CN101787072A - 人血管生成素-2的特异结合剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了结合Ang-2的肽。还公开了包括所述肽的肽抗体，制备这样的肽和肽抗体的方法，用这样的肽和肽抗体治疗的方法。

Description

人血管生成素-2的特异结合剂
本申请是以下申请的分案申请：申请日：2002年10月11日；申请号：02824651.9(PCT/US02/32657)；发明名称：同上。
本申请要求2001年10月11日申请的美国临时申请登记号No.60/328,624的利益，该专利在此全文引作参考.
发明领域
本发明涉及识别血管生成素-2(Ang-2)并且与之结合的特异结合剂。更具体地说，本发明涉及特异性结合Ang-2的所述特异结合剂及其片段的制备，诊断用途，和治疗用途。
发明背景
血管发生，从存在的血管生成新的血管，对于很多生理和病理过程都是比需的。一般来说，血管发生由血管生成因子原和抗血管生成因子严格调节，但是在象癌症，眼新血管病，关节炎，和牛皮癣这样的疾病的情况下，该过程可能错误进行。Folkman，J.，Nat.Med.，1：27-31(1995)。
有很多种疾病已知与不受调节的或者不期望的血管发生相关。这样的疾病包括但不限于，眼新血管形成，例如视网膜病(包括糖尿病视网膜病)，与年龄有关的黄斑变性，牛皮癣，成血管瘤(hemangioblastoma)，血管瘤，动脉硬化，炎性疾病，例如类风湿性或风湿性炎症，尤其是关节炎(包括类风湿性关节炎)，或者其他慢性炎症，例如慢性哮喘，动脉粥样硬化或者移植后动脉粥样硬化，子宫内膜异位，和瘤，例如所谓的实体瘤和液体(或血液)肿瘤(例如白血病和淋巴瘤)。与不期望的血管发生相关的其他疾病对于那些本领域技术人员是显而易见的。
虽然很多信号转导系统在血管发生的调节中涉及，但是表征得最充分并且最具内皮细胞选择性系统之一涉及Tie-2受体酪氨酸激酶(称作″Tie-2″或″Tie-2R″(也称作″ORK″)；鼠Tie-2也称作″tek″)及其配体，血管生成素(Gale，N.W.和Yancopoulos，G.D.，Genes Dev.13：1055-1066[1999])。有四种已知的血管生成素；血管生成素-1(″Ang-1″)至血管生成素-4(″Ang-4″)。这些血管生成素也称作″Tie-2配体″.(Davis，S.，等，Cell，87：1161-1169[1996]；Grosios，K.，等，Cytogenet Cell Genet，84：118-120[1999]；Holash，J.，等，Investigative Ophthalmology&Visual Science，42：1617-1625[1999]；Koblizek，T.I.，等，Current Biology，8：529-532[1998]；Lin，P.，等，Proc Natl Acad Sci USA，95：8829-8834[1998]；Maisonpierre，P.C.，等，Science，277：55-60[1997]；Papapetropoulos，A.，等，Lab Invest，79：213-223[1999]；Sato，T.N.，等，Nature，375：70-74[1998]；Shyu，K.G.，等，Circulation，98：2081-2087[1998]；Suri，C.，等，Cell，87：1171-1180[1996]；Suri，C.，等，Science，282：468-471[1998]；Valenzuela，D.M.，等，Proceedings of the National Academy ofSciences of the USA，96：1904-1909[1999]；Witzenbichler，B.，等，J Biol Chem，273：18514-18521[1998])。Ang-1与Tie-2结合刺激培养的内皮细胞中的受体磷酸化作用，发现Ang-2刺激和拮抗Tie-2受体磷酸化作用(Davis，S.，等，[1996]，上文；Maisonpierre，P.C.，等，[1997]，上文；Kim，I.，J.H.Kim，等，Oncogene 19(39)：4549-4552(2000)；Teichert-Kuliszewska，K.，P.C.Maisonpierre，等，Cardiovascular Research 49(3)：659-70(2001))。
小鼠Tie-2和Ang-1敲除物的表型是类似的并且提示Ang-1-刺激的Tie-2磷酸化作用通过保持内皮细胞-支持细胞附着而介导子宫中发育血管的改变和稳定(Dumont，D.J.，等，Genes&Development，8：1897-1909[1994]；Sato，T.N.，等，Nature，376：70-74[1995]；Suri，C.，等，[1996]，上文)。认为Ang-1在血管稳定中的作用在成年人中是保守的，而且广泛而基本性表达(Hanahan，D.，Science，277：48-50[1997]；Zagzag，D.，等，Experimental Neurology，159：391-400[1999])。相反，Ang-2表达主要限于血管改造部位，认为在那里阻断Ang-1功能，从而诱导有益于血管发生的血管可塑性状态(Hanahan，D.，[1997]，上文；Holash，J.，等，Science，284：1994-1998[1999]；Maisonpierre，P.C.，等，[1997]，上文)。
很多公开的研究支持证明病态血管-选择性Ang-2表达与血管发生有关。这些病理学情况包括，例如，牛皮癣，黄斑变性，和癌症(Bunone，G.，等，American Journal of Pathology，155：1967-1976[1999]；Etoh，T.，等，Cancer Research，61：2145-2153[2001]；Hangai，M.，等，Investigative Ophthalmology&Visual Science，42：1617-1625[2001]；Holash，J.，等，[1999]上文；Kuroda，K.，等，Journal of Investigative Dermatology，116：713-720[2001]；Otani，A.，等，Investigative Ophthalmology&Visual Science，40：1912-1920[1999]；Stratmann，A.，等，American Journal ofPathology，153：1459-1466[1998]；Tanaka，S.，等，J Clin Invest，103：34-345[1999]；Yoshida，Y.，等，International Journal ofOncology，15：1221-1225[1999]；Yuan，K.，等，Journal ofPeriodontal Research，35：165-171[2000]；Zagzag，D.，等，[1999]上文)。这些研究大多数聚焦在癌症上，其中很多癌症类型表现出显示血管Ang-2表达。与在病理性血管发生中的表达相反，正常组织中Ang-2表达十分有限(Maisonpierre，P.C.，等，[1997]，上文；Mezquita，J.，等，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，260：492-498[1999])。在正常成年人体内血管发生的三个主要部位是卵巢，胎盘，和子宫；这些是其中检测到Ang-2mRNA的正常(即，非癌)组织中主要组织。
一些功能研究提示Ang-2可能在肿瘤血管发生中涉及。Ahmad等(Cancer Res.，61：1255-1259[2001])描述Ang-2超量表达并且支持性证明这与小鼠异种移植模型中肿瘤生长增加有关。也参见Etoh等，上文，和Tanaka等，上文，其中给出支持Ang-2超量表达与肿瘤血管过多相关的数据。但是，相反，Yu等.(Am.J.Path.，158：563-570[2001])报道数据支持证明Lewis肺癌和TA3乳房癌细胞中Ang-2超量表达延长用相应的转染子注射的小鼠的存活。
在过去的几年中，很多出版物提出Ang-1，Ang-2和/或Tie-2可能是抗癌治疗的靶物。例如，美国专利Nos.6,166,185，5,650,490，和5,814,464各自公开了抗-Tie-2配体抗体和受体的概念。L in等(Proc.Natl.Acad.Sci USA，95：8829-8834[1998])对小鼠注射腺病毒表达可溶Tie-2；声称可溶Tie-2减小小鼠产生的肿瘤的数目和大小。在最近的研究中，Lin等(J.CLin.Invest.，100：2072-2078[1997])对大鼠注射可溶形式的Tie-2；声称这种化合物减小大鼠的肿瘤大小。Siemeister等(Cancer Res.，59：3185-3189[1999])制备出表达Tie-2胞外结构域的人黑素瘤细胞系，对裸鼠注射这些细胞系，得出结论：声称可溶Tie-2导致肿瘤生长和肿瘤血管发生的″显著抑制″。从这个信息看，并且已知Ang-1和Ang-2都结合Tie-2，从这些研究不能清楚地看出i Ang-1，Ang-2，或Tie-2会是抗癌治疗的有吸引力的靶物。
提高这些分子的半寿期的一些肽与稳定的血浆蛋白例如I g恒定区的融合体描述于，例如，PCT公开WO 00/24782，2000年5月4日公开。
先前描述过提高分子半寿期的一种蛋白质或者其片段与一种稳定的血浆蛋白质例如Ig恒定区的融合体(例如，实施例，美国专利No.5,480,981；Zheng等，J.Immunol.，154：5590-5600，(1995)；Fisher等，N.Engl.J.Med.，334：1697-1702，(1996)；Van Zee，K.等，J.Immunol.，156：2221-2230，(1996)；美国专利No.5,808,029，1998年9月15日公开；Capon等，Nature，337：525-531，(1989)；Harvill等，Immunotech.，1：95-105，(1995)；WO 97/23614，1997年7月3日公开；PCT/US 97/23183，filed Dec.11，1997年12月11日申请；Linsley，J.Exp.Med.，174：561-569，(1991)；WO 95/21258，1995年8月10日公开)。
有效的抗-Ang-2疗法可能使大量的癌症患者受益，因为大多数实体肿瘤需要新血管化生长直径超过1-2毫米。这样的疗法对其他与血管发生相关的疾病例如视网膜病，关节炎和牛皮癣有广泛的应用。
对于特异性识别并结合Ang-2的新的药物有着未开发的需求。这样的药物将有用于对与Ang-2活性相关的病态的诊断筛选和治疗干预。
因此，本发明的一个目的是提供调节Ang-2活性的Ang-2的特异结合剂。本发明这样的药物采取肽抗体(peptibodies)形式，即，与其他分子例如抗体的Fc结构域融合的肽，其中肽部分特异性结合Ang-2。
本发明概述
在一个实施方案中，本发明涉及结合Ang-2的肽(在这里也称作多肽)。本发明还包括这样的肽的变体和衍生物。
在另一个实施方案中，本发明的肽和其变体和衍生物与载体连接。
在另一个实施方案中，所述肽可以和Fc结构域融合，从而提供肽抗体。任选地，所述肽抗体包括例如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：6，或SEQ ID NO：76-SEQ ID NO：157，以及其变体和衍生物的至少一种肽。此外，所述肽可以包括根据SEQ ID NO：65-SEQ ID NO：75，和SEQ ID NO：158所示的结构式的至少一种肽。
在另一个实施方案中，本发明提供编码特异结合剂，和其变体和衍生物的核酸分子。
在另一个实施方案中，本发明提供编码肽抗体，和其变体和衍生物的核酸分子。任选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO：33-SEQ ID NO：53。
在另一个实施方案中，本发明提供通过对需要的受试者施用有效量的特异结合剂而减小肿瘤的方法。本发明还提供抑制受试者血管发生的方法，包括对需要的受试者施用有效量的特异结合剂。本发明进一步提供治疗受试者癌症的方法，包括对需要的受试者施用有效量的特异结合剂。
本发明还涉及能结合Ang-2的多肽及其生理可接受盐，其中所述多肽包括氨基酸序列WDPWT(SEQ ID NO：65)，并且其中所述多肽长度5-50个氨基酸。所述多肽还包括氨基酸序列：
WDPWTC(SEQ ID NO：66)
以及其生理可接受盐。另外，所述多肽可以包括氨基酸序列：
Cz2WDPWT(SEQ ID NO：67)
其中z2是酸性或中性极性氨基酸残基，以及其生理可接受盐。所述多肽可以进一步包括氨基酸序列：
Cz2WDPWTC(SEQ ID NO：68)
其中z2是酸性或中性极性氨基酸残基，以及其生理可接受盐。
在另一个实施方案中，本发明涉及能结合Ang-2的多肽及其生理可接受盐，包括下式的氨基酸序列：
a1a2a3Ca5WDPWTCa12a13a14(SEQ ID NO：69)
其中：
a1，a2，和a3各自独立地是氨基酸残基；
a5是氨基酸残基；
a12不存在或者是氨基酸残基；
a13不存在或者是中性疏水性，中性极性的，或者碱性氨基酸残基；
a14是中性疏水性或中性极性氨基酸残基。在优选的实施方案中：
a1是V，I，P，W，G，S，Q，N，E，K，R，或H；
a2是V，P，M，G，S，Q，D，E，K，R，或H；
a3是A，V，P，M，F，T，G，D，E，K，或H；
a8是A，V，G，Q，N，D，或E；
a12是S，Q，N，D，E，K，或R；
a13是L，T，或H；和
a14是V，L，I，W，或M。
在更优选的实施方案中，a1是Q；a2是E；a3是E；a5是D或E；a12是D或E；a13是H；和a14是M。
要明白在这里使用带有角注的小写字母(例如a1和b1)意在鉴别氨基酸位置，不是意指给定氨基酸的单字母缩写。在这里用大写字母表示单字母氨基酸缩写。
本发明进一步涉及能结合Ang-2的包括下式氨基酸序列的多肽及其生理可接受盐：
b1b2b3b4b5b6Cb8WDPWTCb15b16b17b18b19b20(SEQ ID NO：70)
其中：
b1不存在或者是氨基酸残基；
b2不存在或者是中性疏水的，中性极性的，或者碱性氨基酸残基；
b3，b4，b5，和b6各自独立地不存在或者是氨基酸残基；
b8是氨基酸残基；
b15不存在或者是氨基酸残基；
b16不存在或者是中性疏水的，中性极性的，或者碱性氨基酸残基；
b17不存在或者是中性疏水的或中性极性氨基酸残基；
b18，b19，和b20各自独立地不存在或者是氨基酸残基。在优选的实施方案中：
b1不存在，或者是A，V，L，P，W，F，T，G，S，Q，N，K，R，或H；
b2不存在，或者是A，V，L，I，P，W，M，T，G，S，Y，N，K，R，或H；
b3不存在，或者是A，L，I，P，W，M，T，G，S，Q，N，E，R，或H；
b4是V，I，P，W，G，S，Q，N，E，K，R，或H；
b5是V，P，M，G，S，Q，D，E，K，R，或H；
b6是A，V，P，M，F，T，G，D，E，K，或H；
b8是A，V，G，Q，N，D，或E；
b15是S，Q，N，D，E，K，或R；
b16是L，T，或H；
b17是V，L，I，W，或M；
b18不存在，或者是A，V，L，P，W，F，T，G，Y，Q，D，E，或R；
b19不存在，或者是V，L，I，P，T，G，S，Y，Q，N，D，E，或R；并且
b20不存在，或者是V，L，P，W，M，T，G，S，Y，Q，N，D，K，或R。
在更优选的实施方案中，b1不存在，或者是P，或T；b2不存在，或者是I，或N；b3不存在，或者是R，或I；b4是Q；b5是E；b6是E；b8是D或E；b15是D或E；b16是H；b17是M；b18不存在，或W，或P；b19不存在，或G，或E；和b20不存在，或V，或K。
还明白本发明优选涉及包括选自SEQ ID NO：4，和SEQ ID NO：76至SEQ ID NO：118的至少一种氨基酸序列的多肽以及其生理可接受盐，其中包含的多肽能结合Ang-2。下面给出肽序列：
表1
  肽   SEQ ID NO.   肽序列
  Con4-44   76   PIRQEECDWDPWTCEHMWEV
  Con4-40   77   TNIQEECEWDPWTCDHMPGK
  Con4-4   78   WYEQDACEWDPWTCEHMAEV
  Con4-31   79   NRLQEVCEWDPWTCEHMENV
  Con4-C5   80   AATQEECEWDPWTCEHMPRS
  Con4-42   81   LRHQEGCEWDPWTCEHMFDW
  Con4-35   82   VPRQKDCEWDPWTCEHMYVG
  Con4-43   83   SISHEECEWDPWTCEHMQVG
  Con4-49   84   WAAQEECEWDPWTCEHMGRM
  Con4-27   85   TWPQDKCEWDPWTCEHMGST
  Con4-48   86   GHSQEECGWDPWTCEHMGTS
  Con4-46   87   QHWQEECEWDPWTCDHMPSK
  Con4-41   88   NVRQEKCEWDPWTCEHMPVR
  Con4-36   89   KSGQVECNWDPWTCEHMPRN
  Con4-34   90   VKTQEHCDWDPWTCEHMREW
  Con4-28   91   AWGQEGCDWDPWTCEHMLPM
  Con4-39   92   PVNQEDCEWDPWTCEHMPPM
  Con4-25   93   RAPQEDCEWDPWTCAHMDIK
  Con4-50   94   HGQNMECEWDPWTCEHMFRY
  Con4-38   95   PRLQEECVWDPWTCEHMPLR
  肽   SEQ ID NO.   肽序列
  Con4-29   96   RTTQEKCEWDPWTCEHMESQ
  Con4-47   97   QTSQEDCVWDPWTCDHMVSS
  Con4-20   98   QVIGRPCEWDPWTCEHLEGL
  Con4-45   99   WAQQEECAWDPWTCDHMVGL
  Con4-37   100   LPGQEDCEWDPWTCEHMVRS
  Con4-33   101   PMNQVECDWDPWTCEHMPRS
  AC2-Con4   102   FGWSHGCEWDPWTCEHMGST
  Con4-32   103   KSTQDDCDWDPWTCEHMVGP
  Con4-17   104   GPRISTCQWDPWTCEHMDQL
  Con4-8   105   STIGDMCEWDPWTCAHMQVD
  AC4-Con4   106   VLGGQGCEWDPWTCRLLQGW
  Con4-1   107   VLGGQGCQWDPWTCSHLEDG
  Con4-C1   108   TTIGSMCEWDPWTCAHMQGG
  Con4-21   109   TKGKSVCQWDPWTCSHMQSG
  Con4-C2   110   TTIGSMCQWDPWTCAHMQGG
  Con4-18   111   WVNEVVCEWDPWTCNHWDTP
  Con4-1199   12   VVQVGMCQWDPWTCKHMRLQ
  Con4-16   113   AVGSQTCEWDPWTCAHLVEV
  Con4-11   114   QGMKMFCEWDPWTCAHIVYR
  Con4-C4   115   TTIGSMCQWDPWTCEHMQGG
  Con4-23   116   TSQRVGCEWDPWTCQHLTYT
  Con4-15   117   QWSWPPCEWDPWTCQTVWPS
  Con4-9   118   GTSPSFCQWDPWTCSHMVQG
  TN8-Con4*   4   QEECEWDPWTCEHM
*要明白一些肽和/或肽抗体可以包含前缀″TN″，″TN8″，或″TN12″，对于给定的肽抗体这个前缀可以存在或不存在。这样，例如，术语″TN8-Con4″和″Con4″在这里可互换使用。
在另一个实施方案中本发明涉及具有下式的物质成分(composition of matter)及其多聚体：
(X1)a-F1-(X2)b
其中：
F1是载体；
X1和X2各自独立地选自
-(L1)c-P1；
-(L1)c-P1-(L2)d-P2；
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3；和
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4；
其中P1，P2，P3，和P4的一个或多个各自独立地包括这里描述的多肽。例如，在优选的实施方案中，P1，P2，P3，和P4能各自独立地包括SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：6，和/或SEQ ID NO：76至SEQ ID NO：157的多肽。
在另一个优选的实施方案中，物质成分是下式：
X1-F1
或
F1-Y2
及其生理可接受盐，其中X1，F1，和X2如这里所定义。在另一个实施方案中，物质成分是下式：
F1-(L1)c-P1
及其生理可接受盐，其中L1，F1，和P1如这里所定义。在另一个实施方案中，物质成分是下式：
F1-(L1)c-P1-(L2)d-P2
及其生理可接受盐，其中L1，F1，P1，P2，和c和d如这里所定义。在另一个实施方案中，物质成分是下式：
F1-(L1)c-F1-(L2)d-P2
及其生理可接受盐。在优选的实施方案中，F1是其片段的Fc结构域。
本发明进一步涉及能结合Ang-2的包括下式氨基酸序列的多肽及其生理可接受盐：
Pc2Dc4Lc6c7c8LY(SEQ ID NO：71)
其中
c2是中性疏水氨基酸残基
c4是A，D，或E
c6是酸性氨基酸残基
c7是酸性氨基酸残基；并且
c8是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基。在优选实施方案中，c2是L或M。在另一个优选实施方案中，c6是D或E。
本发明进一步涉及能结合Ang-2的包括下式氨基酸序列的多肽及其生理可接受盐：
d1d2d3d4Pd6Dd8Ld10d11d12LY d15d16d17d18d19d20d21d22
(SEQ ID NO：72)
其中，
d1不存在，或者是氨基酸残基；
d2不存在，或者是中性极性，酸性，或碱性氨基酸残基；
d3不存在，或者是中性疏水性或中性极性氨基酸残基；
d4不存在，或者是氨基酸残基；
d6是中性疏水氨基酸残基；
d8是A，D，或E；
d10是酸性氨基酸残基；
d11是氨基酸残基；
d12是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基；
d15不存在，或者是中性极性，酸性，或碱性氨基酸残基；
d16不存在，或者是中性极性，酸性，或碱性氨基酸残基；
d17不存在，或者是中性疏水，或中性极性氨基酸残基；
d18不存在，或者是中性疏水，或中性极性氨基酸残基；
d19不存在，或者是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基；
d20不存在，或者是氨基酸残基；
d21不存在，或者是中性疏水，酸性，或碱性氨基酸残基；
d22不存在，或者是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基。在优选的实施方案中：
d1是T，S，Q，R，或H；
d2是T，Q，N，或K；
d3是F；
d4是M，Q，E，或K；
d6是L或M；
d8是D或E；
d10是E；
d11是Q或E；
d12是T或R；
d15是Y，D，E，或K；
d16是Q；
d17是W或F；
d18是L，I，M，或T；
d19是L，F，或Y；
d20是Q，D，或E；
d21不存在，或者是Q，或H；
d22不存在，或者是A，L，G，S，或R.
在优选的实施方案中，下面给出包括选自SEQ ID NO：6，和SEQ IDNO：119至SEQ ID NO：142的至少一种氨基酸序列的多肽，其中包含的多肽能结合Ang-2，以及其生理可接受盐。下面给出SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：119-142：
  肽   SEQ ID NO.   肽序列
  L1-1   119   QNYKPLDELDATLYEHFIFHYT
  L1-2   120   LNFTPLDELEQTLYEQWTLQQS
  L1-3   121   TKFNPLDELEQTLYEQWTLQHQ
  L1-4   122   VKFKPLDALEQTLYEHWMFQQA
  L1-5   123   VKYKPLDELDEILYEQQTFQER
  L1-7   124   TNFMPMDDLEQRLYEQFILQQG
  L1-9   125   SKFKPLDELEQTLYEQWTLQHA
  L1-10   126   QKFQPLDELEQTLYEQFMLQQA
  L1-11   127   QNFKPMDELEDTLYKQFLFQHS
  L1-12   128   YKFTPLDDLEQTLYEQWTLQHV
  L1-13   129   QEYEPLDELDETLYNQWMFHQR
  L1-14   130   SNFMPLDELEQTLYEQFMLQHQ
  肽   SEQ ID NO.   肽序列
  L1-15   131   QKYQPLDELDKTLYDQFMLQQG
  L1-16   132   QKFQPLDELEETLYKQWTLQQR
  L1-17   133   VKYKPLDELDEWLYHQFTLHHQ
  L1-18   134   QKFMPLDELDEILYEQFMFQQS
  L1-19   135   QTFQPLDDLEEYLYEQWIRRYH
  L1-20   136   EDYMPLDALDAQLYEQFILLHG
  L1-21   137   HTFQPLDELEETLYYQWLYDQL
  L1-22   138   YKFNPMDELEQTLYEEFLFQHA
  AC6-L1   139   TNYKPLDELDATLYEHWILQHS
  L1-C1   140   QKFKPLDELEQTLYEQWTLQQR
  L1-C2   141   TKFQPLDELDQTLYEQWTLQQR
  L1-C3   142   TNFQPLDELDQTLYEQWTLQQR
  L1   6   KFNPLDELEETLYEQFTFQQ
本发明还涉及能结合Ang-2的包括下式氨基酸序列的多肽及其生理可接受盐：
Rpe3e4e5e6e7G(SEQ ID NO：73)
其中
e3是中性极性氨基酸残基；
e4是酸性极性氨基酸残基；
e5是中性极性或酸性氨基酸残基；
e6是中性疏水氨基酸残基；
e7是中性疏水氨基酸残基。在优选的实施方案中，e3是Y或C。在另一个优选的实施方案中，e4是D或E。在另一个优选的实施方案中，e6是I或M。
本发明进一步涉及能结合Ang-2的包括下式氨基酸序列的多肽及其生理可接受盐：
f1f2f3f4RPf7f8f9f10f11Gf13f14f15f16f17f18f19f20(SEQ ID NO：74)其中，
f1是中性疏水或中性极性氨基酸残基；
f2是中性疏水或中性极性氨基酸残基；
f3是中性极性或酸性氨基酸残基；
f4是中性疏水或中性极性氨基酸残基；
f7是中性极性氨基酸残基；
f8是酸性氨基酸残基；
f9是中性极性或酸性氨基酸残基；
f10是中性疏水氨基酸残基；
f11是中性疏水氨基酸残基；
f13是中性疏水或中性极性氨基酸残基；
f14是中性疏水或中性极性氨基酸残基；
f15是中性极性氨基酸残基；
f16是中性极性氨基酸残基；
f17是中性极性或酸性氨基酸残基；
f18是中性疏水或碱性氨基酸残基；
f19是中性疏水或中性极性氨基酸残基；并且
f20是中性疏水或中性极性氨基酸残基。
在优选的实施方案中：
f1是S，A，或G；
f2是G，Q，或P；
f3是Q，G，或D；
f4是L，M，或Q；
f7是C或Y；
f8是E或D；
f9是E，G，或D；
f10是I或M；
f11是F或L；
f13是C或W；
f14是G或P；
f15是T或N；
f16是Q，Y，或K；
f17是N，D，或Q；
f18是L，V，W，或R；
f19是A，Q，Y，或I；并且
f20是L，A，G，或V。
在更优选的实施方案中，本发明涉及包括选自SEQ ID NO：3，和SEQ ID NO：143至SEQ ID NO：148的至少一种氨基酸序列的多肽，及其生理可接受盐，其中所述多肽能结合Ang-2。SEQ ID NO：3，和SEQID NO：143至SEQ ID NO：148如下。
  肽   SEQ ID NO.   肽序列
  Con1-1   143   AGGMRPYDGMLGWPNYDVQA
  Con1-2   144   QTWDDPCMHILGPVTWRRCI
  Con1-3   145   APGQRPYDGMLGWPTYQRIV
  Con1-4   146   SGQLRPCEEIFGCGTQNLAL
  Con1-5   147   FGDKRPLECMFGGPIQLCPR
  Con1-6   148   GQDLRPCEDMFGCGTKDWYG
  Con1   3   KRPCEEIFGGCTYQ
>另一方面，本发明涉及能结合Ang-2的包括下式的氨基酸序列的多肽及其生理可接受盐：
Cg2Gg4g5DPFTg10GCg13(SEQ ID NO：75)其中
g2是酸性氨基酸残基；
g4是中性疏水氨基酸残基；
g5是E，D，或Q；
g10是中性疏水或中性极性氨基酸残基；
g13是酸性残基。在优选的实施方案中，g2是E或D。在另一个优选的实施方案中，g4是V或M。在另一个优选的实施方案中，g10是F或Q。在另一个实施方案中，g13是D或E。
本发明进一步涉及能结合Ang-2的包括下式氨基酸序列的多肽及其生理可接受盐：
h1h2h3h4Ch6Gh8h9DPFTh14GCh17h18h19h20(SEQ ID NO：158)其中，
h1不存在或者是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基；
h2是中性疏水或中性极性氨基酸残基；
h3是酸性氨基酸残基；
h4是中性疏水或中性极性氨基酸残基；
h6是酸性氨基酸残基；
h8是中性疏水氨基酸残基；
h9是E，D，或Q；
h14是中性疏水或中性极性氨基酸残基；
h17是酸性氨基酸残基；
h18是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基；
h19是中性疏水或中性极性氨基酸残基；和
h20不存在或者是氨基酸残基。
在优选的实施方案中，
h1不存在或者是A，L，M，G，K，或H；
h2是L，F，或Q；
h3是D或E；
h4是W或Y；
h6是D或E；
h8是V或M；
h14是F或Q；
h17是D或E；
h18是M，Y，N，或K；
h19是L或Q；和
h20不存在或者是M，T，G，S，D，K，或R。
在更优选的实施方案中，本发明涉及包括选自SEQ ID NO：5，或SEQ ID NO：149至SEQ ID NO：157的至少一种氨基酸序列的多肽，和其生理可接受盐，其中所述多肽能结合Ang-2。SEQ ID NO：5，和SEQID NO：149至SEQ ID NO：157如下。
  肽 SEQ ID NO.   肽序列
  12-9-1   149   GFEYCDGMEDPFTFGCDKQT
  12-9-2   150   KLEYCDGMEDPFTQGCDNQS
  12-9-3   151   LQEWCEGVEDPFTFGCEKQR
  12-9-4   152   AQDYCEGMEDPFTFGCEMQK
  12-9-5   153   LLDYCEGVQDPFTFGCENLD
  12-9-6   154   HQEYCEGMEDPFTFGCEYQG
  肽 SEQ ID NO.   肽序列
  12-9-7   155   MLDYCEGMDDPFTFGCDKQM
  12-9-C2   156   LQDYCEGVEDPFTFGCENQR
  12-9-C1   157   LQDYCEGVEDPFTFGCEKQR
  12-9   5   FDYCEGVEDPFTFGCDNH
在高度优选的实施方案中，本发明涉及具有下式的物质成分及其多聚体；及其生理可接受盐：
(X1)q-F1-(X2)r
其中：
F1是载体；
X1和X2各自独立地选自
-(L1)s-P1；
-(L1)s-P1-(L2)t-P2；
-(L1)s-P1-(L2)t-P2-(L3)u-P3；并且
-(L1)s-P1-(L2)t-P2-(L3)u-P3(L4)v-P4；
其中P1，P2，P3，和P4中的一个或多个各自独立地包括选自下组的多肽：
(a)氨基酸序列WDPWT(SEQ ID NO：65)，其中所述多肽长度是5-50个氨基酸；
(b)氨基酸序列WDPWTC(SEQ ID NO：66)；
(c)氨基酸序列Cz2WDPWT(SEQ ID NO：67)，其中z2是酸性或中性极性氨基酸残基；
(d)氨基酸序列Cz2WDPWTC(SEQ ID NO：68)，其中z2是酸性或中性极性氨基酸残基；
(e)氨基酸序列Pc2Dc4Lc6c7c8LY(SEQ ID NO：71)，其中c2是中性疏水氨基酸残基；c4是A，D，或E；c6是酸性氨基酸残基；c7是氨基酸残基；c8是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基；
(f)氨基酸序列Rpe3e4e5e6e7G(SEQ ID NO：73)，其中e3是中性极性氨基酸残基；e4是酸性氨基酸残基；e5是中性极性或酸性氨基酸残基；e6是中性疏水氨基酸残基；e7是中性疏水氨基酸残基；
(g)氨基酸序列Cg2Gg4g5DPFTg10GCg13(SEQ ID NO：75)，其中g2是酸性氨基酸残基；g4是中性疏水氨基酸残基；g5是中性极性或酸性氨基酸残基；g10是中性疏水或中性极性氨基酸残基和；g13是酸性残基；
(h)SEQ ID NO：1的多肽；
(i)SEQ ID NO：2的多肽；并且
(j)SEQ ID NO：7的多肽；
其中L1，L2，L3，和L4各自独立地是连接体；并且q，r，s，t，u，和v各自独立地是0或1，前提是q和r中至少一个是。
可以明白本发明进一步涉及包括这里描述的至少一种肽和载体的融合多肽，及其生理可接受盐，其中所述融合多肽能结合Ang-2。在融合多肽中，载体优选是至少一个Fc结构域，聚乙二醇，脂质，胆固醇基团，糖类，和寡糖。本领域技术人员明白其他合适的载体，例如白蛋白等，都包括在本发明的范围内。
本领域技术人员认识到能将各种各样的分子插入特异结合剂结构中。因此，给定的分子能被插入，例如，肽和特异结合剂的载体部分之间，或者插入到肽本身部分中，同时保持特异结合剂的期望的活性。人们能够容易地插入例如象下面的分子，例如Fc结构域或者其片段，聚乙二醇或其他相关的分子，例如葡聚糖，脂肪酸，脂质，胆固醇，小的碳水化合物，肽，细胞毒性物质，化学治疗药物，这里描述的可检测部分(包括荧光剂，放射标记例如放射性同位素)，寡糖，寡核苷酸，多核苷酸，干涉(或其他)RNA，酶，激素，或者类似物。本领域技术人员明白适合在这种形式中插入的其他分子，并且包括在本发明的范围内。这包括例如在两个连接的氨基酸之间插入期望的分子，任意地连接合适的连接体。作为例子，在Con4(C)肽抗体序列中：
M-Fc-GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMLE(SEQ ID NO：23)
本领域技术人员容易例如在两个相邻谷氨酰胺(″QQ″)残基之间插入期望的分子来实现期望的结构和/或功能，同时保留肽结合Ang-2的能力。因此，这个序列可以如下进行修饰：
M-Fc-GGGGGAQ-[分子]-QEECEWDPWTCEHMLE
如果期望，能加入合适的连接体分子。进一步明白在分子的很多位置能插入分子，包括在合适的侧链上，如下在载体和肽序列之间：
M-Fc-[分子]-GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMLE
或者在本领域技术人员期望的任何其他位置中插入。其他合适的实施方案对于本领域技术人员是显而易见的。
在另一个实施方案中，本发明涉及这里描述的编码本发明的特异结合剂(包括但不限于肽和/或肽抗体)的多核苷酸。本领域技术人员明白在氨基酸序列已知的情况下，应用公知技术能容易地测定相应的核苷酸序列。参见，例如Suzuki，D.，An Introduction to GeneticAnalysis，W.H.Freeman Pub.Co.(1986)。下面给出编码本发明的肽的举例的核苷酸序列。本领域技术人员认识到多于一个的密码子能编码给定氨基酸，因此本发明涉及编码本发明的肽和/或肽抗体的任何核苷酸序列。
  肽   序列  鉴定  号   肽序列   举例的DNA  序列
   Con4-44    76    PIRQEECDWDPWTCEHMWEV   ccgatccgtcaggaagaatgcga  ctgggacccgtggacctgcgaac  acatgtgggaagtt(SEQ ID  NO：159)
   Con4-40    77    TNIQEECEWDPWTCDHMPGK   accaacatccaggaagaatgcga  atgggacccgtggacctgcgacc  acatgccgggtaaa(SEQ ID  NO：160)
   Con4-4    78    WYEQDACEWDPWTCEHMAEV   tggtacgaacaggacgcttgcga  atgggacccgtggacctgcgaac  acatggctgaagtt(SEQ ID  NO：161)
   Con4-31    79    NRLQEVCEWDPWTCEHMENV   aaccgtctgcaggaagtttgcgaa  tgggacccgtggacctgcgaaca  catggaaaacgtt(SEQ ID  NO：162)
    Con4-  C5    80     AATQEECEWDPWTCEHMPRS   gctgctacccaggaagaatgcga  atgggacccgtggacctgcgaac  acatgccgcgttcc(SEQ ID  NO：163)
    Con4-42    81     LRHQEGCEWDPWTCEHMFDW   ctgcgtcaccaggaaggttgcga  atgggacccgtggacctgcgaac  acatgttcgactgg(SEQ ID  NO：164)
    Con4-35    82     VPRQKDCEWDPWTCEHMYVG   gttccgcgtcagaaagactgcga  atgggacccgtggacctgcgaac  acatgtacgttggt(SEQ ID  NO：165)
    Con4-43    83     SISHEECEWDPWTCEHMQVG   tccatctcccacgaagaatgcgaa  tgggacccgtggacctgcgaaca  catgcaggttggt(SEQ ID  NO：360)
    Con4-49    84     WAAQEECEWDPWTCEHMGRM   tgggctgctcaggaagaatgcga  atgggatccgtggacttgcgaaca  catgggtcgtatg(SEQ ID  NO：166)
    Con4-27    85     TWPQDKCEWDPWTCEHMGST   acttggccgcaggacaaatgcga  atgggatccgtggacttgcgaaca  catgggttctact(SEQ ID  NO：167)
    Con4-48    86     GHSQEECGWDPWTCEHMGTS   ggtcactcccaggaagaatgcgg  ttgggacccgtggacctgcgaac  acatgggtacgtcc(SEQ ID  NO：168)
    Con4-46    87     QHWQEECEWDPWTCDHMPSK   cagcactggcaggaagaatgcga  atgggacccgtggacctgcgacc  acatgccgtccaaa(SEQ ID  NO：169)
    Con4-41    88     NVRQEKCEWDPWTCEHMPVR   aacgttcgtcaggaaaaatgcgaa  tgggacccgtggacctgcgaaca  catgccggttcgt(SEQ ID  NO：170)
    Con4-36    89     KSGQVECNWDPWTCEHMPRN   aaatccggtcaggttgaatgcaac  tgggacccgtggacctgcgaaca  catgccgcgtaac(SEQ ID  NO：171)
    Con4-34    90     VKTQEHCDWDPWTCEHMREW   gttaaaacccaggaacactgcga  ctgggacccgtggacctgcgaac  acatgcgtgaatgg(SEQ ID  NO：172)
    Con4-28    91    AWGQEGCDWDPWTCEHMLPM   gcttggggtcaggaaggttgcga  ctgggacccgtggacctgcgaac  acatgctgccgatg(SEQ ID  NO：173)
    Con4-39    92     PVNQEDCEWDPWTCEHMPPM   ccggttaaccaggaagactgcga  atgggacccgtggacctgcgaac  acatgcc gccgatg(SEQ ID  NO：174)
    Con4-25    93     RAPQEDCEWDPWTCAHMDIK   cgtgctccgcaggaagactgcga  atgggacccgtggacctgcgctc  acatggacatcaaa(SEQ ID  NO：175)
    Con4-50    94     HGQNMECEWDPWTCEHMFRY   cacggtcagaacatggaatgcga  atgggacccgtggacctgcgaac  acatgttccgttac(SEQ ID  NO：176)
    Con4-38    95     PRLQEECVWDPWTCEHMPLR   ccgcgtctgcaggaagaatgcgtt  tgggacccgtggacctgcgaaca  catgccgctgcgt(SEQ ID  NO：177)
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    Con4-25    93     RAPQEDCEWDPWTCAHMDIK   cgtgctccgcaggaagactgcga  atgggacccgtggacctgcgctc  acatggacatcaaa(SEQ ID  NO：175)
    Con4-47    97     QTSQEDCVWDPWTCDHMVSS   cagacctcccaggaagactgcgtt  tgggacccgtggacctgcgacca  catggtttcctcc(SEQ ID  NO：179)
    Con4-20    98     QVIGRPCEWDPWTCEHLEGL   caggttatcggtcgtccgtgcgaa  tgggacccgtggacctgcgaaca  cctggaaggtctg(SEQ ID  NO：180)
    Con4-45    99     WAQQEECAWDPWTCDHMVGL   tgggctcagcaggaagaatgcgc  ttgggacccgtggacctgcgacc  acatggttggtctg(SEQ ID  NO：181)
    Con4-37    100     LPGQEDCEWDPWTCEHMVRS   ctgccgggtcaggaagactgcga  atgggacccgtggacctgcgaac  acatggttcgttcc(SEQ ID  NO：182)
    Con4-33    101     PMNQVECDWDPWTCEHMPRS   ccgatgaaccaggttgaatgcga  ctgggacccgtggacctgcgaac  acatgccgcgttcc(SEQ ID  NO：183)
    AC2-  Con4    102     FGWSHGCEWDPWTCEHMGST   ttcggttggtctcacggttgcgaat  gggatccgtggacttgcgaacac  atgggttctacc(SEQ ID  NO：184)
    Con4-32    103     KSTQDDCDWDPWTCEHMVGP   aaatccacccaggacgactgcga  ctgggacccgtggacctgcgaac  acatggttggtccg(SEQ ID  NO：185)
    Con4-17    104     GPRISTCQWDPWTCEHMDQL  ggtccgcgtatctccacctgccag tgggacccgtggacctgcgaaca catggaccagctg(SEQ ID NO：186)
    Con4-8    105     STIGDMCEWDPWTCAHMQVD  tccaccatcggtgacatgtgcgaa tgggacccgtggacctgcgctca catgcaggttgac(SEQ ID NO：187)
    AC4-  Con4    106     VLGGQGCEWDPWTCRLLQGW  gttctgggtggtcagggttgcgaa tgggacccgtggacctgccgtctg ctgcagggttgg(SEQ ID NO：188)
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    Con4-  C1    108     TTIGSMCEWDPWTCAHMQGG  accaccatcggttccatgtgcgaa tgggacccgtggacctgcgctca catgcagggtggt(SEQ ID NO：190)
    Con4-21    109     TKGKSVCQWDPWTCSHMQSG  accaaaggtaaatccgtttgccag tgggacccgtggacctgctccca catgcagtccggt(SEQ ID NO：191)
    Con4-  C2    110     TTIGSMCQWDPWTCAHMQGG  accaccatcggttccatgtgccag tgggacccgtggacctgcgctca catgcagggtggt(SEQ ID NO：192)
    Con4-18    111     WVNEVVCEWDPWTCNHWDTP  tgggttaacgaagttgtttgcgaat gggacccgtggacctgcaaccac tgggacaccccg(SEQ ID NO：193)
    Con4-19    112     VVQVGMCQWDPWTCKMRLQ  gttgttcaggttggtatgtgccagt gggacccgtggacctgcaaacac atgcgtctgcag(SEQ ID NO：194)
    Con4-16    113     AVGSQTCEWDPWTCAHLVEV   gctgttggttcccagacctgcgaat  gggacccgtggacctgcgctcac  ctggttgaagtt(SEQ ID  NO：195)
    Con4-11    114     QGMKMFCEWDPWTCAHIVYR   cagggtatgaaaatgttctgcgaat  gggacccgtggacctgcgctcac  atcgtttaccgt(SEQ ID  NO：196)
    Con4-  C4    115     TTIGSMCQWDPWTCEHMQGG   accaccatcggttccatgtgccag  tgggacccgtggacctgcgaaca  catgcagggtggt(SEQ ID  NO：197)
    Con4-23    116     TSQRVGCEWDPWTCQHLTYT   acctcccagcgtgttggttgcgaat  gggacccgtggacctgccagcac  ctgacctacacc(SEQ ID  NO：198)
    Con4-15    117     QWSWPPCEWDPWTCQTVWPS   cagtggtcctggccgccgtgcga  atgggacccgtggacctgccaga  ccgtttggccgtcc(SEQ ID  NO：199)
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    L1-19     135     QTFQPLDDLEEYLYEQWIRRYH   cagaccttccagccgctggacga  cctggaagaatacttgtacgaaca  gtggatccgtcgttaccac  (SEQIDNO：218)
    L1-20     136     EDYMPLDALDAQLYEQFILLHG   gaagactacatgccgctggacgc  tctggacgctcagctgtacgaaca  gttcatcctgctgcacggt(SEQ  ID NO：219)
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    AC6-L1     139     TNYKPLDELDATLYEHWILQHS   accaactacaaaccgctggacga  actggacgctaccctgtacgaaca  ctggatcctgcagcactcc  (SEQIDNO：222)
    L1-C1     140     QKFKPLDELEQTLYEQWTLQQR   cagaaattcaaaccgctggacga  actggaacagaccctgtacgaac  agtggaccctgcagcagcgt  (SEQIDNO：223)
    L1-C2     141     TKFQPLDELDQTLYEQWTLQQR   accaaattccagccgctggacga  actggaccagaccctgtacgaac  agtggaccctgcagcagcgt  (SEQID NO：224)
    L1-C3     142     TNFQPLDELDQTLYEQWTLQQR   accaacttccagccgctggacga  actggaccagaccctgtacgaac  agtggaccctgcagcagcgt  (SEQ ID NO：225)
    L1     6     KFNPLDELEETLYEQFTFQQ   aaattcaacccgctggacgagctg  gaagagactctgtacgaacagttt  acttttcaacag(SEQ ID  NO：226)
    Con1-1     143     AGGMRPYDGMLGWPNYDVQA   gctggtggtatgcgtccgtacgac  ggtatgctgggttggccgaactac  gacgttcaggct(SEQ ID  NO：227)
    Con1-2     144     QTWDDPCMHILGPVTWRRCI   cagacttgggacgatccgtgcatg  cacattctgggtccggttacttggc  gtcgttgcatc(SEQ ID NO：  228)
    Con1-3     145     APGQRPYDGMLGWPTYQRIV   gctccgggtcagcgtccgtacga  cggtatgctgggttggccgaccta  ccagcgtatcgtt(SEQ ID  NO：229)
    Con1-4     146     SGQLRPCEEIFGCGTQNLAL   tccggtcagctgcgtccgtgcgaa  gaaatcttcggttgcggtacccag  aacctggctctg(SEQ ID  NO：230)
    Con1-5     147     FGDKRPLECMFGGPIQLCPR   ttcggtgacaaacgtccgctggaa  tgcatgttcggtggtccgatccag  ctgtgcccgcgt(SEQ ID  NO：231)
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    12-9-1     149     GFEYCDGMEDPFTFGCDKQT   ggtttcgaatactgcgacggtatg  gaagacccgttcaccttcggttgc  gacaaacagacc(SEQ ID  NO：233)
    12-9-2     150     KLEYCDGMEDPFTQGCDNQS   aaactggaatactgcgacggtatg  gaagacccgttcacccagggttg  cgacaaccagtcc(SEQ ID  NO：234)
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  gaagacccgttcaccttcggttgc  gaaaaacagcgt(SEQ ID  NO：235)
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    12-9-7     155     MLDYCEGMDDPFTFGCDKQM   atgctggactactgcgaaggtatg  gacgacccgttcaccttcggttgc  gacaaacagatg(SEQ ID  NO：239)
    12-9-C2     156     LQDYCEGVEDPFTFGCENQR   ctgcaggactactgcgaaggtgtt  gaagacccgttcaccttcggttgc  gaaaaccagcgt(SEQ ID  NO：240)
  gaagacccgttcaccttcggttgc  gaaaaacagcgt(SEQ ID  NO：235)
