CN101351564B

CN101351564B - 通过靶特异性杂交捕获方法检测核酸

Info

Publication number: CN101351564B
Application number: CN200680050037.9A
Authority: CN
Inventors: 依瑞纳·纳扎恩克; 阿迪拉·T·劳伦克兹; 保罗·艾德; 布赖恩·洛厄尔; 理查德·马洛尼; 哈·泰
Original assignee: Qiagen Gaithersburg LLC
Current assignee: Qiagen Gaithersburg LLC
Priority date: 2005-11-07
Filing date: 2006-11-07
Publication date: 2014-04-30
Anticipated expiration: 2026-11-07
Also published as: EP1948832A2; WO2007056723A3; AU2006311288A1; RU2437939C2; CA2629978A1; US9115410B2; KR101334645B1; MX2008007192A; WO2007056723A2; RU2008122909A; BRPI0801480A2; CN101351564A; US20060051809A1; US8901287B2; AU2006311288B2; EP1948832A4; CA2629978C; EP1948832B1; US20130203632A1; BRPI0801480B1

Abstract

靶特异性杂交捕获(TSHC)提供了检测核酸的方法，该方法不仅快速、灵敏还高度特异，并且能够区分高度同源的核酸序列。所述方法产生能够被多种方法检测的DNA:RNA杂交体。

Description

通过靶特异性杂交捕获方法检测核酸

本申请是按照35U.S.C.§120在2004年12月6日提交的美国专利申请序号第11/005,617号、名称为“通过靶特异性杂交捕获方法检测核酸”的部分继续申请，上述申请为2004年10月20日提交，现在已放弃的美国专利申请序号第10/971,251号的部分继续申请，所放弃的申请为2000年6月15日提交的美国专利申请序号第10/971,251号的部分继续申请，所有这些申请通过引用结合入本文。

发明领域

本发明涉及核酸检测方法的领域，具体涉及通过靶特异性杂交捕获方法检测核酸。

背景技术

生物样品中存在的特异性核酸序列的检测对鉴定和分类微生物、诊断传染病、检测和表征遗传异常、鉴定癌症相关的遗传改变、研究对疾病的遗传易感性以及测量对各种类型的治疗的响应都是重要的。检测和定量特异核酸序列的常规技术为核酸杂交和靶扩增。

可以获取各种杂交方法用于核酸的检测和研究。在传统的杂交方法中，所鉴定的核酸或者在溶液中或者附于固体载体上。所述核酸使用能够与核酸杂交的标记的核酸探针进行检测。最近，已经开发出新的杂交方法以提高检测的灵敏度和特异性。一个实例是在美国申请序号第07/792,585号和美国专利第6,228,578号中描述的Hybrid

方法。虽然这些新杂交方法比传统方法有了显著改善，但它们仍然不具备在高度同源的核酸序列之间进行完全区分的能力。

聚合酶链式反应(PCR)是最常使用的靶核酸扩增方法。然而，当同时扩增大量的不同靶(即多重反应)时，PCR在某种程度上受到限制，多重反应可能不仅会引起PCR伪影(artifacts)如引物二聚体，还会引起虚假的靶扩增。为了尝试克服这种限制，当多个靶具有同源区域时可以使用通用引物。然而，物种间的同源从来都不是百分之百的，因此引物与不同靶将具有若干错配，从而引起非均匀扩增。当样品中存在不同量的靶时，不同PCR的扩增效率也变化，导致不同靶的非均匀和非特异性扩增。

因此提供检测靶核酸序列的方法是本发明的一个目的，该方法不仅提供了提高的速度和灵敏度，而且是高度特异的，并且能够在多个高度同源的核酸靶序列之间进行区分。

发明内容

本发明提供了新的核酸检测方法，这里称为靶特异性杂交捕获(“TSHC”)。TSHC是快速的、高度特异和灵敏的方法，能够区分和检测高度同源的核酸靶序列。

本发明的一个实施例涉及用于快速且灵敏检测靶核酸序列的检测和/或定量一个或多个靶核酸的方法，该方法包括靶向富集、扩增和检测的步骤。

实施例在本发明方法的一个实施例中，一个或多个靶核酸通过以下检测：通过将靶核酸、与所述靶核酸互补的核酸探针(其中一个是RNA，另一个是DNA)和固体载体混合来将靶核酸捕获至固体载体上；除去未结合的靶核酸和核酸探针；扩增所捕获的靶核酸或核酸探针，形成多个扩增子，其中所述扩增子的存在表明存在所述靶核酸；以及通过将靶核酸、与所述靶核酸的一部分杂交的选择性且可区别的寡核苷酸(即捕获序列探针，CSP)和与所述靶核酸的其它部分互补的核酸探针(即信号序列探针，SSP)混合来检测所述靶核酸，其中所述探针或靶中任一个为RNA，另一个为DNA，通过被直接或间接标记的DNA:RNA杂交体特异性结合剂检测DNA:RNA杂交体，从而检测靶核酸。所述SSP不仅仅限于作为产生检测信号的手段；也可以通过与靶核酸杂交，利用DNA:RNA杂交体特异性结合剂启动捕获来用于靶富集步骤。

在另一个实施例中，多个靶核酸通过以下检测：将多个靶核酸杂交至与所述靶核酸互补的核酸探针上，形成DNA:RNA杂交体；利用结合至固体载体上的DNA:RNA杂交体特异性抗体捕获所述DNA:RNA杂交体；除去未结合的靶核酸和核酸探针；利用随机引物和DNA聚合酶扩增所捕获的靶核酸或核酸探针，形成多个扩增子，其中所述多个扩增子的存在表明存在所述靶核酸；杂交与所述靶核酸序列的一部分互补的核酸探针，从而在靶和探针之间形成DNA:RNA杂交体；结合至固体载体上的寡核苷酸与靶核酸其它部分杂交，其中所述固体载体为选择性的；选择所述寡核苷酸复合体；并通过DNA:RNA杂交体特异性结合剂与所述DNA:RNA杂交体的结合来检测多个靶核酸。

在另一个实施例中，一个或多个靶DNA通过多重方法检测，所述多重方法的步骤为：多个靶DNA和与所述靶DNA互补的RNA探针杂交，形成DNA:RNA杂交体；利用结合至微珠上的DNA:RNA杂交体特异性抗体捕获所述DNA:RNA杂交体；通过清洗过量的核酸和探针，除去未结合的核酸和核酸探针；使用随机引物和DNA聚合酶等温扩增所述靶DNA，形成多个扩增子；杂交与所述靶DNA的一部分互补的RNA探针(即SSP)，形成DNA:RNA杂交体；特异性DNA寡核苷酸与靶DNA的其它部分杂交，其中所述DNA寡核苷酸结合至选择性微珠上；并通过可检测地标记的DNA:RNA杂交体特异性抗体与所述DNA:RNA杂交体的结合以及使用结合选择性寡核苷酸(即CSP)的微珠选择靶DNA来检测所述多个靶DNA，其中所述DNA:RNA杂交体特异性抗体被可检测地且可区别地标记。通过SSP利用所述被标记的DNA:RNA抗体检测每个靶的存在，所述SSP与靶形成DNA:RNA杂交体，同时根据结合有寡核苷酸(即CSP)的微珠分离和选择各种靶。扩增子和DNA:RNA杂交体的存在表明存在所述靶DNA。

具体实施方式

本发明提供了用于富集、扩增和检测试验样品中一个或多个核酸的存在的方法。更具体地，本发明提供了高度特异和灵敏的方法，该方法能够区分和检测高度同源的核酸序列。

本发明的一个实施例涉及用于靶核酸序列多重检测的、快速灵敏的方法，其可以同时检测多个不同的靶核酸序列。这种方法可以自动化。所述方法主要包括三个步骤：靶富集，靶扩增和靶检测，它提供了用于核酸诊断的半定量或定性方法。本发明的这个实施例可以以多重的方式来进行纯化或未纯化样品中靶核酸序列的检测，其中靶的浓度可以为大约50个拷贝之少或者小于每毫升样品中大约100个靶拷贝，或每毫升中10⁸个拷贝之多。生物样品中单一病原体或靶的检测，例如但又不限于HSV和HPV类型，可以以多重的方式进行，优选但不限于50丛(50-plexes)。

本发明的优点是，这种检测多个靶核酸序列的多重方法是相对快速、灵敏和准确的方法，其具有两个水平的特异性，这对于临床检测是一个有利的特征。通过使用靶特异性序列，所述两个水平的特异性在靶的富集和检测步骤中获得。

靶富集是第一步，它通过将非特异性核酸和污染物同特异性靶分离来制备用于扩增的样品。通过干扰扩增和检测，非特异的或不需要的核酸序列的存在降低了靶扩增的灵敏度。靶富集步骤将样品从可能的抑制剂中纯化出来并清除了非特异性核酸，从而提供特异性的第一个水平。清除非特异性核酸允许等温扩增步骤中的有效扩增，并且由此使同源靶之间的竞争最小化。靶富集还使双链靶变性，产生用于有效扩增的单链DNA。为了提高靶的捕获，可以在所述靶富集步骤中使用各种试剂。例如，可以使用枯草杆菌蛋白酶以提高靶捕获(尤其在血液临床样品中)。枯草杆菌蛋白酶或羰基水解酶，是由杆菌属成员分泌的碱性蛋白酶。当通过微珠捕获靶核酸时，枯草杆菌蛋白酶的存在使微珠形成紧密的粒状沉淀，从而提高洗脱未结合或不需要的物质的容易程度。另外，靶富集步骤还将靶核酸浓缩成小体积。

通过将靶核酸、DNA:RNA杂交体特异性结合剂和固体载体混合来实现靶的富集，所述DNA:RNA杂交体特异性结合剂例如与所述靶核酸互补的核酸探针，比如信号序列探针，其中所述靶核酸和DNA:RNA杂交体特异性结合剂杂交以在固体载体上形成DNA:RNA杂交体，并除去不形成DNA:RNA杂交体的或不被固体载体捕获的任何核酸。

特别地，通过形成DNA:RNA杂交体实现所需要的靶核酸和非特异性核酸的分离，其中所述DNA:RNA杂交体被捕获在固相或固体载体上，如被DNA:RNA杂交体特异性结合剂修饰的顺磁性微珠，该DNA:RNA杂交体特异性结合剂例如但不限于DNA:RNA杂交体特异性抗体(如杂交捕获抗体(HC-Ab))、单克隆抗体或多克隆抗体或其片段、蛋白质、催化失活的核糖核酸酶H、核酸、核酸适配子或具有结合并形成三链体结构能力的寡核苷酸。Haruki等人报道了核糖核酸酶H在没有Mg²⁺和催化剂时通过表面等离子体共振与DNA:RNA杂交体的结合亲和性[“Kinetic andstoichiometric analysis for the binding of Escherichia coliribonuclease HI to RNA-DNA hybrids using surface plasmon resonance”(使用表面等离子体共振的大肠杆菌核糖核酸酶HI和RNA-DNA杂交体的结合的动力学和化学计量学分析“)J.Biol.Chem.272：22015-22022，1997，通过引用并入]。这种靶富集的步骤可以在任何固体载体上进行，如在微量板、微芯片、微珠、顺磁性/非顺磁性微珠或之前提到的任何固相上。例如，将靶DNA、RNA探针或不同的RNA探针的集合(如果是在多重反应中的话)和与轭合的DNA:RNA HC-抗体结合的微珠混合。靶DNA和RNA探针形成DNA:RNA杂交体。所述DNA:RNA HC-抗体结合至固体载体上，如顺磁性微珠。一旦DNA:RNA杂交体被捕获至固体载体上，洗脱所有未结合的核酸序列和污染物，优选通过使用不会降低或影响所述杂交的缓冲液的重复洗涤。

作为一种选择或除了使用DNA:RNA杂交体特异性抗体外，可以使用任何长度的、与结合至固相上的靶互补的寡核苷酸或多聚核苷酸来捕获靶核酸序列。例如，识别特异性HPV类型的寡核苷酸或探针可以结合至固相上，例如平板、芯片或微珠。若干与特异且已知的探针结合的微珠形成微珠集合。例如，每一个微珠集合特异性地针对一种HPV类型。在多重方式中，可以使用多个鉴定不同HPV类型的微珠集合，每个微珠集合对应一个HPV类型。对靶核酸捕获有用的寡核苷酸可以部分或全部为锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)或具有其它修饰[Current Protocols in Nucleic AcidChemistry(核酸化学的最新实验规程)，Eds.Serge L.Beaucage等人，John Wiley&Sons2004]。核酸探针的长度可以达到靶核酸长度的大约100％，且长度范围在大约50个碱基至大约10,000个碱基之间。靶核酸可以为DNA或RNA。如果靶核酸是RNA，那么可以通过任何已知的常规方法从所述RNA靶产生cDNA，或者所述靶RNA可以被DNA探针捕获，其中被杂交的DNA探针将被扩增并检测。

靶富集步骤不受这里所阐述的实施例的限制。根据这里阐述的原理，本领域技术人员应当理解如何纯化样品中的靶核酸，以便从该样品中除去或清除污染物、抑制剂和其它非特异性核酸。通过商业可得的方法和试剂盒，如质粒小量或大量制备试剂盒、凝胶回收试剂盒以及DNA和RNA纯化试剂盒，样品制备在本技术领域中是已知的且可理解的。在较低灵敏度可接受的某种情况下，可以使用这些方法和试剂盒以方便靶富集步骤。

靶富集之后，样品进行核酸扩增。使用随机序列的寡核苷酸引物和具有链置换活性的DNA聚合酶的核酸等温靶扩增，克服了多种限制，例如但不包括多重PCR的受制约的多重能力和不均匀扩增。通过与序列特异性寡核苷酸杂交来鉴定所扩增的序列或扩增子。也可以利用单个靶而不是多重方式进行扩增，并且可以结合扩增子用于杂交试验。

可以使用DNA聚合酶延伸引物和激活链置换。可选择地，如果使用DNA探针捕获靶RNA，那么扩增和检测所杂交的DNA探针。另一个实施例需要反转录靶RNA以产生作为DNA靶的cDNA，该cDNA可以如上所阐述被捕获。这个第二步骤优选地使用靶核酸的等温扩增。具体地，随机序列的寡核苷酸引物和具有链置换活性的DNA聚合酶可能在等温扩增中有用。在一个实施例中，固相或固体载体例如，但不限于磁性微珠，所述微珠具有的所捕获的靶核酸可以直接用于扩增混合物中。可以使用任何DNA聚合酶(包括但不限于phi29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶和DNA聚合酶I)扩增DNA靶，所述扩增通过随机引物引导。

