CN101677537B

CN101677537B - 解联蛋白变体及其药学用途

Info

Publication number: CN101677537B
Application number: CN200780051774.5A
Authority: CN
Inventors: 庄伟哲; 符文美; 黄德富; 黄温雅; 汤智昕; 陈秋月
Original assignee: National Taiwan University NTU; National Cheng Kung University NCKU
Current assignee: National Taiwan University NTU; National Cheng Kung University NCKU
Priority date: 2006-12-26
Filing date: 2007-12-21
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2027-12-21
Also published as: TWI392738B; JP2016047818A; AU2007343734B2; JP2013151502A; JP5908666B2; WO2008088548A3; RU2477727C2; CA2672091A1; EP2124548A4; KR20090108049A; EP2124548B1; RU2012148887A; CN101677537A; US20080188413A1; JP2010514444A; AU2007343734A1; MX2009007065A; AU2007343734A2; WO2008088548A2; NZ598176A

Abstract

本发明披露了解联蛋白变体及其药学用途。所述解联蛋白变体包括具有整联蛋白avβ3受体‑拮抗剂活性且与野生型解联蛋白相比整联蛋白aIIbβ3和/或a5β1受体‑阻断活性大大降低的分离多肽。该变体由编码修饰的氨基酸序列的修饰的解联蛋白核苷酸序列所编码，导致该多肽与野生型解联蛋白相比对整联蛋白aIIbβ3和/或a5β1的亲和性大大减少。所述变体可用于治疗和/或预防哺乳动物中与avβ3整联蛋白相关的疾病，其包括骨质疏松症、骨肿瘤或癌生长、血管生成相关的肿瘤生长和转移、骨内肿瘤转移、恶性肿瘤诱导的高钙血症、血管生成相关的眼部疾病、佩吉特病、风湿性关节炎以及骨关节炎。血管生成相关的眼部疾病包括年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病、角膜新生血管形成病、局部缺血诱导的新血管形成性视网膜病、高度近视以及早产儿视网膜病。

Description

解联蛋白变体及其药学用途

与相关专利申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)主张2006年12月26日提交的美国临时专利申请60/871,854的权利，其内容在此全文引入作为参考。

发明描述

发明领域

本发明总体涉及解联蛋白变体，更具体地说，涉及作为选择性αvβ3整联蛋白拮抗剂，用于治疗和预防αvβ3整联蛋白相关疾病的解联蛋白变体。

发明背景

骨骼是一种由数种细胞类型组成的复杂组织，其持续经历被称为“骨重塑”再生和修复过程。负责骨重塑的两种主要的细胞类型是破骨细胞(吸收骨)和成骨细胞(形成新骨)。已知骨重塑受到数种全身性激素(例如，副甲状腺激素、1，25-二羟基维生素D3、性激素以及降血钙素)和局部因子(例如，一氧化氮、前列腺素、生长因子和细胞因子)的调节[1]。

整联蛋白是异二聚体基质受体，其将细胞锚定至基质，并将外部形成的信号跨过质膜传递[5]。整联蛋白αvβ3在体内[6]和体外[7，8]均牵涉破骨细胞介导的骨吸收。这种异二聚体分子识别包含在骨基质蛋白(如骨桥蛋白和骨涎蛋白)中的氨基酸基序Arg-Gly-Asp(RGD，SEQ ID NO：2)[7，8]。整联蛋白αvβ3在破骨细胞中表达[9]，且其表达受到吸收类固醇和细胞因子的调节[10]。基于阻断试验，αvβ3整联蛋白被鉴定为破骨细胞上主要的功能性粘着受体。整联蛋白αvβ3抑制剂减小了破骨细胞结合和吸收骨的能力[7，11]。整联蛋白αvβ3在破骨细胞的功能中起主要的作用[7，11，12]，而该整联蛋白的抑制剂被认为预防骨质疏松症[11]、溶骨性转移[13]和恶性肿瘤诱导的高钙血症。

许多骨骼疾病与破骨细胞介导的骨质溶解相关。骨质疏松症是最常见的一种，其在骨的吸收和形成不协调，且骨的破坏超过了骨构建时被诱发。骨质疏松症还由其它状况引起，例如激素失衡、疾病或药物(例如，皮质类固醇或抗癫痫药)[2]。骨骼是人乳腺、前列腺、肺和甲状腺癌以及其它癌症最常见的转移部位之一[3，4]。骨质疏松症还由绝经后雌激素缺乏所致。继发性骨质疏松症伴随类风湿性关节炎。骨转移显示了在其它器官转移中未见的破骨性骨吸收的极为独特的步骤。人们已经广泛接受：癌症相关的骨质溶解主要由破骨细胞所介导，破骨细胞似乎被造骨细胞所激活或可被造骨细胞间接激活，或者被肿瘤产物直接激活[4]。此外，高钙血症(血钙浓度增加)是溶骨性疾病的重要并发症。它在具有广泛性骨破坏的患者中相对频繁发生，并在乳腺、肺、肾、卵巢和胰腺癌以及骨髓瘤中特别常见[4]。

解联蛋白是一个特异性结合血小板和其它细胞(包括血管内皮细胞或一些肿瘤细胞)上表达的整联蛋白αllbβ3、α5β1和αvβ3的低分子量含RGD肽家族[14，15]。除了它们有效的抗血小板活性外，对解联蛋白的研究揭示了它们在心血管疾病的诊断以及动脉血栓症、骨质疏松症和血管生成相关的肿瘤生长和转移的治疗剂设计中的新用途[15]。马来亚蝮蛇蛇毒蛋白(Rhodostomin，Rho)是一种源自红口蝮(Colloselasma rhodostoma)的毒液的解联蛋白，已发现它在体内和体外[16，17]通过阻断血小板糖蛋白αllbβ3来抑制血小板凝集。此外，据报导马来亚蝮蛇蛇毒蛋白以剂量依赖型方式抑制乳腺和前列腺癌细胞粘着至未矿化和矿化的骨胞外基质，而不影响肿瘤细胞的生存力。此外，马来亚蝮蛇蛇毒蛋白能够抑制乳腺和前列腺癌细胞的迁移和侵入[18]。另有显示马来亚蝮蛇蛇毒蛋白抑制脂肪形成和肥胖[19]。然而，由于马来亚蝮蛇蛇毒蛋白非特异性结合整联蛋白αllbβ3、α5β1和αvβ3，马来亚蝮蛇蛇毒蛋白的药学使用引起严重的副作用。例如，在使用马来亚蝮蛇蛇毒蛋白治疗癌症时，对血小板凝集的抑制便是不良副作用。

因此，本领域存在解决这些不足和缺陷的需求，特别是对制备特异性选择整联蛋白αvβ3的解联蛋白变体存在需求。

发明概述

根据本发明，本发明的一个方面是对αvβ3整联蛋白具有选择性的多肽。与野生型解联蛋白相比，该多肽显示对αllbβ3和/或α5β1整联蛋白的结合减少。该多肽由编码修饰氨基酸序列的修饰解联蛋白核苷酸序列所编码，并且对αllbβ3和/或α5β1整联蛋白的结合活性降低。该多肽可被聚乙二醇化(pegylated)或与白蛋白缀合。

所述解联蛋白核苷酸序列可来自于蛇毒液。该解联蛋白可选自马来亚蝮蛇蛇毒蛋白、白唇竹叶青素(albolabrin)、食鱼蝮素(applagin)、墨西哥西海岸响尾蛇素(basilicin)、大具窍蝮蛇素(batroxostatin)、扁头腹蛇素(bitistatin)、亚利桑那黑响尾蛇素(cereberin)、角响尾蛇素(cerastin)、西部菱背响尾蛇素(crotatroxin)、南美响尾蛇素(durissin)、华丽蛇毒素(elegantin)、黄绿竹叶青蛇素(flavoridin)、黄绿竹叶青抑制素(flavostatin)、白眉蝮素(halysin)、哈里氏蝮抑制素(halystatin)、美洲矛头蝮蛇素(jararacin)、美洲矛头蝮蛇抑制素(jarastatin)、蝮蛇毒素(kistrin)、叶林腹素(lachesin)、大盆地响尾蛇素(lutosin)、黑尾响尾蛇素(molossin)、白眉蝮蛇素(salmosin)、哈里氏蝮素(saxatilin)、大草原响尾蛇素(tergeminin)、黄绿竹叶青蛇毒素(trimestatin)、原矛头蝮素(trimucrin)、原矛头蝮素酶(trimutase)、乌苏里蝮蛇素(ussuristatin)和霍皮响尾蛇素(viridin)。

本发明的另一方面是多肽，其为马来亚蝮蛇蛇毒蛋白的变体，其中该马来亚蝮蛇蛇毒蛋白包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

本发明的另一方面是包含选自SEQ ID NO：30-42的氨基酸的多肽。

本发明的另一方面是包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的多肽，其进一步包含在对应SEQ ID NO：1的氨基酸48、50、52或53的位置上的四个氨基酸置换中的一个、两个、三个。

本发明的另一方面是包含氨基酸置换的多肽，所述氨基酸置换选自SEQ ID NO：1位置48上的Ala，位置50上的Leu、Ile和His，位置52上的Asp、Met和Asn，以及位置53上的Val、Leu和Met。

本发明的另一方面是由选自SEQ ID NO：43-56的核苷酸序列编码的多肽。

本发明的另一方面是多肽，与马来亚蝮蛇蛇毒蛋白相比，其对αllbβ3和/或α5β1的亲和性降低至少约5、50或100倍。在本发明的一个实施方式中，与马来亚蝮蛇蛇毒蛋白相比，该多肽对αllbβ3和/或α5β1整联蛋白的亲和性降低至少约200倍。在本发明的另一个实施方式中，与马来亚蝮蛇蛇毒蛋白相比，该多肽对αllbβ3和/或α5β1整联蛋白的亲和性降低至少约1000或2000倍。在本发明的另一个实施方式中，与马来亚蝮蛇蛇毒蛋白相比，该多肽对血小板的亲和性降低至少约5、50、100、1000或2000倍。在本发明的另一个实施方式中，与马来亚蝮蛇蛇毒蛋白和/或野生型解联蛋白相比，该多肽在延长凝血时间方面显示显著降低的活性。

本发明的另一方面是包含本发明多肽和药学上可接受载体的生理上可接受的组合物。

本发明的另一方面是包含选自SEQ ID NO：57-69的氨基酸序列的多肽。

本发明的另一方面是使用解联蛋白变体治疗和/或预防哺乳动物(包括人)中αvβ3整联蛋白相关疾病的方法。该方法包括对有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的解联蛋白变体的步骤。在该方法中采用的多肽可被聚乙二醇化或与白蛋白缀合。

在本发明的一个方面，该解联蛋白可源自蛇毒液，并可选自如下之一：马来亚蝮蛇蛇毒蛋白、白唇竹叶青素、食鱼蝮素、墨西哥西海岸响尾蛇素、大具窍蝮蛇素、扁头腹蛇素、亚利桑那黑响尾蛇素、角响尾蛇素、西部菱背响尾蛇素、南美响尾蛇素、华丽蛇毒素、黄绿竹叶青蛇素、黄绿竹叶青抑制素、白眉蝮素、哈里氏蝮抑制素、美洲矛头蝮蛇素、美洲矛头蝮蛇抑制素、蝮蛇毒素、叶林腹素、大盆地响尾蛇素、黑尾响尾蛇素、白眉蝮蛇素、哈里氏蝮素、大草原响尾蛇素、黄绿竹叶青蛇毒素、原矛头蝮素、原矛头蝮素酶、乌苏里蝮蛇素和霍皮响尾蛇素。

在本发明的一个方面，该解联蛋白是马来亚蝮蛇蛇毒蛋白。

在本发明的另一方面，该马来亚蝮蛇蛇毒蛋白包括含有SEQ IDNO：1的氨基酸序列的马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体。

在另一方面，该马来亚蝮蛇蛇毒蛋白包含具有选自SEQ ID NOs：30-42的氨基酸的RGD基序变体。

在另一方面，该马来亚蝮蛇蛇毒蛋白包含选自SEQ ID NOs：57-69的氨基酸。

在本发明的一个方面，所述αvβ3整联蛋白相关的疾病包括但不限于骨质疏松症、骨肿瘤或癌生长及其相关症状、血管生成相关的肿瘤生长和转移、骨内肿瘤转移、恶性肿瘤诱导的高钙血症、血管生成相关的眼部疾病、佩吉特病、风湿性关节炎以及骨关节炎。

在本发明的另一方面，本发明的多肽用于治疗和/或预防血管生成相关的眼部疾病，其包括但不限于年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病、角膜新生血管形成病(corneal neovascularizing diseases)、局部缺血诱导的新血管形成性视网膜病(ischaemia-induced neovascularizingretinopathy)、高度近视以及早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity)。

