CN101084310A - 半软c类免疫刺激性寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于刺激免疫反应的特定C类半软CpG免疫刺激性寡核苷酸。特别地，所述寡核苷酸用于治疗过敏如过敏性鼻炎和哮喘、癌症和传染病如乙型肝炎和丙型肝炎。

Description

半软C类免疫刺激性寡核苷酸
发明领域
本发明总体上涉及具有降低的肾脏炎性效应的免疫刺激性寡核苷酸、其组合物和使用免疫刺激性寡核苷酸的方法。特别地，免疫刺激性寡核苷酸是对治疗过敏和哮喘、癌症和传染病尤其有效的C类半软(C-classsemi-soft)寡核苷酸。
发明背景
细菌DNA对激活B细胞和天然杀伤细胞具有免疫刺激效应，而脊椎动物DNA却不具有所述效应(Tokunaga，T.等人，1988，Jpn.J.Cancer Res.79：682-686；Tokunaga，T.，等人，1984，JNCI 72：955-962；Messina，J.P.，等人，1991，J.Immunol.147：1759-1764；和参见Krieg，1998，AppliedOligonucleotide Technology，CA，Stein和A.M.Krieg，(编)，John Wiley andSons，Inc.，纽约，NY，pp.431-448)。现已明晓，细菌DNA的这些免疫刺激效应是由于在特定碱基环境(CpG基序)中存在有未甲基化CpG二核苷酸的结果，这在细菌DNA中普遍存在，但在脊椎动物DNA中却为甲基化且未被呈递(underrepresented)(Krieg等，1995，自然(Nature)，374：546-549；Krieg，1999 Biochim.Biophys.Acta 93321：1-10)。可应用包含这些CpG基序的合成寡脱氧核苷酸(ODN)模拟细菌DNA的免疫刺激效应。这种CpG ODN对人和鼠的白细胞具有高度的刺激效应，包括B细胞增殖；细胞因子和免疫球蛋白分泌；天然杀伤(NK)细胞裂解活性和IFN-γ分泌；以及活化树突细胞(DC)和其它抗原呈递细胞以表达共刺激分子和分泌细胞因子，特别是分泌对促进Th1样T细胞反应的发展至关重要的Th1样细胞因子。CpG ODN天然磷酸二酯骨架的这些免疫刺激效应是高度CpG特异的，因为若CpG基序经甲基化、变成GpC、或缺失或被经变更后，则这种效应显著降低(Krieg等人，1995，Nature，374：546-549；Hartmann等人，1999 Proc.Natl.Acad.Sci USA 96：9305-10)。
早期研究认为，免疫刺激性CpG基序遵循嘌呤-嘌冷-CpG-嘧啶-嘧啶形式(Krieg等人，1995，Nature，374：546-549；Pisetsky，1996 J.Immunol.156：421-423；Hacker等人，1998 EMBO J.17：6230-6240；Lipford等人，1998 Trends in Microbiol.6：496-500)。但现以明晓，小鼠淋巴细胞对不符合该“形式”的磷酸二酯CpG基序很好地反应(Yi等人，1998 J.Immunol.160：5898-5906)，并且对人B细胞和树突细胞而言也是如此(Hartmann等人，1999 Proc.Natl.Acad.Sci USA 96：9305-10；Liang，1996 J.Clin.Invest.98：1119-1129)。
最近已描述了CpG寡核苷酸的几个不同类(class)。一个类可有效激活B细胞，但诱导IFN-α和NK细胞活化的能力相对较弱；已将该类定义为B类。B类CpG寡核苷酸通常为完全稳定的(fully stablized)且在某些优选的碱基环境中包含未甲基化的CpG二核苷酸。参见如美国专利号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116和6,339,068。另一类的CpG寡核苷酸激活B细胞和NK细胞且诱导IFN-α；已将该类定义为C类。C类CpG寡核苷酸，正如首先表征的那样，通常是完全稳定的，包括B类型序列和富含GC的回文结构或近似回文结构。在2002年8月19日申请的共同待决的美国专利申请US10/224,523以及以国际公开号WO 03/015711公开的相关PCT专利申请PCT/US02/26468中已对该类进行描述。
发明概述
已发现在某些核苷酸间选择性包含有一个或多个非稳定性键的特异C类CpG寡核苷酸的免疫刺激特性具有显著活性并特别用于过敏和哮喘的治疗。非稳定键优选地为天然键，即磷酸二酯键或磷酸二酯样键。非稳定键通常，但非必须，对核酸酶消化相对敏感。本发明的免疫刺激性寡核苷酸在5′C和邻近的3′G间至少包括一个非稳定键，其中5′C和3′G均为内部核苷酸。
本发明的免疫刺激性寡核苷酸对诱导Th1样免疫反应是有用的。因此，本发明的免疫刺激性寡核苷酸疫苗可用作疫苗佐剂，且其可用于对包括癌症、传染病、过敏和哮喘在内的疾病的治疗。认为它们对用于任何目的的需要延长或重复施用免疫刺激性寡核苷酸的任何病症是特别有用的，但对哮喘和如过敏性鼻炎的过敏症的治疗是特别有用的。
本发明部分涉及包含CpG的免疫刺激性寡核苷酸。本发明的一个方面为具有下式的寡核苷酸：5′TC_GX1C_G X2N1 X3C_GN2CG3′(SEQ ID NO：26)。寡核苷酸包含至少2个稳定的核苷酸间键。″_″代表磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键(phosphodiester-like internucleotide linkage)。N1为0-3个核苷酸长，N2为0-9个核苷酸长，其中N指任意核苷酸。X1、X2和X3为任意核苷酸。在一些实施方案中，X1、X2和X3为T。
在一些实施方案中，寡核苷酸可包含5′TC_GTC_GTN1TC_GGCGCN1GCCG 3′(SEQ ID NO：27)。在一个实施方案中，寡核苷酸可包含5′T*C_G*T*C_G*T*N1*T*C_G*G*C*G*CN1G*C*C*G 3′(SEQ ID NO：27)。在一些实施方案中，N1为3或2个核苷酸长。在其它实施方案中，N1为0个核苷酸长。
免疫刺激性寡核苷酸可包含5′T*C_G*T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*_G*C*G*C*C*G 3′(SEQ ID NO：2)，其中*代表稳定的核苷酸间键。任选地，当明确提到时，5′可指寡核苷酸的游离5’端，且3′可指寡核苷酸的游离3’端。
在其它实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸可包含5′T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3′(SEQ ID NO：3)，其中*代表稳定的核苷酸间键。任选地，在特定声明时，5′可指寡核苷酸的游离5’端，且3′可指寡核苷酸的游离3’端。
在另一方面，免疫刺激性寡核苷酸具有下式：TC_GX1C_GX2C_GX3TC_GGCGC_GN3 3’(SEQ ID NO：28)。
N3为1-5个核苷酸长，N指任意核苷酸。在一个实施方案中，N3为5个核苷酸。X1、X2和X3为任意核苷酸。在一些实施方案中，X1和X3为T。
在一个实施方案中，寡核苷酸可包含5′TC_GTC_GAC_GATC_GGCGC_GCGCCG 3’(SEQ ID NO：4)，其中寡核苷酸包括至少2个稳定的核苷酸间键，且_代表磷酸二酯或磷酸二酯样的核苷酸间键。在一个实施方案中，寡核苷酸可包含5′T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3′(SEQID NO：4)。任选地，在特定声明时，5′可指寡核苷酸的游离5’端，且3′可指寡核苷酸的游离3’端。
根据本发明的另一方面，提供的免疫刺激性寡核苷酸具有下式：5′TTC_GX2C_GN1X1_GX3C_GTT 3′(SEQ ID NO：24)。寡核苷酸包括至少2个稳定的核苷酸间键，且代表磷酸二酯或磷酸二酯样的核苷酸间键。N1为1-3个核苷酸长，N指任意核苷酸。X1为嘧啶。X2和X3为任意核苷酸。在一些实施方案中，X2和X3为T。
在一个实施方案中，寡核苷酸可包含5′TTC_GTC_GTTTX1_GTC_GTT 3’(SEQ ID NO：25)。在另一个实施方案中，寡核苷酸可包含5′T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*X1_G*T*C*_G*T*T3’(SEQ ID NO：25)。在一些实施方案中，X1为T或C。
寡核苷酸可包含5′T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T 3′(SEQ ID NO：5)，其中*代表稳定的核苷酸间键。任选地，在特定声明时，5′可指寡核苷酸的游离5’端，且3′可指寡核苷酸的游离3’端。
寡核苷酸可包含5′T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T3′(SEQ ID NO：6)，其中*代表稳定的核苷酸间键。任选地，在特定声明时，5′可指寡核苷酸的游离5’端，且3′可指寡核苷酸的游离3’端。
在本发明的一些方面中，寡核苷酸具有下式之一：TCGTCGTTCGGCGCGCCG(SEQ ID NO：3)、TCGTCGTCGTTCGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO：2)、TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO：4)、TTCGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：5)或TTTCGTCGTTTCGTCGTT(SEQ ID NO：6)。
在本发明的其它方面中，寡核苷酸具有下式之一：TCGTCGTC、CGTCGTCG、GTCGTCGT、TCGTCGTT、CGTCGTTC、GTCGTTCG、TCGTTCGG、CGTTCGGC、GTTCGGCG、TTCGGCGC、TCGGCGCG、CGGCGCGC、GGCGCGCG、GCGCGCGC、CGCGCGCC或GCGCGCCG。
在本发明的其它方面中，寡核苷酸具有下式之一：T*C_G*T*C_G*T*C、C_G*T*C_G*T*C_G、G*T*C_G*T*C_G*T、T*C_G*T*C_G*T*T、C_G*T*C_G*T*T*C、G*T*C_G*T*T*C_G、T*C_G*T*T*C_G*G、C_G*T*T*C_G*G*C、G*T*T*C_G*G*C*G、T*T*C_G*G*C*G*C、T*C_G*G*C*G*C_G、C_G*G*C*G*C_G*C、G*G*C*G*C_G*C*G、G*C*G*C_G*C*G*C、C*G*C_G*C*G*C*C或G*C_G*C*G*C*C*G。
在本发明的其它方面中，提供一种包含T*C_G*T*C_G*T*C的寡核苷酸，其中*代表稳定的核苷酸间键，且代表磷酸二酯或磷酸二酯样的核苷酸间键。任选地，寡核苷酸可为5′T*C-G*T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C 3′(SEQ IDNO：21)、5′T*C-G*T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C 3′(SEQ ID NO：22)或5′T*C-G*T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C_G*C*G*C 3′(SEQID NO：23)，其中，5′指寡核苷酸的游离5’端，且3′指寡核苷酸的游离3’端。
在其它方面，提供包含T*C_G*T*T*C_G*G的寡核苷酸，其中*代表稳定的核苷酸间键，且_代表磷酸二酯或磷酸二酯样的核苷酸间键。任选地，寡核苷酸可为5′C-G*T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3′(SEQ IDNO：15)、5′G*T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3′(SEQ ID NO：16)、5′T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3′(SEQ ID NO：17)、5′C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3′(SEQ IDNO：18)、5′G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3′(SEQ IDNO：19)或5′T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3′(SEQ IDNO：20)，其中，5′指寡核苷酸的游离5’端，且3′指寡核苷酸的游离3’端。
提供了包含本发明寡核苷酸和可药用载体的药物组合物。
在一些实施方案中，组合物制剂于雾化器或吸入器中。吸入器可为定量剂量吸入器。可选地，吸入器为粉末吸入器。
在其它实施方案中，药物组合物可包括化疗剂。又在其它实施方案中，组合物可包括抗病毒剂。
药物组合物可任选地包括制剂为用于皮下给药、经口给药或鼻内给药的可药用载体。
在一个实施方案中，寡核苷酸存在于任选地包含可药用载体的药物组合物中。在一些实施方案中，寡核苷酸可制剂为气雾剂。
在一个实施方案中，寡核苷酸进一步包含佐剂或细胞因子。
在一个实施方案中，寡核苷酸进一步包含抗原，其中寡核苷酸为疫苗佐剂。
在一个实施方案中，抗原选自于病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原和肿瘤抗原。在一个实施方案中，抗原由核酸载体编码。在一个实施方案中，抗原为肽抗原。在一个实施方案中，抗原共价连接至寡核苷酸或免疫刺激核酸分子。在另一个实施方案中，抗原不共价连接至寡核苷酸或免疫刺激核酸分子。
在一个实施方案中，磷酸二酯或磷酸二酯样键为磷酸二酯。在一个实施方案中，磷酸二酯样键为硼烷磷酸酯(boranophosphonate)或非对映异构体纯的Rp硫代磷酸酯。
在一个实施方案中，稳定的骨架包含选自于硫代硫酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸甲酯、硫代磷酸甲酯和其任意组合的多个核苷酸间键。在一个实施方案中，稳定的骨架包含多个硫代硫酸酯核苷酸间键。
在一个实施方案中，免疫刺激核酸分子为4-100个核苷酸长。
在其它方面，本发明为一种通过对患有或处于患有哮喘危险的受试者施用治疗哮喘有效量的本发明寡核苷酸而治疗哮喘的方法。
而在其它方面，本发明为一种通过对患有或处于患有过敏危险的受试者施用治疗过敏有效量的本发明寡核苷酸而治疗过敏的方法。在一个实施方案中，受试者患有过敏性鼻炎。在一个实施方案中，在粘膜表面施用寡核苷酸。在其它实施方案中，以气雾剂剂型施用寡核苷酸。任选地，鼻内施用寡核苷酸。
根据本发明的另一方面，提供一种用于诱导产生细胞因子的方法。通过对受试者施用诱导选自IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、TNF、IFN-α、趋化因子和IFN-γ的细胞因子有效量的此处所述的免疫刺激性CpG寡核苷酸实施该方法。
在另一方面，本发明提供一种此处所述的CpG免疫刺激性寡核苷酸与抗原或其它治疗性化合物如抗微生物剂组合的组合物。例如，抗微生物剂可为抗病毒剂、抗寄生虫剂、抗细菌剂或抗真菌剂。
根据本发明的另一方面，提供一种包括此处所述的CpG免疫刺激性寡核苷酸的持续释放装置的组合物。
组合物任选地可包括药用载体和/或制剂在递送装置中。在一些实施方案中，递送装置选自于阳离子脂类、细胞渗透蛋白质和持续释放装置。在一个实施方案中，持续释放装置为生物可降解聚合物或微粒。
根据本发明的另一方面，提供一种刺激免疫反应的方法。该方法包括对受试者施用能在受试者体内诱导免疫反应剂量的CpG免疫刺激性寡核苷酸。优选地，经口、局部、持续释放装置、粘膜、全身、肠胃外或肌内施用CpG免疫刺激性寡核苷酸。当在粘膜表面施用CpG免疫刺激性寡核苷酸时，施用剂量为有效地诱导粘膜免疫反应或全身免疫反应的剂量。在优选的实施方案中，粘膜表面选自于口、鼻、直肠、阴道和眼睛表面。
在一些实施方案中，本方法包括将受试者暴露于抗原，其中免疫反应是抗原特异性免疫反应。在一些实施方案中，抗原选自于癌症抗原、病毒抗原、细菌抗原、寄生性抗原和肽抗原。
CpG免疫刺激性寡核苷酸能激发广谱免疫反应。例如，这些CpG免疫刺激性寡核苷酸可用于将Th2转向为Th1免疫反应。CpG免疫刺激性寡核苷酸也可用于激活免疫细胞，如淋巴细胞(例如B细胞和T细胞)、树突细胞和NK细胞。可以在体内、体外或间接体内(ex vivo)进行激活，其中所述间接体内即通过从受试者分离免疫细胞，用有效量CpG免疫刺激性寡核苷酸接触免疫细胞而激活免疫细胞，然后再将经激活的免疫细胞回施于受试者。在一些实施方案中，树突细胞呈递癌症抗原。树突细胞可通过间接体内方式暴露于癌症抗原。
由CpG免疫刺激性寡核苷酸产生的免疫反应也可导致产生细胞因子，例如产生IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、TNF、FN-α、趋化因子和IFN-γ。
还在另一实施方案中，CpG免疫刺激性寡核苷酸用于治疗癌症。根据本发明的其它方面，CpG免疫刺激性寡核苷酸也用于处于患癌危险的受试者的癌预防(例如降低患癌危险)。癌选自于胆道癌、乳癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、上皮内瘤、淋巴瘤、肝癌、肺癌(例如小细胞和非小细胞)、黑素瘤、成神经细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肉瘤、甲状腺癌和肾癌，以及其它癌和肉瘤。在一些至关重要的实施方案中，癌选自于骨癌、脑与CNS癌、结缔组织癌、食管癌、眼癌、何杰金氏淋巴瘤、喉癌、口腔癌、皮肤癌和睾丸癌。
CpG免疫刺激性寡核苷酸也可用于增加癌细胞对癌治疗(例如抗癌治疗)的反应性，任选地是在CpG免疫刺激性寡核苷酸与抗癌治疗共同施用时。抗癌治疗可为化疗、疫苗(如体外接触过抗原的树突细胞疫苗或癌抗原疫苗)或基于抗体的治疗。后一种治疗也可包括施用对细胞表面抗原如癌细胞特异的抗体，其中免疫反应导致抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。在一个实施方案中，抗体选自于Ributaxin、Herceptin、Quadramet、Panorex、IDEC-Y2B8、BEC2、C225、Oncolym、SMART M195、ATRAGEN、Ovarex、Bexxar、LDP-03、ior t6、MDX-210、MDX-11、MDX-22、OV103、3622W94、抗-VEGF、Zenapax、MDX-220、MDX-447、MELIMMUNE-2、MELIMMUNE-I、CEACIDE、Pretarget、NovoMAb-G2、TNT、Gliomab-H、GNI-250、EMD-72000、LymphoCide、CMA 676、Monopharm-C、4B5、ior egf.r3、ior c5、BABS、抗-FLK-2、MDX-260、ANA Ab、SMART IDlO Ab、SMART ABL 364 Ab和ImmuRAIT-CEA。
因此，根据本发明的一些方面，对患癌或处于患癌危险的受试者施用CpG免疫刺激性寡核苷酸和抗癌治疗。在一些实施方案中，抗癌治疗选自于化疗剂、免疫治疗剂和癌疫苗。在一些实施方案中，抗癌药为紫杉酚(taxol)或卡铂与紫杉醇(paclitaxel)的组合。
还在预防或治疗癌方法的另一实施方案中，可进一步对受试者施用干扰素-α。
在其它方面，本发明涉及在受试者中预防疾病的方法。该方法包括对受试者定期施用CpG免疫刺激性寡核苷酸以促进免疫系统的反应性来预防在受试者中的疾病。应用本发明的预防方法预防疾病或病症的例子包括微生物传染(如性交传染病)和源自于食物过敏的过敏性休克。
在其它方面，本发明提供一种通过对受试者施用有效激活先天免疫反应剂量的CpG免疫刺激性寡核苷酸的用于诱导先天免疫反应的方法。
根据本发明的另一方面，提供一种用于治疗或预防病毒或逆转录病毒传染的方法。该方法包括对患有或处于患有病毒或逆转录病毒传染危险的受试者施用对治疗或预防病毒或逆转录病毒传染有效剂量的本发明的任意组合物。在一些实施方案中，病毒病由肝炎病毒(如乙型肝炎、丙型肝炎)、HIV、疱疹病毒或乳头状瘤病毒引起。
根据本发明的另一方面，提供一种用于治疗或预防细菌感染的方法。该方法包括对患有或处于患有细菌感染危险的受试者施用足以治疗或预防细菌感染剂量的本发明的任意组合物。在一个实施方案中，细菌感染是因为胞内细菌引起。
在另一方面，本发明提供一种通过对患有或处于患有寄生虫感染危险的受试者施用有效治疗或预防寄生虫感染剂量的本发明的任意组合物而用于治疗或预防寄生虫感染的方法。在一个实施方案中，寄生虫感染是因为胞内寄生虫。在另一个实施方案中，寄生虫感染是因为非肠道寄生虫。
在一些实施方案中，受试者为人，且在其它实施方案中，受试者为选自于狗、猫、马、奶牛、猪、火鸡、山羊、鱼、猴、小鸡、大鼠、小鼠和绵羊的非人脊椎动物。
在另一方面，本发明涉及一种通过对受试者施用有效诱导TH1免疫反应剂量的本发明的任意组合物而用于诱导TH1免疫反应的方法。
在另一方面，本发明涉及一种通过对患有或处于患有自身免疫性疾病危险的受试者施用有效治疗或预防自身免疫性疾病剂量的本发明的任意组合物而用于治疗自身免疫性疾病的方法。
在其它实施方案中，对受试者递送诱导细胞因子表达的有效量的寡核苷酸。任选地，细胞因子选自于IL-6、TNFα、IFNα、IFNγ和IP-10。在其它实施方案中，对受试者递送有效量使免疫反应从偏向Th2的反应转成偏向Th1的反应的寡核苷酸。
在一些方面，本发明为一种用于治疗呼吸道重塑(airway remodeling)的方法，包括：对受试者施用有效治疗受试者的呼吸道重塑剂量的包含CG二核苷酸的寡核苷酸。在一个实施方案中，受试者患有哮喘、慢性阻塞性肺疾病或为吸烟者。在其它实施方案中，受试者无哮喘症状。
本发明一方面也提供本发明寡核苷酸的用途，用于刺激免疫反应。
也提供了本发明寡核苷酸的用途，用于制备刺激免疫反应的药物并实施本发明的任一方法。
本发明的每个限制包含本发明的多种实施方案。因此，可预期本发明的每个方面包括包含任意一个成分或成分组合的本发明的每个限制。
附图简述
图1为一系列描述由经过CpG ODN处理的人PBMC诱导IFN-α的图。
图2为一系列描述对豚鼠施用(A)1mg/kg剂量和(B)(0.03～0.3mg/kg)剂量的CpG寡脱氧核苷酸SEQ ID NO：7抗抗原诱导的鼻阻力(nasalresistance)增加的图。结果为均值±s.e.m.((A)＝n＝5-8；(B)＝n＝14-15)。与使用试验载体(test vehicle)处理的受抗原攻击组比较，*P＜0.05(t检验)。
图3为一系列描述在过敏性鼻炎小鼠模型中CpG寡脱氧核苷酸SEQ IDNO：7对抗原诱导的打喷嚏(3A)和挠鼻(3B)作用的图。结果为均值±s.e.m.(n＝10)。与使用载体处理组比较，*P＜0.05(Mann-Whitney检验)。
图4为描述流感病毒滴定量与确定感染时程的图。计数支气管肺泡灌洗液中的细胞数。结果为均值±s.e.m.(n＝5)。以500 EID50感染的小鼠由于体重下降而在6天后处死。
图5为描述CpG ODN对在肺部病毒载量(virus load)的保护效应图。通过酶免疫分析病毒载量。结果为均值±s.e.m.(n＝5-10)。与B组比较，*P＜0.05，n.d.＝无数据(Kruskal-Wallis检验，Dunn′s post-test)。
图6为一系列通过测定总白细胞(6A)、总嗜中性粒细胞(6B)和总单核细胞(6C)描述CpG ODN对病毒诱发的呼吸道炎症保护效应的图。计数支气管肺泡灌洗液中的细胞。结果为均值±s.e.m.(n＝10)。与B组比较，*P＜0.05(Kruskal-Wallis检验，Dunn′s post-test)。
图7为一系列描述CpG ODN对抗原诱发的呼吸道炎症中嗜酸性粒细胞(7A)和嗜中性粒细胞(7B)细胞数量保护效应的图。结果为均值±s.e.m.(n＝10-14)。与抗原攻击后使用载体处理的组比较，*P＜0.05(Kruskal-Wallis多重比较检验，Dunn′s post test)。
图8为一系列描述CpG ODN对抗原诱发的呼吸道炎症中CD3+(8A)和CD3+CD4+(8B)细胞数量保护效应的图。结果为均值±s.e.m.(n＝8)。与抗原攻击的使用载体处理组比较，*P＜0.05(Kruskal-Wallis多重比较检验，Dunn′s post test)。
图9为一系列描述施用0.1mg/kg ODN后8小时(9A)、施用0.1mg/kgODN后15小时(9B)、施用1mg/kg ODN后8小时(9C)和施用1mg/kg ODN后15小时(9D)在支气管肺泡灌洗液中细胞数量的图。结果为均值±s.e.m(n＝10)。
图10为一系列描述施用0.1mg/kg ODN后8小时(10A)、施用0.1mg/kgODN后15小时(10B)、施用1mg/kg ODN后8小时(10C)和施用1mg/kgODN后15小时(10D)在支气管肺泡灌洗液中IFN-α浓度图。
图11为一系列描述施用0.1mg/kg ODN后8小时(11A)、施用0.1mg/kgODN后15小时(11B)、施用1mg/kg ODN后8小时(11C)和施用1mg/kgODN后15小时(11D)在支气管肺泡灌洗液中IFN-γ浓度的图。
图12为一系列描述施用0.1mg/kg ODN后8小时(12A)、施用0.1mg/kgODN后15小时(12B)、施用1mg/kg ODN后8小时(12C)和施用1mg/kgODN后15小时(12D)在支气管肺泡灌洗液中IP-10浓度的图。
图13为一系列描述施用0.1mg/kg ODN后8小时(13A)、施用0.1mg/kgODN后15小时(13B)、施用1mg/kg ODN后8小时(13C)和施用1mg/kgODN后15小时(13D)在支气管肺泡灌洗液中IL-12p40浓度的图。
图14为一系列描述施用0.1mg/kg ODN后8小时(14A)、施用0.1mg/kgODN后15小时(14B)、施用1mg/kg ODN后8小时(14C)和施用1mg/kgODN后15小时(14D)在支气管肺泡灌洗液中IL-6浓度的图。
图15为一系列描述施用0.1mg/kg ODN后8小时(15A)、施用0.1mg/kgODN后15小时(15B)、施用1mg/kg ODN后8小时(15C)和施用1mg/kgODN后15小时(15D)在支气管肺泡灌洗液中TNF-α浓度的图。
图16为一系列描述施用0.1mg/kg ODN后8小时(16A)、施用0.1mg/kgODN后15小时(16B)、施用1mg/kg ODN后8小时(16C)和施用1mg/kgODN后15小时(16D)在血清中IFN-γ浓度的图。
图17为一系列描述施用0.1mg/kgODN后8小时(17A)、施用0.1mg/kgODN后15小时(17B)、施用1mg/kg ODN后8小时(17C)和施用1mg/kgODN后15小时(17D)在血清中IL-6浓度的图。
图18为一系列描述施用0.1mg/kg ODN后8小时(18A)、施用0.1mg/kgODN后15小时(18B)、施用1mg/kg ODN后8小时(18C)和施用1mg/kgODN后15小时(18D)在血清中TNF-α浓度的图。
图19为一系列描述小鼠中ODN SEQ ID NO：2和ODN CpG寡脱氧核苷酸SEQ ID NO：7对抗原诱导的产生IgE(19A)和IgG2a(19B)的作用的图。结果为均值±s.e.m.(n＝10)。与抗原致敏后使用载体处理组比较，*P＜0.05(使用Dunn′s post test的Kruskal-Wallis test)。
图20为一系列描述在小鼠中ODN SEQ ID NO：2抗流感诱导的过敏性呼吸道炎症恶化作用、描述总白细胞(20A)、嗜酸性粒细胞(20B)、嗜中性粒细胞(20C)、单核细胞(20D)和体重(20E)的图。
图21为此处所用的豚鼠AHR方案。
图22为一组描述SEQ ID NO：7对呼吸道阻力(airway resistance)与肺顺应性(lung compliance)作用的图。对于每个动物，得到剂量反应曲线，且呼吸道反应性的量为曲线下的面积。对豚鼠在鼻内施用载体(盐水)、只有OVA、或浓度为10μl/kg、30μl/kg、100μl/kg或300μl/kg，i.t的SEQ IDNO：7。数据显示出SEQ ID NO：7在AUC阻力(AUC-resistance)中引起剂量依赖降低。图22A和22B描述组胺释放与呼吸道阻力增加(22A)或肺顺应性降低(22B)的函数。图22C和22D以柱形图描述使用盐水、OVA或指定剂量的SEQ ID NO：7处理后呼吸道阻力增加(22C)或肺顺应性降低(22D)。
图23为此处(图22)用于呼吸道阻力(23A)和肺顺应性(23B)的统计分析概述。
图24为一组描述SEQ ID NO：2对呼吸道阻力和肺顺应性的作用的图。对于每个动物，得到剂量反应曲线，且呼吸道反应性的量为曲线下的面积。对豚鼠在鼻内施用载体(盐水)、只有OVA、或浓度为10μl/kg、30μl/kg、100μl/kg或300μl/kg，i.t.的SEQ ID NO：2。数据显示出SEQ ID NO：2在AUC阻力中引起剂量依赖降低。图24A和24B描述组胺释放与呼吸道阻力增加(24A)或肺顺应性降低(24B)的函数。图24C和24D以柱形图描述使用盐水、OVA或指定剂量的SEQ ID NO：2处理后呼吸道阻力增加(24C)或肺顺应性降低(24D)。
图25为此处(图24)用于呼吸道阻力(25A)和肺顺应性(25B)的统计分析概述。
图26为图22和24中的图形概述。图26A和26B对应图22C和22D。图26C和26D对应图24C和24D。
图27为一组描述将人PBMC(3个供体)接触图中X轴底部所列SEQ IDNO：的寡核苷酸48小时后，从这些细胞中分泌出的IL-10(pg/ml)水平的图(来自三个供体的数据点用▲、■和×表示)。图27中所示测试寡核苷酸包括SEQ ID NO：10、9、13、14、1和2。沿X轴分布的特定数据点为使用的寡核苷酸浓度(μM)。收集上清，并用ELISA测定IL-10。给出了所有供体的细胞因子均值。
图28为一组描述将人PBMC接触图中所列寡核苷酸的SEQ ID NO：后分泌出TNF-α(28 A)、干扰素-γ(28B)和IL-6(28C)(μM)的图。每个数据点为三个供体的细胞因子均值。用指定浓度的ODN孵育PBMC。收集上清液，并用ELISA测定细胞因子。给出了所有供体的细胞因子均值。
图29为一组描述将人PBMC接触图中X轴底部所列SEQ ID NO：的寡核苷酸16小时后分泌出TNF-α(pg/ml)水平的图。图29中所示寡核苷酸包括SEQ ID NO：9、13、10、14、2、1、11、12和3。沿X轴分布的特定数据点为使用的寡核苷酸浓度(μM)。所示数据代表三个供体值。SEQ ID NO：下示出的是ODN的类别。Css＝C类半软，C＝C类，B＝B类，non-CpG＝无未甲基化CpG的ODN。收集上清液，并用ELISA测定IL-6。给出了所有供体的细胞因子均值。
图30为一组描述将人PBMC接触图中X轴底部所列SEQ ID NO：的寡核苷酸24小时后分泌出IL-6(pg/ml)水平的图。图30所示寡核苷酸包括SEQID NO：9、13、10、14、2、1、11、12和3。沿X轴分布的特定数据点为使用的寡核苷酸浓度(μM)。所示数据代表三个供体值。SEQ ID NO：下示出的是ODN的类别。Css＝C类半软，C＝C类，B＝B类，non-CpG＝无未甲基化CpG的ODN。
图31为一组描述将人PBMC接触图中X轴底部所列SEQ ID NO：的寡核苷酸48小时后分泌出IFN-γ(pg/ml)水平的图。图31所示寡核苷酸包括SEQ ID NO：9、13、10、14、2、1、11、12和3。沿X轴分布的特定数据点为使用的寡核苷酸浓度(μM)。所示数据代表三个供体值。SEQ ID NO：下示出的是ODN的类别。Css＝C类半软，C＝C类，B＝B类，non-CpG＝无未甲基化CpG的ODN。收集上清液，并用ELISA测定IFN-γ。给出了所有供体的细胞因子均值。
