CN102083996A

CN102083996A - 氧化方法

Info

Publication number: CN102083996A
Application number: CN2009801236945A
Authority: CN
Inventors: 乔恩·D·米凯尔森; 卡斯滕·M·克拉夫; 勒内·米凯尔森; P·M·F·德卡斯; 于书坤; 哈姆·穆德尔; 艾戈·尼古莱夫
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2008-04-30
Filing date: 2009-04-30
Publication date: 2011-06-01
Also published as: WO2009133464A9; US20110256571A1; WO2009133462A3; EP2279248A2; HK1153507A1; WO2009133462A2; EP2281034A2; EP2281034B1; US8802398B2; US8791232B2; US20110236935A1; WO2009133464A2; WO2009133464A3; WO2009133462A9; EP2279248B1; WO2009133461A1; DK2281034T3

Abstract

本发明描述了通过使糖接触醇脱氢酶(ADH)来氧化所述糖的方法，其中所述醇脱氢酶选自醌氧化还原辅助因子依赖性ADH、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)氧化还原辅助因子依赖性ADH、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)氧化还原辅助因子依赖性ADH及其任意组合。本发明还描述了可通过所述方法获得的氧化糖和包含所述氧化糖的产品，特别是食品和纸制品。

Description

氧化方法

相关申请

本发明涉及在2008年4月30日提交的UK专利申请号0807882.6(代理人案号P033144GB(AFC))，2008年6月25日提交的UK专利申请号0811662.6(代理人案号P033144GBR)和2008年9月24日提交的US专利申请号USSN61/099667(代理人案号P033144USO)中公开的主题，上述各申请的内容通过引用并入本文。

本发明还涉及在2008年4月30日提交的UK专利申请号0807881.8(代理人案号P033172GB(SC))和2008年9月24日提交的US专利申请号USSN61/099698(代理人案号P033172USO)中公开的主题，上述各申请的内容通过引用并入本文。

本发明还涉及在2008年9月17日提交的UK专利申请号0817077.1(代理人案号P033900GB(SPC))和2008年9月24日提交的US专利申请号USSN61/099715(代理人案号P033900USO)中公开的主题，上述各申请的内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及氧化方法。

具体地，本发明涉及用于修饰多糖的方法。

更具体地，本发明涉及用于氧化多糖的方法，以及可通过所述方法获得的氧化多糖，及其多种应用，特别是在食品和纸制品中的应用。

背景技术

很多水胶体、果胶、海藻酸盐、角叉菜胶、土豆淀粉和羧甲基纤维素由于半乳糖醛酸(果胶)、α-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸(海藻酸盐)、硫酸根(角叉菜胶)、磷酸根(土豆淀粉)和羧甲基基团(羧甲基纤维素)而带有负电荷。这些取代基对复杂食品基质中水胶体的功能性具有显著影响。其中，果胶、海藻酸盐、土豆淀粉和角叉菜胶是天然存在的，并由植物和藻类合成，而羧甲基纤维素则是通过化学处理由纤维素产生。由于规定的限制和获取官方批准所需的费用问题，仅有少数化学修饰的水胶体被批准用于食品。

大量的食品和饲料产品包含淀粉，因此，可适合于进一步加工，如酶促修饰。具体地，在烘焙过程中，控制淀粉凝沉(starch retrogradation)和重结晶在减缓面包老化中具有重要意义。

包含醛基基团的多糖衍生物及其作为造纸助剂的应用是本领域公知的。例如US4675394描述了多糖醛，例如淀粉、树胶和纤维素醛及其非氧化制备方法，所述方法包括使多糖原料在碱存在下与乙缩醛衍生化试剂反应，随后水解所得的乙缩醛。

氧化糖，特别是氧化多糖可作为偶联剂应用于多个技术领域，特别是制药业，其中此类化合物产生增强各种药物的溶解性和递送的效果。例如，US2006198819描述了用于制备糖蛋白结合物的方法，其中所述糖蛋白结合物具有至少一个末端半乳糖或其衍生物以及与其共价结合的延伸基团(protractor group)，所述方法包括使包含半乳糖的糖蛋白接触半乳糖氧化酶以氧化半乳糖基基团的步骤。该申请认为所述结合物具有比非结合糖蛋白延长的体内血浆半衰期。

US4663448描述了包含醛基的杂多糖，特别是淀粉醚衍生物，以及使用半乳糖氧化酶制备所述杂多糖的方法，其中将糖苷单元的C-6位氧化成醛官能团。

US6265570描述了可溶于冷水的稳定淀粉醛组合物及其制备方法，其中通过制备转化的淀粉乙缩醛，并在酸性条件下水解乙缩醛以形成淀粉醛。

通过化学氧化诸如淀粉的多糖来制备其醛衍生物在本领域是已知的。例如，US7247722描述了通过选择性氧化，使用硝酰自由基介质(nitroxyl radical mediator)，例如2，2，6，6-四甲基-1-哌啶氧(TEMPO)自由基制备多糖醛的方法。

WO99/23240描述了用于生产氧化淀粉的方法，其中使用如TEMPO的产生氧代铵离子的试剂，并结合氧化性酶，特别是氧化酶(例如漆酶)或过氧化物酶。然而，在文献描述的方法中，TEMPO才是氧化性试剂：所述酶是用来再生TEMPO，以使其能够以催化量使用。然而，此类化学氧化通常需要刺激性强的试剂(harsh reagent)，而包括TEMPO法在内的此类化学氧化的区域专一性有限。

因此，需要用于糖的氧化方法，其选择性更高地氧化糖分子中的醇官能团，特别是分别氧化己糖环和戊糖环的C-6和C-5位。此外，还需要使用更温和的试剂实施此类氧化反应的方法。

发明内容

第一方面，本发明包括通过使糖(saccharide)接触醇脱氢酶(ADH)来氧化所述糖的方法，其中所述醇脱氢酶选自醌氧化还原辅助因子依赖性ADH、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)氧化还原辅助因子依赖性ADH、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)氧化还原辅助因子依赖性ADH及其任意组合。

第二方面，本发明包括通过或可通过上述方法获得的氧化糖。

第三方面，本发明包括含有通过或可通过上述方法获得的氧化糖的产品。

本发明的其他方面

本发明还涉及包括应用ADH活性多肽的方法，以及ADH活性多肽的用途，其中所述ADH活性多肽在表达过程中经历了共翻译加工或翻译后加工，例如信号肽切除。翻译后切割也可发生在C-末端。优选共翻译加工或翻译后加工发生在N-末端，以产生N-末端截短的序列。

因此，在本发明的一些实施方式中，其有效片段(也称作其功能性片段)是通过天然宿主或适合的恰当表达宿主产生的成熟多肽。

本发明还涉及经过共翻译加工或翻译后加工的ADH活性多肽。

本发明还涉及编码此类经过共翻译加工或翻译后加工的活性多肽的核苷酸序列。

此外，本发明还涉及由全部或部分所述核苷酸序列表达的氨基酸序列，或者可由全部或部分所述核苷酸序列表达的氨基酸序列。

SEQ ID No.1a显示了经过共翻译加工或翻译后加工的活性多肽的实例。

不希望被理论束缚，SEQ ID No.2可被任选地切割成SEQ ID No.2a。

不希望被理论束缚，SEQ ID No.5可被任选地切割成SEQ ID No.5a。

因此，本发明还包括：

包含SEQ ID No.1A的氨基酸序列，或与SEQ ID No.1A具有至少75％氨基酸序列同一性但不是SEQ ID No.1的氨基酸序列；

包含SEQ ID No.1A的氨基酸序列，或与SEQ ID No.1A具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；

包含SEQ ID No.2A的氨基酸序列，或与SEQ ID No.2A具有至少75％氨基酸序列同一性，但不是SEQ ID No.2的氨基酸序列；

包含SEQ ID No.2A的氨基酸序列，或与SEQ ID No.2A具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；

包含SEQ ID No.5A的氨基酸序列，或与SEQ ID No.5A具有至少75％氨基酸序列同一性，但不是SEQ ID No.5的氨基酸序列；

包含SEQ ID No.5A的氨基酸序列，或与SEQ ID No.5A具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；

编码所述氨基酸序列中任何一个的核苷酸序列；

包含所述核苷酸序列的载体；

由所述核苷酸序列或所述载体转化的宿主；

所述宿主可以是细菌宿主、真菌宿主、酵母宿主或植物宿主；

包括表达所述核苷酸序列或所述载体的方法。

本发明的一些优选方面

本发明的优选方面在本申请的说明书、实施例和权利要求书中是清楚的。

一些优选方面包括：

本发明所述的方法或糖或产品或应用或氨基酸序列或核苷酸序列，其中所述醇脱氢酶选自酶分类EC 1.1.5的醇脱氢酶。

本发明所述的方法或糖或产品或应用或氨基酸序列或核苷酸序列，其中所述醇脱氢酶选自酶分类EC 1.1.5.2的醇脱氢酶。

本发明所述的方法或糖或产品或应用或氨基酸序列或核苷酸序列，其中所述醇脱氢酶选自酶分类EC 1.1.1的醇脱氢酶。

本发明所述的方法或糖或产品或应用或氨基酸序列或核苷酸序列，其中所述醇脱氢酶选自酶分类EC 1.1.1.1和EC 1.1.1.2的醇脱氢酶。

本发明所述的方法或糖或产品或应用或氨基酸序列或核苷酸序列，其中所述NAD⁺或NADP⁺辅助因子的存在浓度按重量计为0.01-5000ppm。

本发明所述的方法或糖或产品或应用或氨基酸序列或核苷酸序列，其中所述NAD⁺或NADP⁺的存在浓度按重量计为0.10-1000ppm。

附图说明

图1显示了通过发酵含有PQQ-ADH基因的重组毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)菌株获得的细胞外培养液的SDS-PAGE；

