CN102245198B

CN102245198B - IgE CH3肽疫苗

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Publication number: CN102245198B
Application number: CN200980149635.5A
Authority: CN
Inventors: A·D·布朗; B·R·钱皮恩; C·克里斯蒂; D·P·热尔韦; L·H·琼斯; A·M·K·谢尔斯特伦; D·C·普赖德; L·R·罗伯茨; D·M·怀亚特
Original assignee: Pfizer Vaccines LLC
Current assignee: Pfizer Vaccines LLC
Priority date: 2008-12-09
Filing date: 2009-12-04
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2029-12-04
Also published as: EP2865389A1; MX2011006077A; US20100158933A1; PE20110891A1; KR101644221B1; KR20130032390A; ES2622562T3; HK1163511A1; US8298547B2; JP5209800B2; US8475801B2; JP2014012009A; CA2744754A1; AU2009325950B2; MX337723B; US20140017239A1; KR20150056881A; JP2016164156A; US20120294848A1; RU2011121043A

Abstract

本发明涉及提供新颖免疫原，其包含优选连接于免疫原性载体的抗原性IgE肽，用于预防、治疗或减轻IgE介导的病症。本发明进一步关于产生这些药物、其免疫原性组合物及药物组合物的方法，及其于医学中的用途。

Description

IgE CH3肽疫苗

发明领域

本发明涉及提供新颖免疫原，其包含用于预防、治疗或减轻IgE介导的病症的优选连接于免疫原性载体的抗原性IgE肽。本发明进一步涉及制造这些药物、免疫原性组合物及药物组合物的方法及其于医学中的用途。

背景技术

在过去几十年间，过敏性疾病已增加至几乎流行的程度且估计显示许多西方国家的总人口的20-30％受到影响。IgE在引发过敏性反应中的关键作用得到充分文献证明。IgE自B淋巴细胞释放后结合于肥大细胞及嗜碱性粒细胞上存在的高亲和力IgE受体(FceRI)。随后特异性过敏原与这些细胞上的相邻IgE分子交联，接着导致其活化，使得释放多种促炎介质(例如组胺、白三烯、前列腺素)以及关键细胞因子及趋化因子。因此，在急性局部反应之后募集及活化其它炎症细胞(例如嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞)，从而扩大过敏性级联反应。树突状细胞，例如存在于过敏性发炎部位(例如肺)的那些细胞亦可表达FceR1，且可使用此受体来选择性及有效地占据与IgE形成的免疫复合物中存在的过敏原并选择性地加工这些过敏原以呈递至过敏原特异性T细胞，由此提供持续性T细胞活化及病理性炎症应答的机制。

大部分当前治疗方案的目的在于缓解症状而非治疗病因且主要基于使用抗组胺、抗白三烯、色甘酸盐、β-激动剂及基于普通消炎化合物(诸如皮质类固醇)。尽管一些受影响患者用这些药物使其疾病处于相对良好控制下，但其施用频率(通常每日一次或甚至每日若干次)通常导致不良患者顺应性及随后疾病恶化。另外，在诸如重度哮喘及重度异位性皮肤炎的一些情况下，现有治疗不足以控制疾病。

最近，单克隆抗体(奥马珠单抗(omalizumab)，亦称为E25，以商品名称Xolair销售；Presta等人J Immunol.1993 Sep 1；151(5)：2623-32。)获得全世界若干机构批准，其主要用于治疗重度哮喘及鼻炎。尽管显示针对重度哮喘的功效，但此抗体仍具有一些缺点。第一，此为人化鼠单克隆抗体，因此并不完全排除人类患者的免疫反应，由此可能产生一些安全性问题。第二，用于治疗重度哮喘的奥马珠单抗的剂量基于体重与循环游离IgE的含量。不推荐体重及循环游离IgE偏离特定范围的患者使用此治疗。那些可治疗的患者可能需要接受多达三次皮下注射，每两周一次。此严重影响了治疗成本(估计每位患者的治疗成本在每年US$ 15,000-44,000范围内)以及患者的生活质量，使得难以用作治疗过敏的普通策略。

为克服高成本及频繁施用的问题，替代方法为藉由疫苗接种来触发我们自身免疫系统产生治疗抗体。

在其研究期间，过敏领域的先前工作者已遇到许多在设计新抗过敏治疗时必须考虑的考虑因素及问题。最危险问题之一围绕IgE交联参与组胺释放信号。最通常情况为，在主动疫苗接种期间，抗IgE抗体的产生能够藉由在过敏原不存在下使相邻IgE-受体复合物交联而触发自身组胺释放。此现象被称为过敏原性(anaphylactogenicity)。实际上，许多通常用于IgE检测的市售抗IgE单克隆抗体具有过敏原性，并因此无效，若向患者施用，则可能会有危险。因此，为了安全且有效，被动施用或疫苗诱导的抗体必须结合在IgE中能够抑制IgE活性而自身不具过敏性的区域内。

人类IgE的与IgE高亲和力受体FceRIα亚单位相互作用的恒定域(constantdomain)CH3-CH4的结构已解出(Wurzburg BA等人(2000)Immunity 13(3)375-85；GarmanSC等人，(2000)Nature 20；406(6793)：259-66)。先前工作亦已鉴别出许多IgE肽或衍生的肽或模拟表位(mimotope)，其被视为适用于诱导非过敏原性抗IgE抗体(WO 1993/005810；WO 99/67293；WO 2004/058799、WO 9731948、WO 2000/25722、WO 05/075504、US 2002/0645525、US 2004/146504及US 2006/062782；WO 00/050461、WO 02/34288及WO 2003/092714；Chen等人(2008)J.Immunologic.Meth.333：10-23；Hellman Expert Rev.Vaccines7(2)：193-208(2008))。此类IgE域或肽通常连接于载体以增加其免疫原性，以便破坏个体对IgE的自身耐受性。

因此，需要提供一种组合物，诸如与免疫原性载体偶联(couple)的抗原性IgE肽或其若干组合，且任选与一或多种佐剂一起施用，能够诱导个体的有效非过敏原性抗IgE抗体，能够显著减少循环游离IgE的含量。效能增加通常将产生以下益处：达成临床益处所需的剂量更低、例如用于皮下或肌肉内施用所需的注射体积更低(例如与单克隆抗体治疗相比)、治疗成本更低、治疗成功的可能性增加、治疗方案中的施用频率降低，由此使得能够治疗更广泛的患者群体(包括具有更高体重和/或高循环IgE含量的患者)且改善患者的生活质量。

发明概述

本发明涉及一种免疫原，其包含优选连接于免疫原性载体的抗原性IgE肽。所述IgE抗原性肽包含选自由SEQ ID No：1至430组成的组、优选选自由SEQ ID NO：1至153及220至430组成的组、甚至更优选选自由SEQ ID NO：220至430组成的组的氨基酸序列。所述抗原性IgE肽可经修饰用于缀合目的，优选藉由添加半胱氨酸或赖氨酸残基和/或添加接头(诸如GC/GGC接头)来达成。在优选实施方案中，所述抗原性IgE肽是构象受限制的(constrain)，优选是受简单限制的。所述免疫原性载体为异源蛋白质，优选为病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，更优选为HBcAg、HBsAg或Qβ VLP。本发明亦关于产生该优选连接于免疫原性载体的抗原性IgE肽的方法。

本发明亦关于包含该优选连接于免疫原性载体的抗原性IgE肽的免疫原性组合物，优选任选包含优选选自以下的佐剂的免疫原性组合物：明矾；含有CpG的寡核苷酸，优选为CpG7909及CpG24555；及基于皂苷的佐剂，优选为Iscomatrix。优选地，所述含有CpG的核酸包含一或多个经修饰的键，优选为一或多个硫代磷酸酯键，甚至更优选地，寡核苷酸的所有核苷酸间键均为硫代磷酸酯键。

本发明的另一方面涉及包含本发明的抗原性IgE肽或其免疫原性组合物的药物组合物，以及此类组合物的医学用途。

具体地，本发明涉及本发明的抗原性IgE肽或其免疫原性或药物组合物，其用作药物，优选用于治疗、减轻或预防IgE介导的病症。本发明亦关于诱导个体对自身IgE的免疫应答的方法及治疗、减轻或预防IgE介导的病症的方法，其包含施用有效量的所述抗原性IgE肽或其免疫原性或药物组合物。

附图说明

图1：人类IgE的CH3-CH4区域与其高亲和力受体FceRI之间的相互作用的结构显示。显示4个环(蓝色、紫色、橙色及黄色)，其分别对应于SEQ ID No：165、312、1及220的4种肽。

图2：用于诱导针对人类IgE的结构确定的表位的抗体应答的肽形式的图解。

发明详述

定义及通用技术

除非另有定义，否则与本发明关联使用的科学及技术术语应具有本领域普通技术人员通常所了解的含义。通常，本文所述的与细胞及组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白质与核酸化学及杂交关联使用的命名及其技术是本领域公知和常用的。

除非另有指示，否则本发明的方法及技术一般根据本领域公知的和常规的方法来进行且如整个本说明书中所引用及论述的各种一般及更特定的参考文献中所述来进行。例如参见Sambrook J.及Russell D.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2000)；Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley，John & Sons，Inc.(2002)；Harlow及LaneUsing Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1998)；及Coligan等人，Short Protocols in Protein Science，Wiley，John & Sons，Inc.(2003)。根据制造商的说明书进行酶促反应及纯化技术，通常如本领域或如本文所述完成。

本文所述与分析化学、合成有机化学及医学及药物化学关联使用的命名及实验步骤及技术是本领域公知的和常用的。

在本说明书及权利要求中，词语“包含”应理解为意指包括所述整数或整数的组，而不排除任何其它整数或整数的组。术语“包含”、“由...组成”及“基本上由...组成”意思可互换。除非另有指示，否则当本案使用术语“一”、“一个”或“一种”时，其意谓“至少一个(种)”或“一或多个(种)”。此外，除非另外要求，否则单数术语应包括复数，且除非内容另外明确规定，否则复数术语应包括单数。

本文中所引用的所有出版物、专利及专利申请(无论上文或下文)均以全文引用的方式并入本文中。

一般定义：

术语“肽”或“多肽”指氨基酸的聚合物而不论该聚合物的长度；因此，肽、寡肽及蛋白质包括在多肽定义中。此术语亦不指定或排除多肽的表达后修饰，例如包括糖基、乙酰基、磷酸基、脂质基团等等共价连接的多肽明确地涵盖于术语多肽。该定义亦包括含有一或多种氨基酸类似物(包括例如非天然存在的氨基酸、仅天然存在于不相关生物系统中的氨基酸、经修饰的哺乳动物系统的氨基酸等)的多肽，具有经取代的键以及本领域中已知的其它修饰(天然存在与非天然存在)的多肽。

术语“经分离的蛋白质”、“经分离的多肽”或“经分离的肽”为根据其衍生起源或来源如下的蛋白质、多肽或肽：(1)不与其天然状态下伴随的天然相关联(associate)的组份相关联；(2)不含相同物种的其它蛋白质；(3)由不同物种的细胞表达；或(4)不存在于自然界中。因此，以化学方式合成或在不同于其天然起源的细胞的细胞系统中合成的肽将与其天然相关联组份“分离”。蛋白质亦可藉由使用本领域中熟知的蛋白质纯化技术分离而实质上不含天然相关联组份。

如本文中所使用，当关于分子(例如肽、多肽或蛋白质)使用术语“经纯化”时，其意谓该经纯化的分子的浓度已相对于其天然环境或其产生、发现或合成环境中与其相关联的分子增加。天然相关联的分子包括蛋白质、核酸、脂质及糖类，但一般不包括添加用于维持经纯化分子的完整性或有助于纯化的水、缓冲液及试剂。

在一些实施方案中，当化合物按重量的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％不含与其天然相关联或在制造期间与其相关联的有机分子时，该化合物为实质上纯或经纯化。在一些实施方案中，制备物为按重量的至少70％、至少75％、至少90％、至少95％或至少99％的所需化合物(相对于其污染物)。

实质上纯或经纯化的化合物可例如藉由自天然来源(例如细菌)提取，藉由化学合成化合物，或藉由纯化及化学修饰的组合来获得。实质上纯或经纯化的化合物亦可藉由例如富集具有结合所需抗体的化合物的样品来获得。纯度可藉由任何适当方法来测量，例如层析法、质谱法、高效液相层析分析等。

如本文在IgE肽或多肽的情形下所使用，当IgE多肽融合蛋白质包含IgE肽或多肽及“异源”多肽时，术语“异源”指不为IgE肽或多肽的多肽，例如在自然界中通常不与IgE肽或多肽相关联的多肽。举例而言，异源多肽与IgE肽或多肽不具有显著氨基酸序列相同性，例如该异源多肽与IgE肽或多肽具有小于约50％、小于约40％、小于约30％或小于约20％的氨基酸序列相同性。

如本文中所使用，术语“IgE介导的病症”或“IgE相关病症”意谓特征为免疫球蛋白质IgE的过量产生和/或对免疫球蛋白质IgE的过敏反应的病状或疾病。具体而言，其应解释为包括与过敏性超敏反应(anaphylactic hypersensitivity)及异位性过敏相关的病状，包括例如：哮喘、过敏性哮喘、过敏性鼻炎及结膜炎(枯草热)、湿疹、荨麻疹、异位性皮肤炎及食物过敏(包括花生过敏)。由例如蜂螫伤、蛇咬伤、食物或药物引起的过敏性休克的严重生理学病状亦涵盖于此术语的范畴内。其它IgE介导的病症包括重度过敏、接触性皮肤炎、过敏性胃肠病、过敏性肺曲菌病、过敏性紫癜、湿疹、高IgE(乔布氏(Job’s))综合症、过敏性超敏反应、IgE骨髓瘤、炎症性肠病(例如克罗恩氏病(Crohn’s disease)、溃疡性结肠炎、未定型结肠炎及传染性结肠炎)、荨麻疹及牛皮癣。

本发明的抗原性IgE肽

本发明涉及IgE肽及其衍生的肽，其已鉴别为能够形成参与CH3-CH4区与其高亲和力受体FceRI的相互作用的环的IgE CH3结构域部分(参看图1)。展示此类IgE肽具有免疫原性且为非过敏原性的。

此类抗原性IgE肽可单独使用或组合使用，优选为与免疫原性载体缀合使用，以诱导个体的自身抗IgE抗体以便治疗、预防或改善IgE相关病症。

详言之，本发明涉及一种免疫原，其由优选连接于免疫原性载体的抗原性IgE肽组成、基本上由该抗原性IgE肽组成或包含该抗原性IgE肽。

在一实施方案中，本发明的抗原性IgE肽由选自SEQ ID No：1至430及其功能活性变体、优选选自SEQ ID No：1至430的氨基酸序列组成、基本上由该氨基酸序列组成或包含该氨基酸序列。在另一实施方案中，该抗原性IgE肽由选自SEQ ID No：1至153及其功能活性变体、优选选自SEQ ID No：1至153的氨基酸序列组成、基本上由该氨基酸序列组成或包含该氨基酸序列。在另一实施方案中，该抗原性IgE肽由选自SEQ ID No：154至219及其功能活性变体、优选选自SEQ ID No：154至219的氨基酸序列组成、基本上由该氨基酸序列组成或包含该氨基酸序列。在又一实施方案中，该抗原性IgE肽由选自SEQ ID No：220至310及其功能活性变体、优选选自SEQ ID No：220至310的氨基酸序列组成、基本上由该氨基酸序列组成或包含该氨基酸序列。在又一实施方案中，该抗原性IgE肽由选自SEQ ID No：311至430及其功能活性变体、优选选自SEQ ID No：311至430的氨基酸序列组成、基本上由该氨基酸序列组成或包含该氨基酸序列。

在本发明的含义中，术语“抗原性IgE肽”包括所有IgE CH3衍生的肽，优选来自哺乳动物物种，更优选来自人类，以及其展现“抗原性IgE肽生物学活性”的变体、类似物、直系同源物、同系物及衍生物以及其片段。优选地，术语“抗原性IgE肽”指包含选自SEQ ID No：1至430的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成的肽，以及其展现基本上相同生物活性的变体、同系物及衍生物。更优选地，术语“抗原性IgE肽”指包含选自SEQ ID 1至430的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成的肽，更优选为包含选自SEQ ID No：1至153及220至430的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成的肽，甚至更优选为包含选自SEQ ID No：220至430的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成的肽。

在一实施方案中，本发明的抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429及430。

在另一实施方案中，本发明的抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152及153。优选地，该抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、88、89、90、91、92、93、94、95、96、99、100、101、102、103、104、105、106、109、110、111、112、113、114、115、118、119、120、121、122、123、126、127、128、129、130、133、134、135、136、139、140、141、144、145及148。更优选地，该抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、49、50、51、52、53、54、55、56、57、63、64、65、66、67、68、69、70、76、77、78、79、80、81、82、88、89、90、91、92、93、99、100、101、102、103、109、110、111、112、118、119、120、126、127、133及139。甚至更优选地，该抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、18、19、20、21、22、23、24、25、34、35、36、37、38、39、40、49、50、51、52、53、54、63、64、65、66、67、76、77、78、79、88、89、90、99、100、101及109。甚至更优选地，该抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、18、19、20、21、22、34、35、36、37、49、50、51、63、64及76。甚至更优选地，该抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ ID No：1、2、3、18、19及34。最优选地，该抗原性IgE肽由SEQ ID No：1或18的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。

在另一实施方案中，本发明的抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ ID No：154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218及219。优选地，该抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ ID No：154、155、156、157、158、159、160、161、162、165、166、167、168、169、170、171、172、175、176、177、178、179、180、181、184、185、186、187、188、189、192、193、194、195、196、199、200、201、202、205、206、207、210、211、214及217。更优选地，该抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ ID No：154、155、156、157、158、159、165、166、167、168、169、175、176、177、178、184、185、186、192、193、199及200。甚至更优选地，该抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ ID No：154、155、156、165、166及175。最优选地，该抗原性IgE肽由SEQ ID No：154或165的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。

