CN101437950A - Pufa聚酮合酶系统及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文公开了来自细菌微生物Shewanella japonica和Shewanella olleyana的完全多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮合酶(PKS)系统，及其生物活性片段和同源物。更具体地，本发明涉及编码这种PUFA PKS系统的核酸，并涉及其包含该PUFA PKS系统的蛋白质或域，包含该PUFA PKS系统的遗传修饰生物体(植物和微生物)，和制造和使用本文所述PUFA PKS系统的方法。本发明还涉及遗传修饰植物和微生物，以及通过操作PUFA聚酮合酶(PKS)系统高效产生富含各种多不饱和脂肪酸(PUFAs)及其他生物活性分子的脂类的方法。

Description

PUFA聚酮合酶系统及其用途
发明领域
本发明涉及来自细菌微生物的多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮合酶(PKS)系统。更具体地，本发明涉及编码PUFA PKS系统的核酸，组成PUFA PKS系统的蛋白质及其域，包含这种PUFA PKS系统的遗传修饰的生物体，和制备和使用本文公开的PUFA PKS系统的方法。本发明还涉及遗传修饰的植物、微生物，以及通过操作PUFA聚酮合酶(PKS)系统高效产生富含各种多不饱和脂肪酸(PUFA)的脂质的方法。
发明背景
聚酮合酶(PKS)系统在本领域一般称作与脂肪酸合酶(FAS)系统相关的酶复合物，但它们经常被高度修饰而产生通常显示与脂肪酸几乎没有相似性的特化(specialized)产物。然而现在证明，聚酮合酶系统存在于能够从乙酰CoA和丙二酰CoA合成多不饱和脂肪酸(PUFAs)的海洋细菌和某些微藻类中。在美国专利No.6,140,486中详细描述了希瓦氏菌属(Shewanella)和另一种海洋细菌海产弧菌(Vibrio marinus)中PUFA合成的PKS途径。在美国专利6,566,583中详细描述了真核破囊壶菌目生物—Schizochytrium中PUFA合成的PKS途径。在2002年12月19日公开(相应于2002年4月16日提交的美国专利申请序列号10/124,800)的美国专利申请公开No.20020194641中，，详细描述了真核生物例如Thraustochytriales成员中PUFA合成的PKS途径，包括Schizochytrium中PUFA PKS途径的完整结构描述以及Thraustochytrium中PUFA PKS途径的鉴定，包括有关这些途径的用途的细节。美国专利申请序列号No.10/810,352(2004年3月24日提交)公开了Thraustochytrium中PUFA PKS途径的完整结构描述，以及关于使用这类系统产生二十碳五烯酸(C20:5，ω-3)(EPA)和其他PUFA的更多细节。
研究者尝试利用聚酮合酶(PKS)系统，文献中传统上将它们描述为属于三种基本类型之一，这三种类型通常是指：I型[模块性(modular)或重复性(iterative)]，II型和III型。为清楚起见，需要指出，I型模块性PKS系统以前被直接称为“模块”PKS系统，I型重复性PKS系统先前也直接称作“I型”PKS系统。II型系统的特征是多个可以分离的(separable)蛋白质，其中各个蛋白质进行截然不同的酶反应。这些酶协同工作来产生终产物，并且在生产终产物的过程中，该系统的每一个单独的酶通常有数次参与。这类系统的工作方式与在植物和细菌中发现的脂肪酸合酶(FAS)系统类似。I型重复性PKS系统与II型系统相似之处在于以重复的方式使用酶来产生最终产物。I型重复性与II型的不同之处在于，酶活性作为较大的蛋白质的域存在，而不是与可分离的蛋白相关联。该系统与在动物和真菌体内发现的I型FAS系统类似。
与II型系统相反，在I型模块性PKS系统中，每个酶域在终产物的产生过程中只使用一次。这些域存在于非常大的蛋白质中，并且在PKS蛋白质中每个反应的产物被传递给另一个域。此外，在上述PKS系统中，如果终产物中包含碳-碳双键，则它通常是反式构型。
更近些时候发现了III型系统，它属于缩合酶(condensing enzymes)的植物查耳酮合酶家族。III型PKS与I型和II型PKS系统迥然不同，在重复缩合反应中利用游离CoA底物，通常产生杂环终产物。
多不饱和脂肪酸(PUFAs)是大多数真核生物中膜脂的关键组分(Lauritzen等，Prog.Lipid Res.401(2001)；McConn等，Plant J.15，521(1998))，还是某些激素和信号分子的前体(Heller等，Drugs 55，487(1998)；Creelman等，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48，355(1997))。PUFA合成的已知途径涉及通过延长和需氧去饱和(aerobic desaturation)反应对脂肪酸合酶(FAS)由来的的饱和16:0或18:0脂肪酸(缩写“X:Y”表示包含X个碳原子和Y个双键(在PUFA中通常是顺式)的酰基；PUFA的双键位置以相对于脂肪酸链甲基碳的位置(例如ω3或ω6)表示，双键之间被系统的亚甲基隔开(Sprecher，Curr.Opin.Clin.Nutr.Metab.Care 2，135(1999)；Parker-Barnes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，8284(2000)；Shanklin等，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Nol.Biol.49，611(1998))进行加工。从乙酰CoA开始，二十二碳六烯酸(DHA)的合成需要大约30种不同的酶活性和将近70个反应，包括脂肪酸合成循环的4个重复的步骤。聚酮合酶(PKSs)执行一些与FAS相同的反应(Hopwood等，Annu.Rev.Genet.24，37(1990)；Bentley等，Annu.Rev.Microbiol.53，411(1999))，并使用相同的小蛋白(或域)，酰基载体蛋白(ACP)，作为生长中的碳链的共价结合位点。然而，在这些酶系统中，FAS中可见的还原、脱氢和还原的完整循环经常被缩减，以致于产生高度衍生化的碳链，这些碳链通常含有许多酮基和羟基基团，以及通常呈反式构型的碳-碳双键。PKS的线性产物经常被环化，形成复杂的生化物质，包括抗生素和许多其他次级产物(Hopwood等，(1990)，同上；Bentley等，(1999)，同上；Keating等，Curr.Opin.Chem.Biol.3，598(1999))。
已经报道了来自于数个海洋细菌物种，包括希瓦氏菌属某个种(Shewanella sp.)(Nichols等，Curr.Op.Biotechnol.10，240(1999)；Yazawa，Lipids 31，S(1996)；DeLong等，Appl.Environ.Microbiol.51，730(1986))的极长链的PUFA，例如二十二碳六烯酸(DHA；22:6ω3)和二十碳五烯酸(EPA；20:5ω3)。通过对来自希瓦氏菌属某个种SCRC2738株的基因组片段(作为质粒pEPA被克隆)进行分析，鉴定了5个开放阅读框(Orfs)，总共20Kb，它们是在E.coli中产生EPA的必要和充分的条件(Yazawa，(1996)，同上)。有数种预测的蛋白质域是FAS酶的同源物，而其他区域显示与已知功能的蛋白没有同源性。所述5个Orfs内的至少11个区域可以鉴定为推定的酶域(见Metz等，Science 293：290-293(2001))。当与基因数据库中的序列进行比较时，其中的7个与PKS蛋白的相关性强于与FAS蛋白的相关性。这个组包括：推定编码丙二酰CoA:ACP酰基转移酶(MAT)的域、推定编码β-酮脂酰基-ACP合酶(KS)的域、推定编码β-酮脂酰基-ACP还原酶(KR)的域、推定编码酰基转移酶(AT)的域、推定编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的域、推定编码链长度(或链引发)因子(CLF)的域、以及一个很不常见的6个ACP域的集簇(也就是，以前没有报道过在PKS或FAS序列中存在超过两个成集簇的ACP域)。很有可能的是，在希瓦氏菌中鉴定的PUFA合成的PKS途径是在广泛分布于海洋细菌中的。在Photobacterium profundum(Allen等，Appli.Environ.Microbiol.65：1710(1999))和Moritella marina(海产弧菌)(见美国专利No.6,140,486，如上，以及Tanaka等，Biotechnol.Lett.21：939(1999))中已经鉴定了与希瓦氏菌基因簇高度同源的基因。
多不饱和脂肪酸(PUFAs)被认为可用于营养、药物、工业和其他目的。目前来自自然来源和化学合成的PUFA供应不足以满足商业需要。PUFA目前的主要来源是海洋鱼类，然而鱼类储量不断下降，这可能不是一个可持续的来源。此外，重金属和毒性有机分子的污染对于海洋鱼类来源的油也是一个严重问题。来源于含油种子作物植物的植物油价格相对低廉，且没有与鱼油相关的污染问题。然而，在商业上开发的植物油中发现的PUFA通常仅限于亚油酸(十八碳，在δ9和12位置具有两个双键—18:2 Δ9，12)和亚麻酸(18:3Δ9，12，15)。在PUFA合成的常规途径中，通过一系列延长和去饱和反应对中等链长的饱和脂肪酸(脂肪酸合酶(FAS)系统的产物)进行修饰。由于从亚油酸和亚麻酸合成脂肪酸需要多种单独的去饱和酶(desaturase)和延长酶(elongase)，以产生饱和度更高的和链长更长的PUFA，因此用于表达PUFA(例如EPA和二十二碳六烯酸(DHA))的工程植物宿主细胞可能需要表达数种单独的酶以实现合成。此外，为了产生可供使用的量的所述PUFA，可能需要更多的工程操作工作，例如通过工程操作下调可竞争底物的酶，通过工程操作提高酶活性，例如通过诱变或者将酶靶定到质体细胞器。因此，从自然产生这些脂肪酸的物种获得PUFA生物合成中涉及的遗传材料，并且将所分离的材料单独或组合表达于可接受操作以供产生商业量的PUFA的异源系统中，是令人感兴趣的问题。
在海洋细菌例如希瓦氏菌和海产弧菌(见美国专利No.6,140,486，同上)中发现了PUFA PKS系统，如上面所讨论的，这为产业化生产PUFA的新方法提供了资源。然而，迄今为止已经鉴定的含有PUFA PKS系统的海洋细菌具有许多限制，这可能最终会限制其在产业化生产水平上的可用性。尤其是，尽管美国专利No.6,140,486公开了这些海洋细菌PUFA PKS系统可能用来遗传修饰植物，但是海洋细菌自然生存和生长在寒冷的海洋环境中，这些细菌的酶系统在超过22℃时不能良好地发挥功能，并且可能在低得多的温度下发挥最佳的功能。与此相对的，许多作物植物作为使用PUFAPKS系统进行遗传操作的目标很有吸引力，但其正常生长条件在超过22℃的温度，其范围可以超过40℃。因此预计，来自这些海洋细菌的PUFA PKS系统不易适用于正常生长条件下的植物表达。
具体就二十碳五烯酸(EPA)的生产而言，研究人员已尝试了通过使微生物在光合和异养培养物中生长来实现微生物生产EPA。他们还使用经典和定向遗传方法，试图增加生物体在培养条件下的生产能力。其他的研究人员试图通过引入编码各种去饱和酶和延长酶的基因在产油种子作物植物中生产EPA。
研究人员尝试使用红微藻(Monodus)、硅藻(例如Phaeodactylum)、其他微藻和真菌(例如在低温下培养的Mortierella)的培养物。然而，在所有这些情况下，生产力都较之现有的用于其他长链PUFA例如DHA的产业化微生物生产系统为低。在许多情况下，EPA主要以磷脂(PL)形式而不是甘油三酯(TAG)形式出现。因为微生物在异养生长条件下的生产能力比在光养条件下高得多，所以研究人员尝试并且已经实现了通过导入编码特异性糖转运体的基因来进行营养转换(trophic conversion)。然而，即使具有了新获得的异养能力，油的生产能力仍然相对低下。
如上文讨论的，已经证明了一些海洋细菌可产生PUFA(EPA以及DHA)。然而，这些细菌不会产生显著量的TAG，且EPA主要以PL膜的形式出现。这些特定细菌产生的EPA的水平以及它们的生长特性(如上面讨论的)限制了它们用于产业化生产EPA的效用。
为了通过修饰内源产生的脂肪酸在产油种子作物植物中生产EPA，人们已经做了大量的努力。通过用多种单独的脂肪酸延长酶和去饱和酶基因对这些植物进行遗传修饰，已经产生了含有显著水平EPA，而且含有显著水平混合的短链和略低不饱和PUFA的叶子或种子(Qi等，Nature Biotech.22：739(2004)；PCT Publication No.WO 04/071467；Abbadi等，Plant Cell 16：1(2004))。对比地，如本文所述的已知产EPA的PUFA PKS系统产生的PUFA分布主要是纯的EPA。
因此，本领域需要产业应用灵活性更高的其它PUFA PKS系统，以及能够在产业上有用的生产过程中高效、大量地生产富含所需PUFA(例如EPA)的脂质(例如PL和TAG)的生物系统。
为了通过修饰内源产生的脂肪酸而在产油种子作物植物中生产EPA，人们已经作了大量的努力。用多种单独的脂肪酸延长酶和去饱和酶的基因对这些植物进行遗传修饰，产生了含有显著水平的EPA的叶子或种子，但它们还含有显著水平的混合的链以及较少的不饱和PUFA(Qi等，NatureBiotech.22：739(2004)；PCT Publication No.WO 04/071467；Abbadi等，PlantCell 16：1(2004))。与此相对的，如本文所述的已知的产EPA性PUFA PKS系统所产生的PUFA谱(profile)基本上是纯的EPA。
因此，本领域需要具有更大产业应用灵活性的其它PUFA PKS系统，以及可在产业上有用的过程中高效、大量地产生富含所需PUFA(例如EPA)的脂质(例如PL和TAG)的生物系统。
发明概述
本发明的一个实施方案总体上涉及来自Shewanella japonica或Shewanella olleyana的编码PUFA PKS蛋白质和域的分离核酸分子，及其生物活性同源物和片段。在一个方面中，本发明包括分离的核酸分子，其包含选自下组的核酸序列：(a)编码氨基酸序列的核酸序列，其中氨基酸序列从下组选择：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQID NO：12；(b)编码(a)中任何氨基酸序列的片段的核酸序列，所述片段具有至少一种选自下组的生物活性：烯酰-ACP还原酶(ER)活性；酰基载体蛋白(ACP)活性；β-酮脂酰-ACP合酶(KS)活性；酰基转移酶(AT)活性；β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)活性；类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶(dehydrase)(DH)活性；非类FabA脱水酶活性；链长度因子(chain length factor)(CLF)活性；丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)活性；和4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)活性；(c)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8具有至少大约65％的同一性，更优选至少大约75％的同一性，更优选至少大约85％的同一性，更优选至少大约95％的同一性，并具有至少一种选自下组的的生物活性：KS活性，MAT活性，KR活性，ACP活性和非类FabA脱水酶活性；(d)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：9具有至少大约60％的同一性，更优选至少大约70％的同一性，更优选至少大约80％的同一性，更优选至少大约90％的同一性，并具有AT生物活性；(e)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10具有至少大约70％的同一性，优选至少大约80％的同一性，更优选至少大约90％的同一性，更优选至少大约95％的同一性，并具有至少一种选自下组的生物活性：KS活性，CLF活性和DH活性；(f)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：12具有至少大约60％的同一性，更优选至少大约70％的同一性，更优选至少大约80％的同一性，更优选至少大约90％的同一性，并具有PPT酶生物活性；(g)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：11具有至少大约85％的同一性，更优选至少大约95％的同一性，更优选至少大约96％的同一性，更优选至少大约97％的同一性，或者与SEQ ID NO：5具有至少大约95％的同一性，更优选至少大约96％的同一性，更优选至少大约97％的同一性，更优选至少大约98％的同一性，并具有ER生物活性。
在一个方面中，上文(b)中提出的片段选自下组：
(a)SEQ ID NO：2的大约29位-大约513位的SEQ ID NO：2片段，其中该域具有KS生物活性；
(b)SEQ ID NO：2的大约625位-大约943位的SEQ ID NO：2片段，其中该域具有MAT生物活性；
(c)SEQ ID NO：2的大约1264位-大约1889位的SEQ ID NO：2片段及其亚域，其中该域或其亚域具有ACP生物活性；
(d)SEQ ID NO：2的大约2264位-大约2398位的SEQ ID NO：2片段，其中该域具有KR生物活性；
(e)包含SEQ ID NO：2的大约2504位-大约2516位的SEQ ID NO：2片段，其中该片段具有非类FabA脱水酶生物活性；
(f)SEQ ID NO：3的大约378位-大约684位的SEQ ID NO：3片段，其中该域具有AT生物活性；
(g)SEQ ID NO：4的大约5位-大约483位的SEQ ID NO：4片段，其中该域具有KS生物活性；
(h)SEQ ID NO：4的大约489位-大约771位的SEQ ID NO：4片段，其中该域具有CLF生物活性；
(i)SEQ ID NO：4的大约1428位-大约1570位的SEQ ID NO：4片段，其中该域具有DH生物活性；
(j)SEQ ID NO：4的大约1881位-大约2019位的SEQ ID NO：4片段，其中该域具有DH生物活性；
(k)SEQ ID NO：5的大约84位-大约497位的SEQ ID NO：5片段，其中该域具有ER生物活性；
(1)SEQ ID NO：6的大约40位-大约186位的SEQ ID NO：6片段，其中该域具有PPT酶生物活性；
(m)SEQ ID NO：8的大约29位-大约513位的SEQ ID NO：8片段，其中该域具有KS生物活性；
(n)SEQ ID NO：8的大约625位-大约943位的SEQ ID NO：8片段，其中该域具有MAT生物活性；
(o)SEQ ID NO：8的大约1275位-大约1872位的SEQ ID NO：8片段及其亚域，其中该域或其亚域具有ACP生物活性；
(p)SEQ ID NO：8的大约2240位-大约2374位的SEQ ID NO：8片段，其中该域具有KR生物活性；
(q)包含SEQ ID NO：8的大约2480-2492位的SEQ ID NO：8片段，其中该片段具有非类FabA脱水酶活性；
(r)SEQ ID NO：9大约366位-大约703位的SEQ ID NO：9片段，其中该域具有AT生物活性；
(s)SEQ ID NO：10大约10位-大约488位的SEQ ID NO：10片段，其中该域具有KS生物活性；
(t)SEQ ID NO：10大约502位-大约750位的SEQ ID NO：10片段，其中该域具有CLF生物活性；
(u)SEQ ID NO：10大约1431位-大约1573位的SEQ ID NO：10片段，其中该域具有DH生物活性；
(v)SEQ ID NO：10大约1882位-大约2020位的SEQ ID NO：10片段，其中该域具有DH生物活性；
(w)SEQ ID NO：11大约84位-大约497位的SEQ ID NO：11片段，其中该域具有ER生物活性；及
(x)SEQ ID NO：12大约29位-大约177位的SEQ ID NO：12片段，其中该域具有PPT酶生物活性。
本发明还包括基本上由这样的核酸序列组成的核酸分子：所述核酸序列与上文确定的任意核酸分子完全互补。本发明的一个方面进一步涉及重组核酸分子，其包含与至少一种表达控制序列可操作连接的任何上文确定的核酸分子。本发明的另一个方面涉及转染了任何所述的重组核酸分子的重组细胞。
本发明的另一个实施方案涉及遗传修饰的植物或该植物的部分，其中所述植物被遗传修饰从而重组表达PKS系统，该PKS系统包含多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮合酶(PKS)系统的至少一种生物活性蛋白或其域，其中所述蛋白或域由任何上述核酸分子编码。在一个方面中，作为遗传修饰的结果，遗传修饰的植物或植物部分产生一种或多种选自下组的多不饱和脂肪酸:DHA(二十二碳六烯酸(C22:6，ω-3))、ARA(二十碳四烯酸或花生四烯酸(C20:4，n-6))、DPA(二十二碳五烯酸(C22:5，ω-6或ω-3))和/或EPA(二十碳五烯酸(C20:5，ω-3)。在特别优选的实施方案中，植物或植物部分产生DHA、EPA、EPA和DHA、ARA和DHA、或ARA和EPA。遗传修饰的植物可包括作物植物(crop plants)和任何双子叶植物或单子叶植物。优选的植物包括，但不限于，油菜(canola)、大豆(soybean)、油菜籽(rapeseed)、亚麻籽(linseed)、玉米(corn)、红花(safflower)、向日葵(sunflower)和烟草(tobacco)。
本发明的另一个实施方案涉及遗传修饰的微生物，其中该微生物被遗传修饰从而重组表达任何上述分离核酸分子。在一个方面中，作为遗传修饰的结果，所述微生物产生选自下组的多不饱和脂肪酸:DHA(二十二碳六烯酸(C22:6，ω-3))、ARA(二十碳四烯酸或花生四烯酸(C20:4，n-6))、DPA(二十二碳五烯酸(C22:5，ω-6或ω-3))和/或EPA(二十碳五烯酸(C20:5，ω-3)。在特别优选的实施方案中，作为遗传修饰的结果，该微生物产生DHA、EPA、EPA和DHA、ARA和DHA、或ARA和EPA。在一个方面中，所述微生物是破囊壶菌目生物，包括但不限于Schizochytrium和破囊壶菌属(Thraustochytrium)。在一个方面中，所述微生物是细菌。
在一个方面中，上述遗传修饰的植物或微生物被遗传修饰从而重组表达核酸分子，所述核酸分子编码至少一种选自下列的氨基酸序列：(a)选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：12；(b)(a)的任何氨基酸序列的片段，其具有至少一种选自下组的生物活性：烯酰-ACP还原酶(ER)活性；酰基载体蛋白(ACP)活性；β-酮脂酰-ACP合酶(KS)活性；酰基转移酶(AT)活性；β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)活性；类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶(DH)活性；非类FabA脱水酶活性；链长度因子(CLF)活性；丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)活性；和4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)活性。在一个方面中，所述植物被遗传修饰从而重组表达核酸分子，该核酸分子编码至少一种选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和/或SEQID NO：6。在另一个方面中，所述植物或微生物被遗传修饰从而重组表达至少一种核酸分子，所述核酸分子编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。在另外一个方面中，植物或微生物被遗传修饰从而重组表达编码至少一种选自下组的氨基酸序列的核酸分子：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和/或SEQ IDNO：12。在另一个方面中，植物或微生物被遗传修饰从而编码至少一种核酸分子，所述核酸分子编码SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQID NO：11和SEQ ID NO：12。在另一个方面中，所述植物或微生物被遗传修饰从而重组表达至少一种编码任何上述片段的核酸分子。
在本发明遗传修饰的植物或植物部分或微生物的实施方案的一个方面中，植物或微生物被进一步遗传修饰而表达多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮合酶(PKS)系统的至少一种生物活性蛋白或域，所述多不饱和脂肪酸聚酮合酶系统来自破囊壶菌目生物，其中破囊壶菌目生物包括但不限于Schizochytrium和破囊壶菌属。在一个方面中，这样的蛋白或域包括选自下组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18；和(b)(a)的任何氨基酸序列的片段，其具有至少一种选自下组的生物活性：烯酰-ACP还原酶(ER)活性；酰基载体蛋白(ACP)活性；β-酮脂酰-ACP合酶(KS)活性；酰基转移酶(AT)活性；β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)活性；类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶(DH)活性；非类FabA脱水酶活性；链长度因子(CLF)活性；丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)活性；和4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)活性。在另一个方面中，所述蛋白或域包含选自下组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24，和(b)(a)中任何氨基酸序列的片段，其具有至少一种选自下组的生物活性：烯酰-ACP还原酶(ER)活性；酰基载体蛋白(ACP)活性；β-酮脂酰-ACP合酶(KS)活性；酰基转移酶(AT)活性；β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)活性；类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶(DH)活性；非类FabA脱水酶活性；链长度因子(CLF)活性；丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)活性；和4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)活性。
在涉及遗传修饰微生物的本发明实施方案的一个方面中，所述微生物包含内源PUFA PKS系统。在该方面中，可以通过用另一种编码不同PKS系统的至少一个域的分离核酸分子取代编码内源PUFA PKS系统的至少一个域的核酸序列，来修饰内源PUFA PKS系统。不同的PKS系统包括，但不限于，非细菌PUFA PKS系统、细菌PUFA PKS系统、I型模块性PKS系统、I型重复性PKS系统、II型PKS系统及III型PKS系统。在另一个方面中，内源PUFA PKS系统已经被遗传修饰，该遗传修饰是用任何上述本发明的分离核酸分子取代编码内源PUFA PKS系统的至少一个域。在另一个方面中，微生物已被遗传修饰从而重组表达核酸分子，该核酸分子编码链长度因子或附加β-酮脂酰-ACP合酶(KS)域的链长度因子，它们指导C20单位的合成。在另一个方面中，内源PUFA PKS系统中选自下组的一个或多个域被修饰：编码类FabA β-羟酰-ACP脱水酶(DH)域的域，和编码β-酮脂酰-ACP合酶(KS)的域；其中与没有修饰相比，该修饰改变PUFA PKS系统所产生的长链脂肪酸的比例。这种修饰可以包括用不具有异构活性的DH域取代内源PUFA PKS系统中类FabA β-羟酰-ACP脱水酶(DH)。这种修饰还可以包括缺失该域的全部或部分，用来自不同生物体的同源域取代该域，和对该域进行突变。在一个方面中，内源PUFA PKS系统中的烯酰-ACP还原酶(ER)域被修饰，其中与没有修饰相比，该修饰导致不同化合物的产生。就此而言，这种修饰可以包括缺失全部或部分的ER域、用来自不同生物体的ER域取代所述ER域，和对所述ER域进行突变。
本发明的另一个实施方案涉及生产由聚酮合酶系统产生的生物活性分子的方法，包括在可有效产生该生物活性分子的条件下培育如上所述的遗传修饰植物。
本发明的另一个实施方案涉及通过聚酮合酶系统产生生物活性分子的方法，包括在可有效产生该生物活性分子的条件下培育如上所述的遗传修饰微生物。
在上面两个实施方案的任何一个中，在一个方面，与野生型生物体相比，遗传修饰改变由内源PKS系统产生的至少一种产物。在另一个方面，所述生物体产生与无遗传修饰的天然生物体不同的多不饱和脂肪酸(PUFA)谱(profile)。在一个方面，生物活性分子选自下组：抗炎制剂、化疗剂、活性赋形剂、骨质疏松症药物、抗抑郁剂、抗惊厥剂、抗幽门螺杆菌(Heliobactor pylori)药、治疗神经变性疾病的药物、治疗变性肝病(degenerative liver disease)的药物、抗生素和降胆固醇制剂(cholesterollowering formulation)。在另一个方面，生物活性分子是抗生素。在另一个方面，生物活性分子是多不饱和脂肪酸(PUFA)。在另外一个方面，生物活性分子是包含顺式构型碳-碳双键的分子。在另一个方面中，生物活性分子是每第三个碳处即含有一个双键的分子。
本发明的另一个实施方案涉及产生植物的方法，其中所述植物具有不同于天然植物的多不饱和脂肪酸(PUFA)谱，该方法包括遗传修饰所述植物的细胞以表达PKS系统，该PKS系统包含至少一种如上所述的本发明的重组核酸分子。
本发明的另一个实施方案涉及产生重组微生物的方法，包括遗传修饰微生物细胞，以表达至少一种上述的本发明的重组核酸分子。
本发明的另一个实施方案涉及修饰终产物以包含至少一种脂肪酸的方法，包括向终产物添加重组宿主细胞产生的油，所述重组宿主细胞表达至少一种上述的本发明的重组核酸分子。例如，终产物可以包括但不限于膳食补充剂(dietary supplement)、食品、药物制剂、母乳化动物乳(humanizedanimal milk)和婴儿配方食品。
本发明的另一个实施方案涉及产生母乳化动物乳的方法，包括用至少一种上述的本发明的重组核酸分子遗传修饰产乳动物的产乳细胞。
本发明的另一个实施方案涉及重组宿主细胞，其被修饰而表达重组细菌多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮合酶(PKS)系统，其中PUFA PKS催化重复性(iterative)和非重复性(non-interative)酶反应，且其中该PUFA PKS系统包括：(a)至少一个烯酰-ACP还原酶(ER)域；(b)至少六个酰基载体蛋白(ACP)域；(c)至少两个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)域；(d)至少一个酰基转移酶(AT)域；(e)至少一个酮还原酶(ketoreductase)(KR)域；(f)至少两个类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶(DH)域；(g)至少一个链长度因子(CLF)域；(h)至少一个丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)域；和(i)至少一个4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)域。该PUFA PKS系统可在至少大约25℃的温度条件下产生PUFA。在一个方面，该PUFA PKS系统包括：(a)一个烯酰-ACP还原酶(ER)域；(b)六个酰基载体蛋白(ACP)域；(c)两个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)域；(d)一个酰基转移酶(AT)域；(e)一个酮还原酶(KR)域；(f)两个类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶(DH)域；(g)一个链长度因子(CLF)域；(h)一个丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)域；和(i)一个4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)域。在一个方面，所述PUFA PKS系统是来自选自下组的海洋细菌的PUFA PKS系统：Shewanella japonica和Shewanella olleyana。
本发明的另一个实施方案涉及遗传修饰的生物体，其包括细菌多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮合酶(PKS)系统的至少一个蛋白或域，其中该细菌PUFA PKS系统催化重复性和非重复性酶反应，其中该细菌PUFA PKS系统在至少大约25℃的温度条件下产生PUFA，并且其中该细菌PUFA PKS系统包括：(a)至少一个烯酰-ACP还原酶(ER)域；(b)至少六个酰基载体蛋白(ACP)域；(c)至少两个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)域；(d)至少一个酰基转移酶(AT)域；(e)至少一个酮还原酶(KR)域；(f)至少两个类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶(DH)域；(g)至少一个链长度因子(CLF)域；(h)至少一个丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)域；和(i)至少一个4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)域。该遗传修饰影响PUFA PKS系统的活性。在一个方面，生物体被修饰以重组表达细菌PUFA PKS系统的至少一个蛋白或域。在另一个方面，生物体被修饰而重组表达细菌PUFA PKS系统。生物体可包括植物或微生物。在一个方面，细菌PUFA PKS系统是来自选自下组的海洋细菌的PUFA PKS系统：Shewanella japonica和Shewanella olleyana。在另一个方面，生物体还表达至少一种来自另一不同PKS系统的蛋白或域。
本发明的另一个实施方案涉及分离重组核酸分子，其编码细菌(PUFA)聚酮合酶(PKS)系统的至少一个蛋白或功能域，其中该细菌PUFA PKS系统催化重复性和非重复性酶反应，其中该细菌PUFA PKS系统在至少约25℃的温度条件下产生PUFA，且其中该细菌PUFA PKS系统包括：(a)至少一个烯酰-ACP还原酶(ER)域；(b)至少六个酰基载体蛋白(ACP)域；(c)至少两个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)域；(d)至少一个酰基转移酶(AT)域；(e)至少一个酮还原酶(KR)域；(f)至少两个类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶(DH)域；(g)至少一个链长度因子(CLF)域；(h)至少一个丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)域；和(i)至少一个4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)域。
发明附图简述
图1是希瓦氏菌属菌种SCRC-2738、Shewanella japonica和Shewanellaolleyana的产EPA基因簇(cluster)的开放阅读框(ORF)构造的示意图。
图2是希瓦氏菌属菌种SCRC-2738、Shewanella japonica和Shewanellaolleyana的产EPA基因簇的域构造的示意图。
图3A为序列比对，其显示来自Shewanella japonica(粘粒3F3)的pfaBORF末端和pfaC ORF起点之间的重叠(显示了SEQ ID NO：1的核苷酸21101-21150，包括互补链)以及它们相应的氨基酸翻译产物(pfaB：SEQ IDNO：3的751-759位；pfaC：SEQ ID NO：4的1-9位)。
图3B为序列比对，其显示来自Shewanella japonica(粘粒9A10)的pfaBORF末端和pfaC ORF起点之间的重叠(显示了SEQ ID NO：7的核苷酸27943-28008，包括互补链)以及它们相应的氨基酸翻译产物(pfaB：SEQ IDNO：9的735-742位；pfaC：SEQ ID NO：10的1-9位)。
图4为序列比对，其显示：pfaE ORF的N末端(Sja_pfaE：SEQ ID NO：6的1-70位；Sol_pfaE：SEQ ID NO：12的1-59位)、希瓦氏菌属菌种SCRC-2738(orf2_ATG：SEQ ID NO：61)的orf2的标注起点(orf2_ATG：SEQ ID NO：61)、以及希瓦氏菌属菌种SCRC-2738的orf2的实验功能性起点(WO98/55625)(orf2_TTG：SEQ ID NO：62)。
发明详述
