CN101248180B - 作为检测日光照射、前列腺癌和其它癌症的诊断工具的线粒体突变及重排 - Google Patents

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Abstract

提供了可用于对于检测癌症和日光照射的线粒体DNA缺失。具体地，提供了检测线粒体DNA缺失以用于前列腺癌、日光照射和非黑色素瘤皮肤癌的早期检测、诊断和发展的方法和试剂盒。

Description

作为检测日光照射、前列腺癌和其它癌症的诊断工具的线粒体突变及重排
技术领域
本发明涉及线粒体基因组学领域。具体地，其涉及线粒体基因组中的突变和重排，及其作为日光照射、衰老和疾病的发生或存在的指示因子的功用，例如在一般的临床症状显现之前检测肿瘤形成前、肿瘤形成以及向潜在恶性转化的进展。 
背景技术
当前生物科学中的大趋势是人类基因组计划以及该数据的商业开发。然而，对这些信息的利用和实行存在例外的限制，因为该数据在个体水平上不是特异性的。令人难以置信的是，该数据仅来自少量个体，难以代表人类种群中存在的变异，从而使得该数据只能用于一般应用。人类基因组惊人的复杂性使基于个体基础的应用并不实际。为了对一个人类细胞核基因组进行完整测序，美国能源部和国立卫生研究院从1988年起已投资25亿美元(http://www.ornl.gov/hgmis/project/budget.html)。 
线粒体基因组 
线粒体基因组是紧凑但却至关重要的核酸序列。线粒体基因组编码细胞呼吸所必需的酶亚基。与33亿bp的庞大核基因组相反，线粒体DNA(或“mtDNA”)是16,569个碱基对(bp)的小核酸基因组(Anderson等，1981；Andrews等，1999)。其遗传互补体比其同细胞的核小得多(0.0005％)。然而，个体细胞带有103至104中任意数目的线粒体，这取决于特定的细胞功能(Singh and Modica-Napolitano 2002)。在细胞核和线粒体基因组之间一般存在通讯或化学信号转导(Sherratt等，1997)。而且，特定的细胞核组分负责线粒体序列的维持和完整性(Croteau等，1999)。当这些细胞核区域由于指示潜在疾病的细胞核重排而失去功能时，接着mtDNA序列中也会开始出现突变。另外，可以通过线粒体基因组中由体细胞突变推动的缺失来对细胞内破坏鉴定特异性线粒体。这种理论性机制也可以用于指示将发生的疾病。线粒体需要约3,000种基因，其中只有37种由线粒体基因组编码，表明了线粒体对细胞核基因座的严重依赖 (Naviaux，1997)。 
一旦发生受精，由于卵细胞中线粒体的克隆扩增，给定个体中所有线粒体DNA(mtDNA)基因组是相同的。mtDNA的关键作用是产生驱动细胞代谢的细胞燃料——三磷酸腺苷(ATP)。重要地，除了由线粒体基因组提供的13种多肽以外，该线粒体基因组依赖70种细胞核编码的蛋白质来完成该生命功能所必需的氧化和还原反应(Leonard和Shapira，1997)。不同的组织和器官对氧化磷酸化的依赖程度不同。与氧化磷酸化(OXPHOS)缺陷相关的疾病看来与mtDNA突变有紧密的联系(Byrne，1992)。由于mtDNA突变的严重性提高而导致OXPHOS降低而超出了器官特异性能量阈值，这引起多种临床表型。而且，线粒体基因组中的突变与多种慢性退行性疾病有关(Gattermann等1995)。众所周知，衰老和特定类型的疾病可以使mtDNA发生改变或突变，使细胞的能量产生能力受损。这常常导致缺陷线粒体的过表达和/或细胞通过增加糖酵解来补充ATP的缺乏(Carew和Huang，2002)；因此，当以连续的间隔进行监测时，线粒体基因组中的改变或突变可以用作疾病发生和/或疾病发展的标记。 
最近，Fliss等(2000)在来自肺及膀胱的癌症的原发性肿瘤中发现了天然情况下主要为同质的mtDNA发生高频率突变，表明突变mtDNA在恶性肿瘤细胞中占多数。点突变和缺失看来是氧自由基对线粒体膜和基因组造成损伤的非程序性但却不可避免的副作用(Miquel等1992)。这个理论看来言之有理，不仅因为线粒体基因组缺乏保护性组蛋白，还因为在产生氧的线粒体内膜附近发现了对氧化损伤的敏感性。而且，由于mtDNA具有紧凑的基因组并缺少内含子，因此有害事件很可能影响编码序列，引起生物化学功能异常。这种功能异常将进一步增加细胞的氧化应激，这将引起核及mtDNA的损伤，从而提高细胞进入癌化过程的可能性(Penta等，2001)。在这方面，研究表明随着年龄的增长，mtDNA的损伤增加(Cortopassi & Wang 1995)，呼吸功能随之衰退(Miquel等1992)，最终导致细胞死亡。 
mtDNA作为诊断工具 
mtDNA序列动力学情况是重要的诊断工具。mtDNA中的突变常常是正在发展中疾病的先期指示，常常与细胞核突变有关，并作为与疾病特异性相关的生物标志物，所述疾病例如但不仅限于：吸烟和接触二手 烟引起的组织损伤和癌症(Lee等，1998；Wei，1998)；基于从约20岁开始并在之后逐渐提高的线粒体基因组突变累积的寿命((von Wurmb，1998)；由突变或接触致癌物、诱变剂、紫外线辐射照射而引起的转移性疾病(Birch-Machm，2000)；骨关节炎；心血管疾病、阿尔茨海默病、帕金森病(Shoffner等，1993；Sherratt等，1997；Zhang等，1998)；与年龄相关的听力丧失(Seidman等，1997)；视神经退化和心率失常(Brown等，1997；Wallace等，1988)；慢性进行性external exophthalmoplegia(Taniike等，1992)；动脉硬化(Bogliolo等，1999)；乳头状甲状腺癌和甲状腺瘤(Yeh等，2000)等等(例如Naviaux，1997；Chinnery and Turnbull，1999)。 
线粒体基因组特定位点的突变可与某些疾病相关。例如，在4216、4217和4917位的突变与Leber′s遗传性视神经病变(LHON)(Mitochondrial Research Society；Huoponen(2001)；MitoMap)相关。在5/5个泛醇细胞色素C还原酶(复合体III)缺陷的患者中发现了15452位的突变(Valnot等1999)。然而，还未这些位点的突变与前列腺癌有关。  具体地，这些改变包括点突变(转换、颠换)、缺失(一个碱基至数千个碱基)、倒位、复制(一个碱基至数千个碱基)、重组以及插入(一个碱基至数千个碱基)。另外，特定的碱基对改变、缺失或其组合与前列腺癌、皮肤癌和肺癌的早期发作以及衰老(例如Polyak等，1998)、提前衰老、接触致癌物(Lee等，1998)等有关。 
因为mtDNA仅通过卵细胞向后代传递，所以急需通过这种遗传手段了解线粒体序列。mtDNA的序列在母系谱系之间有广泛的变异(Ward等，1991)，因此，必须与这种变异相比清楚地了解与疾病相关的突变。例如，若干个体的序列中与特定癌症相关的特定T向C的转换实际上可能是在给定的特定地理区域或与种族相关的母系谱系中广泛的天然变异。例如，北美本地人表现出异常高的成年糖尿病发病频率。另外，所有的北美本地人在遗传上可表征为5个基本的母系谱系，命名为A、B、C、D和X(Schurr等，1990；Stone和Stoneking，1993；Smith等，1999)。谱系A的特点是具有单个点突变，导致线粒体基因组的663bp处出现Hae III位点，然而在这种突变与成人糖尿病发病之间没有因果关系。另外，即使在谱系簇中也存在序列变异。 
在与特定谱系相关的特定标记之外，种群内序列变异多于种群间序 列变异(Easton等，1996；Ward等，1991，1993)。为了最佳地鉴定与疾病相关的突变，就必须了解这种趋异性，因此必须使用模拟纵向设计能力(即长期跟踪受试者)的母系研究法(Parsons等，1997)鉴定与疾病直接相关的突变，而不是物疾病相关性的突变。而且，特定的物质例如二手烟、低水平的石棉、铅、在许多环境中低水平的所有已知诱变剂可能是特定点突变的原因，但却不一定是疾病特异性标志物。因此，丰富的mtDNA序列数据库是准确预测潜在疾病为自然过程或是由于接触致病物质而引起的明确的必要条件。而且，必须对整个分子进行测序以得到其完整的信息内容。必须在整个线粒体基因组上将完整的点突变(转换、颠换)、缺失(一个碱基至数千个碱基)、倒位、复制(一个碱基至数千个碱基)、重组以及插入(一个碱基至数千个碱基)表征为一个整体。这可确保所获得线粒体基因组中所有可能的可用信息。尽管与其核副本一样，胞质线粒体基因组(16,569bp)已在个体水平进行了测序，但是还未在种群水平对线粒体基因组进行测序以用作诊断工具。 
最近，由于其在凋亡和其它肿瘤生物学方面中的作用(Green & Reed，1998，Penta等，2001)，尤其是已在许多人类肿瘤中观察到mtDNA的体细胞突变(mtDNA)(Habano等1998；Polyak等1998；Tamura等1999；Fliss等2000)，因此已经将线粒体与致癌过程相联系。特定的mtDNA突变似乎是同质的(Habano等1998；Polyak等1998；Fliss等2000)，这些后面的发现更有意义。另外，研究者已发现，紫外线辐射(UV)对于非黑色素瘤皮肤癌(NMSC)的发生和发病是重要的(Weinstock 1998；Rees，1998)，并且UV在人类皮肤中诱发mtDNA损伤(Birch-Machin，2000a)。 
而且，线粒体序列随时间失去完整性。例如，4977bp缺失的频率随年龄增长而提高(Fahn等，1996)。从20岁开始，该缺失开始在少量线粒体中发生。至80岁时，大量的分子已发生缺失。该缺失表征了正常衰老的过程，并作为该过程的生物标志物。对这种衰老过程的定量允许使用医学或其他方式的干预来延缓该过程。 
这种线粒体基因组在医学中的应用受到了忽视，是因为mtDNA先前主要用作种群遗传学工具，最近用于取证；然而，越来越明显地，mtDNA的信息内容在医学诊断领域中具有重要的应用。而且，在最近高容量的高通量机器DNA测序系统出现之前，对全部mtDNA互补体 进行测序是一项艰巨的任务。另外，种群遗传学家能够收集来自控制区中的两个高度可变区的重要数据；然而，这些小区域代表整个基因组中10％以下的一小部分，意味着该数据中90％的辨别力没有得到使用。很重要地，许多疾病相关地改变在控制区之外。为了精确并且高辨别地进行诊断，应该考虑整个基因组的特征，以包括所有的序列信息。 
非黑色素瘤皮肤癌 
人类非黑色素瘤皮肤癌(NMSC)在许多白种人群中是最普遍的癌症(Wemstock，1998；Rees，1998)。这些肿瘤中多数为基底细胞癌(BCC)和鳞状细胞癌(SCC)。BCC为局部侵袭性并可导致显著的发病率，但几乎不转移。SCC显示显著的转移潜力，并且免疫抑制的患者中多发性NMSC的发生导致严重的治疗问题(Rees，1998)。尽管BCC没有临床上可检测的恶化前损伤，但一些SCC认为是由前体损伤引起，也就是光化性角化病(AK)或鲍恩病(原位癌)(Rees，1998)。 
SCC显示出影响某些染色体的杂合性丢失，提示某些肿瘤抑制子基因参与其发生。有趣的是，在AK中，这些前体损伤中观察到的基因丢失水平与SCC相比相同或更高(Rehman等1994；Rehman等1996)。这对于本发明是很重要的，因为这提示除了肿瘤抑制子基因失活以外，在SCC的发生中还可能涉及其他机制。 
在发现肿瘤细胞的呼吸系统受损并具有高糖酵解活性时，最先提出了线粒体在肿瘤发生发挥作用的假说(Shay & Werbin，1987)。最近的发现阐明了线粒体在凋亡中的作用(Green & Reed，1998)，与结肠癌(Habano等1998；Polyak等1998，reviewed in Penta等，2001)、膀胱、颈和肺(Fliss等2000)的原发性肿瘤以及胃肿瘤(Tamura等1999)同质mtDNA突变的高发生率一起进一步支持了这种假说。而且，已经提出，这些线粒体突变可影响活性氧类别(ROS)的水平，已经显示ROS具有高促有丝分裂能力(Polyak等1998；Li等1997)。 
本发明人及其它人在先前的研究中已显示mtDNA中的突变以及相关的线粒体功能异常是导致人类退行性疾病的重要促进因素(Birch-Machin等1993；Chinnery等1999；Birch-Machin等2000b)。这是因为，该细胞器中产生的大量ROS使线粒体基因组特别容易突变，同时与核相比缺乏保护性组蛋白并且mtDNA修复的速率很低(Pascucci 等1997；Sawyer & van Houten；LeDoux等1999)。实际上，mtDNA的突变率约比细胞核DNA高10倍(Wallace，1994)。在最近的人类肿瘤研究中鉴定的多数mtDNA突变表明可能接触了ROS衍生的诱变剂。这对于NMSC中mtDNA突变研究十分重要，因为最近有证据表明UV诱导的ROS直接参与人类皮肤细胞mtDNA缺失的产生(Berneburg等1999，Lowes等，2002)。另外，无保护性色素沉着或遗传素因(geneticpredisposition)的个体中NMSC的主要决定因素是UV(Weinstock，1998)。还发现SCC推定的前体损伤主要发生在经常接受日光照射的部位上。这之所以重要，是因为Birch-Machin实验室的工作已经显示，取自接受不同日光照射的身体部位的皮肤中线粒体DNA损伤的发生频率之间存在不同的差异。发现绝大多数损伤位于经常接受日光照射的位点上(Krishanan等，2002)。 
本发明的发明人之一首先定量显示了UV照射诱导mtDNA损伤(Birch-Machin等1998)。作为分子标记，mtDNA用于研究人类皮肤中自然老化与光老化之间的关系。利用3-引物定量PCR(qPCR)方法研究与人类皮肤的日光照射和自然老化相关的4977bp缺失mtDNA与野生型mtDNA比例的改变。与避光部位(1.1％[1/90])相比，日光照射部位的高水平4977bp缺失mtDNA的发生率(27％，[27/100])显著提高(即＞1％)(Fishers精确检验，P＜0.0001)。因此，mtDNA的缺失或突变可以用作累积性紫外线照射的标志物。 
而且，使用针对胸腺嘧啶二聚体的单克隆抗体进行South-Western印迹法进行的研究为纯化的mtDNA中存在UV诱导的损伤提供了直接的证据(Ray等1998)。 
本发明人的研究组在最近的工作中使用了长延伸PCR(LX-PCR)技术扩增完整的线粒体基因组，以确定UV照射继发的mtDNA完整缺失谱(Ray等2000)。对71个分散的皮肤样品就其与日光照射的关系进行了长PCR分析，其中将表皮与下面的真皮分离。随着UV照射的增加，表皮中的缺失数显著增加(Kruskal-Walhs检验，p＝0.0015)。表皮中的该发现不会与也通过长PCR技术检测的年龄依赖性mtDNA缺失提高混淆。大光谱的已鉴定缺失使得与UV照射有关的mtDNA的普遍性质和高突变复合更加明了。与使用竞争性PCR检测单缺失相比，该研究显示长PCR是一种灵敏的技术，因此可以提供更全面的(尽管 不是定量的)皮肤总体mtDNA损伤指标。上述发明人之一的研究清楚地显示，mtDNA是UV的重要靶标，这与线粒体在皮肤病中的功能一起于最近进行了综述(Birch-Machin，2000)。 
已对UV敏感性和人类皮肤癌的主要共变体的人类毛发及皮肤色素沉着进行了研究。这些研究关注于黑皮质素1受体基因变体与个体和种群中日光敏感性与皮肤癌易感性相关的联系(Smith等1998；Healy等1999；Flanagan等2000；Healy等2000；Harding等2000；Flanagan等，2002)。然而，这些研究没有强调mtDNA序列种群水平的变异与特定皮肤类型和/或毛发颜色的关系。 
最近人类肿瘤中mtDNA突变的研究在很大程度上仍未回答的一个问题是线粒体基因组中缺失的发生率与这些肿瘤的关系。这是一个有待解决的重要问题，因为人类皮肤单个患者的初步研究已经显示，在某些肿瘤(AK和SCC)和正常皮肤之间存在普遍mtDNA缺失发生率的差异(Pang等1994)。本发明人自己的初步数据也显示，与正常皮肤相比肿瘤中mtDNA缺失的数目增加。最后，Birch-Machin及其他人已显示，mtDNA缺失以及复制的发生率随UV照射的增加而提高(Berneburg等1999；Birch-Machin等1998；Ray等1998；Ray等1999；Ray等2000)，Lindsey等，2001；Birch-Machin等，2001；Lowes等，2002，Krishnan等，2002)。 
除了与肿瘤进展相关的问题之外，最近在人类肿瘤中的mtDNA研究在很大程度上也没有回答其他重要问题(Habano等1998；Fiiss等2000)。首先，由于技术的局限性，mtDNA突变是否真的是同质的还不清楚，因为变化的异质性水平也可指示重要的疾病转换(Habano等1998；Polyak等1998；Fliss等2000)；其次，除了一个研究以外(Tamura等1999)，还未研究过mtDNA缺失的发生率及其作为NMSC的潜在生物标志物的作用。研究者们研究了常见的缺失并忽视了剩余的约100个缺失。此外，研究者们着眼于突变的鉴定，而非对其定量。以定量方式精确评估缺失的发生率是很重要的，因为mtDNA损伤对ATP产生以及由此引起的细胞功能具有阈值效应。另外，缺失很难于表征。 
通常使用长PCR，其产生随后需要表征的缺失梯状条带。 
现有的NMSC诊断是对切除组织的病理评估。因此，需要使个体易 感于NMSC的UV所诱发DNA损伤的早期标记物。还需要基于遗传学的诊断工具，其允许进行早期检测，并具有诊断精确性。 
前列腺癌 
前列腺癌是经常被诊断出的实体瘤，非常可能来源于前列腺上皮(Huang等1999)。在1997年，对近一千万美国男性筛选了前列腺特异性抗原(PSA)，其存在提示患有前列腺癌(Woodwell，1999)。事实上，这表明通过初步的直肠指检(DRE)会筛选出更大数目的男性。同一年，三千一百万男性进行了DRE(Woodwell，1999)。此外，美国每年新诊断出的前列腺癌病例数目估计为179,000(Landis等，1999)。它是加拿大男性中第二最常诊断出的癌症以及导致癌症死亡的第二主因。在1997年，前列腺癌在加拿大男性新诊断出的癌症中占19,800例(28％)(加拿大国家癌症研究所)。据估计，所有49岁以上的男性中30％至40％具有一些癌性前列腺细胞，然而这些男性中只有20％至25％有临床显著形式的前列腺癌(SpringNet-CE Connection，internet，www.springnet.com/ce/j803a.htm)。前列腺癌表现为多种组织学行为，包括性因素和外在因素，即社会经济状况、饮食、地理环境、激素失衡、家族史以及遗传成分(Konishi等1997；Hayward等1998)。 
就风险的观点而言，家族性和遗传性前列腺癌不认为是同义术语。家族性癌症指在家族内发生，但是不会遗传。这种形式占前列腺癌的最多25％(Walsh & Partin，1997)。遗传性指具有易感基因孟德尔遗传性的前列腺癌亚型，占所报道病例的约9％。这种疾病的前列腺癌家族史提示这些易感基因在前列腺癌的发生和发展中起重要的作用。最近，已将1号和X号染色体上的易感性基因鉴定为使男性易感于前列腺癌，提供了遗传性癌症病因学深入的了解(Berthon等1998；Xu等1998)。 
前列腺癌预后主要依赖于诊断时的肿瘤阶段和分级。只有局部前列腺癌能够通过放射性治疗被治愈。标准化检测仍依赖于直肠指检、PSA检测和对前列腺活检组织的组织病理学检查。活检用于确认恶性，这不是一种早期检测技术。不幸的是，一些早期肿瘤不可能在直肠检查中鉴定出来。PSA检测的特异性为60％至70％，灵敏度为70％至80％(personal communication，Dr.Sunil Gulavita，Northwestern OntarioCancer Centre)。改善普通组织学分级肿瘤的诊断的一种较新技术是使用流式细胞术进行倍性DNA分析(Shankey等1995)；然而，该技术 测量仅在癌症发展后期显现的染色体变化，对于早期癌症中DNA结构的小变化或染色体倒位或交互易位不够灵敏。本发明着眼于早期检测，因为预后严重依赖于诊断时疾病阶段。 
我们对于前列腺癌中的遗传异常的认识并不够。对于前列腺癌的研究着眼于以下领域认识的发展：1)原癌基因(Buttyan等1987)；2)肿瘤抑制基因(p53、p73、KAI1和MMACI/PTEN；Dong等1995；Cairns等1997)以及3)端粒/端粒酶在转移中的活性。前列腺细胞中端粒酶的上调和端粒DNA的扩增可以提供有效的诊断标志物。而且，端粒可作为治疗位点(Ozen等1998)。许多小组已证实了1号染色体短臂中的“前列腺癌基因”(Berthon等1998)。需要更多的工作来鉴定该区域内的特异性基因座。已经提出，该标志物仅是使男性易感于家族性前列腺癌的若干可能基因之一。其他研究已显示了X号染色体上可能的标志物基因座(Xu等1998)。如果某些前列腺癌是多基因的，那么mtDNA将成为重要的诊断工具，因为在这样的情况下鉴定和了解所有相关核基因之间的互作是很困难的。 
当然，前列腺癌研究中的关键问题是鉴定能有效确定和区分肿瘤发展的分子标记物。分子标志物能够在前列腺癌病例中区分出将迅速发展为转移性疾病的以及几乎不会导致肿瘤发生的情况。分子标志物或突变的比较能确定肿瘤途径是潜伏性的还是攻击性的。直至本研究都主要着眼于核基因组中所隐藏的秘密；然而，小得多的mtDNA基因组看来是作为细胞核中事件的晴雨表，从而提供了早期检测人类前列腺癌的手段(Zeviani等1990)。重要的是，在这方面中，由于其在凋亡和肿瘤生物学其他方面中的作用，线粒体已经与癌症发生过程相联系(Green & Reed 1998)。具体地，已在许多人类肿瘤中观察到mtDNA的体细胞突变(Polyak等1998，Tamura等1999，Fliss等2000)。然而，先前的研究完全是横断式的(cross-sectional)，因为它们未考虑母系中mtDNA的无性系性质。这些有限的横断研究仅显示在一个时间点的突变。这可能给出在突变和相应疾病状态之间的准确联系，也可能不能给出。应用母系的横断式研究具有随时间跟踪mtDNA中突变的优点，从而模拟了纵向设计的能力。是常见种群变体的突变以及与其相对的疾病相关突变均能够被鉴定。 
衰老 
衰老由累积的分子和细胞水平上随时间的变化组成；然而，衰老过 程背后的特定分子机制还有待阐明。为了尝试解释衰老过程，将来自较年老受试者的线粒体基因组与同一母系谱系中较年轻受试者的线粒体基因组进行比较。与衰老有关的一个缺失称为普遍缺失或4977-bp缺失。衰老研究局限于该普遍缺失以及控制区中的多态性。为了清楚地了解这些突变，必须分析整个基因组。其他缺失参见表1，改自Wei，1992。 
表1 
