CN101495129A

CN101495129A - 桂枝茯苓组合物及其应用

Info

Publication number: CN101495129A
Application number: CNA2007800279944A
Authority: CN
Inventors: 肖伟; 戴翔翎; 凌娅; 王振中; 毕宇安; 王正宽
Original assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2006-10-18
Filing date: 2007-10-17
Publication date: 2009-07-29
Anticipated expiration: 2027-10-17
Also published as: JP2010506899A; KR101545356B1; MY164475A; KR20090067135A; WO2008090410A2; EP2073825A2; HUE035045T2; EP2073825B1; WO2008090410A3; CN101495129B; CA2659442C; WO2008090410A4; US8067040B2; CA2659442A1; JP5328656B2; EP2073825A4; US20100183660A1

Abstract

本发明提供包括中草药Hamulus cinnamomi和Poria cocos(中文名：桂枝和茯苓)的组合物，其中所述组合物由从改进的色谱方法获得的指纹识别模式所定义。本发明还提供这样的组合物的许多用途。

Description

桂枝茯苓组合物及其应用

本申请要求于2006年10月18日提交的美国临时申请号60/829,945的优先权。在前申请的全部内容和公开通过引用结合到本申请中。

发明领域

本发明涉及包括中草药桂枝(Ramulus cinnamomi)和茯苓(Poriacocos)(中文名称：桂枝和茯苓)的组合物的制备和应用。

发明背景

传统中药利用草药制剂来治疗身体上的疾病。在一些情形中，使用单一的草药或草药衍生物。然而，更普遍地，施用“配方”或几种特别的草药的特异性组合。下述5种草药材料2000多年来一直用在传统中药中。它们已经被记载在许多历史中药教科书中，并且在公布在当代科学杂志中的多篇论文所引用。

常用名拉丁名中文名

Cassia Twig Ramulus cinnamomi 桂枝

Indian Bread Poria cocos 茯苓

Peach Seed Semen persicae 桃仁

White Peony Root Radix paeoniae alba 白芍

Tree Peony Bark Cortex moutan 牡丹皮，

桂枝(Cassia Twig)是肉桂(Cinnamomum cassia Presl)(樟科(Fan.Lauraceae))的干燥的幼茎。该植物在春季或夏季采集。采集并去除它的叶子后在太阳下干燥。它也可以被切成片。该药物制剂具有圆柱体，多分枝，长度30-75cm，具有直径0.3-1cm的厚端。它在表面上是褐色或红褐色的，具有纵向线，细皱，点缀有叶片、枝条或芽痕。坚硬并且脆，它容易断开。至于切片，其为2-4mm厚，切面在树皮区域表现出红褐色，在木质部表现出黄白色到淡黄褐色。它具有特征性的芳香味，并且尝起来是甜的或稍微刺激性(特别在树皮中)。药物制剂是桂枝的干净的碎片，没有可见的杂质。桂枝的重要成分是肉桂醛和肉桂酸(cinamic acid)。

茯苓(Indian Bread)是真菌茯苓(Poria cocos)(多孔菌科(Fam.Polyporaceae))的干菌核。该植物在7月份到9月份间采集。采集后，将其反复堆积并且铺开进行空气干燥，直到在表面上出现皱纹，并且其内部的湿气蒸发掉。完整的干燥菌核叫作“茯苓(Fulingge)”。如果在干燥之前有新的菌核剥落，那么分开的部分叫作“茯苓皮(Fulingpi)”(皮)和“茯苓块(Fulingkuai)”(肉)。

外皮薄且粗糙，褐色到黑褐色，明显起皱并且有条纹。质地硬且紧密。它是无嗅的，味道很弱并且当咀嚼时变粘。该药物制剂是茯苓的干净的碎片没有可见的杂质。它的重要活性成分是茯苓聚糖(Pachman)和茯苓酸。

许多美国专利和文献已经教导了从草药如桂枝、茯苓等制成医疗组合物的方法。许多中国的研究者也已经使用某些桂枝和茯苓组合物在动物或临床研究上进行了报道。

在美国专利号6,093,403中，由多达20重量％的茯苓提取物组成的配方已经被用来治疗或预防糖平衡紊乱、糖尿病和血液循环疾病如心绞痛。

茯苓(Poria cocos wolf)用来治疗心血管疾病、脑血管疾病、阿尔茨海默病和抑郁症。已经在美国专利号5,589,182中公开了含有多达其重量的20％的茯苓的组合物。