本发明总体上涉及多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮合酶(PKS)系统，其来自海洋细菌的一个亚群，该亚群自然产生EPA，并且在高达大约30℃甚至可能在更高的温度下(例如，高达35℃或更高)生长良好，本发明还涉及包含这种PUFA PKS系统的遗传修饰生物体，以及制造和使用这类系统以生产目标产物的方法，其中所述目标产物包括生物活性分子，特别是PUFA，例如DHA、DPH和EPA。
如本文所使用的，PUFA PKS系统(也可称作PUFA合酶系统)一般具有如下识别特征：(1)它产生PUFA作为该系统的天然产物；和(2)它包含数个组装为复合体的多功能蛋白质，该复合体既进行脂肪酸链的重复性(iterative)加工，又进行非重复性(non-iterative)加工，包括在被选循环中进行的顺反异构和烯酰还原反应。提及“PUFA PKS系统”是统称生物体中以复合体形式起作用而产生PUFA的所有基因及其编码产物。因此，PUFA
PKS系统特指天然产物是PUFA的PKS系统。
更具体地讲，首先，构成本发明基础的PUFA PKS系统产生多不饱和脂肪酸(PUFAs)作为产物(即，内源(天然)含有这类PKS系统的生物体使用该系统来制造PUFA)。本文所涉及的PUFA优选是如下的多不饱和脂肪酸，其碳链长度为至少16个碳，更优选至少18个碳，更优选至少20个碳，更优选22个或更多个碳，并至少有3个或更多个双键，优选有4个或更多个，更优选有5个或更多个，更优选有6个或者更多个双键，其中所有的双键都是顺式构型。本发明的一个目的是，通过遗传操作或操作终产物来发现或创建这样的PKS系统：其产生具有所需链长和所需双键数的多不饱和脂肪酸。PUFA的实例包括，但不限于，DHA(二十二碳六烯酸(C22:6，ω-3))、ARA(二十碳四烯酸或花生四烯酸(C20:4，n-6))、DPA(二十二碳五烯酸(C22:5，ω-6 or ω-3))和EPA(二十碳五烯酸(C20:5，ω-3)。
其次，本文所述的PUFA PKS系统包含重复性和非重复性反应，这一点使该系统总体上区别于先前所描述的PKS系统(例如I型模块性或重复性，II型或III型)。更具体地，本文所述的PUFA PKS系统包含似乎在每个循环均起作用的域，以及似乎只在某些循环中起作用的域。该功能性的一个关键方面可能涉及那些与细菌Fab-A酶显示同源性的域。例如，已证明大肠杆菌(E.coli)的Fab-A酶具有两种酶活性。它具有脱水活性，其中从含有羟基的碳链上抽出水分子(H2O)，在该碳链中留下反式双键。此外，它具有异构酶活性，其中反式双键被转换成顺式构型。伴随着该异构化的完成，双键位置迁移到相邻碳原子。在PKS(和FAS)系统中，主碳链以2个碳的增量延伸。因此可以预测产生这些PKS系统的PUFA产物所需的延伸反应的数目。例如，产生DHA(C22:6，全顺式)需要10个延伸反应。由于在终产物中只有6个双键，这意味着在一些反应循环中双键被保留(作为顺式异构体)，而在其它的循环中，双键在下一次延伸之前被还原。
在发现海洋细菌中的PUFA PKS系统之前(见美国专利No.6,140,486)，人们并不知道PKS系统具有这种重复性和选择性酶反应的结合，并且认为它们不能产生顺式构型的碳-碳双键。然而，本发明所述的PUFA PKS系统具有引入顺式双键的能力，以及改变循环中反应顺序的能力。
本发明人建议对PUFA PKS系统的这些特征加以利用，来产生多种先前所述(I型重复性或模块性，II型或III型)的PKS系统所不能产生的生物活性分子。这些生物活性分子包括，但不限于，多不饱和脂肪酸(PUFAs)、抗生素或其他生物活性化合物，它们中的许多将在下面讨论。例如，利用本文所述的PUFA PKS基因结构的知识，可以使用多种方法中的任何方法来改变PUFA PKS基因，或将这些基因的部分与其他合成系统(包括其他PKS系统)结合，以产生新的产物。这种类型系统具有进行重复性和选择性反应的固有能力，这将使该系统能够产生在对其它类型PKS系统应用类似方法时不会出现的产物。
在美国专利申请序列号No.10/810,352(同上)中，本发明人鉴定了两种作为示例的海洋细菌(例如Shewanella olleyana和Shewanella japonica)，它们特别适合于用作PUFA PKS基因的来源，因为它们具有能够在高达大约30℃的温度条件下产生PUFA(例如EPA)和生长的惊人特性，而与之相对照的是，先前描述的含PUFA PKS的海洋细菌，包括希瓦氏菌属中的其它种和株，通常在低得多的温度下产生PUFA和生长。本发明人目前已经分别在Shewanella olleyana[澳大利亚南极微生物保藏中心(Australian Collectionof Antarctic Microorganisms，ACAM)菌株号644；Skerratt等，Int.J.Syst.Evol.Microbiol 52，2101(2002)]和Shewanella japonica[美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)菌株号BAA-316；Ivanova等，Int.J.Syst.Evol.Microbiol.51，1027(2001)]中克隆和测序了所有PUFA PKS开放阅读框(Orfs)的全长基因组序列，并鉴定了这些海洋细菌中构成PUFA PKS系统的域。因此，本发明解决上面提出的提供其它具有产业应用灵活性的PUFA PKS系统的问题。
本发明的PUFA PKS系统还可以作为工具，用于下述策略：本发明人通过对真核生物(包括破囊壶菌目(Thraustochytriales)的成员，例如Schizochytrium和破囊壶菌属)中产生PUFA的类聚酮合酶系统进行操作，开发出遗传修饰微生物和方法，用于高效地生产富含PUFA的脂类，其中PUFA以其各种形式中的一种或多种形式存在(例如三酰基甘油(TAG)和磷脂(PL))，以解决上文提出的生产富含所需PUFA(例如EPA)的、产业上有价值的脂类这一问题。具体举例而言，本发明人在本文中描述了一种菌株，其在先前已经被优化用于工业生产富含PUFA—主要是二十二碳六烯酸(DHA，C22:6，n-3))和二十二碳五烯酸(DPA，C22:5，n-6))—的油，并将被遗传修饰使得EPA(C20:5n-3)的生产(或者其他PUFA的生产)取代DHA的生产，而不牺牲该生物体的油生产力特性。人们可以使用来自发明的一个实施方案中描述的海洋细菌的海洋细菌PUFA PKS基因产生这种遗传修饰的微生物。这只是本发明所涵盖的技术的一个实例，因为本发明的构思可以容易地应用于其他生产生物体和其他期望的PUFAs，这将在下文加以详细描述。
如本文所使用的，术语“脂质”(lipid)包括磷脂；游离脂肪酸；脂肪酸的酯；三酰基甘油；二酰基甘油(diacylglycerides)；甘油磷脂类(phosphatides)；固醇和固醇酯；类胡萝卜素；叶黄素(例如含氧类胡萝卜素(oxycarotenoids))；烃类；和其他本领域普通技术人员已知的脂质。术语“多不饱和脂肪酸”和“PUFA”不仅包括游离脂肪酸形式，而且也包括其他形式，例如TAG形式和PL形式。
在一个实施方案中，根据本发明的PUFA PKS系统包括至少如下的生物活性域：(a)至少一个烯酰-ACP还原酶(ER)域；(b)至少六个酰基载体蛋白(ACP)域；(c)至少两个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)域；(d)至少一个酰基转移酶(AT)域；(e)至少一个β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)域；(f)至少两个类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶(DH)域；(g)至少一个链长度因子(CLF)域；和(h)至少一个丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)域。PUFA PKS系统还包括至少一个4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)域，该域可看成PUFA PKS系统的一部分或者看成PUFA PKS系统的附属域或蛋白质。在一个实施方案中，根据本发明的PUFA PKS系统还包括至少一个含有脱水酶(DH)保守活性位点模体的区域。这些域和模体的功能一般在本领域中均是分别已知的，并且将在下文参考本发明的PUFA PKS系统加以详细说明。本发明的域可以作为单个蛋白质出现(即，域和蛋白质是同义的)，或者作为单个蛋白质的两个或更多(多个)域中之一出现。这些希瓦氏菌属物种中的PUFA PKS系统的域构造(architecture)将在下文加以更加详细的说明，并且显示于图2中。
在另一个实施方案中，PUFA PKS系统至少包括如下的生物活性域：(a)至少一个烯酰-ACP还原酶(ER)域；(b)多个酰基载体蛋白(ACP)域(至少1至4个，优选至少5个，更优选至少6个，更优选至少7个、8个、9个或多于9个)；(c)至少两个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)域；(d)至少一个酰基转移酶(AT)域；(e)至少一个β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)域；(f)至少两个类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶(DH)域；(g)至少一个链长度因子(CLF)域；(h)至少一个丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)域；和(i)至少一个4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)域。在一个实施方案中，根据本发明的PUFA PKS系统还包括至少一个含有脱水酶(DH)保守活性位点模体的区域。
根据本发明，具有β-酮脂酰-ACP合酶(KS)生物活性(功能)的域或蛋白被描述为执行FAS(和PKS)延长反应循环初始步骤的酶。术语“β-酮脂酰-ACP合酶”(β-ketoacyl-ACP synthase)可以和术语“3-酮脂酰-ACT合酶”(3-keto acyl-ACP synthase)、“β-酮脂酰基-ACP合酶”(β-keto-ACPsynthase)、“酮脂酰-ACP合酶”(keto-acyl ACP synthase)和相似的衍生词互换使用。确定要被延长的酰基通过硫酯键与酶活性位点的半胱氨酸残基相连。在多步反应中，酰基-酶与丙二酰-ACP缩合形成-酮脂酰-ACP、CO2和游离酶。KS在延长循环中发挥关键作用，并且在许多系统中，显示具有比反应循环中其他的酶更大的底物特异性。例如，大肠杆菌具有三种不同KS酶—每一种在所述生物体的生理中具有其特定的作用(Magnuson等，Microbiol.Rev.57，522(1993))。本文所述的PUFA-PKS系统的两个KS域在PUFA生物合成反应序列中可能具有不同的作用。
作为一类酶，KS已经得到充分的表征。许多已核实的KS基因的序列已经为人所知，活性位点模体已被鉴定，数种的晶体结构已经确定。通过与已知KS序列的同源性可以容易地鉴定蛋白(或蛋白的域)属于KS酶家族。
根据本发明，具有丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)生物活性(功能)的域或蛋白被描述为可将丙二酰部分从丙二酰-CoA转移到ACP。术语“丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶”(malonyl-CoA:ACP acyltransferase)可以和“丙二酰酰基转移酶”(malonyl acyltransferase)和类似的衍生词互换使用。除了活性位点模体(GxSxG)之外，这些酶还具有一种延伸模体(extended motif)(关键位置的R和Q氨基酸)，该模体使它们具有MAT酶的身份(与下面讨论的AT域相对)。在一些PKS系统中(但不是PUFA PKS域)，MAT域优选地将丙二酸二甲酯或丙二酸二乙酯(methyl-or ethyl-malonate)装载到ACP基团上(来自相应的CoA酯)，藉此将分枝引入到线性碳链中。MAT域可以通过与已知MAT序列的同源性和通过其延伸模体结构来识别。
根据本发明，具有酰基载体蛋白(ACP)生物活性(功能)的域或蛋白被描述为一种小多肽(通常，80-100个氨基酸长度)，其充当载体，将伸长中的脂肪酰基链通过硫酯键合运送给该蛋白质共价结合的辅因子。这些多肽作为单独的单位，或者更大蛋白质内的域存在。ACP通过将CoA的磷酸泛酰巯基乙胺基部分转移到ACP的高度保守的丝氨酸上而从无活性的脱辅基蛋白形式(apo-form)转变成有功能的全蛋白形式(holo-form)。酰基通过磷酸泛酰巯基乙胺基部分的游离末端的硫酯键合附着到ACP上。ACP的鉴定可以通过用放射性泛酰巯基乙胺标记，以及借助与已知ACP的序列同源性。活性位点模体的变化形式(LGIDS*；例如见SEQ ID NO：2的氨基酸1296-1300)的存在也是ACP的标志。
根据本发明，具有β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)活性的域或蛋白被描述为可催化ACP的3-酮脂酰形式的吡啶-核苷酸依赖性还原。术语“β-酮脂酰-ACP还原酶”(β-ketoacyl-ACP reductase)可以和术语“酮还原酶”(ketoreductase)、“3-酮脂酰-ACP还原酶”(3-ketoacyl-ACP reductase)、“酮-脂酰ACP还原酶”(keto-acyl ACP reductase)及该术语的类似衍生语互换使用。它是脂肪酸从头(de novo)生物合成延长循环中的第一个还原步骤，并且是在聚酮生物合成中经常进行的反应。可以观察到与烯酰-ACP还原酶(ER)的一个家族、FAS的另一还原酶(但不是PUFA PKS系统中存在的ER家族)和短链脱氢酶家族具有显著的序列相似性。该PUFA PKS区域的Pfam分析可以显示在核心区与短链醇脱氢酶家族的同源性。相同区域的Blast分析可以显示在核心区域与已知的KR酶匹配，以及与来自其它已表征的PUFAPKS系统的域具有同源性的延伸区域。
根据本发明，根据如下的原理将域或蛋白称为链长度因子(CLF)。CLF最初被描述为II型(解离的酶)PKS系统的特征，人们假设其在确定延长循环的数目，从而确定终产物的链长度的过程中起作用。CLF氨基酸序列显示与KS域的同源性(并且被认为与KS蛋白形成异源二聚体)，但是它们缺乏活性位点半胱氨酸。CLF在PKS系统中的作用有争议。有证据(C.Bisang等，Nature 401，502(1999))显示其具有引发(priming)PKS系统的作用(通过提供待延长的初始酰基)。在这种作用中，CLF域被认为对丙二酸基(malonate)(作为丙二酰-ACP)脱羧，因此形成可被转移到KS活性位点的乙酸基(acetate group)。因此该乙酸基充当可以经历最初的延长(缩合)反应的“引发”分子。II型CLF的同源物已经被鉴定为一些I型模块性PKS系统中的“装载”域。然而，其它新近的证据提示了CLF域在确定链长度中的真正作用(Yi等，J.Am.Chem.Soc.125：12708(2003))。在所有目前已鉴定的PUFA PKS系统中均发现了具有CLF序列特征的域，并且在所有情况下，该域都是以作为多域蛋白质的一部分存在的。
“酰基转移酶”或“AT”是指可执行多种不同酰基转移反应的广泛的一类酶。术语“酰基转移酶”(acyltransferase)可以和术语“酰基转移酶”(acyl transferase)互换使用。Schizochytrium域与所有目前已被考察的其它PUFA PKS系统中均存在的一个域显示良好的同源性，而与一些具体功能已被鉴定的酰基转移酶(例如丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶，MAT)显示非常微弱的同源性。尽管AT域与MAT有微弱的同源性，但人们并不认为AT域起MAT的作用，因为它不具有这类酶的特征性延伸模体结构(见上文MAT域的描述)。就本公开而言，PUFA PKS系统中AT域的功能包括，但不限于：将脂肪酰基团从OrfA ACP域转移到水(即硫酯酶-释放脂肪酰基团为游离脂肪酸)，将脂肪酰基团转移到受体如CoA，在各个ACP域之间转移酰基，或者将脂肪酸基团转移到亲脂受体分子(例如到溶血磷脂酸)。
根据本发明，具有烯酰-ACP还原酶(ER)生物活性的蛋白质或域还原脂肪酰-ACP中的反式双键(由DH活性引入的)，导致那些碳完全饱和。PUFA-PKS中的ER域与一类新近被描述的ER酶家族显示同源性(Heath等，Nature 406，145(2000))。根据本发明，术语“烯酰-ACP还原酶”(enoyl-ACPreductase)可与“烯酰还原酶”(enoyl reductase)、“烯酰ACP-还原酶”(enoyl ACP-reductase)和“烯酰脂酰-ACP还原酶”(enoyl acyl-ACPreductase)互换使用。Heath和Rock通过从肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)克隆目的基因，纯化由该基因表达的蛋白质，并证明它在体外测定中具有ER活性，从而鉴定了这类新型ER酶。本文所述的细菌PUFAPKS系统包含一个ER域。
根据本发明，具有脱水酶或脱水酶(DH)活性的蛋白质或域可催化脱水反应。如本文中通用的，“DH活性”通常是指类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶(DH)生物活性。类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶(DH)生物活性从β-酮脂酰-ACP除去HOH，并最初在碳链内产生反式双键。术语“类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶”(FabA-like β-hydroxyacyl-ACP dehydrase)可以和术语“类FabAβ-羟基酰基-ACP脱水酶”(FabA-like β-hydroxy acyl-ACP dehydrase)、“β-羟酰-ACP脱水酶”(β-hydroxyacyl-ACP dehydrase)、“脱水酶”(dehydrase)和类似的衍生词互换使用。PUFA PKS系统的DH域和细菌FAS系统相关的DH酶(而不是其它PKS系统的DH域)显示同源性。细菌DH的一个亚类：类FabA DH，具有顺反异构酶活性(Heath等，J.Biol.Chem.，271，27795(1996))。正是这种与类FabA DH蛋白质的同源性，暗示本文所述的这些DH域中的一个或全部负责在PUFA PSK产物中插入顺式双键。
本发明的蛋白质还可以具有非类FabA性的脱水酶活性(例如，上文所述的顺-反活性与类FabA活性相关)，在本文一般称作非类FabA DH活性(non-FabA-like DH activity)，或非类FabA β-羟酰-ACP脱水酶(DH)生物活性。更具体地说，在PKS系统的脱水酶域中发现了保守的活性位点模体(～13氨基酸长度：L*xxHxxxGxxxxP；SEQ ID NO：2的氨基酸2504-2516；*在模体中，L也可以是I)(Donadio S，Katz L.Gene.1992Feb1；111(1)：51-60)。该保守模体(在本文中也称脱水酶(DH)保守活性位点模体或DH模体)在迄今已描述的所有已知PUFA-PKS序列的一个相似区域中以及本文所述的PUFA PKS序列中(例如SEQ ID NO：2的氨基酸2504-2516或SEQ ID NO：8的氨基酸2480-2492)均有出现，但是我们相信，该模体在本发明之前没有被检测到。该保守的模体位于PUFA-PKS序列中的一个具有高度同源性的未表征区域内。提出的通过PUFA-PKS的PUFA生物合成需要非类FabA的脱水作用，并且该模体可能负责该反应。
根据本发明，具有4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)生物活性(功能)的域或蛋白质被描述为这样的酶，其将4’-磷酸泛酰巯基乙胺基部分从辅酶A转移到酰基载体蛋白(ACP)。这种向ACP固定丝氨酸残基的转移将无活性的脱辅基蛋白形式活化为全蛋白形式。在聚酮和脂肪酸合成中，磷酸泛酰巯基乙胺基团与正在生长的酰基链形成硫酯。PPT酶是一个酶家族，其在脂肪酸合成、聚酮合成和非核糖体肽合成中得到了充分的描述。许多PPT酶序列是已知的，并确定了晶体结构(例如，Reuter K，Mofid MR，Marahiel MA，Ficner R.“Crystal structure of the surfactin synthetase-activatingenzyme sfp：a prototype of the 4′-phosphopantetheinyl transferase superfamily”EMBO J.1999Dec1；18(23)：6823-31)，而且对于活性重要的氨基酸残基进行了突变分析(Mofid MR，Finking R，Essen LO，Marahiel MA.“Structure-basedmutational analysis of the 4′-phosphopantetheinyl transferases Sfp from Bacillussubtilis：carrier protein recognition and reaction mechanism”Biochemistry.2004Apr13；43(14)：4128-36)。在来自本文所述两种希瓦氏菌属菌株的pfaE ORFs内含有PPT酶中的这些不变且高度保守的氨基酸。此外，希瓦氏菌属菌种SCRC-2738 orf2中的pfaE ORF同源物已被证明是天然菌株中的活性所必需的(Yazawa K.“Production of eicosapentaenoic acid from marine bacteria”.Lipids.1996 Mar；31 Suppl：S297-300.)，且标记实验证实了它的PPT酶活性(WO 98/55625)。
本发明的基础是在高达大约25-30℃，甚至可能更高(例如35℃)的温度下产生PUFA并生长良好的特定海洋细菌(例如，Shewanella olleyana和Shewanella japonica)的PUFA PKS系统，尽管本发明确实考虑将来自这些细菌PUFA PKS系统的域与来自其它细菌和非细菌PUFA PKS系统的域联合使用，例如在美国专利No.6,140,486、美国专利No.6,566,583、美国专利申请序列No.10/124,800和美国专利申请序列No.10/810,352中所描述的那些。更具体地，本发明的PUFA PKS系统可以和其它PUFA PKS系统联用，产生杂合构建体(hybrid construct)和遗传修饰的微生物和植物，以改善或改变这些微生物和植物的生物产品生产。例如，根据本发明，可产生这样的遗传修饰的生物体：其包含非细菌PUFA PKS功能域和细菌PUFA PKS功能域(优选为本发明的那些)，以及来自其它PKS系统(I型、II型、III型)或FAS系统的PKS功能域或蛋白质。
本文中称“非细菌PUFA PKS”系统时是指从非细菌生物体分离的PUFAPKS系统，或者是来自非细菌生物体的PUFA PKS系统的同源物或衍生自这样的PUFA PKS系统，所述非细菌生物体例如真核生物或古细菌。真核生物基于细胞分化的程度而与原核生物区分开来，真核生物具有分化程度更高的细胞，而原核生物具有分化程度较低的细胞。一般地，原核生物不具有核膜，在细胞分裂中不显示有丝分裂，只具有一条染色体，其细胞质含有70S核糖体，它们不具有任何线粒体、内质网、叶绿体、溶酶体或高尔基体，其鞭毛(如果存在)由单条原纤维构成。对比地，真核生物具有核膜，在细胞分裂期间显示有丝分裂，具有许多染色体，其细胞质含有80S核糖体，它们具有线粒体、内质网、叶绿体(在藻类中)、溶酶体和高尔基体，其鞭毛(如果存在)由多条原纤维构成。一般地，细菌是原核生物，而藻类、真菌、原生生物(protist)、原生动物和高等植物是真核生物。
非细菌PUFA PKS系统包括在上文指明的专利和专利申请中已经描述的那些，特别地包括从任何破囊壶菌目生物中分离或衍生的任何PUFA PKS系统。在美国专利No.6,566,583中，对来自Schizochytrium且与希瓦氏菌属菌株SCRC2738 PKS基因显示同源性的数个cDNA克隆进行了测序，并将各个克隆组装成代表两个部分开放阅读框和一个完整开放阅读框的核酸序列。本发明人对cDNA和基因组克隆进行了进一步的测序，从而得以鉴定了Schizochytrium中OrfA、OrfB和OrfC各自的全长基因组序列，并完全鉴定了Schizochytrium中与希瓦氏菌中的域具有同源性的域。这些基因在同上的美国专利申请系列No.10/124,800中有详细的描述，并在下面有一些详细说明。类似地，美国专利申请系列No.10/810,352详细描述了破囊壶菌属(具体为破囊壶菌属菌种23B(ATCC 20892))中编码PUFA PKS系统的基因的全长基因组序列，以及破囊壶菌属中构成PUFA PKS系统的域。
根据本发明，短语“开放阅读框”用缩写“Orf’”表示。需要注意，由开放阅读框编码的蛋白质也可用全大写字母＂ORF＂表示，开放阅读框的核酸序列也可用全小写字母＂orf＂表示，但是出于一致性考虑，本文优选地使用拼写＂Orf＂描述核酸序列或由其编码的蛋白质。根据使用该术语的上下文可以显然明了所指称的是蛋白质还是核酸序列。
图1显示了来自希瓦氏菌属菌株SCRC-2738(“Yazawa”菌株；Yazawa K.“Production of eicosapentaenoic acid from marine bacteria”Lipids.1996 Mar；31Suppl：S297-300)的PUFA PKS(也称作“EPA产物”)基因簇和来自Shewanellajaponica(粘粒3F3)和Shewanella olleyana(粘粒9A10)的本发明基因簇的构造。图2显示了来自希瓦氏菌属菌种SCRC-2738(“Yazawa”菌株)的PUFAPKS基因簇的域构造和由来自Shewanella japonica(粘粒3F3)和Shewanellaolleyana(粘粒9A10)的基因簇所编码的域构造。每个开放阅读框的域结构在下文加以说明。
Shewanella japonica PUFA PKS
SEQ ID NO：1是Shewanella japonica粘粒3F3的核苷酸序列，发现其含有15个ORF，如表1所示(见实施例2)。与该微生物中PUFA PKS系统相关的ORFs的表征如下。
pfaA(SEQ ID NO：1的核苷酸10491-18854)编码PFAS A(SEQ IDNO：2)，它是一种包含如下域的PUFA PKS蛋白：β-酮脂酰-ACP合酶(KS)(SEQ ID NO：1的核苷酸10575-12029，SEQ ID NO：2的氨基酸29-513)；丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)(SEQ ID NO：1的核苷酸12366-13319，SEQ ID NO：2的氨基酸625-943)；六个串联的酰基载体蛋白(ACP)域(SEQ IDNO：1的核苷酸14280-16157，SEQ ID NO：2的氨基酸1264-1889)；β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)(SEQ ID NO：1的核苷酸17280-17684，SEQ ID NO：2的氨基酸2264-2398)；和位于SEQ ID NO：2氨基酸2399-2787之间的PFAS A蛋白区域，包含脱水酶(DH)保守活性位点模体LxxHxxxGxxxxP(SEQ ID NO：2的氨基酸2504-2516)，本文称作DH-模体区域。
在PFAS A中，KS活性位点DXAC*位于SEQ ID NO：2的氨基酸226-229，C*是酰基附着位点。MAT活性位点GHS*XG位于SEQ ID NO：2的氨基酸721-725，S*是酰基结合位点。ACP活性位点LGXDS*位于如下的位置：SEQ ID NO：2的氨基酸1296-1300，氨基酸1402-1406，氨基酸1513-1517，氨基酸1614-1618，氨基酸1728-1732和氨基酸1843-1847，S*是磷酸泛酰巯基乙胺的附着位点。在SEQ ID NO：2的氨基酸2399-2787之间，PFAS A还包含上述的脱水酶(DH)保守活性位点模体LxxHxxxGxxxxP(SEQ ID NO：2的氨基酸2504-2516)。
pfaB(SEQ ID NO：1的核苷酸18851-21130)编码PFAS B(SEQ ID NO：3)，其是一种包含如下域的PUFA PKS蛋白：酰基转移酶(AT)(SEQ ID NO：1的核苷酸19982-20902，SEQ ID NO：3的氨基酸378-684)。
在PFAS B中，活性位点GXS*XG模体位于SEQ ID NO：3的氨基酸463-467，S*是酰基附着位点。
pfaC(SEQ ID NO：1的核苷酸21127-27186)编码PFAS C(SEQ ID NO：4)，其是一种包含如下域的PUFA PKS蛋白：KS(SEQ ID NO：1的核苷酸21139-22575，SEQ ID NO：4的氨基酸5-483)；链长度因子(CLF)(SEQ IDNO：1的核苷酸22591-23439，SEQ ID NO：4的氨基酸489-771)；和两个FabA3-羟酰-ACP脱水酶，称作DH1(SEQ ID NO：1的核苷酸25408-25836，SEQ IDNO：4的氨基酸1428-1570)和DH2(SEQ ID NO：1的核苷酸26767-27183，SEQID NO：4的氨基酸1881-2019)。
在PFAS C中，KS活性位点DXAC*位于SEQ ID NO：4的氨基酸211-214，C*是酰基附着位点。
pfaD(SEQ ID NO：1的核苷酸27197-28825)编码PFAS D(SEQ ID NO：5)，其是一种包含如下域的PUFAPKS蛋白：烯酰还原酶(ER)(SEQ ID NO：1的核苷酸27446-28687，SEQ ID NO：5的氨基酸84-497)。
pfaE(反向互补链上SEQ ID NO：1的核苷酸6150-7061)编码PFASE(SEQ ID NO：6)，其是一种4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)，具有已鉴定的域(SEQ ID NO：1的核苷酸6504-6944，SEQ ID NO：6的氨基酸40-186)。
Shewanella olleyana PUFA PKS
SEQ ID NO：7是Shewanella japonica粘粒9A10的核苷酸序列；发现其含有17个ORF，如表2所示(见实施例2)。与该微生物中PUFA PKS系统相关的ORFs的表征如下。
pfaA(SEQ ID NO：7的核苷酸17437-25743)编码PFAS A(SEQ IDNO：8)，其是一种包含如下域的PUFA PKS蛋白：β-酮脂酰-ACP合酶(KS)(SEQ ID NO：7的核苷酸17521-18975，SEQ ID NO：8的氨基酸29-513)；丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)(SEQ ID NO：7的核苷酸19309-20265，SEQ ID NO：8的氨基酸625-943)；六个串联的酰基载体蛋白(ACP)域(SEQ IDNO：7的核苷酸21259-23052，SEQ ID NO：8的氨基酸1275-1872)；β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)(SEQ ID NO：7的核苷酸24154-24558，SEQ ID NO：8的氨基酸2240-2374)；和位于SEQ ID NO：8氨基酸2241-2768之间的PFAS A蛋白区域，其包含脱水酶(DH)保守活性位点模体LxxHxxxGxxxxP(SEQ IDNO：8的氨基酸2480-2492)，本文称作DH-模体区域。
在PFAS A中，KS活性位点DXAC*位于SEQ ID NO：8的AA226-229，C*是酰基附着位点。MAT活性位点GHS*XG位于SEQ ID NO：8的氨基酸721-725，S*是酰基结合位点。ACP活性位点LGXDS*位于如下的位置：SEQID NO：8的氨基酸1307-1311，氨基酸1408-1412，氨基酸1509-1513，氨基酸1617-1621，氨基酸1721-1725和氨基酸1826-1830，S*是磷酸泛酰巯基乙胺的附着位点。在SEQ ID NO：8的氨基酸2241-2768之间，PFAS A还包含上述的脱水酶(DH)保守活性位点模体LxxHxxxGxxxxP(SEQ ID NO：8的氨基酸2480-2492)。
pfaB(SEQ ID NO：7的核苷酸25740-27971)编码PFAS B(SEQ ID NO：9)，其是一种包含如下域的PUFA PKS蛋白：酰基转移酶(AT)(SEQ ID NO：1的核苷酸26837-27848，SEQ ID NO：9的氨基酸366-703)。
在PFAS B中，活性位点GXS*XG模体位于SEQ ID NO：9的氨基酸451-455，S*是酰基附着位点。
pfaC(SEQ ID NO：7的核苷酸27968-34030)编码PFAS C(SEQ IDNO：10)，其是一种包含如下域的PUFA PKS蛋白：KS(SEQ ID NO：7的核苷酸27995-29431，SEQ ID NO：10的氨基酸10-488)；链长度因子(CLF)(SEQ IDNO：7的核苷酸29471-30217，SEQ ID NO：10的氨基酸502-750)；和两个FabA3-羟酰-ACP脱水酶，称作DH1(SEQ ID NO：7的核苷酸32258-32686，SEQ IDNO：10的氨基酸1431-1573)和DH2(SEQ ID NO：7的核苷酸33611-34027，SEQ ID NO：10的氨基酸1882-2020)。
在PFAS C中，KS活性位点DXAC*位于SEQ ID NO：10的氨基酸216-219，C*是酰基附着位点。
pfaD(SEQ ID NO：7的核苷酸34041-35669)编码PFAS D(SEQ IDNO：11)，一种包含如下域的PUFA PKS蛋白：烯酰还原酶(ER)(SEQ ID NO：7的核苷酸34290-35531，SEQ ID NO：11的氨基酸84-497)。
pfaE(反向互补链上SEQ ID NO：7的核苷酸13027-13899)编码PFASE(SEQ ID NO：12)，其是一种4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)，具有已鉴定的域(SEQ ID NO：7的核苷酸13369-13815，SEQ ID NO：12的氨基酸29-177)。
来自上述两种希瓦氏菌属菌株的pfaC ORF和来自Shewanella olleyana的pfaE ORF均被预测以TTG作为起始密码子。尽管在细菌中，TTG与ATG和GTG相比是较罕见的起始密码子，但是它被预测为1.1％的大肠杆菌基因和11.2％的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)基因的起始密码子(Hannenhalli SS，Hayes WS，Hatzigeorgiou AG，Fickett JW.“Bacterial start site prediction”.Nucleic Acids Res.1999 Sep 1；27(17)：3577-82)。有几个系列的证据支持给这些ORFs的开头标注以TTG密码子。首先，两种计算基因发现工具(EasyGene和GeneMark.hmm)都预测这三种ORF的起始密码子是TTG。其次，从这三个ORF的TTG开始进行翻译，使得相同或相似蛋白质残基的空间分布(spacing)和范围(range)相对于Genbank数据库中的同源基因保守。这些基因中的起始密码子是TTG的另一条证据是预测的核糖体结合位点(RBS)。RBS在起始密码子上游大约7-12个核苷酸，并且通常富含嘌呤。表5(见实施例2)显示了所有pfa ORF的上游区域和可能的RBS。两种pfaC ORFs都显示与TTG起始密码子上游的规范RBS高度同源。表5还显示了标注TTG起始密码子的这三种ORF的备选起始密码子和RBS。还发现来自本文所述希瓦氏菌属菌株的pfaE ORFs与来自希瓦氏菌属菌种SCRC-2738(GenBank编号U73935)的EPA生物合成基因簇的orf2同源。在异源表达系统中证明，希瓦氏菌属菌种SCRC-2738的orf2从标记的ATG开始的表达不支持EPA的生产(见PCT公开No.WO 98/55625)。当在表达中换用另一上游起始密码子TTG时，在异源表达系统中发现了EPA的产生。本文所述两种pfaE ORF的标注的起始密码子所编码的氨基酸，与从来自希瓦氏菌属菌种SCRC-2738的orf2(图4)的可选TTG起始密码子开始被编码的氨基酸相似和相同(图4)。这一点也为用TTG起始密码子标注来自Sh.Olleyana的pfaEORF提供了支持。最后，来自两种希瓦氏菌菌株的pfaC ORF起始密码子与pfaB终止密码子重叠(图3)。ORFs重叠是细菌操纵子的共同特征，并认为是一种在转录水平上偶连两个或多个基因的手段。
本发明的一个实施方案涉及来自本文所述细菌PUFA PKS系统的分离的蛋白质或域，其同源物，和/或其片段。本发明还包括编码本文所述任何蛋白质、域或肽的分离核酸分子(在下文有详细讨论)。根据本发明，分离的蛋白质或肽，例如来自PUFA PKS系统的蛋白质或肽，是从其自然环境脱离(也就是经过了人为操作)的蛋白质或其片段(包括多肽或肽)，并可包括例如纯化蛋白质、部分纯化蛋白质、重组产生的蛋白质和合成产生的蛋白质。就其本身而言，“分离的”并不反映蛋白质被纯化的程度。优选地，本发明的分离蛋白质是重组产生的。分离的肽可以是合成地(例如，化学地，如通过肽合成)或重组地产生的。此外，作为实例，“Shewanella japonic aPUFAPKS蛋白质”是指来自Shewanella japonica微生物的PUFA PKS蛋白质(一般性地包括自然存在的PUFA PKS蛋白质的同源物)，或者指根据对于来自Shewanella japonica的天然PUFA PKS蛋白质的结构(例如序列)以及(可能地)功能的知识，以其它方式产生的PUFA PKS蛋白质。换言之，一般所称的Shewanella japonica PUFA PKS蛋白质包括任何具有与来自Shewanellajaponica的天然PUFA PKS蛋白质基本上相似的结构和功能的PUFA PKS蛋白质，或者是来自Shewanella japonica的天然PUFA PKS蛋白质的生物活性(即，具有生物活性的)同源物，如本文详细说明的。就其本身而言，Shewanella japonica PUFA PKS蛋白质可包括纯化、部分纯化的、重组的、突变的/修饰的和合成的蛋白质。该相同的描述适用于指称本文所述的其它蛋白质或肽，例如来自Shewanella olleyana的PUFA PKS蛋白质和域。
