CN101437943A - 牢固结合的碱基-修饰的寡核苷酸和人工核酸酶组合的反义药剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了具有螯合部分和寡核苷酸序列的化合物，其中寡核苷酸包含一个或多个修饰的核碱基，例如羟基核碱基。所公开的化合物适合用于反义疗法。螯合部分可以与镧系金属的离子复合。这些化合物是有效的核酸翻译抑制剂，对靶核酸有的结合亲和性增加。本发明也包含组合物以及使用这些组合物进行反义治疗的方法。

Description

牢固结合的碱基-修饰的寡核苷酸和人工核酸酶组合的反义药剂

与相关申请的交叉引用

本申请要求2006年5月3日提交的美国临时申请No.60/797,448的权益，该临时申请在此以其全文引为参考。

发明领域

本发明属于含有特定修饰的RNA或DNA碱基、并与具有高度选择性人工核酸酶活性的有机镧系元素复合物结合的寡核苷酸类似物的领域。

发明背景

寡核苷酸和修饰的寡核苷酸的应用在现代医疗中是极其重要的，并有充分的文献记载(Uhlmann等，Antisense oligonucleotides：A newtherapeutic principle.(反义寡核苷酸：新的治疗原理)Chemical Reviews1990，90：543-584；Crooke等《反义研究和应用》(Antisense Researchand Applications)，CRC Press(1993)；Mesmaekar等，“Antisenseoligonucleotides，”(反义寡核苷酸)，Acc.Chem.Res.1995，28：366-374；Stein.“The experimental use of antisense oligonucleotides：a guide for theperplexed.”(反义寡核苷酸的实验应用：疑难指导)J.Clin.Invest.2001，108，641-644.)反义多核苷酸与DNA或RNA靶的特异性结合可以使核酸的复制、转录或翻译失活，从而提供控制疾病例如癌症和病毒感染的机制。因此，反义寡核苷酸与靶的结合可用于在各种不同的环境中改变基因的表达，从而，例如，干扰病毒生命周期、或癌性细胞的生长。

除了与互补靶核苷酸序列的特异性结合亲和性之外，反义寡核苷酸还应当满足治疗性目的的要求，包括效能、生物利用度、低毒性和低成本。因为具有天然磷酸二酯骨架的寡核苷酸对核酸酶不稳定，并且不容易穿透细胞膜，因此研究人员尝试了对多核苷酸骨架进行修饰，以改进核酸酶抗性和细胞摄入。因此，希望提供具有增强的核酸酶抗性和细胞摄入、同时又保留了它们与核酸的特异性相互作用和/或它们的催化活性的多核苷酸类似物。

对于开发对核酸酶活性具有较高抗性的反义寡核苷酸的化学修饰，已经进行了努力(Mesmaekar等，“Antisense oligonucleotides.”(反义寡核苷酸)Acc.Chem.Res.1995，28：366-374.；Crooke ST.“Progressin antisense therapeutics.”(反义治疗学中的进展)Med.Res.Rev.1996；16：319-344)。例如，一种方法(Wang等，“Sugar modified nucleosidesand oligonucleotides”(糖修饰的核苷和寡核苷酸)美国专利No.5,681,940；1997年10月28日)提供了各种新的糖修饰的核苷以及相应的糖修饰的寡核苷酸，它们在用于反义、诊断或其它目的时具有优于天然的RNA和DNA寡核苷酸的性质。各种其它的修饰核苷酸已经被提议作为潜在的反义药物(Iyer，“Reagents and process for synthesis ofoligonucleotides containing phosphorodithioate internucleoside linkages”(合成含有核苷间二硫代磷酸酯键的寡核苷酸的试剂和方法)，美国专利No.6,117,992；2000年9月12日；Meyer等，“Oligonucleotidescontaining pyrazolo[3，4-d]pyrimidines for hybridization and mismatchdiscrimination”(含有吡唑[3，4-d]嘧啶的寡核苷酸用于杂交和错配分辨)，美国专利No.6,127,121；2000年10月3日；Froehler等，“Enhancedtriple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotidescontaining modified pyrimidines”(含有修饰嘧啶的寡核苷酸指导的增强三螺旋和双螺旋的形成)，美国专利No.6,235,887；2001年5月22日；Cook等，“Substituted purines and oligonucleotide cross-linking”(取代的嘌呤和寡核苷酸交联)，美国专利No.6,232,463，2001年5月15日；Short，“Modified nucleotides and methods useful for nucleic acidsequencing”(可用于核酸测序的修饰的核苷酸和方法)，美国专利No.6,579,704，2003年6月17日)。

降低寡核苷酸的核酸酶存活力的一种有意思的方法是通过引入两性离子碱基形式进行修饰，这对磷酸二酯键产生了静电保护(Switzer，“Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidinenucleotides”(含有5-氨基烷基嘧啶核苷酸的反义寡核苷酸)，美国专利No.5,596,091，1997年1月21日；Switzer，“Antisense oligonucleotidecontaining compositions and method of forming duplexes”“含有反义寡核苷酸的组合物以及形成双链体的方法)，美国专利No.6,031,086，2000年2月29日)。

通过分子模拟和相应的实验已经证实了某些修饰的嘌呤和嘧啶碱基(例如1-甲基-5-羟基胞嘧啶及其阴离子形式，1-甲基-5-溴尿嘧啶和2-氨基-9-甲基嘌呤)具有两性离子互变异构体，它们与互补的天然核酸碱基牢固地结合(Suen等，“Identification by UV resonance Ramanspectroscopy of an imino tautomer of 5-hydroxy-2′-deoxycytidine，apowerful base analog transition mutagen with a much higher unfavoredtautomer frequency than that of the natural residue 2′-deoxycytidine.”(通过紫外共振拉曼光谱鉴定5-羟基-2′-脱氧胞苷的亚氨基互变异构体，比天然的2′-脱氧胞苷残基具有高得多的不利的互变异构体频率的强有力的碱基类似物转变诱变剂)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96：4500-4505.Karelson等，“Quantum-Chemical Modeling of the TautomericEquilibria of Modified Anionic Nucleic Acid Bases，”(修饰的阴离子核酸碱基的互变异构体平衡的量子化学模拟)，ARKIVOC，2001，3，51-62.)。

对于设计能够催化水解核酸的有机-金属复合物也有极大的兴趣。(Morrow，“Artificial Ribonucleases，”(人工核糖核酸酶)，Adv.Inorg.Biochem.，1994，9：41-74；Magda，“Metal Complex Conjugates ofAntisense DNA Which Display Ribozyme-Like Activity，”(显示出类似核酶活性的反义DNA的金属复合结合物)，J.Am.Chem.Soc.1997，119：6947-6948.；Komiyama，“Progress towards synthetic enzymes forphosphoester hydrolysis，”(磷酸酯水解的合成酶方面的进展)，CurrentOpinion in Chemical Biology，1998，2：751-757.；Hegg，“Toward thedevelopment of metal-based synthetic nucleases and peptidases：a rationaleand progress report in applying the principles of coordination chemistry，”(开发基于金属的合成核酸酶和肽酶：在配位化学原理的应用中的理论基础和进展报告)，Coord.Chem.Revs.1998，173：133-165；Trawick等，“Inorganic Mimics of Ribonucleases and Ribozymes：From RandomCleavage to Sequence-Specific Chemistry to Catalytic Antisense Drugs，”(核糖核酸酶和核酶的无机模拟物：从随机裂解到序列特异性化学到催化性反义药物)，Chem.Rev.1998，98：939-960.)某些镧系元素(例如镧、铕、铈、钆)的复合物具有与天然的酶相当或甚至更高的磷酸二酯酶活性(Bing Zhua等，“Binuclear lanthanide complexes as catalystsfor the hydrolysis of double-stranded DNA，”(双核镧系元素复合物作为水解双链DNA的催化剂)Inorg.Chem.Communs.，1999，2：351-353.；Williams等，“Structure and Nuclease Activity of Simple Dinuclear MetalComplexes：Quantitative Dissection of the Role of Metal Ions，”(简单的双核金属复合物的结构和核酸酶活性：金属离子作用的定量剖分)，Acc.Chem.Res.1999，32：485-493.；

等，“Development of ArtificialRibonucleases Using Macrocyclic Lanthanide Complexes，”(使用大环镧系元素复合物发展人工核糖核酸酶)，Chimia 2000，54：569-573.；Kuzuya等，“Conjugation of Various Acridines to DNA for Site-SelectiveRNA Scission by Lanthanide Ion，”(将各种不同的吖啶与DNA结合用于通过镧系元素离子进行位点选择性的RNA剪切)，Bioconjugate Chem.2002，13：365-369.；Canaple等，“Artificial Ribonucleases：Efficient andSpecific in Vitro Cleavage of Human c-raf-1RNA，”(人工核糖核酸酶：在体外有效和特异性裂解人类c-raf-1RNA)，Bioconjugate Chem.2002，13：945-951.；Shigekawa等，“Extended x-ray absorption fine structurestudy on the cerium(IV)-induced DNA hydrolysis：Implication to the rolesof 4f orbitals in the catalysis”(对于铈(IV)诱导的DNA水解的延伸的x-射线吸收精细结构研究：4f轨道在催化中的作用的推论)，Appl.Phys.Lett.1999，74：460-462.)

提供合成的RNA转酯催化剂的一种可能的方法可以是通过与催化的裂解基团连接，产生更有力的反义寡核苷酸，使它们成为有效的、选择性诱变的抗病毒药剂(Hall等，“Efficient sequence-specific cleavageof RNA using novel europium complexes conjugated to oligonucleotides”，(使用与寡核苷酸结合的新的铕复合物对RNA进行有效的序列特异性裂解)，Chemistry & Biology，1994，1：185-190；Komiyama，“Sequence-specific and hydrolytic scission of DNA and RNA bylanthanide complex-oligo DNA hybrids”，(通过镧系元素复合物-寡聚DNA杂合体进行DNA和RNA的序列特异性的和水解剪切)，J.Biochem.，1995，118：665-670；Hall等，“Towards artificial ribonucleases：The sequence-specific cleavage of RNA in a duplex”，(关于人工核糖核酸酶：在双链体中进行RNA的序列特异性裂解)，Nucl.Acid Res.，1996，24：3522-3526；Hall等，“Sequence-specific cleavage of RNA usingmacrocyclic lanthanide complexes conjugated to oligonucleotides：Astructure activity study，”(使用与寡核苷酸结合的大环镧系元素复合物进行RNA的序列特异性裂解：结构活性研究)，Nucleosides &Nucleotides，1997，16：1357-1368；等，“The sequence-specificcleavage of RNA by artificial chemical ribonucleases，”(通过人工化学核糖核酸酶对RNA进行序列特异性裂解)，Antisense and nucleic acid drugdevelopment，1997，7：423-430；Baker等，“Oligonucleotide-europiumcomplex conjugate designed to cleave the 5′cap structure of the ICAM-1transcript potentiates antisense activity in cells，”(设计用于裂解ICAM-1转录本的5′-帽结构的寡核苷酸-铕复合结合物增强了细胞中的反义活性)，Nucl.Acid Res.，1999，17：1547-1551；Haner等，“Functionalterpyridine-metal complexes，a process for the preparation thereof andoligonucleotide conjugates with terpyridine-metal complexes”(功能性三联吡啶-金属复合物、其制备方法以及与三联吡啶-金属复合物结合的寡核苷酸)，美国专利No.5,925,744，1999年7月20日；Morrow，“Metalcomplexes for promoting catalytic cleavage of RNA by transesterification”(通过转酯作用促进RNA的催化裂解的金属复合物)，美国专利No.5,684,149，1997年11月4日)。通过将镧系元素(III)离子与带有一个或两个吖啶基团的寡核苷酸合并，已经制备了在一个或两个指定位点选择性剪切RNA的人工酶。(Kuzuya等，“Conjugation of VariousAcridines to DNA for Site-Selective RNA Scission by Lanthanide Ion，”(将各种不同的吖啶与DNA结合用于通过镧系元素离子进行位点选择性RNA剪切)，Bioconjugate Chem.2002，13：365-369；Kuzuya等，“Selective activation of two sites in RNA by acridine-bearingoligonucleotides for clipping of designated RNA fragments，”(通过带有吖啶的寡核苷酸在RNA中选择性活化两个位点用于切下指定的RNA片段)，J.Am.Chem.Soc.，2004，126：1430-1436.)。

发明概述

本发明涉及了含有寡核苷酸的化合物，其中寡核苷酸含有修饰的核碱基和/或螯合部分，这增加了它们与互补的核酸的结合能力并能够赋予磷酸二酯酶活性。根据在公开的化合物的寡核苷酸部分中修饰的核碱基数量的性质，化合物与互补的靶核酸的结合能力与典型的互补寡核苷酸相比可以增加到10³-10⁹倍。这种结合的增强允许使用较低浓度的药剂用于工业、预防、治疗或其它目的。此外或可选地，用能够与金属离子复合的螯合基团修饰的本发明化合物的催化活性可以允许使用较低有效浓度的化合物(与之前的反义疗法化合物相比)，因为化合物可以与互补链复合，催化磷酸二酯键裂解，和与另一条互补链重复这个过程。

本发明的材料可用于使用或将来可能使用反义核酸的所有各种过程，包括但不限于诊断、治疗以及调节宿主或病原体的基因表达。

就强烈的结合力来说，本发明的材料也可以用作检测探针，用于检测和/或定量靶核酸。

因此，本发明的一个方面是含有螯合部分和大约5到大约150个核碱基的寡核苷酸的化合物，其中寡核苷酸还含有至少一个修饰的核碱基，例如两性离子互变变构体、离子互变变构体、巯基核碱基或羟基核碱基。在优选实施方案中，寡核苷酸含有大约10到大约100个核碱基，更优选大约10到大约50个核碱基，最优选大约20到大约30个核碱基。在某些情况下，寡核苷酸具有至少两个修饰的核碱基。在优选实施方案中，修饰的核碱基是巯基核碱基和/或羟基核碱基。在某些实施方案中，羟基核碱基占化合物中核碱基总数的大约10％到大约20％。在优选实施方案中，羟基核碱基是5-羟基胞嘧啶、5-羟基尿嘧啶、8-羟基腺嘌呤或8-羟基鸟嘌呤，和/或巯基核碱基是5-巯基胞嘧啶、5-巯基尿嘧啶、8-巯基鸟嘌呤或8-巯基腺嘌呤。