图2显示了葡萄糖1-乙基肟的结构和片段；

图3显示了葡萄糖1，6-双(乙基肟)的结构和片段；

图4是包含PQQ依赖性ADH基因、Gateway相容的attL位点和博莱霉素选择标记的pENTRY-ADH质粒图；

图5是源自pPIC3.5K(Invitrogen)的毕赤巴斯德酵母目的载体pPIC2-DEST的质粒图；

图6是毕赤巴斯德酵母PQQ-ADH表达质粒pPIC2-ADH的质粒图；

图7是表达大肠杆菌(E.coli)醛糖脱氢酶yliI的质粒pET3d-asd的图示。

具体实施方式

一方面，本发明包括通过使多糖接触醇脱氢酶(ADH)来氧化所述多糖的方法，其中所述醇脱氢酶选自醌氧化还原辅助因子依赖性ADH、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)氧化还原辅助因子依赖性ADH、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)氧化还原辅助因子依赖性ADH及其任意组合。

糖

在本说明书中，术语“糖”旨在涵盖所有的糖类(糖)，包括天然存在的，以及合成和半合成的糖类。此术语包括单糖(即不能水解成更简单的糖的糖类)、二糖(即具有通过糖苷键连接在一起的2个单糖单元(部分)的化合物)、寡糖(即具有通过糖苷键连接在一起的3-10个单糖单元(部分)的直链或支链，或环状(任选具有糖侧链)化合物)和多糖(即具有通过糖苷键连接在一起的10个以上单糖单元(部分)的直链或支链，或环状(任选具有糖侧链)化合物)。

糖可结合其他分子，例如生物分子，如肽、多肽/蛋白(包括酶)、脂质和核酸。然而，出于本发明的目的，优选所述糖仅由单糖单元形成。

在一个实施方式中，所述糖是单糖，即不能水解成更简单的糖的糖类。所述单糖可具有D-或L-构型，并可以是醛糖或酮糖。

在一个实施方式中，所述多糖是己糖，其实例包括己醛糖，例如葡萄糖、半乳糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖和塔罗糖，和己酮醣，例如果糖、塔格糖、阿洛酮糖和山梨糖。优选地，己糖为葡萄糖或半乳糖。

在另一个实施方式中，所述单糖是戊糖，其实例包括戊醛糖，例如核糖、阿拉伯糖、木糖和来苏糖，和戊酮醣，例如核酮糖和木酮糖。优选地，戊糖为阿拉伯糖或木糖。

在可选的实施方式中，所述糖是高级糖，即具有通过糖苷键连接在一起的多于一个单糖部分的糖，其通常可水解成其单糖组分。此类高级糖的实例包括二糖(2个单糖部分)、寡糖(3-10个单糖部分)和多糖(多于10个单糖部分)。在此方面，形成高级糖的单糖部分可相同或不同，可各自独立地具有D-或L-构型，并可各自独立地为醛糖或酮糖部分。

形成高级糖的单糖单元可具有相同或不同数量的碳原子。在一个实施方式中，高级糖的单糖部分(moiety)是己糖部分，其实例包括己醛糖，例如葡萄糖、半乳糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖和塔罗糖，和己酮醣，例如果糖、塔格糖、阿洛酮糖和山梨糖。优选地，此类高级糖的己糖部分是葡萄糖部分。

在另一个实施方式中，所述高级糖的单糖部分是戊醛糖部分，例如核糖、阿拉伯糖、木糖和来苏糖，和戊酮醣，例如核酮糖和木酮糖。优选地，此类高级糖的戊糖部分是阿拉伯糖或木糖部分。

形成高级糖的单糖部分通过糖苷键连接在一起。当所述单糖部分是己糖部分时，所述糖苷键可以是1，4′-糖苷键(其可以是1，4′-α-糖苷键或1，4′-β-糖苷键)、1，6′-糖苷键(其可以是1，6′-α-糖苷键或1，6′-β-糖苷键)、1，2′-糖苷键(其可以是1，2′-α-糖苷键或1，2′-β-糖苷键)或1，3′-糖苷键(其可以是1，3′-α-糖苷键或1，3′-β-糖苷键)或其任意组合。

在一个实施方式中，高级糖包括2个单糖单元(也就是二糖)。适合的二糖的实例包括乳糖、麦芽糖、纤维二糖、蔗糖、海藻糖、异麦芽酮糖(isomaltulose)和海藻酮糖(trehalulose)。

在另一个实施方式中，高级糖包括3-10个单糖单元(也就是寡糖)。单糖单元可以排列成支链或直链：在本说明书中，此类寡糖被称作“链状寡糖”。此类寡糖的实例包括：麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖、纤维六糖和纤维七糖，以及由果糖分子的短链组成的果寡糖(FOS)；甘露寡糖、异麦芽寡糖、半乳寡糖和木寡糖。

或者，形成寡糖的单糖单元也可形成环，其任选地具有糖侧链：在本说明书中，此类寡糖被称作“环状寡糖”。所述环通常由5-8个单糖单元组成，优选6-8个，且更优选6个单糖单元：所述侧链在存在时，通常由1-4个单糖单元组成，优选由1或2个单糖单元组成。

具体地，所述环状寡糖可以是环糊精。环糊精(有时也称作环式直链淀粉，cycloamylose)构成了环状寡糖家族，其由如直链淀粉(淀粉片段)那样的1-＞4连接的5个或更多α-D-吡喃葡糖苷单元组成。五元大环不是天然的。典型的环糊精包含位于环中，6-8个单元范围内的多个葡萄糖单体，从而产生锥形。特别优选的环糊精是α-环糊精(六元糖环分子)，β-环糊精(七元糖环分子)和γ-环糊精(八元糖环分子)。

在另一个实施方式中，高级糖是多糖，其包含通过糖苷键连接在一起的至少10个单糖单元。此类多糖通常包含至少约40个单糖单元，例如至少约100，如至少约200，包括至少约500，例如至少约1000，如至少约5000，例如约10000，如至少约50000，例如约100000个单糖单元。

此类多糖中的单糖单元可以连接成支链或直链：在本说明书中，此类多糖被称作“链状多糖”。或者，单糖单元也可连接成环(其可具有，例如约10至约200，优选约10至约100，更优选约10至约50，且最优选约10至约20个单糖单元)，其可具有一个或多个(优选1或2个)侧链，每个侧链包含1-6个(优选1-4，更优选1或2个)单糖单元：在本说明书中，此类多糖被称作“环状多糖”。

在一些实施方式中，所述多糖包含10-500000个单糖单元。在其他实施方式中，所述多糖包含约100至约1000个单糖单元。在其他实施方式中，所述多糖包含约1000至约10000个单糖单元。在其他实施方式中，所述多糖包含约10000至约100000个单糖单元。在一些实施方式中，所述多糖包含40-3000，优选约200至约2500个单糖单元。

此类多糖的实例包括淀粉及其衍生物(例如阳离子或阴离子、氧化或磷酸化的淀粉)、直链淀粉、支链淀粉、糖原、纤维素或其衍生物(例如羧甲基纤维素)、海藻酸或其盐或衍生物、聚葡萄糖、果胶、普鲁兰多糖(pullulan)、角叉菜胶、刺槐豆胶，以及瓜耳胶及其衍生物(例如阳离子或阴离子瓜耳胶)。

在一个实施方式中，所述多糖包括淀粉或其衍生物。淀粉是葡萄糖聚合物，其中吡喃葡萄糖单元通过α-连接结合。其由直链淀粉和支链淀粉的混合物构成。直链淀粉由通过1，4′-α-糖苷键连接在一起的数百个葡萄糖分子的直链组成。与此不同，支链淀粉是由数千个葡萄糖单元组成的支链分子，其主链包含1，4′-α-糖苷键，但每隔约25个葡萄糖单元具有1，6′-α-糖苷分枝。

根据本发明，淀粉衍生物也可被氧化，只要该衍生物包含足够的供酶作用的游离伯羟基基团(即淀粉具有小于1的取代度)。适合的淀粉的实例包括取代淀粉(例如羧甲基淀粉)以及阳离子、阴离子、氧化和磷酸化的淀粉。

在一个实施方式中，多糖包括糖原。糖原是在动物中存在的多糖，其由支链葡萄糖残基构成。

在一个实施方式中，多糖包括纤维素或其衍生物。纤维素是由通过1，4′-β-糖苷键结合在一起的数千个葡萄糖单元形成的聚合物。纤维素的衍生物在本领域是已知的，并且包括羟烷基纤维素，例如羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素，和羧烷基纤维素，例如羧甲基纤维素和羧乙基纤维素。根据本发明，纤维素衍生物也可被氧化，只要该衍生物包含足够的供酶作用的游离伯羟基基团(即纤维素具有小于1的取代度)。

氧化

本发明的方法包括使用本文定义和列举的醇脱氢酶(ADH)氧化如上文定义和列举的糖。

本发明的方法导致单糖或高级糖的单糖部分中的部分伯醇基团被氧化成醛基基团。氧化的程度，以及所得聚合物(底物为高级糖的情况下)的取代度(D.S.)结果取决于多种因素，例如底物、所采用ADH酶的类型和浓度、辅助因子(如果使用)的类型和浓度，以及反应条件，例如温度和压力。

