CN101802182A - 用于诊断、预后和治疗方法的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于诊断、预后和确定治疗方法的方法和组合物。样品(例如临床样品)中细胞的生理状态可用于在患者的疗法选择中诊断或预后病症(例如慢性淋巴细胞性白血病)，以监控治疗和修改或优化治疗方案。细胞的生理状态可通过比较该细胞(例如癌细胞)中的与另一细胞(例如正常细胞)中的一个或多个激活元件(例如信号传导分子的磷酸化状态)的细胞内状态而确定。细胞的生理状态可通过在被讨论的细胞中加入一个或多个调节剂(例如抑制剂或激活剂)而进一步分类。在一些实施方式中，本发明涉及确定细胞群表型谱的方法。

Description

用于诊断、预后和治疗方法的方法
本申请要求于2007年8月21日提交的美国临时申请序列号为60/957,160和于2008年4月29日提交的美国临时申请序列号为61/048,920的优先权，其全部内容通过引用方式结合于本文中。
背景技术
许多病症是以细胞途径的破坏为特征的，该破坏能导致比如细胞过程的异常控制或非控制的细胞生长和增殖。这些破坏经常是由参与细胞途径的分子的活性的变化导致的。例如，已在许多癌症中发现了特定的信号传导途径的改变。尽管更多的证据表明细胞途径中的破坏会介导有害转化，但是这些转化背后的具体分子事件还未被阐明。因此在治疗涉及未被很好理解的细胞途径的病症时，治疗法不一定有效。因此，对病症的成功诊断以及疗法的使用需要具有对应病症病理学的细胞事件的知识。
此外，患有不同病症的患者可能接受不同的临床过程。例如，对于癌症患者，即使在同一个临床过程之后，治疗中仍然存在着惊人的临床变化性。一些白血病患者在延长的无确定的治疗过程后仍存活，而另外一些却在高强度的治疗后迅速死亡。无论耐药何时发生，对治疗有耐药性的患者具有非常短的存活时间。尽管已发展出不同的分期体系来阐释这种临床多相性，但是它们还是不能精确地预测是否早期或中期患者会经历无痛或侵袭性的疾病过程。
因此，需要预测个体疾病过程的可靠的指示剂，以帮助临床医生识别那些对治疗有响应的患者、进展到疾病后期的患者和对治疗形成耐药性的患者。
发明内容
本发明的方法和组合物的其它目的、特征和优点会在如下描述后更加明显。然而应该理解的是，由于本领域普通技术人员通过本文的具体描述将会明确在本发明的精神和范围内做出的各种改变和修改，因而在表明本发明的具体实施方式时，具体描述和特定例子仅通过示例性的方式给出。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用方式结合在本文中，就好像各出版物或专利申请均通过引用方式特别和分别结合于本文中一样。
本文涉及一种分类细胞的方法，其包括将所述细胞与抑制剂相接触，确定在细胞中是否存在可激活元件的激活水平的变化，和基于是否存在可激活元件的激活水平的变化来对细胞进行分类。在一些实施方式中，可激活元件的激活水平的变化为可激活元件的激活水平的增加。在一些实施方式中，可激活元件为可被磷酸化或去磷酸化的蛋白质。
在本方法的一些实施方式中，本发明提供一种通过将细胞与抑制剂相接触、确定细胞中多个可激活元件的激活水平和基于该激活水平对细胞进行分类来分类细胞的方法。在一些实施方式中，抑制剂为激酶或磷酸酶抑制剂，例如adaphostin、AG 490、AG 825、AG 957、AG 1024、aloisine、aloisine A、alsterpaullone、aminogenistein、API-2、芹菜素、牛蒡子素、AY-22989、BAY 61-3606、双吲哚马来酰亚胺IX、白屈菜红碱、盐酸10-[4′-(N，N-二乙氨基)丁基]-2-氯代吩噁嗪、达沙替尼、2-二甲氨基-4，5，6，7-四溴代-1H-苯并咪唑、二盐酸5，7-二甲氧基-3-(4-吡啶基)喹啉、依地福新、鞣花酸、enzastaurin、ER 27319马来酸盐、埃罗替尼、ET18OCH3、法舒地尔、flavopiridol、吉非替尼、GW 5074、H-7、H-8、H-89、HA-100、HA-1004、HA-1077、HA-1100、羟基法舒地尔、靛红-3’-肟、5-碘代杀结核菌素、kenpaullone、KN-62、KY12420、LFM-A13、薰草菌素A、木犀草素、LY-294002、LY294002、楸毒素、ML-9、NSC-154020、NSC-226080、NSC-231634、NSC-664704、NSC-680410、NU6102、奥罗莫星、羟吲哚I、PD-153035、PD-98059、PD 169316、根皮素、根皮苷、云鞣杉醇(piceatannol)、鬼臼苦素、PKI、PP1、PP2、purvalanol A、槲皮素、R406、R788、雷帕鸣、雷帕霉素、Ro 31-8220、roscovitine、粗糠柴毒、SB202190、SB203580、西罗莫司、索拉非尼、SL327、SP600125、十字孢碱、STI-571、SU-11274、SU1498、SU4312、SU6656、4，5，6，7-四溴代三唑、TG101348、曲西立滨、Tyrphostin AG 490、Tyrphostin AG 825、Tyrphostin AG 957、Tyrphostin AG 1024、Tyrphostin SU1498、U0126、VX-509、VX-667、VX-680、W-7、沃特曼宁、XL-019、XL-147、XL-184、XL-228、XL-281、XL-518、XL-647、XL-765、XL-820、XL-844、XL-880、Y-27632、ZD-1839、ZM-252868、ZM-447439、H2O2、siRNA、miRNA、斑蝥素、(-)-对溴四咪唑((-)-p-Bromotetramisole)、微囊藻素LR、原钒酸钠、过钒酸钠、硫酸氧钒、氧代二过氧(1，10-菲咯啉)钒酸钠、联麦芽酚氧钒(IV)、钼酸钠、过钼酸钠、酒石酸钠、咪唑、氟化钠、β-甘油磷酸酯、十水焦磷酸盐钠、花萼海绵诱癌素A、Discodermia calyx、bpV(phen)、mpV(pic)、DMHV、氯氰菊酯、Dephostatin、冈田酸、NIPP-1、N-(9，10-二氧代-9，10-二氢-菲-2-基)-2，2-二甲基-丙酰氨、α-溴代-4-羟基苯乙酮、4-羟基苯甲酰甲基溴、α-溴代-4-甲氧基苯乙酮、4-甲氧基苯甲酰甲基溴、α-溴代-4-(羧基甲氧基)苯乙酮、4-(羧基甲氧基)苯甲酰甲基溴、和双(4-三氟甲基磺酰氨基苯基)-1，4-二异丙基苯、氧化苯砷、吡咯烷二硫代氨基甲酸或氟化铝。在一些实施方式中，磷酸酶抑制剂为H2O2。
在一些实施方式中，细胞为造血源性细胞。在一些实施方式中，造血源性细胞选自多功能造血干细胞、B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞、T淋巴细胞系祖细胞或分化细胞、NK细胞系祖细胞或分化细胞、粒细胞系祖细胞或分化细胞、单核细胞系祖细胞或分化细胞、巨核细胞系祖细胞或分化细胞和红细胞系祖细胞或分化细胞。在一些实施方式中，造血源性细胞为B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞，例如，早期原B细胞、晚期原B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、浆细胞和记忆B细胞、CD5+B细胞、CD38+B细胞、包含B细胞受体重链突变或非突变的B细胞或表达Zap70的B细胞。
在一些实施方式中，分类包括将细胞作为与临床结果相关的细胞进行分类。在一些实施方式中，临床结果为病症的预后和/或诊断。在一些实施方式中，临床结果为是否存在瘤形成或造血病症，例如非霍奇金淋巴瘤、霍奇金或其它淋巴瘤、急性或慢性白血病、红细胞增多症、血小板增多症、多发性骨髓瘤或浆细胞异常(例如淀粉样变性和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、骨髓增生紊乱、骨髓增生障碍、骨髓纤维化或非典型免疫淋巴细胞增生。在一些实施方式中，瘤形成或造血病症为非B细胞系源性的，例如急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、非B细胞急性骨髓性白血病(ALL)、非B细胞淋巴瘤、骨髓增生紊乱、骨髓增生障碍、骨髓纤维化、红细胞增多症、血小板增多症或非B细胞非典型免疫淋巴细胞增生。在一些实施方式中，瘤形成或造血病症是B细胞或B细胞系源性异常，例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B淋巴细胞系白血病、B淋巴细胞系淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞幼淋巴细胞性白血病、前体B淋巴母细胞性白血病、毛细胞性白血病或浆细胞异常(例如淀粉样变性或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、B细胞淋巴瘤(包括但不局限于弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、小细胞淋巴性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤)。在一些实施方式中，病症为CLL。在一些实施方式中，CLL由共表达CD5及CD19和CD23或CD5及CD20和CD23的单克隆B细胞群限定，或由表面免疫球蛋白的表达限定。
在一些实施方式中，临床结果为瘤形成或造血病症的分期或分级。本专利提供的方法中分期的例子包括侵袭性、无痛、良性、顽固性、罗马数字分期、TNM分期、Rai分期、Binet分期、WHO分类、FAB分类、IPSS评分、WPSS评分、局限期、扩散期、根据如ZAP70和CD38的细胞标记的分期、隐性，其包括能够及时传达恶化、无恶化存活率、整体存活率和无意外存活率的信息。
在本发明方法的一些实施方式中，基于可激活元件的激活水平的细胞分类包括将细胞作为与患者对治疗的响应(例如完全响应、部分响应、结节性部分响应、无响应、疾病的进行、疾病的稳定、复发或副作用)相关的细胞进行分类。本方法还包括确定治疗方法，例如化疗、生物疗法、放射疗法、骨髓移植、外周干细胞移植、脐带血移植、自体干细胞移植、异基因干细胞移植、同基因干细胞移植、手术、诱导治疗、维持治疗、观察等待治疗或整体/替代疗法。
在本发明方法的一些实施方式中，基于激活水平的细胞分类包括将细胞作为与微小残留病(minimal residual disease)或形成耐药性相关的细胞进行分类。
在本发明的一些实施方式中，细胞中多个可激活元件的激活水平选自细胞外或细胞内蛋白酶产生的裂解、新型杂低聚物生成、糖基化水平、磷酸化水平、乙酰化水平、甲基化水平、生物素化水平、谷氨酰化水平、甘氨酰化水平、羟基化水平、异构化水平、异戊烯化水平、豆蔻酰化水平、脂化水平、磷酸泛酰巯基乙胺化水平、硫酸化水平、ISG化水平、亚硝基化水平、棕榈酰化水平、SUMO化水平、遍在蛋白化水平、类泛素化水平、瓜氨酸化水平、脱酰胺化水平、二硫键形成水平、蛋白水解水平、异位水平、蛋白质转化的变化、多蛋白复合体水平、氧化水平、多脂复合体和细胞膜的生物化学改变。在一些实施方式中，激活水平为磷酸化水平。在一些实施方式中，可激活元件选自蛋白质、碳水化合物、脂类、核酸和代谢产物。在一些实施方式中，可激活元件为蛋白质。在一些实施方式中，可激活元件为代谢状态、温度或局部离子浓度的改变。在可激活元件为蛋白质的实施方式中，一些实施方式中该蛋白质为可被磷酸化或脱磷酸化的蛋白质，例如激酶、磷酸酶、衔接/支架蛋白、遍在蛋白酶、黏附分子、收缩蛋白、细胞骨架蛋白、异源三聚体G蛋白、小分子量GTPases、鸟嘌呤核苷酸交换因子、GTPase活化蛋白、半胱天冬酶和参与细胞凋亡的蛋白质(例如PARP)、离子通道、分子运载体、分子侣伴蛋白、代谢酶、小泡运输蛋白、羟化酶、异构酶、转运酶、脱乙酰基酶、甲基化酶、脱甲基酶、蛋白酶、酯化酶、水解酶、DNA结合蛋白或转录因子。在一些实施方式中，蛋白质选自PI3-激酶(p85、p110a、p110b、p110d)、Jak1、Jak2、SOCs、Rac、Rho、Cdc42、Ras-GAP、Vav、Tiam、Sos、Dbl、Nck、Gab、PRK、SHP1和SHP2、SHIP1、SHIP2、sSHIP、PTEN、Shc、Grb2、PDK1、SGK、Akt1、Akt2、Akt3、TSC1，2、Rheb、mTor、4EBP-1、p70S6激酶、S6、LKB-1、AMPK、PFK、乙酰辅酶A羧化酶、DokS、Rafs、Mos、Tpl2、MEK1/2、MLK3、TAK、DLK、MKK3/6、MEKK1，4、MLK3、ASK1、MKK4/7、SAPK/JNK1，2，3、p38s、Erk1/2、Syk、Btk、BLNK、LAT、ZAP70、Lck、Cbl、SLP-76、PLCγ1、PLCγ2、STAT1、STAT 3、STAT 4、STAT 5、STAT 6、FAK、p130CAS、PAKs、LIMK1/2、Hsp90、Hsp70、Hsp27、SMADs、Rel-A(p65-NFκB)、CREB、组蛋白H2B、HATs、HDACs、PKR、Rb、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、P16、p14Arf、p27KIP、p21CIP、Cdk4、Cdk6、Cdk7、Cdk1、Cdk2、Cdk9、Cdc25，A/B/C、Abl、E2F、FADD、TRADD、TRAF2、RIP、Myd88、BAD、Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、PARP、IAPs、Smac、胞衬蛋白、肌动蛋白、Src、Lyn、Fyn、Lck、NIK、IκB、p65(RelA)、IKKα、PKA、PKCα、PKCβ、PKCθ、PKCδ、CAMK、Elk、AFT、Myc、Egr-1、NFAT、ATF-2、Mdm2、p53、DNA-PK、Chk1、Chk2、ATM、ATR、β-连环蛋白、CrkL、GSK3α、GSK3β和FOXO。在一些实施方式中，蛋白质选自Erk、Syk、Zap70、Lck、Btk、BLNK、Cbl、PLCγ2、Akt、RelA、p38、S6。在一些实施方式中，蛋白质为S6。
在一些实施方式中，蛋白质选自HER受体、PDGF受体、Kit受体、FGF受体、Eph受体、Trk受体、IGF受体、胰岛素受体、Met受体、Ret、VEGF受体、TIE1、TIE2、FAK、Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、Src、Lyn、Fyn、Lck、Fgr、Yes、Csk、Abl、Btk、ZAP70、Syk、IRAKs、cRaf、ARaf、BRAF、Mos、Lim激酶、ILK、Tpl、ALK、TGFβ受体、BMP受体、MEKKs、ASK、MLKs、DLK、PAKs、Mek1、Mek2、MKK3/6、MKK4/7、ASK1、Cot、NIK、Bub、Myt1、Wee1、酪蛋白激酶、PDK1、SGK1、SGK2、SGK3、Akt1、Akt2、Akt3、p90Rsks、p70S6激酶、Prks、PKCs、PKAs、ROCK 1、ROCK 2、Auroras、CaMKs、MNKs、AMPKs、MELK、MARKs、Chk1、Chk2、LKB-1、MAPKAPKs、Pim1、Pim2、Pim3、IKKs、Cdks、Jnks、Erks、IKKAs、GSK3α、GSK3β、Cdks、CLKs、PKR、PI3-激酶1型、2型、3型、mTor、SAPK/JNK1，2，3、p38s、PKR、DNA-PK、ATM、ATR、受体蛋白酪氨酸磷酸酶(RPTPs)、LAR磷酸酶、CD45、非受体酪氨酸磷酸酶(NPRTPs)、SHPs、MAP激酶磷酸酶(MKPs)、双重特异性磷酸酶(DUSPs)、CDC25磷酸酶、低分子量酪氨酸磷酸酶、Eyes absent(EYA)酪氨酸磷酸酶、丝切蛋白磷酸酶(SSH)、丝氨酸磷酸酶、PP2A、PP2B、PP2C、PP1、PP5、肌醇磷酸酶、PTEN、SHIPs、肌管素、磷酸肌醇激酶、磷脂酶、前列腺素合成酶、5-脂肪氧化酶、鞘氨醇激酶、神经鞘磷脂酶、衔接/支架蛋白、Shc、Grb2、BLNK、LAT、PI3-激酶B细胞衔接蛋白(BCAP)、SLAP、Dok、KSR、MyD88、Crk、CrkL、GAD、Nck、Grb2结合相关蛋白(GAB)、Fas死亡区相关蛋白(FADD)、TRADD、TRAF2、RIP、T细胞白血病家族、IL-2、IL-4、IL-8、IL-6、干扰素γ、干扰素α、细胞因子信号传导阻抑蛋白(SOCs)、Cbl、SCF遍在蛋白连接酶复合体、APC/C、黏附分子、整合素、类免疫球蛋白黏附分子、选择素、钙粘蛋白、连环蛋白、成簇黏附激酶、p130CAS、胞衬蛋白、肌动蛋白、桩蛋白、肌球蛋白、肌球蛋白结合蛋白、微管蛋白、eg5/KSP、CENPs、β-肾上腺素能受体、毒蕈碱受体、腺苷酸环化酶受体、小分子量GTPases、H-Ras、K-Ras、N-Ras、Ran、Rac、Rho、Cdc42、Arfs、RABs、RHEB、Vav、Tiam、Sos、Dbl、PRK、TSC1，2、Ras-GAP、Arf-GAPs、Rho-GAPs、半胱天冬酶、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、PARP、Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL、Bcl-w、Bcl-B、A1、Bax、Bak、Bok、Bik、Bad、Bid、Bim、Bmf、Hrk、Noxa、Puma、IAPs、XIAP、Smac、Cdk4、Cdk 6、Cdk 2、Cdk1、Cdk 7、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、Rb、p16、p14Arf、p27KIP、p21CIP、分子侣伴蛋白、Hsp90s、Hsp70、Hsp27、代谢酶、乙酰辅酶A羧化酶、ATP柠檬酸裂解酶、一氧化氮合酶、小窝蛋白、转运必须的内吞分选复合物(ESCRT)蛋白、泡状蛋白分选蛋白(Vsps)、羟化酶、脯氨酰羟化酶PHD-1，2和3、天冬酰胺羟化酶FIH转运酶、Pin1脯氨酰异构酶、拓扑异构酶、脱乙酰基酶、组蛋白脱乙酰基酶、去乙酰化酶(sirtuin)、组蛋白乙酰化酶、CBP/P300家族、MYST家族、ATF2、DNA甲基转移酶、组蛋白H3K4脱甲基酶、H3K27、JHDM2A、UTX、VHL、WT-1、p53、Hdm、PTEN、遍在蛋白酶、尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)和uPA受体(uPAR)体系、组织蛋白酶、金属蛋白酶、酯酶、水解酶、分离酶、钾离子通道、钠离子通道、多重耐药蛋白、P-糖蛋白、核苷转运酶、Ets、Elk、SMADs、Rel-A(p65-NFKB)、CREB、NFAT、ATF-2、AFT、Myc、Fos、Spl、Egr-1、T-bet、β-连环蛋白、HIFs、FOXOs、E2Fs、SRFs、TCFs、Egr-1、
Figure GPA00001061269400081
连环蛋白、FOXO STAT1、STAT 3、STAT 4、STAT5、STAT 6、p53、WT-1、HMGA、pS6、4EPB-1、eIF4E结合蛋白、RNA聚合酶、起始因子、延伸因子。
在一些实施方式中，本发明提供了通过将调节剂或抑制剂施用于个体细胞来确定个体是否存在病症、确定细胞中可激活元件的激活水平和基于激活水平来确定是否存在病症的方法。在一些实施方式中，细胞为造血源性细胞。在一些实施方式中，造血源性细胞选自多功能造血干细胞、B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞、T淋巴细胞系祖细胞或分化细胞、NK细胞系祖细胞或分化细胞、粒细胞系祖细胞或分化细胞、单核细胞系祖细胞或分化细胞、巨核细胞系祖细胞或分化细胞和红细胞系祖细胞或分化细胞。在一些实施方式中，造血源性细胞为B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞，例如，早期原B细胞、晚期原B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、浆细胞和记忆B细胞、CD5+B细胞、CD38+B细胞、包含B细胞受体重链突变或非突变的B细胞、或表达Zap70的B细胞。在一些实施方式中，病症为瘤形成或造血病症。
在本发明方法的一些实施方式中，施用于细胞的调节剂为激活剂或抑制剂。在一些实施方式中，调节剂为例如生长因子、细胞因子、黏附分子调节剂、激素、小分子、多核苷酸、抗体、天然化合物、内酯、化疗试剂、免疫调节剂、碳水化合物、蛋白酶、离子、活性氧族或辐射。在一些实施方式中，调节剂为B细胞受体调节剂，例如，如B细胞受体交联复合物或B细胞辅助受体复合物的B细胞受体激活剂。在一些实施方式中，交联剂为抗体或分子结合体。在一些实施方式中，交联剂为抗体，例如多价抗体。在一些实施方式中，抗体为一价、二价或多价抗体，更多价态通过连接在固体表面或栓在纳米颗粒表面以增强抗原决定部位结合域的局部化合价。在一些实施方式中，交联剂为分子结合体，例如通过复合物中的碳水化合物或抗原决定部位作用在或连接在B细胞受体复合物上的实体。在一些实施方式中，分子结合体为单价、二价或多价结合体，更多价态通过连接在固体表面或栓在纳米颗粒表面以增强抗原决定部位结合域的局部化合价。在一些调节剂为B细胞受体调节剂(例如，如B细胞受体复合物或B细胞辅助受体复合物交联剂的B细胞受体激活剂)的实施方式中，交联包括使抗体或分子结合体与细胞相结合，然后通过细胞与固体表面的作用产生交联，该固体表面通过抗体或分子结合体与BCR复合物交联。在一些实施方式中，交联剂选自F(ab)2IgM、IgG、IgD、多克隆BCR抗体、单克隆BCR抗体、Fc受体衍生结合元件。Ig来自选自小鼠、山羊、兔、猪、大鼠、马、牛、鲨鱼、鸡或美洲驼中的一个物种。在一些实施方式中，交联剂为F(ab)2IgM、多克隆IgM抗体、单克隆IgM抗体、生物素化F(ab)2IgCM、生物素化多克隆IgM抗体、生物素化单克隆IgM抗体和/或其组合。
在一些实施方式中，抑制剂为激酶或磷酸酶抑制剂，例如adaphostin、AG 490、AG 825、AG 957、AG 1024、aloisine A、alsterpaullone、aminogenistein、API-2、芹菜素、牛蒡子素、AY-22989、BAY 61-3606、双吲哚马来酰亚胺IX、白屈菜红碱、10-[4′-(N，N-二乙氨基)丁基]-2-氯代吩噁嗪盐酸盐、达沙替尼、2-二甲氨基-4，5，6，7-四溴代-1H-苯并咪唑、5，7-二甲氧基-3-(4-吡啶基)喹啉二盐酸化物、依地福新、鞣花酸、enzastaurin、ER 27319马来酸盐、埃罗替尼、ET18OCH3、法舒地尔、flavopiridol、吉非替尼、GW 5074、H-7、H-8、H-89、HA-100、HA-1004、HA-1077、HA-1100、羟基法舒地尔、靛红-3’-肟、5-碘代杀结核菌素、kenpaullone、KN-62、KY12420、LFM-A13、薰草菌素A、木犀草素、LY-294002、LY294002、楸毒素、ML-9、NSC-154020、NSC-226080、NSC-231634、NSC-664704、NSC-680410、NU6102、奥罗莫星、羟吲哚I、PD-153035、PD-98059、PD 169316、根皮素、根皮苷、云鞣杉醇、鬼臼苦素、PKI、PP 1、PP2、purvalanol A、槲皮素、R406、R788、雷帕鸣、雷帕霉素、Ro 31-8220、roscovitine、粗糠柴毒、SB202190、SB203580、西罗莫司、索拉非尼、SL327、SP600125、十字孢碱、STI-571、SU-11274、SU1498、SU4312、SU6656、4，5，6，7-四溴代三唑、TG101348、曲西立滨、Tyrphostin AG490、Tyrphostin AG 825、Tyrphostin AG 957、Tyrphostin AG 1024、Tyrphostin SU1498、U0126、VX-509、VX-667、VX-680、W-7、沃特曼宁、XL-019、XL-147、XL-184、XL-228、XL-281、XL-518、XL-647、XL-765、XL-820、XL-844、XL-880、Y-27632、ZD-1839、ZM-252868、ZM-447439、H2O2、siRNA、miRNA、斑蝥素、(-)-对溴四咪唑、微囊藻素LR、原钒酸钠、过钒酸钠、硫酸氧钒、氧代二过氧(1，10-菲咯啉)钒酸钠、联麦芽酚氧钒(IV)、钼酸钠、过钼酸钠、酒石酸钠、咪唑、氟化钠、β-甘油磷酸酯、十水焦磷酸盐钠、花萼海绵诱癌素A、Discodermia calyx、bpV(phen)、mpV(pic)、DMHV、氯氰菊酯、Dephostatin、冈田酸、NIPP-1、N-(9，10-二氧代-9，10-二氢-菲-2-基)-2，2-二甲基-丙酰氨、α-溴代-4-羟基苯乙酮、4-羟基苯甲酰甲基溴、α-溴代-4-甲氧基苯乙酮、4-甲氧基苯甲酰甲基溴、α-溴代-4-(羧基甲氧基)苯乙酮、4-(羧基甲氧基)苯甲酰甲基溴、和双(4-三氟甲基磺酰氨基苯基)-1，4-二异丙基苯、氧化苯砷、吡咯烷二硫代氨基甲酸或氟化铝。在一些实施方式中，磷酸酶抑制剂为H2O2。
在本发明方法的一些实施方式中，对细胞施用B细胞受体激活剂和磷酸酶抑制剂或激酶抑制剂，例如F(ab)2IgM或生物素化F(ab)2IgM和磷酸酶抑制剂(例如H2O2)。
在一些实施方式中，本发明提供了通过将调节剂施用于细胞来确定细胞的非诱导性(tonic)信号传导状态、确定在细胞内参与非诱导性信号传导途径的可激活元件的激活水平和基于激活水平来确定细胞中非诱导性信号传导途径的状态的方法。在一些实施方式中，个体的病症是基于细胞的非诱导性信号传导状态确定的。在一些实施方式中，该病症为瘤形成或造血病症。在一些实施方式中，瘤形成或造血病症选自非霍奇金淋巴瘤、霍奇金或其它淋巴瘤、急性或慢性白血病、红细胞增多症、血小板增多症、多发性骨髓瘤或浆细胞异常(例如淀粉样变性和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、骨髓增生紊乱、骨髓增生障碍、骨髓纤维化和非典型免疫淋巴细胞增生。在一些实施方式中，瘤形成或造血病症为非B细胞系源性的，例如急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、非B细胞急性骨髓性白血病(ALL)、非B细胞淋巴瘤、骨髓增生紊乱、骨髓增生障碍、骨髓纤维化、红细胞增多症、血小板增多症和非B细胞非典型免疫淋巴细胞增生。在一些实施方式中，瘤形成或造血病症为B细胞或B细胞系源性异常，例如选自慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B淋巴细胞系白血病、B淋巴细胞系淋巴瘤、多发性骨髓瘤的B细胞或B细胞系源性异常和浆细胞异常(例如淀粉样变性和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)。在一些实施方式中，病症为CLL。在一些实施方式中，CLL由共表达CD5及CD19和CD23或CD5及CD20和CD23的单克隆B细胞群和表面免疫球蛋白的表达所限定。
在一些实施方式中，细胞的非诱导性信号传导状态与临床结果(例如病症的预后或诊断)相关。在一些实施方式中，临床结果为瘤形成或造血病症的分期或分级，例如侵袭性、无痛、良性、顽固性、罗马数字分期、TNM分期、Rai分期、Binet分期、WHO分类、FAB分类、IPSS评分、WPSS评分、局限期、扩散期、根据分子标记(例如ZAP70、B细胞受体(IgVH)的重链的突变状态和CD38)的分期、隐性，其包括能够及时传达恶化、无恶化存活率、整体存活率和无意外存活率的信息。
在一些实施方式中，相关性是来确定个体对治疗的响应，例如正常反应者、超反应者、低反应者、产生耐药性、依从性差和副反应。
在一些实施方式中，相关性包括将细胞作为微小残留病或产生耐药性进行分类。相关性还包括确定治疗方法，例如化疗、生物疗法、放射疗法、骨髓移植、外周干细胞移植、脐带血移植、自体干细胞移植、异基因干细胞移植、同基因干细胞移植、手术、诱导治疗、维持治疗或观察等待治疗。
在该方面的一些实施方式中，本发明提供了通过将调节剂施用于个体的B淋巴细胞系源性细胞来将B淋巴细胞系源性细胞的激活水平与个体的瘤形成或造血病症相关联、确定在B淋巴细胞系源性细胞中参与非诱导性信号传导途径的多个可激活元件的激活水平以及识别与临床结果(例如特定治疗的结果预测、某种病症(例如造血病症)的预后和诊断)相关的细胞非诱导性信号传导途径中的多个可激活元件的激活水平的模式的方法。在一些实施方式中，B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞选自早期原B细胞、晚期原B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、浆细胞和记忆B细胞、CD5+B细胞、CD38+B细胞、包含B细胞受体重链突变或非突变的B细胞和表达Zap70的B细胞。在一些实施方式中，关联性是来确定临床结果，例如病症的预后或诊断。
在本发明方法的一些实施方式中，施用于细胞的调节剂为激活剂或抑制剂。在一些实施方式中，调节剂为例如生长因子、细胞因子、黏附分子调节剂、激素、小分子、多核苷酸、抗体、天然化合物、内酯、化疗试剂、免疫调节剂、碳水化合物、蛋白酶、离子、活性氧族或辐射。在一些实施方式中，调节剂为B细胞受体调节剂，例如B细胞受体激活剂(例如B细胞受体复合物或B细胞辅助受体复合物交联剂)。在一些实施方式中，交联剂为抗体或分子结合体。在一些实施方式中，交联剂为抗体，例如多价抗体。在一些实施方式中，抗体为一价、二价、或多价抗体，更多价态通过连接在固体表面或栓在纳米颗粒表面以增强抗原决定部位结合域的局部化合价。在一些实施方式中，交联剂为分子结合体，例如通过复合物中的碳水化合物或抗原决定部位作用在或结合在B细胞受体复合物上的实体。在一些实施方式中，分子结合体为单价、二价或多价结合体，更多价态通过连接在固体表面或栓在纳米颗粒表面以增强抗原决定部位结合域的局部化合价。在一些调节剂为B细胞受体调节剂(例如，如B细胞受体复合物或B细胞辅助受体复合物交联剂的B细胞受体激活剂)的实施方式中，交联包括使抗体或分子结合体与细胞相结合，然后通过细胞与固体表面的作用产生交联，该固体表面通过抗体或分子结合体与BCR复合物交联。在一些实施方式中，交联剂选自F(ab)2IgM、IgG、IgD、多克隆BCR抗体、单克隆BCR抗体、Fc受体衍生结合元件和/或其组合。Ig来自选自小鼠、山羊、兔、猪、大鼠、马、牛、鲨鱼、鸡或美洲驼中的一个物种。在一些实施例中，交联剂为F(ab)2IgM、多克隆IgM抗体、单克隆IgM抗体、生物素化F(ab)2IgCM、生物素化多克隆IgM抗体、生物素化单克隆IgM抗体和/或其组合。
在本发明方法的一些实施方式中，施用于细胞的调节剂为细胞内参与信号级联放大的细胞因子或多个信号传导因子的抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂为激酶或磷酸酶抑制剂，例如adaphostin、AG490、AG 825、AG 957、AG 1024、aloisine、aloisine A、alsterpaullone、aminogenistein、API-2、芹菜素、牛蒡子素、AY-22989、BAY 61-3606、双吲哚马来酰亚胺IX、白屈菜红碱、10-[4′-(N，N-二乙氨基)丁基]-2-氯代吩噁嗪盐酸盐、达沙替尼、2-二甲氨基-4，5，6，7-四溴代-1H-苯并咪唑、5，7-二甲氧基-3-(4-吡啶基)喹啉二盐酸化物、依地福新、鞣花酸、enzastaurin、ER 27319马来酸盐、埃罗替尼、ET18OCH3、法舒地尔、flavopiridol、吉非替尼、GW 5074、H-7、H-8、H-89、HA-100、HA-1004、HA-1077、HA-1100、羟基法舒地尔、靛红-3’-肟、5-碘代杀结核菌素、kenpaullone、KN-62、KY12420、LFM-A13、薰草菌素A、木犀草素、LY-294002、LY294002、楸毒素、ML-9、NSC-154020、NSC-226080、NSC-231634、NSC-664704、NSC-680410、NU6102、奥罗莫星、羟吲哚I、PD-153035、PD-98059、PD 169316、根皮素、根皮苷、云鞣杉醇、鬼臼苦素、PKI、PP1、PP2、purvalanol A、槲皮素、R406、R788、雷帕鸣、雷帕霉素、Ro 31-8220、roscovitine、粗糠柴毒、SB202190、SB203580、西罗莫司、索拉非尼、SL327、SP600125、十字孢碱、STI-571、SU-11274、SU1498、SU4312、SU6656、4，5，6，7-四溴代三唑、TG101348、曲西立滨、Tyrphostin AG 490、Tyrphostin AG 825、Tyrphostin AG 957、Tyrphostin AG 1024、Tyrphostin SU1498、U0126、VX-509、VX-667、VX-680、W-7、沃特曼宁、XL-019、XL-147、XL-184、XL-228、XL-281、XL-518、XL-647、XL-765、XL-820、XL-844、XL-880、Y-27632、ZD-1839、ZM-252868、ZM-447439、H2O2、siRNA、miRNA、斑蝥素、(-)-对溴四咪唑、微囊藻素LR、原钒酸钠、过钒酸钠、硫酸氧钒、氧代二过氧(1，10-菲咯啉)钒酸钠、联麦芽酚氧钒(IV)、钼酸钠、过钼酸钠、酒石酸钠、咪唑、氟化钠、β-甘油磷酸酯、十水焦磷酸盐钠、花萼海绵诱癌素A、Discodermia calyx、bpV(phen)、mpV(pic)、DMHV、氯氰菊酯、Dephostatin、冈田酸、NIPP-1、N-(9，10-二氧代-9，10-二氢-菲-2-基)-2，2-二甲基-丙酰氨、α-溴代-4-羟基苯乙酮、4-羟基苯甲酰甲基溴、α-溴代-4-甲氧基苯乙酮、4-甲氧基苯甲酰甲基溴、α-溴代-4-(羧基甲氧基)苯乙酮、4-(羧基甲氧基)苯甲酰甲基溴、和双(4-三氟甲基磺酰氨基苯基)-1，4-二异丙基苯、氧化苯砷、吡咯烷二硫代氨基甲酸或氟化铝。在一些实施方式中，磷酸酶抑制剂为H2O2。
在本发明方法的一些实施方式中，还将第二个调节剂进一步施用于细胞，例如可将B细胞受体激活剂和磷酸酶抑制剂(例如F(ab)2IgM或生物素化F(ab)2IgM和磷酸酶抑制剂(例如H2O2))施用于细胞。