在本发明的另一方面，本发明的多肽用于治疗和/或预防骨质疏松症。该骨质疏松症可与选自如下的病理状态相关：绝经后雌激素缺乏、继发性骨质疏松症、类风湿性关节炎、卵巢切除、佩吉特病、骨癌、骨肿瘤、骨关节炎、破骨细胞形成增加以及破骨细胞活性增加。此外，该骨质疏松症包括但不限于卵巢切除诱导的或是绝经后的骨质疏松症或骨丧失(bone loss)。

本发明的另一方面是使用本发明的多肽治疗和/或预防哺乳动物(包括人)中卵巢切除诱导的生理变化的方法。

本发明的另一方面是使用解联蛋白变体抑制和/或防止哺乳动物(包括人)中骨内肿瘤细胞生长及其相关症状的方法。

本发明的另一方面是制备本发明的多肽的方法，该方法包括如下步骤：(a)用编码所述多肽的多核苷酸转染宿主细胞；(b)使所述宿主细胞在培养基内生长；并分离所述多肽。本发明的方法可进一步包括使宿主细胞在不含氨基酸的培养基内生长；并收集上清液，以获得所述的多肽。该方法可进一步包括向该培养基添加甲醇，以诱导该多肽在宿主细胞中的表达。该方法可进一步包括进行色谱柱色谱，以获得所述多肽的步骤。在一个实施方式中，该方法可进一步包括进行HPLC，以获得分离的多肽的步骤。

本发明的另一方面是编码对αvβ3整联蛋白具有选择性的多肽的多核苷酸，其中该多肽可以是从蛇毒液分离的解联蛋白的变体。

在本发明的另一方面，该解联蛋白选自马来亚蝮蛇蛇毒蛋白、白唇竹叶青素、食鱼蝮素、墨西哥西海岸响尾蛇素、大具窍蝮蛇素、扁头腹蛇素、亚利桑那黑响尾蛇素、角响尾蛇素、西部菱背响尾蛇素、南美响尾蛇素、华丽蛇毒素、黄绿竹叶青蛇素、黄绿竹叶青抑制素、白眉蝮素、哈里氏蝮抑制素、美洲矛头蝮蛇素、美洲矛头蝮蛇抑制素、蝮蛇毒素、叶林腹素、大盆地响尾蛇素、黑尾响尾蛇素、白眉蝮蛇素、哈里氏蝮素、大草原响尾蛇素、黄绿竹叶青蛇毒素、原矛头蝮素、原矛头蝮素酶、乌苏里蝮蛇素和霍皮响尾蛇素。

在本发明的另一方面，该解联蛋白包括马来亚蝮蛇蛇毒蛋白。

在本发明的另一方面，该解联蛋白包括含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体。

在本发明的另一方面，该多肽包含具有选自SEQ ID NO：30-42的氨基酸序列的RGD基序变体。

在本发明的另一方面，该多核苷酸包含选自SEQ ID NO：43-56和78-135的序列。

在本发明的另一方面，该多核苷酸可编码具有在对应SEQ ID NO：1的氨基酸48、50、52或53的位置上的四个氨基酸置换中的一个、两个、三个的多肽。

本发明的另一方面是在严格条件下与本发明的多核苷酸杂交的多核苷酸。

本发明的另一方面是由与本发明的多核苷酸序列杂交的多核苷酸编码的多肽。

这些以及其它方面将通过下文结合以下附图对各种实施方式的描述，而变得显而易见，尽管其中的变化和修改可受到影响，但不脱离本发明所披露的新概念的精神和范围。

附图说明了本发明的一个或多个实施方式，其与说明书一起用于解释本发明的原理。

本发明的其它的目的和优点将部分列举在以下的说明书中，部分将通过说明书显而易见，或可通过本发明的实践认识到。本发明的目的和优点将通过所附权利要求书中具体指出的要素及其组合来实现或得到。

应当理解，上文的一般描述和下文的详细描述均为示例性的，仅用于解释，并不对所主张的本发明构成限制。

并入说明书并构成本说明书的一部分的附图图示了本发明的实施方式，并与说明书一起解释了本发明的原理。

附图简述

图1显示了RD和HAS-RD和ARLDDL比马来亚蝮蛇蛇毒蛋白对小鼠中的出血时间具有更小的影响。

图2A是小梁骨(trabecular bone)的照片，其显示了用PGP蛋白治疗的大鼠中对卵巢切除诱导的小梁骨丧失的抑制。横条(bar)＝1mm。

图2B是抗酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)染色的小梁骨的照片，其显示了用PGP蛋白治疗的大鼠中对卵巢切除诱导的破骨细胞数目上升的抑制。横条＝100mm。

图3是显示用RD蛋白或阿伦膦酸盐(药物治疗)治疗的大鼠中对卵巢切除诱导的破骨细胞激活的抑制，在停药期间破骨细胞标记浓度的反弹，以及重新施用RD或阿伦膦酸盐过程中卵巢切除诱导的破骨细胞活性上升的逆转的图。

图4A-4D是番红-O和苏木精染色的膝关节的照片，其显示了用RD蛋白治疗的关节炎大鼠中对软骨细胞层破坏的抑制。箭头指示软骨细胞层。

图5A-5C是显示用RD蛋白治疗的骨关节炎大鼠中对血液细胞因子升高的抑制的图。

图6A-6C是显示用RD蛋白治疗的骨关节炎小鼠中对血液细胞因子升高的抑制的图。[051]图7是显示用RD蛋白(但不用阿伦膦酸盐)治疗的SCID小鼠中对PC-3骨肿瘤生长的抑制的图。

图8是显示用RD蛋白治疗的SCID小鼠中对肿瘤诱导的体重下降的抑制的图。

图9A是显示在胫骨内注射PC-3细胞后，在每条腿的胫骨近端中的可视球形肿瘤生长(在中间图(middle panel)中以箭头指示)以及用RD蛋白治疗的SCID小鼠中对骨肿瘤生长的抑制的照片。

图9B为胫骨的放射照片，其显示了用RD蛋白治疗的SCID小鼠中对PC-3肿瘤细胞诱导的溶骨性骨损害的抑制。

图9C是对图9B中数据进行定量的图，其显示了用RD蛋白治疗的SCID小鼠中对PC-3肿瘤诱导的骨质溶解的抑制。

图9D是显示用RD蛋白治疗的SCID小鼠中对PC-3肿瘤诱导的I型胶原C-末端端肽增加的抑制的图。

图9E是显示用RD蛋白或阿伦膦酸盐治疗的SCID小鼠中对PC-3肿瘤诱导的血清钙浓度上升的抑制的图。

图10A是显示用RD蛋白治疗的裸鼠中对MDA-MB-231骨肿瘤生长的抑制的图。

图10B是显示用RD蛋白治疗的裸鼠中对MDA-MB-231骨肿瘤诱导的I型胶原C-末端端肽增加的抑制的图。

图10C是显示用RD蛋白治疗的裸鼠中对MDA-MB-231骨肿瘤诱导的高钙血症的抑制的图。

图10D是显示在注射MDA-MB-231细胞并用RD蛋白治疗的裸鼠中白细胞计数无变化的图。

图10E是显示在注射MDA-MB-231细胞并用RD蛋白治疗的裸鼠中红细胞计数无变化的图。

图10F是显示在注射MDA-MB-231细胞并用RD蛋白治疗的裸鼠中血小板计数无变化的图。

图11A是显示与未治疗的对照小鼠相比，来自用RD蛋白或RD-白蛋白(HSA-RD)治疗的C57BL/6小鼠的MATRIGEL^TM plugs中血管密度减少的照片。

图11B是显示与未治疗的对照小鼠相比，来自用RD(每天-RD/1d或隔天-RD/2d)或RD-白蛋白(HSA-RD-隔天)蛋白治疗的C57BL/6小鼠的MATRIGEL^TM plugs中血红蛋白含量减少的图。

图12A是显示早产儿视网膜病(ROP)小鼠模型中的血管生成，以及用RD蛋白治疗的ROP小鼠(ROP+RD)中血管生成减少的照片。箭头指示血管轮廓(blood vessel profiles，BVPs)。

图12B是显示用RD蛋白治疗的早产儿视网膜病(ROP)小鼠模型中 BVP减少的图。

图13A是显示用RD蛋白或RD-白蛋白治疗的小鼠中对卵巢切除诱导的破骨细胞激活的抑制的图。

图13B是显示用RD蛋白或RD-白蛋白治疗的小鼠中对卵巢切除诱导的碱性磷酸酶(ALP)失活的抑制的图。

图13C是显示对卵巢切除诱导的BMD下降的抑制的图。

图13D是显示对卵巢切除诱导的BMC下降的抑制的图。

图14A-D显示马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体的氨基酸序列SEQ ID NO：1和57-69。

图15A-C显示马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体的核苷酸序列SEQ ID NO：43-56。

图16A-H显示解联蛋白变体的氨基酸和核苷酸序列SEQ ID NO：78-135。

发明详述

本发明在如下的实施例中得到更具体的描述，所述实施例仅作阐述之用，因为其中的多种修改和变化将对本领域技术人员而言是显而易见的。现在对本发明的各个实施方式进行详细描述。在说明书和所附整个权利要求书中所用的“一个”、“一种”和“该”包括复数指称，除非上下文明确地另行指出。此外，在说明书和所附整个权利要求书中所用的“在...中”的含义包括“在...内”和“在...上”，除非上下文明确地另行指出。此外，在本说明书中所用的一些术语在下文进行更具体的定义。在本说明书中所引用和讨论的所有参考文献均全文引入作为参考，其引用程度如同每篇参考文献单独引入作为参考。

现在将详细提及本发明包括的实施方式(示例性实施方式)，其实施例在附图中得到举例说明。

定义

在本发明的上下文中以及在使用每个术语的特定的上下文中，本说明书中所用的术语通常具有其在本领域的普通含义。用于描述本发明的某些术语在下文中或本说明书的其它部分进行讨论，以为实践者就本发明的描述提供附加的指导。提供某些术语的同义词。对一个或多个同义词的列举不排除其它同义词的使用。本说明书任意部分对实例(包括本文讨论的任意术语的实例)的使用仅供阐述之用，不以任何方式限制本发明或任意示例性术语的范围和含义。本发明不限于本说明书中所给的各种实施方式。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。在产生冲突时，以本文件(包括定义)为准。

“左右”、“约”或“大约”一般指在给定值或范围的20％以内，10％以内，5％、4％、3％、2％或1％以内。若无明确说明，所给出的数量为近似值，意味着可推出术语“左右”、“约”或“大约”。

术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”可互换使用，指任意长度的核苷酸多聚体形式。多核苷酸可包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物或衍生物。该术语包括变体。变体可包括插入、添加、删除或置换。核苷酸序列以5′至3′方向列出。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可互换使用，指任意长度的氨基酸的多聚体形式，其可包含天然存在的氨基酸；编码和非编码氨基酸；化学或生物化学修饰、衍生或设计的氨基酸；氨基酸类似物；肽模拟物和酯肽，以及具有修饰的、环状、二环状、酯环状(depsicyclic)的或酯二环状(depsibicyclic)肽骨架的多肽。该术语包括单链蛋白和多聚体。该术语还包括与标记缀合的蛋白，该标记例如为FITC、生物素和放射性同位素，包括但不限于⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁹⁰Y、⁹⁹mTc、¹¹¹In、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹³⁷Cs、¹⁸⁶Re、²¹¹At、²¹²Bi、²¹³Bi、 ²²³Ra、²⁴¹Am和²⁴⁴Cm；具有可检测产物的酶(例如萤光素酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶等)；荧光剂和荧光标记、荧光发射金属(例如， ¹⁵²Eu或其它的镧系元素)、电化学发光化合物、化学发光化合物(例如，鲁米诺、异鲁米诺或吖啶盐)；特异性结合分子，例如磁性颗粒、微球、纳米球等。该术语还包括与治疗剂缀合的肽。

该术语还包括融合蛋白，其包括但不限于谷胱甘肽S转移酶(GST)融合蛋白、与异源性氨基酸序列如生物发光蛋白(例如，萤光素或水母素(绿色荧光蛋白))的融合蛋白、与异源性和同源性前导序列的融合蛋白、具有或不具有N末端蛋氨酸残基的融合蛋白、聚乙二醇化蛋白以及免疫标记的或是his标记的蛋白。此类融合蛋白还包括与表位的融合。此类融合蛋白可包含本发明的肽的多聚体，例如同源二聚体或同源多聚体，以及异源二聚体和异源多聚体。该术语还包括肽适体。

有关多核苷酸的上下文中的术语“特异性杂交”指在严格条件下杂交。增加DNA/DNA和DNA/RNA杂交反应的严格性的条件是众所周知的，并已在本领域公开。严格杂交条件的实例包括在4X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，在约65-70℃下杂交，或在4X SSC加上50％甲酰胺中，在约42-50℃下杂交，然后在约65-70℃下在1X SSC中洗涤一次或多次。