本发明的方法通常导致单糖或高级糖的单糖部分中至少2％，例如至少3％，例如至少4％，例如至少5％，例如至少6％的伯醇基团被氧化成醛基基团。具体地，在底物是由葡萄糖部分构成的高级糖(特别是多糖)的情况下，可将高级糖的葡萄糖单元C-6位的至少2％，例如至少3％，例如至少4％，例如至少5％，例如至少6％的伯醇基团氧化成醛基基团。

因此，本发明优选包含用于氧化由葡萄糖部分形成的高级糖(特别是多糖)的方法，其中使所述多糖接触如本文定义和列举的醇脱氢酶(ADH)，将所述多糖的葡萄糖单元C-6位的至少2％，例如至少3％，例如至少4％，例如至少5％，例如至少6％的伯醇基团氧化成醛基基团。

本发明的氧化方法可导致单糖或高级糖的单糖部分中的一些伯醇基团被氧化成羧酸。-CH₂OH氧化成-CO₂H基团的程度，以及所得聚合物(底物为高级糖的情况下)的取代度(D.S.)结果取决于多种因素，例如底物、所采用ADH酶的类型和浓度、辅助因子(如果使用)的类型和浓度，以及反应条件，例如温度和压力。本发明的方法通常导致单糖或高级糖的单糖部分中的至少0.05％，例如0.05-0.5％的伯醇基团被氧化成羧酸基团。

醇脱氢酶

本发明的方法采用醇脱氢酶(ADH)作为活性成分。醇脱氢酶(ADH)是20世纪60年代中期首先于黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)发现的氧化还原酶。醇脱氢酶是一组的七个脱氢酶，其出现在很多生物体中，并促进醇和醛或酮的相互转化。在人和很多其他动物中，其用于降解可能有毒的醇类；在酵母和很多细菌中，一些醇脱氢酶催化作为发酵一部分的逆向反应。

在本说明书中，术语“醇脱氢酶”在用于分离时包括能够在辅助因子存在或不存在下作用于＞CH-OH基团，将其氧化成＞C＝O基团(或逆反应)的所有酶。在发生逆反应时(即将＞C＝O基团还原成＞CH-OH基团)，此类酶也被称作“醛还原酶”。

一些ADH酶的活性依赖于氧化还原辅助因子的存在。在本说明书中，此类ADH酶被称作“氧化还原辅助因子依赖性醇脱氢酶”，并用于本发明。

具体地，用于本发明的ADH选自醌氧化还原辅助因子依赖性ADH、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)氧化还原辅助因子依赖性ADH、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)氧化还原辅助因子依赖性ADH及其任意组合。下文更详细地描述了氧化还原辅助因子的功能。

本发明是基于醌依赖性ADH和NAD⁺/NADP⁺依赖性醇脱氢酶能够选择性地将单糖或高级糖(特别是多糖)中的单糖部分氧化成醛基基团的惊人发现。这与预期相反，由于此前并不认为此类醇脱氢酶可作用于此类底物。其具有能够通过酶促技术修饰糖，特别是多糖的物理化学性质，并避免使用刺激性强的(harsh)试剂的前景。

具体地，本发明是基于醌依赖性ADH和NAD⁺/NADP⁺依赖性醇脱氢酶分别能够选择性地氧化己糖环或戊糖环的C-6或C-5位的惊人发现。

落入了酶分类(E.C.)1.1.1，特别是E.C.1.1.1.1或E.C.1.1.1.2，以及落入酶分类(E.C.)1.2.1的一些醇脱氢酶，特别是ADH，通常与氧化还原辅助因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)组合发挥作用，反应进行中将NAD⁺或NADP⁺分别还原成NADH或NADPH。

其他醇脱氢酶，特别是落入了酶分类EC 1.1.5，特别是EC 1.1.5.2的那些醇脱氢酶通常与醌氧化还原辅助因子组合发挥作用，特别是选自吡咯喹啉醌(PQQ)、色氨酰色氨酸醌(tryptophyl tryptophanquinone，TTQ)、羟基多巴醌(topaquinone，TPQ)，赖氨酸酪氨酰醌(lysine tyrosylquinone，LTQ)的醌辅助因子，在反应中醌基团被还原成二氢醌或四氢醌基团。

在一个实施方式中，ADH选自酶分类(E.C.)1.1.1或1.1.5。在E.C.1.1.1的ADH酶中，优选在分类1.1.1.1或1.1.1.2中的那些。在E.C.1.1.5的ADH酶中，优选在分类1.1.5.2中的那些。

在另一个实施方式中，ADH选自酶分类(E.C.)1.2.1的醛还原酶。这些酶催化ADH的逆向反应，并且已知取决于条件，很多酶能够充当正向和逆向两种反应的催化剂。

在一个实施方式中，可从活生物体获得ADH，或从活生物体获得ADH。适合的ADH来自于细菌或真菌。优选来自细菌的ADH酶，特别是生糖酮假葡糖杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)ADH、克菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)ADH、布氏热厌氧菌(Thermoanaerobium brockii)ADH和大肠杆菌(Escherichia coli)ASD，或与其中任一种具有至少70％，例如至少75％，例如至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，例如至少97％，更优选至少98％，且最优选至少99％序列同一性的醇脱氢酶。特别优选生糖酮假葡糖杆菌ADH，或与其具有至少70％，例如至少75％，例如至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，例如至少97％，更优选至少98％，且最优选至少99％序列同一性的醇脱氢酶。在来自真菌的ADH酶中，优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ADH，或与其具有至少70％，例如至少75％，例如至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，例如至少97％，更优选至少98％，且最优选至少99％序列同一性的醇脱氢酶。

氨基酸序列

在本发明中，可以使用具有本文定义的特异性质的ADH酶氨基酸序列，特别是下文限定的SEQ ID No.1、1A、2、2a、3、4、5或5a。

本文中使用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”含义相同。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”含义相同。在一些情况下，术语氨“氨基酸序列”与术语“酶”含义相同。

可从适当的来源制备/分离氨基酸序列，或通过合成制备氨基酸序列，或通过使用重组DNA技术制备。

本发明使用的蛋白质可与其他蛋白，特别是其他酶，例如淀粉酶、蛋白酶或脂肪酶组合使用。因此，本发明还涵盖了包含酶组合的组合物，其中所述组合包括用于本发明的ADH酶和其他酶，所述其他酶可以是，例如本文描述的另一种ADH酶或蛋白酶。在下文部分中讨论了这方面的内容。

序列同一性/序列同源性/变体/同源物/衍生物

本发明还包括与本文限定的氨基酸序列，或具有本文定义的特异性质的多肽具有一定序列同一性(有时也称作序列同源性)的多肽的应用。特别地，本发明包括与SEQ ID No.1、1A、2、2a、3、4、5或5a中任一序列具有一定序列同一性的多肽，或其同源物。在本文中，术语“同源物”是指与目标氨基酸或目标核苷酸序列具有序列同一性的实体。在本文中，术语“同源性”可等同于“序列同一性”。

在优选的实施方式中，酶具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或与SEQID No.1具有至少50％，优选至少55％，例如至少60％，如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在优选的实施方式中，酶具有SEQ ID No.1A所示的氨基酸序列或与SEQ ID No.1A具有至少50％，优选至少55％，例如至少60％，如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在优选的实施方式中，酶具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或与SEQID No.2具有至少50％，优选至少55％，例如至少60％，如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

酶可具有SEQ ID No.2A所示的氨基酸序列或与SEQ ID No.2A具有至少50％，优选至少55％，例如至少60％，如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在优选的实施方式中，酶具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列或与SEQID No.3具有至少50％，优选至少55％，例如至少60％，如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在优选的实施方式中，酶具有SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或与SEQID No.4具有至少50％，优选至少55％，例如至少60％，如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在优选的实施方式中，酶具有SEQ ID No.5所示的氨基酸序列或与SEQID No.5具有至少50％，优选至少55％，例如至少60％，如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

酶可具有SEQ ID No.5A所示的氨基酸序列或与SEQ ID No.5A具有至少50％，优选至少55％，例如至少60％，如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应提供和/或编码保留了酶功能活性和/或增强了酶活性的多肽。

在本文中，所采用的同源序列包括与目标序列具有至少50％，优选至少55％，例如至少60％，如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。同源物通常将包含与目标氨基酸序列相同的活性位点等。尽管也可将同源性视为类似性(即具有类似化学性质/功能的氨基酸残基)，但在本文中，优选以术语序列同一性表示同源性。

可通过目测进行序列同一性比对，但更常借助于易于获得的序列比对程序进行。这些可商购获得的计算机程序使用复杂的比较算法来比对两条或更多的序列，所述序列最好地反映了可能导致所述两条或更多序列之间差异的进化事件。因此，这些算法利用了对相同或类似氨基酸的比对进行加分，并对空位插入、空位延伸和不类似氨基酸的比对进行罚分的记分系统进行操作。比较算法的记分系统包括：

i)在每次插入空位时给出罚分(空位罚分)，

ii)在现存空位每额外延伸一位时给出罚分(延伸罚分)，

iii)对相同氨基酸的比对给出高分，并且

iv)对不相同氨基酸的比对给出不同的分数。

大多数比对程序允许更改空位罚分。然而，在使用此类软件进行序列比对时，优选使用默认值。

根据所谓替换矩阵(substitution matrix)的记分矩阵确定对不相同氨基酸的比对给出的分数。此类替换矩阵提供的分数反映了在进化过程中一个氨基酸被另一个氨基酸取代的可能性不同，并且依赖于待取代氨基酸的物理/化学性质的事实。例如，极性氨基酸被另一种极性氨基酸取代的可能性大于被疏水性氨基酸取代的可能性。因此，记分矩阵将对相同的氨基酸给出最高的分数，对不相同但近似的氨基酸给出较低的分数，而对不相同且不近似的氨基酸给出更低的分数。最常用的记分矩阵是PAM矩阵(Dayhoff et al.(1978)，Jones et al.(1992))、BLOSUM矩阵(Henikoff and Henikoff(1992))和Gonnet矩阵(Gonnet et al.(1992))。