本文中使用的螯合部分是化合物中能够与金属离子复合的部分。在优选实施方案中，金属是镧系元素，在更优选的实施方案中，金属选自镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱和镥。特别优选的金属是铕和镧。优选的螯合部分是具有选自下式的部分：

或

其中R是化合物的寡核苷酸部分。R¹和R³可以是氢、C_1-8烷烃、C_2-8烯烃、C_2-8炔烃、酰基C_1-8烷烃、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、C_1-8烷基芳基或C_1-8烷基杂芳基。R²可以是C_1-8烷基、C_2-8烯烃、C_2-8炔烃、芳基、杂芳基、C_1-8烷基芳基、C_1-8烷基杂芳基或酰基C_1-8烷烃。在一个具体的实施方案中，螯合部分是：

其中R¹各为2，2，2-三氟乙酰基，R是寡核苷酸。

本发明的另一个方面是含有本文公开的化合物和可药用载体的组合物。在某些实施方案中，组合物还含有投送介质，例如脂质体。

本发明的另一个方面是使用本文描述的化合物抑制靶核酸翻译的方法。例如，这样的方法包括将靶核酸与本发明的化合物在允许化合物与靶核酸杂交的条件下进行接触，其中杂交的化合物抑制靶核酸的翻译。在某些情况下，化合物裂解了靶核酸的键。在某些实施方案中，靶核酸是mRNA。在某些实施方案中，靶核酸在生物体中，并且接触包括给生物体施用含有本发明的化合物和可药用载体的组合物。或者，在另外的实施方案中，接触包括将本发明的化合物与来自生物体的含有靶核酸的生物样品进行混合。在某些情况下，生物体是人类或动物对象。在具体的实施方案中，人类或动物对象患有病毒感染、细菌感染、微生物感染、真菌感染或癌症。

本发明的另一个方面是在生物体中抑制核酸的翻译的方法，包括推测或测定生物体中的靶核酸的核酸序列，以及给生物体施用含有本发明的化合物和可药用载体的组合物。在某些情况下，组合物还含有投送介质，例如脂质体。在组合物中施用的化合物含有的核苷酸序列与靶核酸的核苷酸序列充分互补，从而与其在生物体中、在足够允许发生杂交的情况下进行杂交，从而在生物体中抑制核酸的翻译。在某些情况下，化合物的核苷酸序列与靶核酸的序列的全部或一部分完全互补。

本发明的另一个方面是使得化合物在足以允许杂交的条件下抑制靶核酸翻译的方法，该方法包括(a)测定靶核酸的核苷酸序列；(b)合成含有与寡核苷酸连接的螯合部分的化合物，该寡核苷酸包含的寡核苷酸序列与靶核酸的核苷酸序列的至少一部分互补，并且含有5到150个核碱基，其中至少一个核碱基选自5-羟基胞嘧啶、5-羟基尿嘧啶、8-羟基腺嘌呤和8-羟基鸟嘌呤的羟基核碱基；以及(c)将化合物与选自镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱和镥的金属的离子进行混合。在某些实施方案中，螯合部分具有下式：

或

其中R是化合物的寡核苷酸部分。R¹和R³可以是氢、C_1-8烷烃、C_2-8烯烃、C_2-8炔烃、酰基C_1-8烷烃、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、C_1-8烷基芳基或C_1-8烷基杂芳基。R²可以是C_1-8烷基、C_2-8烯烃、C_2-8炔烃、芳基、杂芳基、C_1-8烷基芳基、C_1-8烷基杂芳基或酰基C_1-8烷烃。在一个具体的实施方案中，足以允许杂交的条件是人类的生理条件。

除了上述之外，作为附加的方面，本发明包括了本发明在任何方面比上面具体提到的变化的范围更窄的所有实施方案。例如，尽管为了简短起见，对本发明的方面可以通过引用种属或数值范围进行描述，但应该理解，种属中的每个成员和范围内的每个值或子范围也旨在作为本发明的方面。同样地，本发明各种不同的方面和特征可以组合，产生也旨在本发明范围内的其它方面。尽管申请人发明了本文所附的权利要求的全部范围，但本文所附的权利要求并不打算在其范围内涵盖其他人在现有技术中的工作。因此，在专利局或其它单位或个人提请申请人注意权利要求范围内的法定现有技术的情况下，申请人保留在适用的专利法规定下行使修改权的权利，以重新界定该权利要求的主题，将该法定现有技术或法定现有技术的明显变化从该权利要求的范围中特别排除出去。通过这样修改的权利要求界定的本发明的变化也旨在作为本发明的方面。

附图简述

图1是描绘掺入了0、1、2或3个羟基鸟嘌呤核酸的寡核苷酸在血清中37℃下的稳定性的图。

图2是描绘与各种不同的互补寡核苷酸温育后残留的RNA量的图。

图3是分析凝胶的照片，显示了在本文公开的镧系元素-寡核苷酸复合物的存在下eGFP的降解。上方的凝胶显示了与镧系元素复合的未修饰的寡核苷酸与mRNA温育的结果，下方的凝胶显示了与镧系元素复合的修饰的寡核苷酸与mRNA温育的结果。第1道是分子量大小标记物；第2和3道显示了在10μM寡核苷酸-镧系元素复合物存在下的降解；第3和4道显示了在5μM寡核苷酸-镧系元素复合物存在下的降解；第6道是正义RNA的对照实验；第7道是反义RNA的对照实验。

优选实施方案的具体说明

本发明提供了含有螯合部分和寡核苷酸的新化合物，其中寡核苷酸具有用于反义、诊断和其它使用寡核苷酸的方法中的性质。本发明的化合物包含的反义寡核苷酸具有(a)与天然的核碱基具有高度结合效能的一个或多个修饰的核碱基，以及(b)一个或多个螯合部分。这些化合物可以水解寡核苷酸、RNA和/或DNA的磷酸二酯键，并可用于反义治疗。

在本发明的背景中，术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物、嵌合物、类似物和同系物的寡聚体或多聚体。该术语包括由天然存在的核碱基、糖和共价的核苷酸间(骨架)键构成的寡核苷酸，以及具有非天然存在的部分的寡核苷酸，这些非天然存在的部分在例如与靶核酸杂交或与互补寡核苷酸相互作用时，以类似于天然存在的寡核苷酸的方式发挥作用。这样的修饰的或取代的寡核苷酸通常比天然的形式更为优选，因为具有需要的性质，例如增加细胞摄入、增加对靶核酸的亲和性，以及在核酸酶存在下增加稳定性。

本发明的化合物与生物负体(例如寡核苷酸、RNA或DNA)结合的效率是通过掺入修饰的核碱基或其它具有两性离子或离子互变异构体的类似物来达到的。本发明的化合物有至少一个核碱基具有修饰的核碱基或其它具有两性离子或离子互变异构体的类似物。在优选实施方案中，修饰的核碱基是选自5-羟基胞嘧啶、5-羟基尿嘧啶、8-羟基腺嘌呤和8-羟基鸟嘌呤的羟基核碱基，或选自5-巯基胞嘧啶、5-巯基尿嘧啶、8-巯基鸟嘌呤和8-巯基腺嘌呤的巯基核碱基。

在一个实施方案中，寡核苷酸含有5-羟基尿嘧啶阴离子(1)的一种或多种互变异构体形式，5-羟基尿嘧啶阴离子(1)具有下式(图解1)：

图解1

其中R是指本发明的其余化合物。半经验性的AM1和PM3以及从头计算的SCF和DFT(BLYP/6-31+G(d))计算的结果表明，1-甲基-5-羟基尿嘧啶阴离子在溶液中最稳定的互变异构体是在5-位上具有完整的OH-基团的形式(1b)。因为在N3位置上缺少氢原子，1-甲基-5-羟基尿嘧啶阴离子互变异构体1b与腺嘌呤的正常配对不能形成。但是，1-甲基-5-羟基尿嘧啶阴离子的这种互变异构体形式(1b)与鸟嘌呤产生了牢固键合的复合物，成为反向沃森-克里克(Watson-Crick)配对(图解2)。

图解2

由于在1-甲基-5-羟基尿嘧啶阴离子1b的C4羰基(靠近氧负离子)上具有明显的负电荷，该配对将比天然的鸟嘌呤-胞嘧啶配对具有明显更牢固的键合。计算表明鸟嘌呤与1-甲基-5-羟基尿嘧啶阴离子之间的反向沃森-克里克配对比通常的鸟嘌呤-胞嘧啶配对更稳定2到4kcal/mol。

在另一个实施方案中，本发明的化合物包含羟基碱基5-羟基胞嘧啶(2)。5-羟基胞嘧啶(2)阴离子的互变异构体形式在图解3中给出，其中R仍然是指化合物的其余部分。

图解3

在1-甲基-5-羟基胞嘧啶阴离子的情况下，结构2b是在溶液中最稳定的互变异构体形式。该阴离子的N-H形式在C2羰基氧原子上具有明显的负电荷。结果，与鸟嘌呤的相应配对(图解4)比通常的鸟嘌呤-胞嘧啶配对具有明显更牢固的键合。

图解4

AM1 SCRF计算预测出，异常的鸟嘌呤-互变异构体2b配对比正常的鸟嘌呤-胞嘧啶沃森-克里克配对更稳定5.42kcal/mol。使用PM3参数化的相应计算差值甚至更大，大约为10.21kcal/mol。因此，这种强烈的键合可显著影响正常的DNA复制过程，导致突变或甚至细胞的完结。这与5-羟基胞嘧啶的实验观察相一致，5-羟基胞嘧啶类似5-羟基尿嘧啶，是极其强的诱变剂(Wallace.“Biological consequences of freeradical-damaged DNA bases，”(自由基破坏的DNA碱基的生物学结果)Free Radical Biology and Medicine，2002，33：1-14)。但是，在本实施方案中，非常低浓度的该成分保证了仅仅与特定的标题化合物强烈键合，而与生物负体(DNA、RNA)中随机互补碱基具有可忽略的非特异性键合。

在本发明的另一个实施方案中，羟基碱基是8-羟基腺嘌呤及其阴离子的互变异构体形式(3)。该阴离子的相应的互变异构体形式在图解5中给出，其中R仍是化合物的其余部分。

图解5

在9-甲基-8-羟基腺嘌呤的阴离子的情况下，最稳定的互变异构体形式是离子化的8-羟基形式3a。在该情况下，与尿嘧啶的正常键合仅仅受到轻微的影响。但是，计算表明，中性9-甲基-8-羟基腺嘌呤在溶液中的最稳定的互变异构体是两性离子的形式4，显示在图解6中。

图解6

由于铵基团上的正离子电荷，该互变异构体与尿嘧啶形成非常强的氢键。9-甲基-8-羟基腺嘌呤两性离子互变异构体4与尿嘧啶的配对经计算比正常的腺嘌呤-尿嘧啶配对更稳定5.16kcal/mol(AM1 MCaSCRF)到8.41kcal/mol(PM3 MCa SCRF)(参考图解7)。

图解7

这也与8-羟基腺嘌呤的非常高的诱变活性相一致(Wallace.“Biological consequences of free radical-damaged DNA bases，”(自由基破坏的DNA碱基的生物学结果)Free Radical Biology and Medicine，2002，33：1-14)。但是，预期增加的键合允许将本发明的化合物的浓度降低到与仅具有天然核碱基的化合物相比最多5个数量级。

本发明的另一个实施方案提供了由8-羟基鸟嘌呤及其阴离子的互变异构体形式(5)修饰的本发明的化合物。该阴离子的相应的互变异构体形式在图解8中给出，其中R仍指化合物的其余部分。

图解8

在9-甲基-8-羟基鸟嘌呤的阴离子的情况下，最稳定的互变异构体形式是离子化的8-羟基形式5a，它以与正常的碱基配对相似的能量结合。但是，中性的9-甲基-8-羟基鸟嘌呤在溶液中最稳定的互变异构体，图解9显示的两性离子形式6，与胞嘧啶具有非常牢固的键合。

图解9

9-甲基-8-羟基鸟嘌呤两性离子互变异构体6与胞嘧啶的配对预计比正常的鸟嘌呤-胞嘧啶配对更稳定7.22kcal/mol(AM1 MCa SCRF)到8.17kcal/mol(PM3 MCa SCRF)。这种配对的结构在图解10中给出。

图解10

在本文中使用时，每种羟基核碱基当与相对的核碱基形成稳定的氢键时，被认为与该核碱基互补。因此，在某些情况下，5-羟基尿嘧啶与腺嘌呤互补，5-羟基胞嘧啶与鸟嘌呤互补，8-羟基腺嘌呤与尿嘧啶和/或胸腺嘧啶互补，和8-羟基鸟嘌呤与胞嘧啶互补。羟基核碱基与靶核酸的核碱基的其它稳定的氢键也可以存在，因此，羟基核碱基被认为与靶核酸中与其形成稳定氢键的核碱基互补。

修饰的核碱基中的酸性互变异构基团可以是任何其它的酸性基团，例如-SH、-COOH、-SO₃H等。在示例的实施方案中，鸟嘌呤和胞嘧啶之间的复合物(7a)以及8-巯基鸟嘌呤和胞嘧啶的两性离子形式(7b)的稳定化中存在显著的差别。

图解11

使用Jaguar(Jaguar 6.5，Schrodinger，LLC，New York，NY，2005)，采用6-31G^**+基本设置进行DFT(B3LYP)计算，给出了下面的复合物稳定化能量值：7a的-0.038376a.u.vs.7b的-0.073251a.u.，因此推断出在后者中存在牢固得多的键合。因此，在核苷酸、寡核苷酸和核酸中存在8-巯基鸟嘌呤及等价的互变异构化合物将增加RNA-RNA、RNA-DNA、DNA-DNA、RNA-蛋白和DNA-蛋白氢键复合物的稳定性。这些复合物的稳定性可用于RNAi诊断、反义核苷酸疗法、核酸微阵列诊断学，以及各种利用它们的实验室诊断和临床方法。