为了最佳效率，随机引物可以具有特别比例的dG、dC、dT和dA单体。为了最佳操作，可以完全省略一个或两个核苷酸碱基。随机引物库不必包括所有可能的序列。所述库中所包括的序列也不必为等摩尔浓度。事实上，随机引物库可以包括选择性针对特定疾病的引物序列的子集。长度可以在大约4至大约20个核苷酸之间变化，且优选在大约5至大约8个核苷酸之间。长度取决于引物中单体的比例。最佳扩增温度在大约25℃至大约70℃之间变化，优选在大约28℃至大约40℃之间，该扩增温度可以由本领域的技术人员根据引物的长度确定且不需要过多的试验。所述最佳温度可以通过使用预测寡核苷酸退火温度的商业可得的软件进行估测。这种商业可得的软件的一个实例为6.0或6.41版的OLIGO^TM(Molecular BiologyInsights；Cascade，CO)。例如，可以用五聚体引物结合phi29DNA聚合酶扩增靶DNA 2个小时。

例如，通过修饰保护五聚体引物不受外切核酸酶的降解。引物的结构可包括硫代磷酸酯键或2’-O-甲基。根据所需要的灵敏度，扩增反应优选进行1-3小时，它比所发表的用于phi29DNA聚合酶反应的实验方案的持续时间短很多[Gary J.Vora等，Applied and EnvironmentalMicrobiology，70(5)：3047-3054，2004，通过引用并入]。独特的试剂配方与所选择的靶富集步骤以及靶检测步骤相结合，能够使扩增时间相对变短。

本发明的靶扩增步骤优选利用等温扩增，所述等温扩增能够实现：数量不受限制的靶的均衡效率的扩增；整个序列的扩增，而不是像聚合酶链式反应(PCR)情况中片段的扩增；并且允许靶检测，即使生物样品中一部分靶序列被除去。例如，HPV中L1区域经常被缺失，然而通过使用针对L1区域和E区域的杂交探针[MH Einstein和GN Goldberg，Cancer Invest.20：1080-1085，2002]，所述被缺失的序列仍然可以在相同水平的灵敏度下进行检测，因而即使一部分所述序列不存在也能够检测靶。多重等温扩增可以在大约25℃至大约40℃的温度范围下进行，反应时间范围为1小时到3小时。等温扩增的非限制性实例包括滚环扩增[Lizardi P.，HuangX.，Zhu Z.，Bray-Ward P.，Thomas D.，Ward D.“Mutation detectionand single molecule counting using isothermal rolling circleamplification”(“使用等温滚环扩增的突变检测和单分子计数”)Nat.Genet.1998，19：225-232]、多置换扩增[Little M.等，“Stranddisplacement amplification and homogenous real-time detectionincorporated in a second generation probe system”(“引入到第二代探针系统的链置换扩增和同源实时检测”)Clin.Chem.1999，45：777-784]和蛋白引导的DNA扩增[Blanco M.，Lazaro J.，de Vega M.，Bonnin A.，Salas M“Terminal protein-primed DNA amplification”(末端蛋白引导的DNA扩增”)Proc.Natl.Acad.Sci USA，1994，91：12198-12202]。其它靶扩增实施例包括这样的实施例——在该方案中在将靶加入到扩增混合物之前从固体载体上释放所述靶。用于释放靶核酸的非限制性方法包括碱处理、高温孵育和核糖核酸酶H处理。独特的试剂配方与所选择的靶富集步骤以及靶检测步骤相结合，允许使用相对短的扩增时间。用于等温扩增的试剂(任选包括核糖核酸酶H)可以与靶扩增同时操作，这将增加靶DNA上的引导位点的数量。这些方法允许变性和固体载体释放，使靶扩增更有效率。

下一步骤包括在所扩增的核酸中单个靶核酸序列的检测。这个步骤的灵敏度和特异性通常取决于扩增效率。通过将所扩增的靶产物或扩增子的不同部分与单个捕获序列探针杂交，来进行靶核酸的检测和说明，所述单个捕获序列探针结合至固体载体上并且特异性探针与靶序列互补形成靶复合体。靶核酸序列的不同部分与两个探针的杂交提供两个水平的特异性，保证了样品中特异性靶的检测和鉴定。

结合至固体载体(优选选择性微珠)的寡核苷酸或捕获序列探针在获取一个水平的特异性中是有用的。CSP与所扩增的靶核酸的杂交、随后紧接的微珠的选择，能够从未结合或部分结合的实体中分离靶复合体。CSP通常过量加入以保证结合。优选地，CSP和SSP没有重叠序列；但是有可能在一个CSP和SSP具有与靶核酸序列互补的重叠序列的实施例中进行所述方法。

捕获序列探针(CSP)或寡核苷酸可以被结合或连接到固相、固体载体或固体基质上，它们包括例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯或任何固体塑料材料，形状为平板、载玻片、皿、微珠、颗粒、杯子、条状物(strands)、芯片、带状物(strips)、微平板和微阵列。固相还包括玻璃微珠、玻璃试管和任何其它适当的玻璃产品。也可以使用功能化的固相如塑料或玻璃，它们已经被修饰成表面包含羧基、氨基、酰肼、醛基、核酸或核苷酸衍生物。可以使用任何固相如塑料、金属、磁性微粒或玻璃微粒、微珠、带状物、试管、载玻片、条状物、芯片、微芯片或微量板。

捕获序列探针或寡核苷酸为核酸探针，它们包含至少8个碱基，优选15至100个碱基，且更优选20至40个碱基。所述捕获序列探针优选为可鉴定的，或者通过它们在固体载体上(如亚孔平板(sub-well plate))的已知位置，或者例如当结合至微珠上时，通过可区别的有色染料。用于鉴定所述捕获序列探针的方式是本领域已知的，并且在本说明书中举例说明。

与可以连接在固体载体上的序列特异性探针的杂交，不仅允许特异性靶的鉴定，而且还为试验提供了第二个水平的特异性，使它成为更可信赖的临床试验。如果需要较低的灵敏度时，就不需要信号放大，而是使用利用连接在报道基因(生物素、荧光团、酶等)上的(信号)寡核苷酸或多聚核苷酸的检测。每个靶可以有多于1个的检测寡核苷酸。捕获寡核苷酸和检测寡核苷酸两者都可以被额外地修饰，如PNA、LNA等。寡核苷酸或核酸探针的长度范围可以从大约15个碱基到大约10,000个碱基，或者达到100％的靶长度。

信号序列探针(SSP)可以是用以形成DNA:RNA杂交体的未标记的RNA，该杂交体在检测步骤通过例如被标记的杂交体特异性结合剂进行识别。由于SSP没有被标记，因此当不与靶结合时它不会产生背景噪声，由此产生更高的特异性。例如，如果所述RNA信号探针的大小为8,000个碱基(Kb)且每个抗体结合20个碱基，那么可以获得被放大大约400倍的信号。如之前所阐述，通常信号序列探针包含至少15个碱基，但可以达到或多于大约1000个碱基，优选在大约15个碱基至100个碱基之间。信号序列探针的其它非限制性实例包括被标记的RNA探针和被标记的DNA探针。杂交不限于非重叠区域，而是实际上可以包括重叠区域。结合至固体载体上的RNA:DNA杂交复合体可以以多重的方式进行检测，例如使用PE-标记的抗体、羧化的可区别微珠和流式细胞术检测。

靶(或扩增子)检测的一个实施例利用基于液体的阵列。微珠阵列是商业可得的，并且在这个实施例中优选羧化聚苯乙烯微珠阵列。例如，96孔平板的每一个孔都有微珠集合混合物。13丛就有13个微珠集合，其中每一个微珠集合都有特异性“签名”(“signature”)，并且通过每个微珠内部的染料来提供所述签名。这些染料的比例对于每一个微珠集合来说都是特异的，并且在每个微珠集合之间能够区别。特异针对一个靶核酸的捕获序列探针(CSP)或寡核苷酸被应用或结合至一个特定微珠集合上。当所述靶被杂交至结合有CSP或寡核苷酸的微珠上时，使用互补核酸探针和被标记的DNA:RNA杂交体特异性结合剂，来选择特定的微珠集合然后进行检测。所述选择或分离可以在流式细胞仪中进行，其中所述微珠一个接一个地前进通过两个激光器：其中一个选择微珠上的所述签名，同时另一个检测由被标记的DNA:RNA杂交体特异性结合剂鉴定的靶。在这种方法中，可以区别和检测多个靶。另外，被标记的DNA:RNA试剂允许增强信号的检测，由此提高试验的特异性和灵敏度。

本发明的基于液体的微珠阵列的另外一个实施例利用了亚孔平板。亚孔平板为微量板，具有例如96个主孔，其中每一个单独的主孔被再分成多个亚孔。以前已经阐述了所述亚孔平板作为平台用于多重化[A.Roda，等，Clin.Chem 46：1654-1660，2002，通过引用并入]。然而，如之前所使用和阐述的，由于不同亚孔间的“串扰”(“cross-talk”)问题，亚孔平台的用途受到限制。然而，通过使用掩蔽物(mask)，这里所阐述的被修饰的亚孔平台大体上消除了不同亚孔间的所述串扰问题。每一个亚孔优选具有连接在所述孔上的已知的靶特异性捕获序列探针。可以在所述主孔中加入靶核酸，在此所述靶核酸杂交至与它互补的核酸探针即信号序列探针上。在靶核酸的一部分和信号序列探针之间形成DNA:RNA杂交体。捕获序列探针结合靶核酸的不同部分，从而将所述DNA:RNA杂交体捕获至固相上。如之前所阐述的，使用与靶核酸杂交的互补核酸探针和被标记的DNA:RNA杂交体特异性抗体，并通过例如已知的捕获序列探针进行靶核酸的检测。信号放大和掩蔽物的使用均使具有最小背景噪声的、特异且灵敏的靶核酸的检测能够进行，所述掩蔽物作为盖子消除了亚孔间的串扰。

可以获取很多种可用于检测和鉴定靶序列的方法，所述方法包括但不限于：斑点杂交、尼龙膜上的反向斑点杂交、载玻片阵列的杂交、芯片阵列、微珠阵列、多孔平板底部上的阵列等。用于杂交的固体载体的非限制性实例包括微珠阵列(如商业渠道可得的微珠阵列产品)、载玻片阵列、平板阵列(如微量板每一个孔的底部上的阵列)、亚孔平板(在每一个孔中具有16-64个小亚孔的微量板)和电极阵列如GenOHM系统(GeneOhmSciences，Inc.)。Drummond等，Nature Biotech，21：1192-1199(2003)。通过例如荧光、化学发光和金纳米颗粒，可以应用不同类型的报道基因以产生检测信号。如之前所讨论的，检测的方式可以包括荧光、任何基于酶的信号、化学发光或比色信号、金颗粒的光散射等。

在一个实施例中，报道基因可以连接在杂交体特异性结合剂上，例如但不限于：RNA:DNA杂交体特异性抗体(HC-Ab)、蛋白质、催化失活的核糖核酸酶H、核酸、核酸适配子或具有结合并形成三链体结构能力的寡核苷酸。每个被标记的结合剂结合DNA:RNA杂交体的核苷酸区段，例如至少20个核苷酸的长度，从而提供信号放大。

本发明的另一个实施例用于未纯化样品中多个靶DNA的多重检测，该方案包括以下步骤：1)使靶DNA变性以产生单链靶序列；2)加入RNA探针和磁性微珠，其中所述微珠之前已经被结合至杂交体特异性抗体上；3)通过洗涤除去任何未结合的靶和污染物；4)在DNA聚合酶和其他启动扩增和形成扩增子的试剂存在下，将所捕获的靶进行相对短时间的等温扩增，如1-3小时；4)使所述扩增子变性以产生单链序列；5)所扩增的靶与寡核苷酸(捕获探针)和信号序列探针杂交，所述寡核苷酸结合至固体载体上，如微珠或微量板；和6)根据捕获探针的特征通过区别靶并检测信号序列探针复合体，来检测每一个靶DNA的存在或不存在。

在本发明的一个实施例中，靶和探针的杂交可以与利用杂交体结合剂的捕获步骤在同一混合物中且在升高的温度下同时进行。在整个过程中，升高的温度可以允许增加靶捕获的特异性，同时缩短反应时间。应当理解，使用本领域技术人员所熟知且实践的多种成份、缓冲液和温度，可以改变低的、适度的且高度严紧的杂交/洗涤条件。对于另外的严紧性条件，参见T.Maniatis等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1982)。根据整体试验条件，杂交和捕获一步化还可以比依序进行杂交和捕获更有效率。

在其它核酸存在下，通过靶富集、靶扩增和靶检测对感兴趣的靶核酸进行检测的方法，提供了在同一反应样品中同时检测多个靶的、快速灵敏的方法。这种方法在临床诊断应用中是有用的，其用于鉴别多种疾病状况，例如患者是否感染了人乳头瘤病毒(HPV)并确定患者患有哪种特异性HPV类型，以便更好地对患者进行诊断和治疗。其它与特异性核酸相关的疾病在所属领域是容易得知的且可使用本发明所阐述的检测方法进行鉴定。

任何来源的纯化或未纯化形式的核酸，都可以用作试验样品。例如，试验样品可以为食品或农产品，或者人类或兽医临床样本。典型地，试验样品为生物体液如尿液、血液、血浆、血清、唾液等。可选择地，试验样品可以是怀疑带有感兴趣核酸的组织样本。试验样品中的靶核酸最初可以以离散分子存在，以便待检测的序列组成整个核酸，或者可以仅为较大分子的组分。待检测的核酸序列最初不必以纯的形式存在。试验样品可以包含核酸的复杂混合物，该混合物中的靶核酸可能与整个人类基因组DNA或RNA或致病生物体的一部分核酸序列中所包含的感兴趣基因相符合，所述生物体是临床样品中较少的组份。

试验样品中的靶核酸可以为任何来源的DNA或RNA，如信使RNA，该来源包括细菌、酵母、病毒和更高级生物体(如植物或动物)的细胞或组织。靶也可以为由RNA通过反转录合成的cDNA。提取和/或纯化这种核酸的方法为本领域所熟知。靶核酸可以为双链或单链。在本方法的一个实施例中，靶核酸为单链，或在该方法的杂交和扩增步骤之前通过常规变性技术制成单链。在一个实施例中，使用碱基变性技术或高温以使双链靶DNA变性。

当术语“寡核苷酸”在这里使用时，它指由两个或多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的核酸分子。需要的寡核苷酸可以通过任何适合的方法制备，如通过分子生物学的手段从天然存在的核酸中纯化或通过从头合成。在这里阐述了寡核苷酸和核酸探针的非限制性实例。

核酸探针是与试验样品中互补RNA或DNA序列杂交的核酸序列。所述探针的检测表明试验样品中存在特定的核酸序列。可以直接或间接地检测所述核酸探针。在一个实施例中，靶特异性杂交捕获方法应用了两种类型的核酸序列探针：捕获序列探针(CSP)和信号序列探针(SSP)。