    12-9-C1     157     LQDYCEGVEDPFTFGCEKQR   ctgcaggactactgcgaaggtgtt  gaagacccgttcaccttcggttgc  gaaaaacagcgt(SEQ ID  NO：241)
   12-9    5    FDYCEGVEDPFTFGCDNH   ttcgactactgcgaaggtgttgaa  gacccgttcactttcggctgtgata  accac(SEQ ID NO：242)
在另一个实施方案中，本发明涉及包括至少一个本发明的多核苷酸的表达载体。在另一个实施方案中，本发明涉及包括该表达载体的宿主细胞。明白宿主细胞优选是原核细胞(例如大肠杆菌细胞)或真核细胞。
本发明还涉及含有与药学可接受载体混合的有效量的这里描述的成分的药物组合物。
本发明还涉及抑制哺乳动物不期望的血管发生的方法，包括施用治疗有效量的这里描述的多肽或组合物。本发明还涉及调节哺乳动物血管发生的方法，包括施用治疗有效量的这里描述的多肽或组合物。本发明还涉及抑制哺乳动物不期望的血管发生为特征的肿瘤生长的方法，包括施用治疗有效量的这里描述的多肽或组合物。另外，本发明涉及治疗哺乳动物癌症的方法，包括施用治疗有效量的这里描述的多肽或组合物，和化疗药物。在优选的实施方案中，所述化疗药物至少是5-FU，CPT-11，和脱乙酰基紫杉醇(Taxotere)中的一种。但是要明白也能使用其他合适的化疗药物和其他癌症疗法。
本发明还涉及调节哺乳动物血管渗透性或血浆渗漏中至少一项的方法，包括施用治疗有效量的这里描述的多肽或组合物。本发明进一步涉及治疗哺乳动物中以下病症中的至少一种的方法：眼新血管病，肥胖，成血管瘤，血管瘤，动脉硬化，炎性疾病，炎性紊乱，动脉粥样硬化，子宫内膜异位，肿瘤性疾病，骨相关疾病，或者牛皮癣，包括施用治疗有效量的这里描述的多肽或组合物。
可以明白本发明的特异结合剂能被用来治疗与失去调节的或不期望的血管发生相关的多种疾病。这样的疾病包括但不限于，眼新血管化，例如视网膜病(包括糖尿病视网膜病和与年龄相关的黄斑变性)，牛皮癣，成血管瘤，血管瘤，动脉硬化，炎性疾病，例如类风湿性或风湿性炎症，特别是关节炎(包括类风湿性关节炎)，或者其他慢性炎性紊乱，例如慢性哮喘，动脉或移植后动脉粥样硬化，子宫内膜异位，和肿瘤性疾病，例如所谓实体瘤和液体瘤(例如白血病)。通过施用特异结合剂能治疗的另外的疾病对于本领域技术人员是显而易见的。这样的另外的疾病包括但不限于肥胖，血管渗透，血浆渗漏，骨相关疾病，包括骨质疏松。因此，本发明进一步涉及治疗这些与失去控制或不期望的血管发生相关的疾病的方法。
本发明的其他实施方案通过这里提供的公开内容容易变成显而易见的。
附图的简要说明
图1描述用本发明的肽抗体TN8-Con4-C，或者用磷酸缓冲盐水(PBS)治疗的携带A-431肿瘤的小鼠肿瘤体积(y-轴)对时间(x-轴)的曲线图。实施例中描述了详细情况。
图2小鼠肽抗体PK(50μg剂量)。描述用50微克剂量的2*Con4-C，L1-7-N，或L1-21-N肽抗体处理过的野生小鼠的肽抗体浓度(y-轴)对给药后时间(x-轴)的曲线图。实施例中描述了详细情况。
图3抗-Ang2肽抗体抑制A431肿瘤异种移植物生长。描述用根据本发明的肽抗体2*Con4-C，或者用磷酸缓冲盐水(PBS)或对照肽抗体处理过的携带A431肿瘤的小鼠肿瘤体积(y-轴)对时间(x-轴)的曲线图。实施例中描述了详细情况。
图41mg/ml的抗-Ang2肽抗体对培养的A431细胞的生长没有影响。描述代表用根据本发明的肽抗体Con4-C，对照肽抗体处理过的，或者未处理的培养的A431细胞的体外生长的曲线图。实施例中描述了详细情况。
图5抗-Ang2肽抗体抑制Colo205肿瘤生长。描述用根据本发明的肽抗体Con4-C，肽抗体L1-7-N，肽抗体L1-21-N，或肽抗体2*Con4-C，或者用磷酸缓冲盐水(PBS)，抗-Ang-2抗体(Ab536)，或Fc处理过的Colo205肿瘤细胞的肿瘤体积(y-轴)对时间(x-轴)的曲线图。实施例中描述了详细情况。
图6抗-Ang2肽抗体抑制Colo205肿瘤生长。描述用不同剂量的根据本发明的肽抗体2*Con4-C，或者用磷酸缓冲盐水(PBS)，或Fc处理过的携带Colo205异种移植肿瘤小鼠肿瘤体积(y-轴)对时间(x-轴)的曲线图。实施例中描述了详细情况。
图7抗-Ang2肽抗体治疗减小Colo205肿瘤异种移植物的CD31-染色密度。描述用根据本发明的肽抗体2*Con4-C，或者用对照肽抗体处理过的携带Colo205异种移植肿瘤小鼠肿瘤体积(y-轴)对时间(x-轴)的曲线图。图7还描述CD31染色面积/这些肽抗体总的肿瘤面积的曲线图。实施例中描述了详细情况。
图8抗-Ang2Pbs抑制Colo205肿瘤生长，与何时开始给药无关。描述用根据本发明的肽抗体2*Con4-C，或者用磷酸缓冲盐水(PBS)，或对照肽抗体处理过的携带Colo205异种移植肿瘤小鼠肿瘤体积(y-轴)对时间(x-轴)的曲线图。实施例中描述了详细情况。该曲线图表明与何时开始给药无关，抗-Ang-2肽抗体能抑制Colo205肿瘤生长。
图9长期给药研究中的完全反应率。描述对A431和Colo-205异种移植模型，使用抗体Ab536或者用肽抗体2*Con4-C，从雌性裸鼠获得的完全反应(CR)率的总结。实施例中描述了详细情况。
图10AColo205肿瘤模型中Pb与脱乙酰基紫杉醇的组合。描述用根据本发明的肽抗体2*Con4-C，2*Con4-C和脱乙酰基紫杉醇的组合，或者用磷酸缓冲盐水(PBS)，或用PBS加脱乙酰基紫杉醇处理过的携带Colo205异种移植肿瘤小鼠肿瘤体积(y-轴)对时间(x-轴)的曲线图。实施例中描述了详细情况。
图10B Colo205肿瘤模型中Pb与5-FU的组合。描述用根据本发明的肽抗体2*Con4-C，2*Con4-C和5-FU的组合，或者用磷酸缓冲盐水(PBS)，或用PBS加5-FU处理过的携带Colo205异种移植肿瘤小鼠肿瘤体积(y-轴)对时间(x-轴)的曲线图。实施例中描述了详细情况。
图11A佐剂-诱导的关节炎模型中抗-Ang2肽抗体抑制爪肿胀。描述用根据本发明的肽抗体2*Con4-C，或者用磷酸缓冲盐水(PBS)，或用对照肽抗体处理过的大鼠佐剂诱导的关节炎模型，或者正常或关节炎对照物的爪肿胀水平(AUC+-SE)曲线图。实施例中描述了详细情况。
图11B佐剂-诱导的关节炎模型中抗-Ang2肽抗体抑制骨矿物质密度减小。描述用根据本发明的肽抗体2*Con4-C，或者用磷酸缓冲盐水(PBS)，或用对照肽抗体处理过的大鼠佐剂诱导的关节炎模型，或者正常或关节炎对照物的爪骨矿物质密度(BMD)曲线图。实施例中描述了详细情况。
图11C佐剂-诱导的关节炎模型中抗-Ang2肽抗体对体重减轻的影响。描述用根据本发明的肽抗体2*Con4-C，或者用磷酸缓冲盐水(PBS)，或用对照肽抗体处理过的大鼠佐剂诱导的关节炎模型，或者正常或关节炎对照物的体重变化曲线图。实施例中描述了详细情况。
图12CON4-C肽抗体抑制VEGF-诱导的角膜血管发生。描述说明VEGF-诱导的大鼠角模血管发生的抑制作用的两个图。第一个图描述对用牛血清白蛋白(BSA)，VEGF加磷酸缓冲盐水(PBS)，或VEGF加本发明的肽抗体Con4-C处理过的大鼠测定的血管数目。第二个图说明用BSA，VEGF加磷酸缓冲盐水(PBS)，或VEGF加本发明的肽抗体Con4-C处理过的大鼠的血管面积。实施例中描述了详细情况。
图13A，13B，和13C表位定位。描述分别在全长人Ang-2(hAng-2)，hAng-2的N-末端，和hAng-2的C-末端，对于根据本发明的肽抗体TN8-Con4-C，L1-7-N，和12-9-3-C，以及对于对照肽抗体，Tie2-Fc，C2B8，或5B12的表位定位数据。实施例中描述了详细情况。
图14描述利用Sapidyne KinExA分析测定的根据本发明的2*Con-4-C肽抗体的结合亲和力(KD)。
本发明的详细描述
这里使用这部分的标题只是为了组织的目的，而不是为了在任何方面限制描述的主题。
对于重组DNA分子，蛋白质，和抗体制备，以及对于组织培养和细胞转化可以应用标准技术。酶促反应和纯化技术一般根据厂商说明进行或者根据现有技术通常公开的使用常规方法进行，例如Sambrook等(分子克隆：实验室手册“Molecular Cloning：A LaboratoryManual”冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.[1989])中给出的那些，或者根据这里描述的。除非提供具体的定义，这里描述的相关术语，试验方法和分析化学，合成有机化学，药学和药剂化学技术是本领域公知的和常规使用的。标准技术可以用于化学合成，化学分析，药物制备，制剂，和送递，和对患者的治疗。
定义
除非另外具体说明，贯穿说明书使用的术语如下定义。
术语″Ang-2″指美国专利No.6,166,185的图6中给出的多肽(″Tie-2配体-2″)或者其片段以及相关的多肽，包括等位变体，剪接变体，衍生物，取代，缺失，和/或插入变体，融合肽和多肽，和种间同系物或者其片段。Ang-2多肽可以包括或可以不包括另外的末端残基，例如，前导序列，引导序列，氨基末端甲硫氨酸，和赖氨酸残基，和/或标记或融合蛋白序列，取决于制备它的方法。
术语″生物活性″当与Ang-2或Ang-2特异性结合剂相关联使用时指具有Ang-2或Ang-2特异性结合剂的至少一种活性特征的肽或多肽。Ang-2的特异性结合剂就Ang-2的至少一种生物活性来说可以具有激动剂，拮抗剂，或中和或阻断活性。
术语″特异性结合剂″指一种分子，优选蛋白质分子，其特异结合Ang-2，及这里定义的其变体和衍生物。一种特异性结合剂可以是一种蛋白质，肽，核酸，碳水化合物，脂质，或者优先与Ang-2结合的小分子量化合物。在优选的实施方案中，根据本发明的特异性结合剂是肽或肽抗体，以及其片段，变体或衍生物，或者单独地或者与其他氨基酸序列组合，是公知技术提供的。这样的技术包括但并不限于酶促裂解，化学裂解，肽合成或重组技术。本发明的抗-Ang-2特异性结合剂能结合Ang-2的部分，调节，例如，抑制或促进，Ang-2的生物活性和/或其他Ang-2-相关活性。
这里使用的术语″变体″包括其中天然存在的(至少一种公知的)结合剂的氨基 酸序列中的氨基酸残基被插入，缺失和/或取代的那些肽或多肽。本发明的变体包括如下所述的融合蛋白。
″衍生物″包括以不同于插入，缺失或取代的变体的一些方式化学修饰的那些结合剂。
″特异性结合Ang-2″指本发明的特异性结合剂(例如肽抗体，或者其肽部分)识别并结合成熟的，全长或部分长度的人Ang-2多肽或者其直向同源物的能力，这样其亲和力(根据例如这里描述的亲和力ELISA或BIAcore分析测定)或者其中和能力(根据这里描述的例如，中和作用ELISA分析或类似分析来测定)至少是相同的任何其他血管生成素或其他肽或多肽的亲和力或中和能力的大小的10倍，但是任意地是50倍，100，250或500倍，或者甚至至少1000倍，其中肽抗体的肽部分第一次与人Fc部分融合用于在这样的分析中评价。
术语″表位″指在一个或多个结合剂的抗原结合区能被特异性结合剂例如肽抗体识别和结合的任何分子的部分。表位通常由化学活性表面分子基团例如氨基酸或糖基侧链组成，并且具有特异三维结构特征以及特异电荷特征。这里使用的表位可以是连续或不连续的。
术语″抑制和/或中和表位″是一种表位，当被特异结合剂例如肽抗体结合时，它导致体内，体外，或者原位包含这样的表位的分子，细胞，或生物体的生物活性的丧失(或者至少降低)。在本发明的上下文中，中和表位位于Ang-2的生物活性区或者与Ang-2的生物活性区有关。或者，术语″活性表位″是一种表位，当被本发明的特异结合剂例如抗体结合时，导致Ang-2的生物活性构象激活，或者至少维持。
术语″肽抗体片段″指肽或多肽，其包括完全完整肽抗体的部分。
当与象核酸分子，多肽，宿主细胞等这样的生物材料相关使用时，术语″天然存在的″指在自然界发现的没有被人改变的那些。
术语″分离的″当与Ang-2相关或与Ang-2的特异性结合剂相关的使用时，指没有至少一种其天然环境中发现的污染多肽或化合物的化合物，优选基本上没有会干扰其治疗或诊断用途的污染哺乳动物多肽。
术语″成熟″当与Ang-2肽抗体或者其片段相关使用时，或者与Ang-2的其他蛋白质特异性结合剂相关使用时，指没有前导序列或信号序列的肽或多肽。在例如在原核宿主细胞中表达本发明的结合剂时，″成熟″肽或多肽还可以包括另外的氨基酸残基(但是仍然没有前导序列)，例如氨基末端甲硫氨酸，或者一个或多个甲硫氨酸和赖氨酸残基。可以使用用这种方法制备的肽或多肽，这些另外的氨基酸残基已经被去除或者没有被去除。
术语″有效量″和″治疗有效量″与Ang-2的特异性结合剂相关使用时，指对于支持Ang-2的一种或几种生物活性水平可观察变化是有用的或必需的量。所述变化可以是Ang-2活性水平的提高或降低。优选地，所述变化是Ang-2活性水平的降低。
术语″肽抗体″指包括与至少一种肽连接的抗体Fc结构域的分子。2000年5月4日公开的PCT公开WO 00/24782中一般性描述了肽抗体的制备。
这里使用的术语″变体″包括例如肽或肽-载体化合物的那些分子，例如其中这样的分子的氨基酸序列中氨基酸残基被插入，缺失和/或取代的本发明的肽抗体。具有插入的一个或多个氨基酸的变体包括下面描述的融合蛋白。
″衍生物″包括象以不同于插入，缺失或取代变体的一些方式化学修饰的肽抗体这样的那些肽和/或肽-载体化合物。
术语″片段″指包括小于这样的肽和/或肽-载体化合物全长氨基酸序列的部分的肽和/或肽-载体化合物。这样的片段例如可以从所述肽或肽-载体化合物的氨基酸序列的氨基末端截短，羧基末端截短，和/或中间缺失一个残基而得到。从供选择的RNA剪接或者从体内或体外蛋白酶活性可以得到片段。通过化学肽合成方法，或者通过修饰编码肽，肽-载体化合物，或者肽抗体的Fc部分和/或肽部分的多核苷酸也可以构建这样的片段。
术语″Fc″指本发明载体的一种类型，并且包括整个单体的蛋白分解消化得到的抗体的非抗原结合片段的序列，不管是单体形式还是多聚体形式。本发明中Fc来源优选是全人Fc，并且可以是任何免疫球蛋白，但是IgG1和IgG2是优选的。但是，这里也包括部分人Fc分子，或者从非人物种获得的Fc分子。Fc′s由单体多肽构成，单体多肽可以通过共价键(即，二硫键)和非共价键连接成二聚体或多聚体形式。根据类别(例如，IgG，IgA，IgE)或亚类(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgA1，IgGA2)，天然Fc分子的单体亚基之间分子内二硫键的数目范围是1-4。天然Fc的一个例子是从IgG的木瓜蛋白酶消化得到的二硫键键合的二聚体[参见Ellison等(1982)，Nucl.Acids.Res.10：4071-9]。这里使用的术语天然Fc″一般是单体，二聚体，和多聚体。
术语″Fc结构域″包括天然Fc和如上定义的Fc变体分子和序列。关于Fc变体和天然Fc′s，术语″Fc结构域″包括单体或多聚体形式的分子，不管是从整个抗体消化而来还是其他方法制备的。
术语″多聚体″对于Fc结构域或者包括Fc结构域的分子使用时，指具有共价，非共价，或者通过共价和非共价相互作用结合的两条或几条多肽链的分子。IgG分子典型地形成二聚体；IgM，五聚体；IgD，二聚体；和IgA，单体，二聚体，三聚体，或四聚体。通过开发序列并且得到Fc天然Ig源活性或者通过将这样的天然Fc衍生化(如下定义)可以形成多聚体。
术语″二聚体″对于Fc结构域或者包括Fc结构域的分子使用时，指具有共价或非共价结合的两条多肽链的分子。
术语″载体″指防止治疗蛋白质降解和/或提高治疗蛋白质半寿期，降低毒性，降低免疫原性，或者提高其生物活性的分子。载体的例子包括Fc结构域以及线性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)，多熔素，葡聚糖，等)；支链聚合物(参见，例如，Denkenwalter等人的美国专利No.4,289,872，15，1981年9月15日公布；Tam的美国专利No.5,229,490，20，1993年7月20日公布；Frechet等的WO 93/21259，1993年10月28日公开)；脂质；胆固醇基团(例如类固醇)；碳水化合物或寡糖；或者与补救受体结合的任何天然或合成蛋白质，多肽或肽。下文进一步描述载体。
术语″衍生″和″衍生物″或″衍生化″分别包括方法和得到的产物，其中(1)化合物具有环状部分；例如，化合物中半胱氨酰残基之间的交联；(2)化合物被交联或者具有交联位点；例如，化合物具有半胱氨酰残基，因此培养物中或者体内形成交联二聚体；(3)非肽基键置换一个或多个肽基键；(4)N-末端被下面的基团置换：-NRR1，NRC(O)R1，-NRC(O)OR1，-NRS(O)2R1，-NHC(O)NHR，琥珀酰亚胺基团，或者取代的或未取代的苄氧羰基-NH-，其中R和R1和环取代基如下文定义；(5)C-末端被-C(O)R2或-NR3R4置换，其中R2，R3和R4如下文定义；和(6)通过用能与选择的侧链或末端残基反应的试剂处理而修饰其中各氨基酸部分的化合物。下文进一步描述衍生物。
术语″肽″指大约3至大约75个氨基酸的分子，优选大约5至50个氨基酸的分子，8至40个氨基酸的分子更优选，大约10至25个氨基酸的那些分子最优选。肽可以是天然存在的或人工的(即，非天然存在的)氨基酸序列。举例的肽可以通过这里提出的任何方法制备，例如肽文库中包含的(例如，噬菌体展示文库)，通过化合合成制备，通过蛋白质消化衍生，或者利用重组DNA技术制备。
术语”药学活性”指测得如此描述的物质具有影响药学参数(例如血压，血细胞量，胆固醇水平)或疾病状态(例如癌症，自身免疫失调等)的活性。
术语”拮抗剂肽”或”抑制剂肽”指阻断或者一定程度干扰感兴趣的相关蛋白质的生物活性，或者具有与感兴趣的相关蛋白质的已知的拮抗剂或抑制剂相比的生物活性的肽。因此，术语”Ang-2-拮抗剂肽”包括鉴定为或衍生为具有Ang-2-拮抗剂特征的肽。
另外地，这里也包括本发明的化合物的生理可接受盐。所谓”生理可接受盐”意指已知或者后来发现是药学可接受的任何盐。一些具体的例子是：乙酸盐，三氟乙酸盐，氢卤化物，例如盐酸盐和氢溴化物；硫酸烟；柠檬酸盐；酒石酸盐；乙醇酸盐；和草酸盐，甲磺酸盐，和磷酸盐。
肽抗体
本发明的一个方面涉及开发Ang-2肽抗体。蛋白质配体和它的受体的相互作用经常在相对大的界面发生。但是，根据对人生长激素及其受体所证明的，只有界面处几个关键残基是大部分结合能的致因。Clackson等，Science 267：383-6(1995)。大多数蛋白质配体只是展示正确拓扑学中的结合表位或者发挥与结合不相关的功能。因此，只有“肽”长度(一般2-40个氨基酸)的分子能结合给定大的蛋白质配体的受体蛋白质。这样的肽可以模拟大蛋白配体的生物活性(“肽激动剂”)，或者，通过竞争结合，抑制大蛋白配体的生物活性(“肽拮抗剂”)。
噬菌体展示技术是鉴定这样的肽激动剂和拮抗剂中的有力方法。参见，例如，Scott等，Science 249：386(1990)；Devlin等，Science249：404(1990)；美国专利No.5,223,409，1993年6月29日；美国专利No.5,733,731，1998年3月31日；美国专利No.5,498,530，1996年3月12日；美国专利No.5,432,018，issued Jul.11，1995年7月11日；美国专利No.5,338,665，1994年8月16日；美国专利No.5,922,545，1999年7月13日；WO 96/40987，1996年12月19日公开；和WO 98/15833，1998年4月16日(这些文献在此引作参考)。在肽噬菌体展示文库中，通过与丝状噬菌体的外被蛋白融合能展示随机肽序列。如果期望，展示的肽能相对抗体-固定的受体的胞外结构域被亲和力洗脱。通过连续几轮亲和力纯化和反复持续培养可以富集保留的噬菌体。对最好的结合肽测序，鉴定肽的一个或多个结构相关家族中的关键残基。参见，例如，Cwirla等，Science 276：1696-9(1997)，其中鉴定了两个不同的家族。可以提出肽序列，其残基通过丙氨酸扫描或者通过DNA水平诱变可以被安全置换。可以制备诱变文库并且筛选，进一步优化最佳结合剂的序列。Lowman，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26：401-24(1997)。
可以利用蛋白质-蛋白质相互作用的结构分析提出模拟大蛋白配体结合活性的肽。在这样的分析中，晶体结构可以提示从中可以设计肽的大蛋白配体的决定性残基的身 份和相对取向。参加，例如，Takasaki等，Nature Biotech 15：1266-70(1997)。也可以使用这些分析方法来研究受体蛋白质和噬菌体展示筛选的肽之间的相互作用，可以提出对肽的进一步修饰来提高结合亲和力。
肽研究中有与噬菌体展示相竞争的其他方法。肽文库可以与lac阻抑蛋白的羧基末端融合并且在大肠杆菌中表达。另一个以大肠杆菌为基础的方法通过与肽聚糖-结合脂蛋白(PAL)融合在胞外膜上展示。下文中，这些和相关的方法通称为″E.Coli展示″。在另一个方法中，在核糖体释放之前随机RNA的翻译停止，产生多肽文库，它们相关的RNA仍然连接着。在下文中，这种以及相关的方法通称为″核糖体展示″。其他方法利用肽与RNA的化学键合。参见，例如，Roberts和Szostak，Proc Natl Acad Sci USA，94：12297-303(1997)。在下文中，这种以及相关的方法通称为″RNA-肽筛选″。开发化学衍生的肽文库，其中肽固定在稳定的非生物材料上，例如聚乙烯棒或溶剂可渗透树脂。另一个化学衍生的肽文库使用光刻法扫描固定在载玻片上的肽。在下文中，这种以及相关的方法通称为″化学-肽扫描″。化学-肽扫描的优点在于它让使用D-氨基酸和其他非天然类似物，以及非肽元件。生物和化学方法综述见Wells和Lowman，Curr.Opin.Biotechnol.，3：355-62(1992)。
概念上，人们利用噬菌体展示和提到的其他方法可以发现任何蛋白质的肽模拟物。这些方法已经被用于表位定位，用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用中决定性氨基酸，这引导发现新的治疗物质。参见，例如，Cortese等，Curr.Opin.Biotech.7：616-21(1996)。现在最经常在免疫学研究中使用肽文库，例如表位定位。参见Kreeger，TheScientist 10(13)：19-20(1996)。
噬菌体展示文库筛选鉴定的肽被认为引导治疗药物的研发而不是作为治疗药物本身。和其他蛋白质和肽一样，它们在体内可能通过肾滤，通过网状内皮组织细胞清除机理，或者通过蛋白水解降解作用[Francis，(上文)]而被快速去除。结果，目前本领域使用肽验证药物靶物或者作为通过化学文库筛选可能不会容易地或快速地鉴定的有机化合物的设计平台[Lowman，(上文)；Kay等，(上文)]。本领域从通过其方法这样的肽能更容易地获得抗血管发生治疗药物的方法中受益。
肽抗体的结构
在根据本发明制备的物质成分中，肽可以通过肽的N-末端或C-末端与载体连接。这样，本发明的载体-肽分子可以通过下面五个化学式及其多聚体描述：
  (X1)a-F1-(X2)b   (式I)
  X1-F1   (式II)
  F1-X2   (式III)
  F1-(L1)c-P1   (式IV)
  F1-(L1)c-P1-(L2)d-P2   (式V)
其中：
F1是载体(优选Fc结构域)；
X1和X2各自独立地选自-(L1)c-P1，-(L1)c-P1-(L2)d-P2，-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3，和-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4
P1，P2，P3，和P4各自独立地是这里描述的药学活性肽的序列；
L1，L2，L3，和L4各自独立地是连接体；和
″a″，″b″，″c″，″d″，″e″，和″f″各自独立地是0或1，前提是″a″和″b″至少一个是1。
肽
本发明涉及选择性结合或特异性结合Ang-2的肽。与本发明结合可以使用任何数目的这种肽，噬菌体展示，特别地，用于产生在本发明中使用的肽，已经证明对随机肽文库进行亲和力筛选能用来鉴定任何基因产物的任何位点的肽配体。Dedman等，J.Biol.Chem.268：23025-30(1993)。
通过本领域公知的任何方法可以制备本发明的肽。使用单字母氨基酸缩写。在任何序列中(贯穿说明书始终，除非在特殊情况下另外具体说明)，″X″意思是可以存在20种天然存在的氨基酸残基或者非天然存在的氨基酸(下文在提到″变体″时描述)的任一种。这些肽的任一个可以串联连接(即，顺序地)，有或没有连接体，表中提供了串联连接的实施例。连接体列为″L″并且可以是这里描述的任何连接体。为了清楚起见，串联重复和连接体用短线隔开。任何含有半胱氨酰残基的肽可以与另一个含有Cys-的肽交联，其中任一个或者两者可以与载体连接。具有一个以上Cys残基的任何肽还可以形成肽内二硫键。这些肽的任一个可以根据这里所述被衍生化。关于其中羧基末端可以被氨基带帽的衍生物，带帽氨基-NH2。对于其中氨基酸残基被氨基酸残基之外的部分取代的衍生物，S表示取代作用，它表示Bhatnagar等，J.Med.Chem.39：3814-9(1996)，和Cuthbertson等，J.Med.Chem.40：2876-82(1997)中描述的任何部分，这两篇文献被引作参考。除非另外注明，所有的肽都通过肽键连接。
载体
在一个实施方案中，本发明提供至少一种与至少一种载体(F1，F2)通过肽的一个氨基酸残基的N-末端，C-末端或侧链连接。也可以使用多个载体；例如，各末端的几个Fc或一个末端的一个Fc，和在另一个末端和侧链处的一个PEG基团。
Fc结构域是一个优选的载体。Fc结构域可以被用来与肽的N-末端或C-末端或者N-末端和C-末端融合。
如上文所指出的，Fc变体是本发明范围内合适的载体。天然Fc可以被广泛修饰形成根据本发明的Fc变体，前提是保持与救助受体结合。参见，例如WO 97/34631和WO 96/32478。在这样的Fc变体中，人们可以去除提供本发明的融合分子不是必需的结构特征或功能活性的天然Fc的一个或多个位点。例如通过在所述位点取代或缺失残基，插入残基，或者截短含有所述位点的部分，人们可以去除这些位点。插入或取代的残基也可以是改变的氨基酸，例如肽模拟物或D-氨基酸。有很多原因使得Fc变体是所期望的，下面描述其中的几个。举例的Fc变体包括分子和序列，其中：
1.去除二硫键形成中涉及的位点。这样的去除可以避免与用来产生本发明的分子的宿主细胞中存在的其他含有半胱氨酸的蛋白质反应。为此目的，N-末端含有半胱氨酸的片段可以被截短，或者半胱氨酸残基可以被缺失或者被其他氨基酸取代(例如，丙氨酰，丝氨酰)。即使当半胱氨酸残基被去除时，单链Fc结构域仍然能形成非共价连接在一起的二聚体Fc结构域。
2.修饰天然Fc，使得它与选择的宿主细胞更相容。例如，人们可以去除典型天然Fc的N-末端附近的PA序列，它可以被大肠杆菌中的消化酶例如脯氨酸亚氨基肽酶识别。人们还可以加上一个N-末端甲硫氨酰残基，特别是当在细菌细胞例如大肠杆菌中重组表达该分子的时候。
3.去除天然Fc的N-末端的一部分，防止在选择的宿主细胞中表达时的N-末端不均匀性。为此目的，在N-末端可以缺失头20个氨基酸残基的任何氨基酸残基，特别是位置1，2，3，4和5处的那些。
4.去除一个或多个糖基化位点。一般糖基化的残基(例如，天冬酰胺)可以带来细胞溶解反应。这样的残基可以被缺失或被没有糖基化的残基取代(例如，丙氨酸)。
5.去除与补体的相互作用中涉及的位点，例如C1q结合位点。例如，人们可以缺失或取代人IgG1的EKK序列。补体收集对于本发明的分子可能不是有利的，因此可以用这样一种Fc变体避免。
6.去除影响与补救受体之外的Fc受体结合的位点。天然Fc可以具有与对于本发明的融合分子不是必需的一些白细胞相互作用的位点，因此可以被去除。
7.去除ADCC位点。ADCC位点是本领域公知的。有关I gG1中的ADCC位点，参见，例如，Molec.Immunol.29(5)：633-9(1992)。这些位点也是对于本发明的融合分子不是必需的，因此可以被去除。
8.当天然Fc是从非人抗体衍生的时，天然Fc可以被人源化。典型地，为了将天然Fc人源化，人们可以用人天然Fc正常发现的残基取代非人天然Fc中选择的残基。抗体人源化技术是本领域公知的。
可供选择的载体可以是蛋白质，多肽，肽，抗体，抗体片段，或者能与补救受体结合的小分子(例如，肽模拟化合物)。例如，热敏可以使用Presta等人的1998年4月14日公布的美国专利No.5,739,277中描述的多肽作为载体。通过噬菌体展示也可以选择用于与FcRn补救受体结合的肽。这样的补救受体-结合化合物也包括在“载体”的意义中并且包括在本发明的范围内。应该对这样的载体选择延长的半寿期(例如，通过避免蛋白酶识别的序列)和降低的免疫原性(例如，通过抗体人源化中发现的有利的非免疫原性序列)。
如上文指出的，对于F1和F2也可以使用聚合物载体。现在可以获得连接用作载体的化学部分的各种方法，参见，例如，专利合作条约(″PCT″)国际公开No.WO 96/11953，标题″N-末端化学修饰的蛋白质成分和方法″，这里全文引作参考。该PCT公开其中公开了水溶性聚合物与蛋白质的N-末端的选择性连接。
优选的聚合物载体是聚乙二醇(PEG)。PEG基团可以是任何常规分子量并且可以是支链或支链的。PEG的重均分子量优选范围是大约2千道尔顿(″kDa″)至大约100kDa，更优选大约5kDa至大约50kDa，最优选大约5至大约10kDa。PEG基团一般通过PEG部分上的反应团(例如，醛基，氨基，巯基，或酯基)与本发明化合物上的反应团(例如，醛基，氨基，或酯基)通过酰化作用或还原性烷基化作用而与本发明的化合物连接。
合成肽的PEG化作用的优用策略包括，通过在溶液中形成共轭键，化和肽和PEG部分，所述肽和PEG部分各自带有彼此相互反应的特定官能度。应用本领域公知的常规固相合成方法能容易地制备肽。预先在特定位置用合适的官能团将肽″预活化″在与PEG部分反应之前纯化母体并且完全表征。肽和PEG的连接通常在水相中发生并且能通过反相分析HPLC容易地监测。PEG化肽能容易地通过制备HPLC纯化并且通过分析HPLC，氨基酸分析和激光解吸质谱表征。
多糖聚合物是可以用于蛋白质修饰的水溶性聚合物的另一种类型。葡聚糖是由主要通过一个1-6键连接的葡萄糖的各个亚基构成的多糖聚合物。葡聚糖本身有很多分子量范围，并且容易获得大约1kDa至大约70kDa的分子量。葡聚糖是在本发明中其本身或者与另一种载体(例如，Fc)联合用作载体的合适的水溶性聚合物。参见，例如，WO96/11953和WO 96/05309。有人报道过与治疗性或诊断性免疫球蛋白偶联的葡聚糖的使用；参见，例如，欧洲专利公开No.0315456，在此引作参考。当将葡聚糖用作根据本发明的载体时，大约1kDa至大约20kDa的葡聚糖是优选的。
连接体
所有的″连接体″是随意的。当存在时，其化学结构不是关键的，因为它主要作为间隔基团。连接体优选由肽键连接在一起的氨基酸制成。因此，在优选的实施方案中，连接体由肽键连接的1-20个氨基酸构成，其中氨基酸选自20中天然存在的氨基酸。这些氨基酸中的一个或多个可以被糖基化，这是本领域技术人员公知的。在更优选的实施方案中，1-20个氨基酸选自甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，和赖氨酸。更优选地，连接体由大多数无空间位阻的氨基酸例如甘氨酸和丙氨酸构成。因此，优选的连接体是聚甘氨酸(特别是(Gly)5，(Gly)8)，聚(Gly-Ala)，和聚丙氨酸。Gly和Ala的组合也是优选的，它是这里称作K1的连接体并且具有这里的实施例中提出的氨基酸序列。
非肽连接体也是可能的。例如，能使用烷基连接体，例如-NH-(CH2)s-C(O)-，其中s＝2-20。这些烷基连接体可以进一步被任何没有空间位阻的基团例如低级烷基(例如，C1-C6)低级酰基，卤原子(例如，Cl，Br)，CN，NH2，苯基，等取代。一个举例的非肽连接体是PEG连接体，并且具有100至5000kDa的分子量，优选100至500kDa。用和如上所述一样的方法可以改变肽连接体形成衍生物。
变体和衍生物
特异性结合剂的变体和衍生物包括在本发明的范围内。包括的变体是插入，缺失，和取代变体。明白本发明的特定特异性结合剂可以包含一种，两种，或所有三种类型的变体。插入和取代变体可以包含天然氨基酸，非常见氨基酸(如下文提出的)，或者两者。
在一个实施例中，提供插入变体，其中肽或肽抗体氨基酸序列中插入一个或多个氨基酸残基，或者是天然存在的或者是非常见氨基酸。插入可以位于蛋白质的一端或两端，或者可以位于肽抗体氨基酸序列的中间部分。在一个末端或者两个末端有附加残基的插入变体能包括，例如，包括氨基酸标记或标记的融合蛋白和蛋白质。插入变体包括肽和肽抗体，其中肽或肽抗体氨基酸序列或者其片段被加入一个或多个氨基酸残基。
本发明的变体产物还包括成熟肽或肽抗体，其中去除了前导序列或信号序列，得到的蛋白质有附加的氨基末端残基，所述氨基酸可以是天然的或非天然的。包括氨基酸位置-1有附加的甲硫氨酰残基的特异性结合剂(例如肽抗体)(Met-1-肽抗体)，这些是在位置-2和-1有附加的甲硫氨酸和赖氨酸残基(Met-2-Lys-1-)的特异性结合剂。有附加的Met，Met-Lys，Lys残基(或一个或多个碱性残基，一般地)的变体特别用于在细菌宿主细胞中提高重组蛋白质生产。
本发明还包括使用特异表达系统产生的具有附加的额氨基酸残基的特异性结合剂。例如，使用表达作为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合产物的一部分的期望的多肽的商售载体提供从期望的多肽裂解GST成分之后在氨基酸位置-1具有附加的甘氨酸残基的期望的多肽。也包括在其他载体系统表达得到的变体，包括其中一般在序列的羧基和/或氨基末端向氨基酸序列中插入聚组氨酸标记的那些。
插入变体还包括融合蛋白，其中肽或肽抗体的氨基和/或羧基末端与另一个多肽，其片段或者一般没有识别是任何特异蛋白质序列的一部分的氨基酸融合。这样的融合蛋白的例子是具有长循环半寿期的免疫原性多肽，蛋白质，例如免疫球蛋白恒定区，标记蛋白，有利于纯化期望的肽或肽抗体的蛋白质或多肽，和促进多聚体蛋白质形成的多肽序列(例如在二聚体形成/稳定性中有用的亮氨酸拉链结构基序)。
这种类型的插入变体一般具有在N-或C-末端与第二多肽的全部或部分连接的天然分子的全部或大部分。例如，融合蛋白一般使用来自其他物种的前导序列以允许在异源宿主中重组表达蛋白质。另一种有用的融合蛋白包括免疫活性结构域例如抗体表位的加入，以有利于融合蛋白的纯化。融合连接处或附近裂解位点所包含的会有利于在纯化之后去除外来多肽。其他有用的融合物包括功能结构域的连接，例如来自酶的活性位点，糖基化结构域，细胞定向信号或跨膜区。
有很多可以在本发明中使用的商售融合蛋白表达系统。特别有用的系统包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)系统(Pharmacia)，麦芽糖结合蛋白系统(NEB，Beverley，Mass.)，FLAG系统(IBI，New Haven，Conn.)，和6xHis系统(Qiagen，Chatsworth，Calif.)。这些系统能产生只带有少数附加氨基酸的重组肽和/或肽抗体，这少数附加氨基酸不可能显著影响肽或肽抗体的活性。例如，FLAG系统和6xHis系统只加入短序列，已知这两种系统免疫原性不好并且不会不利地影响多肽折叠成它的天然构象。另一种有用的N-末端融合体是蛋白质或肽的N-末端区Met-Lys二肽的融合体。这样的融合体可以产生蛋白质表达或活性的有利的提高。
其他融合体系产生多肽杂合体，其中期望从期望的肽或肽抗体切除融合配偶体。在一个实施方案中，融合配偶体通过含有蛋白酶的特异识别序列的肽序列与重组肽抗体连接。合适的序列的例子是烟草Etch病毒蛋白酶(Life Technologies，Gaithersburg，Md.)或因子Xa(NewEngland Biolabs，Beverley，Mass.)识别的那些。
本发明还提供了融合多肽，其包括与截短的组织因子(tTF)组合的本发明的肽抗体或肽的全部或部分。TTF是由作为肿瘤血管凝固剂发挥作用的人血凝固-诱导蛋白质的截短形式构成的血管靶向剂，如美国专利Nos.：5,877,289；6,004,555；6,132,729；6,132,730；6,156,321；和欧洲专利No.EP 0988056所述。TTF与抗-Ang-2肽抗体或肽，或者其片段的融合有利于抗-Ang-2向靶细胞的送递。
另一方面，本发明提供缺失变体，其中肽或肽抗体中一个或多个氨基酸残基被去除。从肽抗体的一个或两个末端进行缺失，或者在肽抗体氨基酸序列中去除一个或多个残基。缺失变体必须包括肽或肽抗体的所有的片段。
另一方面，本发明提供本发明的肽或肽抗体的取代变体。取代变体包括其中一个或多个氨基酸残基被去除或者被一个或多个供选择的氨基酸置换的那些肽和肽抗体，其中所述氨基酸可以是天然存在的或非天然存在的。取代变体产生与原来肽或肽抗体“类似的”肽或肽抗体，在于两个分子具有一定百分比的氨基酸是相同的。取代变体包括肽或肽抗体中1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，个氨基酸的取代作用，其中取代的数目最多可以是肽或肽抗体的氨基酸的10％或更多。一方面，取代作用性质是保守的，但是本发明包括也是不保守的取代作用并且还包括非常规氨基酸。
通过公知的方法能容易地计算相关的肽和肽抗体的同一性和相似性。这样的方法包括但不限于下面文献描述的那些：ComputationalMolecular Biology，Lesk，A.M.，编著，Oxford University Press，New York(1988)；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，编著，Academic Press，New York(1993)；ComputerAnalysis of Sequence Data，Part 1，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，编著，Humana Press，New Jersey(1994)；Sequence Analysisin Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press(1987)；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编著，M.Stockton Press，New York(1991)；和Carillo等，SIAM J.AppliedMath.，48：1073(1988)。
设计测定两个肽或肽抗体，或者多肽和肽的相关性或同一性百分比的优选方法，得到测试序列之间的最大匹配。公众能够得到的计算机程序中描述了测定同一性的方法。测定两个序列之间的同一性的优选的计算机程序方法包括但不限于，GCG程序包，包括GAP(Devereux等，Nucl.Acid.Res.，12：387(1984)；Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI，BLASTP，BLASTN，和FASTA(Altschul等，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))。公众从theNational Center for Biotechnology Information(NCBI)和其他来源(BLAST Manual，Altschul等NCB/NLM/NIH Bethesda，Md.20894；Altschul等，上文(1990))能获得BLASTX程序。也可以使用公知的Smith Waterman算法来测定同一性。
用于将两个氨基酸序列比对的一些比对方案可以导致两个序列只有一个短的区匹配，这个小的比对区可以具有非常高的序列同一性，即使两个全长序列之间没有显著相关性。因此，在一些实施方案中，选择的比对方法(GAP程序)可以导致跨距至少是比较的靶多肽全长的10％对齐，即，比较至少400个氨基酸序列时至少40个连续的氨基酸，比较至少300至大约400个氨基酸序列时至少30个连续的氨基酸，比较至少300至大约400个氨基酸序列时至少30个连续的氨基酸，比较200至大约300个氨基酸序列时至少20个连续的氨基酸，比较大约100至200个氨基酸序列时至少10个连续的氨基酸。
例如，利用计算机算法GAP(Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，Wis.)，将要测定序列同一性百分比的两个多肽对它们各个氨基酸进行最佳匹配比对(″匹配跨度″，根据算法确定)。在一些实施方案中，空位罚分(一般计算为3X平均对角线；″平均对角线″是使用的比较矩阵的对角线的平均值；″对角线″是特定比较矩阵分配给每一个完全氨基酸匹配的分数或数目)和空位长度罚分(它通常是空位罚分的1/10倍)，并且与算法联合使用象PAM 250或BLOSUM 62这样的比较矩阵。在一些实施方案中，算法还使用标准比较矩阵(关于PAM 250比较矩阵，参见Dayhoff等，Atlas of ProteinSequence and Structure，5(3)(1978)；关于BLOSUM 62比较矩阵，参见Henikoff等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，89：10915-10919(1992))。
在一些实施方案中，多肽序列比较参数包括如下：
算法：Needleman等，J.Mol.Biol.，48：443-453(1970)；
比较矩阵：上文Henikoff等(1992)的BLOSUM 62；
空位罚分：12
空位长度罚分：4
相似性阈值：0
使用上述参数的GAP程序是有用的。在一些实施方案中，使用GAP算法，上述参数对于多肽比较是默认参数(对于末端空位没有罚分)。
在一些实施方案中，对于多核苷酸分子序列(与氨基酸序列相对应)的参数包括如下：
算法：Needleman等，上文(1970)；
比较矩阵：匹配＝+10，错配＝0
空位罚分：50
空位长度罚分：3
使用上述参数的GAP程序也是有用的。上述参数对于多核苷酸分子比较是默认参数。
其他例举的算法，空位罚分，空位长度罚分，比较矩阵，相似性阈值等也可以使用Program Manual，Wisconsin Package，第9版，1997年9月中提出的那些。进行的具体选择对于本领域技术人员来说是显而易见的并且取决于要进行的具体比较，例如DNA-与-DNA，蛋白质-与-蛋白质，蛋白质-与-DNA；另外，比较是否在给定序列对之间(其中一般优选GAP或BestFit)或者在一个序列和一个序列的大数据库之间(其中FASTA或BLASTA是优选的)。
如这里使用的，按常规使用20种常见氨基酸和它们的缩写。参见Immunology-A Synthesis(第二版，E.S.Golub和D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，这里为了所有的目的引作参考。
氨基酸可以具有L或D立体化学(除了Gly之外，其即不是L也不是D)，并且本发明的多肽和成分可以包括立体化学的混合物。但是，L立体化性是优选的。本发明还提供了反向分子，其中氨基酸的氨基末端至羧基末端序列是反向的。例如，具有正常序列X1-X2-X3的分子的反向应该是X3-X2-X1.。本发明还提供了逆-反向分子，其中，如上所述，氨基酸的氨基末端至羧基末端序列是反向的，并且一般的″L″对映异构体的残基被改变为″D″立体异构型。
二十种常见氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)，非天然氨基酸，例如[α]-，[α]-二取代氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸，和其他非常见氨基酸也是本发明的多肽的合适的成分。非常见氨基酸的例子包括但不限于：氨基脂肪酸，β-丙氨酸，β-氨基丙酸，氨基丁酸，哌啶酸，氨基癸酸，氨基庚酸，氨基异丁酸，氨基庚二酸，二氨基丁酸，锁链素，二氨基庚二酸，二氨基丙酸，N-乙基甘氨酸，N-乙基天冬酰胺，羟基赖氨酸，异-羟基赖氨酸，羟基脯氨酸，异锁链素，异-异亮氨酸，N-甲基甘氨酸，肌氨酸，N-甲基异亮氨酸，N-甲基缬氨酸，新缬氨酸，正亮氨酸，鸟氨酸，4-羟基脯氨酸，[γ]-羧基谷氨酸，[ε]-N，N，N-三甲基赖氨酸，[ε]-N-乙酰基赖氨酸，O-磷酸丝氨酸，N-乙酰基丝氨酸，N-甲酰基甲硫氨酸，3-甲基组氨酸，5-羟基赖氨酸，[σ]-N-甲基精氨酸，和其他相似氨基酸和氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。
类似地，除非具体说明，单链多核苷酸序列的左手端是5′端；双链多核苷酸序列的左手方向指为5′方向。初始RNA转录本的5′至3′加入方向称作转录方向；和RNA具有相同序列并且是RNA转录本的5′至5′端的DNA链上的序列区称作″上游序列″；和RNA具有相同序列并且是RNA转录本的3′至3′端的DNA链上的序列区称作″下游序列″。
明白氨基酸残基可以根据它们共同的侧链性质分为几类：
1.中性疏水：丙氨酸(Ala；A)，缬氨酸(Val；V)，亮氨酸(Leu；L)，异亮氨酸(Ile；I)，脯氨酸(Pro；P)，色氨酸(Trp；W)，苯丙氨酸(Phe；F)，和蛋氨酸(Met，M)。
2.中性极性：甘氨酸(Gly；G)；丝氨酸(Ser；S)，苏氨酸(Thr；T)，酪氨酸(Tyr；Y)，半胱氨酸(Cys；C)，谷氨酰胺(Glu；Q)，天冬酰胺(Asn；N)，和正亮氨酸。
3.酸性：天冬氨酸(Asp；D)，谷氨酸(Glu；E)；
4)碱性：赖氨酸(Lys；K)，精氨酸(Arg；R)，组氨酸(His；H)。
参见Lewin，B.，Genes V，Oxford University Press(1994)，p.11。
保守性氨基酸取代可以包括非常见氨基酸残基，它一般是通过化学肽合成而不是通过生物系统合成而插入的。这些包括但不限于，肽模拟物和其他氨基酸部分的逆反或颠倒形式。非保守性取代可以包括将这些类中的一个变化为另一类中的一个。
根据一些实施方案，进行这样的变化时，可以考虑氨基酸的亲水指数(hydropathic index)。以氨基酸的疏水性和电荷特征为基础对各种氨基酸指派亲水指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本领域知晓氨基酸亲水指数在对蛋白质带来相互影响的生物学功能中的重要性。Kyte等，J.Mol.Biol.，157：105-131(1982)。已知某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或分数的另外的氨基酸取代而仍然保留相似的生物活性。在根据亲水指数进行变化中，在一些实施方案中，包括亲水指数在±2之内的氨基酸取代。在一些实施方案中，包括亲水指数在±1之内的那些，在一些实施方案中，包括亲水指数在±0.5之内的那些。
本领域还知晓，以亲水性为基础能有效地进行类似氨基酸的取代，特别是在由此产生的生物功能肽抗体或肽是为了在免疫实施方案中应用的情况下，本发明情况就是如此。在一些实施方案中，蛋白质最大局部平均亲水性，这由其相邻氨基酸的亲水性支配，与它的免疫原性和抗原性相关，即，与蛋白质的生物学性质相关。
对这些氨基酸残基指定下面的亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬氨酸(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)在根据相似亲水性值进行改变中，在一些实施方案中，包括其亲水性值在±2之内的氨基酸取代。在一些实施方案中，包括亲水性值在±1之内的那些，在一些实施方案中，包括亲水性值在±0.5之内的那些。人们以亲水性为基础还可以鉴定主要氨基酸序列中的表位。这些区也称作″表位核心区″。
下面表2中给出例示的氨基酸取代作用。
表2
氨基酸取代作用
  原残基   例示的取代作用   优选的取代作用
  Ala   Val，Leu，Ile   Val
  Arg   Lys，Gln，Asn   Lys
  Asn   Gln，Glu，Asp   Gln
  Asp   Glu，Gln，Asp   Glu
  Cys   Ser，Ala   Ser
  Gln   Asn，Glu，Asp   Asn
  Glu   Asp，Gln，Asn   Asp
  Gly   Pro，Ala   Ala
  His   Asn，Gln，Lys，Arg   Arg
  Ile   Leu，Val，Met，Ala，Phe，  正亮氨酸   Leu
  Leu   正亮氨酸Ile，Val，Met，  Ala，Phe   Ile
  Lys   Arg，1，4二氨基-丁酸  Gln，Asn   Arg
  Met   Leu，Phe，Ile   Leu
  Phe   Leu，Val，Ile，Ala，Tyr   Leu
  Pro   Ala   Gly
  Ser   Thr，Ala，Cys   Thr
  Thr   Ser   Ser
  Trp   Tyr，Phe   Tyr
  Tyr   Trp，Phe，Thr，Ser   Phe
  Val   Ile，Met，Leu，Phe，Ala，  正亮氨酸   Leu
应用公知的技术，本领域技术人员能确定这里给出的多肽的合适的变体。在一些实施方案中，本领域技术人员通过定位据信对于活性不是重要的区而可以鉴定可以改变而不破坏活性的分子的合适的区。在一些实施方案中，人们能鉴定在相似肽或多肽中保守的分子的残基和部分。在一些实施方案中，即使对生物活性或者对结构是重要的区也可以进行保守性氨基酸取代而不破坏生物学活性或者不会不利地影响多肽结构。
另外，本领域技术人员能进行对相似多肽鉴定对于活性或结构重要的残基的结构-功能研究。考虑这样的比较，人们能预测蛋白质中相应于相似蛋白质中对于活性或结构重要的氨基酸残基的氨基酸残基的重要性。本领域技术人员可以选择对于这样预测的重要的氨基酸残基的化学类似氨基酸取代作用。
本领域技术人员还能分析与相似多肽中的结构相关的三维结构和氨基酸序列。考虑这样的信息，本领域技术人员可以对抗体预测有关其三维结构的氨基酸残基比对。在一些实施方案中，既然这样的残基可能在与其他分子的重要的相互作用中涉及，本领域技术人员可以选择不对预测在蛋白质表面上的氨基酸残基产生根本变化。此外，本领域技术人员可以获得在各个期望的氨基酸残基处包含单一氨基酸取代的试验变体。然后利用本领域技术人员公知的活性测定能对变体进行筛选。这样的变体可以被用来收集有关合适的变体的信息。例如，如果有人发现对特定氨基酸残基的改变导致活性破坏，不期望的降低，或者不适活性，可以避免有这样改变的变体。换句话说，根据从这样的常规实验收集的信息，本领域技术人员能容易地确定应该单独地或与其他突变组合地避免进一步的取代作用的氨基酸。
很多科学出版物致力于二级结构的判断。参见，Moult J.，Curr.Op.Biotech.，7(4)：422-427(1996)，Chou等，Biochemistry，13(2)：222-245(1974)；Chou等，Biochemistry，113(2)：211-222(1974)；Chou等，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.，47：45-148(1978)；Chou等，Ann.Rev.Biochem.，47：251-276和Chou等，Biophys.J.，26：367-384(1979)。此外，目前可获得辅助判断二级结构的计算机程序。一种二级结构判断方法是以同源性模型为基础的。例如，具有大于30％序列同一性的，或者大于40％相似性的两个多肽或蛋白质常常具有相似的结构拓扑学。近来蛋白质结构数据的增长(PDB)为二级结构提供了提高的可预测性，包括多肽或蛋白质结构中可能的折叠数目。参见Ho lm等，Nucl.Acid.Res.，27(1)：244-247(1999)。有人提出(Brenner等，Curr.Op.Struct.Biol.，7(3)：369-376(1997))一种给定多肽或蛋白质有有限数目的折叠，而且一旦明了关键的结构数目，结构预测将变得大大地更加精确。
确定二级结构的另外的方法包括″threading″(Jones，D.，Curr.Opin.Struct.Biol.，7(3)：377-87(1997)；Sippl等，Structure，4(1)：15-19(1996))，″曲线分析″(Bowie等，Science，253：164-170(1991)；Gribskov等，Meth.Enzym.，183：146-159(1990)；Gribskov等，Proc.Nat.Acad.Sci.，84(13)：4355-4358(1987))，和″改良键合″(参见Holm，上文(1999)，和Brenner，上文(1997))。
在一些实施方案中，肽抗体变体包括糖基化变体，其中肽抗体中加入了一个或多个糖基化位点，例如N-连接的糖基化位点。一种N-连接的糖基化位点特征在于序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中指定为X的氨基酸残基可以是除了脯氨酸之外的任何氨基酸残基。对构成该序列的氨基酸残基的取代或加入提供加入N-连接的糖链的可能的新的位点。或者，可以去除该序列的取代作用会去除已有的N-连接的糖链。还提供了N-连接的糖链的重排，其中一个或多个N-连接的糖基化位点(一般是天然存在的那些)被去除并且产生一个或多个新的N-连接的位点。
本发明还提供了″衍生物″，包括带有除了氨基酸残基的加入，插入，缺失，或取代之外的修饰的肽抗体。优选地，修饰作用本质是共价的，并且包括例如，与聚合物，脂质，其他有机和无机部分的化学键合。可以制备提高肽抗体的循环半寿期的本发明的衍生物，或者可以设计提高肽抗体对期望的细胞，组织，或器官的定向能力的本发明的衍生物。
举例的衍生物包括其中进行了下面修饰作用中的一个或多个的部分：
-一个或多个肽基[-C(O)NR-]键合(键)被非肽键置换，所述非肽键例如-CH2-氨基甲酸酯[-CH2-OC(O)NR-]；磷酸酯键；-CH2-磺酰胺[-CH2-S(O)2NR-]键；脲[-NHC(O)NH-]键；-CH2-仲胺键；或烷基化肽基键[-C(O)NR6-，其中R6是低级烷基]；
-其中N-末端被衍生化为下面的基团的肽：-NRR1；-NRC(O)R基团；-NRC(O)OR基团；-NRS(O)2R基团；-NHC(O)NHR基团，其中R和R1是氢或低级烷基，前提是R和R1两者不同时是氢；琥珀酰亚胺基团；苄氧羰基-NH-(CBZ-NH-)基团；或者苯环上带有选自低级烷基，低级烷氧基，氯，和溴的1-3个取代基的苄氧羰基-NH-基团；和
-其中游离的C-末端被衍生化为下面基团的肽：-C(O)R2，其中R2选自低级烷基和-NR3R4，其中R3和R4独立地选自氢和低级烷基。所谓″烷基″意思是具有1-6个碳原子的基团。
另外，通过使肽的目标氨基酸残基与能与选择的侧链或末端残基反应的有机衍生化试剂反应，可以向本发明的多肽或成分引入各个氨基酸的修饰作用。下面是例子：