用于进行此类比对的适合的计算机程序包括，但不限于Vector NTI(Invitrogen Corp.)，以及ClustalV、ClustalW和ClustalW2程序(Higgins DG &Sharp PM(1988)、Higgins et al.(1992)、Thompson et al.(1994)、Larkin et al.(2007))。可由www.expasy.org的ExPASy蛋白质组学服务器选择不同的比对工具。可进行序列比对的软件的另一个实例是可得自于美国国家生物技术信息中心主页的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)，目前可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上找到，并且首次描述于Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215；403-410。

一旦由软件产生比对，即可计算相似性％或序列同一性％。软件通常将其作为序列比对的一部分进行，并产生数值结果。

在一个实施例中，优选使用ClustalW软件进行序列比对。优选使用以下配对比对参数进行ClustalW比对：

替换矩阵	Gonnet 250
		空位开放罚分：	20
空位延伸罚分：	0.2
		空位结束罚分：	无

ClustalW2可得自于，例如欧洲生物信息研究所的EMBL-EBI网页www.ebi.ac.uk，工具栏-序列分析-ClustalW2。目前，ClustalW2工具的具体网址是www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2。

因此，本发明还包括如本文定义的蛋白质的任意氨基酸序列的变体、同源物和衍生物的应用，特别是如本文定义的SEQ ID No.1、1A、2、2a、3、4、5或5a的那些。

所述序列，特别是SEQ ID No.1、1A、2、2a、3、4、5或5a的那些序列也可具有氨基酸残基的删除、插入或取代，其产生沉默突变(silent change，也称作同义突变)，结果形成功能等效的物质。只要保留了所述物质的次级结合活性，可基于残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质上的类似性进行谨慎的氨基酸取代。例如，带负电的氨基酸包括天门冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；而具有类似亲水性值的不带电极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。

本发明还包括保守取代(本文中使用的取代和替换均表示现有氨基酸残基与可选残基之间的相互交换)，其可发生在所谓同类取代(like-for-like substitution)，例如碱性取代碱性，酸性取代酸性，极性取代极性等。也可发生非保守取代，即从一类残基到另一类残基，或涉及引入非天然氨基酸，例如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶基丙氨酸(pyriylalanine)、噻吩基丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。

可以在，例如碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天门冬氨酸)、脂肪族氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、羟基氨基酸(丝氨酸、苏氨酸)、大氨基酸(苯丙氨酸和色氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸)的分类之内进行保守取代。

也可通过非天然氨基酸进行替换，所述非天然氨基酸包括α*和α-二取代*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化衍生物，例如三氟酪氨酸*、p-Cl-苯丙氨酸*、p-Br-苯丙氨酸*、p-I-苯丙氨酸*、L-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基己酸^#、7-氨基庚酸*、L-蛋氨酸砜^#*、L-正亮氨酸*、L-正缬氨酸*、p-硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟脯氨酸^#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物，例如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*、L-Phe(4-氨基)^#、L-Tyr(甲基)*、L-Phe(4-异丙基)*、L-Tic(1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸^#和L-Phe(4-苯甲基)*。出于上述讨论(涉及同源或非保守取代)的目的，使用符号*表示衍生物的疏水性质，而使用^#表示衍生物的亲水性质，^#*表示两性性质。

变体氨基酸序列可包括可插入到序列任意两个氨基酸残基之间的适合的间隔子基团；除了氨基酸间隔子如甘氨酸或β-丙氨酸残基之外，所述间隔子基团还包括烷基基团，例如甲基、乙基或丙基基团。本领域技术人员还可充分理解另一类变体，其涉及存在类肽(peptoid)形式的一个或多个氨基酸残基。为了避免争议，所用“类肽形式”是指变体氨基酸残基，其中α-碳取代基位于残基的氮原子上而不是α-碳原子上。类肽形式的肽的制备方法在本领域是公知的，例如Simon RJ et al.(1992)、Horwell DC.(1995)。

ADH可选自于生糖酮假葡糖杆菌ADH(SEQ ID No.1)、生糖酮假葡糖杆菌ADH(SEQ ID No.1A)、克菲尔乳杆菌ADH(SEQ ID No.2)、克菲尔乳杆菌ADH(SEQ ID No.2a)、酿酒酵母ADH(SEQ ID No.3)或布氏热厌氧菌ADH(SEQ ID No.4)、大肠杆菌ADH(SEQ ID No.5)或大肠杆菌ASD(SEQ ID No.5a)。

在优选的实施方式中，ADH选自于生糖酮假葡糖杆菌ADH(SEQ ID No.1)、生糖酮假葡糖杆菌ADH(SEQ ID No.1A)、克菲尔乳杆菌ADH(SEQ ID No.2)、酿酒酵母ADH(SEQ ID No.3)或布氏热厌氧菌ADH(SEQ ID No.4)或大肠杆菌ASD(SEQ ID No.5)。

在一个优选的实施方式中，ADH选自生糖酮假葡糖杆菌ADH(SEQ IDNo.1)和生糖酮假葡糖杆菌ADH(SEQ ID No.1A)。

一方面，优选本发明中使用的ADH酶为纯化的形式的。术语“纯化的”是指给定的成分以高水平存在。理想地，该成分是存在于组合物中的主要活性成分。

分离的和/或纯化的

一方面，优选本发明中使用的ADH酶为分离的形式。术语“分离的”是指产物至少基本不包含至少一种在反应混合物中与所述产物结合的其它成分。

一方面，优选本发明的产物为纯化的形式的。术语“纯化的”是指给定的成分以高水平存在。理想地，该成分是存在于组合物中的主要成分。优选其存在水平为至少约90％，或至少约95％，或至少约98％，其中所述水平是在相对于目标总组合物的干重/干重基础上测定的。

浓度

ADH可以以任意浓度存在，以使其能够实施所需氧化多糖的功能。所需的ADH浓度取决于多种因素，例如纯化方法，以及任意辅助因子(如果存在)的浓度。适合地，ADH的存在浓度为至少约0.05ppm(按重量计)，例如至少约1ppm，至少约10ppm，至少约100ppm，至少约150ppm或至少约200ppm。优选ADH的存在浓度为约0.05-500ppm，优选约0.1-200ppm，更优选约0.2-100ppm，更优选约0.5-50ppm，更优选约1-50ppm，且最优选约1-10ppm(按重量计)。

氧化还原辅助因子

如上所述，在本发明中优选将氧化还原辅助因子与ADH一起使用。在本说明书中，术语“氧化还原辅助因子”定义为辅助酶促氧化还原反应的任何非蛋白质化合物。所述辅助因子可与酶紧密结合或松散结合，或不结合酶。

辅助因子可被分成两大类：辅酶和辅基。辅酶是在酶之间转运化学基团的有机非蛋白小分子。这些分子不与酶紧密结合，并作为催化循环的正常部分被释放。与此不同，辅基形成蛋白结构的固定部分。

在一个实施方式中，辅助因子是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)。在使用这些化合物作为辅助因子时，反应进行中通常将NAD⁺或NADP⁺分别还原成NADH或NADPH。在此说明书中，术语NAD⁺和NADP⁺包括氧化还原辅助因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)，无论其为氧化形式(带正电)还是还原形式(常描述为NADH和NADPH)。

当ADH是1.1.1亚类的ADH酶，特别是E.C.1.1.1.1或E.C.1.1.1.2的ADH酶，或者是1.2.1亚类的ADH酶时，特别优选NAD⁺或NADP⁺辅助因子。当ADH是克菲尔乳杆菌ADH(SEQ ID No.2)、酿酒酵母ADH(SEQ ID No.3)或布氏热厌氧菌ADH(SEQ ID No.4)时，特别优选NAD⁺或NADP⁺辅助因子。

酶辅助因子可以以任意浓度存在，以使酶能够实施所需氧化糖的功能。适合地，NAD⁺或NADP⁺辅助因子的存在浓度为约0.01ppm至约5000ppm(按重量计)。更优选地，NAD⁺或NADP⁺辅助因子的存在浓度为约0.10ppm至约1000ppm(按重量计)。

在另一个实施方式中，所述辅助因子是醌辅助因子。在本说明书中，术语“醌辅助因子”涵盖包含具有作为环取代基的两个羰基(＞C＝O)基团的六元(饱和或部分不饱和)环且能够发挥ADH辅助因子作用的任何化合物。优选1，4-醌和1，2-醌，例如以下通式的那些(其中波浪键代表与分子其余部分的连接，所述分子包括其中两个键与相连的碳原子一起形成环的分子)。当ADH是1.1.5亚类的ADH酶，特别是E.C.1.1.5.2的ADH酶时，特别是当ADH是生糖酮假葡糖杆菌ADH(SEQ ID No.1)或大肠杆菌ADH(SEQ ID No.5)时，特别优选醌辅助因子。