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氧自由基(ATP产生的正常副产物)是这种随年龄增长而频率增加的缺失的可能原因。现有的文献证明了在分裂期后的组织(如肌肉和脑)中mtDNA(mtDNA)突变、自然年龄和整个衰老过程之间强烈的相关性；然而，需要相当的母系来区分衰老相关的突变事件以及与衰老无关的突变。 
近年来，已显示多种慢性退行性疾病是由于mtDNA的突变(Gatterman等1995)。与缺陷型OXPHOS有关的疾病似乎与mtDNA突变密切相关(Byrne，1992)。而且，已显示这些疾病经常与线粒体基因组4977-bp的普遍缺失有关(Liu等1997)。这种大缺失还在异质水 平上见于正常衰老的人，与“衰老的线粒体理论”一致(Harman，1981)。这表现为老人中缺失频率的提高(Cortopassi & Wang，1995)以及随后呼吸功能的减弱(Miquel等1992)，最终导致细胞死亡。对疾病或病症素因的早期检测为医学干预提供了绝好的机会，因为早期的遗传诊断可改善患者的预后。 
先前使用横断式设计的研究已建立了mtDNA突变、缺失和/或其组合与衰老之间的联系或者因果关系；然而，为了获得准确的数据，必须简要测定年龄特异性缺失和/或突变速度。在种群水平将突变归因于衰老过程而非特定疾病是至关重要的。该信息对于认识mtDNA损伤如何随时间而发生是必需的。而且，必须了解这些特定突变的后果、其频率以及与衰老的时间方面的联系，从而预测并最终在分子水平延缓衰老。研究者们尚未确定该速率，这需要通过母系评估种群数据。因此，需要追踪该衰老过程的生物标志物。 
因此，需要简单的、直接的监测线粒体基因组中突变的系统，所述突变指示早期癌症、衰老或其它具有DNA组分的人类疾病。还需要用于与线粒体基因组缺陷有关的日光照射、非黑色素瘤皮肤癌、前列腺癌、肺癌和衰老的简单诊断系统。需要区分导致疾病的mtDNA突变以及仅代表种群内和种群间变异的突变的诊断系统。 
发明概述 
本发明的内容列于权利要求书中 
例如，本发明提供了用于在含有mtDNA的生物样品中检测癌症素因、癌症早期检测、癌症发生、癌症的存在、癌症的发展、癌症不存在或日光照射的方法，包括(a)提供包含mtDNA的生物样品和(b)检测mtDNA中的缺失。 
本发明的另一个方面提供包含多个核酸成员以及固体基质的阵列，其中每个核酸成员与至少一种缺失有关，并选自线粒体DNA、转录自线粒体DNA的RNA以及cDNA，所述缺失与癌症素因、癌症早期检测、癌症发生、癌症的存在、癌症的发展、癌症不存在、日光照射或衰老有关，其中每个核酸成员在所述阵列上具有独特的位置，并且与所述固体基质稳定结合。 
本发明的另一个方面提供用于诊断癌症素因、癌症早期检测、癌症发生、癌症的存在、癌症的发展、癌症不存在或日光照射的试剂盒，其包含选自以下的至少一个成员：固体支持物、上述阵列、支持所述固体支持物的手段、提取线粒体DNA的手段、获取线粒体DNA序列数据库的手段、引物、试剂和说明书。 
本发明的另一个方面提供包含线粒体DNA序列的数据库，所述线粒体DNA序列选自与非疾病状态相关的正常对照序列、与种群间变异相关的序列、种群内变异相关的序列或者与癌症素因、癌症早期检测、癌症发生、癌症的存在、癌症的发展、癌症不存在、日光照射或衰老相关的序列。 
本发明的另一个方面提供检测具有mtDNA的受试者中跨越mtDNA基因组中约10744位至14124位核苷酸的缺失的方法，其中所述缺失与前列腺癌有关，其包括(a)提供来自该受试者的生物样品，以及(b)检测mtDNA中缺失的存在。所述缺失可在3000至4000bp的范围内。所述缺失可以约为3379bp。所述缺失可缺失10744位至14124位之间的所有或一部分碱基对，基本上包含编码NADH脱氢酶亚基4L、NADH脱氢酶亚基4、NADH脱氢酶亚基5、tRNA组氨酸、tRNA丝氨酸2和tRNA亮氨酸2的基因。 
本发明的另一个方面提供包含 
TAG ACT ACG TAC ATA CTA ACC CTA CTC CTA(SEQ ID NO：139)的核酸引物3.4正向以及包含GAG GTA GGA TTG GTG CTG T(SEQ ID NO：140)的核酸引物3.4反向。 
本发明的另一个方面提供包含多个核酸成员和固体基质的阵列，其中所述核酸成员之一与大约位于10744位至14124位的mtDNA缺失有关，其中所述核酸成员在所述阵列上具有独特的位置，并且与所述固体基质稳定结合。 
本发明的另一个方面提供了用于诊断皮肤癌的试剂盒，其包含选自以下的至少一个成员：一次性芯片、权利要求31的阵列、支持所述一次性芯片的手段、提取mtDNA的手段、引物、试剂和说明书。 
本发明的另一个方面提供在来自受试者的生物样品中监测人向前列腺癌发展或前列腺癌的发展的方法，其包括：提供来自该受试者的生物样品；从该生物样品中提取DNA；检测mtDNA缺失的存在与否；确 定该缺失是否与正常的种群间或种群内变异有关，或者该缺失是否与前列腺癌的素因、向前列腺癌的发展、前列腺癌或前列腺癌发展的存在与否有关，以及；重复所述步骤。 
本发明的另一个方面提供mtDNA中约10744位和14124位之间的缺失在具有mtDNA的受试者中检测前列腺癌素因、前列腺癌早期检测、前列腺癌发生、前列腺癌的存在或前列腺癌发展中的用途，该缺失包含NADH脱氢酶亚基4L、NADH脱氢酶亚基4、NADH脱氢酶亚基5、tRNA组氨酸、tRNA丝氨酸2和tRNA亮氨酸2的基因中的全部或一部分。  本发明的另一个方面提供确认或推翻来自活检样品的前列腺癌活检测试的方法，包括：获得来自活检样品的正常组织；以及检测正常组织中约3379bp的mtDNA缺失的存在与否。 
本发明的另一个方面提供用于前列腺肿瘤三维作图的方法，包括：获得六分(sextant)穿刺活检样品；以及检测每个六分样品中约3379bp的mtDNA缺失的存在与否。 
本发明的另一个方面提供收集患者样品以用于通过mtDNA基因组中约10744位至14124位核苷酸处的缺失来诊断前列腺癌、日光照射的方法，该方法包括：提供来自所述受试者的生物样品。 
本发明的另一个方面提供用于诊断前列腺癌的跨越mtDNA基因组中约10744位至14124位核苷酸的线粒体缺失。 
本发明的另一个方面提供用于检测日光照射或非黑色素瘤皮肤癌的方法。 
本发明的另一个方面提供检测具有mtDNA的受试者中跨越mtDNA基因组劣弧中约547位至4443位核苷酸的缺失的方法，其中所述缺失与皮肤癌和/或日光照射有关，该方法包括：提供来自所述受试者的生物样品；以及检测mtDNA中该缺失的存在。本发明的另一个方面提供了测定具有mtDNA的受试者中累积性UV照射的方法，包括：提供来自所述受试者的生物样品；以及检测mtDNA中该缺失的存在。类似的方法也可用于监测临床UV光疗方案的长期安全性。该缺失可在3500至4000bp的范围内。该缺失可以约为3895bp，包含了从D-环中的mtTF1结合位点左右至tRNA甲硫氨酸的mtDNA段。该缺失可以缺失 mtDNA基因组的劣弧中547位至4443位之间的所有或部分碱基对，基本上包含12s rRNA基因、16s rRNA基因、ND1基因以及H和L链转录的启动子。 
本发明的另一个方面提供包含CTT TTG GCG GTA TGC ACT TT(SEQ ID NO：145)的核酸引物L404以及包含GAT TAT GGA TGC GGT TGC TT(SEQ ID NO：146)的核酸引物H4676。 
本发明的另一个方面提供包含 
TGC TAA CCC CAT ACC CCG AAA ATG TTG G Tamra(SEQ ID NO：153)的核酸探针，3895探针。 
本发明的另一个方面提供了包含多个核酸成员和固体基质的阵列，其中所述核酸成员之一与约547位至4443位的mtDNA缺失有关，其中所述核酸成员在所述阵列上具有独有的位置，并且与所述固体基质稳定结合。 
本发明的另一个方面提供用于诊断皮肤癌的试剂盒，其包括一次性芯片、上述阵列、容纳所述一次性芯片的手段以及用于提取mtDNA的手段。 
本发明的另一个方面提供在来自受试者的生物样品中监测人的日光照射和非黑色素瘤皮肤癌的方法，包括：提供来自所述受试者的生物样品；从该生物样品中提取DNA；检测mtDNA缺失的存在与否；确定该缺失是否与正常的种群间或种群内变异有关，或者该缺失是否与日光照射有关，以及；重复所述步骤。 
本发明的另一个方面提供了具有mtDNA的受试者中mtDNA基因组劣弧约547位至4443位之间的缺失在检测日光照射或非黑色素瘤皮肤癌中的用途。 
本发明的另一个方面提供收集患者样品以用于通过跨越mtDNA基因组劣弧中约547位至4443位核苷酸的缺失来诊断皮肤癌的方法，该方法包括：提供来自所述受试者的生物样品。 
本发明的另一个方面提供了用于诊断日光照射或皮肤癌的跨越mtDNA基因组劣弧中约547位至4443位的线粒体缺失。 
本发明的另一个方面提供了所述缺失接合序列SEQ ID NO：147用于确认与日光照射或NMSC有关的3895bp mtDNA缺失的存在的用途。 
本发明的另一个方面提供灵敏地检测DNA样品中重排的方法，其中样品DNA序列中的所述重排产生了新形成的接合，该方法包括：提供含有或怀疑含有重排的DNA样品；提供跨越由重排产生的新形成接合的引物或探针；通过扩增或探测所述接合来检测所述重排。所述重排可以在mtDNA中。所述重排可以是缺失。 
附图说明
图1是显示来自前列腺癌患者的线粒体DNA中核苷酸位置处突变数目的直方图。 
图2显示使用Hierarchical Clustering Explorer(HCE)得到的非同义聚类的前一半。 
图3显示使用Hierarchical Clustering Explorer(HCE)得到的非同义聚类的后一半。 
图4是图3的拷贝，其中重要的聚类用阴影显示。 
图5是显示可用于检测所述3.4kb缺失的引物设计及序列的示意图。 
图6是显示在3.4kb研究中恶性与症状性良性患者之间循环阈值的比较图。 
图7是显示实施例12相关的循环阈值的图。 
图8a)是代表性溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶，显示与偶尔接受日光照射的皮肤相比，经常接受日光照射的皮肤中3895bp缺失频率更高。 
图8b)是取自不同的日光照射身体部位的104个分散皮肤样品中3895bp缺失频率的直方图。 
图9是显示17次重复性UVR施用后UV诱导的3895bp缺失增加的凝胶。 
图10是在实施例14中使用的用于检测3895bp缺失的PCR引物和TaqMan探针在mtDNA上的定位示意图。 
图11是两幅显示3895bp缺失(A)和野生型内标(B)的模板浓度与阈值循环数(CT)之间线性关系的图。 
图12是溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶照片，显示在来自BCC和SCC的肿瘤(T)以及组织学上正常的病灶周围真皮(D)和表皮(E)中3895bp缺失的发生率。 
图13是代表性的溴化乙锭琼脂糖凝胶照片，显示三对日光照射和三对日光间歇照射的样品中如实时PCR所检测的其相应3895缺失水平的典型实例。 
图14是显示日光照射和日光间歇照射的真皮和表皮中如实时PCR测定的3895bp缺失水平(表示为百分比)的散点图。 
图15是显示在诊断前列腺肿瘤中活检结果与mtDNA分析之间关系的图。 
附表说明 
表1是与衰老有关的突变总结。 
表1a是对照、远处良性、邻近良性以及恶性组织中7个蛋白质编码区的mtDNA中突变的主要成分分析。 
表1b是对照、远处良性、邻近良性以及恶性组织中7个蛋白质编码区的mtDNA中突变的神经网络分析。 
表1c是对31个前列腺癌患者的远处良性、邻近良性以及恶性前列腺组织中线粒体的ND1、ND2、COXI和CYTB区中发现的同义和非同义突变的总结。 
表1d是来自恶性腺的远处良性组织与来自有症状但非恶性的受试者的前列腺组织中线粒体DNA突变的卡方分析。 
表2是对表皮肿瘤和邻近的正常组织中平均缺失数目的总结。 
表3是对DHPLC标准方法的总结。 
表4是对来自前列腺癌患者穿刺活检的线粒体突变(包括D-环)以及恶性、临近及远处良性前列腺的完整基因组突变的总结。 
表5列出用于对来自血液的福尔马林固定组织及正常组织的完整线粒体基因组进行扩增的引物。 
表6列出用于实施例12的扩增引物。 
表7是实施例12的qPCR组分。 
表8显示用于实施例12的循环参数。 
表9列出用于实施例14中的探针。 
发明详述 
本发明所述的方法可用于诊断与mtDNA有关的疾病。本发明的方法提供了由生物样品对个体线粒体基因组进行分析，例如使用任何已知方法通过扩增线粒体基因组、对部分线粒体基因组(优选个体的完整线粒体基因组)进行测序。变性高效液相层析(DHPLC)也可以用于快速筛选许多样品。DHPLC可以着眼于突变热点。DHPLC在检测突变方面比自动测序更灵敏，并且与普通的测序的20-25％比较，它甚至可以检测2％的异质性。还可以开发用于检测更低水平异质性(＜2％)的方法。 
本文所使用的“光化性角化病”指鳞状细胞癌的推定前体表皮损伤。 
本文所使用的“衰老”指分子及细胞水平上随时间变化的积累。 
本文所使用的“等位基因”指占据染色体上特定位置的给定DNA序列的几种备选形式之一。 
本文所使用的“人工神经网络(ANN)”指若干互联元件同时处理信息的虚拟设备，其改编并学习过去的模式。 
本文所使用的“附着”或“点样”指将核酸放置在固体基质上以形成核酸阵列，以使所述核酸通过共价键、氢键或离子相互作用不可逆地结合于固体基质的过程。 
本文所使用的“非典型”或“异常”指不正常但看来也不是恶性的 细胞外观。 
本文所使用的“基底细胞癌”指一种皮肤细胞癌类型。 
本文所使用的“良性的”指对健康没有危险；非复发性或进行性；非恶性。 
本文所使用的“良性前列腺疾病”可包括但不限于增生、炎症、萎缩、前列腺炎、组织转化和前列腺上皮内瘤。 
本文所使用的“鲍恩病”指原位表皮癌。 
本文所使用的“循环阈值”(cycle threshold，CT)是靶扩增升至背景以上时的循环数，如信号(如荧光信号)所示。 
本文所使用的“诊断性”或“诊断”指使用突变的存在与否或突变组合作为疾病诊断或管理的因素。所述突变的检测可以是疾病状态诊断中的步骤。 
本文所使用的“疾病”包括病症或其它异常身体状态。 
本文所使用的“与疾病相关的线粒体基因组”指含有指示特定疾病或以其他方式与特定疾病相关的突变的基因组。 
本文所使用的“数据库”指电子存储系统(基于计算机并使用标准工业软件)，其能够存储并提供可取回的信息，该信息能使研究者快速地确定核苷酸序列的结构。该数据库还存储关于提供所述生物样品的个体的描述性信息。这些描述性信息包括健康状况以及可能与所述生物样品有关的其它相关指标。 
本文所使用的“缺失”指从核酸的连续序列中去除一段DNA区，其中一旦发生缺失，则通过使末端再结合来修复缺口。缺失的大小范围从一个碱基至数千碱基或者更大。 
本文所使用的“复制”指DNA的特定序列拷贝并插入原始拷贝之后或之前一次或多次，或者插入基因组其他位置。 
本文所使用的“异质性”定义为在一个器官或细胞内线粒体序列中突变的比例。异质性突变是那些发生在一些而非所有线粒体基因组拷 贝中的突变。 
本文所使用的“同质性”指所有线粒体序列都是相同的。 
本文所使用的“高变”指加速的突变率，其不能通过正常的细胞过程或标准进化原则来解释。 
本文所使用的“倒位”指将一定长度的DNA切除并以反方向再次插入。 
本文所使用的“母系遗传”指线粒体通过卵的细胞质遗传。 
本文所使用的“母系”指通过连续世代从母亲传递下来的线粒体DNA的无性系序列。 
本文所使用的“线粒体”指产生用于细胞过程的ATP的真核细胞细胞器。 
本文所使用的“突变”包括野生型序列DNA或RNA中的任何修饰或改变，包括但不限于点突变、转换、插入、颠换、易位、缺失、倒位、复制、重组或其组合。所述序列修饰或改变可从单一碱基改变直至完整DNA或RNA片段的添加或消除。 
本文所使用的“突变负荷”指mtDNA中突变的增加，其最终可导致相关基因或整个基因组的功能受损，或者可在非编码区中积累。 
本文所使用的“瘤形成”指可导致转化成恶性状态的病理过程。 
本文所使用的“无关组织”指来自与目的疾病无关的身体部分的组织。 
本文所使用的“非同义的”多核苷酸突变是导致所编码氨基酸不同的突变。 
本文所使用的“正常组织”指通过组织学测定没有可见疾病表现的组织。 
本文所使用的“核酸阵列”指以超过20种不同核酸/cm2的密度附着于固体支持物的一个表面的多个独有核酸，其中每个所述核酸附着在固体支持物表面上的不同预选区域中。在一个实施方案中，附着在所述 固体支持物表面的核酸是DNA。在优选的实施方案中，附着在所述固体支持物表面的核酸是cDNA。在另一个优选的实施方案中，附着在所述固体支持物表面的核酸是通过聚合酶链式反应(PCR)合成的cDNA。优选地，本发明的核酸阵列包含长度至少为150个核苷酸的核酸。优选地，核酸阵列包含长度小于6,000个核苷酸的核酸。更优选地，核酸阵列包含长度小于500个核苷酸的核酸。在一个实施方案中，所述阵列包含附着在固体支持物一个表面上的至少500种不同核酸。在另一个实施方案中，所述阵列包含附着在固体支持物一个表面上的至少10种不同核酸。在另一个实施方案中，所述阵列包含附着在固体支持物一个表面上的至少10000种不同核酸。本文所使用的术语“核酸”可与术语“多核苷酸”互换。 
本文所使用的“核酸靶标”或“靶核酸”定义为能与互补序列的核酸成员结合的核酸，所述结合是通过一种或多种类型的化学键，通常通过互补碱基配对，通常通过氢键形成来实现。本文所使用的核酸靶标可包括天然的(即A、G、C或T)或经修饰的碱基(7-脱氮鸟苷、肌苷等)。另外，核酸探针中的碱基可以通过除磷酸二酯键以外的键连接，只要其不干扰杂交即可。因此，核酸靶标可以是肽核酸，其中成分碱基通过肽键而非磷酸二酯键连接。优选地，所述核酸靶标来源自人组织或流体提取物。更优选地，所述核酸靶标是由人的组织或流体提取物合成的单链或双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交体。 
本文所使用的“核”指真核细胞中最明显的细胞器，其包含所有的染色体DNA。 
本文所使用的NPV(Negative Predictive Value，阴性预测值)指无所检测疾病或病症的测试结果阴性的患者的百分比。其评估阴性测试结果的可靠性。计算为NPV＝(真阴性)/(真阴性和假阴性)。 
本文所使用的“偶尔接受日光照射的皮肤”指个体中偶尔或有时被照射的皮肤。例如，取决于所述个体，其可包括肩膀、背部和胸部。 
本文所使用的PPV(Positive Predictive Value，阳性预测值)指具有所检测疾病或病症的测试结果阳性的患者的百分比。其评估阳性测试结果的可靠性。计算为PPV＝(真阳性)/(真阳性和假阳性)。 
本文所使用的“PSA测试”指前列腺特异性抗原测试；它是可见 于血中的可能指示前列腺癌的抗原。 
本文所使用的“点突变”指DNA中单个核苷酸的改变。 
本文所使用的“多态性”指等位基因群或mtDNA基因组中的序列变异。 
本文所使用的“前体损伤”指表明潜在的疾病相关性的DNA突变或其组合。 
本文所使用的“易感于疾病”或“疾病素因”指个体由于存在或不存在与所述疾病或病症相关的突变，而与一般个体相比发生所述疾病或病症的风险更高，或者所述疾病或异常早发病的风险更高。 
本文所使用的“前瘤形成”指细胞可能在变为瘤性的阈值上时细胞或DNA水平的指示。 
本文所使用的“预选区”、“预定区”或“独有位置”指基质上的局部区域，该区域用于、曾用于或旨在用于放置核酸，并且在本文中还称为“选择区”或简单地称为“区”。预选区可为任何便利的形状，例如圆形、矩形、椭圆形、楔形等。在一些实施方案中，预选区域小于约1cm2，更优选小于1mm2，更优选小于0.5mm2，在一些实施方案中约为0.125至0.5mm2。 
本文所使用的mtDNA中突变的“存在”包括异质突变，因此预期存在突变DNA的样品中还可能存在一些正常mtDNA。 
本文所使用的“鲜有日光照射的皮肤”指个体中很少或几乎不曾被照射的皮肤。例如，取决于该个体，其可包括臀部和足跟。这也可以叫做“防日光”皮肤。 
本文所使用的“实时PCR循环阈值CT”是荧光穿过阈值线的点(循环)。 
本文所使用的“体细胞突变”指受精后DNA序列中的变化。 
本文所使用的“固体基质”或“固体支持物”指具有刚性或半刚性表面的材料。术语“基质”和“支持物”在本文中与术语“固体基质”和“固体支持物”互换使用。所述固体支持物可以是生物的、非生物的、 有机的、无机的或其任意组合，以颗粒、链、沉淀物、凝胶、片、管、球、容器、毛细管、垫、薄片、膜、板、载玻片等存在。基质常常为硅或玻璃表面、聚四氟乙烯、聚二氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、带电膜如尼龙66或硝酸纤维素，或者为其组合。在优选的实施方案中，固体支持物是玻璃。优选地，基质的至少一个表面基本上是平的。优选地，固体支持物的表面含有反应性基团，包括但不限于羧基、氨基、羟基、巯基等。在一个实施方案中，所述表面是透明的。 
本文所使用的“接受日光照射的皮肤”指“经常”或“偶尔”被日光照射的皮肤。 
本文所使用的“防日光的皮肤”指很少被日光照射的皮肤。 
本文所使用的“鳞状细胞癌”指一种皮肤细胞癌类型。 
本文所使用的“稳定结合”指核酸与固体基质通过共价键、氢键或离子相互作用不可逆结合以形成阵列，从而相对于所有其它稳定地与阵列结合的核酸来说，或者相对于固体基质上所有其它预选区域来说，在进行阵列分析(即杂交和扫描)的条件下，该核酸保持在其独有的预选位置。 
“统计学显著”量的线粒体DNA序列通过使用标准卡方统计算法进行测定，其中使用或测定观察与预期相比的分数。 
本文所使用的“微小突变”指在检测阈值处的低水平突变。 
本文所使用的“症状性良性”指患者表现出一种或多种与前列腺恶性有关的症状，包括但不限于PSA升高、异常的直肠指检(DRE)分数、排尿困难、尿中带血和/或脓、下背、骨盆和大腿上部疼痛或者射精痛，但是已由合格病理学家通过活检组织的检查诊断为良性。 
本文所使用的“同义”突变是多核苷酸中不影响所编码氨基酸的突变。 
本文所使用的“转换”指用类似的含氮碱基替换，即嘧啶替换嘧啶，嘌呤替换嘌呤。即一个嘧啶被另一个嘧啶替换，或一个嘌呤被另一个嘌呤替换的突变。 
本文所使用的“颠换”指用不相类似的含氮碱基替换，即嘌呤替换为嘧啶，嘧啶替换为嘌呤。即嘌呤被嘧啶替换或取代的突变，反之亦然。 
本文所使用的“经常接受日光照射的皮肤”指个体中通常或常常被照射的皮肤。例如，取决于个体，其可以包括头皮、脸、颈和耳。特定疾病的mtDNA及诊断 