赖氨酰和氨基末端残基可以与琥珀酸酐或其他羧酸酸酐反应。与这些试剂的衍生化作用具有改变赖氨酰残基电荷的作用。用于将含有α-氨基残基衍生化的其他合适的试剂包括亚氨酸酯，例如吡啶亚氨酸甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氢化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4-戊二酮；和与乙醛酸酯的转氨酶催化的反应。
精氨酰残基可以通过与一种或几种常规试剂的反应而被修饰，所述常规试剂其中包括苯甲酰甲醛，2，3-丁二酮，1，2-环己二酮，和水和茚三酮。精氨酸残基的衍生化作用要求在碱性条件下进行反应，因为胍官能团的高pKa。此外，这些试剂可以与赖氨酸的基团以及精氨酸胍基反应。
酪氨酰残基本身的特定修饰已经被充分研究，通过与芳香重氮化合物或四硝基甲烷反应对酪氨酰残基引入光谱标记特别令人感兴趣。最常见地，可以使用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别生成O-乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。
羧基侧基(天冬氨酰或谷氨酰)通过与碳化二亚胺(R′-N-C＝N-R′)的反应而被选择性修饰，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳化二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4，4-二甲基戊基)碳化二亚胺。此外，通过与铵离子反应可以将天冬氨酰和谷氨酰残基转化为天冬氨酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。
常常将天冬氨酰胺酰和谷氨酰胺酰残基去酰氨基得到相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。或者，可以在温和的酸性条件下将这些残基去酰氨基。这两种残基形式都在本发明的范围内。
使用双功能化试剂的衍生化作用使肽或者它们的功能衍生物与水不溶性载体基体或者与其他大分子载体交联。通常使用的交联剂包括，例如，1，1-双(二偶氮乙酰基)-2-苯乙烷，戊二醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如，与4-叠氮基水杨酸的酯，均双功能亚氨酯，包括二琥珀酰亚胺酯，例如3，3′-二硫双(琥珀酰亚胺丙酸酯)，和双功能马来酰亚胺，例如双-N-马来酰亚胺-1，8-辛烷。衍生化试剂例如甲基-3-[(p-叠氮基苯基)二硫]丙酰亚氨酯得到在光照下能形成交联的光活性中间体。或者，对于蛋白质固定化作用可以使用反应性水不溶性基体，例如溴化氰-活化的碳水化合物和美国专利Nos.3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537；和4,330,440中描述的反应底物。
其他可能的修饰作用包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化作用，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化作用，Cys中硫原子的氧化作用，赖氨酸，精氨酸，和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化作用(Creighton，T.E.，Proteins：Structure and Molecule Properties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，pp.79-86(1983))，N-末端胺的乙酰化作用，和，在某些情况下，C-末端羧基的酰胺化作用。
这样的被衍生化的部分优选改善了一项或几项特征，包括化合物的抗-血管发生活性，溶解性，吸收性，生物学半寿期等。或者，被衍生化的部分可以产生与没有衍生化的化合物相同或基本上相同的特征和/或性质。或者所述部分可以消除或减轻化合物的不期望的副作用等。
而且，本发明的化合物可以在DNA上加以改变。可以将本发明的任何部分的DNA序列变化为与选择的宿主细胞更加适合。关于大肠杆菌，它是优选的宿主细胞，优化密码子是本领域公知的。密码子可以被取代，去除限制位点或者使包括沉默限制位点，这有助于DNA在优选的宿主细胞中表达。可以对载体，连接体和肽DNA序列进行修饰，使包括上述任何序列变化。这样，这里讨论的所有的修饰，取代，衍生化作用等同样适用于本发明的所有方面，包括但不限于肽，肽二聚体和多聚体，连接体和载体。
另外，本领域技术人员能分析鉴定对于活性或结构重要的相似肽中残基的结构-功能研究。考虑这样的比较，人们能预知相应于相似肽中对活性或结构重要的氨基酸残基的肽中氨基酸残基的重要性。本领域技术人员对于肽的这样的预知重要的氨基酸残基可以选择化学相似氨基酸取代。
本领域技术人员还能分析与相似多肽中的结构相关的三维结构和氨基酸序列。考虑这样的信息，本领域技术人员可以对肽预测有关其三维结构的氨基酸残基比对。既然这样的残基可能在与其他分子的重要的相互作用中涉及，本领域技术人员可以选择不对预测在蛋白质表面上的氨基酸残基产生根本变化。此外，本领域技术人员可以获得在各个期望的氨基酸残基处包含单一氨基酸取代的试验变体。然后利用本领域技术人员公知的活性测定能对变体进行筛选。这样的数据可以被用来收集有关合适的变体的信息。例如，如果有人发现对特定氨基酸残基的改变导致活性破坏，不期望的降低，或者不适活性，可以避免有这样改变的变体。换句话说，根据从这样的常规实验收集的信息，本领域技术人员能容易地确定应该单独地或与其他突变组合地避免进一步的取代作用的氨基酸。
很多科学出版物致力于二级结构的判断。参见，Moult J.，Curr.Op.Biotech.，7(4)：422-427(1996)，Chou等，Biochemistry，13(2)：222-245(1974)；Chou等，Biochemistry，113(2)：211-222(1974)；Chou等，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.，47：45-148(1978)；Chou等，Ann.Rev.Biochem.，47：251-276和Chou等，Biophys.J.，26：367-384(1979)。此外，目前可获得辅助判断二级结构的计算机程序。一种二级结构判断方法是以同源性模型为基础的。例如，具有大于30％序列同一性的，或者大于40％相似性的两个多肽或蛋白质常常具有相似的结构拓扑学。近来蛋白质结构数据的增长(PDB)为二级结构提供了提高的可预测性，包括多肽或蛋白质结构中可能的折叠数目。参见Holm等，Nucl.Acid.Res.，27(1)：244-247(1999)。有人提出(Brenner等，Curr.Op.Struct.Biol.，7(3)：369-376(1997))一种给定多肽或蛋白质有有限数目的折叠，而且一旦明了关键的结构数目，结构预测将变得大大地更加精确。
确定二级结构的另外的方法包括″threading″(Jones，D.，Curr.Opin.Struct.Biol.，7(3)：377-87(1997)；Sippl等，Structure，4(1)：15-19(1996))，″曲线分析″(Bowie等，Science，253：164-170(1991)；Gribskov等，Meth.Enzym.，183：146-159(1990)；Gribskov等，Proc.Nat.Acad.Sci.，84(13)：4355-4358(1987))，和″改良键合″(参见Holm，上文(1999)，和Brenner，上文(1997))。
本发明进一步包括衍生的特异性结合剂，例如肽抗体，被共价修饰包括一个或多个水溶性聚合物连接，例如聚乙二醇，聚氧乙二醇，或聚丙二醇，描述于美国专利Nos.：4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；和4,179,337。本领域公知的其他有用的聚合物包括一甲氧基-聚乙二醇，葡聚糖，纤维素或者其他以碳水化合物为基础的聚合物，聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇，丙二醇均聚物，a聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)和聚乙烯醇，以及这些聚合物的混合物。特别优选的是用聚乙二醇(PEG)亚基共价修饰的肽抗体。水溶性聚合物可以在特定位置例如在肽抗体的氨基末端键合，或者与多肽的一个或多个侧链随机连接。2000年10月17日公布的Gonzales等人的美国专利No.6,133,426描述了用于提高对特异性结合剂例如肽抗体，和对于人源化抗体的治疗能力的PEG的使用。
本发明还包括将化合物的肽和/或载体部分衍生化。这样的衍生物可以提高化合物的溶解性，吸收性，生物学半寿期等。或者，被衍生化的部分可以消除或减小化合物的任何不期望的副作用等。举例的衍生物包括化合物，其中：
1.化合物或者不其某些部分是环状的。例如，可以对肽部分进行修饰使得包含两个或多个Cys残基(例如，连接体)，其可以通过形成二硫键而环化。
2.化合物被交联或者使得能在分子之间交联。例如，可以对肽部分修饰使包含一个Cys残基，从而与相似分子能形成分子间二硫键。化合物还可以通过其C-末端被交联。
3.一个或多个一个或多个肽基[-C(O)NR-]键合(键)被非肽键置换。举例的非肽键是-CH2-氨基甲酸酯[-CH2-OC(O)NR-]；磷酸酯键；-CH2-磺酰胺[-CH2-S(O)2NR-]键；脲[-NHC(O)NH-]键；-CH2-仲胺键；和烷基化肽[-C(O)NR6-，其中R6是低级烷基]；
4.N-末端被衍生化。典型地，N-末端可以被酰基化或者被修饰成取代的胺。举例的N-末端衍生化基团包括：-NRR1(不包括-NH2)；-NRC(O)R1；-NRC(O)OR1；-NRS(O)2R1；-NHC(O)NHR1，琥珀酰亚胺，或苄氧羰基-NH-(CBZ-NH-)，其中R和R1各自独立地是氢或低级烷基，并且其中苯环可以被选自C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，氯，和溴的1-3个取代基取代。
5. 游离的C-末端被衍生化。典型地，C-末端被酯化或酰胺化。例如，人们可以应用现有技术描述的方法对本发明的化合物在C-末端加上(NH-CH2-CH2-NH2)2。同样，人们可以应用现有技术描述的方法对本发明的化合物在C-末端加上-NH2，举例的C-末端衍生基团包括，例如，-C(O)R2，其中R2是低级烷基或-NR3R4，其中R3和R4独立地是氢或C1-C8烷基(优选C1-C4烷基)。
6. 二硫键被另一个，优选更稳定的，交联部分(例如亚烷基)置换。参见，例如，Bhatnagar(上文)；Alberts等，Thirteenth Am.Pep.Symp.，357-9(1993)。
7.一个或多个各氨基酸残基被修饰。已知不同的衍生化试剂与选择的侧链或末端残基特异反应，如下面详细描述的。
赖氨酰和氨基末端残基可以与琥珀酸酐或其他羧酸酸酐反应，它改变赖氨酰残基的电荷。用于将含有α-氨基残基衍生化的其他合适的试剂包括亚氨酸酯，例如吡啶亚氨酸甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氢化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4-戊二酮；和与乙醛酸酯的转氨酶催化的反应。
精氨酰残基可以通过与一种或几种常规试剂的反应而被修饰，所述常规试剂其中包括苯甲酰甲醛，2，3-丁二酮，1，2-环己二酮，和水和茚三酮。精氨酸残基的衍生化作用要求在碱性条件下进行反应，因为胍官能团的高pKa。此外，这些试剂可以与赖氨酸的基团以及精氨酸胍基反应。
酪氨酰残基的特定修饰已经被充分研究，通过与芳香重氮化合物或四硝基甲烷反应对酪氨酰残基引入光谱标记特别令人感兴趣。最常见地，可以使用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别生成O-乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。
羧基侧基(天冬氨酰或谷氨酰)通过与碳化二亚胺(R′-N-C＝N-R′)的反应而被选择性修饰，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳化二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4，4-二甲基戊基)碳化二亚胺。此外，通过与铵离子反应可以将天冬氨酰和谷氨酰残基转化为天冬氨酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。
将天冬氨酰胺酰和谷氨酰胺酰残基去酰氨基得到相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。或者，可以在温和的酸性条件下将这些残基去酰氨基。这两种残基形式都在本发明的范围内。
半胱氨酰残基能被氨基酸残基或者其他部分置换，以消除二硫键或者，相反地，稳定交联。参见，例如，Bhatnagar，(上文)。
使用双功能化试剂的衍生化作用使肽或者它们的功能衍生物与水不溶性载体基体或者与其他大分子载体交联。通常使用的交联剂包括，例如，1，1-双(二偶氮乙酰基)-2-苯乙烷，戊二醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如，与4-叠氮基水杨酸的酯，均双功能亚氨酯，包括二琥珀酰亚胺酯，例如3，3′-二硫双(琥珀酰亚胺丙酸酯)，和双功能马来酰亚胺，例如双-N-马来酰亚胺-1，8-辛烷。衍生化试剂例如甲基-3-[(p-叠氮基苯基)二硫]丙酰亚氨酯得到在光照下能形成交联的光活性中间体。或者，对于蛋白质固定化作用可以使用反应性水不溶性基体，例如溴化氰-活化的碳水化合物和美国专利Nos.3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537；和4,330,440中描述的反应底物。
碳水化合物(寡糖)基团可以方便地与已知的蛋白质中的糖基化位点连接。一般情况下，当它们是序列Asn-X-Ser/Thr的一部分，其中X可以是除了脯氨酸的任何氨基酸时，O-连接寡糖连接丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基，而N-连接寡糖连接天冬酰胺(Asn)残基。X优选是除了脯氨酸之外的19中天然存在的氨基酸中的一种。各种类型中发现的N-连接和O-连接寡糖和糖残基的结构是不同的。在这两者中都发现的一种类型的糖是N-乙酰基神经氨酸(称作唾液酸)。唾液酸常常是N-连接和O-连接寡糖的末端残基，而且由于其负电荷，可以给糖基化化合物带来酸性性质。可以在本发明的化合物的连接体中插入这样的位点，并且优选在多肽化合物的重组产生过程中由细胞糖基化(例如，在哺乳动物细胞中，例如CHO，BHK，COS)。但是，这样的位点可以被本领域公知的合成或半合成过程进一步糖基化。
其他可能的修饰作用包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，Cys中硫原子的氧化，赖氨酸，精氨酸，和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化[Creighton，Proteins：Structureand Molecule Properties(W.H.Freeman&Co.，San Francisco)，pp.79-86(1983)]。
本发明的化合物可以在DNA水平上加以改变。可以将化合物的任何部分的DNA序列变化为与选择的宿主细胞更加适合。关于大肠杆菌，它是优选的宿主细胞，优化密码子是本领域公知的。密码子可以被取代，去除限制位点或者使包括沉默限制位点，这有助于DNA在优选的宿主细胞中表达。可以对载体，连接体和肽DNA序列进行修饰，使包括上述任何序列变化。
亲和力成熟
本发明的一个实施方案包括″亲和力成熟″肽和肽抗体。该方法包括利用噬菌体展示或者其他筛选技术提高本发明的肽和肽抗体的亲和力或生物活性。以共有序列为基础(为了收集相关的肽而产生)，能产生定向二级噬菌体展示文库，其中″核心″氨基酸(从共有序列确定)保持不变或者出现频率有偏好。或者，能使用各个肽序列产生有偏好的，定向噬菌体展示文库。对这样的文库筛选能得到获得增强的与Ang-2的结合或者具有提高的生物活性的肽(其可以转化为肽抗体)。
非肽类似物/蛋白质模拟物
此外，也包括提供稳定结构或减小生物降解性的肽的非肽类似物。在选择的抑制肽的基础上通过非肽部分置换一个或多个残基能制备肽模拟物类似物。优选地，非肽部分允许肽保留它的天然构象，或者稳定一种优选的，例如，生物活性构象，它保留识别和结合Ang-2的能力。一方面，得到的类似物/模拟物显示对Ang-2的提高的结合亲和力。Nachman等，Regul.Pept.57：359-370(1995)中描述了从肽制备非肽模拟物类似物的方法的一个例子。如果期望，例如通过本发明肽的糖基化作用，酰胺化作用，羧酸化作用，或磷酸化作用，或者通过产生酸加成盐，酰胺，酯，特别是C-末端酯，和N-酰基衍生物，能修饰本发明的肽。通过与其他部分形成共价或非共价复合物，也可以对肽抗体加以修饰，产生肽衍生物。通过在N-或C-末端使化学部分与包括肽抗体的氨基酸的侧链上的官能团连接能制备共价结合的复合物。
特别地，预见所述肽能与报道基团结合，包括但不限于放射性标记，荧光标记，酶(例如，催化测热反应或荧光反应)，底物，固体基体，载体(例如，生物素或抗生物素蛋白)。因此，本发明提供一种包括肽抗体的分子，其中所述分子优选进一步包括选自放射性标记，荧光标记，酶，底物，固体基体，载体的报道基团。这样的标记是本领域技术人员公知的，例如，特别包括生物素标记。这样的标记的应用是本领域技术人员公知的，并且描述于，例如，美国专利Nos.3,817,837；3,850,752；3,996,345；和4,277,437。有用的其他标记包括但不限于放射性标记，荧光标记和化学发光标记。涉及使用这样的标记物的美国专利包括，例如美国专利Nos.3,817,837；3,850,752；3,939,350；和3,996,345。本发明的任何肽抗体可以包括任何这些标记的一个，两个，或多个。
制备肽的方法
应用各种各样的本领域公知的技术能制备本发明的肽。例如，根据常规技术可以在溶液中或者在固相载体上合成这样的肽。各种各样的自动合成仪是商业上可获得的并且可以根据公知的方法使用。参见，例如，Stewart和Young(上文)；Tam等，J.Am.Chem.Soc.，105：6442，(1983)；Merrifield，Science 232：341-347(1986)；Barany和Merrifield，The Peptides，Gross and Meienhofer，编著，AcademicPress，New York，1-284；Barany等，Int.J.Pep.Protein Res.，30：705-739(1987)；和美国专利No.5,424,398，各篇文献在此引作参考。
固相肽合成方法使用共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)，含有0.1-1.0mM胺/克聚合物。这些肽合成方法使用丁基氧羰基(t-BOC)或9-芴基甲氧羰基(FMOC)保护α-氨基。两种方法都涉及分步合成，从肽的C-末端开始每一步加上一个氨基酸(参见，Coligan等，Curr.Prot.Immunol.，Wiley Interscience，1991，第9单元)。完成化学合成时，可以将合成肽去保护，去除t-BOC或FMOC氨基保护基团并且降低的温度下用酸处理从聚合物上裂解下来(例如，液体HF-10％茴香醚在0℃下处理大约0.25至大约1小时)。蒸发溶剂之后，用1％乙酸溶液从聚合物萃取出肽，然后冻干，得到粗产物。一般通过象在Sephadex G-15上使用5％乙酸作为溶剂进行凝胶过滤这样的技术进行纯化。将过柱的合适的级分冻干得到同质肽或肽衍生物，然后用标准技术进行表征，象氨基酸分析，薄层色谱法，高效液相色谱法，紫外吸收光谱法，摩尔旋光，溶解性，并且通过固相埃德曼降解定量测定。
其他方法，列从噬菌体展示文库选择肽，也是可行的。可以从这里描述的数组氨基酸制备文库。噬菌体展示在鉴定根据本发明有用的肽中是特别有效的。简要地说，制备一个噬菌体文库(使用例如ml 13，fd，或λ噬菌体)，展示4至大约80个氨基酸残基的插入片段。插入片段可以代表，例如完全简并的或偏好排列。然后人们能选择与期望的抗原结合的噬菌体带有的插入片段。该方法通过与期望的抗原结合的噬菌体的几轮反复筛选能重复进行。重复几轮导致带有特定序列的噬菌体的富集。能进行DNA序列分子来鉴定表达肽的序列。能测定与期望的抗原结合的序列的最小线性部分。人们使用包含包含最小线性部分的部分或全部加一个或多个另外的其上游或下游简并残基的插入片段的偏好文库(biased library)能重复该方法。这些技术可以鉴定具有比其中已经鉴定的试剂大的结合亲和力的本发明的肽。
不管制备肽的方法，应用标准重组DNA方法能制备编码各种肽和肽抗体的核酸分子。适当操作这样的DNA分子的核苷酸序列，不改变它们编码的氨基酸序列，解释核酸密码子的简并性并且解释特定宿主细胞中密码子偏好。
重组DNA技术是制备本发明的全长肽抗体和其他蛋白质特异性结合剂或者其片段的常规方法。可以将编码肽抗体或片段的DNA分子插入表达载体，其接着可以被插入宿主细胞产生抗体或片段。
一般情况下，应用这里实施例中描述的方法能获得编码肽或肽抗体的DNA分子。探针和典型的杂交条件是Ausubel等(CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols Press[1994])中提出的那些。杂交之后，根据象探针大小，克隆的探针的期望的同源性，筛选的文库的类型，和筛选的克隆的数目这样的因素，在合适的严谨度下洗涤探针印迹。高严谨度筛选的例子是在50-65℃之间的温度下，0.1XSSC，和0.1％SDS。
也可以应用酵母二次杂交筛选来鉴定与Ang-2结合的本发明的肽。因此，可以使用抗原或者其片段来筛选肽文库，包括噬菌体展示文库，来鉴定和筛选Ang-2结合剂，例如本发明的肽抗体。
或者，可以使用各种各样的表达载体/宿主系统使包含和表达本发明的肽。这些系统包括但不限于微生物，例如重组噬菌体，质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；酵母表达载体转化的酵母；病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)转染的或者细菌表达载体(例如，Ti或pBR 322质粒)转化的植物细胞体系；或者动物细胞体系。重组蛋白质生产中有用的哺乳动物细胞包括但不限于VERO细胞，HeLa细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，COS细胞(例如COS-7)，W138，BHK，HepG2，3T3，RIN，MDCK，A549，PC12，K562和293细胞。下文描述重组表达肽的例示方法。
术语″表达载体″指用于DNA(RNA)序列表达多肽的质粒，噬菌体，病毒或载体。一个表达载体包括转录单元，包括下面结构的组装(1)遗传元件或者在基因表达中具有调节作用的元件，例如启动子或增强子，(2)被转录到mRNA中并且翻译成蛋白质的编码结合剂的结构或序列，和(3)合适的转录起始和终止序列。要在酵母或真核表达系统中使用的结构单元优选包括使宿主细胞胞外分泌翻译的蛋白质的前导序列。或者，没有前导序列或转运序列表达重组蛋白质的情况下，可以包括氨基末端甲硫氨酰残基。这种残基可以或可以不接着从表达的重组蛋白裂解，提供肽终产物。
例如，使用商售表达系统，例如Pichia表达系统(Invitrogen，SanDiego，Calif.)，根据生产商的说明，可以在酵母中重组表达肽。这种系统还依赖指导分泌的前-原-α序列，但是甲醇诱导时醇氧化酶(AOX1)启动子驱动插入片段的转录。
通过，例如，用来从细菌和哺乳动物细胞上清液纯化肽的方法，从酵母培养基纯化分泌的肽。
或者，可以将编码肽的cDNA克隆到杆状病毒表达载体pVL1393(PharMingen，San Diego，Calif.)中。可以根据生产商说明(PharMingen)使用这种载体在没有s F9蛋白质的培养基中感染Spodoptera frugiperda细胞，产生重组蛋白。使用肝素-琼脂糖凝胶柱(Pharmacia)纯化并浓缩重组蛋白。
或者，在昆虫系统中表达肽。用于蛋白质表达的昆虫系统是本领域技术人员公知的。在一个这样的系统中，苜蓿银纹夜蛾核型内多角体病毒(AcNPV)能被用作在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外源基因的载体。可以将肽编码序列克隆到病毒的不重要的区，例如多角体蛋白基因，并且置于多角体蛋白启动子的控制下。成功插入肽会使得多角体蛋白基因失活，并且产生没有外被蛋白外壳的重组蛋白。可以使用重组病毒感染草地夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫，表达肽。Smith等，J.Virol.46：584(1983)；Engelhard等，Proc.Nat.Acad.Sci.(USA)91：3224-7(1994)。
在另一个实施例中，通过PCR能扩增编码肽的DNA序列，并且克隆到合适的载体中，例如，pGEX-3X(Pha rmacia)。设计pGEX载体产生包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的载体编码的融合蛋白，和通过插入到载体克隆位点中的DNA片段编码的蛋白质。能制备包括例如一个合适的酶切位点的PCR引物。仅使用有利于表达的融合部分或者另外不期望与感兴趣的肽连接，然后从融合蛋白的GST部分切割下来重组融合蛋白。pGEX-3X/特异结合剂肽构建体被转化到大肠杆菌XL-1Blue细胞(Stratagene，La Jolla Calif.)中，并且分离各个转化体并且培养。纯化各个转化体的质粒DNA，并且使用自动测序仪部分测序，证实以合适的反向编码核酸插入片段的期望的特异性结合剂的存在。
本发明的一些肽成分是其中肽抗体与任何抗肿瘤肽例如肿瘤坏死因子(TNF)偶合的那些。在特别优选的方法中，TNF-特异性结合剂肽嵌合体被制备成在读框内编码肽的序列与TNF(Novagen，Madison，Wis.)编码序列融合的重组融合体。肽-TNF cDNA可以被克隆到pET-11b在(Novagen)中，并且根据pET11b生产商的说明能诱导TNF-肽在BL21大肠杆菌中表达。通过硫酸铵沉淀法，在Phenyl-Sepharose 6FastFlow上进行的疏水性相互作用色谱法，在DEAE-Sepharose Fast Flow上进行的离子交换色谱法，和在Sephacryl-S-300HR上进行的凝胶过滤色谱法，能从细菌溶胞产物纯化可溶性TNF-肽。
可以如下纯化融合蛋白，所述融合蛋白被制备成细菌中的不溶性胞函物。离心破坏宿主细胞；在0.15M NaCl，10mM Tris，pH 8，1mM EDTA中洗涤；并且在室温下用0.1毫克/毫升溶菌酶(Sigma，St.Louis，Mo.)处理15分钟。超声处理澄清溶胞产物，并且通过以12,000Xg离心10分钟沉积细胞碎屑。将含有融合蛋白的沉淀重新悬浮于50mM Tris，pH 8，和10mM EDTA，用50％甘油分层，并且以6,000Xg离心30分钟。将沉淀重新悬浮于没有Mg++和Ca++的标准盐酸缓冲盐溶液(PBS)中。通过将重新悬浮的沉淀在变性SDS-PAGE(Sambrook等，上文)中分级分离而进一步纯化。凝胶在0.4M KCl中浸透，显现蛋白质，将其切下并且在没有SDS的凝胶展开缓冲液中电洗脱。如果在细菌中产生的GST/融合蛋白是可溶蛋白，可以利用GST PurificationModule(Pharmacia)将其纯化。
可以对融合蛋白进行消化，从本发明的肽切割GST。0.5ml PBS中的消化反应(20-40mg融合蛋白，20-30单位的人凝血酶(4000U/mg，Sigma)可以在室温下温育16-48小时并且加载到变性SDS-PAGE凝胶上，有利于将反应产物分级分离。凝胶在0.4M KCl中浸透，显现蛋白质泳带。通过使用自动测序仪(Applied Biosystems Model 473A，Foster City，Calif.)通过氨基酸序列分析能证实相应于期望的肽分子量的蛋白质泳带的特性。或者，通过对肽进行HPLC和/或质谱能证实蛋白质泳带的特性。
或者，将编码肽的DNA序列克隆到含有期望的启动子和，任选地，前导序列的质粒中[Better等，Science 240：1041-43(1988)]。通过自动测序能证实这种构建体的序列。然后利用对细菌的CaCl2温育和热刺激应用标准方法将质粒转化到大肠杆菌菌株MC1061中(Sambrook等，上文)。在补充有羧苄青霉素的LB培养基中培养转化的细菌，通过用合适的培养基培养能诱导产生表达的蛋白质。如果存在，前导序列能影响肽的分泌并且在分泌过程中被切割。
通过下面描述的方法能从细菌培养基中纯化分泌的重组蛋白。
用于重组蛋白表达的哺乳动物宿主系统是本领域技术人员公知的。对于加工表达蛋白或者产生某些翻译后修饰的特定能力选择宿主细胞菌株，所述修饰在提供蛋白质活性中有用。这样的蛋白质修饰作用包括但不限于乙酰化作用，羧化作用，糖基化作用，磷酸化作用，脂质化作用和酰化作用。与象CHO这样的宿主细胞不同，HeLa，MDCK，293，W138等具有这样的翻译后活性的特定细胞机构和特征机理，并且可以选择来确保引入的外来蛋白质的正确修饰和加工。
优选使用时间长，蛋白质生产产率高的转化细胞，因为期望这样稳定的表达。包含可选择标记以及期望的表达盒的载体一旦将这样的细胞转化，可以让细胞在富集的培养基中培养1-2天，然后换成选择性培养基。设计可选择标记给选择带来抗性，并且其存在使得成功表达引入的序列的细胞生长和回收。利用对细胞合适的组织培养技术增殖稳定转化细胞的抗性簇。
可以利用很多种筛选系统来回收已经被转化重组产生蛋白质的细胞。这样的选择系统包括但不限于HSV胸腺嘧啶核苷激酶，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因，分别在tk-，hgprt-或aprt-细胞中。还有，抗-代谢物抗性被用作下面筛选的基础：DHFR，它带来甲氨喋呤抗性；gpt，它带来霉酚酸抗性；neo，它带来氨基苷G418抗性并带来绿黄隆抗性；和hygro，它带来潮霉素抗性。可以使用的其他可选择基因包括trpB，它使得细胞利用吲哚代替色氨酸，或hisD，它使得细胞利用histinol代替组氨酸。给出用于鉴定转化体的可视指征的标记包括花色素苷，β-葡萄糖醛酸酶及其底物，GUS，和荧光素酶及其底物，荧光素。
特异性结合剂的纯化和重折叠
在某些情况下，本发明的特异性结合剂为了有生物活性可能需要″重折叠″并且被氧化为合适的三级结构并且产生二硫键。应用本领域公知的很多种方法能实现重折叠。这样的方法包括，例如，在离液剂的存在下将可溶性多肽试剂暴露给通常高于7的pH。离液剂的选择类似于胞函体增溶作用使用的选择，但是一般使用低浓度的离液剂。举例的离液剂是胍。在大多数情况下，重折叠/氧化溶液还含有还原剂加特定比例的其氧化形式，产生特定的氧化还原潜能，使得可能存在形成半胱氨酸桥的二硫化合物。一些常用的氧化还原对包括半胱氨酸/胱胺，谷胱甘肽/二硫双GSH，二氯化铜，二硫苏糖醇DTT/二噻烷DTT，和2-巯基乙醇(bME)/二硫-bME。在很多情况下，可以使用辅助溶剂提高重折叠效率。通常使用的辅助溶剂包括甘油，各种分子量的聚乙二醇，和胍。
期望纯化本发明的肽和肽抗体。蛋白质纯化技术是本领域公知的。这些技术在一个水平上包括蛋白质和非蛋白质级分的分级分离。将所述肽和/或肽抗体与其他蛋白质分离之后，应用实现部分或完全纯化(或者纯化至均匀)的色谱法和电泳技术能进一步纯化感兴趣的肽或多肽。特别适合制备本发明的肽抗体和肽的分析方法是离子交换色谱法，排阻层析；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚焦。纯化肽的特别有效的方法是快速蛋白质液相色谱法或HPLC。
本发明的一些方面涉及纯化，在特定实施方案中，涉及本发明的肽抗体或肽的大量纯化。这里使用的术语″纯化的肽抗体或肽″，是意指与其他成分可分离的成分，其中将肽抗体或肽纯化至相对其天然可获得状态的任何程度。因此纯化的肽或肽抗体也称作从其天然存在的环境脱离的肽抗体或肽。
一般，″纯化的″指经分级分离去除各种其他成分的肽或肽抗体成分，所述成分基本上保持其表达的生物活性。使用术语″基本上纯化″时，该概念指肽或肽抗体组合物，其中肽抗体或肽形成组合物的主要成分，例如组合物中蛋白质构成大约50％，大约60％，大约70％，大约80％，大约90％，大约95％或更多。
从现有公开物来说，本领域技术人员公知很多用于定量肽或肽抗体的纯化的方法。这些包括，例如，测定活性级分特异结合活性，或者通过SDS/PAGE分析测定级分中肽或肽抗体的量。评定肽或肽抗体级分的纯度的优选的方法是计算级分的结合活性，将它与开始的提取物的结合活性比较，这样计算出纯化度，这里通过″-折叠纯度叔″评价。用来表示结合活性的量的实际单位当然取决于选择进行纯化的特定分析技术和肽抗体或肽是否显示可检测结合活性。
适合在纯化中使用的各种技术对于本领域技术人员是公知的。这些包括，例如，用硫酸铵沉淀，PEG，抗体(免疫沉淀)等或者通过热变性，接着离心；色谱步骤例如亲和色谱(例如，Protein-A-Sepharose)，离子交换，凝胶过滤，反相，羟基磷灰石和亲和色谱；等电聚焦，凝胶电泳，以及这些和其他技术的组合。正如本领域公知的，相信进行各种纯化步骤的顺序是可以改变的，或者可以省略一些步骤，仍然得到制备基本上纯的特异性结合剂的合适的得到。
一般不要求本发明的肽或肽抗体总是以其最纯化的状态提供。事实上，想到在一些实施方案中比基本上纯稍差的特异结合剂产物具有用途。通过组合中较少的纯化步骤，或者通过使用不同形式的相同的一般纯化方案，可以实现部分纯化。例如，知道使用HPLC设备进行的阳离子交换柱色谱一般会导致比利用低压色谱系统的相同技术更大“倍数”的纯化作用。显示低度相对纯化的方法在肽或肽抗体的总回收中，或者在肽或肽抗体的结合活性的保持中有益。
已知肽或肽抗体的迁移随着SDS/PAGE的不同条件可以改变，有时改变显著[Capaldi等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，76：425(1977)]。因此明白在不同的电泳条件下，纯化或部分纯化的特异性结合剂表达产物的表观分子量可以变化。
结合分析
免疫结合分析一般使用与分析物靶抗原特异性结合并且经常固定分析物靶抗原的捕获剂。捕获剂是与分析物特异性结合的部分。在本发明的一个实施方案中，捕获剂是特异性结合Ang-2的肽或肽抗体或者其片段。这些免疫结合分析是本领域公知的[Asai，编著Methods inCell Biology，Vol.37，Antibodies in Cell Biology，AcademicPress，Inc.，New York(1993)]。
免疫结合分析常常使用标记试剂，它是捕获剂或抗原形成的结合的复合物存在的信号。标记试剂可以是包括结合的复合物的分子之一；即它可以是标记的特异性结合剂或者标记的抗特异性结合剂抗体。或者，标记试剂可以是第三分子，通常是另一种抗体，它结合结合的复合物。标记试剂可以是，例如，带有标记的抗特异性结合剂抗体。二抗，对结合的复合物是特异性的，可以没有标记，但是能被第四分子结合，第四分子对于二抗是其中一员的抗体物质是特异性的。例如，二抗可以被可检测部分修饰，例如生物素，它之后被第四分子结合，所述第四分子例如酶标记的链霉抗生物素蛋白。能特异性结合免疫球蛋白的恒定区的其他蛋白质，例如蛋白质A或蛋白质G也可以被用作标记试剂。这些结合蛋白质是链球菌细胞壁正常成分并且具有与各种物种的免疫球蛋白恒定区的强的非免疫原反应性。Akerstrom，J.Immunol.，135：2589-2542(1985)；Chaubert，Mod.Pathol.，10：585-591(1997)。
在分析中，每一次混合试剂之后可能要求温育和/或洗涤步骤。温育步骤可以是大约5秒至几小时，优选大约5分钟至大约24小时。但是，温育时间取决于分析形式，分析物，溶液体积，浓度等。通常，在环境温度下进行分析，但是在一定温度范围内可以进行。
A.非竞争性结合鉴定法
免疫结合鉴定法可以是非竞争性类型。这些分析有一定量的直接测量的捕获分析物。例如，在优选的″夹心″鉴定法中，捕获试剂(抗体或肽抗体)可以直接结合固体底物，在那里被固定。这些固定化捕获试剂然后捕获(结合)分析样品中存在的抗原。这样被固定的蛋白质然后结合标记试剂，例如带有标记的二抗。在另一个优选的″夹心″鉴定法中，二抗没有标记，但是可以被对二抗从中衍生的物质的抗体特异性的标记抗体结合。二抗还可以被可检测部分例如生物素修饰，第三标记分子例如链霉抗生物生蛋白能特异性结合生物素。参见Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，Ch 14，Cold Spring HarborLaboratory，NY(1988)，这里引作参考。
B.竞争性结合鉴定法
免疫结合鉴定法可以是竞争性类型。通过测定样品中存在的分析物置换的或者从捕获试剂(抗体或肽抗体)完全去除的加入的分析物的量，间接测定样品中存在的分析物的量。在一个优选的竞争性结合鉴定法中，向样品加入通常被标记的已知量的分析物，样品然后接触捕获试剂。与抗体结合的标记分析物的量与样品中存在的分析物的浓度成反比(参见，Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，Ch 14，pp.579-583，上文)。
在另一个优选的竞争性结合鉴定法中，捕获试剂固定在固体底物上。通过测定蛋白质/抗体复合体中存在的蛋白质的量，或者通过测定保留的没有复合的蛋白质的量，可以测定与捕获试剂结合的蛋白质的量。通过提供标记蛋白质可以测定蛋白质的量。Harlow和Lane(上文)。
在另一个优选的竞争性结合鉴定法中，利用半抗原抑制作用。这里，已知的分析物固定在固体底物上。向样品加入已知量的抗体，并且样品接触固定的分析物。与固定的分析物结合的抗体的量与样品中存在的分析物的量成反比。通过测定抗体的固定级分或者溶液中保留的级分可以测定固定化抗体的量。测定可以是直接的，其中抗体被标记，或者通过接着加入标记部分而间接测定，所述标记部分如上所述特异性结合抗体。
C.竞争性结合鉴定法的应用
竞争性结合鉴定法可以用于交叉反应测定，允许技术人员测定本发明的肽抗体识别的蛋白质或酶复合体是不是期望的蛋白质而不是交叉反应分子，或者测定融合蛋白是不是对抗原是特异性的而不结合不相关的抗原。在这种类型的鉴定法中，抗原可以固定到固体载体上并且向测试中加入未知蛋白质混合物，它会与肽抗体与固定化蛋白质的结合相竞争。该竞争分子还结合与所述抗原不相关的一种或几种抗原能。将蛋白质与肽抗体和固定化抗原结合相竞争的能力与和固体载体固定化的相同蛋白质的结合相比较，测定蛋白质混合物的交叉反应。
D.其他结合鉴定法
本发明还提供Western印迹法，测定或定量分析样品中Ang-2的存在。所述技术一般包括以分子量为基础通过凝胶电泳分离样品蛋白质并且将蛋白质转移到合适的固体载体，例如硝基纤维素过滤器，尼龙过滤器，或衍生化尼龙过滤器。样品和特异性结合Ang-2的肽抗体或者其片段温育并且检测得到的复合体。这些肽抗体可以直接被标记或者接着被检测，使用特异性结合肽抗体的标记抗体。
诊断分析
本发明的衍生结合剂，例如肽和肽抗体或者其片段用于特征在于表达Ang-2或亚基的症状或疾病的诊断，或者用于对用Ang-2的诱导物，其片段，Ang-2活性的激动剂或抑制剂治疗的患者监测的检定中。对于Ang-2的诊断鉴定包括使用肽抗体和标记检测人体液或者细胞或组织提取物中的Ang-2的方法。本发明的肽抗体可以在有或没有修饰作用下使用。在优选的诊断鉴定法中，通过连接，例如标记或报道分子，将肽抗体标记。很多种标记和报道分子是公知的，其中的一些已经在这里描述。特别地，本发明用于人疾病的诊断。
本领域公知很多种使用对各种蛋白质特异性的肽抗体测定Ang-2蛋白质的方法。例子包括酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分类(FACS)。使用与Ang-2上两个不干扰表位反应的单克隆抗体的两个位点单克隆为基础的免疫测定是优选的。这些测定方法描述于，例如，Maddox等，J.Exp.Med.，158：1211(1983)。
为了提供诊断基础，通常确定人Ang-2表达的正常或标准值。在本领域公知的适合复合体形成的条件下，通过将来自正常受试者优选人的体液或细胞提取物与抗Ang-2的肽抗体混合，来实现测定。使用对照和疾病样品，通过比较肽抗体与已知量的Ang-2蛋白质的结合能定量测定标准复合体形成的量。然后，将从正常样品获得的标准值与从可能受疾病影响的受试者的样品获得的值相比较。标准值和实验值之间的偏差表明对于疾病状态中的Ang-2的作用。
对于诊断应用，在一些实施方案中，本发明的肽抗体或肽一般用可检测部分标记。可检测部分可以是任何能直接或间接产生可检测信号的那些。例如，可检测部分可以是放射性同位素，例如H，C，P，S，或I，荧光或化学发光化合物，例如荧光素异硫代氰酸酯，诺丹明，或荧光素；或者酶，例如碱性磷酸酶，[β]-半乳糖苷酶，或辣根过氧化物酶。Bayer等，Meth.Enz.，184：138-163，(1990)。
疾病
本发明提供用于治疗人疾病和病理状态的结合Ang-2的结合剂，例如肽，肽抗体，或者其片段，变体或衍生物。可以与其他治疗药物结合使用调节Ang-2结合活性或者其他细胞活性的试剂，以增强它们的治疗效果或者降低可能的副作用。
一方面，本发明提供用于治疗特征在于细胞中不期望的或异常水平的Ang-2活性的疾病和症状的药物和方法。这些疾病包括癌症，和其他超增殖症状，例如增生，牛皮癣，接触性皮炎，免疫失调，和不孕症。
本发明还提供了治疗动物包括人的癌症的方法，包括对动物施用有效量的特异性结合剂，例如抑制或降低Ang-2活性的肽抗体。本发明进一步涉及抑制癌细胞生长的方法，包括生物系统中细胞增殖，侵入，和转移过程。所述方法包括使用本发明的化合物作为癌细胞生长抑制剂。优选地，应用所述方法对活体动物例如哺乳动物抑制或减小癌细胞生长，侵入，转移，或肿瘤发生。本发明的方法还容易适合在测试系统中使用，例如，分析癌细胞生长及其性质，以及鉴定影响癌细胞生长的化合物。
本发明的方法可治疗的癌症优选在哺乳动物中发生。哺乳动物包括，例如，人和其他灵长目，以及宠物或陪伴动物例如狗和猫，试验用动物例如大鼠，小鼠和兔，和农场动物例如马，猪，羊，和牛。
瘤或肿瘤包括其中细胞增殖失控且进行性的组织细胞的生长。一些这样的生长是良性的，但是其他称作恶性并且可能导致生物死亡。恶性肿瘤或癌与良性生长的区别在于，除了表现出进行性细胞增殖之外，它们可以侵犯周围的组织并且转移。此外，恶性肿瘤特征在于它们表现出较大分化损失(较大去分化)，以及相对另一种和它们周围组织的它们的组织的较大损失。这种性质也称作″退行发育″。
本发明可治疗的肿瘤还包括实体瘤，即，癌和肉瘤。癌包括渗透(侵入)周围组织并且发生转移的得自上皮细胞的那些恶性肿瘤。腺癌是得自腺组织的癌，或者它形成可识别腺组织。另一个宽的分类或癌包括肉瘤，它们是包埋在纤丝或同质物质象胚胎缔结组织中的细胞。本发明还能治疗骨髓或淋巴系统癌症，包括白血病，淋巴瘤和一般不以肿瘤质存在而是分布在血管或淋巴网状系统中的其他癌症。
能接受本发明治疗的癌或肿瘤的类型包括，例如，ACTH-产生肿瘤，急性淋巴细胞白血病，急性非淋巴细胞白血病，肾上腺内皮癌，膀胱癌，脑癌，乳腺癌，子宫颈癌，慢性淋巴细胞白血病，慢性髓细胞白血病，结肠癌，皮肤T-细胞淋巴瘤，子宫内膜癌，食管癌，Ewing′s肉瘤，胆囊癌，毛状细胞白血病，头颈癌，霍奇金淋巴瘤，Kaposi′s肉瘤，肾癌，肝癌，肺癌(小细胞和非小细胞)，恶性腹膜积液，恶性胸膜积液，黑素瘤，间皮瘤，多样骨髓瘤，神经胚细胞瘤，神经胶质瘤，非霍奇金淋巴瘤，骨肉瘤，卵巢癌，卵巢(胚细胞)癌，胰腺癌，阴茎癌，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，皮肤癌，软组织肉瘤，鳞状细胞癌，胃癌，睾丸癌，甲状腺癌，滋养层肿瘤，子宫癌，阴道癌，阴户癌，和Wilms′肿瘤。
关于一些类型的实验确定的癌症的治疗，本发明在这里特别详细地描述。在这些详述的治疗中，使用现有技术标准体外和体内模型。这些方法能被用来鉴定预期在体内治疗方案中有效的药物。但是，明白本发明的方法不局限于这些肿瘤类型的治疗，而是延伸到源自任何器官系统的实体瘤。其侵入或转移与Ang-2表达或活性有关的癌症特别易于用本发明抑制或者甚至被诱导退化。
本发明还通过包括使用下面的本发明的化合物而实施，例如与另一种抗癌化疗药物例如任何常用化疗药物结合的肽抗体。特异性结合剂与这样的其他药物结合能使化疗方案有增强的作用。熟练医师会想到很多种化疗法能结合本发明的方法。可以使用任何化疗药物，包括烷基化试剂，抗代谢物，激素和拮抗剂，放射性同位素，以及天然产物。例如，本发明的化合物能和抗生素一起给药，所述抗生素例如阿霉素和其他蒽环霉素类似物，氮芥例如环磷酰胺，嘧啶类似物例如5-氟尿嘧啶，顺铂，羟基脲，紫杉醇及其天然和合成衍生物，等。在另一个实施例中，在混合肿瘤情况下，例如乳腺癌，其中肿瘤包括促性激素依赖性和非促性激素依赖性细胞，该化合物可以和抑那通或果丝瑞宁(LH-RH的合成肽类似物)联合给药。其他抗肿瘤方案包括使用四环素化合物和另一种治疗用药程式，例如，手术，放射等，这里也称作″辅助抗肿瘤用药程式″。因此，本发明的方法可以使用这样的常规方案进行，好处是减小副作用并且增强药效。
本发明因此提供用于治疗多种癌症，包括实体瘤和白血病，的组合物和方法。可以治疗的癌症类型包括但不限于：乳腺癌，前列腺癌，和结肠癌；所有形式的肺支气管原癌；骨髓癌；黑素瘤；肝脏肿瘤；成神经细胞瘤；乳头状瘤；胺前体摄取与脱羧细胞瘤；迷芽瘤；腮原瘤；恶性癌综合症；癌心脏病；癌(例如，Walker癌，基细胞癌，basosquamous癌，Brown-Pearce癌，导管癌，Ehrlich肿瘤，Krebs 2癌，梅克尔细胞，粘蛋白，非小细胞肺癌，燕麦细胞，乳头状瘤，硬癌，细支气管癌，支气管原癌，鳞状细胞癌，和移行细胞癌)；组织细胞性病；白血病；恶性组织细胞增多；Hodgkin′s病；免疫增殖小细胞肺癌；非霍金森淋巴瘤；浆细胞瘤；网状内皮组织增殖；黑素瘤；成软骨瘤；软骨瘤；软骨肉瘤；纤维瘤；纤维肉瘤；巨细胞肿瘤；组织细胞瘤；脂瘤；脂肉瘤；间皮瘤；粘液瘤；粘液肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；脊索瘤；颅咽管瘤；无性细胞瘤；错构瘤；间叶瘤；中肾瘤；肌肉瘤；成釉细胞瘤；牙骨质瘤；牙瘤；畸胎瘤；胸腺瘤；tophoblastic肿瘤。此外，也可以治疗下面类型的癌症：腺瘤；胆管瘤；胆脂瘤；cyclindroma；囊腺癌；囊腺瘤；粒层细胞瘤；两性胚细胞瘤；肝细胞瘤；汗腺腺瘤；小岛细胞肿瘤；间质细胞肿瘤；乳头状瘤；塞尔托利氏细胞肿瘤；鞘细胞瘤；平滑肌瘤；平滑肌肉瘤；原粒细胞瘤；肌瘤；肌肉瘤；横纹肌瘤；横纹肌肉瘤；室管膜瘤；神经节瘤；神经胶质瘤；成神经管细胞瘤；脑膜瘤；神经鞘瘤；成神经细胞瘤；神经上皮瘤；神经纤维瘤；神经瘤；副神经节瘤；副神经节瘤nonchromaff in；血管角质瘤；嗜曙红细胞增多类淋巴管增生；血管瘤硬化；多发性血管瘤；血管球瘤；血管内皮瘤；血管瘤；血管外皮细胞瘤；血管肉瘤；淋巴管瘤；淋巴管肌瘤；淋巴管肉瘤；松果体瘤；癌肉瘤；软骨肉瘤；叶状囊性肉瘤；纤维肉瘤；血管肉瘤；平滑肌肉瘤；淋巴瘤性白血病；脂肉瘤；淋巴管肉瘤；肌肉瘤；粘液肉瘤；卵巢癌；横纹肌肉瘤；肉瘤；赘生物；nerofibromatosis；和子宫颈发育异常。
本发明的另一方面是使用本发明的材料和方法来防止和/或治疗任何皮肤超增殖症状，包括牛皮癣和接触性皮炎或者其他超增殖疾病。已经证明牛皮癣和接触性皮炎患者其身体病灶有升高的Ang-2活性[Ogoshi等，J.Inv.Dermatol.，110：818-23(1998)]。优选地，与治疗表现这些临床症状人的其他药物联合使用对Ang-2特异性的特异性结合剂。利用各种各样的载体通过这里描述的给药途径和本领域技术人员公知的其他途径能送递特异性结合剂。
本发明的另一方面包括治疗各种其中涉及血管发生的视网膜病(包括糖尿病视网膜病和与年龄相关的黄斑变性)，以及女性生殖道失调/疾病，例如子宫内膜异位，子宫纤维瘤，和与功能障碍血管增生相关的女性生殖周期期间其他这样的症状(包括子宫内膜微血管生长)。
本发明的另一方面涉及治疗异常血管生长，包括脑动静脉畸形(AVMs)胃肠粘膜损伤和修复，有消化系统溃疡病使患者胃十二指肠粘膜溃疡，包括中风导致的局部缺血，各种肝病中肺维管失调和非肝门高血压患者的肝门高血压。
本发明的另一方面是使用本发明提供的组合物和方法预防癌症。这样的试药包括特异性结合剂例如抗Ang-2肽抗体。
药物组合物
Ang-2特异性结合剂例如肽抗体的药物组合物在本发明的范围内。含有抗体的药物组合物详细描述于，例如，2001年1月9日公布的Lam等人的美国专利No.6,171,586。这样的组合物含有治疗或预防有效量的特异性结合剂，例如与药学可接受试剂混合的这里描述的抗体，或者其片段，变体，衍生物或融合体。在优选的实施方案中，药物组合物含有与药学可接受试剂混合的部分或完全调节Ang-2的至少一种生物活性的拮抗剂特异性结合剂。典型地，所述特异性结合剂足够纯化，用于对动物施用。
药物组合物可以含有制剂材料，用于调整，保持或维持，例如，组合物的pH，克分子渗透压浓度，粘度，澄清度，颜色，等张性，气味，无菌，稳定性，溶解或释放速度，吸附或渗透。合适的制剂材料包括，但不限于，氨基酸(例如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(例如抗坏血酸，亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲液(例如硼酸盐，碳酸氢盐，Tris-HCl，柠檬酸盐，磷酸盐，其他有机酸)；膨胀剂(例如甘露糖醇或甘氨酸)，螯合剂[例如乙二胺四乙酸(EDTA)]；络合剂(例如咖啡因，聚乙烯吡咯烷酮，β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填料；单糖；二糖和其他碳水化合物(例如葡萄糖，甘露糖，或糊精)；蛋白质(例如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白)；着色剂；矫味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡粒子(例如钠)；防腐剂(例如氯化苄烷铵，苯甲酸，水杨酸，硫贡撒，苯乙醇，羟苯甲酯，羟苯丙酯，洗必太，山梨酸或过氧化氢)；溶剂(例如甘油，丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或湿润剂(例如普流罗尼，PEG，脱水山梨糖醇酯，聚山梨酯类例如聚山梨酯20，聚山梨酯80，三硝基甲苯，氨丁三醇，卵磷脂，胆固醇，四丁酚醛)；稳定增强剂(蔗糖或山梨醇)；紧张性增强剂(例如碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾，甘露糖醇，山梨糖醇)；运送载体；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂(Remington′s PharmaceuticalSciences，第18板，A.R.Gennaro，编著，Mack Publishing Company，1990)。
根据例如想用的给药途径，送递方式，和期望的剂量，本领域技术人员会确定最佳药物组合物。参见，例如，Remington′sPharmaceutical Sciences，上文。这样的组合物可以影响特异性结合剂的物理状态，稳定性，和体内释放速度，和体内清除速度。
药物组合物中的主要赋形剂和载体性质可以是含水的或非水的。例如，合适的赋形剂或载体可以是注射用水，生理盐水或人工脑脊髓液，可能补充有肠胃外给药组合物中常用的其他材料。中性缓冲盐水或者与血清白蛋白混合的盐水是另外的举例的赋形剂。其他例示的药物组合物含有大约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液，或者大约pH 4.0-5.5的乙酸缓冲液，其可以进一步包括山梨糖醇或者合适的替代物。在本发明的一个实施方案中，可以通过将具有期望程度纯度的选择的组合物和任意的配药制剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences，上文)混合成冻干块状物或水溶液而制备结合剂组合物储存。此外，利用合适的赋形剂例如蔗糖可以将结合剂产物配制成冻干剂。
可以选择用于肠胃外给药的药物组合物。或者，可以选择组合物用于吸入法或肠给药例如口服，耳给药，眼给药，直肠，或阴道给药。这样的药学可接受组合物的制备在本领域技术人员能力之内。
给药部位可接受的浓缩物中存在制剂成分。例如，使用缓冲液保持组合物为生理pH或者稍低的pH，一般在大约5至大约8的pH范围内。
当涉及肠胃外给药时，本发明中使用的治疗性组合物可以是无热源的药学可接受赋形剂中含有期望的特异性结合剂的肠胃外可接受水溶液。用于肠胃外注射的特别合适的赋形剂是无菌水，其中结合剂被配制成无菌的，等张的溶液，使当地防腐。而另一个制备涉及用一种提供产物缓蚀或持续性释放然后通过贮存注射送递的物质，例如可注射微球体，生物可降解颗粒，聚合物化合物(聚乳酸，聚乙醇酸)，小球，或脂质体，将期望的分子制成制剂。也可以使用透明质酸，它在循环中有推广延长时间的作用。引入期望的分子的其他合适的方法包括可植入药物送递装置。
另一方面，可以在水溶液，优选生理可容缓冲液例如Hanks′溶液，ringer′s溶液，或者生理缓冲盐水中配制适合肠胃外给药的药物制剂。含水注射悬浮液可以含有提高悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇，或葡聚糖。另外，可以将活性化合物悬浮液制备成合适的油注射悬浮液。合适的亲油性溶剂或赋形剂包括脂肪油，例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯，三甘油脂，或脂质体。非脂质聚阳离子氨基聚合物可以用于送药。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或者提高化合物溶解度的试剂，制备出高浓缩溶液。
在另一个实施方案中，药物组合物可以配制成吸入法用药。例如，可以将结合剂配制成吸入用干粉末剂。也可以用用于气雾剂送药的抛射剂配制多肽或核酸分子吸入用溶液。在另一个实施方案中，可以喷洒溶液。PCT申请No.PCT/US94/001875中进一步描述了肺给药，它描述了肺给药化学修饰的蛋白质。
还涉及可以口服施用一些制剂。在本发明的一个实施方案中，使用或不使用象片剂和胶囊这样的固体剂型是常规使用的那些载体，能配制以这种方式给药的结合剂分子。例如，设计胶囊，当生物利用率最大并且系统之前降解最小时，在胃肠道的一点释放制剂的活性部分。可以含有附加试剂以有利于结合剂分子的吸收。也可以使用稀释剂，矫味剂，低熔点蜡，植物油，润滑剂，悬浮剂，片剂崩解剂，和粘合剂。