在另一实施方案中，本发明的抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309及310。优选地，该抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、245、246、247、248、249、250、251、252、253、256、257、258、259、260、261、262、263、266、267、268、269、270、271、272、275、276、277、278、279、280、283、284、285、286、287、290、291、292、293、296、297、298、301、302及305。更优选地，该抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、225、226、227、233、234、235、236、237、238、239、245、246、247、248、249、250、256、257、258、259、260、266、267、268、269、275、276、277、283、284及290。甚至更优选地，该抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ IDNo：220、221、222、223、224、233、234、235、236、245、246、247、256、257及266。甚至更优选地，该抗原性IgE肽由选自SEQ ID No：220、221、222、233、234及245的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。最优选地，该抗原性IgE肽由SEQ ID No：220或233的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。

在又一实施方案中，本发明的抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429及430。优选地，该抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、365、366、367、368、369、370、371、372、373、376、377、378、379、380、381、382、383、386、387、388、389、390、391、392、395、396、397、398、399、400、403、404、405、406、407、410、411、412、413、416、417、418、421、422及425。更优选地，该抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、326、327、328、329、330、331、332、333、334、340、341、342、343、344、345、346、347、353、354、355、356、357、358、359、365、366、367、368、369、370、376、377、378、379、380、386、387、388、389、395、396、397、403、404及410。甚至更优选地，该抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、326、327、328、329、330、331、340、341、342、343、344、353、354、355、356、365、366、367、376、377及386。甚至更优选地，该抗原性IgE肽由选自SEQ ID No：311、312、313、314、326、327、328、340、341及353的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。甚至更优选地，该抗原性IgE肽由选自SEQ ID No：311、312及326的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。最优选地，该抗原性IgE肽由SEQ ID No：311或312的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。

当本文中使用时，术语“抗原性IgE肽生物学活性”指本发明的抗原性IgE肽诱导患者的具有拮抗谱(antagonistic profile)的自身抗IgE抗体的能力，此类自身抗体能够减少循环游离IgE的含量，同时不会引起任何显著IgE介导的炎症介质释放且同时实质上不会与结合其高亲和力受体的IgE结合。对于本领域技术人员将显而易见，何种技术可用于证实特定构建体是否属于本发明的范畴内。此类技术包括(但不限于)本申请案的实施例部分中所述的技术以及以下技术。可测定假定肽以确定构建体的免疫原性，因为由假定肽引起的抗血清与天然IgE分子交叉反应，且亦具有阻断过敏性介质自过敏性效应细胞释放的功能。

这些应答的特异性可藉由IgE的下拉(pulldown)可被定量的功能性测定和/或可藉由抑制表达IgE受体的细胞的去颗粒(degranulation)来证实，或藉由竞争实验(通过阻断抗血清对肽自身或天然IgE的活性，和/或阻断已知结合IgE中的表位的特异性单克隆抗体的活性)来证实。确定结合于IgE-FcRI的技术亦为本领域技术人员所熟知。

在一实施方案中，本发明的抗原性IgE肽具有使其模拟选自存在天然表位的整个IgE域的区域的大小。在一具体实施方案中，本发明的抗原性IgE肽的长度小于100个氨基酸，优选短于75个氨基酸，更优选小于50个氨基酸，甚至更优选小于40个氨基酸。本发明的抗原性IgE肽的长度通常为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸，优选为4至20个氨基酸，例如6至12个或6至9个氨基酸。

在序列表中提供本发明的抗原性IgE肽的具体实例且其包括长度在4至20个氨基酸范围内的肽。

本发明的抗原性肽包括衍生自人类IgE CH3的一部分的氨基酸序列，人类CH3的该衍生部分对应于天然存在的IgE的氨基酸序列或对应于变体IgE，亦即少量氨基酸已经被取代、添加或缺失但保留基本上相同免疫性质的天然存在的IgE的氨基酸序列。另外，该衍生的IgE CH3部分可进一步由氨基酸修饰，尤其在N及C末端，使得抗原性IgE肽的构象受限制和/或使得在进行适当化学作用后抗原性IgE肽与免疫原性载体偶联。

本发明的抗原性IgE肽涵盖衍生自其氨基酸被缺失、插入或经取代但基本上不降低其免疫性质的IgE CH3的氨基酸序列的功能活性变体肽，亦即此类功能活性变体肽保留实质上抗原性IgE肽生物活性。通常，此类功能变体肽具有与选自SEQ ID No：1至430的氨基酸序列、更优选选自SEQ ID No：1至153及220至430的氨基酸序列、甚至更优选选自SEQ IDNo：220至430的氨基酸序列同源、优选高度同源的氨基酸序列。

在一实施方案中，此类功能活性变体肽与选自SEQ ID No：1至430的氨基酸序列、更优选选自SEQ ID No：1至153及220至430的氨基酸序列、甚至更优选选自SEQ ID No：220至430的氨基酸序列展现至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的相同性。

多肽的序列相似性(亦称为序列相同性)通常使用序列分析软件来量测。蛋白质分析软件使用归因于各种取代、缺失及其它修饰(包括保守性氨基酸取代)的相似性的度量来匹配相似的序列。举例而言，GCG含有诸如“Gap”及“Bestfit”的程序，其在默认参数下用于测定密切相关多肽(诸如来自不同生物物种的同源多肽)之间或野生型蛋白质与其突变蛋白质之间的序列同源性或序列相同性。例如参见6.1版GCG。多肽序列亦可使用FASTA(6.1版GCG中的程序)，使用默认或推荐参数来比较。FASTA(例如FASTA2及FASTA3)提供查询及搜索序列之间的最优选重叠区域的比对及序列相同性百分比(Pearson，Methods Enzymol.183：63-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.132：185-219(2000))。当将本发明的序列与含有大量来自不同生物的序列的数据库作比较时，替代算法为使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其为blastp或tblastn。例如参见Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-402(1997)。

功能活性变体包含天然存在的功能活性变体(诸如等位基因变体及物种变体)及可藉由例如诱变技术或藉由直接合成而产生的非天然存在的功能活性变体。

功能活性变体与SEQ ID No：1至430、更优选SEQ ID No：1至153及220至430、甚至更优选SEQ ID No：220至430所示的任一肽的不同之处为约例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基，但仍保留抗原性IgE生物活性。当此比较需要比对时，比对序列的最大同源性。变异位点可出现于肽的任何地方，只要生物活性实质上类似于SEQ ID No：1至430中所示的肽，更优选地实质上类似于SEQ ID No：1至153及220至430中所示的肽，甚至更优选地实质上类似于SEQ ID No：220至430中所示的肽即可。

关于如何产生表型沉默氨基酸取代的指导提供于Bowie等人，Science，247：1306-1310(1990)中，该文献教示存在两种研究氨基酸序列对改变的容许度(tolerance)的主要策略。

第一种策略利用在进化过程期间藉由自然选择的氨基酸取代容许度。藉由比较不同物种的氨基酸序列，可鉴别物种间保守的氨基酸位置。这些保守的氨基酸可能对于蛋白质功能很重要。相反，自然选择所容许的取代所在的氨基酸位置表示对于蛋白质功能不重要的位置。因此，可修饰容许氨基酸取代的位置，同时仍维持经修饰肽的特异性免疫原性活性。

第二种策略利用遗传工程改造在克隆的基因的特定位置处引入氨基酸变化以鉴别对于蛋白质功能重要的区域。举例而言，可使用定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham等人，Science，244：1081-1085(1989))。接着可测试所得变体肽的特异性抗原性IgE生物学活性。

根据Bowie等人，此两种策略已揭露蛋白质惊人地容许氨基酸取代。作者进一步指出在蛋白质中的某些氨基酸位置处可能容许何种氨基酸变化。举例而言，大部分内埋或内部(在蛋白质的三级结构内)氨基酸残基需要非极性侧链，而一般极少表面或外部侧链的特征是保守的。

将突变引入蛋白质的氨基酸中的方法为本领域技术人员所熟知。例如参见Ausubel(编)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.(1994)；T.Maniatis，E.F.Fritsch及J.Sambrook，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)。

亦可使用市售试剂盒(诸如“QuikChangeTM定点诱变试剂盒”(Stratagene))或直接藉由肽合成来引入突变。藉由置换不显著影响抗原性IgE肽的功能的氨基酸来产生该抗原性IgE肽的功能活性变体可由本领域技术人员来完成。

一类可在本发明的一种肽中进行的氨基酸取代为保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是氨基酸残基经另一具有化学性质(例如电荷或疏水性)类似的侧链R基团的氨基酸残基取代的氨基酸取代。一般而言，保守性氨基酸取代不会实质上改变蛋白质的功能性质。在两个或两个以上氨基酸序列互不相同之处为保守性取代的情况下，可调高序列相同性或相似度百分比以校正该取代的保守性质。进行此调节的方式为本领域技术人员所熟知。例如参见Pearson，Methods Mol.Biol.243：307-31(1994)。

具有化学性质类似的侧链的氨基酸组的实例包括：1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸；2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸及苏氨酸；3)含有酰胺的侧链：天冬酰胺及谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸及组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸及谷氨酸；及7)含硫侧链：半胱氨酸及甲硫氨酸。优选保守性氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸及天冬酰胺-谷氨酰胺。

或者，保守性置换是Gonnet等人，Science 256：1443-45(1992)中所揭示的PAM250对数似然矩阵具有正值的任何改变。“中度保守性”置换为PAM250对数似然矩阵具有非负值的任何改变。

功能活性变体肽亦可使用杂交技术来分离。简言之，使用与编码所需肽、多肽或蛋白质(例如SEQ ID No：1至430)的核酸序列的全部或一部分具有高同源性的DNA来制备功能活性肽。因此，本发明的抗原性IgE肽亦包括功能上等同于SEQ ID No：1至430的一或多种肽以及由与编码SEQ ID No：1至430中的任一者的核酸或其互补序列杂交的核酸分子编码的肽。本领域技术人员可容易地使用易于得到的密码子表来确定编码本发明的肽的核酸序列。因此，本文中不提供这些核酸序列。

编码功能活性变体的肽、多肽或蛋白质的核酸的杂交严格性为例如10％甲酰胺、5×SSPE、1×登哈特溶液(Denhart’s solution)及1×鲑鱼精DNA(低严格性条件)。更优选条件为25％甲酰胺、5×SSPE、1×登哈特溶液及1×鲑鱼精DNA(中等严格性条件)，且甚至更优选条件为50％甲酰胺、5×SSPE、1×登哈特溶液及1×鲑鱼精DNA(高严格性条件)。然而，除上述甲酰胺浓度外，若干种因素可影响杂交严格性，且本领域技术人员可适当地选择这些因素以达到类似严格性。

编码功能活性变体的核酸分子亦可藉由基因扩增方法来分离，诸如使用编码所需肽、多肽或蛋白质(例如SEQ ID No：1至430所示的任一肽)的核酸分子DNA的一部分作为探针的PCR。

出于本发明的目的，应认为本发明的若干种抗原性IgE肽可组合使用。可预想各种可能组合。举例而言，可使用包含一种以上优选选自SEQ ID No：1至430、更优选选自SEQ IDNo：1至153及220至430、甚至更优选选自SEQ ID No：220至430的抗原性IgE肽的多肽，其中同一多肽分子上使用相同抗原性IgE肽的若干拷贝，或其中同一多肽分子上使用具有不同氨基酸序列的抗原性IgE肽；此类不同抗原性IgE肽或拷贝直接彼此融合或由适当接头隔开。如本文中所使用，术语“多聚化抗原性IgE(多)肽”是指两种类型的组合，其中具有不同或相同氨基酸序列的抗原性IgE肽存在于单个多肽分子上。2至约20个相同和/或不同抗原性IgE肽，优选2、3、4、5、6或7个抗原性IgE肽，可因此存在于单个多聚化抗原性IgE多肽分子上。

在本发明的一方面中，免疫原由多聚化抗原性IgE肽组成、基本上由该肽组成或包含该肽，该多聚化IgE肽由至少一个选自SEQ ID No：1至430及其功能活性变体、优选选自SEQ ID No：1至430的氨基酸序列组成、基本上由该氨基酸序列组成或包含该氨基酸序列。在一实施方案中，该多聚化IgE肽包含含有选自SEQ ID No：1至153的氨基酸序列的第一抗原性IgE肽及含有选自SEQ ID No：154至219或SEQ ID No：220至310或SEQ ID No：311至430的氨基酸序列的第二抗原性IgE肽。在另一实施方案中，该多聚化IgE肽包含含有选自SEQID No：154至219的氨基酸序列的第一抗原性IgE肽及含有选自SEQ ID No：1至153或SEQ IDNo：220至310或SEQ ID No：311至430的氨基酸序列的第二抗原性IgE肽。在又一实施方案中，该多聚化IgE肽包含含有选自SEQ ID No：220至310的氨基酸序列的第一抗原性IgE肽及含有选自SEQ ID No：1至153或SEQ ID No：154至219或SEQ ID No：311至430的氨基酸序列的第二抗原性IgE肽。在又一实施方案中，该多聚化IgE肽包含含有选自SEQ ID No：311至430的氨基酸序列的第一抗原性IgE肽及含有选自SEQ ID No：1至153或SEQ ID No：154至219或SEQ ID No：220至310的氨基酸序列的第二抗原性IgE肽。在又一实施方案中，该多聚化IgE肽包含含有选自SEQ ID No：311至430的氨基酸序列的第一抗原性IgE肽、含有选自SEQ ID No：220至310的氨基酸序列的第二抗原性IgE肽及含有选自SEQ ID No：154至219或SEQ ID NO：1至153的氨基酸序列的第三抗原性IgE肽。

在本发明的一实施方案中，本发明的肽、多肽或蛋白质是来源于天然来源且分离自诸如人类、灵长类动物、猫、狗、马、小鼠或大鼠的哺乳动物，优选分离自人类来源。因此，本发明的肽、多肽或蛋白质可使用标准蛋白质纯化技术自细胞或组织来源分离。

或者，本发明的肽、多肽及蛋白质可以化学合成或使用重组DNA技术产生。

举例而言，本发明的肽、多肽或蛋白质可藉由本领域中熟知的固相程序来合成。合适的合成可藉由使用“T-boc”或“F-moc”程序来执行。环状肽可藉由固相程序，使用熟知的“F-moc”程序及聚酰胺树脂，在完全自动装置中合成。或者，本领域技术人员将知晓手动执行过程的必要实验步骤。用于固相合成的技术及程序描述于E.Atherton及R.C.Sheppard的“Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach”，由Oxford UniversityPress的IRL出版(1989)及D.Andreau等人的“Methods in Molecular Biology”，第35卷：Peptide Synthesis Protocols(M.W.Pennington及B.M.Dunn编)，第7章，第91-171页中。

或者，可使用本领域中熟知的技术将编码本发明的肽、多肽或蛋白质的多核苷酸引入可在合适的表达系统中表达的表达载体中，随后分离或纯化所表达的所需肽、多肽或蛋白质。本领域可获得各种细菌、酵母、植物、哺乳动物及昆虫表达系统且可使用任何此类表达系统。任选地，编码本发明的肽、多肽或蛋白质的多核苷酸可在无细胞翻译系统中翻译。

本发明的抗原性IgE肽亦可包含由存在多个基因、选择性转录事件、选择性RNA拼接事件及选择性翻译与翻译后事件所产生的那些肽。肽可在引起与该肽在天然细胞中表达时所存在的实质上相同的翻译后修饰的系统(例如培养细胞)中表达，或在引起在天然细胞中表达时所存在的翻译后修饰(例如糖基化或裂解)的改变或省略的系统中表达。

本发明的肽、多肽或蛋白质(诸如抗原性IgE肽)可以融合蛋白质形式产生，该融合蛋白质含有其它非IgE或非IgE衍生的氨基酸序列，诸如氨基酸接头或信号序列或如本文所定义的免疫原性载体，以及适用于蛋白质纯化的配体，诸如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸标签及葡萄球菌蛋白质A。一种以上本发明的抗原性IgE肽可以融合蛋白质形式存在。异源多肽可例如与本发明的肽、多肽或蛋白质的N端或C端融合。本发明的肽、多肽或蛋白质亦可以包含同源氨基酸序列(亦即其它IgE或IgE衍生的序列)的融合蛋白质形式产生。

本发明的抗原性IgE肽可呈线性或构象受限制。在本发明的优选实施方案中，抗原性IgE肽的构象受限制。如本文中关于分子所使用，术语“构象受限制”意谓三维结构随时间实质上维持一种空间排列的分子(诸如肽、多肽或蛋白质)。构象受限制的分子可具有改良的性质，诸如亲和力、代谢稳定性、膜渗透性或溶解性增加。

另外，预期此类构象受限制的分子以类似于其天然环构象的构象提供抗原性IgE表位，从而诱导抗IgE抗体更易识别完整的天然自身IgE分子或以增加的亲和力识别自身IgE分子。构象限制的方法为本领域所熟知且包括(但不限于)桥接(bridging)及环化。

现有技术中已知存在若干种将构象限制引入线性肽或多肽链中的方法。举例而言，肽中两个相邻氨基酸之间的桥接引起局部构象改变，与规则肽相比，其柔性(flexibility)受限制。形成此类桥接的一些可能性包括内酰胺及哌嗪酮的掺入(关于评论，请参见Giannis and.Kolter，Angew.Chem.Int.Ed.，1993，32：1244)。

如本文中关于肽所使用，术语“环状”是指包括在两个非相邻氨基酸或氨基酸类似物之间的分子内键的结构。环化可经由共价或非共价键来实现。分子内键包括(但不限于)主链与主链、侧链与主链、侧链与侧链、侧链与端基、端与端之间的键。环化方法包括(但不限于)在非相邻氨基酸或氨基酸类似物的侧链之间形成二硫键；在Lys与Asp/Glu残基之间形成酰胺键；在丝氨酸残基与Asp/Glu残基之间形成酯键；例如在一个氨基酸或其类似物的侧链基团与氨基端残基的N端胺之间形成内酰胺键；及形成赖氨酸正亮氨酸及二酪氨酸键。亦可使用二硫键的碳形式(例如乙烯基或乙基键)(J.Peptide Sc.，2008，14，898-902)，以及与适当经多取代的亲电试剂(诸如二卤烷烃、三卤烷烃或四卤烷烃)的烷基化反应(PNAS，2008，105(40)，15293-15298；ChemBioChem，2005，6，821-824)。各种经修饰的脯氨酸类似物亦可用于将构象限制并入肽中(Zhang等人，J.Med Chem.，1996，39：2738-2744；Pfeifer及Robinson，Chem.Comm.，1998，1977-1978)。可用于环化本发明的肽的化学作用产生经包括(但不限于)以下的键环化的肽：内酰胺、腙、肟、噻唑烷、硫醚或锍键。