在本发明的实施方案中，提供了通过比较mtDNA序列来监测衰老、日光照射及诊断特定疾病如前列腺癌和非黑色素瘤皮肤癌的方法。用mtDNA而非核DNA诊断疾病如前列腺癌具有若干优点。首先，mtDNA作为较不复杂的基因组，可容易地在个体和种群水平加以了解，因此具有正常和疾病相关基因组的大mtDNA数据库使得个体诊断极其准确。因此了解了与疾病相关的变异。其次，mtDNA的突变率比核DNA高10倍(Wallace 1992)。提示疾病初期的核重排迅速地与线粒体通讯，其中它们表现为体细胞突变。第三，mtDNA具有母系遗传模式，并且基本上是无性系的，因为所有的线粒体来源于相同的mtDNA序列，因此来自这种无性系状态的变异易于检测。此外，mtDNA未显示重组的有力证据，因此序列中的任何改变均为体细胞事件。任何一个具有突变的线粒体都是隐性的，因为在每个线粒体中有许多线粒体基因组(2-10个拷贝)，并且每个细胞中有许多线粒体(500-2,000)。而且，线粒体基因组可耐受非常高水平(可达90％)的带有基因组损伤的线粒体。这通过其余的野生型mtDNA的互补来实现(Chomyn等1992)。然而，突变的基因组较之野生型基因组具有复制优势，因为它们通常较小(Hayashi等1991)，因此存在突变mtDNA的克隆扩增(Brierley等1998)，这提示与细胞核基因不同，几乎没有或没有针对具有mtDNA突变的细胞的选择。由于这种升高的突变率，mtDNA中出现的突变和/或缺失在该细胞的生命期限内维持，并可以作为接触多种诱变剂的记录。mtDNA的完整性由核修复机制来维持，已经提出这些基因座的缺陷会导致与多种线粒体缺失有关的常染色体显性病症(Zeviani等1990)。所以，mtDNA可作为多种癌症或其他疾病相关的早期核事件的早期预警标记。最后，可在个体基础上对所述线粒体基因组进行测序并监测突变。 
本发明的方法和产物可检测异质及同质的突变。实际上，异质突 变可能对于疾病、病症或衰老的早期发生的检测非常关键。另外，尽管特定的突变位点可以指示特定的疾病状态、病症或衰老过程，但是总的突变负荷对于确定疾病、病症或衰老的发生、存在以及发展也是重要的。 
本发明使得能够检查良性或正常组织或体液以确定日光照射以及疾病、病症或衰老的发生和/或存在的影响。例如，本发明使得能够对良性组织或体液检查前瘤形成、瘤形成、向恶性发展以及恶性的存在。 
将通过本发明方法检测的线粒体突变与线粒体DNA的种群间及种群内变异进行比较，并可以包括与来自所述受试者无关组织的线粒体DNA进行比较，或者与来自母系亲属的线粒体DNA进行比较。没有必要分析整个线粒体基因组。例如，没有必有对整个线粒体基因组进行测序，而仅为选定的一部分。因此，线粒体DNA样品可以提供诊断。 
检测对日光照射
在本发明的一个实施方案中，提供了用于早期检测由于日光照射引起的线粒体DNA突变和重排(例如缺失)的系统。特定的变化，如普遍缺失、实施例13和14中鉴定的3895bp缺失、相关突变以及mtDNA中尚未表征的缺失的发生率作为可靠的日光照射生物标志物。 
诊断皮肤癌
在本发明的优选的实施方案中，提供了用于早期诊断非黑色素瘤皮肤癌(NMSC)及其指示实体肿瘤发生的前体损伤中mtDNA变化的系统。特定的变化，如普遍缺失、实施例13和14中鉴定的3895bp缺失、相关突变以及mtDNA中尚未表征的缺失的发生率作为可靠的日光照射及相关皮肤癌生物标志物。非黑色素瘤皮肤癌尤其与长期的终生日光照射有关。黑色素瘤皮肤癌似乎与急性晒伤事件更加相关。测定了人类NMSC及其前体损伤中全mtDNA基因组突变的指纹图谱。因此，mtDNA变化已确立为人类皮肤癌及其前体损伤的早期生物标志物。接着可使用变性HPLC估计目的序列的低水平异质性。该方法也启示了其他人类肿瘤中早期变化的发生。 
诊断前列腺癌 
在本发明的另一个实施方案中，提供了用于诊断前列腺癌的系统。年龄相关的mtDNA缺陷积累可能使个体易感于在中年及老年男性中多 发的某些临床疾病(如前列腺癌)的表现。在优选的实施方案中，通过对来自前列腺按摩液(massage fluid)的线粒体基因组测序来进行例行的前列腺癌筛查。可以通过扩增来自前列腺按摩液的mtDNA来确定转化为癌细胞的上皮细胞的存在，这优于现有的诊断技术，如直肠指检和PSA。最近，Fliss等(2000)在膀胱癌患者的尿样中鉴定出了突变的mtDNA。前列腺按摩液中类似的发现提供了用于前列腺癌的非侵入性早期检测方法。可以诊断不同类型的前列腺癌，并且相对于总体上诊断为前列腺癌而言，还可以区分患者中侵袭性、快速生长的细胞。例如，在申请人的公开内容中鉴定的3.4kb缺失可用于指示前列腺癌。 
早期检测和监测前列腺癌发展 
本发明的系统和方法可以用于在任何组织学异常发生之前的早期阶段检测癌症(尤其是前列腺癌)。例如，本发明的系统和方法可以用于检测前列腺组织中的前瘤形成。该系统可以用于检测前列腺癌的发生和发展。可以测试来自人类前列腺组织或者与前列腺有关的流体(例如前列腺按摩液或尿)的线粒体DNA中的突变(包括微小突变和高变)(Chen等.2002；Chen等2003)用于检测瘤形成的存在，并且隔一段时间再次测试从而追踪癌症转化、诊断恶性或者确认继续良性的状态。 
这些突变可以通过与提取自无关组织的线粒体进行比较来确定，所述无关组织例如但不限于：血、尿、毛发和口腔刮擦物。这种直接比较消除了与所述疾病无关的多态性、母系背景或正常的单倍型变异。所述突变也可以与种群间和种群内变异相关的线粒体序列进行比较。来自目的器官或身体系统的流体或组织的一种或多种突变指示可能有疾病发生。然后在连续的时间间隔对此人监测其它位点处突变的增加和/或突变线粒体基因组数目的增加，其指示疾病的发展。前列腺的良性组织不能总认为是无关的。事实上，在实施例9中可以看到，看来是良性的组织也可含有与前瘤形成、瘤形成、向恶性发展或恶性相关的线粒体突变。另外，突变负荷而非特定突变可作为确定疾病和疾病发展的手段。本发明的系统和方法检测异质及同质突变。 
通过对前列腺的初次直肠指检(DRE)时所取的前列腺按摩液(PMF)监测前列腺的线粒体基因组突变。浓缩PMF中的细胞，涂在载玻片上并用PSA免疫过氧化物酶进行染色，以鉴定前列腺上皮细胞。 这些前列腺细胞通过激光捕获的显微切片选择性回收。分析这些细胞的线粒体DNA，并与无关组织的线粒体DNA和/或与种群间和种群内变异的序列进行比较。例如，DNA分析可包括对mtDNA进行测序。从这些细胞提取总DNA，使用设计用于经福尔马林处理过的活检材料设计的线粒体特异性引物(表5)利用重叠的扩增子扩增完整的mtDNA基因组。然后利用本领域技术人员熟知的方法对这些PCR产物进行测序，包括DNA再测序阵列。对测序结果进行异质性和突变筛选，并与恶性及良性前列腺组织相关的已知mtDNA突变数据库进行比较。基于这些比较，得到了关于前列腺状态的指示，包括但不限于：良性(无突变)；前瘤形成或瘤形成(低水平突变)；或恶性(高水平突变)。在良性、前瘤形成和瘤形成状态中，可以通过所述的常规PMF筛选检测前列腺的发展。 
或者，已诊断为良性、非典型、异常的活检材料可以通过对活检的激光捕获显微切割进行类似的检测，或者可以从载玻片上刮掉组织，或可以使用包埋的组织切片，之后进行DNA提取、扩增、测序分析和数据库比较。 
作为测序以及与数据库比较的替代，可以通过构建寡核苷酸或寡核苷酸的特定集合，使用微阵列技术鉴定特定的突变模式或基于任意数目的突变负荷或列于表4中的突变的组合。 
可通过以连续时间间隔将mtDNA突变与前瘤形成、瘤形成和前列腺癌相关的线粒体基因组突变数据库进行比较来监测疾病进展，包括计算总的突变负荷。可通过常见的组织学/病理学或其它临床方法检测前列腺活组织，以检测临床上描述为良性、正常、非典型或异常的细胞中前瘤形成、瘤形成和/或恶性进展。 
类似地，可以对DNA分析已知与疾病(如前列腺癌)有关的特定缺失。这可以通过使用基于PCR的技术筛选这样的缺失来实现。 
评估与衰老有关的突变
本发明的系统和方法可以基于突变如4977bp的“普遍缺失”以及线粒体基因组其他突变(Liu等1997)频率的提高而用于评估衰老。该信息与健康调查数据结合使得可以在导致相同突变/缺失的独立原因之间进行关键性的统计区分。幸运的是，mtDNA仅通过卵遗传，并且 基本为无性系性质(Van De Graaff & Fox，1995)。这允许了对跨越几个世代的母系中突变/缺失进行精确控制的研究，从而确定可靠的年龄相关缺失频率。该信息可以用于开发减缓衰老过程的治疗方法。 
收集样品 
可通过任何已知的方法收集生物样品，无论是用于构建mtDNA序列数据库，或对个体进行诊断测试。用于产生数据库的样品包括但不限于：肿瘤库，涉及来自相同母系谱系的患病及未患病个体的母系谱系研究，以及来自具有高频率特定疾病(例如但不限于：皮肤癌和前列腺癌)的组或种群的母系研究，健康状况及衰老的评估。例如，FTAGeneCards
Figure 2006800219031_1
可以用于收集和存放生物样品。适当的样品包括源自间皮、上皮或内皮的任何组织或体液。这样的组织和体液包括但不限于血、痰、口腔细胞、唾液、前列腺按摩液、汗、骨、毛发、淋巴组织、子宫颈涂片、胸部抽吸物、排泄物、精液、月经、尿液和活检组织。优选地，收集约100μl血、100μg至25mg实体组织。在怀疑为皮肤癌的情况中，皮肤细胞或组织(来自正常、NMSC和前体损伤)取自皮肤活检或者例行的起泡技术。在怀疑患病时，主治医师、肿瘤学家或其它医师可以从该患者提取正常和推测患病组织。为了分析日光照射，组织可以取自真皮或表皮，或二者的组合。 
对于诸如前列腺肿瘤或皮肤肿瘤的样品来说，将显微切割石蜡包埋组织的一式二份横切片(5微米)脱蜡，然后其中一份载玻片用苏木精和伊红(HE)染色，另一份用甲基绿(MG)染色，这些均为本领域的标准技术。由病理学家对HE染色评级正常、前体以及肿瘤发展的适用级别。另一份MG载玻片用于分级细胞的激光捕获，按照生产商的推荐进行(Arcturus)。 
提取mtDNA 
可以使用本领域已知的任何方法提取DNA，随后对所有或一段区域的线粒体基因组进行扩增，并可以包括线粒体基因组测序，如CurrentProtocals in Molecular Biology所述。 
分析mtDNA 
检测mtDNA中突变的存在的步骤可以选自本领域技术人员已知的任何技术。例如，分析mtDNA可包括mtDNA测序、通过PCR扩增mtDNA、Southern、Northern、Western、South-Western印迹杂交、变性HPLC、与微阵列、生物芯片或基因芯片杂交、分子标记分析、生物传感器、解链温度谱或以上任意技术的组合。另外，可使用统计技术，如Inductive Rule Extraction和Neural Networking。 
mtDNA测序 
PCR 
本发明的多核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。PCR方法是本领域技术人员所熟知的。PCR需要存在待扩增的核酸、在待扩增序列侧翼的两种单链寡核苷酸引物、DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸、缓冲液和盐。PCR方法是本领域熟知的。如Mullis和Faloona，1987，Methods Enzymol.，155：335所述进行PCR，其作为参考并入本文中。 
一般而言，使用模板DNA(至少1fg；更有用的，1-1000ng)和至少25pmol寡核苷酸引物进行PCR。典型的反应混合物包括：2μlDNA、25pmol寡核苷酸引物、2.5μl 10×PCR缓冲液1(Perkin-Elmer，Foster City，CA)、0.4μl 1.25μM dNTP、0.15μl(或2.5单位)Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer，Foster City，CA)和去离子水至总体积25μl。覆盖矿物油并使用可编程的热循环仪进行PCR。 
PCR循环中每个步骤的长度和温度以及循环数依据实际的严格度需要进行调整。退火温度和时间通过预计引物与模板退火的效率和可接受的错配程度来确定。优化引物退火条件的严格度在本领域普通技术人员的知识范围内。使用40℃与72℃之间的退火温度。一般而言，最初的模板分子变性常常在92℃和99℃之间进行4分钟，之后进行由变性(94-99℃，每kb 15秒至1分钟)、退火(温度确定如上所述；1-2分钟)和延伸(72℃，1分钟)组成的20-40个循环。最后的延伸步骤通常在72℃进行4分钟，其后可以是4℃下时间不定(0-24小时)的步骤。 
DNA测序 
可以使用任何已知的方法对线粒体基因组进行测序。优选地，在测序前通过PCR扩增mtDNA。PCR产物可直接测序，或者将其克隆进载体中，随后将该载体置于细菌宿主中。在Brumley，R.L.Jr.和Smith，L.M.，1991中有DNA测序方法的实例。在Nucleic Acids Res.19：4121-4126和Luckey，J.A.等，1993中有通过水平超薄凝胶电泳进行快速DNA测序的实例，在Methods Enzymol.218：154-172中有通过毛细管凝胶电泳进行高速DNA测序的实例。PCR和mtDNA测序的联合使用描述于Hopgood，R.等，1992，直接由PCR产物自动化测序人mtDNA的策略描述于Biotechniques 13：82-92和Tanaka，M.等，1996，mtDNA的自动测序描述于Methods Enzymol.264：407-421。 
缺失分析和检测 
优选的方法是使用“Expand Long Template PCR系统”(Boehringer Mannheim)的长延伸PCR(LX-PCR)技术。使用LX-PCR技术(Ray等，2000)，有机会快速筛选全mtDNA缺失谱，而非单个缺失的发生率。 
可使用半定量PCR方法(Corral-Debrinski等1991)估计mtDNA4977缺失在总mtDNA中的比例。 
另外，也可以使用Southern印迹和用同位素标记的检测技术或本领域任何其它标准技术检测缺失。 
可使用定量PCR对任何特定的缺失靶标进行定量，其中使用跨越新形成序列接合处的引物。可以将缺失mtDNA分子的量与野生型mtDNA的量进行比较，从而确定缺失mtDNA分子的比例。 
测序PCR产物 
可以使用任何已知的方法对所述PCR产物进行测序。优选地，通过双脱氧测序法表征完整的DNA序列，其中使用ABI Big DyeTerminatorTM技术以及各针对重链和轻链的72种重叠引物。测序反应在一个、几个或ABI平台的组合上进行，如310、3100或3700。按照产品说明书进行测序反应。 
使用变性高效液相层析(DHPLC)进行线粒体基因组的突变分析 
在对线粒体基因组进行测序以及鉴定突变热点之前，可以使用DHPLC在许多样品中快速筛选突变。该技术在鉴定低水平的异质性中提供了较高的灵敏度。它不能检测同质变化，但可与传统的测序法互补。除了最近在肿瘤中鉴定的同质突变以外，绝大多数报道的mtDNA突变都是异质的(Chinnery等1999)。这些异质的mtDNA变化导致mtDNA的PCR扩增后形成异源双链体。使用相对较新的技术——变性高效液相层析(DHPLC)快速筛选异质mtDNA突变(Oefner & Underhill，1998)。该技术最近已用于快速筛选和鉴定全mtDNA基因组中小于5％水平的异质点突变(Van den Bosch等2000)。 
DHPLC可以在“WAVETMDNA片段分析系统”(Transgenomic，Omaha，USA)上进行，其提供全自动的筛选程序。同样的技术可用于筛选mtDNA异质突变。优选地，使用两种不同的PCR条件通过对13个重叠的片段进行PCR来扩增全mtDNA基因组，如van den Bosch等(2000)所述。将1-2kb的PCR产物消化成90-600bp的片段并在其最佳熔解温度解链。突变表现为两个峰，具有低百分比(如＜2％)异质突变作为峰中的“肩部”。 
如本领域已知的，也可使用微阵列进行DNA测序(Chee等1996)。 
数据分析 
一旦测序之后，就将正常及疾病相关mtDNA序列存档在数据库中用于比较。再测序设备、微阵列技术、集成式微流体扩增(microfluidicamplification)及分析系统、高速、高通量、突变检测以及其他方法均可用于本发明的方法。 
从对个体线粒体基因组测序获得的数据与种群水平的数据进行比较。该数据通过如上述的获得样品和mtDNA测序而获得。优选地，该数据库包含来自母系研究的信息。所述种群水平的数据保留在数据库中。可使用任何适当的数据库。 
优选地，使用临床和生物学数据的多维评价研究数据库，其提供了本发明相关实验室所收集信息的收集、处理和传播所必需的生物信息学基础。该数据库是集中式电子系统，其与网络连接从而形成动态并且强大的资源。 
可以通过任何已知的方法进入所述数据库，优选通过安全的英特网途径。优选地，所述数据库使用电子商务算法开发、建立在服务器上并使用应用服务器进行调配，所述应用服务器通过优化的性能和可扩缩性特征支持大量同时使用的用户。单独的“网页”服务器可提供网址结构的基础，因为它可作为所有的内容、应用和处理在到达用户前必经的中心点。 
使用本领域已知的数据挖掘算法发现数据的模式、聚类和模型(SAS 2000)。而且，将开发用于以下目的的智能算法：突变的发生和突变率、用于疾病检测的突变模式、信息取回以及其它复杂的序列分析软件。 
核酸成员和探针 
本发明提供了与靶核酸序列特异性结合的核酸成员和探针。该靶核酸序列是待检测的核酸或核酸区，其指示疾病如前列腺癌、非黑色素瘤皮肤癌等。使用本发明的微阵列进行分析的靶核酸序列优选来源于人组织或体液样品。本发明提供包含RNA或RNA的相应核酸(即cDNA)或DNA的靶核酸序列。核酸成员与固体支持物稳定结合从而组成本发明的阵列。该核酸成员可以是单链或双链的，并且可以是扩增自cDNA的PCR片段。 
本发明还提供了包含探针的多核苷酸序列。本文所使用的术语“探针”指与靶核酸中的序列形成双链体结构的寡核苷酸，这是由于探针中至少一个序列与靶区域中的序列互补。探针可以根据本领域已知的方法进行标记。本发明的探针可以是单链或双链的。 
诊断设备 
本发明包括用于诊断特定疾病或鉴定特定突变的诊断设备，如生物芯片、基因芯片或微阵列。对所有测序的线粒体基因组进行评估从而得到碱基对排列的共有结构，并对与特定疾病或病症相关的碱基对缺失和突变的比例赋予禁止指数(prohibiting index)。其后所述诊断性重排用于制造生物芯片、基因芯片或微阵列。 
一旦鉴定出与特定疾病、疾病状态或病症有关的序列，可使用将mtDNA与寡核苷酸阵列进行杂交从而鉴定特定的突变。可以使用任何 已知的杂交方法。优选地，使用具有与野生型或突变区匹配的寡核苷酸探针以及对照探针的阵列。市售的阵列如微阵列或基因芯片是适合的。这些阵列在载玻片或微芯片上含有数千匹配的以及对照探针对，并能够非常迅速地进行全基因组测序。描述微阵列在基因组和DNA序列分析中用途的综述文献可在www.gene-chips.com获得。 
微阵列 
多核苷酸阵列提供了能在包含一种或多种靶核酸序列的样品中测定大量多核苷酸的高通量技术。本发明的阵列可用于基因表达分析、疾病诊断和疾病预后(例如，监测患者对治疗的反应、药物筛选等)。 
任何指示疾病、衰老或其它健康相关突变的mtDNA多核苷酸序列组合均可用于构建微阵列。 
使用微阵列进行分析的靶核酸样品来自包含如上述足量mtDNA的任何人组织或体液，优选前列腺按摩液、实体瘤、良性组织、血或尿。在足以产生互补核酸成员/靶标复合体杂交模式的杂交条件下使靶核酸样品接触多核苷酸成员。 
构建微阵列 
所述微阵列包含附着在固体支持物一个表面的许多独有多核苷酸，其中每种多核苷酸附着在所述固体支持物表面上不同的预选区中。阵列上每种相关样品包含身份已知(通常序列已知)的多核苷酸组合物，这在下面有更详细的描述。任何可想到的基质都可以应用在本发明中。 
使用任何已知的方法构建所述阵列。可以使用已建立的技术生产所述核酸成员，如聚合酶链式反应(PCR)和逆转录(RT)。这些方法与本领域目前已知的方法类似(参阅如，PCR Strategies，Michael A.Innis(Editor)，等(1995)和PCR：Introduction to Biotechniques Series，C.R.Newton，A.Graham(1997))。经扩增的多核苷酸通过本领域熟知的方法纯化(例如柱纯化)。当多核苷酸已被分离从而基本上不含引物以及所需多核苷酸的合成期间产生的不完整产物时，则认为多核苷酸是纯化的。优选地，纯化的多核苷酸还将基本上不含可能阻碍或掩盖所述分子的结合活性的杂质。 
在本发明的阵列中，所述多核苷酸组合物与固体支持物的表面稳定 结合，其中该支持物可以是柔性或刚性固体支持物。 
本发明中可以使用核酸成员可附着于其上的任何固体支持物。适当的固体支持物材料的实例包括但不限于：硅酸盐如玻璃和硅胶、纤维素和硝酸纤维素纸、尼龙、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、胶乳、橡胶和碳氟树脂如TEFLONTM。 
可以使用各种形状的固体支持物材料，包括但不限于载玻片和珠。载玻片提供了一些功能上的优势，因此是优选的固体支持物形式。由于其表面扁平，因此使用玻璃载玻片将探针和杂交试剂减至最少。载玻片还使得可以靶向应用试剂、易于保持恒定的温度，易于清洗并且便于直接观察固定在固体支持物上的RNA和/或DNA。使用载玻片还便于去除固定在固体支持物上的RNA和/或DNA。 
选择作为固体支持物的具体材料对于本发明不是关键的，只要其提供所述功能。通常创造或使用该发明的人会基于成本和可用性的经济原则、最终产品的预期应用需求以及整个制造过程的需要而选择最佳的市售材料。 
使用许多方法用于将本发明的核酸附着在基质上(称作点样的过程)。例如，使用如U.S.专利No.5,807,522中的技术附着多核苷酸，其作为教授聚合附着方法的参考并入本文。或者使用接触印刷技术进行点样。 
每个组合物中存在的多核苷酸量将足以在使用该阵列的测定中提供充分的靶多核苷酸序列杂交和检测。通常，与阵列的固体支持物稳定结合的核酸成员量为至少约0.1ng，优选至少约0.5ng并且更优选至少1ng，其中所述量可以高至1000ng或更高，但是通常不超过约20ng。当将所述核酸成员“点样”在所述固体支持物上包含总体为圆形的点中时，该“点”的直径通常范围从约10至5,000μm，通常从约20至2,000μm，更通常从约50至1000μm。 
可以将对照多核苷酸点样在该阵列上，并用作靶标表达对照多核苷酸和错配对照核苷酸，从而监测与所述样品中探针靶标意外的多核苷酸进行的非特异性结合或交叉杂交。因此，错配的探针指示杂交是否特异。例如，如果存在靶标，则完全匹配的探针应该相应地比错配的探针更亮。另外，如果存在所有中心错配，则使用错配探针检测突变。 
制备靶标 
