CN101910409A - 检测微生物污染的体系 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及检测液体样品微生物污染的体系，其包括自液体样品中富集微生物的装置，该装置具有(i)高压舱，(ii)过滤器壳，其包括液体可渗透的吸附材料床，并被调整以适于与所述高压舱流体连接，(iii)对所述高压舱加压的装置，所述体系还包括用于检测吸附在所述吸附材料上的微生物的试剂盒，其中所述试剂盒基于使用显色和/或荧光底物类似物的酶学检测。

Description

检测微生物污染的体系
发明领域
本发明属于快速检测微生物污染的领域。具体地，本发明涉及快速检测流体样品中微生物污染的体系，尤其是针对源自粪便的微生物污染。本发明的体系包括自流体样品中富集细菌的装置，其为用于检测微生物污染的试剂盒的一部分，具体为通过使用显色和/或荧光底物类似物进行酶学检测来检测吸附至吸附材料上的微生物的试剂盒，以及使用本发明装置检测水样中的微生物污染的方法。
背景技术
发展中国家每年都有数以百万计的人罹患水传播疾病。据报道，世界范围内每年大约有两亿五千万新发的水传播传染病，导致一百八十万起由腹泻引起的死亡事故，其中90％为五岁以下的儿童。仅在印度一个国家，每年就有三十二万儿童死于腹泻。这些几乎都是由于缺乏可靠和具有成本效益的水生产技术、公共卫生和保健，从而导致用水的不安全或水质的细菌学质量差引起的。此外，还缺乏评价水的细菌学质量的体系。使用安全的饮用水能够减少6-25％的腹泻发病率。如果水不安全，能够对水进行处理。事实上，现场进行氯化消毒处理能够减少35-39％的腹泻。因此，亟需用于现场评价水的细菌学质量以确定是否需要对水进行处理的体系。
导致水传播疾病的最常见原因是粪便污染。最常见的，饮用水被动物和人的排泄物所污染。由粪便引起的饮用水污染常由于缺少价廉的诊断方法而被忽视。为了检测粪便污染，能够使用所谓的指示生物。检测粪便污染的指示生物：i)普遍地大量存在于人类和恒温动物的粪便中；ii)容易被简单的方法检测；iii)在天然水中不生长；iv)留存在水中并能通过与处理水传播性病原体相似的方法去除。非常合适的粪便指示生物，也是为上述目的由世界卫生组织(WHO)指定的指示生物是大肠杆菌(Escherichia coli)。更确切地说，粪便污染的指征能够通过测定每100ml水中大肠菌群(兼性厌氧、杆状、革兰氏阴性、不形成孢子的发酵乳糖的细菌；包括例如大肠杆菌属、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷白氏杆菌属(Kebsiella)和枸橼酸杆菌属(Citrobacter)的细菌)尤其是耐热大肠菌大肠杆菌的数量来获得。
关于检测大肠杆菌的测试体系，WHO引入了首字母组合词ASSURED来描述诊断测试的理想特性和标准，各字母的含义分别为：A代表Affordable，即可承受的价格(对那些受感染威胁的人)；S代表Sensitive，即灵敏性(较少的假阴性)；S代表Specific，即特异性(较少的假阳性)；U代表User-friendly，即用户友好(容易操作，仅需要最少的培训)；R代表Rapid，即快速(初诊即可以进行处理)和robust，即充满活力(无需冷藏)；E代表Equipment-free，即无需设备；D代表Deliverable to developing countries，即可交付发展中国家使用。已经使用了很多方法来检测水中的大肠菌和大肠杆菌。这些检测方法基于如培养、酶反应和免疫或基因检测。目前，有超过30种可选的商业化的分析方法用于检测大肠菌群和大肠杆菌。这些测试中的大部分都不符合ASSURED标准中关于速度和灵敏度的要求，或者不符合不需要设备的要求。事实上，其中的大部分测试为了能够满足最基本的灵敏度和特异性测试标准，都需要专用的实验室。但是，应当理解，比实验室测试的灵敏度低的对于粪便污染的快速现场测试可以有效减少患病人数，拯救生命。因此，灵敏度高的实验室测试并不总是比做这项工作，即告知用户饮用水是否安全的灵敏度较低但快速且特异性好的现场测试有用。
因此，亟需简单、便宜、耐用且快速的用于现场检测水中粪便污染的测试方法。这样的方法的使用频率将更高，应用场合更广，使用人群更多，并能更早地提醒人们，从而拯救生命。
发明内容
本发明人现在已经发现，能够开发能够检测大肠菌群和大肠杆菌的诊断测试体系，该体系简单、便宜、耐用、快速，适合现场检测水样中的粪便污染。该诊断测试体系将微生物细胞的固相吸附与所吸附细胞的特异性生长和酶学检测相结合。
一方面，本发明提供了自液体样品中富集微生物的装置，其包括：
a)用于盛装液体样品的高压舱，其包括：
液体入口，所述液体样品能够通过其进入所述高压舱，
液体出口，所述液体样品能够通过其离开所述高压舱，并调整该液体出口以适于与过滤器壳的液体入口可密封地连接，和
对所述高压舱加压的机构；
b)过滤器壳，其包括：
液体入口，所述液体样品能够通过其进入过滤器壳，并调整该液体入口以适于与所述高压舱的液体出口连接，
液体出口，所述液体样品能够通过其离开过滤器壳，以及
液体可渗透的吸附材料床，其位于所述过滤器壳的所述液体入口与液体出口之间的过滤器壳内，并能够通过静电相互作用吸附微生物，
由此，当：
i)将含液体样品的所述高压舱与所述过滤器壳可密封地连接，使得所述高压舱与所述过滤器壳能够通过其间的密封通道进行流体连通，
ii)对所述高压舱加压时，
所述液体样品被迫从所述高压舱进入过滤器壳内，并通过所述液体可渗透的吸附材料床，然后通过所述液体出口离开。
在本发明装置的优选实施方案中，在吸附材料床位置处的过滤器壳基本上是圆柱状和半透明的，并且其中所述过滤器壳的内容积优选为1ml至10ml。
在本发明装置的另一优选实施方案中，吸附材料的表面带有正电荷，且选自不溶性金属氢氧化物、金属氧化物、载体材料上的金属氢氧化物、载体材料上的金属氧化物、载体材料上的外源凝集素、载体材料上的碳二亚胺、载体材料上的阳离子聚合物、阴离子交换树脂和带正电荷的电极。
在吸附材料基于阳离子聚合物的情况下，这样的聚合物优选选自聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺及其组合。
在吸附材料基于不溶性金属氧化物和/或氢氧化物的情况下，这样的不溶性金属氧化物和/或氢氧化物优选选自羟磷灰石、氢氧化锆、氢氧化钛、氢氧化锰和氢氧化铪、锆氧化物、钛氧化物、锰氧化物、铁氧化物和铪氧化物。在优选实施方案中，吸附材料是羟磷灰石。在可选的优选实施方案中，吸附材料为选自锆氧化物、铪氧化物、锰氧化物、钛氧化物或铁氧化物的金属氧化物。