US 10/114918中所述的设计构象受限制的肽的另一种方法在于将所需短氨基酸序列连接于模板，产生环状受限制的肽。此类环状肽不仅藉由其模板使得结构稳定，且藉此提供可模拟天然蛋白质上(诸如病毒及寄生虫上)或自身蛋白质(自体性哺乳动物蛋白质，诸如IgE)上的构象表位的三维构象，而且在血清中其比线性肽更抗蛋白质水解降解。US10/114918进一步揭示藉由制备合成氨基酸以与适当位置处的氨基酸进行主链偶联以便使肽的超二级结构稳定来合成构象受限制的交联肽。交联可藉由正交保护的(2S，3R)-3-氨基脯氨酸残基的一级氨基与适当位置处的谷氨酸的侧链羧基进行酰胺偶联来达成。在制备CS蛋白质的构象受限制的四肽重复时按照此方法，其中至少一个脯氨酸由(2S，3R)-3-胺基脯氨酸置换且为了引入侧链羧基，并入谷氨酸以置换丙氨酸。

交联策略亦包括应用格罗布斯关环复分解反应(Grubbs ring-closingmetathesis reaction)以形成设计成模拟α螺旋构象的“订书钉型(stapled)”肽(Angew.Int.Ed.Engl.，1998，37，3281；JACS，2000，122，5891)；使用多官能醣；使用氨基羧乙基硫色氨酸键(Chemistry Eu.J.，2008，24，3404-3409)；使用叠氮化合物与炔烃的“点击(click)”反应，其可以侧链氨基酸残基形式并入或位于肽序列的主链中(DrugDisc.Today，2003，8(24)，1128-1137)。文献中亦已知金属离子可经由螯合与金属阳离子配位的特定残基(例如组氨酸)而使线性肽的受限制构象稳定(Angew.Int.Ed.Engl.，2003，42，421)。类似地，用非天然酸及胺官能度或多元胺及多元酸官能度使线性肽序列官能化可用于在活化及酰胺键形成后得到环化结构。

根据一实施方案，抗原性IgE肽因抗原性IgE肽的两个非相邻氨基酸(例如N及C端氨基酸)的彼此分子内共价键接而构象受限制。根据另一实施方案，本发明的抗原性IgE肽因共价结合于支架(scaffold)分子而构象受限制。根据另一实施方案，抗原性IgE肽受简单限制，亦即在一端(C或N端)或经由不位于任一端的另一氨基酸与骨架分子偶联。根据另一实施方案，抗原性IgE肽受双重限制，亦即在C端与N端与骨架分子偶联。根据另一实施方案，抗原性肽藉由经由左右异向双脯氨酸(Diproline)单元(D-Pro-L-Pro)的模板作用进行环化而受限制(Spath等人，1998，Helvetica Chimica Acta 81，第1726-1738页)。本发明的说明性但非限制性构象受限制的肽的实例在图2中图标描述。

支架(亦称为“平台”)可为能够经由共价键接减少抗原性IgE肽可采用的构象数的任何分子。构象限制性支架的实例包括蛋白质及肽，例如脂质运载蛋白相关分子(诸如含有β桶的硫氧还原蛋白及硫氧还原蛋白样蛋白质)、核酸酶(例如RNaseA)、蛋白酶(例如胰蛋白酶)、蛋白酶抑制剂(例如水蛭蛋白酶抑制剂(eglin)C)、抗体或其结构刚性片段、荧光蛋白(诸如GFP或YFP)、芋螺毒素(conotoxin)、纤维结合蛋白III型域的环区、CTL-A4及病毒样颗粒(VLP)。

其它合适的平台分子包括碳水化合物，诸如琼脂糖。该平台可为线性或环状分子，例如接近形成环。平台一般对于抗原性IgE肽为异源性的。认为此类连接于平台的构象受限制的肽比线性肽对蛋白质水解降解更具抗性。

根据一优选实施方案，该支架为如本申请案中所定义的免疫原性载体，优选为异源载体蛋白质或VLP。在另一实施方案中，抗原性IgE肽简单限制于免疫原性载体上。在另一实施方案中，抗原性IgE肽双重限制于免疫原性载体上。以此方式，抗原性IgE肽形成构象受限制的环结构，其经证明为尤其适合作为细胞内识别分子的结构。

本发明的抗原性IgE肽可经修饰以易于与平台结合，例如藉由在一端或两端添加末端半胱氨酸和/或藉由添加连接序列(诸如双甘氨酸头或尾、以赖氨酸残基终止的接头或本领域技术人员已知执行该功能的任何其它接头)来达成。亦可使用使完整肽序列与载体偶联的生物正交化学作用(诸如上述点击反应)，由此避免任何区域化学及化学选择性问题。已知刚化接头(Rigidified linker)(诸如Jones等人Angew.Chem.Int.Ed.2002，41：4241-4244中所述的接头)引起改良的免疫应答且亦可使用此类接头。

在另一实施方案中，抗原性IgE肽连接于自身与载体偶联的多价模板，由此增加抗原密度(参见下文)。该多价模板可为经适当官能化的聚合物或寡聚物，诸如(但不限于)寡谷氨酸(oligoglutamate)或寡聚葡萄胺糖。

该接头可位于肽的N端，或肽的C端，或肽的两端。该接头的长度可为0至10个氨基酸，优选长度为0至6个氨基酸，甚至更优选长度为2-3个氨基酸。或者，可执行一或多种氨基酸的D-立体异构体形式的添加或取代以形成有益衍生物，例如增强肽的稳定性。

以下提供使用各种接头的例示性缀合组合，其全部均在本发明的范畴内且构成多种实施方案：

肽-GGGGGC-支架、

肽-GGGGC-支架、

肽-GGGC-支架、

肽-GGC-支架、

肽-GC-支架、

肽-C-支架、

肽-GGGGGK、

肽-GGGGK、

肽-GGGK、

肽-GGK、

肽-GK、

肽-K、

肽-GGGGSC、

肽-GGGSC、

肽-GGSC、

肽-GSC、

肽-SC、

CSGGGG-肽、

CSGGG-肽、

CSGG-肽、

CSG-肽、

CS-肽。

在一实施方案中，该肽由本文所揭示的任一抗原性IgE肽组成且该支架由本文所揭示的任一免疫原性载体(优选为VLP)组成。

以下提供使用各种接头及双重受限制的肽的例示性缀合组合，其中该载体可为载体的相同单体或载体的相异单体。(在以下实例中，GC接头可经上文例示的任一GK接头或GSC接头或本领域技术人员已知的任何其它接头取代)：

载体-CGGGGG-肽-GGGGGC-载体、

载体-CGGGG-肽-GGGGC-载体、

载体-CGGG-肽-GGGC-载体、

载体-CG-肽-GC-载体、

载体-C-肽-C-载体。

在一实施方案中，若末端半胱氨酸残基不存在于抗原性IgE肽的氨基酸序列中，则将其添加至SEQ ID No：1至430的任一抗原性IgE肽的一端或两端以产生构象受限制的肽。在一优选实施方案中，本发明的构象受限制的抗原性IgE肽选自由SEQ ID No：1至430及其功能活性变体组成的组，优选选自由SEQ ID No：1至430组成的组，更优选选自由SEQ IDNo：1至153及220至430组成的组，甚至更优选选自由SEQ ID No：220至430组成的组。在一实施方案中，在该抗原性IgE肽的C端添加该末端半胱氨酸残基。在另一实施方案中，在该抗原性IgE肽的N端添加该末端半胱氨酸残基。在另一实施方案中，在该抗原性IgE肽的C端与N端皆添加末端半胱氨酸残基。

在另一实施方案中，GC接头包含可变数目的甘氨酸残基且将一个末端半胱氨酸残基添加至SEQ ID No：1至430的任一抗原性IgE肽的一端或两端以产生构象受限制的肽。该GC接头优选包含1至10个甘氨酸残基，更优选1、2、3、4或5个甘氨酸残基。在另一优选实施方案中，本发明的构象受限制的抗原性IgE肽选自由SEQ ID No：1至430及其功能活性变体组成的组，优选选自由SEQ ID No：1至430组成的组，更优选选自由SEQ ID No：1至153及220至430组成的组，甚至更优选选自由SEQ ID No：220至430组成的组。在一实施方案中，在该抗原性IgE肽的C端添加该GC接头。在另一实施方案中，在该抗原性IgE肽的N端添加该GC接头。在另一实施方案中，在该抗原性IgE肽的C端与N端皆添加该GC接头。

在又一实施方案中，GC接头包含可变数目的甘氨酸残基且将一个末端半胱氨酸残基添加至SEQ ID No：1至430的抗原性IgE肽的一端且若末端半胱氨酸残基不存在于抗原性IgE肽的另一端，则将其添加至抗原性肽的另一端。GC接头优选包含1至10个甘氨酸残基，更优选1、2、3、4或5个甘氨酸残基。在另一优选实施方案中，本发明的构象受限制的抗原性IgE肽选自由SEQ ID No：1至430及其功能活性变体组成的组，优选选自由SEQ ID No：1至430组成的组，更优选选自由SEQ ID No：1至153及220至430组成的组，甚至更优选选自由SEQ IDNo：220至430组成的组。在一实施方案中，在该抗原性IgE肽的C端添加该GC接头且在该抗原性IgE肽的N端添加该末端半胱氨酸残基。在一实施方案中，在该抗原性IgE肽的N端添加该GC接头且在该抗原性IgE肽的C端添加该末端半胱氨酸残基。

在另一优选实施方案中，优选藉由添加赖氨酸残基来修饰GC接头，以便使该与该抗原性IgE肽偶联的接头与支架分子缀合。在一甚至更优选实施方案中，本发明的构象受限制的抗原性IgE肽选自由SEQ ID No：1至430及其功能活性变体组成的组，优选选自由SEQID No：1至430组成的组，更优选选自由SEQ ID No：1至153及220至430组成的组，甚至更优选选自由SEQ ID No：220至430组成的组。在一实施方案中，在该抗原性IgE肽的C端添加该经修饰的GC接头。在另一实施方案中，在该抗原性IgE肽的N端添加该经修饰的GC接头。

在一实施方案中，本发明的构象受限制的抗原性IgE肽为表9中所揭示的任一肽。

本发明的免疫原性载体

在本发明的一实施方案中，本发明的抗原性IgE肽或多肽连接于免疫原性载体分子以形成用于疫苗接种方案的免疫原，优选地其中该载体分子与天然IgE分子无关。

本文中的术语“免疫原性载体”包括如下那些物质：具有独立地激发宿主动物的免疫原性应答的特性；且可直接经由在肽、多肽或蛋白质中的游离羧基、氨基或羟基与免疫原性载体物质上的相应基团之间形成肽或酯键，或者藉由经由常规双功能连接基团键接或以融合蛋白质形式与该肽、多肽或蛋白质共价偶联。

用于本发明的免疫原中的载体类型将容易为本领域技术人员所已知。此类免疫原性载体的实例为：血清白蛋白，诸如牛血清白蛋白(BSA)；球蛋白；甲状腺球蛋白；血红蛋白；血蓝蛋白(尤其为匙孔血蓝蛋白[Keyhole Limpet Hemocyanin/KLH])；自蛔虫提取的蛋白质；灭活的细菌毒素或类毒素，诸如破伤风或白喉毒素(TT及DT)或CRM197、结核菌素纯化的蛋白质衍生物(purified protein derivative of tuberculin，PPD)；或来自流行性感冒杆菌(Haemophilus influenzae)的蛋白D(WO 91/18926)或其重组片段(例如TT的片段C的域1，或DT的移位域或包含流行性感冒杆菌蛋白D的N端100-110个氨基酸的蛋白D 1/3^rd(GB9717953.5))；聚赖氨酸；聚谷氨酸；赖氨酸-谷氨酸共聚物；含有赖氨酸或鸟氨酸的共聚物；脂质体载体等。

在一实施方案中，免疫原性载体为KLH。在另一实施方案中，免疫原性载体为病毒样颗粒(VLP)，优选为重组病毒样颗粒。

如本文中所使用，术语“病毒样颗粒”指类似于病毒颗粒但显示非病原性的结构。一般而言，病毒样颗粒缺乏病毒基因组的至少一部分。又，病毒样颗粒通常可藉由异源表达大量产生且可容易地纯化。本发明的病毒样颗粒可含有不同于其基因组的核酸。本发明的病毒样颗粒的一典型及优选实施方案为病毒衣壳(capsid)，诸如相应病毒、噬菌体或RNA-噬菌体的病毒衣壳。

如本文中所使用，术语“噬菌体的病毒样颗粒”指类似于噬菌体结构、非复制性及非感染性、且至少缺乏编码噬菌体的复制机器的基因、且通常亦缺乏编码负责病毒附着于宿主或进入宿主体内的蛋白质的基因的病毒样颗粒。然而，此定义亦应涵盖噬菌体的病毒样颗粒，其中上述基因仍存在，但不活化，并因此亦产生噬菌体的非复制性及非传染性病毒样颗粒。

由RNA噬菌体外壳蛋白的180个亚单位的自组装所形成且任选含有宿主RNA的衣壳结构在本文中被称为“RNA噬菌体外壳蛋白的VLP”。一特定实例为Qβ外壳蛋白的VLP。在此特定情况下，Qβ外壳蛋白的VLP可仅仅由Qβ CP亚单位(藉由表达含有例如TAA终止密码子(经由抑制来阻止较长A1蛋白的任何表达)的Qβ CP基因所产生，参见Kozlovska，T.M.等人，Intervirology 39：9-15(1996))组装，或另外在衣壳组件中含有A1蛋白亚单位。衣壳组件中Qβ A1相对于Qβ CP的百分比一般将受限制，以便确保衣壳形成。

在本发明的情形下，适合用作免疫原性载体的VLP的实例包括(但不限于)乙型肝炎病毒的衣壳蛋白(Ulrich等人，Virus Res.50：141-182(1998))、麻疹病毒(Warnes等人，Gene 160：173-178(1995))、辛德比病毒(Sindbis virus)、轮状病毒(美国专利第5,071,651号及第5,374,426号)、口蹄疫病毒(Twomey等人，Vaccine 13：1603-1610，(1995))、诺沃克病毒(Norwalk virus)(Jiang，X.等人，Science 250：1580-1583(1990)；Matsui，S.M.等人，J Clin.Invest.87：1456-1461(1991))、反转录病毒GAG蛋白(PCT专利申请案第WO 96/30523号)、反转录转座子Ty蛋白p1、乙型肝炎病毒的表面蛋白(WO 92/11291)、人类乳头状瘤病毒(WO 98/15631)、人类多瘤病毒(Sasnauskas K.等人，Biol.Chem.380(3)：381-386(1999)；Sasnauskas K.等人，Generation of recombinant virus-like particles ofdifferent polyomaviruses in yeast.第三届国际会议“Virus-like particles asvaccines.”Berlin，9月26-29(2001))、RNA噬菌体、Ty、frphage、GA-噬菌体、AP205-噬菌体及尤其Qβ-噬菌体、豇豆褪绿斑驳病毒(Cowpea chlorotic mottle virus)、人类乳头状瘤病毒(HPV)、牛乳头状瘤病毒、猪细小病毒、细小病毒、杯状病毒(例如诺沃克病毒)、兔出血病病毒、动物嗜肝DNA病毒核心抗原VLP。

如对于本领域技术人员将显而易见，欲用作本发明的免疫原性载体的VLP不限于任何特定形式。该颗粒可以化学方式或经由可为自然或非自然的生物过程合成。举例而言，此种类型的实施方案包括病毒样颗粒或其重组形式。在一更特定实施方案中，VLP可包含已知形成VLP的任一病毒的重组多肽或者由此类重组多肽组成。病毒样颗粒可进一步包含此类多肽的一或多个片段以及此类多肽的变体，或者由其组成。在氨基酸水平上，多肽的变体可与其野生型对应物共有例如至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同性。适合用于本发明的变体VLP可来源于任何生物，只要其能够形成“病毒样颗粒”且可用作如本文所定义的“免疫原性载体”即可。

本发明的优选VLP包括HBV的衣壳蛋白或表面抗原(分别为HBcAg及HBsAg)或其重组蛋白质或片段，及RNA-噬菌体的外壳蛋白或其重组蛋白质或片段，更优选为Qβ的外壳蛋白或其重组蛋白质或片段。

在一实施方案中，与本发明的抗原性IgE肽或多肽组合使用的免疫原性载体为HBcAg蛋白。在本发明的情形下可使用的HBcAg蛋白的实例可容易由本领域技术人员判定。实例包括(但不限于)Yuan等人(J.Virol.73：10122-10128(1999))及WO 00/198333、WO 00/177158、WO 00/214478、WO 00/32227、WO 01/85208、WO 02/056905、WO 03/024480及WO03/024481中所述的HBV核心蛋白。适合用于本发明的HBcAg可来源于任何生物，只要其能够形成“病毒样颗粒”且可用作如本文所定义的“免疫原性载体”即可。

在本发明的情形下可使用的备受关注的HBcAg变体为一或多个天然固有半胱氨酸残基缺失或经取代的变体。本领域中熟知，游离半胱氨酸残基可与许多化学副反应有关，包括二硫键交换、与例如在与其它物质的组合治疗中注射或形成的化学物质或代谢物反应、或在曝露于UV光后直接氧化及与核苷酸反应。尤其考虑到HBcAg强烈趋向于结合核酸，因此可产生有毒加合物。此类有毒加合物将因此分布于许多物质之间，其个别地可各自以低浓度存在，但合起来达到毒性水平。鉴于上文，疫苗组合物中使用经修饰以移除天然固有半胱氨酸残基的HBcAg的一个优点在于当连接抗原或抗原决定簇时有毒物质可结合的位点数目将减少或全部消除。

另外，在本发明的情形下亦可使用缺乏乙型肝炎核心抗原前体蛋白的N端前导序列的HBcAg的经加工形式，尤其当在不会进行加工(例如在细菌系统中表达)的条件下产生HBcAg时。

