CN101821277B

CN101821277B - 四氢吡喃核酸类似物

Info

Publication number: CN101821277B
Application number: CN200880111600.8A
Authority: CN
Inventors: 查尔斯·艾勒森; 巴尔克利申·巴特; 撒扎·P·普拉卡什; 埃里克·E·斯威兹; 安德鲁·M·西科夫斯基; 普内特·P·塞思
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2007-08-15
Filing date: 2008-08-15
Publication date: 2014-05-07
Anticipated expiration: 2028-08-15
Also published as: CA2696497A1; KR20100071988A; JP2010536792A; CA2696497C; US8088904B2; EP2188298A2; KR101654007B1; EP2188298B1; WO2009023855A2; US20090092981A1; US20140315979A1; WO2009023855A3; US20120071645A1; CN101821277A; HK1142909A1; AU2008286771A1; US8796437B2; US9005906B2; ES2439591T3; AU2008286771B2

Abstract

本发明描述了四氢吡喃核苷类似物、由其制备的寡聚化合物以及使用该寡聚化合物的方法。更具体地，提供了具有一个或多个手性取代基的四氢吡喃核苷类似物，其可用于增强寡聚化合物的特性，包括核酸酶耐性和结合亲和力。在一些实施方案中，本发明提供的寡聚化合物与靶RNA的一部分杂交从而导致靶RNA丧失正常功能。

Description

四氢吡喃核酸类似物

发明领域

本发明提供了四氢吡喃核苷类似物、由其制备的寡聚化合物以及使用该寡聚化合物的方法。更具体地，各四氢吡喃类似物使用取代的四氢吡喃环替代天然存在的呋喃核糖环。在某些实施方案中，本发明提供的寡聚化合物与靶RNA的一部分杂交从而导致靶RNA丧失正常功能。

发明背景

反义技术是降低一种或多种特定基因产物表达的有效方法，并因此被证实在许多治疗、诊断和研究应用中特别有效。化学修饰的核苷通常用于结合至反义序列以增强诸如亲和力和核酸酶耐性等的一种或多种特性。一种此类化学修饰的核苷包括四氢吡喃核苷类似物，其中，呋喃糖环被四氢吡喃环所替代。

文献中已经报道了各种四氢吡喃核苷类似物的合成，例如参见：Verheggen等，J.Med.Chem.，1995，38，826-835；Altmann等，Chimia，1996，50，168-176；Herdewijn等，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，1996，6(13)，1457-1460；Verheggen等，Nucleosides & Nucleotides，1996，15(1-3)，325-335；Ostrowski等，J.Med.Chem.，1998，41，4343-4353；Allart等，Tetrahedron.，1999，55，6527-6546；Wouters等，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，1999，9，1563-1566；Brown等，Drug Development Res.，2000，49，253-259；公开的PCT申请：WO 93/25565；WO 02/18406；和WO 05/049582；美国专利5,314,893；5,607,922；和6,455,507。

已经描述的各种四氢吡喃核苷类似物是单体并已被结合至寡聚化合物(例如参见：1993年12月23日公开的PCT申请WO 93/25565；Augustyns等，Nucleic Acids Res.，1993，21(20)，4670-4676；Verheggen等，J.Med.Chem.，1993，36，2033-2040；Van Aerschol等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1995，34(12)，1338-1339；Anderson等，Tetrahedron Letters，1996，37(45)，8147-8150；Herdewijn等，Liebigs Ann.，1996，1337-1348；De Bouvere等，LiebigsAnn./Recueil，1997，1453-1461；1513-1520；Hendrix等，Chem.Eur.J.，1997，3(1)，110-120；Hendrix等，Chem.Eur.J，1997，3(9)，1513-1520；Hossain等，J.Org.Chem.，1998，63，1574-1582；Allart等，Chem.Eur.J.，1999，5(8)，2424-2431；Boudou等，Nucleic Acids Res.，1999，27(6)，1450-1456；Kozlov等，J.Am.Chem.Soc，1999，121，1108-1109；Kozlov等，J.Am.Chem.Soc，1999，121，2653-2656；Kozlov等，J Am.Chem.Soc，1999，121，5856-5859；Pochet等，Nucleosides & Nucleotides，1999，18(4&5)，1015-1017；Vastmans等，Collection Symposium Series，1999，2，156-160；Froeyen等，HelveticaChimica Acta，2000，83，2153-2182；Kozlov等，Chem.Eur.J，2000，6(1)，151-155；Atkins等，Parmazie，2000，55(8)，615-617；Lescrinier等，Chemistry& Biology，2000，7，719-731；Lescrinier等，Helvetica Chimica Acta，2000，83，1291-1310；Wang等，J.Am.Chem.，2000，122，8595-8602；美国专利申请US 2004/0033967；公开的美国专利申请US 2008/0038745；公开并授权的美国专利7,276,592)。文献中已经评述了DNA类似物(参见：Leumann，J.C，Bioorganic & Medicinal Chemistry，2002，10，841-854)，其中包括对四氢吡喃核苷类似物(在“己糖醇核酸家族”标题下)的一般讨论。

已制备具有磷酸二酯连接的3-H四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物(本领域也称其为HNA-己糖醇核酸或1，5-脱水己糖醇核酸)供细胞试验评价。已评价的不同基序是充分修饰的(其中，各单体是磷酸二酯连接的3-H四氢吡喃核苷类似物)并且是有缺口的(其中，寡聚化合物3和5外部区域的各单体各自为磷酸二酯连接的3-H四氢吡喃核苷类似物，而内部区域的各单体为硫代磷酸酯连接的脱氧核糖核苷(参见：Kang等，Nucleic Acids Research，2004，32(H)，4411-4419；Vandermeeren等，2000，55，655-663；Flores等，Parasitol Res.，1999，85，864-866；和Hendrix等，Chem.Eur.J，1997，3(9)，1513-1520)。

已经制备了具有磷酸二酯连接的3-OH四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物(本领域也称其为ANA或D-阿卓糖醇核酸)并进行了结构评价和体外评价(Allart等，Chem.Eur.J.，1999，5(8)，2424-2431)。

已经制备了具有结合了己糖醇核苷酸的化学修饰的siRNA(本领域也称其为HNA核酸)并测试了其沉默能力(参见：公开的PCT申请，WO 06/047842，公开日2006年5月11日。

因此，仍旧需要通过反义机制特异性调节基因表达的试剂。本发明公开了4-取代的-5-羟基-6-羟基-甲基-四氢吡喃核苷类似物，其可用于制备调节基因表达途径的反义化合物，包括那些依赖于RNA酶H、RNAi和dsRNA酶等作用机制以及基于靶降解或靶占有的其它反义机制的化合物。本领域技术人员通过本发明公开的内容无需额外试验就能够鉴别、制备和开发用于这些用途的反义化合物。

发明概述

本发明提供了四氢吡喃核苷类似物、包含四氢吡喃类似物的寡聚化合物以及使用该寡聚化合物的方法。所述四氢吡喃核苷类似物能使结合了它们的寡聚化合物具有增强的特性。

本发明进一步地分别详细定义了各个变量。应理解，本发明提供的四氢吡喃核苷类似物、寡聚化合物以及其使用方法包括本发明所披露的实施方案和本发明所定义变量的所有组合。

在某些实施方案中，提供了具有式XVI的四氢吡喃核苷类似物：

其中：

Bx是杂环碱基部分；

T₅是羟基保护基；

L₁是H、卤素、C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基；

Z₁是O^-或OE₁；

Z₂是OH、OE₁或N(E₁)(E₂)；

E₁和E₂各自独立地为烷基或取代的烷基；

q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自独立地为：H、C₁-C₆烷基、取代的C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、取代的C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基或取代的C₂-C₆炔基；

其中，各取代的基团包含一个或多个独立地选自下组的任选被保护的取代基：卤素、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、OC(＝X)J₁、OC(＝X)NJ₁J₂、NJ₃C(＝X)NJ₁J₂和CN，其中，J₁、J₂和J₃各自独立地是H或C₁-C₆烷基，且X为O、S或NJ₁。

在某些实施方案中，提供了具有式XVI的四氢吡喃核苷类似物，其中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇中的至少一个不是H。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇中的至少一个是甲基。

在某些实施方案中，提供了具有式XVI的四氢吡喃核苷类似物，其中，Bx是尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、胸腺嘧啶、2-硫代-胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪2(3H)-酮、1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮、9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪2(3H)-酮、2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮或H-吡啶并[3，2：4，5]吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-酮。在某些实施方案中，Bx是尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、腺嘌呤或鸟嘌呤。

在某些实施方案中，提供了具有式XVI的四氢吡喃核苷类似物，其中，T₅是乙酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、对-氯苯基、2，4-二硝基苯基、苄基、苯甲酰基、对-苯基苯甲酰基、2，6-二氯苄基、二苯基甲基、对-硝基苄基、三苯基甲基(三苯甲基)、4-甲氧基三苯甲基、4，4-二甲氧基三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、苯甲酰甲酸酯基、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰基、9-芴基甲基碳酸酯基、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基或取代的9-苯基黄嘌呤-9-基(pixyl)。在某些实施方案中，T₅是乙酰基、苄基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或二甲氧基三苯甲基。

在某些实施方案中，提供了具有式XVI的四氢吡喃核苷类似物，其中，L₁是F。在某些实施方案中，L₁是H。

在某些实施方案中，提供了具有式XVI的四氢吡喃核苷类似物，其中，Z₁是O^-，且Z₂是OH。在某些实施方案中，Z₁是O(CH₂)₂CN，Z₂是N[CH(CH₃)₂]₂，T₅是4,4’-二甲氧基三苯甲基。在某些实施方案中，Z₁是O^-，Z₂是OH，其在四氢吡喃核苷类似物的4’位提供了H膦酸酯基团，其也可写为3’-O-P(=O)(H)(OH或O^-胺⁺)。在某些实施方案中，Z₁是O(CH₂)₂CN，Z₂是N[CH(CH₃)₂]₂，并且T₅是4,4’-二甲氧基三苯甲基，其在3’-位提供了亚磷酰胺。

在某些实施方案中，提供了具有式XVI的四氢吡喃核苷类似物，其具有式XVII所示构型：

在某些实施方案中，提供了具有式XVII的四氢吡喃核苷类似物，其中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H；Bx是尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、腺嘌呤或鸟嘌呤；T₅是4,4’-二甲氧基三苯甲基；Z₁是O(CH₂)₂CN；且Z₂是N[CH(CH₃)₂]₂。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少一个式X的四氢吡喃核苷类似物：

其中，所述至少一个式X的四氢吡喃核苷类似物各自独立地满足：

Bx是杂环碱基部分；

T₃和T₄各自独立地为：将四氢吡喃核苷类似物连接到寡聚化合物的核苷间连接基团；或者T₃和T₄中的一个是将四氢吡喃核苷类似物连接到寡聚化合物的核苷间连接基团，且T₃和T₄中的另一个是H、羟基保护基、连接的共轭基团或者5或3-末端基团；

R₁和R₂中的一个为氟，而R₁和R₂中的另一个是H、卤素、C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基；

各取代的基团包含一个或多个独立地选自下组的任选被保护的取代基：卤素、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、OC(＝X)J₁、OC(＝X)NJ₁J₂、NJ₃C(＝X)NJ₁J₂和CN，其中，X是O、S或NJ₁，且J₁、J₂和J₃各自独立地是H或C₁-C₆烷基；和

其中，所述寡聚化合物包含约8个至约40个通过核苷间连接基团连接的单体亚单元，且至少一个核苷间连接基团是硫代磷酸酯核苷间连接基团。

在某些实施方案中，所述寡聚化合物包含至少两个式X的四氢吡喃核苷类似物。在某些实施方案中，所述寡聚化合物包含至少两个通过硫代磷酸酯核苷间连接基团连接的邻近的式X的四氢吡喃核苷类似物。

在某些实施方案中，所述寡聚化合物包含至少一个式X的四氢吡喃核苷类似物和至少一个β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，所述寡聚化合物包含至少一个通过硫代磷酸酯核苷间连接基团连接到β-D-2-脱氧核糖核苷的式X的四氢吡喃核苷类似物。

在某些实施方案中，所述寡聚化合物包含至少一个具有2至约5个邻近的式X的四氢吡喃核苷类似物的区域。在某些实施方案中，所述寡聚化合物包含至少一个具有2至约5个邻近的式X的四氢吡喃核苷类似物的区域和至少一个具有除β-D-核糖核苷和β-D-2-脱氧核糖核苷以外的1至约5个邻近的单体亚单元的额外区域，其中，所述额外区域通过至少一个β-D-2-脱氧核糖核苷与所述至少一个区域隔开。在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少两个区域，各区域具有1至约5个邻近的式X的四氢吡喃核苷类似物，且其中所述两个区域通过至少一个单体亚单元隔开，其中，各单体亚单元独立地为核苷或修饰的核苷。

在某些实施方案中，提供的寡聚化合物包含有缺口的(gapped)寡聚化合物，其包含至少两个区域，各区域具有1至约5个邻近的式X的四氢吡喃核苷类似物，其中，所述邻近的式X的四氢吡喃核苷类似物的至少两个区域中的一个位于5-端，而所述邻近的式X的四氢吡喃核苷类似物的至少两个区域中的另一个位于3-端，且其中所述两个区域通过包含约6至约18个单体亚单元的内部区域隔开，其中，各单体亚单元独立地为核苷或修饰的核苷。

在某些实施方案中，所述寡聚化合物包含至少一个磷酸二酯核苷间连接基团。在某些实施方案中，各核苷间连接基团是硫代磷酸酯核苷间连接基团。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其中q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆或q₇中的至少一个不是H。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆或q₇中的至少一个是甲基。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其中，各四氢吡喃核苷类似物具有式XI的构型：

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其中，各四氢吡喃核苷类似物具有式XII：

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其在长度上包含约10至约21个单体亚单元。在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其在长度上包含约10至约16个单体亚单元。在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其在长度上包含约10至约14个单体亚单元。在某些实施方案中，术语“包含”仅仅是为了在寡聚化合物中常规添加额外的取代基，例如但不限于诸如羟基保护基之类的保护基、任选连接的共轭基团、5和/或3-末端基团和/或其它取代基。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少两个式XIII的四氢吡喃核苷类似物：

其中所述式XIII的四氢吡喃核苷类似物各自独立地满足：

Bx是杂环碱基部分；

R₃和R₄各自独立地为：H、羟基、卤素、C₁-C₆烷基、取代的C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基或取代的C₁-C₆烷氧基；

各取代的基团包含一个或多个独立地选自下组的任选被保护的取代基：卤素、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、OC(＝X)J₁、OC(＝X)NJ₁J₂、NJ₃C(＝X)NJ₁J₂和CN，其中，X是O、S或NJ₁，且J₁、J₂和J₃各自独立地是H或C₁-C₆烷基；

其中所述寡聚化合物包含约8至约40个单体亚单元；和

至少两个式XIII的四氢吡喃核苷类似物通过硫代磷酸酯核苷间连接基团连接。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其中，对于至少一个式XIII的四氢吡喃核苷类似物而言，R₃和R₄之一是H，而R₃和R₄中的另一个是H、OCH₃或F。

在某些实施方案中，提供的寡聚化合物包含至少一个β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，提供的寡聚化合物包含至少一个β-D-2-脱氧核糖核苷，其中，至少一个β-D-2-脱氧核糖核苷通过硫代磷酸酯核苷间连接基团连接到式XIII的四氢吡喃核苷类似物。

在某些实施方案中，提供的寡聚化合物包含至少一个具有2至约5个邻近的式XIII的四氢吡喃核苷类似物的区域。在某些实施方案中，提供的寡聚化合物包含至少一个具有2至约5个邻近的式XIII的四氢吡喃核苷类似物的区域和至少一个具有除β-D-核糖核苷和β-D-2-脱氧核糖核苷外的1至约5个邻近的单体亚单元的额外区域，其中，所述额外区域通过至少一个β-D-2-脱氧核糖核苷与所述至少一个区域隔开。在某些实施方案中，提供的寡聚化合物包含至少一个具有2至约5个邻近的式XIII的四氢吡喃核苷类似物的区域和至少一个具有1至约5个邻近的式XIII的四氢吡喃核苷类似物的额外区域，其中，具有2至约5个邻近的式XIII的四氢吡喃核苷类似物的所述至少一个区域通过至少一个核苷或修饰的核苷与具有1至约5个邻近的式XIII的四氢吡喃核苷类似物的所述额外区域隔开。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少两个具有1至约5个邻近的式XIII的四氢吡喃核苷类似物的区域，该寡聚化合物包含有缺口的寡聚化合物，其中，所述邻近的式XIII的四氢吡喃核苷类似物的至少两个区域中的一个位于5-端，而所述邻近的式XIII的四氢吡喃核苷类似物的至少两个区域中的另一个位于3-端，且其中所述两个区域通过包含约6至约14个单体亚单元的内部区域隔开，其中，各单体亚单元独立地为核苷或修饰的核苷。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少一个磷酸二酯核苷间连接基团。在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其中，各核苷间连接基团是硫代磷酸酯核苷间连接基团。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H。在某些实施方案中，其中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆或q₇中的至少一个不是H。在某些实施方案中，其中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆或q₇中的至少一个是甲基。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其中，式XIII的各四氢吡喃核苷类似物具有式XIV的构型：

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其中，至少一个四氢吡喃核苷类似物具有式XV：

其中：

Bx是杂环碱基部分；和

R₅是H、OCH₃或F。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其中，各四氢吡喃核苷类似物具有式XV。在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其中，各四氢吡喃核苷类似物具有式XV且各R₅是H。在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其中，各四氢吡喃核苷类似物具有式XV且各R₅是OCH₃。在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其中，各四氢吡喃核苷类似物具有式XV且各R₅是F。

在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗的寡聚化合物。在某些实施方案中，所述治疗是治疗以不希望的基因表达为特征的疾病。在某些实施方案中，所述治疗是通过抑制基因表达来治疗疾病。在某些实施方案中，使动物细胞与所述寡聚化合物接触。在某些实施方案中，本发明提供的寡聚化合物被用于制备用于治疗以不希望的基因表达为特征的疾病的药物。在某些实施方案中，本发明提供的寡聚化合物被用于制备通过抑制基因表达来治疗疾病的药物。在某些实施方案中，提供了包含本发明提供的寡聚化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。

在某些实施方案中，提供了式I的四氢吡喃核苷类似物：

其中：

Bx是杂环碱基部分；

T₁和T₂中的一个是H或羟基保护基，而T₁和T₂中的另一个是H、羟基保护基或反应性磷基团；

R₁和R₂中的一个为氟，而R₁和R₂中的另一个是H、卤素、C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基；和

在某些实施方案中，R₁和R₂中的另一个是H。在某些实施方案中，R₁和R₂各自为氟。在某些实施方案中，R₁和R₂中的另一个是C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。在某些实施方案中，R₁和R₂中的另一个是甲基、乙基、取代的甲基或取代的乙基，R₁和R₂中的另一个是甲基。

在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇中的至少一个是C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇中的至少一个是甲基。在某些实施方案中，q₁和q₂中的至少一个是甲基。在某些实施方案中，q₃和q₄中的至少一个是甲基。在某些实施方案中，q₅、q₆和q₇中的至少一个是甲基。

在某些实施方案中，T₁和T₂各自是H。在某些实施方案中，T₁和T₂中的至少一个是羟基保护基。在某些实施方案中，各羟基保护基独立地是乙酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、对-氯苯基、2，4-二硝基苯基、苄基、苯甲酰基、对-苯基苯甲酰基、2，6-二氯苄基、二苯基甲基、对-硝基苄基、三苯基甲基(三苯甲基)、4-甲氧基三苯甲基、4，4-二甲氧基三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基-二苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、苯甲酰甲酸酯基、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰基、9-芴基甲基碳酸酯基、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基或取代的9-苯基黄嘌呤-9-基(pixyl)。

在某些实施方案中，T₁是乙酰基、苄基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、4-甲氧基三苯甲基或4，4-二甲氧基三苯甲基。在某些实施方案中，T₁和T₂中的一个是羟基保护基，而T₁和T₂中的另一个是二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺或H-膦酸酯。在某些实施方案中，T₁是4，4-二甲氧基三苯甲基，T₂是二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺。

在某些实施方案中，Bx是尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤。在某些实施方案中，Bx是嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取代的嘌呤，其中，所述取代不是插入剂或当该四氢吡喃核苷类似物位于寡聚化合物内时不与靶核酸相互作用的连接基团。在某些实施方案中，Bx是尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、胸腺嘧啶、2-硫代-胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮、1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮、9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮、2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮或H-吡啶并[3，2：4，5]吡咯并 [2，3-d]嘧啶-2-酮。Bx是尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤。

在某些实施方案中，所述四氢吡喃核苷类似物具有式Ia所示的构型：

其中：

Bx是杂环碱基部分；

T₁和T₂中的一个是H或羟基保护基而T₁和T₂中的另一个是H、羟基保护基或反应性磷基团；

q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q_各自独立地为：H、C₁-C₆烷基、取代的C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、取代的C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基或取代的C₂-C₆炔基；

其中，各取代的基团包含一个或多个独立地选自下组的任选被保护的取代基：卤素、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、OC(＝X)J₁、OC(＝X)NJ₁J₂、NJ₃C(＝X)M₁J₂和CN，其中，各J₁、J₂和J₃独立地是H或C₁-C₆烷基，且X为O、S或NJ₁。

在某些实施方案中，提供了具有如式Ia所示构型的四氢吡喃核苷类似物，其中，R₂是氟。在某些实施方案中，提供了具有如式Ia所示构型的四氢吡喃核苷类似物，其中，R₁是H，且R₂是氟。在某些实施方案中，提供了具有如式Ia所示构型的四氢吡喃核苷类似物，其中，R₁是H，R₂是氟，且q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H。

在某些实施方案中，提供了具有如式Ia所示构型的四氢吡喃核苷类似物，其中，R₁是C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。在某些实施方案中，提供了具有如式Ia所示构型的四氢吡喃核苷类似物，其中，R₁是甲基、乙基、取代的甲基或取代的乙基。在某些实施方案中，提供了有如式Ia所示构型的四氢吡喃核苷类似物，其中，R₁和R₂各自为氟。

在某些实施方案中，提供了具有式II的四氢吡喃核苷类似物：

其中：

Bx是杂环碱基部分。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少一个式III的四氢吡喃核苷类似物：

其中，所述至少一个式III的四氢吡喃核苷类似物各自独立地满足：

Bx是杂环碱基部分；

T₃和T₄各自独立地为：将四氢吡喃核苷类似物连接到寡聚化合物的核苷间连接基团；或者T₃和T₄中的一个是将四氢吡喃核苷类似物连接到寡聚化合物的核苷间连接基团；且T₃和T₄中的另一个是H、羟基保护基、连接的共轭基团或者5或3-末端基团；

各取代的基团包含一个或多个独立地选自下组的任选被保护的取代基：卤素、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、OC(＝X)J₁、OC(＝X)NJ₁J₂、NJ₃C(＝X)NJ₁J₂和CN，其中，各J₁、J₂和J₃独立地是H或C₁-C₆烷基，且X为O、S或NJ₁；和

其中，所述寡聚化合物包含约8至约40个单体亚单元。

在某些实施方案中，R₁和R₂中的另一个是H。在某些实施方案中，R₁和R₂各自为氟。在某些实施方案中，R₁和R₂中的另一个是C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。在某些实施方案中，R₁和R₂中的另一个是甲基、乙基、取代的甲基或取代的乙基。在某些实施方案中，R₁和R₂中的另一个是甲基。

在某些实施方案中，T₃和T₄中的至少一个是连接的共轭基团。

在某些实施方案中，各核苷间连接基团独立地为磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷间连接基团。在某些实施方案中，各核苷间连接基团是硫代磷酸酯核苷间连接基团。

在某些实施方案中，各Bx独立地为尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤。在某些实施方案中，各Bx独立地为嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取代的嘌呤，其中，所述取代不是插入剂或不与靶核酸相互作用的连接基团。在某些实施方案中，Bx独立地为尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、胸腺嘧啶、2-硫代-胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪2(3H)-酮)、1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮、9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪2(3H)-酮、2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮或H-吡啶并[3，2：4，5]吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-酮。在某些实施方案中，各Bx独立地为尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤。

在某些实施方案中，式III的各四氢吡喃核苷类似物具有式IIIa所示构型：

其中：

Bx是杂环碱基部分；

其中，所述寡聚化合物包含约8至约40个核苷、修饰的核苷和/或四氢吡喃核苷类似物。

在某些实施方案中，提供了具有式IIIa的四氢吡喃核苷类似物，其中，R₂是氟。在某些实施方案中，提供了具有式IIIa的四氢吡喃核苷类似物，其中，R₂是氟且R₁是H。在某些实施方案中，提供了具有式IIIa的四氢吡喃核苷类似物，其中，R₂是氟，R₁是H，且q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其中，各四氢吡喃核苷类似物具有式IV：

其中：

Bx是杂环碱基部分。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其具有至少一个1至约5个四氢吡喃核苷类似物的邻近区域，其中，各四氢吡喃核苷类似物具有式IIIa。在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其具有至少一个1至约5个四氢吡喃核苷类似物的邻近区域，其中，各四氢吡喃核苷类似物具有式IIIa且该寡聚化合物包含嵌段物(blockmer)。在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其具有至少一个1至约5个四氢吡喃核苷类似物的邻近区域，其中，各四氢吡喃核苷类似物具有式IIIa且该寡聚化合物包含3或5-半体(hemimer)。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其具有至少一个1至约5个四氢吡喃核苷类似物的邻近区域，其中，各四氢吡喃核苷类似物具有式IV：

其中：

Bx是杂环碱基部分。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其具有通过至少一个核苷或修饰的核苷隔开的至少两个区域，所述区域各具有1至约5个邻近的具有式IIIa的四氢吡喃核苷类似物。在某些实施方案中，提供了具有至少两个区域的寡聚化合物，所述各区域具有1至约5个邻近的具有式IIIa的四氢-吡喃核苷类似物，所述寡聚化合物包含有缺口的寡聚化合物，其中，所述四氢吡喃核苷类似物的至少两个区域中的一个位于5-端，且所述四氢吡喃核苷类似物的至少两个区域中的另一个位于3-端，且其中所述四氢吡喃核苷类似物的两个区域通过包含约6至约14个独立地选自核苷、修饰的核苷和四氢吡喃核苷类似物的单体亚单元的内部区域隔开。在某些实施方案中，实质上，所述内部区域中的各单体亚单元是β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约6至约14个β-D-2-脱氧-核糖核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约10至约12个β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约10至约14个β-D-2-脱氧核糖核苷。