使用本发明装置自其样品中富集微生物的液体优选为水，最优选为饮用水。
优选将所述高压舱的液体入口和液体出口合并成一个端口。
另一方面，本发明提供了用于检测液体样品中微生物的体系，其包括：
i)自液体样品中富集微生物的上述发明的装置；
ii)通过检测所述微生物的特异性酶活性来检测所述微生物的试剂盒，所述试剂盒包括显色和/或荧光底物和液体生长培养基，所述底物优选为所述生长培养基的补充物的形式；以及任选地
iii)安装、操作和拆卸装置的说明，和/或通过使用所述检测试剂盒来检测富集在所述装置中的微生物的说明。
在本发明体系的优选实施方案中，该试剂盒用于分别通过检测β-D-半乳糖苷酶和/或β-D-葡萄糖醛酸酶的酶活性来检测大肠菌群和/或大肠杆菌。
合适的用于检测β-D-葡萄糖醛酸酶和/或β-D-半乳糖苷酶活性的显色或荧光底物包括但不限于4-甲基伞形酮酰(umbelliferyl)-β-D-葡糖苷酸(MUG)、邻-硝基苯基β-D-葡糖苷酸(ONPG)、对-硝基苯基β-D-葡糖苷酸(PNPG)、β-萘亚甲基酰胺(naphthalamide)-β-D-葡糖苷酸、6-溴-2-萘基β-D-葡糖苷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-葡糖苷酸(BCIG或X-葡糖苷酸)、α-萘酚(napthol)-β-D-葡糖苷酸、4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃半乳糖苷(MUGal)、邻-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPGal)、对-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPGal)、6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(Salmon-Gal)、5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)、4-硝基苯基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(NPSGal)、6-溴-2-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷、3，4-二硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(DNPGal)、功能衍生物及其组合。
优选地，液体生长培养基包括异乳糖、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和/或乳糖，以便诱导欲检测其活性的酶(即β-D-葡萄糖醛酸酶和/或β-D-半乳糖苷酶)。
另一方面，本发明提供了检测液体样品中微生物的方法，所述方法包括下述步骤：
a)i)提供用于装盛液体样品的高压舱，其包括：
液体入口，液体样品能够通过其进入所述高压舱，
液体出口，所述液体样品能够通过其离开所述高压舱，调整该液体出口以适于与过滤器壳的液体入口可密封地连接，和
用于对所述高压舱加压的机构；
ii)提供过滤器壳，其具有液体入口和液体出口且在所述液体入口与所述液体出口之间设有液体可渗透的吸附材料床，其中所述吸附材料能够通过静电相互作用吸附微生物；
iii)将液体样品装入所述高压舱；
iv)使所述高压舱与所述过滤器壳的液体入口可密封地连接，使得所述高压舱与所述过滤器壳能够通过其间的密封通道进行流体连通；
b)对装有所述液体样品的所述高压舱加压，从而迫使所述液体样品从所述高压舱进入所述过滤器壳，所述液体样品借此通过所述液体可渗透的吸附材料床，然后从所述液体出口离开所述过滤器壳，存在于所述液体样品中的所述微生物被吸附在液体可渗透的吸附材料床上；
c)继续对所述高压舱加压，直至有效量的所述液体样品已经通过所述液体可渗透的吸附材料床；
d)用补充了显色和/或荧光底物的液体生长培养基孵育所述液体可渗透的吸附材料床一段有效的时间，以检测微生物的酶活性；以及
e)监测显色或荧光颜色的变化以确定是否有微生物被吸附在吸附材料上，其中有微生物被吸附在所述吸附材料上表明所述液体样品中存在微生物。
在本发明方法的优选实施方案中，在吸附材料床位置处的过滤器壳基本上是圆柱状和半透明的，并且其中所述过滤器壳的内容积优选为1ml至10ml。
在本发明方法的另一优选实施方案中，吸附材料的表面带有正电荷，且选自不溶性金属氢氧化物、金属氧化物、载体材料上的金属氢氧化物、载体材料上的金属氧化物、载体材料上的外源凝集素、载体材料上的碳二亚胺、载体材料上的阳离子聚合物、阴离子交换树脂和带正电荷的电极。
在吸附材料基于阳离子聚合物的情况下，这样的聚合物优选选自聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺及其组合。
在吸附材料基于不溶性金属氢氧化物的情况下，这样的不溶性金属氢氧化物优选选自羟磷灰石、氢氧化锆、氢氧化钛和氢氧化铪。在最优选的实施方案中，吸附材料是羟磷灰石。
使用本发明方法检测其样品中微生物的液体优选为水，最优选为饮用水。
对所述高压舱加压的装置可以是注射器型活塞，或能够通过使其壁变形来压缩舱容积的可变形的舱壁。
在本发明更优选的实施方案中，液体生长培养基和显色和/或荧光底物用于分别通过检测β-D-半乳糖苷酶和/或β-D-葡萄糖醛酸酶的酶活性来检测大肠菌群和/或大肠杆菌。为实现上述目的，可以通过自以下物质中选择显色或荧光底物来非常合适地实施本发明的方法：4-甲基伞形酮酰-β-D-葡糖苷酸(MUG)、邻-硝基苯基β-D-葡糖苷酸(ONPG)、对-硝基苯基β-D-葡糖苷酸(PNPG)、β-萘亚甲基酰胺-β-D-葡糖苷酸、6-溴-2-萘基β-D-葡糖苷酸、5-溴-4氯-3-吲哚基β-D-葡糖苷酸(BCIG或X-葡糖苷酸)、α-萘酚-β-D-葡糖苷酸、4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃半乳糖苷(MUGal)、邻-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPGal)、对-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPGal)、6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(Salmon-Gal)、5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)、4-硝基苯基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(NPSGal)、6-溴-2-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷、3，4-二硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(DNPGal)、功能衍生物及其组合。