本发明的其它HBcAg变体包括：i)与一种野生型HBcAg氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同性的多肽序列或其亚部分，通常使用已知计算机程序；ii)C端截短的突变体，包括自C端移除1、5、10、15、20、25、30、34或35个氨基酸的突变体；ii)N端截短的突变体，包括自N端移除1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸的突变体；iii)在N端与C端皆截短的突变体，包括自N端移除1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸及自C端移除1、5、10、15、20、25、30、34或35个氨基酸的HBcAg。

在本发明的范畴内的其它HBcAg变体蛋白为经修饰以增强外来表位的免疫原性呈递的变体，其中四个精氨酸重复中的一或多个缺失，但其中C端半胱氨酸得到保留(例如参见WO01/98333)；及嵌合C端截短的HBcAg，诸如WO 02/14478、WO 03/102165及WO 04/053091中所述。

在另一实施方案中，与本发明的抗原性IgE肽或多肽组合使用的免疫原性载体为HBsAg蛋白。在本发明的情形下可使用的HBsAg蛋白可容易由本领域技术人员判定。实例包括(但不限于)US 5792463、WO 02/10416及WO 08/020331中所述的HBV表面蛋白。适合用于本发明的HBsAg可来源于任何生物，只要其能够形成“病毒样颗粒”且可用作如本文所定义的“免疫原性载体”即可。举例而言，亚型adw(参见本文件的实施例部分)。

在又一实施方案中，与本发明的抗原性IgE肽或多肽组合使用的免疫原性载体为Qβ外壳蛋白。

发现Qβ外壳蛋白在大肠杆菌中表达时会自组装成衣壳(Kozlovska TM.等人，GENE137：133-137(1993))。所获得的衣壳或病毒样颗粒显示直径为25nm且具有T＝3准对称性的二十面体噬菌体样衣壳结构。此外，噬菌体Qss的晶体结构已解出。衣壳含有180个外壳蛋白拷贝，其以共价五聚体及六聚体形式由二硫桥连接(Golmohammadi，R.等人，Structure 4：5435554(1996))，引起Qβ外壳蛋白的衣壳的显著稳定性。Qβ衣壳蛋白亦显示对有机溶剂及变性剂的异常抗性。Qβ外壳蛋白的衣壳的高稳定性为有利特征，根据本发明其尤其适用于在哺乳动物及人类的免疫及疫苗接种中。

在本发明的情形下可使用的Qβ外壳蛋白的实例可容易由本领域技术人员判定。实例已充分描述于WO 02/056905、WO 03/024480、WO 03/024481(以全文引用的方式并入本文中)中且包括(但不限于)PIR数据库中所揭示的氨基酸序列，关于Qβ CP为登录号VCBPQβ；关于Qβ A1蛋白为登录号AAA16663；及其变体，包括N端甲硫氨酸经裂解的变体蛋白质；失去多达100、150或180个氨基酸的Qβ A1的C端截短形式；藉由缺失或取代来移除赖氨酸残基或藉由取代或插入来添加赖氨酸残基而修饰的变体蛋白质(例如参见WO 03/024481中所揭示的Qβ-240、Qβ-243、Qβ-250、Qβ-251及Qβ-259，该案以全文引用的方式并入本文中)，及与上述任一Qβ核心蛋白质展现至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同性的变体。适合用于本发明的变体Qβ外壳蛋白可来源于任何生物，只要其能够形成“病毒样颗粒”且可用作如本文所定义的“免疫原性载体”即可。

可经由化学缀合或藉由表达经遗传工程改造的融合配偶体(partner)使本发明的抗原性IgE肽与免疫原性载体偶联。该偶联不一定需要为直接偶联，而可经由接头序列进行。一般而言，在抗原性肽与免疫原性载体融合、缀合或以其它方式连接的情况下，通常在抗原性肽的一端或两端添加间隔或接头序列。此类接头序列一般包含由蛋白酶体、核内体蛋白酶或细胞的其它泡状区室识别的序列。

在一实施方案中，本发明的肽以与免疫原性载体形成的融合蛋白形式表达。肽的融合可藉由插入免疫原性载体一级序列中或藉由与免疫原性载体的N或C端融合来实现。下文中，当提及肽与免疫原性载体的融合蛋白时，涵盖与亚单位序列的任一端融合的融合蛋白或内插入载体序列中的肽。如下文所提及的融合可藉由将抗原性肽插入载体序列中，藉由用抗原性肽取代载体序列的一部分，或藉由组合缺失、取代或插入来实现。

当免疫原性载体为VLP时，嵌合抗原性肽-VLP亚单位一般将能够自组装成VLP。呈现与亚单位融合的表位的VLP在本文中亦称为嵌合VLP。举例而言，EP 0 421 635 B描述使用嵌合嗜肝DNA病毒核心抗原颗粒来呈递病毒样颗粒中的外来肽序列。

可将侧接氨基酸残基添加至抗原性肽序列的任一端以与VLP亚单位序列的任一端融合，或将该肽序列内插入VLP亚单位的序列中。甘氨酸及丝氨酸残基为欲用于添加至欲融合的肽中的侧接序列中的尤其有利的氨基酸。甘氨酸残基赋予额外的柔性，其可减弱将外来序列融合至VLP亚单位序列中的潜在不稳定作用。

在本发明的一特定实施方案中，免疫原性载体为HBcAg VLP。抗原性肽与HBcAg的N端形成的融合蛋白(Neyrinck，S.等人，Nature Med.5：11571163(1999))或在所谓的主要免疫显性(major immunodominant region，MIR)中的插入物已有所描述(Pumpens，P.及Grens，E.，Intervirology 44：98114(2001)，WO 01/98333)，且为本发明的特定实施方案。MIR中有缺失的天然存在的HBcAg变体亦有所描述(Pumpens，P.及Grens，E.，Intervirology44：98-114(2001))，且与N或C端形成的融合物以及在MIR中对应于与wt HBcAg相比为缺失位点的位置处的插入物为本发明的其它实施方案。与C端形成的融合物亦有所描述(Pumpens，P.及Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001))。本领域技术人员将容易获得如何使用典型分子生物学技术构建融合蛋白的指导。编码HBcAg及HBcAg融合蛋白且适用于表达HBcAg及HBcAg融合蛋白的载体及质粒已有所描述(Pumpens，P.及#38；Grens，E.Intervirology 44：98-114(2001)，Neyrinck，S.等人，Nature Med.5：1157-1163(1999))且可用于本发明的实践中。优化自组装的效率及呈现插入HBcAg MIR中的表位的一重要因素是选择插入位点，以及插入后HBcAg序列的MIR中缺失的氨基酸数目(Pumpens，P.及Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001)；EP 0 421 635；美国专利第6,231,864号)，或换言之，来自HBcAg的氨基酸将由新表位取代。举例而言，用外来表位取代HBcAg氨基酸76-80、79-81、79-80、75-85或80-81已有所描述(Pumpens，P.及Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001)；EP0421635；US 6,231,864、WO 00/26385)。HBcAg含有长精氨酸尾(Pumpens，P.及Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001))，其对于衣壳组件为非必需的且能够结合核酸(Pumpens，P.及Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001))。包含或缺乏此精氨酸尾的HBcAg皆为本发明的实施方案。

在本发明的另一特定实施方案中，免疫原性载体为RNA噬菌体的VLP，优选为Qβ。RNA噬菌体的主要外壳蛋白在细菌中及尤其在大肠杆菌中表达后自发地组装成VLP。抗原性肽与Qβ的A1蛋白的截短形式的C端融合或插入A1蛋白中的融合蛋白构建体已有所描述(Kozlovska，T.M.等人，Intervirology，39：9-15(1996))。该A1蛋白藉由在UGA终止密码子处抑制而产生，且若考虑N端甲硫氨酸的裂解，则长度为329aa或328aa。在大肠杆菌中通常发生丙氨酸(由Qβ CP基因编码的第二个氨基酸)前的N端甲硫氨酸的裂解，且Qβ外壳蛋白的N端亦为此情况。A1基因的一部分，UGA琥珀型密码子的3’端编码CP延长部分，其长度为195个氨基酸。在CP延长部分的位置72与73之间插入抗原性肽形成本发明的其它实施方案(Kozlovska，T.M.等人，Intervirology 39：9-15(1996))。抗原性肽融合于C端截短的Qβ A1蛋白的C端形成本发明的其它优选实施方案。举例而言，Kozlovska等人(Intervirology，39：9-15(1996))描述Qβ A1蛋白融合物，其中表位融合于在位置19处截短的Qβ CP延长部分的C端。

如由Kozlovska等人(Intervirology，39：9-15(1996))所述，呈现融合的表位的颗粒的组装通常需要存在A1蛋白-抗原融合物与wt CP以形成镶嵌颗粒。然而，包含病毒样颗粒的实施方案，及由此尤其包含RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP(仅由与抗原性肽融合的VLP亚单位构成)的实施方案亦在本发明的范畴内。

镶嵌颗粒的制造可以多种方法实现。Kozlovska等人，Intervirology，39：9-15(1996)描述三种方法，全部均可用于本发明的实践中。在第一种方法中，在VLP上有效呈现融合的表位藉由在具有编码克隆的UGA抑制tRNA且使得UGA密码子翻译为Trp的质粒(pISM3001质体(Smiley B.K.等人，Gene 134：33-40(1993)))的大肠杆菌菌株中表达编码在CP与CP延长部分之间具有UGA终止密码子的Qβ A11蛋白融合物的质粒来介导。在另一种方法中，CP基因终止密码子经修饰成UAA，且表达A1蛋白-抗原融合物的第二质粒经共转化。该第二质粒编码不同抗生素抗性且复制起点与第一质粒相容。在第三种方法中，CP及A1蛋白-抗原融合物以双顺反子方式编码，可操作地连接于启动子(诸如Trp启动子)，如Kozlovska等人，Intervirology，39：9-15(1996)的图1中所述。

此外，适合于抗原或抗原决定簇融合的VLP描述于WO 03/024481中且包括噬菌体fr、RNA噬菌体MS-2、乳头状瘤病毒的衣壳蛋白、反转录转座子Ty、酵母以及反转录病毒样颗粒、HIV2 Gag、豇豆花叶病毒、细小病毒VP2 VLP、HBsAg(US 4,722,840、EP0020416B1)。适合于本发明的实施的嵌合VLP的实例亦为Intervirology 39：1(1996)中所述的VLP。此外，涵盖用于本发明中的VLP的其它实例为：HPV-1、HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-33、HPV-45、CRPV、COPV、HIV GAG、烟草花叶病毒，SV-40、多瘤病毒、腺病毒、疱疹单纯型病毒、轮状病毒及诺沃克病毒的病毒样颗粒。

对于形成本发明的一部分的任何重组表达的肽或蛋白质，包括与免疫原性载体偶联或不与免疫原性载体偶联的本发明的抗原性IgE肽，编码该肽或蛋白质的核酸亦形成本发明的方面，包含核酸的表达载体及含有该表达载体(自主插入或插入染色体中)的宿主细胞亦形成本发明的方面。藉由使肽或蛋白质在上述宿主细胞中表达来重组产生该肽或蛋白质及自其分离免疫原的方法为本发明的另一方面。本发明不涵盖全长天然IgE分子或编码其的全长天然DNA序列。

在另一实施方案中，使用本领域中熟知的技术，使本发明的肽以化学方式与免疫原性载体偶联。缀合可经由单点缀合(例如N端或C端点)以使肽自由移动或缀合可形成以肽的两端皆与免疫原性载体蛋白质或支架结构(诸如VLP)结合的锁定结构形式。此时经由本领域技术人员已知的缀合化学作用，诸如经由半胱氨酸残基、赖氨酸残基或通常称为缀合点的其它羧基部分(诸如谷氨酸或天冬氨酸)进行缀合。因此，举例而言，直接共价偶联有可能利用碳化二亚胺、戊二醛或N-[y-顺丁烯二酰亚胺基丁酰氧基]丁二酰亚胺酯，使用常见市售的异双功能接头(诸如CDAP及SPDP)(使用制造商的说明书)。肽(尤其环化肽)经由酰肼肽衍生物与蛋白质载体缀合的实例描述于WO 03/092714中。偶联反应后，免疫原可容易藉助于透析方法、凝胶过滤方法、分级分离方法等来分离及纯化。以半胱氨酸残基(优选用在环化区外的接头)终止的肽可以方便地经由顺丁烯二酰亚胺化学作用与载体蛋白质结合。

当免疫原性载体为VLP时，可使具有相同氨基酸序列或不同氨基酸序列的若干抗原性肽与单个VLP分子偶联，如WO 00/32227、WO 03/024481、WO 02/056905及WO 04/007538中所述，优选产生以定向方式呈现若干抗原决定簇的重复及有序结构。

在本发明的一方面中，经由化学交联，通常且优选藉由使用异双功能交联剂，使抗原性肽结合于VLP。若干种异双功能交联剂为本领域所已知。在一些实施方案中，该异双功能交联剂含有可与第一连接位点(亦即与VLP或VLP亚单位的赖氨酸残基的侧链氨基)反应的官能团，及可与优选第二连接位点(亦即与抗原性肽融合且任选亦可用于还原反应的半胱氨酸残基)反应的另一官能团。程序的第一步骤(通常称为衍生)为VLP与交联剂的反应。此反应的产物为活化VLP，亦称为活化载体。在第二步骤中，使用常用方法(诸如凝胶过滤或透析)移除未反应的交联剂。在第三步骤中，使抗原性肽与活化VLP反应，且此步骤通常称为偶联步骤。可任选在第四步骤中移除未反应的抗原性肽，例如藉由透析达成。若干种异双功能交联剂为本领域所已知。这些交联剂包括优选交联剂SMPH(丁二酰亚胺基-6-[β-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺基]己酸酯)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA及例如可得自Pierce Chemical Company(Rockford，IL，USA)且具有一个针对氨基具反应性的官能团及一个针对半胱氨酸残基具反应性的官能团的其它交联剂。上述交联剂均形成硫醚键。

另一类适合于本发明的实施的交联剂的特征为在偶联后在抗原性肽与VLP之间引入二硫键。属于此类的优选交联剂包括例如SPDP及Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。用交联剂衍生VLP的程度可受不同实验条件影响，诸如各反应配偶体的浓度、一种试剂相对于另一种试剂的过量、pH值、温度及离子强度。偶联度(亦即每VLP亚单位的抗原性肽量)可藉由改变上述实验条件来调整以符合疫苗要求。

另一种使抗原性肽结合于VLP的方法为将VLP表面上的赖氨酸残基与抗原性肽上的半胱氨酸残基连接。在一些实施方案中，可能需要作为第二连接位点或作为其一部分的含有半胱氨酸残基的氨基酸接头与抗原性肽融合以与VLP偶联。一般而言，柔性氨基酸接头为有利的。氨基酸接头的实例选自由以下组成的组：(a)CGG；(b)N端γ1-接头；(c)N端γ3-接头；(d)Ig铰链区；(e)N端甘氨酸接头；(f)(G)kC(G)n，其中n＝0-12且k＝0-5；(g)N端甘氨酸-丝氨酸接头；(h)(G)kC(G)m(S)i(GGGGS)n，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，i＝0-2；(i)GGC；(k)GGC-NH₂；(l)C端γ1-接头；(m)C端γ3-接头；(n)C端甘氨酸接头；(o)(G)nC(G)k，其中n＝0-12且k＝0-5；(p)C端甘氨酸-丝氨酸接头；(q)(G)m(S)t(GGGGS)n(G)oC(G)k，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，t＝0-2，且o＝0-8。氨基酸接头的其它实例为免疫球蛋白的铰链区、甘氨酸丝氨酸接头(GGGGS)n及甘氨酸接头(G)n，全部均进一步含有半胱氨酸残基作为第二连接位点且任选含有其它甘氨酸残基。通常，此类氨基酸接头的优选实例为N端γ1：CGDKTHTSPP；C端γ1：DKTHTSPPCG；N端γ3：CGGPKPSTPPGSSGGAP；C端γ3：PKPSTPPGSSGGAPGGCG；N端甘氨酸接头：GCGGGG；及C端甘氨酸接头：GGGGCG。

当疏水性抗原性肽结合于VLP时，尤其适合于本发明的实践中的其它氨基酸接头为CGKKGG或CGDEGG(用于N端接头)，或GGKKGC及GGEDGC(用于C端接头)。对于C端接头，末端半胱氨酸任选C端经酰胺化。

在本发明的一些实施方案中，肽的C端处的GGCG、GGC或GGC-NH₂(“NH₂”表示酰胺化)接头或其N端处的CGG优选作为氨基酸接头。一般而言，甘氨酸残基将插入庞大(bulky)氨基酸与欲用作第二连接位点的半胱氨酸之间，以避免庞大氨基酸在偶联反应中的潜在位阻。在本发明的另一实施方案中，氨基酸接头GGC-NH₂与抗原性肽的C端融合。

抗原性肽上存在的半胱氨酸残基必须呈其还原态以与活化VLP上的异双功能交联剂反应，亦即游离半胱氨酸或具有游离氢硫基的半胱氨酸残基必须为可用的。在充当结合位点的半胱氨酸残基呈氧化形式的情况下，例如，若其形成二硫桥，则需要用例如DTT、TCEP或对巯基乙醇还原此二硫桥。如WO 02/05690中所述，低浓度的还原剂与偶联相容，较高浓度抑制偶联反应，如本领域技术人员所已知，在该情况下在偶联之前必须例如藉由透析、凝胶过滤或反相HPLC移除还原剂或降低其浓度。

根据上述方法藉由使用异双功能交联剂使抗原性肽结合于VLP使得抗原性肽以定向方式与VLP偶联。其它使抗原性肽结合于VLP的方法包括使用碳化二亚胺EDC及NHS使抗原性肽与VLP交联的方法。

在其它方法中，使用诸如戊二醛、DSGBM[PEO]4、BS3(Pierce Chemical Company，Rockford，IL，USA)的同双功能交联剂或具有针对VLP的氨基或羧基具反应性的官能团的其它已知同双功能交联剂使抗原性肽连接于VLP。