捕获序列探针或寡核苷酸包括这样的核酸序列：其能够与靶核酸的独特区域杂交并被捕获到固相上或者其能够捕获靶核酸序列。在所述检测方法中使用的CSP可以为DNA、RNA、肽核酸(PNA)或其它核酸类似物。PNA为糖-磷酸骨架被聚酰胺或“伪肽”骨架取代的寡核苷酸。在一个优选实施例中，CSP为DNA。CSP的最小长度为至少8个碱基，优选在15至100个碱基之间，并且更优选在20至40个碱基之间。CSP与其要杂交的靶核酸序列大体互补。CSP的序列优选至少75％与靶杂交区域互补，更优选地，与该序列100％互补。还优选的是，CSP包含与试验样品中认为存在的、不需要的非靶序列相比，小于或等于75％的序列同一性，更优选小于50％的序列同一性。靶核酸中与CSP结合的序列优选为至少大约12个碱基，更优选20-40个碱基。与CSP杂交的靶核酸序列优选为单一序列或簇特异性序列。簇特异性序列为多个相关序列，它们形成离散的簇。例如，CSP可以包含这样的序列，该序列识别特异的人乳头瘤病毒类型，例如但不限于HPV-16、HPV-18和HPV-31。

在一个实施例中，在所述检测方法中使用的CSP可以在核酸中包含一个或多个修饰，该修饰允许将探针特异性地捕获至固相上。例如，可以通过本领域技术人员所熟知的方法将至少一个配体给CSP加标签来对CSP进行修饰，所述方法包括例如缺口翻译、化学或光化学掺入。另外，可以在多个位置利用一种或多种类型的标记物给CSP加标签。例如，可以利用结合链霉亲和素的生物素、结合抗地高辛的地高辛、或结合抗-DNP的2，4-二硝基苯酚(DNP)，给CSP加标签。也可以使用荧光团来修饰探针。荧光团的实例包括荧光素和衍生物、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、藻蓝蛋白、罗丹明、德克萨斯红或其它专有的荧光团。所述荧光团通常通过化学修饰连接并与荧光团特异性抗体结合，如抗荧光素。本领域技术人员应当理解：也可以通过掺入修饰的碱基给CSP加标签，所述修饰的碱基包含由特异性抗体识别的任何化学基团。用于捕获至包被有底物的固相上的其它标签和核苷酸序列加标签的方法是本领域技术人员所熟知的。核酸标记物的综述可以在Landegren等的“DNA Diagnostics-Molecular Techniques andAutomation”(“DNA分子诊断技术和自动化”)Science，242：229-237(1988)的文章中找到，该文章通过引用结合入本文。在另一个实施例中，利用生物素在核苷酸序列的5’和3’末端给CSP加标签。在另一个实施例中，CSP没有被修饰，但是由于CSP所包含的序列能够与基质杂交，因而CSP被捕获至固相基质上。

在所述检测方法中使用的SSP可以是DNA或RNA。信号序列探针包含能够与靶核酸中与CSP识别的独特区域相邻的区域杂交的核酸序列。在本发明的一个特定的实施例中，SSP和靶核酸形成DNA:RNA杂交体。因此，在这个实施例中，如果靶核酸为DNA，那么优选的SSP为RNA。类似地，如果靶核酸为RNA，那么优选的SSP为DNA。SSP的长度通常为至少15个碱基。然而，SSP的长度可以达到或大于1000个碱基。优选更长的SSP。SSP可以包括单个核酸片段，或多个较小的核酸片段，它们每一个的长度都优选在15至100个碱基之间。

选择CSP和SSP的序列，以便它们不与靶核酸的同一个区域杂交或者不相互杂交。为了消除CSP和SSP之间的竞争，可以对与靶核酸序列的区域相对应的SSP序列和CSP序列进行修饰。例如，SSP可以具有CSP所不包括的缺失。另外，选择CSP和SSP以便与靶中的区域杂交，例如所述区域彼此相距50,000个碱基。靶核酸中与CSP杂交的序列和与SSP杂交的序列之间的距离优选在大约1至50,000个碱基之间。更优选地，CSP和SSP在靶核酸上之间的距离小于3,000个碱基，并且最优选地，所述距离小于1,000个碱基。

在另一个实施例中，在所述检测方法中使用的SSP的一部分与单链靶核酸序列形成DNA:RNA杂交体，该杂交体通过DNA:RNA杂交体特异性结合剂进行检测，并且SSP另一部分能够与靶核酸杂交。所述SSP可以通过如下制备：首先将与靶核酸中的序列互补的单链DNA序列克隆至单链DNA载体中，然后杂交与DNA载体序列互补的RNA以便产生DNA:RNA杂交体。例如，如果M13被用作DNA载体，M13RNA与载体中的M13DNA序列杂交以产生DNA:RNA杂交体。由此产生的SSP形成了DNA:RNA杂交体部分和能够与靶核酸中的序列杂交的单链部分。单链DNA的长度应该为至少10个碱基，并且长度可以达到或大于1000个碱基。可选择地，SSP的DNA:RNA杂交体部分可以在SSP的单链部分与靶核酸杂交的反应中或反应后形成。SSP可以为线性的、环状的或者这两种或更多形式的组合。SSP的DNA:RNA杂交体部分使用例如DNA:RNA杂交体特异性抗体来提供用于被捕获的杂交体检测的放大信号，所述DNA:RNA杂交体特异性抗体通过这里所阐述的被标记的实体进行标记或者识别。

在另一个实施例中，所述检测方法中使用的SSP为不含能够与靶核酸杂交的序列的分子。在这个实施例中，使用了桥探针(bridge probe)，该桥探针包含能够与靶核酸杂交的序列和能够与SSP杂交的序列。桥探针可以为DNA、RNA、肽核酸(PNA)或其它核酸类似物。

在另一个实施例中，SSP的一部分与互补核酸探针形成DNA:RNA杂交体，并且SSP的单链部分包含与桥探针中的序列互补的序列。能够与靶核酸和SSP两者杂交的桥探针，作为中间体用于将SSP连接至靶核酸上。通过可以被标记实体标记或检测的DNA:RNA杂交体特异性结合剂来检测DNA:RNA杂交体。CSP与靶核酸序列的不同部分杂交，由此将靶、桥探针和DNA:RNA杂交复合体捕获至固相或固体载体上。可以如以上所阐述的制备SSP。

在另一个实施例中，在一个靶核酸检测方法中所使用的SSP包含多组重复序列，所述重复序列与能够与桥探针杂交的单链RNA序列互补。含与所述重复序列互补的序列的DNA寡核苷酸探针可以被用于与SSP杂交，以产生信号放大所需要的DNA:RNA双链体。

在另一个实施例中，除了包含能够与靶核酸杂交的序列外，桥探针还包含聚(A)尾。在这个实施例中所使用的SSP包含聚(dT)DNA序列。因此，桥探针能够通过它的聚(A)尾与SSP杂交。含聚(A)序列的RNA探针可以用于与SSP中剩余的聚(dT)DNA序列杂交，以形成DNA:RNA杂交体。含聚(dT)序列的SSP和含聚(A)序列的RNA探针优选长度为100至5,000个碱基。

如同使用以上所阐述的方法和/或本领域中已知的方法的CSP一样，本发明的检测靶核酸序列的方法中所使用的SSP可以为未修饰的或修饰的。在优选的实施例中，SSP为未共价修饰的探针。

应当理解，在本发明的检测方法中可以应用多个CSP和/或SSP。

在另一个实施例中，包含靶核酸的两个或多个不同区域的互补序列的寡核苷酸探针被融合在一起，并被用作本发明的方法中的捕获序列探针。可选择地，可以设计并产生单个探针，它包含与单个或多个靶核酸互补的序列。这里这种类型的探针也被称为“融合”CSP。当以同样的浓度使用时，所述融合捕获序列探针与两个未融合的CSP的组合一样有效。

本发明的核酸探针可以通过本领域已知的任何合适的方法生产，包括例如化学合成、从天然存在的来源中分离、重组生产和不对称PCR(McCabe，1990In：PCR Protocols：Aguide to methods and applications(在PCR实验方案：方法和应用指南中)，San Diego，CA.，Academic Press，76-83)。如同在微芯片上制备寡核苷酸微阵列的情况一样，可以优选使用一个或多个区段并且随后连接所述区段来化学合成探针。Narang等(1979Meth.Enzymol.68：90)，Brown等(1979Meth.Enzymol.68：109)和Caruthers等(1985Meth.Enzymol 154：287)阐述了几种化学合成方法，所有这些文章通过引用结合入本文。可选择地，克隆方法可以提供方便的核酸片段，可以分离所述片段以作为启动子引物使用。在与靶核酸杂交前，使用例如常规变性方法，首先使双链DNA探针提供单链。

杂交在本领域技术人员所熟知的标准杂交条件下进行。探针与核酸序列杂交的反应条件随探针变化而变化，其取决于多种因素，如探针长度、序列中的G核苷酸和C核苷酸的数量，以及杂交反应所使用的缓冲液的组成。通常本领域技术人员所了解的适度严紧杂交条件为：低于碱基完全配对的双链DNA的解链温度的、大约25℃的条件。通常，通过利用具有更高温度的孵育条件，换句话说更严紧的条件，来获取更高的特异性。熟知的Sambrook等的试验手册，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，(分子克隆：实验手册)第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约(1990)(通过引用结合入本文)的第11章，很详细地阐述了寡核苷酸探针的杂交条件，包括所牵涉的因素和保证特异性杂交所必须的严紧水平的阐述。通常，杂交在缓冲水溶液中进行，选择针对所述杂交的条件如温度、盐浓度和pH以提供足够的严紧性，以便探针与它们各自的靶核酸序列而非其它任何序列特异地杂交。

通常，在以下条件下探针和靶之间的杂交效率得到了改善：所加入的探针的量相对模板是摩尔过量的，优选2到10⁶摩尔过量，更优选10³到10⁶摩尔过量。为了有效的捕获，所提供的每种CSP在最终杂交溶液中的浓度为至少25fmole/ml(25pM)，优选在25fmole/ml至10⁴fmole/ml(10nM)之间。每种SSP在最终杂交溶液中的浓度为至少15ng/ml，优选150ng/ml。表A显示了以ng/ml表示的SSP浓度至摩尔浓度的转换。

表A

在检测步骤中，可以同时或以任一顺序连续地进行CSP和SSP与靶核酸的杂交。在一个实施例中，CSP与靶核酸的杂交和SSP与靶核酸的杂交同时进行。在一个实施例中，所形成的DNA:RNA杂交体然后可以被捕获至固相上。可以利用底物包被所述固相，所述底物与连接在CSP上的配体特异性结合。靶核酸序列的一部分和SSP形成DNA:RNA杂交体，同时靶核酸序列的另外部分与连接在固相上的CSP杂交。在另一个实施例中，在CSP与靶核酸的杂交之后进行SSP与靶核酸的杂交。在这种情况下，CSP可以在杂交之前或杂交之后固定在固相上。CSP和靶核酸序列两者都可以在SSP杂交反应的过程中结合至固相上。

本领域的技术人员应当理解，固相、固体载体或固体基质可以交换使用，并且包括例如玻璃、硅、金属、硝化纤维素、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯或任何固体塑料材料，形状为平板、载玻片、皿、微珠、超微珠(microbeads)、颗粒、微粒、杯子、试管、载玻片、条状物、芯片、微芯片、带状物、膜、微平板、带有亚孔的微量板和微阵列。固相也包括玻璃微珠、玻璃试管和任何其它适当的玻璃产品。也可以使用功能化的固相如塑料或玻璃，所述塑料或玻璃已经被修饰以便其表面含羧基、氨基、酰肼、醛基、核酸或核苷酸衍生物。

在一个实施例中，利用生物素标记CSP并且应用链霉亲和素包被或亲和素包被的固相来捕获杂交体。在另一个实施例中，使用了链霉亲和素包被的微量板或微平板。这些平板可以被被动地或共价地包被。另一个实施例使用了微量板，其中每个单独的孔都有几个亚孔，CSP单独连接在每个亚孔中。另一个实施例通过任何已知的且常用的结合方法，如使用间隔子或连接体来应用结合至微珠上的CSP。当CSP被结合至固体载体上时，所述CSP可以用于捕获和/或选择与其互补的靶核酸。

可以通过本领域熟知的常规方式检测所捕获的DNA:RNA杂交体。可以使用被标记的或可区别的DNA:RNA杂交体特异性结合剂直接或间接地检测DNA:RNA杂交体，所述特异性结合剂如特异于DNA:RNA杂交体的被标记的单克隆或多克隆抗体或其片段、特异于一个或多个连接在SSP上的配体的抗体、被标记的抗体，或者SSP本身可检测的修饰。

一个优选的方法通过使用DNA:RNA杂交体特异性抗体检测所捕获的杂交体。在这个实施例中，DNA:RNA杂交体特异性抗体优选利用酶、荧光分子或生物素-亲和素物进行标记，且优选为非放射活性的。所述标记可以通过本领域已知的常规手段如比色计、光度计或荧光检测器进行直接或间接地检测。一个优选的标记是例如碱性磷酸酶。也可以应用本领域技术人员已知的其它标记作为检测所结合的双链杂交体的手段。通过本领域常规使用的方法进行检测，例如在Coutlee等的J.Clin.Microbiol.27：1002-1007(1989)中所阐述的比色法或化学发光法，通过引用并入。优选地，通过加入可以被碱性磷酸酶激活的底物利用化学发光法，来检测被结合的碱性磷酸酶物。被碱性磷酸酶激活的化学发光底物是本领域所熟知的。

优选通过在孵育步骤的过程中将所结合的DNA:RNA杂交体特异性结合剂，例如但不限于DNA:RNA杂交体特异性抗体，结合至DNA:RNA杂交体上，来实现所捕获的DNA:RNA杂交体的检测。在一个实施例中，所述DNA:RNA杂交体特异性抗体结合至固相上，如顺磁性微珠。通过将结合至DNA:RNA杂交体特异性抗体上的顺磁性微珠放置在磁场力中，从而捕获所述DNA:RNA杂交体，然后清洗表面以除去任何过量的抗体和其它未被杂交的物质。这个步骤富集或纯化了靶核酸序列。这些靶富集技术是本技术领域已知的。例如，可以使用重复吸管或注射器、由分解控制器调控的简单的泵或通过带有连接管道的贮器的重力流，进行人工洗涤。也可以使用商业可得的有效的管子洗涤系统。

在本发明中有用的捕获序列探针的非限制性实例包括那些具有针对HSV-1的序列和针对HSV-2的序列的捕获序列探针。针对HPV的CSP包括那些具有SEQID NO：1-64的CSP。这些序列所涵盖的HPV类型包括：HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73和HPV82，其中几个为高危HPV。