图32为一组描述NK细胞或B细胞接触图中所列SEQ ID NO：的寡核苷酸24小时或48小时后，NK细胞上表达的作为NK细胞活化指标的CD69的水平(MFI)(32A)及B细胞上表达的CD80(32B)和CD86(32C)的水平的图。每个数据点为三个供体的平均荧光强度。使用指定的ODN浓度孵育细胞24小时或48小时。对细胞染色，并通过流式细胞仪分析。
图33为一组描述NK细胞接触图中X轴底部所列SEQ ID NO：的寡核苷酸24小时后，NK细胞上表达的作为NK细胞活化指标的CD69的水平的图。图33所示寡核苷酸包括SEQ ID NO：9、13、10、14、2、1、11、12和3。沿X轴分布的特定数据点为使用的寡核苷酸浓度(μM)。所示数据代表三个供体值。SEQ ID NO：下示出的是ODN的类别。Css＝C类半软，C＝C类，B＝B类，non-CpG＝无未甲基化CpG的ODN。以针对CD3、CD56和CD69的抗体染色细胞，并通过流式细胞仪分析。所示数据为平均荧光强度。
图34为一组描述在人PBMC接触图中X轴底部所列SEQ ID NO：的寡核苷酸48小时后这些细胞上表达的CD86的图。图34所示寡核苷酸包括SEQID NO：9、13、10、14、2、1、11、12和3。沿X轴分布的特定数据点为使用的寡核苷酸浓度(μM)。所示数据代表三个供体值。SEQ ID NO：下示出的是ODN的类别。Css＝C类半软，C＝C类，B＝B类，non-CpG＝无未甲基化CpG的ODN。以针对CD86、CD80、CD19和CD14的抗体染色细胞，并通过流式细胞仪分析。所示数据为平均荧光强度。
图35为一组描述在人PBMC接触图中X轴底部所列SEQ ID NO：的寡核苷酸48小时后这些细胞上表达的CD86的图。图35所示寡核苷酸包括SEQID NO：9、13、10、14、2、1、11、12和3。沿X轴分布的特定数据点为使用的寡核苷酸浓度(μM)。所示数据代表三个供体值。SEQ ID NO：下示出的是ODN的类别。Css＝C类半软，C＝C类，B＝B类，non-CpG＝无未甲基化CpG的ODN。以抗体染色细胞CD86、CD80、CD19和CD14，并通过流式细胞仪分析。所示数据为平均荧光强度。
图36为一组描述浆细胞样树突细胞和单核细胞与图中所列SEQ IDNO：的寡核苷酸接触后在浆细胞样树突细胞上表达CD86水平(36A)和单核细胞上表达CD80水平(36B)及CD86水平(36C)的图。每个数据点为三个供体的平均荧光强度。以指定浓度的ODN孵育细胞48小时。对细胞染色，并通过流式细胞仪分析。
图37为一组描述单核细胞与图中X轴底部所列SEQ ID NO：的寡核苷酸接触48小时后在这些细胞上表达CD86的水平图。图37中所示寡核苷酸包括SEQ ID NO：9、13、10、14、2、1、11、12和3。沿X轴分布的特定数据点为使用的寡核苷酸浓度(μM)。所示数据代表三个供体值。SEQ ID NO：下示出的是ODN的类别。Css＝C类半软，C＝C类，B＝B类，non-CpG＝无未甲基化CpG的ODN。以针对CD86、CD80、CD19和CD14的抗体染色细胞，并通过流式细胞仪分析。所示数据为平均荧光强度。
图38为一组描述单核细胞与图中X轴底部所列SEQ ID NO：的寡核苷酸接触48小时后在这些细胞上表达CD80的图。图38所示寡核苷酸包括SEQID NO：9、13、10、14、2、1、11、12和3。沿X轴分布的特定数据点为使用的寡核苷酸浓度(μM)。所示数据代表三个供体值。SEQ ID NO：下示出的是ODN的类别。Css＝C类半软，C＝C类，B＝B类，non-CpG＝无未甲基化CpG的ODN。以针对CD86、CD80、CD19和CD14的抗体染色细胞，并通过流式细胞仪分析。所示数据为平均荧光强度。
图39为一组描述浆细胞样树突细胞与图中X轴底部所列SEQ ID NO：的寡核苷酸接触48小时后在这些细胞上表达CD80的图。图37中所示寡核苷酸包括SEQ ID NO：9、13、10、14、2、1、11、12和3。沿X轴分布的特定数据点为使用的寡核苷酸浓度(μM)。所示数据代表三个供体值。SEQ IDNO：下示出的是ODN的类别。Css＝C类半软，C＝C类，B＝B类，non-CpG＝无未甲基化CpG的ODN。以针对CD86、CD11c、CD123和HLA-DR的抗体染色细胞，并通过流式细胞仪分析。所示数据为平均荧光强度。
图40为一组描述B细胞和单核细胞与图中所列SEQ ID NO：的寡核苷酸接触24小时后在B细胞中表达细胞内IP-10水平(40B)和在单核细胞中表达细胞内IP-10水平(40A)的图。每个数据点为三个供体的平均荧光强度。以指定浓度的ODN孵育细胞24小时。对细胞染色，并通过流式细胞仪分析。
图41为一组描述单核细胞与图中X轴底部所列SEQ ID NO：的寡核苷酸接触24小时后，在这些细胞内表达的细胞内IP-10的水平图。图41中所示寡核苷酸包括SEQ ID NO：9、13、10、14、2、1、11、12和3。沿X轴分布的特定数据点为使用的寡核苷酸浓度(μM)。所示数据代表三个供体值。SEQ ID NO：下示出的是ODN的类别。Css＝C类半软，C＝C类，B＝B类，non-CpG＝无未甲基化CpG的ODN。以针对CD14、CD19和IP-10的抗体染色细胞，并通过流式细胞仪分析。所示数据为平均荧光强度。
图42为一组描述B细胞与图中X轴底部所列SEQ ID NO：的寡核苷酸接触24小时后，在这些细胞内表达的细胞内IP-10的水平图。图42中所示寡核苷酸包括SEQ ID NO：9、13、10、14、2、1、11、12和3。沿X轴分布的特定数据点为使用的寡核苷酸浓度(μM)。所示数据代表三个供体值。SEQID NO：下示出的是ODN的类别。Css＝C类半软，C＝C类，B＝B类，non-CpG＝无未甲基化CpG的ODN。以针对CD14、CD19和IP-10的抗体染色细胞，并通过流式细胞仪分析。所示数据为平均荧光强度。
图43为一组描述SEQ ID NO：2及其片段(SEQ ID NO：15-17)诱导小鼠脾细胞分泌细胞因子能力的比较图。分析的细胞因子包括IFNα(43A)、IFNγ(43B)、IP-10(43C)、IL-6(43D)、IL-10(43E)和TNFα(43F)。
图44为一组描述SEQ ID NO：2及其片段(SEQ ID NO：18-20)诱导小鼠脾细胞分泌细胞因子能力的比较图。分析的细胞因子包括IFNα(44A)、IFNγ(44B)、IP-10(44C)、IL-6(44D)、IL-10(44E)和TNFα(44F)。
图45为一组描述SEQ ID NO：2及其片段(SEQ ID NO：21-23)诱导小鼠脾细胞分泌细胞因子能力的比较图。分析的细胞因子包括IFNα(45A)、IFNγ(45B)、IP-10(45C)、IL-6(45D)、IL-10(45E)和TNFα(45F)。
发明详述
根据本发明，提供了C类半软免疫刺激性寡核苷酸子集。在一些实施方案中，此处所描述的本发明的免疫刺激性寡核苷酸具有改进的特性，包括具有相似或增强的潜能、降低系统暴露于肾、肝和脾，并在注射部位具有降低的反应原性。尽管申请者不受机制约束，但相信这些改进的特性与磷酸二酯或磷酸二酯样的“核苷酸间键”的免疫刺激性寡核苷酸的战略位置相关。此处所用的术语“核苷酸间键”是指核酸分子中连接两个邻近核苷的共价骨架键。共价骨架键一般是经修饰或未经修饰的磷酸键，但也可能是其它修饰。因此，n个核苷酸长的线性寡核苷酸共具有n-1个核苷酸间键。根据本发明的教导，在免疫刺激性寡核苷酸中可对这些共价骨架键进行修饰或不修饰。
特别地，磷酸二酯或磷酸二酯样的核苷酸间键包括“内二核苷酸(internal dinucleotides)”。内二核苷酸一般指由核苷酸间键连接的任意邻近核苷酸对，在核苷酸对中，两个核苷酸都不是末端核苷酸，即核苷酸对中，没有核苷酸是定义为寡核苷酸的5′或3′末端的核苷酸。因此，n个核苷酸长的线性寡核苷酸共具有n-1个二核苷酸，且仅有n-3个内二核苷酸。内二核苷酸中每个核苷酸间键都是内核苷酸间键。因此n个核苷酸长的线性寡核苷酸共有n-1个核苷酸间键，且仅有n-3个内核苷酸间键。因此，处于战略位置的磷酸二酯或磷酸二酯样的核苷酸间键是指位于核苷酸序列中任意一对核苷酸间的磷酸二酯或磷酸二酯样的核苷酸间键。在一些实施方案中，磷酸二酯或磷酸二酯样的核苷酸间键不处于最靠近5′或3′末端的任意核苷酸对。
本发明至少在一些方面是基于此处所述的特异C类半软寡核苷酸具有重要的免疫刺激活性且优选地用于治疗过敏与哮喘这一惊人发现。这些分子与相应的具有相同核苷酸序列的完全稳定的免疫刺激性寡核苷酸相比，至少具有相同的或在许多实例中具有更高免疫刺激活性。
半软寡核苷酸为具有部分稳定骨架的免疫刺激性寡核苷酸，其中，磷酸二酯或磷酸二酯样的核苷酸间键只在至少一个内二核苷酸嘧啶-嘌呤(YZ，优选地为CG)内存在。半软寡核苷酸相对于相应的完全稳定的免疫刺激性寡核苷酸而言，通常具有增强的免疫刺激潜能。由于半软寡核苷酸的较大潜能，因此，为达到目的生物学效应，半软寡核苷酸与传统的完全稳定的免疫刺激性寡核苷酸相比，可使用较低的有效浓度和较低的有效剂量。
尽管完全稳定的免疫刺激性寡核苷酸可表现出剂量反应的最大值，但本发明的半软寡核苷酸表现出剂量反应曲线单调增加(当通过TLR9刺激分析时)，超过相应的完全稳定的免疫刺激性寡核苷酸的最佳浓度。因此，认为本发明的半软寡核苷酸比完全稳定的免疫刺激性寡核苷酸可诱导更大的免疫刺激效应。
尽管长度少于20个核苷酸的完全稳定的免疫刺激性寡核苷酸与更长的(如24个核苷酸长)完全稳定的寡核苷酸比较，可具有适度的免疫刺激活性，但却发现16个核苷酸长的半软寡核苷酸具有的免疫刺激活性至少等于长度超过20个核苷酸的完全稳定的寡核苷酸的免疫刺激活性。
在一些情况下，发现虽然6-mer硫代磷酸酯寡核苷酸表现出缺乏免疫刺激活性，但即使用一个磷酸二酯内CG核苷酸间键替换硫代磷酸酯键也会产生相应的具免疫刺激活性的6-mer。
因此，免疫刺激性寡核苷酸的大小(即沿着寡核苷酸长度方向的核苷酸残基数)也影响寡核苷酸的刺激活性。为了易被细胞摄入，免疫刺激性寡核苷酸的最小长度为6个核苷酸残基。因为在细胞内降解更大的核苷酸，因此根据本发明，多于6个核苷酸的任意长度寡核苷酸(甚至几kb长)若存在足够的免疫刺激基序，能诱导免疫反应。本发明人确信，若4个核苷酸长的半软寡核苷酸能进入细胞，那么它们也具免疫刺激性。在本发明的一些优选实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸为4至100个核苷酸长。在一般实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸为6至40或10至40个核苷酸长。在一些优选的实施方案中，根据本发明，免疫刺激性寡核苷酸为6至19或6至24个核苷酸长。
也认为半软寡核苷酸的前述特性一般随参与内CG二核苷酸的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键“剂量(dose)”的增加而增加。因此认为，例如，一般对于给定的具有5个内CG二核苷酸的寡核苷酸序列，具有5个内磷酸二酯或磷酸二酯样CG核苷酸间键的寡核苷酸比具有4个内磷酸二酯或磷酸二酯样CG核苷酸间键的寡核苷酸具有更大的免疫刺激性，依次地，其比具有3个内磷酸二酯或磷酸二酯样CG核苷酸间键的寡核苷酸具有更大的免疫刺激性，依次地，其比具有2个内磷酸二酯或磷酸二酯样CG核苷酸间键的寡核苷酸具有更大的免疫刺激性，依次地，其比具有1个内磷酸二酯或磷酸二酯样CG核苷酸间键的寡核苷酸具有更大的免疫刺激性。重要的是，认为包含甚至一个内磷酸二酯或磷酸二酯样CG核苷酸间键的寡核苷酸比没有内磷酸二酯或磷酸二酯样CG核苷酸间键的寡核苷酸有利。除了磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键的数量以外，沿着寡核苷酸长度方向的位置也影响潜能。
本发明的免疫刺激性寡核苷酸在血清中一般免于快速降解。除了在具有特异的或过多的能降解免疫刺激性寡核苷酸的核酸酶活性的特定组织外，本发明的免疫刺激性寡核苷酸在大多数组织中一般也免于快速降解。这就致使在这些特定组织中减少了免疫刺激性寡核苷酸，否则，其积聚能导致源自于长期的利用降解抵抗寡核苷酸的治疗的不期望的作用。本发明的寡核苷酸通常除了包括在优选的内部位置的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键以外，还包括对降解有抵抗力的5′和3′末端。这种有抵抗力的末端包括与相应的未修饰的末端相比，致使对核酸外切酶消化的抵抗力增强的任意适当的修饰。例如，5′和3′末端可由骨架中至少包含一个磷酸修饰而稳定。在优选的实施方案中，骨架每个末端中至少一个磷酸修饰独立地为硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸甲酯或硫代磷酸甲酯核苷酸间键。在另一个实施方案中，抵抗降解的末端包括一个或多个由肽键或酰胺键在3′末端连接的核苷酸单位。然而本发明也包括其它稳定的末端，包括但不限于下面所述。
如上所述，本发明的寡核苷酸包括在内CG二核苷酸中的和任选地是与内CG二核苷酸接近的磷酸二酯或磷酸二酯样键。该CG二核苷酸通常是免疫刺激基序的部分。然而，在每个免疫刺激基序中包含磷酸二酯或磷酸二酯样键的寡核苷酸却不是必要的。为更快地肾消化这些在其它情况下“稳定的寡核苷酸”，也可保留额外的磷酸二酯或磷酸二酯样键。
磷酸二酯核苷酸间键是自然界中发现的核酸特征键。磷酸二酯核苷酸间键包括连接两个氧原子桥和两个额外氧原子的磷原子，其中在两个额外氧原子中，一个带电荷，另一个不带电荷。在降低寡核苷酸的组织半衰期重要时，磷酸二酯核苷酸间键是特别优选的。
磷酸二酯样的核苷酸间键为在化学上和/或在非对映异构体上与磷酸二酯相似的含磷的桥连基。与磷酸二酯相似性的测定包括核酸酶消化的易感性和激活RNA酶H的能力。因此，例如虽然磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸两者都激活RNA酶H，但仅磷酸二酯寡核苷酸易被核酸酶消化，而不是硫代磷酸酯。在优选的实施方案中，磷酸二酯样的核苷酸间键是硼烷磷酸酯(boranophosphate)(或等同硼烷磷酸酯(boranophosphonate))键。美国专利号5,177,198；美国专利号5,859,231；美国专利号6,160,109；美国专利号6,207,819；Sergueev等人，(1998)J Am Chem Soc 120：9417-27。在另一个优选的实施方案中，磷酸二酯样的核苷酸间键为非对映异构体纯Rp硫代磷酸酯。认为非对映异构体纯(diasteromerically pure)Rp硫代磷酸酯比混合的或非对映异构体纯Sp硫代磷酸酯更易被核酸酶消化，且能更好地激活RNA酶。应当指出，对于本发明，术语“磷酸二酯样的核苷酸间键”特别地不包括二硫代磷酸酯和磷酸甲酯核苷酸间键。
本发明的免疫刺激性寡核苷酸分子具有嵌合骨架。对于本发明的目的，嵌合骨架指部分稳定的骨架，其中至少一个核苷酸间键为磷酸二酯或磷酸二酯样的，且其中至少一个其它核苷酸间键是稳定的核苷酸间键，其中至少一个磷酸二酯或磷酸二酯样键和至少一个稳定的键是不同的。自从报道硼烷磷酸酯键相对于磷酸二酯键稳定后，为了骨架的嵌合特性的目的，可根据上下文将硼烷磷酸酯键归类为磷酸二酯样的键或稳定的键。例如在一个实施方案中，根据本发明的嵌合骨架包括至少一个磷酸二酯(磷酸二酯或磷酸二酯样)键和至少一个硼烷磷酸酯(稳定的)键。在另一实施方案中，根据本发明的嵌合骨架包括硼烷磷酸酯(磷酸二酯或磷酸二酯样)和硫代磷酸酯(稳定的)键。“稳定的核苷酸间键”是指与磷酸二酯核苷酸间键比较具有相对抵抗体内消化作用(如通过外切或内切核酸酶)的核苷酸间键。优选的稳定的核苷酸间键包括但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸甲酯和硫代磷酸甲酯。其它稳定的核苷酸间键包括但不限于肽、烷基、脱磷(dephospho)和如上所述的其它键。
经修饰的骨架，如硫代磷酸酯，可通过使用氨基磷酸酯或氢膦酸酯化学法的自动化技术进行合成。如在美国专利号4,469,863中所述制备芳基和烷基膦酸酯；且通过使用商业上可用试剂的自动化固相合成法制备烷基磷酸三酯(如在美国专利号5,023,243和欧洲专利号092,574中所述烷基化其带电荷氧)。已详述了用于制备其它DNA骨架修饰和取代的方法。UhlmannE等人，(1990)Chem Rev 90：544；Goodchild J(1990)Bioconjugate Chem1：165。也知道用于制备嵌合寡核苷酸的方法。例如在颁给Uhlmann等人的专利已经描述了该技术。
混合的骨架修饰的ODN可用商业可获得的DNA合成仪和标准亚磷酰胺化学法合成。(F.E.Eckstein，“寡核苷酸及类似物-实验方法”(Oligonucleotides and Analogues-A Practical Approach)，英国牛津IRL出版社(IRL Press，Oxford，UK)，1991，和M.D.Matteucci与M.H.Caruthers，Tetrahedron Lett.21，719(1980))。偶联后，通过用Beaucage试剂(R.P.Iyer，W.Egan，J.B.Regan和S.L.Beaucage，J.Am.Chem.Soc.112，1253(1990))(在乙腈中为0.075M)或二硫化二苯乙酰(PADS)硫化后，以乙酸酐、2，6-二甲基吡啶、四氢呋喃(体积比1∶1∶8)和N-甲基咪唑(在四甲基呋喃中占16％)封端，而引入PS键。在硫化反应后进行封端步骤，以最小化不期望的磷酸二酯(PO)键形成于硫代磷酸酯键应形成的位置处。在引入如CpG二核苷酸的磷酸二酯键的情况时，使用水/吡啶的碘溶液处理而氧化中间体磷-III。从固相支持物上切割并最终用浓氨处理(50℃，15小时)去保护后，在Gen-Pak Fax柱上以NaCl梯度洗脱(缓冲液A：10mM NaH2PO4，在乙腈/水＝l∶4/v∶v中pH 6.8；缓冲液B：10mMNaH2PO4，1.5M NaCl，在乙腈/水＝1∶4/v∶v中；30分钟内B从5％升至60％，速度1ml/分钟)通过HPLC或毛细管凝胶电泳分析ODN。ODN可在SourceHigh Performance柱(Amersham Pharmacia)上通过HPLC或FPLC纯化。合并均一HPLC级分并通过C18柱或超滤脱盐。使用MALDI-TOF质谱仪分析ODN以确定分子量。
本发明的寡核苷酸也包括其它修饰。这些修饰包括非离子化DNA类似物，如磷酸烷基酯和磷酸芳基酯(其中，带电荷磷酸酯的氧由烷基或芳基取代)、磷酸二酯和烷基磷酸三酯，其中，带电荷的氧部分烷基化。含有二醇的寡核苷酸，如四甘醇或六甘醇，在一端或两端都对核酸酶消化作用具有相当高的抵抗。
本发明的寡核苷酸是包含具有引发免疫反应的特异序列的核酸。这些引发免疫反应的特异序列称为“免疫刺激基序”，且含有免疫刺激基序的寡核苷酸称为“免疫刺激核酸分子”，并且同样也称为“免疫刺激核酸”或“免疫刺激性寡核苷酸”。因此，本发明的免疫刺激性寡核苷酸包括至少一个免疫刺激基序。在优选的实施方案中，免疫刺激基序是“内免疫刺激基序”。术语“内免疫刺激基序”指基序序列在长核酸序列内的位置，所述长核酸序列长度比基序序列长至少一个连接到免疫刺激基序序列的5′和3′末端的核苷酸。
免疫刺激性寡核苷酸包括“CpG二核苷酸”的免疫刺激基序。CpG二核苷酸可甲基化或不甲基化。含有至少一个未甲基化的CpG二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸为含有未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列的核酸分子(即未甲基化的5′胞苷后为3′鸟苷，并由磷酸酯键连接)，且其激活免疫系统；该免疫刺激性寡核苷酸为CpG寡核苷酸。已在许多授权专利、公开的专利申请和其它出版物详述了CpG寡核苷酸，包括美国专利号6,194,388、6,207,646、6,214,806、6,218,371、6,239,116和6,339,068。含有至少一个甲基化的CpG二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸是包含甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列的寡核苷酸(即甲基化的5′胞苷后为3′鸟苷，并由磷酸酯键连接)，且其激活免疫系统。
最近已经对不同类的CpG寡核苷酸进行了描述。一个类可有效激活B细胞，但诱导IFN-α和NK细胞活性的能力相对较弱；已将该类定义为B类。B类CpG寡核苷酸通常是完全稳定的且在某些优选的碱基环境中包含未甲基化的CpG二核苷酸。例如见美国专利号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116和6,339,068。另一类有效地诱导IFN-α和NK细胞活性，但相对较弱地激活B细胞；已将该类定义为A类。A类CpG寡核苷酸一般在5′和3′端具有稳定的聚G序列和至少6个核苷的含有中央回文磷酸二酯CpG二核苷酸的序列。例如参见出版的专利申请PCT/US00/26527(WO01/22990)。
还有另一类CpG寡核苷酸激活B细胞和NK细胞，并诱导IFN-α；已将该类定义为C类。C类CpG寡核苷酸，正如首先表征的那样，通常是完全稳定的，包括B类型序列和富含GC的回文结构或近似回文结构。在2002年8月19日申请的共同待决的美国专利申请10/224,523(其以US2003/0148976公开)以及在2004年10月29日申请的US10/978,283、以WO2005/042018公开的相关PCT专利申请中已详述该类，此处引用全部内容作为参考。
C类寡核苷酸也称为C型CpG ODN。在一些实施方案中，C型CpGODN包括多种基序的组合，其中一种基序为富含CG的回文或中和基序，而另一基序为刺激基序，如CpG基序或TCGTCG序列。
C CpG ODN具有下式：5′X1DCGHX2 3′。X1和X2独立地为0至10个核苷酸长的任意序列。D为除C外的核苷酸。C为胞嘧啶。G为鸟嘌呤。H为除G外的核苷酸。核酸序列也包括选自于P和N的核酸序列，其中所述P和N的核酸序列紧邻X1的5′端或紧邻X2的3′端。N为B细胞中和序列，其以CGG三核苷酸起始，至少10个核苷酸长。P为含至少10个核苷酸长的序列的富含GC回文结构。
在一些实施方案中，免疫刺激核酸为5′NX1DCGHX2 3′、5′X1DCGHX2N 3′、5′PX1DCGHX2 3′、5′X1DCGHX2P 3′、5′X1DCGHX2PX33′、5′X1DCGHPX3 3′、5′DCGHX2PX3 3′、5′TCGHX2PX3 3′或5′DCGHPX3 3′。X3为0至10个核苷酸长的任意序列。在其它实施方案中，免疫刺激核酸为5′DCGHP 3′。
任选地，D和/或H为胸腺嘧啶(T)。
在其它实施方案中，H为T且X2为CG、CGT、CGTT、CGTTT或CGTTTT。
根据其它实施方案，H为T且X2为CG或CGTTTT。
根据其它实施方案，C为未甲基化的。
在一些实施方案中，N包括至少四个CG二核苷酸和不多于两个CCG三核苷酸。
任选地，P包括至少一个次黄苷。
核酸也包括5′端或3′端的聚T序列。
可选地，C CpG ODN可具有下式：5′N1PyGN2P 3′。G为鸟嘌呤。N1为1至6个核苷长的任意序列。在一些实施方案中，N1为至少50％的嘧啶，且优选地，至少50％T。在其它实施方案中，N1包括至少一个CG基序、至少一个TCG基序、至少一个CI基序、至少一个TCI基序、至少一个IG基序或至少一个TIG基序。在其它实施方案中，N1为TCGG或TCGH。H为除G外的其它核苷酸。
Py为嘧啶。在一些实施方案中，Py为未甲基化的C。
N2为0至30个核苷酸长的任意序列。在一些实施方案中，N2为至少50％嘧啶或至少50％T。在其它实施方案中，N2不包括任意聚G或聚A基序。
P为含至少10个核苷酸长的序列的富含GC回文结构。在一些实施方案中，P完全是回文的结构。在其它实施方案中，P为具有连续插入1至3个核苷酸的回文结构。任选地，插入的核苷酸为TG。在其它实施方案中，P包括至少3、4或5个C和至少3、4或5个G核苷酸。根据其它实施方案，P包括至少一个次黄苷。
在一个实施方案中，富含GC的回文结构具有至少三分之二G和C的碱基含量(base content)。在另一实施方案中，富含GC的回文结构具有至少81％的G和C的碱基含量。在一些实施方案中，富含GC的回文结构至少为12个核苷酸长。富含GC的回文结构可仅由C和G组成。在一些实施方案中，富含GC的回文结构可包括至少一个非C也非G的核苷酸。
在一些实施方案中，富含GC的回文结构包括至少一个CGG三聚体、至少一个CCG三聚体或至少一个CGCG四聚体。在一些实施方案中，富含GC的回文结构包括至少四个CG二核苷酸。在一些优选的实施方案中，富含GC的回文结构具有中央CG二核苷酸。
在一些实施方案中，富含GC的回文结构为CGGCGCGCGCCG(SEQID NO：58)、CGGCGGCCGCCG(SEQ ID NO：59)、CGACGATCGTCG(SEQ ID NO：60)或CGACGTACGTCG(SEQ ID NO：61)。
在一些实施方案中，富含GC的回文结构为CGCGCGCGCGCG(SEQID NO：62)、GCGCGCGCGCGC(SEQ ID NO：63)、CCCCCCGGGGGG(SEQ ID NO：64)、GGGGGGCCCCCC(SEQ ID NO：65)、CCCCCGGGGG(SEQ ID NO：66)或GGGGGCCCCC(SEQ ID NO：67)。
在一些实施方案中，N1PyGN2为选自于TTTTTCG、TCG、TTCG、TTTCG、TTTTCG、TCGT、TTCGT、TTTCGT和TCGTCGT的序列。
根据本发明的其它方面，提供了13-100个核苷酸长的免疫刺激核酸。核酸具有下式：5′N1PyG/IN2P 3′。G/I指G或I的单个核苷酸。G为鸟嘌呤，且I为次黄苷。
N1为1至6个核苷酸长的任意序列。Py为嘧啶。N2为0至30个核苷酸长的任意序列。
P为含至少10个核苷酸长的序列的回文结构。在一些实施方案中，P为富含GC的回文结构。在其它实施方案中，P为富含IC的回文结构。
在一些实施方案中，N1PyIN2为TCITCITTTT(SEQ ID NO：62)。
一类寡核苷酸，文中称为经修饰的C类寡核苷酸，在溶液中具有成单体的特性。认为这些核酸分子在体外能形成分子内双链体结构，致使它们稳定而抗核酸酶消化作用。也认为这些相同的核酸分子能形成分子间双链体结构，并在认为是其执行其生物活性的内体区室环境中可能形成更高级结构。
经修饰的C类寡核苷酸具有3种通式。式I
Z1[(X1Y1R1)N(X2Y2R2)kZ2]p(S1)qN′(Nn)...(N2)(N1)S2(N1#)(N2#)...(Nn#)Z3(式I)
其中Z1、Z2和Z3中每个都独立地为0至12个核苷酸长的任意序列，其任选地包括非核苷酸接头或无碱基间隔基(abasic dSpacer)；X1和X2中每个都独立地为胸苷、脱氧尿苷、脱氧腺苷或5-取代的脱氧尿苷；Y1和Y2中每个都独立地为胞嘧啶(C)或经修饰的胞嘧啶；R1和R2中每个都独立地为鸟嘌呤(G)或经修饰的鸟嘌呤；N和N′中每个都独立地为0至12个核苷酸长的任意序列，其任选地包括非核苷酸接头或无碱基间隔基；S1为非核苷酸接头、无碱基接头(dSpacers)、三甘醇单元或六甘醇单元，其任选地提供2′5′-、5′5′-、3′3′-、2′2′-或2′3′-核苷间键；S2为1至10个核苷酸长的任意非回文序列或非核苷酸接头、无碱基接头(dSpacers)、三甘醇单元或六甘醇单元；N1、N2、...Nn和N1#、N2#、...Nn#为任意核苷酸或经修饰核苷酸，其中N1与N1#碱基配对、N2与N2#碱基配对、...和Nn与Nn#碱基配对；k为0至5的整数；n为2至16的整数；p为1至6的整数；和q为0至10的整数，且其中当(Nn)...(N2)(N1)S2(N1#)(N2#)...(Nn#)为10至42个核苷酸长时，S2为4至10个核苷酸长，S2包含非核苷酸接头、无碱基接头(dSpacers)、三甘醇单元或六甘醇单元，和/或(Nn)...(N2)(N1)S2(N1#)(N2#)...(Nn#)含GC的量少于2/3。
在一个实施方案中，每个N1、N2、...Nn和N1#、N2#、...Nn#选自于C、G或其修饰物，其中C与G碱基配对。
在一个实施方案中，每个N1、N2、...Nn和N1#、N2#、...Nn#选自于T、A或其修饰物，其中T与A碱基配对。
在这些和其它实施方案中，每个C、G、A和T都可指具有胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和胸腺嘧啶的相应碱基的脱氧核苷酸。
在一个实施方案中，每个N1、N2、...Nn和N1#、N2#、...Nn#选自于C、T、A、G或其修饰物，且C与G碱基配对，T与G碱基配对，A与T碱基配对，和A与G碱基配对。
在一个实施方案中，每个N1、N2、...Nn和N1#、N2#、...Nn#都选自于形成Watson-Crick碱基对的未经修饰的或经修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，每个N1、N2、...Nn和N1#、N2#、...Nn#都选自于形成非Watson-Crick碱基对的未经修饰的或经修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，免疫刺激核酸分子包括具有至少一个磷酸二酯键的部分稳定的骨架。
在一个实施方案中，免疫刺激核酸分子包括具有至少一个稳定的核苷酸间键的骨架。
在一个实施方案中，寡核苷酸的核苷酸间键均为硫代磷酸酯键。
在一个实施方案中，免疫刺激核酸分子包括具有连接Y1R1或Y2R2中至少一个的磷酸二酯键的部分稳定的骨架。
在一个实施方案中，Y1为C。
在一个实施方案中，R1为G。
在一个实施方案中，Y1为C且R1为G。
在一个实施方案中，X1或X2为T。
在一个实施方案中，X1为T，X2为T，Y1为C，R1为G且k为1。
在一个实施方案中，X1为T，X2为T，Y1为C，R1为G，k为1，p为1，N和N′和Z3每个都不含核苷酸，且Z2为TTTT或d(UUUU)。
在一个实施方案中，S2为非核苷酸接头。
在一个实施方案中，S2包含至少一个无碱基间隔基残基。
在一个实施方案中，寡核苷酸包括至少一个有分枝的非核苷键。
在一个实施方案中，免疫刺激核酸分子包括至少一个二重体单元、至少一个三重体单元，或至少一个二重体单元和至少一个三重体单元。
在一个实施方案中，S1为二重体单元或三重体单元。
在一个实施方案中，寡核苷酸包括至少一个2′5′-、5′5′-、3′3′-、2′2′-或2′3′-核苷间键。
在一个方面，  本发明提供式II的免疫刺激核酸分子
Z1(Nn)(Nn-1)...(N2)(N1)S2(N1#)(N2#)...(Nn-1#)(Nn#)(S1)q Z3[(X1Y1R1)N(X2Y2R2)k Z2]p
(式II)
其中，每个Z1、Z2和Z3都独立地为0至12个核苷酸长的任意序列，任选地包括非核苷酸接头或无碱基间隔基；每个X1和X2都独立地为胸苷、脱氧尿苷、脱氧腺苷或5-取代的脱氧尿苷；每个Y1和Y2都独立地为胞嘧啶(C)或经修饰的胞嘧啶；每个R1和R2都独立地为鸟嘌呤(G)或经修饰的鸟嘌呤；N为0至12个核苷酸长的任意序列，其任选地包括非核苷酸接头或无碱基间隔基；S1为非核苷酸接头、无碱基接头(dSpacers)、三甘醇单元或六甘醇单元，其任选地提供2′5′-、5’5′-、3’3′-、2′2′-或2′3′-核苷间键；S2为1至10个核苷长的任意非回文序列或非核苷酸接头、无碱基接头(dSpacers)、三甘醇单元或六甘醇单元；每个N1、N2、...Nn-1、Nn和N1#、N2#、...Nn-1#、Nn#均为核苷酸或经修饰的核苷酸，其中N1与N1#碱基配对，N2与N2#碱基配对、...Nn-1与Nn-1#碱基配对，和Nn与Nn#碱基配对；k为0至5的整数；n为2至16的整数；p为1至6的整数；和q为0至10的整数，且其中当(Nn)...(N2)(N1)S2(N1#)(N2#)...(Nn#)为10至42个核苷酸长时，S2为4至10个核苷酸长，S2包含非核苷酸接头、无碱基接头(dSpacers)、三甘醇单元或六甘醇单元，和/或(Nn)...(N2)(N1)S2(N1#)(N2#)...(Nn#)含GC的量少于2/3。
在一个实施方案中，Z1(Nn)(Nn-1)为TYR，其中Y为胞嘧啶或经修饰的胞嘧啶，且R为鸟嘌呤或经修饰的鸟嘌呤。
在一个实施方案中，每个N1、N2、...Nn-1、Nn和N1#、N2#、...Nn-1#、Nn#都选自于C、G或其修饰物，其中C与G碱基配对。