其它使VLP结合于抗原性肽的方法包括VLP经生物素化且抗原性肽表达为抗生蛋白链菌素-融合蛋白的方法，或抗原性肽与VLP两者皆经生物素化的方法，例如如WO 00/23955中所述。在此情况下，可首先藉由调整抗原性肽与抗生蛋白链菌素的比率而使抗原性肽结合于抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白，以致游离结合位点仍可用于结合VLP，其在下一步骤中添加。或者，所有组份均可在“一锅”反应中混合。其它配体-受体对，如果可溶形式的受体及配体可用，并能交联至VLP或抗原性肽，可用作结合剂以使抗原性肽结合于VLP。或者，该配体或该受体可与抗原性肽融合，且因此分别介导以化学方式结合或融合于受体或配体的VLP的结合。融合亦可藉由插入或取代来实现。

一个或若干个抗原分子可连接于RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳或VLP的一个亚单位，若空间上允许，则优选经由RNA噬菌体的VLP的暴露赖氨酸残基来连接。因此，RNA噬菌体的外壳蛋白的VLP及尤其QP外壳蛋白VLP的一特定特征是可能每个亚单位偶联若干个抗原。此使得产生密集抗原阵列。

在本发明的一实施方案中，至少一个抗原或或抗原决定簇分别与病毒样颗粒的结合及连接分别经由病毒样颗粒的至少一个第一连接位点与抗原性肽的至少一个第二连接之间的相互作用及缔合来进行。

Q外壳蛋白的VLP或衣壳在其表面上呈现确定数目的赖氨酸残基，其中三个赖氨酸残基的确定拓扑结构对着衣壳内部且与RNA相互作用，而其它四个赖氨酸残基暴露于衣壳外部。这些确定性质有利于使抗原连接于颗粒外部，而非赖氨酸残基与RNA相互作用的颗粒内部。其它RNA噬菌体外壳蛋白的VLP亦在其表面上具有确定数目的赖氨酸残基及这些赖氨酸残基的确定拓扑结构。

在本发明的另一实施方案中，该第一连接位点为赖氨酸残基且/或该第二连接包含氢硫基或半胱氨酸残基。在本发明的另一实施方案中，第一连接位点为赖氨酸残基且/或第二连接为半胱氨酸残基。在本发明的其它实施方案中，抗原或抗原决定簇经由半胱氨酸残基结合于RNA噬菌体外壳蛋白的VLP的赖氨酸残基，及尤其结合于Qβ外壳蛋白的VLP。

来源于RNA噬菌体的VLP的另一优点为其在细菌中的高表达产量，此使得在可承受的成本下产生大量物质。此外，使用VLP作为载体使得分别形成具有可变抗原密度的稳固抗原阵列及缀合物。详言之，使用RNA噬菌体的VLP及由此尤其使用RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP可达到极高表位密度。

在本发明的一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物可包含免疫原性缀合物的混合物，亦即与本发明的一个或若干个抗原性IgE肽偶联的免疫原性载体。因此，这些免疫原性组合物可由氨基酸序列不同的免疫原性载体构成。举例而言，可制备包含“野生型”VLP及经修饰的VLP蛋白的疫苗组合物，其中一或多个氨基酸残基已改变(例如缺失、插入或取代)。或者，可使用相同的免疫原性载体但与不同氨基酸序列的抗原性IgE肽偶联。

因此，本发明亦关于产生本发明的免疫原的方法，其包含i)提供本发明的抗原性IgE肽、ii)提供本发明的免疫原性载体(优选为VLP)及iii)组合该抗原性IgE肽与该免疫原性载体。在一实施方案中，该组合步骤经由化学交联，优选经由异双功能交联剂进行。

在另一实施方案中，本发明的抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429及430。优选地，该抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、365、366、367、368、369、370、371、372、373、376、377、378、379、380、381、382、383、386、387、388、389、390、391、392、395、396、397、398、399、400、403、404、405、406、407、410、411、412、413、416、417、418、421、422及425。更优选地，该抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、326、327、328、329、330、331、332、333、334、340、341、342、343、344、345、346、347、353、354、355、356、357、358、359、365、366、367、368、369、370、376、377、378、379、380、386、387、388、389、395、396、397、403、404及410。甚至更优选地，该抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、326、327、328、329、330、331、340、341、342、343、344、353、354、355、356、365、366、367、376、377及386。甚至更优选地，该抗原性IgE肽由选自SEQ ID No：311、312、313、314、326、327、328、340、341及353的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。甚至更优选地，该抗原性IgE肽由选自SEQ ID No：311、312及326的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。最优选地，该抗原性IgE肽由SEQ ID No：311或312的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。

在本发明的一实施方案中，本文所揭示的抗原性IgE肽连接于免疫原性载体分子。在一实施方案中，该免疫原性载体选自由本文所述的任一免疫原性载体组成的组。在另一实施方案中，该免疫原性载体选自由以下组成的组：血清白蛋白，诸如牛血清白蛋白(BSA)；球蛋白；甲状腺球蛋白；血红蛋白；血蓝蛋白(尤其匙孔血蓝蛋白[KLH])及病毒样颗粒(VLP)。在一优选实施方案中，该免疫原性载体为匙孔血蓝蛋白或病毒样颗粒(VLP)。在一甚至优选实施方案中，该免疫原性载体为选自由HBcAgVLP、HBsAg VLP、Qβ VLP或本文所揭示的任何变体组成的组的VLP。在一甚至优选实施方案中，该免疫原性载体为选自由Qβ CP、QβA1、Qβ-240、Qβ-243、Qβ-250、Qβ-251及Qβ-259(WO 03/024481中揭示)组成的组的QβVLP。

在一实施方案中，该免疫原性载体直接或经由接头共价连接于本文所揭示的抗原性IgE肽。在一实施方案中，藉由表达如本文所述的融合蛋白，使该免疫原性载体连接于本文所揭示的抗原性IgE肽。在另一实施方案中，经由如本文所述的化学交联及优选藉由使用异双功能交联剂，使本文所揭示的抗原性IgE肽连接于免疫原性载体(优选为VLP)。若干种异双功能交联剂为本领域所已知。在一些实施方案中，该异双功能交联剂含有可与第一连接位点(亦即与VLP或VLP亚单位的赖氨酸残基的侧链氨基)反应的官能团，及可与优选第二连接位点(亦即与抗原性肽融合且可用于还原反应的半胱氨酸残基)反应的另一官能团。

因此，在本发明的一实施方案中，本文所揭示的抗原性IgE肽在其N端或在其C端或在N端与C端进一步包含能够在化学交联反应中与免疫原性载体的连接位点反应的接头。在一实施方案中，本文所揭示的抗原性IgE肽在其C端进一步包含具有式(G)_nC的接头，其中n为选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10，优选选自0、1、2、3、4及5，更优选选自0、1、2及3的整数，n最优选为0或1(当n等于0时，该式表示半胱氨酸)。优选地，本文所揭示的抗原性IgE肽在其C端进一步包含具有式GGGC、GGC、GC或C的接头。

在本发明的另一具体实例中，本文所揭示的抗原性IgE肽在其N端进一步包含具有式C(G)_n的接头，其中n为选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10，优选选自0、1、2、3、4及5，更优选选自0、1、2及3的整数，n最优选为0或1(当n等于0时，该式表示半胱氨酸)。优选地，本文所揭示的抗原性IgE肽在其N端进一步包含具有式CGGG、CGG、CG或C的接头。

在另一实施方案中，本文所揭示的抗原性IgE肽在其N端进一步包含具有式GGGC、GGC、GC或C的接头。

在另一实施方案中，本文所揭示的抗原性IgE肽在其C端进一步包含具有式(G)_nC的接头，其中n为选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10，优选选自0、1、2、3、4及5、更优选选自0、1、2及3的整数，n最优选为0或1(当n等于0时，该式表示半胱氨酸)，且在其N端进一步包含具有式C(G)_n的接头，其中n为选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10，优选选自0、1、2、3、4及5，更优选选自0、1、2及3的整数，n最优选为0或1(当n等于0时，该式表示半胱氨酸)。优选地，本文所揭示的抗原性IgE肽在其N端进一步包含具有式GGGC、GGC、GC或C的接头且在其C端进一步包含具有式GGGC、GGC、GC或C的接头。更优选地，本文所揭示的抗原性IgE肽在其N端进一步包含半胱氨酸且在其C端进一步包含半胱氨酸。

进一步包含该接头的此类抗原性IgE肽的代表以SEQ ID NO：434、436、437、438及439揭示。在本发明的一实施方案中，包含接头的抗原性IgE肽为表9中所揭示的任一肽。

在IgE抗原性肽的N端和/或C端添加的半胱氨酸残基可用于通常且优选使用异双功能交联剂进行的还原反应(化学交联)。若干种异双功能交联剂为本领域所已知。在一些实施方案中，进一步包含本文所述的接头的IgE抗原性肽与VLP的赖氨酸残基的侧链氨基交联。

因此，在一实施方案中，进一步包含上述接头的IgE抗原性肽与免疫原性载体(尤其与VLP，优选为HBcAg VLP、HBsAg VLP或Qβ VLP)交联。程序的第一步骤(通常称为衍生)为VLP与交联剂的反应。此反应的产物为活化VLP，亦称为活化载体。在第二步骤中，使用常用方法(诸如凝胶过滤或透析)移除未反应的交联剂。在第三步骤中，使抗原性肽与活化VLP反应，且此步骤通常称为偶联步骤。可任选在第四步骤中移除未反应的抗原性肽，例如藉由透析达成。若干种异双功能交联剂为本领域所已知。这些交联剂包括优选交联剂SMPH(丁二酰亚胺基-6-[β-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺基]己酸酯)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA及例如可得自Pierce Chemical Company(Rockford，IL，USA)且具有一个针对氨基具反应性的官能团及一个针对半胱氨酸残基具反应性的官能团的其它交联剂。上述交联剂均形成硫醚键。

在一实施方案中，本发明涉及包含抗原性IgE的免疫原，该抗原性IgE由SEQ IDNo：1、2、3、18、19或34、最优选SEQ ID No：1或18的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成，其中该抗原性IgE在其C端进一步包含半胱氨酸，该抗原性IgE经由硫醚键以化学方式与病毒样颗粒交联。在一优选实施方案中，该VLP选自由HBcAg、HBsAg及Qβ组成的组。该VLP优选为Qβ，甚至更优选为SEQ ID NO：435的Qβ。

在一实施方案中，本发明涉及包含抗原性IgE的免疫原，该抗原性IgE由SEQ IDNo：1、2、3、18、19或34、最优选SEQ ID No：1或18的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成，其中该抗原性IgE在其N端进一步包含半胱氨酸，该抗原性IgE经由硫醚键以化学方式与病毒样颗粒交联。在一优选实施方案中，该VLP选自由HBcAg、HBsAg及Qβ组成的组。该VLP优选为Qβ，甚至更优选为SEQ ID NO：435的Qβ。

在一实施方案中，本发明涉及包含抗原性IgE的免疫原，该抗原性IgE由SEQ IDNo：154、155、156、165、166及175、最优选SEQ ID No：154或165的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成，其中该抗原性IgE在其C端进一步包含半胱氨酸，该抗原性IgE经由硫醚键以化学方式与病毒样颗粒交联。在一优选实施方案中，该VLP选自由HBcAg、HBsAg及Qβ组成的组。该VLP优选为Qβ，甚至更优选为SEQ ID NO：435的Qβ。

在一实施方案中，本发明涉及包含抗原性IgE的免疫原，该抗原性IgE由SEQ IDNo：154、155、156、165、166及175、最优选SEQ ID No：154或165的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成，其中该抗原性IgE在其N端进一步包含半胱氨酸，该抗原性IgE经由硫醚键以化学方式与病毒样颗粒交联。在一优选实施方案中，该VLP选自由HBcAg、HBsAg及Qβ组成的组。该VLP优选为Qβ，甚至更优选为SEQ ID NO：435的Qβ。

在一实施方案中，本发明涉及包含抗原性IgE的免疫原，该抗原性IgE由SEQ IDNo：220、221、222、233、234及245、最优选SEQ ID No：220或233的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成，其中该抗原性IgE在其C端进一步包含半胱氨酸，该抗原性IgE经由硫醚键以化学方式与病毒样颗粒交联。在一优选实施方案中，该VLP选自由HBcAg、HBsAg及Qβ组成的组。该VLP优选为Qβ，甚至更优选为SEQ ID NO：435的Qβ。

在一实施方案中，本发明涉及包含抗原性IgE的免疫原，该抗原性IgE由SEQ IDNo：220、221、222、233、234及245、最优选SEQ ID No：220或233的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成，其中该抗原性IgE在其N端进一步包含半胱氨酸，该抗原性IgE经由硫醚键以化学方式与病毒样颗粒交联。在一优选实施方案中，该VLP选自由HBcAg、HBsAg及Qβ组成的组。该VLP优选为Qβ，甚至更优选为SEQ ID NO：435的Qβ。

在一实施方案中，本发明涉及包含抗原性IgE的免疫原，该抗原性IgE由SEQ IDNo：311、312及326、最优选SEQ ID No：311或312的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成，其中该抗原性IgE在其C端进一步包含半胱氨酸，该抗原性IgE经由硫醚键以化学方式与病毒样颗粒交联。在一优选实施方案中，该VLP选自由HBcAg、HBsAg及Qβ组成的组。该VLP优选为Qβ，甚至更优选为SEQ ID NO：435的Qβ。

在一实施方案中，本发明涉及包含抗原性IgE的免疫原，该抗原性IgE由SEQ IDNo：311、312及326、最优选SEQ ID No：311或312的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成，其中该抗原性IgE在其N端进一步包含半胱氨酸，该抗原性IgE经由硫醚键以化学方式与病毒样颗粒交联。在一优选实施方案中，该VLP选自由HBcAg、HBsAg及Qβ组成的组。该VLP优选为Qβ，甚至更优选为SEQ ID NO：435的Qβ。

在一实施方案中，本发明涉及包含抗原性IgE的免疫原，该抗原性IgE由SEQ IDNo：311、312及326、最优选SEQ ID No：311或312的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。优选地，该抗原性IgE在其C端进一步包含GC接头，优选为具有式GGC的接头(优选地，该在其C端包含GC接头的抗原性IgE肽由SEQ ID No：457的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成)，使用SMPH(丁二酰亚胺基-6-[β-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺基]己酸酯)作为交联剂，该抗原性IgE经由硫醚键以化学方式与病毒样颗粒交联，该键位于VLP的赖氨酸残基与该C端接头的半胱氨酸残基之间。在一优选实施方案中，该VLP选自由HBcAg、HBsAg及Qβ组成的组。该VLP优选为Qβ，甚至更优选为SEQ ID NO：435的Qβ。

在一实施方案中，本发明涉及包含抗原性IgE的免疫原，该抗原性IgE由SEQ IDNo：220、221、233、234、244及246、最优选SEQ ID No：220或233的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成，该抗原性IgE经由硫醚键以化学方式与病毒样颗粒交联，该键位于VLP的赖氨酸残基与该抗原性IgE肽的半胱氨酸残基之间。在该实施方案中，经由如本文所述的化学交联及优选藉由使用异双功能交联剂，使本文所揭示的抗原性IgE肽连接于免疫原性载体(优选为VLP)。若干种异双功能交联剂为本领域所已知。在一些实施方案中，该异双功能交联剂含有可与第一连接位点(亦即VLP或VLP亚单位的赖氨酸残基的侧链氨基)反应的官能团，及可与优选第二连接位点(亦即可用于还原反应的抗原性肽的半胱氨酸残基)反应的另一官能团。在一优选实施方案中，该VLP选自由HBcAg、HBsAg及Qβ组成的组。该VLP优选为Qβ，甚至更优选为SEQ ID NO：435的Qβ。

在一实施方案中，本发明涉及包含抗原性IgE的免疫原，该抗原性IgE由SEQ IDNo：220的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成，使用SMPH(丁二酰亚胺基-6-[β-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺基]己酸酯)作为交联剂，该抗原性IgE经由硫醚键以化学方式与病毒样颗粒交联，该键位于VLP的赖氨酸残基与该抗原性IgE肽的半胱氨酸残基之间。在一优选实施方案中，该VLP选自由HBcAg、HBsAg及Qβ组成的组。该VLP优选为Qβ，甚至更优选为SEQ ID NO：435的Qβ。

在一特定实施方案中，当本文所揭示的抗原性IgE肽的序列包含半胱氨酸时，该抗原性IgE肽直接经由该半胱氨酸共价连接于免疫原性载体。在该实施方案中，经由如本文所述的化学交联及优选藉由使用异双功能交联剂，使本文所揭示的抗原性IgE肽连接于免疫原性载体(优选为VLP)。若干种异双功能交联剂为本领域所已知。在一些实施方案中，该异双功能交联剂含有可与第一连接位点(亦即VLP或VLP亚单位的赖氨酸残基的侧链氨基)反应的官能团，及可与优选第二连接位点(亦即与抗原性肽融合且可用于还原反应的半胱氨酸残基)反应的另一官能团。因此，在一些实施方案中，当本文所揭示的抗原性IgE肽的序列包含半胱氨酸时，该抗原性IgE肽经由硫醚键以化学方式与免疫原性载体交联，该键位于免疫原性载体的赖氨酸残基与该抗原性IgE的半胱氨酸残基之间。在一优选实施方案中，该免疫原性载体为VLP，优选为Qβ病毒样颗粒(甚至更优选为SEQ ID NO：435的Qβ)。

在另一方面中，本发明涉及包含至少两种本文所述的免疫原的组合物。在一实施方案中，本发明涉及包含至少两种免疫原的组合物，其中这些免疫原各包含连接于免疫原性载体的本文所揭示的抗原性IgE肽。在一实施方案中，该组合物包含两种、三种、四种或五种本发明的免疫原，其中这些免疫原各包含连接于免疫原性载体的本文所揭示的抗原性IgE肽。

优选地，各抗原性IgE肽单独地连接于免疫原性载体的不同分子(各免疫原性载体分子仅结合有一种类型的抗原性IgE肽)。在该实施方案中，认为抗原性IgE肽单独地与该免疫原性载体缀合。

在一实施方案中，本发明涉及包含两种免疫原或由两种免疫原组成的组合物，这些免疫原各包含连接于免疫原性载体的本文所揭示的抗原性IgE肽。各抗原性IgE肽优选单独地与该免疫原性载体缀合。