在另一个实施例中，所述方法除了CSP和SSP外还应用了阻断剂探针。阻断剂探针包含与CSP的序列大体互补的序列。阻断剂探针的序列与CSP序列的互补优选为至少大约75％，更优选与CSP 100％互补。在杂交反应混合物中加入所述阻断剂探针，抑制了未杂交的CSP与靶中存在的交叉反应性核酸序列的杂交，并且因此提高检测的特异性。通常，阻断剂探针为至少大约5个碱基至大约12个碱基。在本发明的一个实施例中，杂交反应中阻断剂探针的浓度优选过量于CSP和SSP的浓度。优选地，阻断剂探针以大约2倍的摩尔过量存在，虽然它可以以达到10,000倍的摩尔过量存在。阻断剂探针可以是DNA、RNA、肽、非特异性核酸(PNA)或其它核酸类似物。

在一个实施例中，使用与全长或几乎全长的CSP互补的阻断剂探针。在CSP、SSP和靶核酸之间形成杂交体的反应之后，可以在反应中加入一个或多个阻断剂探针并使杂交持续需要的时间。然后如以上所阐述的方法检测杂交产物。

在另一个实施例中，使用了仅与CSP的一部分互补且比CSP短的阻断剂探针。与CSP相比，这些阻断剂探针具有更低的解链温度。优选地，所述阻断剂探针的解链温度比CSP的解链温度低10度。在这个实施例中，阻断剂探针优选地与CSP和SSP同时加入到靶核酸中。由于阻断剂探针具有比CSP更低的解链温度，因而选择杂交的起始温度以便阻断剂探针不干扰CSP与其靶序列的杂交。然而，当杂交混合物的温度被调整至低于用于靶杂交的温度时，阻断剂探针与CSP杂交并有效地阻止CSP与交叉反应性核酸序列的杂交。例如，在杂交捕获过程中，当杂交产物在链霉亲和素包被的微量板上进行室温孵育时，可以加入阻断剂探针。阻断剂探针的非限制性实例见表2。

以下实施例举例说明本发明的扩增方法和检测试验以及试剂盒的使用。这些实施例仅用于说明和解释本发明，且不应以任何方式限制本发明的范围。这里所阐述的所有参考文献通过引用全部清楚地结合入本说明书。

实施例1

靶特异性杂交捕获(TSHC)试验方案

使用阴性对照培养基(Digene Corp.，Gaithersburg，MD)或阴性颈部样本(Digene Corp)对已知浓度的1-型单纯疱疹病毒(HSV-1)和2-型单纯疱疹病毒(HSV-2)病毒颗粒(Advanced Biotechnologies，Inc.，Columbia，MD)或临床样品进行稀释。制备各种稀释液并等分至单个微量离心管(microfuge tube)中。加入一半体积的变性试剂5100-0431(DigeneCorp.)。试验样品在65℃孵育45分钟以使样品中的核酸变性。

变性之后，向样品中加入含信号序列探针(SSP)(每份600ng/ml)和捕获序列探针(CSP)(每份2.5pmole/ml)的杂交溶液，并在74℃孵育1小时。然后向杂交混合物中加入阻断剂探针溶液，并在74℃孵育15分钟，所述阻断剂探针溶液含一体积的4x探针稀释液(Digene Corp.)、一体积的变性试剂和两体积的阴性对照培养基。

在第二系列试验中，核酸变性后，将含SSP(每份600n/ml)、CSP(每份2.5pmole/ml)和阻断剂探针(每份250pmole/ml)的杂交溶液加入到样品中，并在74℃孵育1小时。

含反应混合物的试管被冷却至室温，持续5分钟，从每个试管中取出等分试样并转移至96孔链霉亲和素捕获平板(Digene Corp.)的单个孔中。将所述平板在室温下以1100rpm摇动1小时。然后轻轻倒出上清液，并用SNM洗涤缓冲液(Digene Corp.)洗涤该板两次，并且暂时倒置以除去残留的洗涤缓冲液。然后向每孔中加入碱性磷酸酶抗-RNA/DNA抗体DR-1试剂(Digene Corp.)，并在室温下孵育30分钟。然后对各孔进行多次洗涤，步骤包括：1)用Sharp洗涤缓冲液(Digene Corp.)在室温下洗涤3次；2)将所述平板与Sharp洗涤缓冲液在加热块(heat block)上60℃孵育10分钟；3)在室温下用Sharp洗涤缓冲液洗涤两次；4)在室温下用SNM洗涤缓冲液(Digene Corp.)洗涤一次。除去残留液体之后，向每孔中加入化学发光底物5100-0350(Digene Corp.)，并在室温下孵育15分钟。然后在平板发光计上读取单个孔以获取相对光单位(RLU)信号。

利用含阴性对照培养基或已知的HSV阴性颈部样本的溶液作为试验样品的阴性对照。以试验样品中获得的平均RLU与阴性对照的平均RLU的比来计算信噪比(S/N)。信噪比被用作测定捕获效率和靶核酸检测的基础。任意指定2或更大的S/N值作为阳性信号，而小于2的S/N值被认为是阴性。通过获得重复试验的标准偏差，除以平均值并乘以100以得到的百分数值来计算变异系数(CV)，变异系数测定的是一个样品组中试验的变异性。

使用Cook等(1988Nucl.Acid.Res.，16：4077-95)所阐述的方法合成在试验中使用的捕获序列探针和阻断剂探针。除非另有指出，否则在这里所阐述的实验中所使用的捕获序列探针在5’和3’末端被生物素标记。

在试验中使用的信号序列探针为RNA探针，这些探针使用Yisraeli等(1989，Methods in EnzymoL，180：42-50)所阐述的方法进行制备。

对所有CSP进行试验，以确定它们在这里所阐述的类型特异性杂交捕获中的类型特异性能力。下列的CSP，即SEQ ID NO：36-56不显示与其它类型的交叉反应性特征，并且可以在试验中使用。

表1：HPV的捕获序列探针

探针	序列	大小(bp)	HPV类型和序列位置
				ZL-1	GTACAGATGGTACCGGGGTTGTAGAAGTATCTG[SEQ ID NO：1]；	33	HPV165360-5392
ZL-4	CTGCAACAAGACATACATCGACCGGTCCACC[SEQ ID NO：2]	31	HPV16495-525
				DP-1	GAAGTAGGTGAGGCTGCATGTGAAGTGGTAG[SEQ ID NO：3]	31	HPV165285-5315
DP-4	CAGCTCTGTGCATAACTGTGGTAACTTTCTGGG[SEQ ID NO：4]	33	HPV16128-160
				SH-1	GAGGTCTTCTCCAACATGCTATGCAACGTCCTG[SEQ ID NO：5]	33	HPV31505-537
SH-4	GTGTAGGTGCATGCTCTATAGGTACATCAGGCC[SEQ ID NO：6]	33	HPV315387-5419
				VS-1	CAATGCCGAGCTTAGTTCATGCAATTTCCGAGG[SEQ ID NO：7]	33	HPV31132-164
VS-4	GAAGTAGTAGTTGCAGACGCCCCTAAAGGTTGC[SEQ ID NO：8]	33	HPV315175-5207

AH-1	GAACGCGATGGTACAGGCACTGCAGGGTCC[SEQ ID NO：9]	30	HPV185308-5337
				AH-2	GAACGCGATGGTACAGGCACTGCA[SEQ ID NO：10]	24	HPV185314-5337
AL-1	ACGCCCACCCAATGGAATGTACCC[SEQ ID NO：11]	24	HPV184451-4474
				PA-4	TCTGCGTCGTTGGAGTCGTTCCTGTCGTGCTC[SEQ ID NO：12]	32	HPV18535-566
18-1AB	*(TTATTATTA)CTACATACATTGCCGCCATGTTCGCCA[SEQ ID NO：13]	36	HPV181369-1395
				18-2AB	(TTATTATTA)TGTTGCCCTCTGTGCCCCCGTTGTCTATAGCCTCCGT [SEQ ID NO：14]	46	HPV181406-1442
18-3AB	(TTATTATTA)GGAGCAGTGCCCAAAAGATTAAAGTTTGC [SEQ ID NO：15]	38	HPV187524-7552
				18-4AB	(TTATTATTA)CACGGTGCTGGAATACGGTGAGGGGG TG [SEQ ID NO：16]	37	HPV183485-3512
18-5AB	(TTATTATTA)ACGCCCACCCAATGGAATGTACCC[SEQ ID NO：17]	33	HPV184451-4474
				18-6AB	(TTATTATTA)ATAGTATTGTGGTGTGTTTCTCACAT[SEQ ID NO：18]	35	HPV1881-106
18-7AB	(TTATTATTA)GTTGGAGTCGTTCCTGTCGTG[SEQ ID NO：19]	30	HPV18538-558
				18-8AB	(TTATTATTA)CGGAATTTCATTTTGGGGCTCT[SEQ ID NO：20]	31	HPV18634-655

PE-1	GCTCGAAGGTCGTCTGCTGAGCTTTCTACTACT[SEQ ID NO：21]	33	HPV18811-843
				PZ-2	GCGCCATCCTGTAATGCACTTTTCCACAAAGC[SEQ ID NO：22]	32	HPV4577-108
PZ-5	TAGTGCTAGGTGTAGTGGACGCAGGAGGTGG[SEQ ID NO：23]	31	HPV455295-5325
				CS-1	GGTCACAACATGTATTACACTGCCCTCGGTAC[SEQ ID NO：24]	32	HPV45500-531
CS-4	CCTACGTCTGCGAAGTCTTTCTTGCCGTGCC[SEQ ID NO：25]	31	HPV45533-563
				PF-1	CTGCATTGTCACTACTATCCCCACCACTACTTTG[SEQ ID NO：26]	34	HPV451406-1439
PF-4	CCACAAGGCACATTCATACATACACGCACGCA[SEQ ID NO：27]	32	HPV457243-7274
				PA-1	GTTCTAAGGTCCTCTGCCGAGCTCTCTACTGTA[SEQ ID NO：28]	33	HPV45811-843
45-5AB	(TTATTATTA)TGCGGTTTTGGGGGTCGACGTGGAGGC[SEQ ID NO：29]	36	HPV453444-3470
				45-6AB	(TTATTATTA)AGACCTGCCCCCTAAGGGTACATAGCC[SEQ ID NO：30]	36	HPV454443-4469
45-8AB	(TTATTATTA)CAGCATTGCAGCCTTTTTGTTACTTGCTTGTAATAGCTCC[SEQ ID NO：31]	49	HPV451477-1516
				45-9AB	(TTATTATTA)ATCCTGTAATGCACTTTTCCACAAA[SEQ ID NO：32]	34	HPV4579-103

45-10AB	(TTATTATTA)GCCTGGTCACAACATGTATTAC[SEQ ID NO：33]	31	HPV45514-535
				45-11AB	(TTATTATTA)CAGGATCTAATTCATTCTGAGGTT[SEQ ID NO：34]	33	HPV45633-656
ON-1	TGCGGTTTTGGGGGTCGACGTGGAGGC[SEQ ID NO：35]	27	HPV453444-3470
				ZZ-1	GGCGCAACCACATAACACACAGAACCACAAAAC[SEQ ID NO：36]	33	HPV185285-5315
DXA-1	GTTCTACACGGGTTTGCAGCACGATCAACAACG[SEQ ID NO：37]	33	HPV331175-1207
				PRA-1	CGCTGCTTGTGGTGGTCGGTTATCGTTGTCTG[SEQ ID NO：38]	32	HPV333389-3420
TT-1	GACGTAGTGTCGCCTCACATTTACAACAGGAC[SEQ ID NO：39]	32	HPV35732-763
				TT-7	CTCGCTTGGTGGGGTTGTAGGGGAGCTCGG[SEQ ID NO：40]	30	HPV353432-3461
NH-1	GCTGTAGTTGTCGCAGAGTATCCCGTGAGG[SEQ ID NO：41]	30	HPV39833-862
				FT-7	GTGAGCCTGTGTTATATGTAGTGCCCGAATCCC[SEQ ID NO：42]	33	HPV395358-5390
SHA-4	CCACCTCCTGCGTCCACTACACCTAGCACTA[SEQ ID NO：43]	31	HPV455295-5325
				SHA-1	TGCGTGCGTGTATGTATGAATGTGCCTTGTGG[SEQ ID NO：44]	32	HPV457243-7274

OCA-1	AATTAGCGCATTGCCCCGTCCAACGTCCCG[SEQ ID NO：45]	30	HPV51482-511
				TAA-7	CGCCGTGCACGTGTAGCCACCATATTTAATCAC[SEQ ID NO：46]	33	HPV514124-4156
LFA-1	CGAATTGTGTGAGGTGCTGGAAGAATCGGTGC[SEQ ID NO：47]	32	HPV52140-171
				PTA-7	GATCGTTCACAACTTTTACCTGCACCGGATCC[SEQ ID NO：48]	32	HPV525066-5097
ZOA-1	CTAGGTTCTCTAGATGTTTGTCTCCAGCACCCC[SEQ ID NO：49]	33	HPV56521-553
				NAA-4	CTGTCGGTATTGTCTGTGTCGCTGATGTGTG[SEQ ID NO：50]	31	HPV563543-3573
LA-1	GATACACACACATTTGCAGCCCGGTCCACACA[SEQ ID NO：51]	32	HPV581180-1211
				LA-7	GGTGGCAAAGGACGTATGTGAGTGCAGAGGAC[SEQ ID NO：52]	32	HPV585376-5407
ZV-4	GCGTTGCGGAGGGGTATGATAGTTGCTCAGAAG[SEQ ID NO：53]	33	HPV593385-3417
				ZV-10	GTCTAGGCGTGTAGGAGGAAACAAGATGGGG[SEQ ID NO：54]	31	HPV597543-7573
PNA-1	CTGAACACAGCAGTTCTCTATACCAATGGCGCTATTTC[SEQ ID NO：55]	38	HPV6881-118
				PNA-4	TTGGTTGCCCCTGAGCAGTCGGACCCTATGGATA[SEQ ID NO：56]	34	HPV685211-5244