在表1中，给出了上面讨论的化合物通过AM1 SCRF(ε＝80)计算的形成热

和相对互变异构平衡常数ΔpK_T。

表1

在本发明的给定的化合物中羟基核碱基的数量至少为1个，但不超过化合物的寡核苷酸部分的核碱基总数的20％。超过20％的羟基核碱基可导致化合物的不稳定，并减少与靶核酸的结合。优选的羟基核碱基的数量为核碱基总数的大约10％到大约20％。在本发明的化合物中存在1个以上的羟基核碱基的情况下，羟基核碱基可以是相同的或不同的。

本发明的化合物优选含有大约5到大约150个核碱基(即从大约5到大约150个连接的核苷)。本技术领域的普通专业人员将会认识到，本发明体现的化合物长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、和150个核碱基。

在一个优选实施方案中，本发明化合物的长度为10到100个核碱基。本技术领域的普通专业人员将会认识到，这体现了长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100个核碱基的化合物。

在另一个优选实施方案中，本发明化合物的长度为10到50个核碱基。本技术领域的普通专业人员将会认识到，这体现了长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个核碱基的化合物。

在另一个优选实施方案中，本发明化合物的长度为20到30个核碱基。本技术领域的普通专业人员将会认识到，这体现了长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核碱基的化合物。

特别优选的化合物是从大约10到大约50个核碱基的寡核苷酸，更优选的是含有大约20到大约30个核碱基的寡核苷酸。

本发明的化合物还含有螯合部分。螯合部分发挥金属配体的功能。它们可以稳定地螯合金属离子。某些金属-配体复合物已经被显示在裂解磷酸二酯键中有效。将螯合部分整合到具有反义活性的寡核苷酸中，由于降解或裂解靶核酸的一个或多个磷酸二酯键的能力，寡核苷酸抑制靶核酸的效能被增加了。因此，本发明的化合物还包含了能够螯合金属离子的螯合部分。在优选的实施方案中，金属离子是镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱和镥。特别优选的是铕或镧的离子。金属的离子可以是任何稳定离子，例如+1、+2、+3、+4、或+5价离子。优选的离子是La(III)、Eu(III)、Ho(III)和Ce(IV)。

可以考虑的螯合部分包括在图解12中概括的分子式所代表的那些。

图解12

其中R是寡核苷酸的其余部分；

R¹选自氢、C_1-8烷烃、C_2-8烯烃、C_2-8炔烃、酰基C_1-8烷烃、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、C_1-8烷基芳基和C_1-8烷基杂芳基，

R²独立地选自C_1-8烷基、C_2-8烯烃、C_2-8炔烃、芳基、杂芳基、C_1-8烷基芳基、C_1-8烷基杂芳基和酰基C_1-8烷烃，并且

R³独立地选自氢、C_1-8烷烃、C_2-8烯烃、C_2-8炔烃、酰基C_1-8烷烃、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、C_1-8烷基芳基和C_1-8烷基杂芳基。

术语“烷基”包括含有指定数量碳原子的直链和支链的烃基团，典型为甲基、乙基以及直链和支链的丙基和丁基基团。烃基团可以含有最多16个碳原子。术语“烷基”包括“桥接烷基”，例如C₆-C₁₆二环或多环烃基团，例如降冰片基、金刚烷基、二环[2.2.2]辛基、二环[2.2.1]庚基、二环[3.2.1]辛基和十氢萘基。术语“烷基”还包含了任选被例如一个或多个卤素原子、一个或多个羟基基团或一个或多个硫羟基团取代的烷基基团。术语“环烷基”被定义为环状的C₃-C₈烃基团，例如环丙基、环丁基、环己基和环庚基。“杂环烷基”被定义为与环烷基相似，只是在环状结构中存在至少一个杂原子。适合的杂原子包括N、S和O。

术语“烯基”和“炔基”与“烷基”的定义相同，只是分别含有碳-碳双键或碳-碳三键。“环烯基”的定义与环烷基相似，只是在环中存在碳-碳双键。

术语“亚烷基”是指具有取代基的烷基基团。例如，术语“C_1-3亚烷基芳基”是指含有1到3个碳原子的烷基基团，并被芳基基团取代。

术语“卤”或“卤素”在本文中被定义为包括氟、溴、氯和碘。

术语“芳基”单独或组合时，在本文中被定义为单环或多环的芳香基团，优选为单环或二环的芳香基团，例如苯基或萘基。除非特别指明，“芳基”基团可以是非取代的或被例如一个或多个、具体一个到三个卤素、烷基、羟基、C(＝O)OR、羟基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、酰胺基、烷硫基、烷基亚硫酰基和烷基磺酰基取代。示例性的芳基基团包括苯基、萘基、四氢萘基、2-氯苯基、3-氯苯基、4-氯苯基、2-甲基苯基、4-甲氧基苯基、3-三氟甲基苯基、4-硝基苯基等。术语“芳基C_1-3烷基”和“杂芳基C_1-3烷基”被定义为具有C_1-3烷基取代基的芳基或杂芳基基团。

术语“杂芳基”在本文中被定义为单环或二环的环系统，含有一个或两个芳香环并在芳香环中含有至少一个氮、氧或硫原子，其可以是非取代的或被例如一个或多个、具体一个到三个取代基所取代，例如卤素、烷基、羟基、羟基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、卤代烷基、硝基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、烷硫基、烷基亚硫酰基和烷基磺酰基。杂芳基基团的例子包括噻吩基、呋喃基、吡啶基、噁唑基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、三唑基、异噻唑基、异噁唑基、咪唑基、苯并噻唑基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基和噻二唑基。

术语“Het”被定义为单环、二环和三环基团，含有一个或多个选自氧、氮和硫的杂原子。“Het”基团也可以含有与环连接的氧代基团(＝O)。Het基团的非限制性例子包括1，3-二氧戊环基、2-吡唑啉基、吡唑烷基、吡咯烷基、哌嗪基、吡咯啉基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、吗啉基、thiopholiny1、哌啶基、1，4-二噻烷基和1，4-二噁烷。

术语“羟基”被定义为-OH。

术语“烷氧基”被定义为-OR，其中R是烷基。

术语“烷氧基烷基”被定义为其中氢已经被烷氧基取代的烷基基团。术语“(烷基巯基)烷基”的定义与烷氧基烷基相似，只是存在硫原子而不是氧原子。

术语“羟基烷基”被定义为连接有烷基基团的羟基基团。

术语“氨基”被定义为-NH₂，术语“烷基氨基”被定义为-NR₂，其中至少一个R是烷基，第二个R是烷基或氢。

术语“酰基氨基”被定义为RC(＝O)N-，其中R是烷基或芳基。

术语“烷硫基”被定义为-SR，其中R是烷基。

术语“烷基亚硫酰基”被定义为RSO₂-，其中R是烷基。

术语“烷基磺酰基”被定义为RSO₃-，其中R是烷基。

术语“硝基”被定义为-NO₂。

术语“三氟甲基”被定义为-CF₃。

术语“三氟甲氧基”被定义为-OCF₃。

术语“氰基”被定义为-CN。

对含有与金属离子复合的螯合部分的本发明化合物计算出的核酸酶效能，根据修饰的核碱基数量的性质，与天然存在的核酸酶相比增加了高达10³-10⁹倍，这允许相应地降低有效浓度，并同时保持了化合物的高特异性。

公开的螯合部分可以使用已知的技术来制备(参见例如Cowan，Curr.Opin.Chem.Biol.，5：634-642(2001)和Franklin，Curr.Opin.Chem.Biol.，5：201-208(2001))。它们可以附加地和可选地使用容易获得的材料和已知的保护基团化学来合成，例如公开在例如Wuts等，Greene’sProtective Groups in Organic Synthesis，(有机合成中的格林保护基团)第四版(Hoboken，NJ：Wiley-Interscience)2007中。

本发明化合物的其他修改

对本发明化合物的其它修改也被考虑到了。尽管寡核苷酸是本发明化合物的优选形式，但本发明也包含了其它化合物家族，包括但不限于寡核苷酸类似物和模拟物，例如在本文中描述的那些。

正如本技术领域熟知的那样，核苷是碱基-糖的组合。核苷的碱基部分通常为杂环碱基。这样的杂环碱基的两种最常见的类型是嘌呤和嘧啶。核苷酸是进一步包含了与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包含了呋喃戊糖的核苷来说，磷酸基团可以连接到糖的2’、3’或5’羟基部分上。在形成寡核苷酸时，磷酸基团将相邻的核苷彼此共价连接，形成线性的聚合体化合物。该线性的聚合体化合物的相应末端又可以进一步连接形成环状化合物，但是，一般优选线性化合物。此外，线性化合物可以具有内部核碱基互补性，因此可以以某种方式折叠产生全部或部分双链的化合物。在寡核苷酸内，磷酸基团通常被称为形成了寡核苷酸的核苷间骨架。RNA和DNA的一般键或骨架是3’到5’磷酸二酯键。

修饰的核苷间连键(骨架)

预期可用于本发明的反义化合物的具体例子包括含有修饰的骨架或非天然核苷间连键的寡核苷酸。正如在本说明书中定义的那样，具有修饰的骨架的寡核苷酸包括在骨架中保留磷原子的和在骨架中不含有磷原子的寡核苷酸。出于本说明书的目的，并且在本技术领域中有时被引用时，在其核苷间骨架中不具有磷原子的修饰的寡核苷酸也可以被认为是寡核苷。

预期的其中含有磷原子的修饰的寡核苷酸骨架包括例如具有正常的3’-5’键的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯包括3’-亚烷基膦酸酯、5′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、亚膦酸酯、磷酰胺酯包括3’-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯、硫代磷酰胺酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和硼代磷酸酯，它们的2’-5’连接的类似物，以及具有颠倒的极性的类似物，其中一个或多个核苷酸间连键是3′到3′、5′到5′或2′到2′键。预期的具有颠倒的极性的寡核苷酸在最靠近3′-端的核苷酸间连键处含有单个3′到3′键，即可以是无碱基的单个颠倒的核苷残基(核碱基丢失或在其位置上有羟基)。也包含了各种盐、混合盐和游离酸形式。

传授了上述的含磷键的制备的代表性美国专利包括但不限于U.S.：3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5,194,599、5,565,555、5,527,899、5,721,218、5,672,697和5,625,050，每个专利在此引为参考。

预期的其中不包含磷原子的修饰的寡核苷酸骨架具有通过短链烷基或环烷基核苷间连键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间连键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间连键形成的骨架。这些包括了具有吗啉代连键(部分从核苷的糖部分形成)的骨架，硅氧烷骨架，硫化物、亚砜和砜骨架，甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基骨架，亚甲基甲酰基和硫代甲酰基骨架，核糖乙酰基(riboacetyl)骨架，含有烯烃的骨架，氨基磺酸酯骨架，亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架，磺酸酯和磺酰胺骨架，酰胺骨架，以及其它具有混合的N、O、S和CH₂组成部分的骨架。

传授了上述的寡核苷制备的代表性美国专利包括但不限于U.S.：5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437、5,792,608、5,646,269和5,677,439，每个专利在此引为参考。

修饰的糖和核苷间连键-模拟物

在另一种预期的寡核苷酸模拟物中，核苷酸单位的糖和核苷间连键(即骨架)均被新的基团所代替。核碱基单位被保留，用于与适当的靶核酸杂交。一种这样的化合物、已经显示出具有很好的杂交性质的寡核苷酸模拟物被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖-骨架被含有酰胺的骨架、特别是氨基乙基甘氨酸骨架所取代。核碱基被保留，并与骨架的酰胺部分的氮杂氮原子直接或间接结合。传授了PNA化合物的制备的代表性美国专利包括但不限于U.S.：5,539,082、5,714,331和5,719,262，每个专利在此引为参考。关于PNA化合物的其他教导可以在Nielsen等，Science，1991，254：1497-1500中找到。

本发明的某些实施方案是具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸，和具有杂原子骨架的寡核苷酸，特别是上面参考的美国专利5,489,677中的-CH₂-NH-O-CH₂-、-CH₂-N(CH₃)-O-CH₂-[被称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架]、-CH₂-O-N(CH₃)-CH₂-、-CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂-和-O-N(CH₃)-CH₂-CH₂-(其中天然磷酸二酯骨架被表述为-O-P-O-CH₂-)，以及上面参考的美国专利5,602,240中的酰胺骨架。还考虑到了具有上面参考的美国专利5,034,506中具有吗啉代骨架结构的寡核苷酸。

修饰的糖

修饰的寡核苷酸也可以含有一个或多个取代的糖部分。预期的寡核苷酸在2’位置上含有下列之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中的烷基、烯基和炔基可以是取代的或非取代的C₁到C₁₀烷基或C₂到C₁₀烯基和炔基。特别优选的是O[(CH₂)_nO]_mCH₃、O(CH₂)_nOCH₃、O(CH₂)_nNH₂、O(CH₂)_nCH₃、O(CH₂)_nONH₂和O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃]₂，其中n和m是从1到大约10。其它优选的寡核苷酸在2’位置上含有下列之一：C₁到C10低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、报告基团、嵌入剂、改进寡核苷酸的药代动力学性质的基团或改进寡核苷酸的药效动力学性质的基团，以及其它具有类似性质的取代基。预期的修饰包括2′-甲氧基乙氧基(2′-O-CH₂CH₂OCH₃，也被称为2′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)(Martin等，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504)，即烷氧基烷氧基基团。其它预期的修饰包括2’-二甲基氨氧基乙氧基，即O(CH₂)₂ON(CH₃)₂基团，也被称为2′-DMAOE，在下文的实施例中描述，以及2′-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本技术领域中也称为2′-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2′-DMAEOE)，即2′-O-CH₂-O-CH₂-N(CH₃)₂，也在下文的实施例中描述。

其它预期的修饰包括2′-甲氧基(2′-O-CH₃)、2′-氨基丙氧基(2′-OCH₂CH₂CH₂NH₂)、2′-烯丙基(2′-CH₂-CH＝CH₂)、2′-O-烯丙基(2′-O-CH₂-CH＝CH₂)和2′-氟代(2′-F)。2′-修饰可以在阿拉伯糖(上方)位置或核糖(下方)位置上。优选的2′-阿拉伯糖修饰是2′-F。类似的修饰也可以在寡核苷酸的其它位置上进行，特别是在3’末端核苷酸上糖的3’位置或2’-5’连接的寡核苷酸中以及5’末端核苷酸的5’位置上。寡核苷酸也可以具有糖模拟物例如环丁基部分来代替呋喃戊糖。讲授了制备这样修饰的糖结构的代表性美国专利包括但不限于U.S.：4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633、5,792,747和5,700,920，每个专利在此以其全文引为参考。