在一实施方案中，第一免疫原的抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成：SEQID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152及153；优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、88、89、90、91、92、93、94、95、96、99、100、101、102、103、104、105、106、109、110、111、112、113、114、115、118、119、120、121、122、123、126、127、128、129、130、133、134、135、136、139、140、141、144、145及148；更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、49、50、51、52、53、54、55、56、57、63、64、65、66、67、68、69、70、76、77、78、79、80、81、82、88、89、90、91、92、93、99、100、101、102、103、109、110、111、112、118、119、120、126、127、133及139；甚至更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、18、19、20、21、22、23、24、25、34、35、36、37、38、39、40、49、50、51、52、53、54、63、64、65、66、67、76、77、78、79、88、89、90、99、100、101及109；甚至更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、18、19、20、21、22、34、35、36、37、49、50、51、63、64及76；甚至更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：1、2、3、18、19及34；该抗原性IgE肽最优选由SEQ ID NO：1或18的氨基酸序列组成。

在一实施方案中，第二免疫原的抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成：SEQID No：154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218及219；优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：154、155、156、157、158、159、160、161、162、165、166、167、168、169、170、171、172、175、176、177、178、179、180、181、184、185、186、187、188、189、192、193、194、195、196、199、200、201、202、205、206、207、210、211、214及217；更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：154、155、156、157、158、159、165、166、167、168、169、175、176、177、178、184、185、186、192、193、199及200；甚至更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：154、155、156、165、166及175；该抗原性IgE肽最优选由SEQ ID No：154或165的氨基酸序列组成。

在另一实施方案中，第二免疫原的抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309及310；优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、245、246、247、248、249、250、251、252、253、256、257、258、259、260、261、262、263、266、267、268、269、270、271、272、275、276、277、278、279、280、283、284、285、286、287、290、291、292、293、296、297、298、301、302及305；更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、225、226、227、233、234、235、236、237、238、239、245、246、247、248、249、250、256、257、258、259、260、266、267、268、269、275、276、277、283、284及290；甚至更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ IDNo：220、221、222、223、224、233、234、235、236、245、246、247、256、257及266；甚至更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：220、221、222、233、234及245；该抗原性IgE肽最优选由SEQ ID No：220或233的氨基酸序列组成。

在另一实施方案中，第二免疫原的抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429及430；优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ IDNo：311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、365、366、367、368、369、370、371、372、373、376、377、378、379、380、381、382、383、386、387、388、389、390、391、392、395、396、397、398、399、400、403、404、405、406、407、410、411、412、413、416、417、418、421、422及425；更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、326、327、328、329、330、331、332、333、334、340、341、342、343、344、345、346、347、353、354、355、356、357、358、359、365、366、367、368、369、370、376、377、378、379、380、386、387、388、389、395、396、397、403、404及410；甚至更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、326、327、328、329、330、331、340、341、342、343、344、353、354、355、356、365、366、367、376、377及386；甚至更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ IDNo：311、312、313、314、326、327、328、340、341及353；甚至更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：311、312及326；该抗原性IgE肽最优选由SEQ ID No：311或312的氨基酸序列组成。

在一实施方案中，本发明涉及包含两种免疫原或由两种免疫原组成的组合物，这些免疫原各包含连接于免疫原性载体的抗原性IgE肽，其中第一免疫原的抗原性IgE肽由SEQ ID No：1的氨基酸序列组成且第二免疫原的抗原性IgE肽由SEQ ID No：165组成。在另一实施方案中，第一免疫原的抗原性IgE肽由SEQ ID No：1的氨基酸序列组成且第二免疫原的抗原性IgE肽由SEQ ID No：220的氨基酸序列组成。在另一实施方案中，第一免疫原的抗原性IgE肽由SEQ ID No：1的氨基酸序列组成且第二免疫原的抗原性IgE肽由SEQ ID No：312的氨基酸序列组成。各抗原性IgE肽优选单独地与该免疫原性载体缀合。

在一实施方案中，本发明涉及包含两种免疫原或由两种免疫原组成的组合物，这些免疫原各包含连接于免疫原性载体的本文所揭示的抗原性IgE肽。各抗原性IgE肽优选单独地与该免疫原性载体缀合。在一实施方案中，第一免疫原的抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218及219；优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：154、155、156、157、158、159、160、161、162、165、166、167、168、169、170、171、172、175、176、177、178、179、180、181、184、185、186、187、188、189、192、193、194、195、196、199、200、201、202、205、206、207、210、211、214及217；更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：154、155、156、157、158、159、165、166、167、168、169、175、176、177、178、184、185、186、192、193、199及200；甚至更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQID No：154、155、156、165、166及175；该抗原性IgE肽最优选由SEQ ID No：154或165的氨基酸序列组成。

在一实施方案中，第二免疫原的抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成：SEQID No：220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309及310；优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、245、246、247、248、249、250、251、252、253、256、257、258、259、260、261、262、263、266、267、268、269、270、271、272、275、276、277、278、279、280、283、284、285、286、287、290、291、292、293、296、297、298、301、302及305；更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、225、226、227、233、234、235、236、237、238、239、245、246、247、248、249、250、256、257、258、259、260、266、267、268、269、275、276、277、283、284及290；甚至更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、233、234、235、236、245、246、247、256、257及266；甚至更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：220、221、222、233、234及245；该抗原性IgE肽最优选由SEQ ID No：220或233的氨基酸序列组成。

在一实施方案中，本发明涉及包含两种免疫原或由两种免疫原组成的组合物，这些免疫原各包含连接于免疫原性载体的抗原性IgE肽，其中第一免疫原的抗原性IgE肽由SEQ ID No：165的氨基酸序列组成且第二免疫原的抗原性IgE肽由SEQ ID No：220组成。在另一实施方案中，第一免疫原的抗原性IgE肽由SEQ ID No：165的氨基酸序列组成且第二免疫原的抗原性IgE肽由SEQ ID No：312的氨基酸序列组成。各抗原性IgE肽优选单独地与该免疫原性载体缀合。

在一实施方案中，本发明涉及包含两种免疫原或由两种免疫原组成的组合物，这些免疫原各包含连接于免疫原性载体的本文所揭示的抗原性IgE肽。各抗原性IgE肽优选单独地与该免疫原性载体缀合。在一实施方案中，第一免疫原的抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309及310；优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、245、246、247、248、249、250、251、252、253、256、257、258、259、260、261、262、263、266、267、268、269、270、271、272、275、276、277、278、279、280、283、284、285、286、287、290、291、292、293、296、297、298、301、302及305；更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、225、226、227、233、234、235、236、237、238、239、245、246、247、248、249、250、256、257、258、259、260、266、267、268、269、275、276、277、283、284及290；甚至更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：220、221、222、223、224、233、234、235、236、245、246、247、256、257及266；甚至更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：220、221、222、233、234及245；该抗原性IgE肽最优选由SEQ ID No：220或233的氨基酸序列组成。

在一实施方案中，第二免疫原的抗原性IgE肽由选自以下的氨基酸序列组成：SEQID No：311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429及430；优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、365、366、367、368、369、370、371、372、373、376、377、378、379、380、381、382、383、386、387、388、389、390、391、392、395、396、397、398、399、400、403、404、405、406、407、410、411、412、413、416、417、418、421、422及425；更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、326、327、328、329、330、331、332、333、334、340、341、342、343、344、345、346、347、353、354、355、356、357、358、359、365、366、367、368、369、370、376、377、378、379、380、386、387、388、389、395、396、397、403、404及410；甚至更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：311、312、313、314、315、316、317、326、327、328、329、330、331、340、341、342、343、344、353、354、355、356、365、366、367、376、377及386；甚至更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：311、312、313、314、326、327、328、340、341及353；甚至更优选由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：311、312及326；该抗原性IgE肽最优选由SEQ ID No：311或312的氨基酸序列组成。

在一实施方案中，本发明涉及包含两种免疫原或由两种免疫原组成的组合物，这些免疫原各包含连接于免疫原性载体的抗原性IgE肽，其中第一免疫原的抗原性IgE肽由SEQ ID No：220的氨基酸序列组成且第二免疫原的抗原性IgE肽由SEQ ID No：312组成。各抗原性IgE肽优选单独地与该免疫原性载体缀合。

根据本发明的一实施方案，以上本文所揭示的组合物的免疫原直接或经由本文所揭示的接头连接于免疫原性载体(优选以化学方式交联)。在一实施方案中，该免疫原性载体为匙孔血蓝蛋白[KLH]或病毒样颗粒(VLP)。在一优选实施方案中，该免疫原性载体为选自由HBcAg VLP、HBsAg VLP、Qβ VLP或本文所揭示的任何变体组成的组的VLP。在一甚至优选实施方案中，该免疫原性载体为选自由Qβ CP、Qβ A1、Qβ-240、Qβ-243、Qβ-250、Qβ-251及Qβ-259组成的组的Qβ VLP。

在一实施方案中，本发明涉及包含两种免疫原或由两种免疫原组成的组合物，这些免疫原各包含连接于免疫原性载体的本文所揭示的抗原性IgE肽。在一实施方案中，第一免疫原由包含抗原性IgE的免疫原组成，该抗原性IgE由SEQ ID No：220、221、233、234、244及246、最优选SEQ ID No：220或233的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成，该抗原性IgE经由硫醚键以化学方式与Qβ病毒样颗粒(更优选为SEQ ID NO：435的Qβ)交联，该键位于VLP的赖氨酸残基与该抗原性IgE肽的半胱氨酸残基之间，且第二免疫原由包含抗原性IgE的免疫原组成，该抗原性IgE由SEQ ID No：311、312及326、最优选SEQ ID No：311或312的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成，其中该抗原性IgE在其C端进一步包含半胱氨酸，该抗原性IgE以化学方式与Qβ病毒样颗粒(更优选为SEQ ID NO：435的Qβ)交联。各抗原性IgE肽优选单独地与该免疫原性载体缀合。

在一实施方案中，本发明涉及包含两种免疫原或由两种免疫原组成的组合物，这些免疫原各包含连接于免疫原性载体的本文所揭示的抗原性IgE肽。在一实施方案中，第一免疫原由包含抗原性IgE的免疫原组成，该抗原性IgE由SEQ ID No：220、221、233、234、244及246、最优选SEQ ID No：220或233的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成，该抗原性IgE经由硫醚键以化学方式与Qβ病毒样颗粒(更优选为SEQ ID NO：435的Qβ)交联，该键位于VLP的赖氨酸残基与该抗原性IgE肽的半胱氨酸残基之间，第二免疫原由包含抗原性IgE的免疫原组成，该抗原性IgE由SEQ ID No：1、2、3、18、19或34、最优选SEQ ID No：1或18的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成，其中该抗原性IgE在其C端进一步包含半胱氨酸，该抗原性IgE以化学方式与Qβ病毒样颗粒(更优选为SEQ ID NO：435的Qβ)交联。各抗原性IgE肽优选单独地与该免疫原性载体缀合。

在一实施方案中，本发明涉及包含三种免疫原或由三种免疫原组成的组合物，这些免疫原各包含连接于免疫原性载体的本文所揭示的抗原性IgE肽。在一实施方案中，第一免疫原由包含抗原性IgE的免疫原组成，该抗原性IgE由SEQ ID No：220、221、233、234、244及246、最优选SEQ ID No：220或233的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成，该抗原性IgE经由硫醚键以化学方式与Qβ病毒样颗粒(更优选为SEQ ID NO：435的Qβ)交联，该键位于VLP的赖氨酸残基与该抗原性IgE肽的半胱氨酸残基之间，第二免疫原由包含抗原性IgE的免疫原组成，该抗原性IgE由SEQ ID No：311、312及326、最优选SEQ ID No：311或312的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成，其中该抗原性IgE在其C端进一步包含半胱氨酸，该抗原性IgE以化学方式与Qβ病毒样颗粒(更优选为SEQ ID NO：435的Qβ)交联，且第三免疫原由包含抗原性IgE的免疫原组成，该抗原性IgE由SEQ ID No：1、2、3、18、19或34、最优选SEQ ID No：1或18的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成，其中该抗原性IgE在其C端进一步包含半胱氨酸，该抗原性IgE以化学方式与Qβ病毒样颗粒(更优选为SEQID NO：435的Qβ)交联。各抗原性IgE肽优选单独地与该免疫原性载体缀合。

在一实施方案中，本发明涉及包含两种免疫原或由两种免疫原组成的组合物，这些免疫原各包含单独地与免疫原性载体缀合的本文所揭示的抗原性IgE肽。在一实施方案中，第一免疫原由包含抗原性IgE肽的免疫原组成，该抗原性IgE肽由SEQ ID No：220、221、233、234、244及246、最优选SEQ ID No：220或233的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。使用SMPH(丁二酰亚胺基-6-[β-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺基]己酸酯)作为交联剂，该第一抗原性IgE肽优选经由硫醚键以化学方式与Qβ病毒样颗粒(更优选为SEQ ID NO：435的Qβ)交联，该键位于VLP的赖氨酸残基与该抗原性IgE肽的半胱氨酸残基之间。优选地，第二免疫原由包含抗原性IgE肽的免疫原组成，该抗原性IgE肽由SEQ ID No：311、312或326、最优选SEQ ID No：311或312的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。优选地，该第二抗原性IgE肽在其C端进一步包含GC接头，优选为具有式GGC的接头(优选地，该在其C端包含GC接头的第二抗原性IgE肽由SEQ ID No：457的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成)，使用SMPH(丁二酰亚胺基-6-[β-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺基]己酸酯)作为交联剂，该肽经由硫醚键以化学方式与病毒样颗粒交联，该键位于VLP的赖氨酸残基与该C端接头的半胱氨酸残基之间。在一优选实施方案中，该VLP选自由HBcAg、HBsAg及Qβ组成的组。该VLP优选为Qβ，甚至更优选为SEQ ID NO：435的Qβ。

在一实施方案中，本发明涉及包含两种、三种、四种或四种以上免疫原或由两种、三种、四种或四种以上免疫原组成的组合物，其中这些免疫原各包含连接于免疫原性载体的抗原性IgE肽且其中该抗原性IgE肽由选自由以下的氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成：SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429及430。在一实施方案中，该抗原性IgE肽连接于同一免疫原性载体。在另一实施方案中，该抗原性IgE肽连接于不同免疫原性载体，然后混合。产生本发明的免疫原的方法

本发明进一步涉及一种产生本文所揭示的免疫原的方法。在一实施方案中，该免疫原包含至少一种连接于本文所揭示的免疫原性载体的本文所揭示的抗原性IgE肽。因此，本发明进一步涉及一种产生免疫原的方法，其包含使至少一种本文所揭示的抗原性IgE肽连接于本文所揭示的免疫原性载体的步骤。在一实施方案中，该连接藉由直接或经由如本文所揭示的接头(尤其GC接头(例如半胱氨酸))的化学交联来进行。在一实施方案中，本发明涉及一种产生免疫原的方法，其包含使至少一种本文所揭示的抗原性IgE肽(任选进一步包含如本文所揭示的接头)连接于本文所揭示的VLP的步骤，该连接藉由直接或经由如本文所揭示的接头(尤其GC接头(例如半胱氨酸))的化学交联来进行。在一特定实施方案中，当本文所揭示的抗原性IgE肽的序列包含半胱氨酸时，该抗原性IgE肽直接经由该半胱氨酸共价连接于VLP。在该实施方案中，该方法包括如本文所述且优选使用异双功能交联剂(例如N-γ-顺丁烯二酰亚胺基-丁酰氧基-丁二酰亚胺酯(GMBS)或丁二酰亚胺基-6-[β-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺基]己酸酯(SMPH))的化学交联步骤。因此，在一些实施方案中，该化学交联步骤使得VLP经由硫醚键交联，该键位于VLP的赖氨酸残基与该抗原性IgE的半胱氨酸残基之间。在一优选实施方案中，该VLP优选为Qβ病毒样颗粒(甚至更优选为SEQ ID NO：435的Qβ)。本发明的另一实施方案涉及一种可藉由本文所揭示的方法获得的免疫原。

包含本发明的抗原性IgE肽的组合物

本发明进一步涉及组合物，尤其亦称为“对象免疫原性组合物”的免疫原性组合物，其包含优选连接于免疫原性载体(更优选为VLP、甚至更优选为HBsAg、HBcAg或Qβ VLP)的本发明的抗原性IgE肽，及任选存在的至少一种佐剂。此类免疫原性组合物(尤其当配制为药物组合物时)被认为适用于预防、治疗或减轻IgE相关病症。

在一些实施方案中，本发明的对象免疫原性组合物包含抗原性IgE肽，其包含选自SEQ ID No：1至430及其功能活性变体、优选选自由SEQ ID No：1至430组成的组、更优选选自由SEQ ID No：1至153及220至430组成的组、甚至更优选选自由SEQ ID No：220至430组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗原性IgE肽连接于免疫原性载体，优选为VLP，更优选为HBsAg、HBcAg或Qβ VLP。

如下文更详细地描述，包含本发明的抗原性IgE肽的对象免疫原性组合物可以多种方式配制。

在一些实施方案中，对象免疫原性组合物包含单种抗原性IgE肽，例如该免疫原性组合物包含一群抗原性IgE肽，其实质上全部均具有相同氨基酸序列。在其它实施方案中，对象免疫原性组合物包含两种或两种以上不同抗原性IgE肽，例如该免疫原性组合物包含一群抗原性IgE肽，该群的成员的氨基酸序列可不同。对象免疫原性组合物可包含2至约20种不同抗原性IgE肽，例如对象免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11-15或15-20种不同抗原性IgE肽，此类肽各自具有的氨基酸不同于其它抗原性IgE肽的氨基酸序列。

