CN101952456A - 用于检测微生物污染的系统 - Google Patents

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CN101952456A CN200880125051.XA CN200880125051A CN101952456A CN 101952456 A CN101952456 A CN 101952456A CN 200880125051 A CN200880125051 A CN 200880125051A CN 101952456 A CN101952456 A CN 101952456A
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Abstract

本发明涉及用于检测液体样本的微生物污染的系统，包括用于从液体样本中浓缩微生物的装置，该装置具有(i)低压室，(ii)包括液体可渗透的吸附材料床并适于与所述低压室流体连接的过滤器壳体，以及(iii)适于与所述低压室流体连接的真空泵，所述系统还包括用于检测吸附在所述吸附材料上的微生物的试剂盒，其中所述试剂盒基于利用显色底物和/或荧光底物类似物的酶检测。

Description

用于检测微生物污染的系统
发明领域
本发明涉及微生物污染快速检测领域。特别是，本发明涉及快速检测流体样本中的微生物污染，特别是源自粪便的微生物污染的系统。本发明的系统包括用于从液体样本中浓缩细菌的装置，其作为用于检测微生物污染的试剂盒，特别是用于通过利用显色底物和/或荧光底物类似物的酶检测来检测吸附至吸附材料上的微生物的试剂盒的一部分；以及利用本发明装置检测水样本中微生物污染的方法。
发明背景
在发展中国家，每年有数百万人成为水传播疾病的牺牲品。每年全世界报导约2.5亿次的新水传播传染病例，这导致180万人死于腹泻疾病，其中90％为5岁以下的儿童。仅在印度，每年32万儿童死于腹泻。这几乎总是归因于缺少可靠且有成本效益的水生产技术、卫生设施和卫生，从而造成不安全的水或劣质细菌学质量的水。而且，缺少用于评价水细菌学质量的系统。使用安全的饮用水能够使腹泻的发病率降低6％至25％。如果水不安全，其是能够处理的。事实上，在使用时，氯化作用能够使腹泻降低35％至39％。因此，在使用时需要用于评价水细菌学质量的系统，来确定是否需要处理。
水传播疾病最通常的原因是粪便污染。经常，饮用水被动物和人的排泄物污染。由于缺少负担得起的诊断方法，通常不会注意到饮用水的粪便污染。为了检测粪便污染，可以使用所谓的指示生物。检测粪便污染的指示生物：i)大量普遍存在于人和温血动物的粪便中；ii)通过简单的方法容易检测；iii)在天然水中没有表现出生长；以及iv)持续处于水中，并能够通过类似于水传播病原体的水处理除去。大肠杆菌(Escherichia coli)是非常合适的粪便指示生物，并且是由世界卫生组织(WHO)指定用于该目的的粪便指示生物。更确切地，能够通过确定每100ml水中大肠菌类(发酵乳糖的兼性厌氧的、杆状的、革兰氏阴性的、无孢子细菌；包括例如包括埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯菌属(Kebsiella)和柠檬酸菌属(Citrobacter)的种类)，特别是耐热大肠菌类大肠杆菌的数目来获得粪便污染的指示。
对于检测大肠杆菌的测试系统，WHO已经采用首字母缩略词ASSURED来描述诊断测试的理想的性质和标准，该首字母缩略词代表：负担得起(对于有感染危险的人)；灵敏(很少的假阴性)；特异(很少的假阳性)；用户友好(操作简单并需要很少的培训)；快速(首次侵袭就能够处理)并耐用(不需要冷冻储存)；无需装备以及可交付给发展中国家。已经使用许多方法来检测水中的大肠菌类和大肠杆菌。这些检测方法可以基于例如培养法、酶反应和免疫学或遗传学检测。目前有超过30种可选择的商购测定来检测大肠菌类和大肠杆菌。这些测试中的大多数不符合速度和灵敏或无需装备的ASSURED标准。事实上，为了满足灵敏和特异的最基本的测试标准，大多数测试需要专用的实验室。然而，应当理解，不如实验室测试灵敏的粪便污染快速现场测试可以明显减少患病人数并挽救生命。因此，与实现此目的即告诉使用者水对于是饮用不安全的、较不灵敏但快速并特异的现场测试相比，灵敏的实验室测试并不总是更加有用。
因此，需要简单、便宜、耐用和快速的测试方法来用于现场检测水中的粪便污染。更多的人将在更多的地方更经常使用这样的方法并能够更早地警告人们，因此挽救生命。
发明简述
目前，本发明人已经发现，可以开发出能够检测大肠菌类和大肠杆菌的诊断测试系统，该系统简单、便宜、耐用和快速，并适于现场检测水样本的粪便污染。该诊断测试系统联合了微生物细胞的固相吸附与吸附细胞的特异性生长和酶检测。
在第一方面，本发明提供了用于从液体样本中浓缩微生物的装置，包括：
i)过滤器壳体(filter housing)，包括：
a)液体入口，所述液体样本能够通过该液体入口进入过滤器壳体，并且该液体入口适于与所述液体样本接合，
b)液体出口，所述液体样本能够通过该液体出口离开过滤器壳体，并且该液体出口适于与低压室密封接合，以及
c)液体可渗透的吸附材料床，其被装在过滤器壳体中的所述液体入口与所述液体出口之间，并且能够通过静电相互作用来吸附微生物，由此，当跨越过滤器壳体施加压力差时，液体样本通过液体入口被吸入过滤器壳体中并且在通过所述液体出口离开之前穿过所述液体可渗透的吸附材料床；
ii)低压室，其具有适于与所述过滤器壳体的液体出口密封接合的液体入口，并且还具有用于从所述低压室抽气的空气出口；以及
iii)真空泵，其适于与所述低压室的空气出口密封接合。
在本发明装置的优选实施方案中，过滤器壳体在吸附材料床的位置基本上是圆柱形的和半透明的，其中所述壳体的内容积优选为1ml至10ml。
在本发明装置的另一优选实施方案中，吸附材料具有带正电的表面，并且选自不溶性金属氢氧化物、金属氧化物、支持材料上的金属氢氧化物、支持材料上的金属氧化物、支持材料上的凝集素、支持材料上的碳二亚胺、支持材料上的阳离子聚合物、阴离子交换树脂和阳极(positively charged electrode)。
在吸附材料基于阳离子聚合物的情况下，优选地，这样的聚合物选自聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺及其组合。