优选醌辅助因子选自结构如下文所示的吡咯喹啉醌(PQQ)、色氨酰色氨酸醌(TTQ)、羟基多巴醌(TPQ)和赖氨酸酪氨酰醌(LTQ)，或其可接受的盐、酯或其他衍生物。

本发明中使用的醌辅助因子的可接受的盐包括其酸加成盐和碱盐。适合的酸加成盐由形成无毒盐的酸形成。实例包括乙酸盐、己二酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐(besylate)、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、硼酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环己氨基磺酸盐、乙二磺酸盐(edisylate)、乙磺酸盐(esylate)、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐(gluceptate)、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、六氟磷酸盐、羟苯酰苯酸盐(hibenzate)、盐酸盐/氯化物、氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐(isethionate)、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐(mesylate)、甲基硫酸盐、萘二甲酸盐(naphthylate)、2-萘磺酸盐(2-napsylate)、烟酸盐(nicotinate)、硝酸盐、乳清酸盐(orotate)、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐(pamoate)、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、焦谷氨酸盐(pyroglutamate)、蔗糖盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三氟乙酸盐和羟萘甲酸盐(xinofoate salt)。适合的碱盐由形成无毒盐的碱形成。实例包括铝盐、精氨酸盐、苄星盐(benzathine)、钙盐、胆碱盐、二乙胺盐、二乙醇胺(diolamine)盐、甘氨酸盐、赖氨酸盐、镁盐、甲葡胺盐、乙醇胺(olamine)盐、钾盐、钠盐、氨基丁三醇(tromethamine)盐和锌盐。

本发明中使用的醌辅助因子的可接受的酯，特别是PQQ的可接受的酯，包括(C_1-6)烷基酯、卤代(C_1-6)烷基酯、羟基(C_1-6)烷基酯和(C_1-6)烷氧基(C_1-6)烷基酯，以及苯甲基酯。其他可接受的衍生物包括N-氧化物衍生物。

更优选醌辅助因子是吡咯喹啉醌(PQQ)或其可接受的盐、酯或其他衍生物。在本说明书中，与作为辅助因子的PQQ一起使用的醇脱氢酶被称作 “PQQ-ADH酶”。

当醌辅助因子是吡咯喹啉醌(PQQ)时，PQQ可通过合成制备，例如Buchi，G，J.H.Botkin，G C.M.Lee，and K.Yakushijin，J.Am.Chem.Soc.(1985)107，5555-5556中的描述。或者，PQQ也可以得自于天然来源，特别是食品，例如Kumazawa et al.，Biochem.J.(1995)307，331-333中的描述。包含PQQ的食品的实例包括蚕豆、毛豆、土豆、甘薯、欧芹、卷心菜、胡萝卜、芹菜、青椒、菠菜、番茄、苹果、香蕉、猕猴桃、橙、木瓜、绿茶、乌龙(茶)、可乐、威士忌、葡萄酒、清酒、面包、发酵大豆(纳豆)、味噌(豆酱)和豆腐。优选的PQQ来源是植物提取物。特别优选的PQQ来源是绿茶提取物，原因在于其价格低廉且来源广泛。

当醌辅助因子是PQQ时，PQQ的存在浓度优选为约0.01至约1000ppm，例如约0.1至约500ppm，约0.15至约250ppm或约0.2至约100ppm。更优选PQQ的存在浓度为约0.25至约10ppm。

当将醌作为辅助因子与ADH酶一起使用时，优选还将金属离子与ADH和醌组合使用。不希望被理论束缚，认为金属离子与醌和底物配位，从而有助于氢从底物到醌的传递。适合的金属离子的实例包括碱金属离子，例如锂、钠和钾离子，碱土金属离子，例如镁和钙离子，以及过渡金属离子，例如铁、锰、钴、铜、钼和锌离子，或其任意组合。优选二价或三价金属离子，且特别优选钙离子或铁离子(Fe²⁺/Fe³⁺)，或其任意组合。

根据Toyama et al，Arch.Biochem.Biophys.(2004)428，10-21，具有作为辅助因子基团的吡咯喹啉醌(PQQ)的醌(血红素)蛋白醇脱氢酶(ADH)被分成3类：I型、II型和III型。I型ADH是以PQQ作为唯一辅助因子基团的简单醌蛋白，而II型和III型ADH是在催化多肽中具有血红素c和PQQ的醌血红素蛋白。II型ADH是广泛分布于变形菌门(Proteobacteria)，例如假单胞菌属(Pseudomonas)、雷尔氏菌(Ralstonia)、丛毛单胞菌(Comamonas)等中的可溶性外周胞质酶。与此不同，III型ADH是仅在乙酸菌的外周胞质表面上发挥作用的膜结合酶。其由三个亚基组成，包括醌血红素蛋白催化亚基、三血红素细胞色素c亚基和功能未知的第三亚基。本发明包括使用上文定义的所有三种类型ADH的组合物和方法；优选I型ADH。

组合

根据本发明，可将ADH酶与一种或多种其他活性剂组合使用。在与本发明的氧化方法一起使用时，此类组合可提供包括协同作用在内的很多优点。

具体地，根据本发明，可将ADH酶与作为活性剂的一种或多种其他酶组合使用。在与本发明的氧化方法一起使用时，此类组合可提供包括协同作用在内的很多优点。

在一个实施方式中，所述其他酶是另外的ADH酶，使得两种(或更多)不同的ADH酶组合使用。

在另一个实施方式中，可将ADH与另一种活性剂组合使用，其中所述活性剂能够将单糖或高级糖的单糖部分中的醛基基团转化成羧酸基团。此类组合提供的优点在于氧化的糖/多糖将更适合用于食品应用的摄取。能够进行上述羧酸转化的此类其他活性剂的实例包括醛脱氢酶或氧化酶(可见于EC1.2.)。

因此，在优选的方面，本发明的方法包括使糖接触醇脱氢酶(ADH)，其中所述醇脱氢酶选自醌氧化还原辅助因子依赖性ADH和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)氧化还原辅助因子依赖性ADH，以及醛脱氢酶或氧化酶。

应用

本发明的方法具有广泛的应用。具体地，本发明的方法可用于食品和造纸业。

一方面，本发明的方法可用于制备用于造纸业的修饰多糖。常与造纸业相关的多糖的实例包括阳离子、阴离子、氧化和磷酸化的淀粉；羧甲基纤维素(CMC)、瓜耳胶、海藻酸盐、瓜耳胶、阳离子瓜耳胶和阴离子瓜耳胶。关于适合多糖的更详细描述可见US2003/150573。

因此，一方面，本发明包括纸制品，其包含通过如上文广义方面或优选方面定义的本发明方法制备的氧化糖(具体地，如上文定义和列举的氧化多糖)，本发明还包括生产包含此类氧化糖(特别是氧化多糖)的纸制品的方法。

典型的造纸方法可包括以下步骤：

(a)化学或机械制浆以生产有助于纤维素释放的木浆

(b)精炼以加工并软化纤维

(c)在网筛上脱水并形成纸张

(d)压制

(e)干燥

(f)压光以平滑表面

(g)涂布

可根据本领域技术人员的知识范围对上述步骤进行调整。

对于食品业应用，面粉中可包含至少部分的糖。可将面粉与常规成分混合以制备面团。此类成分的实例包括酵母、水、蛋、乳、盐、糖、脂肪和油。随后，可烘焙面团以制备烘焙制品。

对于食品业中的可选应用，可在糖制品，例如蔗糖、转化糖、葡萄糖、果糖或麦芽糖中包含至少部分的糖。

实施例

实施例中使用的PQQ-ADH酶是SEQ ID NO.1a，其为“制剂1”中制备的酶。

制剂1：生糖酮假葡糖杆菌ADH

将包含其本身信号序列在内的生糖酮假葡糖杆菌PQQ依赖性醇脱氢酶基因(PQQ-ADH)的编码基因作为密码子优化片段合成，并通过

BP重组反应(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)克隆到pDONR/Zeo中，从而获得入门载体pENTRY-ADH(图4)。SEQ ID No.6显示了密码子优化的PQQ-ADH基因(来自Geneart AG(Regensburg，Germany))的DNA片段。其中斜体部分显示了PQQ-ADH ORF的侧翼序列。这些侧翼序列包含促进基因通过

BP依赖性克隆进入pDONR/Zeo的attB位点。

为了能够在毕赤巴斯德酵母中表达PQQ-ADH，通过

LR重组反应将基因从pENTRY-ADH克隆至pPIC2-DEST(图5)。通过SalI酶切将所得质粒pPIC2-ADH(图6)线性化，使所得构建体能够在转化时整合到毕赤巴斯德酵母GS115的HIS4基因座中。此载体包含毕赤巴斯德酵母的强AOX1启动子，允许强甲醇诱导型基因的表达。为了生产PQQ-ADH，根据标准毕赤巴斯德酵母发酵操作程序(Invitrogen，Carlsbad，CA USA)，在2L的B.Braun Biostat B发酵器中培养毕赤巴斯德酵母：：pPIC2-ADH。发酵期间，在培养上清液中发现了所表达PQQ-ADH的大片段，其在甲醇诱导开始后72小时达到100-400mg/l的水平。发现成熟蛋白的N-末端起始于编码区的第37位，因此以AEPSKAGQSA开始。