在某些实施方案中，提供了具有至少两个区域的的寡聚化合物，所述各区域具有2至约3个邻近的具有式IIIa的四氢吡喃核苷类似物，所述寡聚化合物包括有缺口的寡聚化合物，其中，所述四氢吡喃核苷类似物的至少两个区域中的一个位于5-端，而所述四氢吡喃核苷类似物的至少两个区域中的另一个位于3-端，且其中所述四氢吡喃核苷类似物的两个区域通过包含约6至约14个独立地选自核苷、修饰的核苷和四氢吡喃核苷类似物的单体亚单元的内部区域隔开。在某些实施方案中，四氢吡喃核苷类似物的各区域独立地包含2个四氢吡喃核苷类似物。在某些实施方案中，四氢吡喃核苷类似物的各区域独立地包含2个四氢吡喃核苷类似物且所述内部区域包含10个β-D-2-脱氧核糖核苷。

在某些实施方案中，提供了有缺口的寡聚化合物，其中，四氢吡喃核苷类似物的各区域独立地包含2个四氢吡喃核苷类似物，且所述内部区域包含10个β-D-2-脱氧核糖核苷，且各四氢吡喃核苷类似物具有式IV：

其中：

Bx是杂环碱基部分。

在某些实施方案中，提供了具有至少两个区域的寡聚化合物，所述各区域具有2至约3个邻近的具有式IIIa的四氢吡喃核苷类似物，所述寡聚化合物包括有缺口的寡聚化合物，其中，所述四氢吡喃核苷类似物的至少两个区域中的一个位于5-端，且所述四氢吡喃核苷类似物的至少两个区域中的另一个位于3-端，且其中所述四氢吡喃核苷类似物的两个区域通过包含14个β-D-2-脱氧核糖核苷的内部区域隔开。在某些实施方案中，四氢吡喃核苷类似物的各区域独立地包含2个四氢吡喃核苷类似物。在某些实施方案中，各四氢吡喃核苷类似物具有式IV：

其中：

Bx是杂环碱基部分。

在某些实施方案中，提供了还包含3-末端基团的有缺口的寡聚化合物。在某些实施方案中，所述3-末端基团包含1至约4个修饰的或未修饰的核苷。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其在长度上包含约10至约21个单体亚单元。在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其在长度上包含约10至约16个单体亚单元。在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其在长度上包含约10至约14个单体亚单元。

在某些实施方案中，提供了包含至少两个邻近的式V的四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物：

其中，所述式V的四氢吡喃核苷类似物各自独立地满足：

Bx是杂环碱基部分；

T₃和T₄各自独立地为：将四氢吡喃核苷类似物连接到寡聚化合物的核苷间连接基团；或者T₃和T₄中的一个是将四氢吡喃核苷类似物连接到寡聚化合物的核苷间连接基团，且T₃和T₄中的另一个是H、羟基保护基、连接的共轭基团、或者5或3-末端基团；

R₃和R₄各自独立地为：H、羟基、氟、C₁-C₆烷基、取代的C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基或取代的C₁-C₆烷氧基；

各取代的基团包含一个或多个独立地选自下组的任选被保护的取代基：卤素、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、OC(＝X)J₁、OC(＝X)NJ₁J₂、NJ₃C(＝X)NJ₁J₂和CN，其中，J₁、J₂和J₃各自独立地是H或C₁-C₆烷基，且X为O、S或NJ₁；

所述寡聚化合物包含约8至约40个单体亚单元；和

其中，所述至少两个邻近的四氢吡喃核苷类似物中的至少两个通过除磷酸二酯核苷间连接基团之外的核苷间连接基团连接。

在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇中的至少一个是C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇中的至少一个是甲基。在某些实施方案中，q₁和q₂中的至少一个是甲基。在某些实施方案中，q₃和q₄中的至少一个是甲基。在某些实施方案中，q₅、q₆和q₇中的至少一个是甲基。

在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H，且R₃是H。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H，R₃是H，且R₄是H。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H，R₃是H，且R₄是OCH₃。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H，R₃是H，且R₄是氟。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H，R₃是H，且R₄是羟基。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H，R₃是H，而各R₄是H、OCH₃、氟或羟基。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少两个邻近的式V的四氢吡喃核苷类似物，其中，T₃和T₄中的至少一个是连接的共轭基团，且其中，所述至少两个邻近的四氢吡喃核苷类似物中的至少两个通过除磷酸二酯核苷间连接基团之外的核苷间连接基团连接。在某些实施方案中，所述至少两个邻近的四氢吡喃核苷类似物中的至少两个通过硫代磷酸酯核苷间连接基团连接。在某些实施方案中，所述至少两个邻近的四氢吡喃核苷类似物中的至少两个通过含磷的核苷间连接基团连接。在某些实施方案中，所述至少两个邻近的四氢吡喃核苷类似物中的至少两个通过不含磷的核苷间连接基团连接。在某些实施方案中，所述至少两个邻近的四氢吡喃核苷类似物中的至少两个通过中性核苷间连接基团连接。在某些实施方案中，各核苷间连接基团独立地为磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷间连接基团。在某些实施方案中，各核苷间连接基团是硫代磷酸酯核苷间连接基团。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少两个邻近的式V的四氢吡喃核苷类似物，其中，所述至少两个邻近的四氢吡喃核苷类似物中的至少两个通过除磷酸二酯核苷间连接基团之外的核苷间连接基团连接，且其中，各Bx独立地为尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤。在某些实施方案中，各Bx独立地为嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取代的嘌呤，其中，所述取代不是插入剂或不与靶核酸相互作用的连接基团。在某些实施方案中，各Bx独立地为尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、胸腺嘧啶、2-硫代-胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮、9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪2(3H)-酮、2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮或H-吡啶并[3，2：4，5]-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-酮。在某些实施方案中，各Bx独立地为尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少两个邻近的式V的四氢吡喃核苷类似物，其中，所述至少两个邻近的四氢吡喃核苷类似物中的至少两个通过除磷酸二酯核苷间连接基团之外的核苷间连接基团连接，其中，各式V的四氢吡喃核苷类似物具有式Va所示构型：

Bx是杂环碱基部分；

R₃和R₄各自独立地为：H、羟基、氟、C₁-C₆烷基、取代的C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基或取代的C₁-C₆烷氧基；和

各取代的基团包含一个或多个独立地选自下组的任选被保护的取代基：卤素、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、OC(＝X)J₁、OC(＝X)NJ₁J₂、NJ₃C(＝X)NJ₁J₂和CN，其中，J₁、J₂和J₃各自独立地是H或C₁-C₆烷基，且X为O、S或NJ₁。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少两个邻近的式Va的四氢吡喃核苷类似物，其中，所述至少两个邻近的四氢吡喃核苷类似物中的至少两个通过除磷酸二酯核苷间连接基团之外的核苷间连接基团连接，且其中所述寡聚化合物包含具有1至约5个四氢吡喃核苷类似物的至少一个邻近区域。在某些实施方案中，所述寡聚化合物包含嵌段物。在某些实施方案中，所述寡聚化合物包含3或5-半体。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少两个邻近的式Va的四氢吡喃核苷类似物，其中，所述至少两个邻近的四氢吡喃核苷类似物中的至少两个通过除磷酸二酯核苷间连接基团之外的核苷间连接基团连接，且其中所述寡聚化合物包含通过至少一个核苷或修饰的核苷隔开的至少两个区域，所述各区域具有1至约5个邻近的四氢吡喃核苷类似物。在某些实施方案中，所述寡聚化合物包含有缺口的寡聚化合物，其中，四氢吡喃核苷类似物的一个外部区域位于5-端，而四氢吡喃核苷类似物的第二个外部区域位于 3-端，且其中，所述两个外部区域通过包含约6至约14个独立地选自核苷、修饰的核苷、和四氢吡喃核苷类似物的单体亚单元的内部区域隔开。在某些实施方案中，实质上，所述内部区域中的各单体亚单元是β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约6至约14个β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约10至约12个β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约10至约14个β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，各外部区域独立地包含2至约3个四氢吡喃核苷类似物。在某些实施方案中，各外部区域独立地包含2个四氢吡喃核苷类似物。在某些实施方案中，各外部区域独立地包含2个四氢吡喃核苷类似物且所述内部区域包含10个β-D-2-脱氧核糖核苷。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少两个邻近的式V的四氢吡喃核苷类似物，其中，所述至少两个邻近的四氢吡喃核苷类似物中的至少两个通过除磷酸二酯核苷间连接基团之外的核苷间连接基团连接，且其中的各四氢吡喃核苷类似物具有式Vb所示的结构式和构型：

其中：

Bx是杂环碱基部分；

T₃和T₄各自独立地为：将四氢吡喃核苷类似物连接到寡聚化合物的核苷间连接基团；或者T₃和T₄中的一个是将四氢吡喃核苷类似物连接到寡聚化合物的核苷间连接基团，且T₃和T₄中的另一个是H、羟基保护基、连接的共轭基团、或者5或3-末端基团；和

R₄是H、羟基、氟或OCH₃。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少两个邻近的式V的四氢吡喃核苷类似物，其中，所述至少两个邻近的四氢吡喃核苷类似物中的至少两个通过除磷酸二酯核苷间连接基团之外的核苷间连接基团连接，且其中各四氢吡喃核苷类似物具有式Vb和R₄H。在某些实施方案中，R₄是羟基。在某些实施方案中，R₄是OCH₃。在某些实施方案中，R₄是氟。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少两个邻近的式V的四氢吡喃核苷类似物，其中，所述至少两个邻近的四氢吡喃核苷类似物中的至少两个通过除磷酸二酯核苷间连接基团之外的核苷间连接基团连接，且其中各寡聚化合物在长度上包含约10至约21个单体亚单元。在某些实施方案中，各寡聚化合物在长度上包含约10至约16个单体亚单元。在某些实施方案中，各寡聚化合物在长度上包含约10至约14个单体亚单元。

在某些实施方案中，提供了方法，该方法包括将动物细胞与寡聚化合物接触，所述寡聚化合物包含至少一个式V的四氢吡喃核苷类似物：

其中，所述至少一个式V的四氢吡喃核苷类似物各自独立地满足：

Bx是杂环碱基部分；

各取代的基团包含一个或多个独立地选自下组的任选被保护的取代基：卤素、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、OC(＝X)J₁、OC(＝X)NJ₁J₂、NJ₃C(＝X)NJ₁J₂和CN，其中，J₁、J₂和J₃各自独立地是H或C₁-C₆烷基，且X为O、S或NJ₁；和

其中所述寡聚化合物包含约8至约40个单体亚单元并与靶RNA互补。

在某些实施方案中，所述细胞是人细胞。在某些实施方案中，所述靶RNA选自mRNA、前-mRNA和微RNA。在某些实施方案中，所述靶RNA是mRNA。在某些实施方案中，所述靶RNA是人mRNA。在某些实施方案中，所述靶RNA被裂解从而其功能受到抑制。

在某些实施方案中，所述方法还包括评价所述寡聚化合物对所述细胞的反义活性。在某些实施方案中，所述评价包括检测靶RNA的水平。在某些实施方案中，所述评价包括检测蛋白质水平。在某些实施方案中，所述评价包括检测一种或多种表型效应。

在某些实施方案中，提供了方法，其包括将动物细胞与寡聚化合物接触，所述寡聚化合物包含至少一个式V的四氢吡喃核苷类似物，其中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H，且R₃是H。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H，R₃是H，且R₄是OCH₃。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H，R₃是H，且R₄是氟。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、 q₅、q₆和q₇各自是H，R₃是H，且R₄是羟基。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H，R₃是H，且各R₄是H、OCH₃、氟或羟基。

在某些实施方案中，提供了方法，其包括将动物细胞与寡聚化合物接触，所述寡聚化合物包含至少一个式V的四氢吡喃核苷类似物，其中，各核苷间连接基团独立地为磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷间连接基团。在某些实施方案中，各核苷间连接基团是硫代磷酸酯核苷间连接基团。

在某些实施方案中，提供了方法，其包括将动物细胞与寡聚化合物接触，所述寡聚化合物包含至少一个式V的四氢吡喃核苷类似物，其中，各式V的四氢吡喃核苷类似物具有如式Vb所示构型：

其中：

Bx是杂环碱基部分；

在某些实施方案中，提供了方法，其包括将动物细胞与寡聚化合物接触，所述寡聚化合物包含至少一个四氢吡喃核苷类似物，其中，所述寡聚化合物包含至少一个邻近区域，其具有1至约5个具有式Va的四氢吡喃核苷类似物。在某些实施方案中，所述寡聚化合物是嵌段物。在某些实施方案中，所述寡聚化合物是3或5-半体。

在某些实施方案中，提供了方法，其包括将动物细胞与寡聚化合物接触，所述寡聚化合物包含至少两个具有1至约5个邻近的四氢吡喃核苷类似物的区域，所述区域通过至少一个核苷或修饰的核苷隔开。在某些实施方案中，所述寡聚化合物包含有缺口的寡聚化合物，其中，四氢吡喃核苷类似物的一个外部区域位于5-端，而四氢吡喃核苷类似物的第二个外部区域位于3-端，且其中，所述两个外部区域通过包含约6至约14个独立地选自核苷、修饰的核苷和四氢吡喃核苷类似物的单体亚单元的内部区域隔开。在某些实施方案中，所述内部区域中的各单体亚单元是β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约6至约14个β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约10至约12个β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约10至约14个β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，各外部区域独立地包含2至约3个四氢吡喃核苷类似物。在某些实施方案中，各外部区域独立地包含2个四氢吡喃核苷类似物。在某些实施方案中，各外部区域独立地包含2个四氢吡喃核苷类似物，且所述内部区域包含10个β-D-2-脱氧核糖核苷。

在某些实施方案中，提供了方法，其包括将动物细胞与寡聚化合物接触，所述寡聚化合物包含至少一个式V的四氢吡喃核苷类似物，且其中，各四氢吡喃核苷类似物具有如式Vb所示构型：

其中：

Bx是杂环碱基部分；

R₄是H、羟基、氟或OCH₃。在某些实施方案中，R₄是H。在某些实施方案中，R₄是羟基。在某些实施方案中，R₄是OCH₃。在某些实施方案中，R₄是氟。

在某些实施方案中，提供了方法，其包括将细胞与寡聚化合物接触，所述寡聚化合物包含至少两个邻近的式V的四氢吡喃核苷类似物：

其中，所述式V的四氢吡喃核苷类似物各自独立地满足：

Bx是杂环碱基部分；

所述寡聚化合物包含约8至约40个单体亚单元并与靶RNA互补；和

其中，所述两个邻近的四氢吡喃核苷类似物中的至少两个通过除磷酸二酯核苷间连接基团之外的核苷间连接基团连接。在某些实施方案中，所述细胞在动物体内。在某些实施方案中，所述细胞在人体内。在某些实施方案中，所述靶RNA选自mRNA、前-mRNA和微RNA。在某些实施方案中，所述靶RNA是mRNA。在某些实施方案中，所述靶RNA是人mRNA。在某些实施方案中，所述靶RNA被裂解从而其功能受到抑制。

在某些实施方案中，提供了方法，其包括将细胞与寡聚化合物接触，所述寡聚化合物包含至少两个邻近的式V的四氢吡喃核苷类似物，其中，至少两个四氢吡喃核苷类似物通过除磷酸二酯核苷间连接基团之外的核苷间连接基团连接，且其中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H。在某些实施方案中，R₃是H。在某些实施方案中，R₄是OCH₃。在某些实施方案中，R₄是氟。在某些实施方案中，R₄是羟基。在某些实施方案中，各R₄是OCH₃、氟或羟基。

在某些实施方案中，提供了方法，其包括将细胞与寡聚化合物接触，所述寡聚化合物包含至少两个邻近的式V的四氢吡喃核苷类似物，其中，至少两个四氢吡喃核苷类似物通过除磷酸二酯核苷间连接基团之外的核苷间连接基团连接，且其中，至少两个四氢吡喃核苷类似物通过硫代磷酸酯核苷间键连接。在某些实施方案中，所述至少两个邻近的四氢吡喃核苷类似物中的至少两个通过除磷酸二酯核苷间键之外的含磷的核苷间键连接。在某些实施方案中，所述至少两个邻近的四氢吡喃核苷类似物中的至少两个通过不含磷的核苷间键连接。在某些实施方案中，所述至少两个邻近的四氢吡喃核苷类似物中的至少两个通过中性核苷间键连接。在某些实施方案中，各核苷间连接基团独立地是磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷间连接基团。在某些实施方案中，各核苷间连接基团是硫代磷酸酯核苷间连接基团。

在某些实施方案中，提供了方法，其包括将细胞与寡聚化合物接触，所述寡聚化合物包含至少两个邻近的四氢吡喃核苷类似物，其中，至少两个四氢吡喃核苷类似物通过除磷酸二酯核苷间连接基团之外的核苷间连接基团连接，且其中，各式V的四氢吡喃核苷类似物具有如式Vb所示构型：

其中：

Bx是杂环碱基部分；

T₃和T₄各自独立地为：将四氢吡喃核苷类似物连接到寡聚化合物的核苷间连接基团；或者T₃和T₄中的一个是将四氢吡喃核苷类似物连接到寡聚化合物的核苷间连接基团，且T₃和T₄中的另一个是H、羟基保护基、连接的共轭基团、或者5或3-末端基团；且

各取代的基团包含一个或多个独立地选自下组的任选被保护的取代基：卤素、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、OC(＝X)J₁、OC(＝X)NJ₁J₂、NJ₃C(＝X)NJ₁J₂和CN，其中，各J₁、J₂和J₃独立地是H或C₁-C₆烷基，且X为O、S或NJ₁。

在某些实施方案中，提供了方法，其包括将细胞与寡聚化合物接触，所述寡聚化合物包含至少两个邻近的四氢吡喃核苷类似物，其中，至少两个四氢吡喃核苷类似物通过除磷酸二酯核苷间连接基团之外的核苷间连接基团连接，且其中，所主张的寡聚化合物包含至少一个具有1至约5个具有式Vb的四氢吡喃核苷类似物的邻近区域。在某些实施方案中，所述寡聚化合物包含嵌段物。在某些实施方案中，所述寡聚化合物包含3或5-半体。

在某些实施方案中，提供了方法，其包括将细胞与寡聚化合物接触，所述寡聚化合物包含至少两个邻近的四氢吡喃核苷类似物，其中，至少两个四氢吡喃核苷类似物通过除磷酸二酯核苷间连接基团之外的核苷间连接基团连接，且其中所主张的寡聚化合物包含至少两个邻近的区域，所述各区域具有1至约5个具有式Vb的四氢吡喃核苷类似物，其中，所述区域通过至少一个核苷或修饰的核苷隔开。在某些实施方案中，所述寡聚化合物包含有缺口的寡聚化合物，其中，四氢吡喃核苷类似物的一个外部区域位于5-端，而四氢吡喃核苷类似物的第二个外部区域位于3-端，其中，所述两个外部区域通过包含约6至约14个独立地选自核苷、修饰的核苷和四氢吡喃核苷类似物的单体亚单元的内部区域隔开。在某些实施方案中，所述内部区域中的各单体亚单元是β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约6至约14个β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约10至约12个β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约10至约14个β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，各外部区域独立地包含2至约3个四氢吡喃核苷类似物。在某些实施方案中，各外部区域独立地包含2个四氢吡喃核苷类似物。在某些实施方案中，各外部区域独立地包含2个四氢吡喃核苷类似物且所述内部区域包含10个β-D-2-脱氧核糖核苷。

在某些实施方案中，提供了方法，其包括将细胞与寡聚化合物接触，所述寡聚化合物包含至少两个邻近的四氢吡喃核苷类似物，其中，至少两个四氢吡喃核苷类似物通过除磷酸二酯核苷间连接基团之外的核苷间连接基团连接，且其中，各四氢吡喃核苷类似物具有式V以及以下如式Vb所示构型：

其中

Bx是杂环碱基部分；

在某些实施方案中，提供了减少靶信使RNA的方法，所述方法包括将一种或多种细胞、组织或动物与包含至少一个式V的四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物接触：

Bx是杂环碱基部分；

其中所述寡聚化合物包含约8至约40个核苷、修饰的核苷和/或四氢吡喃核苷类似物。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H，且R₃是H。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H，R₃是H，且R₄是OCH₃。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H，R₃是H，且R₄是氟。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H，R₃是H，且R₄是羟基。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H，R₃是H，且各R₄是H、OCH₃、氟或羟基。

在某些实施方案中，提供了减少靶信使RNA的方法，所述方法包括将一种或多种细胞、组织或动物与包含至少一个式V的四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物接触，其中，各核苷间连接基团独立地为磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷间连接基团。在某些实施方案中，各核苷间连接基团是硫代磷酸酯核苷间连接基团。

在某些实施方案中，提供了减少靶信使RNA的方法，所述方法包括将一种或多种细胞、组织或动物与包含至少一个四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物接触，其中所述各四氢吡喃核苷类似物具有式Vb：

Bx是杂环碱基部分；

在某些实施方案中，提供了减少靶信使RNA的方法，所述方法包括将一种或多种细胞、组织或动物与包含至少一个四氢吡喃核苷的寡聚化合物接触，所述寡聚化合物包含至少一个具有1至约5个四氢吡喃核苷类似物的邻近区域，且其中，各四氢吡喃核苷类似物具有式Vb。在某些实施方案中，所述寡聚化合物包含嵌段物。在某些实施方案中，所述寡聚化合物包含3或5-半体。

在某些实施方案中，提供了减少靶信使RNA的方法，所述方法包括将一种或多种细胞、组织或动物与寡聚化合物接触，所述寡聚化合物包含至少两个具有1至约5个邻近的四氢吡喃核苷类似物的区域，所述区域通过至少一个核苷或修饰的核苷隔开，且其中各四氢-吡喃核苷类似物具有式Vb。在某些实施方案中，所述寡聚化合物包含有缺口的寡聚化合物，其中，四氢吡喃核苷类似物的一个外部区域位于5-端，而四氢吡喃核苷类似物的第二个外部区域位于3-端，其中，所述两个外部区域通过包含约6至约14个独立地选自核苷、修饰的核苷和四氢吡喃核苷类似物的单体亚单元的内部区域隔开。在某些实施方案中，实质上，所述内部区域中的各单体亚单元是β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约6至约14个β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约10至约12个β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，所述外部区域独立地包含2至约3个四氢吡喃核苷类似物。在某些实施方案中，各外部区域独立地包含2个四氢吡喃核苷类似物。在某些实施方案中，各外部区域独立地包含2个四氢吡喃核苷类似物，且所述内部区域包含10个β-D-2-脱氧核糖核苷。

在某些实施方案中，提供了减少靶信使RNA的方法，所述方法包括将一种或多种细胞、组织或动物与包含至少一个四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物接触，其中各四氢吡喃核苷类似物具有式Vb：

其中

Bx是杂环碱基部分；

R₄是羟基、氟或OCH₃。在某些实施方案中，R₄是羟基。在某些实施方案中，R₄是OCH₃。在某些实施方案中，R₄是氟。

在某些实施方案中，提供了具有式I的四氢吡喃核苷类似物：

其中：

Bx是杂环碱基部分；

其中各取代的基团包含一个或多个独立地选自下组的任选被保护的取代基：卤素、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、OC(＝X)J₁、OC(＝X)NJ₁J₂、NJ₃C(＝X)NJ₁J₂和CN，其中，各J₁、J₂和J₃独立地是H或C₁-C₆烷基，且X为O、S或NJ₁。

在某些实施方案中，R₁和R₂中的一个为氟，而R₁和R₂中的另一个是H。在某些实施方案中，R₁和R₂各自为氟。在某些实施方案中，R₁和R₂中的一个为氟，而R₁和R₂中的另一个为C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。在某些实施方案中，R₁和R₂中的一个是氟，而R₁和R₂中的另一个是甲基、乙基、取代的甲基、或取代的乙基。在某些实施方案中，R₁和R₂中的一个是氟，而R₁和R₂中的另一个是甲基。

在某些实施方案中，T₁和T₂各自是H。在某些实施方案中，T₁和T₂中的至少一个是羟基保护基。在某些实施方案中，各羟基保护基独立地为乙酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、对-氯苯基、2，4-二硝基苯基、苄基、苯甲酰基、对-苯基苯甲酰基、2，6-二氯苄基、二苯基甲基、对-硝基苄基、三苯基甲基(三苯甲基)、4-甲氧基三苯甲基、4，4-二甲氧基三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基-二苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、苯甲酰甲酸酯基、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰基、9-芴基甲基碳酸酯基、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、或取代的9-苯基黄嘌呤-9-基(pixyl)。在某些实施方案中，T₁是乙酰基、苄基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、4-甲氧基三苯甲基、或4，4-二甲氧基三苯甲基。在某些实施方案中，T₁和T₂中的一个是羟基保护基，而T₁和T₂中的另一个是二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺或H-膦酸酯。在某些实施方案中，T₁是4，4-二甲氧基三苯甲基，且T₂是二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺。

在某些实施方案中，Bx是尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤。在某些实施方案中，Bx是嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取代的嘌呤，其中，所述取代不是插入剂或当该四氢吡喃核苷类似物位于寡聚化合物内时不与靶核酸反应的连接基团。在某些实施方案中，Bx是尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、胸腺嘧啶、2-硫代-胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪2(3H)-酮、1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮、9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪2(3H)-酮、2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮或H-吡啶并[3，2：4，5]吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-酮。在某些实施方案中，Bx是尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤。

在某些实施方案中，提供了具有如式Ia所示构型的四氢吡喃核苷类似物：

其中：

Bx是杂环碱基部分；

其中各取代的基团包含一个或多个独立地选自下组的任选被保护的取代基：卤素、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、OC(＝X)J₁、OC(＝X)NJ₁J₂、NJ₃C(＝X)NJ₁J₂和CN，其中，J₁、J₂和J₃各自独立地是H或C₁-C₆烷基，且X为O、S或NJ₁。

在某些实施方案中，提供了具有如式Ia所示构型的四氢吡喃核苷类似物，其中，R₁是C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基，且R₂是氟。在某些实施方案中，提供了具有如式Ia所示构型的四氢吡喃核苷类似物，其中，R₁是甲基、乙基、取代的甲基或取代的乙基，其R₂是氟。

在某些实施方案中，提供了具有如式Ia所示构型的四氢吡喃核苷类似物，其中，R₁和R₂各自为氟。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，所述各寡聚化合物包含至少一个式II的四氢吡喃核苷类似物：