在本发明的一些实施方式中，细胞中多个可激活元件的激活水平选自细胞外或细胞内蛋白酶产生的裂解、新型杂低聚物生成、糖基化水平、磷酸化水平、乙酰化水平、甲基化水平、生物素化水平、谷氨酰化水平、甘氨酰化水平、羟基化水平、异构化水平、异戊烯化水平、豆蔻酰化水平、脂化水平、磷酸泛酰巯基乙胺化水平、硫酸化水平、ISG化水平、亚硝基化水平、棕榈酰化水平、SUMO化水平、遍在蛋白化水平、类泛素化水平、瓜氨酸化水平、脱酰胺化水平、二硫键形成水平、蛋白水解水平、异位水平、蛋白质转化的变化、多蛋白复合体水平、氧化水平、多脂复合体和细胞膜的生物化学改变。在一些实施方式中，激活水平为磷酸化水平。在一些实施方式中，可激活元件选自蛋白质、碳水化合物、脂类、核酸和代谢产物。在一些实施方式中，可激活元件为蛋白质。在一些实施方式中，可激活元件为代谢状态、温度或局部离子浓度的改变。在可激活元件为蛋白质的实施方式中，一些实施方式中该蛋白质为可被磷酸化或脱磷酸化的蛋白质，例如激酶、磷酸酶、衔接/支架蛋白、遍在蛋白酶、黏附分子、收缩蛋白、细胞骨架蛋白、异源三聚体G蛋白、小分子量GTPases、鸟嘌呤核苷酸交换因子、GTPase活化蛋白、半胱天冬酶和参与细胞凋亡的蛋白(例如PARP)、离子通道、分子运载体、分子侣伴蛋白、代谢酶、小泡运输蛋白、羟化酶、异构酶、转运酶、脱乙酰基酶、甲基化酶、脱甲基酶、蛋白酶、酯化酶、水解酶、DNA结合蛋白或转录因子。在一些实施方式中，蛋白选自PI3-激酶(p85、p110a、p110b、p110d)、Jak1、Jak2、SOCs、Rac、Rho、Cdc42、Ras-GAP、Vav、Tiam、Sos、Dbl、Nck、Gab、PRK、SHP1和SHP2、SHIP1、SHIP2、sSHIP、PTEN、Shc、Grb2、PDK1、SGK、Akt1、Akt2、Akt3、TSC1，2、Rheb、mTor、4EBP-1、p70S6激酶、S6、LKB-1、AMPK、PFK、乙酰辅酶A羧化酶、DokS、Rafs、Mos、Tpl2、MEK1/2、MLK3、TAK、DLK、MKK3/6、MEKK1，4、MLK3、ASK1、MKK4/7、SAPK/JNK1，2，3、p38s、Erk1/2、Syk、Btk、BLNK、LAT、ZAP70、Lck、Cbl、SLP-76、PLCγ1、PLCγ2、STAT1、STAT 3、STAT 4、STAT 5、STAT 6、FAK、p130CAS、PAKs、LIMK1/2、Hsp90、Hsp70、Hsp27、SMADs、Rel-A(p65-NFκB)、CREB、组蛋白H2B、HATs、HDACs、PKR、Rb、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、P16、p14Arf、p27KIP、p21CIP、Cdk4、Cdk6、Cdk7、Cdk1、Cdk2、Cdk9、Cdc25，A/B/C、Abl、E2F、FADD、TRADD、TRAF2、RIP、Myd88、BAD、Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、PARP、IAPs、Smac、胞衬蛋白、肌动蛋白、Src、Lyn、Fyn、Lck、NIK、IκB、p65(RelA)、IKKα、PKA、PKCα、PKCβ、PKCθ、PKCδ、CAMK、Elk、AFT、Myc、Egr-1、NFAT、ATF-2、Mdm2、p53、DNA-PK、Chk1、Chk2、ATM、ATR、β-连环蛋白、CrkL、GSK3α、GSK3β和FOXO。在一些实施方式中，蛋白质选自Erk、Syk、Zap70、Lck、Btk、BLNK、Cbl、PLCγ2、Akt、RelA、p38、S6。在一些实施方式中，蛋白质为S6。
在一些实施方式中，蛋白质选自HER受体、PDGF受体、Kit受体、FGF受体、Eph受体、Trk受体、IGF受体、胰岛素受体、Met受体、Ret、VEGF受体、TIE1、TIE2、FAK、Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、Src、Lyn、Fyn、Lck、Fgr、Yes、Csk、Abl、Btk、ZAP70、Syk、IRAKs、cRaf、ARaf、BRAF、Mos、Lim激酶、ILK、Tpl、ALK、TGFβ受体、BMP受体、MEKKs、ASK、MLKs、DLK、PAKs、Mek 1、Mek 2、MKK3/6、MKK4/7、ASK1、Cot、NIK、Bub、Myt 1、Weel、酪蛋白激酶、PDK1、SGK1、SGK2、SGK3、Akt1、Akt2、Akt3、p90Rsks、p70S6激酶、Prks、PKCs、PKAs、ROCK 1、ROCK 2、Auroras、CaMKs、MNKs、AMPKs、MELK、MARKs、Chk1、Chk2、LKB-1、MAPKAPKs、Pim1、Pim2、Pim3、IKKs、Cdks、Jnks、Erks、IKKAs、GSK3α、GSK3β、Cdks、CLKs、PKR、PI3-激酶1型、2型、3型、mTor、SAPK/JNK1，2，3、p38s、PKR、DNA-PK、ATM、ATR、受体蛋白酪氨酸磷酸酶(RPTPs)、LAR磷酸酶、CD45、非受体酪氨酸磷酸酶(NPRTPs)、SHPs、MAP激酶磷酸酶(MKPs)、双重特异性磷酸酶(DUSPs)、CDC25磷酸酶、低分子量酪氨酸磷酸酶、Eyes absent(EYA)酪氨酸磷酸酶、丝切蛋白磷酸酶(SSH)、丝氨酸磷酸酶、PP2A、PP2B、PP2C、PP1、PP5、肌醇磷酸酶、PTEN、SHIPs、肌管素、磷酸肌醇激酶、磷脂酶、前列腺素合成酶、5-脂肪氧化酶、鞘氨醇激酶、神经鞘磷脂酶、衔接/支架蛋白、Shc、Grb2、BLNK、LAT、PI3-激酶B细胞衔接蛋白(BCAP)、SLAP、Dok、KSR、MyD88、Crk、CrkL、GAD、Nck、Grb2结合相关蛋白(GAB)、Fas死亡区相关蛋白(FADD)、TRADD、TRAF2、RIP、T细胞白血病家族、IL-2、IL-4、IL-8、IL-6、干扰素γ、干扰素α、细胞因子信号传导阻抑蛋白(SOCs)、Cbl、SCF遍在蛋白连接酶复合体、APC/C、黏附分子、整合素、类免疫球蛋白黏附分子、选择素、钙粘蛋白、连环蛋白、成簇黏附激酶、p130CAS、胞衬蛋白、肌动蛋白、桩蛋白、肌球蛋白、肌球蛋白结合蛋白、微管蛋白、eg5/KSP、CENPs、β-肾上腺素能受体、毒蕈碱受体、腺苷酸环化酶受体、小分子量GTPases、H-Ras、K-Ras、N-Ras、Ran、Rac、Rho、Cdc42、Arfs、RABs、RHEB、Vav、Tiam、Sos、Dbl、PRK、TSC1，2、Ras-GAP、Arf-GAPs、Rho-GAPs、半胱天冬酶、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、PARP、Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL、Bcl-w、Bcl-B、A1、Bax、Bak、Bok、Bik、Bad、Bid、Bim、Bmf、Hrk、Noxa、Puma、IAPs、XIAP、Smac、Cdk4、Cdk 6、Cdk 2、Cdk1、Cdk 7、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、Rb、p16、p14Arf、p27KIP、p21CIP、分子侣伴蛋白、Hsp90s、Hsp70、Hsp27、代谢酶、乙酰辅酶A羧化酶、ATP柠檬酸裂解酶、一氧化氮合酶、小窝蛋白、转运必须的内吞分选复合物(ESCRT)蛋白、泡状蛋白分选蛋白(Vsps)、羟化酶、脯氨酰羟化酶PHD-1，2和3、天冬酰胺羟化酶FIH转运酶、Pin1脯氨酰异构酶、拓扑异构酶、脱乙酰基酶、组蛋白脱乙酰基酶、去乙酰化酶、组蛋白乙酰化酶、CBP/P300家族、MYST家族、ATF2、DNA甲基转移酶、组蛋白H3K4脱甲基酶、H3K27、JHDM2A、UTX、VHL、WT-1、p53、Hdm、PTEN、遍在蛋白酶、尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)和uPA受体(uPAR)体系、组织蛋白酶、金属蛋白酶、酯酶、水解酶、分离酶、钾离子通道、钠离子通道、多重耐药蛋白、P-糖蛋白、核苷转运酶、Ets、Elk、SMADs、Rel-A(p65-NFKB)、CREB、NFAT、ATF-2、AFT、Myc、Fos、Spl、Egr-1、T-bet、β-连环蛋白、HIFs、FOXOs、E2Fs、SRFs、TCFs、Egr-1、β-连环蛋白、FOXO STAT1、STAT 3、STAT 4、STAT 5、STAT 6、p53、WT-1、HMGA、pS6、4EPB-1、eIF4E结合蛋白、RNA聚合酶、起始因子、延伸因子。
除了确定可激活蛋白质的激活水平外，在一些实施方式中，分类细胞的方法还包括确定附加的细胞内标记和/或细胞表面标记的水平。在一些实施方式中，分类细胞的方法包括确定附加的细胞内标记的水平。在一些实施方式中，细胞内标记为捕获的细胞内细胞因子。在一些实施方式中，分类细胞的方法包括确定附加的细胞表面标记的水平。在一些实施方式中，细胞表面标记为细胞表面配体或受体。在一些实施方式中，细胞表面标记为B细胞受体组分。在一些实施方式中，细胞表面标记为CD45、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD37、CD40、CD52、CD79、CD38、CD96、主要的组织相容性抗原(MHC)1型或MHC 2型。
在一些实施方式中，本发明中用于预后、诊断或确定治疗的方法还包括确定附加的血清标记水平。在一些实施方式中，血清标记包括蛋白质。在一些实施方式中，血清标记为细胞因子、生长因子、趋化因子、可溶性受体、小分子或药物。在一些实施方式中，血清标记包括病原体或寄生虫的组分或产物。在一些实施方式中，血清标记选自β-2-微球蛋白、降钙素、胸苷激酶和铁蛋白。
在一些实施方式中，本发明提供了一种通过将调节剂施用于个体的B淋巴细胞系源性细胞来将B淋巴细胞系源性细胞的激活水平与个体的瘤形成或造血病症相关联、确定在B淋巴细胞系源性细胞中多个可激活元件的激活水平和识别与造血病症相关的细胞中多个可激活元件的激活水平的模式的方法。在一些实施方式中，可激活元件选自Erk、Syk、Zap70、Lck、Btk、BLNK、Cbl、PLCγ2、Akt、RelA、p38、S6。在一些实施方式中，可激活元件选自Cbl、PLCγ2和S6。在一些实施方式中，可激活元件为S6。在一些实施方式中，B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞选自早期原B细胞、晚期原B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、浆细胞和记忆B细胞、CD5+B细胞、CD38+B细胞、包含B细胞受体重链突变或非突变的B细胞、或表达Zap70的B细胞。在一些实施方式中，本发明提供了通过将调节剂施用于个体的CLL细胞从而基于个体的临床结果来关联和/或分类CLL细胞的激活状态(其中所述CLL细胞表达B细胞受体(BCR))、确定多个可激活元件的激活水平以及识别多个可激活元件的激活水平的模式以确定是否存在临近BCR的信号传导的改变(其中存在所述改变为临床结果的指征)的方法。
在一些实施方式中，该方法包括识别所述细胞中所述多个可激活元件的所述激活水平的模式，其中所述模式与疾病或病症相关。
在一些实施方式中，相关性可确定临床结果，例如预后或治疗病症的确定。在一些实施方式中，瘤形成或造血病症选自非霍奇金淋巴瘤、霍奇金或其它淋巴瘤、急性或慢性白血病、红细胞增多症、血小板增多症、多发性骨髓瘤或浆细胞异常(例如淀粉样变性和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、骨髓增生紊乱、骨髓增生障碍、骨髓纤维化或非典型免疫淋巴细胞增生。在一些实施方式中，瘤形成或造血病症为非B细胞系源性的，例如急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、非B细胞急性骨髓性白血病(ALL)、非B细胞淋巴瘤、骨髓增生紊乱、骨髓增生障碍、骨髓纤维化、红细胞增多症、血小板增多症和非B细胞非典型免疫淋巴细胞增生。在一些实施方式中，瘤形成或造血病症为B细胞或B细胞系源性异常，例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B淋巴细胞系白血病、B淋巴细胞系淋巴瘤、多发性骨髓瘤或浆细胞异常(例如淀粉样变性和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)。在一些实施方式中，病症为CLL。在一些实施方式中，CLL由共表达CD5及CD19和CD23或CD5及CD20和CD23的单克隆B细胞群和暗表面免疫球蛋白的表达限定。
在一些实施方式中，临床结果为瘤形成或造血病症的分期或分级，例如侵袭性、无痛、良性、顽固性、罗马数字分期、TNM分期、Rai分期、Binet分期、WHO分类、FAB分类、IPSS评分、WPSS评分、局限期、扩散期、根据例如ZAP70、IgVH突变状态和CD38的细胞标记的分期、隐性，其包括能够及时传达恶化、无恶化存活率、整体存活率和无意外存活率的信息。
在一些实施方式中，相关性可确定个体对特定治疗的响应，例如正常反应者、超反应者、低反应者、产生耐药性、依从性差和副反应。
在一些实施方式中，相关性包括根据微小残留病或产生耐药性来分类细胞。相关性还包括确定治疗方法，例如化疗、生物疗法、靶向疗法、放射疗法、骨髓移植、外周干细胞移植、脐带血移植、自体干细胞移植、异基因干细胞移植、同基因干细胞移植、手术、诱导治疗、维持治疗或观察等待治疗。在另外的实施方式中，相关性还包括确定特定治疗的合适的剂量或时间。
在本发明方法的一些实施方式中，施用于细胞的调节剂为激活剂或抑制剂。在一些实施方式中，调节剂为例如生长因子、细胞因子、黏附分子调节剂、激素、小分子、多核苷酸、抗体、天然化合物、内酯、化疗试剂、免疫调节剂、碳水化合物、蛋白酶、离子、活性氧族或辐射。在一些实施方式中，调节剂为可识别细胞表面抗原的抗体，例如抗CD20(Rituxan B细胞单克隆抗体)、抗CD22(依帕珠单抗)、抗CD23(鲁昔单抗)或抗CD52(阿仑单抗)。在一些实施方式中，调节剂为可识别B细胞受体共复合物组分的B细胞受体复合物调节剂(例如抗CD20)或B细胞受体激活剂(例如B细胞受体复合物或B细胞辅助受体复合物交联剂)。在一些实施方式中，交联剂为抗体或分子结合体。在一些实施方式中，交联剂为抗体，例如多价抗体。在一些实施方式中，抗体为一价、二价或多价抗体，更多价态通过连接在固体表面或栓在纳米颗粒表面以增强抗原决定部位结合域的局部化合价。在一些实施方式中，交联剂为分子结合体，例如通过复合物中的碳水化合物或抗原决定部位作用在或结合在B细胞受体复合物上的实体。在一些实施方式中，分子结合体为单价、二价或多价结合体，更多价态通过连接在固体表面或栓在纳米颗粒表面以增强抗原决定部位结合域的局部化合价。在调节剂为B细胞受体调节剂(例如，B细胞受体激活剂(例如B细胞受体复合物或B细胞辅助受体复合物交联剂))的一些实施方式中，交联包括将抗体或分子结合体与细胞相结合，然后通过细胞与固体表面的作用产生交联，该固体表面通过抗体或分子结合体与BCR复合物交联。在一些实施方式中，交联剂选自F(ab)2IgM、IgG、IgD、多克隆BCR抗体、单克隆BCR抗体、Fc受体衍生结合元件和/或其组合。Ig来自选自小鼠、山羊、兔、猪、大鼠、马、牛、鲨鱼、鸡、或美洲驼中的一个物种。在一些实施方式中，交联剂为F(ab)2IgM、多克隆IgM抗体、单克隆IgM抗体、生物素化F(ab)2IgCM、生物素化多克隆IgM抗体、生物素化单克隆IgM抗体和/或其组合。
在本发明方法的一些实施方式中，施用于细胞的调节剂为细胞中参与信号级联放大的细胞因子或多个因子的抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂为激酶或磷酸酶抑制剂，例如adaphostin、AG 490、AG 825、AG 957、AG 1024、aloisine、aloisine A、alsterpaullone、aminogenistein、API-2、芹菜素、牛蒡子素、AY-22989、BAY 61-3606、双吲哚马来酰亚胺IX、白屈菜红碱、10-[4′-(N，N-二乙氨基)丁基]-2-氯代吩噁嗪盐酸盐、达沙替尼、2-二甲氨基-4，5，6，7-四溴代-1H-苯并咪唑、5，7-二甲氧基-3-(4-吡啶基)喹啉二盐酸化物、依地福新、鞣花酸、enzastaurin、ER 27319马来酸盐、埃罗替尼、ET18OCH3、法舒地尔、flavopiridol、吉非替尼、GW 5074、H-7、H-8、H-89、HA-100、HA-1004、HA-1077、HA-1100、羟基法舒地尔、靛红-3’-肟、5-碘代杀结核菌素、kenpaullone、KN-62、KY12420、LFM-A 13、薰草菌素A、木犀草素、LY-294002、LY294002、楸毒素、ML-9、NSC-154020、NSC-226080、NSC-231634、NSC-664704、NSC-680410、NU6102、奥罗莫星、羟吲哚I、PD-153035、PD-98059、PD 169316、根皮素、根皮苷、云鞣杉醇、鬼臼苦素、PKI、PP1、PP2、purvalanol A、槲皮素、R406、R788、雷帕鸣、雷帕霉素、Ro 31-8220、roscovitine、粗糠柴毒、SB202190、SB203580、西罗莫司、索拉非尼、SL327、SP600125、十字孢碱、STI-571、SU-11274、SU1498、SU4312、SU6656、4，5，6，7-四溴代三唑、TG101348、曲西立滨、Tyrphostin AG 490、Tyrphostin AG825、Tyrphostin AG 957、Tyrphostin AG 1024、Tyrphostin SU1498、U0126、VX-509、VX-667、VX-680、W-7、沃特曼宁、XL-019、XL-147、XL-184、XL-228、XL-281、XL-518、XL-647、XL-765、XL-820、XL-844、XL-880、Y-27632、ZD-1839、ZM-252868、ZM-447439、H2O2、siRNA、miRNA、斑蝥素、(-)-对溴四咪唑、微囊藻素LR、原钒酸钠、过钒酸钠、硫酸氧钒、氧代二过氧(1，10-菲咯啉)钒酸钠、联麦芽酚氧钒(IV)、钼酸钠、过钼酸钠、酒石酸钠、咪唑、氟化钠、β-甘油磷酸酯、十水焦磷酸盐钠、花萼海绵诱癌素A、Discodermiacalyx、bpV(phen)、mpV(pic)、DMHV、氯氰菊酯、Dephostatin、冈田酸、NIPP-1、N-(9，10-二氧代-9，10-二氢-菲-2-基)-2，2-二甲基-丙酰氨、α-溴代-4-羟基苯乙酮、4-羟基苯甲酰甲基溴、α-溴代-4-甲氧基苯乙酮、4-甲氧基苯甲酰甲基溴、α-溴代-4-(羧基甲氧基)苯乙酮、4-(羧基甲氧基)苯甲酰甲基溴、和双(4-三氟甲基磺酰氨基苯基)-1，4-二异丙基苯、氧化苯砷、吡咯烷二硫代氨基甲酸或氟化铝。在一些实施方式中，磷酸酶抑制剂为H2O2。
在本发明方法的一些实施方式中，还进一步将第二个调节剂施用于细胞，例如可将B细胞受体激活剂和激酶抑制剂或磷酸酶抑制剂(例如F(ab)2IgM或生物素化F(ab)2IgM和H2O2)施用于细胞。
在本发明的一些实施方式中，细胞中可激活元件的激活水平选自细胞外或细胞内蛋白酶产生的裂解、新型杂低聚物生成、糖基化水平、磷酸化水平、乙酰化水平、甲基化水平、生物素化水平、谷氨酰化水平、甘氨酰化水平、羟基化水平、异构化水平、异戊烯化水平、豆蔻酰化水平、脂化水平、磷酸泛酰巯基乙胺化水平、硫酸化水平、ISG化水平、亚硝基化水平、棕榈酰化水平、SUMO化水平、遍在蛋白化水平、类泛素化水平、瓜氨酸化水平、脱酰胺化水平、二硫键形成水平、蛋白水解水平、异位水平、蛋白质转化的变化、多蛋白复合体水平、氧化水平、多脂复合体和细胞膜的生物化学改变。在一些实施方式中，激活水平为磷酸化水平。在一些实施方式中，可激活元件选自蛋白质、碳水化合物、脂类、核酸和代谢产物。在一些实施方式中，可激活元件为蛋白质。在一些实施方式中，可激活元件为代谢状态、温度或局部离子浓度的改变。在可激活元件为蛋白质的实施方式中，在一些实施方式中，该蛋白质为可被磷酸化或脱磷酸化的蛋白质，例如激酶、磷酸酶、衔接/支架蛋白、遍在蛋白酶、黏附分子、收缩蛋白、细胞骨架蛋白、异源三聚体G蛋白、小分子量GTPases、鸟嘌呤核苷酸交换因子、GTPase活化蛋白、半胱天冬酶和参与细胞凋亡的蛋白(例如PARP)、离子通道、分子运载体、分子侣伴蛋白、代谢酶、小泡运输蛋白、羟化酶、异构酶、转运酶、脱乙酰基酶、甲基化酶、脱甲基酶、蛋白酶、酯化酶、水解酶、DNA结合蛋白或转录因子。
另外一方面，本发明提供了通过在不同培养基中将多个调节剂施用于细胞来确定细胞群的表型谱(profile)(其中至少一种调节剂为抑制剂)、确定在各不同培养基的细胞群中是否存在可激活元件的激活水平的增加以及基于在各不同培养基中是否存在可激活元件的激活的增加来分类细胞群的方法。在一些实施方式中，抑制剂为细胞内参与信号级联放大的细胞因子或多个信号传导因子的抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂为磷酸酶或激酶抑制剂。激酶抑制剂的例子包括adaphostin、AG 490、AG 825、AG 957、AG 1024、aloisine、aloisineA、alsterpaullone、aminogenistein、API-2、芹菜素、牛蒡子素、AY-22989、BAY 61-3606、双吲哚马来酰亚胺IX、白屈菜红碱、10-[4′-(N，N-二乙氨基)丁基]-2-氯代吩噁嗪盐酸盐、达沙替尼、2-二甲氨基-4，5，6，7-四溴代-1H-苯并咪唑、5，7-二甲氧基-3-(4-吡啶基)喹啉二盐酸化物、依地福新、鞣花酸、enzastaurin、ER 27319马来酸盐、埃罗替尼、ET18OCH3、法舒地尔、flavopiridol、吉非替尼、GW 5074、H-7、H-8、H-89、HA-100、HA-1004、HA-1077、HA-1100、羟基法舒地尔、靛红-3’-肟、5-碘代杀结核菌素、kenpaullone、KN-62、KY12420、LFM-A13、薰草菌素A、木犀草素、LY-294002、LY294002、楸毒素、ML-9、NSC-154020、NSC-226080、NSC-231634、NSC-664704、NSC-680410、NU6102、奥罗莫星、羟吲哚I、PD-153035、PD-98059、PD 169316、根皮素、根皮苷、云鞣杉醇、鬼臼苦素、PKI、PP1、PP2、purvalanol A、槲皮素、R406、R788、雷帕鸣、雷帕霉素、Ro 31-8220、roscovitine、粗糠柴毒、SB202190、SB203580、西罗莫司、索拉非尼、SL327、SP600125、十字孢碱、STI-571、SU-11274、SU1498、SU4312、SU6656、4，5，6，7-四溴代三唑、TG101348、曲西立滨、Tyrphostin AG490、Tyrphostin AG 825、Tyrphostin AG 957、Tyrphostin AG 1024、Tyrphostin SU1498、U0126、VX-509、VX-667、VX-680、W-7、沃特曼宁、XL-019、XL-147、XL-184、XL-228、XL-281、XL-518、XL-647、XL-765、XL-820、XL-844、XL-880、Y-27632、ZD-1839、ZM-252868、ZM-447439、siRNA、miRNA。磷酸酶抑制剂的例子包括但不局限于H2O2、siRNA，miRNA、斑蝥素、(-)-对溴四咪唑、微囊藻素LR、原钒酸钠、过钒酸钠、硫酸氧钒、氧代二过氧(1，10-菲咯啉)钒酸钠、联麦芽酚氧钒(IV)、钼酸钠、过钼酸钠、酒石酸钠、咪唑、氟化钠、β-甘油磷酸酯、十水焦磷酸盐钠、花萼海绵诱癌素A、Discodermia calyx、bpV(phen)、mpV(pic)、DMHV、氯氰菊酯、Dephostatin、冈田酸、NIPP-1、N-(9，10-二氧代-9，10-二氢-菲-2-基)-2，2-二甲基-丙酰氨、α-溴代-4-羟基苯乙酮、4-羟基苯甲酰甲基溴、α-溴代-4-甲氧基苯乙酮、4-甲氧基苯甲酰甲基溴、α-溴代-4-(羧基甲氧基)苯乙酮、4-(羧基甲氧基)苯甲酰甲基溴、和双(4-三氟甲基磺酰氨基苯基)-1，4-二异丙基苯、氧化苯砷、吡咯烷二硫代氨基甲酸和氟化铝。在一些实施方式中，磷酸酶抑制剂为H2O2。
在一些实施方式中，调节剂为激活剂或抑制剂。在一些实施方式中，调节剂独立地选自生长因子、细胞因子、黏附分子调节剂、激素、小分子、多核苷酸、抗体、天然化合物、内酯、化疗试剂、免疫调节剂、碳水化合物、蛋白酶、离子、活性氧族或辐射。在一些实施方式中，至少一种调节剂为B细胞受体调节剂。在一些实施方式中，B细胞受体调节剂为B细胞受体激活剂，例如B细胞单克隆抗体、或者B细胞受体复合物或B细胞辅助受体复合物交联剂。
在一些实施方式中，调节剂为PMA、BAFF、April、SDF1a、SCF、CD40L、IGF-1、咪喹莫特、polyCpG、氟达拉滨、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、IL-7、IL-6、1L-10、IL-27、IL-4、IL-2、IL-3、毒胡萝卜素和/或其组合。
在一些实施方式中，可激活元件为蛋白质。在一些实施方式中，蛋白质选自Akt1、Akt2、Akt3、SAPK/JNK1，2，3、p38s、Erk1/2、Syk、ZAP70、Btk、BLNK、Lck、PLCγ1、PLCγ2、STAT1、STAT 3、STAT4、STAT 5、STAT 6、CREB、Lyn、p-S6、Cbl、NF-κB、GSK3β、CARMA/Bcl10和Tcl-1。
另一方面，本发明提供了通过将细胞群与至少一种调节剂相接触来分类细胞群(该调节剂为F(ab)2IgM、B细胞单克隆抗体、阿仑单抗、抗CD22(依帕珠单抗)、抗CD23(鲁昔单抗)、坎帕斯、H2O2、PMA、BAFF、April、SDF1a、CD40L、IGF-1、咪喹莫特、polyCpG、氟达拉滨、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、IL-7、IL-6、IL-10、IL-27、IL-4、IL-2、IL-3、毒胡萝卜素和/或其组合)、确定细胞群中是否存在可激活元件的激活水平的增加和基于是否存在可激活元件的激活的增加来分类细胞群的方法。
在一些实施方式中，细胞群为造血源性细胞群。在一些实施方式中，造血源性细胞群选自多功能造血干细胞、B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞、T淋巴细胞系祖细胞或分化细胞、NK细胞系祖细胞或分化细胞、粒细胞系祖细胞或分化细胞、单核细胞系祖细胞或分化细胞、巨核细胞系祖细胞或分化细胞和红细胞系祖细胞或分化细胞。在一些实施方式中，造血源性细胞群为B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞群，例如早期原B细胞群、晚期原B细胞群、大前B细胞群、小前B细胞群、未成熟B细胞群、成熟B细胞群、浆细胞和记忆B细胞群、CD5+B细胞群、CD38+B细胞、包含B细胞受体重链突变或非突变的B细胞或表达Zap70的B细胞群。
在一些实施方式中，分类包括将细胞群作为与临床结果相关的细胞群进行分类。在一些实施方式中，临床结果为对特定疗法的预测响应、或者病症的预后和/或诊断。在一些实施方式中，临床结果为是否存在瘤形成或造血病症，例如非霍奇金淋巴瘤、霍奇金或其它淋巴瘤、急性或慢性白血病、红细胞增多症、血小板增多症、多发性骨髓瘤或浆细胞异常(例如淀粉样变性和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、骨髓增生紊乱、骨髓增生障碍、骨髓纤维化或非典型免疫淋巴细胞增生。在一些实施方式中，瘤形成或造血病症为非B细胞系源性的，例如急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、非B细胞急性骨髓性白血病(ALL)、非B细胞淋巴瘤、骨髓增生紊乱、骨髓增生障碍、骨髓纤维化、红细胞增多症、血小板增多症或非B细胞非典型免疫淋巴细胞增生。在一些实施方式中，瘤形成或造血病症为B细胞或B细胞系源性异常，例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B淋巴细胞系白血病、B淋巴细胞系淋巴瘤、多发性骨髓瘤或浆细胞异常(淀粉样变性或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)。在一些实施方式中，病症为CLL。在一些实施方式中，CLL由共表达CD5及CD19和CD23或CD5及CD20和CD23的单克隆B细胞群和暗表面免疫球蛋白的表达限定。
在一些实施方式中，临床结果为瘤形成或造血病症的分期或分级。本发明提供的方法中的分期的例子包括侵袭性、无痛、良性、顽固性、罗马数字分期、TNM分期、Rai分期、Binet分期、WHO分类、FAB分类、IPSS评分、WPSS评分、局限期、扩散期、根据例如ZAP70、IgVH突变状态和CD38的细胞标记的分期、隐性，其包括能够及时传达恶化、无恶化存活率、整体存活率和无意外存活率的信息。
在本发明方法的一些实施方式中，基于激活水平的细胞群分类包括将细胞群作为与患者对治疗的响应(例如完全响应、部分响应、结节性部分响应、无响应、疾病的进行、疾病的稳定、复发或副作用)相关联的细胞群进行分类。该方法还包括确定治疗方法，例如化疗、生物疗法、靶向疗法、放射疗法、骨髓移植、外周干细胞移植、脐带血移植、自体干细胞移植、异基因干细胞移植、同基因干细胞移植、手术、诱导治疗、维持治疗、观察等待治疗或整体/替代治疗。
在本发明方法的一些实施方式中，基于激活水平的细胞群分类包括将细胞群作为与微小残留病或形成耐药性相关的细胞群进行分类。
附图说明
本发明的新特征特别在所附权利要求中阐明。通过下面对示例性的实施方式的具体描述将会更好地理解本发明的特征和优点，其中会阐明本发明的主要内容和后面的附图：
图1为显示使用F(ab)2IgM刺激之后Ramos细胞中p-Erk和p-Syk/pZap70的激活的直方图。
图2为显示在使用F(ab)2IgM处理之后Romas细胞系中BLNK、Cbl、PLCγ2、Lck和p38的磷酸化的直方图。
图3为显示使用PMA激活之后提取的(pheresed)CLL样品和Ramos细胞系中Erk的磷酸化增加的直方图。
图4为显示使用15分钟增大剂量的F(ab)2IgM之后提取的CLL样品和Ramos细胞中Erk的激活的直方图。
图5为显示使用PMA或F(ab)2IgM处理之后CLL样品中Erk和Syk/Zap 70的磷酸化增强的等高线图。
图6为显示单独使用H2O2或与F(ab)2IgM联合使用之后CLL样品中Erk和Syk/Zap 70的磷酸化的等高线图。
图7为显示使用H2O2处理之后健康B细胞中Erk和Syk/Zap 70的磷酸化的直方图。
图8为显示使用H2O2和F(ab)2IgM处理之后CLL细胞中Erk和Syk/Zap 70的磷酸化的等高线图。
图9为显示使用PMA或F(ab)2IgM之后CLL样品中Erk和Syk的等高线图。
图10为显示单独作用H2O2或与F(ab)2IgM联合作用之后Erk和Syk/Zap 70的磷酸化的等高线图。
图11为单独作用H2O2或与F(ab)2IgM联合作用之后对比具有低和高频率ZAP70的CLL样品的Erk和Syk/Zap 70的磷酸化的等高线图。
图12为显示使用F(ab)2IgM和H2O2处理之后不同的时间上CLL样品中Syk/Zap 70和Erk的磷酸化的等高线图。
图13为显示使用F(ab)2IgM和H2O2处理之后CLL样品中Syk/Zap 70和Erk的磷酸化的等高线图。
图14为显示CLL中由F(ab)2IgM和H2O2介导的信号传导动力学的直方图。
图15为显示单独使用H2O2或与F(ab)2IgM联合使用之后％ZAP70对BLNK磷酸化的影响的等高线图。
图16为显示ZAP70状态对BLNK磷酸化的影响的直方图。
图17为显示B细胞受体由F(ab)2IgM单独交联之后CLL样品中的CD20+/CD5+系中的pPLCγ2、prpS6和pCbl的磷酸化动力学的直方图。
图18为显示B细胞受体由F(ab)2IgM和H2O2交联之后CLL样品中的CD20+/CD5+系中的pPLCγ2、prpS6和pCbl的磷酸化动力学的直方图。
图19为显示B细胞受体由F(ab)2IgM单独交联之后CLL样品中的CD20+/CD5+系中的pPLCγ2、prpS6和pCbl的磷酸化动力学的直方图。
图20为显示B细胞受体由F(ab)2IgM和H2O2交联之后CLL样品中的CD20+/CD5+系的pPLCγ2、prpS6和pCbl的磷酸化动力学的直方图。
图21为显示F(ab)2IgM单独作用时随时间变化的Syk/Zap 70和Erk的磷酸化的等高线图。
图22为显示响应F(ab)2IgM单独作用的随时间变化的Syk/Zap 70的磷酸化的等高线图。
图23为显示在CD20+/CD5+系CLL样品中响应F(ab)2IgM作用的随时间变化的Syk、Erk和BLNK的磷酸化的直方图。
图24为显示在CD20+/CD5+系CLL样品中在使用H2O2处理之后pPLCγ2、prpS6和pCbl的磷酸化动力学的直方图。
图25为显示在CD20+/CD5+系CLL样品中在使用H2O2处理之后pPLCγ2、prpS6和pCbl的磷酸化动力学的直方图。
图26为显示在BCR和/或H2O2刺激后CLL患者外周血液样品的细胞内响应的热图。CLL表明样品来自诊断为CLL的患者。CON表明样品来自健康个体。患者样品编号标记在热图上，并且各个柱形代表一例患者。柱形上正方形阴影代表磷蛋白节点。不同的阴影代表各节点的磷酸化程度(见图上部标尺)。亮白色(位于标尺最右端)代表最大的增长(即+3.0的Log变化)。黑色(位于标尺的中间)表明很少或没有变化，和暗灰色(位于标尺的最左端)代表磷酸化状态最大的减少(即-3.0的Log变化)。这些磷酸化水平是通过方程的计算得出，该方程计算了刺激样品的荧光强度中值(MFI)除以未刺激样品的MFI的log10倍的增长或减少。热图上的行表明分析过的磷酸蛋白的标识。例如，标记“p-Blnk/H2O2/F(ab)2IgM”表明对过氧化氢(H2O2)和识别IgM(F(ab)2IgM)的Fab片段响应的磷酸化的BLNK的磷酸化状态已被测量。“US”表明样品未刺激。
图27为图26的热图的下部。白色方框代表CLL患者的2个不同的群集(cluster)，其中响应H2O2处理的信号传导增加(左手侧)或响应H2O2处理的信号传导减少(右手侧)。
图28为图26的热图的下部，进一步说明了由H2O2处理所区分的2个患者群集，10/22患者(左上方白色方框)和11/22患者(右下方白色方框)。图右侧的卡通画描述了B细胞受体信号传导途径。
具体实施方式
本专利结合其它申请和正文中的信息。以下专利和其它出版物的全部通过引用方式结合在本文中：Haskell等人，Cancer Treatment，5thEd.，W.B.Saunders and Co.，2001；Alberts等人，The Cell，4th Ed.，Garland Science，2002；Vogelstein和Kinzler，The Genetic Basis ofHuman Cancer，2d Ed.，McGraw Hill，2002；Michael，BiochemicalPathways，John Wiley and Sons，1999；Weinberg，The Biology of Cancer，2007；Immunobiology，Janeway等人7th Ed.，Garland和Leroith和Bondy，Growth Factors and Cytokines in Health and Disease，A MultiVolume Treatise，Volumes 1A and 1B，Growth Factors，1996。通过引用方式结合的专利和申请还包括美国专利No.7,381535和7,393,656和美国序列号(USSN)10/193,462、11/655,785、11/655,789、11/655,821、11/338,957、61/048,886、61/048,920、61/048,657、61/079,766、61/155,362、61/079,579、61/079,537、61/079,551、61/087,555和61/085,789。本发明一些实施方式中使用的一些商业试剂、方案、软件和仪器见Becton Dickinso网站http://WWW.bdbiosciences.com/features/products/和Beckman Coulter网站http://WWW.beckmancoulter.com/Default.asp？bhfv＝7。相关文章包括High-content single-cell drug screening with phosphospecific floWcytometry，Krutzik等人，Nature Chemical Biology，23December(2007)；Irish等人，FLt3 ligand Y591 duplication and Bcl-2over expression aredetected in acute myeloid leukemia cells with high levels ofphosphorylated wild-tyPe p53，Neoplasia，(2007)，Irish等人Mappingnormal and cancer cell signaling networks：towards single-cellproteomics，Nature(2006)6：146-155；和Irish等人，Single cell profilingof potentiated phospho-protein networks in cancer cells，Cell，(2004)118，1-20；Schulz，K.R.，等人，Single-cell phospho-protein analysis by flowcytometry，Curr Protoc Immunol，(2007)78：8 8.17.1-20；Krutzik，P.O.，等人，Coordinate analysis of murine immune cell surface markers andintracellular phosphoproteins by flow cytometry，J Immunol.(2005)175(4)：2357-65；Krutzik，P.O.，等人，Characterization of the murineimmunological signaling network with phosphospecific flow cytometry，J Immunol.(2005)175(4)：2366-73；Shulz等人，Current Protocols inImmunology(2007)78：8.17.1-20；Stelzer等人Use of MultiparameterFlow cytometry and Immunophenotyping for the Diagnosis andClassfication of Acute Myeloid leukemia，Immunophenotyping，Wiley，2000；和Krutzik，P.O.和Nolan，G.P.，Intracellular phospho-proteinstaining techniques for flow cytometry：monitoring single cell signalingevents，Cytometry A.(2003)55(2)：61-70；Hanahan D.，Weinberg，TheHallmarks of Cancer，CELL(2000)100：57-70；Krutzik等人，Highcontent single cell drug screening with phophosphospecific flowcytometry，Nat Chem Biol.(2008)4：132-42。实验和工艺方案和其它有用的信息也可见http:/proteomices.stanford.edu。以下引用的文章和其它文献的全部也通过引用的方式结合在本文中。