在吸附材料基于不溶性金属氧化物和/或不溶性金属氢氧化物的情况下，优选地，这样的不溶性金属氧化物和/或不溶性金属氢氧化物选自羟基磷灰石、氢氧化锆、氢氧化钛、氢氧化锰和氢氧化铪、氧化锆、氧化钛、氧化锰、氧化铁和氧化铪。在优选的实施方案中，吸附材料为羟基磷灰石。在可选择的优选实施方案中，吸附材料为选自氧化锆、氧化铪、氧化锰、氧化钛或氧化铁的金属氧化物。
来自其中微生物被利用本发明装置浓缩的样本的液体优选为水，最优选为饮用水。
优选地，真空泵为手动真空泵。
在另一方面，本发明提供用于检测液体样本中微生物的系统，包括：
i)用于从上述本发明的液体样本中浓缩微生物的装置；
ii)用于通过检测对所述微生物特异性的酶活性来检测所述微生物的试剂盒，所述试剂盒包括显色底物和/或荧光底物和液体生长培养基，优选地，所述底物为所述生长培养基的补充剂的形式；以及任选地，
iii)用于组装、操作和拆卸装置和/或利用所述检测试剂盒来检测在所述装置中所浓缩的微生物的说明书。
在本发明系统的优选实施方案中，试剂盒用于通过分别检测β-D-半乳糖苷酶和/或β-D-葡糖苷酸酶的酶活性来检测大肠菌类和/或大肠杆菌。
用于检测β-D-葡糖苷酸酶和/或β-D-半乳糖苷酶活性的合适的显色底物或荧光底物包括但不限于4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸(MUG)、邻-硝基苯基β-D-葡糖苷酸(ONPG)、对-硝基苯基β-d-葡糖苷酸(PNPG)、β-萘二甲酰亚胺-β-D-葡糖苷酸(β-naphthalamide-β-D-glucuronide)、6-溴-2-萘基β-D-葡糖苷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-葡糖苷酸(BCIG或X-葡糖苷酸)、α-萘酚-β-D-葡糖苷酸(α-napthol-β-D-glucuronide)、4-甲基伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷(MUGal)、邻-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPGal)、对-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPGal)、6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(Salmon-Gal)、5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)、4-硝基苯基1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(NPSGal)、6-溴-2-萘基-β-d-吡喃半乳糖苷、3，4-二硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(DNPGal)、功能性衍生物及其组合。
为了诱导活性要检测的酶(即β-D-葡糖苷酸酶和/或β-D-半乳糖苷酶)，液体生长培养基优选包含异乳糖、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和/或乳糖。
另一方面，本发明提供用于检测液体样本中微生物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将过滤器壳体的液体入口与液体样本接合，其中所述过滤器壳体具有液体出口并在所述液体入口与所述液体出口之间装有液体可渗透的吸附材料床，其中所述吸附材料能够通过静电相互作用吸附微生物；
b)借助于所述过滤器壳体的液体出口与低压室的液体入口之间的密封通道，使所述过滤器壳体的液体出口与低压室的液体入口流体相连；以及
c)跨越过滤器壳体施加压力差，该压力差通过所述过滤器壳体的液体入口延伸至液体样本，从而将液体样本通过所述液体入口吸入过滤器壳体中，并且在通过所述液体出口离开过滤器壳体之前穿过所述液体可渗透的吸附材料床，其中通过利用真空泵，经过空气出口从所述低压室抽气来施加所述压力差，由此将过滤器壳体置于相对真空下并将存在于所述液体样本中的所述微生物吸附至液体可渗透的吸附材料床上；
d)跨越过滤器壳体连续施加压力差直至有效量的所述液体样本穿过所述液体可渗透的吸附材料床；
e)在30℃至45℃的优选温度下，采用补充了显色底物和/或荧光底物的液体生长培养基将所述液体可渗透的吸附材料床(所述液体样本已经通过该吸附材料床)孵育有效的时间段，以便检测微生物的酶活性；以及
f)监测显色颜色或荧光颜色的显影来确定吸附至吸附材料上的微生物的存在或不存在，其中吸附至所述吸附材料的微生物的存在表明在所述液体样本中存在微生物。
在本发明方法的优选实施方案中，过滤器壳体在吸附材料床的位置上基本上是圆柱形的和半透明的，其中所述壳体的内容积优选为1ml至10ml。
在本发明方法的另一优选实施方案中，吸附材料具有带正电的表面，并且选自不溶性金属氢氧化物、支持材料上的凝集素、支持材料上的碳二亚胺、支持材料上的阳离子聚合物、阴离子交换树脂和阳极。
在吸附材料基于阳离子聚合物的情况下，优选地，这样的聚合物选自聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺及其组合。
在吸附材料基于不溶性金属氢氧化物的情况下，优选地，这样的不溶性金属氢氧化物选自羟基磷灰石、氢氧化锆、氢氧化钛和氢氧化铪。在最优选的实施方案中，吸附材料为羟基磷灰石。
微生物被利用本发明的方法检测的样本中的液体优选为水，最优选为饮用水。
优选地，真空泵为手动真空泵。