在一个实施方案中，每个N1、N2、...Nn-1、Nn和N1#、N2#、...Nn-1#、Nn#都选自于T、A或其修饰物，其中T与A碱基配对。
在这些和其它实施方案中，每个C、G、A和T都可指具有胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和胸腺嘧啶的相应碱基的脱氧核苷酸。
在一个实施方案中，每个N1、N2、...Nn-1、Nn和N1#、N2#、...Nn-1#、Nn#都选自于C、T、A、G或其修饰物，且C与G碱基配对，T与G碱基配对，A与T碱基配对，和A与G碱基配对。
在一个实施方案中，每个N1、N2、...Nn-1、Nn和N1#、N2#、...Nn-1#、Nn#都选自于能形成Watson-Crick碱基对的未修饰的或经修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，每个N1、N2、...Nn-1、Nn和N1#、N2#、...Nn-1#、Nn#都选自于能形成非Watson-Crick碱基对的未修饰的或经修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，免疫刺激核酸分子包括具有至少一个磷酸二酯键的部分稳定的骨架。
在一个实施方案中，免疫刺激核酸分子包括具有至少一个稳定的核苷酸间键的骨架。
在一个实施方案中，寡核苷酸的核苷酸间键均为硫代磷酸酯键。
在一个实施方案中，免疫刺激核酸分子包括具有连接Y1R1或Y2R2中至少一个的磷酸二酯键的部分稳定的骨架。
在一个实施方案中，Y1为C。
在一个实施方案中，R1为G。
在一个实施方案中，Y1为C且R1为G。
在一个实施方案中，X1或X2为T。
在一个实施方案中，X1为T，X2为T，Y1为C，R1为G且k为1。
在一个实施方案中，X1为T，X2为T，Y1为C，R1为G，k为1，p为1，N和N′和Z3每个都不含核苷酸，且Z2为TTTT或d(UUUU)。
在一个实施方案中，S2为非核苷酸接头。
在一个实施方案中，S2包含至少一个无碱基间隔基残基。
在一个实施方案中，寡核苷酸包括至少一个有分枝的非核苷键。
在一个实施方案中，免疫刺激核酸分子包括至少一个二重体单元、至少一个三重体单元，或至少一个二重体单元和至少一个三重体单元。
在一个实施方案中，S1为二重体单元或三重体单元。
在一个实施方案中，寡核苷酸包括至少一个2′5′-、5′5′-、3′3′-、2′2′-或2′3′-核苷间键。
在一方面，本发明提供式III的免疫刺激核酸分子
(U)mZ3(S3)    (式III)
其中U为Z1[(X1Y1R1)N(X2Y2R2)kZ2]P(S1)qN′(Nn)....(N3)(N2)(N1)S2(N1#)(N2#)(N3#)...(Nn#)；每个Z1、Z2和Z3都独立地为0至12个核苷长的任意序列，其任选地包括非核苷酸接头或无碱基间隔基；每个X1和X2都独立地为胸苷、脱氧尿苷、脱氧腺苷或5-取代的脱氧尿苷；每个Y1和Y2都独立地为胞嘧啶或经修饰的胞嘧啶；每个R1和R2都独立地为鸟嘌呤或经修饰的鸟嘌呤；每个N和N′都独立地为0至12个核苷长的任意序列，其任选地包括非核苷酸接头或无碱基间隔基；S1为非核苷酸接头、无碱基接头(dSpacers)、三甘醇单元或六甘醇单元，其任选地提供2′5′-、5’5′-、3’3′-、2′2′-或2′3′-核苷间键；S2为1至10个核苷长的任意非回文序列或非核苷酸接头、无碱基接头(dSpacers)、三甘醇单元或六甘醇单元；S3为直接或间接的2′5′-、5′5′-、3′3′-、2′2′-或2-′3′-核苷间键或为非核苷酸接头，所述非核苷酸接头包括促进m个序列部分的2′5′-、5′5′-、3′3′-、2′2′-或2′3′-键的无碱基接头(dSpacers)、三甘醇单元或六甘醇单元；每个N1、N2、...Nn和N1#、N2#、...Nn#均为核苷酸或经修饰的核苷酸，其中N1与N1#碱基配对，N2与N2#碱基配对、...和Nn与Nn#碱基配对；k为0至5的整数；m为2至10的整数；n为2至16的整数；p为1至6的整数；和q为0至10的整数。
在一些实施方案中，Z1[(X1Y1R1)N(X2Y2R2)kZ2]p(S1)q为非回文序列。
在一些实施方案中，Z1[(X1Y1R1)N(X2Y2R2)kZ2]p(S1)q为TCGTCGTTTT(SEQ ID NO：29)、TCGTCGTTDD(SEQ ID NO：30)、TCGA、TCGAC、TCGACGTC或TCGACGTCG，其中D为dSpacer。
在一些实施方案中，Z1[(X1Y1R1)N(X2Y2R2)k Z2]p(S1)q为回文序列。
在一些实施方案中，Z1[(X1Y1R1)N(X2Y2R2)k Z2]p(S1)q为TCGACGTCGA(SEQ ID NO：31)或TCGTCGACGA(SEQ ID NO：32)。
在一些实施方案中，Z1[(X1Y1R1)N(X2Y2R2)k Z2]p(S1)q为TCGCGACGTT(SEQ ID NO：33)或TCGCGTCGTT(SEQ ID NO：34)。
在一个实施方案中，(Nn)....(N2)(N1)S2(N1#)(N2#)...(Nn#)Z3包括序列AGCGAAGCT、CAATATTTATTG(SEQ ID NO：35)、CCGTTTTGTGG(SEQ ID NO：36)、CGGCGCCGTGCCG(SEQ ID NO：37)、CGGCGCCGTTGCCG(SEQ ID NO：38)、CGGCGDDCGCCG(SEQ IDNO：39)、CGGCGDDDTGCCG(SEQ ID NO：40)、CGGCGGDDCCGCCG(SEQ ID NO：41)、CGGCGTCGCCGCCG(SEQ ID NO：42)、CGTCGACGGGACGGG(SEQ ID NO：43)、CGTCGACGTGACGGG(SEQ ID NO：44)、GAGAGTTGGGCTCTC(SEQ ID NO：45)、GTCGAGGAGGT(SEQ ID NO：46)、TAATADDTATTA(SEQ ID NO：47)、TAATATCCATTA(SEQ ID NO：48)或TAATATTTATTA(SEQ IDNO：49)，其中D为dSpacer。
在一个实施方案中，(Nn)....(N2)(N1)S2(N1#)(N2#)...(Nn#)包括序列GGCGCGCTGCCG(SEQ ID NO：50)。
在一个实施方案中，核酸的5′末端起始于免疫刺激基序，其选自于(TCG)nN和R DCGY1Y2N。T为胸腺嘧啶，C为未甲基化的胞嘧啶，G为鸟嘌呤，R为嘌呤， D不是C，每个Y1和Y2都独立地为嘧啶，n为1至4的整数，且N为0-12个碱基长的任意序列。
核酸的3′末端以能形成发夹结构或茎-环结构的反向重复序列结束。术语“结束”指在或接近3′末端的结构。因此，近回文结构的末端可能恰好位于分子的3′末端，或可选地，3′末端可包括不是反向重复结构部分的1个或多个额外核苷酸。优选地，分子的3′末端包括不形成反向重复结构部分的3个或更少的核苷酸。
在一个实施方案中，此处所用的“可形成发夹或茎-环结构的反向重复序列”指形成富含GC的茎或发夹的2至10个连续碱基对长的核苷酸序列，且包括至少一个未匹配或错配的碱基。在单独的实施方案中，富含GC的茎为2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续碱基对长。在一些实施方案中，富含GC的茎包括至少2、3或4个G-C碱基对。
在一个实施方案中，此处所用的“可形成发夹或茎-环结构的反向重复序列”指形成富含AT的茎或发夹的2至10个连续碱基对长的核苷酸序列，且包括至少一个未匹配或错配的碱基。在单独的实施方案中，富含AT的茎为2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续碱基对长。在一些实施方案中，富含AT的茎包括至少2、3或4个A-T碱基对。
在一些例子中，至少一个未匹配或错配碱基桥接茎或发夹末端。通过在分子内为茎碱基对提供柔性点，这就使得二级结构形成发夹。可选地，未匹配或错配的碱基可处于茎内。优选地，若错配碱基处于茎内，那么茎至少为3个碱基对长。未匹配或错配的碱基可为任意核苷酸。在一些实施方案中，未匹配或错配碱基为T。在双链末端的未匹配核苷酸也称为悬垂核苷酸或摇摆末端，其显著地稳定双重结构或发夹结构。Freier SM等人(1983)，3′摇摆末端堆积对GGCC和CCGG双螺旋的影响(Effects of 3′dangling end stacking on the stability of GGCC and CCGG doublehelixes)，生物化学(Biochemistry)，22：6198-206。
核酸也包括部分稳定的含有至少一个5′-CpG-3′磷酸二酯键的骨架。
在一些例子中，分子的双链部分也可包含非天然的(非标准的)碱基对(如二氨基吡啶与黄苷配对)。Lutz MJ等人(1998)，通过耐热DNA聚合酶识别非标准碱基对(Recognition of a non-standard base pair bythermostable DNA polymerases)，Bioorg Med Chem Lett 8：1149-52。
上述诸式定义了CpG寡核苷酸类的子集，其显示出极好的免疫刺激特性。在式中，5′指寡核苷酸的5′游离末端，且3′指寡核苷酸的3′游离末端。
寡核苷酸可具有一个或多个易接近的5′或3′末端。在一些实施方案中，3′末端可连接到另一个3′末端。因为已经发现了5′和3′基序的重要性，并在此进行了详述，因此构建修饰的具有两个这样的5′或3′末端的寡核苷酸是可能的。例如通过3’-3′键链接两个寡核苷酸来制备具有一个或两个易接近的5′末端的寡核苷酸就可以做到。该结构可具有下式如5′-R DCGY1Y2N-NY2Y1GC DR-5′(其中 D为非C；SEQ ID NO：51)或5′-(TCG)nN-N(GCT)n-5′(SEQ ID NO：52)。3′3′-或5′5′-键可以是磷酸二酯、硫代磷酸酯或其它经修饰的核苷间键。领域内众所周知用于制备这种键的方法。例如已在Seliger H等人，(1991)，具有末端为3’-3′-和′-5′-核苷酸间键的寡核苷酸类似物作为病毒基因表达的反义抑制剂(Oligonucleotideanalogs with terminal 3’-3′-and 5′-5′-internucleotidic linkages as antisenseinhibitors of viral gene expression)，核苷&核苷酸(Nucleosides &Nucleotides)10：469-77，和Jiang Z等人，(1999)，假性环寡核苷酸：体外与体内特性(Pseudo-cyclic oligonucleotides：in vitro and in vivoproperties)，Bioorg Med Chem 7：2727-35。
在一些实施方案中，寡核苷酸具有下列结构之一：TCGTCGTTTTA(SEQ ID NO：53)、CGGCGCCGTGCCG(SEQ ID NO：54)、CGGCGTCGTGCCG(SEQ ID NO：55)、TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG(SEQ ID NO：56)、TCGTCGTTTTACGGCGTCGTGCCG(SEQ ID NO：57)。
在一方面，本发明涉及发现了具有嵌合骨架的C类CpG免疫刺激性寡核苷酸的特异的亚类对介导免疫刺激效应非常有效的现象。这些CpG寡核苷酸在治疗上和预防上用于激活免疫系统以治疗癌、传染病、过敏、哮喘、自身免疫性疾病和其它紊乱，并帮助预防癌症化疗后的机会感染。由CpG刺激引起的强且平衡的细胞免疫反应和体液免疫反应反映出机体自身对抗侵入的病原体和癌细胞的天然防御系统。
在一方面，本发明涉及发现了CpG免疫刺激性寡核苷酸的子集具有改进的免疫刺激特性和降低的肾脏炎性效应。在一些例子中，观察了已施用完全硫代磷酸酯寡核苷酸的受试者的肾脏炎症。认为此处所述的嵌合寡核苷酸比完全硫代磷酸酯寡核苷酸产生的肾脏炎症小。此外，这些寡核苷酸对激活免疫反应方面是非常有效的。因此，分子的磷酸二酯区不会降低其作用。
优选的CpG免疫刺激性寡核苷酸属于下列7个通式之一：
5′TTC_GX2C_GN1X1_GX3C_GTT 3′(SEQ ID NO：24)，其中N1为1-3个核苷酸长，且N为任意核苷酸，X1为嘧啶，X2和X3为任意核苷酸。
5’TTC_GTC_GTTTX1_GTC_GTT 3’(SEQ ID NO：25)，其中X1为嘧啶。
5′T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*X1_G*T*C_G*T*T 3′(SEQ ID NO：25)，其中X1为嘧啶。
5′TC_GX1C_GX2N1 X3C_GN2CG 3′(SEQ ID NO：26)，其中N1为0-3个核苷酸长，N2为0-9个核苷酸长，且N指任意核苷酸，X1、X2和X3为任意核苷酸。
5′TC_GTC_GTN1TC_GGCGCN1GCCG 3′(SEQ ID NO：27)，其中N1为0-3个核苷酸长。
5′T*C_G*T*C_G*T*N1*T*C_G*G*C*G*CN1G*C*C*G 3′(SEQ IDNO：27)，其中N1为0-3个核苷酸长。
5′TC_G X1C_G X2C_GX3TC_GGCGC_G N3 3′(SEQ ID NO：28)，其中N3为1-5个核苷酸长，且N指任意核苷酸，及X1、X2和X3为任意核苷酸。
任选地，当对式中说明时，5′指寡核苷酸的5′游离末端，且3′指寡核苷酸的3′游离末端。
式中所用的符号*是指存在稳定的核苷酸间键。这些结构中的符号_是指存在磷酸二酯核苷酸间键。只要寡核苷酸包括至少2-3个磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键，则未以*标记的核苷酸间键可为稳定的或不稳定的。在一些实施方案中，优选地是寡核苷酸包括3-6个磷酸二酯或磷酸二酯样键。在一些情况下，CG基序间的键为磷酸二酯键，而在另外一些情况下，其为硫代磷酸酯或其它稳定的键。
在一些实施方案中，寡核苷酸具有下列结构之一：
T*C_G*T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO：2)
T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO：3)
TC_GTC_GAC_GATC_GGCGC_GCGCCG(SEQ ID NO：4)
T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO：4)
T*T*C_G*T*C-G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：5)
T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：6)
TCGTCGTTCGGCGCGCCG(SEQ ID NO：3)
TCGTCGTCGTTCGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO：2)
TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO：4)
TTCGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：5)
TTTCGTCGTTTCGTCGTT(SEQ ID NO：6)
TCGTCGTC
CGTCGTCG
GTCGTCGT
TCGTCGTT
CGTCGTTC
GTCGTTCG
TCGTTCGG
CGTTCGGC
GTTCGGCG
TTCGGCGC
TCGGCGCG
CGGCGCGC
GGCGCGCG
GCGCGCGC
CGCGCGCC
GCGCGCCG。
T*C_G*T*C_G*T*C
C_G*T*C_G*T*C_G
G*T*C_G*T*C_G*T
T*C_G*T*C_G*T*T
C_G*T*C_G*T*T*C
G*T*C_G*T*T*C_G
T*C_G*T*T*C_G*G
C_G*T*T*C_G*G*C
G*T*T*C_G*G*C*G
T*T*C_G*G*C*G*C
T*C_G*G*C*G*C_G
C_G*G*C*G*C_G*C
G*G*C*G*C_G*C*G
G*C*G*C_G*C*G*C
C*G*C_G*C*G*C*C
G*C_G*C*G*C*C*G
术语“核酸”和“寡核苷酸”也包含如在碱基和/或糖中具有取代或修饰的核酸或寡核苷酸。例如，它们包括具有以共价方式连接到低分子量的有机基团上、而不是2′位置上的羟基基团且也不是5′位置上的磷酸基团或羟基基团上的骨架糖的寡核苷酸。因此，经修饰的寡核苷酸可包括2′-O-烷基化的核糖基团。此外，经修饰的寡核苷酸可包括不是核糖的糖，如阿拉伯糖或2′-氟阿拉伯糖。因此，在骨架组分中寡核苷酸可为异质的，可包含任意可能的相互链接在一起的聚合单元的组合，如肽-核酸(其具有带核酸碱基的氨基酸骨架)。
核酸也包括经取代的嘌呤和嘧啶，如C-5丙炔嘧啶和7-脱氮-7-取代的嘌呤修饰的碱基。Wagner RW等人，(1996)Nat Biotechnol 14：840-4。嘌呤和嘧啶包括但不限于腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤和其它天然的或非天然存在的核酸碱基、取代的和未取代的芳香族部分。领域内技术人员熟知其它此类修饰。
本发明的免疫刺激性寡核苷酸与天然RNA和DNA比较，可包含多种化学修饰和取代，包括磷酸二酯核苷酸间键、β-D-核糖单元和/或天然核苷酸碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)。技术人员熟知化学修饰的例子，并且例如，在Uhlmann E等人，(1990)，Chem Rev 90：543；“用于寡核苷酸和类似物的方案(Protocols for Oligonucleotides andAnalogs)”，合成与特性&合成与分析技术(Synthesis and Properties &Synthesis and Analytical Techniques)，S.Agrawal编，Humana Press，Totowa，USA 1993；Crooke ST等人，(1996)，Annu Rev PharmacolToxicol 36：107-129；和Hunziker J等人，(1995)Mod Synth Methods7：331-417中详述了这些例子。根据本发明的寡核苷酸可具有一个或多个修饰，其中，与组成天然DNA或RNA的相同序列的寡核苷酸比较，每个修饰都处于特定的磷酸二酯核苷酸间键和/或在特定的β-D-核糖单元和/或在特定的天然核苷碱基位置。
例如，本发明涉及包含一个或多个修饰的寡核苷酸，其中每个修饰都独立地选自于：
a)以修饰的核苷酸间桥替换处于核苷酸的3′和/或5′末端的磷酸二酯核苷酸间桥，
b)以脱磷桥替换处于核苷酸的3′和/或5′末端的磷酸二酯桥，
c)以另一单元替换源自于糖磷酸酯骨架的糖磷酸酯单元，
d)以修饰的糖单元替换β-D-核糖单元，和
e)以修饰的核苷酸碱基替换天然的核苷酸碱基。
下面详述更多的关于寡核苷酸的化学修饰的实例。
处于核苷酸的3′和/或5′末端的磷酸二酯核苷酸间桥可被修饰的核苷酸间桥替换，其中修饰的核苷酸间桥选自于如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、NR1R2-氨基磷酸酯、硼烷磷酸酯、α-羟苄膦酸酯、磷酸-(C1-C21)-O-烷基酯、磷酸-[(C6-C12)芳基-(C1-C21)-O-烷基]酯、(C1-C8)烷基膦酸酯和/或(C6-C12)芳基膦酸酯桥、(C7-C12)-α-羟甲基-芳基(如WO 95/01363中公开的)，其中(C6-C12)芳基、(C6-C20)芳基和(C6-C14)芳基任选地被卤素、烷基、烷氧基、硝基、氰基取代，且其中R1和R2相互独立地为氢、(C1-C18)-烷基、(C6-C20)-芳基，(C6-C14)-芳基-(C1-C8)-烷基，优选地为氢、(C1-C8)-烷基，优选地为(C1-C4)-烷基和/或甲氧乙基，或R1和R2共同地连接N原子形成5-6-元杂环，其能进一步额外地包含来自O、S和N的杂原子。
由脱磷桥替换处于核苷酸的3′和/或5′末端的磷酸二酯桥(如在Uhlmann E和Peyman A，“分子生物学方法”(Methods in MolecularBiology)，Vol.20，“用于寡核苷酸及类似物的方案”(Protocols foroligonucleotides and Analogs)，S.Agrawal编，Humana Press，Totowa1993，第16章第355页中详述了脱磷桥)，其中，例如，脱磷桥选自于formacetal、3′-硫代formacetal、甲基羟胺、肟、亚甲基二甲基联亚氨基(methylenedimethylhydrazo)、二亚甲基砜和/或甲硅烷基。
磷酸糖单元(即β-D-核糖与磷酸二酯核苷酸间键桥连形成磷酸糖单元)能由另一单元取代，所述磷酸糖单元源自于磷酸糖骨架(即磷酸糖骨架由磷酸糖单元组成)，例如，其中另一单元适合于建立“吗啉代衍生物”低聚物(如在Stirchak EP等人，1989，Nucleic Acids Res 17：6129-41中所述)，即由吗啉代衍生物单元取代；或建立聚酰胺核酸(“PNA”；如在Nielsen PE等人，1994，Bioconjug Chem 5：3-7中所述)，即由PNA骨架单元取代，如由2-氨基乙基甘氨酸取代。
β-核糖单元或β-D-2′-脱氧核糖单元可由经修饰的糖单元取代，其中经修饰的糖单元选自于如β-D-核糖、α-D-2′-脱氧核糖、L-2′-脱氧核糖、2′-F-2′-脱氧核糖、2′-F-阿拉伯糖、2′-O-(C1-C6)-烷基核糖，优选地2′-O-(C1-C6)-烷基核糖为2′-O-甲基核糖、2′-O-(C2-C6)烯基核糖、2′-[O-(C1-C6)烷基-O-(C1-C6)烷基]-核糖、2′-NH2-2′-脱氧核糖、β-D-木-呋喃糖、α-阿拉伯呋喃糖、2，4-二脱氧-β-D-赤藓己-吡喃糖和碳环化合物(如在Froehler J(1992)Am Chem Soc 114：8320中所述)和/或开链糖类似物(如在Vandendriessche等人(1993)Tetrahedron 49：7223中所述)和/或二环糖类似物(如在TarkovM等人(1993)HeIv Chim Acta 76：481中所述)。
在一些优选的实施方案中，糖为2′-O-甲基核糖，特别是对于一个或两个由磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键连接的核苷酸。
经修饰的碱基为化学上不同于一般在DNA和RNA中发现的天然存在的如T、C、G、A和U碱基的任意碱基，但其具有这些天然存在的碱基的基本化学结构。经修饰的核苷酸碱基为选自于如次黄嘌呤、尿嘧啶、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-(C2-C6)-烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(羟甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-(C2-C6)-烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2-二甲基鸟嘌呤、2，4-二氨基嘌呤、8-杂氮嘌呤、经取代的7-脱氮嘌呤，优选地为7-脱氮-7-取代和/或7-脱氮-8-取代的嘌呤、5-羟甲基胞嘧啶、如N4-乙基胞嘧啶的N4-烷基胞嘧啶、5-羟基脱氧胞苷、5-羟甲基脱氧胞苷、如N4-乙基脱氧胞苷的N4-烷基脱氧胞苷、6-硫代脱氧鸟苷和硝基吡咯的脱氧核糖核苷酸、C5-丙炔嘧啶，和如2，6-二氨基嘌呤的二氨基嘌呤、次黄苷、5-甲基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤或其它天然核苷酸碱基的修饰。该列表仅作示例，并不是解释为限制。
寡核苷酸可具有一个或多个易接近的5’末端。建立具有两个这样的经修饰的5′末端的寡核苷酸是可行的。例如，通过连接两个寡核苷酸的3’-3′键以产生具有一个或两个易接近的5’末端的寡核苷酸即可获得。3’-3′键可为磷酸二酯、硫代磷酸酯或其它经修饰的核苷酸间键。领域内公知实现这种键的方法。例如，在Seliger，H.；等人，作为病毒基因表达的反义抑制剂的具有3′-3′-和5′-5′-末端的核苷酸间键的寡核苷酸类似物(Oligonucleotideanalogs with terminal 3′-3′-and 5′-5′-internucleotidic linkages as antisenseinhibitors of viral gene expression)，Nucleotides & Nucleotides(1991)，10(1-3)，469-77和Jiang，等人，假环寡核苷酸：体外与体内特性(Pseudo-cyclic oligonucleotides：in vitro and in vivo properties)，生物有机化学与药物化学(Bioorganic & Medicinal Chemistry)，1999，7(12)，2727-2735中已描述了这种键。
此外，在3′末端核苷酸之间的键不是磷酸二酯、硫代磷酸酯或其它经修饰的键时，可使用其它间隔基如三或四-乙二醇磷酸酯制备3’3’-连接的寡核苷酸，(Durand，M.等人，由包含通过两个六乙二醇链桥接的一个(dA)12和两个(dT)12序列的寡核苷酸形成的三螺旋(Triple-helix formation byan oligonucleotide containing one(dA)12 and two(dT)12 sequencesbridged by two hexaethylene glycol chains)，生物化学(Biochemistry)，1992，31(38)，9197-204，美国专利号5658738和美国专利号5668265)。可选地，应用标准亚磷酸氨化学法，非核苷酸键可源自于乙二醇、丙二醇或源自于无碱基脱氧核糖(dSpacer)单元(Fontanel，Marie Laurence等人，由T4多聚核苷酸激酶在空间上识别连接到寡核苷酸5′端上的非核苷酸部分(Sterical recognition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidicmoieties 5′-attached to oligonucleotides)，核酸研究(Nucleic AcidsResearch)，1994，22(11)，2022-7)。可掺入非核苷酸接头一次或多次，或相互结合，以允许待连接的两个ODN的3′末端间的任意期望长度。
最近已经报道了CpG寡核苷酸通过与Toll样受体9(TLR9)相互作用而呈现出其免疫刺激效应。Hemmi H等人，(2000)自然，408：740-5。因此通过测定NF-κB、NF-κB-相关信号和NF-κB上游或下游的恰当事件及中间体可以测定出响应CpG寡核苷酸或其它免疫刺激性寡核苷酸的TLR9信号传导活性。
对于在本发明中的应用，可使用领域内公知的众多方法中的任意一个方法从头合成本发明的寡核苷酸。例如，b-氰乙基亚磷酰胺法(Beaucage，S.L.和Caruthers，M.H.，Tet.Let.22：1859，1981)；和核苷酸H-膦酸酯法(Garegg等人，Tet.Let.27：4051-4054，1986；Froehler等人，Nucl.Acid.Res.14：5399-5407，1986，；Garegg等人，Tet.Let.27：4055-4058，1986；Gaffney等人，Tet.Let.29：2619-2622，1988)。通过市场上可获得的多种自动化核酸合成仪进行这些化学法。将这些寡核苷酸称为合成的寡核苷酸。分离的寡核苷酸通常指从那些在自然界中通常与其结合的组合物中分离的寡核苷酸。例如，分离的寡核苷酸可以是从细胞、细胞核、线粒体或染色体中分离出来的寡核苷酸。
寡核苷酸对消化作用是部分抵抗的(如稳定的)。“稳定的寡核苷酸分子”指在体内对降解(如通过核酸外切酶或内切酶)相对抵抗的寡核苷酸。可通过骨架修饰达到稳定核酸作用。具有硫代磷酸酯键的寡核苷酸具有最大活性，并使寡核苷酸免于被胞内核酸外切酶和内切酶消化。其它经修饰的寡核苷酸包括磷酸二酯修饰的寡核苷酸、磷酸二酯与硫代磷酸酯的组合、磷酸甲酯、硫代磷酸甲酯、二硫代磷酸酯、p-乙氧基和其组合。
通过亚磷酰胺化学法或氢磷酸酯化学法使用自动化技术合成经修饰的骨架，如硫代磷酸酯。如在美国专利号4,469,863所述进行制备芳基和烷基磷酸酯；且通过化学上可用试剂使用自动化固相合成制备烷基磷酸三酯(其中带电荷氧部分可如在美国专利号5,023,243和欧洲专利号092,574中所述进行烷基化)。已经描述了用于制备其它DNA骨架修饰和取代的方法(如Uhlmann，E.和Peyman，A.，Chem.Rev.90：544，1990；Goodchild，J.，Bioconjugate Chem.1/165，1990)。其它稳定的寡核苷酸包括：非离子DNA类似物，如烷基和芳基磷酸(其中磷酸上带电荷的氧由烷基或芳基取代)、磷酸二酯和烷基磷酸三酯，其中使带电荷的氧烷基化。在一端或两端包含二醇如四甘醇或六甘醇的寡核苷酸也已显示出对核酸酶消化相当大的抵抗作用。
根据本发明，已经发现了CpG免疫刺激性寡核苷酸子集对人细胞，如PBMC细胞，具有显著的免疫刺激效应，表明这些CpG免疫刺激性寡核苷酸对人接种疫苗、癌免疫治疗、哮喘免疫治疗、免疫功能的全面提高、放疗或化疗后造血恢复的提高、自身免疫性疾病和其它免疫调节应用为有效的治疗剂。也表明CpG免疫刺激性寡核苷酸亚类可在体内应用于对哮喘和过敏性鼻炎的治疗。
患有过敏的受试者为对过敏原具有或处于过敏反应危险的受试者。过敏指对物质的获得性超敏(如对过敏原)。过敏症包括但不限于湿疹、过敏性鼻炎或伤风、枯草热、结膜炎、支气管哮喘、风疹(麻疹)和食物过敏，以及其它遗传性过敏症。
过敏通常是由IgE抗体产生的对抗无害过敏原而引起。由全身或粘膜施用CpG免疫刺激性寡核苷酸而诱导出的细胞因子主要是称为Th1类的细胞因子(实例为IL-12、IP-10、IFN-α和IFN-γ)，且这些细胞因子诱导体液和细胞免疫反应。免疫反应的其它主要类型，其与IL-4和IL-5细胞因子的产生有关，称为Th2免疫反应。通常过敏性疾病似乎是由Th2型免疫反应介导的。基于CpG免疫刺激性寡核苷酸在受试者体内将主要为Th2的免疫反应(其与IgE抗体和过敏的产生有关)转换成平衡的Th2/Th1反应(其保护抗过敏反应)的能力，可对受试者施用诱导免疫反应的有效剂量的作为不含过敏原或与过敏原结合的独特疗法的CpG免疫刺激性寡核苷酸，以治疗或预防哮喘和过敏。
因此，CpG免疫刺激性寡核苷酸对治疗如哮喘和过敏性鼻炎的过敏症具有显著的治疗作用。在患哮喘症患者呼吸道中，Th2细胞因子，特别是IL-4和IL-5增多。这些细胞因子促进哮喘炎性反应的重要方面，包括IgE同种型转换、嗜酸性粒细胞趋化性和活化作用以及肥大细胞生长。Th1细胞因子，特别是IFN-γ和IL-12，可以抑制Th2克隆的形成以及Th2细胞因子的产生。哮喘指呼吸系统紊乱，其特征在于发炎、呼吸道紧缩以及呼吸道对吸入剂增强的反应。哮喘通常，尽管不是专有的，与遗传性过敏症或过敏症有关。
病毒感染可恶化哮喘。在受试者体内，哮喘结合病毒感染可显著恶化病症。此处所用的寡核苷酸对治疗病毒诱导的哮喘恶化提供极大益处。下面列举该疗法的几个实施例。
过敏性鼻炎为由如花粉或灰尘的过敏原引起的导致鼻粘膜炎性的紊乱。该术语包括药物性鼻炎、干燥性鼻炎和萎缩性鼻炎。一般有季节性和长期性两种类型的过敏性鼻炎。季节性过敏性鼻炎一般称为枯草热，通常由霉或花粉引起。长期过敏性鼻炎通常由遗传的对一种或多种类型过敏原敏感引起。该症状一般常年持续，或只要患者接触过敏原就持续。这两种类型的过敏性鼻炎包括引起炎症的1型(IgE介导的)超敏性。认为该炎症是由肥大细胞和血中嗜碱性粒细胞响应一些过敏原而过度脱颗粒引起。因而导致IgE水平增加，并伴随如组胺的炎性介质、如细胞因子、前列腺素和白三烯的趋化因子的释放，其导致局限性炎性反应。
免疫刺激性寡核苷酸可作为独特疗法施用，不必含有额外的抗过敏/哮喘药剂或治疗或不必与这种治疗或药物组合。一般的抗过敏/哮喘药物和治疗包括使用鼻血管缩小剂、鼻内和全身抗组胺剂、鼻内糖皮质激素、肥大细胞稳定剂，如色甘酸复合物，和经口解充血药。