He等在1994年公布了一篇关于在100例妇科病中的桂枝和茯苓组合物的临床研究的论文，所述妇科病为：由子宫内膜的不规则脱落引起的功能障碍性子宫出血、慢性盆腔炎、痛经和小的壁内子宫肌瘤。与使用另一种药物制剂(桂枝和茯苓的大丸剂，BCP)治疗的50例患者相比较，基于多种抱怨症状和身体迹象的观察没有表现出这两组之间的显著差异。

Shi等在2000年报道了桂枝和茯苓组合物在60名患有子宫肌瘤的患者中的治疗效果。患者接受身体妇科检查，超声检查和血色素检验。Shi的研究报道了91.7％的有效率，并且在其中，10％的病例有显著的改善。如果肿瘤减小3-5cm并且增加的月经减少50％或更多，那么治疗的效力定义为“显著改善”；或者如果肿瘤减小2-3cm并且月经减少25％或更多，那么为“改善”。

本发明提供包括桂枝和茯苓的草药组合物，其将有效地减轻许多疾病诸如上文讨论的那些的症状。与中药中更传统的实施相反，本发明通过最新技术进行生产，其能够更好地保留桂枝和茯苓的有效成分。

贯穿本申请，引用了许多公布，并且这些公布的完全引用可以在本说明书最后权利要求之前的参考文献中找到。这些公布的公开内容通过引用由此结合到本申请中，以更充分地描述在本文中描述的和要求保护的本发明的日期时的本领域技术人员已知的现有技术。

发明概述

本发明提供包括中草药桂枝和茯苓(中文名：桂枝和茯苓)的组合物。在一个实施方案中，如在美国专利7,052,700中所述，该草药组合物被配制成胶囊，该专利通过引用结合于此。

本发明的草药组合物由表现出12个峰的HPLC指纹所定义。用甲醇提取所述草药组合物并且针对作为标准物的芍药苷进行分析，所述12个峰具有下述特征：

在一个实施方案中，本发明提供包括桂枝和茯苓的草药组合物，其中所述组合物在进行包括下述步骤的方法时产生12个峰：a)用适当的有机溶剂提取所述组合物；和b)进行色谱分析。与芍药苷相比，峰1-12的相对保留时间范围分别为0.209-0.314，0.456-0.683，0.733-0.999，0.871-1.306，0.921-1.382，0.968-1.451，1.009-1.514，1.058-1.587，1.152-1.728，1.69-2.536，1.771-2.657，和1.943-2.915。

在另一个实施方案中，所述草药组合物还包括芍药苷和芍药醇。优选地，存在1.26～1.90％的芍药苷和0.71～1.07％的芍药醇。

在另一个实施方案中，本发明提供通过包括下述步骤的方法生产的组合物：(a)制备茯苓粉；(b)制备牡丹皮(Cortex moutan)的提取物；(c)制备桂枝的提取物；(d)制备白芍(Radix paeoniae alba)，桃仁(Semenpersicae)和茯苓的提取物；(e)将由步骤(b)-(d)获得的提取物合并；(f)将所述茯苓粉与由步骤(e)获得的提取物混合，并且产生细粉；和(g)将所述细粉与包括牡丹皮和桂枝的提取物的包合物混合。

本发明还提供生产包括桂枝和茯苓的组合物的方法，所述方法包括下列步骤：(a)制备茯苓粉；(b)制备牡丹皮的提取物；(c)制备桂枝的提取物；(d)制备白芍，桃仁和茯苓的提取物；(e)将由步骤(b)-(d)获得的提取物合并；(f)将所述茯苓粉与由步骤(e)获得的提取物混合，并且产生细粉；和(g)将所述细粉与包括牡丹皮和桂枝的提取物的包合物混合。