所述微阵列的靶标来源于人类体液或组织样品。可能希望在杂交之前对靶核酸样片进行扩增。本领域的技术人员会了解，无论使用何种扩增方法，如果需要定量结果的话，则必需注意使用维持或控制所述扩增多核苷酸的相对频率的方法。“定量”扩增的方法对于本领域技术人员是熟知的。例如，定量PCR包括使用相同的引物同时共同扩增已知量的对照序列。这提供了可以用于校准该PCR反应的内标。高密度阵列可以包括内标特异性探针，以定量所扩增的多核苷酸。“PCRProtocols，A Guide to Methods and Applications，Innis等，AcademicPress，Inc.N.Y.，(1990)”中提供了定量PCR的详细方案。其它适当的扩增方法包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)(Innis等，PCR Protocols.Aguide to Methods and Application.Academic Press，Inc.San Diego，(1990))、连接酶链式反应(LCR)(参见Wu和Wallace，Genomics，4：560(1989)，Landegren等，Science，241：1077(1988)和Barringer等，Gene，89：117(1990))、转录扩增(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：1173(1989))以及自主序列复制(Guatelli等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，87：1874(1990))。 
本发明提供了标记的靶标或标记的探针。任何附着中或掺入分子的可分析检测的标记均可用于本发明。可分析检测的标记指任何经分析检测和定量的分子、部分或原子。适用于本发明的检测标记包括任何可通过分光、光化学、生物化学、免疫化学、电、光学或化学方法检测的组合物。可用于本发明的标记包括用标记的链霉抗生物素蛋白缀合物染色的生物素、磁珠(例如，DynabadsTM)、荧光染料(例如，荧光素、得克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性标记(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶及其它普遍用于ELISA的酶)和比色标记如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)珠。教授该标记用途的专利包括U.S.专利No.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和3,366,241。 
检测这些标记的方法对于本领域的技术人员是熟知的。因此，例如，可以使用照相胶片或闪烁计数器检测放射性标记，可使用检测发射光的光检测器检测荧光标记。酶标记通常通过为酶提供底物并检测该酶对底物的作用所产生的反应产物来检测，而比色标记通过简单地观察有 色标记进行检测。 
可以通过本领域技术人员所熟知的许多方法掺入所述标记。然而，在优选的实施方案中，所述标记在制备样品多核苷酸的扩增步骤中同时掺入。因此，例如，带有标记引物或标记核苷酸的聚合酶链式反应(PCR)将提供标记的扩增产物。在优选的实施方案中，如上述使用标记核苷酸(如荧光素标记的UTP和/或CTP)的转录扩增将标记掺入转录的多核苷酸中。或者，可以将标记直接加入原始多核苷酸样品(例如，mRNA、polyA mRNA、cDNA等)或在扩增完成之后加入扩增产物。将标记附着在多核苷酸上的方法对于本领域的技术人员是熟知的，包括如切口平移或末端标记(例如使用标记的RNA)，通过用激酶处理多核苷酸并随后附着(连接)连接多核苷酸与标记(例如，荧光团)的多核苷酸接头。 
在优选的实施方案中，所述靶标将包括一种或多种对照分子，其与微阵列上的对照探针杂交，从而将该微阵列得到的信号归一化。标记的归一化靶标是与如上述点样在所述微阵列上的对照寡核苷酸完全互补的多核苷酸序列。杂交后得自归一化对照的信号提供了对杂交条件、标记强度、“读数”效率及其可造成完全杂交的信号在阵列间变化的其他因素的对照。 
多核苷酸杂交包括在探针或靶核酸成员能够通过互补碱基配对与其互补靶标形成稳定杂交双链体的条件下提供变性探针或靶核酸成员和靶多核苷酸。然后将不形成杂交双链体的多核苷酸洗掉，留下待检测(一般通过检测附着的检测标记)的杂交多核苷酸。通常认为，通过提升温度或降低含有该多核苷酸的缓冲液的盐浓度来变性多核苷酸。在低严格条件下(例如低温和/或高盐)，即使在退火序列不完全互补时也有杂交双链体(例如DNA:DNA、RNA:RNA、RNA:DNA、cDNA:RNA和cDNA:DNA)的形成。因此，在较低的严格度下杂交的特异性降低。相反地，在严格度较高时(例如，温度较高或盐较低)，成功的杂交需要较少的错配。优化杂交条件的方法对于本领域的技术人员是熟知的(参阅如Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Vol.24：Hybridization With Polynucleotide Probes，P.Tyssen，ed.Elsevier，N.Y.，(1993))。 
杂交后，从支持物表面除去未杂交的标记或非标记多核苷酸(方便地通过洗涤)，从而在基质表面上产生已杂交靶多核苷酸的模式。各 种洗涤液对于本领域的技术人员是熟知的，并均可使用。得到的标记杂交寡核苷酸和/或多核苷酸杂交模式可以通过许多方法进行成像或检测，基于测试多核苷酸的具体标记选择具体的检测方法，其中代表性的检测方法包括闪烁计数、放射自显影、荧光测量、热量测量、光发射测量等。 
图像采集和数据分析 
在如上述的杂交和任何洗涤步骤和/或后续处理之后，检测得到的杂交模式。在杂交模式的检测或成像中，标记的强度或信号值将不仅被检测而且还被定量，这意味着将对来自每个杂交点的信号进行测量并与已知数目末端标记多核苷酸所发射信号相应的单位值进行比较，从而获得杂交模式中与阵列上的特定点杂交的每种末端标记靶标的拷贝数的计数或绝对值。 
分析从阵列杂交收集的数据的方法在本领域是熟知的。例如，当杂交检测涉及荧光标记时，数据分析可包括如下步骤：从收集的数据确定作为基质位置的函数的荧光强度，除去异常值，即偏离预定统计分布的数据，以及从剩余的数据计算测试多核苷酸的相对结合亲和力。将得到的数据展示为图像，其中每个区域中的强度根据相关寡核苷酸和/或多核苷酸与测试多核苷酸的结合亲和力而发生变化。 
检测或成像后，所述杂交模式用于确定与该阵列接触从而得到杂交模式的标记靶多核苷酸样品的遗传谱的定量信息，以及所述标记靶多核苷酸样品所来源的生理来源的遗传谱的定量信息。遗传谱指关于样品中存在的多核苷酸类型的信息，例如与其互补基因的类型以及样品中每种特定多核苷酸的拷贝数。 
诊断或预后测试 
本发明提供了用于检测疾病的诊断测试。本发明还提供了用于监测患者对治疗的反应的预后测试。根据本发明的方法，疾病的存在或患者对治疗的反应通过获得来自该患者的体液或组织样品来进行检测。从所述体液或组织样品制备包含核酸的样品。使提取自所述样品的核酸与包含固体基质和多个核酸成员的阵列进行杂交，其中每种成员指示疾病的存在或者疾病或病症的素因。根据这种诊断测试，包含核酸的样品与所述阵列上一种或多种核酸成员杂交指示疾病、疾病或病症的素因，或 者在预后测试的情况下指示患者对治疗的反应。 
试剂盒 
提供了含有实现本发明方法的试剂和说明书的试剂盒。例如，该试剂盒可以包含用于在组织特异性样品和组织相关流体中检测线粒体缺失、突变、异质性、同质性的试剂和说明书。该试剂盒还可以包含一种或多种引物，其与线粒体基因组杂交，以产生引物延伸产物。试剂盒还可以包括固体支持物，如一次性芯片、用于支持所述固体支持物的手段、用于提取mtDNA的手段以及进入mtDNA序列数据库的方法。 
例如，检测与前列腺癌有关的mtDNA缺失的试剂盒可以包括正向和反向3.4引物、试剂和说明书。 
类似的，检测与日光照射或NMSC有关的mtDNA缺失的试剂盒可以包括L404引物、H4676引物、3895探针、试剂和说明书。 
如上文及以下实施例所述的本发明其它效用对于本领域的技术人员是显而易见的。 
本发明将在以下的实施例中得到更具体的描述，所述实施例旨在仅用于说明，因为许多改良和变化对于本领域的技术人员来说将是显而易见的。 
实施例1：前列腺肿瘤 
获得前列腺液或手术除去前列腺肿瘤后，制备活检切片以鉴定转化细胞或癌细胞。使用激光捕获显微切割(LCM)显微术从组织切片上分离正常、良性或恶性的细胞。有可能从周围的异质细胞中获得目的疾病细胞，如癌前细胞或癌细胞侵袭组。 
来自每种这些细胞的总DNA提取物根据改良的ArcturusEnginerring Inc.概述的方案进行纯化。使用50μl体积的10mM TrispH8.0、0.1mM EDTA pH8.0和0.1％Tween 20中的1mg/ml蛋白酶K(PK)于42℃过夜从细胞提取DNA。在42℃过夜孵育后，将管从孵箱中移出。将样品以6400rpm(2000×g)微量离心5分钟。从管上去除CapSureTM并丢弃。将管在95℃孵育10分钟(灭活PK)然后冷却至室温。使用5-50μl样品进行PCR扩增。 
纯化后，使用针对高变区1(HV1)、高变区2(HV2)以及整个12S区的适当引物通过LX-PCR扩增各个样品。之后使用本领域熟知的高通量方法对这些PCR产物进行测序。 
或者，可以使用表5的引物对全长线粒体基因组进行扩增。可以扩增来自任何Geason分级的恶性肿瘤细胞、来自邻近的良性腺体细胞以及来自“远处的”良性腺体细胞的特异性捕获和扩增的DNA。其它可以扩增并被扩增的前列腺组织包括：前列腺上皮内瘤(PIN)、良性前列腺增生(BPH)、多种类型的增生、间质以及具有未确定变化的细胞。这项工作在来自由于前列腺癌诊断而行前列腺切除术的31名个体的前列腺组织上实现。从每名个体获取了三种组织类型：恶性的、邻近良性的和远处良性的。使用每名患者的血作为阳性、非患病的组织对照。通过扩增和测序这些样品得到的新突变参见表4。表4的突变也在SEQ IDNo：102(列出替换)、SEQ ID No：103至109(列出缺失)以及SEQ IDNo：110至138(列出插入)中提供。通过与经修订的剑桥参考序列(Revised Cambridge Reference Sequence，2001)进行比较来确定多态性和突变位置，然而维持历史编号，从而使3106位的缺失表示为缺口，并且保留了稀有多态性750A。之后对这些数据的一个亚组(7个蛋白质编码区)进行本领域的标准主要成分分析，结果显示于下面的表1a中： 
表1a 
Figure 2006800219031A00800021
该结果给出了恶性转化的清楚模式。正常组织(血)和恶性组织表现出高聚类频率(1.00和0.967)。有趣的是，在组织学和病理学意义上均表现为正常的邻近和远处良性组织显示这样的转化水平：50％以上 样品落入远处良性和邻近良性的截距之外。另外，通过本领域的标准化神经网络对同样的数据进行分析，结果显示于下面的表1b中： 
表1b 
Figure 2006800219031A00800031
该表显示，存在肿瘤时，所有的前列腺组织在分子水平均视为恶性，即使所述组织的解剖学表现可以是“正常的” 
表1c：突变区域-ND1、ND2、COX1和CYTB 
Figure 2006800219031A00800041
[0266] 
[0267] 
Figure 2006800219031A00800061
[0268] 
聚类分析 
使用分级聚类探测(HCE)(www.cs.umd.edu/hci/multi-cluster；Seo等，2002；Seo等，2003；Zhao等2003；Seo和Shneiderman；Seo等；2004a；Seo等2004b；Seo等2005a；Seo等2004c；Seo等2005b)分析在31个诊断为前列腺癌的个体中鉴定的突变。另外，还分析了来自临床表现出前列腺癌症状但病理结果表明该前列腺组织非恶性的12名男性的前列腺探针穿刺活检的线粒体基因组。图2和图3显示鉴定出的非同义线粒体突变的聚类分析。图2是聚类分析的前一半，图3是聚类分析的后一半。y-轴列出31名患有前列腺癌的个体 
(105，208，349，377，378，380，382，384，386，416，417，418，426，449，450，451，452，455，456，457，458，460，461，463，464，466，467，498，501，504，505)以及12名表现出临床症状但通过病理学确定为非恶性的个体(2，35，51，209，270，278，375，480，503，536，560，858)的患者编号。y-轴还标出了组织来源(即远处良性(db)、邻近良性(ab)、恶性(ml)和(b)血液)。来自12名个体的有症状而非恶性组织的良性腺体组织标为“gl”。x-轴列出突变的位点。 
图4是图3的拷贝，其显示阴影区域中的一组与临床前列腺癌相关的非同义突变。所述突变出现在特定的基因中：4216和4217位的突变均出现在ND1基因(NADH脱氢酶亚基1)中。4917位的突变出现在ND2基因(NADH脱氢酶亚基2)中。7407位的突变出现在COXI基因(细胞色素c氧化酶亚基1)中。最后，15452位的突变出现在CytB基因(细胞色素b)中。4216和4217位的突变在同一个氨基酸处引起非同义突变，像4917一样，它们是与莱伯遗传性视神经病(LHON)相关的次级突变(Mitochondrial Research Society；Huoponen，2001；MitoMap)。除了前列腺癌以外，7407的相关性还未证明。在5/5个患有二氢泛醌细胞色素c还原酶(复合物III)缺陷的患者中发现15452位的突变(Valnot等1999)。 
在患有前列腺癌而进行前列腺切除术的31个男性中，记录了20个受试者中具有这些突变(一个或多个)(64.5％)。如上所述，在每一名这些个体个中，以下三种类型相关组织的前列腺横切片获取总线粒体基因组序列：恶性、邻近恶性组织的良性以及取自任何病理组织的“远处的”良性组织。由合格的临床病理学家对组织进行激光捕获显微切割(LCM)。将序列与提取自该患者的血液并测序的线粒体DNA(mtDNA)进行比较。测序结果表明，常为异质性的线粒体突变出现在所有三种组织类型中。与Alonso等(2005)的分析不同的是，通过与来自患者血液的mtDNA序列进行比较发现了来自恶性组织、邻近良性和远处良性的线粒体DNA中的突变。存在于同一个体中的异质性、突变和正常线粒体基因组被视为最近发生突变的证据(Huoponen，2001)。多少突变在来自同一个个体的三种组织类型之间并不普遍。事实上，每种组织类型中相当的突变负荷基本相同，表明mtDNA突变在存在肿瘤的前列腺中是活跃的，与前列腺组织类型无关。而且，常常发现表现为组织学良性的组织具有线粒体基因组中的突变。这些突变与嵌入核中的线粒体序列或NUMTS(核/线粒体序列)(Lopez，1994)无关。使用Rho0细胞系对人类NUMTS进行了长期的克隆和测序研究并与NCBI数据库中获得的已知NUMTS进行了比较，为对公共数据库中存档的已知线粒体假基因检测突变，以确保数据中没有假基因数据点。 
在临床表现出前列腺癌症状的12名男性中(其中病理学结果表明该前列腺组织不是恶性的)，通过LCM回收良性腺体组织，并且由前列腺探针穿刺活检组织扩增和测序线粒体基因组。结果表明，4个患者中完全没有mtDNA突变，4个患者中突变在于非编码控制区，或者4个患者中突变在控制区和基因编码区中都有。然而，该突变定位与恶性组显著不同(P＞0.01)。另外，在这些个体中只观察到一个编码区突变，并且在这些突变中有一个位于上述区域(即NDI、ND2、COXI和CytB)中(患者37515081位的CytB)。 
当使用同义和非同义突变(包括4个蛋白质编码区域)作为恶性疾病标志物时，前列腺癌组的30/31(97％)被鉴定出来。表1c列出了可见于来自31个患有前列腺癌个体的组织样品中ND1、ND2、COX1和CytB的同义和非同义突变。ND1、ND2、COX1和CytB中的突变明确地与前列腺癌有关。尽管本发明已鉴定出表1c和图2至4中列出的突变，但是本发明包括ND1、ND2、COX1和CytB中的任何突变。在 同一分析中，12个良性症状性患者中的一个被包括在恶性组中；然而，该患者具有CytB中的突变，这可能指示早期癌症发展。该组的其他人与血液或正常对照聚类。 
将来自恶性受试者的远处良性与12名有症状但非恶性患者的良性腺体相比进行了统计学分析。由于有31名恶性患者以及12名有症状但非恶性的患者，因此对来自恶性患者的12个随机样本的6个组与12名有症状但非恶性的患者一起进行分析。对6组中的每一个进行卡方分析。这些结果列于表1d中。在每种情况下，差异在0.01水平上显著，意味着来自恶性受试者远处良性组织的线粒体序列与来自有症状性但非恶性受试者的线粒体序列之间的差异99％的情况不是因为偶然性。该分析基于在上述4个编码区域发现的突变的数目。 
表1d.卡方检测 
Figure 2006800219031A00800081
有症状性患者-12名；远处良性-6个随机组，每组12名 
实施例2：日光照射的皮肤中mtDNA非编码区域中的复制 
如实施例1中所述，使用Qiagen提供的DNeasyTM试剂盒从组织样品中提取DNA。使用“背对背”引物方法研究与日光照射有关的非编码区域(NCR)中串联复制的发生率。检测了32个年龄匹配的分散人类皮肤样品，分别来自日光照射(n＝24)和防日光(n＝10)的身体部位。 
使用以下的来自Brockington等1993和Lee等1994的复制引物： 
Figure 2006800219031A00800091
引物对C/D和E/F在非编码区域中的两组独立的直接重复位点处是“背对背”的。因此，它们只在这些位点处存在复制时生成产物。生成的产物为260bp和/或不常见的200bp变体。改良的PCR条件是：100ng总细胞DNA、200μM dNTP、2.5U HotStarTaq聚合酶以及PCR缓冲液(Qiagen，Uk)，25皮摩尔引物：94℃4分钟的1循环，94℃×1分钟、55℃×1分钟、72℃×1分钟的36个循环以及72℃×7分钟的一个循环。 
观察到复制发生率随随日光照射增加而提高，在日光照射和防日光的皮肤中分别在10/24以及0/10的样品中鉴定了复制(Fisher精确检验，p＝0.015)(Birch-Machin和Krishnan 2001)。频率最高的复制的大小为200和260碱基对。有趣的是，如实施例6中所述已建立的定量3-引物PCR分析检测所示，这些相同的样品还含有高水平(＞1％)的4977bp普遍mtDNA缺失。 
实施例3：人NMSC及其前体损伤中的mtDNA的突变指纹图谱 
如实施例1中所述，使用Qiagen提供的DNeasyTM从人皮肤组织样品中提取DNA。使用特定的引物通过PCR扩增mtDNA，并且在制备DNA样品(Qiagen)后，使用BigDyeTM末端循环测序法通过自动测序(PE Applied Biosystems)鉴定突变。该方法描述于Healy等2000；Harding等2000。使用已建立的PCR引物对对16，569bp的人类线粒体全基因组进行测序，已知其不扩增假基因或者其它核基因座。通过与修订的“剑桥”人类mtDNA参照(Andrews等1999)进行比较来证实任何推定的DNA变化。从肿瘤mtDNA获得的序列首先与已知的多态性(Andrews等1999；MITOMAP)进行比较，然后再与来自正常的病灶周围皮肤的mtDNA序列进行比较，以鉴定真正的体细胞突变。 
在“WAVETM DNA片段分析系统”(Transgenomic，Omaha，USA)上进行DHPLC，该系统提供了全自动的筛选程序。使用相同的技术筛 选皮肤肿瘤mtDNA中的异质突变。 
使用实施例2中所述的背对背引物法，快速地筛选非编码区(NCR)高变区段中DNA长度突变(即串联复制)的模式。 
实施例4：人NMSC及其前体损伤中整个线粒体基因组的缺失谱 
将鳞状细胞癌(SCC)、基底细胞癌(BCC)和推定的前体损伤(如鲍恩病和光化性角化病)中的mtDNA损伤与取自接受不同日光照射的身体部位的邻近病灶周围皮肤进行比较。使用长延伸PCR技术(LX-PCR)(Ray等1998)来扩增整个线粒体基因组，从而确定mtDNA的完整缺失谱。已观察到许多特异性缺失发生在线粒体基因组中。并非所有的缺失都与非黑色素皮肤癌有关；然而，对于诊断的诊断方法来说，必需指导与该疾病有关的缺失。 
根据生产商的推荐使用市售的试剂盒(Qiagen)提取DNA。使用Expand TM LongTemplate PCR SystemTM(Boehringer Manheim，Switzerland)在两个单独的反应中扩增全线粒体基因组。使用的PCR引物描述于Kleinle等(1997)，其覆盖了所述剑桥序列(Andrews等1999)的以下区域：DIA(核苷酸(nt)336-363)、DIB(nt 282-255)、OLA(nt 5756-5781)以及OLB(nt 5745-5781)。这些大产物消除了核假基因的扩增。所述引物的序列如下： 
DIAF：(336-363)5′AACACATCTCTGCCAAACCCCAAAAACA 3′SEQ ID NO：5 
OLBR：(5745-5721)5′CCGGCGGCGGGAGAAGTAGATTGAA 3′SEQ ID NO：6 
OLAF：(5756-5781)5′GGGAGAAGCCCCGGCAGGTTTGAAGC 3′SEQ ID NO：7 
DIBR：(282-255)5′ATGATGTCTGTGTGGAAAGTGGCTGTGC 3′SEQ ID NO：8 
在50微升反应物中进行扩增，其含有16pmol的每种引物、500μmol dNTP、含有22.5mM MgCl2和洗涤剂的10×PCR缓冲液(试剂盒)、0.75μl酶(3.5×103单位/ml)以及50-200ng的总DNA。一个反应生成基因组的11,095bp区段，而另一个得到5,409bp长度(例如Kleinle等，1997)。PCR扩增条件包括：93℃1分30秒的变性阶段，其后为93℃30秒、60℃30秒和68℃12分钟的10个循环，之后是另外20个模式相同的循环，其中每个循环的延伸时间增加5秒。最后一个循环为93℃30秒、60℃30秒以及延伸时间68℃26分钟。为了确保再现性，在1％琼脂糖凝胶上分离已知量的DNA，并且只有至少具有相 同量DNA的样品才包括在该分析中。 
随UV照射的增加，发现肿瘤样品中平均缺失数目更大，示于表2。 
Figure 2006800219031A00800111
表2.取自接受不同UV照射身体部位的正常及肿瘤皮肤之间在mtDNALX-PCR中观察的平均缺失数的比较。 
实施例5：衰老和mtDNA 