过敏原指在易感患者体内诱导过敏或哮喘反应的物质(抗原)。过敏原数量庞大并可包括花粉、昆虫毒素、动物皮屑、真菌孢子和药物(如青霉素)。天然动物和植物过敏原的例子包括但不限于对下列特种特异的蛋白质：犬属(Canine)(犬(Canisfamiliaris))；螨(Dermatophagoides)(如粉尘螨(Dermatophagoides farinae))；猫(Felis)(家猫(Felis domesticus))；豚草属(Ambrosia)(美洲豚草(Ambrosia artemiisfolia))；黑麦草属(Lolium)(如黑麦草(Lolium perenne)或多花黑麦草(Lolium multiflorum))；柳杉(Cryptomeria)(日本柳杉(Cryptomeria japonica))；链格孢属(Alternaria)(链格孢菌(Alternaria alternata))；Alder；Alnus(Alnusgultinoasa)；桦木属(Betula)(瘤桦(Betula verrucosa))；栎属(Quercus)(白橡(Quercus alba))；木犀榄属(Olea)(橄榄树(Olea europa))；Artemisia(Artemisia vulgaris)；车前属(Plantago)(如长叶车前(Plantagolanceolata))；墙草属(Parietaria)(如弱墙草(Parietaria officinalis)或Parietaria judaica)；Blattella(如Blattella germanicd)；Apis(如Apis multiflorum)；柏木属(Cupressus)(如地中海柏(Cupressussempervirens)、绿干柏(Cupressus arizonica)和大果柏(Cupressusmacrocarpa))；刺柏属(Juniperus)(如Juniperus sabinoides，弗吉尼亚桧(Juniperus virginiana)、欧洲刺柏(Juniperus communis)和Juniperusashei)；金钟柏(Thuya)(如侧柏(Thuya orientalis))；扁柏属(Chamaecyparis)(如日本扁柏(Chamaecyparis obtusa))；大蠊属(Periplaneta)(如美国大蠊(Periplaneta americana))；冰草属(Agropyron)(如冰草(Agropyron repens))；黑麦属(Secale)(如黑麦(Secale cereale))；小麦属(Triticum)(如小麦(Triticum aestivum))；鸭茅属(Dactylis)(如鸭茅(Dactylis glomerata))；狐茅属(Festuca)(如高狐茅(Festuca elatior))；早熟禾属(Poa)(如早熟禾(Poa pratensis)或加拿大早熟禾(Poa compressa))；燕麦属(Avena)(如燕麦(Avenasativa))；绒毛草属(Holcus)(如绒毛草(Holcus lanatus))；黄花茅属(Anthoxanthum)(如日本黄花茅(Anthoxanthum odoratum))；燕麦草属(Arrhenatherum)(如燕麦草(Arrhenatherum elatius))；剪股颍属(Agrostis)(如小糠草(Agrostis alba))；猫尾草属(Phleum)(如梯牧草(Phleum pratense))；萌草属(Phalaris)(如草芦(Phalarisarundinacea))；雀稗属(Paspalum)(如百喜草(Paspalum notatum))；高粱属(Sorghum)(如假高粱(Sorghum halepensis))；和雀麦属(Bronms)(如无芒雀麦(Bromus inermis)。
寡核苷酸也可应用于将免疫反应从Th2免疫反应重定向到Th1免疫反应。其致使产生相对平衡的Th1/Th2环境。从Th2到Th1免疫反应的重定向可通过测量响应核酸产生的细胞因子的水平进行评估(如通过诱导单核细胞和其它细胞产生Th1细胞因子，包括IL-12、IFN-γ和GM-CSF)。从Th2到Th1免疫反应的重定向或平衡特别适用于治疗或预防哮喘。例如，治疗哮喘的有效剂量为对于使与哮喘有关的Th2型免疫反应重定向到Th1型反应或平衡的Th1/Th2环境有效的量。在患哮喘症患者呼吸道中，Th2细胞因子，特别是IL-4和IL-5增多。本发明的CpG免疫刺激性寡核苷酸致使增加Th1细胞因子，以利于平衡免疫系统、预防或降低与主要为Th2免疫反应有关的副作用。
除过敏或哮喘外，在本发明的一些方面，CpG免疫刺激性寡核苷酸也可用作治疗受试者的疫苗，该受试者为处于易感感染性组织获得感染的危险或患有已检测出特异癌抗原的癌的受试者。无抗原或过敏原时也可施用CpG免疫刺激性寡核苷酸以免于感染、过敏或癌，且在该情况下，可反复施用而起长期保护作用。此处所用的处于危险的受试者为具有暴露于传染病原或癌或过敏原的任意危险或患癌危险的受试者。例如，处于危险的受试者为计划去一个发现了特定类型的感染源地方的受试者，或可为通过生活方式或医疗程序而暴露于具有感染性病原的体液或直接暴露于病原的受试者，或任意一个居住在已经鉴定出有感染性生物体或过敏原地区的受试者。处于患感染危险受试者也包括施用医疗机构推荐的具有特定感染性生物抗原的疫苗的普通人群。若抗原为过敏原，且受试者对该特定抗原患过敏反应，并且受试者可能暴露于该抗原，即在开花季节，那么该受试者则处于暴露于抗原的危险。处于患过敏或哮喘危险的受试者包括那些已经被鉴定为患有过敏或哮喘但却在CpG免疫刺激性寡核苷酸治疗期间不具有活动的疾病的受试者，以及由于遗传或环境因素被认为处于患这些疾病危险的受试者。
处于患癌危险的受试者为具有高患癌可能性的人。例如，这些受试者包括具有遗传异常的试受者，已显示出遗传异常与患癌高可能性有相关关系，并包括暴露于如烟草、石棉或其它化学毒素的致癌物的受试者，或包括曾经治疗过癌症并明显处于好转的受试者。当对处于患癌危险的受试者施用对受试者处于患有危险的癌类型特异的抗原和CpG免疫刺激性寡核苷酸时，受试者就可能在癌细胞生长时杀死它们。若肿瘤在受试者体内开始形成，受试者体内就可形成针对肿瘤抗原的特异免疫反应。
除了将CpG免疫刺激性寡核苷酸应用于预防性治疗外，本发明也包括将CpG免疫刺激性寡核苷酸应用于对患有传染病、过敏、哮喘或癌的受试者的治疗。
患有传染病的受试者为已暴露于传染病原体并在体内有急性或慢性可检测到水平的病原体的受试者。CpG免疫刺激性寡核苷酸与或不与抗原一起使用以引起抗原特异的能降低感染性病原体水平的或根除感染性病原体的全身或粘膜免疫反应。此处所用的传染病为由外源微生物在体内存在而引起的疾病。建立有效的疫苗策略和治疗来保护作为致病菌进入的主要位置的机体粘膜表面至关重要。
患癌受试者为具有可检测到的癌细胞的受试者。癌可为恶性或非恶性癌。癌或肿瘤包括但不限于胆管癌；脑癌；乳癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌；上皮内瘤；淋巴瘤；肝癌；肺癌(即小细胞和非小细胞)；黑素瘤；成神经细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤；皮肤癌；睾丸癌；甲状腺癌；和肾脏癌症，以及其它癌和肉瘤。在一个实施方案中，癌症为毛细胞白血病、慢性骨髓瘤白血病、皮肤T细胞白血病、多发性骨髓瘤、囊泡淋巴瘤、恶性黑素瘤、扁平上皮癌、肾脏细胞癌、前列腺癌、膀胱细胞癌或者结肠癌。
受试者为人或脊椎动物，包括但不限于狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、火鸡、鸡、如猴子的灵长类动物和如鲑鱼的鱼(水产养殖种类)。因此，本发明也可应用于治疗非人受试者的癌和肿瘤、传染病，和过敏/哮喘。癌症为伴侣动物(即猫和狗)的主要处死原因之一。
此处所用的术语治疗，当与疾病，如传染病、癌、过敏或哮喘相关时，是指预防性治疗，其增强了受试者对产生疾病的抵抗(如抵抗病原体感染)，或者换句话说，降低受试者体内出现疾病的可能性(如变成病原体感染)，以及指在受试者已患疾病后为战胜疾病(如降低或消除感染)或避免疾病恶化而进行的治疗。
当CpG寡核苷酸与抗原施用时，受试者就可能暴露于抗原。此处所用的术语暴露于是指在体内用抗原主动接触受试者的步骤或使受试者被动暴露于抗原。领域内熟知使受试者主动暴露于抗原的方法。一般而言，通过如静脉内、肌内、口、皮肤、粘膜、鼻内、气管内或皮下给药的手段直接施用抗原给受试者。可全身或局部地施用抗原。下面更详细地描述施用抗原和CpG免疫刺激性寡核苷酸的方法。若抗原在体内变得暴露于免疫细胞，则受体为被动暴露于抗原。例如，通过外源病原体进入体内或通过肿瘤细胞在其表面表达外源抗原的发展，则受试者可被动暴露于抗原。
受试者被动暴露于抗原的方法特别地取决于施用CpG免疫刺激性寡核苷酸的时间安排。例如，处于患癌或传染病或过敏或哮喘反应危险的受试者中，在危险最大时，即在过敏季节或暴露于致癌药之后，可周期地给受试者施用CpG免疫刺激性寡核苷酸。此外，在旅行者去处于暴露于感染源的危险的外地旅行前，对其施用CpG免疫刺激性寡核苷酸。同样地，可对处于暴露于生化战争的士兵或平民施用CpG免疫刺激性寡核苷酸，当且如果受试者暴露于抗原，以诱导系统或粘膜对抗原的免疫反应。
此处所用的抗原为能激发免疫反应的分子。抗原包括但不限于细胞、细胞提取物、蛋白质、多肽、肽、多糖、多糖缀合物、多糖与其它分子的肽和非肽模拟物、小分子、脂、糖脂、糖、病毒与病毒提取物和多细胞生物体，如寄生虫和过敏原。术语抗原广泛地包括任意类型的能由宿主免疫系统识别成外源物的分子。抗原包括但不限于癌抗原、微生物抗原和过敏原。
此处所用的癌抗原为一种与肿瘤或癌细胞表面相关的并与MHC分子在抗原呈递细胞表面表达时能激发免疫反应的化合物，如肽或蛋白质。可通过如在Cohen等人，1994，癌症研究(Cancer Research)，54：1055中所描述制备癌细胞的粗提取物、通过部分地纯化抗原、通过重组技术或通过从头合成已知抗原，从癌细胞制备癌抗原。癌抗原包括但不限于那些重组表达的、免疫原部分的或整个肿瘤或癌的抗原。可通过重组或任意其它领域内已知手段分离或制备这些抗原。
此处所用的微生物抗原为微生物体抗原，且包括但不限于病毒、细菌、寄生虫和真菌。这些抗原包括完整的微生物以及自然分离株和其片段或衍生物，且也包括与天然微生物抗原相同或相似的并诱导对该微生物特异的免疫反应的合成化合物。若化合物诱导响应天然微生物抗原的免疫(体液的和/或细胞的)，则该化合物与天然微生物抗原相似。本领域常用这些抗原，且本领域技术人员熟知这些抗原。
此处所用的术语基本上纯化指基本上从其它蛋白质、脂、糖或其它物质分离出与其天然相关联的多肽。本领域内技术人员应用蛋白质纯化的标准技术能纯化病毒或细菌多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上通常只有一条主要条带。在部分糖基化的多肽或那些具有几个起始密码子的多肽的情况下，在非还原聚丙烯酰胺凝胶上可能有几条带，但这些带会形成与多肽的带明显不同的模式。也可通过氨基末端氨基酸序列分析法检测病毒或细菌的多肽的纯度。本发明包括其它类型的不由核酸载体编码的抗原，如多糖、小分子、模拟物等。
本发明的寡核苷酸可与抗微生物剂一起施用于受试者。此处所用的抗微生物剂指天然存在的或合成的能杀死或抑制感染性微生物的化合物。根据本发明，有益的抗微生物剂类型依赖于受试者感染的或处于感染危险的微生物类型。抗微生物剂包括但不限于抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗寄生剂。本领域内技术人员已充分确定了如“抗感染药”、“抗细菌剂”、“抗病毒剂”、“抗真菌剂”、“抗寄生虫剂”和“驱虫剂”短语的含义，并在标准医学教科书中进行了定义。简而言之，抗细菌剂杀死或抑制细菌，且包括抗生素和其它合成的或天然的具有相似功能的化合物。抗生素为由细胞如微生物在次级代谢时产生的低分子量分子。通常，抗生素干扰一个或多个对微生物特异的而在宿主细胞内不存在的细菌功能或结构。抗病毒剂可从天然原料中分离或合成，并可用于杀死或抑制病毒。抗真菌剂用于治疗浅表真菌感染，以及条件致病性的和原发性系统真菌感染。抗寄生虫剂杀死或抑制寄生虫。
抗寄生虫剂，对人施用的也称为驱虫剂，包括但不限于阿苯达唑、两性霉素B、苄硝唑、硫双二氯酚、盐酸氯喹、磷酸氯喹、氯林肯霉素、去氢吐根碱、乙胺嗪、二氯尼特糠酸酯、依氟鸟氨酸、furazolidaone、糖皮质激素、卤泛群、双碘喹啉、伊维菌素、甲苯咪唑、甲氟喹、葡甲胺锑酸盐、美拉胂醇、美曲磷酯、甲硝哒唑、氯硝柳胺、硝呋莫司、奥沙尼喹、巴龙霉素、异硫代羟酸五脒、哌嗪、吡喹酮、磷酸普奈马奎、双羟萘酸噻嘧啶、乙胺嘧啶磺酰胺类(pyrimethanmine-sulfonamides)、乙胺嘧啶-磺胺多辛、盐酸奎纳克林，硫酸奎宁、葡萄糖酸奎尼丁、螺旋霉素、锑酰葡糖酸钠(葡糖酸钠锑)、苏拉明、四环素、强力霉素、涕必灵、替硝唑、三甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基唑(trimethroprim-sulfamethoxazole)和锥虫胂胺，这些药物可单独使用或与其它药物联用。
抗细菌剂杀死或抑制细菌的生长或功能。一大类抗微生物剂为抗生素。有效杀死或抑制大范围细菌的抗生素指广谱抗生素。抗生素的其它类型主要有效地抗革兰氏阳性或革兰氏阴性类细菌。这些类型的抗生素称为窄谱抗生素。有效抗单一生物或疾病且不抗其它类型细菌的其它抗生素，称为受限谱抗生素。有时根据抗细菌剂的主要作用模式而对其分类。通常，抗细菌剂为细胞壁合成抑制剂、细胞膜抑制剂、蛋白质合成抑制剂、核酸合成或功能抑制剂、和竞争性抑制剂。
抗病毒剂为预防病毒感染细胞或病毒在细胞内复制的化合物。抗病毒剂比抗细菌剂要少许多，因为在宿主细胞内病毒复制的过程与DNA复制如此相近，以至于非特异抗病毒剂对宿主常常有毒。在病毒感染过程中有几个步骤可由抗病毒剂阻断或抑制。这些步骤包括：病毒贴附宿主细胞(免疫球蛋白或结合肽)、病毒脱壳(如金刚烷胺)、病毒mRNA的合成或翻译(如干扰素)、病毒RNA或DNA的复制(如蛋白酶抑制剂)和病毒的出芽与释放。
核苷酸类似物为与核苷酸相似的、但有不完整或异常脱氧核糖或核糖基团的合成化合物。一旦核苷酸类似物进入细胞，就进行磷酸化，产生三磷酸酯而与正常核苷酸竞争对病毒DNA或RNA的掺入。核苷酸类似物的三磷酸酯形式一旦掺入到生长的核酸链，就导致与病毒聚合酶不可逆结合并因而终止链。核苷酸类似物包括但不限于无环鸟苷(用于单纯疱疹病毒和水痘带状疹子病毒的治疗)、丙氧鸟苷(用于治疗巨细胞病毒)、疱疹净、病毒唑(用于治疗呼吸道合胞病毒)、双脱氧次黄苷、双脱氧胞苷、齐多夫定(叠氮胸苷)、咪喹莫特和resimiquimod。
干扰素为病毒感染的细胞及免疫细胞分泌的细胞因子。干扰素通过结合到与感染细胞邻近的细胞上的特异受体，导致细胞发生变化，使其免于病毒感染而起作用。α-干扰素和β-干扰素也诱导MHC I类和II类分子在感染细胞表面表达，导致增加的抗原呈递用于宿主免疫细胞识别。可获得重组形式的α-干扰素和β-干扰素，并已经用于治疗慢性乙型肝炎和丙型肝炎感染。在对抗病毒治疗有效剂量情况下，干扰素具有严重的副作用，如发烧、不适和体重下降。
本发明应用的抗病毒剂包括但不限于免疫球蛋白、金刚烷胺、干扰素、核苷酸类似物和蛋白酶抑制剂。抗病毒剂特异实例包括但不限于乙酰化甘露聚糖；无环鸟苷；无环鸟苷钠盐；阿德福韦；阿洛夫定；阿韦舒托；金刚烷胺盐酸盐；阿拉诺丁；阿立酮；阿替韦啶甲磺酸盐；阿夫立定；西多福韦；西潘茶碱；阿糖胞苷盐酸盐；地拉韦啶甲磺酸盐；地昔洛韦；去羟肌苷；二沙利；依度尿苷；Enviradene；恩韦肟；泛昔洛韦；法莫汀盐酸盐；非西他滨；非阿尿苷；磷利酯；膦甲酸钠；膦乙醇钠；更昔洛韦；更昔洛韦钠；碘苷；Kethoxal；拉米夫定；洛布卡韦；美莫汀盐酸盐；美替沙腙；奈韦拉平；喷昔洛韦；吡罗达韦；病毒唑；金刚乙胺盐酸盐；沙奎那韦甲磺酸盐；索金刚胺盐酸盐；索立夫定；维司托隆；司他夫定；替洛隆盐酸盐；三氟尿苷；丙氧鸟苷盐酸盐；阿糖腺苷；阿糖腺苷磷酸盐；阿糖腺苷磷酸钠；韦罗肟；扎西他滨；齐多夫定和净韦肟。
抗真菌剂用于治疗和预防感染性真菌。有时通过抗真菌剂的作用机理对其分类。一些抗真菌剂作为细胞壁抑制剂通过抑制葡萄糖合成酶起作用。这些包括但不限于basiungin/ECB。其它抗真菌剂通过破坏膜完整性而起作用。这些包括但不限于咪唑，如克霉唑、sertaconzole、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、咪康唑和voriconacole，以及FK 463、两性霉素B、BAY 38-9502、MK 991、pradimicin、UK 292、布替萘芬和特比萘芬。其它抗真菌剂通过分解几丁质(如几丁质酶)或抑制免疫反应(501膏)而起作用。
CpG免疫刺激性寡核苷酸可组合其它治疗剂，如佐剂，以增强免疫反应。可同时或顺序施用CpG免疫刺激性寡核苷酸与其它治疗剂。当同时施用其它治疗剂时，它们可以同一制剂或分别的制剂施用，但要同时施用。当顺序施用其它治疗剂与CpG免疫刺激性寡核苷酸时，需要暂时分别地施用其它治疗剂和CpG免疫刺激性寡核苷酸。施用这些化合物的顺序时间可为几分钟，或时间更长。其它治疗剂包括但不限于佐剂、细胞因子、抗体、抗原等。
本发明的组合物也可与非核酸佐剂一起施用。非核酸佐剂为除了此处所述的CpG免疫刺激性寡核苷酸以外的能刺激体液免疫反应和/或细胞免疫反应的任意分子或化合物。例如，非核酸佐剂包括引起depo作用的佐剂、免疫刺激佐剂，和引起depo作用并激活免疫系统的佐剂。
CpG免疫刺激性寡核苷酸也可用作粘膜佐剂。以前已经讨论过自粘膜递送CpG寡核苷酸诱导全身免疫和粘膜免疫。因此，寡核苷酸可组合其它粘膜佐剂施用。
通过细胞因子(Bueler & Mulligan，1996；Chow等人，1997；Geissler等人，1997；Iwasaki等人，1997；Kim等人，1997)或B-7共刺激分子(Iwasaki等人，1997；Tsuji等人，1997)与CpG免疫刺激性寡核苷酸的共同施用或共线性(co-linear)表达也可诱导或增加免疫反应。术语细胞因子为多种可溶性的、在10-9到10-12摩尔浓度下起体液调节剂作用、并在正常或病理条件下调节个体细胞和组织的功能活性的蛋白质和多肽的总称。这些蛋白质直接地介导细胞间的相互作用，并调节发生在细胞外环境的过程。细胞因子的实例包括但不限于IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素-γ(γ-IFN)、IFN-α、肿瘤坏死因子(TNF)、TGF-β、FLT-3配体和CD40配体。
寡核苷酸也用于提高树突细胞的成活、分化、激活和成熟。CpG免疫刺激性寡核苷酸对增强树突细胞的细胞成活、分化、激活和成熟具有独特能力。
CpG免疫刺激性寡核苷酸也提高天然杀伤细胞的裂解活性和抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。通过将CpG免疫刺激性寡核苷酸与如癌细胞的靶细胞特异的抗体组合进行ADCC。当抗体与CpG免疫刺激性寡核苷酸一起施用于受试者时，可诱导受试者免疫系统杀死癌细胞。应用于ADCC过程中的抗体包括体内与细胞相互作用的抗体。领域内已对许多这种对靶细胞特异的抗体进行了描述，且许多抗体有售。
也可结合抗癌治疗来施用CpG免疫刺激性寡核苷酸。抗癌治疗包括癌药、放疗和外科手术。此处所用的“癌药”指为了治疗癌而施用给受试者的药剂。此处所用的“治疗癌”包括阻断癌发展、降低癌的症状，和/或抑制已经形成的癌的生长。在其它方面，为降低患癌危险而对处于患癌危险的受试者施用癌药。此处描述了多种治疗癌的药物。对本说明书而言，将癌药分为化疗剂、免疫治疗剂、癌疫苗、激素治疗和生物反应调节剂。在一个实施方案中，化疗剂癌药选自于氨甲蝶呤、长春新碱、亚德里亚霉素、顺氯氨铂、含氯乙基亚硝基脲的非糖物质、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素、氮烯唑胺、紫杉醇、fragyline、葡甲铵GLA、戊柔比星、carmustaine和poliferposan、MMI270、BAY 12-9566、RAS法尼西基转移酶抑制剂、法尼西基转移酶抑制剂、MMP、MTA/LY231514、L Y264618/Lometexol、Glamolec、CI-994、TNP-470、托泊替康/拓扑替康、PKC412、伐司朴达/PSC833、盐酸米托蒽醌/Mitroxantrone、Metaret/苏拉明、图巴马司他、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incel/VX-710、VX-853、ZDOlOl、ISI641、ODN 698、TA 2516/Marmistat、BB2516/Marmistat、CDP 845、D2163、PD183805、DX8951f、Lemonal DP2202、FK 317、Picibanil/OK-432、AD 32/Valrubicin、Metastron/strontinmderivative、替莫唑胺/Temozolomide、Evacet/阿霉素脂质体、Yewtaxan/紫杉醇、Taxol/紫杉醇、Xeload/卡培他滨、氟铁龙/Doxifluridine、Cyclopax/口服紫杉醇、Oral Taxoid、SPU-077/顺氯氨铂、HMR 1275/Flavopiridol、CP-358(774)/EGFR、CP-609(754)/RAS致癌基因抑制剂、BMS-182751/口服铂类、UFT(喃氟啶/尿嘧啶)、Ergamisol/左旋四咪唑、二氢嘧啶脱氢酶灭活剂/776C85/5FU增强剂、抗癌妥/左旋咪唑、Camptosar/Irinotecan、Tumodex/Ralitrexed、Leustatin/克拉屈滨、Paxex/Paclitaxel、Doxil/脂质体阿霉素、Caelyx/脂质体阿霉素、Fludara/氟阿糖腺苷、Pharmarubicin/表比星、脂质体阿糖胞苷、ZDl 839、LU 79553/Bis-Naphtalimide、LU103793/海兔毒素、Caetyx/脂质体阿霉素、Gemzar/Gemcitabine、ZD0473/Anormed、YM 116、Iodine seeds、CDK4和CDK2抑制剂、PARP抑制剂、D4809/Dexifosamide、Ifes/Mesnex/Ifosamide、Vumon/替尼泊苷、伯尔定/Carboplatin、Plantinol/顺氯氨铂、Vepeside/依托泊苷、ZD 9331、多烯紫杉醇/紫杉萜、鸟嘌呤阿拉伯糖苷药物前体、Taxane类似物、亚硝基脲、烷化剂如melphelan和环磷酰胺、氨基导眠能、天冬酰胺酶、白消安、卡波铂、Chlorombucil、盐酸阿糖胞苷、放线菌素D、盐酸道诺红菌素、雌氮芥磷酸钠、足叶乙甙(VP 16-213)、5氟脱氧尿苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟他米特、羟基尿(羟基尿素)、异环磷酰胺、干扰素α-2a、α-2b、醋酸亮丙瑞林(LHRH释放因子类似物)、环己亚硝脲(CCNU)、盐酸二氯甲基二乙胺(氮芥)、颈基嘌呤、巯乙磺酸钠、邻氯苯对氯苯二氯乙烷(o.p′-DDD)、盐酸米托蒽醌、奥曲肽、Plicamycin、盐酸甲基苄肼、链脲霉素，枸橼酸他莫昔芬、硫鸟嘌呤、硫化三环氮丙基磷，硫酸长春花碱、安吖啶(m-AMSA)、阿扎胞苷、红细胞生成素、六甲密胺(HMM)、白介素2、米托胍腙(甲基-GAG；甲基乙醛基二脒基腙；MGBG)、喷司他丁(2′deoxycoformycin)、司莫司汀(甲基-CCNU)、替尼泊苷(VM-26)和硫酸长春地辛。在一个重要的实施方案中，癌药为紫杉酚。在另一实施方案中，癌药为卡铂与紫杉醇的组合。
在另一实施方案中，癌药为选自于下述的免疫治疗剂：Ributaxin、Herceptin、Quadramet、Panorex、IDEC-Y2B8、BEC2、C225、Oncolym、SMART M195、ATRAGEN、Ovarex、Bexxar、LDP-03、ior t6、MDX-210、MDX-11、MDX-22、OV103、3622W94、抗-VEGF、Zenapax、MDX-220、MDX-447、MELIMMUNE-2、MELIMMUNE-I、CEACIDE、Pretarget、NovoMAb-G2、TNT、Gliomab-H、GNI-250、EMD-72000、LymphoCide、CMA 676、Monopharm-C、4B5、ior egf.r3、ior c5、BABS、抗-FLK-2、MDX-260、ANA Ab、SMART IDlO Ab、SMART ABL 364 Ab和ImmuRAIT-CEA。
此外，在本发明的方法中，与CpG免疫刺激性寡核苷酸一起使用的癌药不只一种。例如，根据需要，将CpG免疫刺激性寡核苷酸与化疗剂和免疫治疗剂一起施用。可选地，为了对患癌或处于患癌危险的受试者进行治疗，可对其施用包含免疫治疗剂与癌疫苗，或化疗剂与癌疫苗，或化疗剂、免疫治疗剂与癌疫苗的癌药。
将CpG免疫刺激性寡核苷酸与如单克隆抗体的免疫治疗剂联用能通过许多机制包括ADCC的增强(如上所述)、天然杀伤(NK)细胞的激活和IFN-α水平的增加，来增加长期存活率。当寡核苷酸与单克隆抗体联合施用时，寡核苷酸用于降低为获得生物学作用所需的单克隆抗体的剂量。
此处所用的术语“癌抗原”和“肿瘤抗原”可交替使用，以指通过癌细胞进行差异表达并因此进行用以靶向癌细胞的抗原。癌抗原为能潜在地刺激明显肿瘤特异的免疫反应的抗原。部分这类抗原虽然不必表达，但可由正常细胞编码。这些抗原特征为：在正常细胞中为沉默的(即不表达)；仅在一些分化阶段中表达；和暂时表达，如胚胎抗原。其它癌抗原由突变细胞基因编码，如致癌基因(如活化的ras致癌基因)、抑制基因(如p53突变体)、由内部缺失或染色体易位产生的融合蛋白质。还有其它癌抗原由病毒基因编码，如RNA和DNA肿瘤病毒携带的病毒基因。
CpG免疫刺激性寡核苷酸也用于治疗和预防自身免疫性疾病。自身免疫性疾病为受试者自身抗体与宿主组织反应或免疫效应T细胞与内部自体肽自动反应并破坏组织的一类疾病。因此，引起的免疫反应抗称为自身抗原的受试者自身抗原。自身免疫性疾病包括但不限于风湿性关节炎、Crohn病、多发性硬化、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫脑脊髓炎、重症肌无力(MG)、桥本甲状腺炎、古德帕斯丘综合征、天疱疮(如寻常天疱疮)、Grave病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、抗胶原质抗原硬皮症、混合性结缔组织病、多肌炎、恶性贫血、先天阿狄森病、自身免疫相关不孕、肾小球肾炎(如新月体肾小球肾炎、增生性肾小球肾炎)、大疱性类天疱疮、干燥综合症，胰岛素抵抗力和自身免疫性糖尿病。
此处所用的“自身抗原”指正常宿主组织抗原。正常宿主组织不包括癌细胞。因此，在自身免疫性疾病上下文中，引起的抗自身抗原的免疫反应为不期望的免疫反应，且破坏并损伤正常组织，而引起的抗癌抗原的免疫反应为期望的免疫反应，且破坏肿瘤或癌。因此，在本发明的治疗自身免疫性紊乱的一些方面中，不推荐将CpG免疫刺激性寡核苷酸与自身抗原特别是那些自身免疫性疾病的靶抗原一起施用。
在其它例子中，CpG免疫刺激性寡核苷酸可与低剂量自身抗原一起递送。许多动物研究已经表明对粘膜施用低剂量抗原可导致免疫低反应或“耐受”状态。作用机制似乎是细胞因子介导的从Th1转向Th2和Th3主导的(即TGF-β主导的)反应的免疫偏离。低剂量抗原的主动抑制也抑制无关的免疫反应(旁观者抑制)，其在治疗如风湿性关节炎和SLE的自身免疫性疾病方面是令人感兴趣的。旁观者抑制涉及在以抗原特异的或抗原非特异的方式释放促炎性细胞因子和Th1细胞因子的局部环境中，分泌Th1反调节的抑制子细胞因子。此处所用的“耐受”用于指这种现象。实际上，经口耐受已经有效地治疗动物的许多自身免疫性疾病，包括实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、实验性自身免疫性重症肌无力、胶原诱导性关节炎(CIA)和胰岛素依赖型糖尿病。在这些模型中，自身免疫性疾病的预防和抑制与抗原特异的体液和细胞反应从Th1到Th2/Th3反应的转换相关。
本发明也包括使用CpG免疫刺激性寡核苷酸诱导抗原非特异的先天免疫激活(innate immune activation)和广谱抵抗感染攻击的方法。此处所用的术语抗原非特异的先天免疫激活指非B细胞的免疫细胞的激活，例如包括NK细胞、T细胞或其它可以抗原非依赖性方式反应的免疫细胞或这些细胞的一些组合的激活。诱导广谱抵抗感染攻击，因为免疫细胞为活化形式，并且针对入侵的化合物或微生物反应。免疫细胞不必特定于针对特定抗原。这对生物战和其它前面所述的情况如旅行者特别有用。
可直接对受试者施用CpG免疫刺激性寡核苷酸或可与核酸递送复合体一起施用。核酸递送复合体为结合(如离子键或共价键结合；或包囊入)靶向工具(如产生高亲和性结合靶细胞的分子)的核酸分子。核酸递送复合体的例子包括结合固醇(如胆固醇)、脂(如阳离子脂类、病毒颗粒或脂质体)或靶细胞特异结合剂(如靶细胞特异受体识别的配体)的核酸。优选的复合体为在体内足够稳定，从而防止在被靶细胞内化前的明显解偶联。但复合体在细胞内适当条件下可被切割以释放出功能性寡核苷酸。
已经描述了用于将抗原与寡核苷酸递送到表面的递送载体或递送装置。可仅施用CpG免疫刺激性寡核苷酸和/或抗原和/或其它治疗剂(如在盐水或缓冲液中)或使用领域内熟知的任意递送载体。
术语CpG免疫刺激性寡核苷酸的有效剂量指实现期望的生物作用的必要的或充分的剂量。例如，与抗原一起施用的用于诱导粘膜免疫的CpG免疫刺激性寡核苷酸的有效剂量为在暴露于抗原后，与抗原反应而引起IgA产生所必需的剂量，而用于诱导全身免疫所需的剂量为在暴露于抗原后，与抗原反应而引起IgG产生所必需的剂量。结合此处提供的教导，通过在多种活性化合物和如潜能、相对生物利用率、患者体重、有害副作用程度及优选的施用方式的权重因素中进行选择，可以进行有效的预防或治疗方案，其不引起实质的毒性，但却十分有效地治疗特定受试者。根据一些因素，如需要治疗的疾病或症状、施用的特定CpG免疫刺激性寡核苷酸、受试者体型、或疾病或症状的严重性，可以改变用于任意特定施用的有效剂量。领域内普通的一位技术人员可凭经验而无需过多的实验即可确定特定的CpG免疫刺激性寡核苷酸和/或抗原和/或其它治疗剂的有效剂量。
对受试者进行粘膜或局部递送此处所述化合物的剂量，根据施用时间为每日、每周、每月或任意其它时间量，一般为每次施用约0.1μg至10mg。更一般的粘膜或局部施用剂量范围为每次约10μg至5mg，且最一般地为约100μg至1mg，以隔开的天或周施用2-4次。更一般地，免疫刺激剂量范围为每次1μg至10mg，且最一般地为10μg至1mg，每日或每周施用。为诱导抗原特异的免疫反应对受试者进行肠胃外施用此处所描述的化合物的剂量，一般比疫苗佐剂或免疫刺激施用的有效粘膜剂量高5至10,000倍，且更一般地高10至1,000倍，且最一般地高20至100倍，其中化合物是与抗原而不是其它治疗剂一起递送。为诱导先天免疫反应或增加ADCC或诱导抗原特异的免疫反应而肠胃外施用此处所描述的化合物的剂量，根据施用的时间顺序是日、周、月或任意其它时间顺序，一般每次施用范围为0.1μg至10mg，其中CpG免疫刺激性寡核苷酸与其它治疗剂组合或装于专门递送载体中进行递送。为达到这些目的，更一般的肠胃外施用剂量范围为每次约10μg至5mg，且最一般地为约100μg至1mg，以隔开的天或周施用2-4次。然而在一些实施方案中，为达到这些目的而肠胃外施用剂量范围比上面所描述的一般剂量高5至10,000倍。
对于此处所描述的任意化合物，治疗有效量可自动物模型最初加以确定。治疗有效量也可由在人体内试验的(已经开始人临床试验)CpG寡核苷酸或化合物的数据确定，所述化合物已知其表现出相似的药理活性，如其它佐剂，如LT和用作疫苗的其它抗原。对于肠胃外施用可能需要更高的剂量。可根据施用的化合物的相对生物利用度和潜能进行调整施用的剂量。根据上面描述的方法以及领域内众所周知的方法，普通技术人员能很好地调整施用剂量以获得最大化功效。
本发明的制剂可于可药用溶液中施用，所述可药用溶液一般包含可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体、佐剂和任选地其它治疗成分。
对于治疗上的应用，可通过任意将寡核苷酸递送到目的表面如粘膜表面和系统表面的方式施用有效剂量的CpG免疫刺激性寡核苷酸。本发明的药物组合物可通过任意的技术人员熟知的手段进行施用。优选的施用方式包括但不限于经口、肠胃外、肌内、鼻内、舌下、气管内、吸入、眼睛、阴道和直肠。
