CN101365490B - 用于递送治疗剂的疏水核载体组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明部分涉及一种生物相容性疏水核载体，其包含一个载体和多个与该聚合载体共价连接的疏水基团。该疏水基团能够可解离地连接负载分子如治疗剂。该疏水核载体也可以包含保护侧链、定向分子和靶向分子。

Description

用于递送治疗剂的疏水核载体组合物及其制备方法和应用
相关申请信息
根据35 USC第119(e)节，本申请要求享有由在2005年12月19日提交的美国专利申请11/311,895转变而来的美国临时申请60/813,629的优先权。 
政府许可权
在此所述的工作在国立糖尿病及消化系统疾病和肾脏病研究院(NIDDK)资助的5 R43 DK069727-01的政府支持下实施。美国政府在此处提供的主题中可以享有部分权利。 
发明背景
新药、制剂以及其他用于施用生理活性肽、蛋白质、有机药物、其它治疗剂和材料的系统的开发受到实现所需生理效果这一需求的推动。至于肽和蛋白质，它们中的很多都被认为在胃肠道中不稳定，因此需要加以稳定化或保护或经系统循环递送。另外，具有低分子量的肽和蛋白质都因肾脏将其从系统循环中有效清除而倾向于具有短生物半衰期。例如，一部分这样的肽和蛋白质也可由于被单核细胞/巨噬细胞识别或由于补体成分的调理作用而经网状内皮摄取被清除。许多肽和蛋白质也可能由于蛋白质水解(肽键断裂)而在体内失去活性。 
可以使用药物递送系统来部分避免这些不希望的效果。有几种药物递送策略可用于肽及蛋白质的体内递送。首先，可以采用通过泵进行的连续系统药物输注。这一策略的有效性已在临床实践中得到证实，但对于需要高度移动性的门诊病人来说可行性不高，并且具有相关的生活质量以及潜在的静脉输液线感染方面的缺点。 
第二，肽和蛋白质可包含在可植入泵中，该泵由具有允许药物(例如)以所需释放速率扩散的膜的胶囊组成。由于这些胶囊容量有限，肽和蛋白质常常应用在浓缩制剂中，由于聚集导致溶解性下降以及可能的比活性下降。多数情况下，药物通常被释放到细胞外空间中并散布在淋巴中。肽或蛋白质的总浓度可能会受到局部淋巴结活性及植入部位淋巴结排出效率的影响。另外可能还会有潜在的针对胶囊材料的宿主反应，但一般来说这种副作用并不常见。 
第三，药物释放系统可以胶囊化或者包含在可降解药物递送介质或载体例如聚合基质、颗粒或膜囊(脂质体)中而成为生物可降解的。这些递送系统通常是可植入的或者可注射的。可植入药物递送系统通常置于表皮下，在此处系统成分通常由于周围细胞的生物活性(例如，由于释放的酶降解将这些植入物保持在一起的化学键)而缓慢降解。 
Bogdanov等人的美国专利号5,871,710(在此引用作为参考)公开了一种生物相容性的接枝共聚加成物，其包含聚合载体、与该聚合载体相连的保护链、与载体相连或与载体和保护链相连的报道基团、以及用于诊断的可逆相连的Pt(II)。然而，Bogdanov等人并未披露适用于多种治疗剂并且具有调节释放速率的设置的治疗剂递送组合物。Bolotin的美国专利号7,138,105(在此引用作为参考)公开了一种生物相容性的接枝共聚物，其包含两侧为两个金属结合分子的金属桥，其中一个金属结合分子为治疗剂的一部分或与治疗剂共价连接。该金属桥连接载体和能够结合金属的治疗剂。 
仍需要一种适用于多种治疗剂并且释放速率易于控制的持续释放治疗剂递送系统。本申请公开了一种由能够与治疗剂可逆结合的疏水核组成的生物相容性组合物，其中可以改变该核的疏水性程度来控制可逆结合的治疗剂的释放速率。 
发明内容
本发明的一个目的是提供一种持续释放治疗剂递送系统，其安全、生物相容、易于由已知化学方法和化合物制备、适合多种治疗剂， 并且可以通过改变递送系统物理性质的简单机制容易地调节其释放速率。 
本发明的另一个目的是持续释放递送系统包括用于将治疗剂有效递送至所需部位的靶向部分。 
本发明的另一个目的是提供一种治疗疾病的方法，包括给有此需要的患者以控制方式和安全、有效、易于调节的释放速率递送治疗剂。 
本发明的另一个目的是提供一种为了递送药物而增溶低溶解度分子的方法。 
本发明基于以下事实：可以容易地调节本发明的载体系统和治疗剂之间的疏水相互作用以控制治疗剂-或者更广义地，“负载分子”-的释放。可以通过控制载体的疏水性质制备具有高负载能力和可调节的释放速率的安全的、无免疫原性的载体。 
本发明部分涉及新药物递送系统或者显像剂，及其制备和使用方法。 
本发明主要涉及一种疏水核载体组合物，其含有与载体共价连接的疏水基团和通过疏水相互作用与疏水基团结合的目标活性剂(负载分子)。 
在一个实施方案中，本发明涉及一种生物相容性疏水核载体组合物，其包含：(i)包含骨架的聚合载体，其中该载体是聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚丝氨酸、聚苏氨酸、聚半胱氨酸、聚甘油、聚乙烯亚胺、天然糖类、胺化多糖、胺化寡糖、聚酰胺胺(polyamidoamine)、聚丙烯酸、多元醇、磺化多糖、磺化寡糖、羧化多糖、羧化寡糖、氨基羧化多糖、氨基羧化寡糖、羧甲基化多糖或羧甲基化寡糖；和(ii)多个能够结合负载分子并且与聚合载体共价连接的疏水基团，其中每个疏水基团独立于载体的分子量具有小于1,000道尔顿的分子量，其中该疏水基团是直链烷基、支链烷基、苯基、萘基、胆固醇、维生素D和/或维生素E。 
在另一个实施方案中，本发明涉及一种生物相容性疏水核载体组 合物，其包含：(i)包含骨架的载体；(ii)多个能够结合负载分子的疏水基团，其中每个疏水基团与载体共价连接，并且每个疏水基团独立于聚合载体的重量具有小于大约1,000道尔顿的分子量；和(iii)多个聚合保护侧链，其中每个保护侧链与载体共价连接，并且每个保护侧链独立于载体的重量具有大约400-20,000道尔顿的分子量。在进一步的实施方案中，上述组合物进一步包含第二组具有共价连接的保护侧链的疏水基团，其中该疏水基团具有第一和第二末端，第一末端与载体共价连接，第二末端与保护侧链共价连接；该第二组的疏水基团独立于载体和保护侧链的重量具有小于1,000道尔顿的分子量；并且与疏水基团连接的保护侧链独立于疏水基团的重量具有400-20,000道尔顿的分子量。 
在另一个实施方案中，本发明涉及一种生物相容性疏水核载体组合物，其包含：(i)包含骨架的载体；(ii)多个能够结合负载分子的疏水基团，其中每个疏水基团与载体共价连接，并且每个疏水基团独立于骨架的重量具有小于大约1,000道尔顿的分子量；和(iii)第二组多个具有共价连接的保护侧链的疏水基团，其中该疏水基团具有第一和第二末端，第一末端与载体共价连接，第二末端与保护侧链共价连接；该疏水基团独立于载体和保护侧链的重量具有小于1,000道尔顿的分子量；并且与疏水基团连接的保护侧链独立于疏水基团的重量具有400-20,000道尔顿的分子量。 
在另一个实施方案中，本发明涉及一种生物相容性疏水核载体组合物，其包含：(i)包含骨架的载体；和(ii)多个具有共价连接的保护侧链的疏水基团，其中该疏水基团具有第一和第二末端；第一末端与载体共价连接，第二末端与保护侧链共价连接；该疏水基团独立于载体和保护侧链的重量具有150-1000道尔顿的分子量；并且，保护侧链独立于载体和疏水基团的重量具有大约400-20,000道尔顿的分子量。 
在进一步的实施方案中，本发明涉及任一种上述组合物，其中疏水基团包括烷基。在进一步的实施方案中，烷基包括支链烷基。在进一步的实施方案中，烷基包含双键。在进一步的实施方案中，烷基包 括乙基或丙基。在进一步的实施方案中，烷基是丁基、戊基或己基。在进一步的实施方案中，烷基是CH3(CH2)nCH2-、CH3(CH2)nCH2NH-、CH3(CH2)nCO-、CH3(CH2)nCH2O-、CH3(CH2)nCH2S-、-OC(CH2)nCH2-、-OC(CH2)nCH2NH-、-OC(CH2)nCO-、-OC(CH2)nCH2O-、-OC(CH2)nCH2S-、-HNC(CH2)nCH2-、-HNC(CH2)nCH2NH-、-HNC(CH2)nCO-、-HNC(CH2)nCH2O-、-HNC(CH2)nCH2S-、-OCH2(CH2)nCH2-、-OCH2(CH2)nCH2NH-、-OCH2(CH2)nCO-、-OCH2(CH2)nCH2O-、或-OCH2(CH2)nCH2S-基团；其中″n″为4-34(含)。在进一步的实施方案中，本发明涉及上述具有与保护侧链共价连接的疏水链的组合物，其中具有共价连接的保护侧链的疏水链独立地选自：-(CH2)4NHCO(CH2)nOC-A-OR3、-(CH2)4NHCO(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3、-CH2OOC(CH2)nOC-A-OR3、-CH2OOC(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3、-CH(CH3)OOC(CH2)nOC-A-OR3、-CH(CH3)OOC(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3、-CH2COOC(CH2)nCO-A-OR3、-CH2COOC(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3、-CH2CONH(CH2)nNHCOCH2CH2-A-OR3、-CH2CONH(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3、-(CH2)2COOC(CH2)nCO-A-OR3、-(CH2)2COOC(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3、-(CH2)2CONH(CH2)nNHCOCH2CH2-A-OR3、-(CH2)2CONH(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3、-(C6H4)OCO(CH2)nCO-A-OR3和-(C6H4)OCO(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3，其中n为2-22；y为2-6；R3 为H、(CH2)pCH3或(CH2)pCOOH，其中p为0-7；并且A为[OCH2CH2]x 或[OCHCH3CH2]x，其中x为17-250，或总共17-250个单位的[OCH2CH2]和[OCHCH3CH2]的各种组合。在另一个实施方案中，疏水基团包含芳香环化合物。在进一步的实施方案中，芳香环是苯基。在进一步的实 施方案中，芳香环是萘基。在进一步的实施方案中，芳香环化合物是胆固醇。在进一步的实施方案中，芳香环化合物是荧光素(fluorescien)，荧光素中的羧基作为定向分子起作用。 
在另一个实施方案中，本发明涉及任一种上述具有保护链的组合物，其中保护侧链包括选自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、甲氧基聚乙二醇、甲氧基聚丙二醇、或甲氧基聚乙二醇和甲氧基聚丙二醇的共聚物中的任一种。在进一步的实施方案中，保护侧链包括聚乙二醇和聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚乙烯胺或多核苷酸之一的嵌段共聚物。在进一步的实施方案中，保护侧链包括包含二羧酸单酯的聚乙二醇的共聚物。在进一步的实施方案中，保护侧链包括唾液酸链。在进一步的实施方案中，保护侧链的分子量为500-20,000道尔顿。在进一步的实施方案中，保护侧链包括其单酯化衍生物，优选甲氧基聚乙二醇-酯、甲氧基聚丙二醇-酯、或甲氧基聚乙二醇和甲氧基聚丙二醇-酯的共聚物。在进一步的实施方案中，保护侧链包括聚乙二醇单胺、甲氧基聚乙二醇单胺、聚丙二醇单胺、甲氧基聚丙二醇单胺、聚乙二醇肼、甲氧基聚乙二醇肼、聚丙二醇肼、甲氧基聚丙二醇肼、聚乙二醇咪唑、甲氧基聚乙二醇咪唑、聚丙二醇咪唑、甲氧基聚丙二醇咪唑、聚乙二醇二酸、甲氧基聚乙二醇二酸、聚丙二醇二酸、甲氧基聚丙二醇二酸中的任一种，其中末端胺、肼、咪唑或酸用来连接到载体、疏水基团或靶向分子上。在进一步的实施方案中，保护侧链包括聚(乙二醇)与一种或几种由聚氨基酸、聚丙交酯乙交酯共聚物、多糖、聚酰胺胺、聚乙烯亚胺或多核苷酸代表的聚合物(参见聚合载体)的甲氧基聚(乙二醇)咪唑嵌段共聚物，其中这些嵌段优选地交替存在，得到优选直链的嵌段共聚物。在进一步的实施方案中，保护侧链优选地通过单键与载体或疏水基团连接。 
在另一个实施方案中，本发明涉及任一种具有保护链和载体的上述组合物，其中载体包括选自下组的任一种：固体支持体、纳米颗粒和微粒。在进一步的实施方案中，载体包括嵌段共聚物。在进一步的实施方案中，载体包括聚合载体。在进一步的实施方案中，聚合载体 选自聚氨基酸、聚乙烯亚胺、天然糖类、胺化多糖、胺化寡糖、聚酰胺胺、聚丙烯酸、多元醇、磺化多糖、磺化寡糖、羧化多糖、羧化寡糖、氨基羧化多糖、氨基羧化寡糖、羧甲基化多糖和羧甲基化寡糖。在进一步的实施方案中，聚合载体是具有2-560个氨基酸单位的聚氨基酸。在进一步的实施方案中，聚合载体是分子量为1,000-100,000道尔顿的聚氨基酸。在进一步的实施方案中，聚合载体是由单一种类氨基酸组成的聚氨基酸。在进一步的实施方案中，聚合载体是由至少两种不同种类的氨基酸组成的聚氨基酸。在进一步的实施方案中，聚合载体是一种聚氨基酸并且其中该聚氨基酸是嵌段共聚物。在进一步的实施方案中，聚合载体是一种聚氨基酸并且其中该聚氨基酸包括通过可切割的键连接的聚氨基酸片段。在进一步的实施方案中，可切割的键是S-S键。在进一步的实施方案中，聚合载体是选自聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、聚-α，β-(2-氨基乙基)-D，L天冬酰胺、聚-L-天冬氨酸、聚-D-天冬氨酸、聚-L-谷氨酸、聚-D-谷氨酸、聚-L-丝氨酸、聚-D-丝氨酸、聚-L-苏氨酸、聚-D-苏氨酸、聚-L-酪氨酸或聚-D-酪氨酸的聚氨基酸。在进一步的实施方案中，聚合载体是一种聚氨基酸并且该聚氨基酸是非蛋白质的。 
在另一个实施方案中，本发明涉及任一种上述组合物，其进一步包含与保护链、疏水基团或载体共价连接的靶向分子。在进一步的实施方案中，本发明涉及任一种上述具有靶向分子的组合物，其中该靶向分子选自抗体、抗体片段、嵌合抗体、酶、酶的准底物(quasisubstrate)、凝集素、糖配体、肽、蛋白质、受体配体、细胞表面结合蛋白、细胞表面结合肽、细胞表面结合化合物、胞外基质结合肽、胞外基质结合蛋白、胞外基质结合化合物。 
在另一个实施方案中，本发明涉及任一种上述组合物，其进一步包含与载体共价连接的定向分子。在进一步的实施方案中，本发明涉及上述任一种含有定向分子的组合物，其中该定向分子包括肽、硫酸部分、磺酸部分、磷酸部分、膦酸部分、双膦酸部分、羧基部分、氨基部分、赖氨酸和精氨酸中的任一种。在进一步的实施方案中，本发 明涉及任一种上述具有定向分子的组合物，其中该定向分子包括可以在聚合骨架和负载分子之间形成桥的金属离子。 
在另一个实施方案中，本发明涉及上述任一种组合物，其进一步包含负载分子，其中该负载分子是可以可逆地结合上述任何组合物的任何分子。在进一步的实施方案中，本发明涉及任一种上述组合物，其进一步包含与疏水基团、靶向分子、定向分子和/或保护侧链可解离连接的负载分子的任意组合。在进一步的实施方案中，负载分子是一种显像剂。在进一步的实施方案中，负载分子是一种治疗剂。在进一步的实施方案中，该治疗剂是细胞因子、淋巴因子、激素、激素激动剂、激素拮抗剂、抗生素、止痛剂、毒素、光毒素、细胞抑制剂、细胞毒性剂、精神药物、甾体抗炎药、非甾体抗炎药、免疫抑制剂、抗细菌药、抗病毒药、抗真菌药、螯合剂、维生素、蛋白酶抑制剂、杀虫剂、氨基糖苷、多粘菌素、ACE抑制剂、肽、蛋白质、抗体、抗体片段、重组肽、从植物中分离的肽、从真菌中分离的肽、从动物中分离的肽、从细菌中分离的肽、从病毒中分离的肽、从培养的细胞中分离的肽、合成肽、拟肽化合物、有机化合物、合成有机化合物、从植物中分离的有机化合物、从真菌中分离的有机化合物、从动物中分离的有机化合物、从细菌中分离的有机化合物、从病毒中分离的有机化合物、从培养的细胞中分离的有机化合物、有机金属化合物、脱氧核糖核酸、核糖核酸、寡核苷酸、核酸衍生物、寡糖、碳水化合物、脂质、光敏性有机化合物和蛋白聚糖。 
在另一个实施方案中，本发明涉及任一种上述具有负载分子的组合物，其中负载分子是选自下组的治疗剂：胰高血糖素样肽、胰高血糖素样肽衍生物、依泽那太(exenatide)、胰高血糖素样肽-1、胰高血糖素样肽-2、瘦蛋白片段、肠抑胃肽(GIP)、表皮生长因子(EGF)受体配体、EGF、转化生长因子α(TGF-α)、β细胞生长因子(Betacellulin)、胃泌素/缩胆囊素受体配体、胃泌素、缩胆囊素、溶葡萄球菌素、干扰素、干扰素γ、干扰素β、干扰素α、白介素-1、白介素-2、白介素-4、白介素-6、白介素-8、白介素-10、白介素-12、肿瘤坏死因子、肿瘤 坏死因子α、肿瘤坏死因子β、auristatin、乳链菌肽、胰岛素、胰岛素样生长因子、生长激素、生长激素释放激素(GHRH)、神经生长因子、脑源性神经营养因子、酶、内皮抑制素、制管张素、血小板反应素(trombospondin)、尿激酶、链激酶、凝血因子VII、凝血因子VIII、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、血小板生成素(thrombopoedin)、降钙素、甲状旁腺素(PTH)及其片段、促红细胞生成素、心房钠尿肽、单克隆抗体、单克隆抗体片段、促生长素抑制素、蛋白酶抑制剂、促肾上腺皮质激素、促性腺激素释放激素、催产素、促黄体生成激素释放激素、促卵泡激素、葡糖脑苷脂酶、血小板生成素(thrombopoiedin)、非格司亭(filgrastin)、前列腺素、依前列醇、前列环素、环孢菌素、血管升压素、特利加压素(terlipressin)、去氨加压素、色甘酸钠(色甘酸钠或二钠)、血管活性肠肽(VIP)、万古霉素、抗微生物剂、多粘菌素b、抗真菌药、抗病毒药、恩夫韦地(Enfuvirtide)、多柔比星、依托泊苷、芬太尼、氯胺酮和维生素类。在进一步的实施方案中，治疗剂是胰高血糖素样肽-1。在进一步的实施方案中，治疗剂是胰高血糖素样肽-2。在进一步的实施方案中，治疗剂是溶葡萄球菌素。在进一步的实施方案中，治疗剂是干扰素。在进一步的实施方案中，治疗剂是干扰素α。在进一步的实施方案中，治疗剂是干扰素β。在进一步的实施方案中，治疗剂是干扰素γ。在进一步的实施方案中，治疗剂是乳链菌肽。在进一步的实施方案中，治疗剂是表皮生长因子(EGF)受体配体。在进一步的实施方案中，治疗剂是EGF。在进一步的实施方案中，治疗剂是转化生长因子α(TGF-α)。在进一步的实施方案中，治疗剂是β细胞生长因子。在进一步的实施方案中，治疗剂是胃泌素/缩胆囊素受体配体。在进一步的实施方案中，治疗剂是胃泌素。在进一步的实施方案中，治疗剂是缩胆囊素。 
在另一实施方案中，本发明涉及一种治疗患者的胰岛素不足型糖尿病的方法，包括：(i)施用治疗有效量的上述具有负载分子的疏水核载体组合物，其中负载分子是GLP-1、EGF受体配体、EGF、TGF-α、 β细胞生长因子、胃泌素/缩胆囊素受体配体、胃泌素或缩胆囊素，和任选地(ii)施用治疗有效量的质子泵抑制剂。在进一步的实施方案中，质子泵抑制剂是奥美拉唑。 
在另一实施方案中，本发明涉及一种治疗患者的胰岛素不足型糖尿病的方法，包括：(i)施用治疗有效量的上述具有负载分子的疏水核载体组合物，其中负载分子是GLP-1，(ii)施用治疗有效量的上述具有负载分子的疏水核载体组合物，其中负载分子是胃泌素/缩胆囊素受体配体、胃泌素或缩胆囊素，和任选地(iii)施用治疗有效量的质子泵抑制剂。在进一步的实施方案中，质子泵抑制剂是奥美拉唑。 
在另一实施方案中，本发明涉及一种治疗患者的胰岛素不足型糖尿病的方法，包括：(i)施用治疗有效量的上述具有负载分子的疏水核载体组合物，其中负载分子是EGF受体配体、EGF、TGF-α或β细胞生长因子，(ii)施用治疗有效量的上述具有负载分子的疏水核载体组合物，其中负载分子是胃泌素/缩胆囊素受体配体、胃泌素或缩胆囊素，和任选地(iii)施用治疗有效量的质子泵抑制剂。在进一步的实施方案中，质子泵抑制剂是奥美拉唑。 
在另一实施方案中，本发明涉及一种治疗患者的感染的方法，包括给有此需要的患者施用治疗有效量的上述任一种疏水核载体组合物，其中负载分子是溶葡萄球菌素。 
基于以下的描述、附图和权利要求书，本发明的这些实施方案、其它实施方案及其特征和特性将是显然的。 
附图说明
图1显示了本发明疏水核组合物的一个实施方案的示意图：A)保护侧链；B)聚合核(黑色)；C)疏水链(灰色)；和D)在较接近载体的基底处保护侧链之间的间距至少为9nm，因为有360度的分布，所示核的每6个聚合残基有1个保护侧链。小圆圈表示负载分子。例如：水合白蛋白(直径＝7.2nm)；水合生长激素(直径＝3nm)；小球过滤直径＜4nm；β-2巨球蛋白(直径＝3.2nm)、肌红蛋白(直径＝3.9nm)；血红 蛋白(直径＝6.5nm)；γ球蛋白(直径＝11.1nm)；和本-周氏蛋白(Bence-Jones protein)(直径＝5.5nm)。 
图2显示了在制备本发明组合物中有用的用于形成酰胺键的各种化学反应的图示；R1可以是烷基-羧基或芳香基-羧基，R2可以是聚赖氨酸或聚赖氨酸-PEG；或者R1可以是PEG-羧基，R2可以是聚赖氨酸、烷基-聚赖氨酸或芳香基-聚赖氨酸；或者R1可以是聚谷氨酸或聚天冬氨酸，R2可以是PEG-胺、烷基-胺或芳香-胺；或者R1可以是聚谷氨酸-PEG或聚天冬氨酸-PEG，R2可以是烷基-胺或芳香-胺。EDC是DCC的水溶性形式；两者都可以用于进行反应。 
图3显示了合成本发明组合物的方案图。 
图4显示了可以用来向含氨基的载体上添加PEG保护基、其类似物或衍生物的一些化学反应。 
图5显示可以用来向含氨基的载体上添加醛PEG衍生物的一些化学反应。为两步缩合-还原反应(a和b)。 
图6显示可以用来向含羟基的载体上添加PEG保护基、其类似物或衍生物的一些化学反应。 
图7显示可以用来向含羟基的载体上添加烷基疏水基团的一些化学反应。 
图8显示可以用来向含羟基的载体上添加芳香族疏水基团的一些化学反应。 
图9显示一些ε氨基与各种浓度的MPEG反应后每mg产物中的聚赖氨酸(PL)中游离ε氨基的图。y-轴是每mg产物(PLPEG)中的游离ε氨基的量，x-轴是反应之前的反应物(PEG和PL)比。 
图10显示与PLPEG-III-C12和PLPEG-III孵育后游离GLP-1的HPLC描迹图；A)总GLP-1为180μg在0.5ml PBS中。这是通过100kDa滤器的50μl GLP-1注射剂。可用于结合载体的GLP-1总量为144μg；B)不结合450μgPLPEG载体的50μl GLP-1注射剂。未结合的GLP-1通过100kDa滤器。未结合的GLP-1总量为55μg。不含C12的PLPEG的总容量为89μg或者其重量的20％；C)为不结合450μg C12-PLPEG 载体的50μl GLP-1注射剂。未结合的GLP-1应当通过100kDa滤器。未结合的GLP-1总量为0μg。450μg C12-PLPEG的总容量至少为144μg(均可以获得)。该描迹图证实疏水核载体中疏水部分的存在增强了负载分子(在这种情况下为GLP-1)与载体的结合。 
图11显示包含载体、疏水基团、具有(B)以及不具有(A)负载分子的本发明疏水核组合物的两个实施方案的图示。 
图12显示包含载体、疏水基团、定向分子、具有(B)以及不具有(A)负载分子的本发明疏水核组合物的两个实施方案的图示。 
图13显示包含载体、保护链、疏水基团、具有(B)以及不具有(A)负载分子的本发明疏水核组合物的两个实施方案的图示，其中独立于保护基，疏水基团与载体键合。该组合物核中疏水部分的密度不象载体上的所有部位都被疏水基团占据时那样高。 
图14显示包含载体、保护链、疏水基团、定向分子、具有(B)以及不具有(A)负载分子的本发明疏水核组合物的两个实施方案的图示，其中独立于保护基，疏水基团与载体直接键合。该组合物核中疏水基团的密度不象载体上的所有部位都被疏水部分占据时那样高。 
图15显示包含载体、保护链、靶向分子、疏水基团、具有(B)以及不具有(A)负载分子的本发明疏水核组合物的两个实施方案的图示，其中独立于保护基，疏水基团与载体键合。载体上疏水基团的密度不象核中的所有部位都被疏水基团占据时那样高。 
图16显示包含载体、保护链、靶向分子、疏水基团、定向分子、具有(B)以及不具有(A)负载分子的本发明疏水核组合物的两个实施方案的图示，其中独立于保护基，疏水基团与载体键合。载体上疏水基团的密度不象载体上的所有部位都被疏水部分占据时那样高。 
图17显示本发明疏水核组合物的两个实施方案的图示，其包含载体、与载体直接键合的保护链、具有共价连接的保护链的疏水基团、没有共价连接的保护链的疏水基团，具有(A)以及不具有(B)负载分子。 
图18显示本发明疏水核组合物的两个实施方案的图示，其包含载 体、与载体直接键合的保护链、具有共价连接的保护链的疏水基团、疏水基团、定向分子，具有(A)以及不具有(B)负载分子。 
图19显示本发明疏水核组合物的两个实施方案的图示，其包含载体、与载体直接键合的保护链、具有共价连接的保护链的疏水基团、靶向分子、没有共价连接的保护链的疏水基团，具有(A)以及不具有(B)负载分子。 
图20显示本发明疏水核组合物的两个实施方案的图示，其包含载体、与载体直接键合的保护链、具有共价连接的保护链的疏水基团、靶向分子、没有共价连接的保护链的疏水基团、定向分子，具有(A)以及不具有(B)负载分子。 
图21显示本发明疏水核组合物的两个实施方案的图示，其包含载体、具有共价连接的保护链的疏水基团、没有共价连接的保护链的疏水基团，具有(A)以及不具有(B)负载分子。 
图22显示本发明疏水核组合物的两个实施方案的图示，其包含载体、具有共价连接的保护侧链的疏水基团、没有共价连接的保护链的疏水基团、定向分子，具有(A)以及不具有(B)负载分子。 
图23显示本发明疏水核组合物的两个实施方案的图示，其包含载体、具有共价连接的保护链的疏水基团、靶向分子、没有共价连接的保护链的疏水基团，具有(A)以及不具有(B)负载分子。 
图24显示本发明疏水核组合物的两个实施方案的图示，其包含载体、具有共价连接的保护链的疏水基团、靶向分子、没有共价连接的保护链的疏水基团、定向分子，具有(A)以及不具有(B)负载分子。 
图25显示本发明疏水核组合物的两个实施方案的图示，其包含载体、具有共价连接的保护链的疏水基团，具有(A)以及不具有(B)负载分子。 
图26显示本发明疏水核组合物的两个实施方案的图示，其包含载体、具有共价连接的保护链的疏水基团、定向分子，具有(A)以及不具有(B)负载分子。 
图27显示本发明疏水核组合物的两个实施方案的图示，其包含 载体、靶向分子、具有共价连接的保护链的疏水基团，具有(A)以及不具有(B)负载分子。 
图28显示本发明疏水核组合物的两个实施方案的图示，其包含载体、靶向分子、具有共价连接的保护链的疏水基团、定向分子，具有(A)以及不具有(B)负载分子。 
图29显示本发明疏水核组合物的两个实施方案的图示，其包含载体、保护链，其中该保护链提供疏水性并且与载体直接键合，具有(A)以及不具有(B)负载分子。 
图30是假定的血液中的游离负载分子，其自然半衰期为20分钟。不使用载体的游离负载分子的浓度具有显著波动。使用载体时，游离负载分子将保持治疗浓度。疏水载体的nM浓度降低，半衰期为20小时。A)不使用疏水载体每天3次注射5mg/kg产生的负载分子水平，该负载分子的血液半衰期为20分钟；B)载有负载分子的疏水载体的半衰期为20小时；C)疏水载体保持的游离负载分子的治疗水平。 