Bx是杂环碱基部分；

T₃和T₄各自独立地为：将四氢吡喃核苷类似物连接到寡聚化合物的核苷间连接基团；或者T₃和T₄中的一个是将四氢吡喃核苷类似物连接到寡聚化合物的核苷间连接基团，且T₃和T₄中的另一个是H、保护基、连接的共轭基团、或者5或3-末端基团；

其中所述寡聚化合物包含约8至约40个核苷、修饰的核苷和/或四氢吡喃核苷类似物。

在某些实施方案中，R₁和R₂中的一个为氟，而R₁和R₂中的另一个是H。在某些实施方案中，R₁和R₂各自为氟。在某些实施方案中，R₁和R₂中的一个是氟，而R₁和R₂中的另一个是C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。在某些实施方案中，R₁和R₂中的一个是氟，而R₁和R₂中的另一个是甲基、乙基、取代的甲基或取代的乙基。在某些实施方案中，R₁和R₂中的一个是氟，而R₁ 和R₂中的另一个是甲基。

在某些实施方案中，各核苷间连接基团独立地为磷酸二酯或硫代磷酸酯。在某些实施方案中，各核苷间连接基团是硫代磷酸酯。

在某些实施方案中，Bx是尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤。在某些实施方案中，Bx是嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取代的嘌呤，其中，所述取代不是插入剂或当该四氢吡喃核苷类似物位于寡聚化合物内时不与靶核酸相互作用的连接基团。在某些实施方案中，Bx是尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、胸腺嘧啶、2-硫代-胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪2(3H)-酮、1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮、9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪2(3H)-酮、2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮或H-吡啶并[3，2：4，5]吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-酮。在某些实施方案中，Bx是尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤。

在某些实施方案中，提供了包含至少一个具有式IIa所示构型的四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物：

其中

Bx是杂环碱基部分；

在某些实施方案中，提供了包含至少一个具有式IIa所示构型的四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物，其中，R₂是氟。在某些实施方案中，提供了包含至少一个具有式IIa所示构型的四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物，其中，R₁是H，且R₂是氟。在某些实施方案中，提供了包含至少一个具有式IIa所示构型的四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物，其中，R₁是H，R₂是氟，且q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少一个具有1至约5个各自具有式IIa所示构型的四氢吡喃核苷类似物的邻近区域。在某些实施方案中，提供了包含具有至少一个邻近区域的嵌段物基序的寡聚化合物，所述邻近区域具有1至约5个各自具有式IIa所示构型的四氢吡喃核苷类似物。在某些实施方案中，提供了包含具有至少一个邻近区域的3或5-半体基序的寡聚化合物，所述邻近区域具有1至约5个各自具有式IIa所示构型的四氢吡喃核苷类似物。

在某些实施方案中，提供了包含至少一个具有1至约5个四氢吡喃核苷类似物的邻近区域的寡聚化合物，所述四氢吡喃核苷类似物各自具有以下结构式和构型：

在某些实施方案中，提供包含至少两个区域的寡聚化合物，所述各区域具有1至约5个邻近的各自具有式II的四氢吡喃核苷类似物，且所述区域通过至少一个核苷或修饰的核苷隔开。在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其包含有缺口的基序，所述基序具有至少两个区域，所述各区域具有1至约5个邻近的各自具有式II的四氢吡喃核苷类似物，其中，四氢吡喃核苷类似物的一个区域位于5-端，而四氢吡喃核苷类似物的另一个区域位于3-端，且其中所述四氢吡喃核苷类似物的两个区域通过包含约6至约14个独立地选自核苷、修饰的核苷和四氢吡喃核苷类似物的单体亚单元的内部区域隔开。在某些实施方案中，所述内部区域中的各单体亚单元是β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约6至约14个β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约10至约12个β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，四氢吡喃核苷类似物的各区域独立地包含2至约3个四氢吡喃核苷类似物。在某些实施方案中，四氢吡喃核苷类似物的各区域独立地包含2个四氢吡喃核苷类似物。在某些实施方案中，所述内部区域包含10个β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含10个β-D-2-脱氧核糖核苷且各四氢吡喃核苷类似物具有以下结构式和构型：

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其包含有缺口的基序，所述基序具有至少两个区域，所述各区域具有1至约5个邻近的各自具有式II的四氢吡喃核苷类似物，其中，四氢吡喃核苷类似物的一个区域位于5-端，而四氢吡喃核苷类似物的另一个区域位于3-端，所述两个区域的四氢吡喃核苷类似物通过包含约6至约14个独立地选自核苷、修饰的核苷和四氢吡喃核苷类似物的单体亚单元的内部区域隔开，且所述寡聚化合物还包含3-末端基团。在某些实施方案中，所述3-末端基团包含1至约4个修饰的或未修饰的核苷。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其中，各寡聚化合物包含至少一个式II的四氢吡喃核苷类似物，其在长度上包含约10至约21个核苷和/或核苷类似物。在某些实施方案中，各寡聚化合物包含至少一个式II的四氢吡喃核苷类似物，其在长度上包含约10至约16个核苷和/或核苷类似物。在某些实施方案中，各寡聚化合物包含至少一个式II的四氢吡喃核苷类似物，其在长度上包含约10至约14个核苷和/或核苷类似物。

在某些实施方案中，提供了减少靶信使RNA的方法，所述方法包括将一种或多种细胞、组织或动物与一种寡聚化合物接触，所述寡聚化合物包含至少一个式II的四氢吡喃核苷类似物。

在某些实施方案中，提供了减少靶信使RNA的方法，所述方法包括将一种或多种细胞、组织或动物与一种寡聚化合物接触，所述寡聚化合物包含至少一个式III的四氢吡喃核苷类似物：

其中：

Bx是杂环碱基部分；

q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自独立地是H、C₁-C₆烷基、取代的C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、取代的C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、或取代的C₂-C₆炔基；

各R₃和R₄独立地是H、羟基、氟、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基；

在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H，且R₃是H。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H，R₃是H，且R₄是OCH₃。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H，R₃是H，且R₄是氟。在某些实施方案中，q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H，R₃是H，且R₄是羟基。

在某些实施方案中，用于所述方法的各寡聚化合物中的各四氢吡喃核苷类似物具有以下结构式和构型：

其中：

Bx是杂环碱基部分；

各R₃和R₄独立地是H、羟基、氟、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷基或取代的 C₁-C₆烷基；和

在某些实施方案中，用于所述方法的寡聚化合物包含有缺口的基序，其中四氢吡喃核苷类似物的一个外部区域位于5-端，而四氢吡喃核苷类似物的第二个外部区域位于3-端，其中，所述两个外部区域通过包含约6至约14个独立地选自核苷、修饰的核苷和四氢吡喃核苷类似物的单体亚单元的内部区域隔开。

在某些实施方案中，实质上，所述内部区域中的各单体亚单元是β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约6至约14个β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，所述内部区域包含约10至约12个β-D-2-脱氧核糖核苷。在某些实施方案中，各外部区域独立地包含2至约3个四氢吡喃核苷类似物。在某些实施方案中，各外部区域独立地包含2个四氢吡喃核苷类似物。在某些实施方案中，所述内部区域包含10个β-D-2-脱氧核糖核苷。

在某些实施方案中，用于本发明方法的各四氢吡喃核苷类似物具有以下结构式和构型：

其中：

Bx是杂环碱基部分；

T₃和T₄各自独立地为：将四氢吡喃核苷类似物连接到寡聚化合物的核苷间连接基团；或者T₃和T₄中的一个是将四氢吡喃核苷类似物连接到寡聚化合物的核苷间连接基团，且T₃和T₄中的另一个是H、保护基、连接的共轭基团、或者5或3-末端基团；和

R₄是羟基、氟或OCH₃。

在某些实施方案中，R₄是羟基。在某些实施方案中，R₄是OCH₃。在某些实施方案中，R₄是氟。

发明详述

本发明提供了四氢吡喃核苷类似物、包含这种类似物的寡聚化合物以及使用该寡聚化合物的方法。本发明还包括了制备该四氢吡喃核苷类似物和寡聚化合物的中间体和方法。所述四氢吡喃核苷类似物各自具有包含四氢呋喃环的核心结构。与氧原子侧翼的两个碳原子之一相连的为能够形成核苷间键的第一基团，而与另一侧翼碳原子(从氧原子上除去的碳原子)相邻的碳原子相连的为杂环碱基部分。所述杂环碱基部分可任选被基团取代以增强其对诸如核酸靶之类第二链中的互补碱基的亲和力。在某些实施方案中，所述四氢吡喃核苷类似物在离环氧原子最远的碳上还包含至少一个与杂环碱基相邻的氟原子。具有所述氟原子的碳原子可被进一步取代或不被取代。

在某些实施方案中，所述四氢吡喃核苷类似物具有式XVI：

其中：Bx是杂环碱基部分；T₅是羟基保护基；L₁是H、卤素、C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基；Z₁是O^-或OE₁；Z₂是OH、OE₁或N(E₁)(E₂)；E₁和E₂各自独立地为烷基或取代的烷基；q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自独立地为：H，C₁-C₆烷基、取代的C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、取代的C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基或取代的C₂-C₆炔基；其中各取代的基团包含一个或多个独立地选自下组的任选被保护的取代基：卤素、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、OC(=X)J₁、OC(=X)NJ₁J₂和CN，其中，各J₁、J₂和J₃独立地是H或C₁-C₆烷基，且X为O、S或NJ₁。

在某些实施方案中，所述四氢吡喃核苷类似物具有式XVII的构型：

在某些实施方案中，式XVII的四氢吡喃核苷类似物被进一步定义，其中：q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自是H；Bx是尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、腺嘌呤或鸟嘌呤；T₅是4,4’-二甲氧基三苯甲基；Z₁是O(CH₂)₂CN；和Z₂是N[CH(CH₃)₂]₂。

在某些实施方案中，本发明提供的寡聚化合物包含至少一个式X的四氢吡喃核苷类似物：

其中，所述至少一个式X的四氢吡喃核苷类似物各自独立地满足：Bx是杂环碱基部分；T₃和T₄各自独立地为：将四氢吡喃核苷类似物连接到寡聚化合物的核苷间连接基团，或者T₃和T₄中的一个是将四氢吡喃核苷类似物连接到寡聚化合物的核苷间连接基团，且T₃和T₄中的另一个是H、羟基保护基、连接的共轭基团、或者5或3-末端基团；q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自独立地为：H、C₁-C₆烷基、取代的C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、取代的C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基或取代的C₂-C₆炔基；R₁和R₂中的一个为氟，而R₁和R₂中的另一个是H、卤素、C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基；各取代的基团包含一个或多个独立地选自下组的任选被保护的取代基：卤素、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、OC(＝X)J₁、OC(＝X)NJ₁J₂、NJ₃C(＝X)NJ₁J₂和CN，其中，X是O、S或NJ₁，且J₁、J₂和J₃各自独立地是H或C₁-C₆烷基；和其中所述寡聚化合物包含约8至约40个通过核苷间连接基团连接的单体亚单元，且至少一个核苷间连接基团是硫代磷酸酯核苷间连接基团。

在某些实施方案中，本发明提供的寡聚化合物各自包含至少一个式XI的四氢吡喃核苷类似物：

在某些实施方案中，本发明提供的各寡聚化合物中的四氢吡喃核苷类似物各自具有式XII：

在某些实施方案中，本发明提供的寡聚化合物包含至少两个式XIII的四氢吡喃核苷类似物：

其中，式XIII的四氢吡喃核苷类似物各自独立地满足：Bx是杂环碱基部分；T₃和T₄各自独立地为：将四氢吡喃核苷类似物连接到寡聚化合物的核苷间连接基团，或者T₃和T₄中的一个是将四氢吡喃核苷类似物连接到寡聚化合物的核苷间连接基团，且T₃和T₄中的另一个是H、羟基保护基、连接的共轭基团、或者5或3-末端基团；q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自独立地为：H、C₁-C₆烷基、取代的C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、取代的C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基或取代的C₂-C₆炔基；R₃和R₄各自独立地为：H，羟基、卤素、C₁-C₆烷基、取代的C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基或取代的C₁-C₆烷氧基；各取代的基团包含一个或多个独立地选自下组的任选被保护的取代基：卤素、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、OC(＝X)J₁、OC(＝X)NJ₁J₂、NJ₃C(＝X)NJ₁J₂和CN，其中，X是O、S或NJ₁，且J₁、J₂和J₃各自独立地是H或C₁-C₆烷基；其中所述寡聚化合物包含约8至约40个单体亚单元；和至少两个式XIII的四氢吡喃核苷类似物通过硫代磷酸酯核苷间连接基团连接。

在某些实施方案中，本发明提供的寡聚化合物包含至少两个式XIII的四氢吡喃核苷类似物，其中各四氢吡喃核苷类似物还具有式XIV的构型：

在某些实施方案中，本发明提供的寡聚化合物包含至少两个式XIII的四氢吡喃核苷类似物，其中，至少一个四氢吡喃核苷类似物具有式XV：

其中：Bx是杂环碱基部分；且R₅是H、OCH₃或F。

在某些实施方案中，提供了方法，其包括将动物细胞与一种或多种本发明所述的寡聚化合物接触。在某些实施方案中，所述细胞是人细胞。

在某些实施方案中，提供了具有式I的四氢吡喃核苷类似物：

其中：

Bx是杂环碱基部分；

T₁和T₂中的一个是H或羟基保护基，且T₁和T₂中的另一个是H、羟基保护基或反应性磷基团；

q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自独立地为：H、C₁-C₆烷基、取代的C₁-C₆ 烷基、C₂-C₆烯基、取代的C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基或取代的C₂-C₆炔基；

R₁和R₂中的一个为氟，而R₁和R₂中的另一个是H、卤素、C₁-C₆烷基或取代的C-C₆烷基；和

在某些实施方案中，提供了具有如式Ia所示构型的四氢吡喃核苷：

其中所述构型已经定义，但变量的定义与上述式I相同。

在某些实施方案中，提供了具有式II的四氢吡喃核苷：

其中：

Bx是杂环碱基部分。

在某些实施方案中，提供了包含至少一个式III的四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物：

Bx是杂环碱基部分；

其中所述寡聚化合物包含约8至约40单体亚单元。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其中式III的各四氢吡喃核苷类似物具有下式IIIa所示构型：

其中所述构型已经定义，但变量的定义与上述式III相同。

其中：

Bx是杂环碱基部分。

在某些实施方案中，提供的寡聚化合物具有至少两个邻近的式V的四氢吡喃核苷类似物：

其中，式V的所述四氢吡喃核苷类似物各自独立地满足：

Bx是杂环碱基部分；

各取代的基团包含一个或多个独立地选自下组的任选被保护的取代基：卤素、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、OC(＝X)J₁、OC(＝X)NJ₁J₂、NJ₃C(＝X)NJ₁J₂和CN，其中，各J₁、J₂和J₃独立地是H或C₁-C₆烷基，且X为O、S或NJ₁；

所述寡聚化合物包含约8至约40个单体亚单元；和

其中所述至少两个邻近的四氢吡喃核苷类似物中的至少两个通过除磷酸二酯核苷间连接基团之外的核苷间连接基团连接。

在某些实施方案中，提供了寡聚化合物，其具有至少两个邻近的式Va的四氢吡喃核苷类似物：

其中所述构型已经定义，但变量的定义与上述式V相同，且其中的各寡聚化合物包含约8至约40个单体亚单元；和，

其中对各寡聚化合物而言，至少两个四氢吡喃核苷类似物通过除磷酸二酯核苷间连接基团之外的核苷间连接基团连接。

在某些实施方案中，提供的寡聚化合物具有至少两个邻近的式Vb的四氢吡喃核苷类似物：

其中：

Bx是杂环碱基部分；

R₄是H、羟基、氟或OCH₃。

在某些实施方案中，提供了使用该寡聚化合物的方法，所述方法包括将动物细胞与寡聚化合物接触，所述寡聚化合物包含至少一个式V的四氢吡喃核苷类似物：

Bx是杂环碱基部分；

一方面，提供的方法包括将细胞与寡聚化合物接触，所述寡聚化合物包含至少两个邻近的式V的四氢吡喃核苷类似物：

其中，所述式V的四氢吡喃核苷类似物各自独立地满足：

Bx是杂环碱基部分；

在某些实施方案中，提供了方法，其包括将一种或多种细胞、组织或动物与一种寡聚化合物接触，所述化合物包含至少一个式V的四氢吡喃核苷类似物：

其中：

Bx是杂环碱基部分；

在某些实施方案中，当细胞在人体内且所述靶RNA是mRNA时进行该方法。

能够形成核苷间键的基团是可变的。在某些实施方案中，能够形成核苷间键的基团包括任选被保护的伯醇和仲醇以及反应性磷基团。在某些实施方案中，一种能够形成核苷间键的基团是任选被保护的羟基亚甲基，而另一基团是任选被保护的羟基或反应性磷基团。

将两种不同的四氢吡喃核苷类似物结合至2/10/2缺口寡聚化合物的侧翼中并与侧翼中具有2-O-MOE修饰核苷的2/10/2缺口寡聚化合物进行比较。在每个寡聚化合物中，缺口中的10个核苷各自为β-D-2-脱氧核糖核苷，侧翼一致经过修饰，且各核苷间键是硫代磷酸酯。评价所述缺口寡聚化合物在体外和体内抑制PTEN的能力。四氢吡喃核苷类似物和2-O-MOE修饰核苷的结构式和构型如下所示：

与2-O-MOE修饰核苷相比，具有3-O-CH₃和3-F四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物被证实具有增强的体外和体内活性，且与未处理对照相比，3-F被证实具有最高降低水平(见实施例31和33)。修饰的结合亲和力(Tm：2-O-MOE＞3-F＞3-O-CH₃)未能预见到结合了3-O-CH₃或3-F的四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物具有增强的体外活性。与具有2-O-MOE修饰核苷的寡聚化合物相比，具有3-O-CH₃或3-F的四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物分别具有较低的Tm。

基于之前公开的体外数据也未能预测出该活性水平。根据公开的美国专利申请US 2004/0033967，测定了具有一致3-H四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物对RNA的Tm。在均一的3-H寡聚化合物中结合的各3-O-CH₃四氢吡喃核苷类似物使RNA的Tm升高了0.4℃/次修饰

之前曾经报道(Kang等，Nucleic Acids Research，2004，32(14)，4411-4419)，将在侧翼中具有磷酸二酯连接的3-H四氢吡喃核苷类似物、并在缺口中具有硫代磷酸酯连接的β-D-2-脱氧核糖核苷的有缺口的寡聚化合物的活性与具有完全硫代磷酸酯核苷间键并在侧翼中具有2-O-MOE修饰核苷的有缺口的相似寡聚化合物的活性进行了比较。报道称，具有3-H四氢吡喃核苷类似物的缺口聚合物(gapmer)显示出的体外活性与MOE缺口聚合物类似。报道还称，具有3-H四氢吡喃核苷类似物的缺口聚合物在更高浓度下显示出毒性(Kang，同上)。Kang等提出，从脱氧核糖核苷酸缺口区段中除去硫代磷酸酯核苷间键可能会降低观察到的细胞毒性同时维持所需的核酸酶耐性和靶结合。

本发明报道的在缺口中具有β-D-2-脱氧核糖核苷并在侧翼中具有3-OCH₃或3-F四氢吡喃核苷类似物的有缺口的寡聚化合物(完整硫代磷酸酯连接的缺口聚合物)的体外数据与在侧翼中具有2-O-MOE核苷的缺口聚合物相比显示了轻微提升的活性。2-O-MOE缺口聚合物的IC₅₀为37，相比之下，具有3-O-CH和3-F四氢吡喃核苷类似物的缺口聚合物的IC₅₀分别为23和16。由于这些四氢吡喃核苷类似物中每一种的结构和Tm数据都与Kang报道的3-H核苷类似物类似，因此各四氢吡喃核苷类似物的IC₅₀低于2-O-MOE寡聚物是出乎意料的。

除了与2-O-MOE缺口聚合物相比具有更高的体外活性，在侧翼中具有3-F或3-OCH₃四氢吡喃核苷类似物并在缺口中具有β-D-2-脱氧核糖核苷的缺口聚合物在更高研究剂量时所显示出的体内功效也是这些化合物的Tm或体外活性无法预料的。与2-O-MOE缺口聚合物相比，3-O-CH₃缺口聚合物显示功效升高两倍，而3-F缺口聚合物显示功效升高8倍。

与具有含有4-CH₂-O-2桥糖的锁核苷的有缺口的寡聚化合物相比，同样出乎意料的是具有3-F四氢吡喃核苷类似物的有缺口的寡聚化合物的体外和体内活性水平。具有这些基序的有缺口的寡聚化合物(实施例32和35)显示出非常高的体外和体内活性水平，且在各次研究中，两种化合物的水平实质上是相等的。如本发明所示，对于具有锁核苷的有缺口的寡聚化合物，互补RNA的Tm为60.5℃，而对于具有3-F四氢吡喃修饰的核苷类似物的有缺口的寡聚化合物为52.6(对于侧翼2/10/2基序单体上有/没有5-CH₃基团的寡聚化合物为50.7)。这与具有含有4-CH₂-O-2桥糖的锁核苷的寡聚化合物之间有8-10℃的差异。基于8-10℃的Tm差异无法预料侧翼中具有3-F四氢吡喃核苷类似物和含有4-CH₂-O-2桥糖的锁核苷的寡聚化合物的体外和体内活性水平。

除了具有增强的活性，如体内实验所证实，与锁核苷相比，四氢吡喃核苷类似物还显示出较低毒性。在具有4-CH₂-O-2桥的锁核苷的高剂量组中，ALT和AST水平急剧升高(实施例35)。对于具有选定的四氢吡喃核苷类似物的不同的有缺口的寡聚化合物(2/10/2和2/14/2基序)而言，ALT和AST未显示出显著升高。

除了具有增强的活性，预计四氢吡喃核苷类似物还可用于增强将其结合其中的寡聚化合物的所希望的性质例如核酸酶耐性。预计包含这些四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物还可用作各种诊断应用中的引物和探针。

在某些实施方案中，四氢吡喃核苷类似物可用于在一个或多个位置修饰寡聚化合物。这些修饰的寡聚化合物可具有特定基序。在某些实施方案中，所述基序包括但不限于：有缺口的基序、半体基序、嵌段物基序、完全修饰的基序、特定位置修饰的基序以及交替基序。与这些基序结合，还可使用各种键，其中包括但不限于一致地或组合使用的磷酸二酯键和硫代磷酸酯键。四氢吡喃核苷类似物的定位以及键策略的应用可方便地优化以增强对于选定靶的活性。可通过加入5或3-末端基团(诸如共轭基团)来进一步修饰这种基序。

术语“基序”表示核苷在寡聚化合物中的模式。该模式通过具有未修饰的(β-D-核糖核苷和/或β-D-2-脱氧核糖核苷)和/或修饰的糖基的核苷在寡聚化合物中的位置来描述。用于各个位置的杂环碱基和核苷间键的类型是可变的，且不是决定寡聚化合物基序的因素。一种或多种其它基团(包括但不限于加帽基团和共轭基团)的存在也不适决定基序的因素。

教导了代表性基序的制备的代表性美国专利包括但不限于：5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；和5,700,922，其中的一些为本申请人所有，各申请作为参考完整并入本发明。基序还描述于2005年6月2日提交的国际申请PCT/US2005/019219(该申请于2005年12月22日作为WO 2005/121371公开)以及2005年6月2日提交的PCT/US2005/019220(该申请于2005年12月22日作为WO 2005/121372公开)；它们各自作为参考并入本发明。

本发明中使用的术语“交替基序”意在包括核苷的邻近序列，其包含在寡聚化合物的几乎整体序列上交替排列的两种不同单体亚单元。交替模式可通过下式描述：5-A(-L-B-L-A)_n(-L-B)_nn-3，其中各A或各B之一是四氢吡喃核苷类似物，而各A或B中的另一个是除四氢吡喃核苷之外的单体亚单元，各L是核苷间连接基团，nn是0或1，且n是约4至约12。这样允许交替寡聚化合物的长度为约9至约26个单体亚单元。该长度范围并非是限制性的，更长和更短的寡聚化合物也可用于本发明中。该式还允许奇数和偶数长度的交替寡聚化合物。

在某些实施方案中，各A或B中的另一个选自β-D-核糖核苷、2-修饰的核苷、4-硫代修饰的核苷、4-硫代-2-修饰的核苷、二环糖修饰的核苷以及其它修饰核苷。交替基序不由核碱基序列或核苷间键决定。

本发明中使用的术语“完全修饰的基序”意在包括单体亚单元的邻近序列，所述单体亚单元具有相同的糖或糖替代物基团。在某些实施方案中，完全修饰的基序包括四氢吡喃核苷类似物的邻近序列。在某些实施方案中，3和5-末端包括未修饰的核苷。

本发明中使用的术语“半体基序”意在包括寡聚化合物，其具有一种类型单体亚单元的邻近序列，并在末端之一具有第二种类型的单体亚单元的邻近序列。所述两种类型的单体亚单元在组成核苷的糖或糖替代物基团上不同，与使用的碱基和键的类型无关。糖替代物基团包括除核糖类型的糖以外的物质，如本发明所述的四氢吡喃核苷类似物，其中，四氢呋喃环用来代替核糖环。在某些实施方案中，糖替代物基团是包含四氢吡喃核苷类似物的四氢吡喃部分。在某些实施方案中，半体基序包括约10至约28个一种类型单体亚单元的邻近序列并在末端之一有1-5个或2-5个第二种类型单体亚单元。在某些实施方案中，半体是约8至约20个β-D-2-脱氧核糖核苷的邻近序列，其在末端之一具有1-12个邻近的四氢吡喃核苷类似物。在某些实施方案中，在某些实施方案中，半体是约8至约20个β-D-2-脱氧核糖核苷的邻近序列，其在末端之一具有1-5个邻近的四氢吡喃核苷类似物。在某些实施方案中，半体是约12至约18个β-D-2-脱氧核糖核苷的邻近序列，其在末端之一具有1-3个邻近的四氢吡喃核苷类似物。

本发明所使用的术语“嵌段物基序”意在包括寡聚化合物，其具有一种类型的单体亚单元的邻近序列，并在其内部具有第二种类型的单体亚单元的邻近序列。两种类型的单体亚单元在组成核苷的糖或糖替代物基团上不同，并与使用的碱基和键的类型无关。嵌段物在定义上可能会与缺口聚合物部分重叠，但在嵌段物中通常只有嵌段中的单体亚单元是修饰的，而在缺口聚合物中只有外部区域内的单体亚单元是修饰的。在某些实施方案中，嵌段物在整个寡聚化合物中未被嵌段占据的位置上可具有其它类型的修饰的单体亚单元。