使用本领域技术人员公知的药学可接受载体也能将用于口服给药的药物组合物配制成适合口服给药的剂型。这样的载体使药物组合物被配制成患者摄食的片剂，丸剂，糖衣丸，胶囊，液体，凝胶，糖浆，浆液，悬浮液，等。
通过将活性化合物与固体赋形剂混合并且将得到的颗粒混合加工处理(任选地，在研磨之后)，获得片剂或糖衣丸核心，能获得口服使用的药物制剂。如果期望，可以加入合适的辅助剂。合适的辅助剂包括碳水化合物或蛋白质，例如糖，包括乳糖，蔗糖，甘露糖醇，和山梨糖醇；来自玉米，小麦，稻，马铃薯，或其他植物的淀粉；纤维素，例如甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，或羧甲基纤维素钠；树胶，包括阿拉伯胶和黄芪胶；和蛋白质，例如明胶和胶原。如果期望，可以加入崩解剂或增溶剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮琼脂，和海藻酸或者其盐，例如藻酸盐。
糖衣丸心核可以与合适的包衣联合使用，所述合适的包衣是例如浓糖溶液，它还可以含有阿拉伯胶，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，carbopolgel，聚乙二醇，和/或二氧化钛，漆溶液，和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或糖丸剂包衣加入染料或颜料，用于产物识别或者表征活性化合物的量，即，剂量。
可以口服使用的药物制剂还可以包括明胶制成的适合推动的胶囊，以及明胶和包衣例如甘油或山梨糖醇制成的软密封胶囊。适合推动的胶囊可以含有与填料或粘合剂例如乳糖或淀粉，润滑剂，例如滑石或硬脂酸镁，和任选地，稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可以溶解于或悬浮于合适的液体中，例如脂肪油，液体，液体聚乙二醇，有或没有稳定剂。
另一种药物组合物可以含有与适合制备片剂的无毒赋形剂的混合物中有效量的结合剂。通过将片剂溶解于无菌水，或者其他合适的赋形剂中，可以制备单位剂量形式的溶液。合适的赋形剂包括但相比于，惰性稀释剂，例如碳酸钙，碳酸钠或碳酸氢钠，乳糖，或磷酸钙；或粘合试剂，例如淀粉，明胶，或阿拉伯胶；或润滑剂例如硬脂酸镁，硬脂酸，或滑石。
另外的药物组合物对于本领域技术人员是显然的，包括持续性释放或缓释送药制剂中含有结合剂分子的制剂。配制各种各样的其他持续性或缓释送药方式的技术，例如脂质体载体，生物可降解微粒或者大孔小球和贮存注射液，对于本领域技术人员也是公知的。参见，例如，PCT/US93/00829，它描述了用于送递药物组合物的大孔聚合物微粒的缓释。持续性释放制剂的另外的例子包括有形物品形式的半渗透聚合物基体，例如膜，或微胶囊。持续性释放基体可以包括聚酯类，水凝胶，聚较酯(美国专利No.3,773,919，EP 58,481)，L-谷氨酸和γL-谷氨酸乙酯的共聚物[Sidman等，Biopolymers，22：547-556(1983)]，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)[Langer等，J.Biomed.Mater.Res.，15：167-277，(1981)]和[Langer等，Chem.Tech.，12：98-105(1982)]，乙酸亚乙基乙烯酯(Langer等，上文)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP133,988)。持续性释放组合物还包括脂质体，通过本领域公知的几种方法制备。参见，例如，Eppstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，82：3688-3692(1985)；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949。
用于体内施用的药物组合物一般一定要灭菌。通过灭菌过滤膜灭菌过滤能实现这样。将组合物冻干，在冻干和重新配制之前或之后可以实施利用这种方法的灭菌。用于肠胃外给药的组合物可以以冻干形式或在溶液中储存。另外，一般将肠胃外组合物置于具有灭菌入口的容器内，例如，带有皮下注射针头可穿透的塞子的静脉溶液袋或小瓶。
一旦配制了药物组合物，可以在灭菌小瓶中贮溶液，悬浮液，凝胶，乳状液，固体，或脱水或冻干粉末剂。可以以待用形式或者在给药之前需要重新配置的形式(例如冻干的)贮存这样的制剂。
在具体的实施方案中，本发明涉及用于制备单剂量给药单位的试剂盒。试剂盒可以各自含有盛有干燥的蛋白质的第一容器和盛有含水制剂的第二容器两者。本发明范围内还包括包含单个或多个小室预装注射器(例如液体注射器和冻干剂注射器)的试剂盒。
治疗上使用的药物组合物的有效量取决于，例如，治疗背景和主体。本领域技术人员明白用于治疗的适当的剂量水平是不同的，部分取决于送递的分子，使用的结合剂分子的适应征，给药途径，和患者的大小(体重，体表面或器官大小)和状况(年龄和一般的健康情况)。因此，临床医师可以确定剂量并且改变给药途径，以获得最佳治疗效果。根据上面提到的因素，典型的剂量范围是大约0.1mg/kg至最多大约100mg/kg或者更多。在其他实施方案中，剂量范围可以是0.1mg/kg最多至100mg/kg；或者1mg/kg至最多大约100mg/kg；或者5mg/kg至最多大约100mg/kg。
对于任何化合物，开始时在细胞培养物或者动物模型例如小鼠，大鼠，兔，狗，猪，或猴中能估计治疗有效剂量。还可以使用动物模型来确定合适的浓度范围和给药途径。然后利用这样的信息来确定对人给药的有用的剂量和途径。
考虑与需要治疗的受试者相关的因素确定精确剂量。调节剂量和施用，提供足够水平的活性化合物或者保持期望的作用。可以考虑的因素包括病态的严重性，受者的一般健康，受者的年龄，体重和性别，该药的时间和次数，药物联合，反应灵敏性，对治疗的反应。根据特定制剂的半寿期和清除率，可以每3-4天，每周，或者每两周施用长效药物组合物。
给药次数取决于使用的制剂中结合剂分子的药物动力学参数。一般地，施用组合物，直到用量达到期望的作用。因此，可以用单剂量，或随时间多次给药(以相同或不同浓度/剂量)，或者连续输液，可以施用组合物。合适剂量的进一步精确给药方案是常规制定的。通过使用适当的剂量-反应数据，可以确定合适的剂量。
药物组合物的给药途径与已知方法相一致，例如口服，通过静脉内，腹膜内，大脑内(薄壁组织内)，脑室内，肌内，眼内，动脉内，肝门内，病灶内途径注射，骨髓内，鞘内，室内，经皮，皮下，腹膜内，鼻内，肠内，局部，舌下，尿道，阴道，或者直肠方式，通过持续性释放系统或者通过埋入装置。期望时，通过大丸剂注射，或者通过输液或者通过埋入装置连续施用组合物。
或者，另外，通过埋入其上已经吸收或者包在其中有期望的分子的膜，海绵状物质，或者其他合适的材料，可以局部施用组合物。当使用埋入装置时，可以将装置埋入任何合适的组织或器官，期望的分子的送递可以通过扩散，随时间释放的大丸剂，或者连续给药。
在某些情况下，期望以来自体内的方式使用药物组合物。在这样的情况下，使来自患者的细胞，组织，或器官接触药物组合物，其后接着将这些细胞，组织，和/或器官植回给患者。
在另外的情况下，本发明的结合剂例如肽抗体能通过埋入利用这里描述的方法经基因工程处理表达和分泌多肽的细胞送递。这样的细胞可以是动物或人细胞，并且可以是自身的，异种的，或异基因的。任选地，细胞可以是无限增殖的。为了减小免疫应答机会，可以将细胞包在荚膜内，以避免周围组织渗透。密封材料是生物相容的半渗透聚合物外壳或膜，它允许蛋白质产物释放但是防止患者免疫系统或者周围组织的其他有害因子对细胞的破坏。
联合治疗
在对与Ang-2表达相关的疾病的治疗中，本发明的特异性结合剂例如肽抗体可以与其他治疗法联合应用。这些其他疗法包括，例如放射疗法，化疗，和靶向疗法，例如HerceptinTM，RituxanTM，GleevecTM，等。没有在这里具体列出的其他联合疗法也在本发明的范围内。
化疗治疗可以使用抗肿瘤药物，包括，例如，烷基化试剂，包括：氮芥，例如双氯乙基甲胺，环磷酰胺，异磷酰胺，左旋溶肉瘤素和苯丁酸氮芥；亚硝基脲类，例如卡氮芥(BCNU)，洛氮芥(CCNU)，和司莫司汀(甲基-CCNU)；氮丙啶/甲基三聚氰胺例如三亚乙基三聚氰胺(TEM)，三胺硫磷，硫替哌(噻替哌)，六甲基三聚氰胺(HMM，六甲蜜胺)；磺酸烷基酯，例如白消安；三嗪类，例如达卡巴嗪(DTIC)；抗代谢物，包括叶酸类似物，例如甲氨喋呤和曲美沙特，嘧啶类似物，例如5-氟尿嘧啶，氟去氧尿苷，吉西他滨，胞嘧啶阿拉伯糖苷(AraC，阿糖孢苷)，5-氮杂胞苷，2，2′-二氟脱氧胞苷，嘌呤类似物，例如6-巯基嘌呤，6-硫代鸟嘌呤，硫唑嘌呤，2′-脱氧助间型霉素(喷司他丁)，赤型羟基壬基腺嘌呤(EHNA)，磷酸氟达拉滨，和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨，2-CdA)；天然产物，包括抗有丝分裂药物，例如紫杉醇，长春花生物碱，包括长春碱(VLB)，长春新碱，和长春烯碱，脱乙酰基紫杉醇，雌莫司汀，和盐酸雌莫司汀；ppipodophylotoxins例如依托泊苷和替尼泊苷；抗生素例如actimomycin D，柔毛霉素(柔红霉素)，阿霉素，二羟蒽二酮，去甲柔毛霉素，博莱霉素，光辉霉素(普卡霉素)，丝裂霉素C，和放线菌素；酶例如L-天冬酰胺酶；生物学反应改性剂例如干扰素-α，IL-2，G-CSF和GM-CSF；各种药物例如铂复合物例如顺铂和卡铂，蒽二酮类例如二羟蒽二酮，取代的脲例如羟基脲，甲基肼衍生物包括N-甲基肼(MIH)和甲苄肼，肾上腺皮质抑制剂例如米托坦(o，p′-DDD)和安鲁米特；激素和拮抗剂包括肾上腺皮质激素甾族化合物拮抗剂例如强的松和等价物，地塞米松和安鲁米特；孕激素例如长效黄体酮，甲羟孕酮乙酸盐和甲地孕酮乙酸盐；雌激素例如己烯雌酚和乙炔基雌二醇等价物；抗雌激素例如他莫西芬；雄激素包括丙酸睾丸和氟甲睾酮/等价物；抗雄激素例如氟他胺，促性腺素释放激素类似物和抑那通；和非甾族抗雄激素例如氟他胺。
和生长因子的联合治疗包括细胞因子，淋巴因子，生长因子，或者其他造血因子，例如M-CSF，GM-CSF，TNF，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，IFN，TNF0，TNF1，TNF2，G-CSF，Meg-CSF，GM-CSF，血小板生成素，干细胞因子，和红细胞生成素。其他成分包括已知的血小板生成素，例如Ang-1，-2，-4，-Y，和/或人Ang-样多肽，和/或血管内皮生长因子(VEGF)。生长因子包括血管生成素，骨形态发生蛋白-1，骨形态发生蛋白-2，骨形态发生蛋白-3，骨形态发生蛋白-4，骨形态发生蛋白-5，骨形态发生蛋白-6，骨形态发生蛋白-7，骨形态发生蛋白-8，骨形态发生蛋白-9，骨形态发生蛋白-10，骨形态发生蛋白-11，骨形态发生蛋白-12，骨形态发生蛋白-13，骨形态发生蛋白-14，骨形态发生蛋白-15，骨形态发生蛋白受体IA，骨形态发生蛋白受体IB，脑起源神经营养因子，睫状营养佳良因子，睫状神经营养因子受体，细胞因子-诱导的嗜中性白细胞趋化因子1，细胞因子-诱导的嗜中性白细胞趋化因子2，内皮细胞生长因子，内皮素1，表皮生长因子，来自上皮的嗜中性白细胞诱引剂，成纤维细胞生长因子4，成纤维细胞生长因子5，成纤维细胞生长因子6，成纤维细胞生长因子7，成纤维细胞生长因子8，成纤维细胞生长因子8b，成纤维细胞生长因子8c，成纤维细胞生长因子9，成纤维细胞生长因子10，酸性成纤维细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，得自神经胶质细胞系的嗜中性细胞因子受体-1，得自神经胶质细胞系的嗜中性细胞因子受体-2，生长相关蛋白质，生长相关蛋白质-1，生长相关蛋白质-2，生长相关蛋白质-3，肝素结合表皮生长因子，肝细胞生长因子，肝细胞生长因子受体，胰岛素-样生长因子I，胰岛素-样生长因子受体，胰岛素-样生长因子II，胰岛素-样生长因子结合蛋白，角质形成细胞生长因子，白血病抑制因子，白血病抑制因子受体-1，神经生长因子，神经生长因子受体，神经营养蛋白-3，神经营养蛋白-4，胎盘生长因子，胎盘生长因子2，得自血小板的内皮细胞生长因子，得自血小板的生长因子，得自血小板的生长因子A链，得自血小板的生长因子AA，得自血小板的生长因子AB，得自血小板的生长因子B链，得自血小板的生长因子BB，得自血小板的生长因子受体-1，得自血小板的生长因子受体-2，pre-B细胞生长刺激因子，干细胞因子，干细胞因子受体，转化生长因子-1，转化生长因子-2，转化生长因子-1.2，转化生长因子-3，转化生长因子-5，潜伏型转化生长因子-1，转化生长因子-1结合蛋白I，转化生长因子-1结合蛋白II，转化生长因子-1结合蛋白III，肿瘤坏死因子受体I型，肿瘤坏死因子受体II，尿激酶型纤溶酶原激活剂受体，血管内皮生长因子，及其嵌合蛋白和生物学或免疫学活性片段。
免疫治疗
免疫治疗一般依赖定向并破坏癌细胞的免疫效应子细胞和分子的使用。免疫效应子可以是，例如，识别靶细胞表面上的一些标记的本发明的肽抗体。单独的肽抗体可以用作治疗的效应子或者它可以补充其他细胞来实际实施细胞杀伤。肽抗体也可以偶联药物或毒素(化疗药物，放射性核素，蓖麻毒A链，霍乱毒素，百日咳毒素，等)，因此可以只作为靶向试剂。
根据本发明，本发明的免疫疗法肽抗体或肽抗体偶合物可以靶向Ang-2的突变体形式。特别涉及本发明的肽抗体组合物可以与结合Ang-2靶向治疗的治疗方法联合应用。
已经证明被动免疫疗法对于抗多种癌症特别有效。参见，例如，WO98/39027。
下面的实施例只是为了详细说明的目的，而不应该认为在任何方面限制本发明的 范围。
实施例1
病理组织和正常组织中Ang-2表达
利用原位杂交检查正常和病理组织中Ang-2表达。通过逆转录酶-PCR从人或鼠胎儿肺cDNA扩增人(Genbank Accession Number：AF004327，核苷酸1274-1726)和鼠(Genbank Accession Number：AF004326，核苷酸1135-1588)Ang-2序列的片段，克隆到质粒pGEM-T中，并且通过测序证实。使用33P-UTP和RNA聚合酶从线性化质粒模板转录33P-标记反义RNA探针。甲醛固定化的石蜡包埋的组织块切成5微米，并且收集在带电载玻片上。原位杂交之前，组织用0.2M HCL，接着用蛋白酶K消化，并且用三乙醇胺和乙酸酐进行乙酰化作用。55℃下切片与放射性标记探针杂交过夜，然后进行RNA酶消化，并且在大约0.1XSSC在55℃下高严谨性洗涤，将载玻片浸入Slides weredi pped in Kodak NTB2乳剂中，4℃下暴露2-3周，显影，并且复染色。在黑暗区和标准照明下检查切片，同时评价形态学和杂交信号。
结果表明正常产后人，Ang-2表达限于包含血管发生脉管系统的少数组织，例如卵巢，胎盘，和子宫。在正常成年人心脏，脑，肾，肝，肺，胰腺，脾，肌肉，扁桃体，胸腺，阑尾，淋巴结，胆囊，前列腺或睾丸和子宫中没有可检测的Ang-2表达。在五周大小的小鼠(而不是成年猴子或人)，肾显示直小管中显著的Ang-2表达。为了确定这种表达是不是胚胎发育遗留的，使用鼠Ang-2探针和上述条件对最大一年龄大小的小鼠源的肾反复进行这项实验。在新生儿发育期发现Ang-2表达降低，但是一年龄小鼠的肾中仍然明显。
事实上对试验的所有肿瘤类型检查了Ang-2表达，包括，原发性人肿瘤，例如结肠癌(5例)，乳房癌(10例)，肺癌(8例)，恶性胶质瘤(1例)，转移性人肿瘤，例如乳房癌(2例)，肺癌(2例)，和卵巢癌(2例)，已经转移到脑，和啮齿动物肿瘤模型例如C6(大鼠神经胶质瘤)，HT29(人结肠癌)，Colo-205(人结肠癌)，HCT116(人结肠癌)，A431(人表皮样瘤)，A673(人横纹肌肉瘤)，HT1080(人纤维肉瘤)，PC-3(人前列腺癌)，B16F10(鼠黑素瘤)，MethA(鼠肉瘤)，和Lewis肺癌。另外，对反应VEGF的生长到Matrigel栓中的新血管和早产视网膜病小鼠低氧症模型检查Ang-2表达。
实施例2
评价Ang-2肽抗体的分子测定
进行分子测定(亲和力ELISA，中和作用ELISA，和BIAcore)评价结合Ang-2和相关家族成员的直接肽抗体，以及肽抗体对Ang-2：Tie-2相互作用的作用。下面详细描述这些体外试验。
亲和力ELISA
为了最初筛选侯选抗-Ang-2肽抗体，使用纯化的人Ang-2(R&DSystems，Inc；目录号623-AN；Ang-2以2个截短型的混合物被提供)或鼠Ang-2多肽(如上所述制备)。为了证实结合测试，从用全长人Ang-2DNA转染的人293T细胞的条件培养基获得人Ang-2并且在含有大约50微克/毫升牛血清白蛋白(BSA)的无血清Dulbecco′s修饰的Eagle培养基(DMEM)中培养。
使用微量滴定板，向每个孔加入大约100微升/孔Ang-2，并且将板温育大约2小时，然后用含有大约0.1％Tween-20的磷酸缓冲盐水(PBS)将板冲洗四次。然后对于每孔用250微升的大约5％BSA的PBS溶液封闭各孔，板在室温下温育大约2小时。温育之 后，弃除过量的封闭溶液，向孔中加入大约100微升的各种侯选抗-Ang-2肽抗体，稀释系列开始浓度是大约40毫微摩尔，然后在含有大约1％BSA的PBS中系列稀释4倍。培养板然后在室温下温育过夜。温育之后，用含有大约0.1％Tween-20的PBS冲洗平板。将冲洗又重复四次，然后向每孔加入在含有1％BSA的PBS中1∶5000预先稀释的山羊抗-人IgG(Fc)-HRP(Pierce Chemical Co.，catalog#31416)大约100微升。培养板在室温下温育大约1小时。然后在含有大约0.1％Tween-20的PBS冲洗平板五次，然后每孔加入大约100微升的TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺液体底物体系；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.，目录号T8665)底物，并且将培养板温育大约5-15分钟直到显示蓝色。然后在分光光度计上在大约370nm读取吸光度。
中和作ELISA
根据对于亲和力ELISA所描述的制备结合了Ang-2多肽的微量滴定板。在含有大约1％BSA和大约1nM Tie-2(以Tie-2-Fc分子提供，其中Tie-2部分只含有该分子的可溶性胞外部分；R&D Systems，目录号313-TI)的PBS溶液中以4倍稀释度从1000nM至0.2pM滴定侯选抗-Ang-2肽抗体。向各孔加入大约100微升的抗体/Tie-2溶液之后，培养板在室温下温育过夜，然后用含有大约0.1％Tween-20的PBS清洗五次。冲洗之后，每孔加入大约100微升的抗-Tie-2抗体(Pharmingen Inc.，catalog#557039)，最终浓度达到大约1微克/毫升，培养板在室温下温育大约1小时。接着，以含有大约1％BSA的PBS中以1∶10,000的稀释度每孔加入大约100微升山羊抗-小鼠-IgG-HRP(Pierce Chemical CO.，catalog#31432)。培养板在室温下温育大约1小时，然后用含有大约0.1％Tween-20的PBS清洗五次。然后每孔加入大约100微升的TMB底物(如上所述)，使得显色。然后在分光光度计上在大约370nm读取吸光度。
亲和力BIAcore
使用PBS和0.005％P20表面活性剂(Biacore，Inc.)作为洗脱缓冲液在
Figure G2009101594519D00831
2000(Biacore，Inc.，Piscataway，N.J.)上进行各种侯选Ang-2肽抗体的亲和力分析。使用Amine Coupling Kit(Biacore，Inc.)根据供应商建议的方法通过伯胺基团将重组蛋白质G(Repligen，Needham，Mass.)固定到研究级CM5传感器芯片(Biacore，Inc.)上。
通过首先将大约100Ru的各种侯选抗-Ang-2肽抗体捕获到固定的蛋白质G，然后以50微升/分钟的流速向结合的抗体表面注射各种浓度的(0-100nM)的huAng-2或mAng-2三分钟，进行结合分析。应用BIA求值3.1计算机程序(Biacore，Inc.)测定肽抗体结合动力学参数，包括ka(缔合作用速度常数)，kd(离解作用速度常数)和KD(离解平衡常数)。离解平衡常数越低，表明肽抗体对Ang-2的亲和力越大。
实施例3
Ang-2结合肽的鉴定
1.Ang-2-包被磁珠制备
A.Ang-2在磁珠上的固定化
对于非特异性洗脱，对于全部三轮筛选，以每100微升从生产商处得到的小珠原液大约4微克生物素化Ang-2蛋白质的浓度，将生物素化Ang-2蛋白质(Biotinylated Recombinant Human Angiopoietin-2，R&D Systems，Inc.；目录号BT 623)固定在Streptavidin Dynabeads(Dynal，Lake Success，N.Y.)上。对于第二轮筛选，对于抗原 (Ang-2)和受体(Tie-2)洗脱，2微克生物素化Ang-2蛋白质固定在50微升的Streptavidin Dynabeads上。对于第三轮筛选，将包被浓度减小到每50微升小珠原液大约1微克生物素化Ang-2蛋白质。通过使用磁子将小珠拉到试管的一边并且汲出液体，用磷酸缓冲盐水(PBS)将小珠清洗五次并且再次悬浮于PBS。以上述浓度对清洗过的小球加生物素化Ang-2蛋白质，并且室温下转动温育1小时，接着转动下4℃下温育几小时至过夜。然后通过加入BSA至大约1％终浓度并且转动下4℃下温育过夜，封闭Ang-2-包被小珠。然后用PBS将得到的Ang-2包被小珠清洗五次，然后进行筛选程序。
B.阴性筛选小珠制备
另外制备小珠用于阴性筛选。对于各种筛选条件，使用500微升从生产商处得到的小珠原液进行上述程序(1A部分)，除了省略用生物素化Ang-2温育步骤。在最后清洗步骤中，将小珠分为五个100微升等份。
2.Ang-2结合噬菌体的筛选
A.总的策略
使用三个丝状噬菌体文库，称作″TN8-IX″(5X109独立转化体)，″TN12-I″(1.4X109独立转化体)，和″Linear″(2.3X109独立转化体)(都从Dyax Corp.获得)，来筛选Ang-2结合噬菌体。然后用各个文库进行非特异性洗脱，Ang-2洗脱，和受体洗脱(Tie-2)。对于Ang-2使用九种不同的筛选条件(利用非特异性洗脱方法的TN8-IX，利用Ang-2洗脱方法的TN8-IX，利用Tie-2洗脱方法的TN8-IX，利用非特异性洗脱方法的TN12-I，用Ang-2洗脱方法的TN12-I，和利用Tie-2洗脱方法的TN12-I，利用非特异性洗脱方法的Linear，用Ang-2洗脱方法的Linear，和利用Tie-2洗脱方法的Linear)。对于所有这三种文库，在非特异性方法中，从第一轮筛选中只洗脱出用于再几轮筛选的噬菌体。在第二和第三轮筛选中使用Ang-2和Tie-2洗脱。对于Linear文库，仅第二轮对Ang-2和Tie-2洗脱进行筛选。
B.阴性筛选
关于筛选条件，从文库中原种分出对于TN8-IX和TN12-I文库大约100个(对于TN8-IX大约5X1011pfu，对于TN12-I大约1.4X1011pfu)，对于线性文库大约10个(大约1X1011pfu)随机库等价物等份，并且用PBST(含有0.05％Tween-20的PBS)大约400微升稀释。最后洗涤之后，从第一个制备用于阴性筛选(1B章节)的小珠100微升等份汲出液体，向小珠加大约400微升稀释的文库原种。旋转下，得到的混合物在室温下温育大约10分钟。用磁子汲出噬菌体上清液，并且加给第二个100微升等份用于另一个阴性筛选步骤。用这种方法，进行五次阴性筛选步骤。
C.使用Ang-2蛋白质包被珠进行筛选
将最后阴性筛选步骤之后的噬菌体上清液(1B章节)加给Ang-2包被珠(1A章节)。该混合物在旋转下室温下温育1-2小时，使噬菌体与靶蛋白质结合。弃除上清液之后，用PBST将珠清洗大约10次，接着用PBS清洗两次。
D.非特异性洗脱
排除最后的清洗液之后(2C部分)，将大约1毫升的Min A盐溶液(60mM K2HPO4，33mM KH2PO4，7.6mM(NH4)SO4，和1.7mM柠檬酸钠)加给小珠。将这种小珠混合物直接加给浓缩细菌样品用于感染(参见下面的3A和3B章节)。
E.被结合噬菌体的抗原(Ang-2)洗脱
对于第二轮2，最后清洗步骤之后(2C章节)，通过加入100微升的1pM，0.1nM，和10nM重组Ang-2蛋白质(Recombinant HumanAngiopoietin-2，R&D Systems，Inc.，Minneapolis，Minn.)，对于每一个条件继续温育30分钟，从磁珠洗脱被结合噬菌体。非特异性洗脱保留的噬菌体(2D章节)。合并10nM和非特异性洗脱洗脱出的噬菌体，让它们进行第三轮筛选(参见下面的第4章节)。
对于第3轮，最后清洗步骤之后(2C章节)，通过加入大约1nM重组Ang-2蛋白质，和10nM重组Ang-2蛋白质，对于每一个条件继续温育30分钟，从磁珠洗脱被结合噬菌体。另外，在旋转装置上用1毫升的100mM三乙胺溶液(Sigma，St.Louis，Mo.)洗脱噬菌体大约10分钟。用0.5毫升的1M Tris-HCl(pH 7.5)中和含有噬菌体的三乙胺溶液的pH。最后用100mM三乙胺溶液洗脱之后，通过对细菌加小珠而洗脱留下的噬菌体(2D章节)。
F.被结合噬菌体的受体(Tie-2)洗脱
对于第二轮2，最后清洗步骤之后(2C章节)，通过加入大约100微升的1pM，0.1nM，和10nM重组Tie-2蛋白质(重组人Tie-2-Fc嵌合体，R&D Systems，Inc.，Minneapolis，Minn.)，对于每一个条件继续温育30分钟，从磁珠洗脱被结合噬菌体。非特异性洗脱保留的噬菌体(2D章节)。合并10nM和非特异性洗脱洗脱出的噬菌体，让它们进行第三轮筛选(参见下面的第4章节)。
对于第3轮，最后清洗步骤之后(2C章节)，通过加入大约1nM重组Ang-2蛋白质，和10nM重组Tie-2蛋白质，对于每一个条件继续温育30分钟，从磁珠洗脱被结合噬菌体。另外，在旋转装置上用1毫升的100mM三乙胺溶液(Sigma，St.Louis，Mo.)洗脱噬菌体大约10分钟。用0.5毫升的1M Tris-HCl(pH 7.5)中和含有噬菌体的三乙胺溶液的pH。最后用100mM三乙胺溶液洗脱之后，通过对细菌加小珠而洗脱留下的噬菌体(2D章节)。
3.扩增
A.平板细胞的制备
新鲜大肠杆菌(XL-1Blue MRF′)培养物在含有大约12.5微克/毫升四环素的LB培养基中生长至OD600为大约0.5。对于每一个筛选条件，在冰上冷却大约20毫升的这种培养物并且离心。将细菌颗粒重新悬浮于大约1毫升的Min A盐溶液。
B.转导
向浓缩细菌样品(3A章节)加入上述各种不同洗脱方法(2D，2E和2F章节)得到的各种混合物，并且在大约37℃下温育大约15分钟。向各混合物加入大约2毫升的NZCYM培养基(2XNZCYM，50微克/毫升氨苄青霉素)，并且在大约37℃下温育大约15分钟。得到的4毫升溶液在含有大约50微克/毫升氨苄青霉素的大NZCYM琼脂板上平板培养，并且在37℃下温育过夜。
C.噬菌体收集
各种细菌/噬菌体混合物在大NZCYM琼脂板(3B章节)上培养过夜，然后将它们破碎移到大约35毫升的LB培养基中。琼脂板进一步用另外的35毫升的LB培养基漂净。将LB培养基中得到的细菌/噬菌体混合物离心使细菌成颗粒状物。然后将大约50毫升的噬菌体上清液移至一个新试管中，加入大约12.5毫升的PEG溶液(20％PEG8000，3.5M乙酸铵)并且在冰上温育2小时使噬菌体沉淀。将沉淀的噬菌体离心出并且重新悬浮于6毫升的噬菌体再悬浮缓冲液(250mM NaCl，100mMTris pH8，1mM EDTA)中。通过离心进一步纯化这种噬菌体溶液去除残留的细菌，并且通过加入大约1.5毫升的PEG溶液第二次沉淀噬菌体。离心步骤之后，将噬菌体沉淀再次重新悬浮于大约400微升的PBS。让这种溶液最后离心以清除任何残留细菌碎屑的溶液。利用标准噬斑形成测试滴定得到的噬菌体制剂。
4.附加筛选和扩增
在第二轮中，将第一轮(3C章节)得到的扩增的噬菌体制剂(大约1010pfu)用作输入噬菌体进行筛选和扩增步骤(第2和3章节)。对于Ang-2和Tie-2洗脱，将来自10nM个非特异性洗脱的噬菌体合并并且扩增，用于第三轮筛选。从第二轮得到的扩增的噬菌体制剂(大约109pfu)接着被用作输入噬菌体进行第三轮筛选和扩增(第2和3章节)。第三轮洗脱步骤之后(2D，2E，和2F章节)，对洗脱出的小级分制成平板进行噬斑形成分析(3C章节)。取各噬斑并且在每孔含有100微升TE缓冲剂的96孔微量滴定板上平板培养。将这些主板在4℃下温育过夜，使噬菌体洗脱到TE缓冲液中。
5.克隆分析
通过噬菌体ELISA和DNA技术分析噬菌体克隆。以这两个测试合并的结果为基础排列序列。
A.噬菌体ELISA
XL-1 Blue MRF′培养物生长至OD600达到大约0.5。大约30微升的这种培养物分成等份加给96孔微量滴定板的每个孔中。向各孔加入大约10微升洗脱的噬菌体(第4部分)并且让细菌在室温下传染大约15分钟。向各孔加入大约100微升的含有大约12.5微克/毫升四环素和大约50微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基。微量滴定板然后在摇动下在大约37℃下温育过夜。让重组Ang-2蛋白质(大约1微克/毫升PBS溶液)在大约4℃下与96孔Maxisorp板(NUNC)结合过夜。作为对照物，以大约大约2微克/毫升PBS溶液将纯链霉抗生物素蛋白包被到分开的Maxisorp板上。
第二天，弃除蛋白质包被的Maxisorp板中的液体，大约4℃下用大约300微升的5％奶溶液将各个孔封闭过夜(或者，室温下封闭1小时)。然后弃除奶溶液，并且用PBST溶液将孔清洗三次。最后清洗步骤之后，向蛋白质包被的Maxisorp板中的各个孔加入大约50微升的PBST-4％奶液。向Ang-2包被的平板和对照物链霉抗生物素蛋白包被的平板的相应的孔移入从96孔微量滴定板的每个孔中汲出的大约50微升的过夜培养物。室温下将各类型板中100微升混合物温育大约1小时。弃除Maxisorp板中的液体，并且用PBST将孔清洗三次。将HRP-偶合的抗-M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)稀释至大约1∶7,500，并且向Maxisorp板的各孔加入大约100微升稀释溶液，在室温下温育大约1小时。再次弃除液体，并且用PBST将孔清洗大约五次。向各孔加入大约100微升的TMB底物(Sigma)，并且用大约50微升的5N H2SO4溶液终止反应。在分光光度计(Molecular Devices)上读取OD450。
B.噬菌体克隆测序
对于每一个噬菌体克隆，利用PCR制备测序模板。下面的寡核苷酸对被用来扩增大约500个核苷酸片段：
引物1：5′-CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3′(SEQ ID NO：54)
引物2：5′-CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3′(SEQ ID NO：55)
对于各个克隆制备下面的混合物：
  试剂   体积(微升)/试管
  dH2O   26.25
  50％甘油   10
  10X PCR缓冲液(w/o MgCl2)   5
  25mM MgCl2   4
  10mM dNTP混合物   1
  100μM引物1   0.25
  100μM引物2   0.25
  Taq聚合酶   0.25
  TE中的噬菌体(第4章节)   3
  终反应体积   50
对于PCR，使用热循环控制装置(GeneAmp PCR System 9700，Applied Biosystems)进行下面的程序：94℃，5分钟；(94℃30秒，55℃30秒，72℃45秒)x30个循环；72℃7分钟；冷却至4℃。使用QIAquick Multiwell PCR纯化试剂盒(Qiagen)，根据厂商说明，将各反应的PCR产物纯化。然后通过在1％琼脂糖凝胶上对含有大约1微升染料的(10*BBXS琼脂糖凝胶加载颜料)的各种PCR反应混合物大约10微升进行电泳来分析纯化的PCR产物。然后使用ABI 377测序仪(Perkin Elmer)根据厂商推荐的方法对保留的产物测序。
6.序列排列和共有序列测定
A.序列排列和分析
可变核苷酸序列翻译的肽序列(5B章节)与ELISA数据有相关性。在Ang-2包被孔中表现高OD450并且在链霉抗生物素蛋白包被孔中表现低OD450的克隆具有较高优先排列。出现多次的序列也具有较高优先排列。根据这些标准选择候选序列用于进一步肽或肽抗体分析。
B.共有序列测定
如下从TN8-IX文库产生三类不同的共有基序：
KRPCEEXWGGCXYX(SEQ ID NO：56)
KRPCEEXFGGCXYX(SEQ ID NO：57)
XXXCXDXYWYCXXX(SEQ ID NO：61)
XXXCXDXYTYCXXX(SEQ ID NO：62)
XXXCXDXFWYCXXX(SEQ ID NO：63)
XXXCXDXFTYCXXX(SEQ ID NO：64)
XXXCXWDPWTCEXM(SEQ ID NO：58)
从TN12-I文库产生一个共有基序：
W S X C A W F X G X X X X X C R R X(SEQ ID NO：59)
对于所有的共有基序序列，通过测定各个位置上最经常出现的氨基酸而获得各个共有序列的下划线″核心氨基酸序列″。″X″指任何天然存在的氨基酸。两个与核心序列邻接的半胱氨酸是TN8-IX和TN12-I文库中固定的氨基酸。
下面的表3中给出经鉴定与Ang-2结合的肽。
表3  Ang-2结合肽
  肽   SeqIdNo.   肽序列
  TN8-8   1   KRPCEEMWGGCNYD
  TN8-14   2   HQICKWDPWTCKHW
  TN8-Con1   3   KRPCEEIFGGCTYQ
  TN8-Con4   4   QEECEWDPWTCEHM
  TN12-9   5   FDYCEGVEDPFTFGCDNH
  L1   6   KFNPLDELEETLYEQFTFQQ
  C17   7   QYGCDGFLYGCMIN
实施例4
编码肽抗体的DNA的构建
使用选择为对Ang-2：Tie-2结合(参见表3)有潜在抑制性的修饰的肽来构建融合蛋白，其中各个肽单体或者各个肽的串联二聚体(单体单元之间有连接体)读框内与编码连接体的DNA融合，后面接人IgG1的Fc区。通过寡核苷酸(“寡聚物”)对淬火产生编码肽和连接体的多核苷酸双螺旋来构建各个修饰的肽，所述连接体，根据所述肽，由或者五个甘氨酸残基，或者八个甘氨酸残基或一个赖氨酸残基组成；这些构建体被制备成NdeI至XhoI片段。这些双螺旋多核苷酸分子连接包含人Fc基因在载体(pAMG21-Fc N-末端，下文进一步描述)，其预先用NdeI和XhoI消化。利用标准方法通过电穿孔将得到的连接混合物转化到大肠杆菌菌株2596细胞(GM221，下文进一步描述)中。对克隆筛选产生重组蛋白质产物并且具有正确的核苷酸序列的融合基因的能力。对于每一种修饰的肽选择单一的这样的克隆(即，Fc-肽融合产物)。
pAMG21-Fc N-末端载体pAMG21的构建
pAMG21
表达质粒pAMG21(ATCC No.98113)得自表达载体pCFM1656(ATCCNo.69576)和美国专利No.4,710,473中描述的表达载体系统，根据公开的国际专利申请WO 00/24782中描述的方法(参见实施例2部分，第100-103页，以及附图17A和17B)。
Fc N-末端载体
使用大肠杆菌菌株3788，pAMG21 Tpo_Gly5_Fc单体，作为模板，构建Fc N-末端载体。WO 00/24782中可以找到该菌株克隆的信息(参见实施例2和附图10)。设计5′PCR引物(下文进一步描述)去除pAMGTpo Gly5中的Tpo肽序列并且用包含ApaLI和XhoI位点的聚连接体置换它。使用菌株3788作为模板，使用Expand Long聚合酶进行PCR，使用SEQ ID NO：8寡核苷酸，下面的，作为5′引物和通用3′引物，SEQID NO：9，下面的。得到的PCR产物被凝胶纯化并且用限制酶Nde I和BsrGI消化。利用Qiagen(Chatsworth，Calif.)凝胶纯化旋转柱凝胶纯化质粒和编码带有其连接体的感兴趣的肽的多核苷酸。然后利用标准连接技术连接质粒和插入物，并且将得到的连接混合物转化到大肠杆菌细胞(菌株2596)中。选取单克隆并且进行DNA测序。鉴定正确的克隆并且这个被用作这里描述的修饰的肽的载体来源。
5′引物：
ACAAACAAACATATGGGTGCACAGAAAGCGGCCGCAAAAAAACTCGAGGGTGGA
GGCGGTGGGGACA(SEQ ID NO：8)
3′引物：
GGTCATTACTGGACCGGATC(SEQ ID NO：9)
除了将这些修饰的肽制成与Fc的N-末端融合体(N-末端肽抗体)之外，也将它们中的一些制成C-末端融合产物(C-末端肽抗体)。下面描述用于制备C-末端融合体的载体。
Fc C-末端载体的构建
使用大肠杆菌菌株3728，pAMG21Fc_Gly5_Tpo单体，作为模板，构建Fc C-末端载体。WO 00/24782中可以找到该菌株克隆的信息(参见其实施例2和附图7)。设计3′PCR引物(SEQ ID NO：10)去除Tpo肽序列并且用包含ApaLI和XhoI位点的聚连接体置换它。使用菌株3728作为模板，使用Expand Long聚合酶进行PCR，使用通用5′引物(SEQ ID NO：11)和上述3′引物。得到的PCR产物被凝胶纯化并且用限制酶BsrGI和BamHI消化。利用Qiagen凝胶纯化旋转柱凝胶纯化质粒和编码带有其连接体的感兴趣的各个肽的多核苷酸。然后利用标准连接技术连接质粒和插入物，并且将得到的连接混合物转化到大肠杆菌细胞(菌株2596)中。选取单克隆并且进行DNA测序。鉴定正确的克隆并且这个被用作这里描述的修饰的肽的载体来源。
5′引物：
CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG(SEQ ID NO：10)
3′引物：
TTTGTTGGATCCATTACTCGAGTTTTTTTGCGGCCGCTTTCTGTG
CACCACCACCTCCACCTTTAC(SEQ ID NO：11)
GM221(#2596).宿主菌株#2596，用于表达Fc-肽融合蛋白，是经修饰包含1ux启动子，和早期ebg区中温度灵敏λ阻抑物cI857s7和晚期ebg区中lacIQ阻抑物两者的大肠杆菌K-12菌株。这两个阻抑物基因的存在允许这种宿主使用带有各种表达系统。这种菌株的ATCC登记号是202174。
实施例5
肽抗体的制备
在大肠杆菌中表达.37℃下大肠杆菌GM221中各个pAMG21-Fc融合构建体的培养物在Terrific Broth培养基(参见Tartof和Hobbs，″Improved media for growing plasmid and cosmid clones″，BethesdaResearch Labs Focus，第9卷，12页，1987，上文提到的Sambrook等参考文献中引述)中培养。向培养基中加入合成的自身诱导剂，N-(3-氧己酰基)-DL-高丝氨酸内酯，达到每毫升20纳克(ng/ml)的最终浓度之后，实现从l uxPR启动子的基因产物表达的诱导。将培养物在37℃下温育另外的6小时。然后通过显微镜检查对细菌培养物检查包函体的存在并且离心收集。在诱导的培养物中发现可折射包函体，表明Fc-融合体最可能在大肠杆菌中的不溶级分中产生。通过在含有10％β-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液中再次悬浮而直接溶解细胞颗粒状物，然后通过SDS-PAGE加以分析。在大多数情况下，在SDS-PAGE凝胶上发现合适分子量的强考马斯兰染色泳带。
纯化利用高压匀化作用(两个道是14,000PSI)在水(1/10)中将细胞破碎，并且离心收集包函体(4000RPM，J-6B离心机，1小时)。以1/10的比例将包函体溶解于6M胍，50mM Tris，10mM DTT，pH 8.5，1小时。对于与Fc融合的线性肽，用2M脲，50mM Tris，160mM精氨酸，2mM半胱氨酸，pH 8.5将溶解的混合物稀释25倍。4℃下将氧化作用进行2天，让形成二硫键键合的化合物(即，Fc-肽同二聚体)。对于与Fc融合的环肽，加上下面三个折叠条件实施相同的方法：(1)2M脲，50mM Tris，160mM精氨酸，4mM半胱氨酸，1mM胱胺，pH8.5；(2)4M脲，20％甘油，50mM Tris，160mM精氨酸，2mM半胱氨酸，pH 8.5；和(3)4M脲，20％甘油，50mM Tris，160mM精氨酸，4mM半胱氨酸，1mM胱胺，pH 8.5。用1.5M脲，50mM NaCl，50mM Tris，pH 9.0透析再折叠的蛋白质。用乙酸将该混合物的pH降低至pH 5。离心去除沉淀，根据各个融合产物的等电点，将上清液调节至pH为5至6.5。过滤蛋白质并且4℃下加载到SP-Sepharose HP柱子上，柱子用20mM NaAc，50mM NaCl，对各个构建物测定的pH中平衡过。用50mM NaCl至500mM NaCl范围相同的缓冲液，用20-柱体积线性梯度洗脱蛋白质。合并个峰流出液并且过滤。
下面的表4中给出了利用上述方法产生的肽抗体。
表4
  肽抗体   肽抗体序列
  L1(N)   MGAQKFNPLDELEETLYEQFTFQQLEGGGGG-Fc(SEQ  ID NO：12)
  L1(N)WT   MKFNPLDELEETLYEQFTFQQLEGGGGG-Fc(SEQ ID  NO：13)
  L1(N)1K WT   MKFNPLDELEETLYEQFTFQQGSGSATGGSGSTASSGS  GSATHLEGGGGG-Fc(SEQ ID NO：14)
  2xL1(N)   MGAQKFNPLDELEETLYEQFTFQQGGGGGGGGKFNPL  DELEETLYEQFTFQQLEGGGGG-Fc(SEQ ID NO：15)
  2xL1(N)WT   MKFNPLDELEETLYEQFTFQQGGGGGGGKFNPLDELEE  TLYEQFTFQQLEGGGGG-Fc(SEQ ID NO：16)
  Con4(N)   MGAQQEECEWDPWTCEHMLEGGGGG-Fc(SEQ ID  NO：17)
  Con4(N)1K-WT   MQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATH  LEGGGGG-Fc(SEQ ID NO：18)
   2xCon4(N)1K   MGAQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGS  ATHQEECEWDPWTCEHMLEGGGGG-Fc(SEQ ID  NO：19)
  L1(C)   M-Fc-GGGGGAQKFNPLDELEETLYEQFTFQQLE(SEQ  IDNO：20)
  L1(C)1K   M-Fc-  GGGGGAQGSGSATGGSGSTASSGSGSATHKFNPLDELE  ETLYEQFTFQQLE(SEQ ID NO：21)
  2xL1(C)   M-Fc-  GGGGGAQKFNPLDELEETLYEQFTFQQGGGGGGGGKF  NPLDELEETLYEQFTFQQLE(SEQ ID NO：22)
  Con4(C)   M-Fc-GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMLE(SEQ ID  NO：23)
  Con4(C)1K   M-Fc-  GGGGGAQGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDP  WTCEHMLE(SEQ ID NO：24)
   2xCon4(C)1K   M-Fc-  GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASS  GSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE(SEQ ID NO：25)
  Con4-L1(N)   MGAQEECEWDPWTCEHMGGGGGGGGKFNPLDELEET  LYEQFTFQQGSGSATGGSGSTASSGSGSATHLEGGGGG-  Fc(SEQ ID NO：26)
   Con4-L1(C)   M-Fc-  GGGGGAQGSGSATGGSGSTASSGSGSATHKFNPLDELE  ETLYEQFTFQQGGGGGQEECEWDPWTCEHMLE(SEQ  IDNO：27)
  TN-12-9(N)   MGAQ-FDYCEGVEDPFTFGCDNHLE-GGGGG-Fc(SEQ  ID NO：28)
   C17(N)   MGAQ-QYGCDGFLYGCMINLE-GGGGG-Fc(SEQ ID  NO：29)
   TN8-8(N)   MGAQ-KRPCEEMWGGCNYDLEGGGGG-Fc(SEQ ID  NO：30)
   TN8-14(N)   MGAQ-HQICKWDPWTCKHWLEGGGGG-Fc(SEQ ID  NO：31)
   Con1(N)   MGAQ-KRPCEEIFGGCTYQLEGGGGG-Fc(SEQ ID  NO：32)
在表4中，″Fc″指人Fc IgG1序列。第二栏给出肽抗体的氨基酸序列。其Fc部分标记为″Fc″，并且是下面SEQ ID NO：60中给出。要明白使用标记的情况下，例如，″Con4″或″Con-4″，这指Con-4肽，其中其上使用的后缀″C″，″(C)″，或″-C″；或″N″，″(N)″，或″-N″表示该分子是这里描述的肽抗体。肽抗体名称中的后缀″N″，″(N)″，或″-N″表示Ang-2-结合肽(或结合肽复数)是Fc结构域的N-末端，后缀″C″，″(C)″或″-C″表示Ang-2-结合肽(或结合肽复数)是Fc结构域的C-末端。此外，2xCon4(C)1K，如SEQ ID NO：25中定义的，也可以指其中没有″1K″后缀。
各个肽抗体的Fc部分的氨基酸序列如下(从氨基末端至羧基末端)：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV
SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL
HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS
RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALNHYTQKSLS
LSPGK(SEQ ID NO：60)
下面给出表4中分别相应于肽抗体SEQ ID NOs：12-32的肽抗体的编码DNA序列(SEQ ID Nos：33-53)：
SEQ ID NO：33
ATGGGTGCACAGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCT
GTACGAACAGTTCACTTTCCAGCAGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGG
ACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGG
GACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGAT
CTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGA
AGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGC
ATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTAC
CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGC
AAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATC
GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGT
GTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAG
CCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGA
GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC
CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGT
GGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGAT
GCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTC
TCCGGGTAAATAATGGATCC
SEQ ID NO：34
ATGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACA
GTTCACTTTCCAGCAGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCA
CACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGT
TTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC
CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGA
GGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAA
GACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCA
GCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACA
AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCA
TCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG
CCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGC
CTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC
AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA
CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAG
CAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGC
TCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAA
ATAA
SEQ ID NO：35
ATGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACA
GTTCACTTTCCAGCAGGGATCCGGTTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCC
ACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGCGACTCATCTCGAGGGTGGAGGC
GGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTC
CTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACC
CTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG
AGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGT
GGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACA
GCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGC
TGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA
GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA
ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAA
CCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACAT
CGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGA
CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAA
GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT
GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCC
TCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA
SEQ ID NO：36
ATGGGTGCACAGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCT
GTACGAACAGTTCACTTTCCAGCAGGGTGGTGGTGGTGGTGGCGGTGG
TAAGTTCAACCCACTGGATGAGCTGGAAGAGACTCTGTATGAACAGTT
CACTTTCCAGCAACTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACA
CATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTT
TCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCC
CTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAG
GTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAG
ACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAG
CGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAA
GTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT
CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGC
CCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCC
TGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA
ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC
TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGC
AGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCT
CTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
TAA
SEQ ID NO：37
ATGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACA
GTTCACTTTCCAGCAGGGTGGTGGTGGTGGCGGTGGTAAGTTCAACCC
ACTGGATGAGCTGGAAGAGACTCTGTATGAACAGTTCACTTTCCAGCA
ACTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTT
GCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCC
AAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATG
CGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTG
GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG
AGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCC
TGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCC
AACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAA
AGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGG
ATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCT
TCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG
GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCC
TTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG
GGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCAC
TACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA
SEQ ID NO：38
ATGGGTGCACAGCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGA
ACACATGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTC
CACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTT
CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGT
CACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTT
CAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC
CGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC
ACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA
GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAA
AGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT
CCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA
AAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG
CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC
GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG
CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC
AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA
SEQ ID NO：39
ATGCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGGG
ATCCGGTTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCA
GGCAGTGCGACTCATCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCA
CACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGT
TTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC
CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGA
GGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAA
GACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCA
GCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACA
AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCA
TCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG
CCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGC
CTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC
AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA
CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAG
CAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGC
TCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAA
ATAA
SEQ ID NO：40
ATGGGTGCACAGCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGA
ACACATGGGATCCGGTTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAG
CTCTGGTTCAGGCAGTGCGACTCATCAGGAAGAATGCGAATGGGACCC
ATGGACTTGCGAACACATGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAA
CTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGT
CAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCG
GACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACC
CTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATG
CCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTG
GTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAG
TACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAA
ACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACAC
CCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGAC
CTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGA
GAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGC
TGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACA
AGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATG
AGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG
GTAAATAA
SEQ ID NO：41
ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG
GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC
ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC
CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA
GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA
CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA
ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC
CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC
ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCA
GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC
CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA
CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT
CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC
CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC
CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGAAATTCAACCC
GCTGGACGAGCTGGAAGAGACTCTGTACGAACAGTTTACTTTTCAACA
GCTCGAGTAA
SEQ ID NO：42
ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG
GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC
ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC
CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA
GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA
CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA
ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC
CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC
ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCA
GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC
CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA
CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT
CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC
CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC
CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGGGATCCGGTTC
TGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGC
GACTCATAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGA
ACAGTTCACTTTCCAGCAACTCGAGTAA
SEQ ID NO：43
ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG
GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC
ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC
CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA
GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA
CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA
ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC
CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC
ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCA
GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC
CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA
CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT
CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC
CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC
CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGAAATTCAACCC
GCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACAGTTCACTTTCCAGCA
GGGTGGTGGTGGTGGTGGCGGTGGTAAGTTCAACCCACTGGATGAGCT
GGAAGAGACTCTGTATGAACAGTTCACTTTCCAGCAACTCGAGTAA
SEQ ID NO：44
ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG
GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC
ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC
CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA
GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA
CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA
ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC
CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC
ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCA
GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC
CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA
CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT
CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC
CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC
CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGCAGGAAGAAT
GCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGCTCGAGTAA
SEQ ID NO：45
ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG
GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC
ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC
CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA
GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA
CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA
ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC
CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC
ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCA
GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC
CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA
CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT
CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC
CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC
CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGGGATCCGGTTC
TGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGC
GACTCATCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACA
TGCTCGAGTAA
SEQ ID NO：46
ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG
GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC
ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC
CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA
GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA
CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA
ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC
CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC
ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCA
GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC
CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA
CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT
CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC
CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC
CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGCAGGAAGAAT
GCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGGGATCCGGTTCTGCTA
CTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGCGCGACTC
ATCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGCTC
GAGTAA
SEQ ID NO：47
ATGGGTGCACAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACA
CATGGGTGGTGGTGGTGGTGGCGGTGGTAAATTCAACCCGCTGGACGA
ACTGGAAGAAACTCTGTACGAACAGTTCACTTTCCAGCAGGGATCCGG
TTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGT
GCGACTCATCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGgGACAAAACTCACACATGT
CCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCT
TCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGG
TCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGT
TCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAG
CCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC
ACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA
GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAA
AGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT
CCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA
AAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG
CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC
GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG
CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC
AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA
SEQ ID NO：48
ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG
GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC
ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC
CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA
GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA
CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA
ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC
CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC
ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCA
GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC
CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA
CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT
CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC
CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC
CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGGGATCCGGTTC
TGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGC
GACTCATAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGA
ACAGTTCACTTTCCAGCAGGGTGGTGGCGGTGGTCAGGAAGAATGCGA
ATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGCTCGAGTAA
SEQ ID NO：49
ATGGGTGCACAGTTCGACTACTGCGAAGGTGTTGAAGACCCGTTCACT
TTCGGTTGCGACAACCACCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAAC
TCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTC
AGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGG
ACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCT
GAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC  
AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGT
CAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTA
CAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAAC
CATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCC
TGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT
GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGA
GCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTG
GACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAG
AGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAG
GCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
AAATAA
SEQ ID NO：50
ATGGGTGCACAGCAGTACGGTTGCGACGGTTTTCTGTACGGTTGCATG
ATCAACCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCC
ACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTC
CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC
ACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTC
AACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC
GCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCA
CCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAG
GTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA
GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC
CGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAA
AGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC
AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC
GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG
CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC
AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA
SEQ ID NO：51
ATGGGTGCACAGAAACGCCCATGCGAAGAAATGTGGGGTGGTTGCAA
CTACGACCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTC
CACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTT
CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGT
CACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTT
CAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC
CGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC
ACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA
GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAA
AGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT
CCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA
AAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG
CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC
GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG
CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC
AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA
SEQ ID NO：52
ATGGGTGCACAGCACCAGATCTGCAAATGGGACCCGTGGACCTGCAA
ACACTGGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTC
CACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTT
CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGT
CACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTT
CAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC
CGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC
ACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA
GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAA
AGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT
CCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA
AAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG
CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC
GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG
CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC
AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA
SEQ ID NO：53
ATGGGTGCACAGAAACGTCCATGCGAAGAAATCTTCGGTGGTTGCACC
TACCAGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCC
ACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTC
CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC
ACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTC
AACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC
GCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCA
CCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAG
GTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA
GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC
CGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAA
AGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC
AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC
GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG
CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC
AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA
实施例6
肽抗体分析
应用中和作用ELISA分析十四种肽抗体，应用亲和力ELISA分析三种肽抗体。表5给出结果。
表5
Figure G2009101594519D01081
Figure G2009101594519D01091
下面是阴性对照肽抗体4883的氨基酸序列(Fc部分是下划线，连接体是″GGGGG″，肽部分是粗体)：
MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK-GGGGG-CTAGYHWNSDCECCRRN (SEQ ID NO：243)
要明白这里使用术语″没有抑制″不是指化合物没有抑制能力。实际上，这里使用的″没有抑制″指当应用中和作用ELISA分析在这里描述的条件下测试时表现出大于1000nM的IC50值的那些化合物，这是筛选的这些化合物的额最高浓度。当对于标记的分子没有发现显著抑制能力时当作表现出″没有抑制作用″，明白在不同的测试条件下，或者在不同的测试中，那些化合物事实上可以证实抑制能力。在优选的实施方案中，明白本发明涉及应用这里描述的分析具有抑制能力的肽抗体。
应用亲和力BIAcore分析(如实施例2所述)分析两种肽抗体。下面的表6给出结果。
表6
肽抗体(Pb)对于hAng-2和mAng-2的亲和力
Figure G2009101594519D01101
实施例7
全身施用Ang-2肽抗体的治疗功效研究
肿瘤攻击之后72小时以每天一次的治疗方案对携带A431肿瘤的小鼠皮下施用Ang-2肽抗体，TN8-Con4-C。使用的肽抗体的剂量是1000,200，40和8微克/小鼠/天。对所有的动物公共给药20剂。每周三次记录肿瘤体积和体重。研究结束时，杀死动物，收集它们的血清并且通过ELISA测定肽抗体水平。从所有的组收集肿瘤和正常组织。
图1给出结果。可以看出，Ang-2肽抗体治疗组和赋形剂对照组之间观察到肿瘤生长的显著差异。与赋形剂对照组相比，所有四剂Ang-2肽抗体抑制肿瘤生长(p＜0.0001对赋形剂对照组，利用反复测定ANOVA)。相反，对照组中肿瘤继续以快得多的速度生长。用这种融合体治疗对用上述剂量治疗的动物的最后体重，器官重量或血液学参数没有显著影响。
实施例8
1.Ang-2第二肽文库的构建
A.电感受态大肠杆菌细胞
Epicurian
Figure G2009101594519D01102
XL1-Blue MRF′电穿孔感受态细胞(Stratagene#200158)从Stratagene(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，Calif.)购得。
B.pCES1载体的修饰
应用Extend Long Template PCR Systems(Roche DiagnosticsCorp.，Indianapolis，Ind.)，使用1微克的pCES1载体(TargetQuestInc.)作为模板进行PCR。PCR混合物体积是100微升，它含有1xPCR缓冲液，200nM的两种引物的每一种：5′-CAAACGAATGGATCCTCATTAAAGCCAGA-3′(SEQ ID NO：244)和
5′-GGTGGTGCGGCCGCACTCGAGACTGTTGAAAGTTGTTTAGCA-3′(SEQ IDNO：245)，200nM dNTP，和3单位(U)的Tag DNA聚合酶。TRIO-Thermoblock(Biometra)PCR系统如下运行：94℃5分钟；94℃30秒，50℃30秒，72℃45秒30次循环；和72℃10分钟；冷却至4℃。
然后将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，并且用QIAGEN旋转柱(QI AGEN Inc.，Valencia，Calif.)根据厂商提供的方案纯化。在如上所述相同的PCR条件下，使用5微升的PCR产物和200nM的两种引物的每一种5′-CAAACGAATGGATCCTCATTAAAGCCAGA-3′(SEQ ID NO：246)和5′-AACACAAAAGTGCACAGGGTGGAGGTGGTGGTGCGGCCGCACT-3′(SEQ IDNO：247)进行第二PCR反应。
然后在37℃下在含有1xNEB2缓冲液，60U的ApaLI(New EnglandBiolabs，Beverly，Mass.)，60U的BamHI(New England Biolabs)的100微升反应液中分别消化PCR产物和原始pCES 1载体1小时。然后利用QIAGEN Spin Column纯化消化过的DNA，并且在室温下在含有1x连接缓冲液和40U的T4DNA连接酶(New England Biolabs)的40微升反应中连接过夜。
将载体转染到大肠杆菌中并且在37℃下温育过夜。选择分离的单一菌落并且用QIAGEN Spin Column将质粒纯化。通过DNA测序证实正确的插入片段。
C.载体DNA的制备
使用Gene Pulser II(BIO-RAD，Hercules，Calif.)，设置2500V，25μF，和200ohms，将1微克修饰的pCES1载体DNA(从上述1B获得)转化到40微升电感受态XL1-blue大肠杆菌(从上述1A获得)中。然后将转化的细菌样品立刻转移到含有960微升SOC(2％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，10mM NaCl，2.5mM KCl，20mM葡萄糖，10mM MgSO4，10mM MgCl2)的试管中，并且摇动下在37℃下让培养物生长1小时。
然后将细胞分布在2xYTAGT(2xYT，含有100微克/毫升氨苄青霉素，12.5微克/毫升四环素和2％葡萄糖)琼脂板上并且在37℃下温育过夜。测序证实单一菌落，并且用来在37℃下摇动下接种2升2xYTAGT培养基过夜。用QIAGEN Plasmid Maxi试剂盒根据生产商提供的说明纯化质粒载体DNA。
D.载体DNA的消化
在37℃下在含有1xNEB缓冲液，2,300U的ApaLI，和300U的XhoI的5000微升反应中将总共大约2000微克的载体DNA(从上面1C获得)消化过夜。限制性消化反应在37℃下温育过夜并且在预先制备的0.8％琼脂糖凝胶(Embi Tec，San Diego，Calif.)上分析。然后从凝胶上切除线性载体DNA，并且用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN Inc.)根据厂商说明提取。
E.文库寡核苷酸的制备
在从上述结果产生的序列的基础上设计六个文库寡核苷酸(1个固定，5个掺入)。一个固定的文库寡核苷酸是：
5′-CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKSARTGGGATCCGTGGASCNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKCATT CTCTCGAGATCA-3′(文库号20)(SEQ ID NO：248)；
两个70％掺入的文库寡核苷酸是：
5′-CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKaaKcgKccKNNKgaKgaKatKttKggKggKNNKacKtaKcaKNNKNNKNNKCATTCTCTCGAGATCA-3′(文库号27)；(SEQ ID NO：249)；
5′-CACAGTGCACAGGGTNNKaaKttKaaKccKctKgaKgaKctKgaKgaKacKctKtaKgaKcaKttKacKttKcaKcaKNNKCATTCTCTCGAGATCA-3′(文库号99)；(SEQ ID NO：250)；
小写字母表示指定碱基的70％和另三个核苷酸各自的10％的混合物。另三个91％掺入的文库寡核苷酸如下：
5′-CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKcaKgaKgaKTGCgaKtgKgaKccKtgKacKTGCgaKcaKatKNNKNNKNNKCATTCTCTCGAGATC A-3′(文库号94)；(SEQ ID NO：251)；
5′-CACAGTGCACAGGGTNNKttKgaKtaKNNKgaKggKgtKgaKgaKccKttKacKttKggKNNKgaKaaKcaKNNKCATTCTCTCGAGATCA-3′(文库号25)；(SEQ ID NO：252)；和
5′-CACAGTGCACAGGGTNNKaaKttKaaKccKctKgaKgaKctKgaKgaKacKctKtaKgaKcaKttKacKttKcaKcaKNNKCATTCTCTCGAGATCA-3′(文库号26)；(SEQ ID NO：253)；
对于上述寡聚物，本领域技术人员明白″N″表示在寡核苷酸合成中同等代表四种核苷酸中的每一个(A，T，C，和G)，″K″表示在寡核苷酸合成中同等代表核苷酸G和T。小写字母代表指定碱基的91％和另三个核苷酸各自的3％的混合物。这些寡核苷酸各自被用作PCR中的模板。
对于PCR反应使用Expand High Fidelity PCR System试剂盒(Roche Diagnostics Corp.)。在96个孔中在含有1nM的文库寡核苷酸，1xPCR缓冲液，300nM的各种引物5′-CACAGTGCACAGGGT-3′(SEQID NO：254)；和5′-TGATCTCGAGAGAATG-3′，(SEQ IDNO：255)，200μMdNTP，1.5mM MgCl2，和350U的Expand聚合酶的50微升PCR反应中扩增各种文库寡聚物。
使用热循环控制装置(GeneAmp PCR System 9700，AppliedBiosystems)进行下面的程序：94℃，5分钟；(94℃30秒，52.5℃60秒，72℃30秒)x25次循环；72℃10分钟；冷却至4℃。使用QIAquickPCR纯化试剂盒(QIAGEN Inc.Ca t#28104)，根据厂商说明，去除三个核苷酸。
F.文库寡核苷酸的消化
对于每个文库，在37℃下在含有1xNEB缓冲液，2,750U的ApaLI，和750U的XhoI的1200微升反应中将PCR产物(1E章节)消化过夜。在预先制备的3％琼脂糖凝胶上(Embi Tec)分离消化的DNA。从凝胶上切下各个反应中令人感兴趣的DNA泳带并且用COSTAR Spin-X离心管过滤器，0.22微米乙酸纤维素(Corning Inc.，Cat#8160)提取。
G.载体与文库寡核苷酸的连接
450微升连接反应含有1∶5摩尔比的线性载体(1D章节)和各种消化的文库PCR产物(1F章节)，1xNEB连接缓冲液，和20,000U的T4DNA连接酶，在16℃下反应过夜。经连接的产物在65℃下温育20分钟，以灭活T4DNA连接酶，并且进一步与100U的NotI在37℃下温育2小时，将载体自身连接最小化。然后通过标准苯酚/氯仿萃取法(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Maniatis等，第三版，冷泉干实验出版社，2000)纯化经连接的产物全部重新悬浮于120微升的H2O。
H.电穿孔转化
对于每个文库，进行12个电穿孔反应。对于每一次转化，在0.2-cm小杯(BIO-RAD)中混合10微升的连接载体DNA(1G章节)和300微升的XL1-BLUE MRF′细胞(1A章节)。得到的混合物用设置在2500V，25μF，和200ohms的Gene Pulser II脉冲处理。然后将来 自12个电穿孔反应的转化细胞合并并且转移到含有26毫升SOC的烧瓶中，在37℃下温育1小时。将细胞加给450ml 2xYTAG，并且搅拌下在37℃下摇动培养5小时。在4℃下以4000rpm将细胞离心15分钟。然后将细胞颗粒状物重新悬浮于12毫升的15％甘油/2xYT并且在-80℃下贮存。这是文库的第一原液。滴度表示5.0x10(文库数目20)，3.3x10(文库数目94)，4.7x10(文库数目25)，5.0x10(文库数目26)，3.0x10(文库数目27)，和4.2x10(文库数目99)独立的转化体的文库大小。
2.文库的扩增
A.制备文库的第二原液
从第一文库细胞原液(从上文1H章节获得)，使用覆盖10X过量各个文库大小的足量的细胞接种2xYTAGT(2YT，含有100微克/毫升氨苄青霉素，12.5微克/毫升四环素和2％葡萄糖)培养基使得起始OD600是0.1。让培养物在37℃下摇动下生长几小时直到OD600＝0.5。从各个文库取出十分之一等分并且在分开的烧瓶中在37℃下又培养2小时。然后使用Beckman JA-14转床在4℃下将这些传代培养物以4000rpm离心，并且将细菌颗粒状物重新悬浮于7.0ml(对于各个文库)分15％甘油/2xYT，在-80℃下贮存。
B.噬菌体诱导
向保留的OD600＝0.5(从上文2A章节得到)的细菌培养物加入M13KO7辅助噬菌体等份(Amersham Pharmacia Biotech)达到3x10pfu/毫升最终浓度。让辅助噬菌体在37℃下在不摇动下感染细菌30分钟，在慢速摇动下感染细菌30分钟。在4℃下将感染的细胞以5000rpm离心15分钟。将细胞颗粒状物重新悬浮于相同体积的(见上文2A章节)2xYTAK培养基(2YT，含有100微克/毫升氨苄青霉素和40微克/毫升卡那霉素)。让噬菌粒产生在摇动下在30℃下反应过夜。
C.噬菌体收集
在4℃下将上文2B章节获得的细菌培养物以5000r pm离心15分钟。然后将上清液转移到新瓶中，加入0.2体积的20％PEG/2.5M NaCl并且在冰上温育1小时沉淀噬菌粒。在4℃下将沉淀出的噬菌粒以10,000rpm离心30分钟并且小心地悬浮于100ml的冷PBS中。通过在4℃下以4000rpm离心10分钟去除残留的细胞进一步纯化噬菌粒溶液，并且通过加入0.2体积的20％PEG/2.5M NaCl沉淀出噬菌粒。4℃下以10,000rpm将噬菌粒离心30分钟，并且将噬菌粒颗粒状物重新悬浮于18ml的冷PBS。向噬菌粒溶液加入6毫升60％甘油溶液，在-80℃下贮存。通过标准方法测定噬菌粒滴度(Molecular Cloning，Maniatis等，第三版)。
3.Ang-2结合噬菌体的筛选
A.Ang-2在磁珠上的固定化
以对于生产商提供的100微升珠原料2000ng Ang-2蛋白质的浓度在Dynabead M-280 Streptavidin(DYNAL，Lake Success，N.Y.)上固定生物素化Ang-2(来自上文3A章节)。使用磁子将小珠拉到试管的一边并且吸移出液体之后，用磷酸缓冲盐水(PBS)将小珠洗涤两次。以上述浓度向洗过的小珠加入生物素化Ang-2蛋白质，并且在室温下旋转温育1小时。然后通过加入BSA至2％终浓度并且4℃下旋转温育过夜将Ang-2包被小珠封闭。然后用PBST(含有0.05％Tween-20的PBS)将得到的Ang-2包被小珠清洗两次，然后进行筛选程序。