在本发明方法的优选实施方案中，液体生长培养基包括异乳糖、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和/或乳糖。
在另一优选实施方案中，有微生物被吸附在吸附材料上表明所述液体样品中有粪便细菌的潜在污染。
附图说明
图1表示本发明装置中的各个部件：压力泵(1)，高压舱(2)，水样(3)，液体入口(4)(通过图示的漏斗加入液体)，液体出口(5)，连接管(6)，过滤器壳(7)。本领域技术人员应当理解，液体入口也可以通过容器顶端放置加压泵位置的开口形成，将加压泵移去后即可应用。
图2显示了本发明过滤器壳的照片(左侧)和示意图(右侧)，更加详细地展示了各个部件。过滤器壳(1)(本照片中为一次性注射器)，预过滤器(粗滤)(2)，吸附材料床(3)，后置过滤器(精滤)(4)，液体入口(5)，液体出口(6)。液体样品的流向如箭头所示。
图3的照片显示了过滤器壳(1)(在该照片中为一次性注射器)，预过滤器(粗滤)(2)，吸附材料床(3)，后置过滤器(精滤)(4)，液体入口(5)，液体出口(6)。该过滤器被用于处理10L含大肠杆菌的液体样品。注射器柱塞(7)被用于将显色培养液(本例中为
Figure BPA00001174914000071
)按照箭头所示方向从液体出口处吸进过滤器壳中。在37℃下孵育数小时后，由于微生物的代谢转化，显色液体已从澄清的溶液变为黄色的溶液。
图4显示从开始取样到观察到阳性测试结果(本例中为黄颜色)的总时间，该时间取决于液体样品(供试样品)中活的大肠杆菌K12细菌的浓度。该总测试时间包括过滤10L的液体样品，用显色溶液(本例中为
Figure BPA00001174914000072
)在37℃下孵育。对于该测试，将大肠杆菌细菌在胰蛋白大豆肉汤培养基(Oxoid)中进行预培养，然后用生理盐水(0.9％NaCl)稀释至适当的测试浓度。
发明详述
定义
本文使用的术语“微生物”代表各种类群的微小的、简单的生命形式，包括古菌(archeae)、细菌、酵母、藻类、真菌、原生动物和病毒。
术语“不溶性金属氢氧化物”包括涉及的羟磷灰石。
本文使用的术语“羟磷灰石”和缩写“HA”代表羟基化的磷酸钙，特别是本身被称为羟磷灰石的物质(其组成为Ca10(PO4)6(OH)2或Ca5(PO4)3OH，同义词：Ca/P的(化学计量)比例为1.67的(五)钙三磷酸盐)，但也可以是：
-钙含量少的羟磷灰石Ca10-x(HPO4)x(PO4)6-x(OH)2-x(0≤x≤1)，其中Ca/P的比例为1.4-1.67；
-模拟的、合成的或沉淀的羟磷灰石(PHA)，其中Ca/P的摩尔比为1.4-1.8；
-含痕量的氟、氯和/或碳酸盐的羟磷灰石
-上述两种或多种的混合物
-包含上述之一的复合物
本文使用的术语“流体连接”和“流体连通”的含义相同，表示存在提供密封连通的通道，该通道允许液体和/或气体在由此连接的部件之间通过。
本发明涉及用于检测液体样品中微生物污染的体系，其包括基本上如图1中所示的从液体样品中富集微生物的装置(数字表示图1中的参考数字)，其基本上由分离的构件组成，所述构件可以连接也可以拆开，或者可以组装并集合成一个构件。这些分离的构件包括在高压舱中产生高压状态的机构(如气泵，水坡(a slope of water)，由能够对水加压的液压压头产生的水力)，高压舱和包含液体可渗透的吸附材料床的过滤器壳。
WO2005/083109中记载了制备样品的方法，其中样品中存在的可疑的污染物被固定于过滤器的一面。WO2005/083109中的过滤器能够采取亲和色谱法的色谱柱的形式。亲和色谱法是基于如抗原与抗体或者受体与配体之间的高特异性生物相互作用来分离生物化学混合物的色谱方法。
本发明基于静电相互作用来结合微生物。这种通过静电相互作用的结合可以通过例如使用离子交换树脂来获得。离子交换色谱是用来分离离子的方法；分离的基础是溶液中不同离子对细小的不溶性物质(离子交换剂，常为合成树脂)上相反电荷位点的吸附能力的差异。阳离子交换树脂中所有的位点均带负电荷，所以只有阳离子能够被分离；阴离子交换树脂具有带正电荷的位点，所以只有带负电荷的离子能够被分离。
下述实施例1清楚地展示了使用诸如金属氧化物或羟磷灰石的带正电荷的颗粒可以非常有效地结合大肠杆菌细胞。使用其中所有的位点均带负电荷的阳离子交换树脂，大肠杆菌细胞的结合似乎不太有效。但是，这并不意味着阳离子交换树脂不适合用于本发明。事实上，大肠杆菌以外的细胞，以及在不同的条件下生长或处理(吸附)的类似细胞，可以很好的吸附在这样的树脂上。
本发明的装置原则上可以采用任意适宜的形状、形式或结构。或者，可以将用于在高压舱中产生高压状态的部件与高压舱本身组合，如通过提供具有可压缩壁的高压舱，或提供具有活塞组件的所述高压舱，所述活塞组件与管状高压舱的内表面可滑动、可密封地接触，以此来扩大或缩小所述高压舱的内容积。高压舱无需单独提供，可以例如构成加压机构的一部分，例如当这些加压机构是以水泵或水坡(即加压的水)提供时。应当理解，采用该结构时，高压舱被包括在加压机构中。
液体样品可以是任意类型的液体，但优选水。
本发明的体系能够使用非常简单的方法进行操作。装置的构件必须功能上互相联系。这能够通过使用诸如挠性管的合适管道，将气泵的空气出口和过滤器壳的液体入口与高压舱上的各个端口相连接来实现。本发明的装置因此可以轻易地组合和拆卸。
操作时，向高压舱装入液体样品，通过驱动加压机构在高压舱中产生高压状态。结果，液体样品将被迫进入过滤器壳并通过吸附材料。
在可选的实施方案中，将装有活塞组件的另外地密封的管状高压舱液体入口与液体样品相接触，所述活塞组件与所述舱的内表面可滑动、可密封地接触，并驱动活塞以扩大所述舱的内容积，从而在所述舱内产生低压状态，使得液体被吸入所述高压舱内。随后，或提前，使过滤器壳的液体入口与所述高压舱的液体出口可密封地连接，并驱动活塞以缩小所述舱的内容积，从而在所述舱内产生高压状态，使液体被迫从所述出口流出所述高压舱并流入所述过滤器壳内。