介绍
在一些实施方式中，本发明涉及用于诊断和预后的方法和组合物以及治疗方法。在一些实施方式中，样品(例如临床样品)中细胞的生理状态被用在例如病症的诊断和预后、患者的疗法选择中，以监控治疗、修改治疗疗法和进一步优化治疗试剂(其可以单独或联合给药)的选择。因此，根据在疗程之前和疗程中在不同时间得到的数据，治疗疗法可被个体化和特制，因而提供因人而异的疗法。
在一些实施方式中，本发明涉及对来自患有或有可能患有病症(例如瘤形成或造血病症)的个体的样品进行分类的方法。本发明能够识别与预后和治疗相关的病症的亚类以及预测个体的临床过程。本发明的方法提供了用于治疗患有病症的个体的工具，包括但是不局限于选择个体治疗的方法、预测个体对治疗响应的方法、确定个体治疗的有效性的方法、分配风险组的方法、预测复发风险的增加的方法、预测产生继发症风险的增加的方法和确定个体预后的方法。本发明提供了作为预后指示剂以预测病症过程的方法，例如个体中瘤形成或造血病症的过程是否是侵袭性或无痛的，以此辅助临床医生来管理患者和评价所用疗法的模式。
在一些实施方式中，本发明涉及用于确定细胞内一个或多个可激活元件在施用一个或多个调节剂后的激活水平的方法。在施用一个或多个调节剂后细胞中可激活元件的激活可揭示病症的可操作途径，其可用于例如选择个体的疗法、预测个体对疗法的响应、确定疗法对个体的有效性。在一些实施方式中，调节剂自身可直接在个体中作为治疗剂使用。在一些实施方式中，可激活元件的激活可用作指示剂来预测病症的过程、识别风险组、预测产生继发症的增加的风险和确定个体的预后。
在一些实施方式中，本发明涉及通过将细胞与抑制剂接触来分类细胞、确定细胞内是否存在可激活元件的激活水平的增加和基于是否存在可激活元件的激活水平的增加来分类细胞的方法。在一些实施方式中，本发明涉及通过将调节剂和抑制剂施用于个体的细胞来确定个体是否存在病症、确定细胞内可激活元件的激活水平和基于调节剂和抑制剂处理之后的激活水平来确定是否存在病症的方法。
在一些实施方式中，本发明涉及通过使抑制剂与细胞相接触来分类细胞、确定细胞内是否存在可激活元件的激活水平的变化和基于是否存在可激活元件的激活的变化来分类细胞的方法。在一些实施方式中，变化为增加。在一些实施方式中，变化为降低。
在一些实施方式中，本发明涉及通过将调节剂施用于细胞来确定非诱导性信号传导状态、确定细胞内参与非诱导性信号传导途径的可激活元件的激活水平和基于激活水平来确定细胞中非诱导性信号传导途径的状态的方法。细胞中的非诱导性信号传导可具有功能性结果，例如，来维持特定的分化细胞的性质或功能。在本发明的一些实施方式中，非诱导性信号传导途径的状态用于将状态与群中的差异相关联。
在一些实施方式中，本发明涉及通过在不同培养基中将多个调节剂施用于细胞群(其中至少一种调节剂为抑制剂)来确定细胞群的表型谱、确定在各不同培养基中的细胞群中是否存在可激活元件的激活水平的增加和基于在各不同培养基中是否存在可激活元件的激活的增加来对细胞群进行分类的方法。
在一些实施方式中，本发明涉及通过将细胞群与至少一种调节剂相作用(其中调节剂为F(ab)2IgM、H2O2、PMA、BAFF、April、SDF1a、CD40L、IGF-1、咪喹莫特、polyCpG、IL-7、IL-6、IL-10、IL-27、IL-4、IL-2、IL-3、毒胡萝卜素和/或其组合)来分类细胞群、确定细胞群中是否存在可激活元件的激活水平的增加和基于是否存在可激活元件的激活的增加来对细胞群进行分类的方法。
在一些实施方式中，本发明涉及通过向来自个体的CLL细胞施用调节剂(其中CLL细胞表达B细胞受体(BCR))以基于个体的临床结果来关联和/或分类CLL细胞的激活状态、确定多个可激活元件的激活水平和识别多个可激活元件的激活水平的模式以确定是否存在临近BCR的信号传导的改变(其中存在改变为临床结果的指征)的方法。
在一些实施方式中，分类细胞的方法包括将细胞与抑制剂相接触、确定所述细胞中是否存在至少一种可激活元件的激活水平的变化以及基于是否存在至少一种所激活元件的激活水平的所述变化来分类所述细胞。在一些实施方式中，变化为增加。在一些实施方式中，变化为减少。
在一些实施方式中，分类细胞的方法还包括确定细胞内标记、细胞表面标记或其任何组合的水平。例如，细胞可以通过可激活元件的激活水平的变化进行分类，也可以通过一个或多个细胞表面标记的水平进行分类。另外，细胞可以通过可激活元件的激活水平的变化和细胞内标记的水平进行分类。还可以使用组合。血清标记也可用于诊断、预后、确定疗法有效性和/或选择疗法的方法中。
除了细胞内标记(例如磷蛋白)外，一个或多个细胞表面标记也可用于本发明的方法中。在一些实施方式中，方法包括确定多个细胞表面标记的水平。细胞表面标记包括任何可通过流式细胞术检测的细胞表面分子。在一些实施方式中，细胞表面标记为人类白细胞分化抗原。在一些实施方式中，人类白细胞分化抗原选自：CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD14、CD19、CD20、CD22、CD23、CD40、CD52、CD100、CD280、CD281、CD282、CD283、CD284和CD289。在一些实施方式中，人类白细胞分化抗原选自从CD1到CD300。在一些实施方式中，细胞表面标记为任何细胞表面受体或配体。细胞表面配体和受体的例子包括但不局限于TNF超家族成员、白细胞介素、激素、神经递质、干扰素、生长因子、趋化因子、整合素、toll样受体配体、前列腺素或白三烯家族。其它的细胞表面标记的例子包括但不局限于金属蛋白酶。在一些实施方式中，细胞表面标记为膜结合IgM。在一些实施方式中，细胞表面标记为B细胞受体(BCR)或BCR组分。在一些实施方式中，标记为CD45、CD5、CD14、CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD37、CD40、CD52、CD79、CD38、CD96、主要的组织相容性抗原(MHC)1型或MHC2型。在一些实施方式中，细胞表面标记为膜结合IgD。在一些实施方式中，细胞表面标记为膜结合IgG。在一些实施方式中，分类细胞的方法包括确定所述细胞上至少一个细胞表面标记的水平和所述细胞上至少一种可激活元件的激活水平。在一些实施方式中，分类细胞的方法包括确定所述细胞上细胞表面IgM的水平。在一些实施方式中，方法包括确定所述细胞上细胞表面IgD的水平。在一些实施方式中，分类细胞的方法包括确定所述细胞上BCR的水平。在一些实施方式中，细胞表面标记与疾病或病症相关。在一些实施方式中，标记为CD38或CD96。在一些实施方式中，标记为CD38，病症为白血病。在一些实施方式中，标记为CD96，病症为白血病。
本发明的方法可使用一个或多个细胞内标记。这些标记的水平可在它们被分泌之前确定，被称为“捕获的”。捕获的细胞内标记的例子包括但不局限于TNF超家族成员、白细胞介素、激素、神经递质、干扰素、生长因子、趋化因子、整合素、前列腺素、白三烯和以上所有的受体。细胞内标记的例子还包括但不局限于金属蛋白酶。细胞内标记的例子还包括但不局限于参与细胞程序性死亡和增殖的蛋白质。细胞内标记的例子还包括但不局限于病毒、病原体、寄生虫及其组分或产物。在一些实施方式中，分类细胞的方法还包括确定细胞内病原体或病原体组分的水平。在一些实施方式中，细胞内病原体为HIV。在一些实施方式中，细胞内病原体为EBV。在一些实施方式中，细胞内病原体组分为来自所述病原体的核酸序列。在一些实施方式中，细胞内病原体组分为病原体源性多肽。
本发明的方法可包括确定一个或多个血清标记的水平。在一些实施方式中，血清标记为病症的标记。在一些实施方式中，血清标记为炎症的标记。在一些实施方式中，血清标记为可溶性细胞因子、TNF超家族成员、白细胞介素、激素、神经递质、干扰素、生长因子、趋化因子、整合素、前列腺素、白三烯或其任何可溶性受体。在一些实施方式中，血清标记为特定疾病或病症的标记。在一些实施方式中，血清标记为癌症的标记。在一些实施方式中，血清标记为白血病的标记。在一些实施方式中，血清标记为β-2-微球蛋白、降钙素、CD20、CD23、CD52、IL6、IL2R、ICAM-1、CD14、IgG、胸苷激酶或铁蛋白。在一些实施方式中，血清标记为药品、病原体、病毒、寄生虫、小化合物或毒素。因此，在一些实施方式中，此处所述方法用于诊断、预后或确定受试者或患者的治疗方法。在一些实施方式中，方法包括分类细胞或细胞群。在某些实施方式中，诊断、预后或确定治疗方法的方法包括确定来自受试者或患者的至少一种血清标记的水平。在一些实施方式中，血清标记为细胞因子、趋化因子、可溶性受体、生长因子、抗体或结合蛋白。在一些实施方式中，血清标记为病原体。在一些实施方式中，细胞标记为药用化合物或药物。
本发明还提供了用于确定样品中细胞生理状态的试剂盒，该试剂盒包括信号传导分子的一种或多种特定的结合元件和可选地包括一种或多种治疗剂。该试剂盒还可包括用于生理状态数据分析的软件，该软件可包括与实验曲线进行比较的对照曲线。
方法
在一些实施方式中，本发明提供的方法包括例如在与一个或多个调节剂接触之后通过确定可激活元件的激活水平来确定细胞生理状态的方法。在一些实施方式中，发明提供的方法包括根据信号传导通路中可激活元件的状态来分类细胞的方法。信息可用于预后和诊断，包括疑似疾病、疾病阶段的状态和对环境变化的响应，例如传代时间、使用药物或其它方式治疗。样品(例如临床样品)细胞的生理状态可根据兴趣细胞途径的激活进行分类。细胞也可根据它们对治疗剂和治疗的响应能力分类。
可从身体样品中分离出一个或多个细胞或含有一个多个细胞的样品，例如但不局限于涂片、痰、活组织检查、分泌物、脑脊液、胆汁、血液、淋巴液、尿液和粪便、组织或器官(例如肺)的灌洗液或从器官(例如胸、肺、肠、皮肤、子宫颈、前列腺和胃)中移除的组织。例如，组织样品可包含功能相关的细胞或邻近细胞的区域。这些样品可包含可作为群或分离为亚群来测定的细胞群复合物。这些细胞和非细胞样品可通过离心、淘析、密度梯度分离、血浆分离置换法、亲和选择、淘洗、FACS、泛影钠离心等而分离。通过使用在特定细胞类型中鉴别的标记特异性的抗体可以得到相对同源细胞群。可选择的，也可得到异源细胞群。细胞还可使用过滤器分离。例如，可将全血通过针对理想的细胞类型或种类设计带有特定孔径的过滤器。少见的病理细胞可从稀释液中过滤出来，全血在红细胞溶解后通过孔径为5到10μm的过滤器过滤，公开于美国专利申请No.09/790,673。其它装置可从血流中分离出肿瘤细胞，参见Demirci U，Toner M.，Directetch method for microfluidic channel and nanoheight post-fabrication bypicoliter droplets，Applied Physics Letters 2006；88(5)，053117；和Irimia D，Geba D，Toner M.，Universal microfluidic gradient generator，Analytical Chemistry 2006；78：3472-3477。一旦得到样品，可直接使用、冷冻或短期内保存在适合的培养基中。根据本发明方法分离的一种或多种使用的细胞的方法可按照本领域公知的标准技术和实验设计进行操作。
合适的细胞包括那些与各种疾病病症甚至与非疾病状态相关的细胞类型。因此，合适的真核细胞类型包括但不局限于所有类型的肿瘤细胞(例如黑素瘤、骨髓性白血病、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌和睾丸癌)、心肌细胞、树状突细胞、内皮细胞、上皮细胞、淋巴细胞(T细胞和B细胞)、肥大细胞、嗜酸性细胞、血管内膜细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞、红细胞、肝细胞、包括单核白细胞的白细胞、干细胞(例如造血、中性、皮肤、肺、肾、肝和肌细胞(用于筛选分化和去分化因子)干细胞)、破骨细胞、软骨细胞和其它结缔组织细胞、角质化细胞、黑素细胞、肝细胞、肾细胞和脂肪细胞。合适的细胞还包括原发病态细胞，例如原发肿瘤细胞。合适的细胞还包括已知的研究细胞，包括但不局限于Jurkat T细胞、NIH3T3细胞、CHO、COS等。参见ATCC细胞系目录，在此以引用的方式结合于本文。
在一些实施方式中，细胞在收集后置于适合显示可激活元件(例如RPMI、DMEM)的激活水平的包合或不包含血清(例如胎牛血清、牛血清、人血清、猪血清、马血清或山羊血清)的培养基中培养。例如果培养基中存在血清，血清的水平为0.0001％至100％。在一些实施方式中，培养基中血清的水平为0.0001％至90％。在一些实施方式中，培养基中血清的水平为0.01％至30％。在一些实施方式中，培养基中血清的水平为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％。在一些实施方式中，培养基中血清为任何合适的水平。
在一些实施方式中，细胞为造血细胞。造血细胞的例子包括但不局限于多功能造血干细胞、B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞、T淋巴细胞系祖细胞或分化细胞、NK细胞系祖细胞或分化细胞、粒细胞系祖细胞或分化细胞、单核细胞系祖细胞或分化细胞、巨核细胞系祖细胞或分化细胞和红细胞系祖细胞或分化细胞。
在一些实施方式中，本发明所用的细胞取自患者。本发明所用的细胞可通过任何合适的方法从全血中纯化。
此处所用术语“患者”或“个体”包括人类和其它哺乳动物。方法通常包括确定一个可激活元件的状态。方法还包括确定多个可激活元件的状态。
在一些实施方式中，本发明提供了通过确定在经过一个或多个调节剂处理之后细胞中是否存在可激活元件的激活水平的变化来分类细胞和基于是否存在可激活元件的激活的变化来分类细胞的方法。在一些实施方式中，该变化为降低。在一些实施方式中，该变化为增加。在本发明的一些实施方式中，可激活元件的激活水平是通过将细胞与对可激活元件的激活状态有特异性的结合元件相接触来确定。在一些实施方式中，根据将调节剂施用于细胞之后多个可激活元件的激活水平来进行细胞分类。在本发明的一些实施方式中，多个可激活元件的激活水平是通过将细胞与多个可激活元件相接触来确定，其中各结合元件对可激活元件的激活状态有特异性。
根据可激活元件状态的细胞分类包括将细胞作为与临床结果相关联的细胞进行分类。在一些实施方式中，临床结果为病症的预后和/或诊断。在一些实施方式中，临床结果为是否存在瘤形成或造血病症，例如非霍奇金淋巴瘤、霍奇金或其它淋巴瘤、急性或慢性白血病、红细胞增多症、血小板增多症、多发性骨髓瘤或浆细胞异常(例如淀粉样变性和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、骨髓增生紊乱、骨髓增生障碍、骨髓纤维化或非典型免疫淋巴细胞增生。在一些实施方式中，瘤形成或造血病症为非B细胞系源性的，例如急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、非B细胞急性骨髓性白血病(ALL)、非B细胞淋巴瘤、骨髓增生紊乱、骨髓增生障碍、骨髓纤维化、红细胞增多症、血小板增多症或非B细胞非典型免疫淋巴细胞增生、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B淋巴细胞系白血病、B淋巴细胞系淋巴瘤、多发性骨髓瘤或浆细胞异常(例如淀粉样变性或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)。在一些实施方式中，临床结果为是否存在瘤形成或造血病症，例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B淋巴细胞系白血病、B淋巴细胞系淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞幼淋巴细胞性白血病、前体B淋巴母细胞性白血病、毛细胞性白血病或浆细胞异常(例如淀粉样变性或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、B细胞淋巴瘤(包括但不局限于弥散性大B细胞淋巴瘤)、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、小细胞淋巴性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和边缘区淋巴瘤。在一些实施方式中，病症为CLL。在一些实施方式中，临床结果为瘤形成或造血病症的分期或分级。分期的例子包括但不局限于侵袭性、无痛、良性、顽固性、罗马数字分期、TNM分期、Rai分期、Binet分期、WHO分类、FAB分类、IPSS评分、WPSS评分、局限期、扩散期、根据例如ZAP70和CD38的细胞标记的分期、隐性，其包括能够及时传达恶化、无恶化存活率、整体存活率和无意外存活率的信息。
根据可激活元件的状态的细胞分类包括将细胞作为与患者对治疗的响应相关的细胞进行分类。在一些实施方式中，患者的响应选自完全响应、部分响应、结节性部分响应、无响应、疾病的进行、疾病的稳定和副作用。
根据可激活元件的状态的细胞分类包括将细胞作为与微小残留病或形成耐药性相关的细胞进行分类。
根据可激活元件的状态的细胞分类包括选择治疗方法。治疗方法的例子包括但不局限于化疗、生物疗法、放射疗法、骨髓移植、外周干细胞移植、脐带血移植、自体干细胞移植、异基因干细胞移植、同基因干细胞移植、手术、诱导治疗、维持治疗、观察等待治疗和整体/替代疗法。
调节剂包括能影响细胞信号传导网络的化合物或条件。调节剂可为激活剂或抑制剂。调节剂可采取各种环境输入的形式。调节剂的例子包括但不局限于生长因子、细胞因子、趋化因子、可溶性受体、Toll样受体配体、病原体、寄生虫、病原体或寄生虫组分、黏附分子调节剂、药用化合物、药物、激素、小分子、多核苷酸、抗体、天然化合物、内酯、化疗试剂、免疫调节剂、碳水化合物、蛋白酶、离子、活性氧族、辐射、物理学参数(例如热、冷、UV辐射)、肽和蛋白质片段，它们可为单独或以细胞内、细胞自身、病毒和生物和非生物复合物(例如珠粒、板、病毒包膜、例如主要的组织相容性复合体的抗原代表分子)的形式。调节剂的例子包括但不局限于F(ab)2IgM、B细胞单克隆抗体、阿仑单抗、氟达拉滨、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、抗CD22(依帕珠单抗)、抗CD23(鲁昔单抗)、H2O2、PMA、BAFF、April、SDF1a、CD40L、IGF-1、咪喹莫特、polyCpG、IL-7、IL-6、IL-10、IL-27、IL-4、IL-2和IL-3。其它的调节剂、抑制剂和激活剂公开于美国61/085,789，全文以引用的方式结合在本文中。
在一些实施方式中，调节剂为激活剂。在一些实施方式中，调节剂为抑制剂。在一些实施方式中，本发明提供了通过将细胞与抑制剂相接触来分类细胞、确定细胞中是否存在可激活元件的激活水平的变化和基于是否存在可激活元件的激活的变化来分类细胞的方法。在一些实施方式中，该变化为降低。在一些实施方式中，该变化为增加。在一些实施方式中，根据将抑制剂施用于细胞之后多个可激活元件的激活水平来分类细胞。在一些实施方式中，抑制剂为细胞中参与信号级联放大的细胞因子或多个因子的抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂为激酶或磷酸酶抑制剂。激酶抑制剂的例子包括adaphostin、AG490、AG 825、AG 957、AG 1024、aloisine、aloisine A、alsterpaullone、aminogenistein、API-2、芹菜素、牛蒡子素、AY-22989、BAY 61-3606、双吲哚马来酰亚胺IX、白屈菜红碱、10-[4′-(N，N-二乙氨基)丁基]-2-氯代吩噁嗪盐酸盐、达沙替尼、2-二甲氨基-4，5，6，7-四溴代-1H-苯并咪唑、5，7-二甲氧基-3-(4-吡啶基)喹啉二盐酸化物、依地福新、鞣花酸、enzastaurin、ER 27319马来酸盐、埃罗替尼、ET18OCH3、法舒地尔、flavopiridol、吉非替尼、GW 5074、H-7、H-8、H-89、HA-100、HA-1004、HA-1077、HA-1100、羟基法舒地尔、靛红-3’-肟、5-碘代杀结核菌素、kenpaullone、KN-62、KY12420、LFM-A13、薰草菌素A、木犀草素、LY-294002、LY294002、楸毒素、ML-9、NSC-154020、NSC-226080、NSC-231634、NSC-664704、NSC-680410、NU6102、奥罗莫星、羟吲哚I、PD-153035、PD-98059、PD 169316、根皮素、根皮苷、云鞣杉醇、鬼臼苦素、PKI、PP1、PP2、purvalanol A、槲皮素、R406、R788、雷帕鸣、雷帕霉素、Ro 31-8220、roscovitine、粗糠柴毒、SB202190、SB203580、西罗莫司、索拉非尼、SL327、SP600125、十字孢碱、STI-571、SU-11274、SU1498、SU4312、SU6656、4，5，6，7-四溴代三唑、TG 101348、曲西立滨、Tyrphostin AG 490、Tyrphostin AG 825、Tyrphostin AG 957、Tyrphostin AG 1024、Tyrphostin SU1498、U0126、VX-509、VX-667、VX-680、W-7、沃特曼宁、XL-019、XL-147、XL-184、XL-228、XL-281、XL-518、XL-647、XL-765、XL-820、XL-844、XL-880、Y-27632、ZD-1839、ZM-252868、ZM-447439。磷酸酶抑制剂的例子包括但不局限于H2O2、siRNA、miRNA、斑蝥素、(-)-对溴四咪唑、微囊藻素LR、原钒酸钠、过钒酸钠、硫酸氧钒、氧代二过氧(1，10-菲咯啉)钒酸钠、联麦芽酚氧钒(IV)、钼酸钠、过钼酸钠、酒石酸钠、咪唑、氟化钠、β-甘油磷酸酯、十水焦磷酸盐钠、花萼海绵诱癌素A、Discodermia calyx、bpV(phen)、mpV(pic)、DMHV、氯氰菊酯、Dephostatin、冈田酸、NIPP-1、N-(9，10-二氧代-9，10-二氢-菲-2-基)-2，2-二甲基-丙酰氨、α-溴代-4-羟基苯乙酮、4-羟基苯甲酰甲基溴、α-溴代-4-甲氧基苯乙酮、4-甲氧基苯甲酰甲基溴、α-溴代-4-(羧基甲氧基)苯乙酮、4-(羧基甲氧基)苯甲酰甲基溴和双(4-三氟甲基磺酰氨基苯基)-1，4-二异丙基苯、氧化苯砷、吡咯烷二硫代氨基甲酸和氟化铝。在一些实施方式中，磷酸酶抑制剂为H2O2。
在一些实施方式中，本发明方法提供了通过将调节剂或抑制剂施用于个体细胞来确定个体中是否存在病症、确定细胞中可激活元件的激活水平和基于激活水平来确定是否存在病症的方法。在一些实施方式中，细胞中多个可激活元件的激活水平被确定。抑制剂可为在此描述的抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂为磷酸酶抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂为H2O2。调节剂可为在此描述的任何调节剂。在一些实施方式中，调节剂为B细胞受体调节剂。在一些实施方式中，B细胞受体调节剂为B细胞受体激活剂。B细胞受体激活剂的例子为B细胞受体复合物或B细胞辅助受体复合物交联剂。在一些实施方式中，交联剂为抗体或分子结合体。在一些实施方式中，交联剂为抗体。在一些实施方式中，抗体为多价抗体。在一些实施方式中，抗体为一价、二价或多价抗体，更多价态通过连接在固体表面或栓在纳米颗粒表面以增强抗原决定部位结合域的局部化合价。
交联剂可为分子结合体。在一些实施方式中，分子结合体通过复合物中的碳水化合物或抗原决定部位作用于或结合在B细胞受体复合物上。在一些实施方式中，分子为一价、二价或多价态，更多价态通过连接在固体表面或栓在纳米颗粒表面以增强抗原决定部位结合域的局部化合价。
B细胞受体复合物或B细胞辅助受体复合物的交联包括使抗体或分子交联实体与细胞相结合，然后通过细胞与固体表面的作用来产生交联，该固体表面可通过抗体或分子结合体与BCR复合物产生交联。
交联剂可为F(ab)2IgM、IgG、IgD、多克隆BCR抗体、单克隆BCR抗体、Fc受体源性结合元件和/或其组合。Ig可来自选自小鼠、山羊、兔、猪、大鼠、马、牛、鲨鱼、鸡、美洲驼或人类中的一个物种。Ig或连接元件可全部为人类的或部分为人类的，并可通过本领域已知的任何合适的方法产生。在一些实施方式中，交联剂为F(ab)2IgM、多克隆IgM抗体、单克隆IgM抗体、生物素化F(ab)2IgCM、生物素化多克隆IgM抗体、生物素化单克隆IgM抗体和/或其组合。
在一些实施方式中，本发明的方法使用多于一种的调节剂。在一些实施方式中，本发明的方法使用B细胞受体激活剂或磷酸酶抑制剂。在一些实施方式中，本发明方法使用F(ab)2IgM或生物素化F(ab)2IgM和H2O2。
在一些实施方式中，本发明的方法提供了通过在不同培养基中将多个调节剂施用于细胞群来分类细胞群和确定细胞群中可激活元件的状态的方法。在一些实施方式中，细胞群中多个可激活元件的状态被确定。在一些实施方式中，多种调节剂中至少一种为抑制剂。调节剂为在此所述的任何调节剂。在一些实施方式中，调节剂选自F(ab)2IgM、H2O2、PMA、BAFF、April、SDF1a、CD40L、IGF-1、咪喹莫特、polyCpG、IL-7、IL-6、1L-10、IL-27、IL-4、IL-2、IL-3、毒胡萝卜素及其组合。在本发明的一些实施方式中，可激活元件的状态可通过将细胞群与特异于可激活元件的激活状态的结合元件相接触来确定。在一些实施方式中，多个可激活元件的状态可通过将细胞群与多个结合元件相接触来确定，其中各结合元件特异于可激活元件的激活状态。
在一些实施方式中，本发明方法提供了通过将细胞群与至少一种调节剂相接触来分类细胞群以及确定细胞群中可激活元件的状态的方法，其中所述调节剂为F(ab)2IgM、细胞单克隆抗体、阿仑单抗、抗CD22(依帕珠单抗)、抗CD23(鲁昔单抗)、坎帕斯、H2O2、PMA、BAFF、April、SDF1a、CD40L、IGF-1、咪喹莫特、polyCpG、氟达拉滨、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、IL-7、IL-6、IL-10、IL-27、IL-4、IL-2、IL-3、毒胡萝卜素和/或其组合。在一些实施方式中，细胞群中多个可激活元件的状态被确定。在本发明的一些实施方式中，可激活元件的状态可通过将细胞群与特异于可激活元件的激活状态的结合元件相接触来确定。在一些实施方式中，多个可激活元件的状态可通过将细胞群与多个结合元件相接触来确定，其中各结合元件特异于可激活元件的激活状态。
在一些实施方式中，本发明的方法提供了通过在不同培养基中将多种调节剂施用于细胞群(其中至少一种调节剂为抑制剂)来确定细胞群的表型谱、确定在各不同培养基中细胞群中是否存在可激活元件的激活水平的变化和基于在各所述不同培养基中是否存在可激活元件的激活的变化来分类细胞群的方法。在一些实施方式中，该变化为降低。在一些实施方式中，该变化为增加。在一些实施方式中，调节剂选自F(ab)2IgM、B细胞单克隆抗体、阿仑单抗、抗CD22(依帕珠单抗)、抗CD23(鲁昔单抗)、坎帕斯、H2O2、PMA、BAFF、April、SDF1a、CD40L、IGF-1、咪喹莫特、polyCpG、氟达拉滨、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、IL-7、IL-6、IL-10、IL-27、IL-4、IL-2、IL-3、毒胡萝卜素和/或其组合。在一些实施方式中，细胞群中多个可激活元件的状态被确定。在一些实施方式中，细胞群的表型谱被用于分类在此所述细胞群。在一些实施方式中，是否存在可激活元件的激活水平的增加是通过将细胞群与特异于可激活元件的激活状态的结合元件相接触而确定的。在一些实施方式中，多个可激活元件的状态是通过将细胞群与多个连接元件相接触而确定的，其中各连接元件特异于可激活元件的激活状态。
在一些实施方式中，本专利提供了通过将细胞与调节剂相接触来分类在此所述B淋巴细胞祖细胞或分化细胞、确定在细胞中是否存在可激活元件的激活水平的变化和基于是否存在可激活元件的激活的变化来分类细胞的方法。在一些实施方式中，变化为降低。在一些实施方式中，变化为增加。在一些实施方式中，是否存在可激活元件的激活水平的变化是通过将细胞与特异于可激活元件的激活状态的结合元件相接触而确定的。在一些实施方式中，根据将调节剂施用于细胞之后多个可激活元件的激活水平来分类B淋巴细胞祖细胞或分化细胞。在一些实施方式中，是否存在多个可激活元件的激活水平的变化是通过将细胞群与多个连接元件相接触来确定的，其中各连接元件特异于可激活元件的激活状态。在一些实施方式中，分类B淋巴细胞祖细胞或分化细胞的方法还包括确定至少一种细胞表面标记的水平。在一些实施方式中，分类B淋巴细胞祖细胞或分化细胞的方法还包括确定至少一种细胞内标记(例如捕获的细胞内细胞因子)的水平。在一些实施方式中，B淋巴细胞祖细胞或分化细胞与病症(例如瘤形成或造血病症)相关。因此，在一些实施方式中，本发明提供了通过将细胞与调节剂相接触来分类与病症(例如瘤形成或造血病症)相关的B淋巴细胞祖细胞或分化细胞、确定细胞中是否存在一种或多种可激活元件的激活水平的变化和基于一种或多种可激活元件的激活的变化来分类细胞的方法。在一些实施方式中变化为降低。在一些实施方式中，变化为增加。
在一些实施方式中，本发明提供了通过将调节剂(其中CLL细胞表达B细胞受体(BCR))施用于个体的CLL细胞从而基于个体的临床结果来关联和/或分类CLL细胞的激活状态、确定多个可激活元件的激活水平和识别多个可激活元件的激活水平的模式以确定是否存在临近BCR的信号传导的改变(其中存在改变为临床结果的指征)的方法。在一些实施方式中，多个可激活元件的激活水平是通过将细胞与多个结合元件相接触来确定的，其中各结合元件特异于可激活元件的激活状态。临床结果为在此所述的任何临床结果。
在一些实施方式中，本发明的方法提供了通过将调节剂施用于细胞来确定细胞非诱导性信号传导的状态、确定在细胞内参与非诱导性信号传导途径的可激活元件的激活水平和基于激活水平来确定细胞内非诱导性信号传导途径的状态的方法。在一些实施方式中，细胞群中多个可激活元件的状态被确定。在一些实施方式中，可激活元件的激活水平是通过将细胞与特异于可激活元件的激活状态的结合元件相接触而确定的。在一些实施方式中，多个可激活元件的激活水平是通过将细胞与多个结合元件相接触而确定的，其中结合元件特异于可激活元件的激活状态。在一些实施方式中，非诱导性信号传导为细胞受体非诱导性信号传导。在一些实施方式中，非诱导性信号传导为T细胞受体(TCR)的非诱导性信号传导。在一些实施方式中，非诱导性信号传导为BCR的非诱导性信号传导。在一些实施方式中，细胞中非诱导性信号传导的状态用于分类在此所述的细胞。
一个或多个可激活元件的模式和曲线可使用包括那些在此所述的本领域已知的方法进行检测。在一些实施方式中，可使用在此所述的方法来检测作为细胞途径中细胞组分的可激活元件的模式和曲线。在一些实施方式中，可使用在此所述的方法来检测作为信号传导途径中细胞组分的可激活元件的模式和曲线。在一些实施方式中，可使用在此所述的方法来检测作为非诱导性信号传导途径中细胞组分的可激活元件的模式和曲线。例如，可使用包括那些在此所述的本领域已知的方法来检测一个或多个磷酸化多肽的模式和曲线。
在此所述方法的一些实施方式中，细胞(例如正常的非转化的细胞)而不是与病症相关联的细胞(例如癌细胞)可用于做出临床决定。也就是说正常细胞而不是与病症相关联的细胞(例如癌症细胞)事实上是病症过程的反映。正常细胞(例如健康细胞或非转化的细胞)可用于例如分配风险组、预测增加的复发风险、预测增加的发生继发症的风险、为个体选择疗法、预测个体对疗法的响应、确定疗法对个体的有效性和/或确定个体的预后。也就是说正常细胞而不是与病症相关的细胞(例如癌症细胞)事实上是病症过程的反映。例如，在一个癌症病例中，浸润性免疫细胞可预测疾病的结果。另一方面，来自癌症患者血液中癌症细胞和响应的免疫细胞的信息的组合可用于癌症的诊断和预后。
病症
本发明的方法可适用于个体中的任何病症，该病症全部或部分地涉及、表明和/或产生于细胞中变化的生理状态。术语“生理状态”包括细胞中机械、物理和生物化学功能。在一些实施方式中，细胞的生理状态是通过测量细胞途径中的细胞组成的特征确定的。细胞途径是本领域公知的。在一些实施方式中，细胞途径为信号传导途径。信号传导途径也是本领域公知的(参见例如Hunter T.，Cell(2000)100(1)：113-27；Cell Signaling Technology，Inc.，2002 Catalogue，Pathway Diagrams pgs.232-253)。涉及或以改变的生理状态为特征的病症可被容易地识别，例如通过确定一个或多个可激活元件在细胞中的状态，正如在此所述。
在本发明的某些实施方式中，病症为瘤形成或造血病症。在一些实施方式中，瘤形成或造血病症选自非霍奇金淋巴瘤、霍奇金或其它淋巴瘤、急性或慢性白血病、红细胞增多症、血小板增多症、多发性骨髓瘤和浆细胞异常(包括淀粉样变性和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、骨髓增生紊乱、骨髓增生障碍、骨髓纤维化和非典型免疫淋巴细胞增生。
在一些实施方式中，瘤形成或造血病症为非B细胞系源性的。非B细胞源性的瘤形成或造血病症的例子包括但不局限于急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、非B细胞急性骨髓性白血病(ALL)、非B细胞淋巴瘤、骨髓增生紊乱、骨髓增生障碍、骨髓纤维化、红细胞增多症、血小板增多症和非B细胞非典型免疫淋巴细胞增生。