本发明中使用的术语“特定位置修饰的基序”意在包括一种类型的单体亚单元的序列，该序列被两个或多个具有1至约5个修饰的一种类型的单体亚单元的区域打断。在某些实施方案中，特定位置修饰的寡聚化合物是具有8至20个β-D-2-脱氧核糖核苷的序列，该序列进一步包括两个或三个各自具有2至约5个邻近的四氢吡喃核苷的区域。特定位置修饰的寡聚化合物明显不同于有缺口的基序、半体基序、嵌段物基序和交替基序，这是由于由任何位置基序定义的区域取代模式不是由这些其它基序所定义的。特定位置修饰的基序不由核碱基序列或者核苷间键的位置或类型决定。术语“特定位置修饰的寡聚化合物”包括许多不同的特异性取代模式。

本发明中使用的术语“缺口聚合物(gapmer)”或“有缺口的寡聚化合物”意在包括分成以下3个区域的核苷邻近序列：内部区域以及其5和3端的外部区域。各区域至少通过具有不同的组成核苷的糖或糖替代物基团而相互区别。在某些实施方案中，外部区域各自独立地为：1至约5个修饰的核苷，而内部区域为6至18个核苷。通常用来区分有缺口的寡聚化合物各个区域的核苷的类型包括，但不限于：β-D-核糖核苷、β-D-2-脱氧核糖核苷、2-修饰的核苷、4-硫代修饰的核苷、4-硫代-2-修饰的核苷、二环糖修饰的核苷以及含有糖替代物的核苷，例如四氢吡喃核苷类似物。有缺口的寡聚化合物的各个区域基本上是统一修饰的，例如，糖或糖替代物基团是相同的，但至少内部区域具有不同于各外部区域的糖基。内部区域或缺口通常包含β-D-2-脱氧核糖核苷，但也可以是糖修饰的核苷的序列。

在某些实施方案中，如本发明所述，有缺口的寡聚化合物包含β-D-2-脱氧核糖核苷的内部区域和一个包含四氢吡喃核苷类似物的外部区域。在某些实施方案中，如本发明所述，有缺口的寡聚化合物包含β-D-2-脱氧核糖核苷的内部区域和两个包含四氢吡喃核苷类似物的外部区域。在某些实施方案中，有缺口的寡聚化合物包含β-D-2-脱氧核糖核苷的内部区域和两个包含式II所示四氢吡喃核苷类似物的外部区域。有缺口的基序的其它例子示于实施例32和35中，其中，包含14个核苷的寡聚化合物在其3和5各末端上具有2个二环核苷并在内部区域内包含10个未修饰的β-D-2-脱氧核糖核苷。该寡聚化合物具有有缺口的基序，其中，二环核苷的末端外部区域被认为是侧翼，而β-D-2-脱氧核糖核苷内部区域被认为是缺口。

在某些实施方案中，提供了有缺口的寡聚化合物，其包含位于5-端的一个或两个四氢吡喃核苷类似物，位于3-端的两个或三个四氢吡喃核苷类似物，以及具有10-16个核苷的内部区域。在某些实施方案中，提供了有缺口的寡聚化合物，其包含位于5-端的一个四氢吡喃核苷类似物，位于3-端的两个四氢吡喃核苷类似物，以及具有10-16个核苷的内部区域。在某些实施方案中，提供了有缺口的寡聚化合物，其包含位于5-端的一个四氢吡喃核苷类似物，位于3-端的两个四氢吡喃核苷类似物，以及具有10-14个核苷的内部区域。在某些实施方案中，内部区域基本上是β-D-2-脱氧核糖核苷的邻近序列。在另一实施方案中，提供了寡聚化合物，其还包含，但不限于，一个或多个5或3-末端基团，如进一步修饰的或未修饰的核苷、连接的共轭基团以及本领域技术人员已知的其它基团。

在某些实施方案中，提供的有缺口的寡聚化合物长度为约10至约21个核苷。在另一实施方案中，提供的有缺口的寡聚化合物长度为约12至约16个核苷。在进一步的实施方案中，提供的有缺口的寡聚化合物长度为约12至约14个核苷。

一方面，提供了包含具有式III的四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物。另一方面，提供了包含具有式IIIa的四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物。另一方面，提供了包含具有式IV的四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物。另一方面，提供了包含具有式V的四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物。另一方面，提供了包含具有式Va的四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物。另一方面，提供了包含具有式Vb的四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物。

本发明使用的术语“取代基”和“取代基团”意在包括通常加至其它基团或母体化合物以增强所需特性或得到所需效果的基团。取代基可以被保护或未被保护，并且可被加至母体化合物中的一个或多个可用位点。取代基也可被其它取代基进一步取代并且可直接或通过如烷基或烃基等连接基团结合到母体化合物。这些基团包括但不限于：卤素、羟基、烷基、烯基、炔基、酰基(-C(O)R_aa)、羧基(-C(O)O-R_aa)、脂肪基、脂环基、烷氧基、取代的氧基(-O-R_aa)、芳基、芳烷基、杂环基、杂芳基、杂芳基烷基、氨基(-NR_bbR_cc)、亚氨基(＝NR_bb)、酰氨基(-C(O)NR_bbR_cc或-N(R_bb)C(O)R_aa)、叠氮基(-N₃)、硝基(-NO₂)、氰基(-CN)、脲基(-OC(O)NR_bbR_cc或-N(R_bb)C(O)OR_aa)、脲基(-N(R_bb)C(O)NR_bbR_cc)、硫代脲基(-N(R_bb)C(S)NR_bbR_cc)、胍基(-N(R_bb)C(＝NR_bb)NR_bbR_cc)、脒基(-C(＝NR_bb)NR_bbR_cc或-N(R_bb)C(NR_bb)R_aa)、硫醇(-SR_bb)、亚磺酰基(-S(O)R_bb)、磺酰基(-S(O)₂R_bb)、磺酰胺基(-S(O)₂NR_bbR_cc或-N(R_bb)S(O)₂R_bb)和共轭基团，其中，各R_aa、R_bb和R_cc独立地是H、任选连接的化学官能团或进一步的取代基，其优选列表包括但不限于：H、烷基、烯基、炔基、脂肪基、烷氧基、酰基、芳基、芳烷基、杂芳基、脂环基、杂环和杂芳基烷基。本发明所述化合物中选择的取代基以循环程度出现。

本发明中，“循环取代基(recursive substituent)”表示取代基可引入另一个自身。由于这些取代基的循环特性，理论上，任意给定的取代基可能存在很大数目。药物化学和有机化学领域的普通技术人员能够理解这些取代基的总数目受到化合物所需特性的合理限制。这种特性包括，例如但不限于：物理特性(例如分子量、溶解度或log P)、应用性质(如对目的靶的活性)、以及实践特性(如合成的难易度)。

循环取代基是本发明的一个方面。药物化学和有机化学领域的普通技术人员理解这些取代基的多能性。至于循环取代基在本发明权利要求中的存在程度，其总数将如上所述来确定。

本发明中使用的术语“烷基”表示含有至多达24个碳原子的饱和的直链或支链烃残基。烷基的例子包括但不限于：甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、正己基、辛基、癸基、十二烷基等。烷基通常包含1至约24个碳原子，更通常为1至约12个碳原子(C₁-C₁₂烷基)，更优选为1至约6个碳原子。本发明中使用的术语“低级烷基”包含1至约6个碳原子。本发明中使用的烷基可任选包含一个或多个其它取代基团。

本发明中使用的术语“烯基”指含有最多达24个碳原子并具有至少一个碳碳双键的直链或支链烃链残基。烯基的例子包括但不限于：乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基、二烯如1，3-丁二烯等等。烯基通常包含2至约24个碳原子，更通常为2至约12个碳原子，更优选为2至约6个碳原子。烯基在文中可任选包含一个或多个其它取代基团。

本发明中使用的术语“炔基”表示含有至多达24个碳原子并具有至少一个碳碳三键的直链或支链烃残基。炔基的例子包括但不限于：乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基等等。炔基通常包含2至约24个碳原子，更通常为2至约12个碳原子，更优选为2至约6个碳原子。本发明中使用的炔基可任选包含一个或多个其它取代基团。

本发明中使用的术语“酰基”表示除去有机酸上的羟基而形成的具有通式-C(O)-X的残基，其中X通常是脂肪基、脂环基或芳基。例子包括脂肪族羰基、芳族羰基、脂肪族磺酰基、芳族亚磺酰基、脂肪族亚磺酰基、芳族磷酸酯基、脂肪族磷酸酯基等等。本发明中使用的酰基可任选包含其它取代基团。

术语“脂环的”或“脂环基”是指环系统，其中所述环是脂肪族的。环系统可包含一个或多个环，其中至少一个环是脂肪族的。优选的脂环基包括环内具有约5至约9个碳原子的环。脂环基在文中可任选包含其它取代基团。

本发明中使用的术语“脂肪族的”表示含有至多达24个碳原子的直链或支链烃残基，其中，任意两个碳原子之间的饱和度是单键、双键或三键。脂肪族基团优选含有1至约24个碳原子、更通常为1至约12个碳原子、更优选为1至约6个碳原子。脂肪族基团的直链或支链可被一个或多个杂原子间断，其中包括氮、氧、硫和磷。这种被杂原子间断的脂肪族基团包括但不限于聚烷氧基类，如聚亚烷基二醇、聚胺和聚亚胺。本发明中使用的脂肪族基团可任选包含其它取代基团。

本发明中使用的术语“烷氧基”表示在烷基和氧原子之间形成的残基，其中所述氧原子用来将烷氧基连接到母体分子。烷氧基的例子包括但不限于：甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、新戊氧基、正己氧基等等。本发明中使用的烷氧基在文中可任选包含其它取代基团。

本发明中使用的术语“氨基烷基”表示氨基取代的烷基残基。该术语的含义包括在任意位置包括具有氨基取代基的C₁-C₁₂烷基，且其中烷基将氨基烷基基团连接到母体分子。氨基烷基基团的烷基和/或氨基部分可被取代基进一步取代。

术语“芳烷基”和“芳基烷基”在文中指在烷基和芳基之间形成的残基，其中，烷基用来将芳烷基连接到母体分子。实施例包括但不限于：苄基、苯乙基等等。本发明中使用的芳烷基可任选包含与烷基、芳基或两种基团相连以形成残基的其它取代基团。

本发明中使用的术语“芳基”和“芳香的”表示具有一个或多个芳环的单环或多环碳环系统。芳基的例子包括但不限于：苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基(idenyl)等。优选的芳基环系统在一个或多个环上具有约5至约20个碳原子。本发明中使用的芳基可任选包含其它取代基团。

本发明中使用的术语“卤代”和“卤素”表示选自氟、氯、溴和碘的原子。

本发明中使用的术语“杂芳基”和“杂芳的”表示包含单环或多环芳香环的基团、环系统、或稠环系统，其中至少一个环是芳环并包含一个或多个杂原子。杂芳基的含义还包括稠环系统，包括其中一个或多个稠环不含杂原子的系统。杂芳基通常包括一个选自硫、氮或氧的环原子。杂芳基的例子包括但不限于：吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、苯硫基、呋喃基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、喹喔啉基等等。杂芳基可直接或通过脂肪族基团或杂原子等连接部分与母体分子结合。本发明中使用的杂芳基可任选包含其它取代基团。

本发明中使用的术语“杂芳基烷基”表示如上文所定义的杂芳基，其具有可将杂芳基烷基连接于母体分子的烷基。例子包括但不限于：吡啶基甲基、嘧啶基乙基、萘啶基丙基等等。本发明中使用的杂芳基烷基可任选地在杂芳基或烷基部分的其中之一或两者上包含其它取代基团。

本发明中使用的术语“杂环基”表示包括至少一个杂原子的不饱和的、部分饱和的、或完全饱和的单环或多环的环系统，因此包括杂芳基。杂环的含义也包括稠环系统，其中，一个或多个稠环含有至少一个杂原子且其它的环可含有一个或多个杂原子或任选不含杂原子。杂环基通常含有至少一个选自硫、氮或氧的原子。杂环基的例子包括：[1，3]二氧戊环、吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基等等。杂环基在文中可任选包含其它取代基团。

术语“烃基”包括含有C、O和H的基团。包括具有任何饱和度的直链、支链、或环状基团。这些烃基可包含一个或多个选自N、O或S的杂原子并可进一步被一个或多个取代基单取代或多取代。

本发明中使用的术语“单环或多环结构”包括所有单环或多环的环系统，其具有稠合的或连接的环，其含义包括独立地选自下组的单个的和混合的环系统：脂肪基、脂环基、芳基、杂芳基、芳烷基、芳基烷基、杂环基、杂芳基、杂芳基、杂芳基烷基。这些单环和多环结构可含有一致的环或具有不同饱和度的环，包括完全饱和的、部分饱和的、或完全不饱和的。各环可包含选自C、N、O和S的环原子以得到杂环以及仅含碳环原子的环，所述环可存在于混合基序中，如苯并咪唑，其中，一个环仅具有碳环原子而稠环具有两个氮原子。单环或多环结构可被取代基进一步取代，如邻苯二甲酰亚胺，其有两个＝O基团与一个环连接。另一方面，单环或多环结构可直接地或通过环原子、通过取代基或通过双功能连接部分与母体分子相连。

术语“氧代”表示基团(＝O)。

术语“二环核酸(BNA)”和“二环核苷”表示核苷，其中所述核苷的呋喃糖部分包含连接呋喃酮环上两个碳原子的桥从而形成二环系统。

术语“二环核苷类似物”指BNA样核苷，其中所述核糖可被替代或修饰。当用于本申请时，四氢吡喃核苷类似物指四氢吡喃核苷类似物，其中所述核苷的核糖部分被四氢呋喃环代替。

术语“稳定化合物”和“稳定结构”表示足够坚固从而能够经历自反应混合物中的分离而达到有用的纯度水平并被制成有效的治疗剂的化合物。本发明仅涵盖稳定的化合物。

连接基团或双功能连接部分，如本领域已知的连接基团或双功能连接部分，可用于将化学官能团、共轭基团、报告基团和其它基团连接到母体化合物如寡聚化合物中的选择性位点上。通常，双功能连接部分包含具有两种官能团的烃基部分。选择一种官能团以连接至母体分子或目标化合物，而选择另一种官能团以主要连接任何选定基团，如化学官能团或共轭基团。在一些实施方案中，接头包括链结构或具有重复单元(如乙二醇或氨基酸单元)的寡聚物。通常用于双功能连接部分的官能团的例子包括但不限于：与亲核基团反应的亲电子试剂以及与亲电子基团反应的亲核试剂。在一些实施方案中，双官能连接部分包括氨基、羟基、羧酸、硫醇、不饱和(如双键或三键)等等。双官能连接部分的一些非限制性例子包括8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(ADO)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)以及6-氨基己酸(AHEX或AHA)。其它连接基团包括但不限于：取代的C₁-C₁₀烷基、取代或未取代的C₂-C₁₀烯基、或取代或未取代的C₂-C₁₀炔基，其中，优选的取代基的非限制性列表包括：羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。

在某些实施方案中，寡聚化合物通过共价结合一个或多个5或3-末端基团进行修饰。本发明中使用的术语“末端基团”意在包括本领域已知的有用基团，所述基团被置于寡聚化合物的3和5-端之一或两端上以实现各种目的，例如实现对寡聚化合物的示踪(荧光标记或其它报告基团)、提高寡聚化合物的药代动力学或药效学(用于增强摄取和递送的基团)、或增强寡聚化合物的一种或多种其它所需特性(改善核酸酶稳定性或结合亲和力的基团)。在某些实施方案中，3和5-末端基团包括但不限于：一个或多个修饰的或未修饰的核苷、共轭基团、加帽基团、磷酸酯部分和保护基。

在某些实施方案中，寡聚化合物通过共价结合一个或多个共轭基团进行修饰。通常，共轭基团修饰被连接的寡聚化合物的一种或多种特性，包括但不限于，药效学特性、药代动力学特性、结合特性、吸附特性、细胞分布特性、细胞摄取特性、加载和清除特性。共轭基团是化学领域通常使用的并直接或通过任选的连接部分或连接基团连接到母体化合物如寡聚化合物。共轭基团的优选列表包括但不限于：插入剂、报告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、硫醚、聚醚、胆固醇、硫代胆固醇、胆汁酸部分、叶酸、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、菲啶、蒽醌、金刚烷、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。

在某些实施方案中，寡聚化合物通过共价结合一个或多个5或3-末端基团进行修饰，所述基团包括但不限于其它修饰的或未修饰的核苷。这些末端基团可用于增强寡聚化合物的特性，如例如核酸酶稳定性、摄入和递送。

本发明使用的术语“保护基”表示不稳定的化学部分，本领域已知其可用在合成过程中保护反应性基团(包括但不限于羟基、氨基和硫醇基团)不发生不希望的反应的。保护基通常被选择性地和/或正交性地使用以在其它反应性位点反应期间保护某些位点并且然后可被除去而留下未保护的基团维持原样或参与进一步的反应。如本领域已知，保护基通常描述于Greene和Wuts的Protective Groups in Organic Synthesis，第三版，John Wiley & Sons，纽约(1999)。

基团可被选择性结合至作为前体的本发明的寡聚化合物。例如，氨基可作为叠氮基团放入本发明化合物中，该基团能够在合成中希望的时间点化学转变成氨基。通常，基团被保护或作为前体存在，这将使它们对修饰母体分子其它区域的反应无活性并在合适的时刻转变为它们的最终基团。其它的典型保护基团或前体基团描述于Agrawal等，Protocols for OligonucleotideConjugates，Humana Press；新泽西，1994；第26卷，1-72页。

羟基保护基的例子包括但不限于：乙酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、对-氯苯基、2，4-二硝基苯基、苄基、2，6-二氯苄基、二苯基甲基、对-硝基苄基、双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、2-三甲基甲硅烷基乙基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、[(三异丙基甲硅烷基)氧基]甲基(TOM)、苯甲酰甲酸酯基、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰基、苯甲酰基、对-苯基苯甲酰基、9-芴基甲基碳酸酯基、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、三苯基甲基(三苯甲基)、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基(DMT)、三甲氧基三苯甲基、1(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(FPMP)、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(对-甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。其中，更优选的羟基保护基包括但不限于：苄基、2，6-二氯苄基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、苯甲酰基、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、二甲氧基三苯甲基(DMT)、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(对-甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。

氨基保护基的例子包括但不限于：氨基甲酸酯-保护基，例如2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基(Teoc)、1-甲基-1-(4-联苯基)乙氧基羰基(Bpoc)、叔丁氧基羰基(BOC)、烯丙氧基羰基(Alloc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、以及苄氧基羰基(Cbz)；酰胺保护基，例如甲酰基、乙酰基、三卤乙酰基、苯甲酰基和硝基苯基乙酰基；磺酰胺-保护基，例如2-硝基苯磺酰基；和亚胺保护基以及环亚胺保护基，如苯二甲酰亚氨基和二硫代琥珀酰基(dithiasuccinoyl)。硫醇保护基的例子包括但不限于：三苯基甲基(三苯甲基)、苄基(Bn)等。

在某些实施方案中，寡聚化合物通过将核苷与任选被保护的含磷核苷间键相连来制备。含磷核苷间键(例如磷酸二酯键和硫代磷酸酯键)的典型保护基包括：β-氰基乙基、二苯基甲硅烷基乙基、δ-氰基丁烯基、氰基对-二甲苯基(CPX)、N-甲基-N-三氟乙酰基乙基(META)、乙酰氧基苯氧基乙基(APE)、和丁烯-4-基。参见例如美国专利4,725,677和再公告专利34,069(β-氰基乙基)；Beaucage，S.L.和Iyer，R.P.，Tetrahedron，49，10，第1925-1963页(1993)；Beaucage，S.L.和Iyer，R.P.，Tetrahedron，49，46，第10441-10488页(1993)；Beaucage，S.L.和Iyer，R.P.，Tetrahedron，48，12，第2223-2311页(1992)。

术语“正交保护”指被不同类别的保护基保护的官能团，其中，各种类型的保护基可以以任意顺序并在所有其它类型的保护基存在下被除去(参见Barany，G.和Merrifield，R.B.，J.Am.Chem.Soc，1977，99，7363；同上，1980，102，3084)。正交保护被广泛用于例如自动寡核苷酸合成。在一个或多个不受去封闭过程影响的其它受保护的官能团的存在下将某官能团去封闭。该去封闭的官能团以某种方式反应，并在某一时刻在不同反应条件下除去其它正交保护基。这使得能够通过选择化学得到所需的化合物或寡聚化合物。

在某些实施方案中，提供了具有反应性磷基团的化合物，其能用于形成核苷间键，包括例如磷酸二酯和硫代磷酸酯。这种反应性磷基团是本领域已知的并含有P^III或P^V价态的磷原子，包括但不限于：亚磷酰胺、H-膦酸酯、磷酸三酯以及含磷的手性佐剂。优选的固相合成法利用亚磷酰胺(P^III)作为反应性亚磷酸酯。然后采用本领域已知方法将中间体亚磷酸酯化合物氧化成P^v态以得到磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷酸间键。其它的反应性磷酸酯和亚磷酸酯描述于Tetrahedron Report Number 309(Beaucage和Iyer，Tetrahedron，1992，48，2223-2311)。

本发明中使用的术语“核苷间键”意在包括本领域已知的所有形式的核苷间连接基因，包括但不限于：含磷核苷间连接基团(如磷酸二酯和硫代磷酸酯)、不含磷的核苷间连接基团(如甲酰基和亚甲基亚氨基)、以及中性非离子核苷间连接基团如酰胺-3(3-CH₂-C(＝O)-N(H)-5)、酰胺-4(3-CH₂-N(H)-C(＝O)-5)。

用于本发明的寡聚化合物的具体例子包括含有修饰的(例如非天然存在的)核苷间键的寡核苷酸。通过存在或不存在磷原子定义了两种主要类型的核苷间键。具有磷原子的修饰的核苷间键包括但不限于：硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基-磷酸三酯、甲基膦酸酯及其它烷基膦酸酯(包括3-亚烷基膦酸酯、5-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、硒基磷酸酯和硼代磷酸酯，它们具有常规的3-5键，这些寡核苷酸的2-5连接的类似物，以及那些具有反极性的寡核苷酸，其中，一个或多个核苷酸间键是3→3、5→5或2→2键。具有反极性的寡核苷酸可在最靠近3端的核苷间键处包括3→3键，即单个反转的核苷残基，其可以是脱碱基的(没有核碱基或用羟基取代核碱基)。也包括各种盐、混合盐和游离酸形式。

教导制备上述含磷键的典型美国专利包括但不限于：U.S.：3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253； 5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050，其中一些专利为本申请人所有，各专利作为参考并入本发明。

不含磷原子的修饰的核苷间键包括但不限于那些由短链烷基或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的键。其中包括具有硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰基和硫代甲酰基主链；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基主链；核糖乙酰基主链；含烯烃主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合的N、O、S和CH₂组成部分的那些。在本发明的上下文中，术语“寡核苷”表示通过不含磷原子的核苷间键连接的两个或更多核苷的序列。

教导制备上述寡核苷的典型美国专利包括但不限于：U.S.：5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，其中的一些专利为本申请人所有，各专利作为参考并入本发明。

本发明使用的术语“中性核苷间键”表示包括非离子性核苷间键。中性核苷间键包括但不限于：磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI(3-CH₂-N(CH₃)-O-5)、酰胺-3(3-CH₂-C(＝O)-N(H)-5)、酰胺-4(3-CH₂-N(H)-C(＝O)-5)、甲酰酰基(formacetal)(3-O-CH₂-O-5)和硫代甲酰基(3-S-CH₂-O-5)。其它中性核苷间键包括非离子性键，包括硅氧烷(二烷基硅氧烷)、羧酸酯、羧酰胺、硫化物、磺酸酯和酰胺(例如参见：Carbohydrate Modifications in Antisense Research；Y.S.Sanghvi和P.D.Cook编，ACS Symposium Series 580；第3和4章(第40-65 页))。其它中性核苷间键包括含有混合N、O、S和CH₂组分的非离子性键。

本发明所述的化合物可通过任何适用的有机合成技术来制备，如下面的实施例中列举的技术。许多此类技术是本领域已知的。然而，许多已知技术详细描述在Compendium of Organic Synthetic Methods(John Wiley & Sons，纽约)，第1卷，Ian T.Harrison和Shuyen Harrison(1971)；第2卷，Ian T.Harrison和Shuyen Harrison(1974)；第3卷，Louis S.Hegedus和Leroy Wade(1977)；第4卷，Leroy G.Wade Jr.，(1980)；第5卷，Leroy G.Wade Jr.(1984)；和第6卷，Michael B.Smith；以及March，J.，Advanced Organic Chemistry，第三版，John Wiley & Sons，纽约(1985)；Comprehensive Organic Synthesis.Selectivity，Strategy & Efficiency in Modern Organic Chemistry，第9卷，BarryM.Trost主编，Pergamon Press，纽约(1993)；Advanced Organic Chemistry，B部：Reactions and Synthesis，第4版；Carey和Sundberg；KluwerAcademic/Plenum Publishers：纽约(2001)；Advanced Organic Chemistry，Reactions，Mechanisms，and Structure，第2版，March，McGraw Hill(1977)；Protecting Groups in Organic Synthesis，第二版，Greene，T.W.和Wutz，P.G.M.，John Wiley & Sons，纽约(1991)；以及Comprehensive Organic Transformations，第二版，Larock，R.C.，John Wiley & Sons，纽约(1999)。

本发明所述化合物含有一个或多个不对称中心且因此能产生对映体、非对映体和其它立体异构形式，以绝对立体化学而言，例如对于氨基酸，立体异构形式可被定义为(R)-或(S)-、α或β、或者(D)-或(L)-。本发明包括所有这些可能的异构体以及它们的外消旋和光学纯化形式。光学异构体可通过上述方法或者通过拆分外消旋混合物从它们各自的光学活性前体制备。可通过层析或通过反复结晶或者通过本领域技术人员已知的这些技术的组合在存在拆分剂时进行拆分。有关拆分的进一步的细节可在Jacques等，Enantiomers，Racemates，and Resolutions(John Wiley & Sons，1981)中找到。除非另有说明，当本发明所述化合物含有烯属双键、其它不饱和度、或者其它几何不对称中心时，所述化合物将同时包括E和Z几何异构体或者顺-和反-异构体。同样，所有互变异构形式也包括在内。除非另有说明，本发明中出现的任何碳碳双键构型的选择仅出于简便的目的而并非指定某种特定构型；因此，在本发明中被随意描述成反式的碳碳双键或碳-杂原子双键可以是顺式的、反式的、或者是两者任意比例的混合物。