CDA-4	GCGCCGCATTGCTGCACCTCGTTTATATAGCAGGGCATTTTC[SEQ ID NO：57]	42	HPV824827-4868
				CDA-11	CCTGGCGCATGTCATACACACCACATTACTC[SEQ ID NO：58]	31	HPV827596-7626
CTA-1	CACGAAGTGTCAGTGCACAGTATGCCTTGC[SEQ ID NO：59]	30	HPV736006-6045
				CTA-16	GCCATGTACTTCACAAACTGTTAATACTGGTGATTGTCCC[SEQ ID NO：60]	40	HPV73720-749
DLA-14	CCTACACAGTACAAGTGGAGGCCATCACCCG[SEQ ID NO：61]	31	HPV263566-3596
				RBA-16	GTCTGACACATACTGTTGTAACCCATAGTTAAACACAGG[SEQ ID NO：62]	39	HPV267759-7797
BNA-1	GCTGTCTCCCTGTCTTCCTGTGTATTGTTTAT AAGTGTATT[SEQ ID NO：63]	41	HPV661051-1092
				DLA-32	GTACAGCACTAAAATGGAGTTTGGTGTGTTACTATAGTGCATAC[SEQ ID NO：64]	44	HPV667420-7464

*括号中的序列为HSV未指出的“尾”序列

表2：HPV的阻断剂探针

探针	序列	大小	与CSP结合
				PA-6	ACTCCAACGACGCAGA[SEQ ID NO：65]	16	PA-4
ZZ-2	(TTTTGTGGTTCTGTGTG[SEQ ID NO：66]	17	ZZ-1
				ZZ-3	TTATGTGGTTGCGC[SEQ ID NO：67]	14	ZZ-1
DXA-2	CGTTGTTGATCGTGC[SEQ ID NO：68]	15	DXA-1
				DXA-3	TGCAAACCCGTGTAG[SEQ ID NO：69]	15	DXA-1

PRA-2	CAGACAACGATAACCG [SEQ ID NO：70]	16	PRA-1
				PRA-3	ACCACCACAAGCAGC [SEQ ID NO：71]	15	PRA-1
TT-2	GTCCTGTTGTAAATGTG [SEQ ID NO：72]	17	TT-1
				TT-3	AGGCGACACTACGTC [SEQ ID NO：73]	15	TT-1
TT-8	CGAGCTCCCCTACAA [SEQ ID NO：74]	15	TT-7
				TT-9	CCCCACCAAGCGA [SEQ ID NO：75]	13	TT-7
NH-2	CCTCACGGGATACTC [SEQ ID NO：76]	15	NH-1
				NH-3	TGCGACAACTACAGC [SEQ ID NO：77]	15	NH-1
FT-8	GGATTCGGGCACTA [SEQ ID NO：78]	14	FT-7
				FT-9	CATATAACACAGGCTCAC [SEQ ID NO：79]	18	FT-7
SHA-5	TAGTGCTAGGTGTAGTGG [SEQ ID NO：80]	18	SHA-4
				SHA-6	ACGCAGGAGGTGG [SEQ ID NO：81]	13	SHA-4
SHA-2	TACATACACGCACGCA [SEQ ID NO：82]	16	SHA-1
				SHA-3	CCACAAGGCACATTCA [SEQ ID NO：83]	16	SHA-1
TAA-8	GCTACACGTGCACGGCG [SEQ ID NO：84]	17	TAA-7
				TAA-9	GTGATTAAATATGGTGG [SEQ ID NO：85]	17	TAA-7
OCA-2	GGGACGTTGGACG [SEQ ID NO：86]	13	OCA-1
				OCA-3	GGCAATGCGCTAAT [SEQ ID NO：87]	14	OCA-1
LFA-2	CACCGATTCTTCCAG [SEQ ID NO：88]	15	LFA-1
				LFA-3	CACCTCACACAATTCG [SEQ ID NO：89]	16	LFA-1
PTA-8	GGATCCGGTGCAG [SEQ ID NO：90]	13	PTA-7
				PTA-9	GTAAAAGTTGTGAACGATC [SEQ ID NO：91]	19	PTA-7
ZOA-2	GGTGCTGGAGACAA [SEQ ID NO：92]	14	ZOA-1
				ZOA-3	ACATCTAGAGAACCTAG [SEQ ID NO：93]	17	ZOA-1

NAA-5	CACACATCAGCGACA [SEQ ID NO：94]	15	NAA-4
				NAA-6	CAGACAATACCGACAG [SEQ ID NO：95]	16	NAA-4
LA-2	TGTGTGGACCGGG [SEQ ID NO：96]	13	LA-1
				LA-3	CTGCAAATGTGTGTGTAT [SEQ ID NO：97]	18	LA-1
LA-8	GTCCTCTGCACTCACAT [SEQ ID NO：98]	17	LA-7
				LA-9	ACGTCCTTTGCCAC [SEQ ID NO：99]	14	LA-7
ZV-5	TTCTGAGCAACTATCATAC [SEQ ID NO：100]	19	ZV-4
				ZV-6	CCCTCCGCAACG[SEQ ID NO：101]	12	ZV-4
ZV-11	CCCCATCTTGTTTCC [SEQ ID NO：102]	15	ZV-10
				ZV-12	TCCTACACGCCTAGAC [SEQ ID NO：103]	16	ZV-10
PNA-2	TATAGAGAACTGCTGTGTTC [SEQ ID NO：104]	20	PNA-1
				PNA-3	GAAATAGCGCCATTG [SEQ ID NO：105]	15	PNA-1
PNA-5	CTCAGGGGCAACCA [SEQ ID NO：106]	14	PNA-4
				PNA-6	ATCCATAGGGTCCGAC [SEQ ID NO：107]	16	PNA-4
CDA-5	CAATGCGGCGC [SEQ ID NO：108]	11	CDA-4
				CDA-6	TATAAAC GAGGTGCAG [SEQ ID NO：109]	16	CDA-4
CDA-7	GAAAATGCCCTGCTA [SEQ ID NO：110]	15	CDA-4
				CDA-12	ACATGCGCCAGG[SEQ ID NO：111]	12	CDA-11
CDA-13	GAGTAATGTGGTGTGTATG [SEQ ID NO：112]	19	CDA-11
				CTA-2	GCAAGGCATACTGTG [SEQ ID NO：113]	15	CTA-1
CTA-3	CACTGACACTTCGTG [SEQ ID NO：114]	15	CTA-1
				CTA-17	GGACAATCACCAGTATTA [SEQ ID NO：115]	18	CTA-16
CTA-18	AGTTTGTGAAGTACATGG [SEQ ID NO：116]	18	CTA-16
				DLA-15	CGGGTGATGGCC [SEQ ID NO：117]	12	DLA-14

DLA-16	CCACTTGTACTGTGTAGG[SEQ ID NO：118]	18	DLA-14
				RBA-17	CTGTGTTTA ACT ATGGGT[SEQ ID NO：119]	18	RBA-16
RBA-18	TACAACAGTATGTGTCAGAC[SEQ ID NO：120]	20	RBA-16
				BNA-2	AAGACAGGGAGACAGC[SEQ ID NO：121]	16	BNA-1
BNA-3	CTTATAAACAATACACAGG[SEQ ID NO：122]	19	BNA-1
				DLA-33	ATGCACTATAGTAACACACC[SEQ ID NO：123]	20	DLA-32
DLA-34	ACTCCATTTTAGTGCTGTA[SEQ ID NO：124]	19	DLA-32

实施例2

CSP和SSP的靶位点之间的距离对捕获效率的影响

评价捕获序列探针(CSP)和信号序列探针(SSP)在HSV-1靶核酸上的杂交位点之间的距离对捕获效率的影响。测定与距离SSP杂交位点0.2kb、3kb、18kb、36kb和46kb的HSV-1核酸序列杂交的CSP。应用实施例1中所阐述的一般的TSHC方法。捕获效率分别为100％、50％、30％、19％和7％(表3)。当所述距离从0.2kb增加至46kb时，观察到相对捕获效率的稳定下降。

表3：靶位点之间的距离对捕获效率的影响

CSP	SSP	靶位点之间的距离	相对捕获效率

BRH 19	H19	0.2Kb	100％
				F15R	H19	3Kb	50％
F6R	RH5B	18Kb	30％
				F15R	RH5B	36Kb	19％
F6R	H19	46Kb	7％

实施例3

在HSV-1的TSHC检测中各种CSP和SSP的捕获效率

在利用TSHC的HSV-1检测中，对捕获序列探针(CSP)针对四个HSV-1特异性信号序列探针(SSP)：H19、RH5B、RH3和R10中的每一个的捕获效率进行评价。用于设计捕获序列探针的标准为：1)在HSV-1核酸序列上，CSP的杂交位点在SSP的杂交位点的5’或3’端的1kb以内，优选在0.5kb以内；并且2)CSP包含HSV-1独有的序列，该序列没有大于10个碱基的HSV-2同源序列的延伸片段(stretches)。设计CSP以使其靶向与SSP杂交位点相邻的5’和3’区域，每个SSP优选带有5’CSP和3’CSP。商业可得的OMIGA软件(Oxford Molecular Group；Campbell，CA)作为鉴定这些位点的手段。设计CSP的解链温度(Tm)在70℃至85℃之间。应用在实施例1中所阐述的一般的TSHC方法。对H19的11个CSP(结合在6个不同的位点上)、RH5B的6个CSP(结合在3个独特的位点上)、RH3的6个CSP(结合在6个独特的位点上)以及R10的2个CSP进行检测。如表4所示，找到了信号序列探针H19、RH5B和R10的有效捕获序列探针。

表4：HSV-1的TSHC检测的CSP和SSP

实施例4

临床样本检测

使用TSHC和杂交捕获2(hc2^TM；Digene Corp.)两种方法检测了64份临床样本板(clinical specimen panel)的HSV-1和HSV-2。所述板包括15份含数量已知的HSV-1或HSV-2的样品，以及49份通过PCR检测已知为HSV-1和HSV-2阴性的样品。因此，“期望”15份阳性样品在HC2和TSHC两项试验中为检测阳性，并且“期望”49份阴性样品在HC2和TSHC两项检测中为检测阴性。

应用实施例1中所阐述的一般TSHC方法。表5和6分别显示了使用HC2方法和TSHC方法的结果。使用HC2方法，在49份“期望”产生阴性结果的样品中，5份样品检测为阳性和44份样品检测为阳性。作为比较，使用TSHC方法的所有49份样品经检测都为阴性。因此，在HSV-1和HSV-2的检测中，TSHC方法在特异性方面优于HC2方法。

表5：HSV-1和HSV-2的HC2检测的观察结果和期望结果

表6：HSV1和HSV2的TSHC检测的观察结果和期望结果

实施例5

在HSV的TSHC检测中组合探针的效果

评价HSV-1特异性信号序列探针和捕获序列探针组的组合对HSV-1检测的影响。分别使用两组不同的RNA信号序列探针/生物素化捕获序列探针组合(组1：H19加HZ-1；和组2：RH5b加TS-1和TS-2)，来进行HSV-1和HSV-2交叉反应性的TSHC检测。还使用RNA信号序列探针/生物素化捕获序列探针组的组合进行TSHC，以评价两个探针组的组合对灵敏度和交叉反应性的影响。应用实施例1中所阐述的一般TSHC方法。表7所显示的结果清楚地表明，组合两个探针组对HSV-1检测的累加效应没有HSV-2交叉反应性的明显增加。

表7：通过组合HSV-1特异性CSP和SSP提高灵敏度

捕获序列探针	信号序列探针	VP/ml	RLU	CV	S/N
						HZ-1HZ-1HZ-1HZ-1	H19H19H19H19	010^5HSV-110^6HSV-110^7HSV-2	60267231649	3％4％6％2％	1.04.538.90.8
TS-1，TS-2TS-1，TS-2TS-1，TS-2TS-1，TS-2	RH5BRH5BRH5BRH5B	010^5HSV-110^6HSV-110^7HSV-2	78291236875	6％6％11％11％	1.03.830.61.0
						HZ-1，TS-1，TS-2HZ-1，TS-1，TS-2HZ-1，TS-1，TS-2HZ-1，TS-1，TS-2	H19，RH5BH19，RH5BH19，RH5BH19，RH5B	010^5HSV-110^6HSV-110^7HSV-2	70457426367	12％10％1％6％	1.06.560.91.0

实施例6

以多重的方式检测HPV类型

以多重的方式进行代表单个生物样品中不同类型的人乳头瘤病毒(HPV)的13种序列的快速、灵敏且特异的检测。这项试验可以以96孔微平板的方式在5小时时间内分析多达96份样品。试验开始后可以在5小时内检测一种类型病毒的至少500个拷贝。

使用蛋白G-顺磁性微珠(Dynal Corp.；Brown Deer，WI)和

100^TM羧化微珠(Luminex-Corp.，Austin，TX)作为固体载体。通常如本领域所理解的和Ausubel等[Current Protocols in Molecular Biology，纽约，Wiley Publishing，1993，通过引用结合]所阐述的，通过HPV质粒的体外转录制备HPV RNA。新的试验有三个步骤，包括：1)靶富集；2)靶扩增；和3)靶检测。

靶富集：

通过将预选的特异性靶和不需要的或非特异性的DNA以及污染物分离来制备用于扩增的样品。这个步骤除去不需要的DNA，该DNA的存在大量降低靶扩增的灵敏度。通过将序列特异性RNA:DNA杂交体捕获到顺磁性微珠上来进行靶富集。利用RNA:DNA杂交体特异性抗体或杂交捕获抗体(Digene，Corp.)对所述微珠进行最初的修饰。更具体地，HC-Ab顺磁性微珠通过以下进行制备：将1mL蛋白G顺磁性微珠(2.7×10⁹微珠/mL；Dynal，Corp.)和375μg的HC-Ab混合，并在PBS中室温孵育40分钟，形成微珠-抗体(微珠-Ab)复合体。通过将平板放置在磁性网格(grid)(Dynal，Corp.)上并用0.2M、pH为8.2的三乙醇胺洗涤一次，而使所述微珠-Ab复合体被聚集在孔的底部。抗体在20mM DMP/0.2M三乙醇胺、pH 8.2的试剂中与蛋白G交联30分钟。用1mL的PBS-0.05％吐温20洗涤所述微珠-Ab复合体3次。然后在1mL的PBS-吐温中重悬微珠并储存在4℃。

用各种HPV质粒(10kb)对样品进行系列稀释，所述质粒在含100μg/ml鲱鱼精子DNA、1M胍-HCl、10mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM EDTA、0.05％叠氮化钠的去离子水溶液中制备。每份稀释的样品(50μl)在每孔含25μl1.75M NaOH的96孔微平板中混合，并在50℃下孵育15分钟以使样品变性。从表1选择的13种类型的HPV RNA(每次试验每种15ng)的混合液(cocktail)被加入到变性样品的25μL中和溶液中，该中和溶液为：0.125M柠檬酸钠、0.125M磷酸钠、0.6M三乙醇胺、0.6BES、0.83M冰醋酸、3％聚丙烯酸、5mM EDTA、0.05％叠氮化钠和0.4％Tween-20(pH 3.6-4.1)。然后立即向被中和的样品中加入与杂交捕获抗体(Hc-Ab)结合的顺磁性微珠(每次试验5.4×10⁶个微珠)。HPV RNA和顺磁性微珠-抗体物与样品靶序列在65℃、1100rpm摇动下杂交30分钟。通过将平板放置在磁性网格(Dynal，Corp.)上，而使磁性微珠-靶复合体聚集在孔的底部。通过移液器吸出上清液并且使用洗涤缓冲液(40mM Tris pH 8.2、100mM氯化钠、0.05％叠氮化钠和0.05％吐温-20)洗涤微珠3遍，从而除去任何污染物。