通过Edman降解和

cLC毛细管491蛋白测序系统(Applied Biosystems)分析来测定毕赤巴斯德酵母表达的PsADH的N-末端。

图5是源自pPIC3.5K(Invitrogen)的毕赤巴斯德酵母目的载体pPIC2-DEST的质粒图。此载体包含甲醇诱导型AOX1启动子(PAOX1)和AOX转录终止子(AOX-TT)。

盒插入在pPIC3.5K的启动子和终止子之间，并由重组位点attR1和2、氯霉素抗性标记(cmR)，以及用于

克隆法中负筛选的ccdB基因组成。此外，此载体还包含用于在毕赤巴斯德酵母中进行筛选的HIS4基因，以及用于在大肠杆菌(Kan)中进行筛选的卡那霉素(Kan)和氨苄青霉素(Amp)抗性基因。

实施例1-PQQ-ADH基因的表达

订购具有广泛宿主密码子使用(broad hostcodon usage)的合成PQQ-ADH基因，并将其克隆到Gateway相容性表达载体中。在发酵重组毕赤巴斯德酵母菌株后获得可接受的表达水平(0.4g/l)。细胞外培养液的SDS凝胶分析显示了大小正确的显著条带(图1)。

图1是通过发酵含有PQQ-ADH基因的重组毕赤巴斯德酵母株获得的细胞外培养液的SDS-PAGE。分子量标记如下所示：

第1道：发酵液，约3μg蛋白；

第2道：发酵液，约2μg蛋白；

第3道：发酵液，约6μg蛋白；

Nu-PAGE，4-12％，Mes，+DTT

估计表达水平为0.4g/l。

实施例2-麦芽四糖和麦芽七糖的氧化

以麦芽四糖(G4)和麦芽七糖(G7)作为PQQ-ADH酶的潜在氧化底物进行测试。

各反应以由以下组成的250μl总体积进行：

12mM G4或7mM G7(Sigma)

80mM Na-磷酸盐缓冲液pH 7.0

4mM CaCl₂(Sigma)

360μM PQQ(Fluka)

3.9mM吩嗪硫酸甲酯(Sigma)

0.1mM 2，6-二氯酚靛酚(Sigma)

通过添加20μl PQQ-ADH酶混合物启动反应，并在25℃温育12小时。将负对照样品与20μl水一起温育。通过煮沸2分钟终止反应。

通过FTMS分析反应产物，下表1中列出的产物是在PQQ-ADH处理样品中鉴定的。

表1：通过FTMS鉴定的G4和G7反应产物

麦芽四糖-6-醛的相对丰度表明，在使用麦芽四糖作为底物时，转化率约为5％。在使用麦芽七糖作为底物时，观察到形成麦芽七糖-6-醛的转化率较低(1-2％)。

由此实施例能够得出，PQQ-ADH能够在C-1和C-6位氧化寡糖。还原端的C-1-OH被氧化成羧酸，而C-6-OH的修饰产生了作为主要产物的醛，还有形成羧酸的少量氧化。

实施例3-通过PQQ-ADH氧化淀粉

使用糊化小麦淀粉作为PQQ-ADH底物进行测试，还研究了Fe²⁺/Fe³⁺添加的影响。

在570μl的总体积中，各反应包含：

8mg糊化小麦淀粉(Sigma)

90mM Na-磷酸盐缓冲液pH 7.0

320μM PQQ

规定浓度的Fe²⁺或Fe³⁺

20μg PQQ-ADH

将样品在40℃温育24小时，并通过煮沸2分钟终止反应。通过添加125μl 1M乙酸钠，将样品的pH调至pH 4.5。通过添加α-淀粉酶/葡糖淀粉酶的混合物，并在70℃温育3小时将淀粉聚合物降解成单体，并通过煮沸10分钟终止反应。使用5M NaOH将pH调至pH 7.0。

添加40μl 0.5M乙基羟胺以将带有醛基基团的分子衍生化。图2和图3显示了C-1和C-1/C-6葡萄糖衍生醛的乙基羟胺修饰。通过FTMS分析样品。

葡萄糖1，6-双(乙基肟)代表了淀粉聚合物中被PQQ-ADH氧化成6-醛的葡萄糖基单元。葡萄糖1，6-双(乙基肟)和葡萄糖1-乙基肟的比例是测量PQQ-ADH催化转化淀粉聚合物中形成C-6葡萄糖基醛比例的良好方法。

表2：淀粉的氧化

样品	Fe²⁺(mM)	Fe³⁺(mM)	转化比例％
				1	0	0	2.3
2	0	0	2.2
				3	0.02	0	5.3
4	0.2	0	5.2
				5	0	0.1	6.6
6	0	1.0	3.4

由此实施例能够得出，PQQ-ADH能够在葡萄糖基单元的C-6位氧化淀粉。基于测定所形成的C-6醛，获得了～2％的转化率，但通过添加Fe²⁺或Fe³⁺，可将此转化率提高至～5-6％。

实施例4-多种碳水化合物和多糖的氧化

以多种碳水化合物和多糖作为PQQ-ADH酶的潜在氧化底物进行测试。各反应以由以下组成的250μl总体积进行：

2％底物

80mM Na-磷酸盐缓冲液pH 7.0

4mM CaCl₂

360μM PQQ

3.9mM吩嗪硫酸甲酯

0.1mM 2，6-二氯酚靛酚(DCIP)

通过添加20μl PQQ-ADH酶混合物启动反应，并在25℃温育。在此试验中，由DCIP充当电子受体，并通过600nm下DCIP至DCIPH₂的还原反应监测底物的氧化。

观察了对以下底物的氧化活性：

葡萄糖

麦芽糖

麦芽三糖

麦芽四糖

麦芽五糖

麦芽六糖

麦芽七糖

直链淀粉

支链淀粉

糖原

丁醇

木糖

海藻糖

脱水果糖

潘糖(panose)

纤维二糖

纤维五糖

蜜二糖

阿拉伯糖

L-山梨糖

水苏糖

蔗糖

α-环糊精

β-环糊精

γ-环糊精

聚葡萄糖

果胶

普鲁兰多糖

角叉菜胶

刺槐豆胶

瓜耳胶

海藻酸盐

羧甲基纤维素

α-甲基葡萄糖

由此实施例能够得出，PQQ-ADH显示了对于宽范围的底物的氧化活性。

实施例5-瓜耳胶的氧化

使用PQQ-ADH处理粘度谱不同的4种不同瓜耳胶。所测试的瓜耳胶是丹尼斯科公司(Danisco)的产品，其分别为Meyprodor 5、Meyprodor 50、Meyprodor 400和Grindsted Guar 5000。

在700ml的总体积中，各反应包含：

5％Meyprodor 5、1％Meyprodor 50、0.5％Meyprodor 400或0.5％Grindsted Guar 5000(均来自丹尼斯科公司)。

200μM PQQ(Sigma)

0.1μM FeCl₃(Sigma)

使用1M HCl将pH调至pH 7.0。

通过添加4mg PQQ-ADH酶混合物启动反应，并在25℃温育18小时。

通过Mütek粒子电荷检测仪研究瓜耳胶产品中负电荷的量，其中使用阳离子试剂滴定瓜耳胶(表3)。

表3：PQQ-ADH处理瓜耳胶的Mütek分析

底物	对照(ml)	经PQQ-ADH处理(ml)
			Grindsted Guar 5000	0.24	0.50
Meyprodor 400	0.35	0.71
			Meyprodor 50	0.80	0.96
Meyprodor 5	3.28	3.52

由此实施例能够得出，PQQ-ADH能够氧化瓜耳胶并将负电荷引入多糖。

实施例6-α-环糊精和β-环糊精的氧化

以α-环糊精(α-CD)和β-环糊精(β-CD)作为PQQ-ADH酶的底物进行测试。各反应以由以下组成的250μl总体积进行：

15mM α-CD或β-CD(Sigma)

50mM Na-磷酸盐缓冲液pH 7.0

320μM PQQ

通过添加20μl PQQ-ADH酶混合物启动反应，并在40℃温育18小时。将负对照样品与20μl水一起温育。通过煮沸2分钟终止反应。

通过FTMS分析反应产物，表4中列出的产物是在PQQ-ADH处理样品中鉴定出的。

表4：FTMS鉴定的α-CD和β-CD反应产物

由此实施例能够得出，PQQ-ADH能够在C-6位氧化α-环糊精和β-环糊精。C-6-OH的修饰产生了作为主要产物的醛，并且观察到形成羧酸的少量氧化。

以上说明书中提到的所有公开，以及所述公开中引用的文献均通过引用并入本文。本发明描述的方法和系统的各种改变和变体对本领域技术人员而言都是显而易见的，不脱离本发明的范围和精神。尽管已结合具体优选实施方式描述本发明，但应理解，本发明的保护范围绝不应仅限于这些具体实施方式。实际上，对分子生物学或相关领域技术人员而言显而易见的实施本发明所述方式的各种改进都落入以下权利要求书的范围之内。

序列表

SEQ ID No.1

生糖酮假葡糖杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)醇脱氢酶(PsADH)

EC号1.1.5.2

(Acc BAB62258)