在本发明其它的优选实施方案中，液体生长培养基和显色底物和/或荧光底物用于通过分别检测β-D-半乳糖苷酶和/或β-D-葡糖苷酸酶的酶活性来检测大肠菌类和/或大肠杆菌。对于这一目的，通过从以下化合物选择显色底物或荧光底物可以非常合适的进行本发明的方法：4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸(MUG)、邻-硝基苯基β-D-葡糖苷酸(ONPG)、对-硝基苯基β-d-葡糖苷酸(PNPG)、β-萘二甲酰亚胺-β-D-葡糖苷酸、6-溴-2-萘基β-D-葡糖苷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-葡糖苷酸(BCIG或X-葡糖苷酸)、α-萘酚-β-D-葡糖苷酸、4-甲基伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷(MUGal)、邻-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPGal)、对-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPGal)、6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(Salmon-Gal)、5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)、4-硝基苯基1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(NPSGal)、6-溴-2-萘基-β-d-吡喃半乳糖苷、3，4-二硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(DNPGal)、功能衍生物及其组合。
在本发明方法的优选实施方案中，液体生长培养基包含异乳糖、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和/或乳糖。
在另一优选的实施方案中，吸附至吸附材料上的微生物的存在表明粪便细菌对所述液体样本的潜在污染。
附图说明
图1示出本发明的装置，其显示了各种部件：真空泵(1)、低压室(2)、过滤器壳体(3)、连接管(4)。显示通常的水样品(5)。
图2示出本发明的过滤器壳体的照片(左)和示意图(右)，这更详细地显示了各种部件。过滤器壳体(1)(在照片中为一次性注射器)、预过滤器(粗滤)(2)、吸附材料床(3)、后过滤器(精滤)(4)、液体入口(5)、液体出口(6)。箭头表示液体样本的流动方向。
图3示出过滤器壳体(1)(在照片中为一次性注射器)、预过滤器(粗滤)(2)、吸附材料床(3)、后过滤器(精滤)(4)、液体入口(5)、液体出口(6)的照片。使用过滤器来处理具有大肠杆菌的10L的液体样本。使用注射器活塞(7)在箭头所示方向上将显色培养液(这里为
Figure BPA00001184384300071
)通过液体出口吸入过滤器壳体中。在37℃下孵育几个小时后，由于微生物的代谢转化，显色液体已经从清澈的溶液变成黄色溶液。
图4显示从取样开始直至观察到阳性测试结果(此时为黄色)的总时间，其依赖于液体样本(测试样品)中活大肠杆菌株K12细菌的浓度。该总测试时间包括10L液体样本的过滤和在37℃下用显色溶液(这里为
Figure BPA00001184384300072
)的孵育。对于该测试，将大肠杆菌在Tryptic Soy Broth培养基(Oxoid)中预生长，并在生理盐溶液(0.9％NaCl)中稀释至合适的测试浓度。
发明详述
定义
本文所用的术语“微生物”是指不同组的微小简单的生命形式，包括古细菌(archeae)、细菌、酵母、藻类、真菌、原生动物和病毒。
术语“不溶性金属氢氧化物”包括羟基磷灰石。
本文所用的术语“羟基磷灰石”和缩写“HA”是指羟基化的磷酸钙，特别是指本身被称为羟基磷灰石的物质(Ca10(PO4)6(OH)2或Ca5(PO4)3OH，同义词：Ca/P(化学计量)比为1.67的三磷酸(五)钙，但是还指：
-Ca/P比率在1.4至1.67变化的、钙不足的羟基磷灰石Ca10-x(HPO4)x(Pθ4)6-x(OH)2-x(0≤x≤1)；
-Ca/P摩尔比为1.4至1.8的仿造的、合成的或沉淀的羟基磷灰石(PHA)；
-含有痕量氟、氯和/或碳酸盐的羟基磷灰石；
-上述两种或多种的混合物；
-含有上述之一的复合物。
本文所用的术语“流体连接的”和“流体连通”是等同的，并指存在提供密封连通的通道，该通道允许液体和/或气体在因此连接的两项间通过。
本发明涉及用于检测液体样本中的微生物污染的系统，该系统包括基本上如图1所示的用于从液体样本中浓缩微生物的装置(图1中的数字表示参考编号)，该装置基本上由三个独立的部分组成，该三个独立的部分可以互相连接和不连接，或者可以通过整合成单个部分来组装和组合。这三个部分包括用于在低压室(例如真空泵)中产生低压条件的器件(1)、低压室(2)和包括液体可渗透的吸附材料床的过滤器壳体(3)。
WO2005/083109描述了样品制备的方法，其中将疑似存在于样品中的污染物保留在过滤器的一侧。WO2005/083109中的过滤器能够采取用于亲和层析的柱子的形式。亲和层析是分离生物化学混合物的层析方法，其基于诸如抗原和抗体间或受体与配体间的高特异性生物相互作用。
本发明基于利用结合微生物的静电相互作用。例如可通过使用离子交换树脂来获得这样的静电相互作用的结合。离子交换层析是分离离子的方法；分离的基础是溶液中的不同离子向细分的不溶性物质(离子交换剂，通常为合成的树脂)上带相反电荷的位置的变化的吸引。在阳离子交换树脂中，所有位置均是带负电的，从而仅能够分离阳离子；阴离子交换树脂具有带正电的位置，从而仅能够分离带负电的离子
如在下文实施例1中所清晰描述的，使用诸如金属氧化物或羟基磷灰石的带正电的粒子导致非常有效地结合大肠杆菌细胞。使用阳离子交换树脂，其中所有位置均是是带负电的，看起来以较低的效率结合大肠杆菌细胞。然而，这并不意味着阳离子交换树脂不适合用于本发明的方面中。事实上，这样的树脂可成功吸附除了大肠杆菌外的细胞和在不同条件下生长或处理(吸附)的类似细胞。
本发明的装置原则上可采取任何合适的形状、形式或构型。
液体样本可为任何类型的液体，但优选为水。
能够采用非常简单的方法来操作本发明的系统。装置的三个部分必须功能性地相互连接。这能够通过经由诸如柔性管(4)的合适管道连接真空泵(1)的空气入口与过滤器壳体(3)的液体出口来实现，以分离低压室(2)的汽门。因此本发明的装置可容易组装和拆卸。对于操作，然后使过滤器壳体与合适的液体来源(5)接触，并且通过启动器件(1)在低压室(2)中产生低压条件。