靶扩增：

使用随机引物和具有链置换活性的DNA聚合酶进行样品靶DNA的等温扩增。使用由随机五聚体引导的phi29DNA聚合酶扩增所述DNA靶。所合成的五聚体引物带有两个3’末端硫代磷酸酯键以阻止核酸酶的降解。其它的修饰可以包括，但不限于掺入到所述引物结构的2’O-甲基。扩增靶DNA 2小时。将在靶富集步骤获得的、带有所捕获的靶核酸的顺磁性微珠重悬在20μl反应物中，并在30℃孵育2小时，所述反应物由以下所构成：pH7.5的50mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、10mM(NH₄)₂SO₄、4mM DTT、200μg/ml乙酰化的BSA、每种dNTP 400μM、125μM随机五聚体和1U phi29DNA聚合酶(New England Biolabs，Inc)。

下面列出在扩增步骤中可能有用的引物。

探针HPV165’-\FAM\TCAGGACCCACAGGAGCGACCCAG-3’\BHQ

(SEQ ID NO：125)

正向引物5’-GCACCAAAAGAGAACTGCAATGT-3’(SEQ ID NO：126)

反向引物5’-CATATACCTCACGTCGCAGTAACT-3’(SEQ ID NO：127)

*双标记(duel-labeled)探针和引物(Integrated DNA Technologies，Inc.；Salt LakeCity，UT)

*FAM-荧光报道基因；BHQ-黑洞淬灭剂

靶检测

使用基于液体的微珠阵列系统检测所扩增的序列，所述阵列系统整合了光学、流体学和信号处理从而具有多重能力(Luminex技术)。所述Luminex技术使用高度灵敏的试验系统，该系统基于可以在同一个测定孔中检测多个靶的荧光微珠和报道基因分子(参见5,981,180、6,524,793、5,736,330、6,449,562、6,592,822、6,632,526、6,514,295、6,599,331、6,046,807？和6,366,354号美国专利)。Luminex检测设备使用两个激光器：一个用于检测荧光微珠本身，另一个用于荧光报道基因。二重染色的荧光微珠能够多重地检测达约100个不同的靶。在这个实施例中，Luminex技术被用于HPV分型。这种方法提高了平台的灵敏度和稳固性。

使用制造商的方案，将与特异性HPV类型的晚期(L)和早期(E)区域互补的两个寡核苷酸序列[MH Einstein和GN Goldberg，Cancer Invest.20：1080-1085，2002，通过引用并入]结合至商业可得的、不同染色的Luminex羧化微珠上。捕获寡核苷酸的序列在表1中显示。将一个特异性HPV类型的两个寡核苷酸连接在同一个微珠组上，从而消除由可能发生在癌细胞中的HPVL-区域的缺失引起的假阴性结果。由于杂交已经在保留第一个靶富集步骤过程中引入的顺磁性微珠的同一个试管中进行，因而在检测步骤之前不需要扩增子的纯化步骤。

试验的检测步骤始于扩增子在70℃、75μl 438mM NaOH中变性15分钟。将13种不同类型的HPV RNA(每次试验每种15ng)的混合液加入到变性样品的25ul溶液中，该溶液为：0.125M柠檬酸钠、0.125M磷酸钠、0.6M三乙醇胺、0.6BES、0.83M冰醋酸、3％聚丙烯酸、5mM EDTA、0.05％叠氮化钠和0.4％Tween-20(pH 3.6-4.1)。然后将13种类型的寡核苷酸分别结合至羧化的Luminex聚苯乙烯微珠上(每次试验5×10³个微珠)，并立即加入到被中和的样品中。RNA和微珠-寡核苷酸物与靶在65℃、同时以1100rpm摇动下杂交30分钟。然后将样品通过96孔滤板(Whatman)过滤，并将微珠重悬在100μl含有以下的1×磷酸缓冲盐水(PBS)中：0.05％吐温-20、10％山羊血清和10ng藻红蛋白标记的小鼠单克隆DNA:RNA杂交体特异性抗体(PE-HC-Ab)。样品在室温(18-25℃)、同时以1100rpm摇动下孵育30分钟。通过真空过滤将过量的抗体除去，并将带有靶复合体的微珠重悬在100μL含0.05％吐温-20的PBS中。然后在将光电倍增管的增益调整至700伏后，通过Luminex流式细胞仪分析样品。

这个步骤提高的灵敏度归因于允许结合多个藻红蛋白抗体(PE-Ab)的长RNA信号序列探针(长度大约6500bp)，因此，与其它检测技术如使用结合至短的杂交探针上的荧光团的方法相比，其引起大约500倍的信号放大。RNA信号序列探针的长度范围可以从大约500个碱基至大约10,000个碱基，或达到正好小于靶核酸长度的100％。

表8中所显示的结果示出了在所有13种HPV类型微珠组存在下，HPV16检测的灵敏度。如同通过稳健的信噪比所显示的：质粒检测的灵敏度大于每次试验500个拷贝。起始样品体积为50μl，但可以增加至500μl或者甚至整个样品(用于基于试管的试验，没有显示)，这将把试验灵敏度提高到甚至更高的程度。所述结果也示出了HPV16检测的特异性。实质上，在微珠组上没有检测到除了HPV16以外的其它HPV靶特异性信号。表8的信号(平均，n＝4个复制，％CV在3％至31％之间)为通过流式细胞仪计数的每份样品的100个微珠(事件)的中位荧光强度(MFI)。背景或噪音值为不含靶的样品的MFI。

表9示出所有13种HPV类型检测的灵敏度和特异性。沿着X轴列出了靶HPV类型以及沿着y轴列出核酸探针。在表的对角突出显示了针对每种类型的相同HPV靶和HPV探针(阳性结果)。这些方格示出了探针针对其HPV靶的高水平特异性。这项试验确定探针对相应的HPV类型靶是特异的。表9中的结果表明，如HPV16靶仅与相应的HPV16探针结合(阳性结果)，且不与其它HPV类型的探针结合(阴性结果)。

表8：HPV16检测的灵敏度

表9：HPV类型的特异性

实施例7

HPV16、HPV58和HPV33的检测

通过将每种都插有不同类型的HPV序列(10kb)的3种质粒混合在实施例6所示的样品缓冲液中，来对感染多种类型HPV的颈部样品建模。这个实施例示出了当样品中存在的HPV类型多于1种时，所述试验检测多个感染的能力。

如实施例12所示，进行多个靶样品的试验。样品由1×10²拷贝的HPV16、1×10⁴拷贝的HPV58和1×10⁶拷贝的HPV33组成。图7中的结果表明，即使在有高丰度的其它HPV类型存在下，也能检测到低丰度的HPV16靶。图7表明HPV16具有低的信噪比，其中信号(平均，n＝4个复制，％CV(变异系数)在3％至31％之间)为通过流式细胞仪计数的每份样品的100个微珠(事件)的中位荧光强度(MFI)。噪音值为不含靶质粒的样品的MFI。

实施例8

临床样品中HPV的检测

在颈部样品中检测了HPV，其中所述颈部样品被收集在样本转运培养基中(STM；Digene Corp.，Gaithersburg，MD)，并且最初使用商业可得的HC2High-Risk HPV DNA Test^TM assay(Digene Corp.)筛选高危性HPV类型。对所述HC2试验结果与本发明所阐述的HPV分型试验的结果进行比较。

使用刷子收集颈部样品并保存在储存培养基(1M胍-HCl、10mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM EDTA和0.05％叠氮化钠的去离子水)中直至使用。根据生产商的推荐，通过HC2(Digene Corp)或通过实施例6中所阐述的方法，来分析颈部样品的等分试样(50μl)。为了比较两项试验的灵敏度，将阳性样品系列稀释至没有HPV感染的颈部样品中。

表10：临床样品检测灵敏度的比较

阳性样品稀释液	HC2，信号/截止值	分型试验，S/N
			未稀释	187.2	585.1
1∶10	21.2	310.4
			1∶100	2.3	199.2
1∶1000	＜1	113.4
			1∶10,000	＜1	43.1

在表10中报告了临床样品的HC2的灵敏度，并且显示与大约10,000个HPV靶/试验相应的信号/截止值为2.3(100倍稀释样品)。因此，当与本发明的HPV分型试验的灵敏度相比较时，本发明比其高至少100倍，且等于100个拷贝/试验，信噪比(S/N)为大约43。

实施例9

环状、线性和整合形式的HPV DNA的检测

本发明的试验可以检测线性和环状的DNA序列。因此，在本发明的试验中进行的扩增不必通过“滚环”现象进行。所以，本发明的试验的靶不必是环状的。它们可以为线性的，因为环状致病的DNA因变性而具有切口，或者因为致病的(病毒的)DNA靶被整合至线性宿主(人类)基因组中，或因为致病的DNA为线性基因组。

将样品稀释在TE缓冲液中，所述样品包括线性或环状HPV16质粒的系列稀释液或者从CaSki细胞中纯化的DNA的系列稀释液。通过使用标准技术进行环状质粒的限制性内切酶消化，来产生线性质粒。CaSki细胞DNA是人类基因组DNA，它包含每个人类基因组所整合的HPV16病毒基因组的500个拷贝。根据人类和HPV两个基因组的大小和比例以及所纯化的CaSki

DNA的光密度测量值，计算每次试验CaSki细胞DNA的HPV16拷贝的浓度。

在扩增之前，靶在随机引物存在下于以下溶液中立即95℃热变性3分钟：50mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.5mM EDTA和50μM随机六聚体引物(3’末端的键被硫代磷酸酯化)。然后在20μl反应物中于30℃扩增单链靶120分钟，该反应物由以下构成：50mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mMMgCl₂、10mM(NH₄)₂SO₄、4mM DTT、0.2mg/ml乙酰化的BSA、每种dNTP 400μM、0.13mM随机六聚体和10U phi29DNA聚合酶(Epicentre，Inc)。

除了以下之外，按实施例6的阐述对所扩增的靶进行检测。首先利用小鼠单克隆抗RNA:DNA一抗(10μg/试验)然后利用结合有藻红蛋白的山羊抗小鼠IgG二抗(1.6μg/试验)，给RNA:DNA杂交复合体加标签。

表11中的结果表明本发明的试验检测环状、线性和整合DNA具有稳健的信噪比，从而说明所述试验的有效性不依赖于“滚环”机制。然而，由于扩增环状靶比扩增线性靶的效率更高，因此“滚环”机制可以加速反应。

表11：利用提议的方法检测环状、线性和整合的靶

信号为通过流式细胞仪计数的每份样品的100个微珠(事件)的中位荧光强度(MFI)的平均值(n＝2)。噪音值为不含靶质粒的样品的平均MFI。

实施例10

使用随机寡核苷酸通过PHI29DNA聚合酶催化的等温扩增

靶扩增步骤的另一个实施例使用了对长度进行优化的、修饰的寡核苷酸的随机引物。随机五聚体5’-NpNpNpsNpsN-3’由IDT，Inc制备。为了获得这个实施例所产生的数据，通过30℃等温扩增2小时，在20μl总反应体积中扩增HPV16质粒。DNA靶在以下10μl溶液中于95℃加热变性3分钟：50mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.5mM EDTA、50μM引物。等温扩增在以下20μl溶液中于30℃进行2小时：50mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MgCl₂、10mM(NH₄)₂SO₄、4mM DTT、200μg/ml乙酰化BSA、每种dNTP 400μM、125μM随机五聚体和1U phi29DNA聚合酶(NewEngland Biolabs，Inc)。扩增之后，在Luminex流式细胞仪系统中使用实施例11所阐述的“一抗/二抗”检测方案，来检测一半体积(10μl)的扩增子。

表12：随机DNA五聚体为最佳引物长度。所有引物在3’末端都具有两个硫代磷酸酯修饰。

拷贝/试验	5-mer	6-mer	7-mer	8-mer	9-mer	10-mer
							0	10	9	7	13	9	14
1×10²	5873	990	16	10	17	12
							1×10⁴	9864	5766	1469	176	36	26
1×10⁶	12257	7567	7187	5444	2421	1621

*值＝Luminex平均MFI

表13：不同长度和修饰的随机引物的比较

*值＝Luminex平均MFI

表12和13表明带有一个硫代磷酸酯修饰的随机DNA六聚体引物为最佳，并且带有两个硫代磷酸酯修饰的随机DNA五聚体引物为最佳。

实施例11

检测扩增靶的不同方法

比较检测所扩增的靶的三种不同的方案。一种方法利用生物素化探针，该探针是5’末端标记有生物素的脱氧寡核苷酸。通过Integrated DNATechnology Inc.；Salt Lake City，UT的化学合成来制备这些寡核苷酸。其它两种方法使用被标记的一抗HC-Ab(Digene Corp.)，以及依序地使用一抗HC-Ab和被标记的二抗(Digene Corp.)，它们代表本发明的两个实施例。抗体标记或染色微珠的流式细胞仪检测和信号放大的联合，导致增强的信号，并由此把试验的灵敏度提高超过10倍。信号放大就如微珠上存在大复合体一样，通常会增强试验的背景，从而降低或消除灵敏度。然而，所阐述的本发明的方法提供了增强的信号和提高的灵敏度。所述微珠上的大复合体可干扰Luminex流式细胞仪系统中依赖于微珠的某种尺寸的检测模式。本发明的方法克服了这两个问题。

A.在一种方法中，与靶核酸互补的生物素化探针被应用于与藻红蛋白(phycoethithrin)结合的链霉亲和素(SA-PE；Pierce)。所扩增的HPV16质粒在75μl 438mM的NaOH中于70℃变性15分钟。将两种5’生物素化探针(5’-生物素-TATTTTATATGACACAATGT-3’(SEQ ID NO：128)；5’-生物素-GGTTTGTGCTAACAATAAATGTATCCATAG-3’(SEQID NO：129))中的每一种(2纳克)加入到25μl所述变性靶核酸样品的以下溶液中：0.125M柠檬酸钠、0.125M磷酸钠、0.6M三乙醇胺、0.6BES、0.83M冰醋酸、3％聚丙烯酸、5mM EDTA、0.05％叠氮化钠和0.4％吐温-20(pH3.6-4.1)。将大约1000个聚苯乙烯微珠结合至HPV16L区域和E区域特异性的寡核苷酸上(见表1)并立即加入到被中和的样品中。在50℃、同时以1100rpm摇动下进行30分钟杂交。每次反应加入含SA-PE(100ng)的100μl以下溶液：438mM NaOH、0.125M柠檬酸钠、0.125M磷酸钠、0.6M三乙醇胺、0.6BES、0.83M冰醋酸、3％聚丙烯酸、5mM EDTA、0.05％叠氮化钠和0.4％Tween-20，并在室温下孵育5分钟。然后将样品转移到滤板，在此未被结合的物质通过真空过滤被除去。微珠重悬在100μl的PBS-0.05％吐温-20中，并在将光电倍增管的增益调整至700伏后，通过Luminex流式细胞仪分析。