根据本发明，术语“修饰”和“突变”可互换使用，特别是就本文所述蛋白质或肽的主要氨基酸序列(或核酸序列)的修饰/突变而言。术语“修饰”还可用于描述蛋白质或肽的翻译后修饰，包括但不限于，甲基化、法尼基化、羧甲基化、牻牛儿基牻牛儿基化、糖基化、磷酸化、乙酰化、豆蔻酰化、异戊二烯基化、棕榈酸化(palmitation)和/或酰胺化。修饰还可包括，例如，使蛋白质或肽与其它化合物复合(complex)。这类修饰可看作是突变，例如，如果修饰与自然的、野生型蛋白质或肽中发生的翻译后修饰不同的话。
如本文所用的，术语“同源物”用于指这样的蛋白质或肽：其通过对天然蛋白质或肽(即“原型”或“野生型”蛋白质或肽)发生的一个或多个次要的修饰或突变而不同于天然的蛋白质或肽，但保持天然形式的整体基本蛋白质和侧链结构(也就是说，使得该同源物可以被确认与野生型蛋白质相关)。这类变化包括，但不限于：一个或少数氨基酸侧链的改变；一个或少数氨基酸的改变，包括缺失(例如蛋白质或肽的截短形式)、插入和/或取代；一个或少数原子的立体化学改变；和/或次要的衍生化，包括但不限于，甲基化、法尼基化、牻牛儿基牻牛儿基化、糖基化、羧甲基化、磷酸化、乙酰化、豆蔻酰化、异戊二烯基化、棕榈酸化和/或酰胺化。同源物与天然蛋白质或肽相比可具有增强、降低或基本上相似的性质。下面将详细描述PUFA PKS蛋白质或域的优选同源物。需要注意，同源物可包括合成产生的同源物、给定蛋白质或域的天然等位变体、或来自与参考序列所来源的生物体不同的生物体的同源序列。
保守取代通常包括下面各组内的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸和酪氨酸。取代还可以根据保守的疏水性或亲水性(Kyte and Doolittle，J.Mol.Biol.157：105(1982))，或者根据采取相似的多肽二级结构的能力进行(Chou and Fasman，Adv.Enzymol.47：45(1978))。
同源物可以是自然等位变异或自然突变的结果。对于编码蛋白质的核酸，其天然等位变体是这样的基因：其与编码该蛋白质的基因出现在基因组中基本上相同的座位(或多个座位)上，但是，由于例如突变或重组而造成的自然改变，其具有相似但不相同的序列。等位变体通常编码这样的蛋白质，该蛋白质的活性和与它们作比较的基因所编码的蛋白质相似。对于一类等位变体而言，它们可能编码相同的蛋白质，但由于遗传密码的简并而具有不同的核酸序列。等位变体还可包括基因5′或3′非翻译区中(例如在调节控制区中)的改变。等位变体对于本领域普通技术人员而言是熟知的。
同源物可用本领域中已知的用于产生蛋白质的技术来产生，包括但不限于，直接修饰分离的天然蛋白质、直接蛋白质合成、或使用例如经典的或重组DNA技术来修饰编码该蛋白质的核酸序列，以实现随机或靶向诱变。
蛋白质同源物中的修饰或突变与野生型蛋白质相比，提高、降低或基本上不改变与天然(野生型)的蛋白质相比的同源物的基本生物活性。一般地，蛋白质的生物活性或生物作用是指在体内(也就是在蛋白质的自然生理环境中)或体外(也就是在实验室条件下)测量或观察到的、被蛋白质所显示或执行，并被归属于该蛋白质的天然形式的任何功能。本文在别处详细描述了PUFA PKS系统和构成PUFA PKS系统的个体蛋白质/域的生物活性。蛋白质的修饰，例如同源物中的修饰，可导致产生具有与天然的蛋白质相同的生物活性的蛋白质，或者具有与天然的蛋白质相比降低或升高的生物活性的蛋白质。导致蛋白表达降低或蛋白质活性降低的修饰可称作蛋白质的失活(inactivation)(完全或部分)、下调(down-regulation)或作用(或活性)降低。相似地，导致蛋白表达升高或蛋白质活性升高的修饰可称作蛋白质的扩增(amplification)、过量生产(overproduction)、活化(activation)、增强(enhancement)、上调或(upregulation)作用(或活性)升高。需要注意，一般性地指称“具有野生型蛋白质生物活性的同源物”并不一定意味着该同源物具有与野生型蛋白质完全一致的生物活性，尤其是对于生物活性的水平而言。相反，同源物可执行与野生型蛋白质相同的生物活性，但与野生型蛋白质相比，活性水平降低或升高。PUFA PKS系统的功能域是能够执行生物功能(即，具有生物活性)的域(即，域可以是蛋白质的一部分)。
检测和测量PUFA PKS蛋白质或域生物活性的方法包括，但不限于：测量PUFA PKS蛋白质或域的转录，测量PUFA PKS蛋白质或域的翻译，测量PUFA PKS蛋白质或域的翻译后修饰，测量PUFA PKS蛋白质或域的酶活性，和/或测量PUFA PKS系统一种或多种产物的产生(例如PUFA的产生)。需要注意，本发明的分离蛋白质(包括同源物)对于具有野生型蛋白质的生物活性而言不是必需的。例如，PUFA PKS蛋白质或域可以是例如截短的、突变的或失活的蛋白质。这类蛋白质在例如筛选测定中有用，或者可用于其它目的，例如抗体生产。在优选实施方案中，本发明的分离蛋白质具有与野生型蛋白质相似的生物活性(尽管不必相等，如上文所述)。
测量蛋白质表达的方法一般包括，但不限于：Western印迹、免疫印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀、表面等离子体共振、化学发光、荧光偏振、磷光、免疫组化分析、基质辅助激光解吸/离子化飞行时间(MALDI-TOF)质谱、microcytometry、微阵列、显微术、荧光激活细胞分选技术(FACS)和流式细胞术，以及基于蛋白质性质的测定，所述性质包括但不限于，酶活性或与其它蛋白配偶体的相互作用。结合测定也是在本领域众所周知的。例如，可使用BIAcore仪器确定两个蛋白质之间复合体的结合常数。复合体的解离常数可通过在缓冲液流过芯片上方时监视折射系数随时间的改变来确定(O′Shannessy等Anal.Biochem.212：457(1993)；Schuster等，Nature 365：343(1993))。其它用于测量一个蛋白与另一个蛋白结合的合适测定方法包括，例如，免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)；或通过荧光、UV吸收、圆二色性或核磁共振(NMR)监视蛋白质的光谱或光学性质确定结合。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的蛋白质，其包括由选自下列的氨基酸序列，基本上由选自下列的氨基酸序列构成，或由选自下列的氨基酸序列构成：SEQ ID NO：2-6或8-12中的任何一个序列，或其生物活性域或片段。上文详细描述了在SEQ ID NO：2-6和8-12所示PUFA PKS蛋白质中所含的域。在另一个实施方案中，本发明涉及SEQ ID NO：2-6和8-12中任何一个所示蛋白的分离的同源物。这种同源物包括如下所述的氨基酸序列，基本上由如下所述的氨基酸序列构成，或由如下所述的氨基酸序列构成：该氨基酸序列与SEQ ID NO：2-6和8-12中的任何一个具有至少大约60％的同一性，并具有SEQ ID NO：2-6或8-12所示相应蛋白质所含的至少一个域的生物活性。在进一步的实施方案中，本发明涉及由SEQ ID NO：2-6或8-12中任何一个所示的PUFA PKS蛋白质的域的同源物，其中该同源物包括下述的氨基酸序列，基本上由下述氨基酸序列构成，或由下述氨基酸序列构成：所述氨基酸序列与来自SEQ ID NO：2-6或8-12中的任何一个的域具有至少大约60％的同一性，并具有来自SEQ ID NO：2-6或8-12中的任何一个的域的生物活性。在其它实施方案中，任何上述同源物与SEQ IDNO：2-6或8-12中任一序列，或者与这些序列中包含的域，具有至少大约65％的同一性，更优选至少大约70％的同一性，更优选至少大约75％的同一性，更优选至少大约80％的同一性，更优选至少大约85％的同一性，更优选至少大约90％的同一性，更优选至少大约95％的同一性，更优选至少大约96％的同一性，更优选至少大约97％的同一性，更优选至少大约98％的同一性，更优选至少大约99％的同一性(或从60％到99％(以整单个百分点为增量)之间的任何百分数)。如上所述，同源物优选地具有作为其来源或与其相关的蛋白质或域(即，具有参考氨基酸序列的蛋白质或域)的生物活性。
本发明的一个实施方案涉及由SEQ ID NO：2代表的蛋白质的分离同源物，其包括下述氨基酸序列，基本上由该氨基酸序列构成，或由该氨基酸序列构成：该氨基酸序列与SEQ ID NO：2，或者与如前所述的SEQ ID NO：2内的生物活性域具有至少大约65％的同一性，其中该同源物具有由SEQ IDNO：2代表的相应蛋白质内所包含的至少一个域的生物活性。在其它实施方案中，同源物与SEQ ID NO：2或其域具有至少大约70％的同一性，更优选至少大约75％的同一性，更优选至少大约80％的同一性，更优选至少大约85％的同一性，更优选至少大约90％的同一性，更优选至少大约95％的同一性，更优选至少大约96％的同一性，更优选至少大约97％的同一性，更优选至少大约98％的同一性，更优选至少大约99％的同一性(或从60％到99％(以整单个百分点为增量)之间的任何百分数)。
本发明的另一个实施方案涉及由SEQ ID NO：3代表的蛋白质的分离同源物，其包括下述氨基酸序列，基本上由下述氨基酸序列构成，或由下述氨基酸序列构成：该氨基酸序列与SEQ ID NO：3，或者与如前所述的SEQ IDNO：3内的生物活性域具有至少大约60％的同一性，其中该同源物具有在由SEQ ID NO：3代表的相应蛋白质内所含的至少一个域的生物活性。在其它实施方案中，同源物与SEQ ID NO：3或其域具有至少大约65％的同一性，更优选至少大约70％的同一性，更优选至少大约75％的同一性，更优选至少大约80％的同一性，更优选至少大约85％的同一性，更优选至少大约90％的同一性，更优选至少大约95％的同一性，更优选至少大约96％的同一性，更优选至少大约97％的同一性，更优选至少大约98％的同一性，更优选至少大约99％的同一性(或从60％到99％(以整单个百分点为增量)之间的任何百分数)。
本发明的另一个实施方案涉及由SEQ ID NO：4代表的蛋白质的分离同源物，其包括下述氨基酸序列，基本上由下述氨基酸序列构成，或由下述氨基酸序列构成：该氨基酸序列与SEQ ID NO：4，或者与如前所述的SEQ IDNO：4内的生物活性域具有至少大约70％的同一性，其中该同源物具有在由SEQ ID NO：4代表的相应蛋白质内所含的至少一个域的生物活性。在其它实施方案中，同源物与SEQ ID NO：4或其域具有至少75％的同一性，更优选至少大约80％的同一性，更优选至少大约85％的同一性，更优选至少大约90％的同一性，更优选至少大约95％的同一性，更优选至少大约96％的同一性，更优选至少大约97％的同一性，更优选至少大约98％的同一性，更优选至少大约99％的同一性(或从60％到99％(以整单个百分点为增量)之间的任何百分数)。
本发明的另一个实施方案涉及由SEQ ID NO：5代表的蛋白质的分离同源物，其包括下述氨基酸序列，基本上由下述氨基酸序列构成，或由下述氨基酸序列构成：该氨基酸序列与SEQ ID NO：5，或者与如前所述的SEQ IDNO：5内的生物活性域具有至少大约95％的同一性，其中该同源物具有由SEQ ID NO：5代表的相应蛋白质内所包含的至少一个域的生物活性。在其它实施方案中，同源物与SEQ ID NO：5或其域具有至少大约96％的同一性，更优选至少大约97％的同一性，更优选至少大约98％的同一性，更优选至少大约99％的同一性。
本发明的另一个实施方案涉及由SEQ ID NO：6代表的蛋白质的分离同源物，其包括下述氨基酸序列，基本上由下述氨基酸序列构成，或由下述氨基酸序列构成：该氨基酸序列与SEQ ID NO：6，或者与如前所述的SEQ IDNO：6内的生物活性域具有至少大约60％的同一性，其中该同源物具有由SEQ ID NO：6代表的相应蛋白质内所包含的至少一个域的生物活性。在其它实施方案中，同源物与SEQ ID NO：6或其域具有至少大约65％的同一性，更优选至少大约70％的同一性，更优选至少大约75％的同一性，更优选至少大约80％的同一性，更优选至少大约85％的同一性，更优选至少大约90％的同一性，更优选至少大约95％的同一性，更优选至少大约96％的同一性，更优选至少大约97％的同一性，更优选至少大约98％的同一性，更优选至少大约99％的同一性(或从60％到99％(以整单个百分点为增量)之间的任何百分数)。
本发明的另一个实施方案涉及由SEQ ID NO：8代表的蛋白质的分离同源物，其包括下述氨基酸序列，基本上由下述氨基酸序列构成，或由下述氨基酸序列构成：该氨基酸序列与SEQ ID NO：8，或者与如前所述的SEQ IDNO：8内的生物活性域具有至少大约65％的同一性，其中该同源物具有由SEQ ID NO：8代表的相应蛋白质内所包含的至少一个域的生物活性。在其它实施方案中，同源物与SEQ ID NO：8或其域具有至少大约70％的同一性，更优选至少大约75％的同一性，更优选至少大约80％的同一性，更优选至少大约85％的同一性，更优选至少大约90％的同一性，更优选至少大约95％的同一性，更优选至少大约96％的同一性，更优选至少大约97％的同一性，更优选至少大约98％的同一性，更优选至少大约99％的同一性(或从60％到99％(以整单个百分点为增量)之间的任何百分数)。
本发明的另一个实施方案涉及由SEQ ID NO：9代表的蛋白质的分离同源物，其包括下述氨基酸序列，基本上由下述氨基酸序列构成，或由下述氨基酸序列构成：该氨基酸序列与SEQ ID NO：9，或者与如前所述的SEQ IDNO：9内的生物活性域具有至少大约60％的同一性，其中该同源物具有由SEQ ID NO：9代表的相应蛋白质内所包含的至少一个域的生物活性。在其它实施方案中，同源物与SEQ ID NO：9或其域具有至少大约65％的同一性，更优选至少大约70％的同一性，更优选至少大约75％的同一性，更优选至少大约80％的同一性，更优选至少大约85％的同一性，更优选至少大约90％的同一性，更优选至少大约95％的同一性，更优选至少大约96％的同一性，更优选至少大约97％的同一性，更优选至少大约98％的同一性，更优选至少大约99％的同一性(或从60％到99％(以整单个百分点为增量)之间的任何百分数)。
本发明的另一个实施方案涉及由SEQ ID NO：10代表的蛋白质的分离同源物，其包括下述氨基酸序列，基本上由下述氨基酸序列构成，或由下述氨基酸序列构成：该氨基酸序列与SEQ ID NO：10，或者与如前所述的SEQID NO：10内的生物活性域具有至少大约70％的同一性，其中该同源物具有由SEQ ID NO：10代表的相应蛋白质内所包含的至少一个域的生物活性。在其它实施方案中，同源物与SEQ ID NO：10或其域具有至少大约75％的同一性，更优选至少大约80％的同一性，更优选至少大约85％的同一性，更优选至少大约90％的同一性，更优选至少大约95％的同一性，更优选至少大约96％的同一性，更优选至少大约97％的同一性，更优选至少大约98％的同一性，更优选至少大约99％的同一性(或从60％到99％(以整单个百分点为增量)之间的任何百分数)。
本发明的另一个实施方案涉及由SEQ ID NO：11代表的蛋白质的分离同源物，其包括下述氨基酸序列，基本上由下述氨基酸序列构成，或由下述氨基酸序列构成：该氨基酸序列与SEQ ID NO：11，或者与如前所述的SEQID NO：11内的生物活性域具有至少大约85％的同一性，其中该同源物具有由SEQ ID NO：11代表的相应蛋白质内所包含的至少一个域的生物活性。在其它实施方案中，同源物与SEQ ID NO：11或其域具有至少大约90％的同一性，更优选至少大约95％的同一性，更优选至少大约96％的同一性，更优选至少大约97％的同一性，更优选至少大约98％的同一性，更优选至少大约99％的同一性(或从60％到99％(以整单个百分点为增量)之间的任何百分数)。
本发明的另一个实施方案涉及由SEQ ID NO：12代表的蛋白质的分离同源物，其包括下述氨基酸序列，基本上由下述氨基酸序列构成，或由下述氨基酸序列构成：该氨基酸序列与SEQ ID NO：12，或者与如前所述的SEQID NO：12内的生物活性域具有至少大约60％的同一性，其中该同源物具有由SEQ ID NO：12代表的相应蛋白质内所包含的至少一个域的生物活性。在其它实施方案中，同源物与SEQ ID NO：12或其域具有至少大约65％的同一性，更优选至少大约70％的同一性，更优选至少大约75％的同一性，更优选至少大约80％的同一性，更优选至少大约85％的同一性，更优选至少大约90％的同一性，更优选至少大约95％的同一性，更优选至少大约96％的同一性，更优选至少大约97％的同一性，更优选至少大约98％的同一性，更优选至少大约99％的同一性(或从60％到99％(以整单个百分点为增量)之间的任何百分数)。
在本发明的一个方面中，本发明涵盖的PUFA PKS蛋白质或域，包括本文所述的具体的PUFA PKS蛋白或域的同源物，包含如下氨基酸序列：该氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：2-6或8-12中任一序列的氨基酸序列的至少大约100个连续的氨基酸，其中所述同源物的氨基酸序列具有至少一个如本文所述的域或蛋白质的生物活性。在另一方面中，蛋白质的氨基酸序列包括SEQ ID NO：2-6或8-12中任何序列的至少大约200个连续的氨基酸，更优选至少大约300个连续的氨基酸，更优选至少大约400个连续的氨基酸，更优选至少大约500个连续的氨基酸，更优选至少大约600个连续的氨基酸，更优选至少大约700个连续的氨基酸，更优选至少大约800个连续的氨基酸，更优选至少大约900个连续的氨基酸，更优选至少大约1000个连续的氨基酸。
在本发明的优选实施方案中，本发明的分离蛋白质或域包括选自下列的氨基酸序列，基本上由选自下列的氨基酸序列构成，或由选自下列的氨基酸序列氨基酸序列构成：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ IDNO：11，SEQ ID NO：12，或其任何生物活性片段或域。
在一个实施方案中，本文所述并在上文提及的PUFA PKS系统的生物活性域选自下列的氨基酸序列，基本上由选自下列的氨基酸序列构成，或由选自下列的氨基酸序列氨基酸序列构成：(1)SEQ ID NO：2的大约29位-大约513位，其中该域具有KS生物活性；(2)SEQ ID NO：2的大约625位-大约943位，其中该域具有MAT生物活性；(3)SEQ ID NO：2的大约1264位-大约1889位及其亚域，其中该域或其亚域具有ACP生物活性；(4)SEQID NO：2的大约2264位-大约2398位，其中该域具有KR生物活性；(5)包括SEQ ID NO：2的大约2504位-大约2516位的序列，其中该域具有DH生物活性，优选为非类FabA DH活性；(6)SEQ ID NO：3的大约378位-大约684位，其中该域具有AT生物活性；(7)SEQ ID NO：4的大约5位-大约483位，其中该域具有KS生物活性；(8)SEQ ID NO：4的大约489位-大约771位，其中该域具有CLF生物活性；(9)SEQ ID NO：4的大约1428位-大约1570位，其中该域具有DH生物活性，且优选为类FabA DH活性；(10)SEQ IDNO：4的大约1881位-大约2019位，其中该域具有DH生物活性，并且优选为类FabA DH活性；(11)SEQ ID NO：5的大约84位-大约497位，其中该域具有ER生物活性；(12)SEQ ID NO：6的大约40位-大约186位，其中该域具有PPT酶生物活性；(13)SEQ ID NO：8的大约29位-大约513位，其中该域具有KS生物活性；(14)SEQ ID NO：8的大约625位-大约943位，其中该域具有MAT生物活性；(15)SEQ ID NO：8的大约1275位-大约1872位及其亚域，其中该域或其亚域具有ACP生物活性；(16)SEQ ID NO：8的大约2240位-大约2374位，其中该域具有KR生物活性；(17)包含SEQ ID NO：8的大约2480位-大约2492位的序列，其中该序列具有DH生物活性，且优选为非类FabA DH活性；(18)SEQ ID NO：9的大约366位-大约703位，其中该域具有AT生物活性；(19)SEQ ID NO：10的大约10位-大约488位，其中该域具有KS生物活性；(20)SEQ ID NO：10的大约502位-大约750位，其中该域具有CLF生物活性；(21)SEQ ID NO：10的大约1431位-大约1573位，其中该域具有DH生物活性，且优选为类FabA DH活性；(22)SEQ IDNO：10的大约1882位-大约2020位，其中该域具有DH生物活性，且优选为类FabA DH活性；(23)SEQ ID NO：11的大约84位-大约497位，其中该域具有ER生物活性；或(24)SEQ ID NO：12的大约29位-大约177位，其中该域具有PPT酶生物活性。
根据本发明，术语“毗邻的”(contiguous)或“连续的”(consecutive)，对于本文所述的核酸或氨基酸序列而言，是指连接成不间断的序列。例如，对于第一序列包含第二序列的30个毗邻(或连续)氨基酸的而言，是指第一序列中包含30个氨基酸残基的不间断序列，其与第二序列中30个氨基酸残基的不间断序列100％同一。相似地，第一序列与第二序列具有“100％的同一性”是指，第一序列与第二序列精确匹配，核苷酸或氨基酸之间没有缺口(gap)。
如本文所使用的，除非另有说明，“百分比(％)同一性”涉及一种同源性评估，其是如下进行的：(1)BLAST 2.0 Basic BLAST同源搜索，其中使用blastp进行氨基酸搜索，使用blastn进行核酸搜索，及使用blastX进行核酸搜索和所有6个开放阅读框中被翻译氨基酸的搜索，均使用标准默认参数，其中默认对查询序列进行低复杂性区(low complexity regions)过滤(在下列文献中有说明：Altschul，S.F.，Madden，T.L.，
Figure A200580042803D0054140903QIETU
，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.& Lipman，D.J.(1997)＂Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs.＂Nucleic Acids Res.25：3389，本文引入其全部内容作为参考)；(2)BLAST 2比对(使用下文所述的参数)；(3)和/或PSI-BLAST，使用标准默认参数[位置特异性迭代BLAST(Position-Specific Iterated BLAST)]。需要注意，由于BLAST 2.0 BasicBLAST和BLAST 2之间标准参数有一些差异，所以两个具体的序列可能在使用BLAST2程序时被识别为具有显著同源性，而用其中一个序列作为查询序列在BLAST 2.0 Basic BLAST中进行搜索时，第二个序列可能不会被确定为最匹配的结果之一。此外，PSI-BLAST提供了一种自动、易用的“谱”(＂profile＂)搜索形式，这是一种灵敏的寻找序列同源物的方法。程序首先执行有缺口的(gapped)BLAST数据库搜索。PSI-BLAST程序使用来源于任何返回的显著性匹配(significant alignments)的信息构建位置特异性评分矩阵(position-specific score matrix)，其取代查询序列用于下一轮数据库搜索。因此，可以理解，百分比同一性可使用这些程序中的任何一种来确定。
两个具体的序列可以使用BLAST 2序列相互比对，如Tatusova和Madden，＂Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotidesequences＂，FEMS Microbiol Lett.174：247(1999)所述的那样，本文引入其全部内容作为参考。在blastp或blastn中进行BLAST2序列比对，使用BLAST2.0算法，考虑到最终的序列匹配中缺口(缺失和插入)的引入，在两个序列之间进行有缺口的BLAST搜索(Gapped BlAST)(BLAST 2.0)，。为了使本文清楚，BLAST 2序列比对使用如下的标准默认参数进行。
对于blastn，使用0BLOSUM62矩阵：
匹配加分(reward for match)＝1
错配罚分(penalty for mismatch)＝-2
开放缺口(open gap)(5)和延伸缺口(extension gap)(2)罚分
缺口(gap)x_脱落(dropoff)(50)期望(expect)(10)字长(word size)(11)过滤(filter)(on)
对于blastp使用0 BLOSUM62矩阵：
开放缺口(11)和延伸缺口(1)罚分
缺口x_脱落(50)期望(10)字长(3)过滤(on)。
根据本发明，具有PUFA PKS系统中至少一个域的生物活性的氨基酸序列是具有在本文中详述的PUFA PKS系统中至少一个域(例如KS域、AT域、CLF域等)的生物活性的氨基酸序列。因此，本发明中有用的分离蛋白质可包括：任何PUFA PKS开放阅读框的翻译产物、任何PUFA PKS域、所述翻译产物或域的任何生物活性片段，或天然PUFA PKS开放阅读框产物或域的具有生物活性的任何同源物。
在本发明的另一个实施方案中，具有本发明PUFA PKS系统至少一个域的生物活性的氨基酸序列包括如下所述的氨基酸序列：其与本文所具体描述的天然PUFA PKS蛋白质或多肽足够相似，编码该氨基酸序列的核酸序列能够在中等、高或非常高严紧度的条件(如下所述)下与编码天然PUFAPKS蛋白质或多肽的核酸分子(即，与编码天然PUFA PKS蛋白质或多肽的核酸链的互补物(complement))杂交。优选地，具有本发明PUFA PKS系统至少一个域的生物活性的氨基酸序列由这样的核酸序列编码，该核酸序列可在中、高或非常高严紧度条件下与编码PUFA PKS蛋白质或域的任何上述氨基酸序列的核酸序列的互补物杂交。推导互补序列的方法是本领域技术人员已知的。应当注意，因为氨基酸测序和核酸测序技术不是完全没有错误的，所以本文提供的序列最多代表本发明PUFA PKS域和蛋白质的表观序列。
如本文使用的，杂交条件是指使用核酸分子鉴定相似的核酸分子的标准杂交条件。这些标准条件在例如下列文献中公开：Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labs Press(1989)。本文引用Sambrook等如上的文献全部内容作为参考(具体见第9.31-9.62页)。此外，在例如Meinkoth等，Anal.Biochem.138，267(1984)中公开了计算的合适杂交和洗涤条件，以实现允许不同程度的核苷酸错配的杂交的公式；本文引用Meinkoth等的上述论文的全部内容作为参考。
更具体地，本文涉及的中等严紧度的杂交和冲洗条件是指如下条件，其允许分离与用于探测杂交反应的核酸分子具有至少大约70％的核酸序列同一性的核酸分子(也就是说，允许大约30％或更少核苷酸错配的条件)。本文涉及的高严紧度的杂交和洗涤条件是指如下条件：其允许分离与用于探测杂交反应的核酸分子具有至少大约80％的核酸序列同一性的核酸分子(也就是说，允许大约20％或更少的核苷酸错配的条件)。本文涉及的非常高严紧度的杂交和洗涤条件是指如下条件：其允许分离与用于探测杂交反应的核酸分子具有至少大约90％的核酸序列同一性的核酸分子(也就是说，允许大约10％或更少核苷酸错配的条件)。如上面讨论的，本领域技术人员可以使用Meinkoth等同上中的公式计算合适的杂交和洗涤条件，以实现这些特定的核苷酸错配水平。这些条件会根据所形成的是DNA:RNA还是DNA:DNA杂交体而变化。DNA:DNA杂交体算得的熔点比DNA:RNA杂交体低10℃。在具体的实施方案中，对于DNA:DNA杂交体的严紧杂交条件包括在大约20℃到大约35℃之间(低严紧度)，更优选在大约28℃到大约40℃之间(更严紧的)，更优选在大约35℃到大约45℃之间(更严紧的)的温度条件下，在6X SSC(0.9M Na+)的离子强度下进行杂交，以及合适的洗涤条件。在具体的实施方案中，对于DNA:RNA杂交体的严紧杂交条件包括在大约30℃到大约45℃之间，更优选在大约38℃到大约50℃之间，更优选在大约45℃到大约55℃之间的温度条件下，在6X SSC(0.9M Na+)的离子强度下进行杂交，以及相似的严紧洗涤条件。这些值是基于大于约100个核苷酸的分子、0％甲酰胺、以及大约40％的G+C含量的熔点的计算结果。或者，Tm可以根据Sambrook等，如上，第9.31-9.62页中提出的那样经验地计算。一般地，洗涤条件应尽可能严紧，并应适合于所选的杂交条件。例如，杂交条件可包括盐和温度条件的组合，其中温度条件比特定杂交体的计算Tm低大约20-25℃，洗涤条件通常包括盐和温度条件的组合，其中温度条件比特定杂交体的计算Tm低大约12-20℃。适合于DNA∶DNA杂交体使用的杂交条件的一个实例包括在大约42℃条件下在6X SSC(50％甲酰胺)中杂交2-24小时，随后进行洗涤步骤，其包括在室温下在大约2X SSC中洗涤1次或多次，随后在更高温度和更低离子强度下进行进一步的洗涤(例如，在大约37℃和大约0.1X-0.5X SSC中进行至少一次洗涤，随后在大约68℃和大约0.1X-0.5X SSC中进行至少一次洗涤)。
本发明还包括一种融合蛋白质，其包括连接有一个或多个融合区段的任何PUFA PKS蛋白质或其域或任何同源物或片段。可用于本发明的合适融合区段包括，但不限于，可增强蛋白质稳定性的区段；提供其它期望的生物活性的区段；和/或有助于该蛋白质纯化(例如通过亲和色谱)的区段。合适的融合区段可以是任何大小的、具有期望的功能(例如提供更高的稳定性、溶解度、生物活性；和/或简化蛋白质的纯化)的域。融合区段可以连接到蛋白质的氨基和/或羧基末端，且可易于被切断而使人们能够直接回收期望的蛋白质。融合蛋白质优选通过培养用如下所述的融合核酸分子转染的重组细胞来产生：该融合核酸分子编码蛋白质，该蛋白质包括如上所述的本发明蛋白质，以及连接于本发明蛋白质的羧基和/或氨基末端的融合区段。
在本发明的一个实施方案中，产生的任何上述的PUFA PKS氨基酸序列，以及这些序列的同源物，其在给定氨基酸序列C-和/或N-末端之一的侧翼具有额外的异源氨基酸，其数目从至少一个到最多大约20个。所得的蛋白质或多肽可称作“基本上由给定的氨基酸序列组成”。根据本发明，“异源氨基酸”是如下所述的氨基酸的序列：所述氨基酸天然地不存在于(即，不存在于天然状态下，体内)指定氨基酸序列侧翼，或者不被编码指定氨基酸序列的天然核酸序列存在于基因中时与其侧翼连接的核苷酸所编码，如果所述核苷酸的天然序列是按照给定氨基酸序列的来源生物的标准密码子用法翻译的话。类似地，术语“基本上由......组成”在指称本文中的核酸序列时，是指如下的编码给定氨基酸序列的核酸序列，其在编码给定氨基酸序列的核酸序列5’和/或3’端各自侧翼邻接了至少一个到最多大约60个附加异源核苷酸。编码给定氨基酸序列的核酸序列出现在天然的基因中时，异源核苷酸天然不存在(即自然状态下不出现，体内不存在)于该核酸序列的侧翼。
本发明的蛋白质或域和/或其同源物或片段的最小大小，在一个方面中，是足以具有所需的生物活性，或足以充当用于产生或作为体外测定的靶标的大小。在一个实施方式中，本发明的蛋白为至少约8个氨基酸长(例如适于抗体表位或作为测定中的可检测肽)，或至少约25个氨基酸长，或至少约50个氨基酸长，或至少约100个氨基酸长，或至少约150个氨基酸长，或至少约200个氨基酸长，或至少约250个氨基酸长，或至少约300个氨基酸长，或至少约350个氨基酸长，或至少约400个氨基酸长，或至少约450个氨基酸长，或至少约500个氨基酸长，诸如此类，从8个氨基酸直到本发明的蛋白或域的全长之间的任何长度，或更长的长度，以整数计(例如，8，9，10，...25，26，...500，501，...)。除了实际条件的限制外，这样的蛋白的最大大小没有限制，因为该蛋白可包括PUFA PKS蛋白质的一部分、其域或生物活性片段或有用片段，或者全长的PUFA PKS蛋白，加上附加的序列(例如融合蛋白序列)，如果需要的话。
本发明的一个实施方案涉及分离的核酸分子，其包括如下核酸序列，基本上由如下核酸序列组成，或由如下核酸序列组成：编码本文所述的任何PUFA PKS蛋白质或域，包括这些蛋白质或域中任一个的同源物或片段的核酸序列；以及与之完全互补的核酸序列。根据本发明，“分离的核酸分子”是已经与其天然环境脱离(即，已经经受过人的操作)的核酸分子，其“天然环境”是该核酸分子天然所在的基因组或染色体。就其本身而言，“分离的”并不必然反映该核酸分子被纯化的程度，而是表明所述分子不包含该核酸分子天然所在的完整基因组或完整染色体。分离的核酸分子可能包含基因。包含某基因的分离的核酸分子并不是某个包含该基因的染色体的片段，而是包含该基因相关的编码区和调控区，但不包含天然存在于同一染色体上的其它基因，除了编码本文所述PUFA PKS系统的其它蛋白的其它基因之外。分离的核酸分子还可包含指定的核酸序列，该序列的侧翼(即该序列的5’和/或3’端)存在其它核酸，这些其它核酸在天然条件下通常不位于该指定的核酸序列的侧翼(即为异源序列)。分离的核酸分子可包含DNA、RNA(例如mRNA)、或DNA或RNA的衍生物(例如cDNA)。尽管短语“核酸分子”主要指物理的核酸分子，短语“核酸序列”主要指核酸分子上核苷酸的序列，但这两个短语可以互换使用，尤其是对于能够编码蛋白质或蛋白质的域的核酸分子或核酸序列而言。
优选地，本发明的分离的核酸分子是使用重组DNA技术(例如聚合酶链式反应(PCR)扩增，克隆)或化学合成生产的。分离的核酸分子包括天然核酸分子及其同源物，包括，但不限于，自然等位变体，以及这样的经修饰的核酸分子：其中核苷酸被插入、缺失、取代和/或倒位，使得这样的修饰针对如本文所述的PUKA PKS系统生物活性提供所需的效果。蛋白同源物(例如核酸同源物编码的蛋白)已在上文详细描述过了。
核酸分子同源物可使用本领域技术人员已知的多种方法生产(见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Labs Press(1989))。例如，可以用多种技术修饰核酸分子，包括，但不限于，经典诱变技术和重组DNA技术，例如定点诱变、化学处理核酸分子以诱发突变、限制酶切割核酸片段、连接核酸片段、核酸序列的所选区域的PCR扩增和/或诱变、合成寡核苷酸混合物并连接混合物组以“构建”(build)核酸分子的混合物，及其组合。通过筛选核酸所编码的蛋白的功能和/或与野生型基因杂交，可以从经修饰的核酸的混合物中选择出核酸分子同源物。
本发明核酸分子的最小尺寸是足以形成能够与本发明核酸分子的互补序列形成稳定杂交体(例如，在中等、高或非常高严紧度条件下)的探针或寡核苷酸引物的尺寸，或者是足以编码具有根据本发明的PUFA PKS系统的至少一个域的生物活性的氨基酸序列的尺寸。就其本身而言，编码这种蛋白质的核酸分子的尺寸可取决于核酸的组成和该核酸分子与互补序列之间的百分比同源性或同一性，以及取决于杂交条件本身(例如温度、盐浓度和甲酰胺浓度)。用作寡核苷酸引物或探针的核酸分子的最小尺寸通常的长度为：若该核酸分子富含GC，则至少为大约12-大约15个核苷酸，若富含AT，则至少为大约15-大约18个碱基。除了实际条件的限制之外，本发明核酸分子的最大尺寸没有限制，因为核酸分子可以包含足以编码下列物质的序列：PUFA PKS系统的域的生物活性片段、PUFA PKS系统的整个域、PUFA PKS系统开放阅读框(Orf)内的数个域、完整的单域或多域的PUFAPKS系统蛋白质，或者多于一种的PUFA PKS系统蛋白质。
在本发明的一个实施方案中，分离的核酸分子包括如下的核酸序列，基本上由如下的核酸序列的组成，或者由如下的核酸序列组成：该核酸序列编码上述的任意氨基酸序列，包括如本文所述的任何来自Shewanellajaponica或Shewanella olleyana的氨基酸序列或其同源物。在一个方面中，核酸序列从如下组中选择：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7，或者SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7的任何片段(区段，部分)，所述片段编码本文所述PUFAPKS系统的一个或多个域或蛋白质。在另一个方面中，核酸序列包括SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：7的任何片段，或者SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7的任何同源物(包括与这些序列同一性为至少大约50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列)，所述片段或同源物编码本文所述PUFA PKS系统的一个或多个域或蛋白质。在另一方面中，本发明涵盖这类核酸序列的片段和任何互补序列。