对于口腔施用，通过领域内众所周知的可药用载体与活性化合物的组合，可容易地制剂化合物(即CpG免疫刺激性寡核苷酸、抗原和其它治疗剂)。这些载体可使本发明的化合物制成用于接受治疗的受试者口腔摄取的片、丸、糖衣丸、胶囊、流体、凝胶、糖浆、浆、悬浮液等剂型。经口药可加入固体赋形剂，可选地，加入适当的助剂后，研磨所得的混合物，并处理混合物颗粒，若期望的话，可制剂为片剂或糖锭剂。特别地，适当的赋形剂为填充剂，如包括乳糖、蔗糖、甘露糖或山梨糖的糖；纤维素制品，如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。若期望的话，可加入崩解剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或褐藻酸或如海藻酸钠的盐。任选地，经口制剂也可制剂于盐水或缓冲液中，即EDTA用于中和内部酸性环境，或不使用任何载体而施用。
特别考虑了上述一种或多种组分(component)的经口剂型。可对一种或多种组分进行化学修饰以使经口递送的衍生物是有效的。通常考虑的化学修饰为将至少一个部分(moiety)连接到组分分子上，所述部分允许(a)抑制蛋白质裂解；和(b)从胃或肠中进行血液。也期望增加一种或多种组分的总体稳定性并增加在体内的循环时间。这种部分的例子包括：聚乙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。Abuchowski和Davis，1981，″SolublePolymer-Enzyme Adducts″，Enzymes as Drugs，Hocenberg和Roberts编，Wiley-Interscience，New York，NY，pp.367-383；Newmark等人，1982，J.Appl.Biochem.4：185-189。其它可用聚合物为聚-1，3-二氧戊烷(dioxolane)和聚-l，3，6-tioxocane。对于药物应用，如上所述，优选地为聚乙二醇部分。
组分的释放位置可为胃、小肠(十二指肠、空肠或回肠)或大肠。领域内的技术人员可获得不在胃内溶解，但却可在十二指肠或肠内其它位置释放的制剂。优选地，通过保护寡核苷酸或不在胃环境中如在肠中释放生物活性物质，将使释放免于胃环境的有害作用。
为确保完全抵抗胃环境，有必要包衣使其在至少pH5.0时不渗透。更常见的用作肠溶衣的惰性成分的例子为偏苯三酸醋酸纤维素(CAT)、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、邻苯二甲酸聚乙酸乙烯酯(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、Eudragit L、Eudragit S和紫胶。这些包衣可用作混合的膜。
不是用作抵抗胃而起保护作用的包衣或包衣混合物也可用于片剂上。其包括糖衣，或使片剂易于吞服的包衣。胶囊剂可由用于递送干治疗剂，即粉末的硬壳(如明胶)组成；对于流体形式，可使用软明胶。扁囊剂的壳物质为粗淀粉或其它可食纸。对于丸剂、锭剂、塑片剂或药片粉末，可使用潮湿结块技术。
剂型中的治疗剂可包含细小的大量颗粒，粒径为约1mm的细粒或球状粒子。用于胶囊施用的材料剂型也可为粉末、轻微压缩的栓、甚或片剂。可通过压缩制备治疗剂。
也可包括着色剂与调味剂。例如，可制剂寡核苷酸(如通过脂质体或微球包封)，然后进一步将其加入到可食产品中，如包含着色剂和调味剂的冷冻饮料。
可用惰性材料稀释或增加治疗剂的体积。这些稀释剂包括糖，特别地为甘露醇、a-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、经修饰的葡聚糖和淀粉。一些无机盐也可用作填充剂，包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。一些商业可获得的稀释剂为Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress和Avicell。
在将治疗剂制剂为固体剂型时可包括崩解剂。用作崩解剂的材料包括但不限于淀粉(包括基于淀粉的商业崩解剂)、Explotab。也可使用羟基乙酸淀粉钠、安伯来特、羧甲基纤维素钠、ultramylopectin、藻酸钠、明胶、橙皮、酸性羧甲基纤维素、天然海绵和皂土。另一种形式的崩解剂为不溶性阳离子交换树脂。粉末化的胶可用作崩解剂和粘合剂，且其包括如琼脂、刺梧桐或黄蓍胶的粉末化胶。褐藻酸及其钠盐也可用作崩解剂。
粘合剂可使治疗剂聚集成为硬片剂，且包括源自于天然产物材料，如阿拉伯树胶、黄蓍胶、淀粉和凝胶。其它包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)都可在醇溶液中使用以使治疗剂成为颗粒。
治疗剂剂型中包括抗磨擦剂，以预防在配制加工过程的粘结。在治疗剂与模壁间为一层润滑剂，且其包括但不限于硬脂酸(包括硬脂酸镁盐与钙盐)、聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、植物油和蜡。也可使用可溶润滑剂，如月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁、多种分子量的聚乙二醇、Carbowax醇4000和6000。
可加入助流剂，其在配制过程中增加药物的流动特性以促进压缩过程中的重排。助流剂可包括淀粉、滑石、氧化硅和水合硅铝酸。
为促进治疗剂溶于液体环境中，可加入表面活性剂作为润湿剂。表面活性剂可包括阴离子去污剂，如月桂基硫酸钠、丁二酸二辛酯磺酸钠和二辛酯磺酸钠。可使用阳离子去污剂，包括苯扎氯铵(benzalkonium chloride)或苯索氯铵。剂型中用作表面活性剂的潜在的非离子型去污剂包括聚桂醇400、硬脂酸聚烃氧40、聚氧乙烯蓖麻油10、50及60、单硬脂酸甘油酯、聚山梨醇40、60、65及80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可单独或以不同比率的混合物形式存在于寡核苷酸或衍生物制剂中。
可经口使用的药物制品包括由明胶制成的推入配合胶囊(push-fitcapsules)，以及由明胶与增塑剂如甘油或山梨醇制成的软的密封胶囊。推入配合胶囊包含与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉、和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁和任选地稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可溶于或悬浮于适当的液体中，如脂肪油、液体石蜡或液态聚乙二醇。此外，可加入稳定剂。也可使用制成经口用的微球体。现有技术已充分定义了这种微球体。用于经口施用的全部剂型都应为适合这种施用的剂量。
对于经颊施用，组合物应以常规方式制成片剂或锭剂。
对于通过吸入施用，根据本发明，使用的化合物一般地从加压包装或雾化器中利用适当的推进剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当气体，以喷雾方式递送。在加压气雾剂的情况时，单位剂量可通过使用阀来递送规定的量。可制备用于吸入器或吹入器的明胶胶囊与药筒，其包含化合物和适当的如乳糖或淀粉的粉末基质的粉末混合物。
此处也考虑了寡核苷酸(或其衍生物)的肺部递送。当吸入寡核苷酸时，寡核苷酸被递送入哺乳动物肺部并穿过肺粘膜上皮进入血液。吸入分子的其它报告包括Adjei等人，1990，药物研究(Pharmaceutical Research)，7：565-569；Adjei等人，1990，国际制药学杂志(International Journal ofPharmaceutics)，63：135-144(醋酸亮丙瑞林)；Braquet等人，1989，心血管药理学杂志(Journal of Cardiovascular Pharmacology)，13(suppl.5)：143-146(内皮缩血管肽-1)；Hubbard等人，1989，内科医学年报(Annalsof Internal Medicine)，Vol.III，206-212(al-抗胰蛋白酶)；Smith等人，1989，J.Clin.Invest.84：1145-1146(a-1-蛋白酶)；Oswein等人，1990，“蛋白质雾化(Aerosolization of Proteins)”，Proceedings of Symposiumon Respiratory Drug Delivery II，Keystone，Colorado，March，(recombinant human growth hormone)；Debs等人，1988，J.Immunol.140：3482-3488(干扰素-g与肿瘤坏死因子α)和Platz等人，美国专利号5,284,656(粒细胞集落刺激因子)。1995年9月19日授予Wong等人的美国专利号5,451,569中描述了肺部递送药物的用于系统反应的方法与化合物。
为在本发明的实施中使用，考虑了为在肺部递送治疗剂产品而设计的大范围的机械装置，包括但不限于雾化器、计量吸入器和粉末吸入器，领域内的技术人员熟知所有这些装置。
一些具体的商业可获得的适合本发明实施的装置的例子，包括Mallinckrodt，Inc.，St.Louis，Missouri制造的Ultravent雾化器、MarquestMedical Products，Englewood，Colorado制造的Acorn II雾化器、Glaxo Inc.，Research Triangle Park，North Carolina制造的Ventolin定量剂量吸入器和Fisons Corp.，Bedford，Massachusetts制造的Spinhaler粉末吸入器。
所有这些装置要求使用适于分散寡核苷酸(或衍生物)的剂型。一般地，每种剂型专一使用一种装置类型，并且包括使用除了在治疗中使用的常用的稀释剂、佐剂和/或载体以外的适当的推进剂物质。也考虑使用脂质体、微胶囊或微球体、包合络合物或其它类型的载体。根据化学修饰的类型或使用的装置类型，也可在不同剂型中制备化学修饰的寡核苷酸。
适用于喷射或超声波雾化器的剂型，一般包括溶于水的寡核苷酸，浓度为每毫升溶液含0.1到25mg生物活性寡核苷酸。剂型也可包括缓冲液或简单糖(如用于稳定寡核苷酸和调节渗透压)。喷雾剂型也可包含表面活性剂，以减少或预防由溶液在形成气雾过程中雾化造成的寡核苷酸表面聚集。
用于定量剂量吸入装置的剂型，一般包含在表面活性剂帮助下悬浮于推进剂中的充分分散的寡核苷酸粉末。推进剂可为用于该目的的任何常规材料，如氯氟碳、氢氯氟碳、氢氟碳、或烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷或其组合物。适当的表面活性剂包括失水山梨醇三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性剂。
用于从粉末吸入器装置中分散的剂型包含充分分散的干燥的含有寡核苷酸的粉末，且也可包括填充剂，如乳糖、山梨醇、蔗糖或甘露醇，用量为使粉末从装置中易于分散的量，如占剂型重量的50％至90％。对于最有效地递送至远端肺，寡核苷酸应最有利地制成平均粒径不到10mm(或微米)的粒子，最优选地为0.5至5mm。
也考虑了本发明的药物组合物的鼻递送。在鼻部施用治疗剂后，鼻递送使本发明的药物组合物直接进入血液而不必在肺沉积药物。鼻递送的剂型也包括含有葡聚糖或环糊精的药物。
对于鼻施用，使用的装置为连接定量剂量喷射器的小硬瓶。在一个实施方案中，通过将本发明的药物组合物溶液吸入到限定体积小室递送定量剂量，该小室具有在压缩小室内的液体时喷射气雾剂的小孔。压缩小室施用本发明的药物组合物。在特定实施方案中，小室为活塞装置。可以购买到该装置。
可选地，塑料挤瓶具有在受到挤压时喷射气雾剂的小孔或开孔。开孔通常在瓶子上部，且上部一般为渐缩形，对于有效施用气雾剂而言，可以在一定程度上适合鼻通道。优选地，对于施用定量剂量药物而言，鼻吸入器提供定量的气雾剂。
当期望将化合物用于全身递送时，可以制成通过注射方式的肠胃外施药，如通过大丸剂注射或持续输注。具有附加防腐剂的注射剂型可以单位剂量形式存在，如存在于安瓿或多剂量容器中。组合物可采取存在于油或水介质的悬浮液、溶液或乳液的形式，且可包含如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的配制试剂。
用于肠胃外施药的药物剂型包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外，活性化合物的悬浮液可制剂为适当的油溶性注射悬浮液。适当的脂溶剂或运载体包括如麻油的脂肪油、或如油酸乙酯或甘油三酸酯的人造脂肪酸酯、或脂质体。水溶性注射悬浮液包含增加悬浮液的粘性的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬浮液也可包含适当的稳定剂或增加化合物溶解性的试剂以允许制备高浓缩溶液。
备选地，活性化合物可为粉末形式，用于在使用之前，使用合适的运载体如如无热原灭菌水构建。
化合物也可配制成直肠或阴道用组合物，如栓剂或滞留灌肠剂，例如含有常规栓剂基质，如可可黄油或其它甘油酯。
除了前面所描述的剂型以外，化合物也可制剂为储库制品。可用适当的聚合物或疏水材料(例如适当的油中的乳液)或离子交换树脂制备这种长期活性剂型，或作为微溶衍生物，如微溶盐。
药物组合物也可包含适当的固体相或胶体相载体或赋形剂。这种载体或赋形剂的例子包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、多种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和如聚乙二醇的聚合物。
适当的液态或固态药物制品形式为，例如，用于吸入的水或盐水溶液、微胶囊化、螺旋化、包衣在微小金粒上、包于脂质体中、雾化、气雾化、用于植入皮肤的小球、或在锋利物体上干燥以刺入皮肤。药物组合物也包括颗粒剂、粉末剂、片剂、包衣片剂、(微)胶囊剂、栓剂、糖浆剂、乳剂、悬浮液、霜剂、滴剂或具有延迟释放活性化合物的制剂，在这些制剂中，如上所述，通常使用赋形剂和添加剂和/或助剂，如崩解剂、粘合剂、包衣剂、溶胀剂、润滑剂、调味剂、甜味剂或增溶剂。药物组合物适用于多种药物递送系统。用作药物递送方法的简述参见Langer，Science249：1527-1533，1990，此处引用作为参考。
CpG免疫刺激性寡核苷酸和任选地其它治疗剂和/或抗原，可以其本身(净的)或以可药用盐形式施用。当用于药物时，盐应为可药用的，但非可药用的盐一般可用于制备可药用盐。这些盐包括但不限于使用以下酸制备的盐：盐酸、溴化氢、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、醋酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、蚁酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。这些盐也可制剂为碱金属盐或碱土金属盐，如羧酸基的钠盐、钾盐或钙盐。
适当的缓冲剂包括：乙酸和盐(1-2％w/v)；柠檬酸和盐(1-3％w/v)；硼酸和盐(0.5-2.5％w/v)；以及磷酸和盐(0.8-2％w/v)。适当的防腐剂包括苯扎氯铵(0.003-0.03％w/v)；氯代丁醇(0.3-0.9％w/v)；对羟基苯甲酸酯(0.01-0.25％w/v)和乙基汞硫代水杨酸钠(0.004-0.02％w/v)。
本发明的药物组合物包含有效剂量的CpG免疫刺激性寡核苷酸，且任选地包含抗原和/或任选地包括在可药用载体中的其它治疗剂。术语可药用载体意指一种或多种相容的适于施用至人或其它脊椎动物的固体或液体填充剂、稀释剂或包封剂。术语载体指与活性成分结合以利于施用的有机或无机的天然的或合成的成分。药物组合物的组分也能与本发明的化合物混合，且相互之间以基本上不削弱所期望药效的相互作用的方式混合。
通过以下实施例进一步阐述本发明，但决不是作为进一步限制。该申请所引用的所有参考文献(包括参考文献、已发行的专利、公开的专利申请和共同待决的专利申请)的全部内容，此处特别地引用作为参考。
实施例
寡脱氧核苷酸(ODNs)
在实施例中使用下列ODN。
SEQ                        序列
ID-NO.
1    T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G
2    T*C_G*T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G
3    T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G
4    T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G
5    T*T*C_G*T*CG*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T
6    T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T
7    T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T
8    TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(所有的键为*)
9    T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*G_G*C*G*C*C*G
10   TCG TCG TTT TGA CGT TTT GTC GTT(所有的键为*)
14   TCCAGGACTTCTCTCAGGTT(所有的键为*)
15    C-G*T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G
16    G*T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G
17    T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G
18    C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G
19    G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G
20    T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G
21    T*C-G*T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C
22    T*C-G*T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C
23    T*C-G*T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C
材料与方法：
寡脱氧核苷酸(ODNs)
ODNs购自于Biospring(德国法兰克福)或Sigma-Ark(德国达姆施塔特)，并使用Coley Pharmaceutical GmbH(德国Langenfeld)控制其身份与纯度。ODNs在磷酸盐缓冲液(德国Sigma)中稀释，然后于-20℃贮存。全部稀释过程均使用无热原试剂进行。通过Trilink生物技术合成SEQ IDNO：15-23的ODNs。
细胞纯化
从杜塞尔多夫大学血库(德国)获得源自于健康的男性和女性人供体的外周血棕黄层制备物，且从这些制备物中使用Ficoll-Hypaque(Sigma)离心纯化PBMC。立即使用纯化的PBMC(用于大部分测试)或将其悬浮于冷冻剂中并于-70℃贮存。在需要时，将这些细胞的等分试样解冻、清洗并再次悬浮于补充了5％(v/v)热失活的人AB血清(比利时BioWhittaker)或10％(v/v)热失活的FCS、2mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Invitrogen(德国卡尔斯鲁厄))的RPMI 1640培养基(比利时BioWhittaker)。
细胞因子检测
将解冻的或新鲜的PBMC接种于48孔平底板或96孔圆底板上，并在37℃潮湿孵育器中以如上所述浓度的ODN进行孵育。收集培养上清液，且如果不立即使用，则需要将其冷冻保藏在-20℃，直到需要。上清液中细胞因子的数量使用商业可获得的ELISA试剂盒(美国Diaclone)或自己的用商业可获得的抗体(源自于Becton Dickinson/Pharmingen或PBL)生产的ELISA测定。
实施例13的研究如下进行：
从6只小鼠(雄性，BALB/c)中取出脾。轻轻通过细胞筛(70μm孔径)挤，使源自于每个脾的脾细胞分离，然后收集。将脾细胞加入到培养板孔中。每个孔中加入1×107个细胞/900μl培养基。培养基为含有10％牛胎儿血清的RPMI 1640。将培养基中100μl等分试样CpG ODN溶液加入到每个孔中，使每个孔中终浓度为0.01-10μg/ml。孵育36小时(37℃，5％CO2孵育器)后，收集培养上清液，并使用Luminex多重分析法(IFNγ、IP-10、IL-10、IL-6、TNFα)或ELISA(IFNα)分析细胞因子浓度。
诱导豚鼠中抗原诱导的鼻阻力的增加
在研究的第0天使用抗原(卵白蛋白，腹膜内与皮下均为5mg)致敏豚鼠(雄性，Hartley)。在研究的第4天加强致敏(5mg，腹膜内)。通过暴露于连续2周每周2次鼻内施用的抗原，则豚鼠受到抗原攻击。第一次攻击是在研究的第14天。每周在该周第一次抗原攻击前2天鼻内施用一次SEQID NO：7(批号AQE-03J-001-M，0.03-1mg/kg溶于150μl/kg盐水中)。除在研究的第24天的末次攻击以外，抗原攻击为使用卵白蛋白(1.5mg/kg溶于150μl/kg盐水中)。攻击前30分钟使用美吡拉敏(10mg/kg，腹膜内)预处理动物以避免组胺诱导的过敏性反应。在研究的第24天，麻醉豚鼠，使用Buxco呼吸机械系统和软件测量鼻阻力。使用递送到鼻咽处的卵白蛋白(2.5mg溶于250μl盐水中)进行末次抗原攻击。在攻击前30分钟，使用美吡拉敏预处理动物。攻击40分钟后测量鼻阻力。
诱导小鼠中抗原诱导的鼻阻力的增加
在研究的第0天和第7天使用具有氢氧化铝佐剂(Pierce Alum，腹膜内)的抗原(100μg卵白蛋白，腹膜内)致敏小鼠(雄性，BALB/c)。每日对小鼠进行鼻内施用抗原(1mg溶于10μl盐水)使其接受抗原攻击。第一次攻击是在研究的第14天。在鼻内施用2次SEQ ID NO：7。在第一次抗原攻击前2天施用第一剂。7天后施用第二剂。任选地，每日鼻内施用布地奈德(抗炎的合成皮质甾类)。在第一次抗原攻击前2天施用第一剂。每日鼻内抗原攻击前4小时鼻内施用布地奈德剂。在研究的第26天(即第二次施用SEQ ID NO：7后7天)测定终点。对鼻组织进行炎症的组织病理学评估。分别的小鼠接受末次抗原攻击，并在攻击后10分钟内计数打喷嚏和挠鼻频率。
统计分析
Mann-Whitney检验用于比较所比较的对象群体为非正态的数据集。Dunnitt多重比较检验用于数据集对单一控制的比较。
小鼠体内诱导细胞因子
在小鼠(雄性，BALB/c)鼻内滴入CpG ODN(0.1和1mg/kg)或对照载体(盐水25μl)。施用8小时和15小时后收集支气管肺泡灌洗液和血清(从心脏穿刺获得的血液中分离)。使用Advia自动细胞读数器计数支气管肺泡灌洗液中细胞数量。使用ELISA(IFNα、IL-12p40)或Luminex细胞因子多元体系(IFNγ、IP-10、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-17、GM-CSF、RANTES、TNFα)检测支气管肺泡灌洗液和血清中细胞因子和趋化因子的浓度。每个试样最低可检测浓度不同，但其范围为0.3-12pg/ml。
流感病毒诱导小鼠呼吸道中炎症
流感病毒(流感A型，H1N1亚型，小鼠适应株PR8)由纽约州萨拉纳克湖Trudeau研究所的David Woodhouse赠送。流感剂量滴定和感染时程测定作为初步研究，在研究的第0天对BALB/c小鼠(雌性)鼻内滴入流感病毒。40μl盐水中，小鼠接受50、200或500倍卵感染剂量(EID)50的病毒。感染后1、3、6、9和14天评定呼吸道炎症。
鼻内施用CpG ODN并检测呼吸道炎症
对小鼠进行鼻内滴入溶于25μl盐水中的CpG ODN(0.03、0.3或3mg/kg)。在使用流感病毒感染(200 EID50，鼻内)前6天和前2天对每只小鼠施用2次。该病毒剂量选自于初步研究。在病毒感染后6天测呼吸道炎症和肺内病毒载量。该时间点选自于初步研究。通过支气管肺泡灌洗回收呼吸道中的细胞。应用Advia自动细胞计数器(Adiva，Bayer Diagnostics，Zurich，Switzerland)测总白细胞量。使用Wright-Giemza染色剂对细胞离心试样染色，通过光学显微镜检查法检测分类细胞数量。移除肺，并将肺用300μl无菌PBS匀浆。收集上清液，根据说明书使用酶免疫分析试剂盒(Takara Biomedical，Shiga，Japan)分析病毒载量。该分析法利用抗流感A病毒核蛋白质的单克隆抗体作为固相的，并使用多克隆抗流感病毒检测抗体。
实施例1：用CpG ODN处理时人PBMC分泌IFN-α的作用
方法：在指定浓度下，使用CpG ODN孵育源自于三个(SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6)或七个(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3)供体的人外周血单核细胞48小时。检测人PBMC分泌的干扰素α。
结果：图1显示出在与CpG ODN孵育后IFN-α产生的增加。数据表示均值+/-SEM。应当指出，绝对水平pg/ml不能直接比较，因为使用的是源自于不同供体的PBMC，且源自于每个供体的结果均为可变的。
实施例2：体外刺激TLR9转染的细胞
方法：以SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6孵育经人TLR9转染过的HEK293细胞16小时。由萤光素酶读出器检测信号。
结果：结果见表1。使用Sigma Plot计算EC50(SigmaPlot 2002 forWindows version 8.0)。计算对任意ODN检测的全部浓度的最高值与空白介质之比的商为最大刺激指数(最大SI)。
表1
    ODN     EC50     最大SI
    SEQ ID NO：1     2320     22
    SEQ ID NO：2     4730     20
    SEQ ID NO：3     2400     16
    SEQ ID NO：4     3200     14
    SEQ ID NO：5     4290     13
    SEQ ID NO：6     4580     11
实施例3：CpG寡脱氧核苷酸SEQ ID NO：7抗抗原诱导的豚鼠鼻阻力 增加的作用
方法：为了研究CpG寡脱氧核苷酸SEQ ID NO：7抗抗原诱导的豚鼠鼻阻力增加的作用，使用抗原致敏豚鼠，然后经鼻抗原攻击。攻击后测量鼻阻力40分钟。
表2.研究方案概述
Figure A20058004368400771
结果：图2显示出，经过40分钟，抗原攻击引起鼻阻力递增，使用SEQID NO：7(0.03-1mg/kg)处理的豚鼠显著受抑制。
实施例4：过敏性鼻炎小鼠模型中CpG寡核苷酸SEQ ID NO：7的作用
方法：BALB/c小鼠用于研究SEQ ID NO：7对过敏性鼻炎症状的作用。致敏与抗原攻击后，取鼻组织进行炎症的组织病理学评估。分开的小鼠接受末次抗原攻击，并在攻击后10分钟计数打喷嚏和挠鼻频率。
表3：研究方案概述：经寡核苷酸治疗的小鼠
          SEQ ID NO：7           SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8          或SEQ ID NO：8↓                      ↓致敏                        每天抗原攻击↓  ↓          ↓ ↓ ↓ ↓  ↓  ↓  ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓天：0   7   12  13 14 15 16 17  18  19  20 21 22 23 24 25 26↓终点
表4：研究方案概述：经布地奈德治疗的小鼠
                        每天施用布地奈德↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓  ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓致敏                       每天抗原攻击↓  ↓        ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓  ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓天：0   7  12 13 14 15 16 17 18 19  20 21 22 23 24 25 26↓终点
结果：抗原攻击引起打喷嚏和挠鼻。如图3所示，使用SEQ ID NO：7处理的小鼠中打喷嚏和挠鼻的频率受抑制。
实施例5：流感病毒诱导的小鼠肺中呼吸道炎症：C类CpG寡脱氧核苷 酸的作用
引言：CpG寡脱氧核苷酸(ODN)诱导提供抗哮喘作用的调节免疫的细胞因子。C类CpG ODN比前面的B类ODN诱导更高滴度的IFNα。C类CpG ODN对抑制病毒诱导的哮喘恶化提供额外的好处。该研究调查了三个C类CpG ODN抑制小鼠肺中病毒(流感)载量和病毒诱导的呼吸道炎症的能力。
方法：流感病毒用于诱导BALB/c小鼠呼吸道炎症。鼻内施用CpG ODN并测定保护作用。
结果：图4显示出，在滴定测定流感量和确定感染时程的初步研究中，流感病毒引起呼吸道中白细胞积聚。6-9天后出现最大炎症。使用500 EID50病毒感染的小鼠6天后明显体重下降并处死。
图5显示出CpG ODN对病毒载量与病毒诱导的呼吸道炎症的保护效应。在感染流感病毒(200 EID50)前使用CpG ODN进行预处理，感染后6天分析时发现降低了肺中病毒载量。图6显示出感染流感病毒6天后引起呼吸道中白细胞积聚。这些主要为嗜中性粒细胞和单核细胞(单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞)。有少量的嗜酸性粒细胞。使用任意CpG ODN预处理的小鼠中，细胞积聚显著受抑制。
实施例6：小鼠中C类CpG寡脱氧核苷酸抗抗原诱导的呼吸道炎症的作 用
比较了三个C类CpG寡脱氧核苷酸(ODN)的活性。在比较的研究中包括B类CpG ODN SEQ ID NO：7。
方法：在研究的第0天和第7天使用具有氢氧化铝佐剂(Pierce Alum，腹膜内)的抗原(10μg蟑螂，腹膜内)致敏小鼠(雄性，BALB/c)。连续2周，每周2次鼻内施用抗原(10μg溶于40μl盐水中)，使小鼠接受抗原攻击。在研究的第21天进行第一次攻击。当周第一次抗原攻击前2天鼻内施用CpG ODN(1、10和100μg/kg)，每周一次。
最后一次抗原攻击后48小时评估呼吸道炎症。呼吸道中的细胞通过支气管肺泡灌洗回收。分类细胞数量使用Advia自动细胞计数器计数。T细胞数量(总CD3+细胞和CD3+CD4+细胞)使用流式细胞仪计数。
表5.研究方案概述
     抗原           抗原           抗原致敏           攻击           攻击↓  ↓         ↓  ↓         ↓  ↓施用            施用CpG ODN         CpG ODN↓              ↓天：0   7   19     21  24   26    28   31   33↓评估呼吸道炎症
表6.受试CpG ODN