本发明中，术语“寡聚化合物”意在包括具有至少一个能够与核酸分子杂交的区域的聚合物。术语“寡聚化合物”包括寡核苷酸、寡核苷酸类似物和寡核苷以及核苷酸模拟物和/或含有核酸和非核酸组分的混合聚合物，以及包含来自任意这些种类的核苷混合物的嵌合寡聚化合物。四氢吡喃核苷类似物可被归类为模拟物，因为核糖部分已被四氢吡喃基团取代。寡聚化合物通常线性制备，但也可连接或者通过其它方法制成环形，并可包含分支。寡聚化合物可形成双链构建物，如两条链杂交形成双链组合物。双链组合物可连接或分离，并可在末端包含悬臂。通常，寡聚化合物包含连接的单体亚单元的主链，其中，各连接的单体亚单元直接或间接连接于杂环碱基部分。寡聚化合物也可包含未连接于杂环碱基部分的单体亚单元从而提供脱碱基位点。连接单体亚单元、糖部分或糖替代物以及杂环碱基部分的键可独立修饰。键-糖单元(可包含或不包含杂环碱基)可被模拟物取代，如肽核酸中的单体。在寡聚化合物各位点修饰或者取代部分或完整单体的能力导致产生大量可能的基序。

如本领域所知，核苷是碱基-糖组合。核苷的碱基部分通常是杂环碱基部分。最常见的两类这样的杂环碱基是嘌呤和嘧啶。核苷酸是进一步包含了磷酸基的的核苷，所述磷酸基共价连接到核苷的糖部分。对于那些包含呋喃戊糖基糖的核苷，磷酸基可连接于所述糖的2、3或5羟基部分。在形成寡核苷酸时，磷酸基将邻近的核苷彼此共价连接从而形成线性聚合物。该线性聚合结构的两端可通过杂交或通过形成共价键连接形成环状结构。然而，通常希望开放的线性结构。在寡核苷酸结构内，磷酸基通常用来指形成寡核苷酸的核苷间键。RNA和DNA的常规核苷间键是3→5磷酸二酯键。

在本发明的上下文中，术语“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚物或聚合物。该术语包括由天然核碱基、糖和共价核苷间键构成的寡核苷酸。术语“寡核苷酸类似物″指具有一个或多个非天然部分的寡核苷酸。较之天然寡核苷酸，这些非天然寡核苷酸通常是优选的，因为它们具有所希望的特性，如增加的细胞摄入、对靶核酸增强的亲和力以及在存在核酸酶时提高的稳定性。

在本发明上下文中，术语“寡核苷”指通过不含磷原子的核苷间键连接的核苷序列。这种类型的核苷间键包含短链烷基、环烷基、混合的杂原子烷基、混合的杂原子环烷基、一个或多个短链杂原子和一个或多个短链杂环。这些核苷间键包括但不限于：硅氧烷、硫化物、亚砜、砜、乙酰基、甲酰基、硫代甲酰基、亚甲基甲酰基、硫代甲酰基、烯基、氨基磺酸酯、亚甲基亚氨基、亚甲基肼基、磺酸酯、磺酰胺、酰胺以及其它具有混合的N、O、S和CH₂组分的基团。

教导上述寡核苷制备的典型美国专利包括但不限于：U.S.：5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704； 5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，其中的一些专利为本申请人所有，各专利作为参考并入本发明。本发明使用的术语“核碱基”或“杂环碱基部分”与“核酸碱基或其模拟物”同义。通常，核碱基或杂环碱基部分是含有能够与核酸碱基形成氢键的一个或多个原子或多组原子的任何亚结构。

本发明中使用的“未修饰的”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其它合成的和天然的核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟基甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基衍生物及其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基衍生物以及其它烷基衍生物，2-硫代尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基(-C≡C-CH₃)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫代尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基以及其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代(尤其是5-溴)、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤，通用碱基，疏水碱基，杂乱碱基，大小膨胀的碱基(size-expanded base)以及如本发明所定义的氟化碱基。其它的修饰的核碱基包括：三环嘧啶如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-钳例如取代的吩噁嗪胞苷(如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3，2：4，5]吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-酮)。修饰的核碱基还可以包括其中的嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环替代的核碱基，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其它核碱基包括以下文献中披露的那些：美国专利3,687,808；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science AndEngineering，第858-859页，Kroschwitz，J.I.编，John Wiley & Sons，1990；Englisch等，Angewandte Chemie，国际版，1991，30，613；以及Sanghvi，Y.S.，第15章，Antisense Research and Applications，第289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编，CRC出版社，1993。

修饰的核碱基包括但不限于：遍在碱基、疏水碱基、杂乱碱基、大小膨胀的碱基、以及如本发明所定义的氟化碱基。这些核碱基中的一些对于提高本发明寡聚化合物的结合亲和力特别有用。其中包括：5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已显示5-甲基胞嘧啶取代能提高核酸双链体稳定性0.6-1.2℃(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编，Antisense Research andApplications，CRC出版社，Boca Raton，1993，第276-278页)。

教导上述修饰的核碱基以及其它修饰的核碱基的制备的典型的美国专利包括但不限于：上述U.S.3,687,808，以及U.S.：4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,830,653；5,763,588；6,005,096；和5,681,941，其中的一些专利为本申请人所有，各专利作为参考并入本发明，以及美国专利5,750,692，该专利为本申请人所有，各专利作为参考并入本发明。

在某些实施方案中，寡聚化合物也可包含一个或多个具有修饰的糖部分的核苷。呋喃糖基糖环可通过许多方法修饰，其中包括：用取代基(2、3、4 或5)取代，桥连形成BNA，以及用S或N(R)等杂原子取代4-O。教导这些修饰的糖的制备的一些典型美国专利包括但不限于：U.S.：4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；5,700,920；6,600,032；和2005年6月2日提交并于2005年12月22日作为WO 2005/121371公布的国际专利申请PCT/US2005/019219，其中的一些为本申请人所有，各专利作为参考并入本发明。优选的修饰的糖的典型列表包括但不限于：具有2-F、2-OCH₂或2-O(CH₂)₂-OCH₃(2-MOE或简写为MOE)的取代的糖；4-硫代修饰的糖，4-硫代-2-取代的糖和二环修饰的糖。

本发明中使用的术语“核苷模拟物”意在包括那些用来在寡聚化合物的一个或多个位置代替糖或者糖和碱基而非键的结构，例如，具有吗啉的核苷模拟物或二环[3.1.0]己基糖模拟物，如具有磷酸二酯键的非呋喃糖单元。术语“糖替代物”与范围略宽的术语“核苷模拟物”有重叠，但表示仅替换糖单元(呋喃糖环)。术语“核苷酸模拟物”意在包括那些用来在寡聚化合物一个或多个位置代替核苷以和键的结构，例如肽核酸或吗啉(与-N(H)-C(＝O)-O-或其它非磷酸二酯键连接的吗啉)。

本发明中使用的术语“修饰的核苷”意在包括可采用寡聚物合成方法结合至寡聚化合物的所有形式的修饰的核苷。该术语包括具有呋喃核糖并可包含杂环碱基的核苷，但也可包括脱碱基的修饰的核苷。一组典型的修饰的核苷包括但不限于：二环核苷、2-修饰的核苷、4-硫代修饰的核苷以及4-硫代-2-修饰的核苷和碱基修饰的核苷。

本发明中使用的术语“单体亚单元”意在包括可采用寡聚物合成方法结合至寡聚化合物的所有形式的单体。该术语包括具有呋喃核糖和杂环碱基的核苷，但也可包括具有修饰的糖或糖替代物如模拟物的单体。因此，该术语包括核苷、修饰的核苷(如二环核苷)、核苷模拟物(如本发明提供的四氢吡喃核苷类似物)。

了解本发明的公开内容的本领域技术人员将能够制备实际上任何可行长度的寡聚化合物以实践本发明所述方法。这些寡聚化合物将包括至少一个、且优选多个本发明提供的四氢吡喃基核苷类似物，并可包含其它单体亚单元，所述亚单元包括但不限于核苷、修饰的核苷和核苷模拟物。因此，术语“单体亚单元”包括可用于寡聚物合成的所有形式的单体单元，单体亚单元的优选列表包括，例如，四氢吡喃核苷类似物、二环核苷、核苷、修饰的核苷和核苷模拟物。

在某些实施方案中，寡聚化合物包含长度为约8至约80个单体亚单元。本领域普通技术人员将理解本发明示例性寡聚化合物的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个单体亚单元，或其间的任意范围。

在另一实施方案中，本发明的寡聚化合物长度为8至40个单体亚单元。本领域普通技术人员将理解这种示例性寡聚化合物的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个单体亚单元，或其间的任意范围。

在另一实施方案中，本发明的寡聚化合物的长度为8至20个单体亚单元。本领域普通技术人员将理解这种示例性寡聚化合物的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个单体亚单元，或其间的任意范围。

在另一实施方案中，本发明的寡聚化合物的长度为10至16个单体亚单元。本领域普通技术人员将理解这种示例性寡聚化合物的长度为10、11、12、13、14、15或16个单体亚单元，或其间的任意范围。

在另一实施方案中，本发明的寡聚化合物的长度为12至16个单体亚单元。本领域普通技术人员将理解这种示例性寡聚化合物的长度为12、13、14、15或16个单体亚单元，或其间的任意范围。

在另一实施方案中，本发明的寡聚化合物的长度为10至14个单体亚单元。本领域普通技术人员将理解这种示例性寡聚化合物的长度为10、11、12、13或14个单体亚单元，或其间的任意范围。

在某些实施方案中，提供了具有各种长度范围的连接的单体亚单元的寡聚化合物。在某些实施方案中，提供的寡聚化合物由X-Y个连接的单体亚单元构成，其中X和Y各自独立地选自8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50；前提是X＜Y。例如，在某些实施方案中，本发明提供的寡聚化合物包含：8-9、8-10、8-11、8-12、8-13、8-14、8-15、8-16、8-17、8-18、8-19、8-20、8-21、8-22、8-23、8-24、8-25、8-26、8-27、8-28、8-29、8-30、9-10、9-11、9-12、9-13、9-14、9-15、9-16、9-17、9-18、9-19、9-20、9-21、9-22、9-23、9-24、9-25、9-26、9-27、9-28、9-29、9-30、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15、10-16、10-17、10-18、10-19、10-20、10-21、10-22、10-23、10-24、10-25、 10-26、10-27、10-28、10-29、10-30、11-12、11-13、11-14、11-15、11-16、11-17、11-18、11-19、11-20、11-21、11-22、11-23、11-24、11-25、11-26、11-27、11-28、11-29、11-30、12-13、12-14、12-15、12-16、12-17、12-18、12-19、12-20、12-21、12-22、12-23、12-24、12-25、12-26、12-27、12-28、12-29、12-30、13-14、13-15、13-16、13-17、13-18、13-19、13-20、13-21、13-22、13-23、13-24、13-25、13-26、13-27、13-28、13-29、13-30、14-15、14-16、14-17、14-18、14-19、14-20、14-21、14-22、14-23、14-24、14-25、14-26、14-27、14-28、14-29、14-30、15-16、15-17、15-18、15-19、15-20、15-21、15-22、15-23、15-24、15-25、15-26、15-27、15-28、15-29、15-30、16-17、16-18、16-19、16-20、16-21、16-22、16-23、16-24、16-25、16-26、16-27、16-28、16-29、16-30、17-18、17-19、17-20、17-21、17-22、17-23、17-24、17-25、17-26、17-27、17-28、17-29、17-30、18-19、18-20、18-21、18-22、18-23、18-24、18-25、18-26、18-27、18-28、18-29、18-30、19-20、19-21、19-22、19-23、19-24、19-25、19-26、19-29、19-28、19-29、19-30、20-21、20-22、20-23、20-24、20-25、20-26、20-27、20-28、20-29、20-30、21-22、21-23、21-24、21-25、21-26、21-27、21-28、21-29、21-30、22-23、22-24、22-25、22-26、22-27、22-28、22-29、22-30、23-24、23-25、23-26、23-27、23-28、23-29、23-30、24-25、24-26、24-27、24-28、24-29、24-30、25-26、25-27、25-28、25-29、25-30、26-27、26-28、26-29、26-30、27-28、27-29、27-30、28-29、28-30、或29-30个连接的单体亚单元。

在某些实施方案中，寡聚化合物的长度范围为8-16、8-40、10-12、10-14、10-16、10-18、10-20、10-21、12-14、12-16、12-18、12-20和12-24个连接的单体亚单元。

在某些实施方案中，本发明列出的寡聚化合物的范围意在限制寡聚化合物中单体亚单元的数目，然而，这些寡聚化合物可进一步包含保护基，如羟基保护基、任选连接的共轭基团、5和/或3-末端基团和/或其它取代基。

嵌合寡聚化合物在两个或更多位置具有差异修饰的核苷且通常被定义为具有基序。本发明的嵌合寡聚化合物可形成成为两个或更多如上文所述的寡核苷酸、寡核苷酸类似物、寡核苷和/或寡核苷酸模拟物的组合结构。教导这些杂合结构的制备的典型美国专利包括但不限于：U.S.：5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；和5,700,922，其中一些专利为本申请人所有，各专利作为参考完整并入本发明。

在某些实施方案中，修饰的和未修饰的核苷及其模拟物的寡聚化根据文献中合适的DNA(Protocols for Oligonucleotides and Analogs，Agrawal编(1993)，Humana Press)和/或RNA(Scaringe，Methods(2001)，23，206-217；Gait等，Applications of Chemically synthesized RNA in RNA：ProteinInteractions，Smith编(1998)，1-36；Gallo等，Tetrahedron(2001)，57，5707-5713)合成方法适当进行。其它固相合成方法可在Caruthers的美国专利4,415,732；4,458,066；4,500,707；4,668,777；4,973,679；和5,132,418；以及Koster的美国专利4,725,677和再公告专利34,069中找到。

通常用于基于支持介质合成寡聚化合物和相关化合物的市售设备由若干供应商出售，包括例如Applied Biosystems(Foster City，加州)。可额外或替换使用本领域已知的用于此类合成的任何其它方法。包括自动合成技术在内的合适的固相技术描述于F.Eckstein(编)，Oligonucleotide and Analogues，aPractical Approach，Oxford University Press，纽约(1991)。

相对于DNA及相关类似物的合成，随着RNAi研究的增加，RNA及相关类似物的合成也在持续增长。目前使用的主要的RNA合成策略通常包括：5-O-DMT-2-O-叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、5-O-DMT-2-O-[1(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基](FPMP)、2-O-[(三异丙基甲硅烷基)氧基]甲基(2-O-CH₂-O-Si(iPr)₃(TOM)、和5-O-甲硅烷基醚-2-ACE(5-O-双(三甲基甲硅烷氧基)环十二烷氧基甲硅烷基醚(DOD)-2-O-双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)。目前，提供RNA产物的一些主要公司包括：Pierce Nucleic AcidTechnologies、Dharmacon Research Inc.、Ameri Biotechnologies Inc.以及Integrated DNA Technologies，Inc.。Princeton Separations公司销售RNA合成活化剂，这种活化剂据宣传能减少偶联时间，尤其是当使用TOM和TBDMS法时。

用于商业RNA合成的主要基团包括：

TBDMS＝5-O-DMT-2-O-叔丁基二甲基甲硅烷基；

TOM＝2-O-[(三异丙基甲硅烷基)氧基]甲基；

DOD/ACE＝(5-O-双(三甲基甲硅烷氧基)环十二烷氧基甲硅烷基醚-2-O-双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基

FPMP＝5-O-DMT-2-O-[1(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基]。

在某些实施方案中，上述各种RNA合成策略可用于本发明。同样适用于本发明的策略也可以是上述方法的组合，例如采用一种策略中的5-保护基和另一种策略中的2-O-保护。

在本发明上下文中，“杂交”表示将寡聚化合物的互补链配对。在某些实施方案中，一种配对机制涉及在寡聚化合物链的互补核苷或核苷酸碱基(核碱基)之间形成氢键，所述氢键可以是Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen 氢键。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互补的核碱基，通过形成氢键配对。杂交可在各种环境下发生。

当化合物与靶核酸的结合影响靶核酸的正常功能从而造成活性损失，并且存在足够的互补程度以在希望特异性结合的条件(即，对于体内实验或治疗性处理，在生理条件下；以及对于体外实验，在进行实验的条件下)下避免寡聚化合物与非靶核酸序列之间的非特异性结合时，该寡聚化合物是可特异性杂交的。

本发明中使用的“互补”表示两个核碱基的精确配对能力，与核碱基的位置无关。例如，如果在寡聚化合物某个位置上的核碱基能够与靶核酸某个位置上的核碱基形成氢键，所述靶核酸是DNA、RNA或寡核苷酸分子，则寡核苷酸和靶核酸之间的氢键位置被认为是互补位置。当寡聚化合物以及其它DNA、RNA或寡核苷酸各分子中足够数量的互补位置被可相互形成氢键的核碱基占据时，所述分子是彼此互补的。因此，术语“可特异性杂交”和“互补”用来表示在足够数量的核碱基之间足够程度的精确配对能力或互补性，从而可在寡核苷酸和靶核酸之间发生稳定且特异性的结合。

本领域已知，寡聚化合物序列不需要与其可被特异性杂交的靶核酸序列100％互补。此外，寡核苷酸可在一个或多个区段上杂交，因此相干或相邻区段不参与杂交(例如，环结构或发夹结构)。在某些实施方案中，寡聚化合物可包含与它们所靶向的靶核酸中的靶区域至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的序列互补性。例如，在寡聚化合物的20个核碱基中有18个与靶区域互补从而发生特异性杂交的寡聚化合物代表90％互补性。在本例中，其余的非互补性核碱基可以是成簇的或散布在互补的核碱基之间，不需要相互邻近或与互补的核碱基邻近。这样，长度为18个核碱基、具有4 个非互补的核碱基(其侧翼为两个与靶核酸完全互补的区域)的寡聚化合物与靶核酸的整体互补性为77.8％，落入本范围内。寡聚化合物与靶核酸区域的互补性百分数可通过使用BLAST程序(局部序列比对基本检索工具)和本领域已知的PowerBLAST程序(Altschul等，J.MoI.Biol.，1990，215，403-410；Zhang和Madden，Genome Res.，1997，7，649-656)常规确定。

本发明进一步包括了寡聚化合物诸如反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、核酶、外部引导序列(EGS)寡核苷酸、交替剪接物、引物、探针以及其它可与靶核酸的至少一部分杂交的寡聚化合物。由此，这些寡聚化合物可以以单链、双链、环状或发夹寡聚化合物形式被引入，并可含有诸如内部或末端凸出或环等结构元件。一旦被引入系统，本发明的寡聚化合物可引发一种或多种酶或结构蛋白的作用从而实现对靶核酸的修饰。

这些酶的一个非限制性例子是RNA酶H，一种切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶。本领域已知，“DNA-样”的单链寡聚化合物引发RNA酶H。因此，RNA酶H的活化导致RNA靶的切割，从而大大增强寡核苷酸介导对基因表达的抑制的效率。已经假定其它核糖核酸酶如RNA酶III和核糖核酸酶L家族的酶具有类似作用。

尽管一种形式的寡聚化合物是单链反义寡核苷酸，但在许多物种中，引入双键结构如双链RNA(dsRNA)分子显示能诱导强且特异的对基因或其相关基因产物功能的反义介导的降低。这种现象在植物和动物中均有发生，并被认为与病毒防御和转座子沉默进化相关。

在一些实施方案中，“合适的靶区段”可用于筛选调节所选蛋白质表达的其它寡聚化合物。“调节剂”是那些降低或升高编码蛋白质的核酸分子的表达的寡聚化合物，其包含至少一个与合适的靶区段互补的8-核碱基部分。所述筛选方法包括以下步骤：使编码蛋白质的核酸分子的合适靶区段接触一种或多种候选调节剂，并选择降低或升高编码蛋白质的核酸分子表达的一种或多种候选调节剂。一旦显示候选调节剂能够调节(例如，降低或升高)编码肽的核酸分子的表达，然后可将该调节剂用于本发明以进一步研究所述肽的功能，或者用作研究、诊断或治疗试剂。

合适的靶区段也可与本发明提供的它们各自的互补反义寡聚化合物组合形成稳定的双链(双链体的)寡核苷酸。本领域已知这种双链寡核苷酸部分能够通过反义机制调控靶表达、调节翻译以及RNA加工。此外，可对双链部分进行化学修饰(Fire等，Nature，1998，391，806-811；Timmons和Fire，Nature1998，395，854；Timmons等，Gene，2001，263，103-112；Tabara等，Science，1998，282，430-431；Montgomery等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，15502-15507；Tuschl等，Genes Dev.，1999，13，3191-3197；Elbashir等，Nature，2001，411，494-498；Elbashir等，Genes Dev.2001，15，188-200)。例如，这些双链部分已显示能通过双链体反义链与靶的经典杂交从而引发靶的酶降解来抑制靶(Tijsterman等，Science，2002，295，694-697)。

本发明提供的寡聚化合物也可用于药物开发和靶验证领域。在某些实施方案中，本发明提供了本发明鉴定的寡聚化合物和靶在药物开发中的应用，以阐明蛋白质和疾病状态、表型或病症之间的关系。这些方法包括检测或调节靶肽，包括使样品、组织、细胞或器官与本发明提供的一种或多种寡聚化合物接触，在处理后的一段时间测量靶的核酸或蛋白质水平和/或相关表型或化学终点，以及任选地将测量值与未处理样品或用本发明的其它寡聚化合物处理的样品进行比较。这些方法也可平行进行或与其它试验组合进行，以确定未知基因的功能(对靶验证过程而言)，或确定特定基因产物作为靶对于治疗或预防特定疾病、症状或表型的有效性。在某些实施方案中，提供了本发明所述寡聚化合物在治疗中的应用。在某些实施方案中，所述治疗是减少靶信使RNA。

本发明使用的术语“剂量”表示单次施用中提供的药剂的具体量。在某些实施方案中，剂量可通过两次或多次推注、片剂或注射进行施用。例如，在某些实施方案中，需要皮下施用时，所需剂量要求的体积不是通过一次注射就能方便提供的。在该实施方案中，可采用两次或多次注射来实现所需剂量。在某些实施方案中，剂量可通过两次或多次注射施用以使个体注射部位的反应最小化。

在某些实施方案中，相比未修饰的DNA，化学修饰的本发明的寡聚化合物对靶RNA的亲和力更高。在某些此类实施方案中，高亲和力又提供了增强的功效，从而使施用较低剂量的此类化合物、降低毒性潜能、改善治疗指数以及降低治疗整体花费成为可能。

核苷修饰对RNAi活性的作用按照现有文献进行评价(Elbashir等，Nature(2001)，411，494-498；Nishikura等，Cell(2001)，107，415-416；和Bass等，Cell(2000)，101，235-238)。

在某些实施方案中，本发明提供的寡聚化合物可用于诊断、治疗、预防以及作为研究试剂和试剂盒。此外，能够以极高特异性抑制基因表达的反义寡核苷酸通常被本领域普通技术人员用来阐述特定基因的功能或用来区分生物途径各成员的功能。在某些实施方案中，本发明提供的寡聚化合物能够单独使用或与其它寡聚化合物或治疗剂组合使用，能够用作差分和/或组合分析的工具以阐明细胞和组织内表达的基因的一部分或全部补体的表达模式。在有利于基因扩增或检测的条件下，寡聚化合物也可分别用作引物和探针。这些引物和探针可用于需要特异性检测编码蛋白质的核酸分子的方法以及用于核酸分子的扩增以用于检测或进行深入研究。本发明的反义寡核苷酸(尤其是引物和探针)与核酸的杂交可通过本领域已知方法检测。这些方法可包括将酶与寡核苷酸结合、放射性标记寡核苷酸或任何其它合适的检测方法。也可制备采用所述检测手段用于检测样品中所选蛋白质水平的试剂盒。

一个非限制性的例子是，将用一种或多种寡聚化合物处理的细胞或组织内的表达模式与未用寡聚化合物处理的细胞或组织进行比较，并对产生的模式进行基因表达差异水平的分析，因为它们涉及，例如，检测基因的疾病关联性、信号转导途径、细胞定位、表达水平、大小、结构或功能。这些分析可在刺激或未刺激的细胞上并在存在或不存在影响表达模式的其它化合物和/或寡聚化合物时进行。

本领域已知的分析基因表达的方法的例子包括DNA阵列或微阵列(Brazma和Vilo，FEBS Lett.，2000，480，17-24；Celis等，FEBS Lett.，2000，480，2-16)、SAGE(基因表达系列分析)(Madden等，Drug Discov.Today，2000，5，415-425)、READS(消化cDNA的限制性酶扩增)(Prashar和Weissman，Methods Enzymol.，1999，303，258-72)、TOGA(总基因表达分析)(Sutcliffe等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，97，1976-81)、蛋白质阵列和蛋白质组学(Celis等，FEBS Lett.，2000，480，2-16；Jungblut等，Electrophoresis，1999，20，2100-10)、表达序列标签(EST)测序(Celis等，FEBS Lett.，2000，480，2-16；Larsson等，J.Biotechnol.，2000，80，143-57)、消减RNA指纹(SuRF)(Fuchs等，Anal.Biochem.，2000，286，91-98；Larson等，Cytometry，2000，41，203-208)、差减克隆、差示技术(DD)(Jurecic和Belmont，Curr.Opin.Microbiol.，2000，3，316-21)、比较基因组杂交(Carulli等，J.Cell Biochem.Suppl.，1998， 31，286-96)、FISH(荧光原位杂交)技术(Going和Gusterson，Eur.J.Cancer，1999，35，1895-904)和质谱法(To，Comb.Chem.High Throughput Screen，2000，3，235-41)。

尽管在某些实施方案中，本发明提供的寡聚化合物按照描述使用，以下实施例仅用于例证而非限制。

实施例(一般)