本发明的另一个实施方案包括重组核酸分子，其包含重组载体和编码蛋白质或肽的核酸序列，其中所述蛋白质或肽具有本文所述PUFA PKS蛋白质的至少一个域(或其同源物或片段)的生物活性。这些核酸序列在上文有详细说明。根据本发明，重组载体是工程化的(engineered)(即人工产生的)核酸分子，其作为工具，用来操作所选核酸序列和将该核酸序列导入宿主细胞。因此，重组载体适合用于对所选核酸序列进行克隆、测序和/或其它方式的操作，例如将所选核酸序列表达和/或递送到宿主细胞中从而形成重组细胞。这种载体通常含有异源核酸序列，即天然不存在于要克隆或递送的核酸序列附近的核酸序列，尽管载体还可以含有这样的调控性核酸序列(例如启动子、非翻译区)：其天然存在于本发明的核酸分子附近，或者可用于表达本发明的核酸分子(将在下文详细讨论)。载体可以是RNA或DNA，原核或真核，且通常是质粒。载体可以作为染色体外元件(例如质粒)被保持，或者可以整合到重组生物体(例如微生物或植物)的染色体中。整个载体可以在宿主细胞内保持在原位，或者，在某些条件下，质粒DNA可以被缺失，留下本发明的核酸分子。整合的核酸分子可以受染色体启动子的控制，受天然或质粒启动子的控制，或者受多个启动子的组合的控制。可以有单个拷贝或多个拷贝的核酸分子整合到染色体内。本发明的重组载体可含有至少一个可选择标记。
在一个实施方案中，本发明重组核酸分子中使用的重组载体是表达载体。如本文所使用的，词组“表达载体”用来指适合于产生编码产物(例如目的蛋白质)的载体。在本实施方案中，编码待生产产物(例如PUFA PKS域或蛋白质)的核酸序列被插入到重组载体中而产生重组核酸分子。编码待生产蛋白的核酸序列以这样的方式插入到载体中，使得载体中核酸分子与调控序列可操作地连接，从而使核酸序列能够在重组宿主细胞内进行转录和翻译。
在另一个实施方案中，本发明的重组核酸分子中使用的重组载体是打靶载体(targeting vactor)。如本文所使用的，词组“打靶载体”用来指用于将特定核酸分子递送到重组宿主细胞内的载体，其中该核酸分子被用来缺失、失活或取代宿主细胞或微生物内的内源基因或基因的一部分(即，用于靶向性基因破坏(targeted gene disruption)或敲除技术)。这种载体在本领域还被称作“敲除”载体。在本实施方案的一个方面中，载体的一部分，但更典型的是插入载体内的核酸分子(即，插入序列)，具有这样的核酸序列，其与宿主细胞内的靶基因(即，作为缺失和失活的目标的基因)的核酸序列同源。载体插入序列的核酸序列被设计成与靶基因相关，使得靶基因和插入序列可进行同源重组，藉此使内源靶基因缺失、失活、衰减(即通过突变或缺失内源靶基因的至少一部分)、或被取代。2003年9月4日公开的美国专利申请系列No.10/124,807，公开为美国专利公开No.20030166207，在其实施例部分中描述了利用此类重组载体，用例如重组基因替换内源Schizochytrium基因的用途，并且详细描述了遗传转化破囊壶菌目生物的一般技术。用于植物的遗传转化技术在本领域是众所周知的。本发明的一个实施方案中，本文所述的海洋细菌基因可用于转化植物或微生物，例如破囊壶菌目生物，以改善和/或改变(修饰，改变)这些植物或微生物的PUFAPKS生产能力。
通常，重组核酸分子包括本发明的至少一个核酸分子，其与一个或多个表达控制序列可操作连接。如本文所使用的，词组“重组分子”或“重组核酸分子”主要是指与表达控制序列可操作连接的核酸分子或核酸序列，但是当这种核酸分子是如本文所讨论的重组分子时，其可与词组“核酸分子”互换使用。根据本发明，词组“可操作连接”是指核酸分子与表达控制序列(例如转录控制序列和/或翻译控制序列)这样的方式相连接，使得该分子可以在被转化(也就是转化、转导、转染、接合或引导(conduce))进入宿主细胞时表达。转录控制序列是控制转录起始、延长或终止的序列。特别重要的转录控制序列是控制转录起始的序列，例如启动子、增强子、操纵基因或抑制蛋白序列。合适的转录控制序列包括任何这样的转录控制序列：其能够在该重组核酸分子所导入的宿主细胞或生物体中行使功能。
本发明的重组核酸分子还可包含其它调控序列，例如翻译调控序列、复制起点和其它与所述重组细胞相容的调控序列。在一个实施方案中，本发明的重组分子，包括整合到宿主细胞染色体内的重组分子，还含有分泌信号(也就是信号区段核酸序列)，使被表达的蛋白能够从产生该蛋白质的细胞分泌出去。合适的信号区段包括：与待表达的蛋白天然相关的信号区段，或者任何能够指导根据本发明蛋白分泌的异源信号区段。在另一个实施方案中，本发明的重组分子包括前导序列，以使被表达的蛋白能够被递送并插入到宿主细胞的膜内。合适的前导序列包括与蛋白质天然相关的前导序列，或者任何能够指导蛋白质递送到并插入细胞膜的异源前导序列。
可使用一种或多种本发明的重组分子来产生本发明的编码产物(例如，PUFA PKS域，蛋白质或系统)。在一个实施方案中，编码产物是这样产生的：在可有效产生所述蛋白质的条件下，表达本文所述的核酸分子。产生编码蛋白质的一种优选方法是用一个或多个重组分子转染宿主细胞，从而形成重组细胞。供转染的合适的宿主细胞包括，但不限于，任何可被转染的细菌、真菌(例如酵母)、昆虫、植物或动物细胞。在本发明的一个实施方案中，优选的宿主细胞是破囊壶菌目生物宿主细胞(在下文有详细说明)或植物宿主细胞。宿主细胞可以是未转染的细胞或者已经用至少一种其它重组核酸分子转染的细胞。
根据本发明，术语“转染”用于指任何可将外源核酸分子(即重组核酸分子)插入细胞的方法。当术语“转化”用来指将核酸分子导入微生物细胞，例如藻类、细菌和酵母，或导入植物细胞时，其可与术语“转染”互换使用。在微生物和植物系统中，术语“转化”用于描述由于微生物或植物获得了外源核酸而承继(inherited)的改变，与术语“转染”基本上同义。然而，在动物细胞中，转化具有第二种意思，其可以指例如培养中的细胞在癌化之后生长性质的改变。因此，为了避免混淆，术语“转染”优选对于外源核酸导入动物细胞使用，并且，在这些术语与将外源核酸导入细胞相关的范围内，本文将使用术语“转染”来概括性地涵盖动物细胞的转染以及微生物细胞或植物细胞的转化。因此，转染技术包括，但不限于，转化、粒子轰击、扩散、主动转运、浴槽式超声波处理(bath sonication)、电穿孔、显微注射、脂质转染、吸附、感染和原生质体融合。
本领域技术人员将认识到，使用重组DNA技术，可以通过操纵例如宿主细胞内核酸分子的拷贝数、核酸分子转录的效率、所得转录物翻译的效率和翻译后修饰效率等，来改善对被转染的核酸分子表达的控制。此外，可以对启动子序列进行基因工程操作，以提高与相比于天然启动子的表达水平。可用于控制核酸分子表达的重组技术包括，但不限于，将核酸分子整合到一条或多条宿主细胞染色体内、向质粒添加载体稳定性序列、置换或修饰转录控制信号(例如启动子、操纵基因、增强子)、置换或修饰翻译控制信号(例如，核糖体结合位点、Shine-Dalgarno序列)、修饰核酸分子以符合宿主细胞的密码子用法、和缺失使转录不稳定的序列。
上面关于重组核酸分子和转染宿主细胞的一般讨论可适用于本文所讨论的任何核酸分子，包括编码具有来自PUFA PKS系统的至少一个域的生物活性的任何氨基酸序列的核酸分子，编码来自其它PKS系统的氨基酸序列的核酸分子，和编码其它蛋白质或域的核酸分子。
多不饱和脂肪酸(PUFAs)是高等真核生物中的必需膜组分和许多脂质衍生的信号分子的前体。本发明的PUFA PKS系统使用这样的PUFA合成途径，其不需要饱和脂肪酸的去饱和及延长。由PUFA PKS系统催化的途径与先前鉴定的PKS系统在结构和机制上均截然不同。有人提出顺式双键的产生涉及位置特异性的异构酶；人们认为这些酶在产生抗生素的新家族中是有用的。
为了产生显著高产量的一种或多种所需多不饱和脂肪酸或其它生物活性分子，可对生物体，优选微生物或植物进行遗传修饰，改变微生物或植物中的PUFA PKS系统的活性，尤其是终产物，或者将PUFA PKS系统引入该微生物或植物中。
因此，本发明的一个实施方案涉及遗传修饰的微生物，其中该微生物表达PKS系统，该系统包含如本文所述的多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮合酶(PKS)系统的至少一个生物活性域(例如，来自Shewanella japonica或Shewanella olleyana的PUFA PKS系统的至少一个域或蛋白质，或其生物活性片段或同源物)。该微生物的遗传修饰影响该生物体中PKS系统的活性。PUFA PKS系统的域可以包括上述海洋细菌PUFA PKS系统的任何域，包括其同源物，并且还可以包括来自任何其它细菌或非细菌微生物，包括任何真核微生物，尤其包括任何破囊壶菌目微生物的PUFA PKS系统的任何域，或者来自通过美国专利申请系列No.10/124,800(同上)描述的筛选方法鉴定的微生物的PUFA PKS系统的任何域。简而言之，美国专利申请系列No.10/124,800中描述的筛选过程包括如下步骤：(a)选择产生至少一种PUFA的微生物；和(b)从(a)中鉴定这样的微生物：该微生物在发酵培养基中的溶解氧低于约5％饱和度的条件下，与其在发酵培养基中的溶解氧高于约5％饱和度，优选高于约10％饱和度，更优选高于约15％饱和度，更优选高于约20％饱和度的条件下产生的PUFA相比，能够产生更多的PUFA。美国专利No.6,140,486(同上)中描述了其它细菌PUFA PKS系统的蛋白质、域及其同源物，本文引用其全部内容作为参考。美国专利No.6,566,583(同上)、美国专利申请系列No.10/124,800(同上)和美国专利申请系列No.10/810,352(同上)中详细描述了破囊壶菌目生物PUFA PKS系统的蛋白质、域及其同源物，本文引用分别引用它们的全部内容作为参考。
在本发明的一个方面中，遗传修饰的生物体可以内源性地含有和表达PUFA PKS系统，并且遗传修饰可以是内源PUFA PKS系统的一个或多个功能域的遗传修饰，由此该修饰对PUFA PKS系统的活性具有某些影响。例如，本文描述的Shewanella japonica或Shewanella olleyana物种可通过修饰内源PUFA PKS基因(或多个基因)而被遗传修饰，导致该微生物中PUFAPKS功能发生某些变化(改变，修饰)。
在本发明的另一个方面中，遗传修饰的生物体可以内源性地含有和表达PUFA PKS系统，且遗传修饰可以是引入至少一个外源核酸序列(例如重组核酸分子)，其中该外源核酸序列编码来自另一PKS系统(包括PUFA PKS系统或另一类型的PKS系统)的至少一个生物活性域或蛋白质，和/或影响PUFA PKS系统活性的蛋白质。在本发明的这个方面中，生物体还可具有对构成其内源PUFA PKS系统的一个或多个基因的至少一种修饰。
在本发明的另外一个方面中，遗传修饰的生物体不一定内源地(天然地)含有PUFA PKS系统，而是被遗传修饰而引入至少一个重组核酸分子，其编码具有PUFA PKS系统至少一个域的生物活性的氨基酸序列。优选地，该生物体被遗传修饰而引入多于一个重组核酸分子，它们一起编码产生PUFA PKS系统产物(生物活性分子，例如PUFA或抗生素)所需的PUFA PKS系统组分；或者导入编码多个域的重组核酸分子，所述多个域构成PUFAPKS系统产生PUFA PKS产物的必需组分。下面将更详细地讨论与这些方面中的每一个相关的各种实施方案。
应当理解，PUFA PKS系统或包含PUFA PKS系统的生物体的遗传修饰可涉及修饰和/或利用PUFA PKS系统的至少一个域(包括域的一部分)、PUFA PKS系统的多于一个域或数个域(包括PUFA PKS系统中的相邻域、非相邻域或不同蛋白质上的域)，PUFA PKS系统的整个蛋白质，和整个PUFA PKS系统(例如由PUFA PKS基因编码的全部蛋白质)，或者甚至多于一个PUFA PKS系统(例如一个来自自然产生DHA的生物体，一个来自自然产生EPA的生物体)。就其本身而言，修饰可以包括，但不限于：针对内源PUFA PKS系统单个域的小修饰；针对内源PUFA PKS系统的一个或多个域或蛋白质的取代、缺失或者添加；从重组PUFA PKS系统引入一个或多个域或蛋白质；向具有内源PUFA PKS系统的生物体中引入第二PUFAPKS系统，用来自不同生物体的PUFA PKS系统替换生物体中的整个PUFAPKS系统；或者向非内源具有PUFA PKS系统的生物体中引入一个、两个或多个完整的PUFA PKS系统。本领域的技术人员可以理解，对PUFA PKS系统的任何修饰都包含在本发明之内。
如本文使用的，遗传修饰的微生物可以包括遗传修饰的细菌、原生生物、微藻、真菌或其它微生物，尤其是任何破壶囊菌目(Thraustochytriales)的属(例如破囊壶菌目生物)，包括本文所述的破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)和网粘菌科(Labyrinthulaceae)中的任何微生物(例如Schizochytrium，破囊壶菌属(Thraustochytrium)，Japonochytrium，网粘菌属(Labyrinthula)，Labyrinthuloides等)。这种遗传修饰微生物的基因组相对其正常(即野生型或天然)形式已被修饰(即突变或改变)，从而获得期望的结果(也就是，增强或修饰PUFA PKS活性和/或用PKS系统产生期望的产物)。微生物的遗传修饰可以用经典的菌株开发和/或分子遗传技术来实现。这些技术在本领域中是已知的，并且在例如Sambrook等，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labs Press.中一般性地公开了用于微生物的这些技术。本文引用的Sambrook等，如上的全部内容作为参考。遗传修饰的微生物可以包括如下的微生物，其中核酸分子被以如下的方式插入、缺失或修饰(即突变，例如通过核苷酸的插入、缺失、取代和/或倒位)，使这些修饰在微生物内提供期望的效果。
用于遗传修饰的合适宿主微生物的实例包括，但不限于，酵母，包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)，或其它酵母，例如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，或者其它真菌，例如丝状真菌，如曲霉属(Aspergillus)、脉孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)等。细菌细胞也可用作宿主。这些包括，但不限于，大肠杆菌(Escherichia coli)，其可用于发酵过程。或者，仅作为例子而言，可使用例如乳杆菌属(Lactobacillus)的物种或芽孢杆菌属(Bacillus)的物种作为宿主。
特别优选用于本发明的宿主包括来自下列各个属的微生物，包括但不限于：破囊壶菌科中的破囊壶菌属、Japonochytrium属、Aplanochytrium属、Elina属和Schizochytrium属，和网粘菌科中的网粘菌属、Labyrinthuloides属和Labyrinthomyxa属。这些属中的优选种包括，但不限于，Labyrinthula中的任何种，包括Labyrinthula sp.，Labyrinthula algeriensis，Labyrinthulacienkowskii，Labyrinthula chattonii，Labyrinthula coenocystis，网粘菌(Labyrinthula macrocystis)，Labyrinthula macrocystis atlantica，Labyrinthulamacrocystis macrocystis，Labyrinthula magnifica，Labyrinthula minuta，Labyrinthula roscoffensis，Labyrinthula valkanovii，Labyrinthula vitellina，Labyrinthula vitellina pacifica，Labyrinthula vitellina vitellina，Labyrinthulazopfii；Labyrinthuloides属的任何种，包括Labyrinthuloides sp.，Labyrinthuloides minuta，Labyrinthuloides schizochytrops；Labyrinthomyxa属的任何种，包括Labyrinthomyxa sp.，Labyrinthomyxa pohlia，Labyrinthomyxasauvageaui，Aplanochytrium属的任何种，包括Aplanochytrium sp.和Aplanochytrium kerguelensis；Elina属的任何种，包括Elina sp.，Elinamarisalba，Elina sinorifica；Japonochytrium属的任何种，包括Japonochytrium sp.，Japonochytrium marinum；Schizochytrium属的任何种，包括Schizochytrium sp.，Schizochytrium aggregatum，Schizochytriumlimacinum，Schizochytrium minutum，Scchizochytrium octosporum；和破囊壶菌属的任何种，包括破囊壶菌属某个种(Thraustochytrium sp.)，Thraustochytrium aggregatum，Thraustochytrium arudimentale，Thraustochytrium aureum，Thraustochytrium benthicola，Thraustochytriumglobosum，Thraustochytrium kinnei，Thraustochytrium motivum，厚皮破囊壶菌(Thraustochytrium pachydermum)，破囊壶菌(Thraustochytrium proliferum)，Thraustochytrium roseum，Thraustochytrium striatum，Ulkenia sp.，Ulkeniaminuta，Ulkenia profunda，Ulkenia radiate，Ulkenia sarkariana，和Ulkeniavisurgensis。这些属中特别优选的种包括，但不限于，Schizochytrium属的任何种，包括Schizochytrium aggregatum，Schizochytrium limacinum，Schizochytrium minutum；或破囊壶菌属的任何种(包括先前的Ulkenia属的种，例如U.visurgensis，U.amoeboida，U.sarkariana，U.profunda，U.radiata，U.minuta和Ulkenia sp.BP-5601)，包括Thraustochytrium striatum，Thraustochytrium aureum，Thraustochytrium roseum；和Japonochytrium属的任何种。破囊壶菌目中特别优选的菌株包括，但不限于：Schizochytrium sp.(S31)(ATCC 20888)；Schizochytrium sp.(S8)(ATCC 20889)；Schizochytrium sp.(LC-RM)(ATCC 18915)；Schizochytrium sp.(SR21)；Schizochytriumaggregatum(Goldstein et Belsky)(ATCC 28209)；Scchizochytrium limacinum(Honda et Yokochi)(IFO 32693)；Thraustochytrium sp.(23B)(ATCC 20891)；Thraustochytrium striatum(Schneider)(ATCC 24473)；Thraustochytriumaureum(Goldstein)(ATCC 34304)；Thraustochytrium roseum(Goldstein)(ATCC 28210)；和Japonochytrium sp.(L1)(ATCC 28207)。
根据本发明，术语/词组“破囊壶菌目生物”(Thraustochytrid)、“破囊壶菌目微生物”和“属于破囊壶菌目的微生物”可以互换使用，指破囊壶菌目的任何成员，其同时包括破囊壶菌科和网粘菌科。术语“Labyrinthulid”和“网粘菌科”在本文用于特指网粘菌科的成员。为了特指作为破囊壶菌科的成员的破囊壶菌目生物，在本文中使用术语“破囊壶菌科”。因此，对于本发明，Labyrinthulids的成员可以认为包含在破囊壶菌目生物内。
发展导致破囊壶菌目生物的分类频繁修订。分类理论家一般将破囊壶菌目生物放在藻类或类藻类(algae-like)原生生物中。然而，由于分类学的不确定性，对于本发明而言，最好是将本发明描述的菌株看作破囊壶菌目生物，以包含如下的生物：目：破囊壶菌目；科：破囊壶菌科(属：破囊壶菌属、Schizochytrium属、Japonochytrium属、Aplanochytrium属或Elina属)或网粘菌科(网粘菌属、Labyrinthuloides属或Labyrinthomyxa属)。同样，如下的属有时也包含在破囊壶菌科或网粘菌科中：Althornia、Corallochytrium、Diplophyrys和多孢堆菌属(Pyrrhosorus)，并且对于本发明而言，在称“破囊壶菌目生物”或“破囊壶菌目的成员”时也涵盖这些属。可以认识到，在本发明提出时，破囊壶菌目生物的分类学修订将Labyrinthuloides属放在网粘菌科中，并且确认破囊壶菌科和网粘菌科这两个科位于Stramenopile谱系中。需要注意，网粘菌科有时统称作labyrinthulids或labyrinthula，或者labyrinthuloides和破囊壶菌科统称作破囊壶菌目生物，尽管如上面讨论的，出于使本发明清楚的目的，破囊壶菌目生物的称谓涵盖破囊壶菌目中的任何成员，和/或涵盖破囊壶菌和网粘菌科的成员。下面总结了分类学的最新变化。
本文公开的某些单细胞微生物的菌株是破囊壶菌目的成员。破囊壶菌目生物是海洋真核生物，具有不断演变的分类学历史。Moss(在《The Biologyof Marine Fungi》中，Cambridge University Press p.105(1986))，Bahnweb和Jackle(同上p.131)和Chamberlain和Moss(BioSystems 21：341(1988))综述了关于破囊壶菌目生物的分类学位置的问题。
方便起见，分类学家最初将破囊壶菌目生物和其它无色产游动孢子(zoosporic)真核生物一起置于藻状菌纲(Phycomycetes)(类藻类真菌)中。然而，藻状菌这个名称最终从分类学地位中除掉，破囊壶菌目生物便保留在卵菌(Oomycetes)(双鞭毛产游动孢子真菌)中。最初假设，卵菌与异鞭毛藻类有亲缘关系，并且最终由Barr总结的广泛的超结构和生物化学研究支持了该假设(Barr.Biosystems 14：359(1981))。卵菌的确被Leedale(Leedale.Taxon 23：261(1974))和其它藻类学家接受作为异鞭毛藻类的一部分。然而，出于方便起见，由于其异养本质，卵菌和破囊壶菌目生物大多受到真菌学者(研究真菌的科学家)而不是藻类学者(研究藻类的科学家)的研究。
从另一个分类学观点看，进化生物学家对于真核生物如何进化产生了两种一般性观点。一种理论提出，膜结合的细胞器是通过一系列的内共生而从外源起源的(Margulis，1970，Origin of Eukaryotic Cells.Yale UniversityPress，New Haven)；例如线粒体起源于细菌内共生体，叶绿体起源于蓝藻，鞭毛起源于螺旋体。另一种的理论提出，膜结合的细胞器是通过自生过程由原核生物祖先的非膜结合系统逐渐进化而来(Cavalier-Smith，1975，Nature(Lond.)256：462-468)。然而，两组进化生物学家都将卵菌和破囊壶菌目生物从真菌排除，并且将它们或者与chromophyte藻类一起置于在Chromophyta界中(Cavalier-Smith BioSystems 14：461(1981))(这个界后来被扩展到包含其它的原生生物，并且现在该界的成员被称作Stramenopiles)，或者与所有藻类一起设置在Protoctista界中(Margulis和Sagen.Biosystems 18：141(1985))。
随着电子显微术的开发，对破囊壶菌目生物两个属，Thraustochytrium和Schizochytrium的游动孢子的超结构研究(Perkins，1976，pp.279-312in“Recent Advances in Aquatic Mycology”(ed.E.B.G.Jones)，John Wiley & Sons，New York；Kazama.Can.J.Bot.58：2434(1980)；Barr，1981，Biosystems14：359-370)提供了良好的证据，表明破囊壶菌科只与卵菌有远缘关系。此外，反映5-S核糖体RNA序列的对应分析(一种多变量统计的形式)的遗传数据表明，Thraustochytriales明显是一群独特的真核生物，完全区别于真菌，而与红藻和褐藻类以及卵菌的成员有紧密的亲缘关系(Mannella等Mol.Evol.24：228(1987))。大多数分类学家同意将破囊壶菌目生物从卵菌中除去(Bartnicki-Garcia.p.389于《Evolutionary Biology of the Fungi》(Rayner，A.D.M.，Brasier，C.M.& Moore，D.编辑)，Cambridge University Press，Cambridge)。
总之，采用Cavalier-Smith的分类系统(Cavalier-Smith.BioSystems 14：461(1981)；Cavalier-Smith.Microbiol Rev.57：953(1993))，破囊壶菌目生物与chromophytes藻类一起被归类于Chromophyta界(Stramenopiles)中。最近Cavalier-Smith等使用Heterokonta的18s rRNA特征序列重新证实了这种分类设置，表明破囊壶菌目生物是chromists，而非真菌(Cavalier-Smith等Phil.Tran.Roy.Soc.London Series BioSciences 346：387(1994))。这将破囊壶菌目生物设置在与真菌完全不同的界内，其中真菌全部设置在Eufungi界内。
目前，真核生物存在71个不同的群(Patterson.Am.Nat.154：S96(1999))，并且在这些群中确定了具有一定可信度的4个主要的谱系：(1)Alveolates，(2)Stramenopiles，(3)陆生植物-绿藻-红藻_Glaucophyte(Land Plant-greenalgae-Rhodophyte_Glaucophyte)(“植物”)进化枝和(4)后生鞭毛(Opisthokont)进化枝(真菌和动物)。先前，这四个主要的谱系本应被称为界，但是“界”概念的使用被一些研究人员认为不再有用。
如Armstrong指出的，Stramenopile是指分为三部分的(three-parted)管状毛，该谱系中大多数成员具有带这种毛的鞭毛。Stramenopiles的游动细胞(单细胞生物、精子、游动孢子)是不对称的，具有两条横向插入的鞭毛，其中一条长，带有分三部分的管状毛，这些管状毛使鞭毛的推力反向；另一条短而光滑。先前，当该类群较不广泛时，Stramenopiles被称作Chromista界或异鞭毛(＝不同鞭毛)藻(heterokont algae)，因为这些类群由褐藻或Phaeophytes，以及黄藻(yellow-green algae)、金藻(Golden-brown Algae)、Eustigmatophytes和硅藻构成。随后，发现一些异养的类真菌生物、水霉(watermolds)，和labyrinthulids(粘网变形虫(slime net amoebas))，具有相似的游动细胞，因此涉及光合色素或藻类的类群名称变得不合适了。目前，Stramenopile谱系中有两个科是网粘菌科和破囊壶菌科。历史上，对于这些独特的微生物有多种分类策略，并且它们往往被分在相同的目中(即破囊壶菌目)。这些组群中成员的关系仍在发展。Porter和Leander根据18S小亚单位核糖体DNA提出了数据，暗示单源进化中的破囊壶菌目生物-labyrinthulid进化枝。然而，该进化枝受到两个分支的支持；第一个包含破囊壶菌属的三个物种和Ulkenia profunda，第二个包含Labyrinthula的3个物种，Labyrinthuloides的2个物种，以及Schizochytrium aggregatum。
因此本发明使用的破囊壶菌目生物的分类学地位摘要如下：
界：Chromophyta(Stramenopiles)
门：Heterokonta
目：破囊壶菌目(破囊壶菌目生物)
科：破囊壶菌科或网粘菌科
属：破囊壶菌属、Schizochytrium、Japonochytrium、Aplanochytrium、Elina、网粘菌属、Labyrinthuloides或Labyrinthulomyxa
一些早期分类学家将少数原属破囊壶菌属的成员(具有类变形虫的生活阶段的那些)分出为不同的属，称作Ulkenia。然而，现在已经知道，即使不是全部，也有大部分的破囊壶菌目生物(包括破囊壶菌属和Schizochytrium)显示类变形虫的阶段，这样，一些人不再将Ulkenia看作一个有效的属。如本文使用的，破囊壶菌属中包括Ulkenia。
尽管在门和界的更高级分类中的分类学地位存在不确定性，但是破囊壶菌目生物仍然是一个与众不同且有特征的类群，其成员仍可分类在破囊壶菌目内。
本发明的另一个实施方案涉及遗传修饰的植物，其中植物被遗传修饰从而重组表达PKS系统，其包括本文所述多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮合酶(PKS)系统的至少一个生物活性域或蛋白质。PUFA PKS系统的域可以包括上述PUFA PKS系统(例如Shewanella japonica和/或Shewanella olleyana的)的任何域，包括其同源物，并且还可以包括来自任何细菌或非细菌微生物(包括任何真核微生物和任何破囊壶菌目微生物，例如Schizochytrium属和/或破囊壶菌属)的PUFA PKS系统的任何域，或者来自通过美国专利申请系列No.10/124,800，同上所述的筛选方法鉴定的微生物的PUFA PKS系统的任何域。植物还可进一步用另一种PKS系统的至少一个域或其生物活性片段修饰，该PSK系统包括但不限于I型PKS系统(重复性或模块性)、II型PKS系统和/或III型PKS系统。植物的修饰可以涉及修饰和/或利用PUFAPKS系统的至少一个域(包括域的一部分)，PUFA PKS系统的多于一个或数个域(包括相邻域、非毗邻域或PUFA PKS系统不同蛋白质上的域)，PUFAPKS系统的整个蛋白质，和整个P UFA PKS系统(例如，由PUFA PKS基因编码的全部蛋白质)，或者甚至多于一个PUFA PKS系统(例如一个来自自然产生DHA的生物体，一个来自自然产生EPA的生物体)。
如本文使用的，遗传修饰的植物可以包括任何遗传修饰的植物，包括高等植物，特别地，任何可供消费的植物或者可用于产生本发明的期望生物活性分子的植物。本文使用的“植物部分”包括植物的任何部分，包括但不限于，种子、花粉、胚、花、果实、枝条(shoots)、叶、根、茎、外植体等。遗传修饰植物的基因组相对其正常(即野生型或天然)形式被修饰(即突变或改变)，从而获得期望的结果(即增加或改变PUFA PKS活性和/或利用该PKS系统生产期望的产物)。植物遗传修饰可利用经典的菌株开发和/或分子遗传技术来实现。产生基因组中包含编码所需氨基酸序列的重组核酸分子的转基因植物的方法在本领域是已知的。根据本发明用于遗传修饰的优选植物优选地是适于动物包括人类消耗的植物。
根据本发明用于遗传修饰的优选植物(即植物宿主细胞)包括，但不限于，任何高等植物，包括双子叶和单子叶植物，特别是可消耗植物，包括作物植物，特别是用来获取其油类的植物。这些植物可以包括，例如：油菜、大豆、油菜籽、亚麻籽、玉米、红花、向日葵和烟草。其它优选的植物包括已知产生可用作药物、增味剂、营养药(nutraceutical agents)、功能食品成分或美容活性剂的化合物的植物，或者被基因工程操作而生产这些化合物/剂的植物。
根据本发明，遗传修饰的微生物或植物包括用重组技术或通过经典突变和筛选技术修饰的微生物或植物。如本文使用的，导致基因表达降低、基因功能降低或基因产物(即由基因编码的蛋白质)的功能降低的遗传修饰，可称作基因的失活(inactivation)(完全或部分)、缺失(deletion)、遮断(interruption)、阻断(blockage)或下调(down-regulation)。例如导致基因编码蛋白的功能降低的基因遗传修饰可以是下列因素造成的：基因的完全缺失(即基因不存在，故蛋白质不存在)、基因突变导致蛋白质翻译不完全或者不翻译(例如，蛋白质不表达)、或者基因突变降低或完全破坏蛋白质的自然功能(例如所表达的蛋白质具有降低的或者没有酶活性或作用)。导致基因表达或功能增加的遗传修饰称作基因的扩增(amplification)、过生产(overproduction)、过表达(overexpression)、活化(activation)、增强(enhancement)、增加(addition)或上调(up-regulation)。
根据本发明对微生物或植物的遗传修饰，优选对微生物或植物所表达的PKS系统的活性产生影响，不管该PKS系统是内源性并被遗传修饰，还是内源性并具有引入到生物体中的重组核酸分子(可选择修饰或者不修饰内源系统)，还是完全由重组技术提供的。改变PUFA PKS系统或表达该系统的生物体的PUFA生产谱，包括导致宿主微生物或植物的任何一种或多种PUFA(或由PUFA PKS系统产生的其它生物活性分子)的生产与未经遗传修饰相比(即与未经修饰的野生型微生物或植物相比，或者与至少PUFA合成未被修饰的微生物或植物—即可能具有其它与PUFA合成无关的修饰的微生物或植物相比)发生可检测或者可测量到的变化。影响PKS系统的活性，包括导致生物体所表达的PKS系统中与未经遗传修饰相比产生可检测或可测量的变化或修饰的任何遗传修饰。PKS系统可检测的变化或修饰可以包括，但不限于：经修饰的PUFA PKS系统与未经遗传修饰的内源PUFA PKS系统相比，任何一个或多个域的表达和/或生物活性发生改变或修饰(引入、增加或者减少)；向生物体引入PKS系统活性(即生物体在遗传修饰之前不含有PKS系统或PUFA PKS系统)，从而使生物体具有可测量/可检测的PKS系统活性，例如产生PUFA PKS系统的产物；向生物体引入来自与该生物体内源表达的PKS系统不同的PKS系统的功能域，从而使PKS系统活性被修饰(例如将本文所述的细菌PUFA PKS域引入到内源表达非细菌PUFAPKS系统的生物体中，例如破囊壶菌目生物)；改变PKS系统产生的生物活性分子(例如PUFA)的量(例如与未经遗传修饰相比，系统产生更多(增加的量)或者更少(降低的量)的给定产物)；改变PKS系统产生的生物活性分子的类型(例如PUFA类型的改变)(例如系统产生额外的或不同的PUFA，新的或不同的产物，或者该系统自然产生的PUFA或其它产物的变体)；和/或改变PKS系统产生的多种生物活性分子的比例(例如系统产生不同比例的一种PUFA和另一种PUFA，产生与未经遗传修饰相比完全不同的脂质谱，或者将各种PUFA置于甘油三酯的相对天然构型的不同位置)。这种遗传修饰包括任何类型的遗传修饰，并且尤其包括通过重组技术和/或通过经典诱变造成的修饰。
应当注意，称“增加PUFA PKS系统中功能域或蛋白质的活性”是指包含该域或蛋白质(或要引入该域或蛋白质)的生物体中的任何遗传修饰，其导致域或蛋白质系统的功能性(functionality)增加，并可以包括：域或蛋白质的活性(例如比活性或体内酶活性)增加，域或蛋白质系统的抑制或降解减少，和域或蛋白质过表达。例如，可以增加基因拷贝数，表达水平可通过使用导致比自然启动子更高的表达水平的启动子来增加，或者通过可以通过基因工程操作或经典诱变来改变基因，以增加该基因编码的域或蛋白质的活性。
类似地，称“降低PUFA PKS系统中功能域或蛋白质的活性”是指包含该域或蛋白质(或者要引入该域或蛋白质)的生物体的任何遗传修饰，其导致域或蛋白质系统的功能性降低，并可包括：域或蛋白质的活性减少，域或蛋白质系统的抑制或降解增加，和域或蛋白质的表达降低或消除。例如，本发明域或蛋白质作用的降低，可通过阻断或降低该域或蛋白质的产生，“敲除”编码域或蛋白质的基因或其部分，降低域或蛋白质的活性，或者抑制域或蛋白质的活性来实现。阻断或降低域或蛋白质的产生可以包括将编码该域或蛋白质的基因置于需要在生长培养基中存在诱导化合物的启动子的控制之下。通过建立使培养基中诱导物耗尽的条件，可以关闭编码所述域或蛋白质的基因的表达(从而关闭蛋白质的合成)。本发明人在实施例部分中证实了缺失(敲除)破囊壶菌目微生物中靶基因的能力。阻断或降低域或蛋白质的活性还可包括使用与美国专利No.4,743,546中描述的方法相似的切除手段，本文引用该专利的内容作为参考。为了使用该手段，将编码目的蛋白的基因克隆到特定基因序列之间，使该基因能够被特异性、可控地从基因组中切除。切除可以通过例如培养物的培养温度的改变(例如在美国专利No.4,743,546中那样)或者通过其它一些物理或营养信号来引发。
在本发明的一个实施方案中，通过例如经典诱变和选择技术和/或分子遗传技术，包括基因工程技术，对微生物的内源PUFA PKS系统进行遗传修饰。基因工程技术可包括，例如，使用靶向重组载体缺失内源基因的一部分(在实施例中演示)，或者用异源序列替换内源基因的一部分(在实施例中演示)。可导入宿主基因组中的异源序列的实例包括编码下列物质的序列：来自另一PUFA PKS系统的至少一个功能性PUFA PKS域或蛋白质，或乃至整个PUFA PKS系统(例如与PUFA PKS系统相关的所有基因)。异源序列还可以包括编码来自PUFA PKS系统的天然域的修饰功能域(同源物)的序列。其它可导入宿主基因组的异源序列包括编码这样的蛋白或域的序列：该蛋白或域本身不是PKS系统的域，但会影响内源PKS系统的活性。例如可以将编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的核酸分子导入宿主基因组。本文中详细讨论了可对内源PUFA PKS系统进行的特定修饰。