因此本发明的装置包括高压舱。该术语涉及能够在其中建立相对压力的空间。该舱是任意形状(容器状、瓶状、管状或漏斗状)的基本上密闭的部件，具有至少一个端口，作为液体样品的入口和出口。非常合适地，该舱由壳的内部形成，所述壳具有基本上为圆柱状的侧壁(高压舱壁)和能够插入活塞的开口的顶端，底端有液体入口和出口。液体入口和空气出口原则上可以位于舱的壁内、顶端或底端，但是优选位于活塞对面的舱的底端。
高压舱有液体入口，液体样品能够通过该液体入口进入高压舱，调整该液体入口以适于与所述液体样品相连。这样的调整可包括与能够浸没在液体表面下的管道连接的末端或端口。应当注意，由于这种调整，下文更详细地描述的本发明的体系和方法不需要提供样品。事实上，能够使该装置与待检测的可能被粪便污染的水体直接接触。这增加了体系和方法的可靠性。
高压舱还具有液体出口，所述液体样品能够通过该液体出口流出高压舱。调整该液体出口以适于与过滤器壳可密封地连接。这样的调整可包括用于与管道连接的端口。
可以将液体入口和液体出口合并成一个端口。
高压舱的作用是提供相对压力，该相对压力经由过滤器壳的液体入口、经由液体可渗透的过滤器床延伸至过滤器壳的液体出口，以迫使液体样品流过吸附材料。高压舱进一步的作用是提供基本恒定的相对压力水平，以使流过液体可渗透的吸附材料床的液体具有恒定的流速。
高压舱优选为无菌(防腐)的包装，可以使高压舱便于运输和储存而不受过早的污染。对于本发明装置的组装，优选将无菌的高压舱无菌地从无菌包装中取出，并无菌地与装置的其它部分连接。
高压舱可以采用任何合适的刚性材料，如玻璃、金属、聚苯乙烯、丙烯酸聚合物、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、丙烯酸酯丁二烯苯乙烯(ABS)、聚氯乙烯(PVC)、尼龙、乙烯-醋酸乙烯酯(EVA)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)及其组合。材料可以例如是全澄清的、白的、黑的或透明的或遮光的，原则上可以是任意颜色的。高压舱优选为基本上圆柱状、半透明的。高压舱不需要很大，事实上常规的注射器就非常适合用作高压舱。这样的注射器的内容积能够为1ml至100ml。通常，在10ml至25ml的内容积就已经足够了。但是，1L至100L的大容积也可以，其条件为能够有效进行加压和无菌处理。
本发明的设备进一步包括过滤器壳。过滤器壳优选采用无菌(防腐)包装，可以使过滤器壳便于运输和储存而不受过早的污染。对于本发明装置的组装，优选将无菌的过滤器壳无菌地从无菌包装中取出，并无菌地与装置的其它部分连接。
过滤器壳可以采用任合合适的刚性材料，如玻璃、金属、聚苯乙烯、丙烯酸聚合物、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、丙烯酸酯丁二烯苯乙烯(ABS)、聚氯乙烯(PVC)、尼龙、乙烯-醋酸乙烯酯(EVA)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)及其组合。材料可以是全澄清的、白的、黑的或透明的或遮光的，原则上可以是任意颜色的。过滤器壳优选在吸附材料床的位置周围1cm至5cm的区域内基本上是圆柱状、半透明的，以便能够(视觉上)监测显色反应。过滤器壳不需要很大，事实上常规的注射器就非常适合用作过滤器壳。这样的注射器的内容积能够为1ml至100ml。通常，1ml至10ml的内容积容纳的吸附材料足以自高至20升的水中吸附微生物。
过滤器壳具有液体入口，所述液体样品能够通过该液体入口进入过滤器壳，调整该液体入口以适于与所述液体样品相连。这样的调整可以包括与能够浸没在液体表面下的管道连接的末端或端口。应当注意，由于这种调整，下文更详细描述的本发明的体系和方法不需要提供样品。事实上，能够将该装置与待检测的可能被粪便污染的水体直接接触。这增加了该体系和方法的可靠性。
过滤器壳进一步具有液体出口，所述液体样品能够通过该液体出口流出过滤器壳。调整该液体出口以适于与高压舱可密封地连接。这样的调整可以包括用于连接管道的端口。
过滤器壳进一步具有液体可渗透的吸附材料床。为了达到对液体可渗透，吸附材料可以是多孔性的，或者可以是颗粒状的，其中液体能够从颗粒间的空隙中流过。合适的孔尺寸为5μm至1mm。此外，颗粒的大小为1μm至5mm，更优选为5μm至1mm。吸附材料优选以床的形式位于过滤器壳中，液体必须从所述床中通过。术语床只表示一个事实，即在从入口流至出口时，液体不能从吸附材料旁边流过，但是它会流过所述床的颗粒内部和/或外部的孔，并与吸附材料的表面接触。在实践中，可以将该床以0.1cm至10cm厚、直径与过滤器壳的内径相等的圆盘的形式置于圆柱状的壳中。
吸附材料能够吸附微生物。已知的能够吸附微生物的任何材料均能够使用。优选地，通过静电相互作用即电荷差异吸附微生物。为达到上述效果，吸附材料可以适当地基于不溶性的金属氢氧化物如羟磷灰石、氢氧化锆、氢氧化钛和氢氧化铪；金属氧化物，载体材料上的金属氢氧化物，载体材料上的金属氧化物；载体材料上的外源凝集素；与载体材料共价结合的碳二亚胺，优选大小为5μm至1mm的颗粒材料；载体材料上的阳离子(带正电荷的)聚合物如聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺及其组合；阴离子交换树脂；和带正电荷的电极。其它可使用的带正电荷的吸附材料是包含金属氧化物的材料，其中金属选自铝、钙、铈、铪、钛、铁、锰和锆。这些材料可以采用火焰喷涂合成技术作为无机纳米颗粒具成本效益地大量生产，并且已知能够有效吸收和去除水中的DNA和病毒(Link et al.，2007，Inorganic nanoparticles fortransfection of mammalian cells and removal of viruses from aqueoussolutions.Biotechnology and Bioengineering(用于转染哺乳动物细胞和除去水溶液中的病毒的无机纳米颗粒)98(5)1083-1093)。高吸附性的纳米颗粒的比表面积可以为50m2g-1至250m2g-1，颗粒大小为5nm至50nm，当将它们沉积在载体材料上时，过滤和微生物移除最有效(Boccaccini and Zhitomirski，2002，Application of electrophoretic andelectrolytic deposition techniques in ceramics processing(陶瓷加工中电泳和电镀技术的应用).Current Opinion in Solid State and MaterialsScience 6：251-260；Dierstein et al.