优选地，以无菌(无菌)包装提供本发明的过滤器壳体，这允许运输和储存而不会过早污染过滤器壳体。对于本发明装置的组装，优选地将无菌过滤器壳体从无菌包装中无菌地移出并无菌地连接至装置的剩余部分。
本发明装置包括过滤器壳体。过滤器壳体可由任何合适的坚硬材料制成，例如玻璃、金属、聚苯乙烯、聚丙烯(polyacryl)、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、丙烯酸酯/丁二烯/苯乙烯共聚物(ABS)、聚氯乙烯(PVC)、尼龙、乙烯/乙酸乙烯共聚物(EVA)、聚对苯二甲酸乙二酯及其组合。材料可以是完全透明的、白色的、黑色的或透明的或挡光的材料，并且原则上可为任何颜色。优选地，过滤器壳体在吸附材料床位置周围的1cm至5cm区域基本是圆柱形的和半透明的，这允许(视觉)监测显色反应。过滤器壳体不需要非常大，事实上，常规注射器非常合适用作过滤器壳体。这样的注射器的内容积可以为1ml至100ml。通常，1ml至100ml的内容积可足以装下能够从多达20升水中吸附微生物的吸附材料的量。
过滤器壳体提供有液体入口并适于与所述液体样本接合，所述液体样本能够通过该液体入口进入过滤器壳体。这样的适应可包括连接至管的尖端(tip)或汽门，所述尖端或汽门能够浸没在液体表面下。应当指出，由于这种适应，下文更详细地描述的本发明的系统和方法不需要提供样品。事实上，该装置能够直接与待测的潜在粪便污染的水体接触。这提高了系统和方法的可靠性。
过滤器壳体还提供有液体出口，所述液体样本能够通过该液体出口离开过滤器壳体。该液体出口适于与低压室密封接合。这样的适应可包括用于连接管的汽门。可以使得过滤器壳体重于水以促进在液体中的浸没。
过滤器壳体还提供有液体可渗透的吸附材料床。为了是液体可渗透的，吸附材料可以是多孔的或可以采取颗粒的形式，其中液体能够流过颗粒间的空间。孔的合适大小为5μm至1mm。另外，颗粒的大小可以为1μm至5mm，更优选为5μm至1mm。优选地，以液体必须通过的床的形式将吸附材料装入过滤器壳体。术语床仅仅是指这样的事实，即液体在从入口流至出口时，其不能直接流至吸附材料，而是流过所述床的颗粒内孔和/或颗粒外孔并与吸附材料的表面接触。特别是，可以将所述床以厚度为0.1cm至10cm并且直径等于过滤器壳体内径的盘的形式装在圆柱形箱中。
吸附材料能够吸附微生物。能够使用已知能吸附微生物的任何材料。优选地，通过静电相互作用，即电荷不同来吸附微生物。对于该作用，合适的吸附材料可基于不溶性金属氢氧化物，如羟基磷灰石、氢氧化锆、氢氧化钛和氢氧化铪；金属氧化物、支持材料上的金属氢氧化物、支持材料上的金属氧化物；支持材料上的凝集素；共价键结合至支持材料的碳二亚胺，优选大小为5μm至1mm的粒子材料；支持材料上的诸如聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺及其组合的阳离子(带正电的)聚合物；以及阴离子交换树脂和阳极。可以使用的其它带正电的吸附材料为包含金属氧化物的材料，其中金属选自铝、钙、铈、铪、钛、铁、锰和锆。可采用火焰喷涂合成技术经济地将这些材料大量地制成无机纳米颗粒(粒径为1nm至999nm，优选为1nm至100nm)，并且已知这些材料有效地从水中吸附并除去DNA和病毒(Link et al.，2007，Inorganic nanoparticles for transfection of mammalian cells and removal of viruses from aqueous solutions (用于转染哺乳动物细胞并从水溶液中除去病毒的无机纳米颗粒).Biotechnology and Bioengineering 98(5)1083-1093)。高吸附性纳米颗粒的具体表面积可为50m2g-1至250m2g-1，粒度可为5nm至50nm，并且当它们被放置在支持材料上时，可最有效地过滤并除去微生物(Boccaccini and Zhitomirski，2002，Application of electrophoretic and electrolytic deposition techniques in ceramics processing(陶瓷加工中电泳技术和电解沉积技术的应用).Current Opinion in Solid State and Materials Science 6：251-260；Diersteinet al.，2001，Electrochemical deposition under oxidizing conditions (EDOC)：a new synthesis for nanocrystalline metal oxides(氧化条件下的电化学沉积(EDOC)：用于纳米晶金属氧化物的新合成).Scripta mater.44：2209-2212；Ding et al.，2004，Polymer-Monomer pairs as a reactionsystem for the synthesis of magnetic Fe3O4-Polymer hybrid hollow nanospheres(作为反应体系的用于合成磁性Fe3O4-聚合物混杂的中空纳米球的聚合物-单体对).Angew.Chem.Int.Ed.43：6369-6372)。因此，本发明考虑了固定在支持材料上的纳米颗粒形式的吸附材料的用途。也能够在某些实施方案中使用带负电的吸附材料，例如阳离子交换树脂。
在优选的实施方案中，吸附材料为羟基磷灰石、金属氧化物粉末和/或金属氢氧化物粉末。甚至更优选为羟基磷灰石粉末和/或金属氧化物粉末。羟基磷灰石、金属氧化物粉末和/或金属氢氧化物粉末的合适形式为通常(球状)粒度为5μm至1mm的晶体或陶瓷颗粒状或粒状羟基磷灰石、金属氧化物粉末和/或金属氢氧化物粉末。羟基磷灰石、金属氧化物粉末和/或金属氢氧化物粉末可以为大孔形状，其中5μm至1mm的孔径大小是合适的。可以调节吸附(和/或支持)材料的粒度和孔径大小来控制液体流过吸附材料床的流量。当采用如以下实施例1所示的测试条件时，在本发明的方面中用作吸附材料的最优选材料显示出超过36％的附着百分率，更优选超过40％，甚至更优选超过80％。这些条件包括，在0.9wt.％NaCl内的约1.106细胞/ml的细胞悬浮液中，至少所指示百分率的细胞于15分钟内，在室温搅拌下附着至以粉末提供的吸附材料上，该吸附材料具有1μm至1mm的粒子，在所述悬浮液中为约3wt.％。