图31显示每mg PLPEG(聚赖氨酸-聚乙二醇共聚物)的氨基量和聚赖氨酸的％氨基饱和度之间的理论和实际关系。其作为PLPEG组合物的二次确认是非常有用的。该PEG化过程在合成过程中是完全可再现和可调节的，这是通过继续反应直到在反应过程中使用TNBS氨基测定作为反馈指导达到所需％PEG化。产率大约为原材料的50-60％(5-6g)。理论预测值用下列方程计算：X＝[100x(C-Y)]/5YC+C]；其中X为％饱和度；Y为通过TNBS测定的每克PLPEG的mmol NH2；C为通过TNBS测定的每克PL(聚赖氨酸)的mmol NH2。该方程中5YC中的5表示使用的PEG的大小，在此情况下为5kDa，因而是5YC。如果使用10kDa PEG，则为10YC。这是有用的，因为一旦生成PLPEG产物，即可以通过对终产物的单一TNBS试验测定聚赖氨酸的氨基的百分饱和度，来确定Y，并可以由Y计算X。 
图32.这是反应产物通过100kDa MWCO膜(AmershamBiosciences，Needham，MA)纯化之前和之后的凝胶过滤色谱图，显示所有未反应的PEG都已被除去。使用的柱是Ultrahydrogel Linear (0.78×30cm，Waters)，以0.6ml/min PBS的流速洗脱。使用折射率检测仪检测该物质。图A是清除未反应的5kDa PEG之前的20PLPEG5-55(20kDa聚赖氨酸，其中55％的氨基与5kDa分子量的PEG琥珀酸酯反应)。图B是单独的5kDa PEG。图C是纯化后的20PLPEG5-55。 
图33.这些是对应于已知Stokes半径的蛋白质的各种载体的Stokes半径。它们在Ultrahydrogel Linear柱(0.78cm直径×30cm长度)上使用流速为0.6ml/min的含15％乙腈的PBS作为流动相进行分析。20PL-PEG5-55(20kDa聚赖氨酸，其中55％的氨基与5kDa分子量的PEG琥珀酸酯反应)、40PL-PEG5-30(40kDa聚赖氨酸，其中30％的氨基与5kDa分子量的PEG琥珀酸酯反应)、40PL-PEG5-51(40kDa聚赖氨酸，其中51％的氨基与5kDa分子量的PEG琥珀酸酯反应)和40PL-PEG5-27(40kDa聚赖氨酸，其中27％的氨基与5kDa分子量的PEG琥珀酸酯反应)大于肾小球滤过的截止值，该截止值大于4nm(40埃)的直径(或者20埃的半径)。具有已知Stokes半径的蛋白质用作参照物，包括甲状腺球蛋白(669kDa；85.5埃stokes半径)、过氧化氢酶(248kDa；52.2埃stokes半径)和BSA(67kDa；35.5埃stokes半径)。 
图34.显示疏水载体在各种条件下的负载效率(n＝6)。y-轴是不结合载体的量。在该图中，10mg PGC-HC24(20PLPEG5-55C24；其为20kDa聚赖氨酸，其中55％的氨基与5kDa分子量的PEG琥珀酸酯反应并且其余的氨基与二十四烷酸或C24反应)在x-轴所示的不同条件下负载0.6mg GLP1。负载后，所有样品加至1ml PBS(pH 7.4)并通过100kDa分子截止值的纤维素滤膜过滤器(Millipore，Bedford，MA)过滤，各种滤液中的游离GLP-1用反相HPLC定量。经不含载体的对照样品测定，过滤器不结合GLP-1(未显示)。显示最高负载的条件是70％丙酮然后干燥。这种特定的负载过程(使用丙酮)预期也适用于其它蛋白质，而其它过程，特别是水负载，可能随蛋白质不同而不同。该过程利用了溶剂暴露蛋白质的疏水部分和载体的疏水部分的能力。对于10-30kDa的大蛋白质，减少有机溶剂的量可以使变性的风险最小化。 
图35.显示基于C18的PGC-HC(C18-20PLPEG5-55；其为20kDa 的聚赖氨酸，其中55％的氨基与5kDa分子量的PEG琥珀酸酯反应，其余的氨基与硬脂酸或C18反应)在4-5个部位以纳摩尔范围的Kd(249nM)结合肽(例如GLP-1)。其它部位具有较低的亲和力，两个部位的Kd为2.7uM，另外两个部位的Kd为33uM。在该实验中，10mg载体负载(如图34所示，丙酮法)不同量的GLP1。将每种负载的载体溶解在1ml PBS中，并使之平衡2小时。每种含有游离的和结合的GLP1的溶液通过100kDa分子截止值的过滤器过滤，每种含有游离GLP1的滤液通过反相HPLC定量。用70％的乙腈从每种溶液中释放结合的GLP1，并类似地通过HPLC定量。 
图36.显示基于C24的PGC-HC(C24-20PLPEG5-55；其为20kDa的聚赖氨酸，其中55％的氨基与5kDa分子量的PEG琥珀酸酯反应，其余的氨基与二十四烷酸或C24反应)在3-4个部位以纳摩尔范围的Kd(77nM)结合肽(例如GLP-1)。其它部位具有较低的亲和力，两个部位的Kd为2uM。其它较低亲和力的部位未进行分析。在该实验中，10mg载体负载(如图34所示，丙酮法)不同量的GLP1。将每种负载的载体溶解在1ml PBS中，并使之平衡2小时。每种含有游离的和结合的GLP1的溶液通过100kDa分子截止值的过滤器过滤，每种含有游离GLP1的滤液通过反相HPLC定量。用70％的乙腈从每种溶液中释放结合的GLP1，并类似地通过HPLC定量。 
图37.该图显示GLP-1向C18-PL-PEG5-55上的负载(该疏水核载体是20kDa的聚赖氨酸，其中55％的氨基与5kDa分子量的PEG琥珀酸酯反应，其余的氨基与硬脂酸或C18反应)。该图显示当使用图34所示的丙酮法使10mg疏水核载体负载不同量的GLP-1(x-轴)时，结合的(灰色条)和游离的(透明条)的GLP-1的量。将每种负载的载体溶解在1ml PBS中，并使之平衡2小时。每种含有游离的和结合的GLP1的溶液通过100kDa分子截止值的再生纤维素滤膜过滤器(Millipore，Bedford，MA)过滤。用70％的乙腈释放含有游离和结合的GLP1的滤液，然后进行类似的过滤，并通过反相HPLC定量(n＝9)。可以看出，负载能力为4-5％，(0.4-0.5mg/10mg载体)，代表每个载体4-5个部 位。应当注意，在1.0mg负载时只有2/3的蛋白质被负载。负载提高到容量以上可能是由于其它Kd为3.7uM和33uM的低亲和力部位。这些部位可能是由于与PEG或纳米结构内表面的其它组合的相互作用。 
图38.该图显示在载体用PBS千次平衡后保持与载体结合的GLP-1的量。通过在复合物穿过大小排阻柱(0.78×30cm)后监测GLP-1-结合的载体的量检测GLP1-Hydrophoboc载体(C18-20PLPEG555)复合物的溶液稳定性。使用图34所示的丙酮法将总共2mg GLP-1加载到不同量的C18-载体上。含有复合的(结合的)和游离的GLP-1的溶液通过大小排阻层析法洗脱(n＝5)并在220nm监测。游离的GLP-1达到总体积(Vt)，而载体达到空隙容积(Vo)。单独的载体用作定量与载体结合的GLP-1面积的空白，以BioSep 2000柱(0.78×30cm；Phenomenex)的Vo表示。应当注意，高标准差是由于高空白而不是负载差异性。这基本上显示该复合物是稳定的，通过稳定性测试证实Kd为249nM。 
图39.显示在存在和不存在PGC-HC18载体(该疏水核载体为20kDa的聚赖氨酸，其中55％的氨基与5kDa分子量的PEG琥珀酸酯反应，并且其余氨基与硬脂酸或C18反应)或者20PLPEG5-55(该载体为20kDa的聚赖氨酸，其中55％的氨基与5kDa分子量的PEG琥珀酸酯反应，并且其余氨基不反应)的条件下，在磷酸盐缓冲液中用DPP4消化GLP1的体外消化液的样品色谱图。完整GLP1为早期洗脱峰(指向右侧的箭头)。GLP1的降解产物(除去组氨酸残基，较低电荷，在pH2的层析条件下)在稍后的时间洗脱(指向左侧的箭头)。在PGC-HC18载体的存在下，DPP4对GLP1的降解明显延迟。对照(单独的GLP1)和具有20PLPEG5-55的GLP1都降解到相似的程度。该分析进行多次，结果非常明确。HPLC分析使用来自Phenomenex的Mercury SynergyMax-RP(0.4×2cm)，以1.5ml/min的流速洗脱，梯度为25-50％乙腈/水/0.1％TFA，时间为5分钟，洗脱液在220nm监测。具有以及不具有载体的GLP1溶液与1.25mU/ml DPP4孵育24小时，在HPLC分析之前加入DPP4抑制剂终止消化。 
图40.用GLP1和疏水核载体(PGC-HC18；该疏水核载体为20kDa 的聚赖氨酸，其中55％的氨基与5kDa分子量的PEG琥珀酸酯反应，其余氨基与硬脂酸或C18反应)中所含的GLP1诱导的钙流入。显示了GLP1(20nM)和GLP1制剂(3.3ug/ml PGC-HC18；含有20nM GLP1)在INS细胞中诱导的钙流入。细胞负载Fura-2(Molecular probes)，在加入PBS(磷酸盐缓冲液)、GLP-1、C18制剂(3.3ug/ml PGC-HC18；含有20nM GLP1)和C18载体(3.3ug/ml PGC-HC18)之前(1-9秒)和之后(11-60秒)随时间测定细胞内荧光。可见PGC-HC18配制的GLP1(C18-制剂)在该体外试验中具有生物活性(n＝5)。 
图41.配制的GLP1导致葡萄糖刺激的胰岛素释放增强。显示了在不同浓度的GLP1和配制的GLP1(PGC-HC18，含有2％重量的GLP1)存在下葡萄糖刺激的INS细胞释放的胰岛素水平。该制剂中使用的PGC-HC18是20kDa的聚赖氨酸，其中55％的氨基与5kDa分子量的PEG琥珀酸酯反应，其余氨基与硬脂酸或C18反应。将胰岛素瘤细胞或INS细胞(50,000)接种到96孔板中，使之在常规培养基(含有11.1mM葡萄糖)中附着过夜，培养基中的葡萄糖经一夜降至5.5mM。次日，用含有11.1mM葡萄糖和不同浓度的配制和未配制的GLP1(x-轴)的不含血清的培养基诱导胰岛素释放。用LINCO Elisa试剂盒测定在15分钟内释放的胰岛素(n＝3)。 
图42.静脉内施用GLP1和配制的GLP1(PGC-HC18，含有2％重量的GLP1)后，血液中总GLP1的时间依赖性减少。该制剂中使用的PGC-HC18为20kDa的聚赖氨酸，其中55％的氨基与5kDa分子量的PEG琥珀酸酯反应，其余氨基与硬脂酸或C18反应。单独施用的GLP1的清除半衰期仅数分钟，而配制的GLP1的半衰期至少为6小时。给雌性Balb/c小鼠静脉注射2mg单独的GLP-1或2mg在PGC-HC18制剂中的GLP-1。在给定时间点采集末梢血。用Linco的Elisa试剂盒(LINCOResearch，St.Charles，MO)测定总GLP1(PGC-HC18结合的和未结合的)。 
图43.皮下(s.c.)施用GLP1和配制的GLP1(PGC-HC18，含有2％重量的GLP1)后，血液中总GLP1的时间依赖性减少。该制剂中使用的 PGC-HC18为20kDa的聚赖氨酸，其中55％的氨基与5kDa分子量的PEG琥珀酸酯反应，其余氨基与硬脂酸或C18反应。单独施用的GLP1的清除半衰期仅数分钟，而配制的GLP1的半衰期至少为24小时。给雌性Balb/c小鼠皮下注射2mg单独的GLP-1或2mg在PGC-HC制剂中的GLP-1。在给定时间点采集末梢血。用Linco的Elisa试剂盒(LINCOResearch，St.Charles，MO)测定总GLP1(载体结合的和未结合的)。 
图44.皮下(s.c.)施用GLP1和配制的GLP1(PGC-HC18，含有2％重量的GLP1)后，血液中总GLP1的时间依赖性减少。该制剂中使用的PGC-HC18为20kDa的聚赖氨酸，其中55％的氨基与5kDa分子量的PEG琥珀酸酯反应，其余氨基与硬脂酸或C18反应。单独施用的GLP1的清除半衰期仅数分钟，而配制的GLP1的半衰期至少为20小时。给预先插管的雄性Sprague Dawley大鼠皮下注射1ug单独的GLP-1或1ug在PGC-HC制剂中的GLP-1。通过颈静脉插管采血，在分析前将血清保存在-80℃下。用Linco的Elisa试剂盒(LINCO Research，St.Charles，MO)测定总GLP1(PGC-HC18结合的和未结合的)。 
图45.显示从用60mg/kg链脲霉素诱导糖尿病后13天开始的4周治疗期间，15次葡萄糖采样的平均总量。在治疗前，每2天测定一次血液葡萄糖水平，共6天，为300-600mg/dl。随机化后，各组的平均血糖水平为421-433mg/dl。大鼠每2天皮下治疗一次。对照组接受盐水，载体对照仅接受PGC-HC18(1mg，在PBS中)，GLP-1组接受20ugGLP-1，PGC-HC 18/GLP-1组接受负载20ug GLP-1的1mg PGC-HC18。该制剂中使用的PGC-HC18为20kDa的聚赖氨酸，其中55％的氨基与5kDa分子量的PEG琥珀酸酯反应，其余氨基与硬脂酸或C18反应。一只GLP-1动物在2周时间点时由于伴有严重体重减轻的严重糖尿病而需要处死。将每2天测定的非空腹糖水平加在一起，得到每只动物的曲线下面积(AUC)，平均得到每只动物的循环变异性。在用配制的GLP-1-治疗的动物和对照或仅用PGC-HC治疗的动物之间具有显著性差异(*P＜0.01)。 
图46.显示从用60mg/kg链脲霉素诱导糖尿病后第13天开始的4周 治疗期结束时链脲霉素糖尿病大鼠的平均体重(+/-标准差；n＝4)。所有动物在链脲霉素治疗前的初始体重为240-260克。对照组接受盐水，载体对照仅接受PGC-HC18(1mg，在PBS中)，GLP-1组接受20ugGLP-1，PGC-HC18/GLP-1组接受负载20ug GLP-1的1mg PGC-HC18。该制剂中使用的PGC-HC18为20kDa的聚赖氨酸，其中55％的氨基与5kDa分子量的PEG琥珀酸酯反应，其余氨基与硬脂酸或C18反应。用PBS或单独的载体治疗的链脲霉素糖尿病大鼠比用制剂治疗的动物具有显著更多的体重减轻(P＜0.01)。用不含载体的单独GLP1治疗的动物组显示比GLP-1制剂治疗的大鼠更大的反应差异性。 
图47.该图来源于从用60mg/kg链脲霉素诱导糖尿病后第13天开始的4周治疗期结束时链脲霉素糖尿病大鼠的大鼠胰脏的组织切片(+/-标准差；n＝4)。大鼠胰脏用抗-BrdU-抗体和苏木精染色，并且以250倍放大倍数照像。定位胰岛，计数每个胰岛中BrDU阳性核的数目。对照组接受盐水(A)，载体对照仅接受PGC-HC18(1mg，在PBS中)(B)，GLP-1组接受20ug GLP-1(C)，PGC-HC18/GLP-1组接受负载20ugGLP-1的1mg PGC-HC18(D)。该制剂中使用的PGC-HC18为20kDa的聚赖氨酸，其中55％的氨基与5kDa分子量的PEG琥珀酸酯反应，其余氨基与硬脂酸或C18反应。抗-BrdU-抗体染色显示与PBS或空载体治疗的大鼠(A和B)相比，在GLP-1和GLP-1/PGC-HC18制剂治疗的大鼠的胰岛(C和D)中发生显著更多的细胞分裂。另外，在GLP-1/PGC-HC18制剂治疗的大鼠的外分泌组织中具有更多的BrdU阳性细胞(数据未显示)，这可能表示来自导管祖细胞的胰岛细胞的再生。 
图48.显示PGC-HC18在6-7个部位结合有机化合物(例如多柔比星)，Kd为315uM。PGC-HC18为20kDa的聚赖氨酸，其中55％的氨基与5kDa分子量的PEG琥珀酸酯反应，其余的氨基与硬脂酸或C18反应。多柔比星是一种抗癌药。在该实验中，使8mg疏水核载体(如图34所示，丙酮法)负载不同量的多柔比星。将每种负载的载体溶解在1ml PBS中，使之平衡2小时。每种含有游离的和结合的多柔比星的溶液通过100kDa分子截止值过滤器过滤，每种含有游离多柔比星的 滤液通过反相HPLC定量。由在负载过程中使用的多柔比星总量减去通过HPLC测定的游离多柔比星量，确定结合的多柔比星量。 
图49显示多柔比星加载至PGC-HC18的结果。PGC-HC18是20kDa的聚赖氨酸，其中55％的氨基与5kDa分子量的PEG琥珀酸酯反应，其余氨基与硬脂酸或C18反应。多柔比星是一种抗癌药。该图显示了当使用图34所示的丙酮法使8mg PGC-HC18负载不同量的多柔比星(x-轴)时，与PGC-HC18结合的和游离的多柔比星的量。负载后，将每种负载的载体溶解在1ml PBS中，使之平衡2小时。PGC-HC18结合的和游离的多柔比星的混合物通过再生的纤维素滤膜过滤器过滤分离。代表游离多柔比星的滤液通过反相HPLC定量(n＝3)。由在负载过程中使用的多柔比星总量减去通过HPLC测定的游离多柔比星量，确定结合的多柔比星量。 
发明详述 
定义
为了方便起见，在进一步描述本发明之前，在此汇总了在说明书、实施例和所附权利要求书中使用的特定术语。这些定义应当根据公开内容以及本领域技术人员的理解。除非另外定义，此处使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。 
“一种”和“一个”是指一种(一个)或一种(一个)以上(即至少一种/一个)所述对象。例如，“一种元件”是指一种或一种以上的元件。 
本文使用的术语“和/或”应当理解为一种、两种或其任意组合。例如，“A和/或B”包括“A”或“B”或者“A和B”。 
此处所述的任何浓度范围、百分比范围、比例范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任意整数值，并且适当时，包括其分数(如整数的1/10和1/100)，除非另外说明。 
本文使用的“大约”或“基本由组成”的意思是所述数值或范围的±15％，除非另外说明。 
可选方式(例如“或”)的使用应当理解为备选方案的一个、两个 或者任意组合。 
在此使用的术语“疏水基团”是指为非极性的分子或几种分子或化学部分，它们为负载分子提供进行相互作用的疏水环境，以避免周围的水环境。疏水吸引是大分子折叠、底物与酶结合以及限定细胞边界及其内部区室的膜的形成中的主要驱动力。非极性分子在水中被驱动在一起，主要不是因为在不存在水时它们彼此具有高亲和力，而是因为在存在水时它们被水排斥，因为水与其本身强烈地键合。疏水基团可以是在并入载体后不具有阳性或阴性电荷的烃链和/或环化合物，并且能够通过不涉及电荷相互作用的相互作用与分子结合。应当理解某些分子可随着pH的改变而得到或失去电荷，并且本发明包括不含电荷的或者在与治疗剂或负载分子结合期间为疏水性的组合物。还应当理解，疏水基团计为独立于聚合载体的实体，因此，例如当聚合载体是聚氨基酸时，聚氨基酸上的天然R基不计为疏水基团。然而，可以将R基衍生化以添加疏水基团。例如，可以通过丁胺R基的酰胺化将疏水基团添加到聚赖氨酸载体上。有时，疏水基团可以在分子的一个末端含有设计为定向分子的氨基或羧基，该定向分子应当被认为是独立于疏水基团的(例如具有羧基的荧光素分子)。 
术语″定向分子″在本文中是指帮助负载分子与本发明的疏水核组合物结合使得负载分子以特定方式定向而同时与组合物的疏水基团相互作用的任意分子结构。定向分子与聚合载体骨架正常连接。在大多数情况中，除了定向作用以外，定向分子还增强或者加强了负载分子与载体的结合。定向分子可以选自肽、硫酸、磺酸、磷酸、膦酸、双膦酸、赖氨酸和精氨酸。定向分子也可以包含可以在聚合骨架和负载分子之间形成桥的金属离子。定向分子也可以是共价锚定到聚合载体上的氨基或羧基部分。 
本文使用的术语“衍生物”或“类似物”是指其核心结构与母体化合物相同或非常相似，但是具有化学或物理修饰如不同的或另外的基团的化合物；该术语包括可以与其它原子或分子连接的母体化合物的共聚物。该术语也包括与母体肽至少有50％序列同一性的肽。该术语 也包括与母体肽相比连接有另外的基团如脂肪酸和/或另外的氨基酸的肽。该术语也包括与母体聚合物相比连接有另外的基团如烷氧基的聚合物。该术语也包括与母链相比连接有另外的基团的分支或非分支的烷基链。 
术语“靶向部分”、“靶向分子”或“靶向基团”是指帮助组合物构建体在特定靶区定位、进入靶细胞和/或与靶受体结合的任意分子结构。例如，脂质(包括阳离子、中性和甾体脂质、病毒体和脂质体)、抗体、凝集素、配体、糖、甾类、激素、营养素、肽和蛋白质可以作为靶向部分。“靶标”是靶向构建体或疏水核组合物所结合的部位。靶标可以在体内或在体外。在某些实施方案中，靶标可以是肿瘤(例如脑、肺(小细胞和非小细胞)、卵巢、前列腺、乳腺和结肠的肿瘤以及其它癌和肉瘤)。在其它实施方案中，靶标可以是感染(例如细菌、病毒(例如HIV、疱疹、肝炎)和病原真菌(假丝酵母属的种))部位。在另外一些实施方案中，靶标可以是指靶向部分所结合的分子结构，例如半抗原表位、受体、dsDNA片段、碳水化合物或酶。另外，靶标也可以是一种类型的组织，例如神经元组织、肠组织、胰腺组织等。 
在此使用的术语“负载分子”包括可以装载到本发明疏水核组合物中的任何分子，包括诊断剂和治疗剂。 
在此使用的术语“治疗剂”是指任何在受试者体内局部或全身作用的为生物、生理或药理学活性物质的化学部分。治疗剂也被称为“药物”，其实例包括胰高血糖素样肽、胰高血糖素样肽衍生物、依泽那太、胰高血糖素样肽-1、胰高血糖素样肽-2、瘦蛋白片段、肠抑胃肽(GIP)、表皮生长因子(EGF)受体配体、EGF、转化生长因子α(TGF-α)、β细胞生长因子、胃泌素/缩胆囊素受体配体、胃泌素、缩胆囊素、溶葡萄球菌素、干扰素、干扰素γ、干扰素β、干扰素α、白介素-1、白介素-2、白介素-4、白介素-6、白介素-8、白介素-10、白介素-12、auristatin、乳链菌肽、胰岛素、胰岛素样生长因子1、生长激素、生长激素释放激素(GHRH)、神经生长因子、脑源性神经营养因子、酶、内皮抑制素、制管张素、血小板反应素、尿激酶、链激酶、凝血因子 VII、凝血因子VIII、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、血小板生成素、降钙素、甲状旁腺素(PTH)及其片段、促红细胞生成素、心房钠尿肽、单克隆抗体、单克隆抗体片段、促生长素抑制素、蛋白酶抑制剂、促肾上腺皮质激素、促性腺激素释放激素、催产素、促黄体生成激素释放激素、促卵泡激素、葡糖脑苷脂酶、血小板生成素、非格司亭、前列腺素、依前列醇、前列环素、环孢菌素、血管升压素、特利加压素、去氨加压素、色甘酸钠(色甘酸钠或二钠)、血管活性肠肽(VIP)、万古霉素、抗微生物剂、多粘菌素b、抗真菌药、抗病毒药、恩夫韦地、多柔比星、依托泊苷、芬太尼、氯胺酮和维生素。也被称为“药物”的治疗剂的其它例子在公知的文件中描述，如Merck Index，the Merck manual of diagnosis andtherapy，the Physicians Desk Reference，和The Pharmacological Basisof Therapeutics，它们包括但不限于蛋白质、肽、药物；维生素；矿物质补充剂；用于治疗、预防、诊断、治愈或缓解疾病的物质；影响身体结构或功能的物质；或前药，它们在置于生理环境中后变为具有生物活性或活性更高。可以使用在施用于受试者后能够从组合物中释放到相邻组织或体液内的各种形式的治疗剂。实例包括甾类和甾类的酯类(例如雌激素、孕酮、睾酮、雄酮、胆固醇、炔诺酮、地高辛配基、胆酸、脱氧胆酸和鹅脱氧胆酸)、含硼化合物(例如碳硼烷)、化疗核苷酸类、药物(例如抗生素、抗病毒药物、抗真菌药物)、烯二炔类(例如卡奇霉素、埃斯波霉素、蒽环类抗生素(dynemicin)、新制癌菌素发色团和可达菌素(kedarcidin)发色团)、重金属络合物(例如顺铂)、激素拮抗剂(例如他莫昔芬)、非特异性(非抗体)蛋白质(例如糖寡聚体)、寡核苷酸(例如与靶核酸序列(例如mRNA序列)结合的反义寡核苷酸)、siRNA、肽、蛋白质、抗体、光动力剂(例如若丹明123)、放射性核素(例如I-131、Re-186、Re-188、Y-90、Bi-212、At-211、Sr-89、Ho-166、Sm-153、Cu-67和Cu-64)、毒素(例如篦麻毒素)和基于转录的药物。 
在此使用的术语“治疗有效量”是指将对患者提供治疗益处的组 合物的量。在特定实施方案中，该术语是指当加载到本发明疏水载体组合物上并且给患者施用时以适用于任何药物治疗的合理利益/风险比产生一定所需效果的治疗剂的量。在某些实施方案中，该术语是指消除、减少或保持(例如阻止扩散)肿瘤或特定治疗方案的其它靶标所需的或足以产生上述效果的量。有效量可以随如下因素改变：所治疗的疾病或病症、施用的具体构建体、受试者的大小和/或疾病或病症的严重程度。本领域技术人员不需要过多的实验凭经验就可以确定具体化合物的治疗有效量。在特定实施方案中，该术语是指使用此处所述组合物所需的或足够的量。在胰岛素不足型糖尿病的治疗中，治疗有效量是具有相应负载分子的本发明组合物将改善葡萄糖内稳态或者使患者血液葡萄糖水平正常化和/或在胰脏中再生β-胰岛细胞的量。β-胰岛细胞的再生可以通过监测血液葡萄糖水平、血液中的血红蛋白Alc水平、C-肽水平或胰岛素水平间接测定。 
术语“诊断剂”是任何可用于对患者进行诊断或成像的化学部分。例如，诊断剂包括含有放射性同位素如铟或锝的显像剂；含有碘、锝或钆的造影剂；酶，如辣根过氧化物酶、GFP、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶；荧光物，如荧光素、若丹明和铕衍生物；发光物，如N-甲基吖啶鎓(methylacrydium)衍生物等。 
此处使用的术语“烷基”是指4-36个碳原子(包含)的支链或直链烃，并且可以在载体周围提供非极性或疏水环境。本文使用的烷基也包括为4-36个碳原子的支链或直链烃的分子的一部分，该部分两端的旁边可以是含氮或氧的部分，作为连接到载体和/或保护基上的工具。 
此处使用的术语“低级环烷基”是指4-6个碳原子(包含)的环烃。 
此处使用的术语“可解离连接”、“可逆连接”和“结合”是指非共价键。 
术语本发明的“载体”可以是任何能够支持疏水基团因此又可以与负载分子相互作用的物质。它们是具有多个可修饰的官能团的物质。载体的非限制性例子包括聚合物和共聚物、微粒、纳米颗粒和固体表面。微粒包括直径为100nm或更大的颗粒，而纳米颗粒是直径小 于100nm的颗粒。在一个方面，载体是生物相容性的。 
此处使用的术语“聚合载体”是指由几个连接的化学部分组成的分子，这些化学部分可以相同也可以不同，并且作为疏水基团和/或保护链的连接部位。 
此处使用的术语“非蛋白质聚氨基酸”是指不是由生物体自然形成而是由人工重组改造产生的聚氨基酸。其非限制性例子有聚-(L和/或D)-赖氨酸、聚-(L和/或D)-谷氨酸、聚-(L和/或D)-谷氨酸、聚-(L和/或D)-天冬氨酸、聚-(L和/或D)-丝氨酸、聚-(L和/或D)-苏氨酸、聚-(L和/或D)-酪氨酸和聚-(L和/或D)-精氨酸。 
此处使用的术语″保护侧链″是指由于水与链的广泛连接或结合而保护载体分子、疏水基团和负载分子避免接触其它大分子的分子。由于这种与水分子的广泛结合，保护链也提高了组合物的水溶性。这也意味着保护链给组合物提供了亲水性。术语″保护侧链″与术语″亲水链″、″保护基″和″保护链″可以互换使用。 
此处使用的术语“胺化“是指包括键合氨基的分子。 
引言
本发明部分涉及一种组合物，其包含：(i)载体，(ii)与载体共价连接的疏水基团，(iii)与载体或疏水基团共价连接的保护侧链，和(iv)与疏水基团结合的负载分子。在进一步的实施方案中，载体可以任选地含有与载体或保护侧链共价连接的靶向分子。在进一步的实施方案中，载体可以任选含有与载体共价连接的定向分子。 