术语“配体”指与另一分子(包括受体)结合的分子。

“宿主细胞”是可作为或已作为任意重组载体或多核苷酸接受者的单个细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单种宿主细胞的后代，且该后代由于天然的、偶然的或是有意的突变和/或变化而可能不必要与原始的亲代细胞完全一致(在形态学或在总DNA补体方面)。宿主细胞包括在体内或体外用本发明的重组载体或多核苷酸转染或感染的细胞。包含本发明的重组载体的宿主细胞可被称为“重组宿主细胞”。

“治疗”涵盖了在哺乳动物(包括人)中对疾病的药物治疗(remedies)的任意施用或应用，并包括通过例如引起丧失、缺失或缺陷功能的复原或者恢复或修复，或者刺激无效过程来抑制该疾病，遏止其进展或者缓解该疾病。该术语包括获得所需的药理和/或生理学效应，涵盖了在哺乳动物(包括人)中对病理状况或病症的任意治疗。该效应可以是预防性的(就完全或部分防止病症或其症状而言)和/或治疗性的(就部分或完全治愈病症和/或对抗由该病症导致的作用而言)因此，本发明同时提供了治疗和预防。它包括(1)在可能具有该病症先兆但仍未显现症状的对象中防止病症发作或复发，(2)抑制该病症，例如遏止其进展，(3)通过例如恢复或修复丧失、缺失或缺陷功能，或者刺激无效过程，停止或终止该病症或至少它的相关症状，例如停止或终止该疾病或其症状的进展，从而使该宿主不再遭受该种病症或其症状，或(4)减轻、缓解或改善该病症或与之相关的症状，其中改善采用其广义，表示在至少对一项参数(例如，炎症、疼痛和/或肿瘤大小)的数量级的减小。

“药学上可接受的载体”指任意常规类型的无毒性的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、胶囊材料、制剂辅助物质或赋形剂。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下对接受者无毒性，并与该制剂中的其它成分相容。

“组合物”指通常包含载体(例如本领域常规的药学上可接受的载体或赋形剂)并适于因治疗、诊断或预防目而施用至对象的混合物。它可包含细胞培养物，其中多肽或多核苷酸存在于细胞或培养基中。例如，口服施用的组合物可形成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂、漱口剂或散剂。

“疾病”指需要医疗干预或希望进行医疗干预的任意病状、感染、病症或综合征。这种医疗干预可包括治疗、诊断和/或预防。肽

本发明的肽可使用本领域已知的方法进行表达。基于细胞的方法和无细胞方法适用于生成本发明的肽。基于细胞的方法通常涉及将核酸构建体体外导入宿主细胞，并在适于表达的条件下培养该宿主细胞，然后从培养基或从宿主细胞(例如，通过破碎该宿主细胞)或同时从两者收获该肽。本发明还提供了使用无细胞的体外转录/翻译方法来生成肽的方法，该方法已为本领域公知。

合适的宿主细胞包括原核或真核细胞，包括例如细菌、酵母、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞。

典型地，修饰或未修饰的异源肽可按如上所述在其自身表达，或者作为融合蛋白表达，且不仅可以包含分泌信号，而且包含分泌型前导序列。本发明的分泌型前导序列可将某些蛋白导向内质网(ER)。ER将膜结合的蛋白与其它蛋白分离。一旦定位至ER，蛋白可被进一步导向高尔基体，用于分布至囊泡(包括分泌囊泡)、质膜、溶酶体和其它细胞器。

此外，肽部分(peptide moieties)和/或纯化标记可被添加至该肽中。此类区域可在该多肽的最终制备之前被去除。为了产生分泌或排泄、提高稳定性和促进纯化等原因将肽部分添加至多肽中，这些已为本领域熟知，并且是常规技术。合适的纯化标记包括例如V5、多组氨酸(polyhistidine)、抗生物素蛋白和生物素。可使用本领域公知的技术来实现肽与化合物(如生物素)的缀合。(Hermanson编(1996)Bioconjugate Techniques；AcademicPress)。还可使用本领域已知的技术将肽与放射性同位素、毒素、酶、荧光标记、胶体金、核酸、长春瑞滨以及多柔比星缀合。(Hermanson编(1996)Bioconjugate Techniques；Academic Press；Stefano等人(2006)。

适用于本发明的融合伙伴(fusion partner)包括例如胎球蛋白、人血清白蛋白、Fc和/或一种或多种它们的片段。还提供了缀合蛋白，例如聚乙二醇缀合物。

还可采用本领域已知的技术化学合成本发明的肽(例如，参见Hunkapiller等人，Nature，310：105 111(1984)；Grant编(1992)SyntheticPeptides，A Users Guide，W.H.Freeman and Co.；美国专利6,974,884))。例如，对应于多肽片段的多肽可通过采用肽合成仪或通过采用本领域已知的固相方法来合成。

此外，如果需要，可将非经典(nonclassical)氨基酸或化学氨基酸类似物作为替换或添加导入多肽序列中。非经典氨基酸包括但不限于常见氨基酸的D-异构体、2，4-二氨基丁酸、a-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、g-Abu、e-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、b-丙氨酸、氟-氨基酸、设计的氨基酸如b-甲基氨基酸、Ca-甲基氨基酸、Na-甲基氨基酸以及通常的氨基酸类似物。此外，该氨基酸可以是D(右旋性的)或L(左旋性的)。

本发明的多肽可通过标准方法从化学合成和重组细胞培养中回收和纯化，所述标准方法包括但不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱以及外源凝集素色谱。在一个实施方式中，采用了高效液相色谱(″HPLC″)进行纯化。当多肽在分离和/或纯化过程中变性时，可采用公知的重折叠蛋白技术来使活性构象再生。

本发明的肽或肽模拟物可用一种或多种各类亲水聚合物进行修饰或与之共价偶联，以提高该肽的溶解性和循环半衰期。可与肽偶联的合适的非蛋白质亲水聚合物包括但不限于聚烷基醚(如聚乙二醇和聚丙二醇)、聚乳酸、聚羟乙酸、聚氧基烯烃、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素和纤维素衍生物、葡萄糖以及葡萄糖衍生物。一般而言，此类亲水聚合物具有约500-约100,000道尔顿、约2000-约40,000道尔顿或约5,000至约20,000道尔顿的平均分子量。该肽可通过如下参考文献列举的任意方法用此类聚合物衍生或与之偶联：Zallipsky，S.(1995)Bioconjugate Chem.，6：150-165；Monfardini，C，等人(1995)Bioconjugate Chem.6：62-69；美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；4,179,337或WO95/34326。

在一些实施方式中，在与其中众多种类为本领域已知的药学上可接受载体、赋形剂和稀释剂的制剂中提供本发明的肽。这些药物载体、赋形剂和稀释剂包括在USP药物赋形剂清单中所列举的那些。USP和NF赋形剂列举于Categories，第2404-2406页，USP 24 NF19，United StatesPharmacopeial Convention Inc.，Rockville，Md.(ISBN 1-889788-03-1)。药学上可接受的赋形剂，例如载体、佐剂、运载体或稀释剂可被公众容易地获取。此外，药学上可接受的辅助性物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、润湿剂等，可被公众容易地获取。

合适的载体包括但不限于水、葡萄糖、甘油、盐水、乙醇及其组合。载体可包含额外的试剂，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂或增强制剂效力的佐剂。具体载体包括液体石蜡、棕榈酸异丙酯、聚乙二醇、乙醇(95％)、含于水中的单月桂酸聚氧化乙烯酯(5％)或含于水中的月桂基硫酸钠(5％)。其它物质如抗氧化剂、保湿剂、粘度稳定剂以及类似的试剂可按需添加。还可包含诸如氮酮等经皮渗透增强剂。

在药物剂型中，本发明的组合物可以其药学上可接受的盐的形式施用，或者它们还可单独使用或适当联用以及与其它药物活性化合物联用。可根据可能的给药模式配制本主题组合物(the subject compositions)。治疗方法

αvβ3整联蛋白相关的疾病包括但不限于骨质疏松症、骨肿瘤或癌生长及其相关症状、血管生成相关的肿瘤生长和转移、骨内肿瘤转移、恶性肿瘤诱导的高钙血症、血管生成相关的眼部疾病、佩吉特病、风湿性关节炎以及骨关节炎。

可例如通过全身注射(例如通过静脉注射)或通过向相关部位注射或施用(例如当该部位在手术中暴露时通过直接注射或直接施用至该部位)或通过局部施用(例如，如果该病症在皮肤上)将本发明的肽施用至需要治疗的对象。

本发明的肽可作为单一疗法使用。或者，本发明的肽可与标准方案联用，以治疗αvβ3整联蛋白相关疾病。

该药剂的施用可通过多种途径实现，包括口服、口腔、鼻部、直肠、肠胃外、腹膜内、皮肤内、透皮、皮下、静脉内、动脉内、心脏内、室内、颅内、气管内和囊内施用等，或者通过植入或吸入施用。因此，可将本主题组合物配制为固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊、散剂、颗粒、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。以下方法和赋形剂仅供示例，绝非构成限制。

合适的赋形剂载体例如为水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，或其组合。此外，如果需要，载体可含有少量的辅助性物质，例如润湿剂或乳化剂，或者pH缓冲剂。制备此类剂型的实际方法已为本领域技术人员所知，或对其将是显而易见的。在任意情况下，待施用的组合物或制剂将包含一定量的药剂，其足以在受治疗对象中实现所需状态。

可通过将其溶解、悬浮或乳化于水性或非水性溶剂(例如植物油或其它类似的油、合成的脂族酸甘油酯、更高级脂族酸的酯或丙二醇)将本发明的肽配制入注射用制剂；需要时与常规的添加剂，例如增溶剂、等张剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂一起配制。也可使用本领域常规的用于口服或肠胃外传递的其它制剂。

“解联蛋白”指可从蛇毒液纯化得到的多肽家族，其包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列。不受任何理论或机制的束缚，据信该RGD三肽以高亲和性结合整联蛋白，以阻断整联蛋白与含RGD蛋白的相互作用。因此解联蛋白阻断粘着功能，并充当血小板凝集抑制剂。

缩写“Rho”表示“马来亚蝮蛇蛇毒蛋白”，它是一种源自红口腹(Colloselasmarhodostoma)毒液的解联蛋白。马来亚蝮蛇蛇毒蛋白非特异性结合于整联蛋白αllbβ3、α5β1和αvβ3，并通过阻断血小板糖蛋白αllbβ3抑制血小板凝集，从而延长凝血时间。

“解联蛋白变体”或“马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体”指包含从野生型解联蛋白(如马来亚蝮蛇蛇毒蛋白)衍生或修饰或突变得到的氨基酸序列的功能活性蛋白或多肽或其任意衍生物。功能活性解联蛋白/马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体可特异性结合整联蛋白αvβ3并抑制其活性。本发明的解联蛋白或马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体可通过适于本发明目的的任意方法进行构建，在一个实施方式中通过定点突变方法，在另一实施方式中通过聚合酶链反应法。变体可包括与主题肽(the subject peptides)相比的插入、添加、删除或置换。多肽序列的变体包括生物活性多形态变体。

本发明的肽可包含天然存在的或非天然存在的氨基酸。肽可包含D-氨基酸、D-和L-氨基酸的组合、以及各种“设计”或“合成”氨基酸(例如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸以及Nα-甲基氨基酸等)，以赋予特殊的性能。此外，肽可以是环状的。肽可包含非经典氨基酸，以便导入特定的构象基序。任意已知的非经典氨基酸均可使用。氨基酸类似物和肽模拟物可被整合进入肽中，以引入或促成特异性二级结构，所述氨基酸类似物和肽模拟物包括但不限于LL-Acp(LL-3-氨基-2-丙二酮(propenidone)-6-羧酸)、诱导二肽类似物的β-转角(β-turn)；诱导类似物的β-折叠；诱导类似物的β-转角；诱导类似物的α-螺旋；诱导类似物的γ-转角；Gly-Ala转角类似物；酰胺键等排体(isostere)；或者四氮唑(tretrazol)等。

可在肽末端结合去氨基或去羧基残基，以使不存在末端氨基或羧基基团，以降低对蛋白酶的易感性或限制构象。C-末端官能团包括酰胺、酰胺低级烷基、酰胺二(低级烷基)、低级烷氧基、羟基和羧基，及其低级酯衍生物，及其药学上可接受的盐。

术语“IC₅₀”或“半最大抑制浓度”指50％抑制其受体所需的Rho或其变体的浓度。IC₅₀是对50％抑制生物过程(例如该变体对其受体的亲和性)所需的Rho或其变体的量的一种量度，。

所用的术语“治疗有效量”指施用至存活体对象时在该活体对象中达到所需效果的量。例如，向活体对象施用的本发明的解联蛋白或Rho变体的有效量是预防和/或治疗整联蛋白αvβ3-介导的疾病的量。确切的量将取决于治疗目的，并将由本领域技术人员使用已知技术加以确定。如本领域所知，根据全身传递与局部传递、年龄、体重、一般健康、性别、饮食、施用时间、药物相互作用以及病症的严重性的调整可能是必须的，并将由本领域技术人员通过常规实验来确定。