B.使用Ang-2包被珠的筛选
用1毫升含有2％BSA的PBS将大约1000-倍文库等价噬菌粒(来自上面的2C章节)封闭1小时。通过将其加给空白珠(和3A章节所述相同的珠，但是没有Ang-2蛋白质包被)让被封闭的噬菌粒样品进行三个阴性筛选步骤，并且转动下将这种混合物在室温下温育15分钟。使用磁体将含有噬菌粒的上清液排出并且转移到含有空白珠(和3A章节所述相同的珠，但是其上没有Ang-2蛋白质包被)的第二试管，将这种混合物在室温下旋转下温育15分钟。
重复该程序。使用磁体将含有噬菌粒的上清液排出并且转移到含有Ang-2蛋白质包被珠(来自3A章节)的新试管中，将这种混合物在室温下旋转下温育1小时。弃除上清液之后，噬菌粒-结合-珠用2％奶-PBS洗涤10次；用2％BSA-PBS洗涤10次；用PBST洗涤10次和用PBS洗涤两次。然后在旋转装置上让噬菌粒在1毫升的100mM三乙胺溶液(Sigma，St.Louis，Mo.)中洗脱10分钟。通过加入0.5ml的1MTris-HCl(pH 7.5)将含有噬菌粒的溶液的pH中和。使用得到的噬菌粒在37℃下不摇动感染10ml新鲜培养的XL1-Blue MRF′细菌(OD600大约0.5)30分钟并且慢速摇动下感染30分钟。然后将所有的感染的XL1-BLUE MRF′细胞在15x5cm 2xYTAG板上平板培养，在30℃下培养过夜。
C.噬菌体的诱导和收获
将10ml等份的2x YTAGT培养基加给培养板(来自3B章节)以悬浮XL1-BLUE MRF′细胞。所有的XL1-BLUE MRF′细胞收集在试管中，并且将250微升等份的这些细胞加给25ml的2x YTAGT并且在37℃下生长至OD600＝0.5。M13KO7辅助噬菌体加至3x10cfu/ml的终浓度并且在37℃下不摇动温育30分钟并且慢速摇动下温育30分钟。在4℃下将细胞5000rpm离心10分钟并且用25ml的2xYTAK再次悬浮。让这些细胞在30℃下摇动下生长过夜。收获诱导的噬菌粒并且和2C章节一样加以纯化。
D.第二轮筛选
除了下面的操作外，根据上文3B至3C章节描述的要点进行第二轮筛选。从3C章节得到的大约100-倍文库等价噬菌粒用作输入噬菌粒。包被到Dynabead M-280 Streptavidin上的生物素化Ang-2蛋白质(3A章节)的量降至20ng。然后噬菌体-结合-珠用2％奶-PBS洗涤10次；用2％BSA-PBS洗涤10次；用PBST洗涤10次，其中最后洗涤包括在PBST中在室温下温育60分钟。小珠用PBS洗涤两次。洗脱条件和第一轮相同(3B章节)。
E.第三轮筛选
除了下面的操作外，根据上文3B至3C章节描述的要点进行第三轮筛选。从3D章节得到的大约10-倍文库等价噬菌粒用作输入噬菌粒。使用大约2ng的生物素化Ang-2蛋白质(3A章节)包被DynabeadM-280 Streptavidin。噬菌体-结合-珠用2％奶-PBS洗涤10次；用2％BSA-PBS洗涤10次；用PBST洗涤10次，其中最后洗涤包括在PBST中在室温下温育60分钟。小珠用PBS洗涤两次。洗脱条件和第一轮相同(3B章节)。
F.第四轮筛选
除了下面的操作外，根据上文3B至3C章节描述的要点进行第四轮筛选。从3E章节得到的文库等价噬菌粒用作输入噬菌粒。对于文库25，26，和27，包被到Dynabead M-280Streptavidin上的生物素化Ang-2蛋白质(3A章节)的量降至0.4ng。对于文库20和94，包被量和第三轮一样保持在2ng。文库99没有进行第四轮筛选步骤。洗脱条件和第 一轮相同(3B章节)。
4.克隆分析
A.主板的制备
从第二轮筛选取单一菌落并且接种每孔含有120微升的2xYTAGT的96孔板。96孔板在摇动下在30℃下温育过夜。每孔加入40微升的60％甘油，在-80℃下贮存。
B.噬菌粒ELISA
用来自主板的大约2微升等份的细胞(来自上文4A章节)接种新鲜
Figure G2009101594519D01181
96孔板(Corning incorporated，Corning，N.Y.，cat.#9794)，它每孔含有100微升的2xYTAGT，这个新的细胞培养板在37℃下培养直到大约OD600＝0.5。
向每个孔加入40微升的含有M13KO7辅助噬菌体(1.5x1013cfu/ml)的2xYTAGT，96孔板在37℃下不摇动温育30分钟并且在摇动下又温育30分钟。培养板在4℃下以2000rpm(Beckman CS-6R桌面离心机)离心10分钟。从孔中去除上清液，并且将每种细胞颗粒状沉淀重新悬浮于150微升的2xYTAK/孔。培养板在30℃下温育过夜用于噬菌粒的表达。
在4℃下以1xPBS中1微克/毫升用人Ang-2蛋白质包被96孔Maxisorp板(NUNC)过夜。作为对照，2％BSA(Sigma)包被分开的Maxisorp板。第二天，在4℃下以2000rpm将过夜细胞培养物离心10分钟。将来自各个孔的10微升上清液转移给含有BSA/PBS溶液以1∶10稀释上清液的新的96孔板。得到的混合物在室温下摇动下温育1来封闭噬菌粒。同时，每孔用400微升的2％BSA/PBS溶液将Ang-2蛋白质包被的培养板在室温下封闭1小时。弃除BSA溶液，各个孔用PBS溶液清洗三次。最后洗涤步骤之后，向Ang-2蛋白质包被的培养板和对照板的每个孔加入100微升的封闭的噬菌粒溶液，并且在室温下摇动下温育1小时。弃除液体，用PBST溶液将各个孔清洗三次。向Ang-2蛋白质包被的培养板和对照板的每个孔加入100微升的15,000稀释的HRP-偶合抗-M13mAb(Amersham Pharmacia Biotech)，这些板在室温下摇动下温育1小时。再次弃除液体，各个孔用PBST溶液清洗三次。向孔中加入100微升的LumiGLO化学发光底物(Kirkegaard&PerryLaboratories，Gaithersburg，Md.)，并且用Luminoskan AscentDLRearly machine(Labsystems，Franklin，MA)对各个孔读数。
C.噬菌体克隆的测序
使用来自主板(4A章节)的1微升细菌作为模板进行PCR反应。各个PCR混合物的体积是50微升，其含有1xPCR缓冲液，300nM的两种引物的每一种：
5′-GTTAGCTCACTCATTAGGCAC-3′(SEQ ID NO：256)和
5′-GTACCGTAACACTGAGTTTCG-3′，(SEQ ID NO：257)；
200μM dNTP，2mM MgCl2，和2.5U taq DNA聚合酶(RocheMolecular Biochemicals)。使用The GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)进行下面的程序℃：94℃5分钟；(94℃45秒，55℃45秒，72℃90秒)40个循环；72℃10分钟；冷却到4℃。使用QIAquick 96PCR纯化试剂盒(QIAGEN Inc.)根据厂商说明纯化PCR产物。使用ABI 3770测序仪(Perkin Elmer)根据厂商说明，用引物5′-TTACACTTTATGCTTCCG-3′(SEQ ID NO：258)对所有的纯化的PCR产物测序。
5.序列排列
从核苷酸序列(从上文4C章节获得)翻译的肽序列与ELISA数据有相关性。认为显示在Ang-2包被孔中读取高OD并且在BSA包被孔中读取低OD值的更重要。出现多次的序列也认为是重要的。从文库20选择24个肽序列，从文库94选择26个肽序列，从文库25选择7个肽序列，从文库25选择18个肽序列，从文库27选择6个肽序列，从文库99选择4个肽序列用于进一步分析和肽抗体制备。另外，从文库20和94推断11个共有序列，从文库26和99推断3个共有序列，从文库25推断2个共有序列，并且用来制备肽抗体。使用这里实施例10描述的中和作用ELISA方法评价表7中的肽抗体。结果在表7中给出。
表7
  Con4衍生的  亲和性-成熟  Pbs   hAng-2：Tie2  IC50(nM)   肽抗体序列(Seq Id No：)
    Con4-44(C)     0.09   M-Fc-GGGGGAQ-  PIRQEECDWDPWTCEHMWEV-LE  (SEQ ID NO：259)
    Con4-40(C)     0.10   M-Fc-GGGGGAQ-  TNIQEECEWDPWTCDHMPGK-LE  (SEQ ID NO：260)
    Con4-4(C)     0.12   M-Fc-GGGGGAQ-  WYEQDACEWDPWTCEHMAEV-LE  (SEQ ID NO：261)
    Con4-31(C)     0.16   M-Fc-GGGGGAQ-  NRLQEVCEWDPWTCEHMENV-LE  (SEQ ID NO：262)
    Con4-C5(C)     0.16   M-Fc-GGGGGAQ-  AATQEECEWDPWTCEHMPRS-LE  (SEQ ID NO：263)
   Con4-42(C)    0.17   M-Fc-GGGGGAQ-  LRHQEGCEWDPWTCEHMFDW-LE
  (SEQ ID NO：264)
  Con4-35(C)   0.18   M-Fc-GGGGGAQ-  VPRQKDCEWDPWTCEHMYVG-LE  (SEQ ID NO：265)
  Con4-43(C)   0.18   M-Fc-GGGGGAQ-  SISHEECEWDPWTCEHMQVG-LE  (SEQ ID NO：266)
  Con4-49(C)   0.19   M-Fc-GGGGGAQ-  WAAQEECEWDPWTCEHMGRM-LE  (SEQ ID NO：267)
  Con4-27(C)   0.22   M-Fc-GGGGGAQ-  TWPQDKCEWDPWTCEHMGST-LE  (SEQ ID NO：268)
  Con4-48(C)   0.26   M-Fc-GGGGGAQ-  GHSQEECGWDPWTCEHMGTS-LE  (SEQ ID NO：269)
  Con4-46(C)   0.26   M-Fc-GGGGGAQ-  QHWQEECEWDPWTCDHMPSK-LE  (SEQ ID NO：270)
  Con4-41(C)   0.26   M-Fc-GGGGGAQ-  NVRQEKCEWDPWTCEHMPVR-LE  (SEQ ID NO：271)
  Con4-36(C)   0.28   M-Fc-GGGGGAQ-  KSGQVECNWDPWTCEHMPRN-LE  (SEQ ID NO：272)
  Con4-34(C)   0.28   M-Fc-GGGGGAQ-  VKTQEHCDWDPWTCEHMREW-LE  (SEQID NO：273)
  Con4-28(C)   0.30   M-Fc-GGGGGAQ-  AWGQEGCDWDPWTCEHMLPM-LE  (SEQ ID NO：274)
  Con4-39(C)   0.30   M-Fc-GGGGGAQ-  PVNQEDCEWDPWTCEHMPPM-LE  (SEQ ID NO：275)
  Con4-25(C)   0.31   M-Fc-GGGGGAQ-  RAPQEDCEWDPWTCAHMDIK-LE  (SEQ ID NO：276)
    Con4-50(C)     0.38   M-Fc-GGGGGAQ-  HGQNMECEWDPWTCEHMFRY-LE  (SEQ ID NO：277)
    Con4-38(C)     0.40   M-Fc-GGGGGAQ-  PRLQEECVWDPWTCEHMPLR-LE  (SEQ ID NO：278)
    Con4-29(C)     0.41   M-Fc-GGGGGAQ-  RTTQEKCEWDPWTCEHMESQ-LE  (SEQ ID NO：279)
    Con4-47(C)     0.44   M-Fc-GGGGGAQ-  QTSQEDCVWDPWTCDHMVSS-LE  (SEQ ID NO：280)
    Con4-20(C)     0.48   M-Fc-GGGGGAQ-  QVIGRPCEWDPWTCEHLEGL-LE  (SEQ ID NO：281)
    Con4-45(C)     0.48   M-Fc-GGGGGAQ-  WAQQEECAWDPWTCDHMVGL-LE  (SEQ ID NO：282)
    Con4-37(C)     0.49   M-Fc-GGGGGAQ-  LPGQEDCEWDPWTCEHMVRS-LE  (SEQ ID NO：283)
    Con4-33(C)     0.52   M-Fc-GGGGGAQ-  PMNQVECDWDPWTCEHMPRS-LE  (SEQ ID NO：284)
    AC2-Con4(C)     0.52   M-Fc-GGGGGAQ-  FGWSHGCEWDPWTCEHMGST-LE  (SEQ ID NO：285)
    Con4-32(C)     0.75   M-Fc-GGGGGAQ-  KSTQDDCDWDPWTCEHMVGP-LE  (SEQ ID NO：286)
    Con4-17(C)     0.96   M-Fc-GGGGGAQ-  GPRISTCQWDPWTCEHMDQL-LE  (SEQ ID NO：287)
    Con4-8(C)     1.20   M-Fc-GGGGGAQ-  STIGDMCEWDPWTCAHMQVD-LE  (SEQ ID NO：288)
    AC4-Con4(C)     1.54   M-Fc-GGGGGAQ-  VLGGQGCEWDPWTCRLLQGW-LE  (SEQ ID NO：289)
    Con4-1(C)     2.47   M-Fc-GGGGGAQ-  VLGGQGCQWDPWTCSHLEDG-LE  (SEQ ID NO：290)
   Con4-C1(C)    2.75   M-Fc-GGGGGAQ-  TTIGSMCEWDPWTCAHMQGG-LE
  (SEQ ID NO：291)
    Con4-21(C)     3.21   M-Fc-GGGGGAQ-  TKGKSVCQWDPWTCSHMQSG-LE  (SEQ ID NO：292)
    Con4-C2(C)     3.75   M-Fc-GGGGGAQ-  TTIGSMCQWDPWTCAHMQGG-LE  (SEQ ID NO：293)
    Con4-18(C)     4.80   M-Fc-GGGGGAQ-  WVNEVVCEWDPWTCNHWDTP-LE  (SEQ ID NO：294)
    Con4-19(C)     5.76   M-Fc-GGGGGAQ-  VVQVGMCQWDPWTCKHMRLQ-LE  (SEQ ID NO：295)
    Con4-16(C)     6.94   M-Fc-GGGGGAQ-  AVGSQTCEWDPWTCAHLVEV-LE  (SEQ ID NO：296)
    Con4-11(C)     9.70   M-Fc-GGGGGAQ-  QGMKMFCEWDPWTCAHIVYR-LE  (SEQ ID NO：297)
    Con4-C4(C)     9.80   M-Fc-GGGGGAQ-  TTIGSMCQWDPWTCEHMQGG-LE  (SEQ ID NO：298)
    Con4-23(C)     9.88   M-Fc-GGGGGAQ-  TSQRVGCEWDPWTCQHLTYT-LE  (SEQ ID NO：299)
    Con4-15(C)     15.00   M-Fc-GGGGGAQ-  QWSWPPCEWDPWTCQTVWPS-LE  (SEQ ID NO：300)
    Con4-9(C)     20.11   M-Fc-GGGGGAQ-  GTSPSFCQWDPWTCSHMVQG-LE  (SEQ ID NO：301)
    Con4-10(C)     86.61   M-Fc-GGGGGAQ-  TQGLHQCEWDPWTCKVLWPS-LE  (SEQ ID NO：302)
    Con4-22(C)     150.00   M-Fc-GGGGGAQ-  VWRSQVCQWDPWTCNLGGDW-LE  (SEQ ID NO：303)
    Con4-3(C)     281.50   M-Fc-GGGGGAQ-  DKILEECQWDPWTCQFFYGA-LE  (SEQIDNO：304)
    Con4-5(C)     没有抑制   M-Fc-GGGGGAQ-  ATFARQCQWDPWTCALGGNW-LE  (SEQ ID NO：305)
    Con4-30(C)     没有抑制   M-Fc-GGGGGAQ-  GPAQEECEWDPWTCEPLPLM-LE  (SEQ ID NO：306)
    Con4-26(C)     没有抑制   M-Fc-GGGGGAQ-  RPEDMCSQWDPWTWHLQGYC-LE  (SEQ ID NO：307)
    Con4-7(C)     没有抑制   M-Fc-GGGGGAQ-  LWQLAVCQWDPQTCDHMGAL-LE  (SEQ ID NO：308)
    Con4-12(C)     没有抑制   M-Fc-GGGGGAQ-  TQLVSLCEWDPWTCRLLDGW-LE  (SEQ ID NO：309)
    Con4-13(C)     没有抑制   M-Fc-GGGGGAQ-  MGGAGRCEWDPWTCQLLQGW-LE  (SEQ ID NO：310)
    Con4-14(C)     没有抑制   M-Fc-GGGGGAQ-  MFLPNECQWDPWTCSNLPEA-LE  (SEQ ID NO：311)
    Con4-2(C)     没有抑制   M-Fc-GGGGGAQ-  FGWSHGCEWDPWTCRLLQGW-LE  (SEQ ID NO：312)
    Con4-6(C)     没有抑制   M-Fc-GGGGGAQ-  WPQTEGCQWDPWTCRLLHGW-LE  (SEQ ID NO：313)
    Con4-24(C)     没有抑制   M-Fc-GGGGGAQ-  PDTRQGCQWDPWTCRLYGMW-LE  (SEQ ID NO：314)
    AC 1-Con4(C)     没有抑制   M-Fc-GGGGGAQ-  TWPQDKCEWDPWTCRLLQGW-LE  (SEQ ID NO：315)
    AC3-Con4(C)     没有抑制   M-Fc-GGGGGAQ-  DKILEECEWDPWTCRLLQGW-LE  (SEQ ID NO：316)
    AC5-Con4(C)     没有抑制   M-Fc-GGGGGAQ-  AATQEECEWDPWTCRLLQGW-LE  (SEQ ID NO：317)
  L1衍生的  亲和性-成熟  Pbs   hAng-2：Tie2  IC50(nM)   肽抗体序列(Seq Id No：)
     L1-7(N)      0.03   MGAQ-  TNFMPMDDLEQRLYEQFILQQG-  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：318)
     AC6-L1(N)      0.03   MGAQ-  TNYKPLDELDATLYEHWILQHS  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：319)
     L1-15(N)      0.04   MGAQ-  QKYQPLDELDKTLYDQFMLQQG  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：320)
    L1-2(N)     0.04   MGAQ-LNFTPLDELEQTLYEQWTLQQS  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：321)
     L1-10(N)      0.05   MGAQ-  QKFQPLDELEQTLYEQFMLQQA  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：322)
     L1-13(N)      0.05   MGAQ-  QEYEPLDELDETLYNQWMFHQR  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：323)
    L1-5(N)     0.05   MGAQ-VKYKPLDELDEILYEQQTFQER  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：324)
     L1-C2(N)      0.05   MGAQ-  TKFQPLDELDQTLYEQWTLQQR  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：325)
     L1-C3(N)      0.06   MGAQ-  TNFQPLDELDQTLYEQWTLQQR  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：326)
     L1-11(N)      0.07   MGAQ-  QNFKPMDELEDTLTKQFLFQHS  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：327)
     L1-17(N)      0.08   MGAQ-  VYKPLDELDEWLYHQFTLHHQ  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：328)
     L1-12(N)      0.08   MGAQ-  YKFTPLDDLEQTLYEQWTLQHV  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：329)
    L1-1(N)     0.08   MGAQ-QNYKPLDELDATLYEHFIFHTYT  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：330)
     L1-4(N)      0.08   MGAQ-  VKFKPLDALEQTLYEHWMFQQA  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：331)
     L1-20(N)      0.09   MGAQ-  EDYMPLDALDAQLYEQFILLHG  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：332)
     L1-22(N)      0.09   MGAQ-  YKFNPMDELEQTLYEEFLFQHA  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：333)
     L1-14(N)      0.11   MGAQ-  SNFMPLDELEQTLYEQFMLQHQ  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：334)
     L1-16(N)      0.11   MGAQ-  QKFQPLDELEETLYKQWTLQQR  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：335)
    L1-18(N)     0.16   MGAQ-QKFMPLDELDEILYEQFMFQQS  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：336)
     L1-3(N)      0.16   MGAQ-  TKFNPLDELEQTLYEQWTLQHQ  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：337)
     L1-21(N)      0.17   MGAQ-  HTFQPLDELEETLYYQWLYDQL  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：338)
     L1-C1(N)      0.56   MGAQ-  QKFKPLDELEQTLYEQWTLQQR  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：339)
     L1-19(N)      1.26   MGAQ-  QTFQPLDDLEEYLYEQWIRRYH  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：340)
     L1-9(N)      1.62   MGAQ-  SKFKPLDELEQTLYEQWTLQHA  LEGGGGG-Fc  (SEQ ID NO：341)
  Con1衍生的  亲和性-成熟  Pbs    hAng-2：Tie2  IC50(nM)    肽抗体序列(Seq Id No：)
    Con1-4(C)     1.68   M-Fc-GGGGGAQ-  SGQLRPCEEIFGCGTQNLAL-LE  (SEQ ID NO：342)
    Con1-1(C)     3.08   M-Fc-GGGGGAQ-  AGGMRPYDGMLGWPNYDVQA-LE  (SEQID NO：343)
    Con1-6(C)     8.60   M-Fc-GGGGGAQ-  GQDLRPCEDMFGCGTKDWYG-LE  (SEQ ID NO：344)
    Con1-3(C)     16.42   M-Fc-GGGGGAQ-  APGQRPYDGMLGWPTYQRIV-LE  (SEQ ID NO：345)
    Con1-2(C)     没有抑制   M-Fc-GGGGGAQ-  QTWDDPCMHILGPVTWRRCI-LE  (SEQ ID NO：346)
    Con1-5(C)     没有抑制   M-Fc-GGGGGAQ-  FGDKRPLECMFGGPIQLCPR-LE  (SEQ ID NO：347)
    Parent：Con1(C)     26.00   M-Fc-GGGGGAQ-KRPCEEIFGGCTYQ-  LE  (SEQ ID NO：348)
  12-9衍生的  亲和性-成熟  Pbs    hAng-2：Tie2  IC50(nM)    肽抗体序列(Seq Id No：)
    12-9-3(C)     0.81   M-Fc-GGGGGAQ-  LQEWCEGVEDPFTFGCEKQR-LE  (SEQ ID NO：349)
    12-9-7(C)     0.93   M-Fc-GGGGGAQ-  MLDYCEGMDDPFTFGCDKQM-LE  (SEQ ID NO：350)
    12-9-6(C)     0.95   M-Fc-GGGGGAQ-  HQEYCEGMEDPFTFGCEYQG-LE  (SEQ ID NO：351)
    12-9-C2(C)     1.41   M-Fc-GGGGGAQ-  LQDYCEGVEDPFTFGCENQR-LE  (SEQ ID NO：352)
    12-9-5(C)     1.56   M-Fc-GGGGGAQ-  LLDYCEGVQDPFTFGCENL D-LE  (SEQ ID NO：353)
    12-9-1(C)     1.84   M-Fc-GGGGGAQ-  GFEYCDGMEDPFTFGCDKQT-LE  (SEQ ID NO：354)
    12-9-4(C)     2.05   M-Fc-GGGGGAQ-  AQDYCEGMEDPFTFGCEMQK-LE  (SEQ ID NO：355)
    12-9-C1(C)     2.68   M-Fc-GGGGGAQ-  LQDYCEGVEDPFTFGCEKQR-LE  (SEQ ID NO：356)
    12-9-2(C)     8.42   M-Fc-GGGGGAQ-  KLEYCDGMEDPFTQGCDNQS-LE  (SEQ ID NO：357)
    Parent：12-9(C)     15.00   M-Fc-GGGGGAQ-  FDYCEGVEDPFTFGCDNH-LE  (SEQ ID NO：358)
实施例9
在BIAcore上对六个抗-Ang肽抗体测定它们对huAng(R&DSystems，BN012103A)的结合活性。根据标准胺-偶联方法(BIAcoreInc.)将蛋白质G固定到CM5芯片上，然后在蛋白质G表面上注射肽抗体用于捕获(RL大约100Ru)。为了分析hAng2和捕获的肽抗体之间的结合，在捕获的肽抗体表面上注射0.3nM-40nM的huAng2，并且使用BIAevaluation 3.0(BIAcore Inc.)分析结合sensorgrams。表8总结了该项实验的结果。
表8
  肽抗体   批号   KD(M)   ka(1/Ms)   kd(1/s)
 Con4-44(C)   011702   2.1E-10   2.9E+05   5.9E-05
 L1-7(N)   022102   2.4E-10   3.7E+05   8.7E-05
 L1-10(N)   021302   7.7E-10   1.5E+05   1.1E-04
 L1-21(N)   021802   2.4E-10   5.6E+05   1.4E-04
 Con4(C)   33456-77   3.8E-10   5.3E+05   2.0E-04
 2xCon4(C)1K   092501   3.4E-10   4.8E+05   1.6E-04
实施例10
中和作用ELISA
如下用DMEM/50微克/毫升BSA稀释人，鼠，cyno，和大鼠Ang-2和在培养基中条件培养的人和鼠Ang-1：hAng-2-1∶64稀释；mAng-2-1∶64稀释；大鼠Ang-2-没有稀释；cyno Ang-2-1∶32稀释；hAng-1-1∶4稀释；和mAng-1-1∶4稀释。
通过50％最大可实现结合(即，平台)下它们结合1nM hTie2-Fc(以Tie-2-Fc分子提供，其中Tie-2部分只含有分子的可溶性胞外部分；R&D Systems，目录号313-TI)的能力测定稀释这些条件培养基的程度。用稀释的条件培养基100微升包被微量滴定板。对于Ang-2中和作用ELISAs，在含有大约1％BSA和大约1nM Tie-2(以Tie-2-Fc分子提供，其中Tie-2部分只含有分子的可溶性胞外部分；R&D Systems，目录号313-TI)的PBS溶液中4-倍稀释中从62.5nM至0.015pM滴定候选抗-Ang-2肽抗体。对于Ang-1中和作用ELISAs，在含有大约1％BSA和大约1nM Tie-2(以Tie-2-Fc分子提供，其中Tie-2部分只含有分子的可溶性胞外部分；R&D Systems，目录号313-TI)的PBS溶液中4-倍稀释中从1000nM至0.2pM滴定候选抗-Ang-2肽抗体。
向各个孔加入大约100微升肽抗体/Tie-2溶液之后，培养板在室温下温育过夜，然后用含有大约0.1％Tween-20的PBS洗涤五次。洗涤之后，对每孔加入大约100微升的抗-Tie-2抗体(Pharmingen Inc.，catalog#557039)达到每毫升大约1微克的终浓度，培养板在室温下温育大约1小时。接着，以在含有大约1％BSA的PBS中1∶10,000的稀释度每孔加入大约100微升山羊抗-小鼠-IgG-HRP(Pierce Chemical Co.，catalog#31432)。
培养板在室温下温育大约1小时，用含有大约0.1％Tween-20的PBS冲洗五次。然后每孔加入大约100微升的TMB底物(SIGMA，catalog#T8665)使显示蓝色。然后在分光光度计上在370nm读取吸光度。
表9
血管生成素：Tie2相互作用的肽抗体介导的中和作用
  hAng-2   mAng-2   rAng-2   cAng-2   hAng-1   mAng-1
  肽抗体   IC50(nM)   IC50(nM)   IC50(nM)   IC50(nM)   IC50(nM)   IC50(nM)
  2xCon4(C)   0.026   0.035   0.024   0.047   3.0   3.2
  Con4(C)   0.197   0.289   0.236   0.540   200   300
  Con4-44(C)   0.08   0.16   0.22   ----   43   ----
  Con4-40(C)   0.20   0.27   0.35   ----   ＞1000   ----
  L1-7(N)   0.046   0.063   0.035   0.108   ＞1000   ＞1000
  L1-21(N)   0.179   0.249   0.204   0.608   ＞1000   ＞1000
  L1-10(N)   0.06   0.06   0.06   ----   ＞1000   ----
实施例11
PK研究
研究设计
将雄性CD-1小鼠，体重20-30g，随机分为各个肽抗体处理组(2xCon4-C，L1-7-N，和L1-21-N)。动物接受单一IV大丸剂(n＝38/组)或者一次SC施用50微克肽抗体(n＝34/组)。分别尾静脉肩皮肤IV和SC给药进行注射。
血液取样和分析方法
对于SC和IV组，给药之前和给药之后第1，2，4，8，16，24，48，72，96，120，144，168，216，264，312，和336小时对于每一次抗-Ang肽抗体浓度测定取血样。对于IV组给药之后5和30分钟采集另外的样品。每个时间点对两个动物取血，并且在取样之后杀死动物。用心脏穿刺术将血液(大约0.50mL)采取到聚丙烯
Figure G2009101594519D01301
血清分离管中。样品在冰上保持大约20分钟直到发生凝结。通过在2-8℃下离心大约10分钟从血样分离血清，并且在测试之前在大约-70℃下保存。利用校验的时间分辨荧光测定法(TRF)使用100ng/mL较低限度的量化测定样品。用重组小鼠Ang-2蛋白质包被NUNC fluoroMaxisorp微量滴定板。然后用蛋白质封闭培养板以减少非特异性结合。在10％小鼠血清测定缓冲液中制备标 准物，性质对照物和未知样品并且吸移到微量滴定板的孔中。肽抗体与固定的Ang-2特异性结合。将所有的没有结合的物质(Kirkegaard&Perry Laboratories Inc.)洗涤之后，对孔加入生物素化山羊抗-人IgG(H+L)单克隆抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories Inc.)。去除所有的没有结合的生物素化单克隆抗体的洗涤步骤之后，对孔加入铕标记的链霉抗生物素蛋白。将没有结合的链霉抗生物素蛋白铕洗掉之后，结合的铕从链霉抗生物素蛋白释放，酸性溶液吸移到各个孔中。产生荧光信号并且在Wallac′s荧光读数仪上读数。小鼠血清抗-Ang-2肽抗体的分析的测试范围是0.078-5微克/毫升。
药物动力学分析
利用WinNonlin Professional(Version 3.3，Pharsight Corp.，Mountain View，Calif.)对每一组的成分平均浓度-时间数据进行非房室分析。对于PK分析使用标称取样时间，在标称时间的10％内收集样品。在PK分析之前将小于LLOQ的所有的浓度值设置为0。估计下面的PK参数：
根据t1/2＝In(2)/ke1计算极限半寿期(t1/2)，其中ke1是通过极限对数-线性衰退期的线性回归估算的一级极限速度常数。
血清浓度-时间曲线下的面积(AUC(0-最后))用时间是0-最后的线性/对数梯形方法估算，所述时间是最后可以计量的浓度(Clast)。
根据相应的AUC(0-最后)和预计的Clast/kel值之和估算0至无穷大时间(AUC(0-∞))曲线下的面积：
Figure G2009101594519D01311
如下计算SC给药之后的绝对生物可利用率(F)：
F = AU C ( 0 - ∞ ) SC AU C ( 0 - ∞ ) IV × 100
图2中给出结果。
实施例12
在研究的第0天用1x107A431细胞对雌性裸鼠皮下注射。第三天，以200微克/小鼠/天的剂量皮下施用Ang-2肽抗体2xCon4-C。如图中所示以有规律的时间间隔记录肿瘤体积和体重。在旋转摇动器中观察Ang-2肽抗体-处理组对赋形剂对照和对照肽抗体之间的显著差异2小时。(p＜0.0001对每个对照组，使用重复测定ANOVA，用Scheffe’spost hoc检验)。用这种肽抗体处理对体重没有显著影响。图3给出结果。
实施例13
A431体外生长曲线
以每孔2000个细胞对96孔组织培养板接种A431细胞，用补充有10％胎牛血清(FBS)的200微升DMEM。接种之后16小时吸出培养基。然后加回到孔中并且重复三份：每孔100微升DMEM，10％FBS，1毫克/毫升阴性对照肽抗体4883或肽抗体TN8-Con4。在5个板上重复设置。处理之后24，48，72，96，和120小时从一个培养板吸出培养基。然后对每孔加入100微升的10％三氯乙酸(TCA)，然后在4℃存贮培养板。当最后的培养板在10％TCA中最少放置4小时之后收集所有的板。去除10％TCA，孔用自来水洗涤5次。然后在室温下用100微升0.4％sulforhodamineB(Sigma S-9012)的1％乙酸溶液(Sigma A-6283) 将细胞染色10分钟，然后用1％乙酸溶液洗涤5次。然后空气风干培养板。在旋转摇动器上用300微升20mM没有缓冲的Tris(pH＞10)溶解染料。然后在微量滴定板读数仪上在540nm读取光密度(OD)。图4给出结果。
实施例14
在研究的第0天用2x106 Colo-205细胞加Matrigel(2∶1)对雌性裸鼠皮下注射。第三天，以14微克/小鼠的剂量皮下施用Ang-2肽抗体L1-7-N，L1-21-N，Con4-C，和2xCon4-C，一周两次。一周三次施用抗-Ang-2抗体Ab536，47微克/小鼠，作为阳性对照。以有规律的时间间隔记录肿瘤体积和体重。
观察每一个Ang-2肽抗体-处理组对赋形剂对照和对照肽抗体之间的显著差异(p＜0.0001对每个对照组，使用重复测定ANOVA，用Scheffe’s post hoc检验)。用这些肽抗体处理对体重没有显著影响(没有给出结果)。图5给出结果。
实施例15
在研究的第0天用2x106 Colo-205细胞加Matrigel(2∶1)对雌性裸鼠皮下注射。第三天，以14，2.8，和0.56微克/小鼠的剂量皮下施用Ang-2肽抗体2xCon4-C，一周两次。以有规律的时间间隔记录肿瘤体积和体重。观察两个较高剂量的Ang-2肽抗体-处理组对赋形剂对照和对照肽抗体之间的显著差异(中间给药之后p＝0.003，对于高剂量，p＜0.0001，使用重复测定ANOVA，用Scheffe’s post hoc检验)。用这些肽抗体处理对体重没有显著影响。划线代表小组总n的减少，从10减小至9只小鼠，由于一只小鼠不明原因死亡。图6给出结果。
实施例16
抗-Ang-2肽抗体对Colo-205异种移植肿瘤
在研究的第0天用2x106 Colo-205细胞加Matrigel(2∶1)对雌性裸鼠皮下注射。第三天，以350微克/天的剂量皮下施用Ang-2肽抗体2xCon4-C或对照肽抗体。在第14天(大小匹配对照)或第18天(时间匹配对照)收集用对照肽抗体(如表5所述)治疗的组的肿瘤。然后在第18天收集来自2xCon4(C)治疗组的肿瘤。以有规律的时间间隔记录肿瘤体积，如所给出的。观察时间匹配对照组和2xCon4-C处理组之间肿瘤生长的显著差异(p＝0.0154，使用重复测定ANOVA，用Scheffe’s posthoc检验)。用这些肽抗体处理对体重没有显著影响。
将为了成像分析而制备的肿瘤冠状对切，并且把一半迅速在OCT(Sakura Finetek USA Inc.，Torrance，Calif.)中冷冻。使用DAB作为发色体，2微克/毫升，用抗-小鼠CD 31(目录#553370，BDPharMingen，San Diego，Calif.)将冷冻切片免疫组织化学染色。以20倍实物放大率对肿瘤切片数字成像。对于每个肿瘤捕获四个″覆盖-点″区，每个处理组用10个肿瘤。利用MetaMorph(Universal ImagingCorporation，Downington，Pa.)图像分析系统限定图像中CD31染色血管的阈。CD31阳性染色面积表示为各个区内总的肿瘤组织比例。图7给出结果。
实施例17
在研究的第0天用2x106 Colo-205细胞Matrigel(2∶1)对雌性裸鼠皮下注射。从研究的第3，10或15天开始，一周两次用350微克/小鼠的Ang-2肽抗体2xCon4-C，或等价对照肽抗体皮下给药。以有规律的时间间隔记录肿瘤体积和体重。对A431和Colo-205异种移植模型观察所有Ang-2肽抗体-处理组对赋形剂对照之间的肿瘤生长显著差异(对于第15天组，p＝0.089并且p＝给药10周)。这里使用的CR指处理之后没有可测得的肿瘤的结果。图9给出结果。
实施例19
a)Colo-205肿瘤模型中Pb与脱乙酰紫杉醇的联合
在研究的第0天用2x106 Colo-205细胞加Matrigel(2∶1)对雌性裸鼠皮下注射。研究的第14天，用a)350微克/小鼠，每周两次皮下，Ang-2肽抗体2xCon4-C，b)20mg/kg qwx3i.p._脱乙酰紫杉醇，或c)两者的联合，开始治疗。以有规律的时间间隔记录肿瘤体积和体重。观察所有处理组对赋形剂对照之间肿瘤生长的显著差异(p＜0.0001，使用重复测定ANOVA，用Scheffe’s post hoc检验)。另外，和单一治疗药物任一种相比，联合治疗组显著不同(p＜0.0001对2xCon-4-C和p＝0.0122对脱乙酰紫杉醇)。划线代表小组总n的减少，从10减小至9只小鼠，由于一只小鼠不明原因死亡。用这些肽抗体治疗对体重没有显著影响。图10a给出结果。
b)Colo-205肿瘤模型中Pb与5-FU的联合
在研究的第0天用2x106 Colo-205细胞Matrigel(2∶1)对雌性裸鼠皮下注射。研究的第14天，用a)350微克/小鼠，每周两次皮下，Ang-2肽抗体2xCon4-C，b)50mg/kg qwx5i.p.5-FU，或c)两者的联合，开始治疗。以有规律的时间间隔记录肿瘤体积和体重。
观察所有处理组对赋形剂对照之间肿瘤生长的显著差异(p＜0.0001，使用重复测定ANOVA，用Scheffe’s post hoc检验)。另外，和单一治疗药物任一种相比，联合治疗组显著不同(p＝0.0375对2xCon-4-C和p＝0.0453对5-FU)。5-FU治疗组(18％，在研究的第20天)以及联合治疗组(16％，在研究的第20天)发现体重暂时减轻，随后完全恢复体重。图10b给出结果。
实施例20
辅助关节炎模型
在环境控制房间(温度23±2℃，相对湿度50±20％)，12-小时光照/黑暗周期，在每只滤网盖子笼子中关养雄性Lewis大鼠(120-130g，Charles River，Wilmington Mass.)。对动物喂以商售啮齿动物饲料(Formulation 8640；Tek Lab，Madison，Wis.)并且自由饮用过滤器纯化的自来水。食物该和磷含量分别是1.2％和1.0％。
通过在尾根真皮内一次注射悬浮于0.05mL石蜡油(CrescentChemical Co.，Hauppauge，N.Y.)中的0.5mg热杀死结核分枝杆菌H37Ra(Difco Laboratories，Detroit，Mich.)诱导辅助关节炎。关节炎的临床发生在第9天，指征是后爪肿胀行走困难。除了在2xCon4(c)治疗组外(其在免疫之后第一天治疗)，免疫之后第9天开始每天皮下注射(关节炎发生之前)并且持续18天。
辅助关节炎的临床监测
根据Feige等，Cellular Molec.Life Sci.，57：1457-1470(2000)描述的方法用水体积描记法通过测定后爪体积的间歇式测量，临床评价炎症进程。应用根据下式的梯形规则以曲线(AUC)下的面积为基础计算爪炎症的抑制作用：
[1-{(治疗的AdA)-正常)/(未治疗的AdA-正常1))]*100
另外，在9天的治疗方案中每天测定总体重作为补充终点，因为体重减轻表明该 关节炎模型关节炎症的进行平行。第18天用CO2杀死动物。
对尸体检查骨矿物质密度(BMD)的减少(免疫后第18天)。在毛皮线处去除后爪(仅接近踝关节(后踝))，浸在70％乙醇中，然后使用通风机X-射线柱光密度计(Model QDR-4500A；Hologic，Waltham，Mass.)在水平方向上扫描。参见Feige等，上文。扫描之后，将跟骨处居中的矩形盒(29x25mm)位于描绘出的位置用于分析，用专业算法(Hologic软件)计算骨面积，骨矿物质含量，和骨矿物质密度。
所有的结果表示为平均值±标准误差。使用p值是0.05描述各组之间的统计学差异。对临床数据进行Kruskal-Wallis ANOVA和Mann-Whitney U.检验，使用商售统计学软件(Statsoft v3.0；Statsoft，Tulsa，Okla.)。
图11a，11b，和11c中分别给出结果。
实施例21
角膜血管发生模型
CON4(C)对大鼠VEGF-诱导的血管发生的作用
对大鼠血管发生角膜模型评价Ang-2肽抗体CON4(C)。通过将VEGF-(或BSA对照物)浸透的尼龙片埋植到角膜基质中(n＝8/组)诱导血管发生。以1.0或0.1毫克/大鼠/天皮下注射施用肽抗体TN8CON4-C7天。用相同剂量的阴性对照肽抗体4883处理另外两组动物。用3.0或0.3毫克的单一载量预先处理所有的组，这个量是1.0或0.1mg维护剂量的三倍(参见附图)。处理7天之后，从大鼠角膜各个数字成像确定两个血管端点：片和边缘之间的中点相交的血管数目，和血管面积。TN8CON4-C处理以剂量依赖方式显著抑制VEGF-诱导的血管发生(p＜0.04)，而用对照肽抗体处理对两个端点的任一个没有显著作用。根据受治疗动物的体重，没有明显毒性的证据。图12给出了结果。
实施例22
表位定位
将全长(氨基酸1-495)，N-末端(氨基酸1-254)和C-末端(氨基酸255-495)人Ang-2(hAng-2)蛋白质克隆到带有C-末端6xHi s标记的CMV-驱动哺乳动物表达载体中。将三个得到的构建体加载体对照物瞬时表达到293T细胞中。然后从感染的细胞收集条件培养基，并且通过6xHis ELISA和蛋白质印迹估计培养基中Ang-2的表达水平。
根据下面的方案通过ELISA，通过它们结合人hAng-2的三种版本的能力，测定抗-Ang-2抗体和肽抗体的结合表位：每孔用100微升条件培养基包被高结合96-孔测定板，并且在37℃下温育1小时。吸出条件培养基，室温下每孔用200微升5％BSA的PBS溶液封闭平板1小时。然后吸出封闭溶液。以1微克/毫升1％BSA的PBS溶液每孔加入100微升抗体，肽抗体，或Tie 2-Fc，并且室温下温育1小时。用200微升0.1％Tween的PBS溶液将孔洗涤四次。每孔加入100微升HRP-偶联的山羊抗-人IgG或山羊抗-小鼠IgG，并且室温下温育45分钟。然后用200微升0.1％Tween的PBS溶液将孔洗涤四次。然后每孔加入100微升TMB底物。在370nm下读取O.D.。
图13a，图13b，和图13c给出结果。
实施例23
由于BiaCore测定中固有的一些灵敏性限制，利用SepidyneKinExA分析也评估结合亲和力。
在KinExA(Sapidyne，Boise，Ind.)上试验2xCON4-C(Pb5714)与huAng-2的结合。Reacti-Gel 6x珠(Pierce，Rockford，I11.)预先用huAng-2包被并且用BSA封闭。10pM和30pM的2xCON4-C样品与各种浓度的(0.3pM-3nM)的huAng-2在室温下温育8小时，然后通过huAng-2-包被珠。通过荧光(Cy5)标记的山羊抗-人-Fc抗体(Jackson Immuno Research，West Grove，Pa.)定量测定小珠-结合的肽抗体的量。结合信号和平衡中自由肽抗体的浓度成比例。
使用双曲线一点均匀结合模型(KinExTM软件)从竞争曲线的非线性回归获得离解平衡常数(KD)。然后对于与huAng-2结合的2xCON4-C测定KD大约是2pM。
如图14所示，使用KinExA分析，证明肽抗体2xCon4对于hAng-2具有2pM。
实施例24
PEG化肽
利用残基14(met)与N-末端残基1(Cys)，从N-末端至C-末端编号，的标准偶联方法和双偶联，用431ABI合成仪合成L1-7肽。
L1-7肽与甲氧基-聚(乙二醇)-马来酰亚胺的偶联；MW：5KDa；称作″mPEG5K-(L1-7肽)″
用13.5mg甲氧基-聚(乙二醇)-马来酰亚胺(MW＝5KDa；Shearwater Corp.)；0.27ml的50.0mg/mL缓冲液1的溶液，处理400微升缓冲液1(20mM磷酸盐，5mM EDTA，pH 6.5)中0.8mg的L1-7肽的溶液。反应混合物在4℃下温育过夜，然后用1.6mL的缓冲液A(20mM Tris HCl，pH 7.2)稀释，并且在Slide-A-Lyzer盒(3500MWCO，Pierce)中用相同的缓冲液透析。在1.0mL HiTrap Q SepharoseHP柱(Amersham Biosciences Corp.)上通过离子交换色谱法纯化透析的反应混合物。通过40柱体积从100％缓冲液A至100％缓冲液B(缓冲液A+0.5M NaCl)梯度在两个1.0mL级分中洗脱出产物峰。使用Microsep 1K Centrifugal Device(Pall Life Sciences)将合并的产物级分浓缩至250微升，含有0.23mg蛋白质/毫升。
L1-7肽与1，11-双-马来酰亚胺四亚乙基二醇的偶联；称作″PEO4(L1-7肽) 2 ″
用0.0375毫克的1，11-双-马来酰亚胺四亚乙基二醇(Pierce)(0.375mL的缓冲液1中0.1mg/mL溶液)处理500微升缓冲液1中1.0mg的L1-7肽溶液(20mM磷酸盐，5mM EDTA，pH 6.5)。反应混合物在4℃下温育3.33小时，然后用Slide-A-Lyze r盒(3500MWCO，Pierce)中用缓冲液A(20mM Tris HCl，pH 7.2)透析。在1.0mL HiTrapQ Sepharose HP柱(Amersham Biosciences Corp.)上通过离子交换色谱法纯化透析的反应混合物。通过40柱体积从100％缓冲液A至100％缓冲液B(缓冲液A+0.5M NaCl)梯度在三个1.0mL级分中洗脱出二聚体产物峰。使用Microsep 1K Centrifugal Device(Pall LifeSciences)将合并的产物级分浓缩至550微升，含有0.12mg蛋白质/毫升。
L1-7肽与聚(乙二醇)-双-马来酰亚胺的偶联：MW 3.4KDa；称作″PEG3.4K(L1-7肽) 2 ″
用1.125毫克的聚(乙二醇)-双-马来酰亚胺(MW＝3.4KDa，Shearwater Corp.)；0.563mL的缓冲液1中2.0mg/mL溶液处理1.5毫升缓冲液1中3.0mg的L1-7肽溶液(20mM磷酸盐，5mM EDTA，pH 6.5)。反应混合物在4℃下温育过夜，然后用Slide-A-Lyzer盒(3500MWCO，Pierce)中用缓冲液A(20mM Tris HCl，pH 7.2)透析。在5.0mL HiTrap Q Sepharose HP柱(Amersham Biosciences Corp.)上通过离子交换色谱法纯化透析的反应混合物。通过40柱体积从100％缓冲液A至100％缓冲液B(缓冲液A+0.5M NaCl)梯度在三个3.0mL级分中洗脱出产物峰。使用两个Microsep 1K Centrifugal Device(Pall Life Sciences)将合并的产物级分浓缩至850微升，含有0.24mg蛋白质/毫升。
MALDI-TOF质谱结果如下：
 样品#   身份   实验MS   Obs.MS
  1   L1-7(没有PEG化的肽)   3，545   3，538.7
  2   mPEG5K-(L1-7肽)   8，500   8，851
  3   PEO4(L1-7肽)2   7，443   7，446.29
  4   PEG 3.4K(L1-7肽)2   10，550   10，552  6，882.61  3，550.13
明白对于PEG 3.4K(L1-7肽)和PEO4(L1-7肽)的角注″2″指每个聚合物链有两个肽，各位于聚合物的各端。
IC50测定
如实施例2所述，通过中和作用ELISA测定自由L1-7和PEG化肽的hAng：hTie2-Fc相互作用的抑制作用的IC50。对于中和作用ELISA，如实施例2所述制备结合了人Ang-2多肽的微量滴定板用于亲和力ELISA。在含有大约1％BSA和大约1nM Tie-2(Tie-2-Fc分子提供，其中Tie-2部分只含有该分子的可溶性胞外部分；R&D Systems，目录号313-TI)的PBS溶液中以4倍稀释度从1000nM至0.2pM滴定侯选抗-Ang-2L1-7PEG化和自由肽。向各孔加入大约100微升的抗体/Tie-2溶液之后，培养板在室温下温育过夜，然后用含有大约0.1％Tween-20的PBS清洗五次。冲洗之后，每孔加入大约100微升的抗-Tie-2抗体(Pharmingen Inc.，catalog#557039)，最终浓度达到大约1微克/毫升，培养板在室温下温育大约1小时。接着，以含有大约1％BSA的PBS中以1∶10,000的稀释度每孔加入大约100微升山羊抗-小鼠-IgG-HRP(Pierce Chemical CO.，catalog#31432)。培养板在室温下温育大约1小时，然后用含有大约0.1％Tween-20的PBS清洗五次。然后每孔加入大约100微升的TMB底物(如上所述)，使得显色。然后在分光光度计上在大约370nm读取吸光度。
L1-7肽(C-GGGGG-AQ-TNFMPMDDLEQRLYEQFILQQG-LE)(SEQ ID NO：359)包括：用于偶联PEG的N-末端半胱氨酸；和一个5G1y连接体。原始噬菌体克隆和肽抗体中都存在AQ和LE侧翼序列。下面给出hAng-2：Tie2抑制作用IC50结果：
  肽   IC50(nM)
  L1-7肽   0.49
  mPEG5K-(L1-7肽)   11.7
  PEO4(L1-7肽)2   20.064
  PEG 3.4K(L1-7肽)2   0.058
<110>AMGEN INC.