分别在300MHz和75MHz Bruker光谱仪上记录¹H和¹³C NMR光谱。实施例1

合成核苷亚磷酰胺

核苷亚磷酰胺的制备按照本发明以及本领域中所示的方法进行，例如但不限于美国专利6,426,220和公开的PCT申请WO 02/36743。

实施例2

寡核苷合成

本发明使用的寡聚化合物通常可通过已知的固相合成技术方便且常规地进行制备。用于这些合成的设备由若干供应商出售，包括例如AppliedBiosystems(Foster City，CA)。本领域已知的用于这些合成的任何其它手段可另外或可选择的使用。用类似技术来制备寡核苷酸如烷基化衍生物以及具有硫代磷酸酯键的寡核苷酸是已知的。

寡核苷酸：可采用标准亚磷酰胺化学法使用碘氧化在自动DNA分析仪(Applied Biosystems，型号394)上合成未取代的和取代的磷酸二酯(P＝O)寡核苷酸。

硫代磷酸酯(P＝S)采用类似于磷酸二酯寡核苷酸的方法合成，除了以下差别：在某些实施方案中，进行硫杂化时用10％w/v的3，H-1，2-苯并二硫杂环戊二烯-3-酮1，1-二氧化物的乙腈溶液来氧化亚磷酸键。硫杂化反应步骤时间提高到180秒，在常规加帽步骤之后进行。从CPG柱上切下并在55℃的浓氢氧化铵中去封闭(12-16小时)之后，用3倍以上体积的乙醇从1M NH₄OAc溶液中沉淀来回收寡核苷酸。亚膦酸寡核苷酸可按照美国专利5,508,270的描述制备。

烷基膦酸酯寡核苷酸可按照美国专利4,469,863的描述制备。

3-脱氧-3-亚甲基膦酸酯寡核苷酸可按照美国专利5,610,289或5,625,050的描述制备。

亚磷酰胺寡核苷酸可按照美国专利5,256,775或美国专利5,366,878的描述制备。

烷基硫代膦酸酯寡核苷酸可按照公开的PCT申请PCT/US94/00902和PCT/US93/06976(分别作为WO 94/17093和WO 94/02499公开)的描述制备。

3-脱氧-3-氨基氨基磷酸酯寡核苷酸可按照美国专利5,476,925的描述制备。

磷酸三酯寡核苷酸可按照美国专利5,023,243的描述制备。

硼代磷酸酯寡核苷酸可按照美国专利5,130,302和5,177,198的描述制备。

寡核苷：亚甲基甲基亚氨基连接的寡核苷(也称为MMI连接的寡核苷)、亚甲基二甲基次联氨基连接的寡核苷(也称为MDH连接的寡核苷)、以及亚甲基羰基氨基连接的寡核苷(也称为酰胺-3连接的寡核苷)、和亚甲基氨基羰基连接的寡核苷(也称为酰胺-4连接的寡核苷)、以及具有例如交替的MMI和P＝O或P＝S键的混合骨架寡聚化合物可按照美国专利5,378,825、5,386,023、 5,489,677、5,602,240和5,610,289的描述制备。

甲酰酰基和硫代甲酰酰基连接的寡核苷可按照美国专利5,264,562和5,264,564的描述制备。

环氧乙烷连接的寡核苷可按照美国专利5,223,618的描述制备。

实施例3

分离寡核苷酸

从可控孔玻璃固体支持物或其它支持介质上切下并在55℃的浓氢氧化铵中去封闭12-16小时之后，用3倍以上体积的乙醇从1M NH₄OAc溶液中沉淀来回收寡核苷酸或寡核苷。合成的寡核苷酸通过电喷雾质谱法(测定分子量)和毛细管凝胶电泳分析。通过正确分子量与-16amu产物(+/-32+/-48)的比值来确定合成中获得的硫代磷酸酯键和磷酸二酯键的相对量。在一些研究中，寡核苷酸通过HPLC纯化，如Chiang等，J.Biol.Chem.1991，266，18162-18171所述。HPLC-纯化材料所得结果通常类似于非-HPLC纯化材料的结果。

实施例4

寡核苷酸合成-96孔板模式

可在能够以96孔模式同时装配96条序列的自动合成仪上通过固相P(III)亚磷酰胺化学法合成寡核苷酸。可用碘的水溶液氧化得到磷酸二酯核苷酸间键。在无水乙腈中用3，H-1，2苯并二硫杂环戊二烯-3-酮1，1二氧化物(Beaucage试剂)进行硫化生成硫代磷酸酯核苷酸间键。标准碱基-保护的β-氰基乙基-二异丙基亚磷酰胺购自商业供应商(如PE-Applied Biosystems，Foster City，CA，或Pharmacia，Piscataway，NJ)。非标准核苷按照标准方法或专利方法合成。它们被用作碱基-保护的β-氰基乙基二异丙基亚磷酰胺。

将寡核苷酸从支持物上切下并在较高温度(55-60℃)用浓NH₄OH进行12-16小时的去保护，然后真空干燥释放的产物。然后将干燥的产物重悬于无菌水以得到主平板(master plate)，然后用自动移液器从该主平板稀释所有的分析和测试平板样品。

实施例5

用96孔板模式进行寡核苷酸分析

各孔内寡核苷酸的浓度通过样品稀释和UV吸收光谱评价。各产物的全长完整性通过毛细管电泳(CE)评价，电泳采取96孔模式(Beckman P/ACE^TMMDQ)，或者，对于单独制备的样品，在市售CE设备(如，Beckman P/ACE^TM5000，ABI 270)上进行。碱基和骨架组成通过用电喷雾-质谱法对寡聚化合物进行质量分析来证实。所有测试平板采用单通道和多通道自动移液器从主平板稀释得到。如果平板上至少85％的寡聚化合物达到全长的至少85％，则认为该平板是可接受的。

实施例6

细胞培养和寡核苷酸处理

可以在任何细胞类型中测试寡聚化合物对靶核酸表达的影响，只要该靶核酸以可测水平存在。这通常可采用，例如，PCR或Northern印迹分析来检测。从多种组织和物种获得的细胞系可从美国典型培养物保藏所(ATCC，马纳萨斯，VA)获得。

出于示例目的，提供以下细胞类型，但也可常规使用其它细胞类型，前提是靶可在所选细胞类型中表达。这可通过本领域常规方法如Northern印迹分析、核糖核酸酶保护试验或RT-PCR方便地确定。

b.END细胞：鼠脑内皮细胞系b.END从Max Plank Institute(Bad Nauheim，德国)的Dr.Werner Risau处获得。b.END细胞通常在添加有10％胎牛血清(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)的高葡萄糖(Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA)DMEM中培养。通过胰蛋白酶消化并当细胞达到约90％汇合时稀释来对细胞进行常规传代。以约3000细胞/孔的密度将细胞接种于96孔板(Falcon-Primaria#353872，BD Biosciences，Bedford，MA)以便使用，其中包括但不限于进行寡聚化合物转染实验。

涉及用寡聚化合物处理细胞的实验：

当细胞达到适当汇合时，用本发明所述转染方法采用寡聚化合物来处理细胞。

LIPOFECTIN^TM

当细胞达到65-75％汇合时，用寡核苷酸处理细胞。在Opti-MEM^TM-1减少血清的培养基(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)中将寡核苷酸与LIPOFECTIN^TM(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)混合以达到所需的寡核苷酸浓度，并使LIPOFECTIN^TM浓度达到2.5或3μg/mL每100nM寡核苷酸。将这种转染混合物在室温培育约0.5小时。对于在96孔板中生长的细胞，各孔用100μL OPTI-MEM^TM-1洗涤一次，然后用130μL转染混合物处理。生长在24孔板或其它标准培养平板内的细胞用适当体积的培养基和寡核苷酸类似处理。以双份或三份形式处理细胞并获得数据。在37℃处理约4-7小时后，用新鲜培养基代替含转染混合物的培养基。用寡核苷酸处理16-24小时后收获细胞。

本领域已知的其它合适转染试剂包括但不限于：CYTOFECTIN^TM、LIPOFECTAMINE^TM、OLIGOFECTAMINE^TM和FUGENE^TM。本领域已知的其它合适转染方法包括但不限于电穿孔。

实施例7

靶mRNA水平的实时定量PCR分析

使用ABI PRISM^TM 7600、7700或7900序列检测系统(PE-AppliedBiosystems，Foster City，CA)按照制造商的说明通过实时定量PCR完成靶mRNA水平的量化。这是一种闭管的、非基于凝胶的荧光检测系统，其能够对聚合酶链式反应(PCR)的产物进行实时高通量量化。与扩增产物在PCR完成之后量化的标准PCR不同，实时定量PCR的产物在它们累积时量化。这是通过在PCR反应中加入在正向和反向PCR引物之间特异性退火并包含两种荧光染料的寡核苷酸探针来实现的。报告染料(如FAM或JOE，获自PE-AppliedBiosystems，Foster City，CA；Operon Technologies Inc.，Alameda，CA；或Integrated DNA Technologies Inc.，Coralville，IA)附于探针的5端，而淬灭染料(如TAMRA，获自PE-Applied Biosystems，Foster City，CA；OperonTechnologies Inc.，Alameda，CA；或Integrated DNA Technologies Inc.，Coralville，IA)附于探针的3端。当探针和染料完整时，报告染料的发射由于靠近3淬灭染料而被猝灭。在扩增期间，探针和靶序列退火产生能被Taq聚合酶的5-外切核酸酶活性切割的底物。在PCR扩增循环的延伸阶段，Taq聚合酶将探针切除导致报告染料从剩余探针上释放(即从淬灭剂部分释放)并生成序列特异性荧光信号。每轮循环中，额外的报告染料分子从它们各自的探针上切除，荧光强度通过ABI PRISM^TM序列检测系统中的激光光学模块以固定时间间隔监测。在每次试验中，包括来自未处理对照样品的连续稀释的mRNA的一系列平行反应产生了标准曲线，该曲线被用来量化用反义寡核苷酸处理检测样品后的抑制百分数。

在定量PCR分析之前，用GAPDH扩增反应评价了特异于被测量的靶基因的引物-探针组的“多重化”能力。在多重化中，靶基因和内标基因GAPDH在单个样品内同时扩增。在该分析中，从未处理细胞分离的mRNA被连续稀释。各稀释物在仅特异于GAPDH、仅特异于靶基因(“单重化”)或同时特异于这两者(“多重化”)的引物-探针组存在时被扩增。PCR扩增之后，从单重化和多重化样品中生成了作为稀释度函数的GAPDH和靶mRNA信号的标准曲线。如果由多重化样品生成的GAPDH和靶信号曲线的斜率以及相关系数同时落入由单重化样品生成的它们相应值的10％之内，则认为特异于该靶的引物-探针组是可多重化的。其它PCR方法也是本领域已知的。

RT和PCR试剂获自Invitrogen Life Technologies(Carlsbad，CA)。进行RT，实时PCR时，在含有30μL总RNA溶液(20-200ng)的96孔板中加入20μL PCR鸡尾酒(2.5×的扣除MgCl₂的PCR缓冲液，6.6mM MgCl₂，dATP、dCTP、dCTP和dGTP各375μM，正向引物和反向引物各375nM，125nM探针，4单位RNA酶抑制剂，1.25单位

Taq，5单位MuLV反转录酶，以及2.5×ROX染料)。在48℃培育30分钟来进行RT反应。在95℃培育10分钟以激活

Taq后，进行40轮两步PCR方案：95℃15秒(变性)，然后60℃1.5分钟(退火/延伸)。

通过RT，实时PCR获得的基因靶的量用GAPDH(一种稳定表达的基因)的表达水平或通过用RIBOGREEN^TM(Molecular Probes，Inc.Eugene，OR)量化总RNA来标准化。GAPDH表达通过实时RT-PCR来量化，与靶多重化同时进行或单独进行。总RNA用RiboGreen^TM RNA量化试剂(Molecular Probes，Inc.Eugene，OR)来量化。通过RIBOGREEN^TM量化RNA的方法遵从Jones， L.J.等，(Analytical Biochemistry，1998，265，368-374)的教导。

在本分析中，吸取170μL RIBOGREEN^TM工作试剂(以1∶350稀释于10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5中的RIBOGREEN^TM试剂)加入含30μL纯化的细胞RNA的96孔板。平板在CytoFluor 4000(PE Applied Biosystems)上读取，激发波长为485nm，发射波长为530nm。

实施例8

制备化合物8，方案1

a)制备化合物2

将化合物1(13.1g，55.9mmol，1，5：2，3-二脱水-4，6-O-苯亚甲基-D-蒜糖醇，购自Carbosynth，英国)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(210mL)。在该溶液中加入尿嘧啶(7.52g，67.1mmol)和1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(10.0mL，67.1mmol)。将该混合物加热至85℃维持7小时。然后将混合物冷却至室温，倒入乙酸乙酯(1L)，并用半饱和的NaHCO₃水溶液(4×1L)洗涤。水性部分用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发成灰白色泡沫，该物质通过硅胶层析(2％甲醇的CH₂Cl₂溶液)纯化得到12.5克(64.5％产率)白色泡沫状化合物2。ESI-MS[M+H⁺]：计算值347Da；实测值347Da。¹H NMR与结构一致。该过程可参考：Abramov，M.；Marchand，A.；Calleja-Marchand，A.；Herdewijn，P.Systhesisof D-Altritol Nucleosides with a 3-O-tert-butyldimethylsilyl protecting group(用3-O-叔丁基二甲基甲硅烷基保护基合成D-阿卓糖醇核苷)，Nucleosides，Nucleotides & Nucleic Acids(2004)23，439。

b)制备化合物3

将化合物2(12.1g，35.0mmol)溶于无水CH₂Cl₂(50mL)和无水吡啶(50mL)的混合物。将该混合物冷却至0℃，然后用甲磺酰氯(6.77mL，87.4mmol)处理。在0℃维持15分钟后将混合物升至室温并再搅拌5小时。真空下浓缩得到金色软泥，将其重悬于CH₂Cl₂(500mL)，用半饱和的NaHCO₃水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发成金色油状物。随后通过硅胶层析纯化(2％甲醇的CH₂Cl₂溶液)得到11.7克(78.6％产率)淡黄色泡沫状的化合物3。ESI-MS[M+H⁺]：计算值425Da；实测值425Da。¹H NMR与结构相符。

c)制备化合物4

将化合物3(11.2g，26.5mmol)悬浮于1，4-二噁烷(100mL)。在该悬浮液中加入100mL 2M NaOH水溶液。将所得混合物升至60℃并搅拌3.5小时。将混合物冷却至室温，然后用乙酸(11.4mL)中和。将混合物真空浓缩成约100mL，然后倒入CH₂Cl₂(500mL)。所得混合物用饱和的NaHCO₃水溶液(500mL) 洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发得到8.23克(89.7％产率)灰白色固体状化合物4。ESI-MS[M+H⁺]：计算值347Da；实测值347Da。¹H NMR与结构相符。

d)制备化合物5

将化合物4(7.96g，23.0mmol)溶于无水THF(100mL)。在该溶液中加入1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(5.1mL，34mmol)，然后边搅拌边逐滴加入九氟丁烷磺酰氯(11.6mL，34mmol)。将该混合物在30℃培育84小时。将混合物倒入乙酸乙酯(400mL)，用半饱和的NaHCO₃水溶液洗涤(2×500mL)，用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发成灰白色泡沫。硅胶层析(1∶1己烷∶乙酸乙酯)得到7.92克化合物5，其为不纯的混合物。该混合物无需进一步纯化即用于随后的反应。一小部分通过硅胶层析更小心地纯化供分析表征。ESI-MS[M+H⁺]：计算值349Da；实测值349Da(主要杂质[M+H⁺]＝329，与HF消除一致)。¹H和¹⁹F NMR都与化合物5的结构一致。

e)制备化合物6

将不纯的化合物5(6.87g，19.7mmol)溶于无水CH₂Cl₂(100mL)。在该溶液中加入三氟乙酸(35mL)。室温搅拌1小时后将该混合物真空浓缩成淡橙色油状物。通过硅胶层析纯化(分步梯度从1％甲醇到10％甲醇的CH₂Cl₂溶液)得到3.58克(69％产率)白色泡沫状化合物6。ESI-MS[M+H⁺]：计算值261Da；实测值261Da。

f)制备化合物7

将化合物6(3.37g，12.9mmol)溶于无水吡啶(40mL)。冷却至0℃后，用4，4-二甲氧基三苯甲基氯(6.59g，19.5mmol)处理该溶液。在0℃搅拌20分钟后，将混合物升至室温再维持3小时。将所得混合物真空浓缩成棕色油状物，将其重悬于CH₂Cl₂(400mL)，用半饱和的NaHCO₃水溶液洗涤(2×400mL)，用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。硅胶层析(2％v/v甲醇的CH₂Cl₂溶液)得到5.68克(77.9％产率)浅褐色泡沫状化合物7。¹H和¹⁹F NMR都与结构一致。

g)制备化合物8

将化合物7(2.50g，4.45mmol)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(11.2mL)。在该溶液中加入2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异丙基磷酰二胺(2-cyanoethyl-N，N，N’，N’-tetraisopropylphosphorodiamidite)(1.98mL，6.23mmol)、四唑(156mg，2.22mmol)和N-甲基咪唑(89μL，1.11mmol)。室温搅拌3小时后，用三乙胺(2.48mL，17.8mmol)处理混合物，搅拌5分钟，然后倒入乙酸乙酯(250mL)。所得溶液用1∶1的饱和NaHCO₃水溶液∶饱和NaCl水溶液(1×200mL)处理，然后用饱和NaCl水溶液(1×200mL)处理。有机部分用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。硅胶层析(1∶1己烷∶乙酸乙酯)得到2.61克(76.8％产率)淡黄色泡沫状化合物8。¹H、¹⁹F和³¹P NMR与化合物8的结构一致，为含磷非对映体的混合物。

实施例9

制备化合物13，方案2

a)制备化合物9

将化合物7(2.50g，4.44mmol，在之前的实施例中制备)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(10mL)。在该溶液中加入咪唑(1.82g，26.7mmol)和叔丁基二甲基甲硅烷基氯(1.34g，8.88mmol)。室温搅拌12小时后将混合物倒入乙酸乙酯(250mL)，用半饱和的NaHCO₃水溶液(2×200mL)和饱和的NaCl水溶液(2×200mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。硅胶层析(1∶1己烷∶乙酸乙酯)得到2.52克(83.8％产率)化合物9，其为白色泡沫。¹H和¹⁹F NMR与所示结构一致。

b)制备化合物10

在冰冷的(0℃)1，2，4-三唑(3.40g，49.2mmol)的无水乙腈(44mL)悬浮液中加入氯氧化磷(1.31mL，14.1mmol)。在0℃搅拌20分钟后，向混合物中加入三乙胺(9.8mL，70mmol)。在所得浆液中加入化合物9(2.38g，3.52mmol)的无水乙腈(20mL)溶液。将混合物在0℃维持1小时，然后升至室温维持2小时。随后将混合物浓缩至其原始体积的约一半，倒入乙酸乙酯(250mL)，用半饱和的NaCl水溶液(2×200mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发成黄色泡沫。将该残余物重溶于1，4-二噁烷(20mL)并用浓氨水(20mL)处理。将反应容器密封并室温搅拌12小时，此时将混合物减压浓缩，倒入CH₂Cl₂(200mL)，用半饱和的NaHCO₃水溶液洗涤(1×200mL)，用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。硅胶层析(1.5％v/v甲醇的CH₂Cl₂溶液)得到1.98克(83.4％)化合物10，其为黄色泡沫。ESI-MS[M-H⁺]：计算值674.8Da；实测值674.3Da。 ¹H和¹⁹F NMR与结构一致。

c)制备化合物11

将化合物10(1.86g，2.76mmol)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(10mL)。在所得溶液中加入苯甲酸苷(938mg，4.14mmol)。室温搅拌14小时后，将混合物倒入乙酸乙酯(250mL)，用饱和的NaHCO₃水溶液(1×200mL)和半饱和的NaCl水溶液(2×200mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发。硅胶层析(1∶1己烷∶乙酸乙酯)得到2.12克(98.4％)化合物11，其为白色泡沫。ESI-MS[M-H⁺]：计算值778Da；实测值778Da。¹H和¹⁹F NMR与结构一致。

d)制备化合物12

将化合物11(1.98g，2.54mmol)溶于无水THF(3mL)。在该溶液中加入3.3mL的1M四丁基氟化铵的THF溶液。13小时后将混合物蒸发，重溶于 CH₂Cl₂，并进行硅胶层析。用1.5％(v/v)甲醇的CH₂Cl₂溶液洗脱得到1.58克(93.9％)化合物12，其为灰白色泡沫。ESI-MS[M-H⁺]：计算值664.7Da；实测值664.2Da。¹H和¹⁹F NMR与结构一致。

e)制备化合物13

将化合物12(1.52g，2.28mmol)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(5.8mL)。在该溶液中加入2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异丙基磷酰二胺(1.00mL，3.19mmol)、四唑(80mg，1.14mmol)和N-甲基咪唑(45μL，0.57mmol)。室温搅拌3小时后，用三乙胺(1.27mL，9.13mmol)处理混合物，搅拌5分钟，然后倒入乙酸乙酯(200mL)。所得溶液用1∶1的饱和NaHCO₃水溶液：饱和NaCl水溶液(1×200mL)洗涤，然后用饱和NaCl水溶液(2×200mL)洗涤。有机部分用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。硅胶层析(1∶1己烷∶乙酸乙酯)得到1.58克(80.1％产率)化合物13，其为淡黄色泡沫。¹H、¹⁹F和³¹P NMR与化合物13的结构一致，其为含磷非对映体的混合物。

实施例10

制备化合物20，方案3

a)制备化合物14

将化合物1(30.0g，128mmol)溶于无水乙腈(600mL)。在该溶液中加入胸腺嘧啶(48.4g，384mmol)和1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(57.4mL，384mmol)。将该混合物加热至85℃维持12小时。冷却至室温后，未反应的胸腺嘧啶通过过滤除去。将过滤后的溶液真空浓缩成黄色的油，将其重溶于CH₂Cl₂(500mL)，用饱和的NaHCO₃水溶液(2×500mL)洗涤，硫酸钠干燥，过滤，并浓缩成黄色油状物，硅胶层析(2％甲醇的CH₂Cl₂溶液)该干燥的残余物得到30.3克(65.6％)化合物14，其为灰白色泡沫。¹H NMR与结构一致。ESI-MS[M+H⁺]：计算值361.4Da；实测值361.1Da。

b)制备化合物15

将化合物14(30.1g，83.6mmol)溶于无水CH₂Cl₂(100mL)和无水吡啶(100mL)的混合物。将该混合物冷却至0℃，然后用甲磺酰氯(8.4mL，109mmol)处理。将混合物在0℃维持30分钟，然后升至室温并再搅拌24小时。将混合物真空浓缩成橙色的油，将其重溶于CH₂Cl₂(500mL)，用半饱和的NaHCO₃水溶液洗涤(2×500mL)，用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发成淡橙色泡沫。¹HNMR与结构一致。ESI-MS[M+H⁺]：计算值439.4Da；实测值439.1Da。所得材料无需进一步纯化即可用于随后的反应。

c)制备化合物16

将化合物15(约34g粗制化合物，78mmol)悬浮于1，4-二噁烷(125mL)。在该悬浮液中加入125mL 2M NaOH水溶液。将所得混合物升至60℃并搅拌3小时。将混合物冷却至室温，然后用乙酸(14mL)中和。将混合物真空浓缩到约75mL，然后倒入CH₂Cl₂(1.75L)。混合物用饱和的NaHCO₃水溶液(2×1.5L)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发得到黄色固体，该物质无需进一步纯化即可用于随后的反应。ESI-MS[M+H⁺]：计算值361.4Da；实测值361.1Da。 ¹HNMR与结构相符。

d)制备化合物17

将化合物16(26.6g粗制化合物，73.8mmol)溶于无水THF(450mL)。在该溶液中加入1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(16.5mL，111mmol)，然后边搅拌边逐滴加入九氟丁烷磺酰氯(34mL，111mmol)。将该混合物在30℃温热42小时。将所得混合物浓缩至约75mL，然后倒入EtOAc(500mL)，用半饱和的NaHCO₃水溶液洗涤(2×500mL)，用无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发成棕色油状物。硅胶层析(3∶2己烷∶乙酸乙酯)得到18.1克(67.8％)化合物17，其为不纯的混合物(通过LCMS和¹H NMR测得纯度约82％)。该混合物无需进一步纯化即用于随后的反应。ESI-MS[M+H⁺]：计算值363Da；实测值363Da(主要杂质[M+H⁺]＝343，与HF消除一致)。

e)制备化合物18

将不纯的化合物17(4.57g，12.6mmol)溶于甲醇(300mL)。在该溶液中加入Pd(OH)₂/C(9g)。烧瓶用氢气吹扫，密封，用氢气维持，并室温搅拌。12小时后排除氢气，Pd(OH)₂/C通过硅藻土塞过滤除去，塞子再用甲醇彻底洗涤。真空浓缩成白色泡沫。硅胶层析(5％甲醇的CH₂Cl₂溶液)，得到10.7克(95％)18，其为白色泡沫。ESI-MS[M+H⁺]：计算值275.2Da；实测值275.1Da。¹HNMR和¹⁹F NMR都与结构一致。

f)制备化合物19

将化合物18(10.6g，38.6mmol)溶于无水吡啶(120mL)，冷却至0℃并用4，4-二甲氧基三苯甲基氯(26.1g，77.2mmol)处理。所得溶液缓慢升至室温并搅拌14小时。反应混合物用甲醇(10mL)猝灭并真空浓缩成棕色软泥。将混合物重溶于CH₂Cl₂(500mL)，用半饱和的NaHCO₃水溶液洗涤(2×500mL)，用无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发成有粘性的棕色泡沫。硅胶层析(1％甲醇的CH₂Cl₂溶液)得到20.3克(91％)化合物19，其为黄色泡沫。¹HNMR与结构相符。

g)制备化合物20

将化合物19(9.00g，15.6mmol)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(37mL)，加入2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异丙基磷酰二胺(7.43mL，23.4mmol)、四唑(656mg，9.37mmol)和N-甲基咪唑(311μL，3.9mmol)。室温搅拌3小时后用三乙胺(8.7mL，62.4mmol)处理混合物，搅拌5分钟，然后倒入乙酸乙酯(500mL)。所得溶液用半饱和的NaHCO₃水溶液洗涤(3×500mL)，用无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发成有粘性的黄色泡沫。硅胶层析(2∶3己烷∶乙酸乙酯)，然后从己烷/乙酸乙酯沉淀得到10.5克(87％产率)化合物20，其为淡黄色泡沫。¹H、¹⁹F和³¹P NMR都与结构一致，为非对映体的混合物。