，2001，Electrochemical depositionunder oxidizing conditions(EDOC)：a new synthesis for nanocrystallinemetal oxides(纳米晶体金属氧化物的新合成方法).Scripta mater.44：2209-2212；Ding et al.，2004，Polymer-Monomer pairs as a reactionsystem for the synthesis of magnetic Fe3O4-Polymer hybrid hollownanospheres(用于合成磁性Fe3O4-聚合物混合中空纳米球的作为反应体系的聚合物-单体对).Angew.Chem.Int.Ed.43：6369-6372)。带负电荷的吸附材料，如阳离子交换树脂，也能够用于某些实施方案中。
在优选的实施方案中，吸附材料为羟磷灰石、金属氧化物粉末和/或金属氢氧化物粉末。更优选的是羟磷灰石粉末和/或金属氧化物粉末。羟磷灰石、金属氧化物粉末和/或金属氢氧化物粉末的合适形式是晶体或陶瓷颗粒或微粒形式的羟磷灰石、金属氧化物粉末和/或金属氢氧化物粉末，(球形的)颗粒大小通常为5μm至1mm。羟磷灰石、金属氧化物粉末和/或金属氢氧化物粉末可以是大孔形式的，其中合适的孔径为5μm至1mm。可以调节吸附(和/或载体)材料的颗粒大小和孔径以控制液体流过吸附材料床的流速。当使用下文的实施例1中例示的测试条件时，在本发明的方面中用作吸附材料的最优选材料显示的吸附百分比超过36％，更优选超过40％，更优选超过80％。这些条件包括在含大约1.106细胞/ml的细胞悬浮液的0.9wt.％NaCl中至少有标明的百分比的细胞在室温下搅拌15分钟后能够被吸附至作为粉末提供的吸附材料上，吸附材料粉末的颗粒大小为1μm至1mm，在所述细胞悬液中的含量约为3wt.％。
载体材料能够由羟磷灰石、金属氧化物和/或金属氢氧化物球体，或任何其它合适大小的矿物颗粒制成。合适的颗粒包括由诸如硅酸盐、玻璃、金属、陶瓷和粘土矿物的无机材料制成的颗粒；以及诸如纸张、木材、胶乳或合成的聚合物(如塑料)的有机材料颗粒。适当的颗粒大小应当约为5μm至1mm。颗粒可以是实心的或多孔的。
可选地，作为载体材料，可以使用合成材料制成的孔径为5μm至1mm的开孔泡沫塑料或填塞物(柔然的块或纤维板)，如石头填塞物(stone wadding)、聚氨基甲酸酯、氯丁二烯橡胶、聚烯烃或纸张。
为了防止液体可渗透的吸附材料床阻塞，并使床保持在适当的位置，在吸附材料前(即在液体入口的方向)放置预过滤器。这样的预过滤器可以是例如由多孔的聚氨基甲酸酯(开孔)泡沫、多孔的氯丁二烯橡胶、多孔的聚烯烃或石头填塞物制成的。
为了防止液体流过时无意中将吸附材料从床中带走，特别是当吸附材料为颗粒状时，可以在吸附材料的后面(即在液体出口方向)放置后置过滤器。这样的后置过滤器可以是例如由多孔的聚氨基甲酸酯(开孔)泡沫、多孔的氯丁二烯橡胶、多孔的聚烯烃或石头填塞物制成的。
合适的预过滤器和后置过滤器的表面积大小可以基本上覆盖吸附材料床的每一面。预过滤器和后置过滤器的厚度为0.10cm至10cm或者更厚。
本发明的装置还包括用于在高压舱内产生高压状态的机构。用于在高压舱中产生高压状态的机构的作用是迫使液体样品从高压舱中流出。因此，高压舱还可以起到储存液体样品的作用。用于在高压舱中产生高压状态的机构并没有特别的限制。通常，与高压舱连接使得空气可以进入所述舱并对其加压的气泵是合适的。通常，当使用空气将液体样品排出时，需要使液体样品的位置与液体出口相接触，以避免空气从高压舱内泄漏。可选地，该机构可以采用活塞的形式，所述活塞与高压舱壁密封地、滑动地接触，并且能够被连接或驱动以对高压舱加压，使得在高压舱内部与经由液体出口延伸的外部之间产生相对压力差。
在另一可选的实施方案中，用于对所述高压舱加压的机构可以采用可变形的舱壁的形式，所述可变形的舱壁允许所述舱的压缩和所述舱的内容积的减小。当高压舱壁被挤压或对其施加外部压力使得高压舱的压力增加时，会在高压舱内部与其经由液体出口延伸的外部之间产生相对压力差。
当与过滤器壳可密封地连接时，这一压力差会延伸至穿过过滤器壳(其中在液体出口处的压力会基本上是一个大气压，而在液体入口处的压力基本上在一个大气压以上)。一般来说，很小的压力差已经足够获得迫使液体样品流过液体可渗透的吸附材料床的期望结果。横跨过滤器壳的压力差量级可以为3800托至76托(其中760托相当于0℃下的760mmHg，或者1个大气压abs，或者ca.1013mbarA或者101.325kPa)，优选地，760托至228托的压力运行良好。
本文使用的术语“体系”表示材料的结合体，其任选地与该结合体的具体使用方法组合以实现本发明目的。本发明的用于检测液体样品中微生物的体系包括上文描述的装置和用于检测所述微生物的试剂盒。本文使用的术语“试剂盒”表示以任何形式提供在一起的多个元件，或部件的任意组合，或相关构件，优选通过将它们提供在共同的包装中，或者通过提供具有优选为打印形式的使用说明书的至少一个元件，所述使用说明书涉及用于检测待检测的微生物的特异性酶活性所需的至少另一个元件。
该试剂盒一般会包括适合于加入到用于支持微生物的增殖的合适的生长培养基中的显色和/或荧光底物，并且任选地包括关于组装、操作和拆卸该装置的说明，和/或通过使用该检测试剂盒检测富集在所述装置中的微生物的说明。为了诱导待检测酶的表达，可以向生长培养基中加入特异的诱导物(本文中是指酶诱导剂)。在其中测试乳糖转化酶的大肠菌群和大肠杆菌的情况下，液体生长培养基可以适当地包括诸如异乳糖、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和/或乳糖的诱导物。
基于显色和/或荧光底物检测微生物的试剂盒是本领域公知的，且可以采用各种不同供应商生产销售的多种商业试剂盒。非常适合检测耐热的大肠菌群和大肠杆菌的试剂盒为
Figure BPA00001174914000151
Testkit(IDEXXLaboratories，Inc.，Westbrook，Maine，USA)。更多关于
Figure BPA00001174914000152