术语“受体拮抗剂”指受体的结合配体，其通过阻断激动剂与受体结合，或者通过允许激动剂结合但抑制激动剂激活受体的能力，来抑制该受体的功能。

术语“实质上减少的整联蛋白αllbβ3和/或α5β1受体阻断活性”指与野生型马来亚蝮蛇蛇毒蛋白或其它解联蛋白相比，其阻断整联蛋白αllbβ3和/或α5β1受体的活性至少降低五倍。例如，为了计算αllbβ3和/或α5β1受体阻断活性的降低，可将马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体抑制整联蛋白αllbβ3和/或α5β1结合基质蛋白(例如，纤维原蛋白)的IC₅₀与Rho的IC₅₀相比较。

术语“RGD基序变体”指在相应的野生型序列的横跨RGD序列的氨基酸序列(例如包含马来亚蝮蛇蛇毒蛋白中RGD的序列)中包含修饰的肽。“RGD基序变体”的实例包括⁴⁸ARGDDP⁵³、⁴⁸PRLDMP⁵³、⁴⁸PRIDMP⁵³和⁴⁸ARLDDL⁵³。

术语“RD”指具有RGD基序变体⁴⁸PRLDMP⁵³的马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体。

术语“PGP”指具有RGD基序变体⁴⁸PRGDGP⁵³的马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体。

术语ARLDDL指具有RGD基序变体⁴⁸ARLDDL⁵³的马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体。

术语“相对于αllbβ3和/或α5β1受体的对整联蛋白αvβ3的抑制选择性”指变体相对于αllbβ3和/或α5β1受体的对整联蛋白αvβ3的结合选择性，其表示为该变体抑制αllbβ3和/或α5β1受体的IC₅₀与抑制αvβ3受体的IC₅₀的比率。

术语“在延长出血时间方面的实质上降低的活性”指通过本说明书中所述的出血时间实验所测得的抑制凝血的能力以统计学显著方式降低。

术语“聚乙二醇化-RD”指RD蛋白的聚乙二醇化产物。

术语“白蛋白-RD或HAS-RD”指RD蛋白的人白蛋白缀合产物。

发明综述

本发明涉及解联蛋白变体，其为选择性αvβ3整联蛋白拮抗剂。解联蛋白变体(如RD-相关化合物)有效抑制体外破骨细胞分化。在动物研究中它们还抑制破骨细胞吸收活性和卵巢切除诱导的破骨细胞形成的增加。此外，RD抑制骨中人前列腺和乳腺癌细胞的肿瘤生长。恶性肿瘤诱导的高钙血症同样可被RD-相关的蛋白所有效阻滞。佩吉特病(也称为变形性骨炎)是一种慢性骨病症，其通常由于骨组织的不规则破坏和形成而导致骨骼扩大和变形。二膦酸盐已被批准用于治疗佩吉特病。骨关节炎还与破骨细胞活性增加有关。基于类似的作用机制，RD衍生物也应对这些骨病症的治疗有效。以30mg/kg的极大剂量静脉注射RD或PGP未影响小鼠的存活(n＝3)。此外，长期施用PGP(I.V.，0.5mg/kg/天)6周未影响肌酸酐、GOT和GPT的血清水平，显示对肾和肝没有副作用。因此，RD及其衍生物是治疗骨质疏松症、骨肿瘤、恶性肿瘤诱导的高钙血症、佩吉特病、风湿性关节炎、骨关节炎以及血管生成相关的眼部疾病的潜在药物候选物。

多类蛇毒液含有包含RGD结构域的蛋白。这些含RGD结构域的蛋白被称为解联蛋白。在跨RGD结构域序列中的修饰导致极为独特的多肽变体，其对其它类整联蛋白的结合亲和性降低，但对αvβ3整联蛋白的选择性增加。该解联蛋白变体(包括马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体)被证明是骨质疏松症、骨中肿瘤生长抑制以及血管生成相关的眼部疾病等的潜在治疗候选物。此外，具有含至少一个氨基酸置换的RGD-基序区的解联蛋白变体(包括马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体)可以是开发αvβ3整联蛋白的选择性拮抗剂的有价值工具。

本发明的一个方面是具有αvβ3整联蛋白受体-拮抗剂活性和与野生型解联蛋白相比αllbβ3和/或α5β1整联蛋白受体-阻断活性降低的多肽。该多肽由编码修饰氨基酸序列的修饰解联蛋白核苷酸序列所编码，该核苷酸序列导致具有整联蛋白αllbβ3和/或α5β1受体-阻断活性充分降低的多肽。该多肽可被聚乙二醇化或与白蛋白缀合。

该解联蛋白核苷酸序列可来自于蛇毒液。根据本发明，解联蛋白包括但不限于白唇竹叶青素(albolabrin)(白唇竹叶青蛇，Cryptelytropsalbolabris)、食鱼蝮素(applagin)(食鱼蝮，Agkistrodon piscivorus piscivorus)、墨西哥西海岸响尾蛇素(basilicin)(墨西哥西海岸响尾蛇，Crotalusbasiliscus)、大具窍蝮蛇素(batroxostatin)(大具窍蝮蛇，Bothrops atrox)、扁头腹蛇素(bitistatin)(扁头腹蛇，Bitis arietans)、亚利桑那黑响尾蛇素(cereberin)(亚利桑那黑响尾蛇，Crotalusoreganus cerberus)、角响尾蛇素(cerastin)(角响尾蛇，Crotalus cerastes cerastes)、西部菱背响尾蛇素(crotatroxin)(西部菱背响尾蛇，Crotalus atrox)、南美响尾蛇素(durissin)(南美响尾蛇，Crotalus durissus durissus)、华丽蛇毒素(elegantin)(华丽蛇，Protobothrops elegans)、黄绿竹叶青蛇素(flavoridin)(黄绿竹叶青，Trimeresurusflavoviridis)、黄绿竹叶青抑制素(flavostatin)(黄绿竹叶青，Trimeresurusflavoviridis)、白眉蝮素(halysin)(白眉蝮，Gloydius blomhoffi)、哈里氏蝮抑制素(halystatin)(哈里氏蝮，Gloydius halys)、美洲矛头蝮蛇素(jararacin)(美洲矛头蝮蛇，Bothrops jararaca)、美洲矛头蝮蛇抑制素(jarastatin)(美洲矛头蝮蛇，Bothropsjararaca)、蝮蛇毒素(kistrin)(红口腹，Calloselasma.rhodostoma)、叶林腹素(lachesin)(叶林腹蛇，Lachesismuta muta)、大盆地响尾蛇素(lutosin)(大盆地响尾蛇，Crotalus oreganuslutosus)、黑尾响尾蛇素(molossin)(黑尾响尾蛇，Crotalusmolossusmolossus)、白眉蝮蛇素(salmosin)(白眉蝮蛇，Gloydiusblomhoffibrevicaudus)、哈里氏蝮素(saxatilin)(哈里氏蝮，Gloydius halys)、大草原响尾蛇素(tergeminin)(大草原响尾蛇，Sistrurus catenatus tergeminus)、黄绿竹叶青蛇毒素(trimestatin)(黄绿竹叶青，Trimeresurus flavoviridis)、原矛头蝮素(trimucrin)(原矛头蝮，Protobothrops mucrosquamatus)、原矛头蝮素酶(trimutase)(原矛头蝮，Protobothrops mucrosquamatus)、乌苏里蝮蛇素(ussuristatin)(乌苏里蝮蛇，Gloydiusussuriensis)、霍皮响尾蛇素(viridin)(霍皮响尾蛇，Crotalus viridis)。

本发明的另一方面是分离多肽，其为马来亚蝮蛇蛇毒蛋白的变体，其中马来亚蝮蛇蛇毒蛋白包含由SEQ ID NO：1所定义的氨基酸序列，且该变体包含RGD基序变体。

在本发明的一个实施方式中，该RGD基序可包含选自SEQ IDNO：30-42的氨基酸序列。

本发明的另一方面是包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的多肽，其进一步包含对应于SEQ ID NO：1的氨基酸48、50、52或53的位置上的四个氨基酸置换中的一个、两个、三个。

本发明的另一方面是包含氨基酸置换的多肽，所述氨基酸置换选自SEQ ID NO：1的位置48上的Ala，位置50上的Leu、Ile和His，位置52上的Asp、Met和Asn，以及位置53上的Val、Leu和Met。

例如具体而言，在本发明的另一实施方式中，该RGD基序变体可包含对应于在SEQID NO：29所示的野生型RGD基序的Gly⁵⁰或Met⁵²的残基处的至少一个氨基酸置换。该至少一个氨基酸置换发生在对应于SEQID NO：36-37的Leu⁵⁰、SEQ ID NO：39的Ile⁵⁰、SEQ ID NO：40的His⁵⁰、SEQ ID NO：41的Asn⁵²或SEQ ID NO：42的Gly⁵²的残基处。

在本发明的另一实施方式中，该RGD基序变体可包含在对应于SEQ ID NO：29所示的野生型RGD基序的Pro⁴⁸和Met⁵²或Met⁵²和Pro⁵³的残基处的至少两个氨基酸置换。该至少两个氨基酸置换可以是对应于SEQID NO：30的Ala⁴⁸和Asp⁵²或SEQ ID NO：35的Asp⁵²和Met⁵³的残基。

在本发明的另一实施方式中，该RGD基序变体可包含在对应于SEQ ID NO：29所示的野生型RGD基序的Pro⁴⁸、Met⁵²和Pro⁵³或Gly⁵⁰、Met⁵²和Pr0⁵³的残基处的至少三个氨基酸置换。该至少三个氨基酸置换可以是对应于SEQ ID NO：31的Ala⁴⁸、Asp⁵²和Val⁵³、SEQ ID NO：32的Ala⁴⁸、Asp⁵²和Leu⁵³、SEQ ID NO：34的Ala⁴⁸、Asp⁵²和Met⁵³、或SEQ ID NO：37 的Leu⁵⁰、Asp⁵²和Leu⁵³的残基。

在本发明的另一实施方式中，RGD基序变体可包含在对应于SEQID NO：29所示的野生型RGD基序的Pro⁴⁸、Gly⁵⁰、Met⁵²和Pro⁵³的残基处的至少四个氨基酸置换。该至少四个氨基酸置换可以是对应于SEQ ID NO：38的Ala⁴⁸、Leu⁵⁰、Asp⁵²和Leu⁵³的残基。

本发明的另一方面是由具有选自SEQ ID NO：44-56的修饰马来亚蝮蛇蛇毒蛋白核苷酸序列的DNA所编码的分离多肽。与马来亚蝮蛇蛇毒蛋白相比，该多肽对αllbβ3和/或α5β1的亲和性降低至少约5、50或100倍。在本发明的一个实施方式中，与马来亚蝮蛇蛇毒蛋白相比，该多肽对αllbβ3和/或α5β1整联蛋白的亲和性降低至少约200倍。在本发明的另一个实施方式中，与马来亚蝮蛇蛇毒蛋白相比，该多肽对αllbβ3和/或α5β1整联蛋白的亲和性降低至少约1000或2000倍。在本发明的另一个实施方式中，与马来亚蝮蛇蛇毒蛋白相比，该多肽对血小板的亲和性降低至少约5、50、100、1000或2000倍。在本发明的另一个实施方式中，与马来亚蝮蛇蛇毒蛋白或野生型解联蛋白相比，该多肽在延长凝血时间方面显示显示大幅降低的活性。

本发明的另一方面是使用解联蛋白变体治疗和/或预防哺乳动物(包括人)中αvβ3整联蛋白相关疾病的方法。该方法包括对有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的分离多肽或其药学上可接受的盐的步骤。其中的多肽具有整联蛋白αvβ3受体-拮抗剂活性，以及与野生型解联蛋白相比充分降低的整联蛋白αllbβ3和/或整联蛋白α5β1受体-阻断活性，从而导致治疗和/或预防哺乳动物中与αvβ3整联蛋白相关的疾病。该多肽由编码修饰解联蛋白氨基酸序列的修饰解联蛋白核苷酸序列所编码，该核苷酸序列导致具有充分降低的整联蛋白αllbβ3和/或整联蛋白α5β1受体-阻断活性的多肽。在该方法中采用的多肽可被聚乙二醇化或与白蛋白缀合。

如上文讨论，该解联蛋白核苷酸序列可来自于蛇毒液，并可选自：马来亚蝮蛇蛇毒蛋白、白唇竹叶青素、食鱼蝮素、墨西哥西海岸响尾蛇素、大具窍蝮蛇素、扁头腹蛇素、亚利桑那黑响尾蛇素、角响尾蛇素、西部菱背响尾蛇素、南美响尾蛇素、华丽蛇毒素、黄绿竹叶青蛇素、黄绿竹叶青抑制素、白眉蝮素、哈里氏蝮抑制素、美洲矛头蝮蛇素、美洲矛头蝮蛇抑制素、蝮蛇毒素、叶林腹素、大盆地响尾蛇素、黑尾响尾蛇素、白眉蝮蛇素、哈里氏蝮素、大草原响尾蛇素、黄绿竹叶青蛇毒素、原矛头蝮素、原矛头蝮素酶、乌苏里蝮蛇素和霍皮响尾蛇素。