使用时间性母系比较(即从曾祖至曾孙)，快速且准确地对从给定组织提取的mtDNA全序列进行测序，从而确定地表述该特定分子的核苷酸碱基对排列以及可能随时间发生的变化。将这些特征与健康状态、衰老指示进行比较，并在较大的种群内在特定的母系之间进行比较。这种综合信息使得可以关键性地统计学区分引起相同突变/缺失的不同原因，并确立了用作生物标志物的mtDNA序列具有所需的特异性和灵敏度指标，从而确立其可用性。另外，在多种组织中对碱基对缺失和突变的比例进行跨越4个母系世代的一致性比较。最近方法学的发展已允许检测血样中与衰老相关的碱基对缺失(Bassam等1991)，并且提高了使用血样代替骨骼肌用于研究mtDNA的可能性(von Wurmb等1998)。在建立了应用白细胞替代骨骼肌来代表mtDNA缺失和/或突变的效力之后，下一步仅测量白细胞中的mtDNA。然后如上述测定mtDNA缺失/突变。 
骨骼肌或白细胞可得自患者。如实施例1公开的那样提取DNA。 
使用以下的引物： 
12ST1：(1257-1279)5′TATACCGCCATCTTCAGCAAAC 3′SEQ ID NO：9 
12ST2：(1433-1411)5′TACTGCTAAATCCACCTTCGAC 3′SEQ ID NO：10 
D1F：5′CCTTACACTATTCCTCATCACC 3′SEQ ID NO：11 
D1R：5′TGTGGTCTTTGGAGTAGAAACC 3′SEQ ID NO：12 
在50微升反应物中进行扩增，其含有2.0μmol的每种引物、250μmol dNTP、10×PCR缓冲液(Thermopol Reaction Buffer)、牛血清白蛋白、0.5单位Deep yent聚合酶以及50-200ng的总DNA。PCR扩增条件包括95℃5分钟的变性阶段(热启动)、其后为94℃30s、60℃60s和72℃30s的30个循环，最后在72℃延伸10分钟。在2％的琼脂糖凝胶上以125伏进行凝胶电泳60分钟，用溴化乙锭染色，并在UV光下成像。为了确保再现性，在2％琼脂糖凝胶上分离已知量的DNA，并且只将具有相同量DNA的样品包括在该分析中。 
实施例6：通过3-引物PCR定量检测4977bp普遍mtDNA缺失 
适当时，通过检测高于1-5％的水平的3-引物PCR法或检测1％以下低至10-4％的水平的稀释PCR法以定量方式测定普遍缺失的发生率。(参见实施例7)如实施例1中所述获得样品并提取DNA。为了同时检测和定量DNA样品中缺失及野生型(wt)mtDNA的比例，使用3-引物PCR法(描述于Birch-Machin等1998)。引物A和C分别对应于重链位置13720-13705和9028-9008(Anderson等，1981)；引物B对应于轻链位置8273-8289。引物C位于普遍缺失中的mtDNA区，而引物A和B在该缺失区域的侧翼。因此，引物B和C只扩增wt-mtDNA而引物A和B只扩增缺失的mtDNA(不存在缺失时两引物之间的距离约为5.5kb，太长以至于在如下所述我们的PCR条件下不能扩增)。 
使用三个引物使得同时检测两条带，较大的一条(755bp)对应于wt-mtDNA，而较小的一条(470bp)对应于带有“普遍缺失”缺失mtDNA。PCR反应混合物(25μl总体积)含有100ng总细胞DNA、200μMdNTP、10mM Tris-HCl(pH 8.8)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.1％Triton X-100、2.5U Taq DNA聚合酶(BioTaq，BiolineUK Limited，London)、25pmole的引物A和B、6.25pmole的引物C以及3μCi的[α-32P]-dATP。PCR的条件为94℃1分钟、55℃1分钟、72℃2分钟的25个循环，并包括最后在72℃延伸15分钟。之后这些PCR产物通过6％非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，并且使用ImageQuantTM (Molecular Dynamics，Chesham UK)软件通过感光成像分析定量放射性PCR片段。 
实施例7：利用连续稀释PCR法定量检测低水平(＜1％)的普遍mtDNA缺失 
使用半定量PCR法(Corral-Debrinski等1991)估计提取自组织/细胞样品的总mtDNA中普遍缺失的比例。生物样品的获得以及DNA的提取如实施例1中所述。所述DNA样品首先使用限制性酶Bam HI(1μl酶和1μl以商品提供的缓冲液)于37℃线性化90分钟。连续稀释在两倍步骤中进行(对于总mtDNA，最初为10倍稀释)，并且使用以下引物对每个稀释液(1μl)进行PCR： 
用于总mtDNA的引物 
L3108(nt3108-3127) 
H3717(nt3717-3701) 
用于常见缺失的引物 
L8282(nt8282-8305) 
H13851(nt13851-13832) 
反应条件如下： 
94℃2分钟的1个循环，94℃45秒、51℃30秒(总mtDNA)、56℃30秒(常见缺失)、72℃1分钟的34个循环，以及72℃8分钟的最后一个循环。所有的PCR反应在以下的混合物(50μl)中进行：样品DNA 1μl、0.6μM正向引物、0.6μM反向引物、0.2mM dNTP、5μlGeneAmp
Figure 2006800219031_2
10×PCR缓冲液(Perkin Elmer)、0.2μl Amplitaq
Figure 2006800219031_3
DNA聚合酶(Perkin Elmer)、35.75μl高压灭菌的双蒸水。 
电泳后，PCR产物在UV透照仪(TMW-20，Flowgen Ltd.，Lichfield，UK)下成像，并使用图像采集设备(Alpha Imager 2000，AlphaInnotech Corporation，由Flowgen Ltd.，Lichfield，UK提供)获得凝胶的数字图象。相关的图象分析软件(Alpha Ease v3.3，Alpha InnotechCorp.)使得可以计算稀释系列中每个PCR产物的累积光密度(IOD)。对总mtDNA和缺失mtDNA获得IOD值为0的条带，将相应的稀释值用于计算样品中普遍缺失的百分比，因此： 
Figure S2006800219031D00511
实施例8：变性高效液相层析(DHPLC) 
如实施例1获得样品并提取DNA。使用描述于van den Bosch等(2000)的两种不同PCR条件在13个重叠的片段中进行PCR。以下是用于PCR的三组mtDNA特异引物对： 
Figure 2006800219031A00800141
将1-2kb的PCR产物消化为90-600bp的片段，并在其最佳解链温度解离。突变表现为两个峰，百分比低(如＜2％异质性)的突变作为峰的“肩部”。 
以由两种洗脱液(pH 7.0)组成的流动相进行DHPLC。缓冲液A包含乙酸三乙基胺(TEAA)，其与DNA上带负电荷的磷酸基团以及柱表面均发生相互作用。缓冲液B含有TEAA和25％的变性剂乙腈。用线性的乙腈梯度以恒定的流速洗脱片段。提高乙腈浓度将使片段变性。下文表3是按照生产商的说明书使用WAVEMAKER软件(Transgenomics)生成的PCR反应物DHPLC标准方法的实例。 
表3：DHPLC的标准方法 
Figure 2006800219031A00800142
[0353] 成功解离多种异源双链体的温度详述如下，并且可以简单地替换到表2的相应位置中： 
Figure 2006800219031A00800151
实施例9 
对于来自49名前列腺探针穿刺活检患者(46名诊断为恶性)的mtDNA D-环序列的广泛调查证实，与患者血液中的线粒体DNA比较，在包括良性前列腺增生(BPH)、可获得的Gleason分级和基质的所有前列腺组织中均有mtDNA突变。并且，对来自31个前列腺切除术患者线粒体基因组的扩展研究证实，在匹配的恶性腺体、邻近的良性腺体(恶性腺体附近)和远处的良性腺体(位于取自任何恶性病理的无恶性病理的组织中)中有模棱两可的高突变(Chen等2002；Chen等2003)负荷，如表4中所示。表4的突变还在SEQ ID No：102(列出替换)、SEQ ID NO：103至109(列出缺失)和SEQ ID No：110至138(列出插入)中提供。通过与修订的剑桥参照序列(2001)进行比较来确定多态性和突变位置，然而维持历史编号，从而3106位的缺失表示为缺口，并且保留了稀有多态性750A。碱基的编号是基于总共具有16569个碱基位置的修订的剑桥参照序列。显示线粒体基因组每个位置的突变数目的直方图显示于图1。如图1所示，突变可见于整个mtDNA基因组以及所有的患病前列腺。然而，某些“热点”还是明显的，例如D-环区和16s区。这些数据组提示，合格的病理学家使用常规组织学方法和分级标准进行的恶性或良性组织划分没有鉴定早期疾病发展。这强烈地提示，恶性转化在细胞的形态特征改变前开始于细胞水平。重要地，该突变谱对于来自个体患者或者与另一患者相比的匹配前列腺组织完全不一致，可能指示了可能发生恶性细胞克隆扩充的可能的组织部位。并且，来自同一个个体的Gleason评分相同的不同探针穿刺活检几乎总是表现出不同的mtDNA突变模式。这表明更能代表疾病和疾病发展的可能是总的突变负荷，而不是特定的突变位点。 
因为该数据收集自已知患有前列腺癌的个体并且在前列腺切除组中为已知高级阶段的个体，所以很可能组织学良性的组织已经历了一些 与瘤形成以及可能情况下向恶性发展有关的细胞内转化。具有mtDNA突变的良性组织作为“生物传感器”，可以监测其指示疾病发展速度的突变增加。该速度还可以指示肿瘤攻击性。另外，还可以基于这样的突变模式变化监测特定治疗的有效性。 
该技术可用于良性探针穿刺活检的确认测试。目前，当患者进行前列腺穿刺活检并且该组织看来为组织学良性时，他便可回家，并通常计划在6个月内再次进行探针穿刺活检。使用上述的方法可检查已取出的穿刺活检组织，并证实该组织在分子水平上也是良性的，或者发现在该前列腺中事实上存在被穿刺活检技术由于穿刺部位而遗漏的恶性证据，或者该组织在分子水平为前瘤形成或瘤形成。这有可能使人们避免承受多次手术，或者允许进行早期预防性治疗。 
表4 
碱基突变：观察到的同质向同质、同质向异质、异质向同质的突变*第一个核苷酸代表正常的核苷酸，其后为突变核苷酸；以“-”分开。*血不存在时，表示为“X”。 
**历史编号，其中BP3106处的缺失表示为缺口，并且保留了稀有多态性750A。 
Figure 2006800219031A00800171
Figure 2006800219031A00800172
Figure 2006800219031A00800181
 
Figure 2006800219031A00800191
 
Figure 2006800219031A00800201
Figure 2006800219031A00800202
 
Figure 2006800219031A00800212
 
Figure 2006800219031A00800222
 
Figure 2006800219031A00800231
 
Figure 2006800219031A00800241
Figure 2006800219031A00800242
 表5 
Figure 2006800219031A00800251
 
Figure 2006800219031A00800261
实施例10：前列腺组织mtDNA中的3.4kb缺失 
通过新鲜冷冻前列腺组织的完整线粒体基因组扩增鉴定约3.4千碱基(kb)的缺失。使用线性回归估计该缺失的大小在3000碱基对(bp)至3500bp之间。使用Mitomap(Brandon，M.C，Lott，M.T.，Nguyen，K.C.，Spolim，S.，Navathe，S.B.，Baldi，P.& Wallace，D.C.MITOMAP：ahuman mitochondrial genome database--2004 update.Nucleic Acids Research 33(Database Issue)：D611-613，2005；www.mitomap.org)鉴定两种可能的候选缺失，9574-12972位的3397bp缺失以及10744-14124位的3379bp缺失。为了确定两种缺失中哪个是正确的(如果有的话)，针对两种候选缺失中的每一种设计跨越缺失接合处的正向引物，并确保该引物延伸通过缺失侧翼的重复区。图5是显示引物设计和序列的示意图。对10744-14124位3379bp缺失(称为3.4kb缺失)的相应扩增子获得了阳性扩增结果。 
该缺失除去了下列基因中的全部或一部分：(i)NADH脱氢酶亚基4L，(ii)NADH脱氢酶亚基4，(iii)NADH脱氢酶亚基5，(iv)tRNA组氨酸，(v)tRNA丝氨酸2以及(vi)tRNA亮氨酸2。 
在33个新鲜冷冻前列腺样品的91％中检测到所述3.4kb缺失的存在。使用特定的缺失引物测试福尔马林固定的组织，以提高n值。 
先前，本发明的研究人员对来自通过LCM显微切除的32个组织样品以及来自组织学正常前列腺的12个探针穿刺活检的完整线粒体基因组进行了测序。将来自每一个这些样品的已存档组织切片用于以下研究。从每个样品取出1-2个连续切片。从每个样品的整体而非显微切片中提取DNA。因此，每个样品由腺体前列腺组织以及基质前列腺组织的混合物组成。使用Qiagen’s QIAamp DNA迷你试剂盒(目录号51304)进行该提取。提取后，使用Nano-Drop分光光度计对样品进行定量，并且随后将浓度归一化成2ng/ul。使用20ng输入DNA以及iQTMSYBR Green Supermix试剂盒(Bio-Rad Laboratories Inc.)扩增每个样品。反应在Opticon2(MJ Research)上进行。 
如图6所示，在恶性前列腺样品和症状性良性前列腺样品之间的循环阈值以及通过延伸测定的缺失量之间观察到明显的差异。恶性样品一致表现出比早于良性样品的循环阈值。 
实施例11：对3.4kb缺失的盲研究——循环阈值的比较 
在实施例10中所述研究之后，选择另外的21个样品，其中10个为良性，11个为恶性。由合格的病理学家进行探针穿刺活检来确定病理状态。该样品是盲的，从而本发明的研究者在进行检测时并不知道它其病理状态。通过检查循环阈值，本发明的研究者能够在81％的病例中正确地预测出病理状态。对于4个错误预测，其中2个是将恶性样品确 定为良性，2个是将良性样品确定为恶性。医生要求获得后一种情况中的2名个体的随访临床信息，从而确定它们是否在本研究使用的探针穿刺活检结果之后被诊断为前列腺癌。其中最初得到良性样品但被该研究预测为恶性的一名个体随后得到了恶性样品。结果，一个假阳性成为了真阳性。因此，在本研究中所检测病例的86％中病理状态预测是正确的。本发明最终的阳性预测值(PPV，其中PPV＝真阳性/(真阳性+假阳性))为91％，而阴性预测值(NPV，其中NPV＝真阴性/(真阴性+假阴性))为80％。 
实施例12：3.4kb缺失研究——方法(n＝76) 
存档样品
在本研究中对76个前列腺组织检测3.4kb缺失。所有的组织样品均用福尔马林固定，其中25个为恶性，12个为正常，39个组织学显示具有良性前列腺疾病。在后面一组中，一半以上具有增生。所有的标本均为取自研究者组织存档的探针穿刺活检。 
前列腺样品
使用来自Arcturus Bioscience Inc.的Prep-Strips(CatalogueNumber LCM0207)在每个载玻片上进行tapelift。这使得可以在DNA提取前将任何特定物质或非粘附组织从载玻片上去除。组织仍然在载玻片上，用PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗涤载玻片以尽可能地去除固定剂。使用单个包装的无菌外科刀片将载玻片上的1-2个探针穿刺活检切片刮到无菌微量离心管中。接着根据生产商的说明书使用QIAamp
Figure 2006800219031_5
DNA迷你试剂盒(Qiagen，目录号51304)将DNA分离并纯化。与载玻片提取物平行处理阴性提取对照，作为质量对照检验点。通过分光光度计(Nano-Drop ND-1000)测定每个样品的总DNA浓度和纯化比，并且制备2ng/μl的稀释液用于定量聚合酶链式反应(qPCR)。 
引物(寡核苷酸)
由Invitrogen(California，USA)化学合成纯化的寡核苷酸引物。引物序列以及扩增的PCR产物的预期大小列于表6中。另外，对mtDNA缺失的PCR分析包括阳性对照(已知带有突变mtDNA的来源的DNA)。除了TNF以外的每个引物组合都用无线粒体的rho0细胞系来检验，以 证实不存在假基因的共扩增。 
表6扩增引物 
对于TNF的引物，引物参考EppendorfHotMasterTM
应用No.1 
HotMaster——一种得到更好的PCR*结果的创新热启动/冷终止技术 
George Halley和Vincent Prezioso，PhD 
George Halley，Eppendorf-5 Prime，Inc.，Boulder，CO，USA 
Vincent Prezioso，Brinkmann Instruments，BioSytems Application Lab，Westbury，NY 
http://www.brinkmanncanada.com/applications/PCR_appl_hotmaster.asp 
实时聚合酶链式反应 
对每个样品进行三次独立的PCR。每个反应的总体积为25μl，包括模板DNA、一对引物(12s或3.4缺失或TNF)、iQTMSYBR GreenSupermix试剂盒(目录号170-8882，Bio-Rad Laboratories Inc.)和蒸馏去离子水(ddH2O)。所述TNF(肿瘤坏死因子)包含单拷贝核基因引物，12s包含总线粒体基因组引物。模板DNA、引物和反应缓冲液的体积和浓度列于下表。 
表7qPCR组分 
Figure 2006800219031A00800281
每个扩增子的循环参数列于表8中。 
表8循环参数 
Figure 2006800219031A00800282
分析
使用配备Intuitive Opticon MonitorTM软件(MJ Research Inc.)的DNA Engine Opticon
Figure 2006800219031_7
2连续荧光检测系统进行热循环、实时检测以及反应分析。使用标准曲线法进行DNA定量。我们对三种经纯化的PCR产生的模板使用了连续稀释(106、105、104、103、102、101)，一种产物对应于3.4缺失，一种对应于12s的引物，以及一种对应于TNF。由此产生了三条不同的标准曲线就，其显示总mtDNA(12s扩增子-完整线粒体基因组 引物)、3.4缺失或者全核DNA(TNF-单拷贝核基因引物)的拷贝数。通过比较样品的CT值与标准品的CT值，所述样品的CT值然后可以转换成DNA拷贝数。如果在37个循环内没有检测到3.4缺失，则认为该缺失不存在或者以低水平存在。 
基于所述归一化样品中存在的3.4kb缺失的量确定恶性，如所述循环域值的位置所指示。该位置可以是绝对位置(如大于25个循环但是少于35个循环)，或者更可能为12s扩增子所指示的总线粒体DNA存在与3.4kb缺失之间的比例。这可以表达为总线粒体DNA的百分数。可以并入TNF扩增子代表的细胞数，以细化良性与恶性组织之间的区分。 
为了自动化分析这些样品，使用了生物信息学的工具。这些分析涉及的所述的三个变量分别是肿瘤坏死因子(TNF)的循环阈值CT、含有特定引物位点的线粒体总种类以及具有目的缺失的线粒体。 
聚类分析
由于数据的相似性和小范围，不对聚类进行归一化，并且不使用对数函数。 
图7显示数据真实的移动以及趋势。X轴是患者数，Y轴是实时PCR得到的循环阈值。 
应当着重指出的是，循环阈值越高，则代表存在变量的量越低。 
显示于图7中最初的大体趋势是基于缺失、总数以及TNF变量的差异/比值。该缺失在良性/正常样品(右侧)为低至不存在，而在异常以及恶性样品中则提高(向左侧)。异常良性和恶性样品基于缺失与TNF之间的循环阈值比彼此区分。 
指导式学习(Supervised Learning) 
指导式学习基于试图预测已知样品结果的系统。使用半数数据训练，而另一半用来测试算法。指导式学习将其预测数据与靶标结果进行比较，并且从错误中“学习”。但是，如果该预测结果高于或者低于数据的真实结果，该错误会通过系统传回并相应地调整权重。 
数据集：5％到35％-良性 
35％到65％-增生 
65％到95％-恶性 
ANN算法(示意如下) 
数据集的一半用于训练ANN 
另一半数据用于比较精确度。精确度＝对预测的数据集与获得的数据集进行比较→86.6％ 
人工神经网络算法 
Figure S2006800219031D00691
使用人工神经网络算法(ANN)对缺失数据进行指导式学习。 
三个类别： 
良性 
增生 
恶性。 
基于实时PCR循环阈值CT对每种类别使用三个变量： 
肿瘤坏死因子(TNF)-核拷贝对照。 
总线粒体-线粒体拷贝对照 
缺失-缺失状态的线粒体。 
结果： 
数据集的一半用于训练ANN，其余一半用于比较精确度。 
三种分类的精确度＝86.6％ 
阳性预测值(PPV)； 
良性至恶性＝88.2％ 
阴性预测值(NPV) 
良性至恶性＝76.5％ 
实施例13：3895bp线粒体DNA作为人类皮肤日光照射标志物的用途 
因为最初发现3895bp缺失可能与日光照射有关，如Harbottle等，2004和Durham等，2003所报道的，进一步的工作已证实存在这种联系。而且，另外的工作已使得可以将该缺失用于日光照射的诊断检测或皮肤癌的检测，其通过发明以完全定量的方式检测缺失和序列重排的新方法来实现。所述方法使引物或探针与由于重排相关的缺失或插入而新形成的序列退火，从而允许使用实时定量PCR(qPCR)作为检测手段。qPCR平台的使用使得可以定量检测所述缺失，而不是简单的存在与否。这种定量是该测试的基础，因为衡量日光照射的水平或者恶性特征的是缺失的相对量，而不是先前报道的简单的存在与否的半定量。并且qPCR平台使得可以使用明显未患病或未经照射的组织，因为其检测灵敏度显著高于常规的PCR和溴化乙锭检测的灵敏度。 
背景 
非黑色素瘤皮肤癌(NMSC)的发生率在欧洲起源的种群中正在提高(Severi和English，2004)。例如在美国每年诊断出100万新的病例(Wesson和Silverberg，2003)，在英国则为65,000(由Cancer Research.UK提供数据)。NMSC占皮肤癌的约90％，并由基底细胞癌和鳞状细胞癌(分别为BCC和SCC)组成。BCC是NMSC的最常见形式，主要由表皮的基底角化细胞产生，但也由毛囊和皮脂腺的细胞产生。他们具有局部侵袭性，但几乎不转移。SCC也来自基底角化细胞，然而与BCC相反，SCC可转移。与BCC相比，SCC表现出随年龄的显著增加，并且集中在老年人中(Severi和English，2004)。NMSC的相对密度在Armstrong(2004)所定义的在户外“经常”接触日光的身体部位上最高，如头皮、脸、颈和耳。然而，SCC与BCC稍有不同的是它在Armstrong(2004)所定义的“偶尔”接受日光照射的身体部位上(肩、背和胸)密度低得多。 