本发明的载体组合物包括直链或支链结构或其偶联物的聚合物和共聚物、微团、乳液和固体表面，其中聚合物可以在超分子结构中自组织。载体包括包含共价结合的疏水基团的聚合骨架，其中该基团包括烃链或芳香化合物。载体的疏水部分和负载分子在含水或主要含水的介质如生物液体中彼此相互作用。疏水基团可以包含一种以上的与载体共价连接的烃分子和/或芳香分子。保护基也可以加强负载分子与含有疏水基团的载体的结合。在存在或不存在有机溶剂的条件下，负载分子与疏水基团结合。在一个优选实施方案中，疏水部分包括烃 链，例如但不限于CH3(CH2)xCO-和C6H5(CH2)xCO-，其中x为0-34。可以用来从疏水核载体上洗脱或提取分子的有机溶剂包括但不限于乙腈、甲醇、乙醇和丙醇。需要较大量的有机溶剂来从载体上洗脱负载分子指示紧密的结合。所需的有机溶剂越多，结合越紧密。本发明的一个实施方案是具有含有苯环的疏水基团的载体。为特定负载分子选择与载体连接的疏水基团可根据负载分子的疏水性决定。例如，球状蛋白质在水环境中为球形，因为球形构象在热力学上更稳定。这种稳定性由水驱动，以保持蛋白质的疏水部分远离暴露于水的球体的表面。当球状蛋白质暴露于包含疏水基团的载体时，球状蛋白质构象将改变，从而允许球状蛋白质的核心与疏水部分相互作用。球体越大，蛋白质具有的疏水性越强。在水环境中伸长的蛋白质具有比球状蛋白质更低的疏水性。负载分子与疏水载体的结合意味着在用至少100倍重量当量的水性溶剂洗涤后被载体保持的能力。如果需要与负载分子强结合的载体，可以使用较大的和较多的疏水基团修饰载体。负载分子与包含疏水基团的载体的高亲和力结合将在任意给定时间保持低水平的游离负载分子(即药物或治疗剂)，并且提供保护的负载分子贮库(即，载体结合的负载分子将是贮库)。这将降低治疗剂的给药频率。这也有益于疗效需要低浓度同时在高浓度时具有毒性的治疗剂。本发明还提供一种制备和使用用于特定治疗化合物的疏水核载体的方法。 
在一个实施例中，本发明组合物包含聚合程度为2-10,000的线性聚氨基酸骨架载体，载体上共价连接有分子量为300-20,000Da的甲氧基聚乙二醇(mPEG)保护链和疏水基团，其中链和疏水基团独立地与骨架连接。在另一个实施例中，载体的聚合程度为20-1,000。在另一个实施例中，载体的聚合程度为50-300。本发明的疏水基团可以包括芳香化合物和脂肪族基团，也可以包含氮和/或氧，在与载体连接之前可以具有电荷。然而，在这些基团与载体骨架聚合物共价连接后，电荷消失，从而使它们成为疏水性的。这些疏水核载体-保护基组合物将结合具有一定疏水性的负载分子。以纯化状态添加的负载分子将与 载体的疏水部分结合，以提供用于药物递送组合物的制剂。疏水核载体-保护基复合物与负载分子的这种添加或混合可以在水性溶液中进行，任选地随后冻干。或者，这种混合可以在有机溶剂和水的混合物中进行。所述有机溶剂优选地可与水混溶。混合后，混合物可以通过蒸发或冻干干燥(图34)。干燥的混合物通过溶解于水、缓冲液或药物可接受的给药用稀释剂或赋形剂中成为备用制剂。一旦进入血液或任何生理液体中，组合物中的负载分子就将基于负载分子和疏水核载体的平衡结合常数或解离常数释放。游离负载分子的浓度将会保持，只要在载体中存在负载分子贮库。保护基将会非常显著地缓和预期的血液蛋白质释放加速。另外，根据载体中疏水部分的数目和大小，从疏水核载体上释放蛋白质可以是缓慢的或快速的。 
负载分子与疏水基团的结合通过选择疏水基团来控制。通常，脂肪族碳链越长，结合越强。负载分子对于细胞上靶受体的亲和力也可以用作选择疏水基团的指标。理想地，负载分子对于载体中疏水基团的亲和力应低于负载分子对于其生物靶标的亲和力。在溶液中，在游离负载分子和结合的负载分子之间存在平衡。将设计具有疏水基团的载体，使其具有等于所需治疗浓度的游离负载分子。 
疏水核载体提供允许活性分子的稳定性、溶解性和分布显著提高的药物递送系统。 
疏水核载体组合物还可包含共价连接的靶向分子，以利于载体在体外和体内向靶组织和器官和细胞的定位。另外，疏水核载体组合物还可包含共价连接的定向分子，以利于疏水核内负载分子更好地组织化。具有特定蛋白酶敏感末端的负载分子(例如胰高血糖素样肽具有二肽基肽酶IV(DPP-IV)敏感性的N-末端)需要定向。蛋白酶敏感性的末端可以通过沿载体放置定向分子而靠近载体核。该定向分子可以是Bolotin的专利(美国专利号7,138,105)所述的金属离子桥，该专利在此引入作为参考。另外，含有负载分子的疏水载体组合物可以进一步含有包围整个含有负载分子的疏水载体组合物的半透膜，用于皮下或口服给药。半透膜可以由具有大小足以使负载分子通过半透膜的孔的聚 合物片组成。本发明的另外一个目的是提供一种制备和使用其治疗各种疾病的方法。 
具有负载分子的疏水核载体组合物可以具有最大可达几万亿kDa的大小，从而形成扩展的凝胶样组合物的结构，尤其适用于口服、皮下和局部给药。也可以制备较小的疏水核载体组合物以形成凝胶。这可以通过制备亲水保护链与疏水基团的重量比为17及以下的疏水核组合物来实现。例如，当含有聚合载体的组合物中MPEG(保护链)与C18脂肪酸(形成疏水核)的重量比为10时将形成凝胶。也可以将含有负载分子的疏水载体组合物制备成片样结构。这可以通过使用具有可修饰官能团如氨基、羧基或羟基的片状载体来进行，疏水基团、保护基和/或定向分子可以在该官能团处连接。这种含有负载分子例如凝血因子的疏水核载体片可以在紧急情况下和战场上用作治疗伤口的绷带。当负载分子是抗感染药时，该组合物可以用于治疗感染。 
载体
本发明的载体可以是任何能够支持疏水基团，因此可以与负载分子相互作用的物质。本发明的载体必须具有多个可衍生的或可修饰的用于连接疏水基团和/或保护链的官能团。载体的非限制性实例包括聚合物和共聚物、微粒、纳米颗粒和固体表面。在一个方面，载体是生物相容的。 
聚合载体和共聚载体 
在某些实施方案中，本发明组合物的聚合载体或共聚载体，例如包括任一通式所示的重复元件的载体，具有大约500至大约1,000,000道尔顿或更高的分子量，或者大约5,000、10,000、20,000、30,000、40,000或50,000道尔顿，更特别地至少大约100,000道尔顿，甚至更特别地至少大约250,000道尔顿，或者甚至至少500,000道尔顿。数均分子量(Mw)也可以在宽范围内改变，但是通常落在大约500至大约200,000道尔顿，或者至少大约500至大约100,000道尔顿，或者甚至大约500至大约50,000道尔顿的范围内。在一个实施方案中，Mw在大约8,000至45,000道尔顿之间不等。在本发明聚合物的特定样品中，可能 存在宽范围的分子量。例如，样品内的分子可能具有相差2、5、10、20、50、100倍或以上的分子量，或者平均分子量相差2、5、10、20、50、100倍或以上。 
一种测定分子量的方法是凝胶渗透色谱法(″GPC″)，也被称为凝胶过滤色谱法(″GFC″)，例如混合床柱、CH2Cl2溶剂、光散射检测器和离线dn/dc。其它方法是本领域中公知的。 
在某些实施方案中，聚合物在40℃氯仿中的固有粘度通常从大约0.01至大约2.0dL/g不等，或者大约0.01至大约1.0dL/g，偶尔大约0.01至大约0.5dL/g。 
在一个实施方案中，载体可以由聚氨基酸组成，优选由非蛋白质聚氨基酸、聚乙烯亚胺、天然糖类、胺化和羧化多糖、胺化和羧化寡糖、磺化多糖、磺化寡糖、氨基羧化多糖、氨基羧化寡糖、羧甲基化多糖、羧甲基化寡糖、聚酰胺胺、聚丙烯酸、多元醇、聚乙烯醇和聚硫醇组成。所有这些载体聚合物具有可以用来连接疏水基团或保护基的氨基、羧基、羟基、磺酸或硫醇基团，这基本上改变了它们的性质，并且使其同时为可溶的和疏水的。 
载体可以由含有可修饰官能团例如但不限于多碱、多元醇或多酸的聚合物组成，例如聚赖氨酸、聚丝氨酸、聚苏氨酸、聚甘油、聚酪氨酸、聚天冬氨酸或聚谷氨酸，或羧化的聚赖氨酸。这些沿骨架的反应性或带电荷的官能团是有用的，因为它们能够与保护基或疏水基或其衍生物或类似物形成化学键。这些官能团也可以用小疏水基团加帽，以除去任何电荷及使载体骨架具有疏水性。 
聚氨基酸可以是单一种类的或者至少两种不同种类的氨基酸的聚合物，或者可以是嵌段共聚物。聚氨基酸可以包括但不限于通过可切割的键例如S-S键连接的聚氨基酸片段。特别是，聚氨基酸可以是聚-(L和/或D)-赖氨酸、聚-(L和/或D)-谷氨酸、聚-(L和/或D)-谷氨酸、聚-(L和/或D)-天冬氨酸、聚-(L和/或D)-丝氨酸、聚-(L和/或D)-苏氨酸、聚-(L和/或D)-酪氨酸、聚-(L和/或D)-精氨酸或聚-α，β-(2-氨基乙基)-(L和/或D)-天冬酰胺。所有这些聚合物都具有可用于连接疏水基团、保 护基或定向分子的氨基、羧基、羟基或硫醇基，使它们同时为可溶的和疏水性的。疏水核载体组合物的聚氨基酸载体优选具有5-560个氨基酸单位，分子量为500-100,000道尔顿，优选是非蛋白质的。 
胺化多糖或寡糖载体的例子包括但不限于聚葡糖胺(壳聚糖)和聚半乳糖胺。 
羧化多糖或寡糖载体的例子包括但不限于聚葡萄糖醛酸和聚半乳糖醛酸。 
聚合载体的其他例子包括羧化或羧甲基化的直链聚-L-赖氨酸(PL)或聚-D-赖氨酸；羧化或羧甲基化的聚α，β-(2-氨基乙基)-D，L-天冬酰胺；聚-L-天冬氨酸；聚-L-谷氨酸、组氨酸与带正电荷或负电荷的氨基酸的共聚物、羧化聚乙烯亚胺，即与碳酸衍生物反应的聚乙烯亚胺；天然糖类或带有羧基的其化学衍生产物，例如：半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、角叉菜胶；氧化的葡聚糖；胺化的例如含有连接的氨基的直链或支链多糖或寡糖；聚羧化的、羧甲基化的、硫酸化的或磷酸化的多糖或寡糖，例如与碳酸、二碳酸、硫酸、氨基硫酸、磷酸衍生物反应的，导致与羧基、氨基羧基、羧甲基、硫酸基、氨基或磷酸基连接。这些寡糖可以通过化学改变例如葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、支链淀粉、纤维素、壳聚糖、琼脂糖、岩藻多糖、半乳聚糖、阿拉伯聚糖、果聚糖、鞣质(tan)、岩藻聚糖、壳多糖、石耳素、果聚糖或果胶而获得。另外，这些多糖或寡糖可以是单糖如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、半乳糖、脱氧葡萄糖、核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖、岩藻糖、木糖、木酮糖、核酮糖、聚酰胺胺的直链或支链异聚物或同聚物；聚丙烯酸；多元醇，例如聚乙烯醇、聚木糖醇，羧基或氨基与之化学连接。聚氨基酸的分子量优选大于500小于100,000。具有窄分子量(MW)分布的聚氨基酸优于具有宽MW分布的聚氨基酸。聚氨基酸通过化学合成或重组技术如遗传工程技术制备。 
在另一个实施方案中，作为载体的聚合物可以是在远端具有疏水基团组成负载分子或活性剂结合部位的聚(乙二醇)(PEG)。该实施方 案可以概要地表示如下：PEG-疏水基团-负载分子。或者，PEG可以沿其骨架官能化，使疏水部分突出于骨架，这将允许负载分子与突出的疏水部分结合。这种官能化也可以允许有突出的保护链。 
在另一个实施方案中，作为载体的聚合物可以是通式为HO-PEG-[-CH2CH(OH)CH2O-]n-PEG-OH的具有聚(乙二醇)的聚甘油，其中PEG表示聚(乙二醇)，n是3-1000的整数。 
对于适用于本发明的聚合物的其它实例，参见美国专利Nos.6,509,323；6,492,560；6,468,532；6,521,736；6,348,069；5,871,710；和6,051,549，在此引入作为参考。 
载体的另一个例子可以是支架(Stent)表面，以形成药物洗脱支架。 
纳米颗粒和微粒 
可以用作本发明载体的纳米颗粒和微粒的例子包括质量密度小于1.0g/cm3、或者小于大约0.4g/cm3的多孔颗粒。多孔结构例如允许向肺中深入递送较大直径的、例如平均直径大于5微米的治疗性气雾剂。这些多孔颗粒可以修饰为含有能够结合负载分子的疏水基团。 
多孔颗粒通常是生物可降解的和生物相容性的，任选地能够以可控的药物递送速率生物降解。多孔颗粒可由任何能够形成质量密度小于约0.4g/cm3的多孔颗粒的材料制得。无机和有机材料均可使用。例如，可以使用陶瓷。 
颗粒可由任何能够形成密度小于约0.4g/cm3的多孔颗粒的生物相容的及优选生物可降解的聚合物、共聚物或混合物制得。 
可以使用表面侵蚀的聚合物形成多孔颗粒。例如，可以使用聚酸酐，如聚[(对羧基苯氧基)己烷酐](“PCPH”)。生物可降解的聚酸酐例如在美国专利4,857,311中描述。 
在另一实施方案中，可以使用骨架溶蚀(bulk eroding)聚合物，如那些基于聚酯的聚合物，包括聚(羟酸)。例如，聚乙醇酸(“PGA”)或聚乳酸(“PLA”)或其共聚物可用于形成多孔颗粒，其中聚酯已引入了带电荷的或可功能化的或可修饰的基团，如下面所述的氨基酸。 这些可功能化基团可修饰为含有能结合负载分子的疏水基团。 
其他聚合物包括聚酰胺、聚碳酸酯、聚烷烯如聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚氧化乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚乙烯基化合物如聚乙烯醇、聚乙烯醚、丙烯酸和甲基丙烯酸的聚合物、纤维素、多糖类、以及肽或蛋白质、或其能形成质量密度小于约0.4g/cm3的多孔颗粒的共聚物或混合物。多聚物可以选择为或修饰为具备适当的体内稳定性和降解速率以用于不同的可控药物递送应用。 
作为另一个实例，多孔颗粒可以由功能化的聚酯接枝共聚物形成，如Hrkach等人，Macromolecules，28：4736-4739(1995)；和Hrkach等，″Poly(L-Lactic acid-co-amino acid)Graft Copolymers：A Class ofFunctional Biodegradable Biomaterials″in Hydrogel and BiodegradablePolymers for Bioapplications，ACS Symposium Series No.627，RaphaelM.Ottenbrite等人，Eds.，American Chemical Society，Chapter 8，pp.93-101，1996中所述，其内容在此引用作为参考。功能化的接枝共聚物是聚酯如聚乙醇酸或聚乳酸的共聚物，和另外一种包含可功能化或离子化基团的聚合物，如聚氨基酸。在另一个实施方案中，使用梳样接枝共聚物，其包含引入氨基酸的直链聚酯骨架，和从聚酯骨架的氨基酸基团延伸的聚(氨基酸)侧链。聚酯可以是α-羟酸如乳酸、乙醇酸、羟基丁酸和戊酸或其衍生物或组合物的聚合物。发现在聚合物中包含可离子化侧链如聚赖氨酸能够使用本领域公知的制备微粒的技术，如溶剂蒸发，形成高度多孔的颗粒。其他的可离子化基团，如氨基或羧基，也可以共价或非共价地引入至聚合物中从而增强多孔性。例如，可以将聚苯胺引入至聚合物中。这些基团可以进一步修饰，从而包含能结合负载分子的疏水基团。 
可以用来形成多孔聚合颗粒的聚酯接枝共聚物的一个例子是接枝共聚物聚(乳酸-共聚-赖氨酸-接枝-赖氨酸)(“PLALLys”)，它具有由聚(乳酸-共聚-Z-L-赖氨酸)(PLAL)组成的聚酯骨架和接枝赖氨酸链。PLAL-Lys是一种梳样接枝共聚物，例如具有98mol％乳酸和2mol％赖氨酸的骨架组成，和从骨架的赖氨酸部位延伸出的聚(赖氨酸)侧 链。 
聚(乳酸)共聚物的应用是有利的，因为它生物降解为能被机体处理的乳酸和赖氨酸。存在的骨架赖氨酸基团可以作为聚(氨基酸)侧链延长的起始位点。 
在合成时，可以制备接枝共聚物，以优化多孔颗粒的不同特性，包括：i)将要递送的药物质和共聚物之间的疏水相互作用，以提供药物的稳定化以及递送后活性的保持；ii)聚合物的降解速率，因而，药物释放速率谱；iii)通过化学修饰的表面特性和靶向能力；和iv)颗粒多孔性。至于其他适合本发明的纳米颗粒和微粒的例子，参见美国专利6,447,753和6,274,175。 
固体支持物 
在某些实施方案中，本发明使用的载体可以是固体支持物，如聚合物珠或树脂，例如Wang树脂。支持物可以是具备一定刚度的固体，如硅、塑料等。固体也可以是柔性材料，如塑料或其他合成材料(如尼龙)、由天然聚合物(如纤维素或丝)或其衍生物(如硝酸纤维)等制成的材料。在某些实施方案中，支持物是多孔材料，它可以是刚性的或者柔性的、多网格的纤维，包括织物，等等。在某些实施方案中，固体支持物是珠或球，它们可以是多孔的。 
载体可由柔性的半固体聚合物制成。柔性是反复弯曲并可回复原状的特性。由柔性聚合物制成的载体适合放置于将会遇到相邻器官或体壁运动的解剖部位。组织移动可以使柔性载体充分变形而不会导致组织损伤。柔性对于从原位置移走时防止损伤是特别有利的。这种柔韧性载体可适用于保护脉管，如颈部的颈动脉，或用于覆盖颈部更加精细的结构，如也可能会被局部运动影响的颈静脉。类似地，柔性载体也可以用于保护在颈淋巴清扫术时暴露出的神经，如脊髓副神经，其中载体的柔性可使其在遇到运动时弯曲或变形而不是损伤或侵蚀进神经。以上述方式使用本发明的载体可以允许进行更小范围的切开，而在外科保护对于功能重要的结构。载体可设计为适合植入特定解剖区域的三维结构。载体可被制为薄膜、网状、片状、管状或其他 任何适合特定解剖区域尺寸和功能需求的形状。聚合物的物理特征也可通过使用本领域技术人员熟悉的方法修饰化学成分及其交联的方式加以调节，以达到所需程度的柔性。 
一种产生具有反应部位的固体支持物的方法是直接衍生化固体支持物，使其可与化合物偶联。用来实施该方法的化学方法与用来衍生可控孔度玻璃(cpg)珠及聚合物珠的方法相同或类似。通常，该方法的第一步是在支持物上产生羟基(如果载体中不含的话)或氨基。如果已存在或已产生羟基，通常将其转化为氨基，例如通过将羟基与γ-氨丙基三乙氧基硅烷反应。可以使用酸酐、环酸酐、活化酯、与聚合烯化氧的反应和本领域公知的其它方法将疏水基团加到氨基上。 
一种提高固体支持物载体的反应性表面积的方法是产生一氧化硅的柱状结构，例如通过SiO的热蒸发。另外一种这样的方法是向反应中插入织物，如非织造玻璃或塑料(优选玻璃纤维或聚丙烯纤维)织物和血浆处理织物以产生反应部位。再另外一种方法使用旋压玻璃，通过热氧化由硅-倍半氧烷(sil-sesquioxane)梯形聚合物结构产生几乎化学计量的SiO薄膜。溶胶-凝胶法由有机金属原料产生玻璃样组合物，方法是首先在混合醇中形成聚合有机金属结构，然后小心干燥和烘烤。当溶胶-凝胶系统在高于临界温度和溶液压力的条件下干燥时，产生气溶胶。气溶胶具有类似于玻璃的化学组成(例如SiO)，但是具有具有极多孔的微结构。它们的密度相对较低，在某些情况下只有约1-3％的固体组成，其余为空气。 
疏水基团及与载体的连接 
用于连接疏水基团和保护基的化学连接的类型取决于复合物的所需生物半衰期和与复合物相关的治疗剂。如需要较长的半衰期，则优选用醚键或酰胺键，而酯键则用于在生物液体或组织中半衰期较短的载体。这两种化学键可共用于实现特定负载分子所需的稳定性。S-S键也可用于实现用于特定目的的所需半衰期。 
化学连接可包含沿载体或骨架暴露的修饰的氨基。修饰的氨基是包含来源于脂肪酸的烷基酰基或来源于芳香烷基酸的芳香烷基酰基 的疏水官基团的酰胺连接，其通式为[CxHyOz]，其中x为2-36；y为3-71；z为1-4。优选z＝1，这是与氨基的酰胺键的最低要求。然而起始分子在酰胺键形成之前可以是z大于1。 
疏水官能团可包含具有两个末端的疏水烷基，其通式为[-OC(CH2)xCO-]或[-OC(CH2)xCN-]，其中x为2-36，并且可以进一步包含与疏水基团的另一末端共价连接的保护基、其类似物或衍生物。在这种情况下，氨基的修饰可以是完全的，而没有剩余游离氨基，或者修饰可以是部分修饰，修饰程度可以是50-100％，更优选90-100％。此外，剩余的氨基可以进一步修饰，以含有没有保护基的疏水部分。得到的组合物也是本发明的一种实施方案。 
本发明的的另一目的在于提供一种将疏水基团连接至沿其长度具有氨基的载体上的方法。可通过酰胺键形成完成这一修饰。作为一个实例，而不是限制本发明的范围，使用含有碳二亚胺的试剂，如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺或二环己基碳二亚胺，可以将含羧基的疏水分子连接至载体的氨基上。碳二亚胺试剂含有由通式N＝C＝N组成的官能团。在这一偶联反应过程中，被活化的羧基(O-酰基异脲-中间体)可任选地通过使用N-羟基琥珀酰亚胺形成N-羟基琥珀酰亚胺酯而稳定化。这一相对稳定的中间体可与载体如聚赖氨酸或壳聚糖的氨基反应，从而形成氨基-酰基键或酰胺键。 
另外一种连接疏水基团的方式是将载体的氨基与脂肪酸酐反应。例如，载体氨基与棕榈酸酸酐的反应形成含16个碳原子的长链疏水基团。任何脂肪酸酸酐可以用此方式使用。 
本发明的另一目的在于提供一种将疏水基团连接至沿其长度具有羧基的载体上的方法。可通过酰胺键形成完成这一修饰。作为一个实例，而不是限制本发明的范围，可以活化载体的羧基，以与疏水基团的氨基官能团反应。这种活化可以使用含有碳二亚胺的试剂实现，如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺或二环己基碳二亚胺。碳二亚胺试剂含有由通式N＝C＝N组成的官能团。在活化过程中，羧基形成O-酰基异脲-中间体，后者任选地可用N-羟基琥珀酰亚胺稳定化， 以形成N-羟基琥珀酰亚胺酯。这一相对稳定的中间体可与疏水基团的氨基反应。如果疏水基团或分子不含氨基，可以非常容易地向该分子中引入氨基，化学方法是本领域技术人员公知的。 
本发明的另一目的是提供一种将疏水基团连接至沿其长度具有羟基的载体上的方法。脂肪酸的酰基卤、羧基芳香烃与或者二羧酸烷基的合成将有助于羟基的修饰。酰基卤的合成可通过羧酸部分与二氯亚砜(SOCl2)或其他本领域技术人员公知的试剂的反应来完成。生成的酰基卤可与聚氨基酸如聚丝氨酸、聚苏氨酸和聚酪氨酸的残基中存在的醇官能团反应。该反应将导致酯键形成，从而将疏水基团或分子与载体连接。 
通过沿载体长度形成酯键连接疏水基团的另外一种方式是将载体羟基与脂肪酸酸酐反应。例如，载体羟基与棕榈酸酸酐的反应可生成含16个碳原子的长链疏水基团。任何脂肪酸酸酐可以用此方式使用。 
本发明还涉及一种疏水核载体组合物，其包含聚合载体或具有保护链的聚合载体，进一步包含沿聚合物暴露的修饰的羧基。聚合载体中羧基的修饰是包含含氮烃链或脂肪酸酯(或酰胺)或含氮芳香烃(可具有酯或酰胺键)的疏水官能团的酰胺共价连接，其通式为[NwCxHyOz]，其中w为1-6；x为2-36；y为3-74；z为0-10，其中在与载体或骨架连接后，得到的部分没有电荷，并且是非极性的，因此是疏水性的。 
本发明还涉及一种疏水核载体组合物，其包含具有沿载体或骨架暴露的修饰羧基的聚合载体，其中聚合载体中羧基的修饰是包含具有两端疏水烷基的疏水官能团的酰胺共价连接，其通式为[-NC(CH2)xCN-]或[-NC(CH2)xCO-]，其中x为2-36，并且进一步包含与疏水基团的另一末端共价连接的保护基、其类似物或衍生物。在此情况中，沿载体的氨基的修饰可以是完全修饰，其中没有剩余游离氨基，或者可以是部分修饰，修饰程度可以是50-100％，更优选90-100％。此外，剩余的氨基可以进一步修饰为含有不含保护基的疏水部分。得 到的组合物也是本发明的一个实施方案。 
本发明还涉及一种疏水核载体组合物，其包含聚合载体或具有保护链的聚合载体，沿聚合物进一步包含修饰的羟基。羟基的修饰是包含来源于脂肪酸的烷基酰基或来源于芳香烷基酸的芳香烷基酰基烃的疏水官能团的醚或酯共价连接，其通式为[CxHyOz]，其中x为2-36；y为3-74；z为1-10，其中在与载体或骨架连接后，得到的部分没有电荷，并且是非极性的，因此是疏水性的。 
本发明还涉及一种包含沿载体或骨架具有修饰羟基的聚合载体的疏水核载体组合物，其中聚合载体中羟基的修饰是包含两端疏水烷基的疏水官能团的酯共价连接，其通式为[-OC(CH2)xCO-]或[-OC(CH2)xCN-]，其中x为2-36，进一步包含与疏水基团的另一末端共价连接的保护基、其类似物或衍生物。在这种情况下，沿载体的羟基的修饰可以是完全，其中没有剩余游离羟基，或者可以是部分修饰，修饰程度可以是50-100％，更优选90-100％。此外，可以进一步修饰剩余的羟基，使之含有没有保护基的疏水部分。得到的组合物也是一种本发明的实施方案。 
本发明还涉及一种组合物，其包含聚合载体或具有保护链的聚合载体，其进一步包含沿载体或骨架暴露的修饰的氨基。聚合载体中氨基的修饰是包含酰基脂肪酸或酰基芳香烃的疏水官能团的酰胺共价连接，其通式为[NwCxHyOz]，其中w为0-6；x为2-36；y为3-74；z为1-10。 
本发明还涉及一种组合物，其包含聚合载体或具有保护链的聚合载体，其进一步包含沿聚合物暴露的修饰的羧基。聚合载体中羧基的修饰是包含含氮烃链或脂肪酸酯(或酰胺)或含氮芳香烃(可以具有酯或酰胺键)的疏水官能团的酰胺共价连接，其通式为[NwCxHyOz]，其中w为1-6；x为2-36；y为3-74；z为0-10，其中在与载体或骨架连接后，得到的部分没有电荷。作为疏水基团包含的是维生素E、维生素A、维生素D、维生素K和它们的类似物或衍生物。 
本发明还涉及一种组合物，其包含聚合载体或具有保护链的聚合 载体，进一步包含沿聚合物的修饰的羟基。羟基的修饰是包含酰基脂肪酸或酰基芳香烃的疏水官能团的酯共价连接，其通式为[CxHyOz]，其中x为2-36；y为3-74；z为1-10，其中在与载体或骨架连接后，得到的部分没有电荷。 
本发明还涉及一种组合物，其包含具有保护链的聚合载体，进一步包含沿聚合物暴露的未修饰的氨基，其中疏水性主要由保护链提供。 
本发明还涉及一种组合物，其包含具有保护链的聚合载体，进一步包含沿聚合物暴露的未修饰的羧基，其中疏水性主要由保护链提供。 
本发明还涉及一种组合物，其包含具有保护链的聚合载体，进一步包含沿聚合物暴露的未修饰的羟基，其中疏水性主要由保护链提供。 
用于连接疏水基和保护基的化学连接的类型取决于所需的复合物的生物半衰期和与该复合物有关的治疗剂。如果需要有较长的半衰期，优选酰胺键，而酯键可用于需要较短半衰期或在生物液体或组织中的稳定性的载体。两种化学键的混合物可以用于实现将要递送的特定治疗剂的所需稳定性。S-S键可以用于实现有益于其预期治疗和诊断用途的载体的所需性质。 
负载分子
本发明还包括包含负载分子的疏水核组合物，其中负载分子是以下物质之一：治疗剂或诊断剂。治疗剂负载分子包括细胞因子、淋巴因子、激素、激素激动剂、激素拮抗剂、抗生素、止痛剂、毒素、光毒素、细胞抑制剂、细胞毒性剂、精神药物、甾体抗炎药、非甾体抗炎药、免疫抑制剂、抗细菌剂、抗病毒药、抗真菌药、螯合剂、维生素、蛋白酶抑制剂、杀虫剂、氨基糖苷类、多粘菌素、ACE抑制剂。这些负载分子可以是蛋白质、抗体、抗体片段、肽、重组肽、从植物中分离的肽、从真菌中分离的肽、从动物中分离的肽、从细菌中分离的肽、从病毒中分离的肽、从培养的细胞中分离的肽、合成肽、拟肽、 有机化合物、合成有机化合物、从植物中分离的有机化合物、从真菌中分离的有机化合物、从动物中分离的有机化合物、从细菌中分离的有机化合物、从病毒中分离的有机化合物、从培养的细胞中分离的有机化合物、有机金属化合物、脱氧核糖核酸、核糖核酸、寡核苷酸、其他核酸、寡糖、碳水化合物；脂质；光敏性有机化合物和蛋白聚糖。 