Tests的信息能够从美国专利4,925,789、5,429,933、5,518,892、5,610,029、5,620,865、5,620,895、5,690,825、5,700,655、5,753,456、5,780,259、5,985,594、6,287,797、6,329,166、6,387,650、6,472,167、6,509,168、6,730.496和6,783.950中获得。其它适用的显色试剂盒有Colilert，Colisure(IDEXX，USA)；ColiComplete(Biocontrol，USA)；FluorocultLMX，Readycult coliforms(Merck，Germany)；E.colite(Charm Sci.，USA)和B2P Coliquik(B2P Limited，New Zealand)，m-Coliblue(Hach，USA)(Manfani，2000，New developments in chromogenic andfluorogenic culture media(显色和发荧光的培养基的新进展).International Journal of Food Microbiology 60：205-218)。
关于使用该装置和检测试剂盒的说明可以包括本文描述的检测液体样品中微生物的本发明方法的概要。
检测液体样品中微生物的本发明方法优选使用本发明的装置。通过流畅地将该装置的各独立部件连接来组装该装置。该方法开始于将过滤器壳的液体入口与液体样品相连和使用气泵经由空气出口将空气泵入所述高压舱中，可以任意顺序进行。
正确地组装装置并在高压舱内产生高压状态会引起延伸至过滤器壳的液体出口的相对压力，这会随后迫使液体进入过滤器壳。当液体已充满过滤器壳时，保持高压舱中的高压状态，这会产生贯穿过滤器壳的压力差，该压力差延伸至过滤器壳的液体出口外的大气压，从而迫使液体通过吸附材料床，然后液体会经由所述液体出口离开过滤器壳。由对高压舱加压造成的贯穿过滤器壳的压力差以及液体样品与过滤器壳液体入口之间的接触一直被保持到有足够的液体通过吸附材料床。
本领域技术人员可以理解，本文使用的需要过滤的液体样品的有效量在很大程度上取决于液体样品中待检测微生物的荷载量。荷载少(低污染水平)就需要从大体积的液体中富集微生物，以获得能够用最短的用于微生物生长的孵育期即可检测的一定数量被吸附的微生物。可选地，当使用较长时间的孵育期用于微生物生长不成问题时，即使只对少量的液体进行分析，少量的被吸附的微生物也能够产生阳性检测结果。
在本发明的方法中，优选被分析的(通过吸附材料床的)液体体积是比较大的(1-100L)，以将另外地培养被吸附的微生物所需的时间最小化。
高压舱中产生的相对压力优选使得通过吸附材料床的液体的流速为约50m/h至150m/h。通常，流速为100m/h(通过每单位时间被泵过过滤器床(颗粒状吸附材料床)的液体量(L/h)除以液体通过的过滤器床的表面积(例如，位于半径为0.69cm的圆柱状过滤器壳内的过滤器床的表面积为πr2＝1,5cm2)来计算)时流速足够慢，达到使微生物在吸附材料上的吸附效率超过80％，且足够快以允许在通常少于30分钟内过滤1L至100L的液体，优选约10L至50L的液体，最优选约5L至15L的液体。
一旦已经使所需量的液体通过吸附材料床，即用补充了显色和/或荧光底物的液体生长培养基孵育吸附了微生物的吸附材料床。可选地，显色和/或荧光底物可以与过滤器床材料共价结合。
对于该步骤，适当地使用补充了显色和/或荧光底物的液体生长培养基，如通过上述商业试剂盒所提供的那样。通过使吸附材料与补充的生长培养基接触开始孵育。这可以通过例如如下步骤来完成：将过滤器壳从高压舱上拆下，排出过滤器壳中残留的液体样品，通过例如使用针头和注射器向吸附材料床中加入补充的生长培养基。可选地，能够将装满补充的生长培养基的注射器组装至过滤器壳的端口上，以将所述培养基充入过滤器壳内并用补充的生长培养基浸泡吸附材料。
用来测定总大肠菌和/或大肠杆菌的孵育优选在约30-45℃进行，最优选在约37℃左右进行，并进行一段有效的时间。44-45℃是优选的测定耐热大肠菌群和/或大肠杆菌的温度。本领域技术人员会容易地理解，所述有效的时间在很大程度上取决于待检测的微生物在吸附材料上的荷载量。可以通过常规实验来确定合适的时间。一般来说，为了检测微生物的酶活性，有效的时间大约是1-8小时，优选为2-6小时，最优选为3-4小时。
本发明的装置和方法的重要优点是经过在过滤器壳中富集微生物并加入液体生长培养基后，可以例如将整个过滤器壳放在人的腋下以提供所需的37℃左右(即36-38℃)的孵育温度。
在孵育过程中，其中使微生物生长并代谢显色和/或荧光底物，颜色或荧光的变化过程能够通过使用合适的光照或合适的荧光检测设备进行监测。在过滤器壳中吸附材料床的区域处和/或其附近的颜色变化提示存在被吸附至吸附材料上的源自所述液体样品的微生物。
本发明的方法可以对同一液体样品进行多次操作。可靠的测试需要有代表性的取样。推荐的最少的微生物分析次数取决于在具体饮用水源取水饮用的人数。WHO的指导原则要求每5,000个使用水的个体每月进行大约1次分析。
本发明将通过附图和下述非限制性实施例进行更加详细的解释。
实施例
实施例1吸附材料
在试管中将0.5ml过夜的大肠杆菌细胞(K12菌株)液体培养物悬浮于4.5ml生理盐水(0.9wt.％NaCl)中，该试管中含有0.5ml的待测定细胞吸附性能的吸附材料悬浮液。使用了下述悬浮液。将氧化物、沙土和珍珠岩制成浓度为30wt％(5ml生理盐水(0.9％NaCl)中，2g)的悬浮液。使用了生产商提供的来自离子交换介质样品包(IonExchange Media Sampler Pack)的悬浮液，或者如果是粉末形式的，将其悬浮于生理盐水中使其浓度为30wt％。将0.5ml所述悬浮液加入5ml的测试培养液中(0.5ml的培养液+4.5ml的生理盐水)。
-钛氧化物(二氧化钛，技术上的，≥99％；Sigma Aldrich Cat.No.14021_Riedel)；
-锆氧化物(二氧化锆，粉末，5μm，99％微量金属基点；Sigma AldrichCat.No.230693_Aldrich)；
-铪氧化物(二氧化铪，粉末，98％，Sigma Aldrich Cat.No.202118_Aldrich)；
-铁氧化物(三氧化二铁，红色，纯化的，≥95％，Sigma Aldrich Cat.No.12342)
-锰氧化物(二氧化锰，≥90％，粉末，Sigma Aldrich Cat.No.13242)