在本发明的一个实施方式中，该方法包括对有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的分离多肽或其药学上可接受的盐的步骤，其中该多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，且该变体包含RGD基序变体。

在本发明的另一实施方式中，该方法包括对有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的分离多肽或其药学上可接受的盐的步骤，其中该多肽是包含SEQ ID NO：1所定义的氨基酸序列的马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体，且该变体包含具有选自SEQ ID NO：30-42的氨基酸序列的RGD基序变体。

在本发明的另一实施方式中，该方法包括对有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的分离多肽或其药学上可接受的盐的步骤，其中该多肽包含选自SEQ ID NO：57-69的氨基酸序列。

在本发明的一个实施方式中，本发明的多肽用于治疗和/或预防αvβ3整联蛋白相关的疾病，其包括但不限于骨质疏松症、骨肿瘤或癌生长及其相关症状、血管生成相关的肿瘤生长和转移、骨内肿瘤转移、恶性肿瘤诱导的高钙血症、血管生成相关的眼部疾病、佩吉特病、风湿性关节炎以及骨关节炎。

在本发明的另一实施方式中，本发明的多肽用于治疗和/或预防血管生成相关的眼部疾病，其包括但不限于年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病、角膜新生血管形成病、局部缺血诱导的新血管形成性视网膜病、高度近视以及早产儿视网膜病。

在本发明的另一实施方式中，本发明的多肽用于治疗和/或预防骨质疏松症。该骨质疏松症与选自如下的病理状态相关：绝经后雌激素缺乏、继发性骨质疏松症、类风湿性关节炎、卵巢切除、佩吉特病、骨癌、骨肿瘤、骨关节炎、破骨细胞形成增加以及破骨细胞活性增加。此外，该骨质疏松症包括但不限于卵巢切除诱导的骨质疏松症或骨丧失以及绝经后的骨质疏松症或骨丧失。

本发明的另一方面是使用该解联蛋白变体治疗和/或预防哺乳动物(包括人)中卵巢切除或绝经后骨质疏松症诱导的生理变化的方法。该方法包括对有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的分离多肽，或其药学上可接受的盐其具有整联蛋白αvβ3受体-拮抗剂活性，以及与野生型解联蛋白相比充分降低的整联蛋白αllbβ3和/或α5β1受体-阻断活性，从而导致治疗和/或预防哺乳动物中卵巢切除诱导的生理变化。该多肽由编码修饰氨基酸序列的修饰解联蛋白核苷酸序列所编码，从而导致所述多肽具有充分降低的整联蛋白αllbβ3和/或α5β1受体-阻断活性。该解联蛋白核苷酸序列可来自于蛇毒液，并可选自如下之一：马来亚蝮蛇蛇毒蛋白、白唇竹叶青素、食鱼蝮素、墨西哥西海岸响尾蛇素、大具窍蝮蛇素、扁头腹蛇素、亚利桑那黑响尾蛇素、角响尾蛇素、西部菱背响尾蛇素、南美响尾蛇素、华丽蛇毒素、黄绿竹叶青蛇素、黄绿竹叶青抑制素、白眉蝮素、哈里氏蝮抑制素、美洲矛头蝮蛇素、美洲矛头蝮蛇抑制素、蝮蛇毒素、叶林腹素、大盆地响尾蛇素、黑尾响尾蛇素、白眉蝮蛇素、哈里氏蝮素、大草原响尾蛇素、黄绿竹叶青蛇毒素、原矛头蝮素、原矛头蝮素酶、乌苏里蝮蛇素和霍皮响尾蛇素。

用于治疗和/或预防哺乳动物中卵巢切除诱导的生理变化或绝经后的生理变化的多肽变体可含有包含选自SEQ ID NO：30-42的氨基酸序列的RGD基序变体。

在本发明的一个实施方式中，该方法包括对有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的分离多肽或其药学上可接受的盐，其中该多肽变体包含选自SEQ ID NO：57-69的氨基酸序列。在另一实施方式中，该多肽变体被聚乙二醇化或与白蛋白缀合。

本发明的另一方面是使用解联蛋白变体抑制和/或防止哺乳动物(包括人)中骨内肿瘤细胞生长及其相关症状的方法。该方法包括对有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的分离多肽或其药学上可接受的盐，其具有整联蛋白αvβ3受体-拮抗剂活性，以及与野生型解联蛋白相比充分降低的整联蛋白αllbβ3和/或α5β1受体-阻断活性，从而导致抑制和/或防止哺乳动物中的骨内肿瘤细胞生长及相关症状。该多肽由编码修饰氨基酸序列的修饰解联蛋白核苷酸序列所编码，从而导致所述多肽具有充分降低的整联蛋白αllbβ3和/或α5β1受体-阻断活性。

该解联蛋白核苷酸序列可来自于蛇毒液，并可选自：马来亚蝮蛇蛇毒蛋白、白唇竹叶青素、食鱼蝮素、墨西哥西海岸响尾蛇素、大具窍蝮蛇素、扁头腹蛇素、亚利桑那黑响尾蛇素、角响尾蛇素、西部菱背响尾蛇素、南美响尾蛇素、华丽蛇毒素、黄绿竹叶青蛇素、黄绿竹叶青抑制素、白眉蝮素、哈里氏蝮抑制素、美洲矛头蝮蛇素、美洲矛头蝮蛇抑制素、蝮蛇毒素、叶林腹素、大盆地响尾蛇素、黑尾响尾蛇素、白眉蝮蛇素、哈里氏蝮素、大草原响尾蛇素、黄绿竹叶青蛇毒素、原矛头蝮素、原矛头蝮素酶、乌苏里蝮蛇素和霍皮响尾蛇素。

与骨骼内肿瘤细胞生长相关的病理症状包括破骨细胞活性增加、骨吸收增加、骨损害、高钙血症、体重下降及其任意组合。骨内肿瘤细胞生长包括骨癌细胞以及源自前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、卵巢癌、胰腺癌和骨髓癌的转移癌细胞。

在本发明的一个实施方式中，该方法包括对有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的分离多肽，或其药学上可接受的盐，其中该多肽是马来亚蝮蛇蛇毒蛋白的变体，其中马来亚蝮蛇蛇毒蛋白包含SEQ ID NO：1定义的氨基酸序列，该变体包含RGD基序变体。RGD基序变体可包含选自SEQ IDNO：30-42的氨基酸序列。

在本发明的另一实施方式中，该方法包括对有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的分离多肽，或其药学上可接受的盐的步骤，其中该多肽包含选自SEQ ID NO：57-69的氨基酸序列。该多肽变体可被聚乙二醇化或与白蛋白缀合。

本发明的另一方面是制备本发明的多肽的方法，该方法包括如下步骤：(a)用编码所述多肽的多核苷酸转化宿主细胞，以获得一种或多种转化体；(b)选择在该转化体内插入了一个或多个所述DNA构建体拷贝的转化体；(c)使该转化体在培养基中生长，以扩增其细胞群；(d)收获转化体细胞；(e)使收获的转化体细胞在不含氨基酸的培养基中生长；和(g)采集上清液，以获得所述多肽。

前述步骤(e)可进一步包括向培养基添加甲醇以诱导该多肽在转化体细胞中表达的步骤。在一个实施方式中，步骤(g)可进一步包括实施色谱柱色谱以获得所述多肽的步骤。在进一步的实施方式中，前述方法可进一步包括进行HPLC以获得纯化的、分离多肽的步骤。

下文更为具体地描述本发明的这些和其它方面。

人重组RANKL和M-CSF购自R&D Systems(Minneapolis，MN)。I型胶原C-末端端肽ELISA试剂盒得自Cross Laps(Herlev，丹麦)。所有其它的化学品得自Sigma。实施例1编码马来亚蝮蛇蛇毒蛋白和变体的DNA的构建

马来亚蝮蛇蛇毒蛋白可作为模板在载体pGEX-2KS[20]中克隆和表达。编码Rho的DNA由优先用于巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的密码子组成。采用具有促进纯化的Eco RI识别和六个组氨酸残基的正义引物(正义primer)5′-GAATTCGAATTCCATCATCATCATCATCATCATGGTAAGGAATGTGACTGTTCTT-3′(Rho-Pic-1；SEQ IDNO：3)通过聚合酶链反应(PCR)来扩增Rho DNA。反义引物为具有Sac II识别和TCA(或TTA)终止密码子的5′-CCGCGGCCGCGGTCAGTGGTATCTTGGACAGTCAGC-3′或5′-CCGCGGCCGCGGTTAGTGGTATCTTGGACAGTCAGC-3′(SEQID NO：136)(Rho-Pic-2；SEQ ID NO：4)。纯化该PCR产物，然后连接至酵母重组载体pPICZαA的Eco RI和Sac II位点。用该重组质粒转化DH5α菌株，在琼脂板上用低盐LB(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、1.5％琼脂，pH7.0)和25μg/ml抗生素Zeocin选择菌落。

以含Eco RI和Sac II限制性位点的引物采用重叠寡核苷酸策略通过聚合酶链反应(PCR)来合成和扩增马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体。表1列举了用于合成或确认变体的各种引物的核苷酸序列。使用类似的步骤构建RD-HAS融合蛋白。人血清白蛋白的cDNA购自Invitrogen，白蛋白的结构基因通过GSGSGS(SEQ ID NO：137)接头氨基酸序列融合至Rho基因的N末端，且在该N末端具有六个组氨酸残基。

表1

注意：引物α-因子用作测序引物；5′-AOX1和3′-AOX1引物用于检测插入DNA的存在。

聚合酶链反应在95℃下进行1分钟，55℃下进行1分钟，然后在72℃下进行1分钟，循环25次。引物的混合物还用于生成多突变位点。在2％琼脂糖凝胶上分离该PCR产物，并通过溴化乙锭(ethidium bromide)染色进行显色。纯化所需的PCR产物，然后连接至酵母转移载体pPICZαA 的Eco RI和Sac II位点。该重组质粒可用于转化大肠杆菌XL1-蓝菌株，并在含抗生素Zeocin的琼脂板上选择菌落。选取该大肠杆菌XL1-蓝菌落，分离质粒DNA，然后通过对插入物测序确认该序列。表2列举了用于合成编码马来亚蝮蛇蛇毒蛋白以及各种变体的DNA的引物序列ID NO。

表2

用于合成编码马来亚蝮蛇蛇毒蛋白以及各种变体的DNA的引物

实施例2

马来亚蝮蛇蛇毒蛋白和变体的蛋白表达和纯化

按照略微修改的Pichia EasyComp^TM试剂盒的方案在毕赤酵母(Pichia)中进行马来亚蝮蛇蛇毒蛋白及其变体的蛋白表达。简单而言，纯化总计10μg含有编码马来亚蝮蛇蛇毒蛋白或其变体的DNA的质粒，并用Sac I消化，以使质粒线性化。使用来自的Pichia EasyComp^TM试剂盒，通过热激方法用该线性构建体转化毕赤酵母菌株X33。通过单交叉将转化体整合在5′AOX1基因座上。使用PCR分析毕赤酵母整合体，以确定该Rho基因是否被整合进入毕赤酵母基因组，并用溶细胞酶(Sigma)溶解细胞。在含有YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖以及2％琼脂)和100μg/ml Zeocin的琼脂板上选择菌落。选择一定量具有多个Rho基因插入物拷贝的克隆，以拣选具有最高Rho蛋白表达的克隆。

重组体Rho及其变体按如下制备：在30℃下于含有100μg/mlZeocin的YPD培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨和2％葡萄糖)中生长所选的菌落。48小时后，离心收集细胞，使之在1升极限甲醇培养基(含有1.34％酵母氮碱(yeast nitrogen base)(含硫酸铵，不含氨基酸)和4x10^-5％生物素)中生长。每24小时添加总计1％的甲醇，以诱导Rho或变体表达，持续2天。离心收集上清液，以5升缓冲液A(5mM EDTA、8M尿素和10mM磷酸钠缓冲液，pH 7.7)透析两次。将最终的溶液加载到镍螯合柱上，并用200mM咪唑梯度洗脱。通过HPLC(反相C18HPLC)进一步纯化重组体马来亚蝮蛇蛇毒蛋白及其变体。通过两性离子缓冲剂(tricine)-SDS-PAGE判断纯化的重组体Rho具有大于95％的纯度。