治疗剂负载分子的非限制性例子有胰高血糖素样肽、胰高血糖素样肽衍生物、依泽那太、胰高血糖素样肽-1、胰高血糖素样肽-2、瘦蛋白片段、肠抑胃肽(GIP)、表皮生长因子(EGF)受体配体、EGF、转化生长因子α(TGF-α)、β细胞生长因子、胃泌素/缩胆囊素受体配体、胃泌素、缩胆囊素、溶葡萄球菌素、干扰素、干扰素γ、干扰素β(例如干扰素-β1、干扰素-β2)、干扰素α(例如干扰素α-2a或干扰素α-2b)、白介素-1、白介素-2、白介素-4、白介素-6、白介素-8、白介素-10、白介素-12、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、auristatin、乳链菌肽、胰岛素、胰岛素样生长因子、胰岛素样生长因子1、生长激素、人生长激素、生长激素释放激素(GHRH)、神经生长因子、脑源性神经营养因子、酶、内皮抑制素、制管张素、血小板反应素、尿激酶、链激酶、凝血因子VII、凝血因子VIII、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、血小板生成素、降钙素、甲状旁腺素(PTH)及其片段、促红细胞生成素、心房钠尿肽、单克隆抗体、单克隆抗体片段、促生长素抑制素、蛋白酶抑制剂、促肾上腺皮质激素、促性腺激素释放激素、催产素、促黄体生成激素释放激素、促卵泡激素、葡糖脑苷脂酶、血小板生成素、非格司亭、前列腺素、依前列醇、前列环素、环孢菌素、血管升压素、特利加压素、去氨加压素、色甘酸钠(色甘酸钠或二钠)、血管活性肠肽(VIP)、万古霉素、抗微生物剂、多粘菌素b、抗真菌药、抗病毒药、Fuzeon(恩夫韦地)、多柔比星、依托泊苷、芬太尼、氯胺酮、维生素、达托霉素、齐考诺肽、特立帕肽、Hematide、组织因子途径抑制剂(TFPI)、去铁胺(DFO)、催产素、环孢菌素、Hematide、组织因子途径抑制剂(TFPI)、Integrilin(依替巴肽)。 
负载分子也可以是磺胺，如磺胺、磺胺甲噁唑和磺胺醋酰；甲氧苄啶，特别是与磺胺甲噁唑联用；喹啉，如诺氟沙星和环丙沙星；β-内酰胺化合物，包括青霉素，如青霉素G、青霉素V、氨苄青霉素、阿莫西林、亚胺培南、氨曲南和哌拉西林；头孢菌素，如头孢菌素C、头孢噻吩、头孢西丁和头孢他啶；β内酰胺酶抑制剂，如克拉维酸；氨基糖苷，如庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、新霉素、卡那霉素和奈替米星；四环素，如金霉素和多西环素；氯霉素；大环内酯，如红霉素；或混合抗生素，如克林霉素、多粘菌素和杆菌肽；多烯抗生素，如两性霉素B、制霉菌素和哈霉素；氟胞嘧啶；咪唑或三唑，如酮康唑、咪康唑、伊曲康唑和氟康唑；用于真菌病如曲霉菌病、念珠菌病或组织胞浆菌病的灰黄霉素；抗病毒药，如用于病毒病的齐多夫定、阿昔洛韦、更昔洛韦、阿糖腺苷、碘苷、曲氟尿苷和利巴韦林；阿司匹林、保泰松、非那西丁、醋氨酚、布洛芬、吲哚美辛、舒林酸、吡罗昔康、双氯芬酸；用于炎性疾病如关节炎的金和甾体抗炎药；ACE抑制剂，如用于治疗心律不齐的卡托普利、依那普利、赖诺普利、奎尼丁、普鲁卡因胺、利多卡因、恩卡尼、普萘洛尔、艾司洛尔、溴苄铵、维拉帕米(verapimil)和地尔硫卓；用于治疗低脂蛋白血症的洛代他汀、立普妥、氯贝丁酯、考来烯胺、普罗布考和烟酸；有机硝酸酯，如亚硝酸戊酯、硝酸甘油和二硝酸异山梨酯；钙通道阻断剂，如地尔硫卓、硝苯地平和维拉帕米；β肾上腺素能拮抗剂，如用于心血管疾病的普萘洛尔；利尿剂，如噻嗪化物；例如，苯并噻二嗪或袢利尿剂，如呋塞米；交感神经阻滞药，如甲基多巴、可乐定、胍那苄(gunabenz)、胍乙啶(guanaethidine)和利血平；血管扩张剂，如肼屈嗪(hydalazine)和米诺地尔；蒽环类抗生素，如多柔比星、柔红霉素和伊达比星；共价DNA结合化合物、共价DNA结合化合物和铂类化合物，如顺铂和卡铂；叶酸拮抗剂，如氨甲喋呤和三甲曲沙；抗代谢物和嘧啶拮抗剂，如氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶和氟脱氧尿苷；抗代谢物和嘌呤拮抗剂，如巯嘌呤、6-巯嘌呤和硫鸟嘌呤；抗代谢物和糖修饰类似物，如阿糖胞苷和氟达拉滨；抗代谢物和核糖核苷酸还原酶 抑制剂，如羟基脲；共价DNA结合化合物和氮芥化合物，如环磷酰胺和异环磷酰胺；共价DNA结合化合物和烷磺酸酯，如白消安(busulfane)；亚硝基脲，如卡莫司汀；共价DNA结合化合物和甲基化剂，如丙卡巴肼；共价DNA结合化合物和氮丙啶，如丝裂霉素；非共价DNA结合化合物；共价DNA结合化合物，如米托蒽醌和博来霉素；染色质功能抑制剂和拓扑异构酶抑制剂，如依托泊苷、替尼泊苷、喜树碱和托泊替康；染色质功能抑制剂和微管抑制剂，如长春花生物碱类，包括长春新碱、长春碱、长春地辛(vindisine)和紫杉醇、泰素帝或其它紫杉烷；影响内分泌功能的化合物，如泼尼松、泼尼松龙、他莫昔芬、亮丙瑞林、炔雌醇，抗体，如赫赛汀；基因，如p-53基因、p16基因、MIT基因和E-钙粘蛋白基因，集落刺激因子，如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；用于治疗癌症的全反式视黄酸或其它类视黄醇；免疫抑制剂，如：环孢菌素、免疫球蛋白、柳氮磺胺吡啶(sulfasazine)、甲氧沙林和沙利度胺(thalidoimide)；用于胰岛素不足型糖尿病的胰岛素和胰高血糖素；用于治疗骨质疏松症、高钙血症和佩吉特病的降钙素和阿屈膦酸钠；吗啡和相关阿片类药物；哌替啶或同类物；美沙酮或同类物；阿片类拮抗剂如烯丙吗啡；中心活性镇咳药，如右美沙芬(dexthromethrophan)；用于疼痛控制的四氢大麻酚或屈大麻酚、利多卡因和布比卡因(bupivicaine)；氯丙嗪、丙氯拉嗪；大麻素，如四氢大麻酚、苯丁酮类如氟哌利多；苯甲酰胺，如用于治疗恶心和呕吐的甲氧氯普胺；作为抗凝血药、抗溶栓药或抗血小板药的肝素、香豆素、链激酶、组织纤溶酶原激活物因子(t-PA)；用于治疗炎性肠病的肝素、柳氮磺吡啶、烟碱和肾上腺皮质类固醇和肿瘤坏死因子-α；用于治疗吸烟成瘾的烟碱；用于激素治疗的生长激素、生长激素释放激素(GHRH)、促黄体激素、促皮质素和生长素；和用于总体预防的肾上腺素。 
负载分子可以进一步包括甲基黄嘌呤，如茶碱；色甘酸钠；β-肾上腺素能激动剂，如沙丁胺醇和特布他林(tetrabutaline)；抗胆碱能 生物碱，如阿托品和异丙托溴铵；肾上腺皮质类固醇，如用于哮喘或炎性疾病的强的松、倍氯米松和地塞米松；以上列出的用于在肺病(以上所列的具体疾病，包括肺病)患者中抗细菌和抗真菌感染的抗细菌药和抗真菌药，特别是包括使用氨基糖苷类(例如阿米卡星、妥布霉素和庆大霉素)、多粘菌素类(例如多粘菌素E、粘菌素)、羧西林(carboxycillin)(替卡西林)和单环β-内酰胺类，其用于治疗例如囊性纤维化患者中的革兰氏阴性抗细菌感染、用于治疗肺结核患者中的革兰氏阴性感染、用于治疗慢性支气管炎和支气管扩张症患者中的革兰氏阴性感染、用于治疗总体免疫减弱患者中的革兰氏阴性感染；使用喷他脒治疗卡氏肺囊虫(Pneumocytis carinii)感染的患者(例如HIV/AIDS患者)；使用多烯抗生素如两性霉素B、制霉菌素和哈霉素；氟胞嘧啶；咪唑或三唑，如酮康唑、咪康唑、伊曲康唑和氟康唑；灰黄霉素，其用于治疗真菌感染如曲霉菌病、念珠菌病和组织胞浆菌病，特别是起源于或传播到肺的那些疾病；使用皮质类固醇和以上列出的其它甾体以及非甾体抗炎药治疗肺病(以上所列的具体疾病，包括肺病)患者中的抗炎性病症；DNase、阿米洛利、CFTR cDNA，用于治疗囊性纤维化；用于治疗肺气肿的α-1-抗胰蛋白酶和α-1-抗胰蛋白酶cDNA；氨基糖苷，如阿米卡星、妥布霉素或庆大霉素、异烟肼、乙胺丁醇、利福平及其类似物，用于治疗肺结核或分枝杆菌感染；用于治疗呼吸道合胞病毒的利巴韦林；使用以上列出的用于肺癌的抗癌药，特别是顺铂、卡铂和紫杉烷类，如紫杉醇和紫杉烷类、喜树碱、伊立替康和其它喜树碱类、赫赛汀、p-53基因。 
适合在本发明中用作负载分子的生物活性治疗剂包括本身不通过(或者只通过给药剂量的一部分)胃肠粘膜和/或对胃肠道中的酸和酶的化学和/或酶切敏感的化合物；或者它们的任意组合。其中包括蛋白质、多肽、肽、激素、多糖特别是粘多糖和它们的混合物。 
在进一步的实施方案中，本发明涉及上述组合物，其中一种以上的负载分子与聚合载体的疏水基团结合。 
在进一步的实施方案中，本发明涉及上述组合物，其中负载分子 是诊断剂。其中包括荧光分子、顺磁分子和放射性分子。 
本发明的另外一个目的是提供一种向本发明的疏水核载体组合物中装载负载分子的方法，包括将足量的负载分子和疏水核载体在适当的溶剂中混合，并且任选地将负载分子和疏水核载体共冻干。负载分子的足量可以随负载分子变化，但是优选为疏水核载体重量的1-400％。 
本发明的目的是提供一种使用本发明所述的组合物以及适当的选自PDR或Physician Desk Reference(Medical Economics Company，Inc.Montvale，NJ于2001出版)所述的负载分子治疗″The Merk Manualof Diagnosis and Therapy″(Merck&Co.，Inc，Rahway，NJ的一个部门，Merck Laboratories，于1992出版)中所述的各种疾病的方法。MerkManual of Diagnosis and Therapy和PDR在此引入作为参考。负载分子对于特定疾病的适用性可以通过参考″The Merk Manual of Diagnosisand Therapy″或PDR确定。 
保护链或基团
本发明的疏水核载体组合物及其制备及使用方法可以得到由保护链提供的大量期望的结果和特征，一种或多种保护链(如果存在的话)可以存在于本发明的任何特定实施方案中。组合物的保护链优选是氧化乙烯的聚合物(聚(乙二醇)，即PEG或聚(乙二醇)的单甲氧基醚即MPEG)。保护链是有用的，因为：1)它确保了组合物的溶解性，同时保持高药物有效负载，例如GLP-1，在观察到溶解度降低之前，至少30％重量负载在载体中；2)保护链有助于形成空间障碍，这可以阻止负载分子(肽、蛋白质和其他治疗剂)与体内的其它大分子、酶和细胞结合或相互作用；3)保护链提供具有长循环时间或体内生物半衰期的负载分子(肽和蛋白质和药物)(例如，减少肾脏中的肾小球滤过、减少肾脏和肝脏摄取、减少巨噬细胞摄取，等等)，以及产生循环储备；4)保护链降低了载体或其负载分子如肽或蛋白质药物的不希望的免疫原性；5)肿瘤血管的异常通透性通过将负载分子或抗肿瘤化合物递送至肿瘤，有助于具有负载分子的载体在炎症部位的积累，特 别可用于治疗肿瘤；6)保护链也可以提供额外的结合强度；和7)保护链可以提供与表面的结合，例如通过与粘膜相互作用提供与粘膜表面的结合。 
疏水核载体组合物的保护链可以是，例如，聚乙二醇，甲氧基聚乙二醇，甲氧基聚丙二醇，聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇或甲氧基聚丙二醇的共聚物，或其衍生物。另外，保护链可以是聚乙二醇和聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚乙烯胺或多核苷酸中的任一种的嵌段共聚物。保护链也可以是包括二羧酸单酯的聚乙二醇的共聚物。保护链也可以是唾液酸链。保护链优选地具有500-10,000道尔顿的分子量。 
在另外一个相关方面，疏水核载体组合物包括保护链，该保护链为聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物；或其烷氧基衍生物，优选甲氧基聚乙二醇、甲氧基聚丙二醇、或甲氧基聚乙二醇和甲氧基聚丙二醇的共聚物；保护链可以是聚乙二醇单胺、甲氧基聚乙二醇单胺、甲氧基聚乙二醇肼、甲氧基聚乙二醇咪唑、或聚乙二醇二酸；保护链是聚乙二醇和聚氨基酸、多糖、烷氧基化多糖、聚酰胺胺、聚乙二胺或多核苷酸的嵌段共聚物；保护链可以是含有二羧酸单酯的聚乙二醇的共聚物；保护链的分子量为500-10,000道尔顿。 
保护链的其它实例包括聚(乙二醇)和一种或几种由聚氨基酸、聚丙交酯乙交酯共聚物、多糖、聚酰胺胺、聚乙烯亚胺或多核苷酸代表的聚合物的甲氧基聚(乙二醇)咪唑嵌段共聚物(见聚合载体)，其中这些嵌段优选地交替存在，得到优选直链的嵌段共聚物。保护链的总分子量优选大于300，但是优选不超过10,000。保护链与聚合载体优选通过单键连接。 
用于连接保护链的载体的氨基的修饰
本发明还涉及一种疏水核载体组合物，其包含聚合载体或具有疏水基团或分子的聚合载体，其进一步包含沿聚合物暴露的修饰的氨基。沿聚合载体的氨基修饰的非限制性例子是包含酰基聚甲氧基乙二醇的保护链的酰胺连接。并非意在限制本发明范围的保护链的一个例子是酰基PEG、其类似物或衍生物，可以由以下通式表示： 
-CO(CH2)nCOOCH2CH2-A-OR3或-COCH2-A-OR3，其中n为2-22；A为[OCH2CH2]x或[OCH2CH2]x或[OCHCH3CH2]x，其中x为17-250，或总共17-250个单位的[OCH2CH2]、[OCH2CH2]和/或[OCHCH3CH2]的各种组合，R3为H、(CH2)pCH3或(CH2)pCOOH，p为0-7。 
本发明还涉及一种包含聚合载体或具有疏水基团的聚合载体的疏水核载体组合物，其沿聚合物具有修饰的氨基。在进一步的实施方案中，本发明涉及上述组合物，其中载体包含保护侧链。在进一步的实施方案中，保护侧链包含聚(乙二醇)。在进一步的实施方案中，保护侧链包含烷氧基聚(乙二醇)。在进一步的实施方案中，保护侧链包含甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)。在进一步的实施方案中，保护侧链包含多唾液酸。在进一步的实施方案中，保护侧链包含聚(丙烯酰胺)。在进一步的实施方案中，保护侧链包含聚(乙烯吡咯烷酮)。它们可以使用上述任何化学键与聚合载体连接。 
本发明的另外一个目的是提供一种将保护链与载体连接的方法。这种修饰可以通过酰胺键形成来进行。作为并非意在限制本发明范围的一个例子，可以使用含碳二亚胺的试剂如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺或二环己基碳二亚胺将含羧基的保护分子与载体的氨基连接。碳二亚胺试剂含有由通式N＝C＝N组成的官能团。在偶联反应过程中，活化的羧基O-酰基异脲中间体可以通过用N-羟基琥珀酰亚胺形成N-羟基琥珀酰亚胺酯来稳定化。这种相对稳定的中间体可以与载体如聚赖氨酸或壳聚糖的氨基反应，以形成氨基-酰基键或酰胺键。通过将含醛的保护基与沿载体的氨基反应也可以实现类似的结果。醛可以与载体如聚赖氨酸或壳聚糖的氨基反应，以形成氨基-酰基键或酰胺键。 
用于连接保护链的载体的羧基的修饰
本发明还涉及一种疏水核载体组合物，其包含聚合载体或具有疏水基团或分子的聚合载体，其进一步包含沿聚合物暴露的修饰的羧基。聚合载体中羧基的修饰是包含氨基聚甲氧基乙二醇的含氨基保护链的酰胺共价连接。作为并非意在限制本发明范围的一个例子， 保护链可以是由以下通式表示的氨基PEG：-NH(CH2)nNHCOCH2-A-OR3、-NH(CH2)nNHCO(CH2)nCOOCH2CH2-A-OR3，其中n为2-22；A为[OCH2CH2]x或[OCH2CH2]x或[OCHCH3CH2]x，其中x为17-250，或者总共17-250个单位的[OCH2CH2]、[OCH2CH2]和/或[OCHCH3CH2]的各种组合，R3为H、(CH2)pCH3或(CH2)pCOOH，p为0-7。 
本发明还涉及一种疏水核载体组合物，其包含聚合载体或具有疏水基团的聚合载体，其沿聚合物具有修饰的羧基。在进一步的实施方案中，本发明涉及上述组合物，其中载体包含保护侧链。在进一步的实施方案中，保护侧链包含聚(乙二醇)。在进一步的实施方案中，保护侧链包含烷氧基聚(乙二醇)。在进一步的实施方案中，保护侧链包含甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)。在进一步的实施方案中，保护侧链包含多唾液酸。在进一步的实施方案中，保护侧链包含聚(丙烯酰胺)。在进一步的实施方案中，保护侧链包含聚(乙烯吡咯烷酮)。它们可以使用上述任何化学键与聚合载体连接。 
本发明的另外一个目的是提供一种将保护链与载体连接的方法。这些修饰可以通过酰胺键形成来进行。作为并非意在限制本发明范围的一个例子，可以将载体的羧基活化，以与保护分子的氨基官能团反应。这种活化可以使用含碳二亚胺的试剂如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺或二环己基碳二亚胺实现。碳二亚胺试剂含有由通式N＝C＝N组成的官能团。在活化过程中，羧基形成O-酰基异脲中间体，其可以用N-羟基琥珀酰亚胺稳定化，以形成N-羟基琥珀酰亚胺酯。这种相对稳定的中间体可以与保护分子的氨基反应。如果需要引入载体中的保护基或分子不具有氨基，可以非常容易地向该分子中引入氨基，并且该过程是本领域技术人员公知的。 
用于连接保护链的载体的羟基的修饰
本发明还涉及一种疏水核载体组合物，其包含聚合载体或具有疏水基团或分子的聚合载体，进一步沿聚合物包含修饰的羟基。羟基的修饰包括含有酰基聚甲氧基乙二醇的保护基或分子的酯连接。作为并 非限制本发明范围的一个例子，保护基可以是具有由-CO代表的酰基或羰基的PEG，并且连接到载体的羟基的O上，生成酯。酰基PEG或其衍生物可以由以下通式表示：-CO(CH2)nNHCOCH2-A-OR3、-COCH2CH2-A-OR3或-COCH2-A-OR3，其中n为2-22；A为[OCH2CH2]x 或[OCH2CH2]x或[OCHCH3CH2]x，其中x是17-250，或者总共17-250个单位的[OCH2CH2]、[OCH2CH2]和/或[OCHCH3CH2]的各种组合，R3 是H、(CH2)pCH3或(CH2)pCOOH，p是0-7。 
本发明还涉及一种疏水核载体组合物，其包含聚合载体或具有疏水基团的聚合载体，没聚合物具有修饰的羟基。在进一步的实施方案中，本发明还涉及上述组合物，其中载体包含保护侧链。在进一步的实施方案中，保护侧链包括聚(乙二醇)。在进一步的实施方案中，保护侧链包括烷氧基聚(乙二醇)。在进一步的实施方案中，保护侧链包括甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)。在进一步的实施方案中，保护侧链包括多唾液酸。在进一步的实施方案中，保护侧链包括聚(丙烯酰胺)。在进一步的实施方案中，保护侧链包括聚(乙烯吡咯烷酮)。它们可以利用上述任意化学键连接到聚合载体上。 
本发明的另一方面是提供将保护链连接到载体上的方法。保护分子的酰卤的合成可以促进羟基的修饰。酰卤的合成可以通过将保护分子的羧酸部分与二氯亚砜(SOCl2)或其它本领域技术人员所知的试剂反应来进行。产生的酰卤对于醇，包括聚氨基酸的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基，具有反应性。该反应将导致酯键形成，基本上将保护基或分子连接到载体上。PEG-环氧化物、PEG-异氰酸酯、PEG-PNC(PEG-硝基苯基羧酸酯)是PEG类似物，可以用来修饰羟基，分别在保护基与载体之间生成醚、酯和氨基甲酸酯连接。 
定向分子
本发明的再另一方面是提供一种疏水核载体，其包含与载体或与载体和保护基共价连接的疏水基团、通过疏水相互作用与疏水分子结合的负载分子、和与载体共价连接并且结合负载分子的定向分子，以将该负载分子定向或定位于疏水基团内。定向分子可以是识别负载分 子的受体或肽，或者可以是Bolotin(pub.NO.：US 200310224974 A1)描述的含有金属离子桥的复合物，在此引入作为参考。金属离子桥包括具有与金属离子配位的第一金属结合域的载体。金属离子进一步通过第二金属结合域与负载分子配位。定向分子也可以是共价锚定到聚合载体上的氨基或羧基部分。定向分子也可以是带正电荷或正负电荷的，如含有硫酸、磺酸、磷酸、膦酸、或双膦酸的分子，或含氮化合物如赖氨酸、精氨酸、组氨酸(提到少数非限制性的实例)。 
靶向分子
本发明的再另一个目的是提供一种药物组合物，其包含与载体或者与载体和保护基共价连接的疏水基团、通过疏水相互作用与疏水分子结合的负载分子、和利于将该药物组合物定位到目标组织的靶向分子。 
靶向基团可以与聚合载体或保护链或这两者连接。靶向基团可以是抗体、抗体片段、嵌合抗体，其中抗体是多克隆或单克隆抗体；肽；酶；酶的准底物；凝集素；或者与组合物、酶、凝集素、糖配体或肽片段可分离或不可分离地连接的凝集素的糖配体。 
靶向部分的作用是将本发明组合物置于密切接近患者体内的目标处。这样，设想本发明可以任选地使用靶向剂或分子。 
靶向部分的例子包括：(i)趋化性蛋白质和肽，包括单核细胞趋化蛋白1(MCP-I)、N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸；(ii)集落刺激因子，包括GM-CSF、CSF-1，和它们的受体和抗体；和血小板因子4；(iii)生长因子，包括TGF-f1和VEGF；(v)粘附细胞表面糖蛋白，包括E-选择蛋白、VCAM-1和VCAM1f1；(iv)碳水化合物，包括11C-脱氧-D-葡萄糖和IsF-2-氟脱氧-D-葡萄糖；(vi)血管炎性应答的成分，包括C1、C1q、C1r、C1s、C2、C3、C3a、C3b、C4、C4C2、C4C2C3b、C5a、C5b和C5a；(vii)白介素，包括IL-1、IL-1a、IL-10、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7和IL-8；(viii)干扰素，包括干扰素α和干扰素γ；(ix)肿瘤坏死因子TNF-α；和(x)脂质，包括脂质体、聚乙二醇包被的脂质体、胆固醇、胆固醇的酯，脂蛋白，包括LDL、HDL、氧化的LDL，和脂 质受体。 
疏水核载体组合物
具有负载分子的疏水核载体组合物的一个实施方案在图1中显示。该图示不是限制本发明的范围，而是显示本发明的某些重要特征。疏水核载体组合物的成分和负载分子的大小标度根据组合物中存在的化学键的长度来估计。在该图示中，负载分子将被吸附到组合物的疏水部分内，并且将被从载体发出的直链保护链保护。保护链可以独立地与载体连接，或者可以连接到疏水分子的末端。对于前者，保护链可以通过多种方法与载体连接，优选通过酰胺键或酯键。对于后者，保护链可以连接到疏水基团，优选疏水基团的末端部分。疏水基团进一步优选通过酰胺或酯键连接到载体上。负载分子与疏水核载体的疏水部分通过疏水相互作用可逆地结合，这种相互作用在水环境中可以加强。负载分子向疏水核载体上的负载可以通过简单地以疏水核载体与负载分子大约为1∶0.1至1∶10(重量∶重量)的比例混合负载分子和疏水核载体来实现。这种混合优选地在水或磷酸盐缓冲液中进行，取决于负载分子的性质，然后任选地进行冻干。其他赋形剂可以任选地添加到复合物中以调节pH、张力和粘度。疏水核载体-负载分子复合物可以以已知含量按份冻干，用于给需要治疗的患者施用复合物中的特定负载分子。冻干的复合物可以用盐水或水重配，用于给患者施用，以治疗疾病，例如胰岛素不足型糖尿病、血管疾病、心脏疾病、中风、血管中凝血、癌症、肝癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌、内分泌腺癌、垂体瘤、软组织肿瘤、舌癌、骨癌、白血病、黑素瘤、淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、肝炎、甲型肝炎、乙型肝炎、非甲非乙型肝炎、丙型肝炎、阿尔茨海默病、帕金森病、神经紊乱、精神分裂症、双相型障碍、内分泌紊乱、高血压、低血压、凝血因子缺乏、寄生虫病、真菌感染、细菌感染、葡萄球菌感染、杆菌感染、坏死性感染、坏疽、中毒、细菌毒素中毒和毒液中毒。可以用本发明的疏水核载体-负载分子复合物治疗的疾病包括在″The Merk Manualof Diagnosis and Therapy″(Merck&Co.，Inc，Rahway，NJ的一个部门， Merck Laboratories，于1992出版)中所述的各种疾病，其中适当负载分子的选择按照PDR或Physician Desk Reference(Medical EconomicsCompany，Inc.Montvale，NJ于2001年出版)所述。“Merk Manual ofDiagnosis and Therapy”和“PDR”的内容在此引入作为参考。负载分子对于特定疾病的适用性可以通过参考″The Merk Manual of Diagnosisand Therapy″或PDR确定。 
负载分子对疏水核载体的亲和力可以通过改变疏水链的长度、调节芳香基的大小、调节疏水链的数目、或者调节芳香基的数目来进行调节。本发明的疏水核载体可以每个疏水基团都具有保护链，每0.3nm产生一个疏水基团。如果存在较少的保护基(每两个或多个疏水基团一个保护基)，则每个疏水基团之间的距离可以达到0.15nm，这是非常高的。由于每个疏水基团可以具有2-36个碳原子(包含)，决定负载分子与疏水核载体结合的碳载量在需要时可能非常高。可以通过提高与载体连接的疏水基团的密度来设计高亲和力疏水核载体。将长链疏水基团置于聚合载体上所有可以利用的位点可以获得最大值，并且由于没有保护基的位点，保护基将与疏水基团的末端连接。这可以通过将以下任一种分子的一个末端与载体连接并且将另一末端与任一胺化PEG衍生物或类似物连接来实现：丁二酸(HOOC(CH2)2COOH)、戊二酸(HOOC(CH2)3COOH)、己二酸(HOOC(CH2)4COOH)、庚二酸(HOOC(CH2)5COOH)、辛二酸(HOOC(CH2)6COOH)、壬二酸(HOOC(CH2)7COOH)、癸二酸(HOOC(CH2)8COOH)、十一二酸(HOOC(CH2)9COOH)、十二二酸(HOOC(CH2)10COOH)、十三二酸(HOOC(CH2)11COOH)、十四二酸(HOOC(CH2)12COOH)、(HOOC(CH2)13COOH)、(HOOC(CH2)14COOH)、(HOOC(CH2)15COOH)、(HOOC(CH2)16COOH)、(HOOC(CH2)17COOH)、(HOOC(CH2)18COOH)、(HOOC(CH2)19COOH)、(HOOC(CH2)20COOH)、(HOOC(CH2)21COOH)、或(HOOC(CH2)22COOH)、(HOOC(CH2)23COOH)、(HOOC(CH2)24COOH)、(HOOC(CH2)25COOH)、(HOOC(CH2)26COOH)、(HOOC(CH2)27COOH)、(HOOC(CH2)28COOH)、 (HOOC(CH2)29COOH)、(HOOC(CH2)30COOH)、(HOOC(CH2)31COOH)、(HOOC(CH2)32COOH)、(HOOC(CH2)33COOH)或(HOOC(CH2)34COOH)。这可以使用图2所示的反应进行。在聚氨基的修饰过程中应当使用过量的二酸，以防止二酸的两个末端与聚氨基载体反应。在添加胺化PEG、其类似物或衍生物之前应当除去未反应的二酸。在二羧酸疏水分子的两个末端，应当形成酰胺键，其中一个末端与载体连接，另一个末端与保护基连接。使用二氨基烷作为疏水基团，如H2N(CH2)xNH2，其中x为4-36，可以实现类似的过程。可以使用图2中的反应将二氨基烷与含有羧基的载体连接。或者，异双功能疏水部分，如HOOC(CH2)xNH2，其中x为4-36，可以用来避免疏水基团两个末端与载体的可能的副反应。如果使用试剂，聚谷氨酸或聚天冬氨酸载体可以以预活化的形式使用。含羧基的载体的预活化可以如图2所示进行。在与异双功能疏水基团(如HOOC(CH2)xNH2，其中x为4-36)反应之前，过量的活化试剂可以通过过滤或凝胶色谱法除去。用于除去活化剂的膜过滤和凝胶过滤色谱法是本领域技术人员公知的。上述任何异双功能疏水部分都可以添加到预活化的载体上，以允许在氨基和载体如聚谷氨酸或聚天冬氨酸的羧基之间形成酰胺键。然后可以再次过滤反应混合物，以除去过量的异双功能疏水部分。然后可以活化(以类似于载体活化的方式)连接的疏水部分的羧基，并且一旦活化，就可以添加含氨基的保护基类似物或衍生物，以允许酰胺键形成。得到的产物在载体周围具有高密度的疏水基团。较长的疏水链在载体周围提供极高的疏水基团密度和体积。通过将部分与载体连接，这可以增加沿载体的可修饰官能团(如氨基或羧基)的数目，并且进行与上述相同的过程，可以进一步提高密度。此外，可以使用分支的疏水分子修饰载体，使得载体中的每个可修饰官能团连接有两个疏水链。如果对于所需负载分子的亲和力太高，则可以使用较短的疏水链，并且可以降低密度。使用较短的疏水基团和降低密度将降低疏水核载体对负载分子的亲和力。优选的疏水基团是来源于脂肪酸的直链，因为它们是无毒的，并且在体内容易代谢。它们也没有免疫原性。 