举例而言，在一些实施方案中，对象免疫原性组合物包含第一抗原性IgE肽，该第一抗原性IgE肽优选连接于免疫原性载体，更优选连接于VLP，甚至更优选连接于HBsAg、HBcAg或Qβ VLP，且包含选自由SEQ ID No：1至430组成的组、更优选选自由SEQ ID No：1至153及220至430组成的组、甚至更优选选自由SEQ ID No：220至430组成的组的第一氨基酸序列；及至少一种第二抗原性IgE肽，该第二抗原性IgE肽优选连接于免疫原性载体，更优选连接于VLP，甚至更优选连接于HBsAg、HBcAg或Qβ VLP，且包含优选选自由SEQ ID No：1至430组成的组、更优选选自由SEQ ID No：1至153及220至430组成的组、甚至更优选选自由SEQ ID No：220至430组成的组的第二氨基酸序列；其中该第二氨基酸序列与该第一氨基酸序列有至少1、2、3、4、5、6至10个或15个氨基酸不同。在另一实施方案中，该第一抗原性IgE肽包含选自由SEQ ID NO：311至430组成的组的氨基酸序列且该第二抗原性IgE肽包含选自由SEQ ID NO：1至310组成的组、优选选自由SEQ ID NO：220至310或SEQ ID NO：1至153或SEQ ID NO：154至219组成的组、更优选选自由SEQ ID NO：220至310组成的组的氨基酸序列。在另一实施方案中，该第一抗原性IgE肽包含选自由SEQ ID NO：220至310组成的组的氨基酸序列且该第二抗原性IgE肽包含选自由SEQ ID NO：1至219及311至430组成的组、优选选自由SEQ ID NO：311至430或SEQ ID NO：1至153或SEQ ID NO：154至219组成的组、更优选选自由SEQ ID NO：311至430组成的组的氨基酸序列。在另一实施方案中，该第一抗原性IgE肽包含选自由SEQ ID NO：1至153组成的组的氨基酸序列且该第二抗原性IgE肽包含选自由SEQ ID NO：154至430组成的组、优选选自由SEQ ID NO：220至310或SEQ ID NO：311至430或SEQ ID NO：154至219组成的组的氨基酸序列。在另一实施方案中，该第一抗原性IgE肽包含选自由SEQ ID NO：154至219组成的组的氨基酸序列且该第二抗原性IgE肽包含选自由SEQID NO：1至153及220至430组成的组、优选选自由SEQ ID NO：220至310或SEQ ID NO：1至153或SEQ ID NO：311至430组成的组的氨基酸序列。

另举例而言，对象免疫原性组合物包含第一抗原性IgE肽，该第一抗原性IgE肽优选连接于免疫原性载体，更优选连接于VLP，甚至更优选连接于HBsAg、HBcAg或Qβ VLP，且包含选自由SEQ ID No：1至430组成的组的第一氨基酸序列；第二抗原性IgE肽，该第二抗原性IgE肽优选连接于免疫原性载体，更优选连接于VLP，甚至更优选连接于HBsAg、HBcAg或QβVLP，且包含优选选自由SEQ ID No：1至430组成的组的第二氨基酸序列，其中该第二氨基酸序列与该第一氨基酸序列有至少1、2、3、4、5、6至10个或15个氨基酸不同；及至少一种第三抗原性IgE多肽，该第三抗原性IgE多肽优选连接于免疫原性载体，更优选连接于VLP，甚至更优选连接于HBsAg、HBcAg或Qβ VLP，且包含优选选自由SEQ ID No：1至430组成的组的第三氨基酸序列，其中该第三氨基酸序列与第一及第二氨基酸序列皆有至少1、2、3、4、5、6至10个或15个氨基酸不同。在另一实施方案中，该第一抗原性IgE肽包含选自由SEQ ID NO：311至430组成的组的氨基酸序列；且该第二及第三抗原性IgE肽包含选自由SEQ ID NO：1至310组成的组、优选选自由SEQ ID NO：220至310或SEQ ID NO：1至153或SEQ ID NO：154至219组成的组的氨基酸序列。

在另一实施方案中，该第一抗原性IgE肽包含选自由SEQ ID NO：220至310组成的组的氨基酸序列且该第二及第三抗原性IgE肽包含选自由SEQ ID NO：1至219及311至430组成的组、优选选自由SEQ ID NO：311至430或SEQ ID NO：1至153或SEQ ID NO：154至219组成的组的氨基酸序列。

在其它实施方案中，对象免疫原性组合物包含如上文所述的多聚化抗原性IgE多肽。如本文中所使用，术语“包含抗原性IgE肽的免疫原性组合物”或“本发明的免疫原性组合物”或“对象免疫原性组合物”指包含与免疫原性载体偶联或不与免疫原性载体偶联的单种(多聚化或不多聚化)或多种抗原性IgE肽的免疫原性组合物。当使用两种或两种以上肽与载体偶联时，此类肽可与同一载体分子偶联或单独地与载体分子偶联然后组合产生免疫原性组合物。

本发明的另一方面涉及制造本发明的免疫原的方法，该方法包含使抗原性IgE肽与免疫原性载体偶联。在一实施方案中，该偶联为化学偶联。

在一些实施方案中，对象免疫原性组合物包含至少一种佐剂。合适的佐剂包括适合用于哺乳动物(优选为人类)的佐剂。可用于人类的已知合适佐剂的实例包括(但不一定限于)明矾、磷酸铝、氢氧化铝、MF59(4.3％w/v角鲨烯、0.5％w/v聚山梨醇酯80(吐温80(Tween 80))、0.5％w/v三油酸山梨坦(Span 85))、含有CpG的核酸(其中胞嘧啶未经甲基化)、QS21(皂苷佐剂)、MPL(单磷酰脂质A)、3DMPL(3-O-脱酰MPL)、来自Aquilla的提取物、ISCOMS(例如参见等人(1998)J.Leukocyte Biol.64：713；WO 90/03184、WO 96/11711、WO 00/48630、WO 98/36772、WO 00/41720、WO 06/134423及WO 07/026190)、LT/CT突变体、聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、Quil A、白细胞介素及其类似物。对于包括(但不限于)动物实验的兽医应用，可使用弗氏佐剂(Freund’s)、N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(CGP11637，称为去甲-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷酰胺基-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，称为MTP-PE)及RIBI，其含有存于2％角鲨烯/吐温80乳液中的三种自细菌提取的组份，单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯及细胞壁支架(MPL+TDM+CWS)。

其它用于增强组合物的有效性的例示性佐剂包括(但不限于)：(1)水包油乳液配制物(存在或不存在其它特定免疫刺激剂，诸如胞壁酰肽(参见下文)或细菌细胞壁组份)，例如(a)MF59^TM(WO 90/14837；Vaccine design中的第10章：the subunit and adjuvantapproach，Powell及Newman编，Plenum Press 1995)，其含有5％角鲨烯、0.5％吐温80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)及0.5％Span 85(三油酸山梨坦)(任选含有共价连接于二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(MTP-PE)的胞壁酰三肽)且使用高压微射流均质机(microfluidizer)配制成亚微粒颗粒；(b)SAF，其含有10％角鲨烷、0.4％吐温80、5％泊洛尼克(pluronic)嵌段共聚物L121及thr-MDP且高压微射流均质为亚微粒乳液或经涡旋产生较大粒径乳液；及(c)RIBI^TM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，其含有2％角鲨烯、0.2％吐温80及一或多种细菌细胞壁组份，诸如单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)及细胞壁支架(CWS)，优选为MPL+CWS(DETOX^TM)；(2)可使用皂苷佐剂，诸如QS21、STIMULON^TM(CambridgeBioscience，Worcester，MA)、Abisco(Isconova，Sweden)或Iscomatrix(CommonwealthSerum Laboratories，Australia)，或自其产生的颗粒，诸如ISCOM(免疫刺激性复合物)，此类ISCOM可无其它去污剂，例如WO 00/07621；(3)完全弗氏佐剂(Complete Freund’sAdjuvant，CFA)及不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund’s Adjuvant，IFA)；(4)细胞因子，诸如白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(WO 99/44636)等)、干扰素(例如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(5)单磷酰脂质A(MPL)或3-O脱酰MPL(3dMPL)，例如GB-220221、EP-A-0689454，当与肺炎球菌糖类一起使用时，任选实质上不存在明矾，例如WO 00/56358；(6)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳液的组合，例如EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231；(7)包含CpG基序的寡核苷酸[KriegVaccine 2000，19，618-622；Krieg Curr opin Mol Ther20013：15-24；Roman等人，Nat.Med.，1997，3，849-854；Weiner等人，PNAS USA，1997，94，10833-10837；Davis等人，J.Immunol，1998，160，870-876；Chu等人，J.Exp.Med，1997，186，1623-1631；Lipford等人，Ear.J.Immunol.，1997，27，2340-2344；Moldoveami等人，Vaccine，1988，16，1216-1224，Krieg等人，Nature，1995，374，546-549；Klinman等人，PNAS USA，1996，93，2879-2883；Ballas等人，J.Immunol，1996，157，1840-1845；Cowdery等人，J.Immunol，1996，156，4570-4575；Halpern等人，Cell Immunol，1996，167，72-78；Yamamoto等人，Jpn.J.Cancer Res.，1988，79，866-873；Stacey等人，J.Immunol.，1996，157，2116-2122；Messina等人，J.Immunol，1991，147，1759-1764；Yi等人，J.Immunol，1996，157，4918-4925；Yi等人，J.Immunol，1996，157，5394-5402；Yi等人，J.Immunol，1998，160，4755-4761；及Yi等人，J.Immunol，1998，160，5898-5906；国际专利申请案WO 96/02555、WO 98/16247、WO 98/18810、WO 98/40100、WO 98/55495、WO 98/37919及WO 98/52581]，亦即含有至少一种CG二核苷酸，其中胞嘧啶未经甲基化；(8)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯，例如WO 99/52549；(9)聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂与辛苯聚醇的组合(WO 01/21207)，或聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂与至少一种其它非离子型表面活性剂(诸如辛苯聚醇)的组合(WO 01/21152)；(10)皂苷及免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)(WO 00/62800)；(11)免疫刺激剂及金属盐颗粒，例如WO 00/23105；(12)皂苷及水包油乳液，例如WO 99/11241；(13)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IM2(任选+固醇)，例如WO 98/57659；(14)充当免疫刺激剂以增强组合物功效的其它物质，诸如胞壁酰肽，包括N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-25乙酰基-去甲胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷酰胺(nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基L-丙氨酰基-D-异谷酰胺-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)；(15)天然或合成的toll样受体(toll-like receptor，TLR)的配体(例如如Kanzler等人2007，Nature Medicine 13，第1552-9页中所述)，包括TLR3配体，诸如polyI:C及类似化合物，诸如Hiltonol及Ampligen。

在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含至少一种佐剂。在一特定实施方案中，该佐剂为免疫刺激性寡核苷酸且更优选为CpG寡核苷酸。在一实施方案中，该CpG寡核苷酸具有核酸序列5’TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3’(ODN CpG 24555；SEQ ID NO：431)。SEQID NO：431的免疫刺激性寡核苷酸核酸序列与先前报导的免疫刺激性寡核苷酸(ODN10103)5’TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3’(SEQ ID NO：432)的不同为反转最接近3’端的CG二核苷酸。此两种免疫刺激性寡核苷酸之间活性的相似性令人惊讶，因为先前报导CpG寡核苷酸的免疫刺激活性依赖于CpG基序的数目、CG二核苷酸两侧的序列、CpG基序的位置及CpG基序之间的间距(Ballas等人，1996，J.Immunol.；Hartmann等人，2000，J.Immunol.；Klinman等人，2003，Clin.Exp.Immunol.)。如先前揭示所预期的，移除免疫刺激性寡核苷酸CpG ODN24555(SEQ ID NO：431)中最接近3’端的CG二核苷酸不会对此免疫刺激性寡核苷酸加强抗原特异性免疫反应的能力产生负面影响。CpG ODN 24555显示类似情况且在一些情况下与CpG ODN 10103相比增强免疫刺激活性。

免疫刺激性寡核苷酸可为双链或单链。双链分子一般在活体内更稳定，而单链分子具有增加的免疫活性。因此，在本发明的一些方面中核酸优选为单链且在其它方面中核酸优选为双链。

术语“核酸”及“寡核苷酸”在本文中可互换使用，意谓多个核苷酸(亦即糖(例如核糖或脱氧核糖)连接于磷酸基团及可更换的有机碱基的分子，该碱基为经取代的嘧啶(例如胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))或经取代的嘌呤(例如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))。如本文中所使用，术语指寡核糖核苷酸(亦即多核苷酸减去磷酸)及任何其它含有有机碱基的聚合物。核酸分子可自现有核酸来源获得(例如基因组或cDNA)，但优选为合成的(例如藉由核酸合成产生)。

在一实施方案中，与天然RNA及DNA相比，免疫刺激性寡核苷酸可包涵各种化学修饰及取代，包括磷酸二酯核苷间桥、β-D-核糖单元和/或天然核苷碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)。化学修饰的实例为本领域技术人员所已知且例如描述于UhlmannE.等人(1990)，Chem.Rev.90：543；“Protocols for Oligonucleotides and Analogs”Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques，S.Agrawal编，Humana Press，Totowa，USA 1993；Crooke，S.T.等人(1996)Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.36：107-129；及Hunziker J.等人，(1995)，Mod.Synth.Methods 7：331-417中。本发明的寡核苷酸可具有一或多种修饰，其中与由天然DNA或RNA构成的具有相同序列的寡核苷酸相比，各修饰位于特定磷酸二酯核苷间桥和/或特定β-D-核糖单元和/或特定天然核苷碱基位置。

举例而言，寡核苷酸可包含一或多种修饰。此类修饰可选自：a)由经修饰的核苷间桥置换位于核苷的3’和/或5’端的磷酸二酯核苷间桥、b)由脱磷的桥置换位于核苷的3’和/或5’端的磷酸二酯桥、c)由另一单元置换糖磷酸酯主链的糖磷酸酯单元、d)由经修饰的糖单元置换β-D-核糖单元及e)置换天然核苷碱基。

核酸亦包括经取代的嘌呤及嘧啶，诸如C-5丙炔嘧啶及7-去氮-7-取代的嘌呤修饰的碱基(Wagner等人，1996，Nat.Biotechnol.14：840-4)。嘌呤及嘧啶包括(但不限于)腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸苷、5-甲基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤及其它天然及非天然存在的核苷碱基、经取代及未经取代的芳香族部分。其它此类修饰为本领域技术人员所熟知。

经修饰的碱基为化学性质不同于DNA及RNA中所见的天然存在的碱基(诸如T、C、G、A及U)、但与这些天然存在的碱基共有基本化学结构的任何碱基。经修饰的核苷碱基可例如选自次黄嘌呤、尿嘧啶、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C1-C6)烷基尿嘧啶、5-(C2-C6)烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)炔基尿嘧啶、5-(羟甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(C1-C6)烷基胞嘧啶、5-(C2-C6)烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2-二甲基鸟嘌呤、2，4-二氨基-嘌呤、8-氮杂嘌呤、经取代的7-去氮嘌呤(优选为7-去氮-7-经取代的嘌呤和/或7-去氮-8-经取代的嘌呤)、5-羟甲基胞嘧啶、N4-烷基胞嘧啶(例如N4-乙基胞嘧啶)、5-羟基脱氧胞嘧啶、5-羟甲基脱氧胞嘧啶、N4-烷基脱氧胞嘧啶(例如N4-乙基脱氧胞嘧啶)、6-硫脱氧鸟苷及硝基吡咯的脱氧核糖核苷、C5-丙炔基嘧啶及二氨基嘌呤(例如2，6-二氨基嘌呤)、肌苷、5-甲基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤或天然核苷碱基的其它修饰。此清单欲为例示性的且不应解释为限制性的。

在本发明的一些方面中，本文所述的免疫刺激性寡核苷酸的CpG二核苷酸优选未经甲基化。未经甲基化的CpG基序为未经甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(亦即在未经甲基化的5’胞嘧啶后为3’鸟苷且由磷酸键连接)。在其它方面中，CpG基序经甲基化。经甲基化的CpG基序为经甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(亦即在经甲基化的5’胞嘧啶后为3’鸟苷且由磷酸键连接)。

在本发明的一些方面中，免疫刺激性寡核苷酸可含有经修饰的胞嘧啶。经修饰的胞嘧啶为胞嘧啶的天然存在或非天然存在的嘧啶碱基类似物，其可置换此碱基而不减弱寡核苷酸的免疫刺激活性。经修饰的胞嘧啶包括(但不限于)5-取代的胞嘧啶(例如5-甲基-胞嘧啶、5-氟-胞嘧啶、5-氯-胞嘧啶、5-溴-胞嘧啶、5-碘-胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-羟甲基-胞嘧啶、5-二氟甲基-胞嘧啶及未经取代或经取代的5-炔基-胞嘧啶)、6-取代的胞嘧啶、N4-取代的胞嘧啶(例如N4-乙基-胞嘧啶)、5-氮杂-胞嘧啶、2-巯基-胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、具有稠环系统的胞嘧啶类似物(例如N，N’-丙烯胞嘧啶或吩恶嗪)及尿嘧啶与其衍生物(例如5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-溴乙烯基-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羟基-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶)。一些优选胞嘧啶包括5-甲基-胞嘧啶、5-氟-胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-羟甲基-胞嘧啶及N4-乙基-胞嘧啶。在本发明的另一实施方案中，胞嘧啶碱基经普通碱基(例如3-硝基吡咯、P-碱基)、芳族环系统(例如氟苯或二氟苯)或氢原子(dSpacer)取代。

在本发明的一些方面中，免疫刺激性寡核苷酸可含有经修饰的鸟嘌呤。经修饰的鸟嘌呤为鸟嘌呤的天然存在或非天然存在的嘌呤碱基类似物，其可置换此碱基而不减弱寡核苷酸的免疫刺激活性。经修饰的鸟嘌呤包括(但不限于)7-去氮鸟嘌呤、7-去氮-7-取代鸟嘌呤、次黄嘌呤、N2-取代鸟嘌呤(例如N2-甲基-鸟嘌呤)、5-氨基-3-甲基-3H，6H-噻唑并[4，5-d]嘧啶-2，7-二酮、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、嘌呤、吲哚、腺嘌呤、经取代的腺嘌呤(例如N6-甲基-腺嘌呤、8-氧代-腺嘌呤)、8-取代的鸟嘌呤(例如8-羟基鸟嘌呤及8-溴鸟嘌呤)及6-硫鸟嘌呤。在本发明的另一实施方案中，鸟嘌呤碱基经普通碱基(例如4-甲基-吲哚、5-硝基-吲哚及K-碱基)、芳族环系统(例如苯并咪唑或二氯-苯并咪唑、1-甲基-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酸酰胺)或氢原子(dSpacer)取代。