关于遗传修饰植物的生产，植物的基因工程方法在本领域是熟知的。例如，已经开发了大量用于植物转化的方法，包括生物和物理转化规程。见例如Miki等，＂Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants＂，于《Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology》中，Glick，B.R.和Thompson，J.E.编(CRC Press，Inc.，Boca Raton，1993)pp.67-88。此外，用于植物细胞或组织转化和植物再生的载体和体外培养方法也是可以获得的。见例如Gruber等，＂Vectors for Plant Transformation＂于《Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology》，Glick，B.R.和Thompson，J.E.编.(CRCPress，Inc.，Boca Raton，1993)pp.89-119。
将表达载体引入到植物体内的最广泛使用的方法是基于土壤杆菌(Agrobacterium)自然转化系统。见例如Horsch等，Science 227：1229(1985)。根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)和发根土壤杆菌(A.rhizogenes)是植物致病土壤细菌，其遗传转化植物细胞。根癌土壤杆菌的Ti质粒和发根土壤杆菌的Ri质粒分别携带负责植物遗传转化的基因。见例如Kado，C.I.，Crit.Rev.Plant.Sci.10：1(1991)。大量参考文献提供了土壤杆菌载体系统和土壤杆菌介导的基因转化方法的描述，包括Gruber等，同前，Miki等，同前，Moloney等，Plant Cell Reports 8：238(1989)，和美国专利Nos.4,940,838和5,464,763。
另一种可普遍应用的植物转化方法是微粒介导的转化(microprojectitle-mediated transformation)，其中DNA被携载在微粒的表面上。表达载体通过生物射弹(biolistic)设备被导入到植物组织内，该设备可将微粒加速到足以穿过植物细胞壁和膜的速度。Sanford等，Part.Sci.Technol.5：27(1987)，Sanford，J.C.，Trends Biotech.6：299(1988)，Sanford，J.C.，Physiol.Plant 79：206(1990)，Klein等，Biotechnology 10：268(1992)。
另一种用于将DNA物理递送到植物中的方法是超声处理靶细胞。Zhang等，Bio/Technology 9：996(1991)。或者，脂质体或原生质球融合也已经被用于将表达载体到入到植物体内。Deshayes等，EMBO J.，4：2731(1985)，Christou等，Proc Natl.Acad.Sci.USA 84：3962(1987)。利用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸直接将DNA摄入原生质体也已经有报道。Hain等，Mol.Gen.Genet.199：161(1985)和Draper等，Plant Cell Physiol.23：451(1982)。对原生质体和整个细胞和组织进行电穿孔也已经有描述。Donn等，于Abstractsof VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC中，A2-38，p.53(1990)；D′Halluin等，Plant Cell 4：1495-1505(1992)和Spencer等，Plant Mol.Biol.24：51-61(1994)。
在本发明的这个实施方案的一个方面中，生物体(微生物或植物)的遗传修饰可包括：(1)向宿主中导入重组核酸分子，其编码具有PUFA PKS系统至少一个域的生物活性的氨基酸序列；和/或(2)向宿主中导入重组核酸分子，其编码影响PUFA PKS系统活性的至少一个蛋白质或功能域。宿主可以包括：(1)不表达任何PKS系统的宿主细胞，其中将PKS系统的所有功能域导入到该宿主细胞中，并且其中至少一个功能域来自于本文所述的PUFAPKS系统；(2)表达PKS系统(内源的或重组)的宿主细胞，该系统具有本文所述PUFA PKS系统的至少一个功能域；和(3)表达PKS系统(内源或重组)的宿主细胞，其中该系统不一定包含来自本文所述PUFA PKS系统的域功能(在此情况下，导入宿主细胞内的重组核酸分子包括编码本文所述的PUFA PKS系统的至少一个功能域的核酸序列)。换言之，本发明意图涵盖任何这样的遗传修饰生物体(例如微生物或植物)：该生物体包括(或者内源，或者通过重组修饰导入的)来自本文所述PUFA PKS系统的至少一个域(例如来自或者衍生自Shewanella japonica或Shewanella olleyana)，其中该遗传修饰对宿主细胞中的PUFA PKS活性具有可以测量的影响。
本发明特别涉及使用来自本文所述海洋细菌的PUFA PKS系统及其部分对微生物和植物进行遗传修饰，从而影响该微生物和植物的PUFA PKS产物的生产。如上面讨论的，可用于本发明实施方案的细菌可以在下述温度条件下生长，并具有能够在下述温度条件下产生PUFA的PUFA PKS系统(例如，在下述温度下功能良好的酶和蛋白)：所述温度为接近或者超过大约20℃，优选接近或者超过25℃，甚至更优选接近或者超过30℃(或者处于20℃到30℃或者更高温度之间，以整度数递增的任何温度，例如21℃，22℃，23℃...)。在优选实施方案中，这些细菌在这些温度下产生PUFAs。如本文前面描述的，美国专利No.6,140,486中描述的海洋细菌，其它希瓦氏菌属菌种(例如SCRC2738菌株)和海产弧菌，在较高温度(例如在20℃或者更高温度)下不产生PUFAs(或者产生显著较少或者检测不到的PUFAs)，并且即使不是完全不生长，也生长不好；这限制了源自于这些细菌的PUFAPKS系统的有用性，特别是在野外条件下的植物应用中的有用性。
在本发明的一个实施方案中，人们可以鉴定其它具有PUFA PKS系统并能够在高温下生长和产生PUFAs的细菌。例如，从可发现这些细菌的生境/小生境，例如海洋、河口和其它生境收集水样品/土壤样品，使用琼脂板从该样品培养/筛选初始菌株，可以向这样的琼脂板中添加真核生物生长抑制剂，如制霉菌素(抗真菌)或环己亚胺(抑制真核生物蛋白质合成)。该方法有助于筛选富集没有(或最少)真核菌株污染的细菌菌株。该选择方法与在高温(例如20-30℃或25-30℃)下培养平板，然后选择产生至少一种PUFA的菌株的方法相结合，可初步识别具有可在高温下工作的PUFA PKS系统的候选细菌菌株(与现有技术中只在低于20℃，更优选地低于大约5℃的温度下显示PUFA生产的细菌菌株相对)。为了评估任何细菌来源的基因在较高温度下的PUFA PKS功能，可制备无细胞提取物，并在各种温度下测试PUFA生产，随后筛选含有这样的PUFA PKS基因的微生物：该基因在较高温度范围内(例如15℃，20℃，25℃，或30℃，或者更高)具有酶/生物活性。本发明人鉴定了两种示例性细菌(例如Shewanella olleyana和Shewanellajaponica；见实施例)，其特别适合于用作PUFA PKS基因源，其它的也可容易地鉴定或者已知含有PUFA PKS基因，并可用于本发明的实施方案(例如Shewanella gelidimarina)。
使用来自本文所述的特定海洋细菌的PUFA PKS系统，以及先前描述的利用例如来自破囊壶菌目生物和其它真核PUFA PKS系统的PUFA PKS基因的非细菌PUFA PKS系统，可使用基因混合(gene mixing)而将PUFA产物的范围延伸到包括EPA、DHA、ARA、GLA、SDA及其它(下文中有详细说明)，以及产生多种生物活性分子，包括抗生素、其它药物化合物和其它理想的产物。获得这些生物活性分子的方法不仅包括混合来自各种生物体的基因，还包括各种遗传修饰本文所述PUFA PKS基因的方法。有关本发明的细菌PUFA PKS系统的遗传基础和域结构的知识为设计可产生多种生物活性分子的新型遗传修饰生物体提供了基础。特别是，使用本文所述的细菌PUFA PKS基因扩展了这种能力，产生了修饰的PUFA PKS系统，与使用来自先前描述的海洋细菌的PUFA PKS系统相比，该系统可在更高的温度下发挥功能并产生高水平的产物。尽管任何PKS域和相关基因的混合和修饰均在本发明人的考虑之内，但作为示例，下文将讨论与遗传修饰和生物活性分子生产有关的各种可能的PUFA-PKS系统操作。
将与上述海洋细菌PUFA PKS基因联合使用的、特别有用的PUFA PKS基因和蛋白质包括来自破囊壶菌目生物的PUFA PKS基因，例如在Schizochytrium和破囊壶菌属中已经鉴定的那些PUFA PKS基因。这些基因尤其可与来自本文所述海洋细菌基因的各种基因、其部分和其同源物共同用于修饰、靶定、导入宿主细胞，和/或上述的基因混合和修饰。这在美国专利申请系列No.10/810,352(同上)(破囊壶菌属)，美国专利申请系列No.10/124,800(同上)(Schizochytrium)和美国专利No.6,566,583，(同上)(Schizochytrium)中有详细描述。Schizochytrium和破囊壶菌属中的PUFAPKS基因均被组织成三个编码多域的(multi-domain-encoding)开放阅读框，本文称作OrfA，OrfB和OrfC。
Schizochytrium OrfA的完整核苷酸序列在本文中由SEQ ID NO：13表示。OrfA是8730个核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码2910个氨基酸的序列，本文由SEQ ID NO：14表示。在OrfA中有12个域：(a)一个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)域(由SEQ ID NO：14的大约1位-大约500位表示)；(b)一个丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)域(由SEQ ID NO：14的大约575位-大约1000位代表)；(c)9个酰基载体蛋白(ACP)域(由SEQ ID NO：14的大约1095位-大约2096位代表，并且9个ACP域中每一个的活性位点丝氨酸残基(即泛酰巯基乙胺结合位点)相对于SEQ ID NO：14的氨基酸序列的位置如下：ACP1＝S1157；ACP2＝S1266；ACP3＝S1377；ACP4＝S1488；ACP5＝S1604；ACP6＝S1715；ACP7＝S1819；ACP8＝S1930；和ACP9＝S2034)；和(d)一个β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)域(由SEQ ID NO：14的大约2200位-大约2910位代表)。
Schizochytrium OrfB的完整核苷酸序列在本文中表示为SEQ ID NO：15。OrfB是6177个核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码2059个氨基酸的序列，该序列在本文中表示为SEQ ID NO：16。在OrfB中有4个域：(a)一个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)域(由SEQ ID NO：16的大约1位-大约450位代表)；(b)一个链长度因子(CLF)域(由SEQ ID NO：16的大约460位-大约900位代表)；(c)一个酰基转移酶(AT)域(由SEQ ID NO：16的大约901位-大约1400位代表)；和(d)一个烯酰-ACP还原酶(ER)域(由SEQ ID NO：16的大约1550位-大约2059位代表1。
Schizochytrium OrfC的完整核苷酸序列在本文中表示为SEQ ID NO：17。OrfC是一个4509个核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码1503个氨基酸的序列，本文表示为SEQ ID NO：18。在OrfC中有3个域：(a)2个类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶(DH)域(由SEQ ID NO：18的大约1位-大约450位代表，和由SEQ ID NO：18的大约451位-大约950位代表)；和(b)一个烯酰-ACP还原酶(ER)域(由SEQ ID NO：18的大约1000位-大约1502位代表)。
破囊壶菌属OrfA的完整核苷酸序列在本文中表示为SEQ ID NO：19。OrfC是8433个核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码2811个氨基酸的序列，本文中表示为SEQ ID NO：20。在OrfA中有11个域：(a)一个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)域(由SEQ ID NO：20的大约1位-大约500位代表)；(b)一个丙二酰-CoA：ACP酰基转移酶(MAT)域(由SEQ ID NO：20的大约501位-大约1000位代表)；(c)8个酰基载体蛋白(ACP)域(由SEQ ID NO：20的大约1069位-大约1998位代表；并且8个ACP域中每一个的活性位点丝氨酸残基(也就是泛酰巯基乙胺结合位点)相对于SEQ ID NO：20的氨基酸序列的位置如下：1128(ACP1)，1244(ACP2)，1360(ACP3)，1476(ACP4)，1592(ACP5)，1708(ACP6)，1824(ACP7)和1940(ACP8))；和(d)一个β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)域(由SEQ ID NO：20的大约2001位-大约2811位代表)。
破囊壶菌属OrfB的完整核苷酸序列在本文中表示为SEQ ID NO：21。OrfB是5805个核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码1935个氨基酸的序列，本文中表示为SEQ ID NO：22。在OrfB中有4个域：(a)一个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)域(由SEQ ID NO：22的大约1位-大约500位代表)；(b)一个链长度因子(CLF)域(由SEQ ID NO：22的大约501位-大约1000位代表)；(c)一个酰基转移酶(AT)域(由SEQ ID NO：22的大约1001位-大约1500位代表)；和(d)一个烯酰-ACP还原酶(ER)域(由SEQ ID NO：22的大约1501位-大约1935位代表)。
破囊壶菌属OrfC的完整核苷酸序列在本文中表示为SEQ ID NO：23。OrfA是4410个核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码1470个氨基酸的序列，本文称作SEQ ID NO：24。在OrfC中有3个域：(a)2个类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶(DH)域(由SEQ ID NO：24的大约1位-大约500位代表和由SEQ ID NO：24的大约501位-大约1000位代表)；和(b)一个烯酰-ACP还原酶(ER)域(由SEQ ID NO：24的大约1001位-大约1470位代表)。
因此，本发明涵盖通过如下手段遗传修饰微生物或植物细胞的方法：遗传修饰生物体中的至少一个核酸序列，其编码本文所述细菌PUFA PKS系统(例如，来自或衍生自如本文所述的Shewanella japonica或Shewanellaolleyana的PUFA PKS系统)的至少一个功能域或蛋白质(或其生物活性片段或同源物)；和/或表达至少一个包含编码所述域或蛋白质的核酸序列的重组核酸分子。上面已经详细描述了这些序列、遗传修饰生物体的方法和具体的修饰的各种实施方案。通常，使用所述方法产生特定遗传修饰生物体，该生物体产生一种或多种特定生物活性分子。
本发明的一个特别优选的实施方案涉及遗传修饰的植物或植物部分，其中该植物已用本文所述的PUFA PKS基因遗传修饰，使得该植物产生期望的PUFA PKS系统产物(例如PUFA或其它生物活性分子)。关于本发明的细菌PUFA PKS系统的遗传基础和域结构的知识，结合对各种破囊壶菌目生物PUFA PKS系统的遗传基础和域结构的知识，为设计可产生多种生物活性分子的新型遗传修饰植物提供了基础。例如，人们现在可以设计和工程操作新型PUFA PKS构建体，该构建体是由本文所述PUFA PKS系统的域的各种组合衍生而成的。这种构建体可首先在微生物，例如大肠杆菌、酵母或破囊壶菌目生物中制备，以验证例如期望的生物活性分子的产生，随后通过分离该构建体，并用其转化植物，使植物具有类似的产生生物活性分子的性质。已知植物不内源性地含有PUFA PKS系统，因此本发明的PUFA PKS系统为产生具有独特的脂肪酸生产能力的植物提供了机会。本发明特别优选的实施方案之一是对植物进行基因工程操作，以在同一植物中产生一种或多种PUFA，包括EPA，DHA，DPA，ARA，GLA，SDA等。本发明提供了以各种比例和形式生成多种“带标识的油(designer oils)”中任何一种的能力。而且，来自本文所述的特定海洋细菌的PUFA PKS基因的公开，使人们有机会可以更容易地扩展PUFA生产的范围，并且可以在用于培育大多数作物植物的温度范围内成功地生产这些PUFA。
本发明的另一个实施方案涉及遗传修饰的破囊壶菌目微生物，其中该微生物具有内源的多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮合酶(PKS)系统，并且其中该内源PUFA PKS系统被遗传修饰，使得该微生物的多不饱和脂肪酸(PUFA)表达谱与没有修饰的破囊壶菌目生物微生物相比发生改变。可用作本发明宿主生物体的破囊壶菌目微生物内源性地含有和表达PUFA PKS系统。基于本发明的遗传修饰包括向破囊壶菌目生物导入至少一个重组核酸序列，该序列编码来自本文所述细菌PUFA PKS系统的PUFA PKS域或蛋白质(或其同源物或功能片段)。破囊壶菌目生物还可以在其内源PUFA PKS基因中含有遗传修饰，包括取代、添加、缺失、突变，并包括部分或完全缺失破囊壶菌目生物PUFA PKS基因，和用来自本发明的优选海洋细菌的PUFAPKS基因取代。
本发明的这个实施方案在下述方面特别有用：利用本发明人开发的遗传修饰微生物和高效生产富含PUFA的脂类(三酰基甘油(TAG)以及膜相关磷脂(PL))的方法，来生产富含期望的PUFA(例如EPA)的产业上有价值的脂类。这些微生物还可用作“代用”(surrogate)宿主，来确定最佳的基因组合以供随后的植物细胞转化中使用，尽管其它微生物，包括许多细菌和酵母宿主，也可以用作“代用”宿主。
本发明的这一具体实施方案部分地源自于如下的知识：(1)所选微生物，特别是破囊壶菌目生物，例如产业上开发的Schizochytrium菌株ATCC20888的固有的TAG生产能力的利用；(2)本发明人对真核生物中，特别是破囊壶菌目成员和本发明所用海洋细菌中的PUFA PKS生物合成途径(例如PUFAPKS系统)的详细理解；和(3)Schizochytrium中的同源基因重组系统的利用。基于本发明人对相关系统的知识，可以用相同的通用手段来生产除EPA之外的PUFAs。
例如，在本发明的一个实施方案中，内源破囊壶菌目生物PUFA PKS基因，例如编码通常产生DHA和DPA的PUFA PKS酶的Schizochytrium基因，被通过随机或靶向突变而修饰，替换为来自其它编码同源PKS蛋白质(例如来自细菌或其它来源)的基因，例如来自本文详细描述的Shewanellajaponica或Shewanella olleyana的海洋细菌PUFA PKS基因，和/或替换为遗传修饰的Schizochytrium、破囊壶菌属或其它破囊壶菌目生物PUFA PKS基因。如上文所讨论的，可以将来自海洋细菌和破囊壶菌目生物或其它PKS系统的各种域的编码核酸分子的组合进行“混合和匹配”来生成构建体，该构建体可导致所需PUFA或其它生物活性分子的产生。由这些导入的和/或修饰的基因编码的酶的产物可以是例如EPA，或者可以是其它相关分子，包括其它PUFA。该方法的一个特征是利用破囊壶菌目生物PUFA合成和积累机构(synthesis and accumulation machinery)的内源组分，该机构对于高效产生PUFA和将PUFA掺入PL和TAG而言必需的；同时还进一步利用了例如海洋细菌基因的能力，例如用来产生EPA。特别地，本发明的这一实施方案涉及修改生物体所产生的PUFA的类型，同时保持亲本菌株的高产油力。
尽管下面的一些讨论使用Schizochytrium生物作为示例性宿主生物体，但是任何破囊壶菌目生物都可以根据本发明予以修饰，包括破囊壶菌属、Labyrinthuloides属和Japonochytrium属的成员。例如，如上所述的破囊壶菌属也可以用作用本文所述方法进行遗传修饰的宿主生物体，尽管更有可能的是用破囊壶菌属的PUFA PKS基因修饰另一种破囊壶菌目生物(例如Schizochytrium)的内源PUFA PKS基因。此外，使用在美国专利申请系列No.10/124,800(同上)中提出的筛选生物体的方法，人们可以鉴定出其它可用于本方法的生物体，并且所有这些生物体都被本文所涵盖。而且，PUFA PKS系统可以用本文提供的示例性信息来构建，在其它微生物例如细菌或酵母中生产，并转化到植物细胞中以产生遗传修饰的植物。本文讨论的构思可根据需要用于各种系统。
本发明的实施方案可如下说明。作为例子，根据本发明人目前对PUFA在Schizochytrium中合成和积累的理解，整个生物化学过程可分成三个部分。
首先，在Schizochytrium油中积累的PUFA(DHA和DPA)是如上面讨论的PUFA PKS系统的产物。Schizochytrium中的PUFA PKS系统将丙二酰-CoA转变成终产物PUFA，而不释放显著量的中间化合物。在Schizochytrium以及破囊壶菌属中，先前已经鉴定了三个基因(OrfsA、B和C；分别在Schizochytrium中用SEQ ID NO：13，15和17表示，在破囊壶菌属中用SEQ IDNO：19，21和23表示)，其编码已知在这些生物体中实际合成PUFA所必需的所有酶域。从其它数种产PUFA的非真核生物体，即数株海洋细菌中，已克隆并定性了多组与之相似的基因(其编码含有多组的同源酶域的蛋白质)，现在，在本发明中，本发明人鉴定并测序了个两株特别有用的海洋细菌—Shewanella japonica和Shewanella olleyana中的PUFA PKS基因。这些海洋细菌的PUFA产物是EPA。本发明的实施方案之一是，预期任何PUFAPKS基因群组或其组合均可取代本文例子中描述的Schizochytrium基因，只要满足生产生物(例如Schizochytrium)在发酵条件下的生理生长需要即可。特别地，上述的产PUFA细菌菌株在相对高的温度下(例如高于25℃)生长良好，这进一步暗示它们的PUFA PKS基因产物将在Schizochytrium的标准生长温度(25-30℃)条件下发挥功能。本领域技术人员根据本公开中可以显然想到，其它目前未研究或未鉴定的产PUFA细菌也可能包含对破囊壶菌目生物的修饰有用的PUFA PKS基因。
其次，除了编码直接涉及PUFA合成的酶的基因之外，还需要“辅助”酶。该基因编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)，该酶活化存在于PUFAPKS复合物中的酰基载体蛋白(ACP)域。通过添加这种辅助因子来活化ACP域，对PUFA PKS酶复合物的功能而言是必需的。迄今为止鉴定的PUFAPKS系统的所有ACP域均显示高度的氨基酸序列保守性，而且，不受限于理论，本发明人相信，Schizochytrium和其它破囊壶菌目生物的PPT酶将可识别并活化来自其它PUFA PKS系统的ACP域，反之亦然。该基因被鉴定并包含为本文所述海洋细菌PUFA PKS系统中的PUFA PKS系统的一部分，并可在本发明所涵盖的遗传修饰情境中使用。作为异源PPT酶和PUFA PKS基因可共同作用而产生PUFA产物这一理论的证据，本发明人已证实了使用两种不同的异源PPT酶以及来自Schizochytrium的PUFA PKS基因在细菌宿主细胞中产生PUFA。
第三，在Schizochytrium和其它破囊壶菌目生物中，PUFA PKS系统的产物被高效地引导(channeled)到磷脂(PL)和三酰基甘油(TAG)中。本发明人的数据提示，PUFA从PKS复合物的ACP域被转移到了辅酶A(CoA)。正如在其它真核生物体中一样，该酰基-CoA随后充当各种酰基转移酶的底物，这些酶形成PL和TAG分子。与此相对地，该数据表明，在细菌中并不发生向CoA的转移，而存在从PKS复合物的ACP域到形成PL的酰基转移酶的直接转移。Schizochytrium中将PUFA从ACP转移到CoA的酶系统显然可以识别DHA和DPA二者，因此本发明人相信，可以预测，PUFA PKS系统的任何PUFA产物(在连接于PUFA PKS ACP域时)均将充当底物。
因此，在本发明的一个实施方案中，本发明人建议：改变一种破囊壶菌目生物宿主中编码PUFA PKS酶复合物的组分的基因(例如通过导入至少一个编码来自本发明海洋细菌的PUFA PKS至少一个域或其功能部分的重组核酸分子)，同时利用来自另一种破囊壶菌目生物宿主——Schizochytrium的内源PPT酶，或者来自本发明海洋细菌的PPT酶；以及PUFA-ACP至PUFA-CoA转移酶活性和TAG/PL合成系统(或者其它内源PUFA ACP至TAG/PL机制)。本发明的这些方法受到实验数据的支持，其中一些在实施例部分中详细给出。
本发明人和其它人员先前已经证明，PUFA PKS系统可以在生物体之间转移，某些部分可以互换。更具体地，先前已经证明，可以成功地把海洋细菌——希瓦氏菌SCR2738(YazawaLipids 31：S297(1996))和海产弧菌(与来自希瓦氏菌的PPT酶)(美国专利No.6,140,486)的PUFA PKS途径转移到异源宿主中(即转移到大肠杆菌中)。此外，来自两种生物体(希瓦氏菌SCRC2738和海产弧菌)的PUFA PKS酶的亚单位之间具有如此的结构同源性，以致于有可能混合和匹配来自这两个系统的基因(美国专利No.6,140,486，同上)。所有迄今为止已鉴定的PUFA PKS酶的功能域彼此均显示一定的序列同源性。类似地，这些数据表明，PUFA PKS系统，包括来自海洋细菌的那些，可以转移到Schizochytrium和其它破囊壶菌目生物中并在其中发挥功能。
本发明人现已在大肠杆菌宿主中表达了来自Schizochytrium的PUFAPKS基因(Orfs A、B和C)，并且证实了细胞产生DHA和DPA，其产生的比例和Schizochytrium中内源产生这些PUFA的比例大约相同(见实施例3)。因此，已经证实重组Schizochytrium PUFA PKS基因编码功能性的PUFA合成系统。此外，已经证明全部或部分的破囊壶菌属23B OrfA和OrfC基因在Schizochytrium中发挥功能(见实施例7)。而且，本发明人还用破囊壶菌属23B orfC编码序列完全且精确地替换了整个Schizochytrium orfC编码序列，导致Schizochytrium宿主中的PUFA生产谱偏向破囊壶菌属的生产谱(见实施例8)。
本发明人先前发现，PPT酶能够活化异源PUFA PKS ACP域。在用来自海产弧菌的PUFA PKS基因转化的大肠杆菌中，只有当同时存在合适的PPT酶基因时(在此情形下来自希瓦氏菌SCRC2738)，才会有DHA的产生(见美国专利No.6,140,486，同上)。这证实，希瓦氏菌PPT酶能够活化弧菌PUFAPKS ACP域。此外，本发明人现在已经演示了用来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的一种PPT酶(sfp)来活化(泛酰巯基乙胺化)来自Schizochytrium OrfA的ACP域(见实施例3)。本发明人还演示了用名为HetI的来自念珠蓝细菌属(Nostoc)的PPT酶活化(泛酰巯基乙胺化)来自Schizochytrium Orf A的ACP域(见实施例3)。在上面讨论的实验中，还用Het I酶作为PPT酶，使用重组Schizochytrium PUFA PKS基因在大肠杆菌中产生DHA和DPA(实施例3)。
数据还表明，DHA-CoA和DPA-CoA可能是Schizochytrium TAG和PL合成途径中的代谢中间体。已公开的生物化学数据提示，在细菌中，新合成的PUFA直接从PUFA PKS ACP域被转移到磷脂合成酶(phospholipidsynthesis enzymes)。与之相对照地，本发明人的数据提示，在真核生物Schizochytrium中，PUFA PKS ACP域上的PUFA和靶标TAG及PL分子之间可能存在中间体。真核细胞质中脂肪酸的典型载体是CoA。本发明人检查了Schizochytrium细胞提取物，发现在HPLC分级中有显著水平的化合物与DHA-CoA，DPA-CoA，16:0-CoA和18:1-CoA的真实标准品(authenticstandards)共迁移(co-migrate)。用质谱证实了推定的DHA-CoA和DPA-CoA峰的身份。与此相对地，发明人在海产弧菌提取物中无法检测到DHA-CoA，这再次提示细菌中存在不同的将PUFA转移到其最终靶标的机制(例如直接转移到PL)。数据表明，在Schizochytrium中很可能存在将新合成的PUFA转移到CoA的机制(可能通过从ACP到CoA的直接转移)。然后TAG和PL合酶均可作用于该PUFA-CoA。DHA和DPA CoA二者均有产生这一结果提示，该酶促转移机制可能可以识别多种PUFA。
本发明人还在Schizochytrium中制造了OrfA、OrfB和OrfC敲除体(见实施例4)。敲除策略依赖于同源重组，其已被证实在Schizochytrium中存在(见美国专利申请系列No.10/124,807，同上)。在设计敲除结构中可采用数种策略。用于使这三种基因失活的具体策略是利用将与微管蛋白启动子偶连的ZeocinTM抗性基因(来自pMON50000，见美国专利申请系列No.10/124,807)插入到被克隆的Orf的部分。然后使用该含有被隔断的编码区的新构建体，通过粒子轰击法转化野生型Schizochytrium细胞(见美国专利申请系列No.10/124,807)。将经过轰击的细胞涂布在含有ZeocinTM和PUFA供应源的平板上(见下文)。然后将在这些板上生长的克隆在没有补充PUFA的ZeocinTM板上划线。那些需要补充PUFA才可生长的克隆是已经通过同源重组而失活了PUFA PKS Orf的候选物。在所有三种情况中，通过用各自Schizochytrium Orfs的全长基因组DNA克隆转化细胞挽救了敲除体，从而证实了该假定。而且，在一些情况下，发现在被挽救的转化体中，ZeocinTM抗性基因被除去了(见实施例6)，表明所导入的功能性基因通过双同源重组(即缺失了抗性标记)整合到了原来的位点中。这一策略成功的一个关键是用PUFAs补充生长培养基。在本实例中，发现有效的补充方法是在添加到生长培养基之前，通过与部分甲基化的β-环糊精混合来将PUFA捕获(sequestration)(见实施例6)。总之，这些实验证实了如下的原则，即本领域的技术人员根据本文提供的指导，能够使含PUFA PKS微生物如Schizochytrium中的一个或多个PUFA PKS基因失活，从而产生PUFA营养缺陷型，然后其可根据本发明用于进一步的遗传修饰(例如通过引入其它的PKS基因，从而例如改变重组生物体的脂肪酸谱)。
本发明生物体的遗传修饰的一个要素是直接转化破囊壶菌目生物基因组的能力。在美国专利申请系列No.10/124,807(同上)中，演示了通过单交换同源重组转化Schizochytrium，并通过双交换同源重组置换靶基因。如上面讨论的，本发明人现已使用该技术进行同源重组以失活Schizochytrium中PUFA-PKA系统的OrfA，OrfB和OrfC。所得突变体依赖于培养基的PUFA补充。多种转化标记、用于高水平表达导入基因的启动子元件以及用于递送外源遗传材料的方法已经得到开发并且可以获得。因此，人们已具备了工具来敲除破囊壶菌目生物和其它具有相似PUFA PKS系统的真核生物中的内源PUFA PKS基因，并用来自其它生物体的基因，例如本文所述并在前文提出的海洋细菌基因，来替换它们。
在一种用于产生富含EPA的TAG的途径中，可通过添加编码产物为EPA的PUFA PKS系统的异源基因，例如来自本文所述的Shewanellajaponica和Shewanella olleyana的基因，来改变Schizochytrium的PUFA PKS系统。预期内源PPT酶将活化该异源PUFA PKS系统的ACP域，但是本发明人还克隆和测序了来自该海洋细菌的PPT酶，其也可被导入到该宿主中。此外，预期EPA将被转化EPA-CoA，并将容易地掺入到Schizochytrium的TAG和PL成员中。因此，在一个实施方案中，编码产生EPA的异源PUFAPKS系统的基因(例如来自上述海洋细菌)可被导入到天然产生DHA的微生物(例如Schizochytrium)中，使得所得的微生物产生EPA和DHA二者。这种技术可进一步应用于例如遗传修饰的植物，通过将上述的两种不同PUFAPKS系统导入到植物细胞中，以生成产生EPA和DHA二者，或任何所需的PUFA的组合的植物。
在该方法的一种修改形式中，可使用技术来修饰内源Schizochytrium系统的相关域(或者通过引入异源基因的特定区域，或者通过诱变Schizochytrium基因本身)，从而使其终产物是EPA，而不是DHA和DPA，或者，使其终产物是EPA及DHA和/或DPA，或者使终产物是EPA和ARA，而不是DHA和DPA。这是一个示例性的途径，因为这种技术可用于产生其它PUFA终产物，以及用于任何包含PUFA PKS系统并能够高效地将PUFAPKS系统的产物引导到磷脂(PL)和三酰基甘油(TAG)中的真核微生物。特别地，本发明适用于具有内源PUFA PKS系统的任何破囊壶菌目微生物或任何其它真核生物，其在下文将举例详细说明。此外，本发明适用于任何合适的宿主生物体，可向这些这些宿主生物体中转化如本文所述的用于产生各种PUFA谱的修饰遗传材料。例如，在实施例中，来自Schizochytrium的PUFA PKS系统被转化到大肠杆菌中。然后可以用本文所述的方法对这种经过转化的生物体进一步进行修饰，改变PUFA生产谱。
本发明具体利用这样的基因和核酸序列，其编码来自除本文及先前专利申请所述PUFA PKS系统之外的其它PKS系统的蛋白质或域，并且本发明包括来自细菌和非细菌PKS系统，包括上述的I型(重复性或模块性)、II型或III型PKS系统，的基因和核酸序列。表达这些PKS系统中每一种的生物体在本领域是已知的，并可充当本发明遗传修饰方法中有用的核酸的来源。
在一个优选的实施方案中，编码来自除PUFA PKS系统之外的PKS系统或来自其它PUFA PKS系统的蛋白质或域的基因和核酸序列分离自或源自于具有PUFAs生产优选的生长特征的生物体。具体地，理想的是，能够在约15℃或更高，20℃或更高，25℃或更高，或者30℃或更高，或者高达大约35℃的温度下，或者在一个实施方案中，在大约20℃到35℃之间以整度数递增的任何温度下，培养遗传修饰的破囊壶菌目微生物。因此，在这些温度条件下具有功能性酶活性的PKS蛋白质或域是优选的。本文所述的来自Shewanella olleyana或Shewanella japonica的PUFA PKS基因天然产生EPA，并且可以在高达25℃、30℃或35℃的温度条件下生长，这使它们特别适用于本发明的这一实施方案(见实施例1-2)。
在另一个优选实施方案中，使用编码来自产生一种脂肪酸谱的PUFAPKS系统的蛋白质或域的基因和核酸序列修饰另一种PUFA PKS系统，藉此改变宿主的脂肪酸谱。例如，破囊壶菌23B(ATCC 20892)的脂肪酸谱与Schizochytrium sp.(ATCC 20888)显著不同。破囊壶菌23B的DHA:DPA(n-6)比例可以高达40:1，而相比之下，在Schizochytrium(ATCC 20888)中只有2-3:1。破囊壶菌23B还可具有较高的C20:5(n-3)水平。然而Schizochytrium(ATCC 20888)与破囊壶菌23B相比是一种优秀的产油生物。Schizochytrium积累大量富含DHA和二十二碳五烯酸(DPA；22:5 ω6)的三酰基甘油；例如具有以干重计30％的DHA+DPA。因此，本发明人在本文描述了用破囊壶菌23B PUFA PKS基因修饰Schizochytrium内源PUFA PKS系统，而生成具有与破囊壶菌23B更相似的DHA:DPA谱的遗传修饰Schizochytrium(即“超级DHA生产者”Schizochytrium，其中将Schizochytrium的生产能力与破囊壶菌的DHA:DPA比例结合起来)。实施例8中演示了这种修饰。
因此，本发明使用来自某些海洋细菌和任何破囊壶菌目生物或其它真核PUFA PKS系统的基因，并进一步利用基因混合来扩展和/或改变PUFA产物的范围，使其包括EPA，DHA，DPA，ARA，GLA，SDA等。获得这些改变的PUFA生产谱的方法不仅包括将来自各种生物体的基因混合到破囊壶菌目生物PUFA PKS基因中，还包括对本文所公开的内源破囊壶菌目生物PUFA PKS基因进行遗传修饰的各种方法。关于破囊壶菌目生物PUFA PKS系统和海洋细菌PUFA PKS系统遗传基础和域结构的知识为设计可产生多种PUFA谱的新型遗传修饰生物体提供了基础。在微生物例如破囊壶菌目生物中制备的新型PUFA PKS构建体可以分离并用于转化植物，使植物具有相似的PUFA生产性质。
内源破囊壶菌目生物的任何一个或多个PUFA PKS域均可根据本发明改变或替换(例如用来自本发明海洋细菌的域)，只要该修饰可产生期望的结果(即改变微生物的PUFA生产谱)即可。特别优选要改变或替换的域包括，但不限于，与Schizochytrium OrfB或OrfC中的域(β-酮脂酰-ACP合酶(KS)、酰基转移酶(AT)、类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶(DH)、链长度因子(CLF)、烯酰-ACP还原酶(ER)、催化反式-2-酰基-ACP合成的酶、催化反式-2-酰基-ACP可逆异构化为顺式-3-酰基-ACP的酶、以及催化顺式-3-酰基-ACP延长为顺式-5-β-酮-酰基-ACP的酶)对应的任何域。在一个实施方案中，要改变或替换的优选域包括，但不限于，β-酮脂酰-ACP合酶(KS)、类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶(DH)和链长度因子(CLF)。