1 mrfeylrqnv vglalstali aslsgpafaq hdanaaaeps kagqsaienf qpvtaddlag

61 knpanwpilr gnyqgwgysp ldqinkdnvg dlqlvwsrtm epgsnegaai ayngviflgn

121 tndviqaidg ktgsliweyr rklpsaskfi nslgaakrsi alfgdkvyfv swdnfvvald

181 aktgklawet nrgqgveegv anssgpivvd gvviagstcq fsgfgcyvtg tdaesgeelw

241 rntfiprpge egddtwggap yenrwmtgaw gqitydpeld lvyygstgag pasevqrgte

301 ggtlagtntr favkpktgev vwkhqtlprd nwdsectfem mvvstsvnpd akadgmmsvg

361 anvprgetrk vltgvpcktg vawqfdaktg dyfwskatve qnsiasiddt glvtvnedmi

421 lkepgktyny cptflggrdw psagylpksn lyviplsnac ydvmarttea tpadvyntda

481 tlvlapgktn mgrvdaidla tgetkwsyet raalydpvlt tggdlvfvgg idrdfralda

541 esgkevwstr lpgavsgytt sysidgrqyv avvsggslgg ptfgpttpdv dsasgangiy

601 vfalpekk

SEQ ID No.1A(又称为SEQ ID No.7)

生糖酮假葡糖杆菌醇脱氢酶(PsADH)

EC号1.1.5.2

(Acc BAB62258)

aeps kagqsaienf qpvtaddlag

knpanwpilr gnyqgwgysp ldqinkdnvg dlqlvwsrtm epgsnegaai ayngviflgn

tndviqaidg ktgsliweyr rklpsaskfi nslgaakrsi alfgdkvyfv swdnfvvald

aktgklawet nrgqgveegv anssgpivvd gvviagstcq fsgfgcyvtg tdaesgeelw

rntfiprpge egddtwggap yenrwmtgaw gqitydpeld lvyygstgag pasevqrgte

ggtlagtntr favkpktgev vwkhqtlprd nwdsectfem mvvstsvnpd akadgmmsvg

anvprgetrk vltgvpcktg vawqfdaktg dyfwskatve qnsiasiddt glvtvnedmi

lkepgktyny cptflggrdw psagylpksn lyviplsnac ydvmarttea tpadvyntda

tlvlapgktn mgrvdaidla tgetkwsyet raalydpvlt tggdlvfvgg idrdfralda

esgkevwstr lpgavsgytt sysidgrqyv avvsggslgg ptfgpttpdv dsasgangiy

vfalpekk

SEQ ID No.2

克菲尔乳杆菌ADH(LkADH)(05643Sigma)

EC号1.1.1.2

(Acc AAP94029)

1 mtdrlkgkva ivtggtlgig laiadkfvee gakvvitgrh advgekaaks iggtdvirfv

61 qhdasdeagw tklfdtteea fgpvttvvnn agiavsksve dttteewrkl lsvnldgvff

121 gtrlgiqrmk nkglgasiin mssiegfvgd ptlgaynask gavrimsksa aldcalkdyd

181 vrvntvhpgy iktplvddle gaeemmsqrt ktpmghigep ndiawicvyl asdeskfatg

241 aefvvdggyt aq

SEQ ID No.2a(又称为SEQ ID No.8)

dkfvee gakvvitgrh advgekaaks iggtdvirfv

qhdasdeagw tklfdtteea fgpvttvvnn agiavsksve dttteewrkl lsvnldgvff

gtrlgiqrmk nkglgasiin mssiegfvgd ptlgaynask gavrimsksa aldcalkdyd

vrvntvhpgy iktplvddle gaeemmsqrt ktpmghigep ndiawicvyl asdeskfatg

aefvvdggyt aq

SEQ ID No.3

酿酒酵母ADH(ScADH)(A 3263Sigma)

EC号1.1.1.1

(Acc CAA91578)

1 msaatvgkpi kciaavayda kkplsveeit vdapkahevr ikieytavch tdaytlsgsd

61 peglfpcvlg hegagivesv gddvitvkpg dhvialytae cgkckfctsg ktnlcgavra

121 tqgkgvmpdg ttrfhnakge diyhfmgcst fseytvvadv svvaidpkap ldaacllgcg

181 vttgfgaalk tanvqkgdtv avfgcgtvgl sviqgaklrg askiiaidin nkkkqycsqf

241 gatdfvnpke dlakdqtive kliemtdggl dftfdctgnt kimrdaleac hkgwgqsiii

301 gvaaageeis trpfqlvtgr vwkgsafggi kgrsemggli kdyqkgalkv eefithrrpf

361 keinqafedl hngdclrtvl ksdeik

SEQ ID No.4

布氏热厌氧菌ADH(TbADH)(A8435Sigma)

EC号1.1.1.2

(Acc CAA46053)

1 mkgfamlsig kvgwiekekp apgpfdaivr plavapctsd ihtvfegaig erhnmilghe

61 avgevvevgs evkdfkpgdr vvvpaitpdw rtsevqrgyh qhsggmlagw kfsnvkdgvf

121 geffhvndad mnlahlpkei pleaavmipd mmttgfhgae ladielgatv avlgigpvgl

181 mavagaklrg agriiavgsr pvcvdaakyy gatdivnykd gpiesqimnl tegkgvdaai

241 iaggnadima tavkivkpgg tianvnyfge gevlpvprle wgcgmahkti kgglcpggrl

301 rmerlidlvf ykrvdpsklv thvfrgfdni ekafmlmkdk pkdlikpvvi la

SEQ ID No.5

大肠杆菌ADH(EcADH)(Acc NP_415358)

EC号1.1.5.2

1 mhrqsfflvp liclssalwa apatvnvevl qdkldhpwal aflpdnhgml itlrggelrh

61 wqagkglsap lsgvpdvwah gqgglldvvl apdfaqsrri wlsysevgdd gkagtavgyg

121 rlsddlskvt dfrtvfrqmp klstgnhfgg rlvfdgkgyl fialgennqr ptaqdldklq

181 gklvrltdqg eipddnpfik esgaraeiws ygirnpqgma mnpwsnalwl nehgprggde

241 inipqkgkny gwplatwgin ysgfkipeak geivagteqp vfywkdspav sgmafynsdk

301 fpqwqqklfi galkdkdviv msvngdkvte dgriltdrgq rirdvrtgpd gylyvltdes

361 sgellkvspr n

SEQ ID No.5a(又称为SEQ ID No.9)

apatvnvevl qdkldhpwal aflpdnhgml itlrggelrh

wqagkglsap lsgvpdvwah gqgglldvvl apdfaqsrri wlsysevgdd gkagtavgyg

rlsddlskvt dfrtvfrqmp klstgnhfgg rlvfdgkgyl fialgennqr ptaqdldklq

gklvrltdqg eipddnpfik esgaraeiws ygirnpqgma mnpwsnalwl nehgprggde

inipqkgkny gwplatwgin ysgfkipeak geivagteqp vfywkdspav sgmafynsdk

fpqwqqklfi galkdkdviv msvngdkvte dgriltdrgq rirdvrtgpd gylyvltdes

sgellkvspr n

SEQ ID No.6

密码子优化PQQ-ADH基因的DNA序列

ggtaccacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatgagattcgagtacctgcgccagaacgttgtcggtttggctctttctaccgccctgatcgcatccctcagcggccctgcttttgcccaacacgacgctaatgctgccgccgaaccatcaaaggcaggacagtcggcaattgagaacttccaaccggtgactgctgacgatttggccggtaaaaaccctgcaaattggcccatccttcgtggcaactaccagggatgggggtatagtccactggaccagattaacaaggataatgtcggtgatttgcagctcgtttggtctcggacaatggaaccgggaagcaatgagggcgctgctatcgcctataacggtgtgatttttctgggcaacacgaatgacgttatccaagccattgatggaaaaaccggttcccttatctgggaatacagacgaaagctcccctcagcatctaaattcattaactcgttgggggctgctaagaggtccatcgccctgtttggcgacaaggtctacttcgtgagttgggataattttgttgtcgcccttgacgcaaagactggaaaactggcttgggagacaaacagaggtcaaggtgttgaggaaggcgtggccaactctagcggacctattgttgtcgatggcgtcgtgatcgcagggtccacctgccagttctcaggttttggctgttatgtgactggaacggacgctgagtcgggtgaagaattgtggcgcaataccttcattccacgtccgggagaggaaggtgacgatacatggggcggagcaccttacgagaaccggtggatgacgggtgcctggggccaaatcacctatgacccagaacttgatctcgtttactatggttctactggggctggacctgcctccgaggtccagagaggtacagaaggcggcaccctggctggaactaatacacgctttgccgtgaagcccaaaacgggagaggttgtctggaaacatcaaaccttgccgagagacaactgggatagcgagtgcactttcgaaatgatggttgtctcaaccagtgtgaatccagacgctaaggcagatggtatgatgtctgttggggccaacgtgcctaggggcgagacacgtaaggttctcacgggtgtcccgtgtaaaactggcgtggcttggcagtttgatgcaaagacgggagactacttctggtcgaaagccaccgtcgaacaaaactccatcgctagcattgacgataccggtctggttacagtcaatgaggacatgattttgaaagaacccggcaagacttacaactattgcccaacattccttggagggcgagattggccttctgccggttacctgccgaagtcaaatttgtatgtgatcccactctccaacgcatgttacgatgttatggctagaaccactgaggccacgcccgctgacgtctataacaccgatgccacactggtgcttgcacctggcaagacgaatatgggacgcgttgacgctatcgatctcgccaccggtgaaacaaaatggtcgtacgagacaagagctgcactgtatgacccggtcttgaccactggcggagatcttgtttttgtgggtggaattgaccgtgacttccgggctctggatgccgagagcgggaaagaagtctggtctacaaggttgccaggtgcagtgtccggctacaccacgtcatacagtattgatggcagacagtatgttgccgtcgtttctggtggtagcctcggcggacctacctttggaccgactacacccgacgtggattccgcttcgggagcaaacgggatctacgtctttgccctgcctgaaaagaagtaataaacccagctttcttgtacaaagtggtgagctc