随后对Rho及其变体进行电喷雾质谱分析以检查分子量。Rho及其变体的RGD基序的氨基酸序列显示于表3中。

表3

^＊48PRLDMP⁵³-5K指聚乙二醇化⁴⁸PRLDMp⁵³。

实施例3

RD及其衍生物对出血时间的影响

按照如下测量出血时间：用三氯乙醛(200mg/kg)麻醉小鼠，并通过略作改动的前述方法[21]测量出血时间。通过小鼠(ICR，雄性，平均体重23.5±1.8g)的尾静脉静脉注射盐水或蛋白。注射后5分钟在小鼠的尾部尖端形成0.5mm的尖锐切口。然后立即将尾部浸入充满盐水的烧杯中，保持在37℃，并测量出血时间。

图1显示了RD和ARLDDL蛋白对小鼠尾部出血时间的影响。尾部出血时间在静脉施用盐水、RD、ARLDDL、马来亚蝮蛇蛇毒蛋白(每只0.6mg/kg)或HSA-RD(5mg/kg)后5分钟进行测量。静脉注射马来亚蝮蛇蛇毒蛋白(0.5mg/kg)对于延长小鼠的凝血时间发挥了显著的作用。然而，与马来亚蝮蛇蛇毒蛋白相比，对αvβ3整联蛋白显示选择性的RD和ARLDDL(0.5mg/kg)两者仅对小鼠的凝血时间产生了轻微影响。结果表示为平均值±S.E.M(n＝6)。

实施例4

血小板凝集测定

将来自于至少两周未接受任何药物的健康供体的静脉血液(9份)样本采集于3.8％柠檬酸钠中(1份)。将血液样本以150xg离心10分钟，以获得血小板富集血浆(PRP)，并静置5分钟，收集PRP。通过2000xg离心25分钟从剩余的血液制备血小板贫乏的血浆(platelet-poor plasma)(PPP)。在血液分析仪上测量PPP血小板数，并稀释至250,000血小板/μl。在37℃下于Hema Tracer 601凝集计中将190μl PRP溶液与10μl的Rho或PBS缓冲液孵育5分钟。进一步添加10微升的200μM二磷酸腺苷(ADP)，以通过光传输监测血小板凝集反应。

实施例5

细胞粘附抑制测定

如现有技术[27]所述，进行细胞粘附抑制测定。简单而言，将96孔Immulon-2微量滴定板(Costar，Corning，USA)的各孔涂覆含有浓度为50-500nM的底物的100μl磷酸盐缓冲盐水(PBS：10mM磷酸盐缓冲液，0.15M NaCl，pH 7.4)，并在4℃下孵育过夜。底物及其涂覆浓度为纤维原蛋白(Fg)200μg/ml，玻连蛋白(Vn)50μg/ml和纤连蛋白(Fn)25μg/ml。通过将每个孔与200μl热变性的1％牛血清白蛋白(BSA，Calbiochem)于室温下(25℃)孵育1.5小时，来阻断非特异性蛋白结合位点。弃去热变性BSA，每个孔用200μl PBS洗涤两次。

在100μl Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中维持表达αvβ3(CHO-αvβ3)和αllbβ3(CHO-αllbβ3)整联蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。表达整联蛋白αvβ3(CHO-αvβ3)和αllbβ3(CHO-αllbβ3)的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞由Y.Takada博士(Scripps ResearchInstitute)友情提供。人红白血病K562细胞购自ATCC，并在含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。通过胰蛋白酶消化(trypsinization)分离在对数期生长的CHO和K562 细胞，并分别以3x10⁵和2.5x10⁵细胞/ml用于测定。向培养的细胞中添加Rho及其变体，并在37℃，5％CO₂下孵育15分钟。将0.001-500μM浓度下的Rho及其变体用作抑制剂。然后向涂覆的平板中添加经处理的细胞，在37℃，5％CO₂下反应1小时。然后丢弃孵育溶液，用200μl PBS洗涤两次以去除未粘附的细胞。通过结晶紫染色对结合的细胞进行定量。简单而言，用100μl的10％福尔马林将细胞固定10分钟，并干燥。然后在室温下经20分钟，向该孔中添加50微升的0.05％结晶紫。每个孔用200μl蒸馏水洗涤四次，并干燥。通过添加150μl着色溶液(50％乙醇和0.1％乙酸)进行着色。在600nm下读取所得的吸光度，读数与粘附细胞的数量相关。抑制被定义为抑制％＝100-[OD₆₀₀(马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体处理的样本)/OD₆₀₀(未处理样本)]×100。

实施例6

RD及其衍生物对整联蛋白αvβ3、αllbβ3和α5β1的抑制作用

RD及其衍生物对整联蛋白结合的IC₅₀通过上文实施例5所述的细胞粘附测定获取。简单而言，如实施例5所述，以固定浓度将基质蛋白(如纤连蛋白、玻连蛋白或纤维蛋白原)涂覆在微量滴定板上，并将0.001-500μM范围内的不同浓度的Rho及其衍生物添加至表达整联蛋白的细胞，以获得IC₅₀。IC₅₀越低，该变体的特异性或效力越大。

Rho的RGD基序的修饰对于Rho的生物活性具有独特的作用：序列修饰导致了对整联蛋白αllbβ3或α5β1结合基质蛋白的抑制活性降低，并对整联蛋白αvβ3的选择性增加。表4显示了通过Rho及其衍生物抑制细胞粘附的IC₅₀的结果。

表4

RD及其衍生物对细胞粘附至ECM的抑制

^＊48PRGDMP⁵³(29)指Rho的RGD基序，并包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列；⁴⁸PRLDMP⁵³(36)指RD变体的RGD基序，并包含SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列。^a该数值表示实验次数。

马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体对αllbβ3和/或α5β1的亲和性比Rho低得多(表4)。如表4所示，例如RD(即，PRLDMP)在抑制整联蛋白αllbβ3和α5β1上的IC₅₀分别比Rho提高超过104和10倍。此外，ARLDDL在抑制整联蛋白αllbβ3和α5β1上的IC₅₀分别比Rho提高超过2000倍。聚乙二醇化RD和人白蛋白结合的RD对αllbβ3结合的IC₅₀分别比Rho提高113.7和129.9倍(表5)。因此，该变体对血小板的亲和性相比于Rho明显降低(表5)。

实施例7

RD及其衍生物对破骨细胞生成的影响

破骨细胞是从骨髓造血前体分化而成的特化(specialized)单核细胞/巨噬细胞家族成员。在M-CSF(20ng/ml)和sRANKL(50ng/ml)的存在下，培养破骨细胞前体8天，诱导形成具有多核的大型成熟破骨细胞，其表征为获得成熟表型标记(例如TRAP)。从培养的骨髓造血细胞生成破骨细胞的方法以及RD及其衍生物对破骨细胞生成的影响可按如下进行研究。

通过取出6～8周龄SD大鼠的股骨，并用补充有20mM HEPES和10％热灭活FCS、2mM谷氨酰胺、青霉素(100U/ml)以及链霉素(100μg/ml)的a-MEM冲洗骨髓腔来制备骨髓细胞。在24小时后收集非粘附细胞(造血细胞)，用作破骨细胞的前体。在人重组可溶性RANKL(50ng/ml)和鼠M-CSF(20ng/ml)的存在下将细胞以1×106细胞/孔(0.5ml)接种在24孔板中。每3天置换培养基。在第8天通过抗酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)的测定来证实破骨细胞形成。简单而言，在磷酸盐缓冲盐水中用10％甲醛固定粘附细胞3分钟。用乙醇/丙酮(50∶50v/v)处理1分钟后，空气干燥细胞表面，在含有0.01％萘酚AS-MX磷酸盐(Sigma)和0.03％固红紫色LB盐(Sigma)的醋酸盐缓冲液(0.1M醋酸钠，pH5.0)中在50mM酒石酸钠的存在下，于室温孵育10分钟。通过对TRAP阳性和含有多于三个核的多核细胞的计数对每个孔中破骨细胞样TRAP阳性细胞进行评价。

RD衍生物显著抑制破骨细胞的分化，这与它们对αvβ3的抑制活性相关联(表5)。另一方面，AKGDWN(SEQ ID NO：138)和PRGEMP(SEQID NO：139)在抑制整联蛋白αvβ3和破骨细胞分化上的有效性较小(表5)。

表5

RD及其衍生物对血小板凝集、细胞粘附和破骨细胞生成的抑制

实施例8

卵巢切除诱导的骨质疏松症

雌性Sprague-Dawley大鼠(3月龄，270～290g)或ICR小鼠(4周龄，22～28g)用于本研究。大鼠或小鼠在三氯乙醛麻醉下切除(OVX)双侧卵巢，对照大鼠进行假手术(Sham)以供比较。所有的动物均保持在室温(22±1℃)和12小时亮-暗循环的受控条件下。用Purina实验室啮齿动物日粮(PMI；St.Louis，MO)(0.95％钙)喂养动物，自由饮水。每周记录大鼠体重。

实施例9

骨矿物质密度(BMP)和骨矿物质含量(BMC)的分析

在实验结束时，通过断头处死大鼠或小鼠.如Weinreb等人[26]所述，取出胫骨和股骨，将软组织清除，并以精确的测径器(caliper)(±0.05mm)测量胫骨和股骨的长度和重量。用双能X线骨密度仪(dual-energy X-ray absorptiometer，DEX，XR-26；Norland，FortAtkinson，WI)测量胫骨的BMD和BMC。采用了用于测量小型对象的模式。参见Chih-Hsin等人，″Enhancement of Fibronectin Fibrillogenesis and Bone Formation byBasicFibroblast Growth Factor via Protein Kinase C-Dependent Pathway inRatOsteoblasts，″Mol.Pharmacol：66：440-449，(2004)。对腰椎模型(lumbarphantom)上的BMD进行1年以上的每日测量，计算得到0.7％的变异系数[22，23]。对完整的胫骨和股骨进行扫描，通过骨密度仪测量BMD和BMC。

实施例10

骨的组织形态测量

用4％甲醛固定胫骨，然后用12％EDTA脱钙，并在递增系列乙醇溶液和丙酮中脱水，并包埋在石蜡中。纵向切取连续切片(5mm)，并用Mayer苏木精-曙红溶液染色。使用Olympus显微镜摄取生长板和胫骨近端的图像。使用图像分析软件(Image-pro plus 3.0)测量次生松质中的骨体积，该次生松质位于原生松质下方，其表征为较大的小梁网络。为了测量破骨细胞的数目，用抗酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)对切片染色。

实施例11

生物力学三点弯曲(biomechanical three-point bending)测试

通过在材料测试系统(MTS-858，MTS System Inc.，Minneapolis，MN)中进行三点弯曲测试，来测量骨组织的力学性能。两个支撑点的跨距为20毫米，变形速率为1mm/min。将负荷/变形曲线输入计算机，并用Team 490软件(4.10版，Nicolet InstrumentTechnologies Inc.，Madison，WI)进行分析。从照片中测量横截面参数，并用于横截面转动惯量的计算。在假设该横截面是椭圆形条件下计算横截面转动惯量[24]：

I＝π[(ab3x(ax2t)(bx2t)3]/64

其中a是中侧方向(mediolateral)的横截面宽度，b是前后方向的横截面宽度，t是皮层厚度的平均值。使用针对Windows的图像软件ImagePro Plus 3.0(MediaCybernetics，Silver Spring，MD)获取所有这些参数。最大应力、极限应力以及弹性模量(杨氏模量)使用如下方程计算[25]： σ＝FLc/4IE＝F/dэL3/48I其中σ是极限应力，c是自质量中心的距离(等于上述的1/2b)，F是施加的负荷(N)，d是位移(mm)，L是弯曲夹具(bendingfixture)的两个支撑点之间的跨距(mm)。此外，最终应力中的能量可通过计算应力-应变曲线下的相应面积测得。

实施例12

RD衍生物在小鼠中对OVX-诱导的骨丧失的抑制

为了检查RD衍生物对骨丧失的影响，如实施例8所述通过卵巢切除(OVX)在雌性小鼠中诱导骨质疏松症。OVX小鼠显示了全身的BMD和BMC下降。用RD衍生物(I.M.，1.5mg/kg/隔天)或阿伦膦酸盐(p.o.，1.5mg/kg/隔天)治疗两周抑制BMD和BMC的丧失(表6)。胶原的C-末端端肽的血液浓度可以反映破骨细胞活性。如表6所示，RD衍生物或阿伦膦酸盐还抑制卵巢切除诱导的破骨细胞活性的上升(表6)。看起来一些RD衍生物比阿伦膦酸盐有效得多。此外，用RD(I.M.，1.5mg/kg)每周处理一次持续两周也抑制BMD和BMC的丧失(表6)。这些数据显示，RD及其衍生物可在更长的给药间隔下抑制骨质疏松症。

表6

RD及其衍生物在小鼠中对OVX-诱导的骨丧失的抑制

数值为平均±SE

^＊与Sham组相比，p＜0.05

§与OVX组相比，p＜0.05

实施例13

PGP和RD衍生物对大鼠中卵巢切除诱导的骨丧失的抑制

选择PGP(RD衍生物)来更具体地检查对大鼠中卵巢切除(OVX)-诱导的骨丧失的保护。如实施例8所述将成年雌性大鼠(3月龄)进行卵巢切除，并按实施例9-11所述在卵巢切除6周后测量骨体积。据显示，PGP蛋白同时抑制卵巢切除诱导的骨体积下降和破骨细胞数上升。