糖的其它优选修饰包括锁定核酸(LNA)，其中2′-羟基基团连接到糖环的3′或4′碳原子上，从而形成了二环的糖部分。连键优选为桥接了2′氧原子和4′碳原子的亚甲基(-CH₂-)n基团，其中n是1或2。LNA及其制备描述在WO 98/39352和WO 99/14226中。

天然的和修饰的核碱基

寡核苷酸也可以包含核碱基(在本技术领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。在本文中使用时，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其它合成的或天然的核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫基、8-硫烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其它修饰的核碱基包括三环嘧啶例如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-封条(G-clamp)例如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶[4，5-b]吲哚-2-酮)、吡啶吲哚胞苷(H-吡啶[3′，2′:4，5]吡咯[2，3-d]嘧啶-2-酮)。修饰的核碱基也可以包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环取代的核碱基，例如7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其它的核碱基包括在美国专利No.3,687,808中公开的，在Kroschwitz主编的《聚合物科学和工程简明百科全书》第858-859页(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，JohnWiley & Sons，1990)中公开的，在Englisch等，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30：613中公开的，以及在Crooke和Lebleu主编的《反义研究和应用》第15章第289-302页(Antisense Research andApplications，CRC Press，1993)由Sanghvi公开的那些核碱基。

传授了某些上述的修饰核碱基以及其它的修饰核碱基的制备的代表性美国专利包括但不限于上面提到的U.S.3,687,808，以及U.S.：4,845,205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617、5,645,985、5,830,653、5,763,588、6,005,096和5,681,941，每个专利在此引为参考，美国专利5,750,692也在此引为参考。

结合物

本发明的寡核苷酸的另一种修饰包括将寡核苷酸化学连接上一个或多个增加寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄入的部分或结合物。这些部分或结合物可以包括与功能基团例如一级或二级羟基基团共价结合的结合物基团。本发明的结合物基团包括螯合部分、嵌入剂、报告物分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚物的药效动力学性质的基团，以及增强寡聚物的药代动力学性质的基团。

典型的结合物基团包括胆固醇、脂类、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。在本发明中增强药效动力学性质的基团包括改进摄入、增加对降解的抗性和/或加强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。在本发明中增强药代动力学性质的基团包括改进本发明化合物的摄入、分布、代谢或分泌的基团。代表性的结合物基团被公开在国际专利申请PCT/US92/09196和美国专利6,287,860中，其全部内容在此引为参考。

结合物基团包括但不限于脂类基团例如胆固醇基团、胆酸、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇、硫代胆固醇、脂肪族链例如十二烷基二醇或十一烷基残基、磷脂例如二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基铵1，2-二-O-十六烷基-消旋-甘油基-3-H-膦酸酯、多胺或聚乙二醇链、或金刚烷乙酸、棕榈酰基部分、或十八胺或己氨基-羰基-氧基胆固醇部分。本发明的寡核苷酸也可以与活性药物物质结合，例如阿司匹林、华法令、苯丁唑酮、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、丹酰肌氨酸、2，3，5-三碘苯甲酸、氟灭酸、亚叶酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮杂卓、吲哚美辛(indomethicin)、巴比妥酸盐、头孢菌素、磺胺类药物、抗利尿剂、抗菌剂或抗生素。寡核苷酸药物结合物及其制备公开在美国专利申请09/334,130中，在此以其全文引为参考。

传授了这样的寡核苷酸结合物的制备的代表性美国专利包括但不限于U.S.：4,828,979、4,948,882、5,218,105、5,525,465、5,541,313、5,545,730、5,552,538、5,578,717、5,580,731、5,580,731、5,591,584、5,109,124、5,118,802、5,138,045、5,414,077、5,486,603、5,512,439、5,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735、4,667,025、4,762,779、4,789,737、4,824,941、4,835,263、4,876,335、4,904,582、4,958,013、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,245,022、5,254,469、5,258,506、5,262,536、5,272,250、5,292,873、5,317,098、5,371,241、5,391,723、5,416,203、5,451,463、5,510,475、5,512,667、5,514,785、5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,595,726、5,597,696、5,599,923、5,599,928和5,688,941，每个专利在此引为参考。

反义抑制

本发明的化合物与靶核酸的杂交一般被称为“反义”。这样的杂交可以导致抑制靶核酸的翻译，在本文中被称为“反义抑制”。这样的反义抑制通常是基于寡核苷酸链或片段的基于氢键的杂交，使得至少一条链或片段被裂解、降解或以其他方式使其无效。就此而言，目前优选的是靶定特定的核酸分子以及它们的功能以用于这样的反义抑制。

待干扰的DNA功能可以包括复制和转录。复制和转录可以例如来自内源的细胞模板、载体、质粒构建物或其他。待干扰的RNA功能可以包括例如RNA易位到蛋白翻译的位点、RNA易位到细胞内远离RNA合成位点的位点、从RNA翻译蛋白、拼接RNA以产生一种或多种RNA、以及涉及到RNA的RNA可以参与或促进的催化活性或复合物形成的功能。在本发明的背景中，“调节”和“表达的调节”是指增加(刺激)或减少(抑制)编码基因的核酸分子例如DNA或RNA的量或水平。抑制通常是优选的调节表达的方式，mRNA通常是优选的靶核酸。

在本发明的背景中，“杂交”是指寡聚体化合物的互补链配对。在本发明中，优选的配对机制涉及寡聚体化合物链的互补的核苷或核苷酸碱基(核碱基)之间的氢键，可以是沃森-克里克、Hoogsteen或反Hoogsteen氢键。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互补的核碱基，通过形成氢键而配对。杂交可以在各种不同的条件下发生。

反义化合物是在化合物与靶核酸的结合干扰了靶核酸的正常功能从而引起活性的损失时可以特异性杂交的，并且具有足够程度的互补性以在特异性结合所需的条件下避免反义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合，其中特异性结合所需的条件即在体内分析或治疗性处理的情况下的生理条件，在体外分析的情况下的分析条件。

在本发明中，词组“严紧的杂交条件”或“严紧条件”是指本发明的化合物将与其靶序列杂交、并且只与最小量的其它序列杂交的条件。严紧条件是序列依赖性的，在不同情况下不同，在本发明中，寡聚体化合物与靶序列杂交的严紧条件由寡聚体化合物的性质和组成以及研究它们的分析方法所决定。

本文使用的“互补”是指寡聚体化合物的两个核碱基之间精确配对的能力。例如，如果在寡核苷酸(寡聚体化合物)的某个位置上的核碱基能够与靶核酸的某个位置上的核碱基形成氢键，所述靶核酸是DNA、RNA或寡核苷酸分子，那么寡核苷酸与靶核酸之间形成氢键的位置被认为是互补的位置。当每个分子中有足够数量的互补位置被可以彼此形成氢键的核碱基所占据，则寡核苷酸与其它DNA、RNA或寡核苷酸分子彼此互补。因此，术语“可特异性杂交”和“互补”是用于表明足够数量的核碱基有足够程度的精确配对或互补性，使得在寡核苷酸和靶核酸之间可以稳定和特异的结合。

在本技术领域中可以理解的是，反义化合物的序列不需要与它可特异性杂交的靶核酸的序列100％互补。此外，寡核苷酸可以与一个或多个片段杂交，使得其间的或邻近的片段不参与杂交事件(例如环状结构或发夹结构)。优选本发明的化合物的寡核苷酸部分与靶核酸内的靶区域具有至少70％的序列互补性，更优选具有85％或90％的序列互补性，更加优选与靶核酸序列内它们靶定的靶区域具有95％的序列互补性。例如，本发明的化合物，其中化合物的20个核碱基中18个与靶区域互补，因此将特异性杂交，并代表了90％的互补性。在该例子中，剩余的非互补的核碱基可以与互补的核碱基成簇或分散，不必须彼此连续或与互补的核碱基相连。这样，长度为18个核碱基的化合物，含有的4个非互补核碱基的侧翼为两个与靶核酸完全互补的区域，该化合物将与靶核酸具有77.8％的总体互补性，因此落入本发明的范围内。化合物与靶核酸的区域的百分互补性常规使用本技术领域已知的BLAST程序(基本本地比对搜索工具)和PowerBLAST程序来确定(Altschul等，J.Mol.Biol.，1990，215：403-410；Zhang等，Genome Res.，1997，7：649-656)。对于本发明的具有羟基核碱基和/或合成的类似物(例如其它合成的核碱基)的化合物来说，互补性可以通过合成的类似物对具体的靶核酸的核碱基的特异性来估算。

尽管反义化合物的优选形式是单链反义寡核苷酸，但在许多类型中，引入双链结构例如双链RNA(dsRNA)分子，已经显示出诱导了基因或其相关基因产物功能的有力和特异的反义介导的降低。这种现象在植物和动物中都发生，据认为与病毒防御和转座子沉默具有进化上的关联。

dsRNA可以在动物中引起基因沉默的第一个证据来自于1995年在线虫秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中的工作(Guo等，Cell，1995，81：611-620)。Montgomery等已经表明dsRNA的主要干扰作用是转录后的(Montgomery等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95：15502-15507)。在秀丽隐杆线虫中确定的转录后反义机制是由暴露于双链RNA(dsRNA)引起的，此后被命名为RNA干扰(RNAi)。该术语已经被广义化，意指涉及引入dsRNA导致内源的靶mRNA水平的序列特异性降低的反义介导的基因沉默(Fire等，Nature，1998，391：806-811)。最近，已经显示出实际上dsRNAs的反义极性的单链RNA寡聚体才是RNAi的有效诱导物(Tijsterman等，Science，2002，295：694-697)。

配制

本发明的化合物也可以与其它的分子、分子结构或化合物的混合物混合、包囊、结合或以其他方式相关联，成为例如脂质体、载体、稀释剂、受体定向分子、口服、直肠、局部或其它制剂，帮助摄入、分布和/或吸收。传授了这样的摄入、分布和/或吸收辅助制剂的制备的代表性美国专利包括但不限于U.S.：5,108,921、5,354,844、5,416,016、5,459,127、5,521,291、5,543,158、5,547,932、5,583,020、5,591,721、4,426,330、4,534,899、5,013,556、5,108,921、5,213,804、5,227,170、5,264,221、5,356,633、5,395,619、5,416,016、5,417,978、5,462,854、5,469,854、5,512,295、5,527,528、5,534,259、5,543,152、5,556,948、5,580,575和5,595,756，每个专利在此引为参考。

本发明的反义化合物涵盖了任何可药用的盐、酯、或这些酯的盐或任何其它化合物，其在给动物包括人类施用后能够提供(直接或间接地)生物活性代谢物或其残基。因此，例如，本公开也涉及本发明化合物的前体药物和可药用盐、这些前体药物的可药用盐以及其它生物等价物。

术语“前体药物”是指治疗性药剂，它以无活性的形式制备，在身体或其细胞内通过内源的酶或其它化学物质和/或条件转变为活性形式(即药物)。具体来说，本发明的寡核苷酸的前体药物形式按照Gosselin等在1993年12月9日公布的WO 93/24510或Imbach等的WO 94/26764和U.S.5,770,713中公开的方法制备成SATE((S乙酰基-2-硫代乙基)磷酸酯)衍生物。

术语“可药用的盐”是指本发明化合物的生理上和药物上可接受的盐，即保留了母体化合物的所需生物活性并且不对其产生不需要的毒理学效果的盐。对于寡核苷酸来说，可药用的盐以及它们的应用的优选例子被进一步描述在美国专利6,287,860中，在此以其全文引用。

本发明还包括了含有本发明的反义化合物的药物组合物和制剂。本发明的药物组合物可以通过多种方式给药，这依赖于所需的是局部还是全身性治疗以及治疗的区域。给药可以是局部(包括眼部和粘膜包括阴道和直肠投药)，肺部、例如通过吸入或吹入粉末或气溶胶，包括使用喷雾器；气管内、鼻内、表皮和透皮、口服或胃肠外给药。胃肠外给药包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉注射或输注，或颅内例如鞘内或脑室内给药。具有至少一个2′-O-甲氧基乙基修饰的寡核苷酸据认为特别适用于口服给药。用于局部给药的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷物剂、液体和粉末。常规的药物载体、水性的、粉末或油状基料、增稠剂等可能是必需的或需要的。涂层的避孕套、手套等也可能有用。

可以方便地以单位剂量形式存在的本发明的药物制剂，可以按照制药工业中熟知的常规技术来制备。这样的技术包括将活性成分与药物载体或赋形剂进行结合的步骤。一般来说，通过将活性成分与液体载体或分得很细的固体载体或二者进行均匀或紧密的结合、然后如果需要的话对产品成型来制备制剂。

本发明的组合物可以配制成许多可能的剂型的任何一种，例如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物也可以配制成在水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液还可以含有增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。悬浮液也可以含有稳定剂。

本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂、泡沫和含有脂质体的制剂。本发明的药物组合物和制剂可以含有一种或多种穿透增强剂、载体、赋形剂、稀释剂或其它活性或无活性成分。

乳剂通常是一种液体以通常直径大于0.1μm的液滴形式分散在另一种液体中形成的不均质系统。乳剂除了分散相之外可以含有其它成分，以及可以作为在水相、油相中的溶液或本身作为分离的相存在的活性药物。微乳剂作为本发明的实施方案被涵盖。乳剂以及它们的应用在本技术领域中是众所周知的，并在美国专利6,287,860中被进一步描述，该专利在此以其全文引用。

本发明的制剂包括脂质体制剂。用于本发明中的术语“脂质体”是指由排列成球形双层或双层的两亲性脂类构成的介质。脂质体是单层或多层的介质，具有从亲脂性材料形成的膜和含有要投送的组合物的水性内部。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，据认为与带负电荷的DNA分子相互作用，形成稳定的复合物。对pH敏感或带负电荷的脂质体据认为是捕获DNA而不是与它复合。阳离子和非阳离子脂质体都已经被用于将DNA投送给细胞，并都可用于投送本发明的化合物。