<120>人血管生成素-2的特异结合剂
<130>A-801B
<140>NOT YET ASSIGNED
<141>2002-10-11
<150>US 60/414,155
<151>2002-09-27
<150>US 60/328,624
<151>2001-10-11
<160>359
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Ang-2结合肽
<400>1
Lys Arg Pro Cys Glu Glu Met Trp Gly Gly Cys Asn Tyr Asp
1               5                   10
<210>2
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Ang-2结合肽
<400>2
His Gln Ile Cys Lys Trp Asp Pro Trp Thr Cys Lys His Trp
1               5                   10
<210>3
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Ang-2结合多肽
<400>3
Lys Arg Pro Cys Glu Glu Ile Phe Gly Gly Cys Thr Tyr Gln
1               5                   10
<210>4
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Ang-2结合多肽
<400>4
Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met
1               5                   10
<210>5
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Ang-2结合多肽
<400>5
Phe Asp Tyr Cys Glu Gly Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Asp
1               5                   10                  15
Asn His
<210>6
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Ang-2结合多肽
<400>6
Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gln Phe
1               5                   10                  15
Thr Phe Gln Gln
            20
<210>7
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Ang-2结合肽
<400>7
Gln Tyr Gly Cys Asp Gly Phe Leu Tyr Gly Cys Met Ile Asn
1               5                   10
<210>8
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>8
acaaacaaac atatgggtgc acagaaagcg gccgcaaaaa aactcgaggg tggaggcggt    60
ggggaca                                                              67
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>9
ggtcattact ggaccggatc                                                20
<210>10
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>10
cgtacaggt t tacgcaagaa aatgg                                         25
<210>11
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>11
tttgttggat ccattact cg agtttttttg cggccgcttt ctgtgcacca ccacctccac   60
ctttac                                                               66
<210>12
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>Xaa＝Fc
<400>12
Met Gly Ala Gln Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu
1               5                   10                  15
Tyr Glu Gln Phe Thr Phe Gln Gln Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa
            20                  25                  30
<210>13
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(29)..(29)
<223>Xaa＝Fc
<400>13
Met Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gln
1               5                   10                  15
Phe Thr Phe Gln Gln Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa
            20                  25
<210>14
<211>51
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(51)..(51)
<223>Xaa＝Fc
<400>14
Met Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gln
1               5                   10                  15
Phe Thr Phe Gln Gln Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Leu Glu Gly Gly Gly
    35                  40                  45
Gly Gly Xaa
50
<210>15
<211>60
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(60)..(60)
<223>Xaa＝Fc
<400>15
Met Gly Ala Gln Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu
1               5                   10                  15
Tyr Glu Gln Phe Thr Phe Gln Gln Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gln Phe
        35                  40                  45
Thr Phe Gln Gln Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa
    50                  55                  60
<210>16
<211>56
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(56)..(56)
<223>Xaa＝Fc
<400>16
Met Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gln
1               5                   10                  15
Phe Thr Phe Gln Gln Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Lys Phe Asn Pro
            20                  25                  30
Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gln Phe Thr Phe Gln Gln
        35                  40                  45
Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa
    50                  55
<210>17
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(26)..(26)
<223>Xaa＝Fc
<400>17
Met Gly Ala Gln Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu
1               5                   10                  15
His Met Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa
            20                  25
<210>18
<211>45
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(45)..(45)
<223>Xaa＝Fc
<400>18
Met Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly
1               5                   10                  15
Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser
            20                  25                  30
Gly Ser Ala Thr His Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa
        35                  40                  45
<210>19
<211>62
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(62)..(62)
<223>Xaa＝Fc
<400>19
Met Gly Ala Gln Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu
1               5                   10                  15
His Met Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser
            20                  25                  30
Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro
        35                  40                  45
Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa
    50                  55                  60
<210>20
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>20
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu
1               5                   10                  15
Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gln Phe Thr Phe Gln Gln Leu Glu
            20                  25                  30
<210>21
<211>53
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>21
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly
1               5                   10                  15
Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Lys
            20                  25                  30
Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gln Phe Thr
        35                  40                  45
Phe Gln Gln Leu Glu
    50
<210>22
<211>59
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>22
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu
1               5                   10                  15
Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gln Phe Thr Phe Gln Gln Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Gly Gly Gly Gly Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr
        35                  40                  45
Leu Tyr Glu Gln Phe Thr Phe Gln Gln Leu Glu
    50                  55
<210>23
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>23
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp
1               5                   10                  15
Pro Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu
            20                  25
<210>24
<211>47
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>24
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly
1               5                   10                  15
Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Gln
            20                  25                  30
Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu
        35                  40                  45
<210>25
<211>61
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>25
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp
1               5                   10                  15
Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser
            20                  25                  30
Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Gln Glu Glu
        35                  40                  45
Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu
    50                  55                  60
<210>26
<211>75
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(75)..(75)
<223>Xaa＝Fc
<400>26
Met Gly Ala Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu
            20                  25                  30
Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gln Phe Thr Phe Gln Gln Gly Ser Gly
        35                  40                  45
Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Ala Thr His Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa
65                  70                  75
<210>27
<211>72
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>27
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly
1               5                   10                  15
Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Lys
            20                  25                  30
Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gln Phe Thr
         35                  40                  45
Phe Gln Gln Gly Gly Gly Gly Gly Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro
    50                  55                  60
Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu
65                  70
<210>28
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(30)..(30)
<223>Xaa＝Fc
<400>28
Met Gly Ala Gln Phe Asp Tyr Cys Glu Gly Val Glu Asp Pro Phe Thr
1               5                   10                  15
Phe Gly Cys Asp Asn His Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa
            20                  25                  30
<210>29
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(26)..(26)
<223>Xaa＝Fc
<400>29
Met Gly Ala Gln Gln Tyr Gly Cys Asp Gly Phe Leu Tyr Gly Cys Met
1               5                   10                  15
Ile Asn Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa
            20                  25
<210>30
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(26)..(26)
<223>Xaa＝Fc
<400>30
Met Gly Ala Gln Lys Arg Pro Cys Glu Glu Met Trp Gly Gly Cys Asn
1               5                   10                  15
Tyr Asp Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa
            20                  25
<210>31
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(26)..(26)
<223>Xaa＝Fc
<400>31
Met Gly Ala Gln His Gln Ile Cys Lys Trp Asp Pro Trp Thr Cys Lys
1               5                   10                  15
His Trp Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa
            20                  25
<210>32
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(26)..(26)
<223>Xaa＝Fc
<400>32
Met Gly Ala Gln Lys Arg Pro Cys Glu Glu Ile Phe Gly Gly Cys Thr
1               5                   10                  15
Tyr Gln Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa
            20                  25
<210>33
<211>784
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽抗体的DNA
<400>33
atgggtgcac agaaattcaa cccgctggac gaactggaag aaactctgta cgaacagttc    60
actttccagc agctcgaggg tggaggcggt ggggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc    120
ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gttttcctct tccccccaaa acccaaggac    180
accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa    240
gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca    300
aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg    360
caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca    420
gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac    480
accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc    540
aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac    600
aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag    660
ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat    720
gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaataatgg    780
atcc                                                                 784
<210>34
<211>768
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽抗体的DNA
<400>34
atgaaattca acccgctgga cgaactggaa gaaactctgt acgaacagtt cactttccag    60
cagctcgagg gtggaggcgg tggggacaaa actcacacat gtccaccttg cccagcacct    120
gaactcctgg ggggaccgtc agttttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg    180
atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag    240
gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg    300
gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac    360
tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc    420
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc    480
ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc    540
tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag    600
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg    660
gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg    720
cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaataa                 768
<210>35
<211>834
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽抗体的DNA
<400>35
atgaaattca acccgctgga cgaactggaa gaaactctgt acgaacagtt cactttccag    60
cagggatccg gttctgctac tggtggttcc ggctccaccg caagctctgg ttcaggcagt    120
gcgactcatc tcgagggtgg aggcggtggg gacaaaactc acacatgtcc accttgccca    180
gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtt ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc    240
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac    300
cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag    360
ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac    420
caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc    480
cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc    540
ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa    600
ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac    660
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc    720
accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag    780
gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa ataa          834
<210>36
<211>861
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽抗体的DNA
<400>36
atgggtgcac agaaattcaa cccgctggac gaactggaag aaactctgta cgaacagttc    60
actttccagc agggtggtgg tggtggtggc ggtggtaagt tcaacccact ggatgagctg    120
gaagagactc tgtatgaaca gttcactttc cagcaactcg agggtggagg cggtggggac    180
aaaactcaca catgtccacc ttgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagttttc    240
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc    300
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc    360
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt    420
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc    480
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg    540
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac    600
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg    660
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac    720
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac    780
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc    840
tccctgtctc cgggtaaata a                                              861
<210>37
<211>849
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽抗体的DNA
<400>37
atgaaattca acccgctgga cgaactggaa gaaactctgt acgaacagtt cactttccag    60
cagggtggtg gtggtggcgg tggtaagttc aacccactgg atgagctgga agagactctg    120
tatgaacagt tcactttcca gcaactcgag ggtggaggcg gtggggacaa aactcacaca    180
tgtccacctt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagttttcct cttcccccca    240
aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac    300
gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat    360
aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc    420
ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac    480
aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa    540
ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg    600
acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg    660
cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc    720
ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc    780
tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg    840
ggtaaa taa                                                           849
<210>38
<211>759
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽抗体的DNA
<400>38
atgggtgcac agcaggaaga atgcgaatgg gacccatgga cttgcgaaca catgctcgag    60
ggtggaggcg gtggggacaa aactcacaca tgtccacctt gcccagcacc tgaactcctg    120
gggggaccgt cagttttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg    180
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc    240
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag    300
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat    360
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc    420
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg    480
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc    540
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct    600
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc    660
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac    720
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa                           759
<210>39
<211>816
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽抗体的DNA
<400>39
atgcaggaag aatgcgaatg ggacccatgg acttgcgaac acatgggatc cggttctgct    60
actggtggtt ccggctccac cgcaagctct ggttcaggca gtgcgactca tctcgagggt    120
ggaggcggtg gggacaaaac tcacacatgt ccaccttgcc cagcacctga actcctgggg    180
ggaccgtcag ttttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc    240
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac    300
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac    360
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc    420
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc    480
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat    540
gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac    600
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc    660
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg    720
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac    780
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaataa                              816
<210>40
<211>867
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽抗体的DNA
<400>40
atgggtgcac agcaggaaga atgcgaatgg gacccatgga cttgcgaaca catgggatcc   60
ggttctgcta ctggtggttc cggctccacc gcaagctctg gttcaggcag tgcgactcat   120
caggaagaat gcgaatggga cccatggact tgcgaacaca tgctcgaggg tggaggcggt   180
ggggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca   240
gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc   300
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg   360
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg   420
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac   480
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc    540
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc    600
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg    660
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac    720
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag    780
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag    840
agcctctccc tgtctccggg taaataa                                        867
<210>41
<211>774
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽抗体的DNA
<400>41
atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca    60
gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc    120
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg    180
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg    240
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac    300
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc    360
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc    420
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg    480
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac    540
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag    600
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag    660
agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagaaatt caacccgctg    720
gacgagctgg aagagactct gtacgaacag tttacttttc aacagctcga gtaa          774
<210>42
<211>840
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽抗体的DNA
<400>42
atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca    60
gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc    120
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg    180
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg    240
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac    300
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc    360
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc    420
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg    480
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac    540
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag    600
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag    660
agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagggatc cggttctgct    720
actggtggtt ccggctccac cgcaagctct ggttcaggca gtgcgactca taaattcaac    780
ccgctggacg aactggaaga aactctgtac gaacagttca ctttccagca actcgagtaa    840
<210>43
<211>858
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽抗体的DNA
<400>43
atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca    60
gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc    120
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg    180
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg    240
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac    300
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc    360
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc    420
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg    480
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac    540
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag    600
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag    660
agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagaaatt caacccgctg    720
gacgaactgg aagaaactct gtacgaacag ttcactttcc agcagggtgg tggtggtggt    780
ggcggtggta agttcaaccc actggatgag ctggaagaga ctctgtatga acagttcact    840
ttccagcaac tcgagtaa                                                  858
<210>44
<211>756
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽抗体的DNA
<400>44
atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca    60
gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc    120
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg    180
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg    240
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac    300
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc    360
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc    420
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg    480
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac    540
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag    600
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag    660
agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagcagga agaatgcgaa    720
tgggacccat ggacttgcga acacatgctc gagtaa                              756
<210>45
<211>822
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽抗体的DNA
<400>45
atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg  gggaccgtca    60
gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc    120
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg    180
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg    240
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac    300
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc    360
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc    420
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg    480
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac    540
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag    600
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag    660
agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagggatc cggttctgct    720
actggtggtt ccggctccac cgcaagctct ggttcaggca gtgcgactca tcaggaagaa    780
tgcgaatggg acccatggac ttgcgaacac atgctcgagt aa                       822
<210>46
<211>864
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽抗体的DNA
<400>46
atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca    60
gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc    120
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg    180
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg    240
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac    300
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc    360
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc    420
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg    480
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac    540
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag    600
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag    660
agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagcagga agaatgcgaa    720
tgggacccat ggacttgcga acacatggga tccggttctg ctactggtgg ttccggctcc  780
accgcaagct ctggttcagg cagcgcgact catcaggaag aatgcgaatg ggacccatgg  840
acttgcgaac acatgctcga gtaa                                         864
<210>47
<211>906
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽抗体的DNA
<400>47
atgggtgcac aggaagaatg cgaatgggac ccatggactt gcgaacacat gggtggtggt    60
ggtggtggcg gtggtaaatt caacccgctg gacgaactgg aagaaactct gtacgaacag    120
ttcactttcc agcagggatc cggttctgct actggtggtt ccggctccac cgcaagctct    180
ggttcaggca gtgcgactca tctcgagggt ggaggcggtg gggacaaaac tcacacatgt    240
ccaccttgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag ttttcctctt ccccccaaaa    300
cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg    360
agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat    420
gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc    480
accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa    540
gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca    600
caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc    660
tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag    720
ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc    780
tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc    840
gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt    900
aaataa                                                               906
<210>48
<211>897
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽抗体的DNA
<400>48
atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca    60
gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc    120
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg    180
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg    240
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac    300
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc    360
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc    420
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg    480
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac    540
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag    600
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag    660
agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagggatc cggttctgct    720
actggtggtt ccggctccac cgcaagctct ggttcaggca gtgcgactca taaattcaac    780
ccgctggacg aactggaaga aactctgtac gaacagttca ctttccagca gggtggtggc    840
ggtggtcagg aagaatgcga atgggaccca tggacttgcg aacacatgct cgagtaa       897
<210>49
<211>771
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽抗体的DNA
<400>49
atgggtgcac agttcgacta ctgcgaaggt gttgaagacc cgttcacttt cggttgcgac    60
aaccacctcg agggtggagg cggtggggac aaaactcaca catgtccacc ttgcccagca    120
cctgaactcc tggggggacc gtcagttttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc    180
atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct    240
gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg    300
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag    360
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc    420
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg    480
cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc    540
ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac    600
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc    660
gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct    720
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaata a             771
<210>50
<211>759
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽抗体的DNA
<400>50
atgggtgcac agcagtacgg ttgcgacggt tttctgtacg gttgcatgat caacctcgag    60
ggtggaggcg gtggggacaa aactcacaca tgtccacctt gcccagcacc tgaactcctg    120
gggggaccgt cagttttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg    180
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc    240
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag    300
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat    360
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc    420
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg    480
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc    540
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct    600
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc    660
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac    720
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa                           759
<210>51
<211>759
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽抗体的DNA
<400>51
atgggtgcac agaaacgccc atgcgaagaa atgtggggtg gttgcaacta cgacctcgag    60
ggtggaggcg gtggggacaa aactcacaca tgtccacctt gcccagcacc tgaactcctg    120
gggggaccgt cagttttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg    180
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc    240
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag    300
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat    360
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc    420
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg    480
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc    540
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct    600
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc    660
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac    720
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa                           759
<21D>52
<211>759
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽抗体的DNA
<400>52
atgggtgcac agcaccagat ctgcaaatgg gacccgtgga cctgcaaaca ctggctcgag    60
ggtggaggcg gtggggacaa aactcacaca tgtccacctt gcccagcacc tgaactcctg    120
gggggaccgt cagttttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg    180
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc    240
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag    300
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat    360
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc    420
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg    480
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc    540
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct    600
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc    660
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac    720
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa                           759
<210>53
<211>759
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽抗体的DNA
<400>53
atgggtgcac agaaacgtcc atgcgaagaa atcttcggtg gttgcaccta ccagctcgag    60
ggtggaggcg gtggggacaa aactcacaca tgtccacctt gcccagcacc tgaactcctg    120
gggggaccgt cagttttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg    180
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc    240
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag    300
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat    360
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc    420
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg    480
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc    540
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct    600
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc    660
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac    720
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa                           759
<210>54
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>54
cggcgcaact atcggtatca agctg                                         25
<210>55
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>55
catgtaccgt aacactgagt ttcgtc                                       26
<210>56
catgtaccgt aacactgagt ttcgtc                                         26
<210>56
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从TN8-IX文库产生的共有基序
<220>
<221>misc_feature
<222>(7，12和)..(14)
<223>Xaa指任何天然存在的氨基酸
<400>56
Lys Arg Pro Cys Glu Glu Xaa Trp Gly Gly Cys Xaa Tyr Xaa
1               5                   10
<210>57
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从TN8-IX文库产生的共有基序
<220>
<221>misc_feature
<222>(7，12和)..(14)
<223>Xaa指任何天然存在的氨基酸.
<400>57
Lys Arg Pro Cys Glu Glu Xaa Phe Gly Gly Cys Xaa Tyr Xaa
1               5                   10
<210>58
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从TN8-IX文库产生的共有基序
<220>
<221>misc_feature
<222>(1，2，3，5和)..(13)
<223>Xaa指任何天然存在的氨基酸.
<400>58
<210>59
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从TN12-I文库产生的共有基序
<220>
<221>misc_fea ture
<222>(3，8，10-14和)..(18)
<223>Xaa指任何天然存在的氨基酸.
<400>59
Trp Ser Xaa Cys Ala Trp Phe Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Arg
1               5                   10                  15
Arg Xaa
<210>60
<211>227
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人Fc IgG1
<400>60
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
            20                  25                  30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
        35                  40                  45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
    50                  55                  60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
                85                  90                  95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
            100                 105                 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
        115                 120                 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
    130                 135                 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145                 150                 155                 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
                165                 170                 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
            180                 185                 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
        195                 200                 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
    210                 215                 220
Pro Gly Lys
225
<210>61
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从TN8-IX文库产生的共有基序
<220>
<221>misc_feature
<222>(1-3，5，7，12，13和)..(14)
<223>Xaa指任何天然存在的氨基酸.
<400>61
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Asp Xaa Tyr Trp Tyr Cys Xaa Xaa Xaa
1               5                   10
<210>62
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从TN8-IX文库产生的共有基序
<220>
<221>misc_feature
<222>(1-3，5，7，12，13和)..(14)
<223>Xaa指任何天然存在的氨基酸.
<400>62
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Asp Xaa Tyr Thr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa
1               5                   10
<210>63
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从TN8-IX文库产生的共有基序
<220>
<221>misc_feature
<222>(1-3，5，7，12，13和)..(14)
<223>Xaa指任何天然存在的氨基酸.
<400>63
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Asp Xaa Phe Trp Tyr Cys Xaa Xaa Xaa
1               5                   10
<210>64
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从TN8-IX文库产生的共有基序
<220>
<221>misc_feature
<222>(1-3，5，7，12，13和)..(14)
<223>Xaa指任何天然存在的氨基酸.
<400>64
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Asp Xaa Phe Thr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa
1               5                   10
<210>65
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>65
Trp Asp Pro Trp Thr
1               5
<210>66
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>66
Trp Asp Pro Trp Thr Cys
1               5
<210>67
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa是酸性或中性极性氨基酸残基
<400>67
Cys Xaa Trp Asp Pro Trp Thr
1               5
<210>68
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa是酸性或中性极性氨基酸残基
<400>68
Cys Xaa Trp Asp Pro Trp Thr Cys
1               5
<210>69
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1，2和)..(3)
<223>Xaa各自独立地是氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>Xaa是氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(12)
<223>Xaa不存在或者是氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>Xaa不存在或者是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>Xaa是中性疏水或中性极性氨基酸残基
<400>69
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp Asp Pro Trp Thr Cys Xaa Xaa Xaa
1               5                   10
<210>70
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1和)..(15)
<223>Xaa不存在或者是氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(2和)..(16)
<223>Xaa不存在或者是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(3-6，18，19和)..(20)
<223>Xaa各自独立地不存在或者是氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>Xaa是氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(17)
<223>Xaa不存在或者是中性疏水或中性极性氨基酸残基
<400>70
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp Asp Pro Trp Thr Cys Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa
            20
<210>71
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa是中性疏水氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>Xaa是A，D，或E.
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>Xaa是酸性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>Xaa是氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>Xaa是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基
<400>71
Pro Xaa Asp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Leu Tyr
1               5                   10
<210>72
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1，4和)..(20)
<223>Xaa不存在或者是氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(2，15，16和)..(21)
<223>Xaa不存在，或者是中性极性，酸性，或碱性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(3，17和)..(18)
<223>Xaa不存在，或者是中性疏水，或中性极性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>Xaa是中性疏水氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>Xaa是A，D，或E.
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>Xaa是酸性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>Xaa是氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(12)
<223>Xaa是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(19和)..(22)
<223>Xaa不存在，或者是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基
<400>72
Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Asp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Leu Tyr Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20
<210>73
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>Xaa是中性极性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>Xaa是酸性氨基酸残基.