使用的支持材料能够由羟基磷灰石、金属氧化物和/或金属氢氧化物球(或基本上球形的粒子)，或合适大小的任何其它矿物粒子制成。合适的支持粒子包括从诸如硅酸盐、玻璃、金属、陶瓷和粘土矿物的无机材料制成的粒子；以及诸如纸张、木材、胶乳或合成的聚合物(如塑料)的有机材料的粒子。粒子的大小应为约1μm至5mm，优选为5μm至1mm。粒子可以为固态或多孔的。
或者，可以使用孔径大小为5μm至1mm的开孔泡沫或填塞物(软物质或纤维板)合成材料的作为支持材料，例如石料填塞物、聚氨酯、氯丁橡胶、聚烯烃或纸张。
为了避免液体可渗透的吸附材料床的堵塞，并将床固定在适当位置，可以将前过滤器放置在吸附材料之前(即在液体入口方向上)。例如这样的前过滤器可由多孔的聚氨酯(开孔)泡沫、多孔氯丁橡胶、多孔聚烯烃或石料填塞物制成。
为了避免由于液体流动而非有意地从床中除去吸附材料，特别是当以颗粒形式提供吸附材料时，可以将后过滤器放置在吸附材料之后(即在液体出口方向上)。例如这样的后滤器可由多孔聚氨酯(开孔)泡沫、多孔氯丁橡胶、多孔聚烯烃或石料填塞物制成。
合适的前过滤器和后过滤器具有可在任一侧基本覆盖吸附材料床的表面大小。前过滤器和后过滤器的厚度可为0.1cm至10cm或更厚。
本发明的装置还包括低压室。该术语是指能够建立相对真空的空的区域。该室为基本上封闭的任何形状的部件。非常合适的是，由具有基本上圆柱形的侧壁(低压室壁)并具有封闭顶端和底端的壳体的内部形成室，但是其它形状同样是合适的。原则上可以将液体入口和空气出口放置在室的壁、顶端或底端，但优选提供于室的顶端。低压室的目的是提供相对真空，所述相对真空通过过滤器壳体的液体出口延伸，经过液体可渗透过滤器床直达过滤器壳体的液体入口，以便将液体样本吸入过滤器壳体中。低压室的目的是还提供基本上水平恒定的相对真空，从而提供通过液体可渗透的吸附材料床的液体的恒定流量。
由于通常将数升液体的量朝相对真空的源头抽吸并流过吸附材料床，以在吸附材料上浓缩足够数量的用于随后检测的微生物，因此该液体首先将充满过滤器壳体(通常其内容积不超过1mL至1000mL)，并且当在低压室中连续应用相对真空并确保跨越过滤器壳体的压力差时，过滤的液体会开始通过液体出口流出过滤器壳体，经过密封的管道(位于过滤器壳体和低压室之间)并最终进入低压室。结果，由于液体的进入，所述室的低压条件将变差。为此，低压室将包括液体收集部分。非常适合的是，室的最低部分(有效收集过滤的液体的部分)可包括液体收集部分。为了避免室中低压条件变差，例如通过液体可渗透的并且空气不可渗透的膜或通过重力阀门，可将过滤的液体从低压室中排空，从而避免空气进入低压室，但是允许流体从室中释放或排出。在另一可选择的实施方案中，例如通过在过滤器壳体与低压室之间的管道中或在管道的位置提供排放或储存或收集器件，能够在液体进入低压室之前将液体除去。在优选的实施方案中，通过从储存或收集容器中排气，由该容器的内部空间形成低压室，并且通过利用真空泵从该室中进一步排气来补救低压条件的变差。
低压室可由任何合适的能够经受轻微低压条件而不会自身压扁的材料制备。低压室可以由任何合适的坚硬材料制成，例如玻璃、金属、聚苯乙烯、聚丙烯(polyacryl)、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、丙烯酸酯/丁二烯/苯乙烯共聚物(ABS)、聚氯乙烯(PVC)、尼龙、乙烯/乙酸乙烯共聚物(EVA)、聚对苯二甲酸乙二酯及其组合。例如该材料可以是完全透明的、白色的、黑色的或透明的或挡光的材料，并且原则上可以为任何颜色。
应该注意到，在低压室的液体收集部分所收集的液体中的微生物很低，这是由于大多数微生物已经通过吸附至液体可渗透的吸附材料床从液体中除去。如果液体为水，该水将比用于测试污染的初始水样本在微生物学上更加安全。因此，本发明的装置也可用于降低液体的微生物负载量。
本发明的装置还包括用于在低压室中产生低压条件的器件。用于在低压室中产生低压条件的器件，其在本文中通常称为真空泵，但是当然不限于被称为真空泵的商购装置，应当提供在过滤器壳体中产生相对真空的可能性，从而将液体吸入到滤器壳体中并通过液体可渗透的吸附材料床。最终，液体会进入低压室中。因此，原则上真空泵可以是密封并与低压室壁滑动接触的活塞。通常，跨越过滤器壳体的小的压力差(其中在液体入口位置的压力基本上是大气压，并且在液体出口位置的压力基本上低于大气压)就足以获得将液体样本抽吸通过液体可渗透的吸附材料床的所需结果。跨越过滤器壳体的压力差可为约760托至76托(其中760托等于760mm Hg@0℃或1atm abs或约1013mbarA或101.325kPa)，优选地，760托至228托的真空压力工作良好。
本文所用的术语“系统”是指材料的排列，任选地与使用该排列的具体方法组合来实现目的。本发明的用于检测液体样本中的微生物的系统包括上述装置和用于检测所述微生物的试剂盒。本文所用的术语“试剂盒”是指以任何形式以下述方式提供在一起的许多组分或者部件或相关部分的任何组合：优选将它们提供在普通包装内，或者为至少一种组分提供优选为印刷形式的使用说明书，该说明书涉及用于检测对待测微生物具有特异性的酶活性所必需的至少一种其它组分。
试剂盒通常包括适于被并入合适的用于支持微生物繁殖的生长培养基中的显色底物和/或荧光底物，以及任选的说明书，该说明书用于组装、操作或拆卸装置和/或用于通过使用检测试剂盒来检测浓缩在所述装置中的微生物。为了诱导待测酶的表达，可向生长培养基中加入特异性诱导物(本文称为酶诱导剂)。在大肠菌类和大肠杆菌的情况下，其中测试乳糖-转化酶，液体生长培养基可适宜地包含诱导物，例如异乳糖、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和/或乳糖。