在本发明的一个方面中，通过修饰CLF(链长度因子)域改变破囊壶菌目生物PUFA-PKS PUFA生产。该域是II型(解离(disassociated)酶)PKS系统的特征。其氨基酸序列显示与KS(酮合酶对(keto synthase pairs))域的同源性，但是缺乏活性位点半胱氨酸。CLF可能起决定延长循环的数目，从而决定终产物的链长度的作用。在本发明的这个实施方案中，利用当前对FAS和PKS合成的认识，提供了一种合理的策略，即通过定向修饰非细菌PUFA-PKS系统产生ARA。关于PKS系统中CLF的功能在文献中有争议(Bisang等，Nature 401：502(1999)；Yi等，J.Am.Chem.Soc.125：12708(2003))，且人们已经认识到终产物链长度的决定可能还涉及其它的域。然而，重要的一点是，Schizochytrium可产生DHA(C22:6，ω-3)和DPA(C22:5，ω-6)二者。在PUFA-PKS系统中，顺式双键在合成生长中的碳链时引入。因为ω-3和ω-6双键的定位(placement)发生在该分子合成的早期，所以预期它们不会影响随后的终产物链长度决定。因此，不受限于理论，本发明人相信，如果把指导C20单位(而不是C22单位)合成的因子(例如CLF)导入Schizochytrium PUFA-PKS系统，将导致EPA(C20:5，ω-3)和ARA(C20:4，ω-6)的产生。例如，在异源系统中，人们可以这样利用CLF：直接将来自产EPA系统(例如来自发光杆菌(Photobacterium)，或者优选地来自具有如下文所述的优选生长要求的微生物的系统)的CLF替换到Schizochytrium基因群组中。然后，可以分析所得转化体的脂肪酸谱变化，来鉴定产EPA和/或ARA的转化体。
举例而言，在本发明的这个方面中，可以构建这样的克隆，其中OrfB的CLF被替换为来自C20 PUFA-PKS系统，例如本文中详述的海洋细菌系统的CLF。编码区的下游可以插入标记基因。更具体地，可以使用供转化破囊壶菌目生物的同源重组系统，如本文所述及美国专利申请系列No.10/124,807(同上)中详细描述的。然后，可以转化野生型破囊壶菌目生物细胞(例如Schizochytrium细胞)，选择标记表型，然后筛选已经纳入新CLF的细胞。同样，分析对这些转化体的脂肪酸谱的任何影响，以鉴定产生EPA和/或ARA的转化体。作为选择，且在某些情况下，优选地，这种对互换域的影响的筛选可以在大肠杆菌中进行(如下文所述)，或者在其它系统，例如但不限于酵母中进行。如果发现除了与CLF有关的因子之外，还有一些因子影响终产物的链长度，则可以采用相似的策略改变这些因子。在本发明的另一个实施方案中，通过导入链长度因子和β-酮脂酰-ACP合酶(KS)域二者修饰来生物体。
在本发明的另一个方面中，考虑修饰或取代β-羟酰-ACP脱水酶/酮脂酰合酶对。在大肠杆菌的顺式十八碳烯酸(C18:1，Δ11)合成中，顺式双键的生成被认为依赖于一种特定的DH酶——β-羟酰-ACP脱水酶，它是fabA基因的产物。该酶从β-酮脂酰-ACP除去HOH，在碳链中最初产生一个反式双键。DH的一个亚群：类FabA，具有顺反异构酶活性(Heath等，1996，同上)。细菌和非细菌PUFA-PKS系统的一个新方面是存在两个类FabA DH域。不受限于理论，本发明人相信，这些DH域之一或二者都将具有顺反异构酶活性(对DH域的操作在下文有更详细的讨论)。
大肠杆菌中不饱和脂肪酸合成的另一个方面是需要一种特定的KS酶——β-酮脂酰-ACP合酶，它是fabB基因产物。正是这个酶执行连接于活性位点的丝氨酸残基(通过硫酯键)的脂肪酸与丙二酰-ACP的缩合。在该多步反应中，释放CO2，线性链延长2个碳。人们相信，只有这种KS能够延长含有双键的碳链。该延长只有在双键是顺式构型时才发生；如果其是反式构型，则该双键在延长之前被烯酰-ACP还原酶(ER)还原(Heath等，1996，同上)。迄今为止已定性的所有PUFA-PKS系统均具有两个KS域，其中一个显示的与大肠杆菌的类FabB KS的同源性比另一个更高。同样，不受限于理论，本发明人相信，在PUFA-PKS系统中，DH(类FabA)和KS(类FabB)酶域的特异性和相互作用决定终产物中顺式双键的数目和位置。因为2-碳延长反应的数目大于PUFA-PKS终产物中存在的双键的数目，所以可以确定在一些延长循环中发生了完全还原。因此DH和KS域可用作改变DHA/DPA比例或其它长链脂肪酸的比例的靶标。这些可以通过引入来自其它系统的同源域或通过对这些基因片段进行突变而加以修饰和/或评估。在一个实施方案中，类似FabA的DH可能根本不需要KS伴侣域。
在另一个实施方案中，ER(烯酰-ACP还原酶——一种还原脂肪酰-ACP中的反式双键产生完全饱和的碳的酶)域可被修饰或取代，从而改变PKS系统制造的产物类型。例如，本发明人知道，Schizochytrium PUFA-PKS系统与先前描述的细菌系统的不同在于，它具有两个(而不是一个)ER域。不受限于理论，本发明人相信，这些ER域可强烈影响所得的PKS生产的产物。可通过下述手段改变所得的PKS产物：分别敲除个别的域，或修饰它们的核苷酸序列，或者替换成来自其它生物体的ER域，例如来自本文所述海洋细菌的ER域。
在本发明的另一个方面中，考虑用PUFA-PKS系统的DH域(类FabA)之一取代没有异构活性的DH域，可能生成具有混合的顺式和反式双键的分子。Schizochytrium PUFA PKS系统的当前产物是DHA和DPA(C22:5 ω6)。如果人们操作该系统产生C20脂肪酸，则可以预期产物是EPA和ARA(C20:4 ω6)。这将提供一种新的ARA来源。还可以替换为来自可产生不同DHA对DPA比例的相关PUFA-PKS系统的域——例如通过使用来自破囊壶菌23B的基因(其PUFA PKS系统在美国专利申请系列No.10/124,800(同上)中被鉴定)。
此外，在一个实施方案中，改变破囊壶菌目生物PUFA PKS系统中的ER域之一(例如通过除去或失活)，从而改变终产物谱。可以设想用一种比较复杂的方法，以定向的方式对PUFA-PKS蛋白质的每一个不同的域尝试相似的策略。当然，不必仅限于操作单个域。最终，可以通过混合来自所述PUFA-PKS系统和其它PKS或FAS系统(例如I型、II型、III型)的域来扩展该方法，生成一整套新的PUFA终产物。
作为本文详细描述的细菌PUFA PKS基因可如何用于改变Schizochytrium中的PUFA生产的实例，提供了下面的讨论。同样地，这里所述的全部实例均可等同地应用于其它遗传修饰的微生物的生产或遗传修饰植物的生产。来自细菌的PUFA PKS基因的所有目前已知的实例均以4个紧密连锁的基因存在，其含有与Schizochytrium的三基因群组相同的域。确实，本发明人已证实，来自Shewanella olleyana和Shewanella japonica的PUFA PKS基因以这种紧密集簇的排列存在。这样，可使用本文所述细菌PUFA PKS基因的DNA序列设计载体，来转化内源PUFA PKS基因缺陷的Schizochytrium菌株(例如，见实施例4、6和7)。可用整个细菌基因(编码序列)替代整个Schizochytrium基因(编码序列)，从而利用Schizochytrium基因表达区，并且可以使第四个细菌基因靶向基因组中的不同位置。或者，可以通过类似同源重组的技术，将各个细菌PUFA PKS功能域与Schizochytrium相似的域“互易”(swap)或互换。作为另一个选择，甚至可以将细菌PUFA PKS基因添加到来自破囊壶菌目生物的PUFA PKS系统，而产生具有多于一种PUFA合酶活性的生物体。可以理解，考虑到Schizochytrium编码子使用的细节，可能必须对细菌PUFA PKS基因或域的序列进行修饰，但这是本领域技术人员的能力范围之内的事情。
人们承认，可能引入到天然(内源、自然)PKS系统中的、随机的或者定向的许多遗传改变，将导致酶功能失活。因此，为了在受控环境下测试破囊壶菌目生物PUFA PKS系统的遗传操作的效果，人们可以首先使用另一个宿主，例如大肠杆菌中的重组系统，来对该系统的各个方面进行操作，并评估结果。例如，大肠杆菌的FabB菌株不能合成不饱和脂肪酸，需要用可替代其正常不饱和脂肪酸的脂肪酸补充培养基方能生长(见Metz等(2001)，同上)。然而，当用功能性PUFA-PKS系统(即在大肠杆菌宿主中产生PUFA产物的PUFA-PKS系统——见(Metz等.(2001)，同上，该公开的图2A)转化该菌株时，可以免去这种需要(对培养基进行补充的需要)。此时，被转化的FabB菌株需要功能性PUFA-PKS系统(来产生不饱和脂肪酸)以在没有补充的条件下生长。该实施例的关键要素是多种不饱和脂肪酸的生产充足(乃至不饱和脂肪酸替代物，例如分枝链脂肪酸)。因此，在本发明的另一个优选实施方案中，人们可以在一个或多个本文所公开的PUFA PKS基因中生成大量突变，然后转化适当修饰的FabB菌株(例如在含ER域的表达构建体中产生突变，并转化FabB菌株，该菌株在不同质粒上具有其它必需的域，或者这些域整合到该菌株的染色体中)，并仅筛选可在无补充的培养基上生长(即仍然具有产生可补偿FabB缺陷的分子的能力)的转化体。大肠杆菌的FabA菌株具有与FabB菌株相似的表型，也可用作上述实施例的备选菌株。
在实施例部分举例说明了一种用于遗传修饰PUFA PKS的测试系统。简而言之，用编码包含全部或部分破囊壶菌目生物PUFA PKS系统的PUFA
PKS系统(例如Schizochytrium的OrfA、B和C)的基因和编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)的基因转化宿主微生物，例如大肠杆菌，其中磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶是在PKS系统中磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶辅助因子的结合以产生活性ACP全蛋白(holo-ACP)所必需的。可以对编码PKS系统的基因进行基因工程改造，以向破囊壶菌目生物PUFA PKS基因导入一种或多种修饰，和/或向破囊壶菌目生物基因中导入编码来自其它PKS系统的域的核酸(包括来自非破囊壶菌目微生物的基因和来自不同破囊壶菌目微生物的基因)。可以在大肠杆菌中表达该PUFA PKS系统并测量PUFA生产谱。这样，可以在对破囊壶菌目生物PUFA生产生物体进行操作之前评估潜在的遗传修饰。
本发明包括对破囊壶菌目生物PUFA PKS系统中的内源核酸分子进行操作，和/或使用分离核酸分子，其中所述分离核酸分子包括来自Shewanellajaponica PUFA PKS系统的核酸序列，来自Shewanella olleyana PUFA PKS系统的核酸序列，并还可以包括来自破囊壶菌目生物PUFA PKS系统的核酸序列，或者这些核酸序列中任一个的同源体。在一个方面中，本发明涉及下述核酸分子的修饰和/或用途：该分子包括这样的核酸序列，其编码来自PUFA PKS系统的域，所述域具有下列至少一种蛋白质的生物活性：丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)、β-酮脂酰-ACP合酶(KS)、酮还原酶(KR)、酰基转移酶(AT)、类FabA β-羟酰-ACP脱水酶(DH)、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶、链长度因子(CLF)、酰基载体蛋白(ACP)、烯酰ACP-还原酶(ER)、催化反式-2-酰基-ACP合成的酶、催化反式-2-酰基-ACP可逆异构化成顺式-3-酰基-ACP的酶、和/或催化顺式-3-酰基-ACP延长为顺式-5-β-酮-酰基-ACP的酶。优选修饰以改变宿主破囊壶菌目生物的PUFA生产谱的域在本文前面已经有详细讨论。
根据本发明的生物体遗传修饰优选地影响生物体产生的PUFA的类型、量和/或活性，不论生物体是否具有被遗传修饰的内源PUFA PKS系统，和/或不论是否向该生物体中导入重组核酸分子。根据本发明，影响PUFA PKS系统的活性，例如影响PUFA生产谱，包括在PUFA PKS系统或与PUFA PKS系统相互作用的基因中的任何遗传修饰，导致与没有遗传修饰相比，生物体表达的任何PUFA PKS系统生物活性发生任何可检测或可测量的变化或修饰。根据本发明，词组“PUFA谱”(PUFA profile)、“PUFA表达谱”(PUFA expression profile)和“PUFA生产谱”(PUFA production profile)可以互换使用，并描述生物体表达/产生的PUFA的整体概况。PUFA表达谱可包括生物体表达的PUFAs的类型，以及所产生的PUFAs的绝对和相对量。因此，PUFA图谱可以根据生物体产生的PUFAs的相互比例，根据生物体产生的PUFAs的类型，和/或根据生物体产生的PUFAs的类型和绝对或相对量来描述。
如上面讨论的，宿主生物体可以包括任何具有或者不具有内源PUFAPKS系统的原核或真核生物体，并且优选地是能够高效引导PUFA PKS系统的产物进入磷脂(PL)和三酰基甘油(TAG)中的真核微生物。优选的宿主微生物是破囊壶菌目的任何成员，包括破囊壶菌科和网粘菌科。这些科中特别优选的宿主细胞在上面已有说明。优选的宿主植物细胞包括来自任何作物植物或商业上有用植物的植物细胞。
在本发明的一个实施方案中，考虑使基因工程和/或诱变程序与选择性筛选方法相结合，以获得具有目标PUFA生产谱的破囊壶菌目微生物。突变方法包括，但不限于：化学诱变、基因改组(shuffling)、打开/关闭(switching)编码特定酶域的基因的区域或者限于这些基因特定区域的突变，以及其它的方法。
例如，可使用高通量诱变方法影响或优化期望PUFA谱的生产。一旦开发出有效的模型系统，即可以高通量的方式修饰这些基因。可以预想在两个水平上利用这些技术。首先，如果能够设计针对目标产物(例如EPA)的生产具有足够的选择性的筛选方法，则可使用其来尝试改变该系统来产生该产物(例如代替或者结合其它策略，例如上面讨论的策略)。此外，如果上面列举的策略得到了一系列确实产生目标PUFA谱的基因，则可使用高通量技术优化该系统。例如，如果引入的域仅在相对较低的温度下起作用，则可设计允许除去该限制的选择方法。
如上所述，在本发明的一个实施方案中，遗传修饰的微生物或植物包括具有增强的合成所需生物活性分子(产物)的能力或者具有新导入的合成特定产物的能力(例如合成特殊的抗生素)的微生物或植物。根据本发明，“增强的合成某产物的能力”是指任何与该产物合成有关的途径的增强或上调，从而使该微生物或植物与在相同条件下培养或生长的野生型微生物或植物相比，可产生增加的量的产物(包括产生任何先前没有的产物)。产生这种遗传修饰生物体的方法在上文已有说明，并且确实，所说明的使用任何PUFA PKS系统的任何示例性的修饰均可适用于在植物中表达。
本发明的一个实施方案是通过生长或培养本发明的遗传修饰微生物或植物(在上文有详细说明)产生所需生物活性分子(也称作产物或化合物)的方法。这种方法包括如下步骤，分别在发酵培养基中培养，或在合适的环境，例如土壤中培育(grow)具有本文前面说明并且根据本发明的遗传修饰的微生物或植物。用于与本发明PUFA PKS系统有关的遗传修饰的优选宿主细胞在上文有说明。
本发明的一个实施方案是通过培养本发明遗传修饰的微生物(如上文详细说明的)产生期望PUFAs的方法。这种方法包括如下步骤，在发酵培养基中在可以有效产生PUFA(s)的条件下培养微生物，该微生物具有先前所述的并且根据本发明的遗传修饰。合适的或者有效的培养基是指本发明遗传修饰的微生物，包括破囊壶菌目生物和其它微生物，在其中培养时，能够产生期望PUFA产物的任何培养基。这类培养基通常是水性培养基，含有可同化的碳、氮和磷酸根源。这种培养基还可以包括合适的盐、矿物质、金属或其它养分。本发明的任何微生物均可以在常规的发酵生物反应器中培养。微生物可以用任何发酵方法培养，包括但不限于，分批、补料分批、细胞再循环(cell recycle)和连续发酵。对于根据本发明的破囊壶菌目微生物的优选生长条件在本领域是已知的，并且在例如美国专利No.5,130,242、美国专利No.5,340,742和美国专利No.5,698,244中有详细说明，本文引用其每一篇的全部内容作为参考。
在一个实施方案中，遗传修饰的微生物在大约15℃或更高的温度下培养，在另一个实施方案中，在大约20℃或更高，在另外的实施方案中，在大约25℃或更高，在另一实施方案中，在大约30℃或更高，在另一个实施方案中，在高达约35℃或者更高的温度下培养，在另外的实施方案中，在大约20℃-35℃的，以整数度递增的任何温度下培养。
由遗传修饰微生物产生的所需PUFA和/或其它生物活性分子，可以用常规的分离和纯化技术从发酵培养基中回收。例如，可以对发酵培养基进行过滤或离心来除去微生物，细胞碎片和其它颗粒状物质，然后可以通过常规的方法，例如离子交换、层析、萃取、溶剂萃取、相分离、膜分离、电渗析、反渗透、蒸馏、化学衍生化和结晶，从无细胞上清液中回收产物。或者，可以使用产生PUFA的微生物，或其提取物和各种级分，而无须从产物中除去微生物成分。
优选地，本发明的遗传修饰微生物产生一种或多种多不饱和脂肪酸，包括但不限于，EPA(C20:5，ω-3)，DHA(C22:6，ω-3)，DPA(C22:5，ω-6)，ARA(C20:4，ω-6)，GLA(C18:3，n-6)，和SDA(C18:4，n-3))。在一个优选实施方案中，根据本发明遗传修饰Schizochytrium而产生高水平的EPA，其中所述Schizochytrium在野生型形式中产生高水平DHA和DPA。如上面讨论的，使用遗传修饰的破囊壶菌目微生物产生PUFA的一个优点是PUFA被直接纳入磷脂(PL)和三酰基甘油(TAG)中。
优选地，PUFA以大于微生物干重的大约5％的产量被生产，在一个方面中，产量大于6％，在另一个方面中，产量大于7％，在另一个方面中，产量大于8％，在另一个方面中，产量大于9％，在另一个方面中，产量大于10％，依次类推，以整数百分数递增，直到高达大于微生物干重的90％(例如，15％，20％，30％，40％，50％，以及其间的任何百分数)。
在用于产生期望的本发明的生物活性化合物的方法中，在发酵培养基中培养，或者在合适的基质(例如土壤)中培育遗传修饰的植物。合适或者有效的发酵培养基在上文已经详细讨论，高等植物的合适生长基质包括任何用于植物的生长基质，包括但不限于，土壤、砂、任何其它可支持根生长的颗粒基质(例如蛭石、珍珠岩等)或水培(hydroponic)基质，以及使高等植物的生长最优化的合适光、水和营养添加物。本发明遗传修饰的植物受到工程操作，从而通过PKS系统的活性产生显著量的期望产物，其中该提供根据本发明进行了遗传修饰。可以通过从植物中提取化合物的纯化过程来回收所述化合物。在优选的实施方案中，通过收获植物回收化合物。在该实施方案中，植物可以以其自然状态被消费，或者进一步加工成可消费产品。
根据本公开，本领域技术人员显然可以想到许多可用于生产生物活性分子的遗传修饰，各种其它的修饰已在本文中先前讨论了。本发明考虑导致产生期望的生物活性分子的任何与本文所述PUFA PKS系统有关的遗传修饰。
根据本发明，生物活性分子包括如下所述的任何具有生物活性的分子(化合物，产物等)，其可以通过PKS系统产生，该PKS系统包含至少一个这样的氨基酸序列，该序列具有本文所述的非细菌PUFA PKS系统至少一个功能域的生物活性。这类生物活性分子可以包括，但不限于，多不饱和脂肪酸(PUFA)、抗炎制剂、化疗剂、活性赋形剂、骨质疏松症药物、抗抑郁剂、抗惊厥药、抗幽门螺杆菌(Heliobactor pylori)药、治疗神经变性疾病的药物、治疗变性肝病的药物、抗生素和降低胆固醇的制剂。本发明PUFAPKS系统的一个优点是这种系统具有以顺式构型引入碳-碳双键的能力，从而分子在每第三个碳原子具有一个双键。这种能力可利用来产生多种化合物。
优选地，由遗传修饰的微生物产生的目标生物活性化合物以大于微生物干重的大约0.05％，优选大于大约0.1％，更优选大于大约0.25％，更优选大于大约0.5％，更优选大于大约0.75％，更优选大于大约1％，更优选大于大约2.5％，更优选大于大约5％，更优选大于大约10％，更优选大于大约15％，甚至更优选大于微生物干重的大约20％的产量被生产。对于液体化合物，优选所述化合物以大于微生物干重的大约5％的产量被生产。对于其它生物活性化合物，例如抗生素或合成的量较少的化合物，将具有占微生物干重大于约0.5％的这类化合物的菌株鉴定为预期含有上述类型的新PKS系统。在一些实施方案中，微生物分泌而不是积累特定的生物活性分子(化合物)。因此，这类生物活性分子一般从培养基回收，并且所产生分子的浓度根据微生物和培养规模而不同。
本发明的一个实施方案涉及修饰终产物使之包含至少一种脂肪酸的方法(尽管终产物可能已经包含至少一种脂肪酸，这样通过本发明另外提供了至少一种脂肪酸)，该方法包括向终产物添加由重组宿主细胞(微生物或植物)产生的油，该重组宿主细胞表达至少一种重组核酸分子，该核酸分子包含编码PUFA PKS系统至少一个生物活性域的核酸序列。该PUFA PKS系统包括本文所述的任何合适的细菌或非细菌PUFA PKS系统，包括来自Shewanella japonica或Shewanella olleyana的细菌PUFA PKS系统，或者来自其它通常(即在正常或者自然条件下)能够在超过22℃的温度条件下生长并产生PUFA的细菌的任何PUFA PKS系统。
优选地，终产物从如下的组中选择，包括食品、膳食补充剂、药物配方、母乳化动物乳和婴儿配方食品。合适的药物配方包括，但不限于，抗炎制剂、化疗剂、活性赋形剂、骨质疏松症药、抗抑郁剂、抗惊厥药、抗幽门螺杆菌药物、治疗神经变性疾病的药物、治疗变性肝病的药物、抗生素及降胆固醇制剂。在一个实施方案中，终产物用于治疗选自下组的病症：慢性炎症、急性炎症、胃肠紊乱、癌症、恶病质、心脏再狭窄、神经变性紊乱(neurodegenarative disorder)、肝变性紊乱(degenerative disorder of theliver)、血脂紊乱(blood lipid disorder)、骨质疏松症、骨关节炎、自身免疫疾病、先兆子痫、早产、年龄相关性黄斑病变(age-related maculopathy)、肺紊乱(pulmonary disorder)、和过氧化物酶体病(peroxisomal disorder)。
合适的食物产品包括，但不限于，精细烤制品(fine bakery wares)、面包(bread)和卷状食品(rolls)、谷类早餐食品(breakfast cereals)、加工和未加工的乳酪、调味品(condiments)(调味蕃茄酱、蛋黄酱等)、乳制品(乳、酸乳)、布丁和凝胶状点心、充气饮料(carbonated drinks)、茶(teas)、饮料混合粉(powdered beverage mix)、加工鱼制品、基于水果的饮料(fruit-based drinks)、口香糖、硬糖果(hard confectionery)、冷冻乳制品、加工肉制品、坚果和基于坚果的糊(nut-based spreads)、面食制品(pasta)、加工家禽产品、卤汁(gravies)和沙司(sauces)、土豆片和其它薄片(chips)或脆片(crisps)、巧克力和其它糖果、汤和汤粉(soup mix)、基于大豆的制品(奶(milks)、饮料(drinks)、奶油(creams)、增白剂(whiteners))、基于植物油的糊(vegetable oil-based spreads)和基于植物的饮料(vegetable-based drinks)。
本发明另外的实施方案涉及产生母乳化动物乳的方法。该方法包括用至少一种重组核酸分子遗传修饰产乳动物的产乳细胞的步骤，所述重组核酸分子包括编码本文所述PUFA PKS系统的至少一个生物活性域的核酸序列。
遗传修饰宿主细胞产生遗传修饰的非人产乳动物的方法在本领域是已知的。供修饰的宿主动物的实例包括牛、绵羊、猪、山羊、牦牛等，其可接受遗传操作和克隆，以快速扩增表达转基因的群体。对于动物，类PKS转基因可通过基因调控区的修饰适用于在靶细胞器、组织和体液中表达。特别感兴趣的是在宿主动物的母乳中产生PUFAs。
下面的实施例是用于举例说明，并不意图限制本发明的范围。
实施例
实施例1
下面的实施例证明，某些产EPA细菌含有类PUFA PKS基因，这些基因似乎适于用来修饰Schizochytrium。
已经证实，两种希瓦氏菌属的产EPA海洋细菌菌株在Schizochytrium发酵的典型温度下生长，并具有类PUFA PKS基因。Shewanella olleyana(澳大利亚南极微生物保藏中心(ACAM)菌株号644；Skerratt等，Int.J.Syst.Evol.Microbiol 52，2101(2002))在高达25-30℃的条件下产生EPA并生长。Shewanella japonica(美国典型培养物保藏中心(ATCC)菌株号BAA-316；Ivanova等，Int.J.Syst.Evol.Microbiol.51，1027(2001))在高达30-35℃的条件下产生EPA并生长。
为了从这些细菌菌株中鉴定和分离PUFA-PKS基因，根据ShewanellaSCRC-2738、Shewanella oneidensis MR-1、希瓦氏菌属菌种GA-22、Photobacter profundum和Moritella marina的已公开基因序列(见上文的讨论)，设计了针对细菌orf5/pfaA基因的KS-MAT区和细菌orf7/pfaC基因的DH-DH区的简并PCR引物对。具体而言，引物和PCR条件的设计如下：
KS/AT区引物；根据如下的公开序列：希瓦氏菌属菌种SCRC-2738；Shewanella oneidensis MR-1；Photobacter profundum；Moritella marina：
prRZ23  GGYATGMTGRTTGGTGAAGG(正向；SEQ ID NO：25)
prRZ24  TRTTSASRTAYTGYGAACCTTG(反向；SEQ ID NO：26)
DH区引物；根据如下的公开序列：希瓦氏菌属菌种GA-22；希瓦氏菌属菌种SCRC-2738；Photobacter profundum；Moritella marina：
prRZ28  ATGKCNGAAGGTTGTGGCCA(正向；SEQ ID NO：27)
prRZ29  CCWGARATRAAGCCRTTDGGTTG(反向；SEQ ID NO：28)
PCR条件(以细菌染色体DNA为模板)如下：
反应混合物：
0.2μM dN TPs
0.1μM每种引物
8％ DMSO
250ng染色体DNA
2.5U Herculase
Figure A200580042803D0099143258QIETU
 DNA聚合酶(Stratagene)
1X Herculase
Figure A200580042803D0099143258QIETU
缓冲液
50μL总体积
PCR规程：(1)98℃ 3min.；(2)98℃ 40秒；(3)56℃ 30秒；(4)72℃ 90秒；
(5)重复步骤2-429个循环；(6)72℃ 10min.；(7)保持在6℃。
对于两个引物对，使用来自Shewanella olleyana或Shewanella japonica的染色体DNA模板，PCR给出了截然不同的具有预期大小的产物。将四种PCR产物分别克隆到pCR-BLUNT II-TOPO(Invitrogen)中，并用M13正向和反向引物确定插入序列。在所有情况下，这样获得的DNA序列均与已知的细菌PUFA PKS基因区高度同源。
将从细菌PCR产物获得的DNA序列与已知序列和来自SchizochytriumATCC 20888的PUFA PKS基因比较，比较在标准Blastx搜索中进行(BLAST参数：低复杂性过滤(Low Complexity filter)：On；矩阵(Matrix)：BLOSUM62；字长：3；缺口折损(Gap Costs)：存在(Existance)11，延伸(Extension)1(在如下文献中描述的BLAST：Altschul S.F.，Madden，T.L.，
Figure A200580042803D0099143343QIETU
，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.& Lipman，D.J.(1997)＂Gapped BLAST andPSI-BLAST：a new generation of protein database search programs.＂NucleicAcids Res.25：3389-3402，本文引用其全部内容作为参考))。
在氨基酸水平，与Shewanella olleyana ACAM644酮脂酰合酶/酰基转移酶(KS-AT)推定氨基酸序列具有最高同源性程度的序列为：Photobacterprofundum pfaA(同一性＝70％；确信度(positives)＝81％)；Shewanellaoneidensis MR-1“多域β-酮脂酰合酶”(同一性＝66％；确信度＝77％)；和Moritella marina ORF8(同一性＝56％；确信度＝71％)。Schizochytrium sp.ATCC20888 orfA与Shewanella olleyana KS-AT的推定氨基酸序列的同一性为41％，确信度为56％。
在氨基酸水平，与Shewanella japonica ATCC BAA-316酮脂酰合酶/酰基转移酶(KS-AT)的推定氨基酸序列具有最高同源性程度的序列为：Shewanella oneidensis MR-1“多域β-酮脂酰合酶”(同一性＝67％；确信度＝79％)；希瓦氏菌属菌种SCRC-2738 orf5(同一性＝69％；确信度＝77％)；以及Moritella marina ORF8(同一性＝56％；确信度＝70％)。Schizochytrium sp.ATCC20888 orfA与Shewanella japonica KS-AT的推定氨基酸序列的同一性为41％，确信度为55％。
在氨基酸水平，与Shewanella olleyana ACAM644脱氢酶的推定氨基酸序列具有最高同源性程度的序列为：希瓦氏菌属菌种SCRC-2738 orf7(同一性＝77％；确信度＝86％)；Photobacter profundum pfaC(同一性＝72％；确信度＝81％)；和Shewanella oneidensis MR-1“多域β-酮脂酰合酶”(同一性＝75％；确信度＝83％)。Schizochytrium sp.ATCC20888 orfC与Shewanella olleyana DH的推定氨基酸序列的同一性为26％，确信度为42％。
在氨基酸水平，与Shewanella japonica ATCC BAA-316脱氢酶的推定氨基酸序列具有最高同源性程度的序列为：希瓦氏菌属菌种SCRC-2738 orf7(同一性＝77％；确信度＝86％)；Photobacter profundum pfaC(同一性＝73％；确信度＝83％)；和Shewanella oneidensis MR-1“多域β-酮脂酰合酶”(同一性＝74％；确信度＝81％)。Schizochytrium sp.ATCC20888 orfC与Shewanella olleyana DH的推定氨基酸序列的同一性为27％，确信度为42％。
实施例2
下面的实施例演示了编码来自Shewanella japonica和Shewanellaolleyana的完整PUFA PKS系统的DNA克隆的产生、鉴定、测序和分析。
Shewanella japonica和Shewanella olleyana重组文库由大基因组DNA片段(大约40kB)组成，通过标准方法产生在粘粒载体Supercos-1(Stratagene)中。通过标准菌落杂交程序对粘粒文库进行筛选。用两个单独的洋地黄毒苷标记探针筛选Sh.olleyana粘粒库。每个探针含有与上面实施例1所述EPA生物合成基因簇的区段同源的DNA片段，且分别代表所述簇的两端。这些探针是通过PCR产生的，其中使用Sh.olleyana DNA作为模板，对一个探针使用引物prRZ23(SEQ ID NO：25)和prRZ24(SEQ ID NO：26)，对另一探针使用引物prRZ28(SEQ ID NO：27)和prRZ29(SEQ ID NO：28)。上文的实施例1描述了这些简并引物和含有与EPA生物合成基因区段同源的DNA片段的衍生PCR产物。用相似的方式产生Sh.japonica特异性探针，并筛选粘粒库。在所有情况下，探针个体与某些粘粒的强烈杂交，表明存在含有与EPA生物合成基因簇同源的DNA的克隆。
然后，对于与两个探针都强烈杂交的克隆，测定其在大肠杆菌中的EPA异源生产。将大肠杆菌粘粒克隆的单个分离物的细胞在2mL LB肉汤中30℃、200rpm振荡下培育过夜。用0.5mL的该传代培养物接种25mL LB肉汤，并将细胞在20℃培育20小时。然后通过离心收获细胞，并用冷冻干燥法干燥。用标准气相色谱方法分析干燥细胞的脂肪含量以及脂肪酸谱和含量。由含空Supercos-1载体的大肠杆菌对照细胞制备的脂肪酸中没有检测到EPA。含有来自S.japonica和S.olleyana的某些粘粒的大肠杆菌菌株通常产生占总脂肪酸3-8％的EPA。
选择来自Sh.olleyana的粘粒9A10和来自Sh.japonica的粘粒3F3进行总体随机测序(total random sequencing)。将粘粒克隆随机断裂并亚克隆，并对所得的随机克隆测序。利用Phred、Phrap和Consed程序分析色谱图，并组装为重叠群(contig)(Ewing等，Genome Res.8(3)：175-185(1998)；Ewing等，Genome Res.8(3)：186-194(1998)；Gordon等，Genome Res.8(3)：195-202(1998))。最终重叠群的每个核苷酸碱基对至少被最小聚集Phred分数40覆盖(置信度99.995％)。
来自粘粒3F3的39669bp重叠群的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。来自粘粒9A10的38794bp重叠群的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。来自Shewanella japonica(粘粒3F3)和Shewanella olleyana(粘粒9A10)的PUFAPKS基因簇的各个域和蛋白质的序列在本文前面有详细说明，并分别表示在SEQ ID NO：2-6和8-12中。
本文所述的蛋白质比较使用标准BLAST分析来进行(BLAST参数：Blastp，低复杂性过滤：On，程序-BLOSUM62，缺口折损-存在：11，延伸1；(在下列文献中描述的BLAST：Altschul，S.F.，Madden，T.L.，
Figure A200580042803D0099143343QIETU
，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.& Lipman，D.J.(1997)＂Gapped BLAST andPSI-BLAST：a new generation of protein database search programs.＂NucleicAcids Res.25：3389-3402))。域鉴定(domain identification)使用ConservedDomain Database and Search Service(CD-Search)，v2.01来进行。CD-Search是公共访问程序，可以通过美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)的公共数据库访问，该中心由美国国家医学图书馆(National Library of Medicine)和美国国立卫生研究院(National Institutesof Health)主办。CD-Search包含来自各种数据库的蛋白质域。CD-Search使用BLAST算法鉴定查询蛋白质序列中的域(Marchler-Bauer A，Bryant SH.“CD-Search：protein domain annotations on the fly.”Nucleic Acids Res.32：W327-331(2004))。最后，使用EasyGene 1.0 Server(Larsen TS，Krogh A.“EasyGene-aprokaryotic gene finder that ranks ORFs by statisticalsignificance”，BMC Bioinformatics 2003，4：21)和GeneMark.hmm 2.1(LukashinA.和Borodovsky M.，“GeneMark.hmm：new solutions for gene finding”NucleicAcids Res.，Vol.26，No.4，pp.1107-1115.1998)辅助进行开放阅读框(ORF)识别。在EasyGene分析中使用默认设定，并以霍乱弧菌(Vibrio cholerae)作为参考生物。GeneMark.hmm程序使用默认设定，并使用Pseudonative.model作为模型生物的设定。这些程序使用Hidden Markov Models算法预测细菌基因。
表1显示了来自Shewanella japonica粘粒3F3的ORF的概览/分析，包括基于SEQ ID NO：1的起始和终止密码子坐标，每个ORF的总核苷酸长度，每个预测蛋白质的总氨基酸，每个预测蛋白质的计算分子量，对公共GenBank数据库所作BLASTp查询中最高的同源物，GenBank数据库中最同源的条目的GI登记号(“GenInfo Identifier”序列识别号)，和提议的功能(如果与EPA生产相关)。
表2显示了来自Shewanella olleyana粘粒9A10的ORF的概览/分析，包括基于SEQ ID NO：7的起始和终止密码子坐标，以及与表1所示Shewanella japonica相同的附加信息。