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>Xaa是中性极性或酸性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(6和)..(7)
<223>Xaa是中性疏水氨基酸残基
<400>73
Arg Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly
1               5
<210>74
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<220>
<221>misc_featu re
<222>(1，2，4，13，14，19和)..(20)
<223>Xaa是中性疏水或中性极性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(3，9和)..(17)
<223>Xaa是中性极性或酸性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(7，15和)..(16)
<223>Xaa是中性极性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>Xaa是酸性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(10和)..(11)
<223>Xaa是中性疏水性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)
<223>Xaa是中性疏水性或碱性氨基酸残基
<400>74
Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>75
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa是酸性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>Xaa是中性疏水性或碱性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>Xaa是E，D，或Q
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>Xaa是中性疏水性或中性极性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>Xaa是酸性残基
<400>75
Cys Xaa Gly Xaa Xaa Asp Pro Phe Thr Xaa Gly Cys Xaa
1               5                   10
<210>76
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>76
Pro Ile Arg Gln Glu Glu Cys Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Trp Glu Val
            20
<210>77
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>77
Thr Asn Ile Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His
1               5                   10                  15
Met Pro Gly Lys
            20
<210>78
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>78
Trp Tyr Glu Gln Asp Ala Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Ala Glu Val
            20
<210>79
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>79
Asn Arg Leu Gln Glu Val Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Glu Asn Val
            20
<210>80
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>80
Ala Ala Thr Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Pro Arg Ser
            20
<210>81
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>81
Leu Arg His Gln Glu Gly Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Phe Asp Trp
            20
<210>82
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>82
Val Pro Arg Gln Lys Asp Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Tyr Val Gly
            20
<210>83
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>83
Ser Ile Ser His Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Gln Val Gly
            20
<210>84
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>84
Trp Ala Ala Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Gly Arg Met
            20
<210>85
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>85
Thr Trp Pro Gln Asp Lys Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Gly Ser Thr
            20
<210>86
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>86
Gly His Ser Gln Glu Glu Cys Gly Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Gly Thr Ser
            20
<210>87
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>87
Gln His Trp Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His
1               5                   10                  15
Met Pro Ser Lys
            20
<210>88
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>88
Asn ValArg Gln Glu Lys Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Pro Val Arg
            20
<210>89
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>89
Lys Ser Gly Gln Val Glu Cys Asn Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Pro Arg Asn
            20
<210>90
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>90
Val Lys Thr Gln Glu His Cys Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Arg Glu Trp
            20
<210>91
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>91
Ala Trp Gly Gln Glu Gly Cys Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Leu Pro Met
            20
<210>92
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>92
Pro Val Asn Gln Glu Asp Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Pro Pro Met
            20
<210>93
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>93
Arg Ala Pro Gln Glu Asp Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His
1               5                   10                  15
Met Asp Ile Lys
            20
<210>94
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>94
His Gly Gln Asn Met Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Phe Arg Tyr
            20
<210>95
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>95
Pro Arg Leu Gln Glu Glu Cys Val Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Pro Leu Arg
            20
<210>96
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>96
Arg Thr Thr Gln Glu Lys Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Glu Ser Gln
            20
<210>97
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>97
Gln Thr Ser Gln Glu Asp Cys Val Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His
1               5                   10                  15
Met Val Ser Ser
            20
<210>98
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>98
Gln Val Ile Gly Arg Pro Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Leu Glu Gly Leu
            20
<210>99
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>99
Trp Ala Gln Gln Glu Glu Cys Ala Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His
1               5                   10                  15
Met Val Gly Leu
            20
<210>100
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>100
Leu Pro Gly Gln Glu Asp Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Val Arg Ser
            20
<210>101
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>101
Pro Met Asn Gln Val Glu Cys Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Pro Arg Ser
            20
<210>102
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>102
Phe Gly Trp Ser His Gly Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Gly Ser Thr
            20
<210>103
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>103
Lys Ser Thr Gln Asp Asp Cys Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Val Gly Pro
            20
<210>104
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>104
Gly Pro Arg Ile Ser Thr Cys Gln Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Asp Gln Leu
            20
<210>105
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>105
Ser Thr Ile Gly Asp Met Cys Glu Trp A sp Pro Trp Thr Cys Ala Hi s
1               5                   10                  15
Met Gln Val Asp
            20
<210>106
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>106
Val Leu Gly Gly Gln Gly Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu
1               5                   10                  15
Leu Gln Gly Trp
            20
<210>107
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>107
Val Leu Gly Gly Gln Gly Cys Gln Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser His
1               5                   10                  15
Leu Glu Asp Gly
            20
<210>108
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>108
Thr Thr Ile Gly Ser Met Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His
1               5                   10                  15
Met Gln Gly Gly
            20
<210>109
<211>20
<212>PRT    
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>109
Thr Lys Gly Lys Ser Val Cys Gln Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser His
1               5                   10                  15
Met Gln Ser Gly
            20
<210>110
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>110
Thr Thr Ile Gly Ser Met Cys Gln Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His
1               5                   10                  15
Met Gln Gly Gly
            20
<210>111
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>111
Trp Val Asn Glu Val Val Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asn His
1               5                   10                  15
Trp Asp Thr Pro
            20
<210>112
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>112
Val Val Gln Val Gly Met Cys Gln Trp Asp Pro Trp Thr Cys Lys His
1               5                   10                  15
Met Arg Leu Gln
            20
<210>113
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>113
Ala Val Gly Ser Gln Thr Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His
1               5                   10                  15
Leu Val Glu Val
            20
<210>114
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽    
<400>114
Gln Gly Met Lys Met Phe Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His
1               5                   10                  15
Ile Val Tyr Arg
            20
<210>115
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>115
Thr Thr Ile Gly Ser Met Cys Gln Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
1               5                   10                  15
Met Gln Gly Gly
            20
<210>116
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>116
Thr Ser Gln Arg Val Gly Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Gln His
1               5                   10                  15
Leu Thr Tyr Thr
            20
<210>117
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>117
Gln Trp Ser Trp Pro Pro Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Gln Thr
1               5                   10                  15
Val Trp Pro Ser
            20
<210>118
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>118
Gly Thr Ser Pro Ser Phe Cys Gln Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser His
1               5                   10                  15
Met Val Gln Gly
            20
<210>119
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>119
Gln Asn Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Ala Thr Leu Tyr Glu His
1               5                   10                  15
Phe Ile Phe His Tyr Thr
            20
<210>120
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>120
Leu Asn Phe Thr Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gln Thr Leu Tyr Glu Gln
1               5                   10                  15
Trp Thr Leu Gln Gln Ser
            20
<210>121
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>121
Thr Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gln Thr Leu Tyr Glu Gln
1               5                   10                  15
Trp Thr Leu Gln His Gln
            20
<210>122
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>122
Val Lys Phe Lys Pro Leu Asp Ala Leu Glu Gln Thr Leu Tyr Glu His
1               5                   10                  15
Trp Met Phe Gln Gln Ala
            20
<210>123
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>123
Val Lys Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu Ile Leu Tyr Glu Gln
1               5                   10                  15
Gln Thr Phe Gln Glu Arg
            20
<210>124
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>124
Thr Asn Phe Met Pro Met Asp Asp Leu Glu Gln Arg Leu Tyr Glu Gln
1               5                   10                  15
Phe Ile Leu Gln Gln Gly
            20
<210>125
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>125
Ser Lys Phe Lys Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gln Thr Leu Tyr Glu Gln
1               5                   10                  15
Trp Thr Leu Gln His Ala
            20
<210>126
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>126
Gln Lys Phe Gln Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gln Thr Leu Tyr Glu Gln
1               5                   10                  15
Phe Met Leu Gln Gln Ala
            20
<210>127
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>127
Gln Asn Phe Lys Pro Met Asp Glu Leu Glu Asp Thr Leu Tyr Lys Gln
1               5                   10                  15
Phe Leu Phe Gln His Ser
            20
<210>128
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>128
Tyr Lys Phe Thr Pro Leu Asp Asp Leu Glu Gln Thr Leu Tyr Glu Gln
1               5                   10                  15
Trp Thr Leu Gln His Val
            20
<210>129
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>129
Gln Glu Tyr Glu Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu Thr Leu Tyr Asn Gln
1               5                   10                  15
Trp Met Phe His Gln Arg
            20
<210>130
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>130
Ser Asn Phe Met Pro Leu Asp Glu Leu G1u Gln Thr Leu Tyr Glu Gln
1               5                   10                  15
Phe Met Leu Gln His Gln
             20
<210>131
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>131
Gln Lys Tyr Gln Pro Leu Asp Glu Leu Asp Lys Thr Leu Tyr Asp Gln
1               5                   10                  15
Phe Met Leu Gln Gln Gly
            20
<210>132
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>132
Gln Lys Phe Gln Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Lys Gln
1               5                   10                  15
Trp Thr Leu Gln Gln Arg
            20
<210>133
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>133
Val Lys Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu Trp Leu Tyr His Gln
1               5                   10                  15
Phe Thr Leu His His Gln
            20
<210>134
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>134
Gln Lys Phe Met Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu Ile Leu Tyr Glu Gln
1               5                   10                  15
Phe Met Phe Gln Gln Ser
            20
<210>135
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>135
Gln Thr Phe Gln Pro Leu Asp Asp Leu Glu Glu Tyr Leu Tyr Glu Gln
1               5                   10                  15
Trp Ile Arg Arg Tyr His
            20
<210>136
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>136
Glu Asp Tyr Met Pro Leu Asp Ala Leu Asp Ala Gln Leu Tyr Glu Gln
1               5                   10                  15
Phe Ile Leu Leu His Gly
            20
<210>137
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>137
His Thr Phe Gln Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Tyr Gln
1               5                   10                  15
Trp Leu Tyr Asp Gln Leu
            20
<210>138
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>138
Tyr Lys Phe Asn Pro Met Asp Glu Leu Glu Gln Thr Leu Tyr Glu Glu
1               5                   10                  15
Phe Leu Phe Gln His Ala
            20
<210>139
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>139
Thr Asn Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Ala Thr Leu Tyr Glu His
1               5                   10                  15
Trp Ile Leu Gln His Ser
            20
<210>140
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>140
Gln Lys Phe Lys Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gln Thr Leu Tyr Glu Gln
1               5                   10                  15
Trp Thr Leu Gln Gln Arg
            20
<210>141
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>141
Thr Lys Phe Gln Pro Leu Asp Glu Leu Asp Gln Thr Leu Tyr Glu Gln
1               5                   10                  15
Trp Thr Leu Gln Gln Arg
            20
<210>142
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>142
Thr Asn Phe Gln Pro Leu Asp Glu Leu Asp Gln Thr Leu Tyr Glu Gln
1               5                   10                  15
Trp Thr Leu Gln Gln Arg
            20
<210>143
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>143
Ala Gly Gly Met Arg Pro Tyr Asp Gly Met Leu Gly Trp Pro Asn Tyr
1               5                   10                  15
Asp Val Gln Ala
            20
<210>144
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>144
Gln Thr Trp Asp Asp Pro Cys Met His Ile Leu Gly Pro Val Thr Trp
1               5                   10                  15
Arg Arg Cys Ile
            20
<210>145
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>145
Ala Pro Gly Gln Arg Pro Tyr Asp Gly Met Leu Gly Trp Pro Thr Tyr
1               5                   10                  15
Gln Arg Ile Val
            20
<210>146
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>146
Ser Gly Gln Leu Arg Pro Cys Glu Glu Ile Phe Gly Cys Gly Thr Gln
1               5                   10                  15
Asn Leu Ala Leu
            20
<210>147
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>147
Phe Gly Asp Lys Arg Pro Leu Glu Cys Met Phe Gly Gly Pro Ile Gln
1               5                   10                  15
Leu Cys Pro Arg
            20
<210>148
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>148
Gly Gln Asp Leu Arg Pro Cys Glu Asp Met Phe Gly Cys Gly Thr Lys
1               5                   10                  15
Asp Trp Tyr Gly
            20
<210>149
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>149
Gly Phe Glu Tyr Cys Asp Gly Met Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys
1               5                   10                  15
Asp Lys Gln Thr
            20
<210>150
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>150
Lys Leu Glu Tyr Cys Asp Gly Met Glu Asp Pro Phe Thr Gln Gly Cys
1               5                   10                  15
Asp Asn Gln Ser
            20
<210>151
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>151
Leu Gln Glu Trp Cys Glu Gly Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys
1               5                   10                  15
Glu Lys Gln Arg
            20
<210>152
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>152
Ala Gln Asp Tyr Cys Glu Gly Met Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys
1               5                   10                  15
Glu Met Gln Lys
            20
<210>153
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>153
Leu Leu Asp Tyr Cys Glu Gly Val Gln Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys
1               5                   10                  15
Glu Asn Leu Asp
            20
<210>154
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>154
His Gln Glu Tyr Cys Glu Gly Met Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys
1               5                   10                  15
Glu Tyr Gln Gly
            20
<210>155
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>155
Met Leu Asp Tyr Cys Glu Gly Met Asp Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys
1               5                   10                  15
Asp Lys Gln Met
            20
<210>156
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>156
Leu Gln Asp Tyr Cys Glu Gly Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys
1               5                   10                  15
Glu Asn Gln Arg
            20
<210>157
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>157
Leu Gln Asp Tyr Cys Glu Gly Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys
1               5                   10                  15
Glu Lys Gln Arg
            20
<210>158
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>Xaa不存在或者是中性疏水性，中性极性，或碱性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(2，4，14)..(19)
<223>Xaa是中性疏水性或中性极性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(3，6)..(17)
<223>Xaa是酸性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>Xaa中性疏水性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>Xaa是E，D，或Q
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)
<223>Xaa是中性疏水性，中性极性，或碱性氨基酸残基
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(20)
<223>Xaa不存在或者是氨基酸残基
<400>158
Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Gly Xaa Xaa Asp Pro Phe Thr Xaa Gly Cys
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa
            20
<210>159
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>159
ccgatccgtc aggaagaatg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat gtgggaagtt    60
<210>160
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>160
accaacatcc aggaagaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaccacat gccgggtaaa    60
<210>161
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>161
tggtacgaac aggacgcttg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat ggctgaagtt    60
<210>162
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>162
aaccgtctgc aggaagtttg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat ggaaaacgtt    60
<210>163
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>163
gctgctaccc aggaagaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgcgttcc    60
<210>164
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>164
ctgcgtcacc aggaaggttg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gttcgactgg    60
<210>165
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>165
gttccgcgtc agaaagactg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gtacgttggt    60
<210>166
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>166
tgggctgctc aggaagaatg cgaatgggat ccgtggactt gcgaacacat gggtcgtatg    60
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<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>167
acttggccgc aggacaaatg cgaatgggat ccgtggactt gcgaacacat gggttctact    60
<210>168
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>168
ggtcactccc aggaagaatg cggttgggac ccgtggacct gcgaacacat gggtacgtcc    60
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<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>169
cagcactggc aggaagaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaccacat gccgtccaaa    60
<210>170
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>170
aacgttcgtc aggaaaaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gccggttcgt    60
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>171
aaatccggtc aggttgaatg caactgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgcgtaac    60
<210>172
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>172
gttaaaaccc aggaacactg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat gcgtgaatgg    60
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>173
gcttggggtc aggaaggttg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat gctgccgatg    60
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<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>174
ccggttaacc aggaagactg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgccgatg    60
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<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>175
cgtgctccgc aggaagactg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacat ggacatcaaa    60
<210>176
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA    
<400>176
cacggtcaga acatggaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gttccgttac    60
<210>177
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>177
ccgcgtctgc aggaagaatg cgtttgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgctgcgt    60
<210>178
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>178
cgtaccaccc aggaaaaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat ggaatcccag    60
<210>179
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>179
cagacctccc aggaagactg cgtttgggac ccgtggacct gcgaccacat ggtttcctcc    60
<210>180
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>180
caggttatcg gtcgtccgtg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacct ggaaggtctg    60
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<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>181
tgggctcagc aggaagaatg cgcttgggac ccgtggacct gcgaccacat ggttggtctg    60
<210>182
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>182
ctgccgggtc aggaagactg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat ggttcgttcc    60
<210>183
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>183
ccgatgaacc aggttgaatg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgcgttcc    60
<210>184
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>184
ttcggttggt ctcacggttg cgaatgggat ccgtggactt gcgaacacat gggttctacc    60
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>185
aaatccaccc aggacgactg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat ggttggtccg    60
<210>186
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>186
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>187
tccaccatcg gtgacatgtg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacat gcaggttgac    60
<210>188
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>188
gttctgggtg gtcagggttg cgaatgggac ccgtggacct gccgtctgct gcagggttgg    60
<210>189
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>189
gttctgggtg gtcagggttg ccagtgggac ccgtggacct gctcccacct ggaagacggt    60
<210>190
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>190
accaccatcg gttccatgtg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacat gcagggtggt    60
<210>191
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>191
accaaaggtaaat ccgtttg ccagtgggac ccgtggacct gctcccacat gcagtccggt    60
<210>192
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>192
accaccatcg gttccatgtg ccagtgggac ccgtggacct gcgctcacat gcagggtggt    60
<210>193
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>193
tgggttaacg aagttgtttg cgaatgggac ccgtggacct gcaaccactg ggacaccccg    60
<210>194
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>194
gttgttcagg ttggtatgtg ccagtgggac ccgtggacct gcaaacacat gcgtctgcag    60
<210>195
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>195
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<210>196
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>196
cagggtatga aaatgttctg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacat cgtttaccgt    60
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<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>197
accaccatcg gttccatgtg ccagtgggac ccgtggacct gcgaacacat gcagggtggt    60
<210>198
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>198
acctcccagc gtgttggttg cgaatgggac ccgtggacct gccagcacct ga cctacacc    60
<210>199
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>199
cagtggtcct ggccgccgtg cgaatgggac ccgtggacct gccagaccgt ttggccgtcc    60
<210>200
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>200
ggtacctccc cgtccttctg ccagtgggac ccgtggacct gctcccacat ggttcagggt    60
<210>201
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>201
caggaagaat gcgaatggga cccatggact tgcgaacaca tg                       42
<210>202
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>202
cagaactaca aaccgctgga cgaactggac gctaccctgt acgaacactt catcttccac    60
tacacc                                                               66
<210>203
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>203
ctgaacttca ccccgctgga cgaactggaa cagaccctgt acgaacagtg gaccctgcag    60
cagtcc                                                               66
<210>204
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>204
accaaattca acccgctgga cgaactggaa cagaccctgt acgaacagtg gaccctgcag    60
caccag                                                               66
<210>205
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>205
gttaaattca aaccgctgga cgctctggaa cagaccctgt acgaacactg gatgttccag    60
caggct                                                               66
<210>206
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>206
gttaaataca aaccgctgga cgaactggac gaaatcctgt acgaacagca gaccttccag    60
gaacgt                                                               66
<210>207
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>207
accaacttca tgccgatgga cgacctggaa cagcgtctgt acgaacagtt catcctgcag    60
cagggt                                                               66
<210>208
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>208
tccaaattca aaccgctgga cgaactggaa cagaccctgt acgaacagtg gaccctgcag    60
cacgct                                                               66
<210>209
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>209
cagaaattcc agccgctgga cgaactggaa cagaccctgt acgaacagtt catgctgcag    60
caggct                                                               66
<210>210
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>210
cagaacttca aaccgatgga cgaattggaa gacaccctgt acaaacagtt cctgttccag    60
cactcc                                                               66
<210>211
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>211
tacaaattca ccccgctgga cgacctggaa cagaccctgt acgaacagtg gaccctgcag    60
cacgtt                                                               66
<210>212
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>212
aggaatacga accgctggac gaactggacg aaaccctgta caaccagtgg atgttccacc    60
agcgt                                                                65
<210>213
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>213
tccaacttca tgccgctgga cgaactggaa cagaccctgt acgaacagtt catgctgcag    60
caccag                                                               66
<210>214
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>214
cagaaatacc agccgctgga cgaactggac aaaaccctgt acgatcagtt catgctgcag    60
cagggt                                                               66
<210>215
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>215
cagaaattcc agccgctgga cgaactggaa gaaaccctgt acaaacagtg gaccctgcag    60
cagcgt                                                               66
<210>216
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>216
gttaaataca aaccgctgga cgaactggac gaatggctgt accaccagtt caccctgcac    60
caccag                                                               66
<210>217
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>217
cagaaattca tgccgctgga cgaactggac gaaatcctgt acgaacagtt catgttccag    60
cagtccc                                                              67
<210>218
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>218
cagaccttcc agccgctgga cgacctggaa gaatacttgt acgaacagtg gatccgtcgt    60
taccac                                                               66
<210>219
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>219
gaagactaca tgccgctgga cgctctggac gctcagctgt acgaacagtt catcctgctg    60
cacggt                                                               66
<210>220
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>220
cacaccttcc agccgctgga cgaactggaa gaaaccctgt actaccagtg gctgtacgac    60
cagctg                                                               66
<210>221
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>221
tacaaattca acccgatgga cgaactggaa cagaccctgt acgaagaatt cctgttccag    60
cacgct                                                               66
<210>222
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>222
accaactaca aaccgctgga cgaactggac gctaccctgt acgaacactg gatcctgcag    60
cactcc                                                               66
<210>223
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>223
cagaaattca aaccgctgga cgaactggaa cagaccctgt acgaacagtg gaccctgcag    60
cagcgt                                                               66
<210>224
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>224
accaaattcc agccgctgga cgaactggac cagaccctgt acgaacagtg gaccctgcag    60
cagcgt                                                               66
<210>225
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>225
accaacttcc agccgctgga cgaactggac cagaccctgt acgaacagtg gaccctgcag    60
cagcgt                                                               66
<210>226
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>226
aaattcaacc cgctggacga gctggaagag actctgtacg aacagtttac ttttcaacag    60
<210>227
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>227
gctggtggta tgcgtccgta cgacggtatg ctgggttggc cgaactacga cgttcaggct    60
<210>228
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>228
cagacttggg acgatccgtg catgcacatt ctgggtccgg ttacttggcg tcgttgcatc    60
<210>229
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>229
gctccgggtc agcgtccgta cgacggtatg ctgggttggc cgacctacca gcgtatcgtt    60
<210>230
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>230
tccggtcagc tgcgtccgtg cgaagaaatc ttcggttgcg gtacccagaa cctggctctg    60
<210>231
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>231
ttcggtgaca aacgtccgct ggaatgcatg ttcggtggtc cgatccagct gtgcccgcgt    60
<210>232
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>232
ggtcaggacc tgcgtccgtg cgaagacatg ttcggttgcg gtaccaaaga ctggtacggt    60
<210>233
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>233
ggtttcgaat actgcgacgg tatggaagac ccgttcacct tcggttgcga caaacagacc    60
<210>234
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>234
aaactggaat actgcgacgg tatggaagac ccgttcaccc agggttgcga caaccagtcc    60
<210>235
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>235
ctgcaggaat ggtgcgaagg tgttgaagac ccgttcacct tcggttgcga aaaacagcgt    60
<210>236
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>236
gctcaggact actgcgaagg tatggaagac ccgttcacct tcggttgcga aatgcagaaa    60
<210>237
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>237
ctgctggact actgcgaagg tgttcaggac ccgttcacct tcggttgcga aaacctggac    60
<210>238
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>238
caccaggaat actgcgaagg tatggaagac ccgttcacct tcggttgcga ataccagggt    60
<210>239
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>239
atgctggact actgcgaagg tatggacgac ccgttcacct tcggttgcga caaacagatg    60
<210>240
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>240
ctgcaggact actgcgaagg tgttgaagac ccgttcacct tcggttgcga aaaccagcgt    60
<210>241
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>241
ctgcaggact actgcgaagg tgttgaagac ccgttcacct tcggttgcga aaaacagcgt    60
<210>242
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>242
ttcgactact gcgaaggtgt tgaagacccg ttcactttcg gctgtgataa ccac    54
<210>243
<211>250
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>编码能结合Ang-2的肽的DNA
<400>243
Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
            20                  25                  30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
        35                  40                  45
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
    50                  55                  60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
                85                  90                  95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
        115                 120                 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
    130                 135                 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145                 150                 155                 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
                165                 170                 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
            180                 185                 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
        195                 200                 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
    210                 215                 220
Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Cys Thr Ala Gly Tyr His Trp
225                 230                 235                 240
Asn Ser Asp Cys Glu Cys Cys Arg Arg Asn
                245                 250
<210>244
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>244
caaacgaatg gatcctcatt aaagccaga                                      29
<210>245
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>245
ggtggtgcgg ccgcactcga gactgttgaa agttgtttag ca                       42
<210>246
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>246
caaacgaatg gatcctcatt aaagccaga                                      29
<210>247
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>247
aacacaaaag tgcacagggt ggaggtggtg gtgcggccgc act                      43
<210>248
<211>91
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>248
Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Asn
1               5                   10                  15
Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn
            20                  25                  30
Lys Asn Asn Lys Ser Ala Arg Thr Gly Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly
        35                  40                  45
Thr Gly Gly Ala Ser Cys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn
    50                  55                  60
Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Cys Ala Thr Thr Cys
65                  70                  75                  80
Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala
                85                  90
<210>249
<211>91
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>249
Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Asn
1               5                   10                  15
Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Ala Ala Lys Cys Gly Lys Cys Cys
            20                  25                  30
Lys Asn Asn Lys Gly Ala Lys Gly Ala Lys Ala Thr Lys Thr Thr Lys
        35                  40                  45
Gly Gly Lys Gly Gly Lys Asn Asn Lys Ala Cys Lys Thr Ala Lys Cys
    50                  55                  60
Ala Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Cys Ala Thr Thr Cys
65                  70                  75                  80
Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala
                85                  90
<210>250
<211>95
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>250
Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Asn
1               5                   10                  15
Asn Lys Ala Ala Lys Thr Thr Lys Ala Ala Lys Cys Cys Lys Cys Thr
            20                  25                  30
Lys Gly Ala Lys Gly Ala Lys Cys Thr Lys Gly Ala Lys Gly Ala Lys
        35                  40                  45
Ala Cys Lys Cys Thr Lys Thr Ala Lys Gly Ala Lys Cys Ala Lys Thr
    50                  55                  60
Thr Lys Ala Cys Lys Thr Thr Lys Cys Ala Lys Cys Ala Lys Asn Asn
65                  70                  75                  80
Lys Cys Ala Thr Thr Cys Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr
                85                  90                  95
<210>251
<211>91
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>251
Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Asn
1               5                   10                  15
Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Cys Ala Lys Gly Ala Lys Gly Ala
            20                  25                  30
Lys Thr Gly Cys Gly Ala Lys Thr Gly Lys Gly Ala Lys Cys Cys Lys
        35                  40                  45
Thr Gly Lys Ala Cys Lys Thr Gly Cys Gly Ala Lys Cys Ala Lys Ala
    50                  55                  60
Thr Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Cys Ala Thr Thr Cys
65                  70                  75                  80
Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala
                85                  90
<210>252
<211>89
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>252
Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Asn
1               5                   10                  15
Asn Lys Thr Thr Lys Gly Ala Lys Thr Ala Lys Asn Asn Lys Gly Ala
             20                  25                  30
Lys Gly Gly Lys Gly Thr Lys Gly Ala Lys Gly Ala Lys Cys Cys Lys
        35                  40                  45
Thr Thr Lys Ala Cys Lys Thr Thr Lys Gly Gly Lys Asn Asn Lys Gly
    50                  55                  60
Ala Lys Ala Ala Lys Cys Ala Lys Asn Asn Lys Cys Ala Thr Thr Cys
65                  70                  75                  80
Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr
                85
<210>253
<211>95
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>253
Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Asn
1               5                   10                  15
Asn Lys Ala Ala Lys Thr Thr Lys Ala Ala Lys Cys Cys Lys Cys Thr
            20                  25                  30
Lys Gly Ala Lys Gly Ala Lys Cys Thr Lys Gly Ala Lys Gly Ala Lys
        35                  40                  45
Ala Cys Lys Cys Thr Lys Thr Ala Lys Gly Ala Lys Cys Ala Lys Thr
    50                  55                  60
Thr Lys Ala Cys Lys Thr Thr Lys Cys Ala Lys Cys Ala Lys Asn Asn
65                  70                  75                  80
Lys Cys Ala Thr Thr Cys Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr
                85                  90                  95
<210>254
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>254
cacagtgcac agggt                                                     15
<210>255
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>255
tgatctcgag agaatg                                        16
<210>256
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>256
gttagctcac tcattaggca c                                  21
<210>257
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>257
gtaccgtaac actgagtttc g                                  21
<210>258
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>258
ttacacttta tgcttccg                                      18
<210>259
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>259
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Pro Ile Arg Gln Glu Glu Cys
1               5                   10                  15
Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Trp Glu Val Leu Glu
            20                  25                  30
<210>260
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>260
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln ThrAsn Ile Gln Glu Glu Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His Met Pro Gly Lys Leu Glu
            20                  25                  30
<210>261
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>261
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Trp Tyr Glu Gln Asp Ala Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Ala Glu Val Leu Glu
            20                  25                  30
<210>262
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>262
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Asn Arg Leu Gln Glu Val Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Glu Asn Val Leu Glu
            20                  25                  30
<210>263
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>263
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Ala Ala Thr Gln Glu Glu Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Pro Arg Ser Leu Glu
            20                  25                  30
<210>264
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>264
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Leu Arg His Gln Glu Gly Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Phe Asp Trp Leu Glu
            20                  25                  30
<210>265
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>265
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Val Pro Arg Gln Lys Asp Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Tyr Val Gly Leu Glu
            20                  25                  30
<210>266
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>266
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Ser Ile Ser His Glu Glu Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gln Val Gly Leu Glu
            20                  25                  30
<210>267
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>267
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Trp Al a Ala Gln Glu Glu Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Arg Met Leu Glu
            20                  25                  30
<210>268
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>268
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Thr Trp Pro Gln Asp Lys Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser Thr Leu Glu
            20                  25                  30
<210>269
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>269
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gly His Ser Gln Glu Glu Cys
1               5                   10                  15
Gly Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Thr Ser Leu Glu
            20                  25                  30
<210>270
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>270
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gln His Trp Gln Glu Glu Cys
1               5                  10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His Met Pro Ser Lys Leu Glu
            20                  25                  30
<210>271
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>271
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Asn Val Arg Gln Glu Lys Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Pro Val Arg Leu Glu
            20                  25                  30
<210>272
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>272
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Lys Ser Gly Gln Val Glu Cys
1               5                   10                  15
Asn Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Pro Arg Asn Leu Glu
            20                  25                  30
<210>273
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>273
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Val Lys Thr Gln Glu His Cys
1               5                   10                  15
Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Arg Glu Trp Leu Glu
            20                  25                  30
<210>274
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>274
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Ala Trp Gly Gln Glu Gly Cys
1               5                   10                  15
Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Leu Pro Met Leu Glu
            20                  25                  30
<210>275
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>275
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Pro Val Asn Gln Glu Asp Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Pro Pro Met Leu Glu
            20                  25                  30
<210>276
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>276
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Arg Ala Pro Gln Glu Asp Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His Met Asp Ile Lys Leu Glu
            20                  25                  30
<210>277
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>277
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln His Gly Gln Asn Met Glu Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Phe Arg Tyr Leu Glu
            20                  25                  30
<210>278
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>278
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Pro Arg Leu Gln Glu Glu Cys
1               5                   10                  15
Val Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Pro Leu Arg Leu Glu
            20                  25                  30
<210>279
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>279
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Arg Thr Thr Gln Glu Lys Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Glu Ser Gln Leu Glu
            20                  25                  30
<210>280
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>280
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gln Thr Ser Gln Glu Asp Cys
1               5                   10                  15
Val Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His Met Val Ser Ser Leu Glu
            20                  25                  30
<210>281
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>281
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gln Val Ile Gly Arg Pro Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Leu Glu Gly Leu Leu Glu
            20                  25                  30
<210>282
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>282
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Trp Ala Gln Gln Glu Glu Cys
1               5                   10                  15
Ala Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His Met Val Gly Leu Leu Glu
            20                  25                  30
<210>283
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>283
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Leu Pro Gly Gln Glu Asp Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Val Arg Ser Leu Glu
            20                  25                  30
<210>284
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>284
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Pro Met Asn Gln Val Glu Cys
1               5                   10                  15
Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Pro Arg Ser Leu Glu
            20                  25                  30
<210>285
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>285
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Phe Gly Trp Ser His Gly Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser Thr Leu Glu
            20                  25                  30
<210>286
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>286
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Lys Ser Thr Gln Asp Asp Cys
1               5                   10                  15
Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Val Gly Pro Leu Glu
            20                  25                  30
<210>287
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>287
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gly Pro Arg Ile Ser Thr Cys
1               5                   10                  15
Gln Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Asp Gln Leu Leu Glu
            20                  25                  30
<210>288
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>288
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Ser Thr Ile Gly Asp Met Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His Met Gln Val Asp Leu Glu
            20                  25                  30
<210>289
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>289
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Val Leu Gly Gly Gln Gly Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu Gln Gly Trp Leu Glu
            20                  25                  30
<210>290
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>290
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Val Leu Gly Gly Gln Gly Cys
1               5                   10                  15
Gln Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser His Leu Glu Asp Gly Leu Glu
            20                  25                  30
<210>291
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>291
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Thr Thr Ile Gly Ser Met Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His Met Gln Gly Gly Leu Glu
            20                  25                  30
<210>292
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>292
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Thr Lys Gly Lys Ser Val Cys
1               5                   10                  15
Gln Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser His Met Gln Ser Gly Leu Glu
            20                  25                  30
<210>293
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>293
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Thr Thr Ile Gly Ser Met Cys
1               5                   10                  15
Gln Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His Met Gln Gly Gly Leu Glu
            20                  25                  30
<210>294
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>294
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Trp Val Asn Glu Val Val Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asn His Trp Asp Thr Pro Leu Glu
            20                  25                  30
<210>295
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>295
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Val Val Gln Val Gly Met Cys
1               5                   10                  15
Gln Trp Asp Pro Trp Thr Cys Lys His Met Arg Leu Gln Leu Glu
            20                  25                  30
<210>296
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>296
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Ala Val Gly Ser Gln Thr Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His Leu Val Glu Val Leu Glu
            20                  25                  30
<210>297
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>297
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gln Gly Met Lys Met Phe Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His Ile Val Tyr Arg Leu Glu
            20                  25                  30
<210>298
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>298
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Thr Thr Ile Gly Ser Met Cys
1               5                   10                  15
Gln Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gln Gly Gly Leu Glu
            20                  25                  30
<210>299
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>299
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Thr Ser Gln Arg Val Gly Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Gln His Leu Thr Tyr Thr Leu Glu
            20                  25                  30
<210>300
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_fea ture
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>300
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gln Trp Ser Trp Pro Pro Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Gln Thr Val Trp Pro Ser Leu Glu
            20                  25                  30
<210>301
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>301
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gly Thr Ser Pro Ser Phe Cys
1               5                   10                  15
Gln Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser His Met Val Gln Gly Leu Glu
            20                  25                  30
<210>302
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>302
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Thr Gln Gly Leu His Gln Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Lys Val Leu Trp Pro Ser Leu Glu
            20                  25                  30
<210>303
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>303
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Val Trp Arg Ser Gln Val Cys
1               5                   10                  15
Gln Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asn Leu Gly Gly Asp Trp Leu Glu
            20                  25                  30
<210>304
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>304
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Asp Lys Ile Leu Glu Glu Cys
1               5                   10                  15
Gln Trp Asp Pro Trp Thr Cys Gln Phe Phe Tyr Gly Ala Leu Glu
            20                  25                  30
<210>305
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>305
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Ala Thr Phe Ala Arg Gln Cys
1               5                   10                  15
Gln Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala Leu Gly Gly Asn Trp Leu Glu
            20                  25                  30
<210>306
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>306
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gln Glu Glu Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu Pro Leu Pro Leu Met Leu Glu
            20                  25                  30
<210>307
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>307
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Arg Pro Glu Asp Met Cys Ser
1               5                   10                  15
Gln Trp Asp Pro Trp Thr Trp His Leu Gln Gly Tyr Cys Leu Glu
            20                  25                  30
<210>308
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>308
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Leu Trp Gln Leu Ala Val Cys
1               5                   10                  15
Gln Trp Asp Pro Gln Thr Cys Asp His Met Gly Ala Leu Leu Glu
            20                  25                  30
<210>309
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>309
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Thr Gln Leu Val Ser Leu Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu Asp Gly Trp Leu Glu
            20                  25                  30
<210>310
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>310
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Met Gly Gly Ala Gly Arg Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Gln Leu Leu Gln Gly Trp Leu Glu
            20                  25                  30
<210>311
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>311
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Met Phe Leu Pro Asn Glu Cys
1               5                   10                  15
Gln Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser Asn Leu Pro Glu Ala Leu Glu
            20                  25                  30
<210>312
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>312
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Phe Gly Trp Ser His Gly Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu Gln Gly Trp Leu Glu
            20                  25                  30
<210>313
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc    
<400>313
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Trp Pro Gln Thr Glu Gly Cys
1               5                   10                  15
Gln Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu His Gly Trp Leu Glu
            20                  25                  30
<210>314
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>314
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Pro Asp Thr Arg Gln Gly Cys
1               5                   10                  15
Gln Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Tyr Gly Met Trp Leu Glu
            20                  25                  30
<210>315
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>315
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Thr Trp Pro Gln Asp Lys Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu Gln Gly Trp Leu Glu
            20                  25                  30
<210>316
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>316
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Asp Lys Ile Leu Glu Glu Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu Gln Gly Trp Leu Glu
            20                  25                  30
<210>317
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>mise_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>317
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Ala Ala Thr Gln Glu Glu Cys
1               5                   10                  15
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu Gln Gly Trp Leu Glu
            20                  25                  30
<210>318
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>318
Met Gly Ala Gln Thr Asn Phe Met Pro Met Asp Asp Leu Glu Gln Arg
1               5                   10                  15
Leu Tyr Glu Gln Phe Ile Leu Gln Gln Gly Leu Glu Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Xaa
<210>319
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>319
Met Gly Ala Gln Thr Asn Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Ala Thr
1               5                   10                  15
Leu Tyr Glu His Trp Ile Leu Gln His Ser Leu Glu Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Xaa
<210>320
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>320
Met Gly Ala Gln Gln Lys Tyr Gln Pro Leu Asp Glu Leu Asp Lys Thr
1               5                   10                  15
Leu Tyr Asp Gln Phe Met Leu Gln Gln Gly Leu Glu Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Xaa
<210>321
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>321
Met Gly Ala Gln Leu Asn Phe Thr Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gln Thr
1               5                   10                  15
Leu Tyr Glu Gln Trp Thr Leu Gln Gln Ser Leu Glu Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Xaa
<210>322
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>322
Met Gly Ala Gln Gln Lys Phe Gln Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gln Thr
1               5                   10                  15
Leu Tyr Glu Gln Phe Met Leu Gln Gln Ala Leu Glu Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Xaa
<210>323
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>323
Met Gly Ala Gln Gln Glu Tyr Glu Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu Thr
1               5                   10                  15
Leu Tyr Asn Gln Trp Met Phe His Gln Arg Leu Glu Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Xaa
<210>324
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>324
Met Gly Ala Gln Val Lys Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu Ile
1               5                   10                  15
Leu Tyr Glu Gln Gln Thr Phe Gln Glu Arg Leu Glu Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Xaa
<210>325
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>325
Met Gly Ala Gln Thr Lys Phe Gln Pro Leu Asp Glu Leu Asp Gln Thr
1               5                   10                  15
Leu Tyr Glu Gln Trp Thr Leu Gln Gln Arg Leu Glu Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Xaa
<210>326
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>326
Met Gly Ala Gln Thr Asn Phe Gln Pro Leu Asp Glu Leu Asp Gln Thr
1               5                   10                  15
Leu Tyr Glu Gln Trp Thr Leu Gln Gln Arg Leu Glu Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Xaa
<210>327
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<220>
<221>′misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>327
Met Gly Ala Gln Gln Asn Phe Lys Pro Met Asp Glu Leu Glu Asp Thr
1               5                   10                  15
Leu Tyr Lys Gln Phe Leu Phe Gln His Ser Leu Glu Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Xaa
<210>328
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>328
Met Gly Ala Gln Val Lys Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu Trp
1               5                   10                  15
Leu Tyr His Gln Phe Thr Leu His His Gln Leu Glu Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Xaa
<210>329
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>329
Met Gly Ala Gln Tyr Lys Phe Thr Pro Leu Asp Asp Leu Glu Gln Thr
1               5                   10                  15
Leu Tyr Glu Gln Trp Thr Leu Gln His Val Leu Glu Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Xaa
<210>330
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>330
Met Gly Ala Gln Gln Asn Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Ala Thr
1               5                   10                  15
Leu Tyr Glu His Phe Ile Phe His Tyr Thr Leu Glu Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Xaa
<210>331
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>331
Met Gly Ala Gln Val Lys Phe Lys Pro Leu Asp Ala Leu Glu Gln Thr
1               5                   10                  15
Leu Tyr Glu His Trp Met Phe Gln Gln Ala Leu Glu Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Xaa
<210>332
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>332
Met Gly Ala Gln Glu Asp Tyr Met Pro Leu Asp Ala Leu Asp Ala Gln
1               5                   10                  15
Leu Tyr Glu Gln Phe Ile Leu Leu His Gly Leu Glu Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Xaa
<210>333
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>333
Met Gly Ala Gln Tyr Lys Phe Asn Pro Met Asp Glu Leu Glu Gln Thr
1               5                   10                  15
Leu Tyr Glu Glu Phe Leu Phe Gln His Ala Leu Glu Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Xaa
<210>334
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_fea ture
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>334
Met Gly Ala Gln Ser Asn Phe Met Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gln Thr
1               5                   10                  15
Leu Tyr Glu Gln Phe Met Leu Gln His Gln Leu Glu Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Xaa
<210>335
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>335
Met Gly Ala Gln Gln Lys Phe Gln Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr
1               5                   10                  15
Leu Tyr Lys Gln Trp Thr Leu Gln Gln Arg Leu Glu Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Xaa
<210>336
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>336
Met Gly Ala Gln Gln Lys Phe Met Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu Ile
1               5                   10                  15
Leu Tyr Glu Gln Phe Met Phe Gln Gln Ser Leu Glu Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Xaa
<210>337
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>337
Met Gly Ala Gln Thr Lys Phe A sn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gln Thr
1               5                   10                  15
Leu Tyr Glu Gln Trp Thr Leu Gln Hi s Gln Leu Glu Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Xaa
<210>338
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>338
Met Gly Ala Gln His Thr Phe Gln Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr
1               5                   10                  15
Leu Tyr Tyr Gln Trp Leu Tyr Asp Gln Leu Leu Glu Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Xaa
<210>339
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>339
Met Gly Ala Gln Gln Lys Phe Lys Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gln Thr
1               5                   10                  15
Leu Tyr Glu Gln Trp Thr Leu Gln Gln Arg Leu Glu Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Xaa
<210>340
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>340
Met Gly Ala Gln Gln Thr Phe Gln Pro Leu Asp Asp Leu Glu Glu Tyr
1               5                   10                  15
Leu Tyr Glu Gln Trp Ile Arg Arg Tyr His Leu Glu Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Xaa
<210>341
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Fc
<400>341
Met Gly Ala Gln Ser Lys Phe Lys Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gln Thr
1               5                   10                  15
Leu Tyr Glu Gln Trp Thr Leu Gln His Ala Leu Glu Gly Gly Gly Gly
20                  25                  30
Gly Xaa
<210>342
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>342
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Ser Gly Gln Leu Arg Pro Cys
1               5                   10                  15
Glu Glu Ile Phe Gly Cys Gly Thr Gln Asn Leu Ala Leu Leu Glu
            20                  25                  30
<210>343
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>343
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Ala Gly Gly Met Arg Pro Tyr
1               5                   10                  15
Asp Gly Met Leu Gly Trp Pro Asn Tyr Asp Val Gln Ala Leu Glu
            20                  25                  30
<210>344
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>344
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gly Gln Asp Leu Arg Pro Cys
1               5                   10                  15
Glu Asp Met Phe Gly Cys Gly Thr Lys Asp Trp Tyr Gly Leu Glu
            20                  25                  30
<210>345
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>345
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Ala Pro Gly Gln Arg Pro Tyr
1               5                   10                  15
Asp Gly Met Leu Gly Trp Pro Thr Tyr Gln Arg Ile Val Leu Glu
            20                  25                  30
<210>346
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>346
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gln Thr Trp Asp Asp Pro Cys
1               5                   10                  15
Met His Ile Leu Gly Pro Val Thr Trp Arg Arg Cys Ile Leu Glu
            20                  25                  30
<210>347
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>347
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Phe Gly Asp Lys Arg Pro Leu
1               5                   10                  15
Glu Cys Met Phe Gly Gly Pro Ile Gln Leu Cys Pro Arg Leu Glu
            20                  25                  30
<210>348
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>348
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Lys Arg Pro Cys Glu Glu Ile
1               5                   10                  15
Phe Gly Gly Cys Thr Tyr Gln Leu Glu
            20                  25
<210>349
<211>31
<212>PRT    
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>349
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Leu Gln Glu Trp Cys Glu Gly
1               5                   10                  15
Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Glu Lys Gln Arg Leu Glu
            20                  25                  30
<210>350
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>350
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Met Leu Asp Tyr Cys Glu Gly
1               5                   10                  15
Met Asp Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Asp Lys Gln Met Leu Glu
            20                  25                  30
<210>351
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>351
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln His Gln Glu Tyr Cys Glu Gly
1               5                   10                  15
Met Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Glu Tyr Gln Gly Leu Glu
            20                  25                  30
<210>352
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>352
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Leu Gln Asp Tyr Cys Glu Gly
1               5                   10                  15
Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Glu Asn Gln Arg Leu Glu
            20                  25                  30
<210>353
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>353
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Leu Leu Asp Tyr Cys Glu Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Glu Asn Leu Asp Leu Glu
            20                  25                  30
<210>354
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>354
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gly Phe Glu Tyr Cys Asp Gly
1               5                   10                  15
Met Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Asp Lys Gln Thr Leu Glu
            20                  25                  30
<210>355
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>355
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Ala Gln Asp Tyr Cys Glu Gly
1               5                   10                  15
Met Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Glu Met Gln Lys Leu Glu
            20                  25                  30
<210>356
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>356
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Leu Gln Asp Tyr Cys Glu Gly
1               5                   10                  15
Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Glu Lys Gln Arg Leu Glu
            20                  25                  30
<210>357
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>357
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Lys Leu Glu Tyr Cys Asp Gly
1               5                   10                  15
Met Glu Asp Pro Phe Thr Gln Gly Cys Asp Asn Gln Ser Leu Glu
            20                  25                  30
<210>358
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的肽抗体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Fc
<400>358
Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Phe Asp Tyr Cys Glu Gly Val
1               5                   10                  15
Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Asp Asn His Leu Glu
            20                  25
<210>359
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>能结合Ang-2的多肽
<400>359
Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Thr Asn Phe Met Pro Met Asp Asp
1               5                   10                  15
Leu Glu Gln Arg Leu Tyr Glu Gln Phe Ile Leu Gln Gln Gly Leu Glu
            20                  25                  30

Claims (37)

1.能结合Ang-2的多肽及其生理可接受盐，其中所述多肽包括氨基酸序列
WDPWT
(SEQ ID NO：65)
并且其中所述多肽长度是5-50个氨基酸。
2.能结合Ang-2的多肽及其生理可接受盐，其中所述多肽包括氨基酸序列
WDPWTC
(SEQ ID NO：66)。
3.能结合Ang-2的多肽及其生理可接受盐，其中所述多肽包括氨基酸序列
Cz2WDPWT
(SEQ ID NO：67)
其中z2是酸性或中性极性氨基酸残基。
4.权利要求3的多肽及其生理可接受盐，其中所述多肽进一步包括氨基酸序列
Cz2WDPWTC
(SEQ ID NO：68)
其中z2是酸性或中性极性氨基酸残基。
5.能结合Ang-2的多肽及其生理可接受盐，所述多肽包括下式的氨基酸序列：
a1a2a3Ca5WDPWTCa12a13a14
(SEQ ID NO：69)
其中：
a1，a2，和a3各自独立地是氨基酸残基；
a5是氨基酸残基；
a12不存在或者是氨基酸残基；
a13不存在或者是中性疏水性，中性极性的，或者碱性氨基酸残基；
a14是中性疏水性或中性极性氨基酸残基。
6.权利要求5的多肽及其生理可接受盐，其中
a1是V，I，P，W，G，S，Q，N，E，K，R，或H；
a2是V，P，M，G，S，Q，D，E，K，R，或H；
a3是A，V，P，M，F，T，G，D，E，K，或H；
a8是A，V，G，Q，N，D，或E；
a12是S，Q，N，D，E，K，或R；
a13是L，T，或H；和
a14是V，L，I，W，或M。
7.权利要求5的多肽及其生理可接受盐，其中，
a1是Q；
a2是E；
a3是E；
a5是D或E；
a12是D或E；
a13是H；和
a14是M。
8.能结合Ang-2的多肽及其生理可接受盐，所述多肽包括下式氨基酸序列：
b1b2b3b4b5b6Cb8WDPWTCb15b16b17b18b19b20
(SEQ ID NO：70)
其中：
b1不存在或者是氨基酸残基；
b2不存在或者是中性疏水的，中性极性的，或者碱性氨基酸残基；
b3，b4，b5，和b6各自独立地不存在或者是氨基酸残基；
b8是氨基酸残基；
b15不存在或者是氨基酸残基；
b16不存在或者是中性疏水的，中性极性的，或者碱性氨基酸残基；
b17不存在或者是中性疏水的或中性极性氨基酸残基；
b18，b19，和b20各自独立地不存在或者是氨基酸残基。
9.权利要求8的多肽及其生理可接受盐，其中：
b1不存在，或者是A，V，L，P，W，F，T，G，S，Q，N，K，R，或H；
b2不存在，或者是A，V，L，I，P，W，M，T，G，S，Y，N，K，R，或H；
b3不存在，或者是A，L，I，P，W，M，T，G，S，Q，N，E，R，或H；
b4是V，I，P，W，G，S，Q，N，E，K，R，或H；
b5是V，P，M，G，S，Q，D，E，K，R，或H；
b6是A，V，P，M，F，T，G，D，E，K，或H；
b8是A，V，G，Q，N，D，或E；
b15是S，Q，N，D，E，K，或R；
b16是L，T，或H；
b17是V，L，I，W，或M；
b18不存在，或者是A，V，L，P，W，F，T，G，Y，Q，D，E，或R；
b19不存在，或者是V，L，I，P，T，G，S，Y，Q，N，D，E，或R；和
b20不存在，或者是V，L，P，W，M，T，G，S，Y，Q，N，D，K，或R。
10.权利要求8的多肽及其生理可接受盐，其中，
b1不存在，或者是P，或T；
b2不存在，或者是I，或N；
b3不存在，或者是R，或I；
b4是Q；
b5是E；
b6是E；
b8是D或E；
b15是D或E；
b16是H；
b17是M；
b18不存在，或W，或P；
b19不存在，或G，或E；并且
b20不存在，或V，或K。
11.包括选自SEQ ID NO：4，和SEQ ID NO：76至SEQ ID NO：118的至少一种氨基酸序列的多肽及其生理可接受盐，其中所述多肽能结合Ang-2；
  肽   SEQ ID NO.   肽序列 Con4-44   76 PIRQEECDWDPWTCEHMWEV   Con4-40   77   TNIQEECEWDPWTCDHMPGK Con4-4   78 WYEQDACEWDPWTCEHMAEV Con4-31   79   NRLQEVCEWDPWTCEHMENV Con4-C5   80   AATQEECEWDPWTCEHMPRS Con4-42   81 LRHQEGCEWDPWTCEHMFDW Con4-35   82 VPRQKDCEWDPWTCEHMYVG Con4-43   83   SISHEECEWDPWTCEHMQVG Con4-49   84   WAAQEECEWDPWTCEHMGRM Con4-27   85   TWPQDKCEWDPWTCEHMGST Con4-48   86 GHSQEECGWDPWTCEHMGTS   Con4-46   87   QHWQEECEWDPWTCDHMPSK
  肽   SEQ ID NO.   肽序列 Con4-41   88 NVRQEKCEWDPWTCEHMPVR Con4-36   89   KSGQVECNWDPWTCEHMPRN Con4-34   90   VKTQEHCDWDPWTCEHMREW Con4-28   91   AWGQEGCDWDPWTCEHMLPM Con4-39   92   PVNQEDCEWDPWTCEHMPPM Con4-25   93   RAPQEDCEWDPWTCAHMDIK Con4-50   94   HGQNMECEWDPWTCEHMFRY Con4-38   95   PRLQEECVWDPWTCEHMPLR Con4-29   96   RTTQEKCEWDPWTCEHMESQ Con4-47   97   QTSQEDCVWDPWTCDHMVSS Con4-20   98   QVIGRPCEWDPWTCEHLEGL Con4-45   99   WAQQEECAWDPWTCDHMVGL Con4-37   100   LPGQEDCEWDPWTCEHMVRS
  肽   SEQ ID NO.   肽序列 Con4-33   101   PMNQVECDWDPWTCEHMPRS AC2-Con4   102   FGWSHGCEWDPWTCEHMGST Con4-32   103   KSTQDDCDWDPWTCEHMVGP Con4-17   104   GPRISTCQWDPWTCEHMDQL   Con4-8   105   STIGDMCEWDPWTCAHMQVD   AC4-Con4   106   VLGGQGCEWDPWTCRLLQGW   Con4-1   107   VLGGQGCQWDPWTCSHLEDG   Con4-C1   108   TTIGSMCEWDPWTCAHMQGG   Con4-21   109 TKGKSVCQWDPWTCSHMQSG   Con4-C2   110   TTIGSMCQWDPWTCAHMQGG   Con4-18   111   WVNEVVCEWDPWTCNHWDTP Con4-19   112   VVQVGMCQWDPWTCKHMRLQ Con4-16   113   AVGSQTCEWDPWTCAHLVEV   Con4-11   114   QGMKMFCEWDPWTCAHIVYR   Con4-C4   115   TTIGSMCQWDPWTCEHMQGG   Con4-23   116   TSQRVGCEWDPWTCQHLTYT
  肽   SEQ ID NO.   肽序列 Con4-15   117   QWSWPPCEWDPWTCQTVWPS   Con4-9   118   GTSPSFCQWDPWTCSHMVQG   TN8-Con4   4   QEECEWDPWTCEHM
。
12.包括权利要求1，5，8或11的至少一种肽和载体的融合多肽及其生理可接受盐，其中所述融合多肽能结合Ang-2。
13.权利要求12的融合多肽，其中所述载体是Fc结构域，聚乙二醇，脂质，胆固醇基团，糖类，和寡糖中的至少一种。
14.权利要求1，5，8或11的多肽，其是环状的。
15.权利要求1，5，8或11的多肽的二聚体或多聚体。
16.能结合Ang-2的多肽及其生理可接受盐，所述多肽包括SEQID NO：25的氨基酸序列.
17.权利要求16的多肽，其中SEQ ID NO：25的Fc为人IgG1的Fc。
18.权利要求17的多肽，其中SEQ ID NO：25的Fc的氨基酸序列为SEQ ID NO：60。
19.权利要求16的多肽及其生理可接受盐，其中所述多肽由SEQ IDNO：25的氨基酸序列组成。
20.权利要求19的多肽，其中SEQ ID NO：25的Fc的氨基酸序列为SEQ ID NO：60。
21.一种编码权利要求16-20任一项的多肽的多核苷酸。
22.权利要求21的多核苷酸，其为SEQ ID NO：46.
23.一种包含权利要求21或22的多核苷酸的表达载体。
24.一种包含权利要求23的表达载体的宿主细胞。
25.权利要求24的宿主细胞，其中所述细胞为原核细胞。
26.权利要求25的宿主细胞，其中所述细胞为大肠杆菌细胞。
27.权利要求24的宿主细胞，其中所述细胞为真核细胞。
28.一种含有与其药学可接受载体混合的有效量的权利要求16-20任一项的多肽的药物组合物。
29.一种抑制哺乳动物血管发生的方法，包括施用治疗有效量的权利要求16-20任一项的多肽。
30.一种治疗受试者血管发生的方法，包括施用治疗有效量的权利要求16-20任一项的多肽。
31.一种调节哺乳动物血管发生的方法，包括施用治疗有效量的权利要求16-20任一项的多肽。
32.一种抑制哺乳动物中以不需要的血管发生为特征的肿瘤生长的方法，包括施用治疗有效量的权利要求16-20任一项的多肽。
33.一种治疗哺乳动物癌症的方法，包括施用治疗有效量的权利要求16-20任一项的多肽和化疗药物。
34.权利要求33的方法，其中所述化疗药物是5-FU，CPT-11和脱乙酰基紫杉醇中的至少一种。
35.一种调节哺乳动物血管渗透性或血浆渗漏中至少一种的方法，包括施用治疗有效量的权利要求16-20任一项的多肽。
36.一种治疗哺乳动物中以下病症中的至少一种的方法：眼新血管病，成血管瘤，血管瘤，炎性疾病，慢性炎性紊乱，子宫内膜异位，肿瘤性疾病，骨相关疾病，或者牛皮癣，包括施用治疗有效量的权利要求16-20任一项的多肽。
37.权利要求36的方法，其中所述炎性疾病为关节炎。
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