通过沿载体长度形成酰胺键连接疏水基团的另外一种方法是使载体氨基与脂肪酸酐反应。例如，载体氨基与棕榈酸酐的反应形成含有16个碳的长链疏水基团。任何脂肪酸酐可以以这种方式使用。 
如果希望低亲和力的疏水核载体，可以通过独立于疏水基团连接保护基进一步降低疏水基团的密度。使用这种方法，由疏水基团群集的沿载体的位点数可以是从10％至80％(包含)不等，而疏水基团的长度可以是从2个碳到14个碳(包含)不等。 
长期以来需要具有如防止降解、缓慢释放及在任意给定时间控制游离量等性质的药物或治疗药物递送系统。游离药物量通过载体与负载分子的解离常数定义的结合平衡来确定。可以确定特定负载分子和具有确定组成的载体之间的解离常数。 
疏水核载体和负载分子之间解离常数的确定
为了确定分子量大于100kDa的疏水核载体的解离常数，将100μl份的疏水核载体(1mg/ml，在磷酸盐缓冲液PBS中；50mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.4)一式三份置于10个管中。作为对照，一式三份制备另一组不含疏水核载体但是含有100μlPBS的10个管。将一式三份的100μl溶解在磷酸盐缓冲液中的1000nM、500nM、100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、0.5nM、0.1nM和0nM负载分子溶液置于包括对照的所有管中。涡旋混合，并且在37℃下孵育溶液1小时，然后冻干。在200μl去离子蒸馏水中重配干燥的样品，通过100kDa截止值的膜(来自Millipore，Bedford，MA)离心过滤所有溶液。通过过滤器的负载分子代表溶液中游离负载分子的浓度。不含疏水核载体的对照管代表可以结合的负载分子的总量。结合的负载分子量可以通过从接受相同浓度负载分子但是不含疏水核载体的相应对照中减去游离量来计算。将y-轴的结合的/游离负载分子对x-轴的结合的负载分子(nM)作图。Y轴上的结合/游离和结合(nM)x-轴的图的斜率为-1/Kd，其中Kd是解离常数。通过过滤器的负载分子的定量通过如Elisa(酶联免疫吸附测定)、HPLC或HPLC/MS的手段进行。 
游离负载分子浓度的保持
游离负载分子随时间的浓度可以由游离负载分子和与疏水核载体结合的负载分子之间的平衡常数来预测。这可以在等渗盐水溶液中确定。平衡常数可以通过改变载体内疏水部分的大小和含量和保护基的大小和含量进行调节。疏水部分的大小和含量越小，在任意给定时间的游离负载分子浓度越高，直到负载分子贮库被消耗。疏水部分的大小和含量越大，在任意给定时间的游离负载分子浓度越低，直到负载分子贮库被消耗。在后一种情况中，贮库消耗的时间较长，负载分子的释放将延长。如果优选的有效量(例如大约0.00001mg/kg/小时至大约10mg/kg/小时)的负载分子或任何其它物质与生物相容性组合物结合，这种释放性质可以导致延长的递送(高于3至大约4,000小时或者大约10至大约1500小时)。应当注意，疏水核载体和负载分子将彼此具有亲和力，这可以用亲和常数(Ka)或解离常数(Kd)来定义。这种亲和力可以通过改变载体内疏水部分的大小和含量来调节。由于Kd或Ka代表平衡常数，它们定义了任意给定时间的游离负载分子的量。如果游离负载分子的浓度由于体内应用而降低，将从载体自动释放负载分子以恢复平衡。释放速率将由游离负载分子的应用速度确定。载体的总容量也将确定在耗尽负载分子释放之前载体可以保持特定浓度的游离负载分子或治疗剂的时间长度。 
多种因素可以影响负载分子对疏水核载体的Kd，因而影响其释放速率。其中包括载体中的疏水部分的密度、疏水部分大小、载体中的保护部分的密度、载体中的保护链的大小、疏水核载体总大小、疏水性载体-负载分子复合物周围的环境、细胞和身体器官对游离负载分子的利用或清除速率。周围环境条件包括温度、可由离子强度确定的溶剂极性、蛋白质和有机分子浓度、重量摩尔渗透压浓度。蛋白质和有机分子也可以置换载体中的负载分子，这依赖于保护链密度和置换蛋白质或分子的疏水性。 
为了进一步说明，通过调节聚合物骨架或侧链的疏水性而同时仍然保持预期用于任何这种聚合物的足够的生物可降解性，可以获得宽范围的解离速率。这种结果可以通过改变聚合物的疏水基团和保护基 而实现。 
一种本领域普遍接受的测定水环境中的任何负载分子或其它物质的平衡常数的方案包括使负载分子或其它物质在PBS溶液(50mMPO4，150mM NaCl，pH 7.4)中37℃解离。对于本发明，术语“PBS方案”在此用来指这种方案。 
在某些例子中，可以通过将它们进行这种方案来比较本发明不同疏水核载体保持的游离负载分子浓度。在特定情况中，可能必须以相同方式处理几种不同的疏水核载体，以允许对不同疏水核载体进行直接的和相对精确的比较。这种比较可以表明，任一种疏水核载体可以比另一种疏水核载体保持浓度为大约2nM或更低至大约1000nM或更高(包含)的活性剂。此外，比较可能揭示大约3、5、7、10、25、50、100、250、500或750nM的浓度差。本发明和Kd方案可能涉及甚至更高的游离负载分子浓度差。 
在某些实施方案中，平衡常数可以表示单相或双相系统(或两部位系统，具有两个Kd)。在某些情况下，负载分子的释放可以表征为最初增加的释放速率或高游离负载分子浓度，它们可以释放大约5％至大约50％或更多的负载分子，直到具有高Kd的部位用尽，或者大约10、15、20、25、30或40％，然后是低Kd部位引起的更低的游离负载分子浓度。 
活性剂的释放速率也可以用每天每mg载体释放的这些物质的量来表征。例如，在某些实施方案中，当载体是一种聚合物时，释放速率可以从每天每mg聚合系统大约1ng或以下至大约5000ng/天/mg或以上的负载分子不等。或者，释放速率也可以是大约10、25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800或900ng/天/mg。在另外的实施方案中，活性剂的释放速率可以是20,000ng/天/mg或甚至更高。在某些情况中，用这种释放速率方案表征的活性剂可以包括治疗剂、抗原、诊断剂、靶向部分和其它物质。 
另一方面，负载分子的释放速率可以表示为疏水核载体中负载分 子的半衰期。 
除了涉及体外测定释放速率的方案的实施方案以外，本发明也涉及体内方案，在某些情况下可以利用该方案在体内测定从载体释放活性剂的释放速率。可以设计用于测定从本发明载体释放活性剂的其它试验。 
组合物的合成
本发明组合物可以用以下任一种方法合成(图3)。提供了使用聚-L-赖氨酸作为聚合载体、使用MPEG作为保护链和使用疏水基团合成疏水核载体组合物的一个例子。这种合成组合物特别适合作为用于有机药物、肽/蛋白质治疗剂或者造影剂的疏水核载体。 
方案1：组合物可以分两个阶段制备，首先将聚氨基酸与活化的MPEG类似物反应，然后将该反应混合物与活化的疏水性化合物反应。当使用聚-L-赖氨酸作为聚合载体时优选该过程(图3)。 
聚-L-赖氨酸的ε-氨基与羧化MPEG的活化衍生物例如酰氯、酸酐、混合酸酐、氮烯、异硫氰酸酯类和咪唑，和活化酯，例如羟基琥珀酰亚胺、羟基磺基琥珀酰亚胺、对硝基苯、苯并三唑反应。存在其它的连接PEG、它们的类似物或它们的衍生物与沿聚合载体的氨基的方法，如图4和图5所示，其中R代表载体。 
疏水分子以活化形式如酸酐、混合酸酐或异硫氰酸酯或以非活化形式与其余的氨基进行反应。如果疏水分子为非活化形式，它可以在琥珀酰亚胺或磺基琥珀酰亚胺和碳二亚胺的存在下活化，以获得活化酯，然后与其余的氨基进行反应。反应之前可以对聚氨基酸骨架或MPEG链进行额外的化学修饰，这不限于导致至少一个化学键形成或消除的反应。存在其它的连接疏水基团、它们的类似物或它们的衍生物与沿聚合载体的氨基的方法。这些方法在图4和图5中显示，不同之处是在该情况下，PEG或mPEG将是疏水基团，而R仍然是载体。 
以化学方法将保护链和疏水基团连接到聚合载体上的顺序可以颠倒，即首先将疏水基团连接到聚合载体上，然后连接保护链，但是优选使用疏水基团作为单功能活化类似物，即一个活化疏水基团分子 只与聚合载体形成一个共价键。 
方案2：也可以使用标准肽合成方法用修饰的氨基酸前体如MPEG-氨基酸和疏水-氨基酸合成组合物。在这种情况下，疏水基团和PEG可以以可控的方式交替存在。 
方案3：PEG-聚氨基酸的寡聚物可以与疏水基团-聚氨基酸的寡聚物偶联，形成嵌段共聚物。 
所有这些方案都将生成具有高度可预测的分子量分布的可预测的组合物。 
MPEG与聚合载体连接首先阻止了后续反应中聚氨基酸的可能的交联。MPEG链阻止了副产物的形成，因为它们产生对抗试剂交联的空间障碍。因此，可以控制高分子量产物的生成，这使得该合成步骤是可预测的。结果，获得具有窄分子量分布的均质制剂。 
当使用羧化载体如羧化糖类或在其侧链上具有羧基的聚氨基酸如聚天冬氨酸或聚谷氨酸时，优选在碳二亚胺和磺基琥珀酰亚胺的存在下活化该聚合载体，然后在pH 7-9下同时或按顺序与胺化的保护链和胺化的疏水基团如MPEG单胺反应(图2)。 
当使用羟基化载体如聚丝氨酸或聚苏氨酸或任何在其侧链上具有羟基的聚合物时，优选如图6所示活化保护基如PEG。类似地，疏水基团如烷基和芳香基也优选如图7和图8所示活化。 
聚合载体优选含有肽键。相同的键参与疏水分子与氨基酸侧链的反应性基团的偶联。因此该组合物可能被多种动物非特异性肽酶生物降解。为了帮助体内清除聚合载体、保护链和疏水基团，聚合载体、保护链或疏水基团的成分应当通过半稳定的键如S-S键连接在一起。少量被捕获的组合物可以通过降解为较小的片段而从体内除去。然而，多种活化的PEG衍生物可以用于制备组合物，使其处于从实际上不可降解的到不稳定的范围内。然而，不稳定的组合物不是理想的，因为分离MPEG将导致负载分子组合物在网状内皮系统中更广泛的积累。 
本发明的保护链不激活补体的C3成分。C3是血液中的补体途径 的一种成分，它在激活后将导致膜攻击复合物(MAC)的形成，MAC通过在细胞膜上穿孔而破坏细胞。这些途径的完整说明在The Merkmanual of diagnosis and therapy中描述，其在此引入作为参考。这是聚乙二醇保护链及其衍生物相对于已知试剂例如葡聚糖的明显优点，已知葡聚糖激活补体C3成分。类似地，该组合物的疏水脂肪酸成分没有免疫活性，因为脂肪酸以脂肪酸本身和/或甘油三酯的形式在生物系统中普遍存在，并且是一种本领域技术人员公知的正常的能量来源，通过柠檬酸循环或三羧酸循环提供能量。保护链阻止了大量负载分子对于受体细胞例如肾小球吞噬细胞的暴露，如果浓度足够高，则这些细胞能够识别它们。然而，特定负载分子的高亲和力受体可识别低浓度的负载分子。保护链也形成空间障碍，这阻止了较大的血清蛋白质取代负载分子从而提高其释放。本发明的组合物也通过阻止肝脏和脾脏中负载分子的快速积累而防止了可能由高浓度游离负载分子产生的毒性。如果没有负载分子，则预期本发明的疏水核载体组合物没有急性毒素，因为已知PEG是无毒的，并且脂肪酸均正常存在于生物组织和液体中。 
疏水核组合物对患者的施用
含有负载分子的疏水核载体组合物可以与药物赋形剂或稀释剂一起给患者施用。合适的药物赋形剂或稀释剂的非限制性例子包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、碳酸镁、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇、缓冲水、磷酸盐缓冲液等。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等的形式。在另外一个优选实施方案中，任何形式的疏水核组合物可以进一步用合适的赋形剂和稀释剂配制，包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水糖浆、甲基纤维素、羟苯酸甲酯和丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。制剂可以另外包含润滑剂、湿润剂、乳化剂和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或调味剂。 本发明的组合物可以配制，以在给患者施用后使负载分子或活性成分从载体上更持续或延迟地释放。该组合物优选以单位剂量形式配制，每一剂量含有大约1至大约1000mg的疏水核组合物，该疏水核组合物含有1μg至500mg的负载分子或活性成分。然而，应当理解施用的治疗剂量将由医生根据相关情况来确定，包括所治疗的临床病症和选择的给药途径。因此，上述剂量范围绝非限制本发明的范围。术语“单位剂量形式”是指适合作为用于人类患者和其它哺乳动物的单一剂量的物理上分散的单位，每个单位含有经计算产生所需疗效的预定量的活性物质，与合适的药物稀释剂或赋形剂组合。其可以与药物可接受的稀释剂或赋形剂一起以单位剂量形式给人、宠物、家畜或其它动物给药。给药可以是局部、肠胃外、静脉内、动脉内、皮下、肌肉内、颅内、眼眶内、眼睛、心室内、囊内、脊柱内、脑池内、腹膜内、鼻内、气雾剂、通过栓剂或口服给药。用于口服应用的制剂包括含有与非毒性药物可接受的赋形剂混合的活性成分的片剂。这些赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂或填充剂(例如蔗糖和山梨醇)、润滑剂、助流剂和抗粘合剂(例如硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石粉)。 
本发明的活性治疗制剂可以作为例如将在等渗、水性或盐水缓冲液中重配的冻干形式提供，用于肠胃外、皮下、真皮内、肌肉内或静脉内给药。本发明的组合物也可以作为用于经孔，例如口服、经鼻、舌下给药的液体制剂例如悬浮液、糖浆或酏剂给需要治疗剂的患者施用。本发明的组合物也可以制备为用于口服给药，如胶囊、片剂、丸剂等，以及可咀嚼的固体制剂。本发明的组合物也可以制备为用于经皮给药的乳膏剂，如液体、粘稠液体、糊剂或粉末。 
此处公开的组合物设计为用于递送活性剂，特别是在口服、鼻内、舌下、十二指肠内、皮下、口腔、结肠内、直肠、阴道、粘膜、肺、透皮、皮内、肠胃外、静脉内、肌肉内和眼系统中，以及能够穿过血-脑障碍。与本发明疏水核载体组合物结合的活性剂的给药导致该活性剂的生物利用度比活性剂单独给药时提高，如图30中的假定情况所 示。本发明的一个实施方案是预期具有20小时半衰期并且在血管通透性提高的部位积累的疏水载体。这基于以前的研究的聚(乙二醇)保护的具有类似大小的纳米载体。该实施方案理想地延长身体对具有极短生物半衰期的负载分子的暴露，如图30所示。因此，这导致生物利用度提高。 
本发明的目的是提供一种使用本发明所述的组合物以及适当的选自PDR或Physician Desk Reference(Medical Economics Company，Inc.Montvale，NJ于2001出版)所述的负载分子治疗″The Merk Manualof Diagnosis and Therapy″(Merck&Co.，Inc，Rahway，NJ的一个部门，Merck Laboratories，于1992出版)中所述的各种疾病的方法。MerkManual of Diagnosis and Therapy和PDR在此引入作为参考。负载分子对于特定疾病的适用性可以通过参考″The Merk Manual of Diagnosisand Therapy″或PDR确定。 
本发明优选的组合物
本发明也提供了具有以下通式的聚氨基酸载体的组合物： 
Figure S2006800521271D00601
其中的基团可以以任何顺序连接，例如，疏水基团R1单元可以在出现保护链R2单元之前在链中重复数次，反之亦然，其中k为50-560； 
疏水基团R1选自但不限于： 
a)具有通过酰胺键连接的疏水分子的修饰的赖氨酸R基团，例如但不限于： 
-(CH2)4NHCO(CH2)nCH3， 
-(CH2)4NHCO(C6H4)(CH2)nCH3， 
-(CH2)4NHCO(CH2)n(C6H5)，或 
-(CH2)4NHCO[CxHyOz]， 
其中n为0-24；x为6-36；y为5-73；z为0-10； 
b)具有通过酰胺键连接的疏水分子的修饰的天冬氨酸R基团，例如但不限于： 
-CH2CONH(CH2)nNHOC(CH2)nCH3， 
-CH2CONH(CH2)nNHOC(C6H4)(CH2)nCH3， 
-CH2CONH(CH2)nNHOC(CH2)n(C6H5)， 
-CH2CONH(CH2)nOPO2OCH2CH[OOC(CH2)n(CHCH)(CH2)nCH3]CHOOC(CH2)n(CHCH)(CH2)nCH3， 
-CH2CONHCH[CH2OH]CHOHCHCH(CH2)nCH3，或 
-CH2CONH[CxHyOz]， 
其中n为0-24；x为6-36；y为5-73；z为0-10； 
c)具有通过酰胺键连接的疏水分子的修饰的谷氨酸R基团，例如但不限于： 
-(CH2)2CONH(CH2)nNHOC(CH2)nCH3， 
-(CH2)2CONH(CH2)nNHOC(C6H4)(CH2)nCH3， 
-(CH2)2ONH(CH2)nNHOC(CH2)n(C6H5)， 
-(CH2)2CONH(CH2)nOPO2OCH2CH[OOC(CH2)n(CHCH)(CH2)nCH 3]CHOOC(CH2)n(CHCH)(CH2)nCH3， 
-(CH2)2CONHCH[CH2OH]CHOHCHCH(CH2)nCH3，或 
-(CH2)2CONH[CxHyOz]， 
其中n为0-24；x为6-36；y为5-73；z为0-10； 
d)具有通过酯键连接的疏水分子的修饰的丝氨酸R基团，例如但不限于： 
-CH2OOC(CH2)nCH3， 
-CH2OOC(C6H4)(CH2)nCH3， 
-CH2OOC(CH2)n(C6H5)， 
-CH2OOC[CxHyOz]， 
其中n为0-24；x为6-36；y为5-73；z为0-10； 
e)具有通过酯键连接的疏水分子的修饰的苏氨酸R基团，例如但 不限于： 
-CH2[CH3]OOC(CH2)nCH3， 
-CH2[CH3]OOC(C6H4)(CH2)nCH3， 
-CH2[CH3]OOC(CH2)n(C6H5)， 
-CH2[CH3]OOC[CxHyOz]， 
其中n为0-24；x为6-36；y为5-73；z为0-10；或 
f)具有通过酯键连接的疏水分子的修饰的酪氨酸R基团，例如但不限于： 
-(C6H4)OOC(CH2)nCH3， 
-(C6H4)OOC(C6H4)(CH2)nCH3， 
-(C6H4)OOC(CH2)n(C6H5)，或 
-(C6H4)OOC[CxHyOz]， 
其中n为0-24；x为6-36；y为5-73；z为0-10。 
保护基R2选自但不限于： 
a)具有通过酰胺键连接的保护基的修饰的赖氨酸R基团，例如但不限于： 
-(CH2)4NHCO(CH2)nOC-A-OR3，或 
-(CH2)4NHCOCH2-A-OR3， 
其中n为2-22； 
R3为H、(CH2)pCH3或(CH2)pCOOH，p为0-7；且 
A为[OCH2CH2]x或[OCH2CH2]x或[OCHCH3CH2]x， 
其中x为17-250，或者总共17-250个单位的[OCH2CH2]、[OCH2CH2]和/或[OCHCH3CH2]的各种组合； 
b)具有通过酯键连接的保护基的修饰的丝氨酸R基团，例如但不限于： 
-CH2OOC(CH2)nOC-A-OR3， 
-CH2OOCCH2-A-OR3，或 
-CH2OOCCH2CH2-A-OR3， 
其中n为2-22； 
R3为H、(CH2)pCH3或(CH2)pCOOH，p为0-7；且 
A为[OCH2CH2]x或[OCH2CH2]x或[OCHCH3CH2]x
其中x为17-250，或者总共17-250个单位的[OCH2CH2]、[OCH2CH2]和/或[OCHCH3CH2]的各种组合； 
c)具有通过酯键连接的保护基的修饰的苏氨酸R基团，例如但不限于： 
-CH(CH3)OOC(CH2)nOC-A-OR3， 
-CH(CH3)OOCCH2-A-OR3，或 
-CH(CH3)OOCCH2CH2-A-OR3， 
其中n为2-22； 
R3为H、(CH2)pCH3或(CH2)pCOOH，p为0-7；且 
A为[OCH2CH2]x或[OCH2CH2]x或[OCHCH3CH2]x， 
其中x为17-250，或者总共17-250个单位的[OCH2CH2]、[OCH2CH2]和/或[OCHCH3CH2]的各种组合； 
d)具有通过酯键连接的保护基的修饰的天冬氨酸R基团，例如但不限于： 
-CH2COOC(CH2)nCO-A-OR3， 
其中n为2-22； 
R3为H、(CH2)pCH3或(CH2)pCOOH，p为0-7；且 
A为[OCH2CH2]x或[OCH2CH2]x或[OCHCH3CH2]x， 
其中x为17-250，或者总共17-250个单位的[OCH2CH2]、[OCH2CH2]和/或[OCHCH3CH2]的各种组合； 
e)具有通过酰胺键连接的保护基的修饰的天冬氨酸R基团，例如但不限于： 
-CH2CONH(CH2)nNHCOCH2CH2-A-OR3， 
-CH2CONH(CH2)nNHCOCH2-A-OR3，或 
-CH2CONH(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3) 
其中n为2-22； 
R3为H、(CH2)pCH3或(CH2)pCOOH，p为0-7； 
y为2-6；且 
A为[OCH2CH2]x或[OCH2CH2]x或[OCHCH3CH2]x， 
其中x为17-250，或者总共17-250个单位的[OCH2CH2]、[OCH2CH2]和/或[OCHCH3CH2]的各种组合； 
f)具有通过酯键连接的保护基的修饰的谷氨酸R基团，例如但不限于： 
-(CH2)2COOC(CH2)nCO-A-OR3， 
其中n为2-22； 
R3为H、(CH2)pCH3或(CH2)pCOOH，p为0-7；且 
A为[OCH2CH2]x或[OCH2CH2]x或[OCHCH3CH2]x， 
其中x为17-250，或者总共17-250个单位的[OCH2CH2]、[OCH2CH2]和/或[OCHCH3CH2]的各种组合； 
g)具有通过酰胺键连接的保护基的修饰的谷氨酸R基团，例如但不限于： 
-(CH2)2CONH(CH2)nNHCOCH2CH2-A-OR3， 
-(CH2)2CONH(CH2)nNHCOCH2-A-OR3，或 
-(CH2)2CONH(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3， 
其中n为2-22； 
R3为H、(CH2)pCH3或(CH2)pCOOH，p为0-7； 
y为2-6；且 
A为[OCH2CH2]x或[OCH2CH2]x或[OCHCH3CH2]x， 
其中x为17-250，或者总共17-250个单位的[OCH2CH2]、[OCH2CH2]和/或[OCHCH3CH2]的各种组合；或者 
h)具有通过酯键连接的保护基的修饰的酪氨酸R基团，例如但不限于： 
-(C6H4)OCO(CH2)nCO-A-OR3， 
-(C6H4)OOCCH2CH2-A-OR3， 
-(C6H4)OOCCH2-A-OR3，或 
-(C6H4)OCO(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3， 
其中n为2-22； 
R3为H、(CH2)pCH3或(CH2)pCOOH，p为0-7； 
y为2-6；且 
A为[OCH2CH2]x或[OCH2CH2]x或[OCHCH3CH2]x， 
其中x为17-250，或者总共17-250个单位的[OCH2CH2]、[OCH2CH2]和/或[OCHCH3CH2]的各种组合。 
本发明的另一个目的是组合物可以只含有R2，没有或者只有极少的R1，特别是在R2含有显著量的位于载体和保护基旁边的疏水基团时。本发明的主题也提供一种具有以下通式的聚氨基酸载体的组合物： 
Figure S2006800521271D00651
其中R2表示疏水基团和保护基的组合，选自但不限于： 
-(CH2)4NHCO(CH2)nOC-A-OR3， 
-(CH2)4NHCO(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3， 
-CH2OOC(CH2)nOC-A-OR3， 
-CH2OOC(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3， 
-CH(CH3)OOC(CH2)nOC-A-OR3， 
-CH(CH3)OOC(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3， 
-CH2COOC(CH2)nCO-A-OR3， 
-CH2COOC(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3， 
-CH2CONH(CH2)nNHCOCH2CH2-A-OR3， 
-CH2CONH(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3， 
-(CH2)2COOC(CH2)nCO-A-OR3， 
-(CH2)2COOC(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3， 
-(CH2)2CONH(CH2)nNHCOCH2CH2-A-OR3， 
-(CH2)2CONH(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3， 
-(C6H4)OCO(CH2)nCO-A-OR3，或 
-(C6H4)OCO(CH2)nNHCO(CH2)yCO-A-OR3， 
其中n为2-22； 
R3为H、(CH2)pCH3或(CH2)pCOOH，p为0-7； 
y为2-6；且 
A为[OCH2CH2]x或[OCH2CH2]x或[OCHCH3CH2]x， 
其中x为17-250，或者总共17-250个单位的[OCH2CH2]、[OCH2CH2]和/或[OCHCH3CH2]的各种组合。 
非免疫原性
使用对疏水核具有高结合亲和力的负载分子，防止细胞表面暴露于高浓度的负载分子，使得在任意特定时刻只有纳摩尔到皮摩尔浓度的游离负载分子。另外，PEG保护基将保护浓缩的结合负载分子不与细胞表面接触。这将防止在相当高的游离抗原浓度(微克至毫克/ml)时发生免疫应答的刺激。由于PEG保护，疏水核载体与能够识别调理素的细胞，例如抗原呈递吞噬细胞，或免疫活性抗原呈递吞噬细胞，或免疫活性血细胞，例如静息B细胞之间没有结合。结果，对负载分子本身的免疫应答可能较少，并且可以避免产生针对负载分子的宿主抗体。这允许必要时重复使用该组合物。 
长血液半衰期和缺乏免疫原性的组合是本发明的一个重要特征。 
已经证明本发明的组合物对于GLP-1具有高的惊人的容量，例如可达至少30％重量。在另外一个使用溶葡萄球菌素的实验中，已经证明本发明的组合物具有600％重量的惊人的容量。 
剂量
本发明的任意化合物的剂量随患者的症状、年龄和体重、所要治疗或预防的疾病的性质和严重性、给药途径、添加剂形式而不同。任何本发明的制剂可以作为单剂量或分开的剂量给药。本发明化合物的剂量可以通过本领域技术人员所知的或者此处所述的技术容易地确定。本发明也涉及一种以上所述化合物以及其它治疗剂的混合物。 
在特定实施方案中，所述化合物的剂量通常在大约0.01ng至大约10g/kg体重的范围内，特别是在大约1ng至大约0.1g/kg的范围内，更优选在大约100ng至大约10mg/kg的范围内。. 