因此，NMSC的主要决定因素是日光中诱导DNA损伤的紫外线辐射(UVR)成分。重要的是，影响NMSC发生的是日光照射的模式(持续性与间歇性)和累积量。(Armstrong和Kricker，2001)。为了确定人类皮肤中累积性UVR照射的可靠标记，本发明人和其他人已经考虑了使用线粒体DNA(mtDNA)而非核DNA作为UV诱导DNA损伤的生物标志物的新想法(Pang等，1994；Berneburg等，1997；Birch-Machin等，1998；Birch-Machin等，2000)。与细胞核DNA(如p53)的突变筛选相比，研究日光照射的皮肤中mtDNA的损伤具有某些优势。首先，虽然有证据表明在线粒体中存在氧化损伤的碱基切除修复，但是没有DNA光产物(例如环丁基嘧啶二聚体)修复的核切除修复证据(LeDoux等，1993；Croteau和Bohr，1997；Pascucci等，1997；Sawyer和Van Houten，1999)。其次，每个细胞可包含高至几千拷贝的mtDNA基因组，因此线粒体可通过其余野生型的互补来耐受非常高水平(高至90％)的mtDNA损伤(Chomyn等，1992；Sciacco等，1994)。总之，这些因素导致mtDNA中光损伤的累积，而不使细胞功能受损。 
mtDNA损伤作为人类皮肤中累积性日光照射的生物标志物的用途是相对较新的领域，先前的工作仅简单地比较mtDNA损伤用于区分防日光的和日光照射的皮肤(Pang等，1994；Berneburg等，1997；Birch-Machin等，1998)。该方法具有局限性，因为NMSC主要在在户外“经常”接受日光照射的身体部位上形成，而不是“偶尔”接受日光照射的身体部位(Armstrong，2004)。为了说明这种局限性，本实施例证实了，罕有报道的3895bp mtDNA缺失(先前仅描述于患病肌肉中(Moraes等，1992))的发生频率在“经常”和“偶尔”接受日光照射的身体部位之间存在显著差异。另外，本实施例通过重复性亚致死剂量的UVA+UVB光源在体外引入3895bp缺失证实了3895bp缺失的病因与日光中UVR成分之间的联系。 
方法和材料 
日光中的紫外线辐射(UVR)被广泛地认做白人个体中非黑色素瘤皮肤癌(NMSC)的主要决定因素。本发明人和其他人先前的工作已研究出使用线粒体DNA(mtDNA)损伤作为人类皮肤癌中累积性日光照射的生物标志物。这些研究已比较了防日光的和日光照射的皮肤之间的mtDNA损伤，该方法具有局限性，因为NMSC主要在在户外“经 常”接受日光照射的身体部位上形成，而非“偶尔”接受日光照射的身体部位，这样它们在其累积性UV照射中也不同。为了说明这种局限性，本实施例研究了104例年龄匹配的人中取自经常、偶尔和几乎不接受日光照射的身体部位的皮肤样品中罕有报道的3895bp mtDNA缺失的发生频率。随着UV照射的增加(p＜0.0001)，所述缺失频率显著提高，有意义的是，与“偶尔”接受照射相比，“经常”接受日光照射的身体部位中缺失频率在真皮(p＝0.0018)和表皮(p＜0.0001)中都显著提高。对与先前4977 bp缺失普遍缺失研究中使用的相同NMSC样品进行3895 bp缺失研究显示了3895缺失发生频率可比较的提高(分别为8/10对4/10)，尽管这种差异并不是统计学显著的。另外，本实施例通过重复性亚致死剂量的UVA+UVB光源在体外引入3895bp缺失而进一步证实了3895bp缺失的病因与日光中UVR成分之间的联系。人类皮肤中3895bp缺失的频率为累积性UV照射提供了潜在生物标志物，并为NMSC的发生提供了早期检测工具，还提供了监测临床UV光疗方案长期安全性的方法。 
患者样品 
在获得知情同意的情况下，从在Royal Victoria Infirmary，Newcastle，UK接受皮肤癌切除治疗的42例NMSC患者中取出来自在户外“经常”接受日光照射的身体部位(如头皮、脸、颈或耳(表皮n＝21，真皮n＝21，平均年龄±SEM＝69.4±2.6))以及“偶尔”接受日光照射的身体部位(如肩部、背部和胸部(表皮n＝21，真皮n＝21，平均年龄±SEM＝63.1±3.6))的临床上正常的病灶周围皮肤。在经常和偶尔接受日光照射的组之间没有明显的年龄差异(p＝0.158：双侧t检验(Welch校正))。另外，在42个患者中，女性：男性的百分比(即分别为52％：48％)以及BCC和SCC的百分比几乎是相同的，57％的患者患有BCC。来自几乎不接受日光照射的身体部位(如臀部和足跟)的正常皮肤样品取自先前获得的尸检样品(表皮n＝10，真皮n＝10，平均年龄＝73岁)。使用0.25％分散酶于4℃过夜分离表皮和真皮(Durham等，2003)，并使用Qiagen，DNeasy组织提取试剂盒提取DNA。表皮瘤(BCC(n＝5)、SCC(n＝5))得自接受癌症切除的患者。用于该研究的患者均没有mtDNA缺陷。 
HaCaT细胞的UV照射 
在Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基中培养自发永生性角化细胞系(HaCaT)(Boukamp等，1988)，该培养基含有10％胎牛血清、5IU/mL的青霉素和5g/mL的链霉素。该细胞在9cm直径用组织培养物处理的i培养皿中培养至70％-90％会合，在PBS中洗涤，然后每隔一天使用helarium 40W灯以亚致死剂量(0.5J/cm2，相当于1SED)的UVR进行照射(Wolff B1.01，290-400nm，峰值发射在325nm)。在合适的时间点，使用Qiagen，DNeasy组织提取试剂盒从贴壁细胞中提取总细胞DNA。 
PCR分析 
PCR在25μl反应物中进行，其含有200ng基因组DNA、600nM的每种引物、250μM dNTP、每个反应0.6U的Amplitaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems)、GeneAmp缓冲液(含有100mM Tris-HCl，pH8.3、500mM KCl、15mM MgCl以及0.01％(重量/体积)凝胶)。使用的PCR引物为L404(5’CTT TTG GCG GTA TGC ACT TT 3’)(404-423nt)(SEQ ID NO：145)和H4676(5’GAT TAT GGA TGC GGT TGC TT 3’)(4676-4657nt)(SEQ ID NO：146)。引物L404和H4676设计为在3895bp缺失之外退火。在DNA扩增期间，短的(30s)聚合酶延伸时间不允许野生型PCR产物扩增，仅允许扩增代表缺失mtDNA的375bp较小产物。PCR的条件为94℃10分钟，94℃30s、56℃30s、72℃30s的35个循环，以及72℃7分钟的终末延伸。扩增产物在溴化乙锭染色(每ml 0.25μg)的1％琼脂糖凝胶中显影。 
DNA序列分析 
从胶上切下375bp PCR产物，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Germany)纯化，并使用TOPO
Figure 2006800219031_8
TA克隆试剂盒(Invitrogen，UK)将其克隆进pCR
Figure 2006800219031_9
4-TOPO载体中。为了验证该375bp PCR产物的身份，使用自动DNA测序(MWG Biotech，Ebersberg，Germany)将该DNA测序。 
放射性PCR分析 
为了检测UVR产生的低水平缺失，如上所述进行PCR，但是加入3μCi的[α-32P]-dCTP(Amersham，Buckinghamshire，UK)。PCR产 物然后通过6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行电泳，并在磷光成像屏上暴光约24小时。使用ImageQuant软件(Molecular Dynamics，UK)通过磷光成像仪扫描并观察放射性PCR片断。 
统计学分析 
使用StatCalc(Epi-info.CDC，Alberta，Georgia)应用χ2、Pearson’s χ2、Fisher精确检验和配对t检验进行统计学分析。 
结果和讨论 
确认3895bp缺失的身份 
对来自先前研究(Druham等，2003)的NMSC和日光照射皮肤的mtDNA缺失谱进行再次分析。发现许多样品具有大小约4kb的缺失。检索MITOMAP(Mitomap，2004)数据库之后，将该缺失鉴定为报道于劣弧中跨越547-4443位核苷酸的3895bp种类。先前该缺失已与Kearns Sayre综合征和慢性进行性眼外肌麻痹相联系(Moraes等，1995)。为了证实该缺失的身份，设计了如方法部分中所解释的缺失特异性PCR分析。对该PCR的375bp产物进行测序以证实其含有3895bp缺失的特征性缺失-接合序列，即5’CTAACC536bp/4430bpccataccccgaa548bp/4442AATGTT 3’(SEQ ID NO：147)。特征性地，该序列只含有野生型mtDNA中3895bp缺失侧翼两个12bp重复中的一个(小写字母)。对经常接受日光照射和偶尔接受日光照射的身体部位中的3895bp缺失的频率进行比较 
由于3895bp缺失最初在取自日光照射部位的NMSC样品中观察到，所以本发明人提出了以下的问题：该缺失的频率是否为逐渐增加的累积性日光照射的标志物。使用缺失特异性PCR分析(参见材料和方法)，对取自经常、偶尔和几乎不接受日光照射的104个年龄匹配的分散人类皮肤样品的发生频率进行分析。随着UV照射的增加，缺失频率在表皮(p＜0.0001，χ2＝31.36，2df；Pearson’sχ2检验)和真皮(p＜0.0001，χ2＝28.68，2df)中均有显著提高。图8显示了随日光照射的增加观察到的3895bp缺失发生频率的提高。图8a是代表性的溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶，显示在户外经常接受日光(上图)的身体部位中3895bp缺失的频率比偶尔接受日光(下图)的高(D，真皮，E，表皮)。阳性对 照代表已通过测序证实具有3895bp缺失的样品。在两幅图中的泳道1均代表分子量标记(Hyperladder IV-范围在1000-100bp，Bioline，London UK)。每个PCR反应中加入等量的模板DNA。图8b是显示取自接受不同日光照射的身体部位的104个开裂皮肤样品中3895bp缺失频率的直方图。 
重要的是，与“偶尔”接受日光照射相比，在“经常”接受日光照射的身体部位中真皮(p＝0.0018，χ2＝9.72，优势比8.5；χ2检验)和表皮(p＜0.0001，χ2＝17.53，优势比40)中的缺失频率均较高(图8b)。该缺失在“几乎不”接受日光照射的身体部位中未检测到(图8b)。由于在经常接受日光照射和偶尔接受日光照射的组之间获取所述病灶周围皮肤的平均年龄、性别比和肿瘤类型非常相似(参见材料和方法)，因此该发现不太可能与这些因素混淆。另外，具有(即，平均值＝66.95±2.84)和不具有(平均值＝65.81±3.47)3895bp缺失的样本平均年龄值没有统计学差异(p＝0.80，t检验(Welch更正))。 
NMSC中的3895bp mtDNA缺失 
在与先前4977bp普遍缺失(Durham等，2003)研究相同的NMSC样品中对3895bp缺失进行研究，显示出3895缺失发生频率相当地较高(分别为8/10和4/10)，尽管该差异不是统计学显著的。由于这些肿瘤从经常接受日光照射的身体部位切除下来，所以可推测3895bp缺失可能是比普遍缺失更灵敏的累积性日光照射标记物。 
过去，曾经推测含有3895bp缺失的线粒体基因组劣弧区所含有的缺失少于含有普遍缺失的优弧(Wei等，1996；Mitomap，2004)。结果，大多数先前的研究倾向于着眼于优弧区中的缺失谱。可能由于这一“研究偏见”导致3895bp缺失在一般的文献中鲜有报道。或者，3895bp缺失可能在正常组织中以目前不能检测到的水平天然存在，然后通过UV照射富集在皮肤中。 
血液中不存在3895bp mtDNA缺失 
3895bp缺失先前仅在患病肌肉中有所报道(Moraes等，1992)。除了皮肤中的本研究之外，在其它组织中的发生频率未知。本发明人通过对取自与皮肤样品相似年龄组患者的16个血液样品进行缺失特异性PCR研究血液中的缺失频率。所述血液样品均未显示具有所述缺失(数 据未显示)。 
通过重复性UV放射在培养的HaCaT细胞中产生3895bp缺失 
为了评估日光照射的累积量与3895bp缺失发生频率之间的因果关系，有必要研究日光在体外的效果。由于日光包含UVA和UVB，因此使用helarium灯(Diffey，2002)来提供一系列重复性亚致死UVR剂量方案，以尝试在人类表皮来源的(HaCaT)细胞系中产生3895bp缺失。最佳的UVR重复性剂量策略为产生所述缺失而没有显著程度的细胞死亡。使用基于放射性PCR的分析，我们证明在17次0.5J/cm2(即，1SED)的隔日UVR剂量之后在贴壁细胞中观察到了诱导3895bp缺失的最初迹象。 
图9显示helarium灯(UVA/UVB)在17次UVR(每cm2 0.5J)剂量之后诱导HaCaT细胞中的3895bp缺失。用每cm2 0.5J(即，1 SED)的UVA/UVB每隔一天(共19次)照射HaCaT细胞。从贴壁细胞提取总细胞DNA，取100ng用于PCR扩增3895bp缺失。在17次重复性UVR剂量之后，观察到3895bp缺失受UV诱导而增加的最初迹象。阳性对照是来自具有3895bp缺失的肿瘤样品的DNA，而阴性对照不含有DNA。并且，因为使用了亚致死UVR剂量，因此在随后的两次UV剂量之后细胞系中维持了所述缺失的水平，如果3895bp可用作推定的人类皮肤中日光照射的累积性生物标志物的话，这种特性是很重要的。结合Berneberg等(2004)新近的发现(在出版的草稿修改期间)，这将很有意义，他们在体内证明了UVA诱导的普遍缺失可以在照射停止后的16个月后出现。 
上述的观察出于几个原因而具有重要性。首先，该研究使用了发射UVA和UVB的UVR来源，因此与仅使用UVA产生普遍缺失的先前研究(Berneburg等，1999；Koch等，2001)相比更接近地代表模拟太阳的UVR源。其次，这是首次通过重复性UVR产生4977bp普遍缺失以外的缺失。另外，与Berneburg研究中使用成纤维细胞不同的是，本实验在来源于角化细胞的细胞系中进行，正是这种细胞类型产生NMSC。 
功能重要性 
在3895bp缺失中缺失的区域是从D-环中的mtTF1结合位点至 tRNA甲硫氨酸。缺失的基因包括12s rRNA、16s rRNA、ND1以及H和L链转录用的启动子。野生型：缺失mtDNA的确定阈值必须在观察到线粒体呼吸功能受损之前获得(Sciacco等，1994)。对于编码蛋白质的mtDNA基因(如所述3895bp缺失去除的那些)来说，线粒体呼吸链功能异常的阈值约为65％及以上(Hayashi等，1991；Chomyn等，1992)。例如，先前的工作已显示，带有＜25％的4977bp mtDNA普遍缺失的人类皮肤样品不表现线粒体功能的缺陷，其通过细胞色素氧化酶和琥珀酸脱氢酶活性的双组织化学染色来确定(Durham等，2002)。因为没有用于3895bp缺失的功能性组化染色，所以使用Southern分析对患者中的所述缺失进行定量。在合适的对照存在下，该分析未能检测到3895bp缺失的存在，因此提示该缺失的水平低于2％-5％(结果未显示)。因此，基于先前对于普遍缺失的工作，患者样品中3895bp缺失的水平不太可能引起贯穿真皮或表皮的任何功能性效果，尽管不能排除小的病灶性效果。 
推测的机制 
先前已经提出，普遍缺失的产生机制涉及通过滑动链错配发生的基因组间重组事件，并可以发生在普遍缺失侧翼的13bp重复DNA序列处(Schon等，1989；Shoffner等，1989；Mita等，1990；Degoul等，1001)。由于3895bp缺失的侧翼为12bp重复，因此其产生可以通过相似的机制发生。普遍缺失的产生机制提出，所述13bp重复易感于DNA弯曲，由此使得单链DNA的小区域或“泡“打开(Schon等，1989)。本发明的结果提示，UVR可能是所述3895bp缺失产生的促进因素。其机制能是通过打开可增加重组事件的单链DNA“泡”而直接或间接影响12bp重复中的结构易变位点。 
结论 
概括地说，本实施例显示了鲜有报道的3895bp-mtDNA的频率在户外“经常”以及“偶尔”接受日光照射的身体部位之间存在显著差异。对先前4977bp普遍缺失研究中使用的相同NMSC样品中3895bp缺失的研究显示，3895bp缺失的发生频率相对较高。另外，3895bp缺失的病因与日光的UVR成分之间的联系已通过在体外用重复性亚致死剂量的UVA+UVB光源诱导3895bp缺失而建立。人类皮肤中3895bp缺失的频率提供了人类皮肤中累积性UV照射的潜在生物标志物，并可能继 而提供NMSC发展的早期检测工具以及提供监测临床UV光疗方案的长期安全性的方法。 
实施例14：NMSC中3895线粒体DNA缺失的实时PCR分析及其作为人类皮肤中日光照射的定量标志物的用途 
材料和方法 
人类皮肤样品 
在获得知情同意的情况下，从在Out-Patients Clinic，RoyalVictoria Infirmary，Newcastle，UK从接受NMSC(即基底细胞癌(BCC)(n＝5，年龄范围55-89岁，平均78岁)或鳞状细胞癌(SCC)(n＝5，年龄范围70-87岁，平均78岁))切除的患者获取肿瘤及匹配的病灶周围皮肤样品。对于日光照射的研究，从在户外“经常”接受日光照射的身体部位(如头皮、脸、颈和耳)(表皮n＝30，真皮n＝30，平均年龄±SEM＝70.45±2.161)以及“偶尔”接受日光照射的身体部位(肩、背和胸)(表皮n＝22，真皮n＝22，平均年龄±SEM＝63.77±3.501)获取临床正常的病灶周围皮肤。在经常和偶尔接受日光照射的组之间没有明显的年龄差异(p＝0.1134)：双侧t检测(Welch校正)。对于所有病灶周围皮肤样品，使用0.25％分散酶于4℃过夜分离表皮和真皮(Durham等，2003)，并使用Qiagen，DNeasy组织提取试剂盒提取DNA。该研究使用的患者均没有mtDNA缺陷。 
PCR分析 
所述PCR在25μl反应物中进行，其含有200ng基因组DNA、600nM的每种引物、250μM dNTP、每个反应0.6u的Amplitaq GoldDNA聚合酶(Applied Biosystems)、GeneAmp缓冲液(含有100mMTris-HCl，pH8.3、500mM KCl、15mM MgCl以及0.01％(重量/体积)明胶)。PCR引物L404和H4676(表9和表10)设计为在3895bp缺失之外退火。在DNA扩增期间，短的(30s)聚合酶延伸时间不允许野生型PCR产物扩增，仅允许扩增较小的缺失mtDNA片段。PCR条件为94℃10分钟，94℃30s、56℃30s、72℃30s的35个循环，以及72℃7分钟的终末延伸。扩增产物在溴化乙锭染色(0.25μg/ml)的1％琼脂糖凝胶中显影。 
这已经过两次改进，首先是使用Deep Vent(New England Biolabs)，其后通过使用Roche Faststart Taq进一步改进了灵敏度。这使得人们可以从测量年老患者的日光照射样品中的缺失转为能够测量年轻患者中的缺失。 
实时PCR分析 
已对3895bp缺失的定量建立了可靠的TaqMan-PCR分析。该定量TaqMan-PCR法通过双标记探针以PCR积累提供对靶标输入的实时测量。该探针在正向和反向引物之间退火，它在PCR延伸期中被Taq聚合酶的5’-3’外切核酸酶活性所切割。因此，与探针连接的5’端报告染料FAM(6-羧基荧光素)或VIC以及3’端的猝灭染料TAMRA(6-羧基-N，N，N’，N’-四甲基罗丹明)被分离，使得报告染料发射荧光。探针本身不能作为引物，因为其3’末端被磷酸基团封闭。该方法使用基因组的细胞色素b区域中的内标探针(IS-探针，表1和图10)(Koch等，2001)，以估计mtDNA的总拷贝数(即缺失及野生型)。3895bp缺失的水平通过探针(3895-探针，表9和图10)来确定，该探针跨越所述缺失的断点，以确保其仅在缺失存在时扩增。缺失水平的定量通过比较内标与3895bp缺失的比值来确定。 
扩增反应以25μl一式三份在96孔微量培养板中进行。在分开的管中扩增总mtDNA和缺失mtDNA，其中各含有100ng DNA、1×TaqMan Universal Mastermix(ABI)、300nM的每种内标引物(ISF和ISR，表9和图10)和100nM的IS-探针，或者300nM的每种3895bp缺失引物(3895F和3895R，表9)以及100nM的3895探针(图10)。使用ABI Prism 7000(Applied Biosystems，UK)进行PCR和荧光分析。扩增条件如下：50℃2分钟，95℃10分钟，其后为95℃15秒和60℃1分钟的40个循环。Rn值是对参比荧光归一化的靶报告信号，所述参比荧光为包括在TaqMan反应缓冲液中的染料。ΔRn义为Rn + (含有包括模板的所有组分的反应的Rn)和Rn -(无模板对照的Rn)之间的差异。首先检测到ΔRn统计学显著增加时的循环称为阈值循环(Ct)。如果荧光强度超过定义为阈值的背景Rn值的10倍标准偏差，则荧光信号认为是显著的。 
该实时PCR方法是新的并且以前从未公开过。与半定量标准PCR相比，该方法具有增强的灵敏性并可以定量。这种类型的断点特异性检 测与用于前列腺检测的方法相同，并且是新颖的。我们已显示其可用于前列腺癌和日光照射的线粒体重组特异性检测，但也可用于检测其它重排。 
图10显示PCR引物和TaqMan探针的定位，并且是含有3895bp缺失的mtDNA基因组的示意图。引物ISF/ISR和IS探针与野生型及缺失mtDNA退火。使用引物3895F/3895R和3895探针检测3895bp缺失。该特异性3895探针仅与缺失mtDNA退火，因为其结合跨越缺失接合处。另外，3895bp缺失的发生使缺失特异性引物(即3895F：3895R和L404：H4676)足够接近，从而在给定的PCR条件下产生扩增子。 
TOPO TA克隆 
按照生产商的说明书使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，UK)克隆控制区和3895缺失。TOPO TA克隆利用Taq聚合酶将单个脱氧腺嘌呤(A)加入PCR产物3’末端的非模板依赖性末端转移酶活性。该试剂盒提供的线性化载体具有单个突出的3’脱氧胸腺嘧啶(T)残基，允许PCR产物与载体之间的高效连接。正确大小插入片段的存在通过pCR4-TOPO载体中的EcoR1限制性片段分析来证实。 