本发明还提供包括药用载体和本文所述的草药组合物的药物组合物。

本发明还提供本文所述的组合物在制备用于治疗选自由下列各项组成的组的疾病或病症的药物中的应用：原发性痛经、继发性痛经、功能障碍性子宫出血、慢性盆腔炎和小的壁内子宫肌瘤。

附图详述

图1显示本文所述的桂枝和茯苓胶囊组合物的HPLC指纹。

发明详述

本发明提供包括中草药桂枝和茯苓(Ramulus cinnamomi和Poriacocos)的组合物。在一个实施方案中，该草药组合物可以配制成如在美国专利7,052,700中所述的胶囊，所述专利的公开内容通过引用结合于此。

在一个实施方案中，本发明提供包括桂枝和茯苓的草药组合物，其中所述草药组合物由通过指纹识别方法获得的12-峰指纹(图1)所定义，所述指纹识别方法包括用适当的有机溶剂提取所述组合物，并且进行色谱分析的步骤。在一个实施方案中，所述色谱分析是高效液相色谱(HPLC)。通常，所述草药组合物用有机溶剂甲醇提取，然后用芍药苷标准物按照本领域公知的方法进行HPLC。

与芍药苷相比，峰1，8，9，和12的相对峰面积范围分别为0.25-0.89，0.69-1.5，0.3-0.85，和1.56-3.06。

与芍药苷相比，峰1-12的相对保留时间分别为0.209-0.314，0.456-0.683，0.733-0.999，0.871-1.306，0.921-1.382，0.968-1.451，1.009-1.514，1.058-1.587，1.152-1.728，1.69-2.536，1.771-2.657，和1.943-2.915。

本发明的草药组合物还包括芍药苷和芍药醇。在一个实施方案中，存在1.26～1.90％的芍药苷和0.71～1.07％的芍药醇。

本发明还提供包括本文所述的草药组合物和药用载体的药物组合物。通常，所述草药组合物可以按照标准方法配制成丸剂、胶囊、片剂、混悬剂、或糖浆剂。

依据本发明使用的药物组合物可以包括药用赋形剂或载体。当用在本文时，术语“药用载体”意指无毒、惰性的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂。可以作为药用载体的物质的代表性实例是糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；无热源的水；等渗盐水；林格溶液(Ringer’s solution)；乙醇；和磷酸缓冲溶液，以及其它无毒相容的滑润剂，如硫酸月桂酯钠和硬脂酸镁，以及着色剂，释放剂，涂层剂，甜味剂，调味剂和芳香剂，防腐剂和抗氧化剂也可以在依据所述草药组合物的应用而存在于所述组合物中。

本发明还提供治疗患有疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的本文公开的草药组合物的步骤。所述“有效量”的试剂或组合物是指激发需要的生物反应所需要的量。草药或草药药物的活性成分的有效量是减少特别的病征和/或症状所需要的量。本领域普通技术人员通过常规方法和技术可以容易地确定所述草药组合物的有效量。

本发明的草药组合物可以用来治疗各种疾病或病症。在美国专利7,052,700中已经讨论了许多应用。例如，桂枝和茯苓胶囊可以用来治疗原发性或继发性的痛经、由不规则的子宫内膜脱落引起的功能障碍性子宫出血、具有炎性下腹肿块的慢性盆腔炎或小的壁内子宫肌瘤，以及许多其它常见的盆腔病症。使用本发明的草药组合物的进一步的药物研究、预临床以及临床研究可以如在美国专利7,052,700中所述那样进行。

优选地，本发明的创造性药物组合物可以口服施用。在本发明的另一个实施方案中，药物组合物可以递送至粘膜，例如，通过吸入或注射递送。通常，所述创造性的药物组合物可以口服、直肠、肠胃外、脑池内(intracisternally)、阴道内、腹膜内、局部(如通过散剂、软膏剂或滴剂)、含服(bucally)或作为口或鼻喷雾剂而施用给人和/或其它动物。