在一些实施方式中，瘤形成或造血病症为B细胞或B细胞系源性异常。B细胞或B细胞源性的瘤形成或造血病症的例子包括但不局限于慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B淋巴细胞系白血病、B淋巴细胞系淋巴瘤、多发性骨髓瘤和浆细胞异常(包括淀粉样变性和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)。
在一些实施方式中，病症为CLL。在一些实施方式中，CLL由共表达CD5及CD19和CD23或CD5及CD20和CD23的单克隆B细胞群和表面免疫球蛋白的表达所限定。在一些实施方式中，CLL由共表达CD5及CD19和CD23或CD5及CD20和CD23的单克隆B细胞群和暗表面免疫球蛋白的表达所限定。
本专利范围内的其它病症包括但不局限于神经胶癌症，例如胶质瘤、肺癌、结肠癌和前列腺癌。已经描述了多种癌症中的特定的信号传导途径，包括PTEN缺失和导致在前列腺癌Akt信号传导的激活(Whang Y E.Proc Natl Acad Sci USA Apr.28，1998；95(9)：5246-50)、前列腺癌中IGF-1表达的增加(Schaefer等人，Science October 9 1998，282：199a)、胶质瘤中EGFR的过表达和导致ERK的激活(Thomas C Y.Int J Cancer Mar.10，2003；104(1)：19-27)、乳腺癌中HER2的表达(Menard等人Oncogene.Sep 29 2003，22(42)：6570-8)和结肠癌中APC突变和Wnt信号传导的激活(Bienz M.Curr Opin Genet Dev 1999October，9(5)：595-603)。
除了涉及具有生理状态变化的癌症外，本发明还包括其它疾病。例如，有人指出糖尿病涉及隐含的信号传导改变，也就是说对胰岛素耐药和无法通过IRS激活下游的信号传导(Burks D J，White M F.Diabetes 2001 February；50Suppl 1：S140-5)。类似的，心血管疾病也显示出涉及多个途径的心脏细胞(例如PKC家族)肥大(Malhotra A.MolCell Biochem 2001 September；225(1-)：97-107)。炎症性疾病(例如风湿性关节炎)已知涉及趋化因子受体和中断的下游信号传导(D′Ambrosio D.J Immunol Methods 2003 February；273(1-2)：3-13)。本发明不局限于目前所知涉及细胞功能改变的疾病，也包括随后表现为生理改变或异常的疾病。
在一些实施方式中，本发明涉及用于分类来自患有或可能患有病症的个体样品中一种或多种细胞的方法。在一些实施方式中，本发明能够识别预后或治疗相关的病症亚组和预测个体的临床过程。在一些实施方式中，本发明提供了根据来自患有或可能患有病症的个体的细胞中一个或多个可激活元件的激活水平来分类细胞的方法。在一些实施方式中，分类包括将细胞作为与临床结果相关的细胞进行分类。临床结果可为病症的预后和/或诊断，和/或病症的分期或分级。在一些实施方式中，分类细胞包括将细胞作为与患者对治疗的响应的细胞进行分类。在一些实施方式中，细胞的分类包括将细胞作为与微小残留病或形成耐药性相关的细胞进行分类。
可激活元件
本发明的方法和组合物可用于检查和描绘细胞途径中任何可激活元件的状态或这些可激活元件的集合。可以描绘(顺序地或同时地)单个或多个不同的途径或可以检查(也是顺序地或同时地)单个途径中或跨多个途径中的可激活元件的子集。
本领域中技术人员可以理解，各种激活事件可用于本发明中。一般来说，基本的要求是激活会导致可激活蛋白质的变化，该变化优化通过标记的结合元件的结合改变或通过可检测的生物活性的变化(例如激活的状态具有可被测量且可与非激活状态中活性的缺乏相比较的酶活性)可被一些指征(称为“激活状态指示剂”)检测出。重要的是通过使用可检测的事件或部分来区分两个或多个活性状态(例如“关”和“开”)。
个体的可激活元件的活性状态为开或关的状态。作为示例性的例子且不意于局限于任何理论，蛋白质中个别的可磷酸化位点可使蛋白质激活或失活。当作为细胞组成的一部分的可激活元件使用时，术语“开”和“关”在此处用于描述可激活元件的状态，而不是将可激活元件作为一部分的细胞组成的总体状态。典型的，细胞包合多个特定的蛋白质或其它具有特定的可激活元件的组成，多个蛋白质或组成通常含有一些个别的可激活元件为开的状态的蛋白质或组成和其它个别的可激活元件为关的状态的蛋白质和组成。因为各可激活元件的激活状态可通过使用可识别特定的激活状态的结合元件来测量，只有那些可被结合元件识别的、处于特定的激活状态中的可激活元件(代表可激活元件总数的一部分)才会被结合元件结合以产生可测量的信号。对应于单个细胞中激活的特定类型的单个可激活元件的总和的可测量信号为该细胞中可激活元件的“激活水平”。
特定的可激活元件的激活水平可在个体细胞中呈现多样化，以至于当分析多个细胞时激活水平遵循一定的分布。该分布可为正态分布(还被称为高斯分布)或另一类型的分布。不同细胞群的激活水平可具有不同的分布，这些分布继而可用于区别不同的群。在一些实施方式中，分类细胞的基础是：一个或多个特定的可激活元件的激活水平的分布在不同的表型中不同。细胞或细胞群中可见的一个或多个可激活元件的某种激活水平或更典型地激活水平的范围指示着该细胞或细胞群属于独特的表型。还可使用除了可激活元件的激活水平之外的其它测量(例如可能不含有可激活元件的生物分子的细胞水平(例如表达水平))来分类细胞；可以理解的是，这些水平也遵循类似于可激活元件的分布。因此，细胞或细胞群中的一个或多个可激活元件的一个或多个激活水平以及可选择地一个或多个可能不含有可激活元件的生物分子的水平可用于分类细胞或细胞群。一旦知道单细胞的细胞内可激活元件的激活水平，它们就可被归于一个或多个类型，例如与表型对应的类型。类型包括细胞的类型，其中各细胞具有相同或基本相同的一个或多个细胞内可激活元件的已知激活水平或激活水平的范围。例如，如果分析五个细胞内可激活元件的激活水平，可以基于这五个元件中各个的激活水平或激活水平的范围来构建包括一个或多个细胞内可激活元件的预定义类型。可以理解的，激活水平可作为分布存在，用于分类细胞的特定元件的激活水平可为分布上的特定的点，但更典型地为分布的一部分。
除细胞内可激活元件的激活水平以外，细胞内和细胞外生物分子(例如蛋白质)的表达水平可以单独或与可激活元件的激活状态结合使用以分类细胞。此外，还可以使用其它的细胞元件(例如生物分子或分子复合物(如RNA、DNA、碳水化合物、代谢产物等))和在此所包括的细胞分类中的可激活状态或表达水平。
在一些实施方式中，影响细胞组成的状态的其它特征也可用于分类细胞。例子包括生物分子的异位或其转换率的改变以及生物分子复合物的形成和分解。这种复合物包括多蛋白复合物、多脂类复合物、同或异二聚体或寡聚体及其组合。其它的特征包括溶蛋白性裂解，例如，来自于将细胞接触细胞外蛋白酶或来自于生物分子的细胞内溶蛋白性裂解。
还可以使用其它的元件来分类细胞，例如细胞外或细胞内标记的表达水平、核抗原、酶活性、蛋白质的表达和定位、细胞周期分析、染色体分析、细胞容积和例如核的颗粒度和尺寸的形态特征或其它显著的特征。例如，还可进一步根据细胞表面标记的表达(例如CD45、 CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD37、CD40、CD52、CD79、CD38、CD96、主要的组织相容性抗原(MHC)1型或MHC 2型)来细分B细胞。
可选的，预定义的细胞类型可根据共有的特征进行分类，共有特征包括一个或多个其它的预定义类型中的内含物或存在细胞外和/或细胞内标记、相似的基因表达曲线、突变状态、后生沉默、核抗原、酶活性、蛋白质的表达和定位、细胞周期分析、染色体分析、细胞容积和例如核的颗粒度和尺寸的形态特征或其它显著的特征。
在一些实施方式中，一个或多个细胞的生理状态是通过检测和描绘细胞途径中的一个或多个可激活元件的激活水平而确定的。在一些实施方式中，根据多个可激活元件的激活水平来分类细胞。在一些实施方式中，根据多个可激活元件的激活水平来分类造血细胞。在一些实施方式中，造血细胞的一个或多个可激活元件的激活水平与病症相关。在一些实施方式中，造血细胞的一个或多个可激活元件的激活状态与在此所述的瘤形成或造血病症相关。造血细胞的例子包括但不局限于多功能造血干细胞、骨髓祖细胞、B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞、T淋巴细胞系祖细胞或分化细胞、NK细胞系祖细胞或分化细胞、粒细胞系祖细胞或分化细胞、单核细胞系祖细胞或分化细胞、巨核细胞系祖细胞或分化细胞和红细胞系祖细胞或分化细胞。在一些实施方式中，造血细胞为在此所述的B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞。
在一些实施方式中，样品中单细胞中的一个或多个可激活元件的激活水平被确定。包括可激活元件的细胞组成无局限地包括蛋白质、碳水化物、脂类、核酸和代谢物。可激活元件可为细胞组成的一部分(例如可被磷酸化的蛋白质中的核酸残基)或可为细胞组成自身(例如通过从细胞一部分到另一部分的易位、构型的变化(由于例如pH或离子浓度的变化)、溶蛋白性裂解等而激活的蛋白质)。激活后，可激活元件发生变化，例如可激活元件的共价修饰(例如可激活元件的分子或基团的结合，包括但不局限于磷酸化、乙酰基化、甲基化、遍在蛋白化)或构型改变。这样的改变通常会使包括可激活元件的细胞组成发生特定的生物、生化或物理性质的变化。包括可激活元件的细胞组成的状态尽管不一定是完全地、也在某种程度上通过细胞组成的特定可激活元件的激活状态被确定。例如，蛋白质可包括多个可激活元件，这些元件的特定可激活状态可以总体地确定蛋白质的激活状态；而单个可激活元件的状态不一定为可确定的。其它的因子(例如其它蛋白质的结合、pH、离子浓度、与其它细胞组成的作用等)也可影响细胞组成的状态。
在一些实施方式中，单细胞的多个细胞中可激活元件的激活水平被确定。在一些实施方式中，至少大约2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10个细胞内可激活元件被确定。
可激活元件的激活状态可由化学添加或生物分子的修饰产生，并包括生化过程，例如糖基化、磷酸化、乙酰化、甲基化、生物素酰化、谷氨酰化、甘氨酰化、羟基化、异构化、异戊烯化、豆蔻酰化、脂化、磷酸泛酰巯基乙胺化、硫酸化、ISG化、亚硝基化、棕榈酰化、SUMO化、遍在蛋白化、类泛酸化、瓜氨酸化、酰胺化和双硫键形成、双硫键还原。其它可能的化学添加或生物分子的修饰包括蛋白质羰基的形成、蛋白侧链的直接修饰(例如o-酪氨酸、氯代、硝基酪氨酸和二酪氨酸)和与碳水化合物和脂类衍生物反应产生的蛋白质加合物。其它的修饰可为非共价的，例如与配体结合或与异构的调节剂结合。
包括可激活元件的蛋白质的例子包括但不局限于激酶、磷酸酶、脂质信号传导分子、衔接/支架蛋白、细胞因子、细胞因子调节剂、遍在蛋白酶、黏附分子、细胞骨架/收缩蛋白、异源三聚体G蛋白、小分子量GTPases、鸟嘌呤核苷酸交换因子、GTPase活化蛋白、半胱天冬酶、参与细胞凋亡的蛋白(例如PARP)、细胞周期调节剂、分子侣伴蛋白、代谢酶、小泡运输蛋白、羟化酶、异构酶、脱乙酰基酶、甲基化酶、脱甲基酶、肿瘤抑制基因、蛋白酶、离子通道、分子运载体、转录因子/DNA结合蛋白、转录调节剂和转译调节剂。可激活元件的例子、激活状态以及确定可激活元件的激活水平的方法记载于美国公布号20060073474名为“Methods and compositions fordetecting the activation state of multiple proteins in single cells”和US7,393,656名为“Methods and compositions for risk stratification”，其内容通过引用方式结合于本文中。
在一些实施方式中，蛋白质选自HER受体、PDGF受体、Kit受体、FGF受体、Eph受体、Trk受体、IGF受体、胰岛素受体、Met受体、Ret、VEGF受体、TIE1、TIE2、FAK、Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、Src、Lyn、Fyn、Lck、Fgr、Yes、Csk、Abl、Btk、ZAP70、Syk、IRAKs、cRaf、ARaf、BRAF、Mos、Lim激酶、ILK、Tpl、ALK、TGFβ受体、BMP受体、MEKKs、ASK、MLKs、DLK、PAKs、Mek 1、Mek 2、MKK3/6、MKK4/7、ASK1、Cot、NIK、Bub、Myt 1、Wee1、酪蛋白激酶、PDK1、SGK1、SGK2、SGK3、Akt1、Akt2、Akt3、p90Rsks、p70S6激酶、Prks、PKCs、PKAs、ROCK 1、ROCK 2、Auroras、CaMKs、MNKs、AMPKs、MELK、MARKs、Chk1、Chk2、LKB-1、MAPKAPKs、Pim1、Pim2、Pim3、IKKs、Cdks、Jnks、Erks、IKKAs、GSK3α、GSK3β、Cdks、CLKs、PKR、PI3-激酶1型、2型、3型、mTor、SAPK/JNK1，2，3、p38s、PKR、DNA-PK、ATM、ATR、受体蛋白酪氨酸磷酸酶(RPTPs)、LAR磷酸酶、CD45、非受体酪氨酸磷酸酶(NPRTPs)、SHPs、MAP激酶磷酸酶(MKPs)、双重特异性磷酸酶(DUSPs)、CDC25磷酸酶、低分子量酪氨酸磷酸酶、Eyes absent(EYA)酪氨酸磷酸酶、丝切蛋白磷酸酶(SSH)、丝氨酸磷酸酶、PP2A、PP2B、PP2C、PP1、PP5、肌醇磷酸酶、PTEN、SHIPs、肌管素、磷酸肌醇激酶、磷脂酶、前列腺素合成酶、5-脂肪氧化酶、鞘氨醇激酶、神经鞘磷脂酶、衔接/支架蛋白、Shc、Grb2、BLNK、LAT、PI3-激酶B细胞衔接蛋白(BCAP)、SLAP、Dok、KSR、MyD88、Crk、CrkL、GAD、Nck、Grb2结合相关蛋白(GAB)、Fas死亡区相关蛋白(FADD)、TRADD、TRAF2、RIP、T细胞白血病家族、IL-2、IL-4、IL-8、IL-6、干扰素γ、干扰素α、细胞因子信号传导阻抑蛋白(SOCs)、Cbl、SCF遍在蛋白连接酶复合体、APC/C、黏附分子、整合素、类免疫球蛋白黏附分子、选择素、钙粘蛋白、连环蛋白、成簇黏附激酶、p130CAS、胞衬蛋白、肌动蛋白、桩蛋白、肌球蛋白、肌球蛋白结合蛋白、微管蛋白、eg5/KSP、CENPs、β-肾上腺素能受体、毒蕈碱受体、腺苷酸环化酶受体、小分子量GTPases、H-Ras、K-Ras、N-Ras、Ran、Rac、Rho、Cdc42、Arfs、RABs、RHEB、Vav、Tiam、Sos、Dbl、PRK、TSC1，2、Ras-GAP、Arf-GAPs、Rho-GAPs、半胱天冬酶、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、PARP、Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL、Bcl-w、Bcl-B、A1、Bax、Bak、Bok、Bik、Bad、Bid、Bim、Bmf、Hrk、Noxa、Puma、IAPs、XIAP、Smac、Cdk4、Cdk 6、Cdk 2、Cdk1、Cdk 7、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、Rb、p16、p14Arf、p27KIP、p21CIP、分子侣伴蛋白、Hsp90s、Hsp70、Hsp27、代谢酶、乙酰辅酶A羧化酶、ATP柠檬酸裂解酶、一氧化氮合酶、小窝蛋白、转运必须的内吞分选复合物(ESCRT)蛋白、泡状蛋白分选蛋白(Vsps)、羟化酶、脯氨酰羟化酶PHD-1，2和3、天冬酰胺羟化酶FIH转运酶、Pin1脯氨酰异构酶、拓扑异构酶、脱乙酰基酶、组蛋白脱乙酰基酶、去乙酰化酶、组蛋白乙酰化酶、CBP/P300家族、MYST家族、ATF2、DNA甲基转移酶、组蛋白H3K4脱甲基酶、H3K27、JHDM2A、UTx、VHL、WT-1、p53、Hdm、PTEN、遍在蛋白酶、尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)和uPA受体(uPAR)体系、组织蛋白酶、金属蛋白酶、酯酶、水解酶、分离酶、钾离子通道、钠离子通道、多重耐药蛋白、P-糖蛋白、核苷转运酶、Ets、Elk、SMADs、Rel-A(p65-NFKB)、CREB、NFAT、ATF-2、AFT、Myc、Fos、Spl、Egr-1、T-bet、β-连环蛋白、HIFs、FOXOs、E2Fs、SRFs、TCFs、Egr-1、β-连环蛋白、FOXO STAT1、STAT 3、STAT 4、STAT 5、STAT 6、p53、WT-1、HMGA、pS6、4EPB-1、eIF4E结合蛋白、RNA聚合酶、起始因子、延伸因子。
在一些实施方式中，根据可激活元件的激活水平来分类细胞，例如在细胞途径中，包括将细胞作为与临床结果相关联的细胞进行分类。在一些实施方式中，临床结果为病症的预后和/或诊断。在一些实施方式中，临床结果为是否存在瘤形成或造血病症。在一些实施方式中，临床结果为瘤形成或造血病症的分期或分级。分期的例子包括但不局限于侵袭性、无痛、良性、顽固性、罗马数字分期、TNM分期、Rai分期、Binet分期、WHO分类、FAB分类、IPSS评分、WPSS评分、局限期、扩散期、根据例如ZAP70、IgVH突变状态和CD38的细胞标记的分期、隐性，其包括能够及时传达恶化、无恶化存活率、整体存活率和无意外存活率的信息。
在一些实施方式中，提供的方法和组合物用于根据(例如在细胞途径中的)可激活元件的激活水平进行细胞分类，其中该分类包括将细胞作为与患者对治疗的响应相关联的细胞进行分类。在一些实施方式中，患者的响应选自完全响应、部分响应、结节性部分响应、无响应、疾病的进行、疾病的稳定和副作用。
在一些实施方式中，提供的方法和组合物用于根据(例如在细胞途径中的)可激活元件的激活水平进行细胞分类，其中该分类包括将细胞作为与微小残留病或形成耐药性相关联的细胞进行分类。
在一些实施方式中，提供的方法和组合物用于根据(例如在细胞途径中的)可激活元件的激活水平进行细胞分类，其中该分类包括治疗方法的选择。治疗方法的例子包括但不局限于化疗、生物疗法、放射疗法、骨髓移植、外周干细胞移植、脐带血移植、自体干细胞移植、异基因干细胞移植、同基因干细胞移植、手术、诱导治疗、维持治疗和观察等待治疗。
一般而言，本发明的方法包括确定样品中多个单细胞中的可激活元件的激活水平。
A.信号传导途径
在一些实施方式中，本发明的方法用于确定信号传导途径中可激活元件的状态。在一些实施方式中，如此所述，根据一个或多个信号传导途径中一个或多个可激活元件的激活水平来分类细胞。信号传导途径及其成员已被详细描述。参见(Hunter T.Cell(2000)100(1)：13-27)。示例性的信号传导途径包括以下途径及其成员：MAP激酶途径(包括Ras、Raf、MEK、ERK和elk)、PI3K/Akt途径(包括PI-3-激酶、PDK1、Akt和Bad)、NF-κB途径(包括IKKs、IkB和NF-κB)和Wnt途径(包括卷曲受体、β-连环蛋白、APC和其它辅助因子和TCF)(参见Cell Signaling Technology，Inc.2002目录231-279页和Hunter T.，supra.)。在本发明的一些实施方式中，被分析的相关可激活元件(或被检测的信号传导蛋白质)为MAP激酶、Akt、NFkB、WNT、STAT和/或PKC信号传导途径的成员。本发明的方法还包括US 61/085,789中公开的方法、信号传导途径和信号传导分子，其全部内容通过引用方式结合其中。
在一些实施方式中，本发明的方法用于确定包括在此描述的本领域已知的信号传导途径中的信号传导蛋白质的状态。在本发明的范围内的信号传导蛋白质的示例性的类型包括但不局限于激酶、激酶底物(即磷酸化的底物)、磷酸酶、磷酸酶底物、结合蛋白(例如14-3-3)、受体配体和受体(细胞表面受体酪氨酸激酶和核受体))。例如，激酶和蛋白质结合域已被详细描述(参见，例如Cell SignalingTechnology，Inc.，2002目录″The Human Protein Kinases″和″ProteinInteraction Domains区″，254-279页)。
示例性的信号传导蛋白质包括但不局限于激酶、HER受体、PDGF受体、Kit受体、FGF受体、Eph受体、Trk受体、IGF受体、胰岛素受体、Met受体、Ret、VEGF受体、TIE1、TIE2、FAK、Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、Src、Lyn、Fyn、Lck、Fgr、Yes、Csk、Abl、Btk、ZAP70、Syk、IRAKs、cRaf、ARaf、BRAF、Mos、Lim激酶、ILK、Tpl、ALK、TGFβ受体、BMP受体、MEKKs、ASK、MLKs、DLK、PAKs、Mek 1、Mek 2、MKK3/6、MKK4/7、ASK1、Cot、NIK、Bub、Myt1、Wee1、酪蛋白激酶、PDK1、SGK1、SGK2、SGK3、Akt1、Akt2、Akt3、p90Rsks、p70S6激酶、Prks、PKCs、PKAs、ROCK 1、ROCK 2、Auroras、CaMKs、MNKs、AMPKs、MELK、MARKs、Chk1、Chk2、LKB-1、MAPKAPKs、Pim1、Pim2、Pim3、IKKs、Cdks、Jnks、Erks、IKKAs、GSK3α、GSK3β、Cdks、CLKs、PKR、PI3-激酶1型、2型、3型、mTor、SAPK/JNK1，2，3、p38s、PKR、DNA-PK、ATM、ATR、磷酸酶、受体蛋白酪氨酸磷酸酶(RPTPs)、LAR磷酸酶、CD45、非受体酪氨酸磷酸酶(NPRTPs)、SHPs、MAP激酶磷酸酶(MKPs)、双重特异性磷酸酶(DUSPs)、CDC25磷酸酶、低分子量酪氨酸磷酸酶、Eyes absent(EYA)酪氨酸磷酸酶、丝切蛋白磷酸酶(SSH)、丝氨酸磷酸酶、PP2A、PP2B、PP2C、PP1、PP5、肌醇磷酸酶、PTEN、SHIPs、肌管素、脂质信号传导、磷酸肌醇激酶、磷脂酶、前列腺素合成酶、5-脂肪氧化酶、鞘氨醇激酶、神经鞘磷脂酶、衔接/支架蛋白、Shc、Grb2、BLNK、LAT、PI3-激酶B细胞衔接蛋白(BCAP)、SLAP、Dok、KSR、MyD88、Crk、CrkL、GAD、Nck、Grb2结合相关蛋白(GAB)、Fas死亡区相关蛋白(FADD)、TRADD、TRAF2、RIP、T细胞白血病家族、细胞因子、IL-2、IL-4、IL-8、IL-6、干扰素γ、干扰素α、细胞因子调节剂、细胞因子信号传导阻抑蛋白(SOCs)、遍在蛋白酶、Cbl、SCF遍在蛋白连接酶复合体、APC/C、黏附分子、整合素、类免疫球蛋白黏附分子、选择素、钙粘蛋白、连环蛋白、成簇黏附激酶、p130CAS、细胞骨架/收缩蛋白、胞衬蛋白、肌动蛋白、桩蛋白、肌球蛋白、肌球蛋白结合蛋白、微管蛋白、eg5/KSP、CENPs、异源三聚体G蛋白、β-肾上腺素能受体、毒蕈碱受体、腺苷酸环化酶受体、小分子量GTPases、H-Ras、K-Ras、N-Ras、Ran、Rac、Rho、Cdc42、Arfs、RABs、RHEB、鸟嘌呤核苷酸交换因子、Vav、Tiam、Sos、Dbl、PRK、TSC1，2、GTPase活化蛋白、Ras-GAP、Arf-GAPs、Rho-GAPs、半胱天冬酶、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、PARP、参与细胞凋亡的蛋白质、Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL、Bcl-w、Bcl-B、A1、Bax、Bak、Bok、Bik、Bad、Bid、Bim、Bmf、Hrk、Noxa、Puma、IAPs、XIAP、Smac、细胞周期调节蛋白、Cdk4、Cdk 6、Cdk 2、Cdk1、Cdk 7、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、Rb、p16、p14Arf、p27KIP、p21CIP、分子侣伴蛋白、Hsp90s、Hsp70、Hsp27、代谢酶、乙酰辅酶A羧化酶、ATP柠檬酸裂解酶、一氧化氮合酶、小窝蛋白、转运必须的内吞分选复合物(ESCRT)蛋白、泡状蛋白分选蛋白(Vsps)、羟化酶、脯氨酰羟化酶PHD-1，2和3、天冬酰胺羟化酶FIH转运酶、Pin1脯氨酰异构酶、拓扑异构酶、脱乙酰基酶、组蛋白脱乙酰基酶、去乙酰化酶、乙酰化酶、组蛋白乙酰化酶、CBP/P300家族、MYST家族、ATF2、甲基化酶、DNA甲基转移酶、组蛋白H3K4脱甲基酶、H3K27、JHDM2A、UTX、肿瘤抑制基因、VHL、WT-1、p53、Hdm、PTEN、蛋白酶、遍在蛋白酶、尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)和uPA受体(uPAR)体系、组织蛋白酶、金属蛋白酶、酯酶、水解酶、分离酶、钾离子通道、钠离子通道、分子转运酶、多重耐药蛋白、P-糖蛋白、核苷转运酶、转录因子/DNA结合蛋白、Ets、Elk、SMADs、Rel-A(p65-NFKB)、CREB、NFAT、ATF-2、AFT、Myc、Fos、Spl、Egr-1、T-bet、HIFs、FOXOs、E2Fs、SRFs、TCFs、Egr-1、
Figure GPA00001061269400561
连-环蛋白、FOXO STAT1、STAT 3、STAT 4、STAT 5、STAT 6、p53、WT-1、HMGA、转译调节酶、pS6、4EPB-1、eIF4E结合蛋白、转录调节酶、RNA聚合酶、起始因子和延伸因子。
在一些实施方式中，蛋白质选自PI3-激酶(p85、p110a、p110b、p110d)、Jak1、Jak2、SOCs、Rac、Rho、Cdc42、Ras-GAP、Vav、Tiam、Sos、Dbl、Nck、Gab、PRK、SHP1和SHP2、SHIP1、SHIP2、sSHIP、PTEN、Shc、Grb2、PDK1、SGK、Akt1、Akt2、Akt3、TSC1，2、Rheb、mTor、4EBP-1、p70S6激酶、S6、LKB-1、AMPK、PFK、乙酰辅酶A羧化酶、DokS、Rafs、Mos、Tpl2、MEK1/2、MLK3、TAK、DLK、MKK3/6、MEKK1，4、MLK3、ASK1、MKK4/7、SAPK/JNK1，2，3、p38s、Erk1/2、Syk、Btk、BLNK、LAT、ZAP70、Lck、Cbl、SLP-76、PLCγ1、PLCγ2、STAT1、STAT 3、STAT 4、STAT 5、STAT 6、FAK、p130CAS、PAKs、LIMK1/2、Hsp90、Hsp70、Hsp27、SMADs、Rel-A(p65-NFκB)、CREB、组蛋白H2B、HATs、HDACs、PKR、Rb、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、P16、p14Arf、p27KIP、p21CIP、Cdk4、Cdk6、Cdk7、Cdk1、Cdk2、Cdk9、Cdc25，A/B/C、Abl、E2F、FADD、TRADD、TRAF2、RIP、Mvd88、BAD、Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、PARP、IAPs、Smac、胞衬蛋白、肌动蛋白、Src、Lyn、Fyn、Lck、NIK、IκB、p65(RelA)、IKKα、PKA、PKCα、PKCβ、PKCθ、PKCδ、CAMK、Elk、AFT、Myc、Egr-1、NFAT、ATF-2、Mdm2、p53、DNA-PK、Chk1、Chk2、ATM、ATR、β-连环蛋白、CrkL、GSK3α、GSK3β和FOXO。
MAP激酶途径：在一些实施方式中，本发明的方法被用于确定MAP激酶途径中可激活元件的状态。不希望局限于任何理论，MAP激酶途径为将结合生长因子的细胞内响应与细胞表面受体偶合的信号转导途径。该途径非常复杂并包括许多蛋白质组分。在许多细胞类型中，该途径的激活有助于细胞分裂。
受体连接酪氨酸激酶(例如上皮生长因子受体(EGFR))被细胞外配体激活。上皮生长因子(EGF)与EGFR的结合激活了受体胞浆区的酪氨酸激酶活性。EGFR的酪氨酸被磷酸化。停靠蛋白(例如GRB2)包含结合在激活的受体上的磷酸酪氨酸的SH2域。GRB2通过GRB2的SH3域与鸟嘌呤核苷酸交换因子SOS相结合。当GRB2-SOS复合物对接在磷酸化的EGFR时，SOS被激活。激活的SOS促进GDP从Ras上去除。然后Ras结合在GTP上并被激活。其它小G蛋白可通过类似的方式被激活，但是在此不做进一步讨论。激活的Ras激活RAF激酶的蛋白激酶活性，丝氨酸/苏氨酸-选择性蛋白激酶。RAF激酶磷酸化并激活MEK，另一种丝氨酸/苏氨酸激酶。MEK磷酸化并激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)。
技术上来说，RAF、MEK和MAPK都是丝裂原活化激酶，正如MNK。MAPK原来被称为“细胞外信号调节激酶”(ERKs)和微管相关蛋白激酶(MAPK)。最先知道的可被ERK磷酸化的蛋白之一为微管相关蛋白。许多其它被MAPK磷酸化的靶点已被发现，因而蛋白质被重命名为“微管联系蛋白激酶”(MAPK)。从RAF到MEK到MAPK的激酶系列为蛋白激酶级联的例子。该激酶系列提供了反馈调节和信号放大的机会。多种癌症中的RAS被激活(参见Cell SignalingTechnology，Inc.Catolog，supra.231-279页和Hunter T，supra.和其中文献)。
PI3K/Akt途径：在一些实施方式中，本发明的方法被用于确定PI3K/Akt途径中可激活元件的状态。不希望局限于任何理论，PI3K/Akt途径可以影响对细胞外信号响应的多种细胞功能的改变。PI3K下游的效应物为丝氨酸-苏氨酸激酶Akt，其针对PI3K的激活来磷酸化和调控包括激酶、转录因子和其它调节分子的许多靶点的活性。丝氨酸/苏氨酸激酶Akt在细胞内作为会聚上游信号传导途径集合的节点起作用，其参与刺激受体酪氨酸激酶(例如IGF-1R、HER2/Neu、VEGF-R、PDGF-R)、聚集受体-PI3K的膜上复合物和通过第二信使PIP3激活Akt。在Akt及其激酶活性水平上集成这些细胞内信号传导可以调节几种下游效应物(例如NF-B、mTOR、Forkhead、Bad、GSK-3和MDM-2)的磷酸化。这些磷酸化事件反过来会介导Akt对细胞生长、增殖、防止前细胞凋亡刺激和新生血管刺激的作用。Akt及其上游调节剂在多种实体肿瘤和血液恶性肿瘤中不受调控。Akt途径是重要的细胞生存途径，该途径被致瘤事件(例如上游受体酪氨酸激酶(例如EGFR(同上))的过表达或上游调节蛋白(例如PTEN(同上))的缺失)所激活。
NF-κB途径：在一些实施方式中，本发明的方法被应用于确定NF-κB途径中可激活元件的状态。不希望局限于任何理论，NF-κB途径涉及在压力、损伤和尤其是在免疫响应途径中调节细胞活性的许多方面。一些例子为：对IL-2的响应和诱导、NF-κB对TAP1和MHC分子的诱导和炎症应答的许多方面，例如IL-1(α和β)、TNF-α和白细胞黏附分子(E-selectin、VCAM-1和ICAM-1)的诱导。而且，NF-κB通过诱导某些生长和转录因子(例如c-myc、ras和p53)参与细胞生长、分化和增殖的许多方面。NF-κB信号转导途径在各种人类癌症、特别是那些淋巴样细胞起源的癌症中被错误调节。几种人类淋巴样癌细胞被报道具有编码NF-κB转录因子的突变或扩增。在大多数癌细胞中，NF-κB为组成性活性的并存在于核上。在一些情况中，这是由于IKK途径的慢性刺激，而在其它的情况中编码IkBa的基因为有缺陷的。这样的连续的核NF-κB活性不仅防止癌细胞免于细胞凋亡死亡，而且还提高了它们的生长活性。设计抗癌试剂来阻断NF-κB活性或提高它们对常规化疗的灵敏度可以产生很高的治疗价值。
WNT途径：在一些实施方式中，本发明的方法被应用于确定WNT途径中可激活元件的状态。不希望局限于任何理论，Wnt信号传导途径描述了蛋白质的复杂网络，其最著名的为在胚胎发生和癌症中的作用，也包含在成年动物的正常生理过程中的作用。典型的Wnt途径涉及当Wnt蛋白质连接在Frizzled家族的细胞表面受体上时发生的一系列事件，从而导致受体激活Dishevelled家族蛋白质和最终产生在达到核的β-连环蛋白量上的改变。Dishevelled(DSH)是膜相关Wnt受体复合物的一个关键组分，当其被Wnt连接激活时可抑制包括axin、GSK-3和蛋白质APC的第二蛋白质复合物。Axin/GSK-3/APC复合物通常能够促进β-连环蛋白细胞内信号传导分子的蛋白水解性降解。该“β-连环蛋白破坏复合物”被抑制后，胞质β-连环蛋白库稳定，一些β-连环蛋白能进入细胞核并与TCF/LEF家族转录因子相作用以促进特定的基因表达。
PKC途径：在一些实施方式中，本发明的方法被应用于确定PKC途径中可激活元件的状态。不希望局限于任何理论，PKC途径与细胞的增殖、分化和细胞凋亡相关。至少11种密切相关的PKC同功酶已报道具有不同的结构、生化性质、组织分布、亚细胞定位和底物特异性。它们被分类为传统型(α、β1、β2、γ)、新型(δ、ε、η、θ、μ)和非典型(ζ、λ)同功酶。传统型PKC同功酶为Ca2+-依赖的，而新型和非典型同功酶不需要Ca2+激活。除ζ和λ以外的所有AKC同功酶可被甘油二酯(DAG)激活。PKC同功酶负向或正向调控关键的细胞周期转变，包括细胞周期的开始和结束以及G1和G2的关卡(checkpoint)。PKC活性的改变与不同类型的恶性肿瘤相关。已在乳腺癌、腺瘤垂体、甲状腺癌组织、白血病细胞和肺癌细胞中报道了较高的PKC水平以及不同PKC同功酶的分化激活。PKCα的减量调节在大多数直肠腺癌和早期肠道癌中被报道。因此，PKC抑制剂成为治疗癌症的重要工具。在细胞凋亡的调节中PKC的参与增加了特异性靶向PKC的药物开发的另一维度。PKC途径的激活也被认为在例如心血管疾病和糖尿病中起作用。
在发明的一些实施方式中，在此所述方法被用于确定信号传导途径中可激活元件的状态。提供了用于根据信号传导途径中可激活元件的状态来分类细胞的方法和组合物。细胞可为造血细胞。造血细胞的例子包括但不局限于多功能造血干细胞、B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞、T淋巴细胞系祖细胞或分化细胞、NK细胞系祖细胞或分化细胞、粒细胞系祖细胞或分化细胞、单核细胞系祖细胞或分化细胞、巨核细胞系祖细胞或分化细胞和红细胞系祖细胞或分化细胞。
在一些实施方式中，根据信号传导途径中可激活元件的状态的细胞分类包括将细胞作为与临床结果相关的细胞进行分类。在一些实施方式中，临床结果为病症的预后和/或诊断。在一些实施方式中，临床结果为是否存在瘤形成或造血病症。在一些实施方式中，临床结果为瘤形成或造血病症的分期或分级。分期的例子包括但不局限于侵袭性、无痛、良性、顽固性、罗马数字分期、TNM分期、Rai分期、Binet分期、WHO分类、FAB分类、IPSS评分、WPSS评分、局限期、扩散期、根据例如ZAP70、IgVH突变状态和CD38的细胞标记的分期、隐性，其包括能够及时传达恶化、无恶化存活率、整体存活率和无意外存活率的信息。
在一些实施方式中，提供了用于根据信号传导途径中可激活元件的状态来分类细胞的方法和组合物，其中该分类包括将细胞作为与患者对治疗的响应相关的细胞进行分类。在一些实施方式中，患者的响应选自完全响应、部分响应、结节性部分响应、无响应、疾病的进行、疾病的稳定和副作用。
在一些实施方式中，提供了根据信号传导途径中可激活元件的状态来分类细胞的方法和组合物，其中该分类包括将细胞作为与微小残留病或形成耐药性相关的细胞进行分类。
在一些实施方式中，提供了根据信号传导途径中可激活元件的状态来分类细胞的方法和组合物，其中该分类包括选择治疗的方法。治疗方法的例子包括但不局限于化疗、生物疗法、放射疗法、骨髓移植、外周干细胞移植、脐带血移植、自体干细胞移植、异基因干细胞移植、同基因干细胞移植、手术、诱导治疗、维持治疗、观察等待治疗和整体/选择疗法。
本发明不局限于目前阐明的信号传导途径和信号转换蛋白，并且还包括下面的信号传导通路和蛋白质。
B.B细胞受体途径