如图2A所示，与假手术大鼠(Sham)相比，卵巢切除(OVX)引起小梁骨的明显丧失。然而，用PGP治疗(IV，0.3mg/kg/天或IM，1.5mg/kg/隔天)明显抑制卵巢切除诱导的次生松质中的小梁骨的丧失。

在图2B中，抗酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)染色显示，破骨细胞主要位于小梁骨周围，PGP抑制OVX-诱导的破骨细胞形成增加。

在实验结束时，OVX大鼠还显示体重增加。用PGP治疗(I.V.，0.3mg/kg/天或I.M.，1.5mg/kg/隔天)明显抑制OVX-诱导的体重增加。

卵巢切除后6周，大鼠还显示股骨和胫骨中的BMD和BMC湿重均降低(表7)。用PGP治疗(I.V.或I.M.)抑制了OVX大鼠中胫骨和股骨两者的BMD和BMC湿重的降低。组织形态测量显示，卵巢切除引起了次生松质中小梁骨的丧失(图2)。用PGP处理显著地逆转骨体积的丧失(图2和表7)。此外，TRAP染色证实破骨细胞主要位于小梁骨周围，OVX增加破骨细胞数目。长期施用PGP拮抗OVX诱导的破骨细胞形成(图2和表7)。胶原的C-末端端肽的血清水平反映破骨细胞活性。据发现，该值在OVX组中相比于Sham组显著上升，而用PGP治疗有效拮抗OVX-诱导的破骨细胞活性增加(表7)。

表7

PGP蛋白对大鼠中卵巢切除-诱导的骨丧失的抑制

ALP，碱性磷酸酶；N.Oc/BS，破骨细胞数/mm骨表面。

数值为平均值±SE。

^＊与Sham组相比，p＜0.05

§与OVX组相比，p＜0.05

在股骨中进行三点弯曲测试，以检查骨骼的力学活性。与假手术组相比，OVX大鼠的最大负荷、极限负荷、杨氏模量和极限应力均降低。用PGP治疗显示对OVX-诱导的骨强度降低的保护(表8)。这些结果表明PGP样蛋白药物可显著抑制由卵巢切除引起的骨丧失。

表8

PGP蛋白对OVX大鼠中生物力学性能的增加

数值为平均值±SE。

^＊与Sham组相比，p＜0.05

§与OVX组相比，p＜0.05

实施例14

用RD蛋白后处理抑制OVX-诱导的破骨细胞激活

为了检查RD衍生物对体内破骨细胞活性的动态治疗效果，通过卵巢切除在雌性大鼠中诱导骨质疏松症，并以不同的间隔从血液测量I型胶原的C-末端端肽。与假手术大鼠(Sham)相比，卵巢切除(OVX)引起破骨细胞活性的显著升高。对COL(I)α1链的C-末端端肽的血清水平的测量显示OVX大鼠中破骨细胞活性升高。在卵巢切除28天后，该I型胶原的C-末端端肽从361±25.6(n＝15)的基础水平上升至708±50.7ng/ml(n＝15)。

然后在卵巢切除后一个月进行RD和阿伦膦酸盐的后处理。用RD(I.M.，1.5mg/kg/隔天)和阿伦膦酸盐(p.o.，1.5mg/kg/隔天)的后处理逆转卵巢切除诱导的破骨细胞活性的升高，且RD比阿伦膦酸盐有效得多(图3)。在撤除RD或阿伦膦酸盐处理后破骨细胞活性恢复。阿伦膦酸盐处理组的破骨细胞活性的恢复比RD处理组快得多。然而，重新施用RD有效抑制卵巢切除诱导的破骨细胞活性升高。对RD处理反应的破骨细胞值远低于对阿伦膦酸盐处理反应的破骨细胞值(图3)。这些结果显示，RD相关的蛋白对由卵巢切除诱导的破骨细胞激活所引起的骨丧失具有治疗效果。

在第二药物治疗期(the second drug treatment period)后，处死大鼠，并测量胫骨和股骨的BMD和BMC。如表9所示，RD后处理(posttreatment)有效逆转卵巢切除的骨丧失作用。对于骨体积的保持，RD比阿伦膦酸盐更有效。

表9

RD后处理抑制大鼠中OVX-诱导的骨损失

BMD是骨矿物质密度的缩写；

BMC是骨矿物质含量的缩写。

数值为平均值±SD。

^＊与Sham组相比，p＜0.05

§与OVX组相比，p＜0.05

RD：I.M.注射(1.5/mg/kg/隔天)

阿伦膦酸盐：p.o.(1.5/mg/kg/隔天)

每组n＝5

实施例15

RD在骨关节炎动物中对软骨细胞损伤的抑制

通过仅在雄性Sprague-Dawley大鼠的右膝上进行手术来获得骨关节炎动物模型。手术涉及前交叉韧带处理(anterior cruciate ligationtransaction)和部分内侧半月板切除。手术后，通过肌内途径(1.5mg/kg/隔天)或局部关节注射(每周一次)施用RD蛋白直至手术后6周的最后一天，并在该天处死大鼠。将每个关节包埋在石蜡中，切片，并用0.1％番红-O和苏木精染色。如图4B所示，右膝关节的软骨细胞被关节炎损伤，在肌内注射(图4D)或局部施用(图4C)RD时均抑制软骨细胞层破坏。

实施例16

RD在骨关节炎大鼠中对血液细胞因子升高的抑制

通过上述的手术形成骨关节炎大鼠。手术后六周，获取血清以测量细胞因子的血液水平。如图5A-5C所示，骨关节炎大鼠中的细胞因子(例如c-反应性蛋白、IL-1β和IL-6)的血清水平升高，施用RD显著抑制骨关节炎诱导的细胞因子升高。

实施例17

RD在骨关节炎小鼠中对血液细胞因子上升的抑制

通过上述的手术形成骨关节炎小鼠。手术后六周，获取血清以测量细胞因子水平。如图6A-6C所示，骨关节炎小鼠中的细胞因子(例如c-反应性蛋白、IL-1β和IL-6)的血清水平升高，施用RD显著抑制骨关节炎诱导的细胞因子升高。

实施例18

小鼠中前列腺癌细胞或乳腺癌细胞的胫骨内注射

使用在无特殊病原体(SPF)条件下于22±2℃饲养于动物隔离箱(IVC架)中的体重20-22g(6周龄)的重症综合型免疫缺乏症(SCID)雄性小鼠或BALB/c-nu/nu雄性小鼠。在第1天将人前列腺癌PC-3细胞或人乳腺癌MDA-MB-231细胞(1x10⁶细胞，含于15ml无菌PBS中)分别注射入SCID小鼠或裸鼠的左和右胫骨的骨髓中。在第11天，将动物随机分为三组，并开始施用测试物质。通过肌内(IM)注射施用RD(1.5mg/kg)，通过皮下(SC)注射给予阿伦膦酸盐(1.5mg/kg)，每日一次，总共15个剂量(施用5天，停2天，持续3周)。在实验期间，每周观察并记录体重和肿瘤生长情况。一个月后，处死小鼠，测量后腿重量。减去对照腿的重量以反映相对肿瘤重量。此外，在实验结束时采集血液样本，以进行红细胞(RBC)、白细胞(WBC)和血小板的血液计数，并测量I型胶原的C-末端端肽(CTX)和血清钙浓度。

为了测定骨质溶解，通过软X-光生成装置(Young-kid EnterpriseCo.，Ltd.，台北，台湾)拍摄放射照片。用一水合三氯乙醛深度麻醉动物，以俯卧位躺在柯达科学成像胶片(Kodak Scientific Imaging film，13x18cm)上，并在45kV的X射线下暴露5秒。使用图像分析软件(Image-pro plus 3.0)测量骨质溶解程度。

实施例19

骨中肿瘤生长和高血钙症的抑制

骨中的肿瘤细胞生长涉及骨吸收活性。因此检查了RD蛋白对骨中前列腺癌细胞的肿瘤生长的影响。将PC-3细胞(1x10⁶)局部注射入SCID小鼠的两个胫骨骨髓腔中。在肿瘤细胞植入后10天施用RD或阿伦膦酸盐。通过肌内(IM)途经给予RD(1.5mg/kg)，而通过皮下(SC)注射给予阿伦膦酸盐(1.5mg/kg)，每日一次，总共15个剂量(施用5天，停2天，维持3周)。在第33天计算后腿的肿胀，以反映肿瘤生长。在整个实验期间测量体重。结果显示，在第33天1.5mg/kg的RD明显抑制肿瘤细胞诱导的后腿肿胀(43.8±4.1％，n＝21-22)(图7)。然而，皮下施用1.5mg/kg阿伦膦酸盐并未抑制腿中的肿瘤生长(图7)。

图8显示RD对SCID小鼠中响应肿瘤生长的体重下降的影响。未治疗对照小鼠在实验结束时显示体重下降。用RD治疗防止由肿瘤生长引起的体重下降。阿伦膦酸盐用作阳性对照。

图9显示RD在SCID小鼠中对肿瘤生长和溶骨性骨损害的抑制。为了确定骨质溶解，通过软X光生成单元拍摄放射照片。在图9A中，在胫骨内注射PC-3细胞后33天拍摄照片。从胫骨近端生长出可见的球形肿瘤。用RD(I.M.，1.5mg/kg/隔天)治疗抑制肿瘤生长。在图9B中，在第33天拍摄的放射照片揭示在癌症细胞注射的胫骨中出现溶骨性损害，而RD的治疗抑制骨质溶解。图9C显示对该数据的量化。图9D用ELISA法显示 RD抑制肿瘤诱导的I型胶原的C-末端端肽(破骨细胞活性的标记)的增加。图9E显示RD和阿伦膦酸盐(1.5mg/kg/隔天)还抑制肿瘤诱导的血清钙浓度升高(即，高钙血症)。^＊：p＜0.05，与对照相比。#：p＜0.05，与PC-3-注射组相比。

乳腺癌具有强的向骨骼转移的偏好。图10显示RD在裸鼠中对肿瘤生长的抑制。将人乳腺癌细胞MDA-MB-231(1x10⁶)局部注射入裸鼠的两个胫骨的骨髓腔中。在植入肿瘤细胞后10天施用RD(I.M.，1mg/kg/天)，共持续14天。用RD(I.M.，1.5mg/kg/天)治疗2周抑制骨中MDA-MB-231-诱导的肿瘤生长的增加(图10A)。此外，RD还防止肿瘤诱导的破骨细胞活性的增加(图10B)和高钙血症(图10C)，但不影响RBC、WBC和血小板的血液计数(图10D-10F)。^＊：p＜0.05，与对照相比。#：p＜0.05，与MDA-MB-231-注射组相比。

实施例20

RD蛋白的聚乙二醇化

聚乙二醇化产物或与白蛋白的缀合物可延长蛋白药物的持续时间并其降低抗原性。为了使RD蛋白的抗原性最小化并延长其持续时间，可按如下制备聚乙二醇化的RD蛋白：将20mM NaCNBH₃中的RD蛋白(4mg)在pH 5下与5mM PEGk5-丙醛(O-甲基-O′-[2-(6-氧代己酰基氨基)乙基]聚乙二醇5,000)(Sigma)于4℃反应12小时。通过反相C18 HPLC纯化聚乙二醇化RD蛋白。纯化后的聚乙二醇化RD蛋白的最终产率大于60％。

如表6所示，聚乙二醇化RD抑制破骨细胞的分化。此外，用聚乙二醇化RD(I.M.，1.5mg/kg，每周一次)治疗两周抑制BMD和BMC的丧失(表6)。这些数据显示，聚乙二醇化RD不丧失其体内活性。

实施例21

MATRIGEL ^TM Plug抗血管生成测定

据报道，整联蛋白αvβ3与血管生成有关。因此使用对先前描述方法略微改动的MATRIGEL^TM plug血管生成测定来调查RD蛋白是否能够抑制血管生成[32]。简单而言，将含有200ng/ml VEGF的MATRIGEL^TM等分试样(500μl)(Becton Dickinson Lab.)皮下注射入6-8周龄C57BL/6小鼠的背部区。MATRIGEL^TM迅速形成栓塞(plug)。在处死前每天(RD/1d)或隔天(RD/2d或HSA-RD)肌肉内施用RD(3mg/kg)。8天后，取出栓塞并拍照(图11A)。采用Drabkin法和Drabkin试剂盒525(Sigma)通过测量栓塞中血红蛋白(作为血液血管形成的指示)来对新血管进行定量(图11B)。如图11A和11B所示，使用MATRIGEL^TM plug测定，RD蛋白有效抑制血管生成。 ^＊：P＜0.05相对于对照组。