实施例11

制备化合物25，方案4

a)制备化合物21

将化合物19(11.2g，19.4mmol，在之前的实施例中制备)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(44mL)。在该溶液中加入咪唑(7.9g，116mmol)和叔丁基二甲基甲硅烷基氯(5.85g，38.8mmol)。室温搅拌14小时后加入甲醇(10mL)猝灭，倒入乙酸乙酯(500mL)，用半饱和的NaHCO₃水溶液洗涤(3×500mL)，用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发成13.2克(98％)化合物21，其为淡黄色泡沫。¹H NMR与所示结构一致。该材料无需进一步纯化即可用于随后的反应。

b)制备化合物22

在冰冷的(0℃)1，2，4-三唑(18.4g，267mmol)的无水乙腈(350mL)悬浮液中加入氯氧化磷(7.1mL，76mmol)。在0℃搅拌30分钟后中混合物中加入三乙胺(53mL，382mmol)。在所得浆液中加入化合物21(13.2g，19.1mmol)的无水乙腈(100mL)溶液。将混合物在0℃维持1小时，然后升至室温维持3.5小时。随后将混合物浓缩到其最初体积的约一半，倒入乙酸乙酯(500mL)，用半饱和的NaCl水溶液(2×500mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发成黄色泡沫。将该残余物重溶于1，4-二噁烷(175mL)并用浓氨水(175mL)处理。将反应容器密封并室温搅拌14小时，此时将混合物减压浓缩，倒入CH₂Cl₂(500mL)，用半饱和的NaHCO₃水溶液洗涤(2×500mL)，用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发成12.4克(94％)化合物22，其为黄色泡沫，通过干燥过夜进行结晶。¹HNMR与结构一致。该材料无需进一步纯化即可用于随后的反应。

c)制备化合物23

将化合物22(12.3g，17.8mmol)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(60mL)。在所得溶液中加入苯甲酸苷(6.05g，26.7mmol)。室温搅拌12小时后将混合物倒入乙酸乙酯(500mL)，用半饱和的NaHCO₃水溶液洗涤(3×500mL)，用无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发。硅胶层析(3∶1己烷∶乙酸乙酯)得到13.4克(95.1％)化合物23，其为白色泡沫。¹H NMR与结构相符。

d)制备化合物24

将化合物23(13.4g，16.9mmol)溶于无水THF(14mL)。在该溶液中加入22mL 1M四丁基氟化铵的THF溶液。5小时后将混合物蒸发，然后进行硅胶层析。用2∶1的己烷∶乙酸乙酯洗脱得到9.57克(83.2％)化合物24，其为白色泡沫。¹H NMR与结构相符。

e)制备化合物25

将化合物24(9.5g，14.0mmol)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(33mL)。在该溶液中加入2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异丙基磷酰二胺(6.7mL，21.0mmol)、四唑(589mg，8.41mmol)和N-甲基咪唑(279μL，3.50mmol)。室温搅拌3小时后，用三乙胺(7.8mL，56mmol)处理混合物，搅拌5分钟，然后倒入乙酸乙酯(500mL)。所得溶液用饱和的NaCl水溶液(3×500mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。硅胶层析(3∶1己烷∶乙酸乙酯)得到11.8克(95％产率)化合物25，其为白色泡沫。¹H和³¹P NMR与化合物25的结构一致，其为含磷非对映体的混合物。

实施例12

制备化合物33，方案4

a)制备化合物27

将化合物1(5.40g，4.56mmol，1，5：2，3-二脱水-4，6-O-苯亚甲基-D-蒜糖醇，购自Carbosynth，英国)与2-氨基-6-氯嘌呤化合物26(5.89g，34.69mmol)混合并用P₂O₅减压干燥过夜。将混合物悬浮于无水六甲基磷酰胺(86mL)，加入18-冠-6(2.86g，10.82mmol)和K₂CO₃(3.46g，25.04mmol)。将反应混合物在90℃搅拌3小时，然后平衡至室温。加入碎冰并搅拌1小时。滤出形成的沉淀并用冷水和二乙醚洗涤。粗制材料通过硅胶柱层析纯化，用5％MeOH的 CH₂Cl₂溶液洗脱得到化合物27(7.01g，75％)。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ3.61(m，1H)，3.78(t，J＝10.1Hz，1H)，3.92(m，1H)，4.18-4.28(m，4H)，5.63(1，1H)，5.83(d，J＝4.2Hz，1H)，5.40(d，J＝6.3Hz，1H)，5.85(d，J＝3.8Hz，1H)，6.99(s，2H)，7.31-7.42(m，5H)，8.21(s，1H)；MS(ES)m/z 404.0[M+H]-。

实施例13

制备化合物41，方案5

化合物1，1，5：2，3-二脱水-4，6-O-苯亚甲基-D-蒜糖醇，购自Carbosynth，英国。

实施例14

制备化合物49

a)制备化合物43

将新戊酰氯(5.5mmol，0.67mL)加入至市售的1，5-脱水-4，6-O-苯亚甲基-D-山梨醇(Carbosynth，英国)、化合物42(5mmol，1.25g)、三乙胺(5.5mmol，0.77mL)和二甲基氨基吡啶(20mg)在二氯甲烷(25mL)中的溶液中。室温搅拌24小时后，反应用二氯甲烷稀释并用5％HCl、饱和碳酸氢钠和盐水洗涤，然后干燥(Na₂SO₄)并浓缩。通过柱层析纯化(硅胶，用10-30％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱)得到化合物43(1.06g)和化合物44(0.64g)，都为白色固体。化合物43： ¹H NMR(300MHz，氯仿-d)δ＝7.56-7.44(m，2H)，7.36(m，3H)，5.49(s，1H)，4.98-4.81(m，1H)，4.40-4.22(m，1H)，4.16-3.99(m，1H)，3.82(s，1H)，3.65(s，1H)，3.46(s，1H)，3.41-3.27(m，1H)，3.27-3.15(m，1H)，3.04-2.80(m，1H)，1.29-1.16(m，9H)。化合物44：¹H NMR(300MHz，氯仿-d)δ＝7.49-7.40(m，2H)，7.39-7.32(m，3H)，5.53(s，1H)，5.08-4.91(m，1H)，4.42-4.29(m，1H)，4.19-4.04(m，1H)，3.92-3.76(m，1H)，3.76-3.55(m，2H)，3.50-3.30(m，2H)，1.24(s，9H)。

b)制备化合物46

将三氟甲磺酸酐(4.8mmol，0.8mL)加入化合物43(3.2mmol，1.07g)和吡啶(0.5mL)的冷(0℃)溶液中。搅拌1小时后加水猝灭反应，有机层用水和盐水洗涤，然后干燥(Na₂SO₄)并浓缩以提供粗制化合物45，该物质无需任何进一步纯化即可使用。¹H NMR(300MHz，氯仿-d)δ＝7.53-7.42(m，2H)，7.42-7.32(m，3H)，5.59(s，1H)，5.10(s，2H)，4.48-4.33(m，1H)，4.32-4.15(m，1H)，3.90-3.69(m，2H)，3.57-3.42(m，1H)，3.40-3.22(m，1H)，1.24(s，9H)。

将化合物45和氟化铯(10mmol，1.5g)的叔丁醇(10mL)溶液在70℃加热2小时。然后将反应物冷却至室温，用乙酸乙酯稀释，有机层用水和盐水洗涤，然后干燥(Na₂SO₄)并浓缩。通过柱层析纯化(硅胶，洗脱采用10-20％乙酸乙酯的己烷溶液)得到化合物46(0.94g，从43制备的产率为90％)。¹HNMR(300MHz，氯仿-d)δ＝7.49(m，2H)，7.37(m，3H)，5.56(s，1H)，5.29-5.02(m，1H)，5.02-4.81(m，1H)，4.49-4.32(m，1H)，4.22-4.04(m，1H)，3.99-3.54(m，7H)，1.23(s，9H)。

c)制备化合物49

将碳酸钾(3.2mmol，0.44g)加入化合物46(1.18mmol，0.4g)的甲醇(10mL)溶液中。室温搅拌3小时后减压蒸发溶剂并将残余物在乙酸乙酯和水之间分配。将有机层干燥(Na₂SO₄)并浓缩以提供化合物47，该物质无需任何进一步纯化即可使用。¹H NMR(300MHz，氯仿-d)δ＝7.58-7.30(m，5H)，5.54(s，1H)，5.23-4.94(m，1H)，4.39(dd，J＝4.7，10.0Hz，1H)，4.02-3.43(m，6H)，2.25-2.08(m，1H)。

将三氟甲磺酸酐(0.45mmol，0.08mL)加入化合物47(0.3mmol，0.08g)和吡啶(0.05mL)的冷(0℃)溶液中。搅拌1小时后通过加水猝灭反应，有机层用水和盐水洗涤，然后干燥(Na₂SO₄)并浓缩以提供粗物质49，该物质无需任何进一步纯化即可使用。¹H NMR(300MHz，氯仿-d)δ＝7.58-7.32(m，5H)，5.55(s，1H)，5.28(1H，d，J＝55Hz)，5.02-4.85(m，1H)，4.42(dd，J＝4.9，10.4Hz，1H)，4.09(dd，J＝5.7，10.8Hz，1H)，4.01-3.80(m，2H)，3.78-3.50(m，2H)；MS(e/z)，387(m+1)。

实施例15

制备化合物49(备选途径)

a)制备化合物48

将三氟甲磺酸酐(12.0mmol，2.0mL)加入化合物42(4.0mmol，1.0g)和吡啶(16mmol.，1.3mL)的冷(0℃)二氯甲烷溶液(40mL)。搅拌1小时后通过加水猝灭反应，有机层用水和盐水洗涤，然后干燥并浓缩以提供粗制化合物48(2.24g，定量)，该物质无需任何进一步纯化即可使用。¹H NMR(CDCl₃)：δ7.52-7.45(m，2H)，7.41-7.35(m，3H)，5.58(s，1H)，5.08(1H，t，J＝9Hz)，5.06-4.91(m，1H)，4.50-4.25(m，2H)，3.83-3.69(m，2H)，3.65-3.43(m，2H)。MS(e/z)，517(m+1)。

b)制备化合物49和50

将化合物48(2.05mmol，1.1g)和CsF(6.2mmol.，0.94g)与无水叔丁醇(15mL)混合并将混合物在90℃搅拌25分钟。将反应物冷却至室温并用乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯溶液浓缩至干，将残余物通过硅胶层析纯化，采用5％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱。获得澄清油状的化合物49(0.47g，59％产率)。¹HNMR(300MHz，氯仿-d)δ＝7.58-7.32(m，5H)，5.55(s，1H)，5.28(1H，d，J＝55Hz)，5.02-4.85(m，1H)，4.42(dd，J＝4.9，10.4Hz，1H)，4.09(dd，J＝5.7，10.8Hz，1H)，4.01-3.80(m，2H)，3.78-3.50(m，2H)；MS(e/z)，387(m+1)。获得白色固体状化合物50(0.14g，18％产率)。¹H NMR(CDCl3)：δ7.50-7.43(m，2H)，7.40-7.34(m，3H)，5.64(s，1H)，5.15-4.90(m，2H)，4.45-4.15(m，3H)，3.80-3.52(m，2H)，3.55-3.40(m，1H)。MS(e/z)，387(m+1)。

实施例16

制备化合物58a

a)制备化合物51

将NaH(1.3mmol，52mg)加入化合物47(1.0mmol，0.27g)和2-(溴甲基)萘(1.3mmol，0.28g)的冷(0℃)二甲基甲酰胺(5mL)溶液中。搅拌1小时后通过加水猝灭反应并用乙酸乙酯萃取混合物。乙酸乙酯溶液用水和盐水洗涤，然后干燥并浓缩以提供粗制化合物51，该物质通过硅胶柱层析纯化，洗脱采用5％乙酸乙酯的己烷溶液。获得白色固体状化合物51(0.4g，定量)。¹HNMR(CDCl₃)：δ8.0-7.25(m，12H)，5.47(s，1H)，5.17(1H，d，J＝54Hz)，4.87-4.76(m，2H)，4.40-4.30(m，1H)，3.95-3.78(m，2H)，3.75-3.56(m，2H)，3.51-3.39(m，2H)。MS(e/z)，395，417(m+1，m+23)。

b)制备化合物52

将分子筛4A(粉末，4.45g)放入100mL烧瓶并在140℃下真空加热4小时。冷却至室温后加入化合物51和二氯甲烷(15mL)。室温搅拌1小时后将混合物冷却至-78℃，在连续搅拌下依次加入Et₃SiH(4.11mmol.0.66mL)和PhBCl₃(3.63mmol.0.48mL)。将混合物在-78℃再搅拌10分钟，加入30％H₂O₂(12.6mmol.1.6mL)。过滤后用二氯甲烷萃取反应混合物。有机溶液用水和盐水洗涤，然后干燥并浓缩以提供粗制化合物52，该物质通过硅胶柱层析纯化，洗脱采用1％丙酮的二氯甲烷溶液。获得白色固体状化合物52(0.31g，62％)。¹H NMR(CDCl₃)：δ7.87-7.77(m，4H)，7.52-7.46(m，3H)，7.40-7.30(m，5H)，5.14(1H，d，J＝54Hz)，4.83-4.52(m，4H)，3.90-3.83(m，2H)，3.73-3.66(m，3H)，3.56-3.34(m，2H)，1.68(1H，t，3＝6Hz)。MS(e/z)，419(m+23)。

c)制备化合物53

将化合物52(0.025mmol.0.01g)溶于二氯甲烷(0.3mL)，加入Dess-Martin试剂(0.025mmol.0.01g)。将反应物室温搅拌10分钟并浓缩以提供化合物53。 ¹HNMR(CDCl₃)：δ9.70(s，1H)，8.1-7.3(m，12H)，5.17(1H，d，J＝54Hz)，4.80(s，2H)，4.45-4.75(m，2H)，4.25-4.20(m，1H)，4.0-3.90(m，1H)，3.85-3.35(m，3H)。

d)制备化合物58a

通过在存在氯化铈时加入MeMgBr从化合物53制备化合物54a和54b。或者，化合物54a和54b可通过Mitsunobu反应彼此相互转化。54a中的仲羟基被作为酯、优选异丁酰基酯进行保护，并用DDQ除去2O-萘基，然后与三氟甲磺酸苷反应以提供化合物55a。在50-100℃的温度下在DMSO之类的溶剂中与适当保护的核碱基和氢化钠之类的强碱反应，随后用催化加氢除去苄基并作为甲硅烷基醚重保护以得到化合物56a。用甲醇氨溶液或碳酸钾的甲醇溶液除去异丁酰基，随后在25-50℃下用二甲基吡啶和吡啶作为溶剂与DMTCl反应，然后用三氢氟化三乙胺除去甲硅烷基保护基得到化合物57a。进行亚磷酸酯化反应得到亚磷酰胺，化合物58a。

实施例17

制备化合物58b

化合物54a和54b是在存在氯化铈时加入MeMgBr从醛53制备的。或者，化合物54a和54b可通过Mitsunobu反应彼此相互转化。54b中的仲羟基被作为酯、优选异丁酰基酯进行保护，并用DDQ除去2O-萘基，然后与三氟甲磺酸苷反应以提供化合物55b。在50-100℃的温度下在DMSO之类的溶剂中与适当保护的核碱基和氢化钠之类的强碱反应，随后用催化加氢除去苄基并作为甲硅烷基醚重保护以得到化合物56b。用甲醇氨溶液或碳酸钾的甲醇溶液除去异丁酰基，随后在25-50℃下用二甲基吡啶和吡啶作为溶剂与DMTCl反应，然后用三氢氟化三乙胺除去甲硅烷基保护基得到化合物57b。进行亚磷酸酯化反应得到亚磷酰胺58b。

实施例18

制备化合物63

a)制备化合物59

将化合物53(0.7mmol.0.27g)溶于THF(2mL)，加入水(0.7mL)、HCHO(0.7mL)和4N NaOH(水溶液，0.7mL)。反应物在室温搅拌3天。反应物用乙酸乙酯萃取并用水和盐水洗涤，然后干燥并浓缩以提供粗制的59，该物质通过硅胶柱层析纯化，洗脱采用10％丙酮的二氯甲烷溶液。获得白色固体状化合物59(0.19g，64％)。¹H NMR(CDCl₃)：7.94-7.80(m，4H)，7.61-7.45(m，3H)，7.42-7.21(m，5H)，5.20(1H，d，J-54Hz)，4.49-4.40(m，4H)，4.20-3.35(m，11H)，2.10-1.95(m，1H)，1.90-1.75(m，1H)。

b)制备化合物63

使化合物59与TBDPSCl反应得到单甲硅烷基化产物的混合物，分离产物并通过Barton还原反应将羟基还原以得到化合物60。用DDQ除去2O-萘基，然后进行三氟甲磺酸化，并在50-100℃的温度下在DMSO之类的溶剂中与适当保护的核碱基和氢化钠之类的强碱反应以得到化合物61。用三氢氟化三乙胺除去甲硅烷基保护基，然后通过催化氢化除去苄基得到化合物62。将伯羟基作为DMT醚保护，然后通过亚磷酸酯化反应得到亚磷酰胺，化合物63。

实施例19

制备化合物68

化合物65按照Bihovsky(J.Org.Chem.，1988，53，4026-4031)描述的方法从已知化合物64制备。用催化氢化除去苄基保护基，然后将4-OH和6-OH作为苯亚甲基缩醛保护。与三氟甲磺酸苷反应得到双三氟甲磺酸酯66。按照实施例15的描述用CsF选择性置换3-三氟甲磺酸酯基，然后在50-100℃下在存在氢化钠等强碱以及二甲亚砜等极性溶剂时与适当保护的核碱基一起加热，并在50-100℃下用乙酸水溶液除去苯亚甲基保护基以得到核苷67。伯醇与DMTCl反应，随后进行亚磷酸酯化反应得到亚磷酰胺，化合物68。

实施例20

制备化合物75

在60-80℃下在存在对甲苯磺酸时将市售甲基-β-D-吡喃葡糖与二甲基苯亚甲基缩醛反应制备化合物69。用新戊酰氯选择性保护化合物69，三氟甲磺酸化，用CsF置换，并按照实施例14所述用碳酸钾的甲醇溶液水解新戊酰酯得到化合物70。除去苯亚甲基保护基，然后重保护羟基作为苄醚，得到化合物71。与乙酸和硫酸水溶液一起加热将Ome缩醛水解，然后用乙酸酐的DMSO溶液将内半缩醛氧化，并用Tebbe 试剂或Petassis试剂进行烯化反应得到烯烃72。将乙烯基还原并用催化氢化除去苄基保护基，随后重保护4OH和6OH作为苯亚甲基缩醛，得到化合物73。用三氟甲磺酸苷进行三氟甲磺酸化，然后在50-100℃的温度下在DMSO之类的溶剂中与适当保护的核碱基和氢化钠之类的强碱反应以得到74。用催化氢化除去苯亚甲基保护基，保护伯醇作为DMT醚，并进行亚磷酸酯化反应得到亚磷酰胺化合物75。

实施例21

制备化合物81

化合物76按照Houlton(Tetrahedron，1993，49，8087)描述的方法制备，并通过催化氢化反应还原成化合物77。保护4OH和6OH作为苯亚甲基缩醛得到化合物78。按照实施例14描述的方法用新戊酰氯处理2OH，然后Barton还原3OH，并水解新戊酰酯得到化合物79。用三氟甲磺酸苷进行三氟甲磺酸化，然后在50-100℃的温度下在DMSO之类的溶剂中与适当保护的核碱基和氢化钠之类的强碱反应以得到化合物80。用催化氢化除去苯亚甲基保护基，保护伯醇作为DMT醚并进行亚磷酸酯化反应得到亚磷酰胺，化合物81。

实施例22

制备化合物85

将化合物43(按照实施例14所示的方法制备)氧化，然后进行Wittig反应得到化合物82。通过催化氢化反应还原烯烃，接着用碳酸钾的甲醇溶液除去新戊酰基得到化合物83。用三氟甲磺酸苷进行三氟甲磺酸化，然后在50-100℃的温度下在DMSO之类的溶剂中与适当保护的核碱基和氢化钠之类的强碱反应以得到化合物84。用催化氢化除去苯亚甲基保护基，保护伯醇作为DMT醚并进行亚磷酸酯化反应得到亚磷酰胺，化合物85。

实施例23

制备化合物92

使化合物45(按照实施例14所述方法制备)与合适的亲核试剂如叠氮化钠、氰化钠、硫化钠、伯胺或仲胺衍生物或者甲醇钠反应得到化合物86，其中，所述亲核试剂(Nu)可选自任何所需的亲核试剂，其中可包括叠氮化合物、氰化物、硫醇、硫醚、胺或醇盐之类的亲核试剂。用碳酸钾水解新戊酰基得到化合物87。用三氟甲磺酸苷将羟基三氟甲磺酸化得到化合物88。在50-100℃的温度下在DMSO之类的溶剂中与适当保护的核碱基和氢化钠之类的强碱反应以得到化合物89。用催化氢化或通过与乙酸水溶液反应将苯亚甲基保护基除去得到化合物90。保护伯醇作为DMT醚得到化合物91，然后进行亚磷酸酯化反应得到亚磷酰胺，化合物92。

实施例24

制备化合物99

在合适的溶剂中用乙酸钾和18-冠-6处理化合物45得到S_N2取代的三氟甲磺酸酯。在低温下用甲醇氨溶液处理所得产物得到化合物93。或者，可将化合物45置于Mitsunobu条件(R₃P，DIAD，pO₂NBzOH)下，然后进行氨解以得到相同的化合物93。93依次用三氟甲磺酸苷处理，分离三氟甲磺酸酯基，并用氟化铯的叔丁醇溶液处理得到94，与上文所述从化合物45制备化合物46类似。用碳酸钾的甲醇溶液处理94得到氟醇95，该物质用三氟甲磺酸苷的吡啶溶液处理转化成三氟甲磺酸酯。分离，然后在存在氢化钠之类强碱时用核碱基处理得到化合物96。用90％乙酸水溶液除去苯亚甲基保护基得到化合物97。与4，4-二甲氧基三苯甲基氯的吡啶溶液反应得到化合物98，分离之后将该物质转化成氰基乙基亚磷酰胺，化合物99。

实施例25

制备化合物106

在Swern条件(草酰氯，DMSO，三乙胺，二氯甲烷)下氧化化合物43(按照实施例14所述方法制备)得到酮100。用氟化试剂如1，1，2，2-四氟乙基-N，N-二甲胺(或者deoxofluor(一种氟化试剂)或DAST)处理得到化合物101。在碳酸钾/甲醇条件下除去新戊酰基得到化合物102。依次用三氟甲磺酸苷的吡啶溶液处理，分离，并在存在碱时用核碱基处理得到核苷类似物，化合物103。用90％乙酸水溶液除去苯亚甲基得到化合物104，用4，4-二甲氧基三苯甲基氯的吡啶溶液处理该物质将其转化成化合物105。进行亚磷酸酯化反应得到亚磷酰胺，化合物106。

实施例26

制备化合物116

在存在氢化钠时用2-(溴甲基)-萘(Nap溴化物)处理化合物42(按照实施例14所述方法制备)得到Nap-保护的位置异构体(regioisomer)的混合物(107 and108)。通过硅胶层析分离得到异构体，化合物107。在Swern条件(草酰氯， DMSO，三乙胺，二氯甲烷)下氧化化合物107得到酮，化合物109，该物质随后用甲基溴化镁(Methyl Grignard)处理得到甲基醇，化合物110和111的混合物。通过硅胶层析分离所需立体异构体110，然后在三氟甲磺酸苷/吡啶条件下形成三氟甲磺酸酯，并用氟化铯处理得到氟化物112。或者，用TFEDMA处理110一步得到化合物112。用DDQ除去Nap保护基，然后进行三氟甲磺酸化，分离，并在存在碱时用核碱基处理得到化合物113。用90％乙酸水溶液除去苯亚甲基得到化合物114，用4，4-二甲氧基三苯甲基氯的吡啶溶液处理该物质得到化合物115。进行亚磷酸酯化反应得到亚磷酰胺，化合物116。

实施例27

制备化合物129

按照之前在Nucleosides，Nucleotides，and Nucleic Acids(2004)，23(1&2)，439-455中的描述，在存在咪唑和DMF时用叔丁基二甲基甲硅烷基氯处理化合物42(按照实施例14所述方法制备)得到甲硅烷基化化合物117和118的混合物。硅胶层析之后在Swern条件(草酰氯，DMSO，三乙胺，二氯甲烷)下氧化化合物117产生酮，化合物119。用甲基溴化镁处理得到醇，化合物120和121的混合物。通过硅胶层析分离，用四丁基氟化铵处理分离的化合物120，然后在甲苯磺酰氯和吡啶条件下转化成甲苯磺酸酯，得到化合物122。如文献中对类似化合物的记载(Bioorg.Med.Chem.Lett.1996，6，1457)，用碱处理将甲苯磺酸酯122转化成相应的环氧化物，化合物123。在存在碱时使化合物123与选定的嘧啶杂环(杂环碱基)反应形成化合物124。用甲磺酰氯处理使羟基的立体化学反转，然后水解所得甲磺酸酯基，该过程经过无水环状中间体。在DBU/THF条件下用九氟丁烷磺酰氯进行氟化得到氟化化合物126。用90％乙酸水溶液除去苯亚甲基得到化合物127，用4，4-二甲氧基三苯甲基氯的吡啶溶液处理将其转化成化合物128。进行亚磷酸酯化反应得到亚磷酰胺，化合物129。