表3显示了来自Shewanella japonica(粘粒3F3)EPA簇的推定蛋白质与Shewanella olleyana(粘粒9A10)比较，以及与一些蛋白质比较的百分比同一性，所述蛋白质来自公共序列数据库中同一性水平最高的产EPA生物。表4显示了与表3相同的关于核苷酸同一性的分析。
表5显示了所有已标注的pfa ORF上游的23个核苷酸，下划线是可能的核糖体结合位点；以及标注为以TTG起始密码子开始的ORF的可选起始密码子和上游核苷酸。
Figure A200580042803D01031
Figure A200580042803D01041
表3
氨基酸百分比同一性
PfaA
 
Shewanella japonica(3F3) Shewanella olleyana(9A10)
Shewanella japonica(3F3) 87.7
Shewanella olleyana(9A10) 87.7
希瓦氏菌属菌种SCRC-2738 Orf5 63 634
Photobacteriumprofundum S9 PfaA 60.9 62.2
Moritella marina Orf8 41.6 42.9
PfaB
 
Shewanella japonica(3F3)             Shewanella olleyana(9A10)
Shewanella japonica(3F3) 70.3
Shewanella olleyana(9A10) 70.3
希瓦氏菌属菌种SCRC-2738 Orf6 39.8 384
Photobacterium profundum S9P faB 39 39.6
Moritella marina Orf9 19 18.4
PfaC
 
Shewanella japonica(3F3)             Shewanella olleyana(9A10)
Shewanella japonica(3F3) 85.7
Shewanella olleyana(9A10) 85.7
希瓦氏菌属菌种SCRC-2738 Orf7 65.1 64.8
Photobacterium profundum S9 PfaC 64.6 64.6
Moritella marina Orf10 47.3 47.1
PfaD
 
Shewanella japonica(3F3)             Shewanella olleyana(9A10)
Shewanella japonica(3F3) 98.2
Shewanella olleyana(9A10) 98.2
希瓦氏菌属菌种SCRC-2738 Orf8 84.2 84
Photobacterium profundum S9 PfaD 93.8 64.6
Moritella marina Orf11 63 62.6
PfaE
 
Shewanella japonica(3F3)             Shewanella olleyana(9A10)
Shewanella japonica(3F3) 61.2
Shewanella olleyana(9A10) 61.2
希瓦氏菌属菌种SCRC-2738 Orf2 36.7 38
鱼腥蓝细菌属(Anabaena)菌种PCC 7120 HetI              22.6 24.8
枯草芽孢杆菌Sfp 20.1 20.7
表4
核酸百分比同一性
pfaA
 
Shewanella japonica(3F3)             Shewanella olleyana(9A10)
Shewanella japonica(3F3) 83.1
Shewanella olleyana(9A10) 83.1
希瓦氏菌属菌种SCRC-2738 orf5 65.5 65.5
Photobacterium profundum S9 pfaA 63.5 64.4
Moritella narina orf8 56 56.2
pfaB
 
Shewanella japonica(3F3)             Shewanella olleyana(9A10)
Shewanella japonica(3F3) 704
Shewanella olleyana(9A10) 704
希瓦氏菌属菌种SCRC-2738 orf6 54.7 54.5
Photobacterium profundum S9 pfaB 534 52.6
Moritella marina orf9 42.2 40.6
pfaC
 
Shewanella japonica(3F3)             Shewanella olleyana(9A10)
Shewanella japonica(3F3) 79.6
Shewanella olleyana(9A10) 79.6
希瓦氏菌属菌种SCRC-2738 orf7 66.2 67.2
Photobacterium profundum S9 pfaC 66 66.7
Moritella marina orf10 58.3 58.8
pfaD
 
Shewanella japonica(3F3)             Shewanella olleyana(9A10)
Shewanella japonica(3F3) 89.5
Shewanella olleyana(9A10) 89.5
希瓦氏菌属菌种SCRC-2738 orf8 774 77.8
Photobacterium profundum S9 pfaD 75.9 76.0
Moritella marina orf11 63.5 62.9
pfaE
 
Shewanella japonica(3F3)             Shewanella olleyana(9A10)
Shewanella japonica(3F3) 65
Shewanella olleyana(9A10) 65
希瓦氏菌属菌种SCRC-2738 orf2 43 44.4
鱼腥蓝细菌属菌种PCC 7120 hetI 43.1 38.6
枯草芽孢杆菌sfp 34.6 32.9
表5
EPA生物合成簇的ORFs的预测起始位点(起始密码子用粗体显示)
下划线表示可能的核糖体结合位点
ALL pfa ORFs
3F3
CTGAACACTGGAGACTCAAA   ATG   pfaA  SEQ ID NO：33
GCTGACTTGCAGGAGTCTGT   GTG   pfaB  SEQ ID NO：34
CAATTAGAAGGAGAACAATC   TTG   pfaC  SEQ ID NO：35
AGAGGCATAAAGGAATAATA   ATG   pfaD  SEQ ID NO：36
GCGACCTAGAACAAGCGACA   ATG   pfaE  SEQ ID NO：37
9A10
CTGAACACTGGAGACTCAAA   ATG   pfaA  SEQ ID NO：38
GCTGATTTGCAGGAGTCTGT   GTG   pfaB  SEQ ID NO：39
CAATTAGAAGGAGAACAATC   TTG   pfaC  SEQ ID NO：40
AGAGGCATAAAGGAATAATA   ATG   pfaD  SEQ ID NO：41
CAATTTAGCCTGAGCCTAGT   TTG   pfaE  SEQ ID NO：42
pfaC可选起点的比较
3F3
CAATTAGAAGGAGAACAATC    TTG  pfaC
TAAATCGCACTGGTATTGTC    ATG  pfaC备选#1  SEQ ID NO：43
AAGCACTCAATGATGCTGGT    GTG  pfaC备选#2  SEQ ID NO：44
pfaC备选#1开始于SEQ ID NO：1的第21514位核苷酸
这是标注的pfaC起点387个核苷酸的下游
pfaC备选#2开始于SEQ ID NO：1的第21460位核苷酸
这是标注的pfaC起点333个核苷酸的下游
9A10
CAATTAGAAGGAGAACAATC   TTG  pfaC
TAAACCGCACCGGTATTGTC   ATG  pfaC备选#1  SEQ ID NO：45
ACCCAGCTGACTATCAAGGT   GTG  pfaC备选#2  SEQ ID NO：46
pfaC备选#1开始于SEQ ID NO：7的第28370核苷酸
这是标注的pfaC起点的402个核苷酸的下游
pfaC备选#2开始于SEQ ID NO：7的第28151位核苷酸
这是标注的pfaC起点的183个核苷酸的下游
pfaE可选起点的比较
9A10
CAATTTAGCCTGAGCCTAGT TTG pfaE
ATGAATCGACTGCGTCTATT GTG pfaE备选#1  SEQ ID NO：47
CATCTAGAGAACAAGGTTTA ATG pfaE备选#2  SEQ ID NO：48
pfaE备选#1开始于SEQ ID NO：7的第13821位核苷酸，这是标注的pfaE起点78个核苷酸的上游
pfaE备选#2开始于SEQ ID NO：7的第13743位核苷酸，这是标注的pfaE起点156个核苷酸的上游
实施例3
下面的实施例通过在大肠杆菌中的功能性表达，证实了SchizochytriumOrf A、B和C编码功能性DHA/DPA合酶。
大肠杆菌转化体的一般性制备
将三个基因克隆进入单个大肠杆菌表达载体(源自于pET21c(Novagen))中，这三个基因编码生产DHA和DPA的Schizochytrium PUFAPKS系统(Orf A、B和C；分别为SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15和SEQ IDNO：17)。这些基因被转录为单条信息(通过T7RNA聚合酶)，被克隆到每个基因前面的核糖体结合位点引发翻译。为了在大肠杆菌中实现全长Orf B蛋白质的生产，需要修饰Orf B编码序列(见下文)。将编码PPT酶的附属基因(见下文)克隆到第二个质粒中(源自于pACYC184，New England Biolabs)。
OrfB基因被预测编码质量为～224kDa的蛋白质。初步尝试了在大肠杆菌中表达该基因，结果导致表观分子量为～165kDa(通过在SDS-PAGE中与已知质量的蛋白质比较而判断的)的蛋白质的积累。检查OrfB核苷酸序列，发现了一个含有15个连续丝氨酸密码子的区域——它们都是TCT密码子。该遗传编码含有6个不同的丝氨酸密码子，其中三个在大肠杆菌中经常使用。本发明人使用4个重叠的寡核苷酸，结合聚合酶链式反应程序，重新合成了Orf基因的一小部分(～195碱基对，BspHI至SacII限制酶片段)，该部分含有所述的丝氨酸密码子重复区。在合成的OrfB片段中，使用大肠杆菌常用的三种丝氨酸密码子的随机混合，同时改变了某些其它可能有问题的密码子(即其它的大肠杆菌罕用密码子)。用所述重新合成的片段替换原来Orf B中存在的BspHI至SacII片段(以产生OrfB*)，将该经修饰的基因克隆到相关表达载体中。修饰的OrfB*仍然编码SEQ ID NO：16的氨基酸序列。修饰的OrfB*克隆在大肠杆菌中表达，结果出现了～224kDa的蛋白质，表明产生了OrfB的全长产物。所述重合成的Orf B* BspHI至SacII片段的序列在本文中表示为SEQ ID NO：29。参见SEQ ID NO：29，显示了重合成的OrfB BspHI至SacII区域的核苷酸序列。鉴定了BspHI限制位点和SacII限制位点。BspHI位点开始于OrfB CDS(SEQ ID NO：15)的第4415位核苷酸(注意：在OrfB CDS中总共有3个BspHI位点，而SacII位点是唯一的)。
OrfA蛋白质的ACP域(Schizochytrium中的SEQ ID NO：14)必须通过添加磷酸泛酰巯基乙胺基团活化才能起作用。催化这种一般反应类型的酶称作磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)。大肠杆菌含有两种内源PPT酶，但人们预测它们不能识别Schizochytrium的OrfA ACP域。通过在没有添加的PPT酶条件下于大肠杆菌中表达OrfA、B*(见上文)和C证实了这一点。在该转化体中，没有检测到DHA产生。本发明人在大肠杆菌PUFA PKS表达系统中测试了两种异源PPT酶：(1)sfp(源自于枯草芽孢杆菌)和(2)Het I(源自于蓝细菌念珠蓝细菌(Nostoc)7120菌株)。
sfp PPT酶已得到充分的表征，并且由于能够识别范围广泛的底物而被普遍应用。根据公开的序列信息(Nakana等，1992，Molecular and GeneralGenetics 232：313-321)将编码区和确定的上下游侧翼DNA序列一起克隆到pACYC-184克隆载体中，从而构建了sfp的表达载体。使用寡核苷酸：
CGGGGTACCCGGGAGCCGCCTTGGCTTTGT(正向；SEQ ID NO：30)；和
AAACTGCAGCCCGGGTCCAGCTGGCAGGCACCCTG(反向；SEQ IDNO：31)
从枯草芽孢杆菌基因组DNA扩增出目的区域。使这些寡核苷酸中包含合适的限制酶位点，以便于克隆到中间性高拷贝数载体中，并最终克隆入pACYC184的EcoRV位点，而生成质粒pBR301。检查用该质粒转化的大肠杆菌的提取物，发现存在新蛋白质，其具有sfp的预期迁移率。在某些条件下，在表达Orf A，B*，C蛋白质的细胞中共表达sfp构建体，导致了DHA的产生。这一实验证实了sfp能够活化Schizochytrium OrfA ACP域。此外，使用sfp基因的相关调控元件创建了表达盒，其可插入其它基因。具体地说，用53个碱基对的DNA部分替换pBR301中的sfp编码区(连同ATG紧邻上游的3个核苷酸)，该DNA部分被设计为包含数个唯一(对于该构建体而言)的限制酶位点。该区域中最先的限制酶位点是NdeI。利用该位点中内含的ATG序列作为被导入基因的起始甲硫氨酸密码子。该DNA部分包含其它的限制位点(BglLL，NotI，SmaI，PmelI，HindIII，SpeI和XhoI)以帮助克隆过程。使用PCR产生5’端带NdeI位点、3’端带XhoI位点的sfp形式，来检测该表达载体盒的功能性。将该片段克隆到所述表达盒内，并与Orf A、B*和C表达载体一起转移到大肠杆菌中。在合适的条件下，这些细胞积累DHA，证实已经产生了功能性sfp。
就本发明人所知，Het I以前尚未在异源条件下被测试过。Het I存在于念珠蓝细菌的一个基因簇中，已知该基因簇负责合成长链羟基脂肪酸，长链羟基脂肪酸是这种生物异形胞中存在的糖脂层的组分。不受限于理论，本发明人相信，Het I活化该簇中存在的一种蛋白质——Hgl E的ACP域。Hgl E的两个ACP域与Schizochytrium Orf A中发现的ACP域具有高度的序列同源性。SEQ ID NO：32代表念珠蓝细菌Het I蛋白质的氨基酸序列。Het I的内源起始密码子尚未被鉴定(在假定蛋白质中不存在甲硫氨酸)。在开放阅读框的5’端附近有数个潜在的备选起始密码子(例如TTG和ATT)。在该序列中不存在甲硫氨酸密码子(ATG)。利用PCR，将最靠5’侧的潜在备选起始密码子(TTG)替换为甲硫氨酸密码子(ATG，作为上述NdeI限制酶识别位点的一部分)，并在编码序列的3’端引入XhoI位点，创建Het I表达构建体。然后将经过修饰的HetI编码序列插入到含有sfp调控元件的pACYC184载体构造的NdeI和XhoI位点中。在大肠杆菌中表达该Het I构建体，结果出现了新的蛋白质，其具有根据该序列数据预计的大小。在数种条件下在大肠杆菌中共表达Het I和Schizochytrium Orf A、B*、C，结果导致这些细胞中DHA和DPA积累。在所有比较sfp与Het I的实验中，含Het I构建体的细胞中积累的DHA和DPA比含sfp构建体的细胞中更多。
在大肠杆菌转化体中表达DHA和DPA
将两个质粒转化到大肠杆菌BL21菌株中，其中两个质粒编码(1)Schizochytrium PUFA PKS基因(Orf A、B*和C)和(2)PPT酶(来自sfp或Het I)；BL21菌株含有可诱导的T7RNA聚合酶基因。Schizochytrium蛋白质的合成被培养基中IPTG的添加所诱导，而PPT酶的表达被别的调控元件(见上文)所控制。细胞在各种限定条件下培育，并使用两种异源PPT酶基因中的任何种。收获细胞，并将脂肪酸转化成甲基酯(FAME)，并用气相-液相色谱进行分析。
在数种条件下，在表达Schizochytrium PUFA PKS基因以及两种异源PPT酶中任何种的大肠杆菌中，检出了DHA和DPA(数据未显示)。从对照细胞(即用缺乏所述诸Orf之一的质粒转化的细胞)制备的FAME中，没有检测到DHA或DPA。大肠杆菌中发现的DHA与DPA比例接近Schizochytrium中观察到的内源DHA和DPA生产的比例。在补充了10％(重量)甘油的765培养基(配方可获自美国典型培养物保藏中心)中、32℃条件下培育的细胞中，发现了PUFA(DHA加DPA)的最高水平：占总FAME的～17％。当细胞在补充了5或10％甘油的Luria肉汤中培育时，以及在20℃条件下培育时，也观察到了PUFA积累。在培育期间引入合适的抗生素，以保持对各质粒存在的选择，并使用IPTG(最终浓度为0.5mM)诱导OrfA、B*和C的表达。
实施例4
下面的实施例证实，编码Schizochytrium PUFA PKS酶复合物的基因可以被选择性失活(敲除)，并且其是致死表型，除非培养基中补充多不饱和脂肪酸。
Schizochytrium中的同源重组已经得到证实(见共同待审美国专利申请系列No.10/124,807，本文引用其全部内容作为参考)。设计了使Schizochytrium Orf A(SEQ ID NO：13)失活的质粒，该质粒通过将ZeocinTM抗性标记插入含OrfA编码序列的克隆的Sma I位点而制成。ZeocinTM抗性标记获自质粒pMON50000—ZeocinTM抗性基因的表达被来自Schizochytrium的微管蛋白启动子元件所驱动(见美国专利申请系列No.10/124,807，同上)。因此敲除构建体由下列组分组成：5’Schizochytrium Orf A编码序列，tub-ZeocinTM抗性元件，和3’Schizochytrium Orf A编码序列；它们全部被克隆在pBluescript II SK(+)载体(Stratagene)中。
通过微粒轰击将质粒导入Schizochytrium细胞中，并在含ZeocinTM且补充了多不饱和脂肪酸(PUFA)的平板上筛选转化体(见实施例5)。对于在该ZeocinTM+PUFA平板上生长的克隆，测试其在未补充PUFA的平板上的生长能力，发现数个克隆需要PUFA。这些PUFA营养缺陷型是推定的Orf A敲除体。对从这数个突变体提取的RNA进行Northern印迹分析，证实在这些突变体中不产生全长OrfA信息。
这些实验证实，Schizochytrium基因(例如OrfA)能够通过同源重组被失活，OrfA的失活导致致死表型，并且通过对培养基补充PUFA可以挽救这些突变体。
涉及失活Schizochytrium Orf B(SEQ ID NO：15)和Orf C(SEQ ID NO：17)的类似系列实验产生了相似的结果。即：Orf B和Orf C可以通过同源重组而被分别失活，并且这些细胞需要补充PUFA才可生长。
实施例5
下面的实施例显示，PUFA营养缺陷型可以在补充有EPA的培养基上维持，证明EPA可以替代Schizochytrium中的DHA。
如实施例4中表明的，PUFA PKS复合物已失活的Schizochytrium细胞需要补充PUFA方可存活。除了证实Schizochytrium的生长依赖于该系统的产物之外，该实验系统还允许测试各种脂肪酸挽救突变体的能力。已经发现，突变体细胞(其中三个基因中的任何一个被失活)在补充EPA的培养基上和在补充DHA的培养基上一样生长良好。这个结果表明，如果将产生DHA的内源PUFA PKS复合物替换成产物为EPA的PUFA PKS复合物，则细胞可能具有存活能力。此外，这些突变体细胞可通过补充ARA或GLA加以挽救，这证明了制造可生产这些产物的遗传修饰Schizochytrium的可行性。需要注意，补充PUFA的优选方法涉及将游离脂肪酸与部分甲基化的β-环糊精组合，然后将这些PUFA添加到培养基。
实施例6
下面的实施例显示，可以在相同位点将失活的PUFA基因替换为活性形式的PUFA基因，以恢复PUFA合成。
已经证实了Schizochytrium中乙酰乳酸合酶基因位点的双同源重组(见美国专利申请系列No.10/124,807，同上)。本发明人通过用全长Schizochytrium OrfA基因组克隆转化Schizochytrium Orf A敲除菌株(如实施例3所述)，试验了将这种构思用于Schizochytrium PUFA PKS基因的替换。根据转化体在未补充PUFA的培养基上的生长能力选择转化体。然后检验这些PUFA原养型对ZeocinTM的抗性，发现有数株对这种抗生素敏感。这些结果表明，导入的Schizochytrium Orf A通过双同源重组替换了敲除菌株中的ZeocinTM抗性基因。该实验为在PUFA PKS基因中进行基因替换的构思显示了证据。对Schizochytrium OrfB和OrfC敲除体进行的类似实验给出了一致的结果。
实施例7
该实施例显示，破囊壶菌23B PUFA PKS基因的全部或某些部分可以在Schizochytrium中执行功能。
如美国专利申请系列No.10/124,800(同上)所述，产DHA的原生生物破囊壶菌23B(Th.23B)已被证明含有orfA、orfB和orfC同源物。使用这三个Th.23B基因的完全基因组克隆来转化抗ZeocinTM Schizochytrium菌株，这些菌株含有同源(cognate)orf“敲除”(见实施例4)。在没有PUFA补充的条件下直接选择补偿转化体。通过这种方法证明，Th.23B orfA和orfC基因可以分别补偿Schizochytrium orfA和orfC敲除菌株，使之成为PUFA原养型。我们发现，补偿转化体或者保留，或者失去了ZeocinTM抗性(这样插入到Schizochytrium基因中的标记即为敲除体的特征)。抗ZeocinTM的补偿转化体很可能是由于整个破囊壶菌基因单交换整合到各orf区外部的Schizochytrium基因组中而产生的。该结果提示，整个破囊壶菌基因在Schizochytrium中起作用。ZeocinTM敏感性补偿转化体可能是通过双交换产生的，在该双交换中，部分(或者可能全部)的破囊壶菌基因功能性替换了含有破坏的ZeocinTM抗性标记的Schizochytrium基因同源区。这一结果提示，部分破囊壶菌基因在Schizochytrium中起作用。
实施例8
在这个实施例中，整个Schizochytrium orfC编码序列被完全、精确地替换为破囊壶菌23B orfC编码序列，导致PUFA谱偏向破囊壶菌的PUFA谱。
为了缺失Schizochytrium orfC编码序列，将直接上游(上达但不包括ATG起始密码子)和直接下游(恰好起始于TAA终止密码子之后)的大约2kb的DNA克隆到ZeocinTM抗性标记周围。这些上游和下游区为双交换重组提供了同源性，该重组有效地将所述orfC编码序列替换为该标记。在存在PUFA补充的条件下选择ZeocinTM抗性转化体，筛选PUFA营养缺陷型，并通过PCR和Southern印迹分析加以定性。类似地，构建质粒，其中将相同的Schizochytrium orfC基因区上游和下游序列克隆到Th.23B orf C编码序列(SEQ ID NO：23)周围。将该质粒转化到上述的ZeocinTM抗性PUFA营养缺陷型中，并选择PUFA原养型，从而依赖于Th.23B orfC基因以在Schizochytrium中正确地行使功能并补偿PUFA营养缺陷型。随后筛选ZeocinTM敏感的转化体，鉴定了那些可能因Th.23B orfC基因替换ZeocinTM抗性标记而导致的转化体。这些orfC替换株中DHA∶DPA比例平均为8.3，而正常菌株(“野生型”)的值为2.3。这个高比例接近破囊壶菌23B在这些生长条件下的值：10。由此证明，可以通过置换PUFA合酶复合物的组分来操纵Schizochytrium的PUFA谱。
更具体地，第一对质粒可捕捉(capture)Schizochytrium orfC基因的直接“上游”和“下游”区域，并被用于构建orfC缺失载体和Th.23B替换载体。
使用引物prRZ15(SEQ ID NO：49)和prRZ16(SEQ ID NO：50)，从Schizochytrium orfC区的克隆扩增orfC编码区上游的2000bp片段。引物prRZ15在该片段的5’端引入KpnI位点，prRZ16含有与直到但不包括ATG起始密码子的Schizochytrium序列的同源性，并在片段的3’端引入BamHI位点。将PCR产物克隆到pCR-Blunt II(Invitrogen)中，产生质粒pREZ21。以相似的方式，使用引物prRZ17(SEQ ID NO：51)和prRZ18(SEQ ID NO：52)扩增orfC编码区直接下游的1991bp片段(不包括TAA终止密码子)，但是在5’端引入BamHI位点，在3’端引入XbaI位点。将该PCR片段克隆到pCR-Blunt II(Invitrogen)中，产生pREZ18。在三组分连接反应(three-component ligation)中，将来自pREZ21的上游区域(作为KpnI-BamHI片段)和来自pREZ18的下游区域(作为BamHI-XbaI片段)克隆到pBlueScriptII SK(+)的KpnI-XbaI位点中，产生pREZ22。将来自pTUBZEO11-2(又称pMON50000；见美国专利申请系列No.10/124,807，同上)的ZeocinTM抗性标记作为1122bp的BamHI片段插入到pREZ22的BamHI位点，产生pREZ23A和pREZ23B(含有任何方向的ZeocinTM抗性标记)。然后使用pREZ23质粒，通过如上所述的微粒轰击转化，精确地产生orfC编码区缺失。将一株具有期望结构的菌株命名为B32-Z1。
为了开发用于插入Th.23B orfC基因的质粒，首先产生中间构建体，其含有下述部分之间的精确连接：1)Schizochytrium上游区与Th.23B orfC编码区的5’端，和2)Th.23B orfC编码区的3’端与Schizochytrium下游区。然后，导入内部区段Th.23B orfC编码区。
使用引物prRZ29a(SEQ ID NO：53)和prRZ30(SEQ ID NO：54)扩增Schizochytrium orfC编码序列直接上游的大约100bp。引物prRZ29a包括Schizochytrium orfC ATG起始密码子上游大约95bp的SpeI限制位点，而prRZ30含有与Schizochytrium orfC ATG起始密码子直接上游19bp的同源性和与Th.23B orfC编码区起点(包括起始ATG)同源的15bp。另外，用克隆的Th.23B基因作为模板，从Th.23B orfC编码区的5’端产生大约450bp的PCR产物。引物prRZ31含有15bp的起始ATG直接上游的SchizochytriumorfC编码序列，并含有与Th.23B orfC编码区起始17bp的同源性，引物prRZ32包含位于Th.23B orfC ATG起始密码子下游大约450bp的NruI位点，并还包含位于NruI位点紧邻下游的人工SwaI限制位点。因此，这两个PCR产物之间在起始ATG位点具有大约30bp的重叠同源性，其基本上包括prRZ30(SEQ ID NO：54)和prRZ31(SEQ ID NO：55)的序列。使用所述两个第一轮PCR产物(prRZ29a(SEQ ID NO：53)X prRZ30(SEQ ID NO：54)；约100bp；prRZ31(SEQ ID NO：55)X prRZ32(SEQ ID NO：56)；约450bp)的混合物作为模板，并使用外部引物prRZ29a(SEQ ID NO：53)和prRZ32(SEQ IDNO：56)进行第二轮PCR，产生大约520bp的产物，其含有上游SchizochytriumorfC区和Th.23B orfC编码区起点之间的“完美衔接”。将该PCR产物克隆到质粒pCR-Blunt II中生成pREZ28，并验证插入序列。
用克隆的Th.23B基因作为模板，使用引物prRZ33(SEQ ID NO：57)和prRZ34(SEQ ID NO：58)进行PCR，产生Th.23B orf C编码区3’端大约65bp的片段。该片段的上游末端(来自prRZ33)包含人工SwaI限制位点，并且包含Th.23B orfC TAA终止密码子的上游大约60bp处的SphI限制位点。该片段的下游末端(来自prRZ34)包含Th.23B orf C编码区的3’端处的16bp，并包含在与orfC编码区直接下游(包括终止密码子)的Schizochytrium序列同源的18bp。使用引物prRZ35(SEQ ID NO：59)和prRZ36(SEQ ID NO：60)产生大约250bp与orfC编码区直接下游的Schizochytrium DNA同源的片段。该PCR片段的上游末端(来自prRZ35)含有与Th.23B orfC编码区末端同源的15bp(算上TAA终止密码子)，下游末端含有Schizochytrium终止密码子下游大约240bp的SalI限制位点。用所述两个第一轮PCR产物(prRZ33(SEQID NO：57)X prRZ34(SEQ ID NO：58)；约65bp；prRZ35(SEQ ID NO：59)XprRZ36(SEQ ID NO：60)；约250bp)的混合物作为模板，并使用外部引物prRZ33(SEQ ID NO：57)和prRZ36(SEQ ID NO：60)进行第二轮PCR，产生大约310bp的产物，其包含上游破囊壶菌23B orfC编码区末端和orfC编码区直接下游的Schizochytrium DNA区域之间的“完美衔接”。将该PCR产物克隆到质粒pCR-Blunt II中生成pREZ29，并验证插入序列。
接着，将上游和下游“完美衔接”区合并到pREZ22中(见上文)。在三组分连接反应中，将来自pREZ28的SpeI/SwaI片段和pREZ29的SwaI/SalI片段克隆到pREZ22的SpeI/SalI位点内，生成pREZ32。最后，将内部的破囊壶菌23B orfC编码区大片段作为NruI/SphI片段克隆到pREZ32中，生成pREZ33。然后使用该质粒转化orfC敲除菌株B32-Z1，选择PUFA原养型。
在这里引用本文引用和讨论的每个出版物的全部内容作为参考。
尽管已经详细地描述了本发明的各种实施方案，但是显然，本领域的技术人员可以对这些实施方案进行修改和改造。然而显然可以理解，这些修改和改造落入由下文权利要求提出的本发明的范围。
序列表
<110>马泰克生物科学公司(Martek Biosciences Corporation)
     Weaver，Craig
     Zirkle，Ross
     James，Metz G.
<120>PUFA聚酮合酶系统及其用途
<130>2997-49-1-PCT
<150>10/965,017
<151>2004-10-13
<160>62
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>39669
<212>DNA
<213>Sh.japonica
<400>1
Figure A200580042803D01171
Figure A200580042803D01181
Figure A200580042803D01201
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Figure A200580042803D01221
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Figure A200580042803D01341
<210>2
<211>2787
<212>PRT
<213>Sh.japonica
<400>2
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Figure A200580042803D01351
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Figure A200580042803D01411
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Figure A200580042803D01441
<210>3
<211>759
<212>PRT
<213>Sh.japonica
<400>3
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Figure A200580042803D01461
<210>4
<211>2019
<212>PRT
<213>Sh.japonica
<400>4
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Figure A200580042803D01471
Figure A200580042803D01481
Figure A200580042803D01491
Figure A200580042803D01501
Figure A200580042803D01511
Figure A200580042803D01521
Figure A200580042803D01531
<210>5
<211>542
<212>PRT
<213>Sh.japonica
<400>5
Figure A200580042803D01532
Figure A200580042803D01541
Figure A200580042803D01551
<210>6
<211>303
<212>PRT
<213>Sh.japonica
<400>6
Figure A200580042803D01552
Figure A200580042803D01561
<210>7
<211>38794
<212>DNA
<213>Sh.olleyana
<400>7
Figure A200580042803D01562
Figure A200580042803D01581
Figure A200580042803D01591
Figure A200580042803D01601
Figure A200580042803D01611
Figure A200580042803D01621
Figure A200580042803D01631
Figure A200580042803D01641
Figure A200580042803D01661
Figure A200580042803D01681
Figure A200580042803D01691
Figure A200580042803D01701
Figure A200580042803D01711
Figure A200580042803D01721
Figure A200580042803D01731
<210>8
<211>2768
<212>PRT
<213>Sh.olleyana
<400>8
Figure A200580042803D01732
Figure A200580042803D01741
Figure A200580042803D01751
Figure A200580042803D01761
Figure A200580042803D01771
Figure A200580042803D01781
Figure A200580042803D01801
Figure A200580042803D01811
<210>9
<211>743
<212>PRT
<213>Sh.olleyana
<400>9
Figure A200580042803D01831
Figure A200580042803D01841
Figure A200580042803D01851
<210>10
<211>2020
<212>PRT
<213>Sh.olleyana
<400>10
Figure A200580042803D01852
Figure A200580042803D01871
Figure A200580042803D01881
Figure A200580042803D01891
Figure A200580042803D01901
Figure A200580042803D01911
Figure A200580042803D01921
<210>11
<211>542
<212>PRT
<213>Sh.olleyana
<400>11
Figure A200580042803D01922
Figure A200580042803D01931
Figure A200580042803D01941
<210>12
<211>290
<212>PRT
<213>Sh.olleyana
<400>12
Figure A200580042803D01942
Figure A200580042803D01951
<210>13
<211>8730
<212>DNA
<213>Schizochytrium sp.
<400>13
Figure A200580042803D01952
Figure A200580042803D01971
Figure A200580042803D01981
Figure A200580042803D01991
<210>14
<211>2910
<212>PRT
<213>Schizochytrium sp.
<400>14
Figure A200580042803D01992
Figure A200580042803D02001
Figure A200580042803D02011
Figure A200580042803D02021
Figure A200580042803D02031
Figure A200580042803D02041
Figure A200580042803D02051
Figure A200580042803D02061
Figure A200580042803D02091
<210>15
<211>6177
<212>DNA
<213>Schizochytrium sp.