Claims

1.通过使糖接触醇脱氢酶(ADH)来氧化所述糖的方法，其中所述醇脱氢酶选自醌氧化还原辅助因子依赖性ADH、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)氧化还原辅助因子依赖性ADH、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)氧化还原辅助因子依赖性ADH及其任意组合。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述醇脱氢酶为纯化的形式。

3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中氧化还原辅助因子与所述醇脱氢酶一起使用。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述醇脱氢酶选自酶分类EC 1.1.5的醇脱氢酶。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述醇脱氢酶选自酶分类EC 1.1.5.2的醇脱氢酶。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述醇脱氢酶选自生糖酮假葡糖杆菌(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)ADH(SEQ ID No.1)、生糖酮假葡糖杆菌ADH(SEQ ID No.1A)、大肠杆菌(Escherichia coli)ADH(SEQ ID No.5)和大肠杆菌ASD(SEQ ID No.5a)，或与它们任何一个具有至少70％序列同一性的醇脱氢酶。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述醇脱氢酶选自生糖酮假葡糖杆菌ADH(SEQ ID No.1)、生糖酮假葡糖杆菌ADH(SEQ ID No.1A)、大肠杆菌ADH(SEQ ID No.5)和大肠杆菌ADH(SEQ ID No.5a)，或与它们任何一个具有至少75％(例如至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％)序列同一性的醇脱氢酶。

8.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述醇脱氢酶选自酶分类EC 1.1.1的醇脱氢酶。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述醇脱氢酶选自酶分类EC 1.1.1.1和EC 1.1.1.2的醇脱氢酶。

10.如权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述醇脱氢酶选自克菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)ADH(SEQ ID No.2)、克菲尔乳杆菌ADH(SEQ ID No.2a)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ADH(SEQ ID No.3)或布氏热厌氧菌(Thermoanaerobium brockii)ADH(SEQ ID No.4)，或与它们任一种具有至少70％序列同一性的醇脱氢酶；优选其中所述醇脱氢酶选自克菲尔乳杆菌ADH(SEQ ID No.2)、克菲尔乳杆菌ADH(SEQ ID No.2a)、酿酒酵母ADH(SEQ ID No.3)或布氏热厌氧菌ADH(SEQ ID No.4)，或与它们任一种具有至少75％(例如至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％)序列同一性的醇脱氢酶。

11.如权利要求3-7中任一项所述的方法，其中所述氧化还原辅助因子是醌辅助因子。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述醌辅助因子选自吡咯喹啉醌(PQQ)、色氨酰色氨酸醌(TTQ)、羟基多巴醌(TPQ)和赖氨酸酪氨酰醌(LTQ)。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述氧化还原辅助因子是吡咯喹啉醌(PQQ)。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述PQQ来自绿茶提取物。

15.如权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述PQQ的存在浓度按重量计为约0.01ppm至约1000ppm。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述PQQ的存在浓度按重量计为约0.2ppm至约100ppm。

17.如权利要求11-16中任一项所述的方法，其中金属离子与所述醌辅助因子一起使用。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述金属离子是Fe²⁺或Fe³⁺离子，或其组合。

19.如权利要求3、8、9或10中任一项所述的方法，其中所述氧化还原辅助因子选自NAD⁺和NADP⁺。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述NAD⁺或NADP⁺的存在浓度按重量计为约0.01ppm至约5000ppm。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述NAD⁺或NADP⁺的存在浓度按重量计为约0.10ppm至约1000ppm。

22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述醇脱氢酶的使用浓度按重量计为至少约0.05ppm。

23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，包括将所述糖中至少2％的伯醇基团氧化成醛基基团。

24.如权利要求23所述的方法，包括将所述糖中至少6％的伯醇基团氧化成醛基基团。

25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述糖是包含己糖部分的多糖。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述多糖的己糖部分是葡萄糖部分。

27.如权利要求25或权利要求26所述的方法，包括选择性氧化所述多糖的己糖部分C-6位的醇基。

28.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述糖是包含戊糖部分的多糖。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述多糖的戊糖部分是阿拉伯糖部分或木糖部分。

30.如权利要求28或权利要求29所述的方法，包括选择性氧化所述多糖的戊糖部分C-5位的醇基。

31.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述糖是二糖。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述二糖选自乳糖、麦芽糖、纤维二糖、蔗糖、海藻糖、异麦芽酮糖和海藻酮糖。

33.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述糖是寡糖。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述寡糖是链状寡糖。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述多糖选自麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖、纤维六糖、纤维七糖、果寡糖、甘露寡糖；以及异麦芽寡糖、半乳寡糖和木寡糖。

36.如权利要求33所述的方法，其中所述寡糖是环状寡糖。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述环状寡糖是选自α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精的环糊精。

38.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述糖是包含至少40个单糖单元的多糖。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述多糖包含至少1000个单糖单元。

40.如权利要求38或权利要求39所述的方法，其中所述多糖选自淀粉、直链淀粉、支链淀粉、糖原、阿拉伯糖基木聚糖、β-葡聚糖、纤维素或其衍生物、海藻酸或其盐或衍生物、聚葡萄糖、果胶、普鲁兰多糖、角叉菜胶、刺槐豆胶和瓜耳胶。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述多糖是淀粉。

42.一种氧化糖，其可通过权利要求1-41中任一项所述方法获得。

43.一种产品，其包含可通过权利要求1-41中任一项所述方法获得的氧化糖。

44.如权利要求43所述的产品，其选自食品和纸制品。

45.如权利要求44所述的产品，其为食品，所述食品选自面团和由面团制备的烘焙产品。

46.氧化糖在制造食品或纸制品中的应用，所述氧化糖可通过权利要求1-41中任一项所述的方法获得。

47.权利要求1-10之任一项中所定义的醇脱氢酶在制造纸制品中的应用。

48.醇脱氢酶在用于氧化糖和/或用于制备食品或纸制品中的应用，其中所述醇脱氢酶选自醌氧化还原辅助因子依赖性ADH、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)氧化还原辅助因子依赖性ADH、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)氧化还原辅助因子依赖性ADH及其任意组合。

49.一种氨基酸序列，其包含SEQ ID No.1A，或为与SEQ ID No.1A具有至少75％氨基酸序列同一性但不是SEQ ID No.1的氨基酸序列。

50.如权利要求49所述的氨基酸序列，其包含SEQ ID No.1A，或为与SEQ ID No.1A具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

51.一种核苷酸序列，其编码权利要求49或权利要求50所述的氨基酸序列。

52.一种载体，其包含权利要求51所述的核苷酸序列。

53.一种宿主，其由权利要求51所述的核苷酸序列或权利要求52所述的载体转化。

54.如权利要求53所述的宿主，其中所述宿主选自细菌宿主、真菌宿主或酵母宿主。

55.一种方法，包括表达权利要求51所述的核苷酸序列或权利要求52所述的载体。

56.一种氨基酸序列，其包含SEQ ID No.2A，或为与SEQ ID No.2A具有至少75％氨基酸序列同一性但不是SEQ ID No.2的氨基酸序列。

57.如权利要求56所述的氨基酸序列，其包含SEQ ID No.2A，或为与SEQ ID No.2A具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

58.一种核苷酸序列，其编码权利要求56或权利要求57所述的氨基酸序列。

59.一种载体，其包含权利要求58所述的核苷酸序列。

60.一种宿主，其由权利要求58所述的核苷酸序列或权利要求59所述的载体转化。

61.如权利要求60所述的宿主，其中所述宿主选自细菌宿主、真菌宿主或酵母宿主。

62.一种方法，包括表达权利要求58所述的核苷酸序列或权利要求59所述的载体。

63.一种氨基酸序列，其包含SEQ ID No.5A，或为与SEQ ID No.5A具有至少75％氨基酸序列同一性但不是SEQ ID No.5的氨基酸序列。

64.如权利要求63所述的氨基酸序列，其包含SEQ ID No.2A，或为与SEQ ID No.2A具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

65.一种核苷酸序列，其编码权利要求63或权利要求64所述的氨基酸序列。

66.一种载体，其包含权利要求65所述的核苷酸序列。

67.一种宿主，其由权利要求65所述的核苷酸序列或权利要求66所述的载体转化。

68.如权利要求67所述的宿主，其中所述宿主选自细菌宿主、真菌宿主或酵母宿主。

69.一种方法，包括表达权利要求65所述的核苷酸序列或权利要求66所述的载体。

70.如权利要求1或其任一项从属权利要求所述的方法，或如权利要求48所述的应用，其中所述糖选自以下组成的组：葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、直链淀粉、支链淀粉、糖原、丁醇、木糖、海藻糖、脱水果糖、潘糖、纤维二糖、纤维五糖、蜜二糖、阿拉伯糖、L-山梨糖、水苏糖、蔗糖、α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、聚葡萄糖、果胶、普鲁兰多糖、角叉菜胶、刺槐豆胶、瓜耳胶、海藻酸盐、羧甲基纤维素、α-甲基葡萄糖及其组合。

71.基本如本文并参考附图所述的方法或糖或产品或应用。

72.基本如本文并参考附图所述的氨基酸序列或核苷酸序列或载体或宿主或方法。