B.在第二种方法中，所扩增的HPV16质粒在75μl 438mM的NaOH中于70℃变性15分钟。将13种不同类型的HPV RNA(每次试验每种15ng，如实施例6所述获得)的混合物加入到25μl所述变性样品的以下溶液中：0.125M柠檬酸钠、0.125M磷酸钠、0.6M三乙醇胺、0.6BES、0.83M冰醋酸、3％聚丙烯酸、5mM EDTA、0.05％叠氮化钠和0.4％吐温-20(pH3.6-4.1)。将13组结合有寡核苷酸的聚苯乙烯微珠(每次试验5×10³个微珠)立即加入到被中和的样品中。每组微珠都有两个与特异性HPV类型的晚期(L)区域和早期(E)区域互补的寡核苷酸序列。捕获寡核苷酸的序列如表1所示。RNA和微珠-寡核苷酸物与靶核酸在1100rpm摇动、65℃下杂交30分钟。然后将样品在96-孔滤板(Whatman)中过滤，并加入100μl含1μg一抗HC-Ab的PBS-0.05％吐温-20。室温摇动5分钟后，过滤反应物并加入100μl含8μg PE-标记的二抗(山羊-抗小鼠)的PBS(0.05％Tween-20和10％山羊血清溶液)。在室温下进行摇动的同时持续孵育20分钟。通过真空过滤将过量的抗体除去并将带有靶复合体的微珠重悬在100μl的PBS(含0.05％吐温-20)中。然后在将光电倍增管的增益调整至700伏后，通过Luminex流式细胞仪分析样品。

C.在第三种方法中，所扩增的HPV16质粒在75μl 438mM的NaOH中于70℃变性15分钟。将13种不同类型的HPV RNA(每次试验每种15ng，如实施例6所述获得)的混合物加入到25μl所述变性样品的以下溶液中：0.125M柠檬酸钠、0.125M磷酸钠、0.6M三乙醇胺、0.6BES、0.83M冰醋酸、3％聚丙烯酸、5mM EDTA、0.05％叠氮化钠和0.4％吐温-20(pH3.6-4.1)。将13组结合有寡核苷酸的聚苯乙烯微珠(每次试验5×10³个微珠)立即加入到被中和的样品中。每组微珠都有两个与特异性HPV类型的晚期(L)区域和早期(E)区域互补的寡核苷酸序列。捕获寡核苷酸的序列如表1所示。RNA和微珠-寡聚体物与靶在1100rpm摇动、65℃下杂交30分钟。然后将样品通过96-孔滤板(Whatman)过滤，并将微珠重悬在100μl含有以下的PBS中：0.05％吐温-20、10％山羊血清和10ng标记有藻红蛋白的小鼠单克隆RNA:DNA特异性抗体(PE-HC-Ab)。然后将样品在1100rpm摇动、室温(18℃-25℃)下孵育30分钟。通过真空过滤将过量的抗体除去，并将带有靶复合体的微珠重悬在100μl含0.05％吐温-20的PBS中。然后在将光电倍增管的增益调整至700伏后，通过Luminex流式细胞仪分析样品。

如实施例6所描述的进行HPV16靶的等温扩增。使用在以上方案A、B或C中所阐述的三个方案中的一个来检测所扩增的靶。结果在表14中显示。在所阐述的三种方案中，利用生物素化探针的检测(方案A)涉及的实施该方法的时间最少。然而，这种检测方法也产生最低的信号强度。使用被标记的一抗的检测方案获得了最大的信号强度和信噪比(表14)，该方案实现了HC-Ab信号放大(方案B和C)。方案C比方案B使用的步骤少一步，并且是优选的。

表14：等温扩增后HPV16检测的比较

实施例12

96孔NUCLEOLINK平板中的HPV分型

在一个可选择的实施例中，可以用微量板代替微珠作为用于序列检测的固体载体。单一HPV类型特异性寡核苷酸被结合至所述孔的底部。靶核酸与捕获寡核苷酸杂交，然后通过化学发光进行检测。

在NucleoLink^TM多孔平板(Nalge Nunc International；纽约)的制备中，使用以下所阐述的试验方案，将两个与特异性HPV类型的晚期(L)区域和早期(E)区域互补的寡核苷酸序列结合至Nucleolink平板上。表1显示了捕获寡核苷酸的序列。通过将两个寡核苷酸放置在每个孔中，可以消除由常见于癌细胞中的HPV L区域的缺失引起的假阴性结果。在新鲜配制的、pH为7的、含10mM1-甲基咪唑的10mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液中，制备终浓度为100nM(0.1pmole/μL)的、含5’-C12-氨基连接体的类型特异性捕获寡核苷酸(每个HPV类型两个)。将这种溶液以每孔100μL(每孔一种类型)加入到Nucleolink 96孔平板中，用热稳定条带密封该平板并在50℃孵育4小时。然后轻轻倒出所述溶液并洗涤孔三次，浸湿5分钟并全部用含150mM氯化钠和0.1％吐温-20的pH 7.5的100mM Tris-HCl在室温下洗涤三次。然后洗涤孔三次，浸湿5分钟并用分子生物学级别的水洗涤孔三次。然后允许所述平板在室温下干燥30分钟。将所述平板放在带有干燥剂的乙烯袋中于4℃贮存直至需要。

贮存之后将共价结合有寡核苷酸的NucleoLink平板取出至室温。该平板每孔用290μl的6％酪蛋白的含0.05％叠氮化钠的100mM Tris-HCl溶液(pH7.2)室温封闭30分钟。在由以下构成的去离子水溶液中制备HPV质粒(10kb)稀释液的标准样品(100pg/mL)：100μg/mL鲱鱼精子DNA、1M胍-HCl、10mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM EDTA、0.05％叠氮化钠。将样品(50μl)在96孔微平板中与25μL 1.75M的NaOH混合，并在70℃孵育30分钟。将未标记的RNA探针(每次试验15ng)的以下溶液加入到杂交平板的每个孔中：0.125M柠檬酸钠、0.125M磷酸钠、0.6M三乙醇胺、0.6N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙烷磺酸、0.83M冰醋酸、3％聚丙烯酸、5mM EDTA、0.05％叠氮化钠和0.4％吐温-20(pH 3.6-4.1)。所述溶液变澄清或微黄色。将每一个孔中的内容物转移到它们各自在Nucleolink平板上的孔中。在1150rpm摇动、65℃下孵育平板1小时。将所述平板冷却至室温并轻轻倒出溶液。在每孔中加入结合有小鼠单克隆抗RNA:DNA抗体的碱性磷酸酶溶液(100μL/孔)和30％封闭溶液(含6％酪蛋白的pH 7.2的100mM Tris-HCl和0.05％叠氮化钠)，并在37℃孵育平板30分钟，所述碱性磷酸酶溶液为：0.1MmM Tris-pH 7.4、0.6M氯化钠、0.1mM氯化锌、1mM氯化镁、0.05％叠氮化钠、0.25％吐温-20、0.2mg/mL核糖核酸酶、4％羟丙基-β-环糊精、0.05％山羊IgG、0.0008％磺酰罗丹明B。将所述溶液轻轻倒出，并用含有以下的溶液洗涤平板两次：128mM Tris pH 7.2、0.6M氯化钠、0.05％叠氮化钠、0.24％吐温；然后在每孔中加入250μL含有以下的溶液：pH 7.2的128mM Tris、0.6M氯化钠、0.05％叠氮化钠、0.24％吐温。所述平板用热稳定性条带密封并在60℃孵育10分钟。将所述溶液轻轻倒出并用以下溶液再次洗涤平板两次：pH 7.2的128mM Tris、0.6M氯化钠、0.05％叠氮化钠。然后用以下溶液洗涤平板两次：pH 8.2的40mM Tris、100mM氯化钠、0.05％叠氮化钠。轻轻倒出溶液并在每孔中加入100μL的CDP-Star底物。平板在黑暗中孵育20分钟并在DML照度计上读数。表15显示了通过以上所阐述的方法检测的、100pg/mL的7种不同的HPV克隆靶所产生的信噪比。

表15：HPV16、18、31、33、35、45和52在96孔平板上的分型

实施例13

在与亚孔平板结合中使用掩蔽物的效果

将碱性磷酸酶溶液加入到CDP-Star底物中。将这种溶液(20μL)加入到384孔平板(Digene Corp.)上所指明的亚孔中并孵育20分钟。然后在加和没有加掩蔽物(Digene Corp.)的情况下，在384孔平板照度计上大约450nm处读取平板。表16显示了掩盖每一个孔/亚孔的掩蔽物提高S/N比例大于100倍。带有掩蔽物的亚孔平板具有克服之前已知的亚孔之间的串扰的优势。表16的每一个格子代表单个亚孔。只有两个亚孔具有化学发光底物，其用黑体字表示。

表16：邻近亚孔间的串扰

*添加有化学发光底物的亚孔用黑体表示

实施例14

384亚孔平板中的HPV分型

以亚孔平板的方式进行单种和多种类型HPV的检测。在这个实施例中，将样品加入到每个孔中，并且单个靶迁移并杂交至相应的捕获序列探针上。在所述孔中加入检测试剂，该试剂在此与阳性亚孔中的靶结合。利用化学发光进行检测。

在含1mM乙二胺四乙酸二钠盐的pH为8.5的500mM磷酸氢二钠溶液中制备终浓度为5μM(5pmole/μL)的、含5’-C12-氨基连接体的类型特异性捕获寡核苷酸(每种HPV类型两个寡核苷酸)。将这种溶液以每孔20μL加入到亚孔平板的每一个亚孔中(每个亚孔一种类型)，用热稳定条带密封该平板并在42℃孵育4小时。轻轻倒出所述溶液并用TBS洗涤所述孔三次。然后将平板立即用于HPV分型试验。

该平板用含6％酪蛋白的pH7.2的100mM Tris-HCl、0.05％叠氮化钠(每个大孔1mL)室温封闭30分钟。在由以下构成的去离子水溶液中制备HPV质粒(10kb)稀释液组成的标准样品(100pg/mL)：100μg/mL鲱鱼精子DNA、1M胍-HCl、10mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM EDTA、0.05％叠氮化钠。样品(500μl)在微量离心管中与250μl 1.75M的NaOH混合，并在70℃孵育30分钟。接着，将RNA探针的以下溶液(每次试验15ng)加入到每个试管中：0.125M柠檬酸钠、0.125M磷酸钠、0.6M三乙醇胺、0.6N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙烷磺酸、0.83M冰醋酸、3％聚丙烯酸、5mM EDTA、0.05％叠氮化钠和0.4％吐温-20(pH 3.6-4.1)。所述溶液目前澄清或为微黄色。将每一个试管中的内容物(1mL)转移到亚孔平板上的相应孔中。在1150rpm摇动下于65℃孵育平板1小时。将所述平板冷却至室温并轻轻倒出溶液。在每孔中加入结合有小鼠单克隆抗RNA:DNA抗体的碱性磷酸酶溶液(每大孔1mL)和30％封闭溶液(含6％酪蛋白的pH 7.2的100mM Tris-HCl和0.05％叠氮化钠)，并在37℃孵育平板30分钟，所述碱性磷酸酶溶液为：100mM Tris-pH 7.4、0.6M氯化钠、0.1mM氯化锌、1mM氯化镁、0.05％叠氮化钠、0.25％吐温-20、0.2mg/mL核糖核酸酶、4％羟丙基-β-环糊精、0.05％山羊IgG、0.0008％磺酰罗丹明B。将所述溶液轻轻倒出，并用以下溶液洗涤平板两次：128mMTris pH 7.2、0.6M氯化钠、0.05％叠氮化钠、0.24％吐温，然后在每孔中加入1mL以下溶液：pH 7.2的128mM Tris、0.6M氯化钠、0.05％叠氮化钠、0.24％Tween。所述平板用热稳定性条带密封并在60℃孵育10分钟。将所述溶液轻轻倒出并用以下溶液再次洗涤平板两次：pH 7.2的128mM Tris、0.6M氯化钠、0.05％叠氮化钠、0.24％吐温。然后用pH 8.2的40mM Tris、100mM氯化钠、0.05％叠氮化钠洗涤平板两次。轻轻倒出溶液并在每孔中加入20μL的CDP-Star底物(Applera Corp.)。如实施例13所阐述的，将平板在黑暗中孵育20分钟，并在带有掩蔽物的384照度计上在大约450nm处读数。

表17中的结果表明亚孔平板中单种和多种HPV类型检测的特异性。以黑体字显示的信号表明检测的特异性。例如，当仅用HPV16探针表示时HPV16靶显示一个阳性信号，而用其它HPV类型探针时不显示信号。但是，多个感染显示多个信号。

表17：在384亚孔平板中利用被动结合的HPV分型

实施例15

使用微量板和微珠的HPV检测方法的比较

比较本发明的两种试验方式，其中检测步骤在微量板(如通过化学发光检测)或Luminex羧化微珠(如通过荧光检测)上进行。

按照实施例6所阐述的进行靶富集和靶扩增步骤。包括杂交和检测的第三个步骤以以下两种方式进行：一种按照实施例6所阐述的在Luminex羧化微珠上进行，另一种按照实施例14所阐述的在微量板上进行。

表18的结果表明平板试验在30分钟的扩增中可以检测到500个输入拷贝，S/N比为9。在扩增1小时时，平板试验的灵敏度比Luminex方式高出至少一个数量级。

表18：使用平板和微珠检测方式的HPV检测

实施例16

随机引物中核苷酸的比例对等温扩增效率的影响

使用在实施例6所阐述的方法的靶扩增步骤中核苷酸的不同组合和比例，来化学合成随机引物。表19中的结果表明dG和T在实现有效扩增中起主要作用。省略dA的影响较不显著，省略dC没有任何影响。利用五聚体引物进行等温扩增2个小时。按照实施例6的阐述进行整个试验。以信噪比计算相对效率，其中标准的引物组成的效率为(1.0)。

