白分子为人免疫球蛋白。
12.权利要求9-11中任意一项所述的多肽，其中所述免疫球蛋白分子为IgG2。
13.权利要求9-12中任意一项所述的多肽，其中所述免疫球蛋白为Fc部分。
14.核酸分子，其编码根据权利要求1-13中任意一项所述的多肽。
15.表达载体，其包含权利要求14的核酸分子。
16.原核细胞，其包含权利要求15的表达载体。
17.根据权利要求1-13中任意一项所述的多肽的用途，用于制备治疗癌症疾病或HIV的药物。
18.权利要求17的用途，其中施用于患者的多肽的有效量为0.01至10mg/kg/天之间。
19.治疗患有癌症疾病或HIV的患者的方法，其通过向所述患者施用治疗有效量的根据权利要求1-13中任意一项所述的多肽进行。
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