-羟磷灰石80μm；(
Figure BPA00001174914000181
Ceramic Hydroxyapatite Type I Cat.No.157-0080 BioRad Laboratories，Hercules，CA，USA)
-珍珠岩(Agra-perlite，100L，Pull Rhenen B.V.，Rhenen，TheNetherlands)
-介质样品包(Cat no 158-0100 BioRad Laboratories，Hercules，CA，USA；由以下组成：Macro-Prep High Q、DEAE、High S和CM各25ml，CHT陶瓷状羟磷灰石I和II型各10g，UNOsphere Q和S各25ml，以及Macro-Prep methyl HIC和t-butyl HIC各25ml)；
-
Figure BPA00001174914000191
Streptavidin 1(＝M-280)和2(＝MyOneTM StreptavidinC1)(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA，USA)
将生理盐水中的细胞与测试吸附材料的混合物搅拌15分钟。15分钟后，通过离心(20’@500rpm)使测试吸附材料(吸附有大肠杆菌细胞)沉淀，并将含有自由悬浮的未被吸附的细胞的上清液轻轻倒出，保留沉淀用于实施例2(下文)。利用系列稀释和标准平板计数技术以菌落形成单位(CFU)对上清液中的细胞进行计数。测试吸附材料对细胞的吸附作用通过公式(X-Y)*100％计算，采用吸附百分数表示，其中X表示不包括测试吸附材料的对照试样中的CFU数，Y表示包括测试吸附材料的测试培养液中上清液中的CFU数。吸附百分数参见下文的表1。
本测试中最有效的材料是金属氧化物颗粒。这些颗粒与羟磷灰石相似，带正电荷，这表明通过细菌细胞与吸附材料之间的静电相互作用进行吸附。不吸附或几乎不吸附大肠杆菌细胞的材料包括不带电荷(沙土)或带负电荷(珍珠岩、阳离子交换树脂)的材料。
实施例2对被吸附细胞的检测
将实施例1中描述的实验中的沉淀加入1ml的B2P ColiQuik试剂(B2P limited，Auckland，New Zealand)中。在37℃下孵育该沉淀，监测显色团由蓝色变成粉色的时间。这些孵育时间见下文的表1。
通常，表现出最高的细胞吸附水平的材料也导致显色团很早变色。
对使用铁氧化物和锰氧化物的情况，由于材料本身颜色较重，妨碍了通过视觉观察显色团的颜色变化。
表1：不同吸附材料对大肠杆菌的结合效能(实施例1)，以及使用B2P ColiQuik试剂对被吸附细胞的检测实验(实施例2)
Figure BPA00001174914000201

Claims (25)

1.自液体样品中富集微生物的装置，其包括：
a)用于盛装液体样品的高压舱，其包括：
-液体入口，所述液体样品能够通过其进入所述高压舱，
-液体出口，所述液体样品能够通过其离开所述高压舱，并调整所述液体出口以适于与过滤器壳的液体入口可密封地连接，和
-用于对所述高压舱加压的机构；以及
b)过滤器壳，其包括：
-液体入口，所述液体样品能够通过其进入所述过滤器壳，并调整所述液体入口以适于与所述高压舱的所述液体出口连接，
-液体出口，所述液体样品能够通过其离开所述过滤器壳，和
-液体可渗透的吸附材料床，其位于所述过滤器壳的所述液体入口与液体出口之间的所述过滤器壳内，并能够通过静电相互作用吸附微生物，
由此，当：
i)将含液体样品的所述高压舱与所述过滤器壳可密封地连接，使得所述高压舱与所述过滤器壳之间能够通过密封通道进行流体连通，并且
ii)对所述高压舱加压时，
所述液体样品被迫从所述高压舱进入所述过滤器壳内，并通过所述液体可渗透的吸附材料床，然后经由所述液体出口离开。
2.如权利要求1所述的装置，其中在所述吸附材料床位置处的所述过滤器壳基本上是圆柱状和半透明的，并且其中所述过滤器壳的内容积优选为1ml至10ml。
3.如权利要求1或2所述的装置，其中所述吸附材料的表面带有正电荷，且选自不溶性金属氢氧化物、金属氧化物、载体材料上的金属氢氧化物、载体材料上的金属氧化物、载体材料上的外源凝集素、载体材料上的碳二亚胺、载体材料上的阳离子聚合物、阴离子交换树脂和带正电荷的电极。
4.如权利要求3所述的装置，其中所述阳离子聚合物选自聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺及其组合。
5.如权利要求3所述的装置，其中所述不溶性金属氢氧化物和/或金属氧化物选自羟磷灰石、氢氧化锆、氢氧化钛、氢氧化铪、锆氧化物、钛氧化物、锰氧化物、铁氧化物和铪氧化物。
6.如权利要求1或2所述的装置，其中所述吸附材料包括载体材料上的金属氧化物纳米粒子，其中所述金属选自铝、钙、铈或锆。
7.如权利要求5所述的装置，其中所述吸附材料是羟磷灰石。
8.如前述权利要求中任一权利要求所述的装置，其中所述液体为水。
9.如前述权利要求中任一权利要求所述的装置，其中将所述高压舱的所述液体入口与所述液体出口合并成一个端口。
10.用于检测液体样品中微生物的体系，其包括：
-权利要求1至9中任一权利要求所述的用于自液体样品中富集微生物的装置；
-通过检测所述微生物的特异性酶活性来检测所述微生物的试剂盒，其包括：
显色和/或荧光底物，
液体生长培养基；
以及
-任选地，安装、操作和拆卸所述装置的说明，和/或通过使用所述检测试剂盒来检测富集在所述装置中的微生物的说明。
11.如权利要求10所述的体系，其中所述试剂盒用于分别通过检测β-D-半乳糖苷酶和/或β-D-葡萄糖醛酸酶的酶活性来检测大肠菌群和/或大肠杆菌(E.coli)。