实施例28

制备化合物134

a)制备化合物130

将化合物49(按照实施例14所述方法制备，10.8mmol，4.20g)和腺嘌呤(54.5mmol，7.35g)悬浮于无水DMSO(80mL)。在该悬浮液中加入氢化钠(54.4mmol，2.18g，60％矿物油悬浮液)。将所得混合物加热至55℃维持12小时，冷却至室温并倒入水中(400mL)。混合物用乙酸乙酯(3×400mL)萃取，合并的有机萃取物用半饱和的NaCl水溶液(3×500mL)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发得到3.93克(97％产率)棕色固体。NMR(¹H和¹⁹F)和LCMS质量分析与结构一致。该材料无需进一步纯化即可使用。

b)制备化合物131

将化合物130(10.5mmol，3.93g)溶于无水吡啶(50mL)。冷却至0℃后溶液用苯甲酰氯(16.9mmol，1.97mL)处理。在0℃继续搅拌15分钟，此时将混合物升至室温2.5小时。将混合物冷却至0℃，用20mL H₂O猝灭并搅拌15分钟。用30分钟在混合物中边搅拌边加入浓氨水(20mL)。将混合物真空浓缩到约40mL并倒入乙酸乙酯(500mL)。混合物用半饱和的NaCl水溶液(3×500mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发成淡棕色泡沫。通过硅胶层析纯化(1.5％甲醇的二氯甲烷溶液)得到2.33克化合物131，其为淡棕色泡沫。NMR(¹H和¹⁹F)和LCMS分析与结构一致。

c)制备化合物132

将化合物131(4.84mmol，2.30g)溶于70mL 90％(v/v)乙酸水溶液。将该溶液加热至80℃维持4小时，然后真空浓缩成粘稠的黄色的油。加入三乙胺(10滴)，然后加入5mL甲醇和100mL乙酸乙酯。形成白色沉淀，沉淀通过过滤收集并用乙酸乙酯洗涤，然后真空干燥过夜。最终得到1.28克(69％)白色固体，化合物132。NMR(¹H和¹⁹F)和LCMS分析与化合物132的结构一致。

d)制备化合物133

将化合物132(3.24mmol，1.25g)悬浮于无水吡啶(12mL)。将所得悬浮液冷却至0℃并边搅拌边用4，4-二甲氧基三苯甲基氯(5.19mmol，1.76g)。在0℃继续搅拌15分钟，并在室温搅拌5小时，然后用甲醇(2mL)猝灭混合物，并真空浓缩成粘稠的黄色油状物。将该油状物溶于二氯甲烷(150mL)并用饱和的NaHCO₃水溶液(100mL)和饱和的NaCl水溶液(2×100mL)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发成黄色泡沫。通过硅胶层析纯化得到2.05克(92％产率)化合物133，其为黄色泡沫。NMR分析(¹H和¹⁹F)与结构相符。

e)制备化合物134

将化合物133(2.59mmol，1.79g)溶于无水DMF(6mL)，加入四唑(1.56mmol，109mg)，1-甲基咪唑(0.65mmol，52μL)和四异丙基氨基-2-氰基乙基磷酰二胺(3.90mmol，1.24mL)。搅拌4.5小时后加入三乙胺(10.4mmol，1.45mL)猝灭反应。将混合物倒入乙酸乙酯(150mL)，用饱和的NaCl水溶液(4×100mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发成淡黄色泡沫。将该固体重溶于乙酸乙酯(7mL)并被逐滴加入70mL己烷进行沉淀。硅胶纯化(1∶1己烷∶乙酸乙酯)所得沉淀得到1.92克(83％)化合物134，其为白色泡沫。NMR(¹H、 ¹⁹F和³¹P)与结构一致。³¹P NMR(CDCl₃)：δppm 151.64，151.58，150.37，150.33。

实施例29

制备化合物140

a)制备化合物135

将化合物49(按照实施例14所述方法制备，7.51mmol，2.9g)和6-碘-2-氨基嘌呤四丁基铵盐(17.6mmol，8.5g，按照J.Org.Chem.1995，60，2902-2905中的描述制备)溶于无水HMPA(26mL)。将混合物室温搅拌18小时，倒入乙酸乙酯，用水和饱和NaCl洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发。通过硅胶层析纯化(1∶1己烷∶乙酸乙酯)得到2.78克(75％产率)化合物135。NMR(¹H和¹⁹F)和LCMS分析与结构一致。

b)制备化合物136

将化合物135(0.64mmol，0.32g)溶于1，4-二噁烷(9mL)，加入9mL 1MNaOH水溶液，并在55℃加热18小时。将混合物冷却，然后用1N HCl中和。将混合物真空浓缩，残余物通过硅胶层析(5％甲醇的二氯甲烷溶液)纯化得到0.22克(88％产率)136。NMR(¹H和¹⁹F)和LCMS分析与结构一致。

c)制备化合物137

将化合物136(3.23mmol，1.25g)溶于无水吡啶(13.6mL)，冷却至0℃，然后用异丁酰氯(4.85mmol，0.51mL)处理。将混合物升至室温并搅拌6小时。将混合物冷却至0℃并用浓氨水(3.2mL)搅拌处理30分钟。将混合物倒入乙酸乙酯(100mL)，用水(200mL)和盐水(200mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。通过硅胶层析纯化(梯度为0-5％甲醇的二氯甲烷溶液)得到1.21克(82％产率)化合物137。NMR(¹H和¹⁹F)和LCMS分析与结构一致。

d)制备化合物138

将化合物137(0.219mmol，0.103g)溶于甲醇(10mL)，在氢气气氛(气球压力)下加入乙酸(0.2mL)和Pd(OH)₂/C(0.44g)，搅拌14小时。将催化剂过滤除去，将所得滤液浓缩并与乙腈一起研磨得到化合物138，其为白色固体。NMR(¹H和¹⁹F)和LCMS分析与结构一致。

e)制备化合物139

将化合物138(3.83mmol，1.41g)溶于无水吡啶(32mL)，加入4，4-二甲氧基三苯甲基氯(5.0mmol，1.71g)并室温搅拌3小时，然后用甲醇(0.5mL)猝灭。将溶液真空浓缩，然后重溶于乙酸乙酯。有机溶液用饱和的NaHCO₃水溶液和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。通过硅胶层析纯化得到1.63克(70％产率)139。NMR(¹H和¹⁹F)分析与结构相符。

f)制备化合物140

将化合物139(1.59mmol，1.07g)溶于无水DMF(4.25mL)，加入四唑(1.35mmol，95mg)、1-甲基咪唑(0.45mmol，35μL)和四异丙基-2-氰基乙基磷酰二胺(2.25mmol，0.71mL)。将混合物室温搅拌3小时，倒入乙酸乙酯并用饱和NaHCO₃水溶液和盐水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发。通过硅胶层析纯化得到1.07克(78％产率)化合物140。NMR(¹H、¹⁹F和³¹P)分析与结构一致。³¹P NMR(CDCl₃)：δppm 151.30，151.24，148.82，148.78。

实施例30

制备有缺口的寡聚化合物

用自动固相分析来制备本发明使用的寡聚化合物。一种示例性的有缺口的寡聚化合物是ISIS-410131，其具有SEQ ID NO：01和结构式：5-C_fU_fTAGCACTGGCC_fU_f-3。各核苷间连接基团是硫代磷酸酯，没有下标f的T、A、G和C字母各自表示β-D-2-脱氧核糖核苷，而C_f和U_f各为单体亚单元，其中，Bx分别代表杂环碱基胞嘧啶或尿嘧啶，且其中的单体亚单元具有以下结构式和构型：

410131的合成以40μmol的规模进行，采用具有聚苯乙烯固体支持物的

Oligopilot 10(GE Healthcare)合成仪，加载200μmol/g通用接头。包括化合物8和13在内的所有核苷亚磷酰胺制备成0.1M的无水乙腈溶液。在存在4，5-二氰基咪唑时用4摩尔当量各自的亚磷酰胺进行偶联，偶联时间为14分钟。在1∶13-甲基吡啶∶乙腈中用0.2M苯乙酰基硫化物处理将三价的磷硫化成硫代磷酸酯。所得有缺口的寡聚化合物用1∶1三乙胺∶乙腈去保护(室温1小时)，然后在55℃用浓氨水处理7小时。进行离子交换纯化，然后进行反向脱盐得到9.8μmol(44mg)纯化的寡核苷酸。通过LC/MS离子对层析进行质量和纯度分析，显示UV纯度为98.5％，ESI质量为4522.8Da(计算值4523.6Da)。

实施例31

靶向PTEN的2-10-2有缺口的寡聚化合物：体外研究

合成有缺口的寡聚化合物并检测它们在一定剂量范围内降低PTEN表达的能力。采用3μg/mL Lipofectin在OptiMEM中的溶液，用剂量为0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20或40nM的有缺口的寡聚化合物转染bEND细胞4小时，之后用正常生长培养基(DMEM，高葡萄糖，10％FBS，青霉素-链霉素)代替转染混合物。1天后(大约在转染开始后24小时)收获RNA并用实时RT-PCR分析PTEN和亲环蛋白A的RNA水平。数值代表根据亲环蛋白A水平标准化的PTEN RNA水平的平均值和标准差(n＝3)。

用所得的剂量反应曲线来确定下面列出的IC₅₀。Tm用4μM下面列出的修饰的寡聚物和4μM互补RNA AGGCCAGTGCTAAG(SEQ ID NO：7)在100mM磷酸缓冲液、0.1mM EDTA，pH 7中在260nm确定。

SEQ ID NO. 组成(5’至3’) Tm(℃) IC₅₀(nM)

/ISIS NO.

01/392753 C_eU_eTAGCACTGGCC_eU_e 51.3 37

01/410312 C_mU_mTAGCACTGGCC_mU_m 49.2 23

01/410131 C_fU_fTAGCACTGGCC_fU_f 50.0 16

各核苷间连接基团是硫代磷酸酯。有下标的核苷定义如下，其中，Bx是杂环碱基：

实施例32

靶向PTEN的2-10-2有缺口的寡聚化合物：体外研究

SEQ ID NO. 组成(5’至3’)

/ISIS NO.

02/392063 ^MeC₁T₁TAGCACTGGC^MeC₁T₁

01/410131 C_fU_fTAGCACTGGCC_fU_f

02/417999 ^MeC_fT_fTAGCACTGGC^MeC_fT_f

SEQ ID NO. ％UTC剂量

/ISIS NO. 0.3125 0.625 1.25 2.5 5 10 20 40

02/392063 86 83 66 40 36 24 32 17

01/410131 78 70 71 50 52 35 29 17

02/417999 98 108 77 72 68 43 33 20

各核苷间连接基团是硫代磷酸酯，上标Me表示随后的C是5-甲基C。有下标的核苷定义如下，其中，Bx是杂环碱基：

实施例33

靶向PTEN的2-10-2有缺口的寡聚化合物：体内研究

给6周龄Balb/c小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)注射一次剂量为20或60mg/kg的靶向PTEN的有缺口的寡聚化合物。施用72小时后处死小鼠。将肝组织均质并按照本发明的描述用实时PCR量化mRNA水平，与未处理的对照水平进行比较(％UTC)。进行血浆化学分析。

SEQID NO. 组成(5’至3’) 剂量％UTC

/ISIS NO. (mg/kg)

盐水 N/A 100

01/392753 C_eU_eTAGCACTGGCC_eU_e 20 84

01/392753 C_eU_eTAGCACTGGCC_eU_e 60 68

01/410312 C_mU_mTAGCACTGGCC_mU_m 20 83

01/410312 C_mU_mTAGCACTGGCC_mU_m 60 27

01/410131 C_fU_fTAGCACTGGCC_fU_f 20 26

01/410131 C_fU_fTAGCACTGGCC_fU_f 60 8

各核苷间连接基团是硫代磷酸酯。有下标的核苷定义如下：

用这些有缺口的寡聚化合物处理后未观察到ALT升高且对体重或器官重量没有显著影响。

实施例34

靶向PTEN的有缺口的寡聚化合物：体内研究

给6周龄Balb/c小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)每周注射两次剂量为0.47、1.5、4.7或15mg/kg的靶向PTEN的有缺口的寡聚化合物，持续3周。最后一次施用48小时后处死小鼠。将肝组织均质并按照本发明的描述用实时PCR量化mRNA水平，与未处理的对照水平进行比较(％UTC)。进行血浆化学分析。Tm用4μM下面列出的修饰的寡聚物和4μM互补RNAAGGCCAGTGCTAAG(SEQ ID NO：7)在100mM磷酸缓冲液、0.1mM EDTA，pH 7中在260nm确定。

SEQ ID NO. 组成(5’至3’) Tm(℃)

/ISIS NO.

01/410131 C_fU_fTAGCACTGGCC_fU_f 50.7

02/417999 ^MeC_fT_fTAGCACTGGC^MeC_fT_f 52.6

各核苷间连接基团是硫代磷酸酯，上标Me表示随后的C是5-甲基C，有下标f的核苷定义如下，其中，Bx是杂环碱基：

SEQ ID NO. ％UTC ％UTC ％UTC ％UTC

/ISIS NO.0. 47mg/kg 1.5mg/kg 4.7mg/kg 15mg/kg

01/410131 - - - 12

02/417999 77 64 31 10

盐水％UTC＝100(剂量N/A)

相对于注射盐水的小鼠，还测定了血清中肝转氨酶，丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的水平。大致的肝转氨酶水平列于下表。

SEQ ID NO. AST AST AST AST

/ISIS NO. 0.47mg/kg 1.5mg/kg 4.7mg/kg 15mg/kg

01/410131 - - - 106

02/417999 51 90 86 37

盐水 82(剂量N/A)

SEQ ID NO. ALT ALT ALT ALT

/ISIS NO. 0.47mg/kg 1.5mg/kg 4.7mg/kg 15mg/kg

01/410131 - - - 27

02/417999 28 31 42 21

盐水 34(剂量N/A).

实施例35

靶向PTEN的有缺口的寡聚化合物：体内研究

给6周龄Balb/c小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)注射一次剂量为3.2、10、32或100mg/kg的靶向PTEN的有缺口的寡聚化合物。施用72 小时后处死小鼠。将肝组织均质并按照本发明的描述用实时PCR量化mRNA水平，与未处理的对照水平进行比较(％UTC)。进行血浆化学分析。Tm用4μM下面列出的修饰的寡聚物以及互补RNATCAAGGCCAGTGCTAAGAGT(SEQ ID NO：8)(对于2/14/2基序寡聚物)和互补RNAAGGCCAGTGCTAAG(SEQ ID NO：7)(对于2/10/2寡聚物)在100mM磷酸缓冲液、0.1mM EDTA，pH 7中在260nm确定。

SEQ ID NO. 组成(5’至3’) Tm(℃) 基序

/ISIS NO.

03/411026 C_fU_fGCTAGCCTCTGGATU_fU_f 57.1 2/14/2

04/418000 ^MeC_fT_fGCTAGCCTCTGGATT_fT_f 58.5 2/14/25-CH₃翼

01/410131 C_fU_fTAGCACTGGCC_fU_f 50.7 2/10/2

02/417999 ^MeC_fT_fTAGCACTGGC^MeC_fT_f 52.6 2/10/25-CH₃翼

02/392063 ^MeC₁T₁TAGCACTGGC^MeC₁T₁ 60.5 2/10/25-CH₃翼

SEQIDNO. ％UTC ％UTC ％UTC ％UTC

/ISIS NO. 3.2mg/kg 10mg/kg 32mg/kg 100mg/kg

02/392063 92 29 7 7

03/411026 92 52 12 7

04/418000 100 38 12 5

01/410131 100 59 9 3

02/417999 94 31 10 5

盐水％UTC＝100

SEQ ID NO. AST AST AST AST

/ISIS NO. 3.2mg/kg 10mg/kg 32mg/kg 100mg/kg

02/392063 57 86 81 27399

03/411026 166 78 69 130

04/418000 90 94 80 345

01/410131 48 87 18 751

02/417999 72 126 99 55

SEQ IDNO. ALT ALT ALT ALT

/ISIS NO. 3.2mg/kg 10mg/kg 32mg/kg 100mg/kg

02/392063 9 13 10 18670

03/411026 25 20 26 115

04/418000 17 33 44 321

01/410131 14 15 22 11

02/417999 13 22 15 11.

实施例36

靶向PTEN的有缺口的寡聚化合物：体内研究

给6周龄Balb/c小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)注射一次剂量为3.2、10、32或100mg/kg的靶向PTEN的有缺口的寡聚化合物。施用72小时后处死小鼠。将肝组织均质并按照本发明的描述用实时PCR量化mRNA水平，与未处理的对照水平进行比较(％UTC)。用Graphpad Prism估算各种寡聚化合物的ED₅₀，如下所示。

SEQ ID NO. 组成(5’至3’) ED₅₀(mg/kg)

/ISIS NO.

02/417999 ^MeC_fT_fTAGCACTGGC^MeC_fT_f 7.5

02/425857 ^MeC_hT_hTAGCACTGGC^MeC_hT_h 14.5

SEQ ID NO. ％UTC剂量

/ISIS NO. 3.2mg/kg 10mgg/g 32mg/kg 100mg/kg

02/417999 77 41 9 5

02/425857 76 72 20 6

盐水 100

SEQ ID NO. AST(IU/L)剂量

/ISIS NO. 3.2mg/kg 10mg/kg 32mg/kg 100mg/kg

02/417999 72 126 99 55

02/425857 88 64 77 46

盐水 77(剂量：n/a)

SEQ ID NO. ALT(IU/L)剂量

/ISIS NO. 3.2mg/kg 10mg/kg 32mg/kg 100mg/kg

02/417999 26 24 19 31

02/425857 28 26 29 51

盐水 31(剂量：：n/a).

实施例37

有缺口的寡聚化合物

制备了具有含各种缺口和翼大小的有缺口的基序的寡聚化合物。Tm用4μM下面列出的修饰的寡聚物以及互补RNATCAAGGCCAGTGCTAAGAGT(SEQ ID NO：8)(对于Tm¹)或互补RNAAGGCCAGTGCTAAG(SEQ ID NO：7)(对于Tm²)在100mM磷酸缓冲液、0.1mM EDTA，pH 7中在260nm确定。

SEQ ID NO. 组成(5’至3’) Tm¹(℃)缺口聚合物设计

/ISIS NO.

02/417999 ^MeC_fT_fTAGCACTGGC^MeC_fT_f 59.42-10-2

02/425858 ^MeC_fT_fTfAGCACTGG^MeCf^MeC_fT_f 67.43-8-3

05/425859 T_f ^MeC_fT_fTAGCACTGGC^MeC_fT_fT_f 65.03-10-3

05/425860 T_f ^MeC_fT_fTfAGCACTGG^MeC_f ^MeC_fT_fT_f 70.44-8-4

06/425861 ^MeC_fT_f ^MeC_fT_fT_fAGCACTGG^MeC_f ^MeC_fT_fT_f 74.35-8-4

实施例38

靶向PTEN的半体：体内研究

给6周龄Balb/c小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)注射一次剂量为1.6、5、16或50mg/kg的靶向PTEN的有缺口的寡聚化合物。在最后一次施用72小时后处死小鼠。将肝组织均质并按照本发明的描述用实时PCR量化mRNA水平，与未处理的对照水平进行比较(％UTC)。用Graphpad Prism估算各种寡聚化合物的ED50，如下所示。Tm用4μM下面列出的修饰的寡聚物以及互补RNA TCAAGGCCAGTGCTAAGAGT(SEQ ID NO：8)(对于Tm¹)或互补RNA AGGCCAGTGCTAAG(SEQ ID NO：7)(对于Tm²)在100mM磷酸缓冲液、0.1mM EDTA，pH 7中在260nm确定。

SEQ ID NO./ISIS NO. 组成(5’至3’) Tm¹ Tm²

02/412471 ^MeC₁T₁T₁AGCACTGGC^MeCT 65.5 62.5

02/429495 ^MeC_fT_fT_fAGCACTGGC^MeCT 63.8 59.6

各核苷间连接基团是硫代磷酸酯，上标Me表示随后的C是5-甲基C，有下标的核苷定义如下，其中，Bx是杂环碱基：

剂量

SEQ ID NO. ％UTC at dosage

/ISIS NO. 1.6mg/g 5mg/kg 16mg/kg 50mg/kg

02/412471 85 51 20 23

02/429495 90 79 40 17

盐水％UTC＝100

SEQ ID NO. AST(IU/L)剂量

/ISIS NO. 1.6mg/kg 5mg/kg 16mg/kg 50mg/kg

02/412471 67 67 69 4572

02/429495 95 54 77 58

盐水 68(剂量：n/a)

SEQ ID NO. ALT(IU/L)剂量

/ISIS NO. 1.6mg/kg 5mg/kg 16mg/kg 50mg/kg

02/412471 29 31 33 3419

02/429495 33 31 38 23

盐水 35(剂量：n/a)。

序列表

<110>ISIS药物公司

查尔斯.艾勒森

巴尔克利申.巴特

撒扎.P.普拉卡什

埃里克.E.斯威兹

<120>四氢吡喃核酸类似物

<130>CHEM0041WO

<150>61/052,030

<151>2008-05-09

<150>61/031,226

<151>2008-02-25

<150>61/021,236

<151>2008-01-15

<150>60/956,100

<151>2007-08-15

<160>8

<170>用于Windows 4.0版的FastSEQ

<210>1

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域

<222>1，2，13，14

<223>在这些位点的碱基是RNA

<400>1

cutagcactg gccu 14

<210>2

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>2

cttagcactg gcct 14

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<222>2，17，18

<223>在这些位点的碱基是RNA

<400>3

cugctagcct ctggatuu 18

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>4

ctgctagcct ctggattt 18

<210>5

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>5

tcttagcact ggcctt 16

<210>6

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>6

ctcttagcac tggcctt 17

<210>7

<211>14

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>7

aggccagtgc taag 14

<210>8

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>8

tcaaggccag tgctaagagt 20

Claims

1.一种四氢吡喃核苷类似物，其具有式XVII：

其中：

Bx是杂环碱基部分；

T₅是羟基保护基；

Z₁是O(CH₂)₂CN；

Z₂是N[CH(CH₃)₂]₂；和

q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自为H。

2.如权利要求1所述的四氢吡喃核苷类似物，其中，Bx是尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤。

3.如权利要求1或2中任一项所述的四氢吡喃核苷类似物，其中，T₅是乙酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、对-氯苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、苯甲酰基、对-苯基苯甲酰基、2,6-二氯苄基、二苯基甲基、对-硝基苄基、三苯基甲基(三苯甲基)、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、苯甲酰甲酸酯基、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰基、9-芴基-甲基碳酸酯基、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、或三甲氧基三苯甲基。

4.如权利要求1或2中任一项所述的四氢吡喃核苷类似物，其中，T₅是乙酰基、苄基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或二甲氧基三苯甲基。

5.如权利要求1所述的四氢吡喃核苷类似物，其中，T₅是4,4’-二甲氧基三苯甲基。

6.一种包含至少一个式XI的四氢吡喃核苷类似物的寡聚化合物：

其中所述至少一个式XI的四氢吡喃核苷类似物各自独立地满足：

Bx是杂环碱基部分；

T₃和T₄各自独立地为：将四氢吡喃核苷类似物连接到寡聚化合物的核苷间连接基团；或者T₃和T₄中的一个是将四氢吡喃核苷类似物连接到寡聚化合物的核苷间连接基团，且T₃和T₄中的另一个是H、羟基保护基或者连接的共轭基团；

其中所述核苷间连接基团选自：磷酸二酯、亚甲基亚氨基、3’-CH₂-C(=O)-N(H)-5’、3’-CH₂-N(H)-C(=O)-5’、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯及其它烷基膦酸酯、亚膦酸酯、氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、硒基磷酸酯和硼代磷酸酯、3'-CH₂-N(CH₃)-O-5'、3'-O-CH₂-O-5'和3'-S-CH₂-O-5'；

q₁、q₂、q₃、q₄、q₅、q₆和q₇各自为H；

R₁为H；

R₂为氟；和

其中，所述寡聚化合物包含8至40个通过核苷间连接基团连接的单体亚单元，且至少一个核苷间连接基团是硫代磷酸酯核苷间连接基团。

7.如权利要求6所述的寡聚化合物，其包含至少两个式XI的四氢吡喃核苷类似物。

8.如权利要求6或7中任一项所述的寡聚化合物，其包含至少两个通过硫代磷酸酯核苷间连接基团连接的邻近的式XI的四氢吡喃核苷类似物。

9.如权利要求6或7中任一项所述的寡聚化合物，其包含至少一个β-D-2’-脱氧-核糖核苷。

10.如权利要求9所述的寡聚化合物，其包含至少一个通过硫代磷酸酯核苷间连接基团连接到式XI的四氢吡喃核苷类似物的β-D-2’-脱氧-核糖核苷。

11.如权利要求6或7中任一项所述的寡聚化合物，其包含至少一个具有2至5个邻近的式XI的四氢吡喃核苷类似物的区域。

12.如权利要求11所述的寡聚化合物，其还包含至少一个具有除β-D-核糖核苷和β-D-2’-脱氧核糖核苷以外的1至5个邻近的单体亚单元的额外区域，其中，所述额外区域通过至少一个β-D-2’-脱氧核糖核苷与所述至少一个区域隔开。

13.如权利要求6所述的寡聚化合物，其包含至少两个区域，各区域具有1至5个邻近的式XI的四氢吡喃核苷类似物，且其中所述两个区域通过至少一个单体亚单元隔开，其中，各单体亚单元独立地为核苷或修饰的核苷。

14.如权利要求13所述的寡聚化合物，其包含有缺口的寡聚化合物，其中，所述具有邻近的式XI的四氢吡喃核苷类似物的至少两个区域中的一个位于5’-端，而所述具有邻近的式XI的四氢吡喃核苷类似物的至少两个区域中的另一个位于3’-端，且其中所述两个区域通过包含6至18个单体亚单元的内部区域隔开，其中，各单体亚单元独立地为核苷或修饰的核苷。

15.如权利要求6、7、13或14中任一项所述的寡聚化合物，其中，至少一个核苷间连接基团是磷酸二酯核苷间连接基团。

16.如权利要求6、7、13或14中任一项所述的寡聚化合物，其中，各核苷间连接基团是硫代磷酸酯核苷间连接基团。

17.如权利要求6、7、13或14中任一项所述的寡聚化合物，其包含10至21个单体亚单元。

18.如权利要求6、7、13或14中任一项所述的寡聚化合物，其包含12至17个单体亚单元。

19.如权利要求6、7、13或14中任一项所述的寡聚化合物，其包含13至16个单体亚单元。

20.如权利要求6或7中任一项所述的寡聚化合物，其包含至少两个式XI的四氢吡喃核苷类似物通过硫代磷酸酯核苷间连接基团连接。

21.如权利要求13或14中任一项所述的寡聚化合物，其中各单体亚单元是β-D-2’-脱氧核糖核苷。

22.如权利要求6、7、13或14中任一项所述的寡聚化合物，其中，各Bx独立地为尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤。

23.减少靶信使RNA的体外方法，其包括将一或多个细胞、或组织与如权利要求6、7、13或14中任一项所述的寡聚化合物接触。

24.如权利要求6、7、13或14中任一项所述的寡聚化合物在制备用于体内减少靶信使RNA的药物中的用途，所述药物通过使一或多个细胞、组织或动物与如权利要求6、7、13或14中任一项所述的寡聚化合物接触减少靶信使RNA。

25.如权利要求6、7、13或14中任一项所述的寡聚化合物在制备用于抑制基因表达的药物中的用途。