概括描述的本发明将通过参考下述实施例而更容易理解，所述实施例仅出于举例说明本发明的某些方面和实施方案的目的包含于此，并不是意欲限制本发明。

实施例1

桂枝和茯苓胶囊

本实施例提供以胶囊形式的包括桂枝和茯苓的草药组合物(桂枝和茯苓胶囊)。制备桂枝和茯苓胶囊的方法已经在美国专利7,052,700中进行了描述，其通过引用结合于此。所述桂枝和茯苓胶囊包含尝起来稍苦的黄褐色颗粒。在一个实施方案中，每个含有0.31g所述颗粒的胶囊可以在室温下保存24个月。

在一个实施方案中，所述桂枝和茯苓胶囊可以通过下述方法生产：

步骤1：称重(制剂数量的50％-90％)茯苓。

步骤2：将所述茯苓碾成细粉，并且通过100目的筛子。

步骤3：将所述茯苓粉末通过微波灭菌。这被指定为茯苓粉。

步骤4：称重牡丹皮。

步骤5：通过蒸汽蒸馏提取牡丹皮。

步骤6：收集液体蒸馏物。将所述液体蒸馏物冷冻、过滤并且冷却干燥以获得提取物。将所干燥的提取物指定为芍药醇。

步骤7：保存所提取的原材料(固体残渣I)。

步骤8：将固体残渣I用80～95％的乙醇提取两次(第一次3～5倍体积，第二次2～4倍)。每次煮沸1～3小时。

步骤9：将乙醇提取物合并。这是提取物I。

步骤10：将所述固体残渣用水提取两次(第一次5～7倍体积，第二次3～5倍)。每次煮沸1～3小时。

步骤11：将所述水提取物合并。这是提取物II。

步骤12：称重桂枝。

步骤13：通过蒸汽蒸馏提取挥发性的油。收集所述挥发性的油的产量。

步骤14：保存所提取的原材料(固体残渣II)。

步骤15：将固体残渣II用80～95％的乙醇提取两次(第一次3～5倍体积，第二次2～4倍)。每次煮沸1～3小时。

步骤16：将乙醇提取物合并。这是提取物III。

步骤17：将所述固体残渣用水提取两次(第一次5～7倍体积，第二次3～5倍)。每次煮沸1～3小时。

步骤18：将所述水提取物合并。这是提取物IV。

步骤19：称重白芍、桃仁和茯苓(制剂数量的10％-50％)。

步骤20：加入3～5倍的80～95％的乙醇，并且置于室温下20～40分钟，然后煮沸1～3小时。

步骤21：用2～4的乙醇再提取所述固体，并且煮沸1～3小时。

步骤22：将所述乙醇提取物合并。这是提取物V。

步骤23：将所述固体残渣用水提取两次(第一次5～7倍体积，第二次3～5倍)。每次煮沸1～3小时。

步骤24：将所述水提取物合并。这是提取物VI。

步骤25：将提取物I(步骤9)，III(步骤16)和V(步骤22)合并。在真空中浓缩，直到没有乙醇的气味。这是液体A。

步骤26：将提取物II(步骤11)，IV(步骤18)和VI(步骤24)合并。在真空下浓缩。这是液体B。

步骤27：将液体A和B合并。在真空下浓缩直到相对密度等于1.15～1.35(60～90℃)。浓缩的液体提取物指定为半固体提取物。

步骤28：称重β-环糊精，并且加入到2～3倍的水中。将β-环糊精溶液加热到50～70℃。

步骤29：将来自步骤6的总芍药醇提取物溶解在4～6倍的80～95％的乙醇中。

步骤30：将所述芍药醇溶液加入到所述β-环糊精溶液中。

步骤31：碾磨10～30分钟。

步骤32：然后置于冰箱中12～36小时。

步骤33：在真空下过滤。

步骤34：在40～60℃干燥。得到的白色粉末是包合物I。

步骤35：称重β-环糊精，并且加入到4～6倍的10～30％的乙醇溶液中。在持续搅拌下，将来自步骤13的所有挥发性油加入到β-环糊精溶液中。

步骤36：保持碾磨20～40分钟。

步骤37：然后置于冰箱中12～36小时。

步骤38：在真空下过滤。

步骤39：在40～60℃干燥。得到的白色粉末为包合物II。

步骤40：将所述茯苓粉与所有半固体提取物混合。

步骤41：将所述混合物在70～100℃干燥，并且碾成细粉。

步骤42：将细粉I与包合物I和包合物II混合。