 SEQ ID NO：7 半软B类 批号A25-0313-L1
 SEQ ID NO：1 半软C类 批号C44-1209-M1B
 SEQ ID NO：2 半软C类 批号C44-1209-M2D
 SEQ ID NO：3 半软C类 批号C44-1209-M4B
结果：抗原攻击引起呼吸道中嗜酸性粒细胞和T细胞积聚(图7和图8)。嗜中性粒细胞不聚积。每个CpG ODN在受测试的最高剂量(100mG/kg)都显著抑制嗜酸性粒细胞积聚(图7)。尽管T细胞数量也降低，但降低通常在统计学上不显著(图8)。
实施例：小鼠体内C类CpG寡脱氧核苷酸诱导的细胞因子
比较了三个C类CpG寡脱氧核苷酸(ODN)的活性。在比较研究中包括B类CpG ODN SEQ ID NO：7。
方法：如在材料与方法中所描述地检测支气管肺泡灌洗液和血清中细胞因子和趋化因子的浓度。
表7.处理组
                  CpG寡脱氧核苷酸  鼻内施用 收集样品的时间点
 载体SEQ ID NO：7ODN SEQ ID NO：1ODN SEQ ID NO：2ODN SEQ ID NO：3 半软B类半软C类半软C类半软C类 批号A25-0313-L1批号C44-1209-M1B批号C44-1209-M2D批号C44-1209-M4B 0.1，1mg/kg0.1，1mg/kg0.1，1mg/kg0.1，1mg/kg 8，15小时8，15小时8，15小时8，15小时8，15小时
结果：图9显示出支气管肺泡中灌洗液细胞数量。鼻内滴入每种C类ODN，特别是1mg/kg，显示出引起支气管肺泡灌洗液中白细胞轻微积聚的趋势。
图10-15显示出支气管肺泡灌洗液中细胞因子浓度。鼻内滴入每种CpGODN，在支气管肺泡灌洗液中诱导出可测定的IFNα、IFNγ、IP-10、IL-12p40、IL-6和TNFα滴度。所测其它分析物的滴度未达到可检测浓度或未超过背景浓度(一般＜20pg/ml，未显示数据)。作为IFNα、IFNγ、IP-10、IL-12p40、IL-6和TNFα的诱导剂，C类ODN每种都比B类ODN SEQ ID NO：7的更有潜能。在0.1mg/kg剂量水平时，C类ODN的增加潜能特别明显。特别值得注意的是观察到，仅有C类ODN在施用0.1mg/kg后能诱导任意可测定的IFNα和IFNγ滴度(图10)。
图15-18显示出血清中细胞因子的浓度。鼻内滴入每种CpG ODN在血清中诱导出可检测的IFNγ、IL-6和TNFα滴度。其它所检测分析物的滴度未达到可检测浓度(一般＜20pg/ml，数据未显示)。当与B类CpG SEQ IDNO：7比较时，三种C类ODN中每个均为更有潜能的免疫调节性细胞因子IFNα、IFNγ、IP-10、IL-12p40、IL-6和TNFα的诱导剂。
实施例8：小鼠内CpG寡脱氧核苷酸SEO ID NO：2和SEO ID NO：7对 抗原诱导的IgE产生的作用
方法：在研究的第0天和第7天使用具有氢氧化铝佐剂(Pierce Alum，腹膜内)的抗原(10μg卵白蛋白，腹膜内)致敏小鼠(雄性，BALB/c)。在研究的第-2、0、5和7天(即致敏前2天和致敏当天)，对小鼠施用SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：7。在研究的第18天通过心脏穿刺对小鼠取血。离心收集血清，并通过ELISA分析卵白蛋白特异的IgE和IgG2a。
表8：处理组：
    致敏   处理 n
 12   无抗原   无载体，i.p. 510
 3456   抗原抗原抗原抗原   SEQ ID NO：2，1μg/kg，i.p.SEQ ID NO：2，10μg/kg，i.p.SEQ ID NO：2，100μg/kg，i.p.SEQ ID NO：2，1000μg/kg，i.p. 10101010
 78910   抗原抗原抗原抗原   SEQ ID NO：7，1μg/kg，i.p.SEQ ID NO：7，10μg/kg，i.p.SEQ ID NO：7，100μg/kg，i.p.SEQ ID NO：7，1000μg/kg，i.p. 10101010
表9：研究方案概述
           免疫            免疫
  ↓   ↓
  ODN   ODN   ODN   ODN
  ↓   ↓   ↓   ↓
    天：   -2   0   5   7      18
     ↓
    终点
结果：抗原致敏引起抗原(卵白蛋白)特异的IgE和IgG2a的血清滴度。使用SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7处理的小鼠中，抑制了IgE的产生，但加强了IgG2a的产生(图19)。
结论：实施例8的数据显示出SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7抑制响应抗原致敏而产生的Th2相关的IgE，并增强产生Th1相关的IgG2a。该研究结果进一步表明这些CpG寡聚物能抑制暴露于抗原的小鼠的Th2型反应。
实施例9：SEQ ID NO：2抗组合的流感感染和抗原攻击而诱导的呼吸 道炎症恶化的作用
引言：C类CpG寡脱氧核苷酸SEQ ID NO：2能抑制小鼠中流感病毒载量和病毒诱导的呼吸道炎症。本研究调研了SEQ ID NO：2抗组合的流感病毒感染和抗原攻击而诱导的呼吸道炎症恶化的保护效应。
方法：施用抗原与病毒：在研究的第0天和第7天使用具有氢氧化铝佐剂(Pierce Alum，腹膜内)的抗原(10μg蟑螂，腹膜内)致敏小鼠(雄性，BALB/c)。小鼠通过暴露于连续3周每周2次鼻内施用的抗原(10μg，溶于40μl盐水)而受抗原攻击。在研究的第21天进行第一次攻击。在研究的第34天(即最后一对抗原攻击前)，对小鼠鼻内滴入流感病毒(流感A型，HIN1亚型，小鼠适应株PR8，200 EID50溶于40μl盐水中)使其感染。可选地，分别的小鼠组别可只接受抗原攻击或只接受病毒感染。
每周1次，并于当周第一次抗原攻击前2天，进行鼻内施用SEQ ID NO：2(100μg/kg)。于最后一次抗原攻击后48小时评估呼吸道炎症。呼吸道中的细胞通过支气管肺泡灌洗回收。通过Wright-Giemza染料染色离心细胞，使用光学显微镜得出分类细胞数量。
表10：研究方案概述
抗原致敏↓  ↓天：0   7 抗原攻击↓  ↓ODN↓19     21  24第一处理周 抗原攻击↓  ↓ODN↓26     28   31第二处理周        病毒↓     抗原攻击↓  ↓ODN↓33     34    35   38第三处理周 40↓终点
结果：图20显示出只使用流感病毒感染或只使用抗原攻击，每个都引起支气管肺泡灌洗液中白细胞总量的增加。在病毒感染小鼠中，白细胞积聚包括显著的嗜中性粒细胞，而在抗原攻击小鼠中，白细胞积聚包括显著的嗜酸性粒细胞。当与只接受抗原攻击的小鼠比较时，接受抗原攻击和病毒感染的小鼠显示出支气管肺泡灌洗液中加剧的白细胞积聚。该增加的积聚包括嗜中性粒细胞和单核细胞。然而这些小鼠却表现出嗜酸性粒细胞数量降低。其它研究者已同样表明流感感染能抑制抗原攻击小鼠呼吸道嗜酸性粒细胞，并推定其为Th1介导的效应(如Wohlleben等人，2003)。
使用SEQ ID NO：2(100μg/kg)的处理不抑制病毒诱导的嗜中性粒细胞(图20)。期望这种负面发现，因为在早期研究中，300μg/kg的高剂量为最适的表现抗病毒作用。此外，SEQ ID NO：2(100μg/kg)确实显著抑制抗原诱导的嗜酸性粒细胞。这种正面发现与早期研究一致。
SEQ ID NO：2(100μg/kg)显著抑制接受病毒感染和抗原攻击的小鼠中诱导出的恶化性呼吸道炎症。嗜中性粒细胞和单核细胞的恶化性积聚均受抑制。除恶化性呼吸道炎症外，接受病毒感染和抗原攻击的小鼠明显体重下降。这在使用SEQ ID NO：2处理的小鼠中显著受抑制。
结论：在哮喘的儿童与成人中，呼吸道病毒感染显著引起呼吸道阻力与喘息。发炎过程复杂。但引起哮喘恶化的呼吸道阻力涉及病毒诱导的嗜中性粒细胞和单核细胞募集与激活(参见Gern和Busse，自然免疫学(Nature Immunology)，2002)。实施例9的数据显示出SEQ ID NO：2显著地抑制由组合的病毒感染与抗原攻击诱导的小鼠嗜中性粒细胞和单核细胞恶化性积聚。
实施例10：豚鼠研究
实施例10a：豚鼠AHR方案概述
在研究的第0天和第4天使用具有氢氧化铝佐剂的抗原(卵白蛋白，0.5ml，1％OVA，腹膜内/皮下)使雄性豚鼠致敏。豚鼠通过连续2周每周2次暴露于吸入的卵白蛋白气雾剂而接受抗原攻击。在研究的第13天进行第一次攻击。每周一次于当周第一次抗原攻击前2天鼻内施用CpG ODN或载体(盐水20μl)。在最后一次抗原攻击后24小时，通过测定静脉输入乙酰甲基胆碱引起的支气管狭窄(呼吸道阻力增加)评估呼吸道高反应性。对于每只动物，得到一条乙酰甲基胆碱的剂量反应曲线，并以曲线下面积量化呼吸道反应性。图21显示出过程示意图。
实施例10b：SEQ ID NO：7对豚鼠的呼吸道阻力和肺顺应性的影响
方法：如在实施例10中所描述使豚鼠致敏。在研究的第13天进行第一次攻击。对豚鼠进行鼻内施用载体(盐水)、只有OVA、浓度为10μl/kg、30μl/kg、100μl/kg或300μl/kg，i.t.的SEQ ID NO：7。
结果：图22显示出SEQ ID NO：7引起AUC阻力的剂量依赖性降低。
实施例10c：SEQ ID NO：7对豚鼠的呼吸道阻力和肺顺应性影响的统 计分析
方法：使用Dunnett多重比较检验分析实施例10b中的实验数据。Dunnett多重比较检验允许所有样本对单个对照组的比较。
结果：图23显示出SEQ ID NO：7引起AUC阻力的剂量依赖性降低。
实施例10d：SEQ ID NO：2对豚鼠的呼吸道阻力和肺顺应性影响
方法：如在实施例10中所描述使豚鼠致敏。在研究的第13天进行第一次攻击。对豚鼠进行鼻内施用载体(盐水)、只有OVA、浓度为10μl/kg、30μl/kg、100μl/kg或300μl/kg，i.t.的SEQ ID NO：2。
结果：图24显示出SEQ ID NO：2引起AUC阻力的剂量依赖性降低。
实施例10e：SEQ ID NO：2对豚鼠的呼吸道阻力和肺顺应性作用的统 计分析
方法：使用Dunnett多重比较检验分析实施例10d中的实验数据。Dunnett多重比较检验允许所有样本对单个对照组的比较。
结果：图25显示出SEQ ID NO：2引起AUC阻力的剂量依赖性降低。
实施例11：
附图27-31显示出通过人PBMC接触此处所描述的CpG寡核苷酸后而由这些细胞产生的IL-10、TNF-α、干扰素-γ和IL-6(pg/ml)的水平。图27中所示的试验寡核苷酸包括SEQ ID NO：10、9、13、14、1和2。沿X轴分布的特定数据点为使用的寡核苷酸浓度(μM)。
如在图27中所示，分析中检测的每个寡核苷酸都能产生不同水平和模式的IL-10分泌。在这些受检测的ODN中，SEQ ID NO：1和2引起IL-10的产量非常高。
图28描述的数据涉及三个有代表性剂量处的TNF-α、干扰素-γ和IL-6。使用额外寡核苷酸剂量的关于这些细胞因子的更详细图形见图29-31。
实施例12：
将B细胞、浆细胞样树突细胞和单核细胞与此处所描述的CpG寡核苷酸接触后，这些细胞的活化水平见附图32-42。附图以序列号显示了检测的寡核苷酸，且这些寡核苷酸包括SEQ ID NO：9、13、10、14、2、1、11、12和3。沿X轴分布的特定数据点为所使用的寡核苷酸的浓度(μM)。
如在图32、34、35、40和42中所示，在分析中所检测的CpG寡核苷酸能激活B细胞，这一点通过受测试的标记物表示。在图32和33中，在分析中所检测的CpG寡核苷酸能激活NK细胞，这一点通过受测试的标记物表示。在图36、37、40和41中，在分析中所检测的CpG寡核苷酸能激活单核细胞，这一点通过受测试的标记物表示。在图36和39中，在分析中所检测的CpG寡核苷酸能激活浆细胞样树突细胞，这一点通过受测试的标记物表示。
与SEQ ID NO：9(完全为硫代磷酸酯骨架)比较，在分析中所检测的具有半软骨架的5个ODN在分析(IFN-α、IP-10、IL-10)方面都显示出潜能增强。在单核细胞激活(CD80、CD86表达)、pDC激活(CD86表达)、胞内IP-10(单核细胞和B细胞)、IL-6分泌和B细胞激活(CD80、CD86表达)方面，这些半软ODN也具增强了的潜能。例如，在大约相同或较低浓度条件下，与完全为硫代磷酸酯的SEQ ID NO：9比较，大部分被检测的ODN都更好地诱导细胞表面标记物。
实施例13：
该研究的目的为调研SEQ ID NO：2的被选定的片段(推定的代谢物)的生物学活性。通过测定每个片段诱导体内小鼠脾细胞分泌TLR9相关的细胞因子的能力进行活性测定。
附图43-45显示了SEQ ID NO：2的片段刺激细胞因子分泌。图中以序列号表示所描述的受检测寡核苷酸，并包括SEQ ID NO：15-23。沿X轴分布的特定数据点为所用的寡核苷酸的浓度(μg/ml)。
如在图43-45中所示，SEQ ID NO：2和被检测的片段(推定的代谢物，SEQ ID NO：15-23)都诱导体内小鼠脾细胞的TLR9相关的细胞因子IFNα、IFNγ、IP-10、IL-6、IL-10和TNFα(图43、44和45)。该数据表明每个片段都保留了生物学活性。
                       序列表
<110>科勒制药集团公司
     科勒制药有限公司
<120>半软C类免疫刺激性寡核苷酸
<130>C1037.70059WO00
<140>尚未获得
<141>2005-10-20
<150>US 60/620,759
<151>2004-10-20
<160>68
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>1
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<220>
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<223>其中n为任意核苷酸并且其中任意一个或多个n可以存在或不存在
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<223>其中n为无碱基接头
<400>30
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tcgcgacgtt                                 10
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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caatatttat tg                              12
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<213>人工序列
<220>
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ccgttttgtg g                               11
<210>37
<211>13
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<213>人工序列
<220>
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>38
cggcgccgtt gccg                            14
<210>39
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(7)
<223>其中n为无碱基接头
<400>39
cggcgnncgc cg                              12
<210>40
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(8)
<223>其中n为无碱基接头
<400>40
cggcgnnntg ccg                              13
<210>41
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(8)
<223>其中n为无碱基接头
<400>41
cggcggnncc gccg                              14
<210>42
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>42
cggcgtcgcc gccg                              14
<210>43
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>43
cgtcgacggg acggg                             15
<210>44
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>44
cgtcgacgtg acggg                             15
<210>45
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>45
gagagttggg  ctctc                              15
<210>46
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>46
gtcgaggagg t                                   11
<210>47
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(7)
<223>其中n为无碱基接头
<400>47
taatanntat ta                                  12
<210>48
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>48
taatatccat ta                                  12
<210>49
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>49
taatatttat ta                                  12
<210>50
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>50
ggcgcgctgc cg                              12
<210>51
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n为嘌呤
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>其中n不为c
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(6)
<223>其中n为嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(31)
<223>其中一个核苷酸间键为3′-3′键
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(18)
<223>其中n为任意核苷酸并且其中任意一个或多个n可以存在或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(30)
<223>其中n为任意核苷酸并且其中任意一个或多个n可以存在或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(31)..(32)
<223>其中n为嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(35)..(35)
<223>其中n不为c
<220>
<221>misc_feature
<222>(36)..(36)
<223>其中n为嘌呤
<400>51
nncgnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nngcnn    36
<210>52
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(6)
<223>其中3个核苷酸可以存在或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(9)
<223>其中3个核苷酸可以存在或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(12)
<223>其中特征可以存在或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(37)
<223>其中一个核苷酸间键为3′-3′键
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(24)
<223>其中n为任意核苷酸并且其中任意一个或多个n可以存在或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(36)
<223>其中n为任意核苷酸并且其中任意一个或多个n可以存在或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(42)
<223>其中3个核苷酸可以存在或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(43)..(45)
<223>其中3个核苷酸可以存在或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(46)..(48)
<223>其中3个核苷酸可以存在或不存在
<400>52
tcgtcgtcgt cgnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnngctg ctgctgct    48
<210>53
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>53
tcgtcgtttt a                                            11
<210>54
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>54
cggcgccgtg  ccg                                         13
<210>55
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>55
cggcgtcgtg ccg                                          13
<210>56
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>56
tcgtcgtttt acggcgccgt gccg                              24
<210>57
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>57
tcgtcgtttt acggcgtcgt  gccg    24
<210>58
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>58
cggcgcgcgc  cg                 12
<210>59
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>59
cggcggccgc cg                  12
<210>60
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>60
cgacgatcgt  cg                 12
<210>61
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>61
cgacgtacgt  cg                 12
<210>62
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>62
cgcgcgcgcg cg                                  12
<210>63
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>63
gcgcgcgcgc gc                                  12
<210>64
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>64
ccccccgggg gg                                  12
<210>65
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>65
ggggggcccc cc                                  12
<210>66
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>66
cccccggggg                                     10
<210>67
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>67
gggggccccc                                10
<210>68
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n为肌苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>其中n为肌苷
<400>68
tcntcntttt                                 10

Claims (84)

1.包含5′TC_GTC_GTN1TC_GGCGCN1GCCG 3′(SEQ ID NO：27)的寡核苷酸，其中该寡核苷酸包括至少2个稳定的核苷酸间键，且_代表磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键，且其中N1为0-3个核苷酸长，N指任意核苷酸。
2.权利要求1的寡核苷酸，其中N1为3个核苷酸长。
3.权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含5′T*C_G*T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3′(SEQID NO：2)，其中*代表稳定的核苷酸间键。
4.权利要求3的寡核苷酸，其中寡核苷酸为5′T*C_G*T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3′(SEQID NO：2)，其中*代表稳定的核苷酸间键，其中5′指寡核苷酸的游离5’末端，且3′指寡核苷酸的游离3’末端。
5.权利要求1的寡核苷酸，其中N1为0个核苷酸长。
6.权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含5′T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3′(SEQ ID NO：3)，其中*代表稳定的核苷酸间键。
7.权利要求6的寡核苷酸，其中寡核苷酸为5′T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3′(SEQ ID NO：3)，其中*代表稳定的核苷酸间键，其中5′指寡核苷酸的游离5’末端，且3′指寡核苷酸的游离3’末端。
8.包含5′TC_GTC_GAC_GATC_GGCGC_GCGCCG 3′(SEQ IDNO：4)的寡核苷酸，其中该寡核苷酸包括至少2个稳定的核苷酸间键，且代表磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键。
9.权利要求8的寡核苷酸，其中寡核苷酸为5′T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3′(SEQID NO：4)，其中*代表稳定的核苷酸间键。
10.包含5′TTC_GTC_GTTTX1_GTC_GTT 3′(SEQ ID NO：25)的寡核苷酸，其中该寡核苷酸包括至少2个稳定的核苷酸间键，且_代表磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键，且X1为嘧啶。
11.权利要求10的寡核苷酸，其中X1为T。
12.权利要求11的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含5′T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T 3′(SEQ ID NO：5)，其中*代表稳定的核苷酸间键。
13.权利要求11的寡核苷酸，其中寡核苷酸为5′T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T 3′(SEQ ID NO：5)，其中*代表稳定的核苷酸间键，其中5′指寡核苷酸的游离5’末端，且3′指寡核苷酸的游离3’末端。
14.权利要求10的寡核苷酸，其中X1为C。
15.权利要求14的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含5′T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T 3′(SEQ ID NO：6)，其中*代表稳定的核苷酸间键。
16.权利要求14的寡核苷酸，其中寡核苷酸为5′T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T 3′(SEQ ID NO：6)，其中*代表稳定的核苷酸间键，其中5′指寡核苷酸的游离5’末端，且3′指寡核苷酸的游离3’末端。
17.包含TCGTCGTTCGGCGCGCCG(SEQ ID NO：3)的寡核苷酸。
18.包含TCGTCGTCGTTCGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO：2)的寡核苷酸。
19.包含TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO：4)的寡核苷酸。
20.包含TTCGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：5)的寡核苷酸。
21.包含TTTCGTCGTTTCGTCGTT(SEQ ID NO：6)的寡核苷酸。
22.包含T*C_G*T*C_G*T*C的寡核苷酸，其中*代表稳定的核苷酸间键且代表磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键。
23.权利要求22的寡核苷酸，其中寡核苷酸为5′T*C-G*T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C 3′(SEQ IDNO：21)，其中5′指寡核苷酸的游离5’末端，且3′指寡核苷酸的游离3’末端。
24.权利要求22的寡核苷酸，其中寡核苷酸为5′T*C-G*T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C 3′(SEQ ID NO：22)，其中5′指寡核苷酸的游离5’末端，且3′指寡核苷酸的游离3’末端。