<400>15
Figure A200580042803D02092
Figure A200580042803D02101
<210>16
<211>2059
<212>PRT
<213>Schizochytrium sp.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(2059)
<223>Xaa＝Ala or Val
<400>16
Figure A200580042803D02121
Figure A200580042803D02141
Figure A200580042803D02151
Figure A200580042803D02161
Figure A200580042803D02171
Figure A200580042803D02181
Figure A200580042803D02191
<210>17
<211>4509
<212>DNA
<213>Schizochytrium sp.
<400>17
Figure A200580042803D02201
<210>18
<211>1503
<212>PRT
<213>Schizochytrium sp.
<400>18
Figure A200580042803D02212
Figure A200580042803D02221
Figure A200580042803D02241
Figure A200580042803D02251
Figure A200580042803D02261
<210>19
<211>8436
<212>DNA
<213>破囊壶菌属菌种
<400>19
Figure A200580042803D02262
Figure A200580042803D02271
Figure A200580042803D02291
<210>20
<211>2811
<212>PRT
<213>破囊壶菌属菌种
<400>20
Figure A200580042803D02301
Figure A200580042803D02311
Figure A200580042803D02321
Figure A200580042803D02331
Figure A200580042803D02351
Figure A200580042803D02361
Figure A200580042803D02371
Figure A200580042803D02381
Figure A200580042803D02391
<210>21
<211>5808
<212>DNA
<213>破囊壶菌属菌种
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(5808)
<223>n＝a，c，t，或g
<400>21
Figure A200580042803D02392
Figure A200580042803D02411
Figure A200580042803D02421
<210>22
<211>1935
<212>PRT
<213>破囊壶菌属菌种
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1935)
<223>Xaa＝Asp，Gly，Ala或Val
<400>22
Figure A200580042803D02422
Figure A200580042803D02431
Figure A200580042803D02451
Figure A200580042803D02481
Figure A200580042803D02491
<210>23
<211>4410
<212>DNA
<213>破囊壶菌属菌种
<400>23
Figure A200580042803D02492
Figure A200580042803D02501
Figure A200580042803D02511
<210>24
<211>1470
<212>PRT
<213>破囊壶菌属菌种
<400>24
Figure A200580042803D02531
Figure A200580042803D02541
Figure A200580042803D02551
Figure A200580042803D02561
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>25
Figure A200580042803D02562
<210>26
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>26
Figure A200580042803D02563
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>n＝a，c，t，or g
<400>27
Figure A200580042803D02564
<210>28
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>28
Figure A200580042803D02565
<210>29
<211>192
<212>DNA
<213>Schizochytrium sp.<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(7)
<223>BspHI限制位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(188)..(192)
<223>SacII限制位点
<400>29
Figure A200580042803D02571
<210>30
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>30
Figure A200580042803D02572
<210>31
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>31
Figure A200580042803D02573
<210>32
<211>237
<212>PRT
<213>念珠蓝细菌属菌种
<400>32
Figure A200580042803D02574
Figure A200580042803D02581
<210>33
<211>23
<212>DNA
<213>Sh.japonica
<400>33
<210>34
<211>23
<212>DNA
<213>Sh.japonica
<400>34
<210>35
<211>23
<212>DNA
<213>Sh.japonica
<400>35
Figure A200580042803D02584
<210>36
<211>23
<212>DNA
<213>Sh.japonica
<400>36
Figure A200580042803D02585
<210>37
<211>23
<212>DNA
<213>Sh.japonica
<400>37
Figure A200580042803D02591
<210>38
<211>23
<212>DNA
<213>Sh.olleyana
<400>38
Figure A200580042803D02592
<210>39
<211>23
<212>DNA
<213>Sh.olleyana
<400>39
Figure A200580042803D02593
<210>40
<211>23
<212>DNA
<213>Sh.olleyana
<400>40
Figure A200580042803D02594
<210>41
<211>23
<212>DNA
<213>Sh.olleyana
<400>41
Figure A200580042803D02595
<210>42
<211>23
<212>DNA
<213>Sh.olleyana
<400>42
Figure A200580042803D02596
<210>43
<211>23
<212>DNA
<213>Sh.japonica
<400>43
Figure A200580042803D02597
<210>44
<211>23
<212>DNA
<213>Sh.japonica
<400>44
Figure A200580042803D02598
<210>45
<211>23
<212>DNA
<213>Sh.olleyana
<400>45
Figure A200580042803D02601
<210>46
<211>23
<212>DNA
<213>Sh.olleyana
<400>46
Figure A200580042803D02602
<210>47
<211>23
<212>DNA
<213>Sh.olleyana
<400>47
Figure A200580042803D02603
<210>48
<211>23
<212>DNA
<213>Sh.olleyana
<400>48
<210>49
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>49
Figure A200580042803D02605
<210>50
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>50
Figure A200580042803D02606
<210>51
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>51
Figure A200580042803D02607
<210>52
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>52
Figure A200580042803D02611
<210>53
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>53
Figure A200580042803D02612
<210>54
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>54
Figure A200580042803D02613
<210>55
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>55
Figure A200580042803D02614
<210>56
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>56
<210>57
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>57
Figure A200580042803D02616
<210>58
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>58
Figure A200580042803D02621
<210>59
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>59
Figure A200580042803D02622
<210>60
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>60
Figure A200580042803D02623
<210>61
<211>7
<212>PRT
<213>希瓦氏菌属菌种
<400>61
Figure A200580042803D02624
<210>62
<211>54
<212>PRT
<213>希瓦氏菌属菌种
<400>62
Figure A200580042803D02625

Claims (86)

1.一种分离核酸分子，包括从下组选择的核酸序列：
a)编码选自下组的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；
b)编码a)中任何氨基酸序列的片段的核酸序列，该片段具有至少一种选自下组的生物活性：烯酰-ACP还原酶(ER)活性；酰基载体蛋白(ACP)活性；β-酮脂酰-ACP合酶(KS)活性；酰基转移酶(AT)活性；β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)活性；类FabA β-羟酰-ACP脱水酶(DH)活性；非类FabA脱水酶活性；链长度因子(CLF)活性；丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)活性；和4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)活性；
c)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2或SEQID NO：8具有至少大约65％的同一性，并具有至少一种选自下组的生物活性：KS活性，MAT活性，KR活性，ACP活性和非类FabA脱水酶活性；
d)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：3或SEQID NO：9具有至少大约60％的同一性，并具有AT生物活性；
e)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：4或SEQID NO：10具有至少大约70％的同一性，并具有至少一种选自下组的生物活性：KS活性，CLF活性和DH活性；
f)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：6或SEQID NO：12具有至少大约60％的同一性，并具有PPT酶生物活性；
g)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：11具有至少大约85％的同一性，或者与SEQ ID NO：5有至少大约95％的同一性，并具有ER生物活性。
2.权利要求1的分离核酸分子，其中所述核酸序列选自下组：
a)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2或SEQID NO：8具有至少大约75％的同一性，并具有至少一种选自下组的生物活性：KS活性，MAT活性，KR活性，ACP活性和非类FabA脱水酶活性；
b)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：3或SEQID NO：9具有至少大约70％的同一性，并具有AT生物活性；
c)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：4或SEQID NO：10具有至少大约80％的同一性，并具有至少一种选自下组的生物活性：KS活性，CLF活性和DH活性；
d)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：6或SEQID NO：12具有至少大约70％的同一性，并具有PPT酶生物活性；
e)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：11有至少大约95％的同一性，或者与SEQ ID NO：5有至少大约96％的同一性，并具有ER生物活性。
3.权利要求1的分离核酸分子，其中所述核酸序列选自下组：
a)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2或SEQID NO：8具有至少大约85％的同一性，并具有至少一种选自下组的生物活性：KS活性，MAT活性，KR活性，ACP活性和非类FabA脱水酶活性；
b)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：3或SEQID NO：9具有至少大约80％的同一性，并具有AT生物活性；
c)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：4或SEQID NO：10具有至少大约90％的同一性，并具有至少一种选自下组的生物活性：KS活性，CLF活性和DH活性；
d)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：6或SEQID NO：12具有至少大约80％的同一性，并具有PPT酶生物活性；
e)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：11有至少大约96％的同一性，或者与SEQ ID NO：5有至少大约97％的同一性，并具有ER生物活性。
4.权利要求1的分离核酸分子，其中所述核酸序列选自下组：
a)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8具有至少大约95％的同一性，并具有至少一种选自下组的生物活性：KS活性，MAT活性，KR活性，ACP活性和非类FabA脱水酶活性；
b)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：9具有至少大约90％的同一性，并具有AT生物活性；
c)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10具有至少大约95％的同一性，并具有至少一种选自下组的生物活性：KS活性，CLF活性和DH活性；
d)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：12具有至少大约90％的同一性，并具有PPT酶生物活性；
e)编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：11具有至少大约97％的同一性，或者与SEQ ID NO：5有至少大约98％的同一性，并具有ER生物活性。
5.权利要求1的分离核酸分子，其中所述核酸序列编码选自下组的氨基酸序列：
a)选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，和SEQ ID NO：12；和
b)a)中任何氨基酸序列的片段，具有至少一种选自下组的生物活性：烯酰-ACP还原酶(ER)活性；酰基载体蛋白(ACP)活性；β-酮脂酰-ACP合酶(KS)活性；酰基转移酶(AT)活性；β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)活性；类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶(DH)活性；非类FabA脱水酶活性；链长度因子(CLF)活性；丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)活性；和4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)活性。
6.权利要求1的分离核酸分子，其中在b)中提出的片段选自下组：
a)从SEQ ID NO：2大约29位到大约513位的SEQ ID NO：2片段，其中该域具有KS生物活性；
b)从SEQ ID NO：2大约625位到大约943位的SEQ ID NO：2片段，其中该域具有MAT生物活性
c)从SEQ ID NO：2大约1264位到大约1889位的SEQ ID NO：2片段及其亚域，其中该域或其亚域具有ACP生物活性；
d)从SEQ ID NO：2大约2264位到大约2398位的SEQ ID NO：2片段，其中该域具有KR生物活性；
e)包含从SEQ ID NO：2大约2504位到大约2516位的SEQ ID NO：2片段，其中该片段具有非类FabA脱水酶生物活性；
f)从SEQ ID NO：3大约378位到大约684位的SEQ ID NO：3片段，其中该域具有AT生物活性；
g)从SEQ ID NO：4大约5位到大约483位的SEQ ID NO：4片段，其中该域具有KS生物活性；
h)从SEQ ID NO：4大约489位到大约771位的SEQ ID NO：4片段，其中该域具有CLF生物活性；
i)从SEQ ID NO：4大约1428位到大约1570位的SEQ ID NO：4片段，其中该域具有DH生物活性；
j)从SEQ ID NO：4大约1881位到大约2019位的SEQ ID NO：4片段，其中该域具有DH生物活性；
k)从SEQ ID NO：5大约84位到大约497位的SEQ ID NO：5片段，其中该域具有ER生物活性；
l)从SEQ ID NO：6大约40位到大约186位的SEQ ID NO：6片段，其中该域具有PPT酶生物活性；
m)从SEQ ID NO：8大约29位到大约513位的SEQ ID NO：8片段，其中该域具有KS生物活性；
n)从SEQ ID NO：8大约625位到大约943位的SEQ ID NO：8片段，其中该域具有MAT生物活性；
o)从SEQ ID NO：8大约1275位到大约1872位的SEQ ID NO：8片段，及其亚域，其中该域或其亚域具有ACP生物活性；
p)从SEQ ID NO：8大约2240位到大约2374位的SEQ ID NO：8片段，其中该域具有KR生物活性；
q)包含SEQ ID NO：8大约2480-大约2492位的SEQ ID NO：8片段，其中该域具有非类FabA脱水酶活性；
r)从SEQ ID NO：9大约366位到大约703位的SEQ ID NO：9片段，其中该域具有AT生物活性；
s)从SEQ ID NO：10大约10位到大约488位的SEQ ID NO：10片段，其中该域具有KS生物活性；
t)从SEQ ID NO：10大约502位到大约750位的SEQ ID NO：10片段，其中该域具有CLF生物活性；
u)从SEQ ID NO：10大约1431位到大约1573位的SEQ ID NO：10片段，其中该域具有DH生物活性；
v)从SEQ ID NO：10大约1882位到大约2020位的SEQ ID NO：10片段，其中该域具有DH生物活性；
w)从SEQ ID NO：11大约84位到大约497位的SEQ ID NO：11片段，其中该域具有ER生物活性；和
x)从SEQ ID NO：12大约29位到大约177位的SEQ ID NO：12片段，其中该域具有PPT酶生物活性。
7.权利要求1的分离核酸分子，其中该核酸分子编码选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：12。
8.一种分离核酸分子，其基本上由与权利要求1的核酸分子完全互补的核酸序列组成。
9.一种重组核酸分子，包含与至少一个表达控制序列可操作连接的权利要求1的核酸分子。
10.一种重组细胞，其转染了权利要求9的重组核酸分子。
11.一种遗传修饰的植物或植物部分，其中该植物被遗传修饰而重组表达PKS系统，该PKS系统包含多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮合酶(PKS)系统的至少一种生物活性蛋白质或其域，其中该蛋白质或域由权利要求1的核酸分子编码。
12.根据权利要求11的遗传修饰植物或植物部分，其中该植物被遗传修饰从而重组表达核酸分子，所述核酸分子编码选自下组的至少一种氨基酸序列：
a)选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；
b)a)中任何氨基酸序列的片段，其具有至少一种选自下组的生物活性：烯酰-ACP还原酶(ER)活性；酰基载体蛋白(ACP)活性；β-酮脂酰-ACP合酶(KS)活性；酰基转移酶(AT)活性；β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)活性；类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶(DH)活性；非类FabA脱水酶活性；链长度因子(CLF)活性；丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)活性；和4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)活性。
13.权利要求11的遗传修饰植物或植物部分，其中该植物被遗传修饰从而重组表达核酸分子，所述核酸分子编码选自下组的至少一种氨基酸序列：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6。
14.权利要求11的遗传修饰植物或植物部分，其中该植物被遗传修饰从而重组表达至少一种核酸分子，所述核酸分子编码SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
15.权利要求11的遗传修饰植物或植物部分，其中该植物被遗传修饰从而重组表达核酸分子，所述核酸分子编码选自下组的至少一种氨基酸序列：SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：12。
16.权利要求11的遗传修饰植物或植物部分，其中该植物被遗传修饰从而重组表达至少一种核酸分子，所述核酸分子编码SEQ ID NO：8，SEQ IDNO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。
17.根据权利要求11的遗传修饰植物或植物部分，其中该植物被遗传修饰从而重组表达至少一种核酸分子，所述核酸分子编码选自下组的氨基酸序列：
a)从SEQ ID NO：2大约29位到大约513位的SEQ ID NO：2片段，其中该域具有KS生物活性；
b)从SEQ ID NO：2大约625位到大约943位的SEQ ID NO：2片段，其中该域具有MAT生物活性；
c)从SEQ ID NO：2大约1264位到大约1889位的SEQ ID NO：2片段及其亚域，其中该域或其亚域具有ACP生物活性；
d)从SEQ ID NO：2大约2264位到大约2398位的SEQ ID NO：2片段，其中该域具有KR生物活性；
e)包含从SEQ ID NO：2大约2504位到大约2516位的SEQ ID NO：2片段，其中该片段具有非类FabA脱水酶生物活性；
f)从SEQ ID NO：3大约378位到大约684位的SEQ ID NO：3片段，其中该域具有AT生物活性；
g)从SEQ ID NO：4大约5位到大约483位的SEQ ID NO：4片段，其中该域具有KS生物活性；
h)从SEQ ID NO：4大约489位到大约771位的SEQ ID NO：4片段，其中该域具有CLF生物活性；
i)从SEQ ID NO：4大约1428位到大约1570位的SEQ ID NO：4片段，其中该域具有DH生物活性；
j)从SEQ ID NO：4大约1881位到大约2019位的SEQ ID NO：4片段，其中该域具有DH生物活性；
k)从SEQ ID NO：5大约84位到大约497位的SEQ ID NO：5片段，其中该域具有ER生物活性；
l)从SEQ ID NO：6大约40位到大约186位的SEQ ID NO：6片段，其中该域具有PPT酶生物活性；
m)从SEQ ID NO：8大约29位到大约513位的SEQ ID NO：8片段，其中该域具有KS生物活性；
n)从SEQ ID NO：8大约625位到大约943位的SEQ ID NO：8片段，其中该域具有MAT生物活性；
o)从SEQ ID NO：8大约1275位到大约1872位的SEQ ID NO：8片段及其亚域，其中该域或其亚域具有ACP生物活性；
p)从SEQ ID NO：8大约2240位到大约2374位的SEQ ID NO：8片段，其中该域具有KR生物活性；
q)包含从SEQ ID NO：8大约2480位-大约2492位的SEQ ID NO：8片段，其中该域具有非类FabA脱水酶生物活性；
r)从SEQ ID NO：9大约366位到大约703位的SEQ ID NO：9片段，其中该域具有AT生物活性；
s)从SEQ ID NO：10大约10位到大约488位的SEQ ID NO：10片段，其中该域具有KS生物活性；
t)从SEQ ID NO：10大约502位到大约750位的SEQ ID NO：10片段，其中该域具有CLF生物活性；
u)从SEQ ID NO：10大约1431位到大约1573位的SEQ ID NO：10片段，其中该域具有DH生物活性；
v)从SEQ ID NO：10大约1882位到大约2020位的SEQ ID NO：10片段，其中该域具有DH生物活性；
w)从SEQ ID NO：11大约84位到大约497位的SEQ ID NO：11片段，其中该域具有ER生物活性；和
x)从SEQ ID NO：12大约29位到大约177位的SEQ ID NO：12片段，其中该域具有PPT酶生物活性。
18.权利要求11的遗传修饰植物或植物部分，其中植物被进一步遗传修饰从而表达来自破囊壶菌目生物的多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮合酶(PKS)系统的至少一种生物活性蛋白质或域。
19.权利要求18的遗传修饰植物或植物部分，其中破囊壶菌目生物选自Schizochytrium和破囊壶菌属。
20.权利要求18的遗传修饰植物或植物部分，其中所述蛋白质或域包括选自下组的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18；和
b)a)中任何氨基酸序列的片段，其具有至少一种选自下组的生物活性：烯酰-ACP还原酶(ER)活性；酰基载体蛋白(ACP)活性；β-酮脂酰-ACP合酶(KS)活性；酰基转移酶(AT)活性；β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)活性；类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶(DH)活性；非类FabA脱水酶活性；链长度因子(CLF)活性；丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)活性；和4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)活性。
21.权利要求18的遗传修饰植物或植物部分，其中该蛋白质或域包括选自下组的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24，和
b)a)中任何氨基酸序列的片段，其具有至少一种选自下组的生物活性：烯酰-ACP还原酶(ER)活性；酰基载体蛋白(ACP)活性；β-酮脂酰-ACP合酶(KS)活性；酰基转移酶(AT)活性；β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)活性；类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶(DH)活性；非类FabA脱水酶活性；链长度因子(CLF)活性；丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)活性；和4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)活性。
22.权利要求11的遗传修饰植物或植物部分，其中该植物由于遗传修饰而产生一种或多种选自下组的多不饱和脂肪酸：DHA(二十二碳六烯酸(C22:6，ω-3))，ARA(二十碳四烯酸或花生四烯酸(C20:4，n-6))，DPA(二十二碳五烯酸(C22:5，ω-6或ω-3))和EPA(二十碳五烯酸(C20:5，ω-3)。
23.权利要求11的遗传修饰植物或植物部分，其中该植物由于遗传修饰而产生DHA。
24.权利要求11的遗传修饰植物或植物部分，其中该植物由于遗传修饰产生EPA。
25.权利要求11的遗传修饰植物或植物部分，其中该植物由于遗传修饰而产生EPA和DHA。
26.权利要求11的遗传修饰植物或植物部分，其中该植物由于遗传修饰而产生ARA和DHA。
27.权利要求11的遗传修饰植物或植物部分，其中该植物由于遗传修饰而产生ARA和EPA。
28.权利要求11的遗传修饰植物或植物部分，其中该植物是作物植物。
29.权利要求11的遗传修饰植物或植物部分，其中该植物是双子叶植物。
30.权利要求11的遗传修饰植物或植物部分，其中该植物是单子叶植物。
31.权利要求11的遗传修饰植物或植物部分，其中该植物从下组选择：油菜、大豆、油菜籽、亚麻籽、玉米、红花、向日葵和烟草。
32.一种遗传修饰的微生物，其中该微生物被遗传修饰从而重组表达根据权利要求1的分离核酸分子。
33.权利要求32的遗传修饰微生物，其中该微生物被遗传从而重组表达核酸分子，所述核酸分子编码选自下组的至少一种氨基酸序列：
a)选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；和
b)a)中任何氨基酸序列的片段，其具有至少一种选自下组的生物活性：烯酰-ACP还原酶(ER)活性；酰基载体蛋白(ACP)活性；β-酮脂酰-ACP合酶(KS)活性；酰基转移酶(AT)活性；β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)活性；类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶(DH)活性；非类FabA脱水酶活性；链长度因子(CLF)活性；丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)活性；和4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)活性。
34.权利要求32的遗传修饰微生物，其中该微生物被遗传修饰从而重组表达核酸分子，所述核酸分子编码选自下组的至少一种氨基酸序列：SEQID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
35.权利要求32的遗传修饰微生物，其中该微生物被遗传修饰从而重组表达至少一种核酸分子，所述核酸分子编码SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
36.权利要求32的遗传修饰微生物，其中该微生物被遗传修饰从而重组表达核酸分子，所述核酸分子编码选自下组的至少一种氨基酸序列：SEQID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。
37.权利要求32的遗传修饰微生物，其中该微生物被遗传修饰从而重组表达至少一种核酸分子，所述核酸分子编码SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。
38.权利要求32的遗传修饰微生物，其中该微生物被遗传修饰从而重组表达至少一种核酸分子，其编码选自下组的氨基酸序列：
a)从SEQ ID NO：2大约32位到大约513位的SEQ ID NO：2片段，其中该域具有KS生物活性；
b)从SEQ ID NO：2大约625位到大约943位的SEQ ID NO：2片段，其中该域具有MAT生物活性
c)从SEQ ID NO：2大约1264位到大约1889位的SEQ ID NO：2片段及其亚域，其中该域或其亚域具有ACP生物活性；
d)从SEQ ID NO：2大约2264位到大约2398位的SEQ ID NO：2片段，其中该域具有KR生物活性；
e)包含从SEQ ID NO：2大约2504位到大约2516位的SEQ ID NO：2片段，其中该片段具有非类FabA脱水酶生物活性；
f)从SEQ ID NO：3大约378位到大约684位的SEQ ID NO：3片段，其中该域具有AT生物活性；
g)从SEQ ID NO：4大约5位到大约483位的SEQ ID NO：4片段，其中该域具有KS生物活性；
h)从SEQ ID NO：4大约489位到大约771位的SEQ ID NO：4片段，其中该域具有CLF生物活性；
i)从SEQ ID NO：4大约1428位到大约1570位的SEQ ID NO：4片段，其中该域具有DH生物活性；
j)从SEQ ID NO：4大约1881位到大约2019位的SEQ ID NO：4片段，其中该域具有DH生物活性；
k)从SEQ ID NO：5大约84位到大约497位的SEQ ID NO：5片段，其中该域具有ER生物活性；
l)从SEQ ID NO：6大约40位到大约186位的SEQ ID NO：6片段，其中该域具有PPT酶生物活性；
m)从SEQ ID NO：8大约29位到大约513位的SEQ ID NO：8片段，其中该域具有KS生物活性；
n)从SEQ ID NO：8大约625位到大约943位的SEQ ID NO：8片段，其中该域具有MAT生物活性；
o)从SEQ ID NO：8大约1275位到大约1872位的SEQ ID NO：8片段及其亚域，其中该域或其亚域具有ACP生物活性；
p)从SEQ ID NO：8大约2240位到大约2374位的SEQ ID NO：8片段，其中该域具有KR生物活性；
q)包括SEQ ID NO：8大约2480位-大约2492位的SEQ ID NO：8片段，其中该域具有非类FabA脱水酶活性；
r)从SEQ ID NO：9大约366位到大约703位的SEQ ID NO：9片段，其中该域具有AT生物活性；
s)从SEQ ID NO：10大约10位到大约488位的SEQ ID NO：10片段，其中该域具有KS生物活性；
t)从SEQ ID NO：10大约502位到大约750位的SEQ ID NO：10片段，其中该域具有CLF生物活性；
u)从SEQ ID NO：10大约1431位到大约1573位的SEQ ID NO：10片段，其中该域具有DH生物活性；
v)从SEQ ID NO：10大约1882位到大约2020位的SEQ ID NO：10片段，其中该域具有DH生物活性；
w)从SEQ ID NO：11大约84位到大约497位的SEQ ID NO：11片段，其中该域具有ER生物活性；和
x)从SEQ ID NO：12大约29位到大约177位的SEQ ID NO：12片段，其中该域具有PPT酶生物活性。
39.权利要求32的遗传修饰微生物，其中该微生物被进一步遗传修饰，从而表达至少一种来自破囊壶菌目生物的多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮合酶(PKS)系统的生物活性蛋白质或域。
40.权利要求39的遗传修饰微生物，其中破囊壶菌目生物选自Schizochytrium和破囊壶菌属。
41.权利要求39的遗传修饰微生物，其中所述蛋白质或域包括选自下组的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18；和
b)a)中任何氨基酸序列的片段，其具有至少一种选自下组的生物活性：烯酰-ACP还原酶(ER)活性；酰基载体蛋白(ACP)活性；β-酮脂酰-ACP合酶(KS)活性；酰基转移酶(AT)活性；β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)活性；类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶(DH)活性；非类FabA脱水酶活性；链长度因子(CLF)活性；丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)活性；和4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)活性。
42.权利要求39的遗传修饰微生物，其中所述蛋白质或域包含选自下组的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24；和
b)a)中任何氨基酸序列的片段，其具有至少一种选自下组的生物活性：烯酰-ACP还原酶(ER)活性；酰基载体蛋白(ACP)活性；β-酮脂酰-ACP合酶(KS)活性；酰基转移酶(AT)活性；β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)活性；类FabAβ-羟酰-ACP脱水酶(DH)活性；非类FabA脱水酶活性；链长度因子(CLF)活性；丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)活性；和4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)活性。
43.权利要求32的遗传修饰微生物，其中所述微生物由于遗传修饰而产生一种或多种选自下组的多不饱和脂肪酸：DHA(二十二碳六烯酸(C22:6，ω-3))，ARA(二十碳四烯酸或花生四烯酸(C20:4，n-6))，DPA(二十二碳五烯酸(C22:5，ω-6或ω-3))和EPA(二十碳五烯酸(C20:5，ω-3)。
44.权利要求32的遗传修饰微生物，其中该微生物由于遗传修饰而产生DHA。
45.权利要求32的遗传修饰微生物，其中该微生物由于遗传修饰而产生EPA。
46.权利要求32的遗传修饰微生物，其中该微生物由于遗传修饰而产生EPA和DHA。
47.权利要求32的遗传修饰微生物，其中该微生物由于遗传修饰而产生ARA和DHA。
48.权利要求32的遗传修饰微生物，其中该微生物由于遗传修饰而产生ARA和EPA。
49.权利要求32的遗传修饰微生物，其中该微生物包括内源PUFA PKS系统。
50.权利要求49的遗传修饰微生物，其中所述内源PUFA PKS系统被修饰，该修饰是通过用另一种分离核酸分子来替换核酸序列，所述分离核酸分子编码不同PKS系统的至少一个域，所述核酸序列编码内源PUFA PKS系统的至少一个域。
51.权利要求50的遗传修饰微生物，其中所述不同PKS系统选自：非细菌PUFA PKS系统、细菌PUFA PKS系统、I型模块性PKS系统、I型重复性PKS系统、II型PKS系统，和III型PKS系统。
52.权利要求49的遗传修饰微生物，其中内源PUFA PKS系统被遗传修饰，该修饰是通过用权利要求1的分离核酸分子替换编码内源PUFA PKS系统至少一个域的核酸序列。
53.权利要求49的遗传修饰微生物，其中微生物被遗传修饰从而重组表达核酸分子，所述核酸分子编码链长度因子或链长度因子加β-酮脂酰-ACP合酶(KS)域，其指导C20单位的合成。
54.权利要求49的遗传修饰微生物，其中内源PUFA PKS系统在选自下组的一个或多个域中被修饰：编码类FabA β-羟酰-ACP脱水酶(DH)域的域，和编码β-酮脂酰-ACP合酶(KS)的域；其中与没有修饰相比，该修饰改变由PUFA PKS系统产生的长链脂肪酸的比例。
55.权利要求54的遗传修饰微生物，其中修饰包括用不具有异构活性的DH域取代内源PUFA PKS系统中的类FabA β-羟酰-ACP脱水酶(DH)。
56.权利要求54的遗传修饰微生物，其中修饰选自下组：缺失该域的全部或部分，用来自不同生物体的同源域取代该域，和对该域进行突变。
57.权利要求49的遗传修饰微生物，其中内源PUFA PKS系统在烯酰-ACP还原酶(ER)域中被修饰，其中该修饰与没有修饰相比，导致不同化合物的产生。
58.权利要求57的遗传修饰微生物，其中该修饰选自下组：缺失所述ER域的全部或部分、用来自不同生物体的ER域取代所述ER域、和对所述ER域进行突变。
59.权利要求32的遗传修饰微生物，其中该微生物是破囊壶菌目生物。
60.权利要求59的遗传修饰微生物，其中破囊壶菌目生物来源于选自Schizochytrium和破囊壶菌属的属。
61.权利要求32的遗传修饰微生物，其中该微生物是细菌。
62.一种生产由聚酮合酶系统产生的生物活性分子的方法，包括在可有效产生该生物活性分子的条件下培育权利要求12的遗传修饰植物。
63.一种生产由聚酮合酶系统产生的生物活性分子的方法，包括在可有效产生该生物活性分子的条件下培育权利要求29的遗传修饰微生物。
64.权利要求63的方法，其中与野生型生物体相比，所述遗传修饰改变由内源PKS系统产生的至少一种产物。
65.权利要求63的方法，其中所述生物体产生不同于未遗传修饰的天然生物体的多不饱和脂肪酸(PUFA)谱。
66.权利要求63的方法，其中所述生物活性分子选自下组：抗炎制剂、化疗剂、活性赋形剂、骨质疏松症药物、抗抑郁剂、抗惊厥药、抗幽门螺杆菌药、治疗神经变性疾病的药物、治疗变性肝病的药物、抗生素和降胆固醇制剂。
67.权利要求63的方法，其中所述生物活性分子是抗生素。
68.权利要求63的方法，其中所述生物活性分子是多不饱和脂肪酸(PUFA)。
69.权利要求63的方法，其中所述生物活性分子是包含顺式构型碳-碳双键的分子。
70.权利要求63的方法，其中该生物活性分子是每第三个碳处包含一个双键的分子。
71.一种产生植物的方法，所述植物具有不同于天然植物的多不饱和脂肪酸(PUFA)谱，该方法包括遗传修饰所述植物的细胞以表达PKS系统，其中该PKS系统包含权利要求9的至少一种重组核酸分子。
72.一种产生重组微生物的方法，包括遗传修饰微生物细胞以表达根权利要求9的至少一种重组核酸分子。
73.一种修饰终产物以包含至少一种脂肪酸的方法，包括向终产物添加由重组宿主细胞产生的油，所述重组宿主细胞表达根据权利要求9的至少一种重组核酸分子。
74.权利要求73的方法，其中该终产物选自下组：膳食补充剂、食品、药物制剂、母乳化动物乳和婴儿配方食品。
75.一种产生母乳化动物乳的方法，包括用权利要求9的至少一种重组核酸分子遗传修饰产乳动物的产乳细胞。
76.一种重组宿主细胞，其被修饰而表达重组细菌多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮合酶(PKS)系统，其中PUFA PKS催化重复性和非重复性酶反应，并且其中该PUFA PKS系统包括：
a)至少一个烯酰-ACP还原酶(ER)域；
b)至少六个酰基载体蛋白(ACP)域；
c)至少两个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)域；
d)至少一个酰基转移酶(AT)域；
e)至少一个酮还原酶(KR)域；
f)至少两个类FabA β-羟酰-ACP脱水酶(DH)域；
g)至少一个链长度因子(CLF)域；
h)至少一个丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)域；和
i)至少一个4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)域；和
其中该PUFA PKS系统在至少大约25℃的温度条件下产生PUFA。
77.权利要求76的重组宿主细胞，其中该PUFA PKS系统包括：
a)一个烯酰-ACP还原酶(ER)域；
b)六个酰基载体蛋白(ACP)域；
c)两个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)域；
d)一个酰基转移酶(AT)域；
e)一个酮还原酶(KR)域；
f)两个类FabA β-羟酰-ACP脱水酶(DH)域；
g)一个链长度因子(CLF)域；
h)一个丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)域；和
i)一个4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)域。
78.权利要求76的重组宿主细胞，其中该PUFA PKS系统是来自海洋细菌的PUFA PKS系统，所述海洋细菌选自Shewanella japonica和Shewanella olleyana。
79.一种遗传修饰的生物体，其包括细菌多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮合酶(PKS)系统的至少一个蛋白质或域，其中该细菌PUFA PKS系统催化重复性和非重复性酶反应，其中该细菌PUFA PKS系统在至少大约25℃的温度条件下产生PUFA，且其中所述PUFA PKS系统包括：
a)至少一个烯酰-ACP还原酶(ER)域；
b)至少六个酰基载体蛋白(ACP)域；
c)至少两个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)域；
d)至少一个酰基转移酶(AT)域；
e)至少一个酮还原酶(KR)域；
f)至少两个类FabA β-羟酰-ACP脱水酶(DH)域；
g)至少一个链长度因子(CLF)域；
h)至少一个丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)域；和
i)至少一个4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)域，且
其中该遗传修饰影响PUFA PKS系统的活性。
80.权利要求79的遗传修饰生物体，其中该生物体被修饰而重组表达细菌PUFA PKS系统的至少一个蛋白质或域。
81.权利要求79的遗传修饰生物体，其中该生物体被修饰而重组表达细菌PUFA PKS系统。
82.权利要求79的遗传修饰生物体，其中该生物体是植物。
83.权利要求79的遗传修饰生物体，其中该生物体是微生物。
84.权利要求79的遗传修饰生物体，其中该细菌PUFA PKS系统是来自海洋细菌的PUFA PKS系统，所述海洋细菌选自Shewanella japonica和Shewanella olleyana。
85.权利要求79的遗传修饰生物体，其中该生物体表达至少一种额外的来自第二不同PKS系统的蛋白质或域。
86.一种分离重组核酸分子，其编码细菌(PUFA)聚酮合酶(PKS)系统的至少一个蛋白或功能域，其中该细菌PUFA PKS系统催化重复性和非重复性酶反应，其中该细菌PUFA PKS系统在至少大约25℃的温度条件下产生PUFA，并且其中该PUFA PKS系统包括：
a)至少一个烯酰-ACP还原酶(ER)域；
b)至少六个酰基载体蛋白(ACP)域；
c)至少两个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)域；
d)至少一个酰基转移酶(AT)域；
e)至少一个酮还原酶(KR)域；
f)至少两个类FabA β-羟酰-ACP脱水酶(DH)域；
g)至少一个链长度因子(CLF)域；
h)至少一个丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)域；和
i)至少一个4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)域。
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