基于显色底物和/或荧光底物的用于检测微生物的试剂盒是本领域公知的，并且能够利用任意数个从不同供应商处购买的商用试剂盒。非常合适的用于检测耐热大肠菌类和大肠杆菌的试剂盒为Testkit(IDEXX Laboratories，Inc.，Westbrook，Maine，USA)。在美国专利4,925,789、5,429,933、5,518,892、5,610,029、5,620,865、5,620,895、5,690,825、5,700,655、5,753,456、5,780,259、5,985,594、6,287,797、6,329,166、6,387,650、6,472,167、6,509,168、6,730,496和6,783,950中能够找到关于Tests的更多信息。其它工作良好的显色试剂盒为Colilert、Colisure(IDEXX，USA)、ColiComplete(Biocontrol，USA)、Fluorocult LMX、Readycult大肠菌类(Merck，德国)、E.colite (Charm Sci.，USA)和B2P Coliquik(B2P Limited，新西兰)、m-Coliblue (Hach，USA)(Manfani，2000，New developments in chromogenic and fluorogenic culture media(显色培养基和荧光培养基的新发展).International Journal of Food Microbiology 60：205-218)。
使用装置和检测试剂盒的说明书可包括用于在本文所述的液体样本中检测微生物的本发明方法的概要。
用于在液体样本中检测微生物的本发明方法优选使用本发明的装置。通过流体连接装置的单独部件来组装该装置。将过滤器壳体的液体入口与液体样本接合，并且利用真空泵通过空气出口从所述低压室中排出空气以任意次序开始所述方法。
装置的正确组装和低压室中低压条件的产生会导致延伸至过滤器壳体的液体入口的相对真空，然后该相对真空会吸入液体。当液体充满过滤器壳体时，维持低压室中的低压条件，并且会产生通过液体入口延伸至液体样本的跨越过滤器壳体的压力差，由此向过滤器壳体吸入甚至更多的液体。已经穿过吸附材料床的液体会通过所述液体出口离开过滤器壳体，并被收集在收集部分。维持跨越过滤器壳体的压力差和液体与过滤器壳体入口的接触，直至足够的液体已经穿过吸附材料床。
如本文所用的，技术人员应当理解的是，需要过滤的液体样本的有效量很大程度上取决于液体样本中待测微生物的负载量。小的负载量(低污染水平)将需要从大量液体中浓缩微生物，从而获得许多能够利用微生物生长的最短孵育周期来检测的吸附的微生物。或者当微生物生长的长孵育周期不成问题时，甚至当分析少量液体时，少量吸附的微生物仍能够产生阳性的检测结果。
在本发明的方法中，优选的是，被分析的液体的体积(通过吸附材料床)是大的(1升至100升)，从而减少吸附的微生物的其它培养所需的时间。
优选地，在低压室内所产生的相对真空，使通过吸附材料床的流量为约50m/h至150m/h。通常，100m/h的流量(以每单位时间被泵入通过过滤床(filer bed)(吸附材料的颗粒床)的液体的量(以L/h表示)乘以液体通过的过滤床的表面积(例如位于半径为0.69cm，表面积为πr2＝1.5cm2的圆柱形箱中的过滤床来计算)低得足以获得超过80％的吸附剂上的微生物的吸附效率，同时通常在不到30分钟内，快得足以允许过滤1升至100升、优选约10升至50升、最优选约5升至15升液体。
一旦期望量的液体已经穿过吸附材料床，则将吸附有微生物的吸附材料床用液体生长培养基孵育，该液体生长培养基补充有显色底物和/或荧光底物。或者，可将显色底物和/或荧光底物共价结合至过滤床材料上。
对于该步骤，适当地使用补充了由上述商购的试剂盒提供的显色底物和/或荧光底物的液体生长培养基。通过使吸附材料与补充的生长培养基接触来开始孵育。这例如可以通过以下步骤来实现：将过滤器壳体与低压室分开，从所述液体样本中排出过滤器壳体的剩余液体，以及例如使用针和注射器向吸附材料床加入补充的生长培养基。或者，能够使用真空将补充的生长培养基吸入过滤器壳体中，来用补充的生长培养基浸泡吸附材料。
优选在约30℃至45℃下，最优选在约37℃下将孵育进行有效的一段时间来确定总的大肠菌类和/或大肠杆菌。优选44℃至45℃的温度来确定耐热大肠菌类和/或大肠杆菌。技术人员容易理解的是，所述有效的一段时间的持续，在很大程度上取决于吸附材料上的待测微生物的负载量。通过常规的实验方法可确定合适的时间。通常，为了检测微生物的酶活性，约1至8小时、通常2至6小时、最通常3至4小时的时间是有效的时间。
本发明的装置和方法重要的优势是，在过滤器壳体中将微生物浓缩并添加液体生长培养基之后，可将整个过滤器壳体例如放在人的腋窝下来来提供约37℃(即36℃至38℃)的所需孵育温度。
在孵育期中，其中允许微生物生长并代谢显色底物和/或荧光底物，通过可视地使用合适的照明或通过使用合适的荧光检测仪器，能够监测颜色或荧光显影。在吸附材料床和/或其区域周围过滤器壳体的颜色显影，表明存在源自所述液体样本的吸附至吸附材料上的微生物。
可以对相同的液体样本多次进行本发明的方法。可信的测试需要代表性取样。推荐的微生物分析的最少量，取决于用具体饮用水源供应水的人口。WHO的指导原则粗略要求使用该水的每5,000人，每月分析一次。
现在，在以下非限制性实施例中更详细地描述本发明。
实施例
实施例1.吸附材料
将0.5ml的大肠杆菌细胞(菌株K12)的过夜液体培养物悬浮在试管中的4.5ml的盐水(0.9wt.％NaCl)中，该试管含有0.5ml的要测试细胞吸附性质的吸附材料悬浮液。使用下述悬浮液。由氧化物、沙子和珍珠岩制备30wt％(在5ml盐水(0.9％NaCl)中2克)的悬浮液。按制造商所提供的，使用来自离子交换介质取样包(Ion Exchange Media Sampler Pack)的悬浮液，如果是粉末，则以30wt.％悬浮在盐水中。将0.5ml的所述悬浮液加入至5ml的测试培养物(0.5ml培养物+4.5ml盐水)中。
-氧化钛(作为氧化钛(IV)，工业级，≥99％；Sigma Aldrich，产品编号14021_Riedel)；
-氧化锆(作为氧化锆(IV)，粉末，5μm，99％痕量金属基；Sigma Aldrich，产品编号230693_Aldrich)；
-氧化铪(作为氧化铪(IV)，粉末，98％，Sigma Aldrich，产品编号202118_Aldrich)；
-氧化铁(作为氧化铁(III)，红色，纯化的，≥95％；Sigma Aldrich，产品编号12342)；
-氧化锰(作为氧化锰(IV)，≥90％，粉末，Sigma Aldrich，产品编号13242)；