在一些实施方式中，本发明的方法和组合物可用于检测和描绘B细胞受体(BCR)信号传导的任何可激活元件的状态，或B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞中该可激活元件的集合。在一些实施方式中，一种或多种B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞的生理状态是通过检测和描绘BCR信号传导中一个或多个可激活元件的状态来确定的。如此所述，在一些实施方式中，根据BCR信号传导中一个或多个可激活元件的激活水平将B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞进行分类。B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞的例子包括但不局限于B淋巴细胞系早期原B细胞、晚期原B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、浆细胞、记忆B细胞、CD5+B细胞、CD38+B细胞、包含B细胞受体重链突变或非突变的B细胞和表达Zap70的B细胞。在一些实施方式中，B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞为与在此所述的病症相关的细胞。
不希望局限于任何理论，BCR交联引起Igα和Igβ的ITAM基序域中酪氨酸被Src家族成员酪氨酸激酶(例如Lyn、Lck、Blk、Fyn)磷酸化。Igαβ的磷酸化ITAM吸引并提高了Syk(直接)和Btk(通过Syk)的磷酸化。BCR交联也将很多的调节剂和衔接分子(例如SLP-65/BLNK、Grb2、CD22、SHP-1)集合在一起，并与辅助受体CD19和CD21一起区室化脂筏上的BCR。在Syk和Btk激活后，磷脂酶-Cγ2(PL
Figure GPA00001061269400611
γ2)和PI3K扩散BCR信号传导。PL
Figure GPA00001061269400612
γ2的激活产生了钙流出、肌醇-1，4，5-三磷酸盐和二酰基甘油，并导致了蛋白激酶C和NF-κB的激活。Syk通过接合体与PL
Figure GPA00001061269400613
γ2相互作用，而Btk可直接作用，各因子对BCR交联后PLCγ2的活性为必需的。Syk和Btk都可在BCR交联后激活PI3K。PI3K的激活允许Akt介导的生存信号传导，PI3K对于B细胞发育中BCR介导的生存是必需的。PLCγ2和PI3K还引起了导致MAPK家族蛋白质ERK1/2和p38磷酸化的激酶级联。Ras-Raf-ERK1/2信号级联的激活是BCR信号传导中的关键事件，并且由于小鼠中RasGRP1和RasGRP3的缺失而降低Ras的激活可减少B细胞的增殖。相反，p38为压力反应蛋白质，可与p53相作用并调节细胞周期的关卡。ERK1/2和p38的差异激活可使BCR产生不同的细胞结果，但是问题在于特定的B细胞是同时激活这两条途径还是根据另外的信号物利于一条途径。
BCR信号传导的有效激活取决于H2O2的产生和负调节蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)的失活。继BCR的交联，钙依赖NADPH氧化酶(例如NOX5)的募集和激活促使产生H2O2并降低BCR的信号传导阈值。BCR诱导的H2O2通过将半胱氨酸可逆地催化氧化到次磺酸来短暂地使膜临近PTPs失活(包括SHP-1)。在昆虫细胞中重建BCR信号传导途径的完美研究提出了氧化还原反馈环的模型，其中H2O2使PTPs失活并使得早期的信号传导事件(例如Syk磷酸化和ITAM接合)的扩大。最近的研究将内源产生的H2O2定性为BCR信号传导产生的主要的氧化还原种类，并表明NOX-依赖性地产生H2O2对在小鼠A20B细胞中产生BCR信号传导波起关键作用。
在一些实施方式中，本发明提供了在使用调节剂和/或抑制剂处理以后分类B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞的方法。B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞的例子包括但不局限于早期原B细胞、晚期原B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、浆细胞和记忆B细胞、CD5+B细胞、CD38+B细胞、包含B细胞受体重链突变或非突变的B细胞和表达Zap70的B细胞。
在一些实施方式中，分类包括根据BCR途径中可激活元件状态将细胞作为与临床结果相关的细胞进行分类。在一些实施方式中，本发明提供根据临近BCR的信号传导的改变分类B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞的方法。在一些实施方式中，临床结果为病症的预后和/或诊断。在一些实施方式中，临床结果为是否存在瘤形成或造血病症，例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B淋巴细胞系白血病、B淋巴细胞系淋巴瘤、多发性骨髓瘤或浆细胞异常(例如淀粉样变性或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)。在一些实施方式中，病症为CLL。在一些实施方式中，发明提供基于临近BCR的信号传导的改变来分类CLL细胞的方法。存在改变为临床结果的指征。在一些实施方式中，CLL由共表达CD5及CD19和CD23或CD5及CD20和CD23的单克隆B细胞和表面免疫球蛋白的表达所限定。在一些实施方式中，CLL由共表达CD5及CD19和CD23或CD5及CD20和CD23的单克隆B细胞群或暗表面免疫球蛋白的表达所限定。其它的B细胞标记也可用于确定或分类B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞。这样的标记的非限定的例子包括CD45、CD5、CD14、CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD37、CD40、CD52、CD79、CD38、CD96、主要的组织相容性抗原(MHC)1型和MHC2型。
在一些实施方式中，临床结果为瘤形成或造血病症的分期或分级。分期的例子包括但不局限于侵袭性、无痛、良性、顽固性、罗马数字分期、TNM分期、Rai分期、Binet分期、WHO分类、FAB分类、IPSS评分、WPSS评分、局限期、扩散期、根据例如ZAP70、IgVH突变状态和CD38的细胞标记的分期、隐性，其包括能够及时传达恶化、无恶化存活率、整体存活率和无意外存活率的信息。
在本发明方法的一些实施方式中，基于BCR途径中可激活元件的激活水平来分类B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞的方法包括将细胞作为与患者对治疗的响应相关的细胞进行分类，例如完全响应、部分响应、结节性部分响应、无响应、疾病的进行、疾病的稳定、复发或副作用。方法还包括确定治疗的方法，例如化疗、生物疗法、放射疗法、骨髓移植、外周干细胞移植、脐带血移植、自体干细胞移植、异基因干细胞移植、同基因干细胞移植、手术、诱导治疗、维持治疗、观察等待治疗或整体/选择疗法。
在本发明方法的一些实施方式中，基于BCR途径中可激活元件的激活来分类B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞的方法包括将细胞作为与微小残留病或形成耐药性相关的细胞进行分类。
C.非诱导性信号传导
在一些实施方式中，本发明的方法和组合物可被用于确定细胞中非诱导性信号传导途径的状态。在一些实施方式中，本发明的方法和组合物可被用于检测和描绘非诱导性信号传导途径中任何可激活元件的状态或细胞中该可激活元件的集合。在一些实施方式中，细胞的生理状态通过检测和描绘非诱导性信号传导途径中一个或多个可激活元件的状态来确定。在一些实施方式中，如在此所述，根据非诱导性信号传导途径中一个或多个可激活元件的状态来分类细胞。术语“非诱导性信号传导”包括抗原非依赖性信号传导、非依赖性基础信号传导和非诱导或配体非依赖性信号传导。
不希望局限于任何理论，最新的证据支持以下概念：在多数被细胞受体调控的信号传导系统中，尽管经过该系统的流可非常不同，但是一些信号传导的基础水平以配体非依赖型的方式连续发生。非刺激细胞中信号传导的基础水平或稳态水平为信号传导途径中正和负调节剂平衡的结果。因此信号传导中正和负调节剂的平衡作用确保了稳态平衡。受体刺激继而以不同方式引发细胞响应以干扰平衡状态。非刺激状态中信号传导的稳态水平本身可导致功能性的结果，例如保持某些分化细胞的特征或功能。
在一些实施方式中，本发明提供了用于确定细胞非诱导性信号传导状态的方法。在一些实施方式中，非诱导性信号传导为细胞受体的非诱导性信号传导。在一些实施方式中，非诱导性信号传导为BCR的非诱导性信号传导。提供了根据非诱导性信号传导途径中可激活元件的状态进行细胞分类的方法和组合物。细胞可为造血细胞。造血细胞的例子包括但不局限于多功能造血干细胞、B淋巴细胞系祖细胞或分化细胞、T淋巴细胞系祖细胞或分化细胞、NK细胞系祖细胞或分化细胞、粒细胞系祖细胞或分化细胞、单核细胞系祖细胞或分化细胞、巨核细胞系祖细胞或分化细胞和红细胞系祖细胞或分化细胞。
在一些实施方式中，根据非诱导性信号传导途径中可激活元件的状态的细胞分类包括将细胞作为与临床结果相关联的细胞进行分类。在一些实施方式中，临床结果为病症的预后和/或诊断。在一些实施方式中，临床结果为是否存在瘤形成或造血病症。瘤形成或造血病症的例子包括但不局限于，例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B淋巴细胞系白血病、B淋巴细胞系淋巴瘤、多发性骨髓瘤或浆细胞异常(例如淀粉样变性或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)。在一些实施方式中，病症为CLL。在一些实施方式中，CLL由共表达CD5及CD19和CD23或CD5及CD20和CD23的单克隆B细胞群和被表面免疫球蛋白的表达限定。
在一些实施方式中，临床结果为瘤形成或造血病症的分期或分级。分期的例子包括但不局限于侵袭性、无痛、良性、顽固性、罗马数字分期、TNM分期、Rai分期、Binet分期、WHO分类、FAB分类、IPSS评分、WPSS评分、局限期、扩散期、根据例如ZAP70、IgVH突变状态和CD38的细胞标记的分期、隐性，其包括能够及时传达恶化、无恶化存活率、整体存活率和无意外存活率的信息。
在一些实施方式中，本发明提供了根据临近BCR的信号传导的改变来分类CLL细胞的方法，BCR为存在非诱导性信号传导的指征。存在改变为在此所述的临床结果的指征。
在一些实施方式中，提供了根据在非诱导性信号传导途径中可激活元件的状态进行细胞分类的方法和组合物，其中该分类包括将细胞作为与患者对治疗的响应相关联的细胞进行分类。在一些实施方式中，患者的响应选自完全响应、部分响应、结节性部分响应、无响应、疾病的进行、疾病的稳定稳定和副作用。
在一些实施方式中，提供了根据在非诱导性信号传导途径中可激活元件的状态进行细胞分类的方法和组合物，其中该分类包括将细胞作为与微小残留病或形成耐药性相关的细胞进行分类。
在一些实施方式中，提供了根据在非诱导性信号传导途径中可激活元件的状态进行细胞分类的方法和组合物，其中该分类包括选择治疗的方法。治疗方法的例子包括但不局限于化疗、生物疗法、放射疗法、骨髓移植、外周干细胞移植、脐带血移植、自体干细胞移植、异基因干细胞移植、同基因干细胞移植、手术、诱导治疗、维持治疗、观察等待治疗和整体/替代疗法。
结合元件
在本发明的一些实施方式中，可激活元件的激活水平通过将细胞与特异于可激活元件的激活状态的结合元件相接触来确定。术语“结合元件”包括能够从可激活元件的另一激活状态中识别出可激活元件的某一激活状态的任何分子，例如肽、核酸、小有机分子。
在一些实施方式中，结合元件为肽、多肽、寡肽或蛋白质。这些肽、多肽、寡肽或蛋白质可由天然存在的氨基酸和肽键或合成的模拟肽结构所构成。因此在此使用的“氨基酸”或“肽残基”包括天然存在的和合成的氨基酸。例如，高苯丙氨酸、瓜氨酸和正亮氨酸在本专利中被认为是氨基酸。侧链可为(R)或(S)构型。在一些实施方式中，氨基酸为(S)或L-构型。如果使用非天然存在的侧链，可以使用非氨基酸的取代基，例如来阻止或延缓体内的降解。包括非天然存在的氨基酸的蛋白质可被合成或在一些情况中通过重组产生；参见van Hest等人，FEBS Lett 428：(1-2)68-70May 22，1998和Tang等人，Abstr.Pap Am.Chem.S218：U138 Part 2Aug.22，1999，这两篇文献通过引用方式结合在本文中。
本专利的方法可用于检测样品中任何特定的可激活元件，该可激活元件为抗原性可检测的并且能从样品中其它可激活元件中抗原性抗原性区分出来的。例如，正如在此示范(参见例如实施例)和描述的，本发明中激活状态特异性抗体可用在本方法中以识别复杂的细胞群中亚型或亚群中不同的信号级联以及潜在的信号传导等级中蛋白质激活(例如激酶的激活)的顺序。因此，在一些实施方式中，一个或多个多肽的表达和磷酸化可使用本发明的方法进行检测和量化。在一些实施方式中，作为细胞途径的细胞组分的一个或多个多肽的表达和磷酸化可使用本发明的方法进行检测和量化。在此使用的术语“激活状态特异性抗体”或“激活状态抗体”或其语法上的等同语是指特异性结合在相应的和特定的抗原上的抗体。优选地，相应的和特定的抗原为特定形式的可激活元件。同样优选地，激活状态特异性抗体的结合是特定的可激活元件的特定的激活状态的指征。
在一些实施方式中，结合元件为抗体。在一些实施方式中，结合元件为激活状态特异性抗体。在一些实施方式中，结合元件为磷酸特异性抗体。
术语“抗体”包括全长的抗体和抗体片段，也可指来自生物体的自然抗体、人工抗体或者用于实验、治疗或下述其它目的重组产生的抗体。本领域中已知的抗体片段的例子(例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、scFv或抗体的其它抗原结合子序列)是通过对全抗体或那些通过重组DNA技术重新合成的进行修饰而产生的。术语“抗体”包括单克隆和多克隆抗体。抗体可为拮抗剂、激动剂、中和剂、抑制的或刺激的。
本发明的抗体可为非人类的、嵌合的、人源化的或完全人源性的。关于嵌合和人源化抗体的描述参见Clark等人，2000和此处引用的文献(Clark，(2000)Immunol.Today 21：397-402)。嵌合抗原包括非人类抗体的可变区域(例如小鼠或大鼠来源的VH和VL结构域)，可操作地连接到人类抗体的恒定区(参见例如美国专利No.4,816,567)。在一些实施方式中，本专利的抗体为人源化的。此处所用“人源化”抗体是指包括人类框架区(FR)和来自非人类(通常为小鼠或大鼠)抗体的一个或多个互补决定区(CDR′s)的抗体。提供CDR′s的非人类抗体被称为“供体”，提供框架的人类免疫球蛋白被称为“受体”。人源化主要依赖于将供体CDRs嫁接到受体的(人类)VL和VH框架上(Winter的美国专利No.5,225,539)。该策略被称为“CDR嫁接”。将选择的受体框架残基“回复突变(backmutation)”为相应的供体残基对于重新获得在初始嫁接的构建体中缺失的亲和力是必需的(美国专利No.5,530,101；美国专利No.5,585,089；美国专利No.5,693,761；美国专利No.5,693,762；美国专利No.6,180,370；美国专No.5,859,205；美国专利No.5,821,337；美国专利No.6,054,297；美国专利No.6,407,213)。人源化抗体可选地还包括免疫球蛋白恒定区(通常是人类免疫球蛋白)的至少一部分，因此通常包括人类Fc区。将非人类抗体人源化的方法是本领域公知的，可基本按照Winter和合作者的方法进行(Jones等人，1986，Nature 321：522-525；Riechmann等人，1988，Nature 332：323-329；Verhoeyen等人，1988，Science，239：1534-1536)。人源化鼠单克隆抗体的其它例子也是本领域已知的，例如人结合蛋白C(O′Connor等人，1998，Protein Eng 11：321-8)、白介素2受体(Queen等人，1989，Proc Natl Acad Sci，USA86：10029-33)和人上皮生长因子受体2(Carter等人，1992，Proc Natl.Acad Sci USA 89：4285-9)抗体。在可选的实施方式中，本发明的抗体可为完全人源性的，也就说抗体的序列完全或基本上为人类的。一些用于产生完全人源性抗体的方法是本领域已知的，包括使用转基因小鼠(Bruggemann等人，1997，Curr Opin Biotechnol 8：455-458)或结合选择方法的人类抗体库(Griffiths等人，1998，Curr Opin Biotechnol9：102-108)。
“抗体”的定义还特别包括无糖基化抗体。此处所用“无糖基化抗体”是指缺乏附加在Fc区297位置上的碳水化合物的抗体，其中编号是根据Kabat的EU系统。无糖基抗体可为去糖基抗体，其为Fc碳水化合物被例如化学或酶催化去除的抗体。可选地，无糖基抗体可为非糖基受体，即表达不含Fc碳水化合物的抗体，例如通过突变一个或多个编码糖基模式的残基或通过在不会将碳水化合物连接到蛋白质上的生物体(例如细菌)中表达。
如上所指出，激活状态特异性受体可用于检测激酶的活性，但是本发明还提供了用于确定激酶活性的其它方法。例如可特异性地被蛋白激酶识别并磷酸化的底物是已知的。特异性地结合在这样的磷酸化底物上而不是这样的非磷酸化底物(磷酸底物抗体)上的抗体可用于确定样品中活性激酶的存在。
在进一步的实施方式中，通过使用固定的激活状态抗体的多重态可确定元件的活性曲线。抗体可以非扩散地结合在具有样品接受区(例如微孔板、芯片等)的不溶性支持物上。该不溶性支持物可由结合组合物的任何组分构成、容易从可溶性材料分离出来或与整体的筛选方法兼容。这样的支持物的表面可为固体或多孔的，并为任何方便的形状。合适的不溶性支持物的例子包括微孔板、芯片、膜和珠粒。这些通常由玻璃、塑料(例如聚乙烯)、多糖、尼龙或硝酸纤维素、teflon.TM等构成。微孔板和芯片尤其方便，因为可使用小量的试剂和样品同时进行大量的测定。在一些情况中，包括磁性珠粒等。
只要与试剂和本发明的整体方法兼容并保持组合物的活性和非扩散性，结合组合物的特定方式不是关键的。结合的方法包括使用抗体(当蛋白质结合在支持物上，该抗体不会在空间上阻断配体的结合位点或激活序列)、直接结合到“粘性”或离子支持物上、化学交联、合成表面抗体等。在结合抗体以后，过量的非结合材料通过清洗除去。样品接受区域可继而通过与牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或其它无害蛋白质或其它部分培育被阻断。
可激活元件的活性异构体的抗原性可与可激活元件的非活性异构体的抗原性或不同的激活状态的异构体的抗原性有区别。在一些实施方式中，元件的活性异构体具有元件的非活性异构体不存在的抗原决定部位，反之亦然。在一些实施方式中，该区别是由于在元件上共价加成部分(例如磷酸部分)，或由于元件中结构的变化(例如通过蛋白质裂解)，或由于元件中诱导的构型变化，引起元件以抗原性可辨别的方式呈现相同的序列。在一些实施方式中，这样的构型变化引起元件的活性异构体呈现在非激活异构体中不存在的至少一个抗原决定部位，或不呈现存在于元件的非活性异构体的至少一个抗原决定部位。在一些实施方式中，可辨别的抗体的抗原决定部位居中位于元件活性位点的周围，尽管正如本领域已知的，元件的一个区域的构型变化可导致元件中不同区域的变化。
已制造出许多抗体，其中许多为市售的(例如参见Cell SignalingTechnology，www.cellsignal.com，Millipore，eBioscience，Caltag，SantaCruz Biotech，Abcam，BD Biosciences，Sigma和Anaspec，其内容以引用方式结合于本文中)，其可特异性地结合蛋白质的磷酸化异构体而不能特异性地结合蛋白质的非磷酸化异构体。许多这样的抗体被制造出来用于研究可逆地被磷酸化的信号传导蛋白质。特别地，许多这样的能够特异性地结合蛋白质的磷酸化活性异构体的抗体被制造出。可使用在此所述方法进行分析的蛋白质的例子包括但不局限于激酶、HER受体、PDGF受体、Kit受体、FGF受体、Eph受体、Trk受体、IGF受体、胰岛素受体、Met受体、Ret、VEGF受体、TIE1、TIE2、FAK、Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、Src、Lyn、Fyn、Lck、Fgr、Yes、Csk、Abl、Btk、ZAP70、Syk、IRAKs、cRaf、ARaf、BRAF、Mos、Lim激酶、ILK、Tpl、ALK、TGFβ受体、BMP受体、MEKKs、ASK、MLKs、DLK、PAKs、Mek 1、Mek 2、MKK3/6、MKK4/7、ASK1、Cot、NIK、Bub、Myt 1、Wee1、酪蛋白激酶、PDK1、SGK1、SGK2、SGK3、Akt1、Akt2、Akt3、p90Rsks、p70S6激酶、Prks、PKCs、PKAs、ROCK 1、ROCK 2、Auroras、CaMKs、MNKs、AMPKs、MELK、MARKs、Chk1、Chk2、LKB-1、MAPKAPKs、Pim1、Pim2、Pim3、IKKs、Cdks、Jnks、Erks、IKKAs、GSK3α、GSK3β、Cdks、CLKs、PKR、PI3-激酶1型、2型、3型、mTor、SAPK/JNK1，2，3、p38s、PKR、DNA-PK、ATM、ATR、受体蛋白酪氨酸磷酸酶(RPTPs)、LAR磷酸酶、CD45、非受体酪氨酸磷酸酶(NPRTPs)、SHPs、MAP激酶磷酸酶(MKPs)、双重特异性磷酸酶(DUSPs)、CDC25磷酸酶、低分子量酪氨酸磷酸酶、Eyes absent(EYA)酪氨酸磷酸酶、丝切蛋白磷酸酶(SSH)、丝氨酸磷酸酶、PP2A、PP2B、PP2C、PP1、PP5、肌醇磷酸酶、PTEN、SHIPs、肌管素、脂质信号传导、磷酸肌醇激酶、磷脂酶、前列腺素合成酶、5-脂肪氧化酶、鞘氨醇激酶、神经鞘磷脂酶、衔接/支架蛋白、Shc、Grb2、BLNK、LAT、PI3-激酶B细胞衔接蛋白(BCAP)、SLAP、Dok、KSR、MyD88、Crk、CrkL、GAD、Nck、Grb2结合相关蛋白(GAB)、Fas死亡区相关蛋白(FADD)、TRADD、TRAF2、RIP、T细胞白血病家族、细胞因子、IL-2、IL-4、IL-8、IL-6、干扰素γ、干扰素α、细胞因子调节蛋白、细胞因子信号传导阻抑蛋白(SOCs)、遍在蛋白酶、Cbl、SCF遍在蛋白连接酶复合体、APC/C、黏附分子、整合素、类免疫球蛋白黏附分子、选择素、钙粘蛋白、连环蛋白、成簇黏附激酶、p130CAS、细胞骨架/收缩蛋白、胞衬蛋白、肌动蛋白、桩蛋白、肌球蛋白、肌球蛋白结合蛋白、微管蛋白、eg5/KSP、CENPs、β-肾上腺素能受体、毒蕈碱受体、腺苷酸环化酶受体、小分子量GTPases、H-Ras、K-Ras、N-Ras、Ran、Rac、Rho、Cdc42、Arfs、RABs、RHEB、鸟嘌呤核苷酸交换因子、Vav、Tiam、Sos、Dbl、PRK、TSC1，2、GTPase活化蛋白、Ras-GAP、Arf-GAPs、Rho-GAPs、半胱天冬酶、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、PARP、Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL、Bcl-w、Bcl-B、A1、Bax、Bak、Bok、Bik、Bad、Bid、Bim、Bmf、Hrk、Noxa、Puma、IAPs、XIAP、Smac、细胞周期调节蛋白、Cdk4、Cdk6、Cdk2、Cdk1、Cdk7、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、Rb、p16、p14Arf、p27KIP、p21CIP、分子侣伴蛋白、Hsp90s、Hsp70、Hsp27、代谢酶、乙酰辅酶A羧化酶、ATP柠檬酸裂解酶、一氧化氮合酶、小泡运输蛋白、小窝蛋白、转运必须的内吞分选复合物(ESCRT)蛋白、泡状蛋白分选蛋白(Vsps)、羟化酶、脯氨酰羟化酶PHD-1，2和3、天冬酰胺羟化酶FIH转运酶、异构酶、Pin1脯氨酰异构酶、拓扑异构酶、脱乙酰基酶、组蛋白脱乙酰基酶、去乙酰化酶、乙酰化酶、组蛋白乙酰化酶、CBP/P300家族、MYST家族、ATF2、甲基化酶、DNA甲基转移酶、去甲基化酶、组蛋白H3K4脱甲基酶、H3K27、JHDM2A、UTX、肿瘤抑制基因、VHL、WT-1、p53、Hdm、PTEN、蛋白酶、遍在蛋白酶、尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)和uPA受体(uPAR)体系、组织蛋白酶、金属蛋白酶、酯酶、水解酶、分离酶、离子通道、钾离子通道、钠离子通道、分子转运蛋白、多重耐药蛋白、P-糖蛋白、核苷转运酶、转录因子/DNA结合蛋白、Ets、Elk、SMADs、Rel-A(p65-NFKB)、CREB、NFAT、ATF-2、AFT、Myc、Fos、Spl、Egr-1、T-bet、β-连环蛋白、HIFs、FOXOs、E2Fs、SRFs、TCFs、Egr-1、β-连环蛋白、FOXO STAT1、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6、p53、WT-1、HMGA、转译调节蛋白、pS6、4EPB-1、eIF4E结合蛋白、转录调节蛋白、RNA聚合酶、起始因子、延伸因子。在一些实施方式中，蛋白质为S6。
在一些实施方式中，使用激活状态抗体的抗原决定部位-识别片段而不是整个抗体。在一些实施方式中，抗原决定部位-识别片段被固定。在一些实施方式中，使用识别抗原决定部位的抗体轻链。通过使用本领域公知的重组手段，使用编码可识别抗原决定部位的轻链基因产物的重组核酸来制造这样的抗体片段。
非激活状态的抗体也可用于本发明中。在一些实施方式中，非激活状态的抗体以元件的激活和非激活形式结合于抗原决定部位。这样的抗体可用于确定样品中非激活和激活元件的量。在一些实施方式中，非激活状态的抗体结合在存在于元件非激活形式中但不存在于元件激活形式中的抗原决定部位。这样的抗体可用于确定样品中非激活元件的量。两种非激活状态的抗体可用于确定激活状态元件的量的变化(例如在使用在此所述的备选生物活性试剂治疗前和治疗后的样品中)是否与非激活状态元件的变化一致。例如，这样的抗体可用于确定活性元件的增长是否是由于非激活状态元件的激活或由于元件的表达的增加或两者。
在一些实施方式中，通过使用那些已知的用于标准流式细胞术中的珠粒类似物来固定抗体。可通过本领域已知的和/或在此所述的方法将多种激活状态特异性抗体连接在珠粒上。在允许多种激活元件(如果存在的话)结合多种固定化抗体的条件下，这样的结合的珠粒可与样品(优化为细胞提取物)相接触。包括唯一地标记的非激活状态抗体的多种第二抗体可被加入到固定的激活状态的特定抗体-激活元件复合物中，并且可根据各标记的存在按照FACS将珠粒进行分类，其中标记的存在表明与相应的第二抗体的结合和相应的激活元件的存在。
在本发明的替代实施方式中，蛋白结合元件的芳香族氨基酸可被取代为D-或L-萘基丙氨酸(naphylalanine)、D-或L-苯基甘氨酸、D-或L-2-噻吩丙氨酸(thieneylalanine)、D-或L-1-、2-、3-或4-pyreneylalanine、D-或L-3-噻吩丙氨酸、D-或L-(2-吡啶基)-丙氨酸、D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸、D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸、D-或L-(4-异丙基)-苯基甘氨酸、D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸、D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸、D-对氟苯基丙氨酸、D-或L-对联苯苯基丙氨酸、D-或L-对甲氧基联苯苯基丙氨酸、D-或L-2-吲哚(烷基)丙氨酸以及D-或L-烷基丙氨酸，其中烷基可为取代或非取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、sec-isotyl、异戊基和C1-C20的非酸性氨基酸。
酸性氨基酸可被非羧基氨基酸(同时维持带负电荷)及其衍生物和类似物所取代，非限制性的例子例如(膦酰)丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸或丝氨酸；或硫酸化的(例如-SO3H)苏氨酸、丝氨酸或酪氨酸。
其它取代基可包括非天然的羟基化氨基酸，可通过使“烷基”与任何天然的氨基酸结合产生。在此术语“烷基”是指支链或非支链的包含1至24个碳原子的饱和碳氢基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、辛基、癸基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基(tetracisyl)等。烷基包括含氮、氧和硫原子的杂烷基。在一些实施方式中，烷基在此包含1至12个碳原子。碱性氨基酸可在天然存在的氨基酸、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸或(胍基)-乙酸或其它(胍基)烷基-乙酸的任何位置被烷基取代，其中“烷基”如上定义。腈类衍生物(例如包含取代COOH的CN-部分)也可替代天冬酰胺或谷氨酰胺，蛋氨酸亚砜可替代蛋氨酸。制备这些肽类衍生物的方法是本领域普通技术人员公知的。
另外，任何多肽中的任何酰胺连接可被南五味子酮部分所取代。这些衍生物预期对酶降解有增强的稳定性，因此具有下述优点：可被配制成具有延长的体内半衰期的化合物，经口服、静脉内、肌肉、腹膜内、局部、直肠、眼内或其它途径给药。
对本发明中不同多肽氨基酸的其它氨基酸修饰可包括如下：半胱氨酰残基可与α-卤代乙酸(以及相应的胺)(例如2-氯代乙酸或乙酰胺)反应而生成羧甲基或羧胺甲基衍生物。半胱氨酰残基也可为与例如溴代三氟丙酮、α-溴代-β-(5-咪唑)丙酸、氯代乙酰磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶二硫化物、甲基2-吡啶二硫化物、对-氯代苯甲酸汞、2-氯代汞-4-硝基苯酚或氯代-7-硝基苯-2-氧杂-1，3-重氮盐的化合物反应生成的衍生物。
组氨酰残基可为与化合物(例如二乙基焦碳酸酯)例如在pH5.5-7.0下反应生成的衍生物，因为该试剂对组氨酰侧链有相对的特异性，且还可以使用对-溴代苯甲甲基溴；例如其中反应优化在0.1M二甲胂酸钠、pH6.0下反应。
赖氨酰和氨基末端残基可与例如琥珀酸或其它羧酸酐的化合物反应。这些试剂的衍生物预期可使赖氨酰残基产生相反的价态。
其它可生成含α-氨基残基衍生物的合适的试剂包括化合物，例如亚氨酸酯(例如甲基吡啶亚胺甲酯)、磷酸吡哆醛、吡哆醛、硼氢化氯、三硝基苯硫酸、邻-甲基异脲、2，4戊二酮和转氨酶催化的与乙醛酸的反应。精氨酰残基可根据已知方法步骤通过与一个或几个常规的试剂(包括苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮)反应而被修饰。精氨酸残基衍生物的产生需要反应在碱性状态下发生，这是因为胍基官能团的pKa高。此外，这些试剂可与赖氨酸基团以及精氨酸的ε-氨基反应。酪氨酰残基自身的特定的修饰是公知的，例如在酪氨酰残基中通过与芳香性重氮化合物或四硝基甲烷反应加入光谱标记。
N-乙酰咪唑和四硝基甲烷可分别用于生成O-乙酰基酪氨酰类以及3-硝基衍生物。羧基侧基(门冬氨酰或谷氨酰)可通过与碳二亚胺(R′--N--C--N--R′)(例如1-环己基-3-(2-吗啉基-1-(4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮酮-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺)反应而被选择性修饰。此外，天冬氨酰和谷氨酰残基可通过与铵离子反应转化为天冬氨酰酰基和谷氨酰胺酰基残基。
谷氨酰胺酰基和冬氨酰酰基基团可经常被去酰胺基化而形成相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。可选地，这些基团可在弱酸性条件下被去酰胺化。这些基团的任一形式都在本发明的范围之内。
在一些实施方式中，激活状态特异性结合元件为包括可结合于可激活蛋白质的靶结构上的识别结构的肽。多种识别结构为本领域公知的，并可通过本领域已知的方法进行制备，包括噬菌体展示库(参见例如Gururaja等人(2000)Chem.Biol.7：515-27；Houimel等人，(2001)Eur.J.Immunol.31：3535-45；Cochran等人(2001)J.Am.Chem.Soc.123：625-32；Houimel等人(2001)Int.J.Cancer 92：748-55，各以引用的方式结合于本文中)。此外，荧光团可被附加在该抗体上以用于本发明的方法中。
多种识别结构是本领域已知的(例如，Cochran等人，(2001)J.Am.Chem.Soc.123：625-32；Boer等人，(2002)Blood 100：467-73，各以引用的方式明确结合于本文中)，并且可使用本领域已知的方法进行制备(参见例如Boer等人，(2002)Blood 100：467-73；Gualillo等人，(2002)Mol.Cell Endocrinol.190：83-9，各以引用的方式明确结合于本文中)，包括例如通过组合化学的方法来产生识别结构，例如对可激活蛋白质上的靶结构有亲和力的多聚体(参见例如，Barn等人，(2001)J.Comb.Chem.3：534-41；Ju等人，(1999)Biotechnol.64：232-9，各以引用的方式明确结合于本文中)。在另一实施方式中，激活状态特异性抗体为只结合于特异性可激活蛋白的磷酸化的异构体而不结合于可激活蛋白的没有被磷酸化或非磷酸化的异构体上的蛋白质。在另一实施方式中，激活状态特异性抗体为只结合于细胞内而非细胞外的可激活蛋白的异构体的蛋白质，或反之亦然。在一些实施方式中，识别结构为抗层粘连蛋白单链抗体片段(scFv)(参见例如Sanz等人，(2002)GeneTherapy 9：1049-53；Tse等人，(2002)J.Mol.Biol.317：85-94，各以引用的方式明确结合于本文中)。
在一些实施方式中结合元件为核酸。术语“核酸“包括核酸类似物，例如磷酰胺(Beaucage等人，(1993)Tetrahedron 49(10)：1925和其中文献；Letsinger，J.(1970)Org.Chem.35：3800；Sprinzl等人，(1977)Eur.J.Biochem.81：579；Letsinger等人，(1986)Nucl.Acids Res.14：3487；Sawai等人，(1984)Chem.Lett.805，Letsinger等人，(1988)J.Am.Chem.So c.110：4470；和Pauwels等人，(1986)Chemica Scripta26：141-9)、磷硫酰(Mag等人，(1991)Nucleic Acids Res.19：1437和美国专利No.5,644,048)、二硫代磷酸酯(Briu等人，(1989)J.Am.Chem.Soc.111：2321)、O-甲基亚磷酰胺连接(参见Eckstein，Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，OxfordUniversity Press)和肽核酸骨架和连接(参见Egholm，(1992)J.Am.Chem.Soc.114：1895；Meier等人，(1992)Chem.Int.Ed.Engl.31：1008；Nielsen，(1993)Nature，365：566；Carlsson等人，(1996)Nature 380：207，其全部以引用方式结合于本文中)。其它核酸类似物包括包含正价骨架(Denpcy等人，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6097)、非离子骨架(美国专利Nos.5,386,023，5,637,684，5,602,240，5,216,141和4,469,863；Kiedrowshi等人，Angew.Chem.Intl.Ed.English 30：423(1991)；Letsinger等人，(1988)J.Am.Chem.Soc.110：4470；Letsinger等人，(1994)Nucleoside & Nucleotide 13：1597；Chapters 2 and 3，ASCSymposium Series 580，″Carbohydrate Modifications in AntisenseResearch″，Ed.Y.S.Sanghui和P.Dan Cook；Mesmaeker等人，(1994)Bioorganic & Medicinal Chem.Lett.4：395；Jeffs等人，(1994)J.Biomolecular NMR 34：17；Tetrahedron Lett.37：743(1996))和非核糖体骨架的那些，包括美国专利Nos.5,235,033和5,034,506，和Chapters 6and 7，ASC Symposium Series 580，″Carbohydrate Modifications inAntisense Research″，Ed.Y.S.Sanghui和P.Dan Cook中记载的那些。包含一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义中(见Jenkins等人，(1995)Chem.Soc.Rev.pp169-176)。一些核酸类似物记载于Rawls，C&E News Jun.2，1997page 35。所有的文献都以引用的方式明确结合于本文中。核糖磷酸骨架的这些修饰可有助于添加其它部分(例如标记)或增加生理环境中这些分子的稳定性和半衰期。