脂质体还包括“立体稳定的”脂质体，该术语在本文中使用时是指含有一种或多种专门的脂类的脂质体，该脂类当掺入到脂质体中时，相对于缺少该专门的脂类的脂质体，将产生循环寿命增加。立体稳定的脂质体的例子是其中脂质体的一部分囊泡形成脂类部分含有一种或多种糖脂或者是用一种或多种亲水性聚合物、例如聚乙二醇(PEG)部分衍生化的脂质体。脂质体以及它们的应用在美国专利6,287,860中被进一步描述，该专利在此以其全文引用。

本发明的药物制剂和组合物也可以含有表面活性剂。在药物产品、制剂和乳剂中使用表面活性剂在本技术领域中是熟知的。表面活性剂及其应用被进一步描述在美国专利6,287,860中，该专利在此以其全文引用。

在一个实施方案中，本发明使用了各种不同的穿透增强剂来实现核酸、特别是寡核苷酸的有效投送。除了帮助非亲脂性药物跨细胞膜扩散之外，穿透增强剂还增强了亲脂性药物的透过性。穿透增强剂可以被分类归属于5个大类之一，即表面活性剂、脂肪酸、胆盐、螯合剂，以及非螯合性非表面活性剂。穿透增强剂及其应用被进一步描述在美国专利6,287,860中，该专利在此以其全文引用。

本技术领域的专业人员将会认识到，通常情况下制剂按照它们的计划应用、即给药的途径来设计。

优选的用于局部给药的制剂包括其中本发明的化合物与局部投送剂例如脂类、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的制剂。优选的脂类和脂质体包括中性的(例如二油酰磷脂酰基DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰基磷脂酰胆碱)、带负电荷的(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子的(例如二油酰四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。

对于局部或其它给药来说，本发明的化合物可以包裹在脂质体中，或可以与其、特别是阳离子脂质体形成复合物。或者，化合物可以与脂类、特别是阳离子脂类复合。优选的脂肪酸和酯、其可药用的盐以及它们的应用被进一步描述在美国专利6,287,860中，该专利在此以其全文引用。局部制剂在1999年5月20日提交的美国专利申请09/315,298中有详细描述，该申请在此以其全文引为参考。

用于口服给药的组合物和制剂包括粉末或颗粒、微颗粒、纳米颗粒、在水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、袋剂、片剂或小片剂。可能需要增稠剂、香味剂、稀释剂、乳化剂、分散辅助剂或粘合剂。优选的口服制剂是其中本发明的化合物与一种或多种穿透增强剂表面活性剂和螯合剂结合施用的制剂。优选的表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆酸和/或其盐。优选的胆酸/盐和脂肪酸以及它们的应用被进一步描述在美国专利6,287,860中，在此以其全文引用。还优选穿透增强剂的组合，例如脂肪酸/盐与胆酸/盐的组合。特别优选的组合是月桂酸、癸酸和UDCA的钠盐。其它的穿透增强剂包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚。本发明的化合物可以以颗粒的形式包括喷雾干燥的颗粒或复合形成微粒或纳米颗粒进行口服投送。复合剂以及它们的应用被进一步描述在美国专利6,287,860中，该专利在此以其全文引用。口服制剂以及它们的制备详细描述在美国专利申请09/108,673、09/315,298和10/071,822中，每个申请在此以其全文引为参考。

用于胃肠外、鞘内或脑室内给药的组合物和制剂可以包括无菌的水性溶液，其还可以包含缓冲液、稀释剂和其它适合的添加剂，例如但不限于穿透增强剂、载体化合物和其它可药用的载体或赋形剂。

本发明的某些实施方案提供了含有一种或多种本发明的化合物以及一种或多种通过非反义机制起作用的其它化疗药剂的药物组合物。这样的化疗剂的例子包括但不限于癌症化疗药物例如柔红霉素、道诺霉素、更生霉素、阿霉素、表柔比星、依达比星、依索比星、博来霉素、马磷酰胺、异环磷酰胺、胞嘧啶阿拉伯糖苷、双-氯乙亚硝脲、白消安、丝裂霉素C、放线菌素D、光辉霉素、泼尼松、羟孕酮、睾酮、它莫西芬、达卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲基三聚氰胺、五甲基三聚氰胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氦芥、甲基环己基亚硝脲、氮芥子气、美法仑、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-巯基鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氮杂胞苷、羟基脲、脱氧柯福霉素、4-羟基过氧环磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脱氧尿苷(5-FudR)、氨甲蝶呤(MTX)、秋水仙素、红豆杉醇、长春新碱、长春花碱、依托泊甙(VP-16)、三甲曲沙、伊立替康、拓扑替康、吉西他滨、替尼泊甙、顺铂和己烯雌酚(DES)。当与本发明的化合物使用时，这样的化疗药剂可以单个使用(例如5-FU和寡核苷酸)、相继使用(例如5-FU和寡核苷酸一段时间，接着是MTX和寡核苷酸)，或与一种或多种其它这样的化疗药剂组合使用(例如5-FU、MTX和寡核苷酸，或5-FU、放疗和寡核苷酸)。抗炎药，包括但不限于非甾醇抗炎药和皮质类固醇，以及抗病毒药包括但不限于利巴韦林、阿糖腺苷、阿昔洛韦和更昔洛韦，也可以与本发明的组合物组合使用。反义化合物与其它非反义药物的组合也在本发明的范围内。两种或多种组合的化合物可以一起或相继使用。

在另一个相关的实施方案中，本发明的组合物可以含有一种或多种靶定第一种核酸的反义化合物、特别是寡核苷酸，以及一种或多种靶靶定第二种核酸的另外的反义化合物。或者，本发明的组合物可以含有靶定同一个核酸靶的不同区域的两种或多种反义化合物。大量的反义化合物的例子在本技术领域中是已知的。两种或多种组合的化合物可以一起或相继使用。

用药

治疗性组合物的制剂以及它们随后的给药(用药)相信是在本技术领域的专业人员的技术范围之内，并可以通过例如剂量-反应、毒性和药代动力学研究来确定。用药取决于被治疗的疾病状态的严重性和反应性，持续几天到几个月的治疗过程，或直到达到治愈或实现疾病状态的减轻。对于只能实现减轻而不能治愈的慢性疾病状态或病症来说，用药可以无限期地继续。最适的用药方案可以根据患者体内药物积累的测量值来计算。普通专业技术人员可以容易地确定最适剂量、用药方法和重复速率。最适剂量可以根据个体寡核苷酸的相对效能而变化，一般情况下可以根据在体外和体内动物模型中被发现有效的EC₅₀来估算。一般来说，剂量为每公斤体重0.01μg到100g，可以每天、每周、每月或每年给药一次或多次，或甚至每2到20年一次。本技术领域的普通专业人员可以容易地根据在体液或组织中测量到的药物滞留时间和浓度估算重复速率。在成功治疗后，可能希望使患者经历维持治疗，以防止疾病状态的复发，其中寡核苷酸以维持性剂量给药，范围在每公斤体重0.01μg到100g，每天一次或多次到每20年一次。

本发明化合物的应用

本发明化合物可以在体外或体内用于修饰细胞的表现型，或用于限制病原体例如病毒、细菌、原生生物、支原体物种、衣原体等的增殖，或用于在肿瘤细胞或特定类型的正常或患病细胞中诱导发病。因此，可以给正遭受或处于疾病状态的生物体施用化合物。当给生物体使用时，化合物可用于治疗多种病原体引起的感染，例如产肠毒素的细菌、肺炎球菌(Pneumococci)、奈瑟菌属(Neisseria)生物体、贾第鞭毛虫属(Giardia)生物体和内阿米巴。化合物也可以用作肿瘤细胞、例如癌细胞、肉瘤细胞和淋巴瘤细胞的细胞毒性药剂或细胞生长抑制剂。化合物可用于调节免疫系统细胞的功能，例如特异性B细胞，特异性T细胞例如辅助性细胞、抑制性细胞、细胞毒性T淋巴细胞(C)和自然杀伤细胞(NK)。使用本发明的化合物调节免疫功能可用于治疗各种不同的疾病例如癌症和免疫系统疾病。

可以对化合物进行选择，以便能够通过涉及化合物的寡核苷酸与其靶序列结合的任何机制来干扰蛋白的转录或表达。这些机制可以包括干扰加工、抑制跨核膜的运输、用内切核酸酶裂解等。

化合物的寡核苷酸可以与核酸序列互补，例如编码生长因子、淋巴因子、免疫球蛋白、T细胞受体位点、MHC抗原、DNA或RNA聚合酶、抗生素抗性、多重药物抗性(mdr)、参与代谢过程例如氨基酸、核酸等的形成的基因的核酸序列。寡核苷酸可以与包含内含子或与开放阅读框架有关的侧翼序列的核酸序列互补。

本发明的化合物可用于治疗传染性疾病、癌症、自身免疫疾病和与器官移植有关的病症。在传染性疾病的治疗中，靶核酸序列包括与AIDS、CMV、疱疹、药物抗性质粒和锥虫有关的基因。在癌症治疗中，靶核酸序列可以是与癌基因、肿瘤抑制基因和相关的基因有关的DNA或RNA。此外，本发明的化合物也可以靶定与药物抗性有关的基因以及它们的基因产物。对于自身免疫疾病的治疗来说，化合物可以例如靶定与类风湿性关节炎、I型糖尿病、系统性狼疮和多发性脑硬化有关的核酸序列。

正如本文公开的那样，本发明不限于任何类型的靶基因或核苷酸序列，可用于例如任何生物体或病毒的任何基因。但是为了说明的目的，列出了下面类别的可能的靶基因：发育性基因(例如粘附分子、细胞周期蛋白激酶抑制因子、Wnt家族成员、Pax家族成员、翼状螺旋家族成员、Hox家族成员、细胞因子/淋巴因子及其受体、生长/分化因子及其受体、神经递质及其受体)；癌基因(例如ABL1-GenBank登记号No.BC 107069；BCL1-GenBank登记号No.NM 053056；BCL2-GenBank登记号No.NM 181505；BCL6-GenBank登记号No.NM138931；CBFA2-GenBank登记号No.NM 001001890；CBL-GenBank登记号No.NM 138392；CSF1R-GenBank登记号No.CH471062；ERBA-GenBank登记号No.NM 021724；ERBB-GenBank登记号No.NM138573；ERBB2-GenBank登记号No.NM 181505；ETS1-GenBank登记号No.NM 005238；ETV6-GenBank登记号No.NM 002336；FGR-GenBank登记号No.NM 153048；FLT-GenBank登记号No.NM004119；FOS-GenBank登记号No.NM 001080547；FYN-GenBank登记号No.NM 016363；HCR-GenBank登记号No.NM 003965；HRAS-GenBank登记号No.NM 007069；SOCS6-GenBank登记号No.-NM004232；KRAS-GenBank登记号No.NM 176795；LCK-GenBank登记号No.；LYN-GenBank登记号No.NM 001042771；MET-GenBank登记号No.NM 017956；MDM2-GenBank登记号No.NM 022045；MLL-GenBank登记号No.NM 012081；MYB-GenBank登记号No.NM014520；MYC-GenBank登记号No.NM 032789；MYCL1-GenBank登记号No.NM 001033082；MYCN-GenBank登记号No.NM 005378；NRAS-GenBank登记号No.NM 002524；PIM1-GenBank登记号No.；PML-GenBank登记号No.NM 002648；RET-GenBank登记号No.NM020630；SRC-GenBank登记号No.NM 016848；TAL1-GenBank登记号No.；NM 003189；TCL1-GenBank登记号No.NM 021966；TLX1-GenBank登记号No.NM 005521；以及YES-GenBank登记号No.NM006106)；肿瘤抑制基因(例如APC-GenBank登记号No.NM 000038；BRCA1-GenBank登记号No.NG 005905；BRCA2-GenBank登记号No.NM 007305；MADH4-GenBank登记号No.NM 005359；MCC-GenBank登记号No.NM 022132；NF1-GenBank登记号No.NM017940；NF2-GenBank登记号No.NM 181831；RB1-GenBank登记号No.NM 000321；TP53-GenBank登记号No.EF432550；以及WT1-GenBank登记号No.NM 024426)；酶(例如ACC合成酶和氧化酶、ACP去饱和酶和羟化酶、ADP-葡萄糖焦磷酸酶、ATP酶、醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、查耳酮合成酶、几丁质酶、环加氧酶、脱羧酶、糊精酶、DNA和RNA聚合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、粉粒结合淀粉合酶、GTP酶、解旋酶、半纤维素酶、整合酶、菊糖酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂酶、脂氧合酶、溶菌酶、胭脂氨酸合成酶、章鱼碱合成酶、果胶酯酶、过氧化物酶、磷酸酶、磷酸酯酶、磷酸化酶、植酸酶、植物生长调节剂合酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶和肽酶、普鲁蓝酶、重组酶、逆转录酶、RUBISCO、拓扑异构酶和木聚糖酶)；病原性微生物的基因(例如假单胞菌属(Pseudomonas)菌种、大肠杆菌(Escherichia coli)、疟原虫属(Plasmodium)和衣原体属(Chlamydia))；病原性病毒的基因(例如HIV、肝炎、疱疹、流感、鼻病毒、腺病毒和负链RNA病毒)；商业化的相关基因(例如抗体的基因、生长因子基因和激素基因)；动物病毒(例如FMDV-GenBank登记号No.DQ902653和FLV-GenBank登记号No.DQ531584)；植物病毒(例如PVY-GenBank登记号No.EF470241；TMV-GenBank登记号No.AB264547；以及CMV-GenBank登记号No.NC 002034)。

除了结合核酸之外，本发明的化合物还可以用于结合蛋白，包括但不限于配体、受体和/或酶，由此化合物抑制了蛋白的活性。

在本发明中，将反义化合物“靶定”特定的核酸分子可以是多步骤的过程。该过程通常以鉴定其功能将要被调节的靶核酸开始。该靶核酸可以是例如其表达与特定的紊乱或疾病状态相关的细胞基因(或从该基因转录的mRNA)，或来自感染性因子的核酸分子。

靶定过程通常还包括在靶核酸内确定至少一个靶区域、区段或位点，用于发生反义相互作用，从而产生所需的效果，例如调节表达。在本发明中，术语“区域”被定义为具有至少一种可鉴定的结构、功能或特征的靶核酸的部分。在靶核酸的区域内有区段。“区段”被定义为靶核酸内区域的较小部分或子部分。本发明中使用的“位点”被定义为靶核酸内的位置。