步骤43：加入50～80％的乙醇溶液以制备面团状物质。

步骤44：将湿物料通过16-24目的筛子，以获得颗粒。

步骤45：在40～60℃干燥所述颗粒。

步骤46：将所干燥的颗粒再次通过所述筛子。

步骤47：将干燥的颗粒充分混合。这是最终的颗粒。

技术要求

(1)所述茯苓细碎粉末需要通过100目的筛子(内径150±6.6μm)进行筛选。

(2)粗芍药醇的浓度应该不低于90％。

(3)浓缩必须在真空条件下进行。

(4)检测所述挥发性物质的桂醛的存在。

(5)物料质量平衡应该是±5％。

质量控制

乳膏提取物：所述乳膏提取物在颜色上是深褐色的。它的相对密度应该为1.15～1.35(60～70℃)，并且芍药苷的含量应该为1.36～2.04％。

在混合茯苓后的软粉末：颜色黄褐色，具有略苦的味道。微生物限制：细菌数不能超过5000实体/g；真菌不能超过100实体/g；不应该检测到活的螨虫、螨虫卵或大肠菌。芍药苷的含量：(1.23～0.87％).(1.23～1.87％)

最终的颗粒：黄褐色，水含量不超过6.0％。

胶囊：干净、不粘或者形状上没有损伤。含量的差别不应该超过±10％(0.31g/胶囊)。溶解时间在30分钟之内。水含量不应该超过7.0％。芍药苷的含量在1.26～1.90％，并且芍药醇在0.71～1.07％。

实施例2

桂枝和茯苓胶囊的指纹识别

本检测依据HPLC方法(中国药典(Chinese Pharmacopoeia)2000版，第一卷，附录VI D)和指纹识别的需要进行。

HPLC条件和系统适合性

安捷伦1100液相色谱(Agilent 1100 Liquid Chromatograph)；AlltimaC185μm，250mm X 4.6mm柱。移动相A包含0.1％的磷酸和5％的乙腈水溶液；移动相B包含0.1％的磷酸和50％的乙腈水溶液。流速：1ml/min；检测波长：230nm。基于芍药苷的峰，柱的理论塔板数应该不低于6000。梯度洗脱程序运行如下：

时间(min) A％ B％

0 100 0

70 0 100

制备参比溶液

准确称重特定量的芍药苷标准参比，然后加入适当量的甲醇，以制备50μg/ml的溶液。

样品制备

取用于重量变化检测的样品的含量，充分混合，并且碾磨成细粉。准确称重约0.25g的所述混合物，并且加入25ml的50％甲醇。将所述混合物声处理30min，然后过滤。弃掉第一部分的滤液。收集残留的滤液作为检测溶液。

测定

将10μl的每种参比溶液和所述检测溶液注射到HPLC系统中，然后运行程序。

结果

如在图1和表1中所示，检测到13个峰(编号1-12和标准，S)，并且说明了它们的相对保留时间范围。另外，峰1，8，9和12指明为相对峰面积的范围(表1)。这样的说明是基于许多批次的桂枝和茯苓组合物在HPLC上的组合分析。

依据本文描述的结果，任何批次的桂枝和茯苓组合物的HPLC色谱应该具有13个特征峰。所述13个峰的相对保留时间和峰1，8，9和12的相对峰面积应该在指定的范围内。通过这样的控制，桂枝和茯苓组合物的可重现性和内部质量可以得到控制和保证。来自10个不同批次的桂枝和茯苓胶囊的HPLC数据已经证实表现出本文所述的指纹模式。

表1

HPLC指纹中的通用峰和它们的界限

本文所述的指纹模式与在美国专利7,052,700中所示的那些不同。在所述‘700专利中，用于HPLC的水性样品通过水回流提取制备。将3粒桂枝和茯苓胶囊的内容物与200ml蒸馏水混合用于加热回流30min(在沸腾时开始计时)。将溶液冷却，离心10min，并且用0.45μm的滤膜过滤。滤液的第一部分被弃掉，并且采用其余滤液作为检测溶液。结果，所述‘700专利描述了4个色谱，即，一个关于水溶性成分，两个关于脂溶性成分(不同的色谱条件和检测波长)，和一个关于气相色谱。前3个色谱表现出可重现性差，并且具有一些相互重叠的峰。