结果 
建立用于3895bp缺失的定量实时PCR分析 
在确定有可能可靠地检测和定量带有3895bp mtDNA缺失的线粒体基因组拷贝的百分比之后，使用内标探针(IS-探针)或者3895缺失探针(3895-探针)对大范围的模板浓度检测两种PCR反应的线性。在两种情形中都通过将合适的PCR产物克隆进克隆载体来产生模板DNA(参见方法)。每种模板的浓度利用荧光法测定(GRI，UK)，并且对每种探针使用50ng和50pg之间的模板DNA进行实时PCR扩增(图11)。对于3895bp缺失(r＝0.9952)和内部标准(r＝0.9941)来说，CT值与模板浓度之间的关系都是线性的。另外，每种模板的扩增梯度是相同的。这证实了每种模板都以相同程度的效率进行扩增。因此，CT值可以用作模板DNA的度量，并用于定量3895bp缺失对野生型mtDNA的相对量。这些标准曲线准确预测“缺失mtDNA：野生型mtDNA”比值的能力通过使用一系列克隆的缺失：野生型模板混合物得到了证实(结果未显示)。 
图11显示了实时PCR对模板拷贝数的灵敏度。显示了模板DNA(稀释范围为1ug/ul模板的1/10-1/10000)和3895bp缺失(A)或野生型内标(B)浓度降低时的阈值循环(即CT，纵轴)。对于两种扩增来说，模板浓度与阈值循环数(CT)之间均存在线性关系。每个数字代表三次独立观察的平均值±SD。 
定量肿瘤中的3895bp缺失 
通过实时taqman PCR和先前建立的标准PCR测定确定NMSC以及组织学正常的病灶周围真皮和表皮中3895bp缺失的水平(图12)。发现通过实时PCR定量的3895bp缺失水平通常与通过标准非定量PCR分析估计的水平一致。 
图12通过展示溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶来显示肿瘤中3895bp缺失的实时PCR定量和标准PCR扩增，实时凝胶显示来自BCC和SCC的肿瘤(T)和组织学正常的病灶周围真皮(D)及表皮(E)中3895bp缺失的发生率。每个泳道下显示通过实时taqman PCR定量的3895bp缺失在每个样品中的百分比水平。标记有“ND”的样品确定为零，因为实时PCR的CT＞36，这是在无模板的对照中观察到的水平。所有图中的泳道1＝分子量标记(Hyperladder IV-范围1000-100bp，BiolineLtd，London UK)。将相同量的模板DNA加入每个PCR反应中。 
BCC中3895bp缺失发生的简单模式总体上与SCC中观察到的相似。在BCC和SCC中，在5名患者的3名中存在该缺失(尽管不是同样的患者)。在病灶周围皮肤中，该缺失在真皮中(5名BCC中的4名，5名SCC中的3名)比在表皮(5名BCC中的两名，5名SCC中的一名)更常见。然而，尽管样品的绝对数很小，但是当考虑缺失的真实水平而非其发生的简单模式时，在BCC和SCC结果之间是存在差异的。例如，就在肿瘤和病灶周围真皮中都存在缺失的样品而言，在SCC患者中缺失水平在真皮中最高，而BCC患者中的情况则相反。另外，有趣的是观察到取自面部的两个不同区域的BCC样品表现出非常不同的缺失水平(即7.14％与0.02％)，这可反映累积性日光照射程度的变化。决定通过在取自不同日光照射身体部位的相对大的组织学正常病灶周围样品亚组中测定缺失水平(而非发生模式)来对这一方面进行进一步研究。 
在取自不同日光照射身体部位的较大的组织学正常病灶周围样品亚组中定量3895bp缺失 
选择组织学正常的病灶周围皮肤而不是肿瘤样品，以避免除累积性日光照射部位以外的干扰因素。使用定量实时taqman PCR，检查了取自多种日光照射位点(定义为在户外经常接受照射(n＝60)和偶尔接受照射(n＝44))的104个年龄匹配的分散人类皮肤样品中的3895bp缺失水平。图13显示了三对经常和偶尔接受日光照射的样品中溴化乙锭染色3895bp扩增子琼脂糖凝胶的典型实例，以及通过实时PCR检测的相应的3895bp缺失水平。图13显示经常接受日光照射及偶尔接受日光照射的代表性溴化乙锭琼脂糖凝胶中3895bp缺失的实时PCR扩增和标准PCR扩增，其显示了三对经常和偶尔接受日光照射的样品中通过实时PCR检测的相应的3895bp缺失水平。缺失水平表示为百分比。两个图中的泳道1＝分子量标记(Hyperladder IV-范围1000-100bp，BiolineLtd，London UK)。将相同量的模板DNA加入每个PCR反应。两个图中的阳性对照为肿瘤DNA，从其中克隆PCR产物并测序，以产生用于实时PCR的模板。对通过实时PCR检测的3895bp缺失水平与通过标准PCR检测的水平进行的比较再次显示了两种技术之间良好的相关性。 
因此决定使用定量实时PCR测定分析所有的样品。该分析的结果清楚地显示，3895bp缺失的发生率随日光照射的增加而提高。图14是显示经常接受日光照射和偶尔接受日光照射的皮肤中3895bp缺失定量的散点图。3895bp缺失的水平表达为在经常接受日光照射和偶尔接受日光照射的真皮和表皮中的百分比，其通过实时taqman PCR测定。缺失的平均水平通过每组样品的水平线来指示。 
具体而言，定量实时PCR分析显示，与偶尔接受日光照射的样品相比，经常接受日光照射的样品中缺失的水平显著更高(真皮p＝0.0009，表皮p＝0.008；双侧t检测)。有意思的是，真皮样品具有比表皮更高的缺失频率(偶尔接受日光照射p＝0.0143，经常接受日光照射p＝0.0007)。由于获取病灶周围皮肤的平均年龄、性别比和肿瘤类型在经常接受日光照射和偶尔接受日光照射组之间非常相似(参见方法)，因此该发现不太可能与这些因素混淆。 
表9 
Figure 2006800219031A00800301
实施例15：证实活检测试 
从存档的前列腺样品中取出先前未使用的核芯穿刺活检(needlecore biopsy)：62个良性、49个恶性、30个活检在肿瘤附近但不含恶性细胞。总的来说，分析了总共141个样品以及7个额外样品(6个用于产生标准曲线，1个用作阴性对照(试剂/反应污染))。将完整的测定重复三次，每次由三名独立个体进行。 
用邻近或接近肿瘤的良性样品对人工神经网络(ANN)进行盲查询。另外，还包括了确定为远离肿瘤(在前列腺切除后定位于该位置)的一些样品。结果是接近肿瘤的“正常”组织中3.4kb缺失的频率提高，这与相邻的恶性组织一致。然而，远处的良性保留了其良性特征(图15)。这种检测将能够基于得自肿瘤附近位置的正常组织证实肿瘤，并且是基于所述3.4kb缺失研究。已显示线粒体DNA中的分子变化(即缺失)使组织发生并继续可检测的形态学变化。因此，对病理学家来说，在视觉观察下可能表现为正常或良性的样品的组织区可能已开始积累向恶性发展的突变。这种能力是病理学家现有的前列腺活检和组织学诊断的有力补充。使用PSA测试筛选前列腺癌会引起大量的活检操作，并且估计70％不能展示恶性细胞。这些活检被诊断为良性，并可以分成两类：真良性，即前列腺中不存在肿瘤；假良性，其中前列腺中存在肿瘤，而穿刺活检操作没有取到恶性样品。通过对良性组织的分子测试，人们对真良性类别中的个体再次确保其确实为良性，从而他们接下来可以不接受或接受较少的随访活检操作；或者为引起症状但还不能通过活检操作检测的恶性提供早期检测，避免了对用于诊断的额外活检的需要，并为临床医生提供了尽早开始并且可能更有效地治疗患者的机会。这种检测为受困于大量假阴性诊断的当前的活检分析提供了再次确认和验证。 
实施例16：前列腺肿瘤作图 
为了发现肿瘤行为标记物而进行的该研究的另一个潜在结果是能够基于六分法探针穿刺标本提供前列腺中肿瘤位置的三维模型。3.4kb缺失反映相邻良性组织中存在恶性的能力对于这种作图操作是至关重要的。这种作图将为泌尿学家和肿瘤学家提供前列腺肿瘤的虚拟模型并可以辅助治疗决定。 
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序列表 
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<120> 作为检测日光照射、前列腺癌和其他癌症的诊断工具的线粒体突变及重排 
<130>IP0710418P
<140>CN 200680021903.1
<141>2006-04-18
<150>PCT/CA2006/000652
<151>2006-04-18
<150>US 60/672,016
<151>2005-04-18
<150>US 60/721,522
<151>2005-09-29
<150>US 60/789,872
<151>2006-04-07
<160>153
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<212>DNA
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<220>
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<220>
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<212>DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<211>25
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<220>
<223> 引物序列 
<400>85
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<220>
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<220>
<223> 引物序列 
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<220>
<223> 引物序列 
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tcctatccct caaccccgac at22
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<220>
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<400>89
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<220>
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<220>
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<400>91
gttgaggtct agggctgtta gaag24
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<212>DNA
<213> 人工序列 
<220>
<223> 引物序列 
<400>92
agaacaccaa tgaccccaat acgc24
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<220>
<223> 引物序列 
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<211>23
<212>DNA
<213> 人工序列 
<220>
<223> 引物序列 
<400>94
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<212>DNA
<213> 人工序列 
<220>
<223> 引物序列 
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<211>21
<212>DNA
<213> 人工序列 
<220>
<223> 引物序列 
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<212>DNA
<213> 人工序列 
<220>
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<212>DNA
<213> 人工序列 
<220>
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<220>
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<221>misc_feature
<222>(16318)..(16318)
<223>n 为 a 、 c 、 g 或 t
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atgatctgct gcagtgctct gagccctagg attcatcttt cttttcaccg taggtggcct6960
gactggcatt gtattagcaa actcatcact agacatcgta ctacacgaca cgtactacgt7020
tgtagcccac ttccactatg tcctatcaat aggagctgta tttgccatca taggaggctt7080
cattcactga tttcccctat tctcaggcta caccctagac caaacctacg ccaaaatcca7140
tttcactatc atattcatcg gcgtaaatct aactttcttc ccacaacact ttctcggcct7200
atccggaatg ccccgacgtt actcggacta ccccgatgca tacaccacat gaaacatcct7260
atcatctgta ggctcattca tttctctaac agcagtaata ttaataattt tcatgatttg7320
agaagccttc gcttcgaagc gaaaagtcct aatagtagaa gaaccctcca taaacctgga7380
gtgactatat ggatgccccc caccctacca cacattcgaa gaacccgtat acataaaatc7440
tagacaaaaa aggaaggaat cgaacccccc aaagctggtt tcaagccaac cccatggcct7500
ccatgacttt ttcaaaaagg tattagaaaa accatttcat aactttgtca aagttaaatt7560
ataggctaaa tcctatatat cttaatggca catgcagcgc aagtaggtct acaagacgct7620
acttccccta tcatagaaga gcttatcacc tttcatgatc acgccctcat aatcattttc7680
cttatctgct tcctagtcct gtatgccctt ttcctaacac tcacaacaaa actaactaat7740
actaacatct cagacgctca ggaaatagaa accgtctgaa ctatcctgcc cgccatcatc7800
ctagtcctca tcgccctccc atccctacgc atcctttaca taacagacga ggtcaacgat7860
ccctccctta ccatcaaatc aattggccac caatggtact gaacctacga gtacaccgac7920
tacggcggac taatcttcaa ctcctacata cttcccccat tattcctaga accaggcgac7980
ctgcgactcc ttgacgttga caatcgagta gtactcccga ttgaagcccc cattcgtata8040
ataattacat cacaagacgt cttgcactca tgagctgtcc ccacattagg cttaaaaaca8100
gatgcaattc ccggacgtct aaaccaaacc actttcaccg ctacacgacc gggggtatac8160
tacggtcaat gctctgaaat ctgtggagca aaccacagtt tcatgcccat cgtcctagaa8220
ttaattcccc taaaaatctt tgaaataggg cccgtattta ccctatagca ccccctctac8280
cccctctaga gcccactgta aagctaactt agcattaacc ttttaagtta aagattaaga8340
gaaccaacac ctctttacag tgaaatgccc caactaaata ctaccgtatg gcccaccata8400
attaccccca tactccttac actattcctc atcacccaac taaaaatatt aaacacaaac8460
taccacctac ctccctcacc aaagcccata aaaataaaaa attataacaa accctgagaa8520
ccaaaatgaa cgaaaatctg ttcgcttcat tcattgcccc cacaatccta ggcctacccg8580
ccgcagtact gatcattcta tttccccctc tattgatccc cacctccaaa tatctcatca8640
acaaccgact aatcaccacc caacaatgac taatcaaact aacctcaaaa caaatgataa8700
ccatacacaa cactaaagga cgaacctgat ctcttatact agtatcctta atcattttta8760
ttgccacaac taacctcctc ggactcctgc ctcactcatt tacaccaacc acccaactat8820
ctataaacct agccatggcc atccccttat gagcgggcac agtgattata ggctttcgct8880
ctaagattaa aaatgcccta gcccacttct taccacaagg cacacctaca ccccttatcc8940
ccatactagt tattatcgaa accatcagcc tactcattca accaatagcc ctggccgtac9000
gcctaaccgc taacattact gcaggccacc tactcatgca cctaattgga agcgccaccc9060
tagcaatatc aaccattaac cttccctcta cacttatcat cttcacaatt ctaattctac9120
tgactatcct agaaatcgct gtcgccttaa tccaagccta cgttttcaca cttctagtaa9180
gcctctacct gcacgacaac acataatgac ccaccaatca catgcctatc atatagtaaa9240
acccagccca tgacccctaa caggggccct ctcagccctc ctaatgacct ccggcctagc9300
catgtgattt cacttccact ccataacgct cctcatacta ggcctactaa ccaacacact9360
aaccatatac caatgatggc gcgatgtaac acgagaaagc acataccaag gccaccacac9420
accacctgtc caaaaaggcc ttcgatacgg gataatccta tttattacct cagaagtttt9480
tttcttcgca ggatttttct gagcctttta ccactccagc ctagccccta ccccccaatt9540
aggagggcac tggcccccaa caggcatcac cccgctaaat cccctagaag tcccactcct9600
aaacacatcc gtattactcg catcaggagt atcaatcacc tgagctcacc atagtctaat9660
agaaaacaac cgaaaccaaa taattcaagc actgcttatt acaattttac tgggtctcta9720
ttttaccctc ctacaagcct cagagtactt cgagtctccc ttcaccattt ccgacggcat9780
ctacggctca acattttttg tagccacagg cttccacgga cttcacgtca ttattggctc9840
aactttcctc actatctgct tcatccgcca actaatattt cactttacat ccaaacatca9900
ctttggcttc gaagccgccg cctgatactg gcattttgta gatgtggttt gactatttct9960
gtatgtctcc atctattgat gagggtctta ctcttttagt ataaatagta ccgttaactt10020
ccaattaact agttttgaca acattcaaaa aagagtaata aacttcgcct taattttaat10080
aatcaacacc ctcctagcct tactactaat aattattaca ttttgactac cacaactcaa10140
cggctacata gaaaaatcca ccccttacga gtgcggcttc gaccctatat cccccgcccg10200
cgtccctttc tccataaaat tcttcttagt agctattacc ttcttattat ttgatctaga10260
aattgccctc cttttacccc taccatgagc cctacaaaca actaacctgc cactaatagt10320
tatgtcatcc ctcttattaa tcatcatcct agccctaagt ctggcctatg agtgactaca10380
aaaaggatta gactgaaccg aattggtata tagtttaaac aaaacgaatg atttcgactc10440
attaaattat gataatcata tttaccaaat gcccctcatt tacataaata ttatactagc10500