正如本技术领域中熟知的那样，因为翻译起始密码子通常为5′AUG(在转录的mRNA分子中；在相应的DNA分子中为5′ATG)，因此翻译起始密码子也被称为“AUG密码子”、“起始密码子”或“AUG起始密码子”。少数基因具有的翻译起始密码子的RNA序列为5′GUG、5′UUG或5′CUG，并且5′AUA、5′ACG和5′CUG已经被显示在体内有功能。因此，术语“翻译起始密码子”和“起始密码子”可以包含许多密码子序列，即使是每种情况下起始的氨基酸通常为甲硫氨酸(在真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(在原核生物中)。在本技术领域中还已知真核和原核的基因可以具有两个或多个可选的起始密码子，其中的任何一个在特定的细胞类型或组织中、或在特定的条件设置下可优选被用于翻译起始。在本发明中，“起始密码子”和“翻译起始密码子”是指在体内用于启动从编码白介素18的基因转录的mRNA的翻译的密码子，不论这样的密码子的序列如何。在本技术领域中还已知基因的翻译终止密码子(或“终止密码子”)可以具有三个序列之一，即5′UAA、5′UAG和5′UGA(相应的DNA序列分别为5′TAA、5′TAG和5′TGA)。

术语“起始密码子区”和“翻译起始密码子区”是指所述mRNA或基因中的一部分，其包含了从翻译起始密码子向任一方向(即5’或3’)的大约25到大约50个连续的核苷酸。类似地，术语“终止密码子区”和“翻译终止密码子区”是指所述mRNA或基因中的一部分，其包含了从翻译终止密码子向任一方向(即5’或3’)大约25到大约50个连续的核苷酸。因此，“起始密码子区”(或“翻译起始密码子区”)和“终止密码子区”(或“翻译终止密码子区”)是可以用本发明的反义化合物有效靶定的所有区域。

开放阅读框架(ORF)或“编码区”，在本技术领域中已知是指翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区域，也是可以被有效靶定的区域。在本发明中，优选的区域是涵盖了基因的开放阅读框架(ORF)的翻译起始或终止密码子的基因内区域。

其它的靶区域包括5′非翻译区(5′UTR)，在本技术领域中已知是指mRNA在5′方向上从翻译起始密码子开始的部分，因此包含了在mRNA的5′帽位点和翻译起始密码子之间的核苷酸(或基因上相应的核苷酸)，以及3′非翻译区(3′UTR)，在本技术领域中已知是指mRNA在3′方向上从翻译终止密码子开始的部分，因此包含了mRNA的翻译终止密码子和3′末端之间的核苷酸(或基因上相应的核苷酸)。mRNA的5′帽位点含有N7-甲基化鸟嘌呤残基，与mRNA的最靠5′-端残基通过5′-5′三磷酸酯键连接。mRNA的5′帽区域被认为包含了5′帽结构本身以及与帽位点相邻的前50个核苷酸。靶定5′帽区域也是优选的。

尽管某些真核mRNA转录本是直接翻译的，但很多含有一个或多个被称为“内含子”的区域，它们在翻译前从转录本中切除了。剩余的(因此是被翻译的)区域被称为“外显子”，它们被剪接在一起形成了连续的mRNA序列。在疾病牵涉异常剪接或疾病中涉及过量生产的特定剪接产物的情况下，靶定剪接位点，即内含子-外显子接点或外显子-内含子接点，可能是特别有用的。由于重排或缺失导致的异常的融合接点也是优选的靶位点。通过来自不同基因来源的两个(或多个)mRNA的剪接过程产生的mRNA转录本被称为“融合转录本”。已知可以使用靶定例如DNA或前mRNA的反义化合物来有效靶定内含子。

在本技术领域中已知可以从DNA的相同基因组区域产生可选的RNA转录本。这些可选的转录本一般被称为“变异体”。更具体来说，“前mRNA变异体”是从同样的基因组DNA产生的转录本，它们与从同样的基因组DNA产生的其它转录本的差别在于它们的起始或终止位置，并含有内含子和外显子序列。

在剪接过程中切除了一个或多个外显子或内含子区或其部分之后，前mRNA变异体产生了较小的“mRNA变异体”。因此，mRNA变异体是加工过的前mRNA变异体，并且作为剪接的结果，每个独特的前mRNA变异体必定总是产生独特的mRNA变异体。这些mRNA变异体也被称为“可选的剪接变异体”。如果不发生前mRNA变异体的剪接，那么前mRNA变异体与mRNA变异体相同。

在本技术领域中已知变异体可以通过使用可选的信号起始或终止转录来产生，并且前mRNA和mRNA可以具有一个以上的起始密码子或终止密码子。源于使用可选的起始密码子的前mRNA或mRNA的变异体被称为前mRNA或mRNA的“可选的起始变异体”。使用了可选的终止密码子的转录本被称为该前mRNA或mRNA的“可选的终止变异体”。一种特定类型的可选终止变异体是“聚腺苷酸变异体”，其中产生的多个转录本来自于转录机制对“聚腺苷酸终止信号”之一的可选的选择，由此产生了在独特的聚腺苷酸位点处终止的转录本。在本发明中，本文描述的变异体的类型也是优选的靶核酸。

靶核酸上与优选的反义化合物杂交的位点在后文被称为“优选的靶区段”。在本文中使用的术语“优选的靶区段”被定义为至少是活性反义化合物靶定的靶区域的5-核碱基部分。尽管不希望被理论束缚，但目前认为这些靶区段代表了靶核酸中允许杂交的部分。

尽管在本文中提出了某些优选靶区段的具体序列，但本技术领域的专业人员将会认识到，它们用于在本发明的范围内说明和描述具体的实施方案。其它优选的靶区段可以由普通的专业技术人员来鉴定。

长度为5-150个核碱基的靶区段，含有选自说明性的优选靶区段内的至少5个连续核碱基的一段序列，也被认为适合用作靶。

靶区段可以包含的DNA或RNA所含有的至少5个连续核碱基来自说明性的优选靶区段之一的5’末端(其余的核碱基是同样的DNA或RNA中连续的一段，从紧接靶区段的5’末端上游开始直到DNA或RNA含有大约5到大约150个核碱基为止)。同样优选的靶区段由含有来自说明性优选靶区段之一的3’末端的至少5个连续核碱基的DNA或RNA代表(其余的核碱基是同样的DNA或RNA的连续一段，从紧接靶区段3’末端的下游开始直到DNA或RNA含有大约5到大约150个核碱基为止)。本技术领域的专业人员在本文说明的优选靶区段的指导下，能够无需过多的实验就鉴定其它优选的靶区段。

一旦鉴定到一个或多个靶区域、区段或位点后，就合成与靶充分互补、即足够好并具有足够特异性的杂交以给出所需的效果的反义化合物，并掺入至少一个与靶区域、区段或位点的序列中的核碱基互补的羟基核碱基，并进一步掺入本文描述的螯合部分。然后将反义化合物与金属离子接触，使离子与化合物复合。该产生的化合物然后可用于反义疗法机制中。

试剂盒和诊断工具

本发明的化合物可用于诊断、治疗、预防和作为研究试剂和试剂盒。此外，能够以极高的特异性抑制基因表达的反义寡核苷酸，通常被专业技术人员用于阐述特定基因的功能或用于辨别生物途径的各个成员的功能。

对于试剂盒和诊断应用来说，本发明的化合物可以单独地或与其它化合物或治疗方法组合，作为工具用在差异和/或组合分析中以说明细胞或组织中表达的基因的部分或全部互补链的表达模式。

作为一个非限制性的例子，将用一种或多种反义化合物处理的细胞或组织中的表达模式与没有用反义化合物处理的对照细胞或组织进行比较，并分析产生的模式中基因表达水平的差异，以将它们与例如所研究的基因的疾病相关性、信号传导途径、细胞定位、表达水平、大小、结构或功能相统属。这些分析可以在被刺激的或未刺激的细胞上进行，在存在或不存在影响表达模式的其它化合物的情况下进行。

在本技术领域中已知的基因表达分析方法的例子包括DNA阵列或微阵列(Brazma和Vilo，FEBS Lett.，2000，480：17-24；Celis等，FEBSLett.，2000，480：2-16)、SAGE(基因表达的连续分析)(Madden等，Drug Discov.Today，2000，5：415-425)、READS(消化的cDNAs的限制性酶扩增)(Prashar和Weissman，Methods Enzymol.，1999，303：258-72)、TOGA(总基因表达分析)(Sutcliffe等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，97：1976-81)、蛋白阵列和蛋白质组学(Celis等，FEBS Lett.，2000，480：2-16；Jungblut等，Electrophoresis，1999，20：2100-10)、表达序列标签(EST)测序(Celis等，FEBS Lett.，2000，480：2-16；Larsson等，J.Biotechnol.，2000，80：143-57)、差减RNA指纹(SuRF)(Fuchs等，Anal.Biochem.，2000，286：91-98；Larson等，Cytometry，2000，41：203-208)、差减克隆、差异显示(DD)(Jurecic和Belmont，Curr.Opin.Microbiol.，2000，3：316-21)、比较基因组杂交(Carulli等，J.Cell Biochem.Suppl.，1998，31：286-96)、FISH(荧光原位杂交)技术(Going等Gusterson，Eur.J.Cancer，1999，35：1895-904)和质谱方法(To，Comb.Chem.High Throughput Screen，2000，3：235-41)。

反义的特异性和灵敏性也被本技术领域的专业人员用于治疗性应用。反义化合物已经在动物包括人类中的疾病状态治疗中被用作治疗性部分。反义寡核苷酸药物，包括核酶，已经被安全有效地用于人类，有大量的临床试验目前正在进行中。因此确立了反义化合物可以是有用的治疗模式，它们可以被构造成可用于治疗方案中，以治疗细胞、组织和动物，特别是人类。

对于治疗来说，怀疑患有可以通过调节靶核酸的表达进行治疗的疾病或病患的对象，优选为人类，可以通过施用本发明的反义化合物来治疗。例如，在一个非限制性的实施方案中，方法包括了给需要治疗的对象施用治疗有效量的反义化合物的步骤。本发明的化合物可以通过将有效量的化合物加入到适合的可药用稀释剂或载体中来用于药物组合物中。本发明的化合物和方法的使用也可以是在预防上有用的。

参考下面的实施例，本公开的其它方面和详细情况将变得更加明显，这些实施例的目的是说明性的而不是限制性的。

实施例

合成带有修饰核苷酸的寡核苷酸

GCAGCCAAAACGTCCN(SEQ ID NO：1)或CCTTCGN(N＝5-OH dC)(SEQ ID NO：5)的合成

使用与合成5-羟基胞苷5′-二磷酸所述类似的过程合成5-羟基-2′-脱氧胞苷5′-三磷酸。将25mg(45μmol)dCTP(作为钠盐)溶解在200μl水中，然后冷却到4℃。将溴在剧烈混合下缓慢加入到dCTP溶液中，直到出现持续的黄色。为了除去过量的溴，振荡下加入7μl环己烯，然后加入0.1ml 2，4，6-三甲基吡啶。将乳浊液在37℃温育大约2小时，然后用乙醚(4 x 0.5ml)抽提。将水层在真空下蒸发，重新溶解在水中，并上样于DEAE-Sephadex A-25柱(大约80ml，HCO₃ ^-形式)。使用pH 7.5-8的三乙基碳酸氢铵(TEAB)的线性梯度(5mM到0.8M)，将含有三磷酸的级份从柱子上洗脱下来。将含有核苷三磷酸混合物的级份合并，用50％乙醇蒸发几次以除去TEAB。首先使用在pH 7.5的20mM Tris-HCl缓冲液中从5mM to 0.7M的NaCl线性梯度，以及最后使用pH 3.5的从5mM到0.7M的磷酸钠缓冲液线性梯度，在MonoQ柱上将5-OHdCTP进一步纯化两次。收集5-OHdCTP的峰，用水稀释，并重新上样于DEAE sephadex A-25柱(2.5ml，HCO₃ ^-形式)。将柱子用0.1M碳酸氢铵清洗以除去盐，然后用0.6M的碳酸氢铵洗脱5-OHdCTP。通过用50％乙醇重复地蒸发来除去碳酸氢铵。5-OHdCTP的产率为大约25-30％。摩尔吸收率[ε＝7700(X，＝292nm)](15)被用于计算5-OHdCTP的量。

以修改过的以前描述的方法制备含有单个内部5-OhdC的寡核苷酸。将1到2.5nmol的GCAGCCAAAACGTCC(SEQ ID NO：2)或CCTTCG(SEQ ID NO：3)在65μl缓冲液中于30℃温育30分钟，该缓冲液含有100mM二甲胂酸钠pH 7.0、1mM CoCl₂、0.1mM EDTA、50μg/ml BSA、0.1mM DTT、101μM 5-OHdCTP和100单位的末端脱氧核苷基转移酶。然后将从3′-末端以单个5-OHdCMP延伸的寡核苷酸，在Partisphere SAX柱子(0.4 x 12.5cm，Whatman)上使用含有25％乙腈的pH 6.3的磷酸钠缓冲液的线性梯度(在60分钟内从5mM到0.5M)进行HPLC纯化。使用NEP-5柱(Pharmacia)对纯化的延伸的寡核苷酸GCAGCCAAAACGTCCN(SEQ ID NO：4)或CCTTCGN(SEQ ID NO：5)(N＝5-OhdC或5-OhdU)进行脱盐。

合成稀土金属复合物以及它们与寡核苷酸的结合物

材料

环拉胺(cyclam，Aldrich，98％)，4-氯甲基苯甲酸(Aldrich，95％)，三氟乙基乙酸(Aldrich，99％)，N-羟基琥珀酰亚胺(Aldrich，97％)，1-(3-二甲基氨基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(Sigma，蛋白测序级)，三氟甲磺酸铕(Aldrich，98％)，三氟甲磺酸镧(Aldrich，99.999％)，粒度为60-200μm孔径为4nm的硅胶(Acros Organics，USA)，粒度为40-125μm容量为3-4meq/g的Sephadex G-25(Sigma-Aldrich)。