可能需要确定本发明的任何具体化合物的有效剂量或含量以及对制剂给药时间安排的可能的影响。这可以通过此处所述的使用一组或多组动物(优选每组至少5只动物)的常规实验进行，或者适当时在人体试验中进行。任何化合物和治疗或预防方法的有效性可以如下评价：施用添加剂，通过测定一个或多个与目标肿瘤有关的指标评价给药的效果，并且将这些指标的治疗后数值与相同指标在治疗前的数值进行比较。 
将在特定患者中产生最有效治疗的任何具体化合物的精确给药时间和给药量将取决于特定化合物的活性、药代动力学和生物利用度、患者的生理条件(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、总体身体状况、对特定药物剂量和类型的反应性)、给药途径等。此处所述的指导可以用来优化治疗，例如确定最佳给药时间和/或给药量，这仅需要常规实验，包括监测受试者和调整剂量和/或时间安排。 
治疗受试者时，可以通过在24小时期间内在预定的时间测定一个或多个相关指标来监测患者的健康。治疗，包括给药和制剂的添加剂、含量和时间，可以根据监测结果进行优化。可以通过测定相同的参数定期重新评价患者，以确定改善程度，第一次重新评价通常在从治疗开始四周结束时进行，随后的重新评价在治疗期间每4-8周进行一次，然后每三个月进行一次。治疗可以持续数月或者数年，最少一个月是对于人类治疗的典型长度。根据这些重新评价可以对给药量以及可能对给药时间进行调节。 
治疗可以用低于化合物最佳剂量的较小剂量开始。之后，可以以较小的增幅提高剂量，直到达到最佳治疗效果。 
联合应用数种本发明的化合物或者其它化疗剂可以减少任何单个成分的所需剂量，因为不同化合物效果的发生和持续时间可能是互补的。在这样的联合治疗中，不同的活性剂可以一起递送或者分开递 送，同时或者在一天内不同的时间递送。 
所述化合物的毒性和疗效可以用标准药物方法在细胞培养或实验动物中确定，例如测定LD50和ED50。优选显示高治疗指数的组合物。尽管可以使用显示毒副作用的化合物，但是应当小心设计将化合物靶向到所需部位的递送系统，以减少副作用。 
从细胞培养试验和动物研究中获得的数据可以在配制用于人体的剂量范围中使用。任何添加剂或其中任何成分的剂量优选在包括ED50的循环浓度的范围内，具有较低毒性或没有毒性。剂量可以在该范围内因使用的剂型和使用的给药途径而不同。对于本发明的药物，开始时可以从细胞培养试验估计治疗有效剂量。剂量可以在动物模型中配制，以达到包括在细胞培养中测定的IC50(即达到症状半数最大抑制时的受试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。这些信息可以用来更精确地确定在人体中有用的剂量。例如，通过高液液相色谱法(HPLC)可以测定血浆中的水平。 
制剂
如本领域公知的，本发明的疏水核载体组合物可以通过各种手段施用，这取决于它们的预期用途。例如，如果本发明的组合物口服给药，则可以配制为片剂、胶囊、颗粒、粉末或糖浆。或者，本发明的制剂可以作为注射剂(静脉内、肌肉内或皮下)、滴注制剂或栓剂肠胃外给药。对于经眼睛粘膜途径的应用，本发明的组合物可以配制为滴眼剂或眼膏剂。这些制剂可以利用常规手段制备，并且需要时，该组合物可以与任何常规添加剂如赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫正剂、增溶剂、助悬浮剂、乳化剂或包衣剂混合。 
在本发明的制剂中，在配制的试剂中可以存在湿润剂、乳化剂和润滑剂，如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。 
本发明的疏水载体组合物可以适合口服、经鼻、局部(包括口腔和舌下)、直肠、阴道、气雾剂和/或肠胃外给药。疏水载体组合物的制剂可以方便地以单位剂量形式存在，并且可以用药学领域公知的 任何方法制备。可以与其它赋形剂相组合产生单剂量的组合物的量随所治疗的患者、具体给药方式而不同。 
制备这些疏水载体-负载分子制剂的方法包括以下步骤：使本发明的疏水载体与负载分子和任选的一种或多种辅助成分结合。通常，通过使负载分子与疏水载体或细碎的固体疏水载体或此两者均匀且紧密地结合，然后必要时使产物成形，以此制备制剂。 
适合口服给药的制剂可以是胶囊、扁胶囊、丸剂、片剂、锭剂(使用香味基质，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、粉末、颗粒或作为在水性或非水液体中的溶液或悬液、或作为水包油型或油包水型乳剂、或作为酏剂或糖浆剂、或作为软锭剂(使用惰性基质，如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)的形式，每种含有预定量的所述组合物作为活性成分。本发明组合物也可以作为丸剂、药糖剂或糊剂给药。 
在用于口服的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、锭剂、粉末、颗粒等)中，所述疏水载体-负载分子组合物与一种或多种药物可接受的载体如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下任一种物质混合：(1)填充剂或膨胀剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如，羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，如甘油；(4)崩解剂，如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，如石蜡；(6)吸收促进剂，如季铵化合物；(7)湿润剂，例如乙酰醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，如高岭土和皂粘土；(9)润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠和它们的混合物；和(10)着色剂。对于胶囊、片剂和丸剂，疏水载体-负载分子组合物也可以包含缓冲剂。也可以使用相似类型的固体组合物作为软和硬填充明胶胶囊中的填充剂，使用赋形剂如乳糖或奶糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等。 
片剂可以通过任选与一种或多种辅助成分压缩或成型来制备。压缩片剂可以用粘合剂(例如明胶或羟丙甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如淀粉乙醇酸钠或交联的羧甲基纤维素 钠)、表面活性剂或分散剂来制备。成型的片剂可以通过用适当的机器将用惰性液体稀释剂湿润的所述混合物模塑而制成。片剂和其它固体剂型如锭剂、胶囊、丸剂和颗粒任选地可以刻痕，或者制备为具有包衣和外壳，如肠衣和制药领域公知的其它包衣。 
用于口服给药的液体剂型包括药物接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖剂和酏剂。液体剂量疏水载体-负载分子制剂可以含有本领域中常用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯，和它们的混合物。 
疏水载体-负载分子制剂的悬浮剂型可以含有悬浮剂，例如，乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和山梨聚糖酯、微晶纤维素、氧氢氧化铝(aluminum metahydroxide)、皂粘土、琼脂-琼脂和黄蓍胶，和它们的混合物。 
用于经直肠或阴道给药的疏水载体-负载分子制剂可以是栓剂，可以通过将负载分子与一种或多种合适的疏水载体和包含例如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸酯的其它赋形剂混合而制备，它在室温下是固体，但是在体温下为液体，因此在体腔中融化，并且释放出具有负载分子的疏水载体。适用于经阴道给药的制剂也包括含有本领域公知合适的赋形剂的阴道栓剂、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂。 
用于所述组合物经皮给药的疏水载体-负载分子剂量制剂包括粉末、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。活性成分可以在无菌条件下与药物可接受的载体以及可能需要的任何防腐剂、缓冲液或抛射剂混合。 
软膏、糊剂、乳膏和凝胶除了所述组合物以外还可含有赋形剂，如动物和植物脂肪、油、蜡类、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅氧烷、膨润土、硅酸、滑石粉和氧化锌或其混合 物。本发明的疏水载体-负载分子组合物也可以是婴儿湿巾(babywipes)的形式。 
粉末和喷剂除了所述组合物以外还可含有赋形剂如乳糖、滑石粉、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，或这些物质的混合物。喷剂另外还可含有常用抛射剂，如氯氟烃和挥发性非取代的烃，例如丁烷和丙烷。 
本发明的疏水载体-负载分子组合物可以通过气雾剂方式给药。这通过制备含有化合物的水性气雾剂、脂质体制剂或固体颗粒来实现。使用非水(例如碳氟化合物抛射剂)悬浮液。可以使用超声喷雾器，因为它们使可导致所述组合物中所含化合物降解的试剂所受到的剪切最小化。 
通常，水性气雾剂通过将所述组合物的水溶液或悬液与常规药物可接受的载体和稳定剂一起配制而制备。载体和稳定剂根据具体组合物的需要而变化，但是一般包括非离子型表面活性剂(吐温、Pluronics或聚乙二醇)、无害的蛋白质样血清白蛋白、山梨聚糖酯、油酸、卵磷脂、氨基酸如甘氨酸、缓冲液、盐、糖或糖醇。通常由等渗溶液制备气雾剂。 
适合肠胃外给药的本发明的药物组合物包括与一种或多种药物可接受的无菌等渗水溶液或非水溶液、分散液、悬浮剂或乳剂或者在使用前可以重配为无菌注射液或分散液的无菌粉末组合的组合物，它可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂。 
可以在本发明药物组合物中使用的适当的水性和非水载体的例子包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和它们的适当的混合物、植物油如橄榄油，和可注射的有机酯，如油酸乙酯。例如，通过使用包衣材料如卵磷脂，在分散液的情况中通过保持所需的颗粒大小，以及使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。 
使用疏水核载体组合物治疗疾病
胰岛素不足型糖尿病是一种机体不产生胰岛素或不能正确利用 胰岛素的疾病，胰岛素是一种调节血糖的激素。在北美，胰岛素不足型糖尿病是排在第三位的最常见的疾病和排在第四位的主要死亡原因，在美国估计影响到1820万人(人口的6.3％)。美国每年花在胰岛素不足型糖尿病上的经济费用估计多达1000亿美元，因此该疾病成为一个重要的临床和公共健康问题(综述见Ettaro，L.等人，Cost-of-illnessstudies in diabetes mellitus.Pharmacoeconomics，2004.22(3)：p.149-64)。 
糖尿病有两种主要的类型：1型或T1D，(占糖尿病患者中的5-10％)，其中免疫系统攻击胰脏的产胰岛素β细胞，和2型或T2D，其中个体发展对胰岛素的抗性。未接受治疗的糖尿病患者受到多种并发症的影响，包括眼、肾脏、神经和心血管疾病。胰岛素不足型糖尿病治疗的目的是调节血糖水平并且预防高血糖症。尽管可以通过生活方式的改变和口服抗高血糖药控制2型糖尿病中的高血糖，然而，T1D的唯一的标准治疗是通过注射胰岛素严格控制血液葡萄糖水平，具有严重低血糖事件相关的风险。最近证明了产胰岛素胰岛细胞的移植在逆转I型患者的胰岛素不足型糖尿病中非常有效。然而这种治疗的成功取决于有效的免疫抑制，以防止移植的胰岛被患者的异体和自身免疫应答排斥(Shapiro，A.M.，S.A.Nanji和J.R.Lakey，Clinical islettransplant：current and future directions towards tolerance.ImmunolRev，2003.196：p.219-36)，尽管已经报道了对移植物的持续耐受。如果没有发现替代方法，预期这种移植方法将成为临床治疗标准，尽管慢性免疫抑制方案可见毒性。 
最近发现在糖尿病动物中可以用肽激素胰高血糖素样肽1(GLP-1)使胰岛细胞再生(Drucker，D.J.，Enhancing incretin action forthe treatment of type 2 diabetes.Diabetes Care，2003.26(10)：p.2929-40，Perry，T.和N.H.Greig，The glucagon-like peptides：a double-edgedtherapeutic sword？Trends Pharmacol Sci，2003.24(7)：p.377-83)，这提出了一种新的令人兴奋的治疗方法的可能性，该方法不需要移植胰岛并且避免了相关的并发症。GLP-1在体内具有非常短的半衰期，需要 使用具有长半衰期的潜在免疫原性类似物评价其功效。实际上，当前正在NIH-资助的I期临床试验中评价GLP-1类似物(依泽那太)与用于逆转T1D的免疫抑制剂的联合应用。然而，38％的接受依泽那太的2型糖尿病患者产生针对这种GLP-1类似物的抗体，该抗体潜在限制了该激素在未来的有效性。本发明使天然GLP-1的循环半衰期从大约5分钟延长到惊人的超过24小时(图44)，提供了在不开发中和抗体的情况下进行胰岛再生研究的可能性。本发明推动了用于再生β细胞和/或治疗胰岛素不足型糖尿病的长效天然GLP-1的开发。 
天然-GLP-1作为药物的限制和现有技术的问题：GLP-1(7-36酰胺)是一种提高胰岛素分泌的强肠激素。进食引起的释放的GLP-1刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，抑制激素胰高血糖素的释放(其作为胰岛素拮抗剂起作用)并且延迟了胃排空。通过与胰岛细胞上的GLP-1受体相互作用，GLP-1导致信号反应级联，导致含胰岛素颗粒的胞吐作用以严格依赖于葡萄糖的方式增强(葡萄糖浓度＞4.5mM时)。另外，GLP-1强烈增强了胰岛素生物合成的所有步骤，包括胰岛素基因的转录(Ahren，B.等人，Improved glucose tolerance and insulin secretion byinhibition of dipeptidyl peptidase IV in mice.Eur J Pharmacol，2000.404(1-2)：p.239-45)。β细胞功能必需的其它基因(葡糖激酶和Glut-2)的转录也因GLP-1治疗而增强(Ahren，B.等人，Improved glucosetolerance and insulin secretion by inhibition of dipeptidyl peptidase IV inmice.Eur J Pharmacol，2000.404(1-2)：p.239-45)。由于GLP-1的这些作用，对能够用功能性β细胞刺激2型糖尿病患者中胰岛素释放的作为潜在治疗剂的该肽具有浓厚的兴趣。然而，由于血流中的二肽基肽酶4(DPP4)在Ala2位进行N-末端切割，GLP-1的活性被快速抑制。这种酶切使GLP-1的半衰期限制为2-6分钟，这被认为是其治疗潜力的严重限制。正在开发大量GLP-1类似物以对抗DPP4的作用(表1)，但是其中没有一个使用天然GLP-1和本发明中的载体系统。其中一些已经在糖尿病动物模型(Xu，G.等人，Exendin-4 stimulates both beta-cellreplication and neogenesis，resulting in increased beta-cell mass and improved glucose tolerance in diabetic rats.Diabetes，1999.48(12)：p.2270-6)以及人体(Drucker，D.J.，Enhancing incretin action for thetreatment of type 2 diabetes.Diabetes Care，2003.26(10)：p.2929-40)中证实使空腹和餐后血液葡萄糖正常化。最大的进展是，extendin 4或依泽那太(人GLP-1的一种爬行动物类似物)现在已被批准用于2型糖尿病。然而，这些非天然肽的长期全身给药的效果还不清楚。持续给药的副作用似乎导致胃肠和心血管副作用(Nielsen，L.L.和A.D.Baron，Pharmacology of exenatide(synthetic exendin-4)for the treatment oftype 2 diabetes.Curr Opin Investig Drugs，2003.4(4)：p.401-5)，并且必须小心控制以防止发生血糖过低。此外，现在证明非天然GLP-1类似物如依泽那太的给药导致在38％的所治疗的2型糖尿病患者中产生抗体。尽管已经表明产生的抗体是非中和抗体，也许是由于对C末端而不是对N-末端敏感，但是随着时间推移也可能将开发出N-末端中和抗体。 
西他列汀(Sitagliptin)(7-[(3R)-3-氨基-1-氧代-4-(2，4，5-三氟苯基)丁基]-5，6，7，8-四氢-3-(三氟甲基)-1，2，4-三唑[4，3-a]吡嗪磷酸盐(1∶1)单水合物)是一种DPP-4抑制剂，它被认为通过减慢包括GLP-1在内的肠降血糖素激素的失活在2型糖尿病患者中发挥作用。西他列汀提高了活性完整激素的浓度，由此提高并延长了这些激素的作用。肠降血糖素激素，包括胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)，由肠全天释放，其水平由于进食而升高。这些激素被酶DPP-4快速灭活。肠降血糖素是与葡萄糖内稳态的生理调节有关的内源系统的一部分。当血液葡萄糖浓度正常或者升高时，GLP-1和GIP通过涉及环AMP的细胞内信号途径提高了胰岛素的合成和从胰岛β细胞的释放。GLP-1也降低胰岛α细胞的胰高血糖素分泌，导致肝葡萄糖生成减少。通过提高和延长活性肠降血糖素水平，西他列汀以依赖于葡萄糖的方式提高了胰岛素释放并且降低了循环中的胰高血糖素水平。证明西他列汀对于DPP-4具有选择性，并且在接近治疗剂量的浓度时在体外不抑制DPP-8或DPP-9的活性。 
表1.天然GLP-1限制导致开发GLP-1类似物 
 产品   相对于天然GLP-1改善  的基础   开发阶段
 依泽那太 Amylin Pharma   DPP4-抗性类似物，与  人GLP-1具有53％的同  源性   已批准用于2型糖尿病
 CJC1131 Conjuchem   具有长半衰期的BSA-连  接的类似物   II期临床试验
 利拉鲁肽 Novo Nordisk   具有长半衰期的BSA-连  接的脂肪-酰化GLP-1   III期临床试验
 依泽那太LAR Amylin   用于每周-每月给药一次  的缓释制剂   II期临床试验
 BIM 51077 Ipsen   用于每天给药一次-每  两周给药一次的缓释  制剂   II期研究，证实该化合物在  缓释制剂中的有效性和安  全性开始于2007年初
作为具有长半衰期的GLP-1类似物的替代物，DPP4的小分子抑制剂处于开发中，它具有可口服使用的优点。然而，由于DPP4在切割对于免疫功能重要的其它分子中的重要性，这些抑制剂具有其它副作用的可能(Wiedeman，P.E.和J.M.Trevillyan，Dipeptidyl peptidase IVinhibitors for the treatment of impaired glucose tolerance and type 2diabetes.Curr Opin Investig Drugs，2003.4(4)：p.412-20)。 
GLP-1不仅提高β细胞的增殖(Buteau，J.等人，Glucagon-likepeptide-1 promotes DNA synthesis，activates phosphatidylinositol3-kinase and increases transcription factor pancreatic and duodenalhomeobox gene 1(PDX-1)DNA binding activity inβ(INS-1)-cells.Diabetologia，1999.42(7)：p.856-64)及阻止其凋亡(Urusova，LA.等人，GLP-1 inhibition of pancreatic islet cell apoptosis.Trends EndocrinolMetab，2004.15(1)：p.27-33)而且刺激其新生、诱导从胰管祖细胞分化 新β细胞(Bulotta，A.等人，Cultured pancreatic ductal cells undergo cellcycle re-distribution and beta-cell-like differentiation in response toglucagon-like peptide-1.J Mol Endocrinol，2002.29(3)：p.347-60)的发现使人们对这种肽可能治愈T1D产生了兴趣。实际上，在缺乏GLP-1受体的小鼠中观察到GLP-1在胰岛产生中的重要性，该小鼠具有含有较少β细胞的胰岛和异常葡萄糖耐受(Scrocchi，L.A.等人，Identification of glucagon-like peptide 1(GLP-1)actions essential forglucose homeostasis in mice with disruption of GLP-1 receptor signaling.Diabetes，1998.47(4)：p.632-9)。GLP-1和其它GLP-1受体的激动剂引起的胰岛细胞的再生和胰腺β细胞量的增加在动物模型中已经得到证明(Xu，G.等人，Exendin-4 stimulates both beta-cell replication andneogenesis，resulting in increased beta-cell mass and improved glucosetolerance in diabetic rats.Diabetes，1999.48(12)：p.2270-6)，进一步已经证明GLP-1减弱了胰岛素不足型糖尿病在部分胰切除术后的进展(Xu，G.等人，Exendin-4 stimulates both beta-cell replication andneogenesis，resulting in increased beta-cell mass and improved glucosetolerance in diabetic rats.Diabetes，1999.48(12)：p.2270-6)。因此，GLP-1治疗可能使T1D中被破坏的胰岛再生。遗憾的是，不应用本发明，作为药物的天然GLP-1作为商品不能存活。本发明能够提供人们长期寻求的许多益处。 
本发明包括将GLP-1配制到四种载体的至少两种中，其解离常数为77和249nM(图35和36)。这些Kd远低于DPP4对于GLP-1的Km，因此阻止了GLP-1的降解。这种保护加上有效大小的增加，阻止了肾脏清除，使我们的天然GLP-1制剂的循环半衰期延长到惊人的程度(图42-44)并且降低了链脲霉素诱导的糖尿病大鼠中的葡萄糖水平(图45)。与FDA批准的或接近批准的GLP-1类似物相比，我们的长效GLP-1制剂的半衰期大大高于使用蛋白酶抗性GLP-1类似物(FDA批准的依泽那太；t1/2＝4小时，每天给药两次)或非蛋白酶抗性利拉鲁肽(Liraglutide)(与白蛋白结合的脂肪酸连接的GLP-1；t1/2＝10小时， 计划每天给药一次)所达到的半衰期。重要的是注意到我们的天然 GLP-1不可能引起在用依泽那太(Byetta)治疗的患者中所见的抗体形成。另外，由于配制的天然GLP-1具有长循环半衰期，预期给药频率较低。尽管长效依泽那太(Byetta-LAR)仍在开发中，但是我们的方法不同于Byetta-LAR。Byetta-LAR使用在皮肤下溶解并且缓慢释放游离GLP-1类似物的聚合物(随时间降解的聚乳酸)。我们的制剂是在皮下注射，我们对血液中结合的和游离的GLP-1的测定证明载体以及GLP-1在血液中循环，总GLP-1的87.5％与血液中的循环载体结合，其余12.5％是游离的。这恰好证明了本发明的有用性，而非限制本发明的范围。 
本发明另一实施方案涉及一种治疗患者的胰岛素不足型糖尿病的方法，包括：给有此需要的患者施用治疗有效量的上述任一种疏水核载体组合物，其中负载分子是GLP-1。 
在另一个实施方案中，本发明涉及一种治疗患者的胰岛素不足型糖尿病的方法，包括：给有此需要的患者施用治疗有效量的上述任一种疏水核载体组合物；该组合物包含：聚氨基酸载体，与所述聚氨基酸载体共价连接的甲氧基聚乙二醇保护链，与所述聚氨基酸载体共价连接的疏水脂肪酸链，与所述疏水脂肪酸链可逆结合的负载分子，其中负载分子是GLP-1。 
天然胃泌素和天然EGF具有与天然GLP-1类似的限制：胃泌素如EGF受体配体的转基因过量表达刺激了成年小鼠的胰岛新生，显著增加了胰岛细胞质量(Wang，T.C.等人，Pancreatic gastrin stimulates isletdifferentiation of transforming growth factor alpha-induced ductularprecursor cells.J Clin Invest，1993.92(3)：p.1349-56)。EGF受体配体如EGF、TGF-α和β细胞生长因子增加了产生胰岛素的β-胰岛细胞的新生和增殖(Suarez-Pinzon，W.L.等人，Combination therapy with epidermalgrowth factor and gastrin increases beta-cell mass and reverseshyperglycemia in diabetic NOD mice.Diabetes，2005.54(9)：p.2596-601，Song，S.Y.等人，Expansion of Pdx1-expressing pancreatic epithelium and islet neogenesis in transgenic mice overexpressing transforminggrowth factor alpha.Gastroenterology，1999.117(6)：p.1416-26，Krakowski，M.L.等人，Transgenic expression of epidermal growth factorand keratinocyte growth factor in beta-cells results in substantialmorphological changes.J Endocrinol，1999.162(2)：p.167-75，Cras-Meneur，C等人，Epidermal growth factor increasesundifferentiated pancreatic embryonic cells in vitro：a balance betweenproliferation and differentiation.Diabetes，2001.50(7)：p.1571-9，Huotari，M.A.，J.Palgi和T.Otonkoski，Growth factor-mediatedproliferation and differentiation of insulin-producing INS-1 and RINm5Fcells：identification of Betacellulin as a novel beta-cell mitogen.Endocrinology，1998.139(4)：p.1494-9，Yamamoto，K.等人，Recombinant human Betacellulin promotes the neogenesis of beta-cellsand ameliorates glucose intolerance in mice with diabetes induced byselective alloxan perfusion.Diabetes，2000.49(12)：p.2021-7)。另外，通过系统施用EGF和胃泌素药物治疗慢性链脲霉素诱导的糖尿病大鼠导致葡萄糖的正常化和葡萄糖耐受的改善(Brand，S.J.等人，Pharmacological treatment of chronic diabetes by stimulating pancreaticbeta-cell regeneration with systemic co-administration of EGF andgastrin.Pharmacol Toxicol，2002.91(6)：p.414-20)。组织学分析显示β-细胞量随BrdU标记增多而增多，指示新生。重要的是，证据表明生长因子如EGF也引起对新再生的β-细胞的免疫耐受的诱导(Suarez-Pinzon，W.L.等人，Combination therapy with epidermal growthfactor and gastrin increases beta-cell mass and reverses hyperglycemiain diabetic NOD mice.Diabetes，2005.54(9)：p.2596-601)。为了克服天然胃泌素和天然EGF具有短生物半衰期的限制(其半衰期均为几分钟(Hansen，C.P.等人，Pharmacokinetics and organ metabolism ofcarboxyamidated and glycine-extended gastrins in pigs.Am J Physiol，1996.271(1 Pt 1)：p.G156-63，Lev-Ran，A.等人，Origin of urinary epidermal growth factor in humans：excretion of endogenous EGF andinfused [131I]-human EGF and kidney histochemistry.Clin ExpPharmacol Physiol，1992.19(10)：p.667-73，Senekowitsch-Schmidtke，R.等人，In vivo evaluation of epidermal growth factor(EGF)receptordensity on human tumor xenografts using radiolabeled EGF andanti-(EGF receptor)mAb 425.Cancer Immunol Immunother，1996.42(2)：p.108-14，Feng，J.等人，Tissue distribution and plasma clearanceof heparin-binding EGF-like growth factor(HB-EGF)in adult andnewborn rats.Peptides，2005))，使用EGF和胃泌素的类似物，每天通过腹膜内注射给药两次(美国专利#6,992,060，Suarez-Pinzon，W.L.等人，Combination therapy with epidermal growth factor and gastrinincreases beta-cell mass and reverses hyperglycemia in diabetic NODmice.Diabetes，2005.54(9)：p.2596-601)。另外，本领域中的一个实例教导不使用天然胃泌素和天然EGF。 
本发明另一实施方案涉及一种治疗患者的胰岛素不足型糖尿病的方法，包括：给有此需要的患者施用治疗有效量的上述任一种疏水核载体组合物，其中负载分子是EGF，和；上述任一种疏水核载体组合物，其中负载分子是胃泌素。 
本发明另一实施方案涉及一种治疗患者的胰岛素不足型糖尿病的方法，包括：给有此需要的患者施用治疗有效量的上述任一种疏水核载体组合物，其中负载分子是GLP-1，和；上述任一种疏水核载体组合物，其中负载分子是胃泌素。 