-羟基磷灰石80μm；(作为
Figure BPA00001184384300171
型陶瓷羟基磷灰石介质，产品编号157-0080，BioRad Laboratories，Hercules，CA，USA)
-珍珠岩(作为Agra-珍珠岩(Agra-perlite)，100升，Pull RhenenB.V.，Rhenen，The Netherlands)；
-介质取样包(产品编号158-0100，BioRad Laboratories，Hercules，CA，USA；组成为：Macro-Prep High Q、DEAE、High S和CM，各5ml；I型和II型CHT陶瓷羟基磷灰石，各10g；UNOsphere Q和S，各25ml；以及Macro-Prep甲基HIC和叔丁基HIC，各25ml)；
Figure BPA00001184384300181
链霉抗生物素1(＝M-280)和2(＝MyOneTM链霉抗生物素Cl)(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA，USA)。
将细胞与测试吸附材料的混合物在盐水中搅拌15分钟。15分钟后，通过离心(20’@500rpm)使测试吸附材料(带有附着的大肠杆菌细胞)形成小球，并将含有自由悬浮的、未附着的细胞的上清液轻轻倒出，留下小球用在实施例2中(见下文)。利用连续稀释法和标准平板计数技术以集落形成单位(CFU)的形式来计数上清液中的细胞。利用公式(X-Y)*100％，以附着百分数来表示细胞在测试吸附材料上的附着，其中X为在不包括测试吸附材料的培养物的对照等分试样中CFU的数目，而Y为在包括测试吸附材料的测试培养物的上清液中CFU的数目。附着百分数显示在下表1中。
在该测试中最有效的材料为金属氧化物颗粒。这些颗粒与羟基磷灰石相似，也带有正电，这表明吸附是通过细菌细胞和吸附材料间的静电相互作用方式。没有或很难结合大肠杆菌细胞的材料包括不带电的(沙子)或带负电的(珍珠岩、阳离子交换树脂)的材料。
实施例2.吸附的细胞的检测
向实施例1所述的实验测试的小球中加入1ml的B2P ColiQuik试剂(B2P limited，Auckland，New Zealand)。在37℃下孵育小球，并且监测色原从蓝色到粉色的颜色改变的时间。这些孵育时间显示在下文的表1中。
通常，表现出高水平细胞附着的材料也导致色原非常早的颜色变化。
在氧化铁和氧化锰的情况下，色原的不可视性涉及这样的事实：材料自身的深色妨碍了色原颜色变化的观察。
表1：大肠杆菌结合不同吸附材料的效力(实施例1)，以及利用B2PColiQuik对附着细胞的检测测试(实施例2)。
Figure BPA00001184384300191

Claims (25)

1.用于从液体样本中浓缩微生物的装置，包括：
-过滤器壳体，包括
液体入口，所述液体样本能够通过所述液体入口进入所述过滤器壳体，并且所述液体入口适于与所述液体样本接合，
液体出口，所述液体样本能够通过所述液体出口离开所述过滤器壳体，并且所述液体出口适于与低压室密封接合，以及
液体可渗透的吸附材料床，其被装在所述过滤器壳体中的所述液体入口与所述液体出口之间，并且能够通过静电相互作用来吸附微生物，由此，当跨越所述过滤器壳体施加压力差时，所述液体样本通过所述液体入口被吸入所述过滤器壳体中，并且在通过所述液体出口离开之前穿过所述液体可渗透的吸附材料床；
-低压室，其具有适于与所述过滤器壳体的液体出口密封接合的液体入口，而且还具有用于从所述低压室排气的空气出口；以及
-真空泵，其适于与所述低压室的空气出口密封接合。
2.如权利要求1所述的装置，其中所述过滤器壳体在所述吸附材料床的位置基本上是圆柱形的和半透明的，其中所述壳体的内容积优选为1ml至10ml。
3.如权利要求1或2所述的装置，其中所述吸附材料具有带正电的表面，并且选自不溶性金属氢氧化物、金属氧化物、支持材料上的金属氢氧化物、支持材料上的金属氧化物、支持材料上的凝集素、支持材料上的碳二亚胺、支持材料上的阳离子聚合物、阴离子交换树脂和阳极。
4.如权利要求3所述的装置，其中所述阳离子聚合物选自聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺及其组合。
5.如权利要求3所述的装置，其中所述不溶性金属氢氧化物和/或不溶性金属氧化物选自羟基磷灰石、氢氧化锆、氢氧化钛、氢氧化铪、氧化锆、氧化钛、氧化锰、氧化铁和氧化铪。
6.如权利要求1或2所述的装置，其中所述吸附材料为固定在支持材料上的纳米颗粒的形式。
7.如权利要求5所述的装置，其中所述吸附材料为羟基磷灰石。
8.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述液体为水。
9.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述真空泵为手动真空泵。
10.用于检测液体样本中微生物的系统，包括：
-权利要求1至9中任一项所述的用于从液体样本中浓缩微生物的装置；
-用于通过检测对所述微生物特异性的酶活性来检测所述微生物的试剂盒，所述试剂盒包括：
显色底物和/或荧光底物，
液体生长培养基；
以及
-用于组装、操作和拆卸所述装置，和/或利用所述检测试剂盒检测在所述装置中浓缩的微生物的任选的说明书。
11.如权利要求10所述的系统，其中所述试剂盒用于通过分别检测β-D-半乳糖苷酶和/或β-D-葡糖苷酸酶的酶活性来检测大肠菌类和/或大肠杆菌。