25.权利要求22的寡核苷酸，其中寡核苷酸为5′T*C-G*T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C 3′(SEQ ID NO：23)，其中5′指寡核苷酸的游离5’末端，且3′指寡核苷酸的游离3’末端。
26.包含T*C_G*T*T*C_G*G的寡核苷酸，其中*代表稳定的核苷酸间键且代表磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间键。
27.权利要求26的寡核苷酸，其中寡核苷酸为5′C-G*T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3′(SEQ IDNO：15)，其中5′指寡核苷酸的游离5’末端，且3′指寡核苷酸的游离3’末端。
28.权利要求26的寡核苷酸，其中寡核苷酸为5′G*T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3′(SEQ ID NO：16)，其中5′指寡核苷酸的游离5’末端，且3′指寡核苷酸的游离3’末端。
29.权利要求26的寡核苷酸，其中寡核苷酸为5′T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3′(SEQ ID NO：17)，其中5′指寡核苷酸的游离5’末端，且3′指寡核苷酸的游离3’末端。
30.权利要求26的寡核苷酸，其中寡核苷酸为5′C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3′(SEQ ID NO：18)，其中5′指寡核苷酸的游离5’末端，且3′指寡核苷酸的游离3’末端。
31.权利要求26的寡核苷酸，其中寡核苷酸为5′G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3′(SEQ ID NO：19)，其中5′指寡核苷酸的游离5’末端，且3′指寡核苷酸的游离3’末端。
32.权利要求26的寡核苷酸，其中寡核苷酸为5′T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3′(SEQ ID NO：20)，其中5′指寡核苷酸的游离5’末端，且3′指寡核苷酸的游离3’末端。
33.药物组合物，其包含权利要求1-32中任意一项所述的寡核苷酸和可药用载体。
34.权利要求33的药物组合物，其还包含雾化器。
35.权利要求33的药物组合物，其还包含吸入器。
36.权利要求35的药物组合物，其中吸入器为计量的剂量吸入器。
37.权利要求35的药物组合物，其中吸入器为粉末吸入器。
38.权利要求33的药物组合物，其还包含化疗剂。
39.权利要求33的药物组合物，其还包含抗病毒剂。
40.权利要求33的药物组合物，其中将可药用载体制剂为用于皮下施用。
41.权利要求33的药物组合物，其中将可药用载体制剂为用于经口施用。
42.权利要求33的药物组合物，其中将可药用载体制剂为用于鼻内施用。
43.权利要求1-32中任意一项所述的寡核苷酸的用途，用于刺激免疫反应。
44.权利要求1-32中任意一项所述的寡核苷酸的用途，用于制备刺激免疫反应的药物。
45.权利要求1-32中任意一项所述的寡核苷酸的用途，用于制备治疗哮喘的药物。
46.权利要求45的用途，其中哮喘由病毒感染而恶化。
47.权利要求1-32中任意一项所述的寡核苷酸的用途，用于制备治疗过敏的药物。
48.权利要求1-32中任意一项所述的寡核苷酸的用途，用于制备治疗癌症的药物。
49.权利要求48的用途，其中所述药物与化疗剂一起使用。
50.权利要求1-32中任意一项所述的寡核苷酸的用途，用于制备治疗传染病的药物。
51.权利要求1-32中任意一项所述的寡核苷酸的用途，用于制备治疗病毒性疾病的药物。
52.权利要求51的用途，其中病毒性疾病为肝炎。
53.权利要求52的用途，其中肝炎为乙型肝炎。
54.权利要求52的用途，其中肝炎为丙型肝炎。
55.权利要求1-32中任意一项所述的寡核苷酸的用途，用于制备治疗自身免疫性疾病的药物。
56.权利要求1-32中任意一项所述的寡核苷酸的用途，用于制备治疗呼吸道重塑的药物。
57.权利要求44的用途，其中药物不与抗原一起使用。
58.权利要求44的用途，其中药物与抗原一起使用。
59.用于治疗哮喘的方法，包括对患有或处于患有哮喘危险的受试者施用治疗有效量的权利要求1-32中任意一项所述的寡核苷酸来治疗哮喘。
60.用于治疗过敏的方法，包括对患有或处于患有过敏危险的受试者施用治疗有效量的权利要求1-32中任意一项所述的寡核苷酸来治疗过敏。
61.权利要求60的方法，其中受试者患过敏性鼻炎。
62.用于调节免疫反应的方法，包括对受试者施用有效量的权利要求1-32中任意一项所述的寡核苷酸来调节免疫反应。
63.用于治疗由病毒感染而加重的哮喘的方法，包括对患有或处于患有由病毒感染而加重的哮喘危险的受试者施用有效量的权利要求1-32中任意一项所述的寡核苷酸来治疗哮喘。
64.权利要求62的方法，其中对受试者施用寡核苷酸以治疗受试者的过敏。
65.权利要求62的方法，其中对受试者施用寡核苷酸以治疗受试者的自身免疫性疾病。
66.权利要求62的方法，其中对受试者施用寡核苷酸以治疗受试者的呼吸道重塑。
67.权利要求62的方法，其中对受试者施用无抗原的寡核苷酸。
68.权利要求62的方法，其中寡核苷酸通过选自口、鼻、舌下、静脉内、皮下、粘膜、呼吸道、直接注射和皮肤的途径递送。
69.权利要求62的方法，其中将寡核苷酸以诱导细胞因子表达的有效量递送至受试者。
70.权利要求69的方法，其中细胞因子选自IL-6、TNFα、IFNα、IL-10、IL-12、IFNγ和IP-10。
71.权利要求62的方法，其中将寡核苷酸以使免疫反应从偏向Th2的反应转到偏向Th1反应的有效量递送至受试者。
72.治疗癌症的方法，包括对患癌受试者施用治疗癌症有效量的权利要求1-32中任意一项所述的寡核苷酸。
73.权利要求72的方法，其还包括对受试者施用化疗剂。
74.权利要求72的方法，其还包括对受试者施用辐射。
75.治疗传染病的方法，包括对患有或处于患传染病危险的受试者施用治疗传染病有效量的权利要求1-32中任意一项所述的寡核苷酸。
76.权利要求75的方法，其中受试者患病毒感染。
77.权利要求76的方法，其中病毒感染为乙型肝炎。
78.权利要求76的方法，其中病毒感染为丙型肝炎。
79.权利要求76的方法，其还包括对受试者施用抗病毒剂。
80.制备用于刺激免疫反应的权利要求1-32中任意一项所述寡核苷酸的药物的方法。
81.制备用于治疗癌症的权利要求1-32中任意一项所述寡核苷酸的药物的方法。
82.制备用于治疗哮喘的权利要求1-32中任意一项所述寡核苷酸的药物的方法。
83.制备用于治疗过敏的权利要求1-32中任意一项所述寡核苷酸的药物的方法。
84.制备用于治疗传染病的权利要求1-32中任意一项所述寡核苷酸的药物的方法。
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JP (1) JP2008516634A (zh)
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CN (1) CN101084310A (zh)
AR (1) AR051462A1 (zh)
AT (1) ATE527355T1 (zh)
AU (1) AU2005332970A1 (zh)
BR (1) BRPI0516497A (zh)
CA (1) CA2578844A1 (zh)
CR (1) CR9131A (zh)
ES (1) ES2375071T3 (zh)
GT (1) GT200500294A (zh)
IL (1) IL182470A0 (zh)
MA (1) MA29028B1 (zh)
MY (1) MY159370A (zh)
NO (1) NO20072526L (zh)
NZ (1) NZ554753A (zh)
PA (1) PA8650101A1 (zh)
PE (1) PE20061045A1 (zh)
RS (1) RS20070164A (zh)
RU (1) RU2393223C2 (zh)
SV (1) SV2006002279A (zh)
TN (1) TNSN07150A1 (zh)
TW (1) TW200626720A (zh)
UY (1) UY29173A1 (zh)
WO (1) WO2006135434A2 (zh)
ZA (2) ZA200703609B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108728444A (zh) * 2017-04-18 2018-11-02 长春华普生物技术股份有限公司 免疫调节性多核苷酸及其应用
CN109891238A (zh) * 2016-10-25 2019-06-14 生物技术Rna制药有限公司 免疫治疗剂的剂量确定

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030109469A1 (en) * 1993-08-26 2003-06-12 Carson Dennis A. Recombinant gene expression vectors and methods for use of same to enhance the immune response of a host to an antigen
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US7935675B1 (en) * 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6429199B1 (en) * 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US6239116B1 (en) * 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030026782A1 (en) 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
EP0855184A1 (en) * 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
JP2002514397A (ja) * 1998-05-14 2002-05-21 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー ＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いる造血調節の方法
DK1077722T3 (da) 1998-05-22 2006-11-27 Ottawa Health Research Inst Fremgangsmåder og produkter til induktion af mukosaimmunitet
US20030022854A1 (en) 1998-06-25 2003-01-30 Dow Steven W. Vaccines using nucleic acid-lipid complexes
ATE464907T1 (de) * 1999-02-17 2010-05-15 Csl Ltd Immunogene komplexe und methoden in bezug auf diese
US6949520B1 (en) * 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
US7585847B2 (en) * 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
AU7013401A (en) * 2000-06-22 2002-01-02 Univ Iowa Res Found Methods for enhancing antibody-induced cell lysis and treating cancer
KR100991644B1 (ko) 2001-08-17 2010-11-02 콜리 파마슈티칼 게엠베하 활성이 개량된 조합 모티프 면역자극성 올리고뉴클레오티드
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
US8153141B2 (en) 2002-04-04 2012-04-10 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory G, U-containing oligoribonucleotides
US7576066B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7807803B2 (en) 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US20040053880A1 (en) 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
EP2241325B1 (en) * 2002-10-29 2012-02-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Use of CPG oligonucleotides in the treatment of hepatitis C virus infection
JP2006512927A (ja) 2002-12-11 2006-04-20 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド ５’ｃｐｇ核酸およびその使用方法
AU2004226605A1 (en) * 2003-04-02 2004-10-14 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations for topical application
BRPI0411514A (pt) * 2003-06-20 2006-08-01 Coley Pharm Gmbh antagonistas de receptor toll-like de molécula pequena
JP4989225B2 (ja) * 2003-09-25 2012-08-01 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド 核酸親油性接合体
SG123799A1 (en) 2003-10-30 2006-07-26 Coley Pharm Gmbh C-class oligonucleotide analogs with enchanced immunostimulatory potency
US20050239733A1 (en) * 2003-10-31 2005-10-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides
US20050256073A1 (en) * 2004-02-19 2005-11-17 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides
JP2007531746A (ja) * 2004-04-02 2007-11-08 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド Ｉｌ−１０応答を誘導するための免疫活性化核酸
EP2484374A1 (en) * 2004-07-18 2012-08-08 CSL Limited Immuno stimulating complex and oligonucleotide formulations for inducing enhanced interferon-gamma responses
MY159370A (en) * 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
CA2600036A1 (en) 2005-03-04 2006-09-14 Dynavax Technologies Corporation Vaccines comprising oligonucleotides having immunostimulatory sequences (iss) wherein the iss are conjugated to antigens and stabilized by buffer conditions and further excipients
US20060213010A1 (en) * 2005-03-22 2006-09-28 Davis David T Mattress sled
SG161260A1 (en) * 2005-04-08 2010-05-27 Coley Pharm Group Inc Methods for treating infectious disease exacerbated asthma
JP2009500412A (ja) * 2005-07-07 2009-01-08 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド 癌の処置のための、抗ｃｔｌａ−４抗体とｃｐｇモチーフ含有合成オリゴデオキシヌクレオチドとの組み合わせ治療
CA2622679A1 (en) * 2005-09-16 2007-08-09 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory single-stranded ribonucleic acid with phosphodiester backbone
EA013375B1 (ru) * 2005-09-16 2010-04-30 Коли Фармасьютикал Гмбх МОДУЛЯЦИЯ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИХ СВОЙСТВ КОРОТКОЙ ИНТЕРФЕРИРУЮЩЕЙ РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ (siРНК) С ПОМОЩЬЮ МОДИФИКАЦИИ НУКЛЕОТИДОВ
PL1957647T3 (pl) 2005-11-25 2015-07-31 Zoetis Belgium S A Oligorybonukleotydy immunostymulujące
US20080045473A1 (en) * 2006-02-15 2008-02-21 Coley Pharmaceutical Gmbh Compositions and methods for oligonucleotide formulations
KR101251707B1 (ko) 2006-09-27 2013-04-11 콜리 파마슈티칼 게엠베하 면역 자극 활성이 증강된 소수성 Ｔ 유사체를 함유하는 ＣｐＧ 올리고뉴클레오티드 유사체
WO2008057529A2 (en) * 2006-11-06 2008-05-15 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Peptide-based vaccine compositions to endogenous cholesteryl ester transfer protein (cetp)
DK2573176T3 (en) * 2007-05-04 2016-08-01 Index Pharmaceuticals Ab Tumor growth retardant compounds and methods of use thereof
BRPI0814260B8 (pt) 2007-08-13 2021-05-25 Coley Pharm Gmbh composição compreendendo um polímero de fita única, método compreendendo contatar uma célula com tal polímero e uso de tal polímero
EP2278979A4 (en) 2008-05-21 2012-09-26 Us Gov Health & Human Serv PROCESS FOR TREATING PNEUMOCONIOSIS WITH OLIGODESOXYNUCLEOTIDES
WO2009154565A1 (en) * 2008-06-18 2009-12-23 Index Pharmaceuticals Ab Combination therapies against cancer
EP2350282A1 (en) * 2008-11-04 2011-08-03 Index Pharmaceuticals AB Increased expression of specific antigens
US8053422B2 (en) 2008-12-04 2011-11-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Anti-cancer oligodeoxynucleotides
US8552165B2 (en) * 2008-12-09 2013-10-08 Heather Davis Immunostimulatory oligonucleotides
ES2572563T3 (es) 2008-12-09 2016-06-01 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Oligonucleótidos inmunoestimulantes
MX2011010050A (es) 2009-03-25 2011-12-14 Univ Texas Composiciones para estimulación de resistencia inmune innata de mamiferos a patógenos.
EA201592264A1 (ru) 2009-08-26 2016-08-31 Селекта Байосайенсиз, Инк. Композиции, которые индуцируют хелперное действие т-клеток
ES2661813T3 (es) * 2009-12-16 2018-04-04 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con la peptidasa del factor de transcripción de membrana, sitio 1 (mbtps1) mediante inhibición del transcrito antisentido natural al gen mbtps1
CN107029223A (zh) 2010-05-26 2017-08-11 西莱克塔生物科技公司 合成纳米载体联合疫苗
US9994443B2 (en) 2010-11-05 2018-06-12 Selecta Biosciences, Inc. Modified nicotinic compounds and related methods
KR20140050698A (ko) 2011-07-29 2014-04-29 셀렉타 바이오사이언시즈, 인크. 체액성 및 세포독성 t 림프구(ctl) 면역 반응을 발생시키는 합성 나노운반체
CN105188744A (zh) 2013-03-14 2015-12-23 哈佛大学的校长及成员们 基于纳米颗粒的组合物
AU2014292926B2 (en) 2013-07-25 2020-03-05 Exicure Operating Company Spherical nucleic acid-based constructs as immunostimulatory agents for prophylactic and therapeutic use
EP3556353A3 (en) 2014-02-25 2020-03-18 Merck Sharp & Dohme Corp. Lipid nanoparticle vaccine adjuvants and antigen delivery systems
CN106535876B (zh) 2014-06-04 2020-09-11 埃克西奎雷股份有限公司 免疫调节剂通过脂质体球形核酸的多价递送以用于预防或治疗应用
EP3160453A1 (en) 2014-06-25 2017-05-03 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for treatment with synthetic nanocarriers and immune checkpoint inhibitors
WO2016044839A2 (en) 2014-09-19 2016-03-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for treating viral infections through stimulated innate immunity in combination with antiviral compounds
AU2015349680A1 (en) 2014-11-21 2017-06-08 Northwestern University The sequence-specific cellular uptake of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates
EP3240801B1 (en) 2014-12-31 2021-01-20 Checkmate Pharmaceuticals, Inc. Combination tumor immunotherapy
AU2016271018A1 (en) 2015-05-29 2017-11-30 Dynavax Technologies Corporation Combination of a PD-1 antagonist and CPG-C type oligonucleotide for treating cancer
EP3301179B1 (en) 2015-07-09 2019-06-05 National Institute for Materials Science Immunostimulating oligonucleotide complex
WO2017015252A1 (en) * 2015-07-20 2017-01-26 Zoetis Services Llc Liposomal adjuvant compositions
US10456459B2 (en) * 2015-07-20 2019-10-29 Zoetis Services Llc Liposomal adjuvant compositions
US20190046638A1 (en) 2016-04-01 2019-02-14 Checkmate Pharmaceuticals, Inc. Fc RECEPTOR-MEDIATED DRUG DELIVERY
WO2018039629A2 (en) 2016-08-25 2018-03-01 Northwestern University Micellar spherical nucleic acids from thermoresponsive, traceless templates
US11696954B2 (en) 2017-04-28 2023-07-11 Exicure Operating Company Synthesis of spherical nucleic acids using lipophilic moieties

Family Cites Families (133)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5194428A (en) * 1986-05-23 1993-03-16 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of influenza virus replication by oligonucleotide phosphorothioates
US4806463A (en) * 1986-05-23 1989-02-21 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of HTLV-III by exogenous oligonucleotides
US5276019A (en) * 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5004810A (en) * 1988-09-30 1991-04-02 Schering Corporation Antiviral oligomers
US5399676A (en) * 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5514788A (en) * 1993-05-17 1996-05-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulation of cell adhesion
US5166195A (en) 1990-05-11 1992-11-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibitors of the human immunodeficiency virus phosphorothioate oligonucleotides
EP0533838B1 (en) 1990-06-11 1997-12-03 NeXstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
US6605708B1 (en) 1993-07-28 2003-08-12 Hybridon, Inc. Building blocks with carbamate internucleoside linkages and oligonucleotides derived therefrom
US5859231A (en) 1993-09-03 1999-01-12 Duke University Synthesis of oligonucleotides with boranophosphonate linkages
DE4338704A1 (de) * 1993-11-12 1995-05-18 Hoechst Ag Stabilisierte Oligonucleotide und deren Verwendung
US5596091A (en) * 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US6727230B1 (en) * 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5696248A (en) 1994-06-15 1997-12-09 Hoechst Aktiengesellschaft 3'-modified oligonucleotide derivatives
US20030026782A1 (en) * 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6239116B1 (en) * 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