本领域技术人员将可以理解，所有这些氨基酸类似物均可在本发明中使用。而且，还可以制备天然存在的氨基酸和类似物的混合物。可选地，可以制备不同氨基酸类似物的混合物以及天然存在的氨基酸和类似物的混合物。在一些实施方式中，包括肽核酸类似物的肽核酸(PNA)被使用。这些骨架在中性状态下基本上为非离子型，与天然存在的核酸的磷酸二酯骨架的高电荷形成对比。
所述的核酸可为单链或双链的，或包含既含有双链也含有单链序列的部分。核酸可为DNA(可为基因组的和cDNA)、RNA或杂合体，其中核酸包括脱氧核糖-和核糖-核苷酸的任何组合以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等的任何碱基的组合。
在一些实施方式中，结合元件为合成化合物。存在许多针对多种多样有机化合物和生物分子的随机和定向合成的方法，包括随机寡核苷酸的表达。参见例如WO 94/24314，在此以引用的方式结合于本文中，其描述了包括随机化学方法以及酶催化方法的生成新化合物的方法。
可选地，一些实施方式使用了可获得的或易于生成的细菌、真菌、植物和动物提取物形式的自然化合物作为结合元件。
另外的，自然或合成的化合物容易通过常规的化学、物理和生化学方法进行修饰。已知的药理学试剂可被用于进行直接或随机的化学修饰，包括酶催化修饰，以生成可用于本发明中的结合元件。
在一些实施方式中，结合元件为小的有机化合物。结合元件可从一系列可被化学修饰的底物合成。在此“化学修饰”包括传统的化学反应以及酶催化反应。这些底物通常包括但不局限于烃基(包括烷、烯、炔和杂烷基)、芳香基(包括芳烃和杂芳基)、醇、醚、胺、醛、酮、酸、酯、酰胺、环化物、杂环化合物(包括嘌呤、嘧啶、苯并二氧杂唑、β-内酰胺、四环素、头孢菌素和碳水化合物)、甾体(包括雌激素、雄激素、可的松、蜕皮素等)、生物碱(包括麦角类、长春花、箭毒、吡咯兹定和丝裂霉素)、有机金属化合物、杂原子化合物、氨基酸和核苷。可在底物的部分上进行化学(包括酶催化)反应以形成可用于本发明中的新的底物或结合元件。
在一些实施方式中结合元件为碳水化合物。在此使用的术语碳水化合物包括具有分子通式(CH2O)n的任何化合物。碳水化合物的例子为二、三和寡糖以及例如糖原、纤维素和淀粉的多聚糖。
在一些实施方式中，结合元件为脂类。在此使用的术语脂类指包括可溶于非极性有机溶剂中的任何水不溶性有机分子。脂类的例子是甾体，例如胆固醇和磷脂(例如鞘磷脂)。
可激活元件、激活状态和确定可激活元件的激活水平的方法的例子在美国公布号20060073474题为“Methods and compositions fordetecting the activation state of multiple proteins in single cells”和美国公布号20050112700题为“Methods and compositions for riskstratification”中描述，其内容通过引用的方式结合于本文中。
A.标记
本发明的方法和组合物提供了包含标记或标签的结合元件。标记是指一个可直接(即原始标记)或间接(即二级标记)被检测的分子；例如，标记可被看见和/或测量或识别到，因此可以知道它是否存在。化合物可直接或间接与提供可检测的信号(例如放射性同位素、荧光、酶、抗体、例如磁性颗粒的颗粒、化学发光物或特异性的结合分子等)的标记相结合。特异性的结合分子包括例如生物素和抗生蛋白链菌素、地高辛和抗地高辛药等的配对。标记的例子包括但不局限于光学荧光和包括标记、标记酶和放射性同为素的显色染料。
在一些实施方式中，一个或多个结合元件为唯一的标记。使用两个激活状态特异性抗体的例子，其中“唯一地标记的”指第一激活状态抗体识别包括第一标记的第一激活元件，第二激活状态抗体识别包括第二标记的第二激活元件，其中第一和第二标记可被检测和识别，使第一抗体和第二抗体成为惟一地标记的。
通常，标记分为四类：a)可为放射性或重同位素的同位素标记；b)磁、电、热标记；c)包括发光、磷、荧光染料或部分的有色光学标记；和d)结合配对。标记还可包括酶(辣根过氧化物酶等)和磁性颗粒。在一些实施方式中，可检测的标记为原始标记。原始标记为可被直接检测的标记，例如荧光团。
标记包括例如荧光染料或部分的光学标记。荧光团可为“小分子”荧光剂或蛋白质性的荧光剂(例如绿色荧光蛋白和其所有变体)。
合适的荧光标记包括但不局限于荧光素、若丹明、四甲基若丹明、曙红、藻红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿(Malacite green)、均二苯乙烯、荧虾黄、Cascade BlueTM、德克萨斯红、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705和Oregon green。合适的光学染料在1996年Richard P.Haugland所著Molecular Probes Handbook中所描述，在此以引用的方式结合于本文中。合适的荧光标记还包括但不局限于绿色荧光蛋白(GFP；Chalfie，等人，Science 263(5148)：802-805(Feb.11，1994)；和EGFP；Clontech--基因库登录号U55762)、蓝色荧光蛋白(BFP；1.QuantumBiotechnologies，Inc.1801 de Maisonneuve Blvd.West，8th Floor，Montreal(Quebec)Canada H3H 1J9；2.Stauber，R.H.Biotechniques24(3)：462-471(1998)；3.Heim，R.和Tsien，R.Y.Curr.Biol.6：178-182(1996))、增强的黄色荧光蛋白(EYFP；1.Clontech Laboratories，Inc.，1020 East Meadow Circle，Palo Alto，Calif.94303)、萤虫素酶(Ichiki等人，J.Immunol.150(12)：5408-5417(1993))、β-半乳糖苷酶(Nolan等人，Proc Natl Acad Sci USA 85(8)：2603-2607(April 1988))和Renilla(WO 92/15673；WO 95/07463；WO 98/14605；WO 98/26277；WO99/49019；美国专利No.5,292,658；美国专利No.5,418,155；美国专利No.5,683,888；美国专利No.5,741,668；美国专利No.5,777,079；美国专利No.5,804,387；美国专利No.5,874,304；美国专利No.5,876,995；和美国专利No.5,925,558)。以上所有引用的文献均在此以引用的方式结合于本文中。
在一些实施方式中，本发明中使用的标记包括：Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor660、Alexa Fluor 680)、Cascade Blue、Cascade Yellow和R-藻红蛋白(PE)(分子探针)(Eugene，Oreg.)、FITC、若丹明和德克萨斯红(Pierce，Rockford，Ill.)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science，Pittsburgh，Pa.)。Cy5PE、Cy5.5PE、Cy7PE、Cy5.5APC、Cy7APC的串联连接实验方案是本领域已知的。荧光探针连接的定量可用于确定标记的程度，包括染料光谱性质的实验方案也是本领域公知的。在一些实施方式中，荧光标记与结合结合元件或抗体的氨基右旋糖酐联结子(linker)相连接。所列的其它标记可在BD Biosciences、BeckmanCoulter、AnaSpec、Invitrogen、Cell Signaling Technology、Millipore、eBioscience、Caltag、Santa Cruz Biotech、Abcam和Sigma的在线或纸件目录中获得，其内容在此通过引用方式结合于本文中。
在一些实施方式中，荧光标记为GFP，更优化地为GFP的Renilla、Ptilosarcus或Aequorea种类。
在一些实施方式中，使用二级可测标记。二级级标记为间接检测到的标记；例如，二级标记可与原始标记结合或反应以用于检测，可与其它产物反应以产生原始标记(例如酶)等。二级标记包括但不局限于结合配对之一、化学修饰部分、核酸酶抑制剂、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、萤虫素酶等)。
在一些实施方式中，二级标记为结合配对。例如标记可为半抗原或抗原，其可结合于其结合配对体。例如，合适的结合配对包括但不局限于抗原(例如蛋白质(包括肽)和小分子)和抗体(包括其片段(FAbs等))、蛋白质和小分子(包括生物素/抗生蛋白链菌素)酶和底物或抑制剂、其它蛋白-蛋白交互作用对、受体-配体以及碳水化合物和它们的结合配对。核酸-核酸结合蛋白对也是有用的。结合配对包括但不局限于生物素(或亚胺基-生物素)和抗生蛋白链菌素、地高辛配基和Ab以及ProlinxTM试剂。
在一些实施方式中，结合配对包含抗原和可特异性地与抗原结合的抗体。“特异性地结合”在此是指配对体特异性地结合，足以区别该对与系统中其它的组分或污染物。在包括去除非特异性结合的冲洗步骤的测定条件下，结合应足以保持连接的状态。在一些实施方式中，配对的解离常数小于大约10-4至10-9M-1，优选为小于大约10.-5至10-9M-1，特别优选为小于大约10-7至10-9M-1。
在一些实施方式中，二级标记为化学可修饰部分。在此实施方式中，包含反应官能团的标记被引入需标记的分子中。官能团可继而(例如在测试前或后)被原始标记标记。合适的功能团包括但不局限于氨基、羧基、马来酰亚胺基、氧代和巯基，其中氨基和巯基为特别优化的。例如，包含氨基的原始标记可被连接在包含氨基的二级标记上，例如使用本领域已知的联结子；例如，公知的同或异双功能联接子(见1994 Pierce Chemical Company catalog，technical section oncross-linkers，155-200页，在此以引用的方式结合于本文中)。
在一些实施方式中，本发明的方法和组合物使用多个荧光标记。在一些实施方式中，各标记为唯一的并可从其它标记中区别出。
本领域技术人员可以理解，抗体-标记的配合可通过标准方法或使用Molecular Probes(Eugene，Oreg.)的蛋白质-蛋白质/蛋白质-染料交联试剂盒进行。
在一些实施方式中，标记的抗体可用于细胞中可激活蛋白质的功能性分析。在进行这一分析时，实验的几个方面需被考虑：(1)确定染色合适的抗体鸡尾酒组合，(2)确定使用抗原(即可激活蛋白质)和感兴趣的抗体克隆的染色步骤，以及(3)彻底地评价细胞培养状态对细胞刺激的影响。抗原克隆的选择对于人类细胞表面抗原是特别重要的，因为不同的抗体克隆会产生不同的结果以及在不同实验方案中染色不相似。细胞类型的选择和培养条件优化也是检测差异的关键部分。例如，一些细胞系可以适应培养条件并产生异源响应。
在一些实施方式中，激活状态特异性抗体被Chattopadhyay，P.K.等人Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotypingby polychromatic flow cytometry.Nat.Med.12，972-977(2006)中公开的量子点所标记。量子点标记为Invitrogen市售的，http://probes.invitrogen.com/products/qdot/。
量子点标记的抗体可以单独使用或可与有机荧光染料-配合抗体共同使用以增加可用标记的总数。当标记的抗体的数量增加时，划分已知细胞群亚类型的能力也增加。另外，激活状态特异性抗体可使用螯合或束缚的稀土元素进行标记，例如在Erkki，J.等人Lanthanidechelates as new fluorochrome labels for cytochemistry.J.HistochemistryCytochemistry，36：1449-1451，1988和美国专利No.7,018850题为Salicylamide-Lanthanide Complexes for Use as Luminescent Markers中公开。还可以使用其它的检测荧光的方法，例如量子点方法(参见例如Goldman等人，J.Am.Chem.Soc.(2002)124：6378-82；Pathak等人J.Am.Chem.Soc.(2001)123：4103-4；和Remade等人，Proc.Natl.Sci.USA(2000)18：553-8，其全部在此以引用的方式结合于本文中)以及共聚焦显微镜。
在一些实施方式中，可激活元件被Tanner等人SpectrochimicaActa Part B：Atomic Spectroscopy，2007Mar；62(3)：188-195；Ornatsky等人，mRNA Detection in Leukemia Cell lines by Novel Metal-Taggedin situ Hybridization using Inductively Coupled Plasma MassSpectometry，Translational Oncogenomics(2006)：1，1-9；Ornatsky等人，Multiple Cellular Antigen Detection by ICP-MS，J.Imm.Methods 308(2006)68-76；和Lou等人，Polymer-Based Elemental Tags for SensitiveBioassays，Angew.Chem.Int.Ed.，(2007)46，6111-6114中公开的适于电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)的标签所标记。
可选地，可以使用例如下详细讨论的基于FRET的检测系统。FRET在本发明中可用于例如检测涉及聚集或多聚化的激活状态，其中邻近的两个FRET标记由于激活而改变。在一些实施方式中，至少两个荧光标记被使用，它们组成荧光共振能量转移(FRET)对。
FRET为本领域已知的现象，其中一个荧光染料的激发被转移至另一个荧光染料而不发射光子。FRET对由供体荧光团和受体荧光团构成。供体的荧光发射光谱和受体的荧光吸收光谱必须有重叠，而且两个分子必须接近。当50％的供体失活(转移能量至受体)时的供体和受体间的距离是由Forster半径(Ro)定义的，通常为
Figure GPA00001061269400821
包含FRET对的荧光发射光谱的变化可被检测到，表明邻近处的数目变化(即在相互距离100 521之内)。这通常产生于两分子的结合或解离，其中一个被FRET供体标记而另一个被FRET受体标记，其中这一结合使得FRET对处于邻近位置。这一分子的结合将产生受体的荧光发射的增加和/或供体的荧光发射的猝灭。
可用于本发明的FRET对(供体/受体)包括但不局限于EDANS/荧光素、IAEDANS/荧光素、荧光素/四甲基若丹明、荧光素/LC Red640、荧光素/Cy 5、荧光素/Cy 5.5和荧光素/LC Red 705。
在一些实施方式中，当使用FRET时，可使用荧光供体分子和非荧光受体分子(“猝灭剂”)。在此应用中，当猝灭剂被移出供体的邻近位置时供体的荧光发射增强，当猝灭剂位于供体的邻近位置时供体的荧光发射降低。使用的猝灭剂包括但不局限于TAMRA、DABCYL、QSY 7和QSY 33。使用的荧光供体/猝灭剂对包括但不局限于EDANS/DABCYL、德克萨斯红/DABCYL、BODIPY/DABCYL、荧虾黄/DABCYL、香豆素/DABCYL和荧光素/QSY 7染料。
本领域普通技术人员可以理解FRET和荧光猝灭可以超时监测标记分子的结合，从而提供有关结合反应的时间过程的连续信息。
优选地，FRET程度的变化可作为供体和受体部分的荧光量比率的变化函数而确定，此过程被称为为“比率”。样品中底物、激发强度和浊度或其它背景吸收在激发波长下的绝对量的变化影响了近似平行的供体和受体的荧光强度。因此两个发射强度的比率比各自单独的强度更强且有利于对裂解的测量。
在此所述的荧光比率指示系统比现有的用于蛋白质整合分析的指示物有显著优势，因为其容许对于表达和非表达的单个活细胞进行灵敏地检测和分离。在一些实施方式中，分析系统使用非毒性的、非极性的荧光底物，该底物可被容易地上样，然后进行细胞内捕获。当底物转化为产物时，同源蛋白质对荧光底物的修饰产生了荧光发射移位。因为指示读数为比率性的，其在指示蛋白分析中是唯一的，这是因为它可控制变量(例如将底物上样到个别细胞中的量等)。这种稳定的易检测的细胞内读数减少了在表达分析之前建立克隆细胞系的需要。该系统和其它类似的流动分类系统可用于分离具有特定的受体元件群集和/或来自数以百万活细胞的库的激活曲线的细胞。
本发明的方法和组合物还可使用标记酶。标记酶是指在产生可检测产物的标记酶底物的存在下可以反应的酶。用于本发明的合适的标记酶包括但不局限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶。使用这些底物的方法是本领域公知的。标记酶的存在通常通过酶催化标记酶底物反应并产生可辨认的产物而显示。这样的产物可为不透明的(例如四甲基联苯胺与辣根过氧化物酶的反应)并可产生多种颜色。其它的标记酶底物(例如鲁米诺(Pierce Chemical Co.提供))已被开发以产生荧光反应产物。确定标记酶底物的标记酶方法是本领域公知的，并且存在许多市售的试剂盒。使用不同的标记酶的例子和方法描述于Savage等人，Previews 247：6-9(1998)，Young，J.Virol.Methods24：227-236(1989)中，其全部内容在此通过引用的方式结合于本文中。
放射性同位素是指任何放射性分子。合适的用于本发明的放射性同位素包括但不局限于14C、3H、32P、33P、35S、125I和131I。应用放射性同位素作为标记是本领域公知的。
如所述的，标记可被间接检测，也就是说，标签为结合配对的配对体。“结合配对的配对体”是指第一和第二部分中的一个，其中第一和第二部分相互具有特定的亲和力。在本发明中使用的合适的结合配对包括但不局限于抗原/抗体(例如异羟洋地黄毒苷配基/抗-异羟洋地黄毒苷配基、二硝基苯基(DNP)/抗DNP、dansyl-X/抗dansyl、荧光素/抗荧光素、荧虾黄/抗荧虾黄和若丹明/抗若丹明)、生物素/卵白素(或生物素/抗生蛋白链菌素)以及钙调素结合蛋白(CBP)/钙调蛋白。其它合适的结合配对包括多肽(例如FLAG-肽[Hopp等人，BioTechnology，6：1204-1210(1988)])、KT3抗原决定部位肽(Martin等人，Science，255：192-194(1992))、微管蛋白抗原决定部位肽(Skinner等人，J.Biol.Chem.，266：15163-15166(1991))和T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6393-6397(1990))及其各抗体。本领域普通技术人员可以理解，在此所述的结合配对配对体可用于本申请中除标记以外的应用。
本领域中普通技术人员可以理解，一个结合配对的配对体可为另一个结合配对的配对体。例如，抗原(第一部分)可结合在第一抗体(第二部分)上，这也反过来成为第二抗体(第三部分)的抗原。还可以理解，这种情况允许通过各自结合配对配对体的中间第二部分产生第一部分和第三部分的间接结合。
本领域中普通技术人员可以理解，结合配对的配对体可包含上述的标记。也可以理解，这允许了标签在和包含标记结合配对体的结合后间接被标记。如上所述，将标记连接在作为结合配对的配对体的标签上在此被称为“间接标记”。
“表面底物结合分子”或“附着标签”以及语法上的等同语在此是指对特定的表面底物具有结合亲和力的分子，该底物通常指所应用、引入或连接在表面上的结合配对成员。合适的表面底物结合分子和它们的表面底物包括但不局限于多聚-组氨酸(多聚-his)或多聚-组氨酸-甘氨酸(多聚-his-gly)标签和镍底物、谷胱甘肽-S转移酶标签及其抗体底物(Pierce Chemical可售)、流感HA标签多肽及其抗体12CA5底物(Field等人，Mol.Cell.Biol.，8：2159-2165(1988))、c-myc标签及其8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体底物(Evan等人，Molecular and Cellular Biology，5：3610-3616(1985))以及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体底物(Paborsky等人，ProteinEngineering，3(6)：547-553(1990))。通常，用于本发明中的表面结合底物分子包括但不局限于可结合于镍底物的多聚组氨酸结构(His-标签)、结合于包含抗体的表面底物的抗原、结合于卵白素底物(例如生物素)的半抗原和结合于包含钙调蛋白的表面底物的CBP。
抗体-植入底物的生成是已知的；参见Slinkin等人，Bioconj.Chem.，2：342-348(1991)；Torchilin等人，如上；Trubetskoy等人，Bioconj.Chem.3：323-327(1992)；King等人，Cancer Res.54：6176-6185(1994)；和Wilbur等人，Bioconjugate Chem.5：220-235(1994)(所有均在此以引用的方式结合于本文中)，蛋白质与抗原的连接或生成如上所述。钙调蛋白-植入底物为市售的，蛋白质与CBP的生成描述在Simcox等人，Strategies 8：40-43(1995)中，其全部内容通过引用的方式结合于本文中。
本领域中普通技术人员可以理解，本发明的标签-组分很大程度取决于标签的形式可通过不同的方式生成。本发明的组分和标签优化通过共价键连接。
当标签也是多肽时，通过重组的方法来产生标签-多肽，如下所述。标签-标记蛋白质的生成为是本领域公知的，用于这样的生成的试剂盒为市售的(例如来自Kodak和Sigma)。标签标记的蛋白质的例子包括但不局限于Flag-多肽和His-多肽。用于产生和使用标签-标记蛋白质的方法可参见例如Winston等人，Genes and Devel.13：270-283(1999)(其全部内容结合在此)以及上述试剂盒中提供的产品手册。
靶分子和底物的生物素化为公知的，例如，大量已知的生物素化的试剂包括用于蛋白质、核酸、碳水化合物、羧酸生物素化的胺基-反应和巯基-反应试剂；参见chapter 4，Molecular Probes Catalog，Haugland，6th Ed.1996，在此以引用方式结合于本文中。生物素化的底物可通过卵白素或抗生蛋白链菌素附着于生物素化的组分上。类似地，大量半抗原化的试剂也是已知的(Id.)。
使用放射性同位素标记蛋白质的方法是本领域已知的。例如，这样的方法可见于Ohta等人，(1999)Molec.Cell 3：535-541中，其全部内容以引用是方式结合于此。
通过重组方法产生含有标签的蛋白质是公知的，且生成此种蛋白质的试剂盒为市售的。例如，这种试剂盒及其用法在Joanne Crowe等人所著QIAexpress Handbook from Qiagen中有所阐述，在此以引用方式结合于本文中。
具有化学反应活性基团(例如巯基、胺基、羧基等)的标记的功能是本领域普遍已知的。在一些实施方式中，标签被功能化以辅助共价连接。标签的共价连接可为直接地或通过联结子。在一个实施方式中，联结子为用于连接分子的相对短的偶联部分。偶联部分可被直接合成在本发明的组分上，并含有至少一个官能团以辅助标签的连接。可选地，偶联部分可具有至少两个官能团，例如被用于将功能化的组分连接在功能化的标签上。在另外的实施方式中，联结子为聚合物。在这个实施方式中，共价连接通过直接或通过使用聚合物的组分或标签的偶联部分来完成。在一些实施方式中，共价连接为直接的，也就是说没有使用联结子。在这个实施方式中，组分优选含有例如羧酸的官能团，该官能团用于与功能化的标签直接连接。应该理解的是，组分和标签可通过多种方法进行连接，包括以上列出的方法。在一些实施方式中，标签连接在多肽的氨基或羧基末端。本领域普通技术人员可以理解，以上所述标签的共价连接实际上可用于连接本文公开的任何两个分子。
如前面所概述的，在一些实施方式中，标签被功能化以辅助共价连接。因此，包含官能团的多种标签为市售的，其中官能团包括但不局限于异硫氰酸基、氨基、卤代乙酰基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺酯和硫酰基卤化物，在此所述所有基团可用于将标签共价连接到第二分子上。标签的功能团的选择取决于与上述联结子或本发明组分的连接位点。因此，例如，为了直接连接到蛋白质的羧酸基上，使用氨基或联氨修饰的标签通过碳二亚胺化学进行偶联，例如使用本领域已知的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDAC)(参见Set 9和Set11 of the Molecular Probes Catalog，如上；还可参见the Pierce 1994Catalog and Handbook，pages T-155to T-200，两个均通过引用的方式在此结合于本文中)。在一个实施方式中，碳二亚胺首先连接在标签上，例如在此所述的许多市售的标签。
可选的激活状态指示剂
在本发明中使用的可选的激活状态指示剂可以通过指示该激活的结果而检测激活状态。例如，底物的磷酸化可用于检测用于磷酸化该底物的激酶的激活。类似地，底物的裂解可作为用于该裂解的蛋白酶的激活的指示剂使用。允许将该指示和可检测信号进行偶合的方法是本领域公知的，例如上述的标记和标签与结合元件。例如，底物的裂解可消除猝灭部分，因此允许可检测信号从之前猝灭的标记中产生。
调节剂
在一些实施方式中，本发明的方法和组合物使用调节剂。调节剂可为激活剂、抑制剂或可影响细胞途径的化合物。调节剂可采用环境信号(cue)和输入的形式。
调节可在多种环境中进行。在一些实施方式中，细胞在收集后立即接触调节剂。在一些存在混合细胞群的实施方式中，细胞的纯化是在调节后进行的。在一些实施方式中，收集其中加入调节剂的全血被。在一些实施方式中，在处理单细胞或单细胞的纯化部分后调节细胞。作为一个例子，全血被采集，并对继而会接触调节剂的富含淋巴细胞的组分进行处理。调节包括将细胞与多于一个调节剂相接触。例如，在一些实施方式中，细胞与至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种调节剂相接触。
在一些实施方式中，细胞在收集后、接触调节剂前培养在合适的培养基中。在一些实施方式中，培养基为生长培养基。在一些实施方式中，生长培养基为可包含血清的复合培养基。在一些实施方式中，生长培养基包含血清。在一些实施方式中，血清选自胎牛血清、牛血清、人血清、猪血清、马血清和山羊血清。在一些实施方式中，血清水平为0.0001％至30％。在一些实施方式中，使用任何合适量的血清。在一些实施方式中，生长培养基为化学限定基础培养基，且不含有血清。在一些实施方式中，细胞在分化培养基中培养。
调节剂包括化学和生物实体，和物理或环境刺激。调节剂可在细胞外或细胞内起作用。化学和生物调节剂包括生长因子、细胞因子、神经递质、黏附分子、激素、小分子、无机化合物、多核苷酸、抗体、天然化合物、凝集素、内酯、化疗试剂、生物效应调节剂、碳水化合物、蛋白酶和自由基。调节剂包括复合物和可包含细胞或植物提取物、细胞或腺体分泌物、生理液体(例如血清)、羊水或毒液的非限定性生物组合物。物理和环境刺激包括电磁、紫外、红外或微粒辐射、氧化还原电势和pH、是否存在营养物、温度的变化、氧气分压的变化、离子浓度的变化和氧化应激的应用。调节剂可为内源性或外源性的，可根据暴露于单一细胞的浓度和接触时间或它们是否和与其它调节剂联合或连续使用而产生不同的效应。调节剂可直接作用于可激活元件或间接通过与一个或多个中间生物分子而间接作用。间接的调节包括基因表达的变更，其中表达的基因产物为可激活元件或可激活元件的调节剂。
在一些实施方式中，调节剂根据调节剂的浓度、接触时间或它们是否与其它调节剂联合或连续使用而产生不同的激活状态。
在一些实施方式中，调节剂选自生长因子、细胞因子、黏附分子调节剂、药物、激素、小分子、多核苷酸、抗体、天然化合物、内酯、化疗试剂、免疫调节剂、碳水化合物、蛋白酶、离子、活性氧族、多肽和蛋白质片段，单独或在细胞内、细胞本身、病毒和生物和非生物的复合物(例如珠粒、盘、病毒包膜、例如主要的组织相容性复合体的抗原代表分子)。在一些实施方式中，调节剂为物理刺激，例如热、冷、UV辐射和辐射。调节剂的例子包括但不局限于F(ab)2IgM、B细胞单克隆抗体、阿仑单抗、抗CD22(依帕珠单抗)、抗CD23(鲁昔单抗)、坎帕斯、H2O2、PMA、BAFF、April、SDF1a、CD40L、IGF-1、咪喹莫特、polyCpG、氟达拉滨、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、IL-7、IL-6、IL-10、IL-27、IL-4、IL-2、IL-3和毒胡萝卜素。
在一些实施方式中，调节剂为激活剂。在一些实施方式中，调节剂为抑制剂。在一些实施方式中，细胞接触一种或多种调节剂。在一些实施方式中，细胞接触至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种调节剂。在一些实施方式中，细胞接触至少两种调节剂，其中一种调节剂为激活剂和一种调节剂为抑制剂。在一些实施方式中，细胞接触至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种调节剂，其中至少一种调节剂为抑制剂。
在一些实施方式中，调节剂为B细胞受体调节剂。在一些实施方式中，B细胞受体调节剂为B细胞受体激活剂。B细胞受体激活剂的例子为B细胞受体复合物或B细胞辅助受体复合物的交联剂。在一些实施方式中，交联剂为抗体或分子结合体。在一些实施方式中，交联剂为抗体。在一些实施方式中，抗体为多价抗体。在一些实施方式中，抗体为一价、二价或多价抗体，更多价态通过连接在固体表面或栓在纳米颗粒表面以增强抗原决定部位结合域的局部化合价。
在一些实施方式中，交联剂为分子结合体。在一些实施方式中，分子结合体通过复合物中的碳水化合物或抗原决定部位作用或结合在B细胞受体复合物上。在一些实施方式中，分子为一价、二价或多价的，更多价态通过连接在固体表面或栓在纳米颗粒表面以增强抗原决定部位结合域的局部化合价。
在一些实施方式中，B细胞受体复合物或B细胞辅助受体复合物的交联包括将抗体或分子结合体与细胞相结合，然后通过使细胞与固体表面的作用而产生交联，其固体表面可通过抗体或分子结合体与BCR复合物产生交联。
在一些实施方式中，交联剂为F(ab)2IgM、IgG、IgD、多克隆BCR抗体、单克隆BCR抗体、Fc受体衍生结合元件和/或其组合。Ig可来自选自小鼠、山羊、兔、猪、大鼠、马、牛、鲨鱼、鸡或美洲驼中的物种。在一些实施方式中，交联剂为F(ab)2IgM、多克隆IgM抗体、单克隆IgM抗体、生物素化F(ab)2IgCM、生物素化多克隆IgM抗体、生物素化单克隆IgM抗体和/或其组合。
在一些实施方式中，抑制剂为细胞中参与细胞途径(例如信号级联放大)的细胞因子或多个因子的抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂为激酶或磷酸酶抑制剂。激酶抑制剂的例子包括adaphostin、AG490、AG 825、AG 957、AG 1024、aloisine、aloisine A、alsterpaullone、aminogenistein、API-2、芹菜素、牛蒡子素、AY-22989、BAY 61-3606、双吲哚马来酰亚胺IX、白屈菜红碱、10-[4′-(N，N-二乙氨基)丁基]-2-氯代吩噁嗪盐酸盐、达沙替尼、2-二甲氨基-4，5，6，7-四溴代-1H-苯并咪唑、5，7-二甲氧基-3-(4-吡啶基)喹啉二盐酸化物、依地福新、鞣花酸、enzastaurin、ER 27319马来酸盐、埃罗替尼、ET18OCH3、法舒地尔、flavopiridol、吉非替尼、GW 5074、H-7、H-8、H-89、HA-100、HA-1004、HA-1077、HA-1100、羟基法舒地尔、靛红-3’-肟、5-碘代杀结核菌素、kenpaullone、KN-62、KY12420、LFM-A13、薰草菌素A、木犀草素、LY-294002、LY294002、楸毒素、ML-9、NSC-154020、NSC-226080、NSC-231634、NSC-664704、NSC-680410、NU6102、奥罗莫星、羟吲哚I、PD-153035、PD-98059、PD 169316、根皮素、根皮苷、云鞣杉醇、鬼臼苦素、PKI、PP1、PP2、purvalanol A、槲皮素、R406、R788、雷帕鸣、雷帕霉素、Ro 31-8220、roscovitine、粗糠柴毒、SB202190、SB203580、西罗莫司、索拉非尼、SL327、SP600125、十字孢碱、STI-571、SU-11274、SU1498、SU4312、SU6656、4，5，6，7-四溴代三唑、TG101348、曲西立滨、Tyrphostin AG 490、Tyrphostin AG 825、Tyrphostin AG 957、Tyrphostin AG  1024、Tyrphostin SU1498、U0126、VX-509、VX-667、VX-680、W-7、沃特曼宁、XL-019、XL-147、XL-184、XL-228、XL-281、XL-518、XL-647、XL-765、XL-820、XL-844、XL-880、Y-27632、ZD-1839、ZM-252868、ZM-447439、siRNA、miRNA。磷酸酶抑制剂包括但不局限于H2O2、siRNA、miRNA、斑蝥素、(-)-对溴四咪唑、微囊藻素LR、原钒酸钠、过钒酸钠、硫酸氧钒、氧代二过氧(1，10-菲咯啉)钒酸钠、联麦芽酚氧钒(IV)、钼酸钠、过钼酸钠、酒石酸钠、咪唑、氟化钠、β-甘油磷酸酯、十水焦磷酸盐钠、花萼海绵诱癌素A、Discodermiacalyx、bpV(phen)、mpV(pic)、DMHV、氯氰菊酯、Dephostatin、冈田酸、NIPP-1、N-(9，10-二氧代-9，10-二氢-菲-2-基)-2，2-二甲基-丙酰氨、α-溴代4-羟基苯乙酮、4-羟基苯甲酰甲基溴、α-溴代-4-甲氧基苯乙酮、4-甲氧基苯甲酰甲基溴、α-溴代-4-(羧基甲氧基)苯乙酮、4-(羧基甲氧基)苯甲酰甲基溴和双(4-三氟甲基磺酰氨基苯基)-1，4-二异丙基苯、氧化苯砷、吡咯烷二硫代氨基甲酸和氟化铝。在一些实施方式中，磷酸酶抑制剂为H2O2。