atttaccatc tcacttctag gaatactagt atatcgctca cacctcatat cctccctact10560
atgcctagaa ggaataatac tatcgctgtt cattatagct actctcataa ccctcaacac10620
ccactccctc ttagccaata ttgtgcctat tgccatacta gtctttgccg cctgcgaagc10680
agcggtgggc ctagccctac tagtctcaat ctccaacaca tatggcctag actacgtaca10740
taacctaaac ctactccaat gctaaaacta atcgtcccaa caattatatt actaccactg10800
acatgacttt ccaaaaaaca cataatttga atcaacacaa ccacccacag cctaattatt10860
agcatcatcc ctctactatt ttttaaccaa atcaacaaca acctatttag ctgttcccca10920
accttttcct ccgaccccct aacaaccccc ctcctaatac taactacctg actcctaccc10980
ctcacaatca tggcaagcca acgccactta tccagtgaac cactatcacg aaaaaaactc11040
tacctctcta tactaatctc cctacaaatc tccttaatta taacattcac agccacagaa11100
ctaatcatat tttatatctt cttcgaaacc acacttatcc ccaccttggc tatcatcacc11160
cgatgaggca accagccaga acgcctgaac gcaggcacat acttcctatt ctacacccta11220
gtaggctccc ttcccctact catcgcacta atttacactc acaacaccct aggctcacta11280
aacattctac tactcactct cactgcccaa gaactatcaa actcctgagc caacaactta11340
atatgactag cttacacaat agcttttata gtaaagatac ctctttacgg actccactta11400
tgactcccta aagcccatgt cgaagccccc atcgctgggt caatagtact tgccgcagta11460
ctcttaaaac taggcggcta tggtataata cgcctcacac tcattctcaa ccccctgaca11520
aaacacatag cctacccctt ccttgtacta tccctatgag gcataattat aacaagctcc11580
atctgcctac gacaaacaga cctaaaatcg ctcattgcat actcttcaat cagccacata11640
gccctcgtag taacagccat tctcatccaa accccctgaa gcttcaccgg cgcagtcatt11700
ctcataatcg cccacgggct tacatcctca ttactattct gcctagcaaa ctcaaactac11760
gaacgcactc acagtcgcat cataatcctc tctcaaggac ttcaaactct actcccacta11820
atagcttttt gatgacttct agcaagcctc gctaacctcg ccttaccccc cactattaac11880
ctactgggag aactctctgt gctagtaacc acgttctcct gatcaaatat cactctccta11940
cttacaggac tcaacatact agtcacagcc ctatactccc tctacatatt taccacaaca12000
caatggggct cactcaccca ccacattaac aacataaaac cctcattcac acgagaaaac12060
accctcatgt tcatacacct atcccccatt ctcctcctat ccctcaaccc cgacatcatt12120
accgggtttt cctcttgtaa atatagttta accaaaacat cagattgtga atctgacaac12180
agaggcttac gaccccttat ttaccgagaa agctcacaag aactgctaac tcatgccccc12240
atgtctaaca acatggcttt ctcaactttt aaaggataac agctatccat tggtcttagg12300
ccccaaaaat tttggtgcaa ctccaaataa aagtaataac catgcacact actataacca12360
ccctaaccct gacttcccta attcccccca tccttaccac cctcgttaac cctaacaaaa12420
aaaactcata cccccattat gtaaaatcca ttgtcgcatc cacctttatt atcagtctct12480
tccccacaac aatattcatg tgcctagacc aagaagttat tatctcgaac tgacactgag12540
ccacaaccca aacaacccag ctctccctaa gcttcaaact agactacttc tccataatat12600
tcatccctgt agcattgttc gttacatggt ccatcataga attctcactg tgatatataa12660
actcagaccc aaacattaat cagttcttca aatatctact catcttccta attaccatac12720
taatcttagt taccgctaac aacctattcc aactgttcat cggctgagag ggcgtaggaa12780
ttatatcctt cttgctcatc agttgatgat acgcccgagc agatgccaac acagcagcca12840
ttcaagcaat cctatacaac cgtatcggcg atatcggttt catcctcgcc ttagcatgat12900
ttatcctaca ctccaactca tgagacccac aacaaatagc ccttctaaac gctaatccaa12960
gcctcacccc actactaggc ctcctcctag cagcagcagg caaatcagcc caattaggtc13020
tccacccctg actcccctca gccatagaag gccccacccc agtctcagcc ctactccact13080
caagcactat agttgtagca ggaatcttct tactcatccg cttccacccc ctagcagaaa13140
atagcccact aatccaaact ctaacactat gcttaggcgc tatcaccact ctgttcgcag13200
cagtctgcgc ccttacacaa aatgacatca aaaaaatcgt agccttctcc acttcaagtc13260
aactaggact cataatagtt acaatcggca tcaaccaacc acacctagca ttcctgcaca13320
tctgtaccca cgccttcttc aaagccatac tatttatgtg ctccgggtcc atcatccaca13380
accttaacaa tgaacaagat attcgaaaaa taggaggact actcaaaacc atacctctca13440
cttcaacctc cctcaccatt ggcagcctag cattagcagg aatacctttc ctcacaggtt13500
tctactccaa agaccacatc atcgaaaccg caaacatatc atacacaaac gcctgagccc13560
tatctattac tctcatcgct acctccctga caagcgccta tagcactcga ataattcttc13620
tcaccctaac aggtcaacct cgcttcccca cccttactaa cattaacgaa aataacccca13680
ccctactaaa ccccattaaa cgcctggcag ccggaagcct attcgcagga tttctcatta13740
ctaacaacat ttcccccgca tcccccttcc aaacaacaat ccccctctac ctaaaactca13800
cagccctcgc tgtcactttc ctaggacttc taacagccct agacctcaac tacctaacca13860
acaaacttaa aataaaatcc ccactatgca cattttattt ctccaacata ctcggattct13920
accctagcat cacacaccgc acaatcccct atctaggcct tcttacgagc caaaacctgc13980
ccctactcct cctagaccta acctgactag aaaagctatt acctaaaaca atttcacagc14040
accaaatctc cacctccatc atcacctcaa cccaaaaagg cataattaaa ctttacttcc14100
tctctttctt cttcccactc atcctaaccc tactcctaat cacataacct attcccccga14160
gcaatctcaa ttacaatata tacaccaaca aacaatgttc aaccagtaac tactactaat14220
caacgcccat aatcatacaa agcccccgca ccaataggat cctcccgaat caaccctgac14280
ccctctcctt cataaattat tcagcttcct acactattaa agtttaccac aaccaccacc14340
ccatcatact ctttcaccca cagcaccaat cctacctcca tcgctaaccc cactaaaaca14400
ctcaccaaga cctcaacccc tgacccccat gcctcaggat actcctcaat agccatcgct14460
gtagtatatc caaagacaac catcattccc cctaaataaa ttaaaaaaac tattaaaccc14520
atataacctc ccccaaaatt cagaataata acacacccga ccacaccgct aacaatcaat14580
actaaacccc cataaatagg agaaggctta gaagaaaacc ccacaaaccc cattactaaa14640
cccacactca acagaaacaa agcatacatc attattctcg cacggactac aaccacgacc14700
aatgatatga aaaaccatcg ttgtatttca actacaagaa caccaatgac cccaatacgc14760
aaaactaacc ccctaataaa attaattaac cactcattca tcgacctccc caccccatcc14820
aacatctccg catgatgaaa cttcggctca ctccttggcg cctgcctgat cctccaaatc14880
accacaggac tattcctagc catgcactac tcaccagacg cctcaaccgc cttttcatca14940
atcgcccaca tcactcgaga cgtaaattat ggctgaatca tccgctacct tcacgccaat15000
ggcgcctcaa tattctttat ctgcctcttc ctacacatcg ggcgaggcct atattacgga15060
tcatttctct actcagaaac ctgaaacatc ggcattatcc tcctgcttgc aactatagca15120
acagccttca taggctatgt cctcccgtga ggccaaatat cattctgagg ggccacagta15180
attacaaact tactatccgc catcccatac attgggacag acctagttca atgaatctga15240
ggaggctact cagtagacag tcccaccctc acacgattct ttacctttca cttcatcttg15300
cccttcatta ttgcagccct agcaacactc cacctcctat tcttgcacga aacgggatca15360
aacaaccccc taggaatcac ctcccattcc gataaaatca ccttccaccc ttactacaca15420
atcaaagacg ccctcggctt acttctcttc cttctctcct taatgacatt aacactattc15480
tcaccagacc tcctaggcga cccagacaat tataccctag ccaacccctt aaacacccct15540
ccccacatca agcccgaatg atatttccta ttcgcctaca caattctccg atccgtccct15600
aacaaactag gaggcgtcct tgccctatta ctatccatcc tcatcctagc aataatcccc15660
atcctccata tatccaaaca acaaagcata atatttcgcc cactaagcca atcactttat15720
tgactcctag ccgcagacct cctcattcta acctgaatcg gaggacaacc agtaagctac15780
ccttttacca tcattggaca agtagcatcc gtactatact tcacaacaat cctaatccta15840
ataccaacta tctccctaat tgaaaacaaa atactcaaat gggcctgtcc ttgtagtata15900
aactaataca ccagtcttgt aaaccggaga tgaaaacctt tttccaagga caaatcagag15960
aaaaagtctt taactccacc attagcaccc aaagctaaga ttctaattta aactattctc16020
tgttctttca tggggaagca gatttgggta ccacccaagt attgactcac ccatcaacaa16080
ccgctatgta tttcgtacat tactgccagc caccatgaat attgtacggt accataaata16140
cttgaccacc tgtagtacat aaaaacccaa tccacatcaa aaccccctcc ccatgcttac16200
aagcaagtac agcaatcaac cctcaactat cacacatcaa ctgcaactcc aaagccaccc16260
ctcacccact aggataccaa caaacctacc cacccttaac agtacatagt acataaagcc16320
atttaccgta catagcacat tacagtcaaa tcccttctgc gtccccatgg atgacccccc16380
tcagataggg gtcccttgac caccatcctc cgtgaaatca atatcccgca caagagtgct16440
actctcctcg ctccgggccc ataacacttg ggggtagcta aagtgaactg tatccgacat16500
ctggttccta cttcagggtc ataaagccta aatagcccac acgttcccct taaataagac16560
atcacgatg16569
<210>139
<211>30
<212>DNA
<213> 人工序列 
<220>
<223> 引物序列 
<400>139
tagactacgt acatactaac cctactccta30
<210>140
<211>19
<212>DNA
<213> 人工的 
<220>
<223> 引物序列 
<400>140
gaggtaggat tggtgctgt19
<210>141
<211>21
<212>DNA
<213> 人工序列 
<220>
<223> 引物序列 
<400>141
cgttccagtg agttcaccct c21
<210>142
<211>23
<212>DNA
<213> 人工序列 
<220>
<223> 引物序列 
<400>142
cactctttac gccggcttct att23
<210>143
<211>20
<212>DNA
<213> 人工序列 
<220>
<223> 引物序列 
<400>143
cctgccccaa tccctttatt20
<210>144
<211>21
<212>DNA
<213> 人工序列 
<220>
<223> 引物序列 
<400>144
ggtttcgaag tggtggtctt g21
<210>145
<211>20
<212>DNA
<213> 人工序列 
<220>
<223> 引物序列 
<400>145
cttttggcgg tatgcacttt20
<210>146
<211>20
<212>DNA
<213> 人工序列 
<220>
<223> 引物序列 
<400>146
gattatggat gcggttgctt20
<210>147
<211>24
<212>DNA
<213> 人工序列 
<220>
<223> 缺失 - 连接序列 
<400>147
ctaaccccat accccgaaaa tgtt24
<210>148
<211>24
<212>DNA
<213> 人工序列 
<220>
<223> 引物序列 
<400>148
gatttgggta ccacccaagt attg24
<210>149
<211>23
<212>DNA
<213> 人工序列 
<220>
<223> 引物序列 
<400>149
aatattcatg gtggctggca gta23
<210>150
<211>32
<212>DNA
<213> 人工的 
<220>
<223>IS 探针 
<400>150
cacccatcaa caaccgctat gtatttcgta ca32
<210>151
<211>18
<212>DNA
<213> 人工序列 
<220>
<223> 引物序列 
<400>151
caaccctcgc ccatccta18
<210>152
<211>26
<212>DNA
<213> 人工序列 
<220>
<223> 引物序列 
<400>152
cctgcaaaga tggtagagta gatgac26
<210>153
<211>28
<212>DNA
<213> 人工序列 
<220>
<223>3895 探针 
<400>153
tgctaacccc ataccccgaa aatgttgg28

Claims (15)

1.核酸引物3.4正向，其包含
TAG ACT ACG TAC ATA CTA ACC CTA CTC CTA(SEQ ID NO：139)。
2.核酸引物3.4反向，其包含
GAG GTA GGA TTG GTG CTG T(SEQ ID NO：140)。
3.包含多个核酸成员以及固体基质的阵列，其中所述核酸成员之一对10744至14124位的人mtDNA缺失具有特异性，其中所述核酸成员在所述阵列上具有独有的位置，并且与所述固体基质稳定结合。
4.权利要求3的阵列，其中所述核酸成员之一与具有人mtDNA基因组中10744至14124位核苷酸之缺失的mtDNA特异性结合。
5.权利要求4的阵列，其中所述核酸成员之一是核酸探针。
6.用于诊断前列腺癌的试剂盒，其包含权利要求3的阵列以及选自以下的至少一种成员：一次性芯片、容纳所述一次性芯片的手段、提取mtDNA的手段、引物、试剂和说明书。
7.权利要求6的试剂盒，其中至少一种所述引物具有对应于SEQID NO：139或SEQ ID NO：140的序列。
8.用于检测与前列腺癌相关的mtDNA缺失的阵列，所述阵列包含多个核酸成员以及固体基质，其中至少一种所述核酸成员对人mtDNA基因组中10744至14124位核苷酸的人mtDNA缺失具有特异性，其中所述至少一种核酸成员在所述阵列上具有独有的位置，并且与所述固体基质稳定结合。
9.权利要求8的阵列，其中所述至少一种核酸成员与具有人mtDNA基因组中10744至14124位核苷酸之缺失的mtDNA特异性结合。
10.权利要求9的阵列，其中所述至少一种核酸成员是核酸探针。
11.用于检测与前列腺癌相关的mtDNA缺失的试剂盒，所述试剂盒包含含有对人mtDNA基因组中10744至14124位核苷酸缺失具有特异性之核酸成员的阵列，以及选自以下的至少一种成员：固体支持物、容纳所述固体支持物的手段、提取mtDNA的手段、引物、试剂和说明书，其中所述核酸成员在所述阵列上具有独有的位置，并且与所述固体基质稳定结合。
12.权利要求11的试剂盒，其中所述核酸成员与具有人mtDNA基因组中10744至14124位核苷酸之缺失的mtDNA特异性结合。
13.权利要求12的试剂盒，其中所述核酸成员是核酸探针。
14.权利要求11的试剂盒，其中至少一种所述引物具有对应于SEQ ID NO：139或SEQ ID NO：140的序列。
15.用于检测与前列腺癌相关的mtDNA缺失的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种具有对应于SEQ ID NO：139或SEQ ID NO：140之序列的引物。
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