合成4-(1，4，8，11-四氮杂环十四-1-基甲基)-苯甲酸

在溶解在乙醇：水混合物(体积比为5：1)中的环拉胺(0.913g，4.5mmol)溶液(18ml)中，加入溶解在水性LiOH(53mg在4ml水)中的4-氯甲基苯甲酸(0.157g，0.92mmol)溶液。然后将混合物搅拌并剧烈回流5小时。然后减压除去溶剂，将残余物溶解在13ml水中。然后将获得的水溶液用氯仿抽提(10次，每次3ml)，并在减压下将水层浓缩到2ml。通过加入浓盐酸和乙醇溶液将产物沉淀为白色固体，并通过重结晶从乙醇/水/HCl中纯化，产生0.205g标题化合物。根据LC-MS，4-(1，4，8，11-四氮杂环十四-1-基甲基)-苯甲酸盐酸盐的分析大于95％。

合成4-(4，8，11-Tris-(2，2，2-三氟乙酰基)-1，4，8，11-四氮杂环十四-1- 基甲基)-苯甲酸

在用氩气吹扫的双颈圆底烧瓶中相继加入4-(1，4，8，11-四氮杂环十四-1-基甲基)-苯甲酸(90mg，0.24mmol)、无水甲醇(1ml)、无水三乙胺(0.5ml)和三氟乙酸乙酯(1.7ml)。所有下面的步骤都在氩气氛下进行。将混合物搅拌60小时。在减压除去溶剂后，将残余物收集到无水四氢呋喃(5ml)中。将THF溶液过滤，在减压下除去溶剂。将残余物在真空中干燥4小时，产生0.54g油状化合物。MS m/z 623.5M[C₂₄H₂₇F₉N₄O₅]+1。

合成4-(4，8，11-Tris-(2，2，2-三氟乙酰基)-1，4，8，11-四氮杂环十四-1- 基甲基)-苯甲酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯

含有4-(4，8，11-Tris-(2，2，2-三氟乙酰基)-1，4，8，11-四氮杂环十四-1-基甲基)-苯甲酸(0.54g)的烧瓶用氩气吹扫，并相继加入无水THF(1.2ml)、N-羟基琥珀酰亚胺(28mg，0.24mmol)和1-(3-二甲基氨基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(51.6mg，0.27mmol)。将该混合物在氩气下于室温搅拌60小时。然后减压除去溶剂，将残余物溶解在最小量的氯仿中，并通过硅胶柱。产物用氯仿:甲醇(50:1)洗脱。在用旋转蒸发器浓缩和真空干燥后，收集的4-(4，8，11-Tris-(2，2，2-三氟乙酰基)-1，4，8，11-四氮杂环十四-1-基甲基)-苯甲酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯为白色的固体物质，产量为70mg。产物的LC-MS光谱证实了主要级份的质量为721[M(C₂₈H₃₀F₉N₅O₇)+1]，给出了质量为623的片段[(M-C₂F₃O)+1]。

检测的次要级份(～1％)为：

MS m/z 855.7[M(C₃₈H₄₀F₆N₆O₁₀)+1]

制造4-(4，8，11-Tris-(2，2，2-三氟乙酰基)-1，4，8，11-四氮杂环十四-1- 基甲基)-苯甲酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯的La和Eu复合物的一般程序

将等摩尔(～20μmol)的4-(4，8，11-Tris-(2，2，2-三氟乙酰基)-1，4，8，11-四氮杂环十四-1-基甲基)-苯甲酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯与三氟甲磺酸镧La(CF₃SO₃)₃或Eu(CF₃SO₃)₃在无水乙醇(2ml)中的混合物，在氩气氛下于室温搅拌22小时。然后减压除去溶剂，将残余物用乙腈(0.5ml)收集。加入乙醚(0.7ml)后，将混合物在冷冻器中保持48小时，过滤，然后在真空下干燥，产生淡黄色固体的4-(4，8，11-Tris-(2，2，2-三氟乙酰基)-1，4，8，11-四氮杂环十四-1-基甲基)-苯甲酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯的La和Eu复合物。

其它配体的合成可以使用已知的合成技术来制备。参见例如美国专利No.6,984,734、6,127,121和5,684,149，每个专利在此以其全文引为参考。

4-(4，8，11-Tris-(2，2，2-三氟乙酰基)-1，4，8，11-四氮杂环十四-1-基甲 基)-苯甲酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯的La和Eu复合物与寡核苷酸的结 合

合成了两种不同修饰的20mer寡核苷酸：5’-CTT CTG GCC GTTTAC GTC GN-3’(N＝5-OH-C或C)(SEQ ID NO：6)。

将每种寡核苷酸大约10nmol溶解在300μL 200mM的NaHCO₃溶液中。然后将获得的溶液加入到四氮杂大环的镧系元素复合物(0.64mg)在二噁烷(200μL)的溶液中。将获得的混合物在室温剧烈搅拌3小时。然后将混合物通过装配在磷酸盐缓冲液(pH 6.86)中的SephadexG-25柱子(1.5 x 5.5cm)。产物用同样的磷酸盐缓冲液洗脱，收集总共15毫升提取物中的最后13毫升，在室温下将体积真空减小到大约0.5ml。

体外活性测量

镧和铕复合的化合物的活性通过将靶核酸(例如5’-GCG ACGTAA ACG GCC AGA AG-3’(SEQ ID NO：7))的溶液与每种复合的化合物在模拟人类生理条件(例如温度和盐条件)的条件下进行混合来测量。将化合物和靶核酸混合并使其相互作用。从混合物取出等份试样并分析靶核酸的存在或降解。计算靶核酸的量。靶核酸的降解速度与镧和铕复合的化合物的核酸酶活性直接相关。

掺有羟基-核酸的寡核苷酸5’-CTT CTN NCC NTT TAC NTC NC-3’(N＝G或8-OHG)(SEQ ID NO：8)的稳定性

使用T4多核苷酸激酶将一系列寡核苷酸在多核苷酸链的5’-末端用³⁵S-αATP进行标记。使用Pharmacia PD10凝胶过滤柱将标记的寡核苷酸纯化并与游离的标记³⁵S-αATP分离。寡核苷酸的比活性在0.05-0.2μCi/μg寡核苷酸之间。

将标记的寡核苷酸(1-10nM)在pH7.5的5mM HEPES缓冲液中温育，缓冲液含有100nM KCl和80％胎牛血清，在37℃温度下温育指定的时间。在指定的时间间隔从反应混合物中取出等份试样，用含有0.05％溴酚蓝、0.05％二甲苯青、7M尿素和0.5x TBE缓冲液的上样染料稀释5倍。降解的寡核苷酸使用20％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。从凝胶中切出条带，使用Wallac微型β闪烁计数器对放射活性进行计数。

使用的方案描述在Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook，J.的《分子克隆：实验室手册》中(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.1082。

结果证实了在寡核苷酸中掺入羟基核碱基的稳定性截然不同(图1)。图1中的图注对应于天然寡聚体(SEQ ID NO：8，其中所有的N是G)和具有一个(1-修饰；5’-CTT CTN GCC GTT TAC GTC GC-3’；SEQ ID NO：9；N＝8-OH G)、两个(2-修饰；5’-CTT CTN GCC NTTTAC GTC GC-3’；SEQ ID NO：10；N＝8-OH G)和三个(3-修饰；5’-CTTCTN GCC NTT TAC GTC NC-3’；SEQ ID NO：11；N＝8-OH G)的寡聚物。

牢固结合的互变异构体的存在略微增加了相应的核酸双链体的熔解温度。其中所有的N是G的SEQ ID NO：8正常双链体的熔解温度测量为67±2℃。相反，具有两个8-羟基鸟嘌呤取代(SEQ ID NO：10)的同样的寡聚体的熔解温度是71±2℃。

使用掺入了8-羟基鸟嘌呤的寡核苷酸进行RNA降解

制备了³⁵S标记的和未标记的、编码增强绿色荧光蛋白(eGFP)的正义和反义RNA，用于RNA降解的体外监测。eGFP被克隆到pCR3.1表达载体中，在两个方向：正义和反义方向上置于T7RNA聚合酶启动子的控制之下。使用T7 RNA聚合酶³⁵S-标记的核糖核苷三磷酸，采用标准方法在体外合成正义和反义的cGPF RNA。为了进行本分析，将等量的³⁵S标记的RNA与不同浓度的与eGFP互补的寡核苷酸温育。寡核苷酸有零个(SEQ ID NO：8)或一个掺入的8-羟基鸟嘌呤(SEQ ID NO：9)。将天然的和修饰的寡核苷酸都与已知具有核糖核酸酶活性的镧系元素复合。将RNA与寡核苷酸在37℃保温1小时。然后在1％琼脂糖凝胶电泳上分析RNA。凝胶通过放射自显影可视化，切下RNA条带、水解、并用Wallac闪烁计数器计数。定量的结果显示在图2中，描绘了仍然残留的未降解的RNA的量。图2中的1和3柱显示了将eGFPRNA与分别掺有10μM和5μM 8-羟基鸟嘌呤的寡核苷酸-镧系元素复合物温育的结果。图2的2和4柱显示将eGFP RNA与分别含有10μM和5μM天然鸟嘌呤的寡核苷酸-镧系元素复合物温育的结果。图2的5和6柱呈现了没有加入寡核苷酸-镧系元素复合物的对照实验。这些实验的结果清楚地显示出，具有一个修饰的寡核苷酸与靶eGFP RNA形成了更稳定的复合物，并增加了它的降解(较之1和2柱与3和4柱)。在5μM时，含有单个8-羟基鸟嘌呤修饰的寡核苷酸-镧系元素复合物显示出了核酸酶活性，而含有天然鸟嘌呤的寡核苷酸-镧系元素复合物实际上没有显示出核酸酶活性。

镧系元素-寡核苷酸复合物引起的RNA降解的分析。eGFP RNA与正常的或修饰的20个核苷酸长的与eGFP互补的寡核苷酸一起温育。温育在37℃进行1小时。在该实验中，使用了未标记的RNA，结果使用1％琼脂糖凝胶通过电泳进行分析。通过溴化乙锭染色使凝胶上的RNA可视化。

图3显示了该实验的结果。上方的凝胶显示了与未修饰的寡核苷酸-镧系元素复合物(1，4，8，11-四氮杂环十四基铕与SEQ ID NO：8的复合物)保温后eGFP RNA的降解，下方的凝胶是修饰的寡核苷酸-镧系元素复合物(1，4，8，11-四氮杂环十四基铕与SEQ ID NO：9的复合物)，其中寡核苷酸具有单个变为羟基核碱基的修饰。上方和下方凝胶上的道如下：1.分子量和核酸大小标记物；2.10μM的寡核苷酸-镧系元素复合物；3.10μM的寡核苷酸-镧系元素复合物；4.5μM的寡核苷酸-镧系元素复合物；5.5μM的寡核苷酸-镧系元素复合物；6.对照(正义RNA)；7.对照(反义RNA)。

图3中显示的结果表明，具有修饰的寡核苷酸在与镧系元素的复合物中更稳定和有活性。

引用的文献

所有这里列出的文档以其传授的材料、方法和程序引为参考。

美国专利文献

Cook等，“Substituted purines and oligonucleotide cross-linking”(取代的嘌呤和寡核苷酸交联)美国专利No.6,232,463，2001年5月15日。

Froehler等，“Enhanced triple-helix and double-helix formationdirected by oligonucleotides containing modified pyrimidines”(含有修饰的嘧啶的寡核苷酸指导的增强三螺旋和双螺旋形成)美国专利No.6,235,887；2001年5月22日。

Iyer，“Reagents and process for synthesis of oligonucleotidescontaining phosphorodithioate internucleoside linkages”(合成含有核苷间二硫代磷酸酯键的寡核苷酸的试剂和方法)美国专利No.6,117,992；2000年9月12日。

Meyer，Jr.等，“Oligonucleotides containingpyrazolo[3，4-D]pyrimidines for hybridization and mismatchdiscrimination”(含有吡唑[3，4-D]嘧啶的寡核苷酸用于杂交和错配鉴别)美国专利No.6,127,121；2000年10月3日。

Morrow，“Metal complexes for promoting catalytic cleavage of RNAby transesterification”(通过转酯作用促进RNA的催化裂解的金属复合物)美国专利No.5,684,149；1997年11月4日。

Short，“Modified nucleotides and methods useful for nucleic acidsequencing”(可用于核酸测序的修饰的核苷酸和方法)美国专利No.6,579,704，2003年6月17日。

Switzer，“Antisense oligonucleotide containing compositions andmethod of forming duplexes”(含有反义寡核苷酸的组合物以及形成双链体的方法)美国专利No.6,031,086，2000年2月29日。

Haner等，“Functional terpyridine-metal complexes，a process for thepreparation thereof and oligonucleotide conjugates with terpyridine-metalcomplexes”(功能性三嘧啶-金属复合物、其制备方法以及寡核苷酸与三嘧啶-金属复合物的结合物)美国专利No.5,925,744，1999年7月20日。

Switzer，“Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkylpyrimidine nucleotides”(含有5-氨基烷基嘧啶核苷酸的反义寡核苷酸)美国专利No.5,596,091，1997年1月21日。

Wang等，“Sugar modified nucleosides and oligonucleotides”(糖修饰的核苷和寡核苷酸)美国专利No.5,681,940；1997年10月28日。

其它出版物

Baker B.F.等，Oligonucleotide-europium complex conjugatedesigned to cleave the 5′cap structure of the ICAM-1 transcriptpotentiates antisense activity in cells，(被设计用于裂解ICAM-1转录本的5′-帽结构的寡核苷酸-铕复合结合物增强了细胞中的反义活性)Nucl.Acid Res.，1999，27：1547-1551.

Bing Zhua等，Binuclear lanthanide complexes as catalysts for thehydrolysis of double-stranded DNA，(双核镧系元素复合物作为水解双链DNA的催化剂)Inorg.Chem.Communs.，1999，2：351-353.

Canaple，L.等，Artificial Ribonucleases：Efficient and Specific inVitro Cleavage of Human c-raf-1 RNA，(人工核糖核酸酶：在体外有效和特异性裂解人类c-raf-1 RNA)Bioconjugate Chem.2002，13：945-951.

Crooke ST.Progress in antisense therapeutics.(反义疗法的进展)Med.Res.Rev.1996；16：319-344.