在一些实施方式中，H2O2作为抑制剂施用。在一些实施方式中，施用的H2O2为0.01至50mM。在一些实施方式中，施用的H2O2为0.1至10mM。在一些实施方式中，施用的H2O2为1至10mM。在一些实施方式中，施用的H2O2为1至5mM。在一些实施方式中，施用的H2O2为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mM。在某些实施方式中，施用的H2O2为3.0mM。在某些实施方式中，施用的H2O2为3.3mM。在一些实施方式中，接触H2O2的持续时间介于0.01至360分钟。在一些实施方式中，接触H2O2的持续时间介于0.1至240分钟之间。在一些实施方式中，接触H2O2的持续时间介于0.5至180分钟之间。在一些实施方式中，接触H2O2的持续时间介于0至120分钟之间。在一些实施方式中，接触H2O2的持续时间介于5至15分钟之间。在一些实施方式中，接触H2O2的持续时间为1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、120、140、160或180分钟。在一些实施方式中，接触H2O2的持续时间为10分钟。在一些实施方式中，H2O2被用作抑制剂与至少一种其它的调节剂一起施用。在一些实施方式中，H2O2被用作抑制剂与F(ab)2IgM或任何合适的BCR激动剂一起施用。在一些实施方式中，在施用F(ab)2IgM前施用H2O2。在一些实施方式中，H2O2与F(ab)2IgM同时施用。在一些实施方式中，施用F(ab)2IgM后施用H2O2。
在一些实施方式中，细胞中可激活元件的激活水平在细胞与至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种调节剂接触后被确定。在一些实施方式中，细胞中可激活元件的激活水平在细胞与至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种调节剂接触后被确定，其中至少一种调节剂为抑制剂。在一些实施方式中，细胞中可激活元件的激活水平在细胞与抑制剂和调节剂接触后被确定，其中调节剂可为抑制剂或激活剂。在一些实施方式中，细胞中可激活元件的激活水平在细胞与抑制剂和激活剂接触后被确定。在一些实施方式中，细胞中可激活元件的激活水平在细胞与两种或多种调节剂接触后被确定。
在一些实施方式中，细胞群的表型谱通过测量当细胞群在不同培养基中接触多个调节剂时可激活元件的激活水平来确定。在一些实施方式中，调节剂包括F(ab)2IgM、B细胞单克隆抗体、阿仑单抗、抗CD22(依帕珠单抗)、抗CD23(鲁昔单抗)、坎帕斯、H2O2、PMA、BAFF、April、SDF1a、CD40L、IGF-1、咪喹莫特、polyCpG、氟达拉滨、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、IL-7、IL-6、IL-10、IL-27、IL-4、IL-2、IL-3、毒胡萝卜素和/或其组合。例如，细胞群可接触一种或多种、所有或以下调节剂的组合：(i)F(ab)2IgM；(ii)B细胞单克隆抗体；(iii)坎帕斯；(iv)H2O2；(v)PMA；(vi)BAFF；(vii)April；(viii)SDF1a；(ix)CD40L；(x)IGF-1；(xi)咪喹莫特；(xii)polyCpG；(xiii)氟达拉滨；(xiv)环磷酰胺；(xv)苯丁酸氮芥；IL-7；(xvi)IL-6；(xvii)IL-10；(xviii)IL-27；(xx)IL-4；(xx)IL-2；(xxi)IL-3；(xxii)阿仑单抗；(xxiii)抗CD22(依帕珠单抗)；(xxiv)抗CD23(鲁昔单抗)；(xxv)毒胡萝卜素和(xxvi)F(ab)2IgM和H2O2。在一些实施方式中，在此所述的细胞群的显性曲线用于分类细胞群。
检测
在实施本发明的方法时，一个或多个可激活元件的状态的检测可由例如实验室技术人员的人员完成。可选地，一个或多个可激活元件的状态的检测可使用自动化系统完成。在任何一种情况中，本发明方法中使用的一个或多个可激活元件的状态的检测是根据本领域公知的标准技术和实验方案进行的。
一个或多个可激活元件可通过可检测和/或量化感兴趣的可激活元件的存在的任何方法被检测和/或量化。这样的方法可包括放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫组织化学、使用或不使用共聚焦显微镜的免疫荧光组织化学、反相测定、均质酶免疫测定和相关的非酶学技术、免疫印迹法、全细胞染色、免疫电子显微镜、核酸扩增、基因芯片、蛋白质芯片、质谱、膜片钳、二维凝胶电泳、差异筛选凝胶电泳、基于微球体的多重蛋白测定、不含标记的细胞测定和流式细胞术等。美国专利No.4,568,649阐述了使用闪烁计数的配体检测系统。这些技术对于改良的蛋白质参数尤其有效。蛋白质和其它细胞决定因素的细胞读数可通过使用荧光或其它标签指示分子得到。流式细胞术方法对于测量细胞内参数有效。
在一些实施方式中，本发明提供了用于确定单细胞中可激活元件的激活曲线的方法。该方法包括基于至少两个可激活元件的激活水平使用流式细胞术来分析细胞。结合元件(例如激活状态特异性抗体)被用于基于可激活元件的激活水平分析细胞，并可按照如下所述进行检测。可选地，如上所述的非结合元件系统可用于在此所述的任何系统中。
当在本发明的方法和组合物中使用荧光标记组分时，可识别到不同类型的荧光监测系统(例如细胞计数测量装置系统)可用于实施本发明。在一些实施方式中，使用流式细胞检测系统或高通量筛选系统，例如96孔或更多孔的微孔板。在荧光材料上进行测试的方法是本领域公知的，并描述在例如Lakowicz，J.R.，Principles of FluorescenceSpectroscopy，New York：Plenum Press(1983)；Herman，B.，Resonanceenergy transfer microscopy，in：Fluorescence Microscopy of Living Cellsin Culture，Part B，Methods in Cell Biology，vol.30，ed.Taylor，D.L.&Wang，Y.-L.，San Diego：Academic Press(1989)，pp.219-243；Turro，N.J.，Modern Molecular Photochemistry，Menlo Park：Benjamin/CummingsPublishing Col，Inc.(1978)，pp.296-361中。
样品中的荧光可通过荧光计进行测量。总的来说，来自于具有第一波长的激发源的激发辐射通过激发光学元件。激发光学元件引起激发辐射以激发样品。作为响应，样品中的荧光蛋白质发出具有不同于激发波长的波长的辐射。然后光学元件采集样品中的发射。装置可包括温度控制器以使样品在被扫描时保持在一个特定的温度。根据一个实施方式，多轴位移台(translation stage)移动载有多个样品的微孔板以定位待接触的不同孔穴。多轴位移台、温度控制器、自动聚集特征以及图像和数据采集相关的电子产品可通过适当程序化的数字计算机来控制。计算机还能将测定中采集的数据转化为另一显示格式。一般来说，可以使用已知的自动化系统和组件。
还可以使用其它的检测荧光的方法，例如量子点方法(参见例如Goldman等人，J.Am.Chem.Soc.(2002)124：6378-82；Pathak等人J.Am.Chem.Soc.(2001)123：4103-4；和Remade等人，Proc.Natl.Sci.USA(2000)18：553-8，其全部在此以引用的方式结合于本文中)和共聚焦显微镜。一般来说，流式细胞术包括使单个细胞通过激光束通路。任何连接在或在细胞内的荧光分子的散射光束和激发可被光电倍增管检测以产生可读的输出，例如大小、颗粒度或荧光强度。
本发明方法的检测、分类或分离步骤使荧光激活细胞分选(FACS)技术成为必需，其中FACS用于从包含特定的表面标记的细胞群中选择细胞，或者该选择步骤可使将磁性响应颗粒作为用于捕获靶细胞和/或去除背景的可回收支持材料成为必需。多种FACS系统是本领域已知的，并可用于本发明的方法中(参见例如于1999年4月16日提交的WO99/54494；于2001年7月5日提交的美国序列号20010006787，其全部在此以引用方式结合于本文中)。
在一些实施方式中，用FACS细胞分类器(例如FACSVantageTM细胞分类器，Becton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose，Calif.)根据它们的激活谱(阳性细胞)-是否存在应答于调节剂的可激活元件激活水平的变化-来分类和收集细胞。在一些实施方式中，变化为减少。在一些实施方式中，变化为增加。
在一些实施方式中，细胞首先与荧光标记的激活状态特异性结合元件(例如抗体)相接触，该结合元件直接针对特异性可激活元件的特定的激活状态。在该实施方式中，各细胞上结合的结合元件的量可通过使包含细胞的液滴通过细胞分类器而测量。通过将电磁电荷传递至包含阳性细胞的液滴，细胞可从其它细胞中分离出。正性选择的细胞可继而在无菌收集容器中富集。细胞分类步骤被详细描述在例如FACSVantageTM的培训手册特别是第3-11至3-28节和第10-1至10-17节中，其全部内容在此通过引用方式结合于本文中。
在另一实施方式中，阳性细胞可基于可激活元件异构体的存在通过使用磁性分离被分类。在该分离技术中，被正向选择的细胞可首先与特定的结合元件(例如结合于可激活元件异构体的抗体或试剂)相接触。细胞继而接触与结合特异性元件的试剂相偶合的可回收颗粒(例如磁性响应颗粒)。细胞结合元件颗粒复合物可继而从非阳性或非标记细胞中进行物理分离，例如通过使用磁场。当使用磁性响应颗粒时，当去除阴性细胞时，阳性或标记细胞可被保留在使用磁场的容器中。这些以及相似的分离步骤被描述在例如Baxter ImmunotherapyIsolex培训手册中，其全部内容通过引用的方式结合在此。
在一些实施方式中，提供了用于确定单细胞的受体元件的激活状态曲线的方法。该方法包括提供细胞群和通过流式细胞术分析细胞群。优选地，细胞可基于至少两个可激活元件的激活水平进行分析。在一些实施方式中，多样性的可激活元件的激活状态抗体可用于同时确定多样性的元件的激活状态。
在一些实施方式中，通过流式细胞术的基于至少两个元件的激活水平的细胞分析与其它流式细胞术可读输出的确定(例如表面标记的存在、颗粒度和细胞尺寸)相结合，以提供多样性的元件的激活水平与可被流式细胞术测量的单细胞的其它细胞性质之间的相关性。
可以理解的是，本发明还提供信号转导中元件群集事件的排序。特别地，本发明允许本领域普通技术人员基于群集水平与单细胞内多样性的元件的激活之间的关联性来构建元件群集和激活等级。排序可通过在单一时间点将细胞和细胞群的激活水平与对照进行比较、或通过在多个时间点比较细胞以从另外细胞中观察亚群而完成。
本发明提供了用于确定细胞群中细胞亚群的存在有价值的方法。理想地，信号转导途径在同源细胞群中被评价以确保：细胞间信号传导的差异不定性或不定量的屏蔽信号转导事件和其中的变化。由于最终的同源系统为单细胞，本发明允许对细胞的个体评价以允许以显著的方式确定的真正区别。
因此，本发明提供了可在较大的细胞群中区别细胞亚群的方法。正如在此概述的，这些细胞亚群经常展现出与群中其它亚群相比不同的生物特征(例如激活水平、对调节剂的改变的响应)。例如，如此所述，本发明方法允许从群(例如原始细胞群)中确定细胞亚群，例如展现不同的响应(例如与病症的存在相关的响应)的外周血单核细胞与其它亚群的比较。另外，该类型的评价可以区别不同的激活状态、对调节剂的不同响应、细胞系、细胞分化状态等。
可以理解的是，这些方法提供了在复杂的细胞群(例如外周血单核细胞或原初和记忆淋巴细胞)中识别人工和可刺激的病症的不同的信号级联放大。
在必要的时候，细胞可分散为单细胞悬浮液(例如使用合适的蛋白酶、胶原酶、分散酶等的酶解等)中。合适的溶液被用于分散或悬浮。这种溶液通常为平衡盐溶液，例如生理盐水、PBS、Hanks平衡盐溶液等，方便地补加肽牛血清或其它天然存在的因子，并与可接受的低浓度(通常为5-25mM)缓冲液结合。方便的缓冲液包括HEPES1磷酸缓冲液、乳酸盐缓冲液等。细胞可使用例如3％多聚甲醛进行固定，并通常使用例如冰甲醇、含0.1％皂草苷、3％BSA的HEPES缓冲PBS进行透化，浸于-200C丙酮中2分钟等，根据在此所述的方法进行。
在一些实施方式中，96孔板或其它市售多孔板的孔穴中含有一个或多个细胞。在替代的实施方式中，反应混合物或细胞在细胞计数测量仪器中。本发明使用的其它多孔板包括但不局限于384孔板和1536孔板。本领域普通技术人员还知道装有反应混合物或细胞的其它容器及其在本发明中的作用。
为检测可激活元件的激活水平或活性而填加测定的组分、或者调节该激活水平或活性可为顺序的或以预先确定顺序或根据适合于测定的活性的条件下进行分组。这样的条件在本文中有描述，并且是本领域已知的。此外，下面还提供了进一步的指导(参见例如实施例)。
在一些实施方式中，可激活元件的激活水平可使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测量。已标记特定的元件的结合元件与可激活元件相结合。当细胞被引入ICP，它被原子化和离子化。包括结合可激活元件的标记的结合元件的细胞元件组成被测定。对应于结合元件上的标记的信号的存在和强度表明在该细胞上可激活元件的水平(Tanner等人Spectrochimica Acta Part B：Atomic Spectroscopy，(2007)，62(3)：188-195)。
本领域中普通技术人员可以理解，本方法和组合物可被用于除了流式细胞术分析以外的其它测定形式中。例如，DNA芯片的类似芯片可用于本发明方法中。在预期阵列上将核酸定位于芯片的阵列物(arrayer)和方法是已知的。另外，蛋白芯片和合成方法为已知的。为了在预期阵列中将激活状态元件固定在芯片上，可将这些方法和材料进行改造。在一些实施方式中，这样的芯片包含多样性的元件激活状态结合元件，并用于确定存在于细胞表面的元件的元件激活状态曲线。
在一些实施方式中，芯片包括多样性的“第二套结合元件”，该情况下通常为未标记的。该芯片与样品(优选为细胞提取物)相接触，包含元件激活状态特异性结合元件的多样性的第二结合元件被用在三明治测定中，以同时确定样品中多样性的激活元件的存在。优选地，各多样性的激活状态特异性结合元件被唯一地进行标记，以促进检测。
在一些实施方式中，共聚焦显微镜可用于检测单个细胞的激活曲线。共聚焦显微镜依赖于来自空间过滤的个体样本点的一系列光集合，其可继而经过电子处理以取得样本的放大图像。涉及信号处理的共聚焦显微镜还具有可在单细胞中检测标记的结合元件的其它能力，相应地在该实施方式中，细胞可被一个或多个结合元件标记。在一些实施方式中，与使用共聚焦显微镜有关的结合元件为偶合了荧光标记的抗体，然而例如其它蛋白质或核酸的其它结合元件也是可能的。
在一些实施方式中，本发明的方法和组合物可与“细胞内Western测定”联合使用。在该测定中，通过使用标准的组织培养技术，细胞最初在标准的组织培养瓶中生长。一旦生长至优化的铺满度(confluency)，去除生长培养基，清洗和使用胰蛋白酶处理细胞。然后计数细胞，足以转移适当细胞数量的体积被等分到微孔板(例如Nunc TM 96微孔TM板)上。然后各孔穴在完全培养基中生长至优化的铺满度，此时培养基被更换为不含血清的培养基。此时，不处理对照，但是试验孔穴与例如EGF的调节剂共同培育。在与调节剂培育后，细胞被固定并使用标记的抗体染色正在研究的激活元件。一旦细胞被标记，可使用图象仪(例如Odyssey Imager(LiCor，LincolnNebr.))通过Odyssey Operator′s Manual v1.2(其全部内容在此以引用的方式结合于本文中)中描述的技术来扫描板。扫描多孔板扫描获得的数据可被分析，并且激活曲线按照如下所述进行确定。
在一些实施方式中，检测使用高效液相色谱(HPLC)进行(例如反相HPLC)，进一步地，检测使用质谱进行。
这些仪器可放于无菌层流或通风厨中，或作为自含式系统封闭在内，用于在多孔板或试管中的细胞培养生长和转化以及用于危险操作。活细胞可在控制的生长条件下生长，同时进行在活细胞测定的不同时间上的温度、湿度和气体的对照。自动化的细胞转化和自动化的菌落挑选器可有助于快速筛选理想的细胞。
流式细胞术或毛细管电泳形式可用于磁性的和其它珠粒、颗粒、细胞和生物体的个体捕获。
灵活的硬件和软件使得该仪器适于多种应用。软件程序模块确保了方法的产生、修饰和运行。系统诊断模块确保了仪器的校准、正确的连接和发动机的操作。定制的工具、实验室器皿和液体、微粒、细胞和生物体的转化模式使得能够进行不同的应用。数据库可以存储方法和参数。自动化和计算机界面确保了仪器间的联络。
在一些实施方式中，本发明方法包括使用液体处理组件。液体处理系统可包括包含任何数量的组件的自动化系统。另外，任何或所有列举的步骤可为自动化的；因此，例如，该系统可为全部或部分自动化的。
本领域中技术人员可以理解，有多种可应用的组件，包括但不局限于一个或多个机器臂；用于微孔板定位的板处理机；自动化的盖或帽处理机以去除和替代非交叉污染板上的孔盖；使用一次性吸头的样品分配器的吸头装配；样品分配器的可清洗的吸头装配；96孔上样区；冷却的试剂支架；微孔板移液管的位置(可选择地冷却)；板和吸头的堆积塔；和计算机系统。
完全自动化或微流系统包括自动化的液体-、微粒-、细胞-和生物体-处理，包括高通量移液以实现筛选应用的所有步骤。这包括液体、微粒、细胞和生物体的操作，例如抽吸、分配、混合、稀释、清洗、精确地容积转移、回收和丢弃移液管吸头，和从单一样品抽吸中反复吸量相同的体积用于多次转移。这些操作为无交叉污染的液体、微粒、细胞和生物体的转移。该仪器自动反复地将微孔板样品上样到过滤器、膜和/或子过滤板、进行高密度转移、全板系列稀释和高容量操作。自动化、自动化样品收集和分析的其它例子公开于US61/048,657中，其全部内容通过引用方式结合于本文中。
在一些实施方式中，被用化学衍生微粒、板、药筒、试管、磁性颗粒或与测定组分具有特异性的其它固相基质。微孔板、试管或任何固相基质的结合表面包括非极性表面、高极性表面、促进共价结合的改良的葡聚糖涂层、抗体涂层、结合融合蛋白质或肽、表面固定蛋白质(例如重组蛋白质A或G)的亲和介质、核苷酸树脂或涂层和本发明使用的其它亲和基质。
在一些实施方式中，多孔板、多管、支架、药筒、微管、深孔板、微离心管、冷冻管、正方孔板、过滤器、芯片、光学纤维、珠粒和具有其它固相基质的平台或不同体积的平台可调节为用于其它性能的可升级模块平台。该模块平台包括不同速度的定轨摇床以及用于来源样品、样品和试剂稀释、测定板、样品和试剂贮器、移液管吸头和活性清洗站的多位置工作台。在一些实施方式中，本发明的方法包括使用板读数仪。
在一些实施方式中，温度循环器和温度调节系统被用于稳定热交换器(例如控制的区或平台)的温度以精确控制培育样品的稳定为0℃至100℃。
在一些实施方式中，具有单个或多个磁性探针、亲和探针或移液管的可交换的移液管头(单或多通道)可自动化地操作液体、微粒、细胞和生物体。多孔或多管磁性分离器或平台以单个或多个样品形式来操作液体、颗粒、细胞和生物体。
在一些实施方式中，仪器包括检测器，取决于不同的标记和测试，可为多种不同的检测器。在一些实施方式中，使用的检测器包括有多荧光波道的显微镜；提供具有单和双波长终点和动力学性能的荧光、紫外和可见光分光光度计检测、荧光共振能量转移(FRET)、发光、猝灭、双光子激发和强度再分配的板读数器；捕获和转化数据和图像为可计量形式的CCD照相；和计算机工作站。
在一些实施方式中，自动化的仪器包括可通过总线与内存和一组输入/输出装置(例如键盘、鼠标、显示器、打印机等)联通的中央处理单元。此外，如下所述，它可以是本发明的多元装置中除了CPU以外的其它装置获或替代CPU。中央处理器、内存、输入/输出装置和总线之间的一般相互作用是本领域已知的。因此，取决于运行的实验，多种不同的程序存储在CPU内存中。
这些自动化的液体操作系统可使用任何数量的不同的试剂，包括缓冲液、试剂、样品、洗液、测定组分(例如标记探针)等。
分析
流式细胞术的进展使得单个细胞计数可同时达到13个参数(DeRosa等人，2001)，并且朝着基因组和蛋白组数据亚群(Krutzik和Nolan，2003；Perez和Nolan，2002)的方向进展。同样的，其它技术(例如微列阵)的进展使得能够识别多个可激活元件。随着参数、抗原决定部位和样品的数目增加，实验的复杂性和数据分析的挑战也迅速增长。另一层面的数据复杂性由于刺激仪表板(panel)的发展而增加，该仪表板使得在增值的一组实验状态下能够研究可激活元件。用于分析多个参数的方法是本领域公知的。在一些实施方式中，流式细胞术的应用需要运行和分析不同阶段的软件，参见61/079,579；61/079,551；61/079,537；61/087,555；61/085,789，其全部内容通过引用方式结合于本文中。
在使用流式细胞术的一些实施方式中，流式细胞实验被排列，并且使用热图来辅助评估，结果大约为倍的变化。通常来讲，阵列流式细胞术实验基于实验设计和流式细胞样品间观察到的差异而简化了多维流式细胞术的数据。比较一组流式细胞术样品中的变化的一个普通方式为在同一作图上将一个参数的直方图进行叠加。阵列流式细胞术实验理想化地包括实验样品与其进行比较的参考样品。该参考样品被置于阵列的第一个位置，接下来的试验样品跟着对照顺序排列。参考样品可包括正常的和/或与病症相关的细胞(例如肿瘤细胞)。
在使用流式细胞术的一些实施方式中，在分析数据前，感兴趣的群和用于表征这些群的方法被确定。例如，至少存在两种用于数据分析的识别群的普通方法：(i)个体样品或亚群(例如临床试验中的患者)的参数集的“外-进(outside-in)”对比。在这个更为普遍的例子中，细胞群为同源或系门控的(lineage gated)，这样的方式能够将与兴趣靶点同源的那些分为不同的组。样品水平进行对比的例子为识别患者的肿瘤细胞中的信号曲线和将这些曲线与临床响应的非随机分布相关联。这被认为是外-进的方法，由于感兴趣的群在绘图和与其它群的曲线对比之前已被预定义。(ii)异源群中在个体细胞水平下参数的“内-出(inside-out)”对比。其例子为在某种病症下混合的造血细胞的信号传导状态图和使用系特异性标记的计算机识别细胞群集的后继比较。这被认为是单细胞研究的内-出的方法，因为在分类前并没有假定特定群的存在。该方法的主要缺点在于它产生的群至少在初始时需要多个瞬时标记来计数，并可能永远也不能接触单细胞的表面抗原决定部位。因此，这些细胞群的生物学显著性很难确定。该非常规方法的主要优点在于追踪细胞群时无偏见，不会潜在武断地划分细胞系或细胞类型之间的区别。
这些技术中各个技术利用了流式细胞术在单细胞水平下传递大量的多参数数据的能力。对于与病症(例如瘤形成或造血病症)相关联的细胞，存在数据的第三“元级”，因为与病症(例如癌细胞)相关联的细胞，通常被作为单一实体处理并根据历史技术进行分类。这些技术包括起源器官或组织、分化程度、增殖指数、转移速度和患者的遗传或代谢数据。
在一些实施方式中，本发明使用方差图谱(variance mapping)技术来绘制病症信号空间。这些方法代表了病症生物学研究上的一个显著进步，因为不依赖假定的正常对照也能够进行病症的对比。传统的差异状态分析方法(例如基因微阵列、差减RNA印迹)通常依赖于各患者样品中与病症相关联的细胞与正常对照(通常为临近或理论上未转化的组织)的比较。可选地，它们依赖于多个群集和重新群集成组，并且根据表型继续将患者的样品分层。相反，病症状态的方差图谱首先将病症样品与自身进行比较，然后再与母病症群进行比较。因此，病症中具有最多差异的激活状态为差异状态的分析提供了核心的参数。假定存在差异病症库，这项技术使得研究者能够识别到差异病症病理学(例如癌症对化疗的响应)中潜在的分子事件，而不是病症与假定的正常对照之间的差异。
在一些实施方式中，当方差图谱用于描绘患者样品的信号空间时，不论来源的组织或细胞类型，其信号对调节剂响应相似的病症被分组在一起。同样，基于系标记或来源的组织被认为是相对类似的两个病症(例如两个肿瘤)可能具有非常不同的解释环境刺激的能力，因而应被划分到两个不同的组内。
当信号曲线组被确定时，经常有用的是：确定其它因子(例如临床响应、基因突变的存在和蛋白质的表达水平)在组内是否为非随机分布的。如果实验或文献在阵列流式细胞术实验中暗示这样的假设，那么可以使用简单的统计学测试(例如Student′s t-检验和X2检验)来判断。同样，如果实验中两个可变因素被认为是相关的，那么线性回归中的r2相关性系数用来表明这种关系的程度。
分析可激活元件的例子描述在US公布号20060073474题为“Methods and compositions for detecting the activation state of multipleproteins in single cells”和US公布号20050112700题为“Methods andcompositions for risk stratification”和US 61/085,789中，其内容通过引用的方式结合于本文中。
CLL为本发明方法的一个例子。图26、27和28中所示的数据为在22例CLL患者和4例对照患者中比较多个可激活元件的激活状态的热图。该数据表明：根据热图所示，来自不同CLL患者的B细胞显示出可激活元件的可区别的模式。抑制剂或抑制剂和另一调节剂进一步定义了可以识别、分类和分组隐藏的或异常的造血细胞群(即患者群集)的可激活元件的其它模式。在图26、27和28中，患者样品标明在热图的上部。各柱形代表一位患者。CLL表明：样品来自诊断为CLL的患者。CON表明：样品来自对照患者。热图的图标标记在图的上部，并且基于log10倍的增加或减少，使用相对于未刺激的对照(0分钟)的平均荧光强度(MFI)的阴影标尺。
该热图通过在抑制剂和/或另外的调节剂存在下在可激活元件的水平下指示变化或缺乏变化来定义不同的可激活元件的激活状态。因此，热图可定义当所述细胞与抑制剂或调节剂接触后细胞中是否存在多个可激活元件的激活水平的增加。热图右侧的标记表明检测到的可激活元件，例如磷蛋白。右侧标记也表明本行中使用的调节剂或抑制剂。“US”表明未刺激或未处理的。图28表明细胞中多个可激活元件的激活水平的模式。图28还表明了患者群集组(即群集组)的确定。患者群集组包含在响应一个或多个调节剂(例如抑制剂、或调节剂和另一调节剂)的一个或多个可激活元件中显示相似或不同模式的激活水平患者的样品。图28表明包含患者样品的群集组，其中p-PLCγ2、p-SyK/Zap-70、p-BLNK和p-Lck针对相同的刺激物具有相似的激活水平。显示了在调节或使用如框内所示的抑制剂后一些患者的群集组。使用H2O2显示：根据p-PLCγ2、p-SyK/Zap-70、p-BLNK和p-Lck水平定义的患者群集组(图28，右下框形区)与四例对照患者相似(图28，中下框内)。使用H2O2进一步显示与对照不同的患者群集组(图28，底部框形区左侧的9例患者)。使用H2O2的调节和BCR交联定义了另一患者群集组，包含显示与对照组(中上框)相似的p-BLNK、p-Syk和p-PLCγ2激活水平(图28，左上框形区)的患者样品。另外，使用H2O2的调节和BCR交联进一步显示了另一不同于对照(右上框形区的10例患者)的患者群集组。
因此，在此还提供了衍生分类的方法。衍生分类涉及定义群集组。群集组通过确定来自多个细胞的多个可激活元件的激活状态来定义，其中各细胞来自患有已知病症和/或已知临床结果的个体。群集组可定义与已知病症或已知临床结果相关的模式。任何合适的可激活元件可被使用，其中所述可激活元件的激活水平提供了关于患者的已知病症或临床结果的有用信息。来自具有未知病症和/或未知临床结果的患者的细胞可根据所识别的群集组进行分类。这可进一步得出诊断、预后和/或评价或选择患者的疗法。
试剂盒
在一些实施方式中，本发明提供了试剂盒。本发明所提供试剂盒可包含在此所述的一个或多个状态特异性结合元件，例如磷酸特异性抗体。在一些实施方式中，试剂盒包含一个或多个对选自下面的蛋白质有特异性的磷酸特异性抗体：PI3-激酶(p85、p110a、p110b、p110d)、Jak1、Jak2、SOCs、Rac、Rho、Cdc42、Ras-GAP、Vav、Tiam、Sos、Dbl、Nck、Gab、PRK、SHP1和SHP2、SHIP1、SHIP2、sSHIP、PTEN、Shc、Grb2、PDK1、SGK、Akt1、Akt2、Akt3、TSC1，2、Rheb、mTor、4EBP-1、p70S6激酶、S6、LKB-1、AMPK、PFK、乙酰辅酶A羧化酶、DokS、Rafs、Mos、Tpl2、MEK1/2、MLK3、TAK、DLK、MKK3/6、MEKK1，4、MLK3、ASK1、MKK4/7、SAPK/JNK1，2，3、p38s、Erk1/2、Syk、Btk、BLNK、LAT、ZAP70、Lck、Cbl、SLP-76、PLCγ1、PLCγ2、STAT1、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6、FAK、p130CAS、PAKs、LIMK1/2、Hsp90、Hsp70、Hsp27、SMADs、Rel-A(p65-NFκB)、CREB、组蛋白H2B、HATs、HDACs、PKR、Rb、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、P16、p 14Arf、p27KIP、p21CIP、Cdk4、Cdk6、Cdk7、Cdk1、Cdk2、Cdk9、Cdc25，A/B/C、Abl、E2F、FADD、TRADD、TRAF2、RIP、Myd88、BAD、Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、PARP、IAPs、Smac、胞衬蛋白、肌动蛋白、Src、Lyn、Fyn、Lck、NIK、IκB、p65(RelA)、IKKα、PKA、PKCα、PKCβ、PKCθ、PKCδ、CAMK、Elk、AFT、Myc、Egr-1、NFAT、ATF-2、Mdm2、p53、DNA-PK、Chk1、Chk2、ATM、ATR、β-连环蛋白、CrkL、GSK3α、GSK3β和FOXO。在一些实施方式中，试剂盒包含一个或多个对选自下面的蛋白质有特异性的磷酸特异性抗体：Erk、Syk、Zap70、Lck、Btk、BLNK、Cbl、PLCγ2、Akt、RelA、p38、S6。在一些实施方式中，试剂盒包含一个或多个对选自下面的蛋白质有特异性的磷酸特异性抗体：Akt1、Akt2、Akt3、SAPK/JNK1，2，3、p38s、Erk1/2、Syk、ZAP70、Btk、BLNK、Lck、PLCγ1、PLCγ2、STAT1、STAT 3、STAT 4、STAT 5、STAT 6、CREB、Lyn、p-S6、Cbl、NF-κB、GSK3、CARMA/Bcl10和Tcl-1。
本发明所提供试剂盒包含一个或多个在此所述的调节剂。在一些实施方式中，试剂盒包含一个或多个调节剂，选自F(ab)2IgM、H2O2、PMA、BAFF、April、SDF1a、CD40L、IGF-1、咪喹莫特、polyCpG、IL-7、IL-6、IL-10、IL-27、IL-4、IL-2、IL-3、毒胡萝卜素及其组合。
本发明的状态特异性结合元件可直接或间接地结合在固态支持物和可检测基团上。试剂也可包括辅助试剂，例如缓冲液试剂和例如多聚糖等的稳定剂。如果需要的话，试剂盒还可以包括信号产生系统的其它部件，在该系统中可检测基团为部件(例如酶底物)、试验中用于降低背景干扰的试剂、对照试剂、用于进行试验的装置等。试剂盒可以任何适合的方式进行包装，代表性的是将所有元件以及印有进行测试的说明书的纸张装入单个容器中。
这样的试剂盒通过使用灵敏的细胞测定方法(例如IHC和流式细胞术)来检测可激活元件，该细胞测定方法适用于临床检测、预后和从患有涉及途径信号改变的疾病的患者(例如白血病患者)中筛选细胞和组织。
这样的试剂盒可还包含一个或多个治疗剂。该试剂盒可进一步包含用于生理状态数据分析的软件包，其可包括用于与实验曲线进行对比的参考曲线。
这样试剂盒还可包括例如科学文献、软件插入材料、临床试验结果和/或其总结等的信息，这些信息指出或建立了组合物的活性和/或优点，和/或这些信息描述了剂量、给药、副反应、药物相互作用或对卫生保健供应者有用的其它信息。这样的试剂盒还可包括进入数据库的使用说明，例如在USSN 61/087,555中所述的用于选择对兴趣途径有特异性的抗体。这样的信息可基于不同研究的结果，例如，使用涉及体内模型的实验动物的研究和基于人类临床试验的研究。在此所述的试剂盒可被供应、出售和/或推广给卫生供应者，包括医生、护士、药剂师、处方官员等。在一些实施方式中，试剂盒可直接卖给消费者。
下面的实施例用于完整地描述使用上述发明的方式，同时阐明了实施本发明不同方面的最佳模式。可以理解，这些实施例不会局限本发明的实际范围，而仅用于说明性的目的。所有引用文献的全部内容在此通过引用的方式结合于本文中。
实施例
实施例1：CLL样品中的信号传导途径
通过B细胞受体(BCR)传导的信号指导B细胞的成熟和存活，可能参与慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的发病机理和进展。在这个实施例中，使用多参数的流式细胞术在单细胞水平研究CLL细胞中BCR信号传导。同时使用对B细胞表面抗原有特异性的荧光染料偶联抗体和在所选细胞内信号传导蛋白质组中特异性地识别磷酸肽抗原决定部位的一组抗体进行分析。当使用抗-μ交联仅刺激BCR时，来自患者(N＝6)的CLL样品显示p72SYK/p70ZAP、Erk1/2、B细胞连接蛋白(BLNK)和磷脂酶-Cγ-2、(PLCγ2)具有弱或最小的信号传导活性，而对照Ramos B细胞系呈现强的信号传导。CLL细胞中的低水平信号传导可由激活信号传导所需的关键蛋白质的缺陷或磷酸酶(例如SHIP-1、SHIP-2、SHP-1或SHP-2)介导的抑制增强来解释。为了确定磷酸酶是否阻止或减缓CLL样品中BCR的激活，使用过氧化氢(H2O2)处理CLL细胞，过氧化氢为产生于BCR信号传导中的生理磷酸酶的抑制剂，并且之前也被用于显示在滤泡性淋巴瘤中BCR信号传导的异常调节(Sing等人，(2005)Cell；Reth(2002)Nat.Immunol.；Irish等人，(2006)Blood)。在一些不依赖表面F(ab)2抗-μ连接的患者中，使用H2O2处理CLL细胞诱导了高水平的磷酸化的p72SYK/p70ZAP、ERK1/2、BLNK和PLCγ2。相反，即使在F(ab)2抗-μ的存在下，其它的CLL-B细胞对该处理的响应非常低。将健康供体的血液B细胞接触H2O2，不能引起这些相同的细胞内信号传导蛋白质磷酸化的实质性的增加。这些研究显示，在一些CLL细胞中，在表面IgM连接之后，之前未识别的、组成型高水平磷酸酶活性可能会导致这些细胞中信号传导的减弱。
CLL细胞中信号传导途径的分析
使用本领域已知的方法来维持和培养Ramos细胞。使用本领域已知的方法来获得来自CLL患者的细胞。
BCR交联和染色准备：在37℃水浴中解冻细胞直至部分解冻(～50％)。室温下将细胞融化在5％FBS/RPMI中。细胞悬浮液逐滴加入培养基中。在900RPM不间断地离心细胞10分钟。倾出上清液，将沉淀物重新悬浮在25毫升(ml)的培养基中。在900RPM再次离心细胞10分钟，再次倾出上清液，并重新悬浮在5ml的1％FBS/RPMI中。使用台盼蓝染色通过血细胞计数器对细胞进行计数。按需调节细胞浓度以降低拥挤现象。然后将细胞在37℃培育2小时。包括添加剂和试剂(例如刺激物、Fab片段、H2O2、水等)的最终的细胞浓度为1.6百万/ml。细胞被分量加入孔穴中。F(ab)2IgM单独、3.3mM H2O2单独或F(ab)2IgM和H2O2(H2O2在加入F(ab)2IgM 30秒内加入)被加入适当的试管中，通过涡动搅拌混合样品。除非需进行时间过程实验，细胞与不同处理物一起孵化15分钟。如果进行时间过程实验，细胞与不同的处理物一起培育5、10、30、60或120分钟。培育后，在室温下在黑暗中使用1.6％多聚甲醛固定细胞5分钟。然后用0.1％BSA/PBS(2ml)清洗细胞，在2000RPM下离心细胞5分钟。倾出上清液，将沉淀物重新悬浮在1ml的100％MeOH(甲醇)中。
染色：使用2ml 0.4％BSA PBS(冰冷)清洗试管，在2000RPM，4℃离心10分钟。清洗细胞两次。然后使用荧光偶联的对CD20、CD3、CD4、CD8、CD5、p-Erk、p-BLNK、p-syk/Zap70特异性的抗体在室温下染色细胞25分钟。细胞被置于80个孔穴中，共2板。用于染色的鸡尾酒混合物如下所述：