实施例22

放射性配体结合测定：RD相关蛋白的特异性

为了确定RD及其衍生物PGP是否结合αvβ3整联蛋白以外的其它受体，使用RD及其衍生物PGP来分析对其配体为蛋白的受体的靶标特异性(测定者：MDS Pharma services，台北，台湾)。

如表10所示，RD和PGP不影响降血钙素、内皮素ETA、内皮素ETB、胰岛素、来普汀、钠通道、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子(TNF)以及血管内皮生长因子(VEGF)对其各自的受体的结合活性。这显示RD相关的蛋白对体内的靶蛋白αvβ3具有选择性结合活性。

表10

RD和PGP蛋白的结合测定

TGF-β：转化生长因子-

β TNF：肿瘤坏死因子

VEGF：血管内皮生长因子

实施例23

RD在早熟性视网膜病的小鼠模型中对血管生成的抑制

如Wilkinson-Berka等人[28]所描述，通过使用缺氧诱导的血管生成在小鼠中构建用于早熟性视网膜病的动物模型。简单而言，将七日龄的幼鼠及它们的母亲圈养(housed)于含75％O₂和空气的密封室中。将小鼠在室中保留五天(高氧期，P7至P12)，然后圈养在室内空气中另外七天(缺氧诱导的血管生成期，出生后12天至出生后19天，或P12至P19)。在第12天经由玻璃体内途径施用RD(2μg)，在第19天处死小鼠。

从每只动物的一只眼睛制备三个切片，去石蜡化，并用苏木精和曙红染色。对内层视网膜中的血管轮廓(BVP)计数，包括粘附在内界膜(innerlimiting membrane)上的血管。在放大100x的光学显微镜(Leica)上进行计数。

如图12A所示，RD蛋白抑制早熟性视网膜病(ROP)小鼠模型中的血管生成。图12B显示，用RD蛋白治疗的早熟性视网膜病(ROP)小鼠模型中BVP减少。通过从三个苏木精和曙红染色的切片中内层视网膜内以及延伸入玻璃体腔的血管轮廓(BVP)计数，对血管生成定量。用RD(2μg)(即，ROP+RD)治疗的ROP组相比用载体(ROP)治疗的ROP组减少了约46％的血管生成。(每个ROP组n＝7，sham组n＝2)。数据表示为平均值±SE。#：p＜0.01，与sham组相比。^＊＊：p＜0.001，与ROP组相比。

实施例24

白蛋白缀合的RD对卵巢切除诱导的骨质疏松症的抑制

在切除卵巢的雌性小鼠中检查白蛋白缀合的RD对骨质疏松症的影响。如图13A和13B中所示箭头指示，施用人血清白蛋白缀合的RD(即，RD-白蛋白)。将RD的数据合并入图13A-13D以供比较。测量I型胶原的C-末端肽和碱性磷酸酶(ALP)的血清水平，分别作为破骨细胞和破骨细胞活性的指标。同样每2周测量BMD和BMC，如图13C和13D所示。RD-白蛋白(15mg/kg/周)的治疗明显减少破骨细胞，但以可逆的方式增加ALP 活性。

实施例25

RD对类风湿性关节炎的抑制

类风湿性关节炎是一种病因学未知的慢性全身性炎性疾病，其特征为导致关节被逐渐破坏的侵袭性滑液增生。源自单核细胞/巨噬细胞系的破骨细胞在类风湿性关节炎中的软骨下骨骼破坏中起关键的作用。放射照相研究显示，在类风湿性关节炎中，软骨下骨骼的骨质减少和骨质侵蚀开始于该疾病的早期，并逐渐恶化[29]。在腐蚀的滑膜/骨界面处观察到了骨吸收性破骨细胞[30]。近期的一篇综述讨论了破骨细胞在类风湿性关节炎中的作用[31]。因此，显著抑制破骨细胞功能的RD相关蛋白可用于治疗类风湿性关节炎。

对Lewis大鼠皮内/皮下(SC)注射牛II型胶原(2mg/ml，含于不完全弗氏佐剂中)。随着大鼠发展类风湿性疾病，它们被随机分为多个研究组。在关节炎的临床征象清晰可见(例如，由踝关节肿大所证明)的第一天开始治疗。测量爪体积后，处死大鼠，采集踝和膝关节，以供检查组织病理学变化。

图14A-D分别显示了Rho及其变体的氨基酸序列SEQ ID NO：1和57-69。图15A-C显示了马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体的核苷酸序列SEQ IDNO：43-56。图16A-H显示了解联蛋白变体的氨基酸和核苷酸序列SEQ IDNO：78-135。

前述对本发明的示例性实施方式的描述仅为阐述和描述目的而提供，无意进行穷举或将本发明限制为所披露的确切形式。根据上述教导有可能进行多种修改和变化。

从对本说明书和本文所披露的本发明的实践的考虑，本发明的其它实施方式将对本领域技术人员显而易见。有意将本说明书和实施例仅可视作举例说明，本发明真实的范围和精神将由随附的权利要求书指明。参考文献列表[1]van′t Hof RJ，Ralston SH.(2001)Nitric oxide and bone.Immunology 103：255-61.[2]Goltzman D.(2002)Discoveries，drugs and skeletal disorders.NatRev Drug Discov 1：784-96.[3]Yoneda T，Williams PJ，Hiraga T，Niewolna M，Nishimura RA.(2001)Bone-seekingclone exhibits different biological properties from theMDA-MB-231 parentalhuman breast cancer cells and a brain-seeking clonein vivo and in vitro.JBone Miner Res 16：1486-95.[4]Mundy G.R.(2002)Metastasis to bone：causes，consequences andtherapeutic opportunities.Nat Rev Cancer 2：584-93.[5]MiyauchiAJ，Alvarez EM，Greenfield A，Teti M，Grano S，ColucciA，Zambonin-Zallone FP，RossSL，Teitelbaum，Cheresh D.(1991)Recognition of osteopontin and related peptidesby an αvβ3 integrinstimulates immediate cell signals in osteoclasts.J BiolChem266：20369-20374.[6]Crippes BA，Engleman VW，Settle SL，Delarco J，Ornberg RL，Helfrich MH，Horton MA，Nickols GA.(1996)Antibody to β3 integrininhibitsosteoclast-mediated bone resorption in thethyroparathyroidectomizedrat.Endocrinology 137：918-924.[7]Horton MA，Taylor ML，Arnett TR，Helfrich MH.(1991)Arg-gly-asp(RGD)peptides and the anti-vitronectin receptor antibody23C6inhibit dentine resorption and cell spreading by osteoclasts.Exp CellRes 195：368-375.[8]Ross FP，Alvarez JI，Chappel J，Sander D，Butler WT，Farach-Carson MC，Mintz KA，Robey PG，Teitelbaum SL，Cheresh DA.(1993)Interactions between thebone matrix proteins osteopontin and bonesialoprotein and the osteoclastintegrin αvβ3 potentiate bone resorption.JBiol Chem 268：9901-9907. 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Claims

1.对αvβ3整联蛋白具有选择性的多肽或所述多肽的药学上可接受的盐，其中所述多肽为马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体，其中所述马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体由选自SEQ ID NO:57-69的氨基酸序列组成。

2.由选自SEQ ID NO:57-69的氨基酸序列组成的多肽、或所述多肽的药学上可接受的盐。

3.如权利要求1所述的多肽，其中所述马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体由SEQ ID NO:65的氨基酸序列组成。

4.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸由选自SEQID NO:50－54的核苷酸序列组成。

5.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸由SEQ IDNO:52的核苷酸序列组成。

6.如权利要求3所述的多肽，其中与马来亚蝮蛇蛇毒蛋白相比，所述多肽对α5β1的亲和性下降至少5倍。

7.如权利要求1所述的多肽，其中与马来亚蝮蛇蛇毒蛋白相比，所述多肽对血小板的亲和性下降至少5倍。

8.如权利要求1所述的多肽，其中与马来亚蝮蛇蛇毒蛋白相比，所述多肽对血小板的亲和性下降至少50倍。

9.如权利要求1所述的多肽，其中与马来亚蝮蛇蛇毒蛋白相比，所述多肽对血小板的亲和性下降至少100倍。

10.如权利要求1所述的多肽，其中与马来亚蝮蛇蛇毒蛋白相比，所述多肽对血小板的亲和性下降至少1000倍。

11.如权利要求1所述的多肽，其中与马来亚蝮蛇蛇毒蛋白相比，所述多肽对血小板的亲和性下降至少2000倍。

12.如权利要求1所述的多肽，其中与马来亚蝮蛇蛇毒蛋白相比，所述多肽在延长凝血时间方面显示降低的活性。

13.如权利要求1-12中任一项所述的多肽，其中所述多肽与白蛋白缀合或被聚乙二醇化。

14.生理上可接受的组合物，其包含权利要求1-13中任一项所述的多肽或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。

15.生理上可接受的组合物，其包含权利要求3所述的多肽或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。

16.生理上可接受的组合物，其包含权利要求13所述的多肽或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。

17.权利要求1所述的多肽或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防与αvβ3整联蛋白相关的疾病的药物中的用途，其中所述疾病选自骨质疏松症、骨内肿瘤细胞生长及其相关症状、恶性肿瘤诱导的高钙血症、血管生成相关的眼部疾病、佩吉特病、类风湿性关节炎和骨关节炎，其中所述症状为病理症状，其选自破骨细胞活性增加、骨吸收增加、骨损害、高钙血症、体重下降及其任意组合，且其中所述骨内肿瘤细胞生长包括骨癌细胞以及来源于前列腺癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌、肾癌、卵巢癌、胰腺癌和骨髓癌中的一种或多种的转移癌细胞，其中所述血管生成相关的眼部疾病选自年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病、角膜新生血管形成病、局部缺血诱导的新血管形成性视网膜病、高度近视以及早产儿视网膜病。

18.权利要求1所述的多肽或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防与αvβ3整联蛋白相关的疾病的药物中的用途，其中所述疾病选自骨质疏松症诱导的骨丧失。

19.如权利要求17或18所述的用途，其中所述的马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体由选自SEQID NO:63-67的氨基酸序列组成。

20.如权利要求17或18所述的用途，其中所述的马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体由SEQ IDNO:65的氨基酸序列组成。

21.如权利要求17或18所述的用途，其中所述的马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体由多核苷酸编码，所述多核苷酸由SEQ ID NO:52的核苷酸序列组成。

22.如权利要求17或18所述的用途，其中所述多肽与白蛋白缀合或被聚乙二醇化。

23.如权利要求17或18所述的用途，其中所述的马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体由SEQ IDNO:65的氨基酸序列组成，其中所述多肽与白蛋白缀合或被聚乙二醇化。

24.制备权利要求1所述的多肽的方法，其包括如下步骤：

a.用编码所述多肽的多核苷酸转染宿主细胞；

b.使所述宿主细胞在培养基中生长；以及

c.分离所述多肽。

25.如权利要求24所述的方法，其中步骤(b)进一步包括向所述培养基添加甲醇。

26.如权利要求25所述的方法，其进一步包括使所述宿主细胞在不含氨基酸的培养基中生长。

27.如权利要求25所述的方法，其中步骤(c)进一步包括进行柱色谱，以获得所述多肽。

28.编码权利要求1－13中任一项所述的多肽的多核苷酸。

29.如权利要求28所述的多核苷酸，其中所述马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体由选自SEQ IDNO:63-67的氨基酸序列组成。

30.如权利要求28所述的多核苷酸，其中所述马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体由SEQ ID NO:65的氨基酸序列组成。

31.如权利要求28所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸由SEQ ID NO:52的核苷酸序列组成。

32.如权利要求28所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码权利要求13所述的多肽。

33.对αvβ3整联蛋白具有选择性的多肽或所述多肽的药学上可接受的盐，其中所述多肽为马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体，其中所述马来亚蝮蛇蛇毒蛋白变体由选自SEQ ID NO:57-69的氨基酸序列组成，其中所述多肽与白蛋白缀合，且其中所述多肽包含接头氨基酸序列。

34.生理上可接受的组合物，其包含权利要求33所述的多肽或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。

35.权利要求33所述的多肽或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防与αvβ3整联蛋白相关的疾病的药物中的用途，其中所述疾病选自骨质疏松症、骨内肿瘤细胞生长及其相关症状、恶性肿瘤诱导的高钙血症、血管生成相关的眼部疾病、佩吉特病、类风湿性关节炎和骨关节炎，其中所述症状为病理症状，其选自破骨细胞活性增加、骨吸收增加、骨损害、高钙血症、体重下降及其任意组合，且其中所述骨内肿瘤细胞生长包括骨癌细胞以及来源于前列腺癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌、肾癌、卵巢癌、胰腺癌和骨髓癌中的一种或多种的转移癌细胞，其中所述血管生成相关的眼部疾病选自年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病、角膜新生血管形成病、局部缺血诱导的新血管形成性视网膜病、高度近视以及早产儿视网膜病。

36.权利要求35所述的多肽或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防与αvβ3整联蛋白相关的疾病的药物中的用途，其中所述疾病选自骨质疏松症诱导的骨丧失。