表19：靶检测的相对效率取决于随机引物的组成

实施例17

在微芯片阵列上的HPV分型

可以在微芯片阵列形式上进行HPV类型(单个和多个类型的HPV)的检测。根据实施例6进行靶核酸捕获和扩增。根据用于洗涤载玻片、膜、芯片等的商业可得的产品和说明，实施试剂的配制和洗涤试验方案。根据实施例6，靶检测步骤包括靶变性和与RNA探针或信号序列探针的杂交。

在这个实施例中，按实施例6的阐述，在寡核苷酸点阵列而非微珠上，进行靶与序列特异性捕获序列寡核苷酸探针的杂交。术语“点阵列”(spotted array)指固体载体表面上的二维系列元素，在此每个元素为沉积在特定位置的寡核苷酸的等分试样。用于这种方式的固体载体包括：玻璃载玻片、尼龙膜或微芯片(玻璃或硅)。另外的实施例和阐述在“Microarrays And Cancer Research”(“微阵列和癌症研究”)Ed.J.Warrington，Eaton Publishing，2002中找到。

把用5’-C12-氨基连接体修饰的类型特异性捕获序列寡核苷酸探针(每种HPV类型两个寡核苷酸)点样在固体载体如微阵列上，每个点对应于一种特异的HPV类型。寡核苷酸通过例如伯氨基连接。固体载体在室温下用2×SSC(氯化钠和柠檬酸钠)缓冲液平衡10分钟，然后在37℃在预杂交缓冲液(2×SSC/0.05％封闭试剂/5％硫酸葡聚糖/0.1％SDS)中孵育30分钟，该预杂交缓冲液含50μg/mL变性的鲱鱼精子DNA。然后在加入所扩增的靶核酸和RNA信号序列探针的相同预杂交缓冲液中进行杂交。当在摇动下于37℃孵育3小时时，杂交溶液中的靶核酸、RNA信号序列探针和类型特异性捕获序列寡核苷酸探针发生了杂交。

含扩增子的点的检测可以用两种方法进行：a)使用被Cy荧光染料标记的杂交捕获抗体(HC-Ab)，随后使用商业可得的扫描仪进行扫描；或b)使用碱性磷酸酶标记的HC-Ab，随后应用起沉淀作用的底物(例如5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸酯和四唑硝基蓝：NBT/BCIP)。在后一种情况下，信号不用仪器辅助设备就可以检测。

上述各种实施例的阐述目的是为了举例说明和描述。其并不能够穷举或者限制本发明公开的精确形式。根据以上说明，明显的修饰或变更都是可能的。选择和阐述所讨论的实施例以提供例证及其实际应用，由此使本领域普通技术人员能够利用各种实施例和适合所关注的特定用途的各种修饰。如同所附的权利要求所确定的，当根据它们公平、合法、公正地赋予的宽度来解释时，所有这种修饰和变更都包括在所述发明中。

Claims

1.一种检测多个靶核酸中的每一个的方法，其包括：

a）通过将所述多个靶核酸、与所述靶核酸的至少一部分互补的核酸探针和固体载体混合来将所述多个靶核酸捕获至所述固体载体上，形成多个富集的靶核酸，其中所述靶核酸及核酸探针一个为RNA另一个为DNA；

b）扩增富集的核酸或核酸探针，形成多个扩增的靶；和

c）通过将所述多个扩增的靶、与所述扩增的靶的第一部分杂交的可选择性寡核苷酸，和与所述扩增的靶的第二部分互补的核酸探针混合形成DNA∶RNA杂交寡核苷酸复合体，来检测所述多个扩增的靶而进行所述靶核酸的检测，其中DNA∶RNA杂交体通过DNA∶RNA杂交体特异性结合剂检测，并通过所述寡核苷酸复合体分离进行选择，从而检测所述多个靶核酸中的每一个。

2.如权利要求1所述的方法，其中在捕获的所述步骤中，所述固体载体与DNA∶RNA杂交体特异性结合剂结合，由此将所述靶核酸捕获至所述固体载体上。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述DNA∶RNA杂交体特异性结合剂选自由以下组成的组：DNA∶RNA杂交体特异性抗体、单克隆抗体或多克隆抗体或其片段、蛋白质、催化失活的核糖核酸酶H，和核酸、核酸适配子或结合并形成三链体结构的寡核苷酸。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述DNA∶RNA杂交体特异性结合剂为DNA∶RNA杂交体特异性抗体。

5.如权利要求2所述的方法，其中所述DNA∶RNA杂交体特异性结合剂为与所述靶核酸互补的核酸探针。

6.如权利要求3所述的方法，其中所述DNA∶RNA杂交体特异性结合剂被可检测地标记。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述标记通过比色法、化学发光、荧光和光散射方法检测。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述捕获的靶核酸或核酸探针通过等温扩增被扩增。

9.如权利要求8所述的方法，其中在所述等温扩增中使用DNA聚合酶。

10.如权利要求8所述的方法，其中在所述等温扩增中使用随机引物。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述随机引物为五聚体。

12.如权利要求10所述的方法，其中所述随机引物包含疾病特异性引物序列的子集。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述选择性寡核苷酸被结合至固体载体。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述固体载体选自由以下所组成的组：平板、微平板、微量板、载玻片、皿、微珠、颗粒、微粒、杯子、条状物、芯片、微芯片、带状物、膜、微阵列和试管。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述固体载体的制造材料选自由以下所组成的组：玻璃、硅、塑料、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯和聚碳酸酯。

16.如权利要求14所述的方法，其中修饰所述固体载体以使其包含：进行修饰以便表面包含羧基、氨基、酰肼、醛基、核酸或核苷酸衍生物、伯氨基和染料。

17.如权利要求1所述的方法，其进一步包括添加阻断剂探针。

18.一种检测多个靶核酸中的每一个的方法，其包括：

a）将多个靶核酸和与所述靶核酸的至少一部分互补的核酸探针杂交，形成DNA∶RNA杂交体；

b）用结合至固体载体上的DNA∶RNA杂交体特异性抗体捕获所述DNA∶RNA杂交体；

c）将未结合的靶核酸与所述DNA∶RNA杂交体分离；

d）使用随机引物和DNA聚合酶扩增所述捕获的靶核酸或核酸探针，形成多个扩增的靶；

e）杂交与所述扩增的靶的第一部分互补的核酸探针，形成DNA∶RNA杂交体；

f）将结合至多个固体载体上的寡核苷酸和所述扩增的靶的第二部分杂交，其中所述固体载体为选择性的；和

g）通过所述选择性固体载体选择所述多个扩增的靶中的每一个；和

h）通过DNA∶RNA杂交体特异性结合剂与所述DNA∶RNA杂交体的结合，检测所述多个扩增的靶中的每一个，其中多个扩增子的存在表明存在所述靶核酸。

19.如权利要求18所述的方法，其中与寡核苷酸结合的所述固体载体为可区别的微珠。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述可区别的微珠选自由可检测的标记物所组成的组：荧光标记物、金标记物和酶标记物。

21.一种检测多个靶DNA的多重方法，其包括：

a）多个靶DNA和与所述靶DNA的至少一部分互补的RNA探针杂交，形成DNA∶RNA杂交体；

b）用结合至微珠上的DNA∶RNA杂交体特异性抗体捕获所述DNA∶RNA杂交体；

c）将未结合的核酸与所述DNA∶RNA杂交体分离，形成富集的靶；

d）利用随机引物和DNA聚合酶扩增所述富集的靶DNA，形成多个扩增的靶；

e）杂交与所述扩增的靶DNA的第一部分互补的RNA探针，形成DNA∶RNA杂交体；

f）将DNA寡核苷酸和所述靶DNA的第二部分杂交，其中所述DNA寡核苷酸结合至多个选择性微珠上；和

g）通过所述DNA∶RNA杂交体特异性抗体与所述DNA∶RNA杂交体的结合，检测所述多个扩增的靶DNA，并根据特定的选择性微珠选择每一个所述扩增的靶。

22.如权利要求1所述的方法，其中与步骤a)中所述靶核酸的至少一部分互补的所述核酸探针、与步骤c)中所述扩增的靶的第二部分互补的所述核酸探针和寡核苷酸序列选自由以下所组成的组：

GTACAGATGGTACCGGGGTTGTAGAAGTATCTG[SEQ ID NO:1];

CTGCAACAAGACATACATCGACCGGTCCACC[SEQ ID NO:2];

GAAGTAGGTGAGGCTGCATGTGAAGTGGTAG[SEQ ID NO:3];

CAGCTCTGTGCATAACTGTGGTAACTTTCTGGG[SEQ ID NO:4];

GAGGTCTTCTCCAACATGCTATGCAACGTCCTG[SEQ ID NO:5];

GTGTAGGTGCATGCTCTATAGGTACATCAGGCC[SEQ ID NO:6];

CAATGCCGAGCTTAGTTCATGCAATTTCCGAGG[SEQ ID NO:7];

GAAGTAGTAGTTGCAGACGCCCCTAAAGGTTGC[SEQ ID NO:8];

GAACGCGATGGTACAGGCACTGCAGGGTCC[SEQ ID NO:9];

GAACGCGATGGTACAGGCACTGCA[SEQ ID NO:10];

ACGCCCACCCAATGGAATGTACCC[SEQ ID NO:11];

TCTGCGTCGTTGGAGTCGTTCCTGTCGTGCTC[SEQ ID NO:12];

*(TTATTATTA)CTACATACATTGCCGCCATGTTCGCCA[SEQ ID NO:13];

(TTATTATTA)TGTTGCCCTCTGTGCCCCCGTTGTCTATAGCCTCCGT[SEQ ID NO:14];

(TTATTATTA)GGAGCAGTGCCCAAAAGATTAAAGTTTGC[SEQ ID NO:15];

(TTATTATTA)CACGGTGCTGGAATACGGTGAGGGGGTG[SEQ ID NO:16];

(TTATTATTA)ACGCCCACCCAATGGAATGTACCC[SEQ ID NO:17];

(TTATTATTA)ATAGTATTGTGGTGTGTTTCTCACAT[SEQ ID NO:18];

(TTATTATTA)GTTGGAGTCGTTCCTGTCGTG[SEQ ID NO:19];

(TTATTATTA)CGGAATTTCATTTTGGGGCTCT[SEQ ID NO:20];

GCTCGAAGGTCGTCTGCTGAGCTTTCTACTACT[SEQ ID NO:21];

GCGCCATCCTGTAATGCACTTTTCCACAAAGC[SEQ ID NO:22];

TAGTGCTAGGTGTAGTGGACGCAGGAGGTGG[SEQ ID NO:23];

GGTCACAACATGTATTACACTGCCCTCGGTAC[SEQ ID NO:24];

CCTACGTCTGCGAAGTCTTTCTTGCCGTGCC[SEQ ID NO:25];

CTGCATTGTCACTACTATCCCCACCACTACTTTG[SEQ ID NO:26];

CCACAAGGCACATTCATACATACACGCACGCA[SEQ ID NO:27];

GTTCTAAGGTCCTCTGCCGAGCTCTCTACTGTA[SEQ ID NO:28];

(TTATTATTA)TGCGGTTTTGGGGGTCGACGTGGAGGC[SEQ ID NO:29];

(TTATTATTA)AGACCTGCCCCCTAAGGGTACATAGCC[SEQ ID NO:30];

(TTATTATTA)CAGCATTGCAGCCTTTTTGTTACTTGCTTGTAATAGCTCC[SEQ IDNO:31];

(TTATTATTA)ATCCTGTAATGCACTTTTCCACAAA[SEQ ID NO:32];

(TTATTATTA)GCCTGGTCACAACATGTATTAC[SEQ ID NO:33];

(TTATTATTA)CAGGATCTAATTCATTCTGAGGTT[SEQ ID NO:34];

TGCGGTTTTGGGGGTCGACGTGGAGGC[SEQ ID NO:35];

GGCGCAACCACATAACACACAGAACCACAAAAC[SEQ ID NO:36];

GTTCTACACGGGTTTGCAGCACGATCAACAACG[SEQ ID NO:37];

CGCTGCTTGTGGTGGTCGGTTATCGTTGTCTG[SEQ ID NO:38];

GACGTAGTGTCGCCTCACATTTACAACAGGAC[SEQ ID NO:39];

CTCGCTTGGTGGGGTTGTAGGGGAGCTCGG[SEQ ID NO:40];

GCTGTAGTTGTCGCAGAGTATCCCGTGAGG[SEQ ID NO:41];

GTGAGCCTGTGTTATATGTAGTGCCCGAATCCC[SEQ ID NO:42];

CCACCTCCTGCGTCCACTACACCTAGCACTA[SEQ ID NO:43];

TGCGTGCGTGTATGTATGAATGTGCCTTGTGG[SEQ ID NO:44];

AATTAGCGCATTGCCCCGTCCAACGTCCCG[SEQ ID NO:45];

CGCCGTGCACGTGTAGCCACCATATTTAATCAC[SEQ ID NO:46];

CGAATTGTGTGAGGTGCTGGAAGAATCGGTGC[SEQ ID NO:47];

GATCGTTCACAACTTTTACCTGCACCGGATCC[SEQ ID NO:48];

CTAGGTTCTCTAGATGTTTGTCTCCAGCACCCC[SEQ ID NO:49];

CTGTCGGTATTGTCTGTGTCGCTGATGTGTG[SEQ ID NO:50];

GATACACACACATTTGCAGCCCGGTCCACACA[SEQ ID NO:51];

GGTGGCAAAGGACGTATGTGAGTGCAGAGGAC[SEQ ID NO:52];

GCGTTGCGGAGGGGTATGATAGTTGCTCAGAAG[SEQ ID NO:53];

GTCTAGGCGTGTAGGAGGAAACAAGATGGGG[SEQ ID NO:54];

CTGAACACAGCAGTTCTCTATACCAATGGCGCTATTTC[SEQ ID NO:55];

TTGGTTGCCCCTGAGCAGTCGGACCCTATGGATA[SEQ ID NO:56];

GCGCCGCATTGCTGCACCTCGTTTATATAGCAGGGCATTTTC[SEQ ID NO:57];

CCTGGCGCATGTCATACACACCACATTACTC[SEQ ID NO:58];

CACGAAGTGTCAGTGCACAGTATGCCTTGC[SEQ ID NO:59];

GCCATGTACTTCACAAACTGTTAATACTGGTGATTGTCCC[SEQ ID NO:60];

CCTACACAGTACAAGTGGAGGCCATCACCCG[SEQ ID NO:61];

GTCTGACACATACTGTTGTAACCCATAGTTAAACACAGG[SEQ ID NO:62];

GCTGTCTCCCTGTCTTCCTGTGTATTGTTTAT AAGTGTATT[SEQ ID NO:63];和

GTACAGCACTAAAATGGAGTTTGGTGTGTTACTATAGTGCATAC[SEQ ID NO:64]。