12.如权利要求11所述的体系，其中通过使用显色或荧光底物来检测所述β-D-葡萄糖醛酸酶和/或β-D-半乳糖苷酶的活性，所述显色或荧光底物选自4-甲基伞形酮酰-β-D-葡糖苷酸(MUG)、邻-硝基苯基β-D-葡糖苷酸(ONPG)、对-硝基苯基β-D-葡糖苷酸(PNPG)、β-萘亚甲基酰胺-β-D-葡糖苷酸、6-溴-2-萘基β-D-葡糖苷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-葡糖苷酸(BCIG或X-葡糖苷酸)、α-萘酚-β-D-葡糖苷酸、4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃半乳糖苷(MUGal)、邻-硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(ONPGal)、对-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPGal)、6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(Salmon-Gal)、5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)、4-硝基苯基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(NPSGal)、6-溴-2-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷、3，4-二硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(DNPGal)、功能衍生物及其组合。
13.如权利要求11或12所述的体系，其中所述液体生长培养基包括异乳糖、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和/或乳糖。
14.检测液体样品中微生物的方法，所述方法包括下述步骤：
a)-提供用于装盛液体样品的高压舱，其包括：
液体入口，液体样品能够通过其进入所述高压舱，
液体出口，所述液体样品能够通过其离开所述高压舱，并调整所述液体出口以适于与过滤器壳的液体入口可密封地连接，和
用于对所述高压舱加压的机构；
-提供过滤器壳，其具有液体入口和液体出口且在所述液体入口与所述液体出口之间设有液体可渗透的吸附材料床，其中所述吸附材料能够通过静电相互作用吸附微生物；
-将液体样品装入所述高压舱中；
-将所述高压舱与所述过滤器壳的液体入口可密封地连接，使得所述高压舱与所述过滤器壳能够通过其间的密封通道进行流体连通；
b)对装有所述液体样品的所述高压舱加压，从而迫使所述液体样品从所述高压舱进入所述过滤器壳，所述液体样品借此通过所述液体可渗透的吸附材料床，然后经由所述液体出口离开所述过滤器壳，存在于所述液体样品中的所述微生物被吸附至所述液体可渗透的吸附材料床上；
c)继续对所述高压舱加压，直至有效量的所述液体样品已经通过所述液体可渗透的吸附材料床；
d)用补充了显色和/或荧光底物的液体生长培养基孵育所述液体可渗透的吸附材料床一段有效的时间，以检测微生物的酶活性；以及
e)监测显色或荧光颜色的变化以确定是否有微生物被吸附在吸附材料上，其中有微生物被吸附在所述吸附材料上表明所述液体样品中存在微生物。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述吸附材料选自不溶性金属氢氧化物、金属氧化物、载体材料上的金属氢氧化物、载体材料上的金属氧化物、载体材料上的外源凝集素、载体材料上的碳二亚胺、载体材料上的阳离子聚合物、阴离子交换树脂和带正电荷的电极。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述阳离子聚合物选自聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺及其组合。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述不溶性金属氢氧化物和/或金属氧化物选自羟磷灰石、氢氧化锆、氢氧化钛、氢氧化铪、锆氧化物、钛氧化物、锰氧化物、铁氧化物和铪氧化物。
18.如权利要求14所述的方法，其中所述吸附材料包括载体材料上的金属氧化物纳米粒子，其中所述金属选自铝、钙、铈或锆。
19.如权利要求14所述的方法，其中所述吸附材料为羟磷灰石。
20.如权利要求14-19中任一权利要求所述的方法，其中所述液体为水。
21.如权利要求14-20中任一权利要求所述的方法，其中用于对所述高压舱加压的所述机构是注射器型活塞或者可变形的舱壁，所述可变形的舱壁允许所述舱的压缩和所述舱的内容积的减小。
22.如权利要求14-21中任一权利要求所述的方法，其中所述液体生长培养基和所述显色和/或荧光底物用于通过检测β-D-半乳糖苷酶和/或β-D-葡萄糖醛酸酶的酶活性来检测大肠菌群和/或大肠杆菌。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述显色和/或荧光底物选自4-甲基伞形酮酰-β-D-葡糖苷酸(MUG)、邻-硝基苯基β-D-葡糖苷酸(ONPG)、对-硝基苯基β-D-葡糖苷酸(PNPG)、β-萘亚甲基酰胺-β-D-葡糖苷酸、6-溴-2-萘基β-D-葡糖苷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-葡糖苷酸(BCIG或X-葡糖苷酸)、α-萘酚-β-D-葡糖苷酸、4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃半乳糖苷(MUGal)、邻-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPGal)、对-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPGal)、6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(Salmon-Gal)、5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)、4-硝基苯基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(NPSGal)、6-溴-2-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷、3，4-二硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(DNPGal)、功能衍生物及其组合。
24.如权利要求22或23所述的方法，其中所述液体生长培养基包括酶诱导剂，如异乳糖、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和/或乳糖。
25.如权利要求22至24中任一权利要求所述的方法，其中有微生物被吸附至所述吸附材料上表明所述液体样品中有粪便细菌的潜在污染。
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