在本发明中，这种处理方法已经改变成使用50％的甲醇以提取样品。将用于重量变化检测的样品的内容物充分混合，并且碾成细粉。将25ml甲醇加入到0.25g的所述混合物中，然后将其声处理30min，然后过滤。将滤液的第一部分弃掉，并且收集其余滤液作为检测溶液。发现用50％的甲醇提取导致更多的峰，不但揭示所述桂枝和茯苓胶囊的更多的成分，而且表明了产品中的脂溶性和挥发性成分。因此，本方法只产生一个色谱，其可以与其它质量控制方法结合使用，以控制所述桂枝和茯苓胶囊的质量。

因此，这两种方法之间的不同在于，前者水回流提取方法提取主要是水溶性的成分，并且在所述色谱中的主峰是产品中的水溶性化合物。相反，本发明的方法使用50％的甲醇作为提取溶剂，以提取更多的水溶性成分、脂溶性成分以及挥发性化合物芍药醇，并且这些化合物可以存在于一个色谱中，该色谱基于相等的样品量表现出更高的芍药醇峰。

实施例3

桂枝和茯苓胶囊指纹识别的特异性、可重现性和稳定性

用于传统中药的指纹的评估参数通常是保留时间和特征峰面积与参比的那些的比例。每个峰的相对保留时间和峰面积用于表征指纹。在标准的指纹识别中，说明特征峰的相对保留时间和相对峰面积。

这样的评估参数可以消除由仪器、柱、流动相和可能改变保留时间和峰面积的环境中的差异引起的变化。因此，这些参数可以客观而综合地用来表示其中成分的实际条件和产品的内部质量。

特异性：

本文提供的指纹特征对于本发明的桂枝和茯苓胶囊是独特的。所述指纹的特征峰揭示依据所公开的制备方法加工的每个批次的桂枝和茯苓胶囊的成分。

可重现性：

所述指纹分析标准物来源于测定条件和从许多批次收集的数据的最优化。来自相同批次的重复测定的结果，以及来自不同批次的数据(表2-3)表明本方法可以以良好的可重现性准确地指纹识别桂枝和茯苓胶囊。所述结果还表明在不同批次中成分的含量类似，所有特征峰的相对保留时间和峰面积在指定的范围内。

稳定性

从0-12月一直研究连续的三批的指纹。结果表明，在12个月中没有特征峰的明显改变，这说明产品质量以及所述指纹测定方法的稳定性(表4-6)。

表2

来自5个批次的指纹数据

表3

来自其它5个批次的指纹数据

表4

稳定性数据

表5

稳定性数据

表6

稳定性数据

权利要求书(按照条约第19条的修改)

15.一种制备包含桂枝(Ramulus cinnamomi)和茯苓(Poria cocos)的组合物的颗粒剂的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)将茯苓(Poria)研磨成细粉，以提供茯苓粉；