奥美拉唑不可逆地抑制胃中的质子泵，直到发生新泵的合成(于：W.B.，D.P.Blakeman和J.P.Davis，Irreversible inactivation of rat gastric(H+-K+)-ATPase in vivo by omeprazole.Biochem Biophys Res Commun，1985.126(1)：p.78-82，Keeling，D.J.等人，Studies on the mechanism ofaction of omeprazole.Biochem Pharmacol，1985.34(16)：p.2967-73)。长久以来已知质子泵抑制导致高胃泌素血症，其中血清胃泌素水平可以从15pg/ml升高至200pg/ml以上(Lamberts，R.等人，Long-term omeprazole treatment in man：effects on gastric endocrine cellpopulations.Digestion，1988.39(2)：p.126-35)，在已经具有高水平胃泌素的疾病中(佐林格-埃利森综合征)，奥美拉唑可以使其进一步提高至700pg/ml(Cadranel，J.F.等人，[Long-term efficacy and tolerability ofomeprazole in 20 patients with severe Zollinger-Ellison syndrome].Gastroenterol Clin Biol，1989.13(8-9)：p.654-62)。奥美拉唑已经应用了超过20年，其用于治疗胃食管返流病(GERD)和其它消化性疾病的安全性已经经过长时间的检验(LD50＞4g/Kg)。其它质子泵抑制剂如H2受体阻断剂也用于相同的适应症(Schentag，J.J.和T.F.Goss，Pharmacokinetics and pharmacodynamics of acid-suppressive agents inpatients with gastroesophageal reflux disease.Am J Hosp Pharm，1993.50(4Suppl 1)：p.S7-10)。用奥美拉唑治疗应当使胃泌素水平升高至正常水平的至少3倍，在大多数情况下升高10倍(Halter，F.等人，Effect ofacid inhibition on the growth of parietal cells.Scand J GastroenterolSuppl，1986.125：p.9-13，Hakanson，R.等人，Evidence that gastrinenhances 45Ca uptake into bone through release of a gastric hormone.Regul Pept，1990.28(1)：p.107-18，Van Nieuwenhove，Y.等人，Gastrinstimulates epithelial cell proliferation in the oesophagus of rats.Virchows Arch，1998.432(4)：p.371-5，Koop，H.，M.Klein和R.Arnold，Serum gastrin levels during long-term omeprazole treatment.AlimentPharmacol Ther，1990.4(2)：p.131-8，Larson，G.M.，H.W.Sullivan和P.Rayford，Omeprazole-induced hypergastrinemia：role of gastric acidity.J Surg Res，1986.40(5)：p.504-9，Larson，G.M.，H.W.Sullivan和P.L.Rayford，Relationship of omeprazole-induced hypergastrinemia togastric pH.Surgery，1986.100(2)：p.175-80，Creutzfeldt，W.和R.Lamberts，Is hypergastrinemia dangerous to man？Scand J GastroenterolSuppl，1991.180：p.179-91)，这种升高持续存在(Klinkenberg-Knol，E.C.，The role of omeprazole in healing and prevention of reflux disease.Hepatogastroenterology，1992.39 Suppl 1：p.27-30)。尽管存在其它奥美 拉唑衍生物，奥美拉唑的使用已经得到长期检验，并且导致的血清胃泌素升高非常一致。奥美拉唑及其衍生物仍然是比较新一代质子泵抑制剂的黄金标准，质子泵抑制剂有效性的证据是血清胃泌素水平的升高(Yu，K.S.等人，Pharmacokinetic and pharmacodynamic evaluation ofa novel proton pump inhibitor，YH1885，in healthy volunteers.J ClinPharmacol，2004.44(1)：p.73-82)。本发明的另外一个实施方案涉及与本发明疏水核载体组合物配制的天然GLP-1或天然EGF与质子泵抑制剂联合应用，通过诱导β-胰岛细胞再生升高血液中的胃泌素水平，以治疗胰岛素不足型糖尿病。 
本发明另一实施方案涉及一种治疗患者的胰岛素不足型糖尿病的方法，包括给有此需要的患者施用治疗有效量的上述任一种疏水核载体组合物，其中负载分子是GLP-1，以及进一步给患者施用质子泵抑制剂。在进一步的实施方案中，质子泵抑制剂可以是奥美拉唑。在进一步的实施方案中，奥美拉唑以低于4g/Kg患者体重，但是优选低于500mg/kg患者体重，甚至更优选低于100mg/Kg患者体重的剂量给药。 
本发明另一实施方案涉及一种治疗患者的胰岛素不足型糖尿病的方法，包括给有此需要的患者施用治疗有效量的上述任一种疏水核载体组合物，其中负载分子是表皮生长因子(EGF)受体配体。 
本发明另一实施方案涉及一种治疗患者的胰岛素不足型糖尿病的方法，包括给有此需要的患者施用治疗有效量的上述任一种疏水核载体组合物，其中负载分子是表皮生长因子(EGF)受体配体，以及进一步给患者施用质子泵抑制剂。在进一步的实施方案中，质子泵抑制剂可以是奥美拉唑。在进一步的实施方案中，奥美拉唑以低于4g/Kg患者体重，但是优选低于500mg/kg患者体重，甚至更优选低于100mg/Kg患者体重的剂量给药。 
本发明另一实施方案涉及一种治疗患者的胰岛素不足型糖尿病的方法，包括：给有此需要的患者施用治疗有效量的上述任一种疏水核载体组合物，其中负载分子是EGF。 
本发明另一实施方案涉及一种治疗患者的胰岛素不足型糖尿病的方法，包括：给有此需要的患者施用治疗有效量的上述任一种疏水核载体组合物，其中负载分子是GLP-1，以及；上述任一种疏水核载体组合物，其中负载分子是胃泌素。 
本发明另一实施方案涉及一种治疗患者的胰岛素不足型糖尿病的方法，包括给有此需要的患者施用治疗有效量的上述任一种疏水核载体组合物，其中负载分子是EGF，以及进一步给患者施用质子泵抑制剂。在进一步的实施方案中，质子泵抑制剂可以是奥美拉唑。在进一步的实施方案中，奥美拉唑以低于4g/Kg患者体重，但是优选低于500mg/kg患者体重，甚至更优选低于100mg/Kg患者体重的剂量给药。 
本发明另一实施方案涉及一种治疗患者的胰岛素不足型糖尿病的方法，包括给有此需要的患者施用治疗有效量的上述任一种疏水核载体组合物，其中负载分子是TGF-α。 
本发明另一实施方案涉及一种治疗患者的胰岛素不足型糖尿病的方法，包括给有此需要的患者施用治疗有效量的上述任一种疏水核载体组合物，其中负载分子是TGF-α，以及进一步给患者施用质子泵抑制剂。在进一步的实施方案中，质子泵抑制剂可以是奥美拉唑。在进一步的实施方案中，奥美拉唑以低于4g/Kg患者体重，但是优选低于500mg/kg患者体重，甚至更优选低于100mg/Kg患者体重的剂量给药。 
本发明另一实施方案涉及一种治疗患者的胰岛素不足型糖尿病方法，包括给有此需要的患者施用治疗有效量的上述任一种疏水核载体组合物，其中负载分子是β细胞生长因子。 
本发明另一实施方案涉及一种治疗患者的胰岛素不足型糖尿病的方法，包括给有此需要的患者施用治疗有效量的上述任一种疏水核载体组合物，其中负载分子是β细胞生长因子，以及进一步给患者施用质子泵抑制剂。在进一步的实施方案中，质子泵抑制剂可以是奥美拉唑。在进一步的实施方案中，奥美拉唑以低于4g/Kg患者体重，但是优选低于500mg/kg患者体重，甚至更优选低于100mg/Kg患者体重 的剂量给药。 
本发明另一实施方案涉及一种治疗患者的胰岛素不足型糖尿病的方法，包括给有此需要的患者施用治疗有效量的上述任一种疏水核载体组合物，其中负载分子是胃泌素/缩胆囊素受体配体。 
本发明另一实施方案涉及一种治疗患者的胰岛素不足型糖尿病的方法，包括给有此需要的患者施用治疗有效量的上述任一种疏水核载体组合物，其中负载分子是胃泌素。 
本发明另一实施方案涉及一种治疗患者的胰岛素不足型糖尿病的方法，包括给有此需要的患者施用治疗有效量的上述任一种疏水核载体组合物，其中负载分子是胃泌素，以及进一步给患者施用质子泵抑制剂。在进一步的实施方案中，质子泵抑制剂可以是奥美拉唑。在进一步的实施方案中，奥美拉唑以低于4g/Kg患者体重，但是优选低于500mg/kg患者体重，甚至更优选低于100mg/Kg患者体重的剂量给药。含有胃泌素的疏水核载体组合物和奥美拉唑的联用将减少所需的含有胃泌素的疏水核载体组合物的剂量。 
本发明另一实施方案涉及一种治疗患者的胰岛素不足型糖尿病的方法，包括给有此需要的患者施用治疗有效量的上述任一种疏水核载体组合物，其中负载分子是缩胆囊素。 
本发明另一实施方案涉及一种治疗患者的胰岛素不足型糖尿病的方法，包括给有此需要的患者施用治疗有效量的上述任一种疏水核载体组合物，其中负载分子是缩胆囊素，以及进一步给患者施用质子泵抑制剂。在进一步的实施方案中，质子泵抑制剂可以是奥美拉唑。在进一步的实施方案中，奥美拉唑以低于4g/Kg患者体重，但是优选低于500mg/kg患者体重，甚至更优选低于100mg/Kg患者体重的剂量给药。含有缩胆囊素的疏水核载体组合物和奥美拉唑的联用将减少所需的含有缩胆囊素的疏水核载体组合物的剂量。 
本发明的目的是提供一种使用本发明所述的组合物以及适当的选自PDR或Physician Desk Reference(Medical Economics Company，Inc.Montvale，NJ于2001出版)所述的负载分子治疗″The Merk Manual of Diagnosis and Therapy″(Merck&Co.，Inc，Rahway，NJ的一个部门，Merck Laboratories，于1992出版)中所述的各种疾病的方法。MerkManual of Diagnosis and Therapy和PDR在此引入作为参考。负载分子对于特定疾病的适用性可以通过参考″The Merk Manual of Diagnosisand Therapy″或PDR确定。 
实施例 
合成方法概述
本发明的疏水核载体包括中心载体链、疏水基团、保护基和任选的靶定基团。每个基团连接在一起，疏水基团能够与负载分子如药物、治疗剂或诊断剂形成可逆连接。疏水核载体和负载分子之间的可逆连接包括疏水相互作用。 
由含有氨基、羧基或羟基的聚合载体合成疏水核载体负载分子复合物通常包括三个合成步骤：1)用保护链共价修饰骨架载体；2)用疏水基团例如棕榈酸修饰步骤1)的产物；和3)将步骤2)的产物与负载分子一起孵育，例如与GLP-1一起孵育，以实现疏水核载体-GLP-1复合物的形成。 
实施例1 
脂肪酸和芳香烷基羧酸的N-羟基琥珀酰胺酯的制备 
脂肪酸和芳香羧酸的N-羟基琥珀酰胺酯可促进本发明疏水核载体的合成，因为这些酯可沿载体与氨基容易地反应。下述方法来自Lapidot等人[Lapidot，Y.，Rappoport，S.和Wolman，Y.(1967)J.LipidRes.，8，142]：(i)通过将3.45g(30nmol)的N-羟基琥珀酰亚胺溶解在30ml乙酸乙酯中制成230mM溶液，并在250ml带塞玻璃锥形瓶中在分子筛球上干燥；(ii)向上述溶液中加入30nmol所需脂肪酸；(iii)制备在10ml乙酸乙酯中含有30mmol(6.18g)二环己基碳二亚胺的溶液，并将其加入至脂肪酸溶液中；(iv)使反应在室温下进行过夜；(v)使用吸捕器(suction tap)过滤除去沉淀的二环己基碳二亚胺；(vi)在旋转蒸 发器上将滤液蒸发至干，并通过从乙醇中重结晶将其纯化；和(vii)通过TLC检测纯度，使用以下溶剂系统：(a)氯仿，(b)石油(沸点40-60)-二乙醚，8∶2；(viii)通过喷射在0.1M NaOH中的10％羟胺，2分钟后喷射在1.2M HCl中的5％FeCl3，对N-羟基琥珀酰亚胺和酯(红色)染色。可获得89-90％的收率。 
其它活化的脂肪酸和芳香烷基羧酸以脂肪酸酐、脂肪酰卤、芳香基-烷基-羧基-酐或芳香基-烷基-酰基-卤(如-酰基-Cl和-酰基-Br)的形式作为商品获得(例如来自Sigma-Aldrich Chem.Co.，St louis，MO)。例如，硬脂酸酐将自发地与载体的氨基反应，形成酰胺键，连接硬脂酸酐的CH3(CH2)16CO-，并且释放硬脂酸酐的其它部分为硬脂酸。用碱性缓冲液中和硬脂酸产物将帮助使反应完成。类似的反应可以用苯甲酸酐进行，以将疏水苯基连接到载体上。类似地，烷基-酰基-卤或苄基-烷基-酰基-卤将与氨基反应，或者，当加热时，也与羟基反应。这允许将疏水基团加到载体上。 
实施例2 
MPEG-聚-L-赖氨酸(5000；40,000；73％)(PLPEG-I)的合成。 
试剂MPEG-琥珀酰亚胺基-琥珀酸酯和聚赖氨酸可从市场上购得，并且它们的合成在本领域中众所周知。将聚-L-赖氨酸(200mg；氢溴酸聚赖氨酸；Sigma chemical Co.；DPvis：264；MWvis：55,200；DPmalls：190；MWmalls：39,800；TNBS测定含0.7mmol氨基，Sparado等人.Anal Biochem 96：317，1979)溶解在10ml 0.1M碳酸盐缓冲液pH8.35中，加入1150mg MPEG-琥珀酰亚胺基-琥珀酸酯，涡旋，并在室温下孵育过夜。第二天，取等份，使用三硝基苯磺酸将剩余氨基的量进行定量(Sparado等人.Anal Biochem 96：317，1979)。结果表明，73％的氨基已与MPEG偶合。为了将潜在干扰下一反应(加入疏水基团)的聚赖氨酸的羧基端进行封端，加入600μl乙二胺和100mg EDC混合，并在室温下孵育1小时。所得溶液(200ml)通过截止值为100kDa的过滤薄(Amersham Biosciences Corp，Westborough，MA)过滤洗涤，期 间换水5次。将所得PLPEG复合物冻干，称重，得到860mg的产量。基于被MPEG衍生化的氨基数目估计所得产物的分子量为730kDa。每mg终产物中的游离氨基的量为0.43μmol/mg(图9)。应当注意的是，如果所使用的MPEG-琥珀酰亚胺基-琥珀酸酯掺杂有游离琥珀酸酯(这非常常见)，PEG的量将少于根据氨基分析预期的值，并且将与每mg终产物中的氨基量不相符。 
实施例3 
MPEG-聚-L-赖氨酸(5000；40,000；55％)(PLPEG-II)的合成。 
试剂MPEG-琥珀酰亚胺基-琥珀酸酯和聚赖氨酸可从市场上购得，并且它们的合成在本领域中众所周知。将聚-L-赖氨酸(200mg；氢溴酸聚赖氨酸；Sigma chemical Co.；DPvis：264；MWvis：55,200；DPmalls：190；MWmalls：39,800；TNBS测定含0.7mmol氨基，Sparado等人.Anal Biochem 96：317，1979)溶解在10ml 0.1M碳酸盐缓冲液pH8.35中，加入900mg MPEG-琥珀酰亚胺基-琥珀酸酯，涡旋，并在室温下孵育过夜。第二天，取等份，使用三硝基苯磺酸将剩余氨基的量进行定量(Sparado等人.Anal Biochem 96：317，1979)。结果表明，55％的氨基已与MPEG偶合。为了将潜在干扰下一反应(加入疏水基团)的聚赖氨酸的羧基端进行封端，加入600μl乙二胺和100mg EDC混合，并在室温下孵育1小时。所得溶液(200ml)通过截止值为100kDa的过滤薄(Amersham Biosciences Corp，Westborough，MA)过滤洗涤，期间换水5次。将所得PLPEG复合物冻干，称重，得到860mg的产量。基于被MPEG衍生化的氨基数目估计所得产物的分子量为560kDa。每mg终产物中的游离氨基的量为0.795μmol/mg(图9)。应当注意的是，如果所使用的MPEG-琥珀酰亚胺基-琥珀酸酯掺杂有游离琥珀酰亚胺基-琥珀酸酯(这非常常见)，PEG的量将少于根据氨基分析预期的值，并且将与每mg终产物中的氨基量不相符。 
实施例4 
MPEG-聚-L-赖氨酸(5000；40,000；22％)(PLPEG-III)的合成。 
试剂MPEG-琥珀酰亚胺基-琥珀酸酯和聚赖氨酸可从市场上购得，并且它们的合成在本领域中众所周知。将聚-L-赖氨酸(200mg；氢溴酸聚赖氨酸；Sigma chemical Co.；DPvis：264；MWvis：55,200；DPmalls：190；MWmalls：39,800；TNBS测定含0.7mmol氨基，Sparado等人.Anal Biochem 96：317，1979)溶解在10ml 0.1M碳酸盐缓冲液pH8.35中，加入600mg MPEG-琥珀酰亚胺基-琥珀酸酯，涡旋，并在室温下孵育过夜。第二天，取等份，使用三硝基苯磺酸将剩余氨基的量进行定量(Sparado等人.Anal Biochem 96：317，1979)。结果表明，22％的氨基已与MPEG偶合。为了将潜在干扰下一反应(加入疏水基团)的聚赖氨酸的羧基端进行封端，加入600μl乙二胺和100mg EDC混合，并在室温下孵育1小时。所得溶液(200ml)通过截止值为100kDa的过滤薄(Amersham Biosciences Corp，Westborough，MA)过滤洗涤，期间换水5次。将所得PLPEG复合物冻干，称重，得到320mg的产量。基于被MPEG衍生化的氨基数目估计所得产物的分子量为250kDa。每mg终产物中的游离氨基的量为1.14μmol/mg(图9)。应当注意的是，如果所使用的MPEG-琥珀酰亚胺基-琥珀酸酯掺杂有游离琥珀酰亚胺基-琥珀酸酯，PEG的量将少于根据氨基分析预期的值，并且将与每mg终产物中的氨基量不相符。 
实施例5 
MPEG-聚-L-赖氨酸(5000；40,000；9％)(PLPEG-IV)的合成。 
试剂MPEG-琥珀酰亚胺基-琥珀酸酯和聚赖氨酸可从市场上购得，并且它们的合成在本领域中众所周知。将聚-L-赖氨酸(200mg；氢溴酸聚赖氨酸；Sigma chemical Co.；DPvis：264；MWvis：55,200；DPmalls：190；MWmalls：39,800；TNBS测定含0.7mmol氨基，Sparado等人.Anal Biochem 96：317，1979)溶解在10ml 0.1M碳酸盐缓冲液pH8.35中，加入300mg MPEG-琥珀酰亚胺基-琥珀酸酯，涡旋，并在室温下孵育过夜。第二天，取等份，使用三硝基苯磺酸(TNBS)将剩 余氨基的量进行定量(Sparado等人.Anal Biochem 96：317，1979)。结果表明，9％的氨基已与MPEG偶合。为了将潜在干扰下一反应(加入疏水基团)的聚赖氨酸的羧基端进行封端，加入600μl乙二胺和100mgEDC混合，并在室温下孵育1小时。所得溶液(200ml)通过截止值为100kDa的过滤薄(Amersham Biosciences Corp，Westborough，MA)过滤洗涤，期间换水5次。将所得PLPEG复合物冻干，称重，得到300mg的产量。基于被MPEG衍生化的氨基数目估计所得产物的分子量为125kDa。每mg终产物中的游离氨基的量为1.5μmol/mg(图9)。应当注意的是，如果所使用的MPEG-琥珀酰亚胺基-琥珀酸酯掺杂有游离琥珀酰亚胺基-琥珀酸酯，PEG的量将少于根据氨基分析预期的值，并且将与每mg终产物中的氨基量不相符。 
实施例6 
MPEG-聚-L-赖氨酸-C12(PLPEG-III-C12)的合成。 
PLPEG-III-C12是含有连接到剩余赖氨酸的ε氨基上的CH3(CH2)10CO-疏水基团的疏水核载体。将20mg实施例4得到的PLPEG-III溶解至2ml 0.1M碳酸盐缓冲液pH 8.35中。用2ml 30％乙腈：水溶解50mg月桂酸钠盐(Acros Organics，NJ.)，并向该溶液中加入25mg NHSS(N-羟基琥珀酰亚胺硫酸盐；Pierce，Rockfor，IL)，之后再加入100mg EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亚胺盐酸盐；Pierce，Rockfor，IL)。再将该溶液滴加至2ml PLPEG-III溶液中，于室温下孵育。第二天，取等份，使用三硝基苯磺酸(NBS)将剩余氨基的量进行定量(Sparado等人.Anal Biochem 96：317，1979)。结果表明，已没有游离氨基。将溶液通过2ml经50％乙腈/水平衡的阴离子交换树脂(Mono-Q，Bio-Rad，Hercules，CA)除去剩余的可溶性脂肪酸和NHSS。然后将洗脱液在20ml经50％乙腈/水平衡的Superdex 200(AmershamBio sciences Corp，Westborough，MA)上脱盐，将含有PLPEG-III-C12的空体积冻干，称重，得到12mg的产量。 
实施例7 
MPEG-聚-L-赖氨酸-C18(PLPEG-III-C18)的合成。 
PLPEG-III-C18是含有连接到剩余赖氨酸的ε氨基上的CH3(CH2)16CO-疏水基团的疏水核载体。将20mg实施例4得到的PLPEG-III加至2ml 0.1M碳酸盐缓冲液pH 8.35中。用2ml乙腈溶解50mg月桂酸钠盐(Fisher，Houston，TX)，并向该溶液中加入25mgNHSS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺；Pierce，Rockfor，IL)，之后再加入100mg EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亚胺盐酸盐；Pierce，Rockfor，IL)。再将该溶液滴加至2ml PLPEG-III溶液中，于室温下孵育。第二天，取等份，使用三硝基苯磺酸(TNBS)将剩余氨基的量进行定量(Sparado等人.Anal Biochem 96：317，1979)。结果表明，已没有游离氨基。将溶液通过2ml经50％乙腈/水平衡的阴离子交换树脂(Mono-Q，Bio-Rad，Hercules，CA)除去剩余的可溶性脂肪酸和NHSS。然后将洗脱液在20ml经50％乙腈/水平衡的Superdex 200(AmershamBiosciences Corp，Westborough，MA)上脱盐，将含有PLPEG-III-C18的空体积冻干，称重，得到18mg的产量。 
实施例8 
MPEG-聚-L-赖氨酸-C8(PLPEG-III-C8)的合成。 
PLPEG-III-C8是含有连接到剩余赖氨酸的ε氨基上的CH3(CH2)6CO-疏水基团的疏水核载体。将20mg实施例4得到的PLPEG-III加至2ml 0.1M碳酸盐缓冲液pH 8.35中。用2ml 30％乙腈：水溶解50mg月桂酸钠盐(Sigma chemical Co.St Louis，MO)，并向该溶液中加入25mg NHSS (N-羟基琥珀酰亚胺硫酸盐；Pierce，Rockfor，IL)，之后再加入100mg EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亚胺盐酸盐；Pierce，Rockfor，IL)。再将该溶液滴加至2ml PLPEG-III溶液中，于室温下孵育。第二天，取等份，使用三硝基苯磺酸(NBS)将剩余氨基的量进行定量(Sparado等人.Anal Biochem 96：317，1979)。结果表明，已没有游离氨基。将溶液通过2ml经50％乙腈/水平衡的阴离子交 换树脂(Mono-Q，Bio-Rad，Hercules，CA)除去剩余的可溶性脂肪酸和NHSS。然后将洗脱液在20ml经50％乙腈/水平衡的Superdex 200(Amersham Biosciences Corp，Westborough，MA)上脱盐，将含有PLPEG-III-C8的空体积冻干，称重，得到8mg的产量。 
实施例9 
MPEG-聚-L-赖氨酸-C12(PLPEG-II-C12)的合成。 
PLPEG-II-C12是含有连接到剩余赖氨酸的ε氨基上的CH3(CH2)10CO-疏水基团的疏水核载体。将40mg实施例3得到的PLPEG-II加至4ml 0.1M碳酸盐缓冲液pH 8.35中。在2ml 30％乙腈：水中溶解50mg月桂酸钠盐(Acros Organics，NJ.)，并向该溶液中加入25mg NHSS(N-羟基琥珀酰亚胺硫酸盐；Pierce，Rockfor，IL)，之后再加入100mg EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亚胺盐酸盐；Pierce，Rockfor，IL)。再将该溶液滴加至4ml PLPEG-III溶液中，于室温下孵育。第二天，取等份，使用三硝基苯磺酸(NBS)将剩余氨基的量进行定量(Sparado等人.Anal Biochem 96：317，1979)。结果表明，已没有游离氨基。将溶液通过2ml经50％乙腈：水平衡的阴离子交换树脂(Mono-Q，Bio-Rad，Hercules，CA)除去剩余的可溶性脂肪酸和NHSS。然后将洗脱液在20ml经50％乙腈/水平衡的Superdex 200(AmershamBiosciences Corp，Westborough，MA)上脱盐，将含有PLPEG-II-C12的空体积冻干，称重，得到25mg的产量。 
实施例10 
GLP-1与PLPEG-II-C12的结合 
一式三份准备6个聚丙烯微量离心管。将实施例9获得的PLPEG-II-C12贮存液(5mg/ml)的等份(90μl)置于聚丙烯微量离心管1和2中。将PLPEG-II贮存液(5mg/ml)的等份置于聚丙烯微量离心管3和4中。管3和4含有无C12脂肪酸衍生化的PLPEG-II。然而应当指出，它们在与C4等同的保护基底部含有琥珀酸酯衍生物。向管2、4和6中 加入60μl等份GLP-1(3mg/ml；7-36酰胺化的人GLP-1，Polypeptide Lab.GmbH，德国)。再向所有管中加入50μl等份1.5M NaCl/0.5M PO4缓冲液，pH 7.35。加水使所有管的内容物升至0.5ml，得到50mM磷酸盐/150mM NaCl/pH 7.35的最终缓冲液和NaCl浓度。混合并冻干该溶液。次日，用水将所有溶液补充至0.5ml，离心通过100kDa截止膜(来自Millipore，Bedford，MA)。通过滤膜的GLP-1是游离GLP-1在溶液中的溶度。不含PLPEG-II-C12或PLPEG-II的对照管(管6)是可用于结合的GLP-1的总量。管6的对照是管5，管5只含缓冲液。结合的负载分子的量可以通过从接受相同浓度的负载分子但是不含疏水核载体的相应对照中减去游离负载分子的量来计算。通过滤膜的负载分子的定量用HPLC进行(见图10)。结果表明不含C12脂肪酸修饰的PLPEG-II能够结合相当于其重量20％的GLP-1。然而，含有C12脂肪酸修饰的PLPEG-II显示所有可利用的GLP-1都结合。这表明PLPEG-E-C12可以结合相当于其重量至少32％的GLP-1。游离GLP-1的量无法利用常规HPLC-UV检测法检测到，表明游离GLP-1的量低于10nM。该条件下游离GLP-1的准确含量可以利用用于GLP-1的Elisa试剂盒(Linco，St.Charles，MO)来确定。 
实施例11 
20PLPEG5-55的合成和质量保证 
为了确定每mg PLPEG(聚赖氨酸-聚乙二醇共聚物)的氨基量和聚赖氨酸的氨基百分饱和度之间的理论和实际关系，研究了一个方程式来基于每mg终PLPEG产物表达的通过TNBS反应测定的氨基预测聚赖氨酸的饱和度。这只在反应中使用的PEG相对于任何含羧基化合物的纯度为95-100％时才是有用的。该方程式作为PLPEG组合物的次要确认非常有用。理论预测值用以下方程式计算：X＝[100×(C-Y)]/5YC+C]；其中X是百分饱和度；Y是通过TNBS测定的每克PLPEG的mmol NH2；C是通过TNBS测定的每克PL(聚赖氨酸)的NH2的mmol数。方程式中5YC中的5表示使用的PEG的大小，在此情 况下为5kDa，因此为5YC。如果使用10kDa PEG，则为10YC。这是有用的，因为一旦生成PLPEG产物，就可以通过对终产物的单一TNBS试验测定聚赖氨酸的氨基的百分饱和度，来确定Y，由Y可以计算X。如下所述，通过用高纯度MPEG-琥珀酸酯合成PLPEG，对实验数据检验该方程式。将1克20PL(此时1克具有1.7mmol NH2)溶解在100ml200mM HEPES中。通过添加250mg NHSS，然后将500mg EDC溶解在水中，在一个单独的容器上活化在25ml 10mM MES pH＝4.7中的5gMPEG琥珀酸酯。活化进行18-20分钟。将活化的MPEG琥珀酸酯添加到20PL溶液中，并反应4小时。4小时后，如上所述活化并添加另外5g MPEG琥珀酸酯，在搅拌下孵育过夜。次日，测定氨基，发现为0.77mmol，表明氨基的饱和度为55％。在通过100kDa分子截止滤过滤器超滤洗涤之前(图32A)和之后(图32C)，通过大小排阻层析分析一小部分样品，并测定共聚物的直径(图33)。将洗涤的样品冻干(8克；命名为20PLPEG5-55)，每mg干燥终产物的氨基量通过TNBS试验测定(Sparado等人.Anal Biochem 96：317，1979)。使用上述方程式，证实PEG百分饱和度为55％(图31)。又进行了几次合成，将理论值与实验值进行比较(图31)。 
实施例12 
C18-20PLPEG5-55(PGC-HC18)的合成 
将8g 20PLPEG5-55(1.6mmol NH2)溶解在含有TEA(200μl；Mw＝101；2mmol)的143ml DCM中。通过添加DCC(Mw＝206；0.47ml＝0.618g＝3.0mmol)并且孵育2小时，用5.7ml DMF中的230mg NHS(Mw＝115；2mmol)活化并稳定化硬脂酸或C18(570mg；Mw＝285；2mmol)(溶液变为不溶性的，因为生成了不溶性的NHS活化的FA和尿素)。将活化的C18添加到20PLPEG5-55溶液中使之反应。2小时后重复该过程并且使之在搅拌下孵育一个周末。总体积为160ml(PLPEG为50mg/ml)，将40μl反应混合物稀释到1ml水中，并测定150μl等份的氨基(2mg/ml；0.002μmol-NH2/mg)。用1号Whatman滤纸过滤掉不 溶性的尿素。通过旋转蒸发浓缩滤液，并通过100kDa分子截止过滤器经超滤，用4L 70％乙醇洗涤过夜，然后用1L水洗涤。样品通过0.2μm过滤器过滤除菌，并且冻干(6.7g)。 
实施例13 
C24-20PLPEG5-55的合成 
将3g 20PLPEG5-55(0.6mmol NH2)溶解在60ml DCM中，加入100μl TEA。通过添加DCC(Mw＝206；0.47ml＝0.618g＝3.0mmol)并且孵育2小时，用2.7ml DMF中的NHS(86mg；Mw＝115；0.75mmol)活化并稳定化二十四烷酸或C24(Mw＝368.6；276mg；0.75mmol)(不溶性的尿素沉淀出来，因为生成了NHS活化的FA和尿素)。将活化的C24添加到20PLPEG5-55溶液中使之反应。2小时后重复该过程并且使之在搅拌下孵育过夜。结束时总体积为70ml。将23μl反应混合物稀释到1ml水中，并测定150μl等份的氨基(1mg/ml)，发现含有8μM，这只是略高于6μM的水空白。用1号Whatman滤纸过滤掉不溶性的尿素。通过旋转蒸发浓缩滤液，并通过100kDa分子截止过滤器经超滤，用4L 70％乙醇洗涤过夜，然后用1L水洗涤。样品通过0.2μm过滤器过滤除菌，并且冻干(1.9g)。 
实施例14 
GLP1向C18-PLPEG5-55(PGC-HC18)上的加载 
将GLP1(200μg)溶解在500μl 70％丙酮/水(v/v)中，并转移到干燥瓶中的10mg载体中。含有200μg GLP1的载体在弱真空下蒸发，通过控制施加真空的程度，小心不要冷冻或者剧烈煮沸样品。当溶液干燥时，将瓶密封供以后使用。瓶中的肽样品在4℃时数月内非常稳定。迄今我们还未见GLP1在该条件下降解。该加载过程是基于图34所示的使用PGC-HC24获得的以下结果发展的。一旦干燥就给样品加盖，并保存于冰箱中或4℃下，直到使用。加载的载体通常在PBS中重配用于注射。所有这些都在无菌条件下进行。或者，终产物可以在重配 后通过0.5μm过滤器过滤。然后可以将过滤的产物冻干。可以使用丙酮以外的溶剂，如乙腈、甲醇或乙醇。这些溶剂的目的是部分溶解脂肪酸，并且使肽更加紧密。在干燥过程中，由于挥发性溶剂消失，肽将更接近脂肪酸，并且将与它结合。注意到所有这些溶剂的沸点都低于水。(丙酮沸点＝57℃；乙腈沸点＝80℃；甲醇沸点＝65℃；乙醇沸点＝78℃)。负载比取决于肽和所需的血液浓度，但是通常相对于载体重量为2-20％。对于GLP1肽，只有4-5％在高亲和力部位(nM)处结合，而其余6％在低亲和力部位(μM)处结合。由于我们希望保持低GLP1血液浓度，因此我们只使用高亲和力部位，因此通常加载载体重量的2％。 
实施例15 
PGC-HC18和GLP1之间解离常数(Kd)的确定 