PT772619E (pt) * 1994-07-15 2006-10-31 Univ Iowa Res Found Oligonucleotidos imunomoduladores
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US7935675B1 (en) * 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030050263A1 (en) * 1994-07-15 2003-03-13 The University Of Iowa Research Foundation Methods and products for treating HIV infection
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
EP0855184A1 (en) * 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
JP2001513776A (ja) * 1997-02-28 2001-09-04 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション ＬＰＳ関連障害の処置における非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸の使用
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US6426334B1 (en) 1997-04-30 2002-07-30 Hybridon, Inc. Oligonucleotide mediated specific cytokine induction and reduction of tumor growth in a mammal
AU7690898A (en) * 1997-05-20 1998-12-11 Ottawa Civic Hospital Loeb Research Institute Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols
US6589940B1 (en) 1997-06-06 2003-07-08 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
US20040006034A1 (en) * 1998-06-05 2004-01-08 Eyal Raz Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
US6221882B1 (en) * 1997-07-03 2001-04-24 University Of Iowa Research Foundation Methods for inhibiting immunostimulatory DNA associated responses
JP4663113B2 (ja) 1997-09-05 2011-03-30 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 抗原刺激顆粒球媒介炎症を予防または軽減するための免疫刺激オリゴヌクレオチドの使用
ATE356630T1 (de) 1998-04-03 2007-04-15 Univ Iowa Res Found Verfahren und produkte zur stimulierung des immunsystems mittels immunotherapeutischer oligonukleotide und zytokine
WO1999056755A1 (en) 1998-05-06 1999-11-11 University Of Iowa Research Foundation Methods for the prevention and treatment of parasitic infections and related diseases using cpg oligonucleotides
JP2002514397A (ja) * 1998-05-14 2002-05-21 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー ＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いる造血調節の方法
DK1077722T3 (da) 1998-05-22 2006-11-27 Ottawa Health Research Inst Fremgangsmåder og produkter til induktion af mukosaimmunitet
WO2000006588A1 (en) 1998-07-27 2000-02-10 University Of Iowa Research Foundation STEREOISOMERS OF CpG OLIGONUCLEOTIDES AND RELATED METHODS
AU777225B2 (en) 1998-09-03 2004-10-07 Coley Pharmaceutical Gmbh G-motif oligonucleotides and uses thereof
US6207819B1 (en) * 1999-02-12 2001-03-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds, processes and intermediates for synthesis of mixed backbone oligomeric compounds
FR2790955B1 (fr) * 1999-03-19 2003-01-17 Assist Publ Hopitaux De Paris Utilisation d'oligonucleotides stabilises comme principe actif antitumoral
US6977245B2 (en) * 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
ATE275727T1 (de) 1999-04-29 2004-09-15 Coley Pharm Gmbh Screening nach modulatoren der funktion von immunstimulatorischer dna
BR0010323A (pt) 1999-05-06 2002-01-08 Immune Response Corp Inc Composições imunogênicas, kit e método de confecção da mesma para uso na imunização de um mamìfero
CA2412345A1 (en) 1999-06-16 2000-12-21 University Of Iowa Research Foundation Antagonism of immunostimulatory cpg-oligonucleotides by 4-aminoquinolines and other weak bases
US6514948B1 (en) * 1999-07-02 2003-02-04 The Regents Of The University Of California Method for enhancing an immune response
KR100863630B1 (ko) * 1999-09-25 2008-10-15 유니버시티 오브 아이오와 리써치 파운데이션 면역자극성 핵산
US6949520B1 (en) 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
ATE378348T1 (de) * 2000-01-14 2007-11-15 Us Health Oligodeoxynukleotide und ihre verwendung zur induktion einer immunreaktion
WO2001095935A1 (en) 2000-01-20 2001-12-20 Ottawa Health Research Institute Immunostimulatory nucleic acids for inducing a th2 immune response
CA2398432C (en) 2000-01-26 2012-06-19 Hybridon, Inc. Modulation of oligonucleotide cpg-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US7585847B2 (en) 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
US20020156033A1 (en) 2000-03-03 2002-10-24 Bratzler Robert L. Immunostimulatory nucleic acids and cancer medicament combination therapy for the treatment of cancer
US20040131628A1 (en) 2000-03-08 2004-07-08 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the treatment of disorders associated with microorganisms
AU7013401A (en) * 2000-06-22 2002-01-02 Univ Iowa Res Found Methods for enhancing antibody-induced cell lysis and treating cancer
US20020165178A1 (en) 2000-06-28 2002-11-07 Christian Schetter Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of anemia, thrombocytopenia, and neutropenia
US20020198165A1 (en) 2000-08-01 2002-12-26 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of gastric ulcers
US20020091097A1 (en) * 2000-09-07 2002-07-11 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of sexually transmitted diseases
JP2005500806A (ja) 2000-09-15 2005-01-13 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー ＣｐＧに基づく免疫アゴニスト／免疫アンタゴニストの高スループットスクリーニングのためのプロセス
EP1322656B1 (en) 2000-09-26 2008-01-16 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory activity of immunostimulatory oligonucleotide analogs by positional chemical changes
EP1350262B8 (en) 2000-12-08 2008-08-13 Coley Pharmaceuticals GmbH Cpg-like nucleic acids and methods of use thereof
WO2002053141A2 (en) * 2000-12-14 2002-07-11 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Inhibition of angiogenesis by nucleic acids
ATE471374T1 (de) * 2000-12-27 2010-07-15 Dynavax Tech Corp Immunomodulatorische polynukleotide und verfahren zur deren verwendung
US20030050268A1 (en) 2001-03-29 2003-03-13 Krieg Arthur M. Immunostimulatory nucleic acid for treatment of non-allergic inflammatory diseases
US7105495B2 (en) 2001-04-30 2006-09-12 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US20030129605A1 (en) 2001-05-04 2003-07-10 Dong Yu Immunostimulatory activity of CpG oligonucleotides containing non-ionic methylphosophonate linkages
US20030199466A1 (en) 2001-06-21 2003-10-23 Fearon Karen L. Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same - ll
US20040132677A1 (en) 2001-06-21 2004-07-08 Fearon Karen L. Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same-IV
US20030003970A1 (en) * 2001-06-28 2003-01-02 Alan Johnson Portable communications device
WO2003012061A2 (en) 2001-08-01 2003-02-13 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods and compositions relating to plasmacytoid dendritic cells
KR100991644B1 (ko) 2001-08-17 2010-11-02 콜리 파마슈티칼 게엠베하 활성이 개량된 조합 모티프 면역자극성 올리고뉴클레오티드
IL160837A0 (en) 2001-10-05 2004-08-31 Coley Pharm Gmbh Toll-like receptor 3 signaling agonists and antagonists
CA2462203A1 (en) 2001-10-12 2003-11-20 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for enhancing immune responses using imidazoquinoline compounds
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
WO2003035836A2 (en) * 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
JP4000251B2 (ja) * 2001-10-31 2007-10-31 富士通株式会社 光信号交換装置およびその制御方法
AU2002366710A1 (en) * 2001-12-20 2003-07-09 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of USE OF CpG OLIGODEOXYNUCLEOTIDES TO INDUCE ANGIOGENESIS
US20030232443A1 (en) 2002-06-18 2003-12-18 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of centromere protein B expression
US8153141B2 (en) 2002-04-04 2012-04-10 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory G, U-containing oligoribonucleotides
US7371734B2 (en) * 2002-04-22 2008-05-13 Bioniche Life Sciences Inc. Oligonucleotide compositions and their use for the modulation of immune responses
US20040009949A1 (en) * 2002-06-05 2004-01-15 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Method for treating autoimmune or inflammatory diseases with combinations of inhibitory oligonucleotides and small molecule antagonists of immunostimulatory CpG nucleic acids
US7569553B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US20040053880A1 (en) * 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7807803B2 (en) 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
EP1551221A4 (en) * 2002-07-03 2007-08-01 Coley Pharm Group Inc NUCLEIC ACID COMPOSITIONS FOR STIMULATING IMMUNE RESPONSES
US7576066B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7605138B2 (en) 2002-07-03 2009-10-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
AU2003255969A1 (en) 2002-07-17 2004-02-02 Coley Pharmaceutical Gmbh Use of cpg nucleic acids in prion-disease
EP1575504A4 (en) * 2002-08-01 2009-11-04 Us Gov Health & Human Serv METHOD FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY ARTHROPATHIES WITH SUPPRESSORS OF THE CPG OLIGONUCLEOTIDES
AR040996A1 (es) * 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
AU2003278845A1 (en) 2002-09-19 2004-04-08 Coley Pharmaceutical Gmbh Toll-like receptor 9 (tlr9) from various mammalian species
EP2241325B1 (en) * 2002-10-29 2012-02-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Use of CPG oligonucleotides in the treatment of hepatitis C virus infection
JP2006512927A (ja) * 2002-12-11 2006-04-20 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド ５’ｃｐｇ核酸およびその使用方法
DE60329223D1 (de) * 2002-12-23 2009-10-22 Dynavax Tech Corp Oligonukleotide mit einer immunsystemstimulierenden sequenz und verfahren zu deren anwendung
JP2006516099A (ja) 2002-12-23 2006-06-22 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション 分枝状の免疫調節化合物及び該化合物の使用方法
MXPA05007652A (es) * 2003-01-16 2006-02-22 Hybridon Inc Modulacion de propiedades inmunoestimulantes de compuestos basados en oligonucleotido mediante la utilizacion de dinucleotidos inmunoestimulantes modificados.
AU2004226605A1 (en) 2003-04-02 2004-10-14 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations for topical application
EP1631687A2 (en) 2003-04-22 2006-03-08 Coley Pharmaceutical GmbH Methods and products for identification and assessment of tlr ligands
US8008267B2 (en) * 2003-06-11 2011-08-30 Idera Pharmaceuticals, Inc. Stabilized immunomodulatory oligonucleotides
BRPI0411514A (pt) 2003-06-20 2006-08-01 Coley Pharm Gmbh antagonistas de receptor toll-like de molécula pequena
JP2007531699A (ja) * 2003-07-15 2007-11-08 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマー化合物をサイトカインおよび／または化学療法剤または放射線療法と組み合わせて用いる、免疫系の相乗的刺激
JP4989225B2 (ja) * 2003-09-25 2012-08-01 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド 核酸親油性接合体
US20050215501A1 (en) * 2003-10-24 2005-09-29 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods and products for enhancing epitope spreading
SG123799A1 (en) 2003-10-30 2006-07-26 Coley Pharm Gmbh C-class oligonucleotide analogs with enchanced immunostimulatory potency
US20050239733A1 (en) 2003-10-31 2005-10-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides
US20050100983A1 (en) * 2003-11-06 2005-05-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cell-free methods for identifying compounds that affect toll-like receptor 9 (TLR9) signaling
KR101138131B1 (ko) * 2003-12-08 2012-04-23 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 작은 올리고뉴클레오티드-기초 화합물에 의한 면역자극특성의 조절
US20050256073A1 (en) 2004-02-19 2005-11-17 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides
US7668561B2 (en) * 2004-02-27 2010-02-23 Qualcomm Incorporated Apparatus and method for controlling reverse link interference among access terminals in wireless communications
CN101217973A (zh) 2004-03-12 2008-07-09 海布里顿公司 使用第二代免疫调节寡核苷酸增强的hiv疫苗活性
JP2007531746A (ja) * 2004-04-02 2007-11-08 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド Ｉｌ−１０応答を誘導するための免疫活性化核酸
WO2006080946A2 (en) * 2004-06-08 2006-08-03 Coley Pharmaceutical Gmbh Abasic oligonucleotide as carrier platform for antigen and immunostimulatory agonist and antagonist
KR20070028537A (ko) * 2004-06-15 2007-03-12 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 면역자극 올리고누클레오티드 다량체
EP2484374A1 (en) * 2004-07-18 2012-08-08 CSL Limited Immuno stimulating complex and oligonucleotide formulations for inducing enhanced interferon-gamma responses
US20070129320A9 (en) * 2004-07-18 2007-06-07 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Methods and compositions for inducing innate immune responses
MY159370A (en) * 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
WO2006076454A1 (en) * 2005-01-12 2006-07-20 Amcol International Corporation Detersive compositions containing hydrophobic benefit agents pre-emulsified using colloidal cationic particles
US20080009455A9 (en) * 2005-02-24 2008-01-10 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory oligonucleotides
SG161260A1 (en) * 2005-04-08 2010-05-27 Coley Pharm Group Inc Methods for treating infectious disease exacerbated asthma
AU2006241149A1 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Coley Pharmaceutical Gmbh Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity
US20070093439A1 (en) * 2005-10-25 2007-04-26 Idera Pharmaceuticals, Inc. Short immunomodulatory oligonucleotides
PL1957647T3 (pl) * 2005-11-25 2015-07-31 Zoetis Belgium S A Oligorybonukleotydy immunostymulujące
US20080045473A1 (en) * 2006-02-15 2008-02-21 Coley Pharmaceutical Gmbh Compositions and methods for oligonucleotide formulations
US8027888B2 (en) 2006-08-31 2011-09-27 Experian Interactive Innovation Center, Llc Online credit card prescreen systems and methods
WO2008033432A2 (en) 2006-09-12 2008-03-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides
KR101251707B1 (ko) 2006-09-27 2013-04-11 콜리 파마슈티칼 게엠베하 면역 자극 활성이 증강된 소수성 Ｔ 유사체를 함유하는 ＣｐＧ 올리고뉴클레오티드 유사체
JP2010504982A (ja) 2006-09-27 2010-02-18 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド Ｔｌｒのリガンドと抗ウイルス剤との組成物
US20100144846A1 (en) 2006-10-26 2010-06-10 Coley Pharmaceutical Gmbh Oligoribonucleotides and uses thereof
WO2008057529A2 (en) * 2006-11-06 2008-05-15 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Peptide-based vaccine compositions to endogenous cholesteryl ester transfer protein (cetp)
CN101820908A (zh) * 2007-10-09 2010-09-01 科利制药公司 包含改性糖部分的免疫刺激寡核苷酸类似物

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109891238A (zh) * 2016-10-25 2019-06-14 生物技术Rna制药有限公司 免疫治疗剂的剂量确定
CN108728444A (zh) * 2017-04-18 2018-11-02 长春华普生物技术股份有限公司 免疫调节性多核苷酸及其应用

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