(b)通过蒸汽蒸馏提取牡丹皮(Cortex moutan)，以提供芍药醇提取物；

(c)用乙醇提取从步骤(b)提取的原料，以提供提取物I，然后用热水再次提取所述原料，以提供提取物II；

(d)通过蒸汽蒸馏提取桂枝，以提供挥发性油；

(e)用乙醇提取从步骤(d)提取的材料，以提供提取物III，然后用热水再次提取所述原料，以提供提取物IV；

(f)用乙醇提取白芍(Radix paeoniae alba)、桃仁(Semen persicae)和茯苓，以提供提取物V，然后用热水提取以提供提取物VI；

(g)合并提取物I、III和V，并且去除全部乙醇，以提供液体A；

(h)合并提取物II、IV和VI，并且浓缩所述合并的提取物，以提供液体B；

(i)合并液体A和B，并且浓缩所述液体以提供具有等于1.15-1.35(60-90℃)的相对密度的半固体提取物；

(j)将来自步骤(b)的芍药醇提取物溶解在乙醇中，并且将所述溶液添加到β-环糊精的水溶液中，其中研磨所述混合物，并且干燥以提供包合物I；

(k)将来自步骤(d)的挥发性油与β-环糊精在乙醇中混合，其中将所述混合物研磨并且干燥以提供包合物II；

(l)将来自步骤(a)的茯苓粉与来自步骤(i)的半固体混合，其中将所述混合物干燥并且研磨成细粉；

(m)将来自步骤(1)的细粉与包合物I和II混合，向所述混合物中添加乙醇，制成面团状物质，并且使所述湿物料通过筛子，以获得颗粒；并且

(n)干燥所述颗粒剂，并且使所述干燥的颗粒再次通过筛子，以提供最终的桂枝和茯苓的颗粒剂。

16.权利要求15的方法，其中所述组合物还包括芍药苷和芍药醇。

17.权利要求16的方法，其中所述芍药苷以1.26-1.90％存在，并且所述芍药醇以0.71-1.07％存在。

18.权利要求15-17中任一项的方法，其中所述组合物被配制成丸剂、胶囊、颗粒剂、片剂、混悬剂或糖浆剂。

19.权利要求18的方法，其中所述配制成丸剂、胶囊、颗粒剂、片剂、混悬剂或糖浆剂的组合物用于治疗选自由下列各项组成的组的一种疾病或病症：原发性痛经、继发性痛经、功能障碍性子宫出血、慢性盆腔炎和小的壁内子宫肌瘤。

20.权利要求18或19的方法，其中所述配制成丸剂、胶囊、颗粒剂、片剂、混悬剂或糖浆剂的组合物是口服、直肠、肠胃外、阴道内、腹膜内、局部、或作为口或鼻喷雾剂施用的。

21.分析权利要求15的组合物的方法，所述方法包括下列步骤：

a)用适当的有机溶剂提取所述组合物；和

b)进行色谱分析；

其中所述分析产生12个峰。

22.权利要求21的方法，其中所述有机溶剂是甲醇。

23.权利要求21或22的方法，其中将芍药苷用作所述色谱分析中的标准物。

24.权利要求21-23中任一项的方法，其中所述色谱分析是高效液相色谱(HPLC)。

25.权利要求21-24中任一项的方法，其中与芍药苷相比，关于峰1、8、9和12的相对峰面积范围分别为0.25-0.89，0.69-1.5，0.3-0.85和1.56-3.06。

26.权利要求21-25中任一项的方法，其中与芍药苷相比，关于峰1-12的相对保留时间分别为0.209-0.314，0.456-0.683，0.733-0.999，0.871-1.306，0.921-1.382，0.968-1.451，1.009-1.514，1.058-1.587，1.152-1.728，1.69-2.536，1.771-2.657，1.943-2.915。

27.通过权利要求15-17中任一项的方法生产的组合物用于制备药物的应用，所述药物用于治疗选自由下列各项组成的组的一种疾病或病症：原发性痛经、继发性痛经、功能障碍性子宫出血、慢性盆腔炎和小的壁内子宫肌瘤。

28.权利要求27的应用，其中所述组合物被配制成丸剂、胶囊、颗粒剂、片剂、混悬剂或糖浆剂。

29.权利要求28的应用，其中所述配制成丸剂、胶囊、颗粒剂、片剂、混悬剂或糖浆剂的组合物是口服、直肠、肠胃外、阴道内、腹膜内、局部、或作为口或鼻喷雾剂施用的。

根据PCT条约第19条的修改声明

通过该修改，修改了权利要求以解决在国际检索机构的书面意见(方框号V)中提出的问题。申请人恭敬地认为新的权利要求是被说明书和原权利要求书充分支持的。因而，不存在新内容的问题，并且权利要求修改对于公布的申请的任何部分没有影响。

根据PCT条约第33条第3款的拒绝

审查员声称相对于CN 1748735(D1)，本申请的权利要求1-14没有创造性。审查员声称，在权利要求1-14和D1之间的区别是本发明用有机溶剂提取全部原料并且因而产生不同数目的峰和成分在组合物中的特定比例，但是这些区别特征可以被认为是常规的并且对于本领域技术人员是显而易见的。在答复中，申请人恭敬地反驳。