12.如权利要求11所述的系统，其中通过使用显色底物或荧光底物来检测β-D-葡糖苷酸酶和/或β-D-半乳糖苷酶活性，所述显色底物或荧光底物选自4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸(MUG)、邻-硝基苯基β-D-葡糖苷酸(ONPG)、对-硝基苯基β-d-葡糖苷酸(PNPG)、β-萘二甲酰亚胺-β-D-葡糖苷酸、6-溴-2-萘基β-D-葡糖苷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-葡糖苷酸(BCIG或X-葡糖苷酸)、α-萘酚-β-D-葡糖苷酸、4-甲基伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷(MUGal)、邻-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPGal)、对-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPGal)、6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(Salmon-Gal)、5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)、4-硝基苯基1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(NPSGal)、6-溴-2-萘基-β-d-吡喃半乳糖苷、3，4-二硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(DNPGal)、功能性衍生物及其组合。
13.如权利要求11或12所述的系统，其中所述液体生长培养基包含异乳糖、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和/或乳糖。
14.用于检测液体样本中微生物的方法，所述方法包括以下步骤：
-将过滤器壳体的液体入口与液体样本接合，其中所述过滤器壳体具有液体出口并在所述液体入口与所述液体出口之间装有液体可渗透的吸附材料床，其中所述吸附材料能够通过静电相互作用吸附微生物；
-借助于所述过滤器壳体的液体出口与低压室的液体入口之间的密封通道，使所述过滤器壳体的液体出口与低压室的液体入口流体连通；以及
-跨越所述过滤器壳体施加压力差，所述压力差通过所述过滤器壳体的液体入口延伸至所述液体样本，从而使所述液体样本通过所述液体入口被吸入所述过滤器壳体中，并且在通过所述液体出口离开所述过滤器壳体之前穿过所述液体可渗透的吸附材料床，其中通过利用真空泵，经过空气出口从所述低压室抽气来施加所述压力差，由此将所述过滤器壳体置于相对真空下并将存在于所述液体样本中的所述微生物吸附至所述液体可渗透的吸附材料床上；
-跨越所述过滤器壳体连续施加压力差直至有效量的所述液体样本穿过所述液体可渗透的吸附材料床；
-用补充了显色底物和/或荧光底物的液体生长培养基将所述液体可渗透的吸附材料床孵育有效的时间段，以检测微生物的酶活性；
-监测显色颜色或荧光颜色的显影来确定吸附至吸附材料上的微生物的存在或不存在，其中吸附至所述吸附材料上的微生物的存在表明在所述液体样本中存在微生物。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述吸附材料选自不溶性金属氢氧化物、金属氧化物、支持材料上的金属氢氧化物、支持材料上的金属氧化物、支持材料上的凝集素、支持材料上的碳二亚胺、支持材料上的阳离子聚合物、阴离子交换树脂和阳极。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述阳离子聚合物为聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺及其组合。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述不溶性金属氢氧化物和/或不溶性金属氧化物选自羟基磷灰石、氢氧化锆、氢氧化钛、氢氧化铪、氧化锆、氧化钛、氧化锰、氧化铁和氧化铪。
18.如权利要求14所述的方法，其中所述吸附材料为固定在支持材料上的纳米颗粒的形式。
19.如权利要求14所述的方法，其中所述吸附材料为羟基磷灰石。
20.如权利要求14至19中任一项所述的方法，其中所述液体为水。
21.如权利要求14至20中任一项所述的方法，其中所述真空泵为手动真空泵。
22.如权利要求14至21中任一项所述的方法，其中所述液体生长培养基和所述显色底物和/或荧光底物用于通过检测β-D-半乳糖苷酶和/或β-D-葡糖苷酸酶的酶活性来检测大肠菌类和/或大肠杆菌。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述显色底物和/或荧光底物选自4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸(MUG)、邻-硝基苯基β-D-葡糖苷酸(ONPG)、对-硝基苯基β-d-葡糖苷酸(PNPG)、β-萘二甲酰亚胺-β-D-葡糖苷酸、6-溴-2-萘基β-D-葡糖苷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-葡糖苷酸(BCIG或X-葡糖苷酸)、α-萘酚-β-D-葡糖苷酸、4-甲基伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷(MUGal)、邻-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPGal)、对-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPGal)、6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(Salmon-Gal)、5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)、4-硝基苯基1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(NPSGal)、6-溴-2-萘基-β-d-吡喃半乳糖苷、3，4-二硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(DNPGal)、功能性衍生物及其组合。
24.如权利要求22或23所述的方法，其中所述液体生长培养基包含酶诱导剂，例如异乳糖、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和/或乳糖。
25.如权利要求22至24中任一项所述的方法，其中吸附至所述吸附材料上的微生物的存在表明粪便细菌可能污染了所述液体样本。
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