Crooke，S.T.和Lebleu，B.“Antisense Research and Applications”，(反义研究与应用)CRC Press(1993).

Hegg E.L；Burstyn，J.L；Toward the development of metal-basedsynthetic nucleases and peptidases：a rationale and progress report inapplying the principles of coordination chemistry，(开发基于金属的合成的核酸酶和肽酶：在配位化学原理的应用中的理论基础和进展报告)Coord.Chem.Revs.1998，173：133-165.

Hall，J；Hüsken D；Pieles，U.，Moser，H.E.；，R，Efficientsequence-specific cleavage of RNA using novel europium complexesconjugated to oligonucleotides”，(使用与寡核苷酸结合的新的铕复合物对RNA进行有效的序列特异性裂解)Chemistry & Biology，1994，1：185-190.

Hall J.；Husken D.；Haner R.，Sequence-specific cleavage of RNAusing macrocyclic lanthanide complexes conjugated to oligonucleotides：Astructure activity study，(使用与寡核苷酸结合的大环镧系元素复合物进行RNA的序列特异性裂解：结构活性研究)Nucleosides &Nucleotides，1997，16：1357-1368.

Hall J.；Husken D.；Haner R.，Towards artificial ribonucleases：Thesequence-specific cleavage of RNA in a duplex，(关于人工核糖核酸酶：在双链体中进行RNA的序列特异性裂解)Nucl.Acid Res.，1996，24：3522-3526.

 R.；Hall J.，The sequence-specific cleavage of RNA byartificial chemical ribonucleases.(使用人工化学核糖核酸酶对RNA进行序列特异性裂解)Antisense and nucleic acid drug development，1997，7：423-430.

 R.；Hüsken D.；Hall J.，Development of ArtificialRibonucleases Using Macrocyclic Lanthanide Complexes，(使用大环镧系元素复合物发展人工核糖核酸酶)Chimia 2000，54：569-573.

Karelson，M.；Lomaka，A.Quantum-Chemical Modelling of theTautomeric Equilibria of Modified Anionic Nucleic Acid Bases，(修饰的阴离子核酸碱基的互变异构体平衡的量子化学模拟)ARKIVOC，2001，3，51-62.

Komiyama，M.，Sequence-specific and hydrolytic scission of DNAand RNA by lanthanide complex-oligoDNA hybrids，(通过镧系元素复合物-寡聚DNA杂合体进行DNA和RNA的序列特异性的水解剪切)J.Biochem.，1995，118：665-670.

Komiyama，M.Sumaoka，J.，Progress towards synthetic enzymes forphosphoester hydrolysis，(在合成用于磷酸酯水解的酶方面的进展)Current Opinion in Chemical Biology，1998，2：751-757.

Kuzuya，A.等，Conjugation of Various Acridines to DNA forSite-Selective RNA Scission by Lanthanide Ion，(将各种不同的吖啶与DNA结合用于通过镧系元素离子进行位点选择性的RNA剪切)Bioconjugate Chem.2002，13：365-366.

Kuzuya A.；Mizoguchi R.；Sasayama T.；Zhou J.M.；Komiyama M.，Selective activation of two sites in RNA by acridine-bearingoligonucleotides for clipping of designated RNA fragments，(通过带有吖啶的寡核苷酸在RNA中选择性活化两个位点用于切下指定的RNA片段)J.Am.Chem.Soc.，2004，126：1430-1436.

Magda，D.，Metal Complex Conjugates of Antisense DNA WhichDisplay Ribozyme-Like Activity，(显示出类似核酶活性的反义DNA的金属复合结合物)J.Am.Chem.Soc.1997，119：6947-6948.

Morrow，J.R.，Artificial Ribonucleases，(人工核糖核酸酶)Adv.Inorg.Biochem.，1994，9：41-74.

Mesmaekar，A.D.；Haner，R.；Martin，P.；Moser，E.H..Antisenseoligonucleotides，(反义寡核苷酸)Acc.Chem.Res.1995，28：366-374.

Shigekawa等，Extended x-ray absorption fine structure study on thecerium(IV)-induced DNA hydrolysis：Implication to the roles of 4 forbitals in the catalysis，(对铈(IV)诱导的DNA水解的扩伸的x-射线吸收精细结构研究：4f轨道在催化中作用的意义)Appl.Phys.Lett.1999，74：460-462.

Stein，C.A.；The experimental use of antisense oligonucleotides：aguide for the perplexed.(反义寡核苷酸的实验应用：疑难解答)J.Clin.Invest.2001，108，641-644.

Suen，W.；Spiro，T.G.；Sowers，L.；和Fresco，J.R.Identification byUV resonance Raman spectroscopy of an imino tautomer of 5-hydroxy-2′-deoxycytidine，a powerful base analog transition mutagen with a muchhigher unfavored tautomer frequency than that of thenatural residue2′-deoxycytidine.(通过紫外共振拉曼光谱鉴定5-羟基-2′-脱氧胞苷的亚氨基互变异构体，一种比天然的残基2′-脱氧胞苷具有高得多的不利的互变异构体频率的强有力的碱基类似物转变诱变剂)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96：4500-4505.

Trawick，BN；Daniher，AT；Bashkin，JK，Inorganic Mimics ofRibonucleases and Ribozymes：From Random Cleavage toSequence-Specific Chemistry to Catalytic Antisense Drugs，(核糖核酸酶和核酶的无机模拟物：从随机裂解到序列特异性化学到催化性反义药物)Chem.Rev.1998，98：939-960.

Uhlmann，E.；Peyman，A：Antisense oligonucleotides：A newtherapeutic principle.(反义寡核苷酸：新的治疗原理)ChemicalReviews 1990，90：543-584.

Wallace S.S.，Biological consequences of free radical-damaged DNAbases，(自由基破坏的DNA碱基的生物学后果)Free Radical Biologyand Medicine，2002，33：1-14.

Williams，N.H.et al.，Structure and Nuclease Activity of SimpleDinuclear Metal Complexes：Quantitative Dissection of the Role of MetalIons，(简单的双核金属复合物的结构和核酸酶活性：金属离子功能的定量剖析)Acc.Chem.Res.1999，32：485-493.

序列表

<110>波罗的科技发展有限公司

<120>牢固结合的碱基-修饰的寡核苷酸和人工核酸酶组合的反义药剂

<130>SCT084651-00

<150>US 60/797,448

<151>2006-05-03

<160>11

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>16

<212>DNA

<213>Artificial sequence

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<223>Synthetic primer

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<221>misc_feature

<222>(16)..(16)

<223>n＝5-hydroxycytosine

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<212>DNA

<213>Artificial sequence

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<212>DNA

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<223>Synthetic primer

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<212>DNA

<213>Artificial sequence

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<223>Synthetic primer

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<222>(16)..(16)

<223>n＝5＝hydroxycytosine or 5-hydroxyuracil

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<223>n＝5-hydroxycytosine or cytosine

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<222>(6)..(6)

<223>n＝7，8-dihydro-8-oxoguanine

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<222>(7)..(7)

<223>n＝7，8-dihydro-8-oxoguanine

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<223>n＝7，8-dihydro-8-oxoguanine

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<221>misc_feature

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<223>n＝7，8-dihydro-8-oxoguanine

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<223>n＝7，8-dihydro-8-oxoguanine

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<223>Synthetic primer

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<223>n＝7，8-dihydro-8-oxoguaunine

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<223>n＝7，8-dihydro-8-oxoguaunine

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<223>n＝7，8-dihydro-8-oxoguanine

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<223>n＝7，8-dihydro-8-oxoguanine

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<223>n＝7，8-dihydro-8-oxoguanine

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Claims (37)

1.包含具有5到150个核碱基的寡核苷酸和与该寡核苷酸连接的螯合部分的化合物，其中所述核碱基的至少一个是选自5-巯基胞嘧啶、5-巯基尿嘧啶、8-巯基鸟嘌呤、8-巯基腺嘌呤、5-羟基胞嘧啶、5-羟基尿嘧啶、8-羟基腺嘌呤和8-羟基鸟嘌呤的修饰的核碱基。

2.权利要求1的化合物，其中修饰的核碱基是羟基核碱基，并选自5-羟基胞嘧啶、5-羟基尿嘧啶、8-羟基腺嘌呤和8-羟基鸟嘌呤。

3.权利要求1的化合物，其含有10到100个核碱基。

4.权利要求1的化合物，其含有10到50个核碱基。

5.权利要求1的化合物，其含有20到30个核碱基。

6.权利要求1-5任一项的化合物，其中至少两个核碱基是羟基核碱基。

7.权利要求1-5任一项的化合物，其中10％到20％的核碱基是羟基核碱基。

8.权利要求1-7任一项的化合物，其中螯合部分具有下式：

其中R是寡核苷酸。

9.权利要求1-7任一项的化合物，其中螯合部分具有下式：

其中R是寡核苷酸；并且

其中的R³独立地选自氢、C_1-8烷烃、C_2-8烯烃、C_2-8炔烃、酰基C_1-8烷烃、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、C_1-8烷基芳基和C_1-8烷基杂芳基。

10.权利要求1-7任一项的化合物，其中螯合部分具有下式：

其中R是寡核苷酸；并且

其中R²选自C_1-8烷基、C_2-8烯烃、C_2-8炔烃、芳基、杂芳基、C_1-8烷基芳基、C_1-8烷基杂芳基和酰基C_1-8烷烃。

11.权利要求1-7任一项的化合物，其中螯合部分具有下式：

其中R是寡核苷酸；并且

其中R¹独立地选自氢、C_1-8烷烃、C_2-8烯烃、C_2-8炔烃、酰基C_1-8烷烃、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、C_1-8烷基芳基和C_1-8烷基杂芳基。

12.权利要求11的化合物，其中R¹独立地选自氢、-C(O)CF₃和-CH₂-苯基，并且其中苯基用H、OH、C(O)O杂环烷基、C(O)O烷基或烷基取代。

13.权利要求1-7任一项的化合物，其中螯合部分具有下式：

其中R是寡核苷酸；并且

其中R¹选自氢、C_1-8烷烃、C_2-8烯烃、C_2-8炔烃、酰基C_1-8烷烃、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、C_1-8烷基芳基和C_1-8烷基杂芳基。

14.权利要求1-7任一项的化合物，其中螯合部分具有下式：

其中R是寡核苷酸。

15.权利要求1-7任一项的化合物，其中的螯合部分具有下式：

其中R是寡核苷酸；并且

其中R³独立地选自氢、C_1-8烷烃、C_2-8烯烃、C_2-8炔烃、酰基C_1-8烷烃、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、C_1-8烷基芳基和C_1-8烷基杂芳基。

16.权利要求1-7任一项的化合物，其中螯合部分具有下式：

其中R是寡核苷酸。

17.权利要求1-16任一项的化合物，还含有金属离子，其中金属选自镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱和镥。

18.权利要求17的化合物，其中金属是铕或镧。

19.组合物，其含有权利要求1-18任一项的化合物和可药用的载体。

20.权利要求19的组合物，还含有投送介质。

21.权利要求20的组合物，其中投送介质含有脂质体，其中化合物包含在脂质体内。

22.抑制靶核酸翻译的方法，包括将靶核酸与权利要求1-18任一项的化合物或权利要求19-21任一项的组合物，在允许化合物与靶核酸杂交的条件下相接触，其中杂交的化合物抑制靶核酸的翻译。

23.权利要求22的方法，其中靶核酸是在生物体中。

24.权利要求23的方法，其中接触包括给生物体施用含有化合物和可药用载体的组合物。

25.权利要求23或24的方法，其中生物体是人类或动物对象。

26.权利要求23的方法，其中接触包括将化合物与含有靶核酸的生物样品进行混合。

27.权利要求22-26任一项的方法，其中杂交诱导了靶核酸的裂解。

28.权利要求1-18任一项的化合物在制造用于抑制人类或动物对象中靶核酸翻译的药物中的应用。

29.权利要求22或28的方法或应用，其中靶核酸是mRNA。

30.权利要求22-29任一项的方法，其中化合物裂解靶核酸的键。

31.权利要求25或28的方法或应用，其中人类或动物对象患有病毒感染、细菌感染、微生物感染、真菌感染或癌症。

32.在生物体中抑制核酸翻译的方法，包括：

预测或测定生物体中靶核酸的核苷酸序列；以及

给生物体施用权利要求19-21任一项的组合物，其中化合物含有核苷酸序列，其中在生物体的生理条件下，所述化合物与其在生物体中杂交的靶核酸的核苷酸序列充分互补，从而抑制核酸的翻译。

33.权利要求28-32任一项的方法或应用，其中化合物的核苷酸序列与靶核酸的核苷酸序列的全部或一部分完全互补。

34.制造在生物体的生理条件下抑制生物体的核酸翻译的化合物的方法，包括：

a)确定靶核酸的核苷酸序列；

b)合成含有与寡核苷酸连接的螯合部分的化合物，所述寡核苷酸含有与靶核酸的至少部分核苷酸序列充分互补从而允许发生杂交的核苷酸序列，其中寡核苷酸含有5到150个核碱基，并且其中寡核苷酸的至少一个核碱基是选自5-巯基胞嘧啶、5-巯基尿嘧啶、8-巯基鸟嘌呤、8-巯基腺嘌呤、5-羟基胞嘧啶、5-羟基尿嘧啶、8-羟基腺嘌呤和8-羟基鸟嘌呤的修饰核碱基；以及

c)将所述化合物与金属离子混合，所述金属选自镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱和镥。

35.权利要求34的方法，其中修饰的核碱基是羟基核碱基，并选自5-羟基胞嘧啶、5-羟基尿嘧啶、8-羟基腺嘌呤和8-羟基鸟嘌呤。

36.权利要求34或35的方法，其中螯合部分选自下式：

和

其中R是寡核苷酸，

R¹和R³独立地选自氢、C_1-8烷烃、C_2-8烯烃、C_2-8炔烃、酰基C_1-8烷烃、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、C_1-8烷基芳基和C_1-8烷基杂芳基；以及

其中R²独立地选自C_1-8烷基、C_2-8烯烃、C_2-8炔烃、芳基、杂芳基、C_1-8烷基芳基、C_1-8烷基杂芳基和酰基C_1-8烷烃。

37.权利要求34-36任一项的方法，其中所述条件包括人类生理条件。

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