在本文中提出的指纹识别模式不同于D1中所示的那些。在本发明中，已经将加工方法改变成使用50％甲醇以提取样品。将用于重量差异试验的样品的内容物充分混合并且研磨成细粉。将25ml甲醇添加到0.25g混合物，然后将其声波处理30min，然后过滤。将第一份滤液丢弃，并且收集其余的滤液作为试验溶液。发现，用50％甲醇提取产生更多的峰，表示组合物中脂溶性和挥发性的组分两者(见实施例2)。

因此，D1和本方法之间的区别是，前者的水回流提取方法提取主要是水溶性的组分，并且色谱图中的主要峰是产物中的水溶性化合物。相反，本发明的方法使用50％甲醇作为提取溶剂以提取除芍药醇之外更多的水溶性和脂溶性的组分。D1没有教导或暗示如本文所公开的用甲醇提取；D1也没有教导或暗示用甲醇提取将产生不仅在批次之间而且经过12个月的时期是可重现的指纹，如本文所公开(见实施例3)。因此，申请人认为目前所要求的制备和分析桂枝和茯苓的组合物的方法相对于D1是非显而易见的。

Claims

1.一种包括桂枝(Ramulus cinnamomi)和茯苓(Poria cocos)的组合物，其中所述组合物在进行包括下述步骤的方法时产生12个峰：

a)用适当的有机溶剂提取所述组合物；和

b)进行色谱分析。

2.权利要求1的组合物，其中与芍药苷相比较，对于峰1，8，9和12的相对峰面积范围分别为0.25-0.89，0.69-1.5，0.3-0.85，和1.56-3.06。

3.权利要求1的组合物，其中与芍药苷相比较，对于峰1-12的相对保留时间范围分别为0.209-0.314，0.456-0.683，0.733-0.999，0.871-1.306，0.921-1.382，0.968-1.451，1.009-1.514，1.058-1.587，1.152-1.728，1.69-2.536，1.771-2.657，和1.943-2.915。

4.权利要求1的组合物，其中所述有机溶剂是甲醇。

5.权利要求1的组合物，其中芍药苷用作色谱分析中的标准物。

6.权利要求1的组合物，其中所述色谱分析是高效液相色谱(HPLC)。

7.按照权利要求1-6任一项的组合物，所述组合物还包括芍药苷和芍药醇。

8.权利要求7的组合物，其中所述芍药苷以1.26～1.90％存在，并且所述芍药醇以0.71～1.07％存在。

9.按照权利要求1-8任一项的组合物，其中所述组合物通过包括下述步骤的方法生产：

(a)制备茯苓(Poria)粉；

(b)制备牡丹皮(Cortex moutan)的提取物；

(c)制备桂枝的提取物；

(d)制备白芍(Radixpaeoniae alba)，桃仁(Semen persicae)和茯苓的提取物；

(e)将由步骤(b)-(d)获得的提取物合并；

(f)将所述茯苓粉与由步骤(e)获得的提取物混合，并且产生细粉；和

(g)将所述细粉与包括牡丹皮和桂枝的提取物的包合物混合。

10.一种药物组合物，所述药物组合物包括权利要求1的组合物和药用载体。

11.权利要求10的药物组合物，其中所述组合物被配制成选自由丸剂、胶囊、颗粒剂、片剂、混悬剂和糖浆剂组成的组的形式。

12.一种生产包括桂枝和茯苓的组合物的方法，所述方法包括下述步骤：

(a)制备茯苓粉；

(b)制备牡丹皮的提取物；

(c)制备桂枝的提取物；

(d)制备白芍，桃仁和茯苓的提取物；

(e)将由步骤(b)-(d)获得的提取物合并；

(g)将所述细粉与包括牡丹皮和桂枝的提取物的包合物混合。

13.权利要求1或权利要求10的组合物在制备用于治疗选自由下列各项组成的组的疾病或病症的药物中的应用：原发性痛经、继发性痛经、功能障碍性子宫出血、慢性盆腔炎和小的壁内子宫肌瘤。

14.权利要求13的应用，其中所述组合物以口服、直肠、肠胃外、阴道内、腹膜内、局部、或作为口或鼻喷雾剂而施用。