PGC-HC18是一种由20kDa聚赖氨酸组成的疏水核载体，其中55％的氨基与分子量为5kDa的PEG-琥珀酸酯反应，而其余的氨基则与硬脂酸或C18反应。将多个分别含有5mg载体的试管与0.50、0.40、0.30、0.25、0.20、0.15、0.1mg的GLP1相混合，一式三份。在每个小瓶中与载体相混合的GLP-1的量分别代表载体重量的2、3、4、5、6、8、10％。也准备了不含载体的空白试管并在之后的步骤中进行类似处理。冻干这些样品，向每个小瓶中加入100μl 70％的丙酮，并使样品蒸发至干。将样品在500μl PBS(pH 7.3)中重配，并通过以10000×g离心12分钟使用100MWCO再生纤维素过滤器(Millipore，Bedford，MA)滤除结合的GLP1。含有游离GLP-1的滤液通过反相HPLC定量。过滤器中剩余的物质用100μl 70％乙腈通过上述离心洗涤三次，每个样品释放的GLP1(结合的部分)通过反相HPLC定量。计算结合的/游离的值，并对结合的值作图(图35)。结合的GLP-1相对于游离GLP-1的相对含量显示在图37中。线性区的回归线的斜率代表-1/Kd，由它计算Kd(图35)。发现每个载体有三个不同的Kd。为249nM的Kd是较高亲和力的部位，估计具有该亲和力的部位数为4-5个/载体。第二个Kd为3.7μM，是中亲和力，代表2个部位/载体。第三个Kd为33μM，是最低亲和力，代表 另外2个部位/载体。后两个亲和力不是与GLP-1递送非常相关的部位，因为它们具有较接近DPP4酶(GLP-1降解酶)对于GLP-1的Km(300μM)的亲和力。 
实施例16 
PGC-HC24和GLP1之间解离常数(Kd)的确定 
PGC-HC24是一种由20kDa聚赖氨酸组成的疏水核载体，其中55％的氨基与分子量为5kDa的PEG-琥珀酸酯反应，而其余的氨基则与二十四酸或C24反应。将多个分别含有5mg载体的试管与0.50、0.40、0.30、0.25、0.20、0.15、0.1mg的GLP1相混合，一式三份。与载体相混合的GLP-1的量分别代表载体重量的2、3、4、5、6、8、10％。也准备了不含载体的空白试管并在之后的步骤中进行类似处理。冻干这些样品，向每个管中加入100μl 70％的丙酮，并使样品蒸发至干。将样品在500μl PBS(pH 7.3)中重配，并通过以10000×g离心12分钟使用100MWCO再生纤维素过滤器(Millipore，Bedford，MA)滤除结合的GLP1。含有游离GLP-1的滤液通过反相HPLC定量。过滤器中剩余的物质用100μl 70％乙腈通过上述离心洗涤三次，每个样品释放的GLP1(结合的部分)通过反相HPLC定量。计算结合的/游离的值，并对结合的值作图(图36)。线性区的回归线的斜率代表-1/Kd，由它计算Kd。发现每个载体有三个不同的Kd。为77nM的Kd是较高亲和力的部位，估计这些部位的数目为3-4个。第二个Kd为2μM，是中亲和力，代表2个部位。后一个亲和力不是非常相关的部位，因为它较接近DPP4酶(GLP-1降解酶)对于GLP-1的Km(300μM)。 
实施例17 
GLP1-疏水核载体(PGC-HC18)复合物的溶液稳定性测试。 
PGC-HC18是一种由20kDa聚赖氨酸组成的疏水核载体，其中55％的氨基与分子量为5kDa的PEG-琥珀酸酯反应，而其余的氨基则与硬脂酸或C18反应。凝胶渗透色谱法基于分子大小洗脱分子。PGC-HC18 分子大小为大约300kDa，而GLP1大小为3kDa。当PGC-HC18在凝胶渗透柱(BioSep 2000柱；0.78×30cm；Phenomenex)中单独洗脱时，它达到接近空隙容积(Vo)，而单独的GLP1在较晚时达到更接近柱的总体积或Vt。当PGC-HC18和GLP-1之间的非共价复合物通过凝胶渗透柱洗脱时，复合物将在该柱的每个理论板处经历平衡，相互作用的强度将反映为在用PBS(pH 7.4)进行千次平衡后多少GLP-1仍与PGC-HC18结合。这用作除Kd以外的复合物稳定性的二次确认。GLP-1-疏水核载体(C18-20PLPEG555)复合物的溶液稳定性通过监测复合物通过大小排阻柱(0.78×30cm)后与载体结合的GLP-1量来检测。使用图34所示的丙酮法，将每样总共2mg GLP-1加载到不同量的C18-载体上。含有复合的(结合的)或游离的GLP-1的溶液通过大小排阻色谱法洗脱(n＝5)，并且在220nm处监测。游离的GLP-1达到总体积(Vt)，而载体达到空隙容积(Vo)。单独的载体用作定量与载体结合的GLP-1面积的空白，其达到BioSep 2000柱(0.78×30cm；Phenomenex)的Vo。该复合物是稳定的，并且249nM的Kd与该稳定性试验的结果相符(图38)。 
实施例18 
PGC-HC18阻止GLP-1被DPP4快速降解。 
PGC-HC18是一种20kDa的聚赖氨酸，其中55％的氨基与分子量为5kDa的PEG-琥珀酸酯反应，而其余的氨基则与硬脂酸或C18反应。为了确定PGC-HC18是否阻止GLP-1被DPP-4快速降解，溶于磷酸盐缓冲液(PBS；pH 7.4)中的GLP-1(1mg/ml)在存在或不存在PGC-HC18(10mg/ml)或不含C18脂肪酸或PGC的对照载体的条件下用DPP4(1.25mU/ml；Sigma Chem.Co.St Luois Mo)消化。PGC是一种20kDa的聚赖氨酸，其中55％的氨基与5kDa分子量的PEG琥珀酸酯反应，而其余的氨基不反应。孵育24小时后，加入DPP4抑制剂终止消化，然后对每种溶液10μl等份进行HPLC分析(图39)。HPLC(Waters Co.Milford，MA)分析采用来自Phenomenex的Mercury SynergyMax-RP(0.4×2cm)， 以1.5ml/min的流速洗脱，梯度为25％乙腈/水/0.1％TFA至50％乙腈/水/0.1％TFA，时间为5分钟，洗脱液在220nm监测。在PBS中用DPP4体外消化GLP1的消化液的色谱图显示完整GLP1为早期洗脱峰(指向右侧的箭头，图39)。GLP1的降解产物(除去组氨酸残基，较低电荷，在pH 2的层析条件下)在稍后的时间洗脱(指向左侧的箭头)。其它峰是DPP4峰(和蛋白质酶抑制剂，3-4分钟的峰)。在PGC-HC18载体的存在下，DPP4对GLP1的降解明显延迟，而单独的GLP1和具有PGC(不含脂肪酸的载体)的GLP1都降解到相似的程度。该分析进行多次，结果非常明确。 
实施例19 
GLP-1-PGC-HC18复合物具有足够的游离GLP-1与细胞受体结合并刺激Ca流入。 
通过与胰岛细胞上GLP-1受体的相互作用，GLP-1导致信号反应级联，包括细胞内Ca2+浓度增加，导致含胰岛素颗粒的胞吐作用以严格依赖于葡萄糖的方式增强(葡萄糖浓度＞4.5mM时)。由于GLP-1对载体的亲和力(Kd 249nM)低于GLP-1对其受体的亲和力(Kd 1nM)，我们预测，在受体存在的情形下，反应平衡将会向有利于释放游离GLP-1的方向移动。我们通过评价其刺激钙离子流入的能力测试了配制的GLP-1活化培养的胰岛细胞上GLP-1受体的能力。将大鼠的胰岛瘤细胞(INS-1细胞)接种在96孔板上，密度为每孔200,000个细胞，使之在37℃/5％CO2/100％相对湿度下在200μl含有RPMI、10％胎牛血清(FBS)、11.1mM葡萄糖、10mM HEPES(pH 7.4)、1mM丙酮酸钠和50μM 2-巯基乙醇的培养基中附着过夜。次日，将培养基替换为20μl含有2％FBS、11.1mM葡萄糖和0.5μg/ml Fura 2(MolecularProbes，Eugine，OR)的磷酸盐缓冲液(PBS)。30分钟后，使用Chemeleon(BioScan，Washington D.C)监测含有2％FBS和11.1mM葡萄糖的180μl PBS以及孔的背景荧光(激发340nm；发射510nm)。10秒钟后，将20μl含有及不含300nM GLP1的PBS、含有150nM PGC-HC18的300 nM GLP1或150nM PGC-HC18分别注入孔中(n＝5)，监测各孔的荧光60秒(激发340nm；发射510nm)。如图40所示，PGC-HC18配制的GLP-1在INS-1胰岛细胞中刺激钙流入，证实了其释放足够GLP-1以结合并活化GLP-1受体的能力。 
实施例20 
GLP-1-PGC-HC18复合物具有足够的游离GLP-1用以结合细胞受体并增强由葡萄糖刺激的胰岛素分泌。 
为了进一步确认配制的GLP-1的活性，测试了GLP-1以及配制的GLP-1对由于GLP-1受体活化而发生的葡萄糖刺激的胰岛素释放增强的效果。将大鼠的胰岛瘤细胞(INS-1细胞)接种在96孔板上，密度为每孔50,000个细胞，使之在37℃/5％CO2/100％相对湿度下在100μl含有RPMI、10％胎牛血清(FBS)、11.1mM葡萄糖、10mM HEPES(pH7.4)、1mM丙酮酸钠和50μM 2-巯基乙醇的培养基中附着过夜。次日，加入另外100μl不含葡萄糖的培养基，使总葡萄糖浓度为5.5mM。将细胞进一步孵育过夜。通过将培养基替换为20μl含有葡萄糖(11.1mM)和不同含量GLP1(0、0.33、1、3nM)、PGC-HC18(0、0.17、0.33、1nM)以及在PGC-HC18(0、0.17、0.33、1nM)中的GLP-1(0、0.33、1、3nM)的无血清培养基，诱导葡萄糖刺激的胰岛素释放。使用的PGC-HC18与使用的GLP-1为0.5摩尔当量。30分钟后，收集上清液，用来自Linco的ELISA试剂盒(Linco Research，St Charles，MO.)测定细胞释放的胰岛素量。结果表明GLP-1制剂类似于游离GLP-1，增强了INS细胞中的胰岛素分泌，证实了该制剂的活性(图41)。类似于游离GLP-1，GLP-1制剂也增强了胰岛素的合成，如对GLP-1和GLP-1制剂刺激的INS-1细胞的提取物所进行的检测所见。 
实施例21 
PGC-HC延长GLP-1的生物半衰期。 
对于该体内方案，使用重约25g的雌性Balb/c小鼠(退出的种鼠， Charles River)。在使用前使动物禁食(16小时)，以避免将干扰GLP-1分析的脂血症。在采血时在异氟烷麻醉下断头处死每组七只小鼠。在没有给药的t＝-1时间点时，杀死七只小鼠来确定各组的基线。在t＝0时给小鼠注射50pmol未配制的GLP-1或在100μl盐水中的25pmolPGC-HC18制剂中的50pmol GLP-1。注射液通过侧尾静脉注射浓注给药。也通过在靠近尾根处背侧皮下给药进行相同实验。这对于确定使用两种不同给药途径的GLP-1制剂的药代动力学的改变是至关重要的。这使我们能够证实皮肤组织给药进一步延长了配制的GLP-1在血液中的半衰期。每组七只小鼠在给药后的不同时间点断头处死，将血样收集在含有按照使用说明使用的DPP4抑制剂(Linco Research，StCharles，MO)的微量离心管中。用Linco的GLP-1 ELISA试剂盒(LincoResearch，St Charles，MO.)测定血清中的总GLP-1。为了测定血液中游离GLP-1的量与载体结合的GLP-1进行比较，将稀释的血清通过100kDa分子量截止值的再生纤维素过滤器(Millipore，Bedford，MA)过滤，并用上述Linco测定确定滤液中的游离GLP-1。图42和43显示PGC-HC18延长了GLP-1的体内半衰期，并且皮下给药进一步延长了GLP-1的半衰期。另外，如图43所示，皮下给药允许从皮肤释放PGC-HC载体，此处的游离GLP1远低于血清中的总GLP-1(注意y-轴为对照标度)。在大鼠中进行类似的实验。简要地说，对于该体内方案，使用预先植入颈静脉插管的重350-370g的雄性Sprague Dawley(HSD)大鼠。使用前使动物禁食(16小时)，以避免将干扰GLP-1分析的脂血症。在GLP-1(50nmol)或PGC：GLP-1制剂给药前，在t＝-1min时采集血样(250μl)。在t＝0min时，1ml含有GLP-1(50nmol)的磷酸盐缓冲液或在PGC-HC18(25nmol)中的GLP-1(50nmol)通过侧尾静脉注射浓注给药。在不同时间点从插管的颈静脉中采集血样。在96小时结束时，通过腹膜内注射过量的戊巴比妥(200mg/kg)处死动物。该实验的结果证实用PGC-HC18配制的GLP-1比未配制的GLP-1具有更长的半衰期(图44)。 
实施例22 
在PGC-HC18中配制的GLP-1治疗糖尿病的应用。 
简要来说，对于该体内方案，将12周龄的雄性Sprague-Dawley(HSD)大鼠(Harlan，Indianapolis，IN)饲养于23±1℃、12：12-h光：暗循环中，并且使其随意获取食物和水(饮食LM-485，Teklad，Madison，WI)。所有大鼠都在实验开始前称重，发现全都在240-260克范围内。通过侧尾静脉注射在200μl 50mM柠檬酸钠缓冲液pH 4.5中的链脲霉素(STZ；100mg/kg)在20只大鼠中诱导糖尿病。从第2天开始每天通过剪断尾尖采血(5μl)监测非空腹血糖水平，使用血糖仪(Ascensia Elite，Bayer Co.Mishawaka，IN)和试纸条(Bayer Co.Mishawaka，IN)测定血糖水平。10天后，基于340-380mg/dl的平均非空腹血液葡萄糖水平，选择95％的β细胞群被破坏的动物(19只)进行研究。这些动物分为四组：STZ治疗组(n＝4)，STZ治疗后不含GLP-1的单独PGC-HC18治疗组(n＝5)，STZ治疗后GLP-1治疗组(n＝5)，以及STZ治疗后PGC-HC18制剂中的GLP-1治疗组(n＝5)。糖尿病诱导后的后续治疗每2天皮下进行一次(星期一、星期三、星期五)，共4周。该治疗剂量包括磷酸盐缓冲液、GLP-1(20μg)、PGC-HC18(1mg)中的GLP-1(20μg)、PGC-HC18(1mg)。GLP-1、PGC-HC18、和PGC-HC18制剂中的GLP-1在1ml磷酸盐水中重配，并且每2天通过皮下注射到背侧肩部皮肤内给药一次(星期一、星期三、星期五)，共4周，然后采集尾血进行葡萄糖测定。在最后一次注射或治疗和采血结束时，对大鼠称重，以确定糖尿病的严重程度(相对于实验开始时的总重量减轻)，因为它们在开始时全都具有大致相同的重量。然后使大鼠禁食16小时，于次日进行腹膜内葡萄糖耐量试验。对于葡萄糖耐量试验而言，禁食是必需的。将大鼠麻醉，然后腹膜内注射2ml葡萄糖(1.0mg/g体重)和5′-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)(50mg/kg体重)作为胰岛细胞新生标记物。在葡萄糖/BrdU注射后-2、0、2、5、10、20、30和60分钟从尾静脉采集血液(250μl)进行胰岛素和葡萄糖测定。在60分钟结束时，在异氟烷麻醉下通过切断下腔静脉放血处死动物，之后收集胰脏进行免疫组化分 析。取胰脏进行BrdU掺入、凋亡、胰岛素的免疫组化分析和β细胞群测定。用PGC-HC 18配制的GLP-1治疗的大鼠比对照组具有较低的平均累积葡萄糖水平，表示在PGCHC18中配制的GLP-1对减轻这些大鼠中糖尿病的严重程度具有积极影响(图45)。另外，与对照组相比，用PGC-HC18配制的GLP-1治疗防止了与糖尿病有关的严重体重减轻(图46)。对这些动物的胰脏进行BrDU染色，以确定胰岛中分裂细胞的数目(图47)。 
实施例23 
一种非肽有机化合物与PGC-HC18结合。 
多柔比星是一种用于治疗多种人类癌症的非肽有机化合物。为了证实PGC-HC能力的广泛性，向PGC-HC18中加载多柔比星，并测定解离常数(Kd)。多柔比星的最初HPLC分析显示它在比GLP-1低的多的有机溶剂浓度时被洗脱，因而预期对于PGC-HC18结合而言，它具有比GLP-1更高的Kd。对于该实验，使用0.006、0.012、0.018、0.024、0.030、0.036mg的多柔比星(Mw＝580)与2mg C-18载体结合。将15mg载体溶解于1.5ml水中，每个管中加入每200μl等份，并干燥。将1.5mg多柔比星溶解于0.75ml水中(2mg/ml)。向每份干燥载体和无载体的空白试管中分别加入0、3(0.006mg或0.3％)、6(0.012mg或0.6％)、9(0.018mg或0.9％)、12(0.024mg或1.2％)、15μl(0.030mg或1.5％)和18μl(0.036mg或1.8％)的多柔比星。该试管用50％叔丁醇补至72μl，然后蒸发干燥。将干燥样品溶解于250μl PBS(pH7.3)中，并在平衡2小时后，每个样品通过以10000×g离心12分钟使用100MWCO再生纤维素过滤器(Millipore，Bedford，MA)过滤。滤液中的多柔比星(游离的或未结合的多柔比星)使用HPLC(Waters2975，具有二极管阵列检测器，Milford，MA)定量。HPLC分析使用来自Phenomenex的MercurySynergyMax-RP(0.4×2cm)，以1.5ml/min的流速洗脱，梯度为25-50％含0.1％TFA的乙腈水溶液，时间为5分钟，洗脱液在220nm监测。从多柔比星总量中减去游离多柔比星的量，获得结合多柔比星的量(图 48)。用于过滤的再生纤维素过滤器不会结合显著量的多柔比星而干扰分析。计算结合/游离值，并对结合值作图(图49)。线性区的回归线的斜率表示-1/Kd，由它计算Kd。发现多柔比星以315μM的Kd与PGC-HC18相互作用。 
尽管为了理解清楚起见，已经通过举例说明和实施例详细描述了本发明，但是本领域技术人员应当容易地确定，可以在不背离所附权利要求书的精神和范围的情况下进行某些变化和修改。 
参考引用
此处引用的所有专利和出版物都引入本文作为参考。 
等同方案
本领域技术人员应当认识到或者仅使用常规实验就能够确定此处所述的本发明具体实施方案的许多等同方案。这些等同方案也包括在所附的权利要求书中。 

Claims (95)

1.一种组合物，其包含：(i)具有多于一个可衍生的或可修饰的用于连接疏水基团和/或保护侧链的官能团的载体，其中所述载体是聚氨基酸；(ii)多于一个第一疏水基团，其中第一疏水基团与载体共价连接，能够通过疏水相互作用结合负载分子，并且独立于载体重量具有小于1,000道尔顿的分子量，并且该第一疏水基团独立地选自由直链烷基、支链烷基、苯基、萘基、胆固醇、维生素D和维生素E组成的组；和(iii)多于一个第一保护侧链，其中每个第一保护侧链与载体共价连接，并且独立于载体重量具有400至20,000道尔顿的分子量，并且该第一保护侧链选自由聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、和它们的烷氧基衍生物组成的组。
2.权利要求1的组合物，其中所述烷氧基衍生物是甲氧基聚乙二醇、甲氧基聚丙二醇、甲氧基化的聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、或乙氧基化的多糖。
3.权利要求1的组合物，其中所述第一保护侧链是甲氧基聚乙二醇。
4.权利要求1的组合物，其进一步包含与疏水基团可解离连接的负载分子。
5.权利要求4的组合物，其中所述负载分子是治疗剂。
6.权利要求5的组合物，其中所述治疗剂选自胰高血糖素样肽、依泽那太、瘦蛋白片段、肠抑胃肽(GIP)、表皮生长因子(EGF)受体配体、EGF、转化生长因子α(TGF-α)、β细胞生长因子、胃泌素/缩胆囊素受体配体、胃泌素、缩胆囊素、干扰素、白介素-1、白介素-2、白介素-4、白介素-6、白介素-8、白介素-10、白介素-12、肿瘤坏死因子、auristatin、胰岛素、胰岛素样生长因子、生长激素、神经生长因子、脑源性神经营养因子、酶、内皮抑制素、制管张素、血小板反应素、凝血因子VII、凝血因子VIII、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、血小板生成素、降钙素、甲状旁腺素(PTH)及其片段、促红细胞生成素、心房钠尿肽、单克隆抗体、单克隆抗体片段、促生长素抑制素、蛋白酶抑制剂、促肾上腺皮质激素、促性腺激素释放激素、催产素、促黄体生成激素释放激素、促卵泡激素、前列腺素、前列环素、血管升压素、特利加压素、去氨加压素、色甘酸钠或色甘酸二钠、血管活性肠肽(VIP)、万古霉素、抗微生物剂、多柔比星、依托泊苷、芬太尼、氯胺酮和维生素类。
7.权利要求5的组合物，其中所述治疗剂选自抗真菌药和抗病毒药。
8.权利要求5的组合物，其中所述治疗剂选自胰高血糖素样肽-1、胰高血糖素样肽-2、干扰素γ、干扰素β、干扰素α、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、尿激酶、链激酶、非格司亭、溶葡萄球菌素、乳链菌肽、环孢菌素、多粘菌素b和恩夫韦地。
9.权利要求5的组合物，其中所述治疗剂是胰高血糖素样肽、表皮生长因子(EGF)受体配体、EGF、转化生长因子α(TGF-α)、β细胞生长因子、胃泌素/缩胆囊素受体配体、葡糖脑苷脂酶、胃泌素、缩胆囊素、前列腺素、干扰素、因子VIII、特利加压素、肠抑胃肽(GIP)、血管活性肠肽(VIP)或乳链菌肽。
10.权利要求5的组合物，其中所述治疗剂是胰高血糖素样肽1。
11.权利要求5的组合物，其中所述治疗剂是表皮生长因子(EGF)受体配体。
12.权利要求5的组合物，其中所述治疗剂是表皮生长因子(EGF).
13.权利要求5的组合物，其中所述治疗剂是转化生长因子α(TGF-α)。
14.权利要求5的组合物，其中所述治疗剂是β细胞生长因子。
15.权利要求5的组合物，其中所述治疗剂是胃泌素/缩胆囊素受体配体。
16.权利要求5的组合物，其中所述治疗剂是胃泌素。
17.权利要求5的组合物，其中所述治疗剂是缩胆囊素。
18.权利要求1的组合物，其进一步包含与载体共价连接的定向分子，其中，所述定向分子是指帮助负载分子与疏水核组合物结合使得负载分子以特定方式定向而同时与组合物的疏水基团相互作用的任意分子结构。
19.权利要求18的组合物，其中所述定向分子选自肽、硫酸、磺酸、磷酸、膦酸、双膦酸、羧酸、金属结合部分、氨基、赖氨酸和精氨酸。
20.权利要求18的组合物，其进一步包含与疏水基团和/或定向分子可解离连接的负载分子。
21.权利要求1的组合物，其进一步包含与保护侧链共价连接的靶向分子。
22.权利要求21的组合物，其中所述靶向分子选自抗体、抗体片段、凝集素、受体配体、蛋白质、酶、肽、糖类、酶的准底物、细胞表面结合化合物和胞外基质结合化合物。
23.权利要求22的组合物，其中所述抗体为嵌合抗体。
24.权利要求21的组合物，其进一步包含与疏水基团可解离连接的负载分子。
25.权利要求21的组合物，其进一步包含与载体共价连接的定向分子，其中，所述定向分子是指帮助负载分子与疏水核组合物结合使得负载分子以特定方式定向而同时与组合物的疏水基团相互作用的任意分子结构。
26.权利要求25的组合物，其进一步包含与疏水基团和/或定向分子可解离连接的负载分子。
27.权利要求1的组合物，其进一步包含第二保护侧链和多个第二疏水基团，其中该第二疏水基团具有与载体共价连接的第一末端和与第二保护侧链共价连接的第二末端；
其中该第二疏水基团独立于载体和保护侧链的重量具有小于1,000道尔顿的分子量；和
其中与疏水基团共价连接的第二保护侧链独立于疏水基团的重量具有400-20,000道尔顿的分子量。
28.权利要求27的组合物，其进一步包含与疏水基团可解离连接的负载分子。
29.权利要求27的组合物，其进一步包含与载体共价连接的定向分子，其中，所述定向分子是指帮助负载分子与疏水核组合物结合使得负载分子以特定方式定向而同时与组合物的疏水基团相互作用的任意分子结构。
30.权利要求29的组合物，其进一步包含与疏水基团和/或定向分子可解离连接的负载分子。
31.权利要求27的组合物，其进一步包含与保护侧链共价连接的靶向分子。
32.权利要求31的组合物，其进一步包含与疏水基团可解离连接的负载分子。
33.权利要求31的组合物，其进一步包含与载体共价连接的定向分子，其中，所述定向分子是指帮助负载分子与疏水核组合物结合使得负载分子以特定方式定向而同时与组合物的疏水基团相互作用的任意分子结构。
34.权利要求33的组合物，其进一步包含与疏水基团和/或定向分子可解离连接的负载分子。
35.一种组合物，其包含：
(i)具有多于一个可衍生的或可修饰的用于连接疏水基团和/或保护侧
链的官能团的载体，其中该载体是聚氨基酸；和
(ii)多于一个具有共价连接的保护侧链的第一疏水基团，
其中所述第一疏水基团具有与载体共价连接的第一末端和与保护侧链共价连接的第二末端；
其中所述第一疏水基团独立于载体和保护侧链的重量具有150-1000道尔顿的分子量，并且该第一疏水基团独立地选自由直链烷基、支链烷基、苯基、萘基、胆固醇、维生素D和维生素E组成的组；和
其中所述保护侧链独立于载体和疏水基团的重量具有400-20,000道尔顿的分子量，并且该保护侧链选自由聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、和它们的烷氧基衍生物组成的组。
36.权利要求35的组合物，其中所述烷氧基衍生物是甲氧基聚乙二醇、甲氧基聚丙二醇、或甲氧基化的聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。
37.权利要求35的组合物，其中所述保护侧链是甲氧基聚乙二醇。
38.权利要求35的组合物，其进一步包含与疏水基团可解离连接的负载分子。
39.权利要求38的组合物，其中所述负载分子是治疗剂。
40.权利要求39的组合物，其中所述治疗剂选自胰高血糖素样肽、依泽那太、瘦蛋白片段、肠抑胃肽(GIP)、表皮生长因子(EGF)受体配体、EGF、转化生长因子α(TGF-α)、β细胞生长因子、胃泌素/缩胆囊素受体配体、胃泌素、缩胆囊素、干扰素、白介素-1、白介素-2、白介素-4、白介素-6、白介素-8、白介素-10、白介素-12、肿瘤坏死因子、auristatin、胰岛素、胰岛素样生长因子、生长激素、神经生长因子、脑源性神经营养因子、酶、内皮抑制素、制管张素、血小板反应素、凝血因子VII、凝血因子VIII、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、血小板生成素、降钙素、甲状旁腺素(PTH)及其片段、促红细胞生成素、心房钠尿肽、单克隆抗体、单克隆抗体片段、促生长素抑制素、蛋白酶抑制剂、促肾上腺皮质激素、促性腺激素释放激素、催产素、促黄体生成激素释放激素、促卵泡激素、前列腺素、前列环素、血管升压素、特利加压素、去氨加压素、色甘酸钠或色甘酸二钠、血管活性肠肽(VIP)、万古霉素、抗微生物剂、多柔比星、依托泊苷、芬太尼、氯胺酮和维生素类。
41.权利要求39的组合物，其中所述治疗剂选自抗真菌药和抗病毒药。
42.权利要求39的组合物，其中所述治疗剂选自胰高血糖素样肽-1、胰高血糖素样肽-2、干扰素γ、干扰素β、干扰素α、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、尿激酶、链激酶、非格司亭、溶葡萄球菌素、乳链菌肽、环袍菌素、多粘菌素b和恩夫韦地。
43.权利要求39的组合物，其中所述治疗剂是胰高血糖素样肽、表皮生长因子(EGF)受体配体、EGF、转化生长因子α(TGF-α)、β细胞生长因子、胃泌素/缩胆囊素受体配体、葡糖脑苷脂酶、胃泌素、缩胆囊素、前列腺素、干扰素、因子VIII、特利加压素、肠抑胃肽(GIP)、血管活性肠肽(VIP)或乳链菌肽。
44.权利要求39的组合物，其中所述治疗剂是胰高血糖素样肽1。
45.权利要求39的组合物，其中所述治疗剂是表皮生长因子(EGF)受体配体。
46.权利要求39的组合物，其中所述治疗剂是表皮生长因子(EGF)。
47.权利要求39的组合物，其中所述治疗剂是转化生长因子α(TGF-α)。
48.权利要求39的组合物，其中所述治疗剂是β细胞生长因子。
49.权利要求39的组合物，其中所述治疗剂是胃泌素/缩胆囊素受体配体。
50.权利要求39的组合物，其中所述治疗剂是胃泌素.
51.权利要求39的组合物，其中所述治疗剂是缩胆囊素。
52.权利要求35的组合物，其进一步包含与载体共价连接的定向分子，其中，所述定向分子是指帮助负载分子与疏水核组合物结合使得负载分子以特定方式定向而同时与组合物的疏水基团相互作用的任意分子结构。
53.权利要求52的组合物，其中所述定向分子选自肽、硫酸、磺酸、磷酸、膦酸、双膦酸、羧酸、金属结合部分、氨基、赖氨酸和精氨酸。
54.权利要求52的组合物，其进一步包含与疏水基团和/或定向分子可解离连接的负载分子。
55.权利要求35的组合物，其进一步包含与保护侧链共价连接的靶向分子。
56.权利要求55的组合物，其中所述靶向分子选自抗体、抗体片段、酶、肽、酶的准底物、凝集素、受体、和凝集素的糖配体。
57.权利要求56的组合物，其中所述抗体为嵌合抗体。
58.权利要求55的组合物，其进一步包含与疏水基团可解离连接的负载分子。
59.权利要求55的组合物，其进一步包含与载体共价连接的定向分子，其中，所述定向分子是指帮助负载分子与疏水核组合物结合使得负载分子以特定方式定向而同时与组合物的疏水基团相互作用的任意分子结构。
60.权利要求59的组合物，其进一步包含与疏水基团和/或定向分子可解离连接的负载分子。
61.权利要求35的组合物，其进一步包含多个第二疏水基团，其中该第二硫水基团与载体共价连接，并且独立于载体重量具有小于1,000道尔顿的分子量。
62.权利要求61的组合物，其进一步包含与疏水基团可解离连接的负载分子。
63.权利要求61的组合物，其进一步包含与载体共价连接的定向分子，其中，所述定向分子是指帮助负载分子与疏水核组合物结合使得负载分子以特定方式定向而同时与组合物的疏水基团相互作用的任意分子结构。
64.权利要求63的组合物，其进一步包含与疏水基团和/或定向分子可解离连接的负载分子。
65.权利要求61的组合物，其进一步包含与保护侧链共价连接的靶向分子。
66.权利要求65的组合物，其进一步包含与疏水基团可解离连接的负载分子。
67.权利要求65的组合物，其进一步包含与载体共价连接的定向分子，其中，所述定向分子是指帮助负载分子与疏水核组合物结合使得负载分子以特定方式定向而同时与组合物的疏水基团相互作用的任意分子结构。
68.权利要求67的组合物，其进一步包含与疏水基团和/或定向分子可解离连接的负载分子。
69.一种组合物，其包含：(i)聚合载体，选自聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚丝氨酸、聚苏氨酸、聚半胱氨酸、聚甘油、聚乙烯亚胺、天然糖类、胺化多糖、胺化寡糖、聚酰胺胺、聚丙烯酸、多元醇、磺化多糖、磺化寡糖；羧化多糖、羧化寡糖、氨基羧化多糖、氛基羧化寡糖、羧甲基化多糖和羧甲基化寡糖；和(ii)多于一个能够通过疏水相互作用结合负载分子并且与载体共价连接的疏水基团，其中每个疏水基团独立于载体重量具有小于1,000道尔顿的分子量，并且其中每个疏水基团独立地选自直链烷基、支链烷基、苯基、萘基、胆固醇、维生素D和维生素E。
70.权利要求69的组合物，其中所述负载分子是治疗剂。
71.权利要求69的组合物，其进一步包含与载体共价连接的定向分子，其中，所述定向分子是指帮助负载分子与疏水核组合物结合使得负载分子以特定方式定向而同时与组合物的疏水基团相互作用的任意分子结构。
72.权利要求71的组合物，其中所述定向分子选自肽、硫酸、磺酸、磷酸、膦酸、双膦酸、羧酸、金属结合部分、氨基、赖氨酸和精氨酸。
73.权利要求71的组合物，其中所述负载分子与定向分子可解离连接。
74.权利要求73的组合物，其中所述负载分子是治疗剂。
75.权利要求69的组合物，其进一步包含与载体或疏水基团共价连接的靶向分子。
76.权利要求75的组合物。其中所述靶向分子选自抗体、抗体片段、酶、肽、受体、酶的准底物、凝集素、和凝集素的糖配体。
77.权利要求76的组合物，其中所述抗体为嵌合抗体。
78.权利要求75的组合物，其进一步包含与疏水基团可解离连接的负载分子。
79.权利要求78的组合物，其中所述负载分子是治疗剂。
80.权利要求75的组合物，其进一步包含与载体共价连接的定向分子，其中，所述定向分子是指帮助负载分子与疏水核组合物结合使得负载分子以特定方式定向而同时与组合物的疏水基团相互作用的任意分子结构。
81.权利要求80的组合物，其进一步包含与疏水基团和/或定向分子可解离连接的负载分子。
82.权利要求81的组合物，其中所述负载分子是治疗剂。
83.如权利要求1-82任一项所述的组合物，其中所述组合物是水溶性的。
84.选自权利要求10-17和44-51任一项的组合物的第一组合物在制备用于治疗哺乳动物的糖尿病的药物中的用途。
85.权利要求84的用途，所述药物进一步包括选自权利要求15-17和49-51任一项的组合物的第二组合物，其中所述第一组合物选自权利要求10的组合物和权利要求44的组合物。
86.权利要求85的用途，所述药物进一步包括作为第三组合物的质子泵抑制剂。
87.权利要求84的用途，所述药物进一步包括作为第二组合物的质子泵抑制剂。
88.权利要求87的用途，其中所述质子泵抑制剂是奥美拉唑。
89.权利要求87的用途，所述药物进一步包括作为第三组合物DPP4抑制剂。
90.权利要求84的用途，所述药物进一步包括作为第二组合物DPP4抑制剂。
91.权利要求84的用途，所述药物进一步包括选自权利要求15-17和49-51的组合物的第二组合物，其中所述第一组合物是根据权利要求11-14和45-49中任一项所述的组合物。
92.权利要求91的用途，所述药物进一步包括作为第三组合物的质子泵抑制剂。
93.权利要求92的用途，其中所述质子泵抑制剂是奥美拉唑。
94.权利要求93的用途，所述药物进一步包括作为第二组合物的质子泵抑制剂，其中所述第一组合物是根据权利要求11-14和45-49中任一项所述的组合物。
95.权利要求94的用途，其中所述质子泵抑制剂是奥美拉唑。
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