a.鸡尾酒
(i)CD3 pac blue＝160μl
(ii)CD4 APC＝80μl
(iii)CD 8PE Cy7＝80μl
(iv)CD5 PE Cy5＝400μl
(v)CD20 PerCP Cy5.5＝800μl
(vi)p-Erk＝800μl
(vii)p-BLNK＝800μl
(viii)p-Syk/ZAP70＝800μl
b.鸡尾酒混合物中总抗体体积为3920μl。加入PBS至总体积为8.0ml。各孔中装有100μl该鸡尾酒混合物。
流式细胞术分析：在BD LSR II流式细胞仪中收集各样品中10,000至100,000件的非门控事件。针对细胞外标记(即CD3、CD4、CD8、CD5和CD20)的荧光抗体被用于标记细胞，并使用分级门控策略在如下所述记录的事件中确定B细胞和成熟B细胞群：
a.向前和侧面的散射首先被用于淋巴细胞(淋巴)群的门控(gate)。
b.然后该“淋巴”群显示在CD20和CD3轴上以门控高CD3表达细胞(CD3+)和高CD20表达细胞(CD20+)。
c.该“CD20+”群进一步进行门控，通过将它们显示在CD20和CD5轴上以识别成熟B细胞(高CD5表达细胞-CD5+)群。
d.所有的记录事件还使用以下细胞内标记进行标记：p-Erk、p-Syk/Zap70和p-BLNK。
在CD20+和CD5+细胞中各细胞内标记的荧光强度值的log10概率密度估计使用R-Statistics软件包(http://www.r-project.org/)中的kernel密度估计方程来计算。然后将提供的概率密度估计进行作图以可视化基于基线的不同标记的磷酸化水平的变化。
结果：图1表明F(ab)2IgM和PMA都可在Ramos细胞中激活p-Erk和p-Syk/pZap70。直方图的大阴影线表示非激活且未染色的细胞的荧光水平，下文被称为自发荧光。粗实线代表非激活染色的细胞的荧光水平，以下被称为背景。在使用PMA(虚线)和F(ab)2IgM(细实线)激活后，p-Erk和p-Syk荧光高于自发荧光和背景信号，说明这些蛋白质在刺激后被激活。图2显示F(ab)2IgM(虚线)也激活了Ramos细胞中的pBLNK、pCbl、pPLCγ2、pLck、p38。在所有实验中，Ramos细胞(Ramos细胞系)被用作阳性对照。
分析了来自CLL患者的细胞。图3显示PMA(细实线)激活了提取的CLL样品中的Erk。然而，F(ab)2IgM的量增加15分钟后，最小程度地激活了CLL样品中的信号传导(图4)。
CLL样品被分成具有低和高频率ZAP70的群。Zap70可用于CLL的预后指标。然而，含ZAP70的CLL样品的临床意义还不清楚。CLL样品显示当使用PMA激活时的适度p-Erk(y轴)和p-Syk(x轴)磷酸化(图5)。当使用F(ab)2IgM激活时，这些细胞显示弱的激活，如图5所示。
使用H2O2处理或与F(ab)2IgM一起处理CLL样品。H2O2为已知的磷酸酶抑制剂。抑制磷酸酶会激活Erk和Syk，如图6所示。不希望局限于任何理论，磷酸酶的抑制揭示了强的BCR非诱导性信号传导。非诱导性信号传导在F(ab)2IgM单独作用下不明显(图4-5)。F(ab)2IgM和H2O2显示在CLL患者中具有不同的动力学亚群(异源性)差异(图6)。相反，在正常B细胞中，H2O2阻断磷酸酶，但是自身不能激活后BCR(图7).不希望局限于任何理论，这些结果表明这些CLL细胞在临近BCR的信号传导中具有变化。在CLL中，H2O2揭示潜在的信号传导事件，可能是可推动信号传导事件向BCR下游的非诱导性信号传导(例如Syk和Erk)，如图8所示。
当分别使用被PMA和F(ab)2IgM激活时，其它CLL样品显示出中等和弱的Erk和Syk磷酸化(图9)。当H2O2作用于这些CLL样品时，磷酸酶的抑制不显示强的BCR非诱导性信号传导(图10)。使用F(ab)2IgM和H2O2处理后显示：(i)不同的动力学(ii)亚群异源性和(iii)CLL患者中的差异，如图10所示。
CLL标本中信号传导的动力学
细胞的制备和染色如上所述。
图12表示使用F(ab)2IgM和H2O2后Syk和Erk磷酸化的不同的动力学。Syk和BLNK磷酸化的峰值出现在激活后5分钟，然而Erk磷酸化的峰值出现在激活后30分钟。
图13表示使用F(ab)2IgM和H2O2后Syk/Zap70和Erk中等的激活。图14表示使用F(ab)2IgM和H2O2后的信号传导动力学。图21表示F(ab)2IgM单独超时使用时Syk/Zap70和Erk的最小激活。图22表示响应F(ab)2IgM单独超时作用的Syk/Zap70和Erk的最小激活。图23表示不使用H2O2时CD20+/CD5+群的F(ab)2时间过程。
图15和16表示在具有不同的ZAP70水平的细胞中响应外界刺激的BLNK磷酸化的不同水平。
图17-21表示有或没有过氧化物时CLL样品中CD20+/CD5+群中响应B细胞受体交联的PLCγ2、S6和Cbl的磷酸化动力学。图24表示CLL样品CD20+/CD5+群中使用H2O2处理的动力学。图25表示CLL样品CD20+/CD5+群中使用H2O2处理的动力学。这些结果表明单独使用F(ab)2IgM可调节rpS6的磷酸化增加，这与之前评价的信号传导分子相反。单独使用H2O2或与F(ab)2IgM联合使用减弱了这种磷酸化。响应于单独施用H2O2或与F(ab)2IgM联合使用，PLCγ2磷酸化增强了。Cbl对所有的处理响应最小。不希望局限于任何理论，这些结果表明一条单独的途径源自调节prpS6的BCR，它与调节Erk、Syk/Zap、BLNK和PLCγ2并具有负反馈环的途径是不同的。
总而言之，这些结果表明：对于CLL患者样品而言，PMA的p-Erk激活在无论是否表达ZAP70的所有患者有可比性，并且单独使用F(ab)2IgM不激活信号传导。在六例样本中的两例中，观察到具有不同信号传导谱的两个细胞亚群。最后，Syk/ZAP70、BLNK和Erk的激活的动力学是不同的。
实施例2：CLL患者显示可辨别的模式
原始细胞的分离、储存、解冻和平衡。使用密度梯度分离(Ficoll-Paque Plus；Amersham Biosciences)分离PBMC。在一些实施方式中，使用低转速离心将PBMC沉淀，重悬浮在90％FCS(HyClone)+10％DMSO(Sigma-Aldrich)的培养基中，在液氮气相中缓慢冷冻在多个冷冻管中，并储存在液氮中。用于冷冻样品的信号传导分析，单个冷冻管在5ml RMPI+1％血清中解冻、计数、沉淀，并重悬浮为3.3×106细胞/ml。解冻的PBMC在刺激前在CO2保温箱中37℃下静置2小时。
调节
在刺激前至少半小时，300μl含有1×106PBMC的培养基被分置于流式细胞管中(Falcon 2052；BD Biosciences)，并在37℃下静置于CO2保温箱中。使用羊单克隆抗IgM和抗IgG F(ab′)2(BioSourceInternational)实现B细胞受体的交联。使用时，H2O2的终浓度为3.3mM，在BCR交联后迅速加入2μl的500-mM储备液。在信号传导时，细胞保存在37℃的CO2恒温箱中，进行信号传导和磷酸化。信号传导在10分钟后通过固定细胞而被停止。为了确定磷酸化的基础水平，未刺激的细胞和刺激的细胞平行使用，并在零时间固定。为了固定，多聚甲醛(Electron Microscopy Services)被加入各试管中至细胞终浓度为1.4％。细胞在室温下固定5分钟，沉淀，在2ml甲醇中透化10分钟，并储存在4℃直至染色用于流式细胞术。
流式细胞术
通过加入2ml的PBS再水化多聚甲醛固定的、甲醇透化的细胞，小心地重新悬浮细胞，然后离心。清洗细胞，染色同实施例I，除了还使用磷酸特异性alexa(Ax)染料Ax488和Ax647(分子探针)或R-PE-耦合Abs。染色鸡尾酒包含特异于p-ERK1/2(T202/Y204)和p-Syk(Y352)/Zap70(Y319)、p-Lck/p-Lyn、p-BLNK、p-PLCγ2(PLCr2)或p-S6的荧光偶合抗体。细胞亚群的检测、选择和门控参见实施例1的描述。使用MeV(MultiExperiment Viewer)软件生成热图(图26、27和28)。
结果
图26、27和28中的数据显示：如热图所示，来自不同CLL患者的B细胞表现出可激活元件的可辨别的模式。磷酸化的调节剂进一步限定了可激活元件的其它模式，使得能够识别、分类和分组隐藏的或异常的造血细胞群。在图26、27和28中，患者样品标于热图的上部。各个柱形代表一个患者。CLL表明样品来自诊断为CLL的患者。CON表明样品来自对照患者。热图的图例标于图的上部，并基于log 10-倍增加或降低，使用相对于未刺激的对照(0分钟)的平均荧光强度(MFI)的阴影标尺。直方图右侧的标记表明本行中为磷蛋白染色和调节剂处理的。“US”表明样品未刺激。图28表明包含相似或不同p-PLCγ2、p-SyK/Zap-70、p-BLNK和p-Lck水平的几个患者群集组的识别。如框内区域所示，一些患者群集是明显的。
在图28中，使用H2O2的处理显示患者群集，该患者群集由与四例对照患者(底部中间框)相似的p-PLCγ2、p-SyK/Zap-70、p-BLNK和p-Lck(底部右框区域)水平所定义。使用H2O2的处理进一步显示了与对照不同(底部框区域左侧的9例患者)的患者群集。使用H2O2的调节和BCR交联定义了包含与对照患者(中上框)相似的p-BLNK，p-Syk和p-PLCγ2水平(左上框区域)的另外一患者群集，以及异常响应者群(上部框区域右侧的10例患者)。
实施例3：CLL患者样品中细胞凋亡途径的评估
目前CLL治疗方法包括与单克隆抗体(例如利妥昔单抗)联合使用的基于氟达拉滨的用药法。氟达拉滨为嘌呤类似物，其通过干扰核苷酸还原酶和DNA聚合酶来抑制DNA合成。利妥昔单抗为嵌合CD20特异性抗体，并且在机制上显示与补体结合，诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，在一些情况下，结合CD20的利妥昔单抗抑制增殖并诱导细胞凋亡(细胞凋亡的讨论参见USSN 61/085,789)。
响应治疗剂(包括但不局限于例如氟达拉滨的DNA损伤剂或例如利妥昔单抗的生物试剂)的细胞凋亡可通过多参数流式细胞术使用识别细胞内蛋白组分或细胞凋亡机制结点的荧光团偶联抗体进行测量。这样的结点包括但不局限于半胱天冬酶3、半胱天冬酶8、细胞色素C、多聚ADP核糖聚合酶(PARP)、Bcl-2、Bcl-X、p-Chk2、p-BAD。进一步的信息可通过使用pan-半胱天冬酶抑制剂苄氧羰基-Val-Ala-Asp(OMe)荧光甲基丙酮(Z-VAD.FMK)处理细胞得到，以显示半胱天冬酶依赖性和/或非依赖性途径。描述细胞凋亡蛋白如何响应治疗剂的曲线可用于指导临床决定。
用于测量施用氟达拉滨和利妥昔单抗的样品对细胞凋亡的响应的实验步骤。
细胞在37℃水浴中解冻直到部分解冻(50％)，然后室温下加到RPMI/1％FBS中。在900RPM不间断地离心细胞10分钟，倾出上清液，将沉淀物重悬浮在25毫升的培养基中。重复该步骤。使用台盼蓝染色用血细胞计数器对细胞的等分试样进行计数。细胞在理想的浓度被重悬浮于RPMI/1％或10％/FBS中。在37℃培育2小时后，细胞被等分为96孔板的每孔中1×106个细胞的浓度。存在或不存在ZVAD的情况下，细胞与氟达拉滨(浓度0-50μM)、利妥昔单抗(浓度0-500μM)和/或十字孢碱单独或联合培育不同的时间。与药物培育后，细胞被染色处理，使用荧光染料偶合的包含CD3、CD5、CD19、CD20、CD3、CD5、CD19、CD20(细胞外标记)抗体以及荧光染料偶合的如上所述细胞凋亡结点/标记的抗体的鸡尾酒。使用流式细胞术分析细胞。细胞处理和流式细胞术分析的详细描述参见USSN61/085,789。
尽管已经显示和描述了本发明优化的实施方式，对于本领域技术人员知道，该实施方式仅是通过示例性的方式提供的。本领域技术人员理解，在不背离本发明的前提下可以进行各种修改、变化和替换。可以理解的是，可以使用不同的替换方式来实施在此描述的本发明实施方式。以下权利要求限定了本发明的范围，在这些权利要求范围内的方法和结构以及它们的等同物也包含在此。

Claims (50)

1.一种分类细胞的方法，包括：
将所述细胞与抑制剂相接触，
确定所述细胞中是否存在可激活元件的激活水平的变化，和
基于是否存在所述可激活元件的激活水平的所述变化来对所述细胞进行分类。
2.根据权利要求1所述的方法，其中可激活元件的激活水平的所述变化为可激活元件的激活水平的增加。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞为癌细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中是否存在所述可激活元件的激活水平的所述变化是通过与所述抑制剂接触的正常细胞相比较确定的。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞为造血源性细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在所述确定步骤中确定是否存在多个可激活元件的激活水平的变化。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述分类包括将所述细胞分类为与临床结果相关的细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述临床结果为是否存在瘤形成和/或造血病症。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述瘤形成和/或造血病症为选自慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞淋巴瘤、B淋巴细胞系白血病、B淋巴细胞系淋巴瘤、多发性骨髓瘤、B细胞幼淋巴细胞性白血病、前体B淋巴母细胞性白血病、毛细胞性白血病和浆细胞异常的B细胞或B细胞系源性异常。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述临床结果为瘤形成的和/或造血病症的分期或分级。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述分类还包括确定治疗方法。
12.根据权利要求1所述的方法，其中还包括将调节剂施用于所述细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述调节剂为B细胞受体调节剂。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述抑制剂为激酶或磷酸酶抑制剂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述激酶或磷酸酶抑制剂选自adaphostin、AG 490、AG 825、AG 957、AG 1024、aloisine A、alsterpaullone、aminogenistein、API-2、芹菜素、牛蒡子素、AY-22989、BAY 61-3606、双吲哚马来酰亚胺IX、白屈菜红碱、盐酸10-[4′-(N，N-二乙氨基)丁基]-2-氯代吩噁嗪、达沙替尼、2-二甲氨基-4，5，6，7-四溴代-1H-苯并咪唑、二盐酸5，7-二甲氧基-3-(4-吡啶基)喹啉、依地福新、鞣花酸、enzastaurin、ER 27319马来酸盐、埃罗替尼、ET18OCH3、法舒地尔、flavopiridol、吉非替尼、GW 5074、H-7、H-8、H-89、HA-100、HA-1004、HA-1077、HA-1100、羟基法舒地尔、靛红-3’-肟、5-碘代杀结核菌素、kenpaullone、KN-62、KY12420、LFM-A13、薰草菌素A、木犀草素、LY-294002、LY294002、楸毒素、ML-9、NSC-154020、NSC-226080、NSC-231634、NSC-664704、NSC-680410、NU6102、奥罗莫星、羟吲哚I、PD-153035、PD-98059、PD 169316、根皮素、根皮苷、云鞣杉醇、鬼臼苦素、PKI、PP1、PP2、purvalanolA、槲皮素、R406、R788、雷帕鸣、雷帕霉素、Ro 31-8220、roscovitine、粗糠柴毒、SB202190、SB203580、西罗莫司、索拉非尼、SL327、SP600125、十字孢碱、STI-571、SU-11274、SU1498、SU4312、SU6656、4，5，6，7-四溴代三唑、TG101348、曲西立滨、Tyrphostin AG 490、Tyrphostin AG 825、Tyrphostin AG 957、Tyrphostin AG  1024、Tyrphostin SU1498、U0126、VX-509、VX-667、VX-680、W-7、沃特曼宁、XL-019、XL-147、XL-184、XL-228、XL-281、XL-518、XL-647、XL-765、XL-820、XL-844、XL-880、Y-27632、ZD-1839、ZM-252868、ZM-447439、H2O2、siRNA、miRNA、斑蝥素、(-)-对溴四咪唑、微囊藻素LR、原钒酸钠、过钒酸钠、硫酸氧钒、氧代二过氧(1，10-菲咯啉)钒酸钠、联麦芽酚氧钒(IV)、钼酸钠、过钼酸钠、酒石酸钠、咪唑、氟化钠、β-甘油磷酸酯、十水焦磷酸盐钠、花萼海绵诱癌素A、Discodermia calyx、bpV(phen)、mpV(pic)、DMHV、氯氰菊酯、Dephostatin、冈田酸、NIPP-1、N-(9，10-二氧代-9，10-二氢-菲-2-基)-2，2-二甲基-丙酰氨、α-溴代-4-羟基苯乙酮、4-羟基苯甲酰甲基溴、α-溴代-4-甲氧基苯乙酮、4-甲氧基苯甲酰甲基溴、α-溴代-4-(羧基甲氧基)苯乙酮、4-(羧基甲氧基)苯甲酰甲基溴和双(4-三氟甲基磺酰氨基苯基)-1，4-二异丙基苯、氧化苯砷、吡咯烷二硫代氨基甲酸和氟化铝。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述激活水平选自细胞外或细胞内蛋白酶产生的裂解、新型杂低聚物生成、糖基化水平、磷酸化水平、乙酰化水平、甲基化水平、生物素化水平、谷氨酰化水平、甘氨酰化水平、羟基化水平、异构化水平、异戊烯化水平、豆蔻酰化水平、脂化水平、磷酸泛酰巯基乙胺化水平、硫酸化水平、ISG化水平、亚硝基化水平、棕榈酰化水平、SUMO化水平、遍在蛋白化水平、类泛素化水平、瓜氨酸化水平、脱酰胺化水平、二硫键形成水平、蛋白水解水平、异位水平、蛋白质转化的变化、多蛋白复合体水平、氧化水平、多脂复合体和细胞膜的生物化学改变。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述可激活元件为可被磷酸化或脱磷酸化的蛋白质。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述蛋白质选自PI3-激酶(p85、p110a、p110b、p 110d)、Jak1、Jak2、SOCs、Rac、Rho、Cdc42、Ras-GAP、Vav、Tiam、Sos、Dbl、Nck、Gab、PRK、SHP1、和SHP2、SHIP1、SHIP2、sSHIP、PTEN、Shc、Grb2、PDK1、SGK、Akt1、Akt2、Akt3、TSC1，2、Rheb、mTor、4EBP-1、p70S6激酶、S6、LKB-1、AMPK、PFK、乙酰辅酶A羧化酶、DokS、Rafs、Mos、Tpl2、MEK1/2、MLK3、TAK、DLK、MKK3/6、MEKK1，4、MLK3、ASK1、MKK4/7、SAPK/JNK1，2，3、p38s、Erk1/2、Syk、Btk、BLNK、LAT、ZAP70、Lck、Cbl、SLP-76、PLCγ1、PLCγ2、STAT1、STAT3、STAT 4、STAT 5、STAT 6、FAK、p 130CAS、PAKs、LIMK1/2、Hsp90、Hsp70、Hsp27、SMADs、Rel-A(p65-NFκB)、CREB、组蛋白H2B、HATs、HDACs、PKR、Rb、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、P16、p 14Arf、p27KIP、p21CIP、Cdk4、Cdk6、Cdk7、Cdk1、Cdk2、Cdk9、Cdc25，A/B/C、Abl、E2F、FADD、TRADD、TRAF2、RIP、Myd88、BAD、Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、PARP、IAPs、Smac、胞衬蛋白、肌动蛋白、Src、Lyn、Fyn、Lck、NIK、IκB、p65(RelA)、IKKα、PKA、PKCα、PKCβ、PKCθ、PKCδ、CAMK、Elk、AFT、Myc、Egr-1、NFAT、ATF-2、Mdm2、p53、DNA-PK、Chk1、Chk2、ATM、ATR、β-连环蛋白、CrkL、GSK3α、GSK3β和FOXO。
19.一种用于确定个体中是否存在病症的方法，包括
将抑制剂施用于所述个体的细胞，
确定所述细胞中可激活元件的激活水平，和
基于所述可激活水平来确定是否存在所述病症。
20.根据权利要求19所述的方法，包括将调节剂施用于所述个体的细胞。
21.根据权利要求19所述的方法，其中在所述确定步骤中确定多个可激活元件的激活水平。
22.根据权利要求21所述的方法，包括在所述细胞中识别所述多个可激活元件的所述激活水平的模式，其中所述模式与疾病或病症相关。
23.根据权利要求19所述的方法，其中所述病症为瘤形成和/或造血病症。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述瘤形成和/或造血病症为选自慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞淋巴瘤、B淋巴细胞系白血病、B淋巴细胞系淋巴瘤、多发性骨髓瘤、B细胞幼淋巴细胞性白血病、前体B淋巴母细胞性白血病、毛细胞性白血病和浆细胞异常的B细胞或B细胞系源性异常。
25.根据权利要求20所述的方法，其中所述调节剂为激活剂或抑制剂。
26.根据权利要求20所述的方法，其中所述调节剂为B细胞受体复合物的或B细胞辅助受体复合物的B细胞受体激活剂。
27.根据权利要求20所述的方法，其中所述激酶或磷酸酶抑制剂选自adaphostin、AG 490、AG 825、AG 957、AG 1024、aloisine、aloisine A、alsterpaullone、aminogenistein、API-2、芹菜素、牛蒡子素、AY-22989、BAY 61-3606、双吲哚马来酰亚胺IX、白屈菜红碱、盐酸10-[4′-(N，N-二乙氨基)丁基]-2-氯代吩噁嗪、达沙替尼、2-二甲氨基-4，5，6，7-四溴代-1H-苯并咪唑、二盐酸5，7-二甲氧基-3-(4-吡啶基)喹啉、依地福新、鞣花酸、enzastaurin、ER 27319马来酸盐、埃罗替尼、ET18OCH3、法舒地尔、flavopiridol、吉非替尼、GW 5074、H-7、H-8、H-89、HA-100、HA-1004、HA-1077、HA-1100、羟基法舒地尔、靛红-3’-肟、5-碘代杀结核菌素、kenpaullone、KN-62、KY12420、LFM-A13、薰草菌素A、木犀草素、LY-294002、LY294002、楸毒素、ML-9、NSC-154020、NSC-226080、NSC-231634、NSC-664704、NSC-680410、NU6102、奥罗莫星、羟吲哚I、PD-153035、PD-98059、PD 169316、根皮素、根皮苷、云鞣杉醇、鬼臼苦素、PKI、PP1、PP2、purvalanol A、槲皮素、R406、R788、雷帕鸣、雷帕霉素、Ro 31-8220、roscovitine、粗糠柴毒、SB202190、SB203580、西罗莫司、索拉非尼、SL327、SP600125、十字孢碱、STI-571、SU-11274、SU1498、SU4312、SU6656、4，5，6，7-四溴代三唑、TG101348、曲西立滨、Tyrphostin AG 490、Tyrphostin AG 825、Tyrphostin AG 957、Tyrphostin AG 1024、Tyrphostin SU1498、U0126、VX-509、VX-667、VX-680、W-7、沃特曼宁、XL-019、XL-147、XL-184、XL-228、XL-281、XL-518、XL-647、XL-765、XL-820、XL-844、XL-880、Y-27632、ZD-1839、ZM-252868、ZM-447439、H2O2、siRNA、miRNA、斑蝥素、(-)-对溴四咪唑、微囊藻素LR、原钒酸钠、过钒酸钠、硫酸氧钒、氧代二过氧(1，10-菲咯啉)钒酸钠、联麦芽酚氧钒(IV)、钼酸钠、过钼酸钠、酒石酸钠、咪唑、氟化钠、β-甘油磷酸酯、十水焦磷酸盐钠、花萼海绵诱癌素A、Discodermia calyx、bpV(phen)、mpV(pic)、DMHV、氯氰菊酯、Dephostatin、冈田酸、NIPP-1、N-(9，10-二氧代-9，10-二氢-菲-2-基)-2，2-二甲基-丙酰氨、α-溴代-4-羟基苯乙酮、4-羟基苯甲酰甲基溴、α-溴代-4-甲氧基苯乙酮、4-甲氧基苯甲酰甲基溴、α-溴代-4-(羧基甲氧基)苯乙酮、4-(羧基甲氧基)苯甲酰甲基溴、和双(4-三氟甲基磺酰氨基苯基)-1，4-二异丙基苯、氧化苯砷、吡咯烷二硫代氨基甲酸和氟化铝。
28.根据权利要求19所述的方法，其中所述可激活元件为可被磷酸化或脱磷酸化的蛋白质。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述蛋白质选自PI3-激酶(p85、p110a、p110b、p110d)、Jak1、Jak2、SOCs、Rac、Rho、Cdc42、Ras-GAP、Vav、Tiam、Sos、Dbl、Nck、Gab、PRK、SHP1、和SHP2、SHIP1、SHIP2、sSHIP、PTEN、Shc、Grb2、PDK1、SGK、Akt1、Akt2、Akt3、TSC1，2、Rheb、mTor、4EBP-1、p70S6激酶、S6、LKB-1、AMPK、PFK、乙酰辅酶A羧化酶、DokS、Rafs、Mos、Tpl2、MEK1/2、MLK3、TAK、DLK、MKK3/6、MEKK1，4、MLK3、ASK1、MKK4/7、SAPK/JNK1，2，3、p38s、Erk1/2、Syk、Btk、BLNK、LAT、ZAP70、Lck、Cbl、SLP-76、PLCγ1、PLCγ2、STAT1、STAT3、STAT 4、STAT 5、STAT 6、FAK、p130CAS、PAKs、LIMK1/2、Hsp90、Hsp70、Hsp27、SMADs、Rel-A(p65-NFκB)、CREB、组蛋白H2B、HATs、HDACs、PKR、Rb、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、P 16、p 14Arf、p27KIP、p21CIP、Cdk4、Cdk6、Cdk7、Cdk1、Cdk2、Cdk9、Cdc25，A/B/C、Abl、E2F、FADD、TRADD、TRAF2、RIP、Myd88、BAD、Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、PARP、IAPs、Smac、胞衬蛋白、肌动蛋白、Src、Lyn、Fyn、Lck、NIK、IκB、p65(RelA)、IKKα、PKA、PKCα、PKCβ、PKCθ、PKCδ、CAMK、Elk、AFT、Myc、Egr-1、NFAT、ATF-2、Mdm2、p53、DNA-PK、Chk1、Chk2、ATM、ATR、β-连环蛋白、CrkL、GSK3α、GSK3β和FOXO。
30.一种用于确定细胞的非诱导性信号传导状态的方法，包括将调节剂施用于所述细胞，
确定在所述细胞内参与非诱导性信号传导途径的可激活元件的激活水平，和
基于所述激活水平来确定所述细胞中非诱导性信号传导途径的状态。
31.权利要求30所述的方法，还包括确定个体的病症。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述病症为瘤形成和/或造血病症。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述瘤形成和/或造血病症为B细胞或B细胞系源性异常。
34.权利要求31所述的方法，还包括确定临床结果，其中所述临床结果为瘤形成的和/或造血病症的分期或分级。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述分期选自侵袭性、无痛、良性、顽固性、罗马数字分期、TNM分期、Rai分期、Binet分期、WHO分类、FAB分类、IPSS评分、WPSS评分、局限期、扩散期、根据例如ZAP70和CD38的细胞标记的分期、隐性，其包括能够及时传达恶化、无恶化存活率、整体存活率和无意外存活率的信息。
36.权利要求30所述的方法，还包括将所述可激活元件的激活水平与个体对治疗的响应相关联。
37.根据权利要求30所述的方法，其中所述调节剂为激酶或磷酸酶抑制剂。
38.根据权利要求30所述的方法，其中所述激活水平为磷酸化水平。
39.一种基于个体的临床结果关联和/或分类CLL细胞的激活状态的方法，包括：
将调节剂施用于所述个体的所述CLL细胞，其中所述CLL细胞包含B细胞受体(BCR)，
确定多个可激活元件的激活水平，和
识别所述多个可激活元件的所述激活水平的模式以确定临近BCR的信号传导是否存在改变，其中存在所述改变为临床结果的指征。
40.一种确定细胞群的表型谱的方法，包括
在不同培养基中将多种调节剂施用于细胞群，其中至少一种调节剂为抑制剂，
确定来自各所述不同培养基的所述细胞群中是否存在可激活元件的激活水平的变化，和
基于在各所述不同培养基中是否存在所述可激活元件激活的变化来对所述细胞群进行分类。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述抑制剂为在所述细胞中参与信号级联放大的细胞因子或多个因子的抑制剂。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述抑制剂为激酶或磷酸酶抑制剂。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述激酶或磷酸酶抑制剂选自adaphostin、AG 490、AG 825、AG 957、AG 1024、aloisine A、alsterpaullone、aminogenistein、API-2、芹菜素、牛蒡子素、AY-22989、BAY 61-3606、双吲哚马来酰亚胺IX、白屈菜红碱、盐酸10-[4′-(N，N-二乙氨基)丁基]-2-氯代吩噁嗪、达沙替尼、2-二甲氨基-4，5，6，7-四溴代-1H-苯并咪唑、二盐酸5，7-二甲氧基-3-(4-吡啶基)喹啉、依地福新、鞣花酸、enzastaurin、ER 27319马来酸盐、埃罗替尼、ET18OCH3、法舒地尔、flavopiridol、吉非替尼、GW 5074、H-7、H-8、H-89、HA-100、HA-1004、HA-1077、HA-1100、羟基法舒地尔、靛红-3’-肟、5-碘代杀结核菌素、kenpaullone、KN-62、KY12420、LFM-A13、薰草菌素A、木犀草素、LY-294002、LY294002、楸毒素、ML-9、NSC-154020、NSC-226080、NSC-231634、NSC-664704、NSC-680410、NU6102、奥罗莫星、羟吲哚I、PD-153035、PD-98059、PD 169316、根皮素、根皮苷、云鞣杉醇、鬼臼苦素、PKI、PP1、PP2、purvalanolA、槲皮素、R406、R788、雷帕鸣、雷帕霉素、Ro 31-8220、roscovitine、粗糠柴毒、SB202190、SB203580、西罗莫司、索拉非尼、SL327、SP600125、十字孢碱、STI-571、SU-11274、SU1498、SU4312、SU6656、4，5，6，7-四溴代三唑、TG101348、曲西立滨、Tyrphostin AG 490、Tyrphostin AG 825、Tyrphostin AG 957、Tyrphostin AG 1024、Tyrphostin SU1498、U0126、VX-509、VX-667、VX-680、W-7、沃特曼宁、XL-019、XL-147、XL-184、XL-228、XL-281、XL-518、XL-647、XL-765、XL-820、XL-844、XL-880、Y-27632、ZD-1839、ZM-252868、ZM-447439、H2O2、siRNA、miRNA、斑蝥素、(-)-对溴四咪唑、微囊藻素LR、原钒酸钠、过钒酸钠、硫酸氧钒、氧代二过氧(1，10-菲咯啉)钒酸钠、联麦芽酚氧钒(IV)、钼酸钠、过钼酸钠、酒石酸钠、咪唑、氟化钠、β-甘油磷酸酯、十水焦磷酸盐钠、花萼海绵诱癌素A、Discodermia calyx、bpV(phen)、mpV(pic)、DMHV、氯氰菊酯、Dephostatin、冈田酸、NIPP-1、N-(9，10-二氧代-9，10-二氢-菲-2-基)-2，2-二甲基-丙酰氨、α-溴代-4-羟基苯乙酮、4-羟基苯甲酰甲基溴、α-溴代-4-甲氧基苯乙酮、4-甲氧基苯甲酰甲基溴、α-溴代-4-(羧基甲氧基)苯乙酮、4-(羧基甲氧基)苯甲酰甲基溴、和双(4-三氟甲基磺酰氨基苯基)-1，4-二异丙基苯、氧化苯砷、吡咯烷二硫代氨基甲酸和氟化铝。
44.根据权利要求40所述的方法，其中所述调节剂为激活剂或抑制剂。
45.根据权利要求40所述的方法，其中所述可激活元件为可被磷酸化或脱磷酸化的蛋白质。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述蛋白质选自Akt1、Akt2、Akt3、SAPK/JNK1，2，3、p38s、Erk 1/2、Syk、ZAP70、Btk、BLNK，Lck、PLCγ1、PLCγ2、STAT1、STAT3、STAT4、STAT5、STAT 6、CREB、Lyn、p-S6、Cbl、NF-κB、GSK3β、CARMA/Bcl10和Tcl-1。
47.一种分类细胞群的方法，包括
将所述细胞群与至少一种调节剂相接触，其中所述调节剂为F(ab)2IgM、B细胞单克隆抗体、阿仑单抗、抗CD22(依帕珠单抗)、抗CD23(鲁昔单抗)、坎帕斯、H2O2、PMA、BAFF、April、SDF1a、CD40L、IGF-1、咪喹莫特、polyCpG、氟达拉滨、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、IL-7、IL-6、IL-10、IL-27、IL-4、IL-2、IL-3、毒胡萝卜素或其组合，
确定在所述细胞群中是否存在可激活元件的激活水平的变化，和
基于是否存在所述可激活元件的激活的变化来对所述细胞群进行分类。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述可激活元件为选自Akt1、Akt2、Akt3、SAPK/JNK1，2，3、p38s、Erk1/2、Syk、ZAP70、Btk、BLNK，Lck、PLCγ1、PLCγ2、STAT1、STAT 3、STAT 4、STAT5、STAT 6、CREB、Lyn、p-S6、Cbl、NF-κB、GSK3β、CARMA/Bcl10和Tcl-1的蛋白质。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述分类包括将所述细胞群划分为与临床结果相关的细胞群。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述临床结果为是否存在选自慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞淋巴瘤、B淋巴细胞系白血病、B淋巴细胞系淋巴瘤、多发性骨髓瘤、B细胞幼淋巴细胞性白血病、前体B淋巴母细胞性白血病、毛细胞性白血病和浆细胞异常的B细胞或B细胞系源性异常。
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