在某些方面中，寡核苷酸可包括经修饰的核苷酸间键。这些经修饰的键可部分抗降解(例如稳定化)。“稳定的核酸分子”应意谓相对地抗活体内降解(例如经由核酸外切酶或核酸内切酶)的核酸分子。稳定可与长度或二级结构有关。长度为数万至数十万碱基的核酸相对地抗体内降解。对于较短核酸，二级结构可使其作用稳定及增加。茎环(stem loop)结构的形成可使核酸分子稳定。举例而言，若核酸的3’端与上游区域具有自身互补性以致其可向后折迭且形成茎环结构，则核酸可变得稳定且展现更多活性。

核酸稳定亦可经由磷酸主链修饰来实现。在一些实施方案中，具有硫代磷酸酯键的寡核苷酸可提供最大活性且保护寡核苷酸不被细胞内核酸外切酶及核酸内切酶降解。

对于体内使用，核酸优选相对地抗降解(例如经由核酸内切酶及核酸外切酶)。已显示当体内施用时，核酸主链的修饰提供增强的核酸活性。诸如茎环的二级结构可使核酸稳定抗降解。或者，核酸稳定亦可经由磷酸主链修饰来实现。优选稳定的核酸至少具有部分经硫代磷酸酯修饰的主链。可使用自动化技术，使用氨基磷酸酯或H-膦酸酯化学作用来合成硫代磷酸酯。芳基-膦酸酯及烷基-膦酸酯可例如如美国专利第4,469,863号中所述制备；且烷基磷酸三酯(其中带电氧部分经烷基化，如美国专利第5,023,243号及欧洲专利第092,574号中所述)可藉由自动化固相合成，使用市售试剂来制备。进行其它DNA主链修饰及取代的方法已有所描述(Uhlmann，E.及Peyman，A.(1990)Chem.Rev.90：544；Goodchild，J.(1990)Bioconjugate Chem.1：165)。具有CpG基序的2’-O-甲基核酸亦引起免疫活化，经乙氧基修饰的CpG核酸亦如此。事实上，没有发现完全消除CpG作用的主链修饰，尽管该作用藉由用5-甲基C置换C而大大降低。具有硫代磷酸酯键的构建体提供最大活性且保护核酸不被细胞内核酸外切酶及核酸内切酶降解。其它经修饰的核酸包括经磷酸二酯修饰的核酸、磷酸二酯与硫代磷酸酯核酸的组合、甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、p-乙氧基及其组合。关于CpG核酸，这些组合及其对免疫细胞的特定作用更详细地各论述于PCT公开专利申请案PCT/US 95/01570(WO 96/02555)及PCT/US 97/19791(WO 98/18810)及2001年2月27日颁布的美国专利US 6,194,388 B1及2001年5月29日颁布的美国专利US 6,239,116B1中，此类专利的全部内容以引用的方式并入本文中。相信这些经修饰的核酸可显示更多刺激活性，此归因于增强的核酸酶抗性、增加的细胞摄取、增加的蛋白质结合和/或改变的细胞内定位。

对于体内施用，核酸可与使得结合于靶细胞(例如树突状细胞、B细胞、单核细胞及天然杀伤(NK)细胞)表面的亲和力较高和/或靶细胞的细胞摄取增加的分子缔合，以形成“核酸送递复合物”。可使用本领域所熟知的技术，使核酸与适当分子离子性或共价缔合。可使用各种偶联剂或交联剂，例如蛋白A、碳化二亚胺及N-丁二酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)。或者，可使用熟知技术将核酸囊封于脂质粒或病毒体中。

其它稳定的核酸包括(但不限于)非离子型DNA类似物，诸如烷基-磷酸酯及芳基-磷酸酯(其中带电膦酸酯氧经烷基或芳基置换)、磷酸二酯及烷基磷酸三酯(其中带电氧部分经烷基化)。在任一端或两端含有二醇(诸如四乙二醇或六乙二醇)的核酸亦显示实质上抗核酸酶降解。在一些实施方案中，本发明的免疫刺激性寡核苷酸可包括至少一种经取代的亲脂性核苷酸类似物和/或嘧啶-嘌呤二核苷酸。

寡核苷酸可具有一或两个可接近的5’端。有可能形成具有两个此类5’端的经修饰的寡核苷酸，例如藉由经由3’-3’键连接两个寡核苷酸，产生具有一或两个可接近的5’端的寡核苷酸。该3’3’键可为磷酸二酯、硫代磷酸酯或任何其它经修饰的核苷间桥。实现此类连接的方法为本领域中所已知。举例而言，此类连接已描述于Seliger，H.等人，Oligonucleotide analogs with terminal 3’-3’-and 5’-5’-internucleotidiclinkages as antisense inhibitors of viral gene expression，Nucleosides &Nucleotides(1991)，10(1-3)，469-77及Jiang等人，Pseudo-cyclic oligonucleotides：invitro and in vivo properties，Bioorganic & Medicinal Chemistry(1999)，7(12)，2727-2735中。

另外，3’端核苷之间的键不为磷酸二酯、硫代磷酸酯或其它经修饰的桥的3’3’连接的ODN可使用另一间隔物(spacer)制备，诸如三乙二醇或四乙二醇磷酸酯部分(Durand，M.等人，Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one(dA)12 andtwo(dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains，Biochemistry(1992)，31(38)，9197-204，美国专利第5,658,738号及美国专利第5,668,265号)。或者，利用标准亚磷酰胺化学作用，非核苷酸接头可衍生自乙二醇、丙二醇或无碱基脱氧核糖(dSpacer)单元(Fontanel，Marie Laurence等人，Sterical Recognition by T4polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5’-attached tooligonucleotides；Nucleic Acids Research(1994)，22(11)，2022-7)。非核苷酸接头可掺入一次或多次，或彼此组合，允许欲连接的两个ODN的3’端之间的任何所需距离。

位于核苷的3’和/或5’端的磷酸二酯核苷间桥可由经修饰的核苷间桥置换，其中该经修饰的核苷间桥例如选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、NR1R2-氨基磷酸酯、硼烷磷酸酯、α-羟基苯甲基膦酸酯、磷酸酯-(C1-C21)-O-烷基酯、磷酸酯-[(C6-C12)芳基-(C1-C21)-O-烷基]酯、(C1-C8)烷基膦酸酯和/或(C6-C12)芳基磷酸酯桥、(C7-C12)-α-羟甲基-芳基(例如WO 95/01363中所揭示)，其中(C6-C12)芳基、(C6-C20)芳基及(C6-C14)芳基任选经卤素、烷基、烷氧基、硝基、氰基取代，且其中R1及R2彼此独立地为氢、(C1-C18)烷基、(C6-C20)芳基、(C6-C14)芳基、(C1-C8)烷基，优选为氢、(C1-C8)烷基，优选为(C1-C4)烷基和/或甲氧基乙基，或R1及R2连同带有其的氮原子形成5-6元杂环，其可另外含有另一来自O、S及N的组的杂原子。

可由去磷桥(dephospho bridge)(去磷桥例如描述于Uhlmann E.及Peyman A.“Methods in Molecular Biology”，第20卷，“Protocols for Oligonucleotides andAnalogs”，S.Agrawal编，Humana Press，Totowa 1993，第16章，第355页以下中)置换位于核苷的3’和/或5’端的磷酸二酯桥，其中去磷桥例如选自去磷桥甲缩醛、3’-硫甲缩醛、甲基羟胺、肟、亚甲基二甲基-伸肼基、二甲亚砜和/或硅烷基。

本发明的免疫刺激性寡核苷酸可任选具有嵌合主链。嵌合主链为包含一种以上类型的键的主链。在一实施方案中，该嵌合主链可由下式表示：5’Y1N1ZN2Y23’。Y1及Y2为具有1至10个核苷酸的核酸分子。Y1及Y2各包括至少一个经修饰的核苷酸间键。因为嵌合寡核苷酸的至少2个核苷酸包括主链修饰，所以这些核酸为一类“稳定的免疫刺激性核酸”的实例。

关于嵌合寡核苷酸，认为Y1与Y2彼此无关。此意谓Y1及Y2各在同一分子中可能具有或可能不具有互不相同的序列及互不相同的主链键。在一些实施方案中，Y1和/或Y2具有3至8个核苷酸。N1及N2为具有0至5个核苷酸的核酸分子，只要N1ZN2具有总共至少6个核苷酸即可。N1ZN2的核苷酸具有磷酸二酯主链且不包括具有经修饰的主链的核酸。Z为免疫刺激性核酸基序，优选选自本文所述的那些基序。

式Y1N1ZN2Y2的中心核苷酸(N1ZN2)具有磷酸二酯核苷酸间键且Y1及Y2具有至少一个、但可具有一个以上或甚至可具有所有经修饰的核苷酸间键。在优选实施方案中，Y1和/或Y2具有至少2个或2至5个经修饰的核苷酸间键或Y1具有5个经修饰的核苷酸间键且Y2具有2个经修饰的核苷酸间键。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸间键为经硫代磷酸酯修饰的键、二硫代磷酸酯键或经p-乙氧基修饰的键。

核酸亦包括具有主链糖的核酸，此类糖共价连接于除2’位置的羟基外及除5’位置的磷酸基外的低分子量有机基团。因此，经修饰的核酸可包括2’-O-烷基化的核糖基团。另外，经修饰的核酸可包括诸如阿拉伯糖或2’-氟阿拉伯糖的糖以替代核糖。因此，核酸的主链组成可为异质的，从而含有连接在一起的聚合物单元的任何可能组合，诸如肽-核酸(其具有氨基酸主链及核酸碱基)。在一些实施方案中，核酸的主链组成为均质的。

来自糖磷酸酯主链的糖磷酸酯单元(亦即共同形成糖磷酸酯单元的β-D-核糖及磷酸二酯核苷间桥)(亦即糖磷酸酯主链由糖磷酸酯单元构成)可由另一单元置换，其中该另一单元例如适合于建构“N-吗啉基-衍生物”寡聚物(如例如Stirchak E.P.等人(1989)Nucleic Acid Res.17：6129-41中所述)，亦即例如由N-吗啉基-衍生物置换；或建构聚酰胺核酸(“PNA”；如例如Nielsen P.E.等人(1994)Bioconjug.Chem.5：3-7中所述)，亦即例如由PNA主链单元(例如由2-氨基乙基甘氨酸)置换。寡核苷酸可具有其它碳水化合物主链修饰及置换，诸如具有磷酸酯基的肽核酸(PHONA)、锁核酸(locked nucleic acid，LNA)及主链部分具有烷基接头或氨基接头的寡核苷酸。烷基接头可为分支链或非分支链的，经取代或未经取代的，及手性纯的或外消旋混合物。

β-核糖单元或β-D-2’脱氧核糖单元可由经修饰的糖单元置换，其中该经修饰的糖单元例如选自β-D-核糖、α-D-2’-脱氧核糖、L-2’-脱氧核糖、2’-F-2’-脱氧核糖、2’-F-阿拉伯糖、2’-O-(C1-C6)烷基-核糖(2’-O-(C1-C6)烷基-核糖优选为2’-O-甲基核糖)、2’-O-(C1-C6)烯基-核糖、2’-[O-(C1-C6)烷基-O-(C1-C6)烷基]-核糖、2’-NH₂-2’-脱氧核糖、β-D-木-呋喃糖、α-阿拉伯呋喃糖、2，4-双脱氧-β-D-赤-己-哌喃醣及碳环(例如描述于Froehler J.(1992)Am.Chem.Soc.114：8320中)和/或开链糖类似物(例如描述于Vandendriessche等人(1993)Tetrahedron 49：7223中)和/或双环糖类似物(例如描述于Tarkov M.等人(1993)Helv.Chim.Acta.76：481中)。

在一些实施方案中，该糖为2’-O-甲基核糖，尤其对于由磷酸二酯或磷酸二酯样核苷间键连接的一个或两个核苷酸。

本发明的寡核苷酸可使用本领域中熟知的许多程序中的任一者来重新合成。举例而言，b-氰乙基亚磷酰胺方法(Beaucage，S.L.及Caruthers，M.H.，(1981)Tet.Let.22：1589)；核苷H-膦酸酯方法(Garegg等人，(1986)Tet.Let.27：4051-4054；Froehler等人，(1986)Nucl.Acid Res.14：5399-5407；Garegg等人，(1986)27：4055-4058；Gaffney等人，(1988)Tet.Let.29：2619-2622)。这些化学法可藉由市场有售的各种自动化核酸合成器来执行。这些寡核苷酸被称为合成寡核苷酸。或者，富含T的二核苷酸和/或TG二核苷酸可大规模地以质粒形式产生(参见Sambrook T.等人，“Molecular Cloning：A LaboratoryManual”，Cold Spring Harbor laboratory Press，New York，1989)且分离成较小片段或整个施用。核酸可使用已知技术(诸如使用限制酶、核酸外切酶或核酸内切酶的那些技术)，由现有核酸序列(例如基因组或cDNA)制备。

可使用自动化技术，采用氨基磷酸酯或H-膦酸酯化学法来合成经修饰的主链(诸如硫代磷酸酯)。芳基-膦酸酯及烷基-膦酸酯可例如如美国专利第4,469,863号中所述制备，且烷基磷酸三酯(其中带电氧部分经烷基化，如美国专利第5,023,243号中所述)可藉由自动化固相合成，使用市售试剂来制备。进行其它DNA主链修饰及取代的方法已有所描述(例如Uhlmann，E.及Peyman，A.，Chem.Rev.90：544，1990；Goodchild，J.，BioconjugateChem.1：165，1990)。

以此方式制备的核酸被称为经分离的核酸。“经分离的核酸”通常指与与其一起自细胞、自细胞核、自线粒体或自染色质分离的组份及可视为污染物的任何其它组份分离的核酸。

在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含至少一种为CpG寡核苷酸的佐剂。CpG寡核苷酸已描述于许多颁布专利、公开专利申请案及其它公开案中，包括美国专利第6,194,388号；第6,207,646号；第6,214,806号；第6,218,371号；第6,239,116号；及第6,339,068号。

已鉴别出不同种类的CpG免疫刺激性寡核苷酸。这些种类被称为A、B、C及P类，且更详细地描述于下文中。本发明的方法及组合物包含使用这些不同种类的CpG免疫刺激性寡核苷酸。

可使任一种类进行增强其效能的E修饰。E修饰可为对5’端核苷酸的卤素取代；此类取代的实例包括(但不限于)溴-尿苷或碘-尿苷取代。E修饰亦可包括对5’端核苷酸的乙基-尿苷取代。

“A类”CpG免疫刺激性寡核苷酸在功能上的特征为自浆细胞样树突状细胞(pDC)诱导高含量的干扰素-α(IFN-α)及诱导NK细胞活化，同时对B细胞活化具有极小作用的能力。在结构上，此类通常在5’及3’端具有稳定的聚-G序列。其亦具有至少6个核苷酸的含有回文磷酸二酯CpG二核苷酸的序列，例如(但不一定)，其含有由Yamamoto及同事描述的以下六聚体回文中的一者：GACGTC、AGCGCT或AACGTT。Yamamoto S等人J.Immunol 148：4072-6(1992)。A类CpG免疫刺激性寡核苷酸及此类的例示性序列已描述于美国非临时专利申请案第09/672,126号及公开PCT申请案PCT/USOO/26527(WO 01/22990)中，两者皆于2000年9月27日申请。

在一实施方案中，本发明的“A类”CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：5’GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3’(SEQ ID NO：440)。

A类寡核苷酸的一些非限制性实例包括：

5’G*G*G_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_G*G*G*G*G*G 3’；其中*指硫代磷酸酯键且_指磷酸二酯键。

“B类”CpG免疫刺激性寡核苷酸在功能上的特征为活化B细胞及pDC的能力，但在诱导IFN-α及NK细胞活化方面相对较弱。在结构上，此类通常可由硫代磷酸酯键完全稳定，但其亦可具有一或多个磷酸二酯键，优选位于CpG基序的胞嘧啶与鸟嘌呤之间，在该情况下该分子被称为半软的(semi-soft)。在一实施方案中，本发明的CpG寡核苷酸为至少由下式表示的B类CpG寡核苷酸：

5’X₁X₂CGX₃X₄ 3’，其中X₁、X₂、X₃及X₄为核苷酸。在一实施方案中，X₂为腺嘌呤、鸟嘌呤或胸腺嘧啶。在另一实施方案中，X₃为胞嘧啶、腺嘌呤或胸腺嘧啶。

在另一实施方案中，本发明的CpG寡核苷酸为至少由下式表示的B类CpG寡核苷酸：

5’N₁X₁X₂CGX₃X₄N₂ 3’，其中X₁、X₂、X₃及X₄为核苷酸且N为任何核苷酸且N₁及N₂各为由约0-25个N构成的核酸序列。在一实施方案中，X₁X₂为选自由GpT、GpG、GpA、ApA、ApT、ApG、CpT、CpA、CpG、TpA、TpT及TpG组成的组的二核苷酸；且X₃X₄为选自由TpT、ApT、TpG、ApG、CpG、TpC、ApC、CpC、TpA、ApA及CpA组成的组的二核苷酸。优选地，X₁X₂为GpA或GpT且X₃X₄为TpT。在其它实施方案中，X₁或X₂或两者为嘌呤且X₃或X₄或两者为嘧啶或X₁X₂为GpA且X₃或X₄或两者为嘧啶。在一优选实施方案中，X₁X₂为选自由TpA、ApA、ApC、ApG及GpG组成的组的二核苷酸。在又一实施方案中，X₃X₄为选自由TpT、TpA、TpG、ApA、ApG、GpA及CpA组成的组的二核苷酸。在另一实施方案中，X₁X₂为选自由TpT、TpG、ApT、GpC、CpC、CpT、TpC、GpT及CpG组成的组的二核苷酸；X₃为选自由A及T组成的组的核苷酸，且X₄为核苷酸，但当X₁X₂为TpC、GpT或CpG时，X₃X₄不为TpC、ApT或ApC。

在另一优选实施方案中，CpG寡核苷酸具有序列5’TCN₁TX₁X₂CGX₃X₄ 3’。在一些实施方案中，本发明的CpG寡核苷酸包括选自由GpT、GpG、GpA及ApA组成的组的X₁X₂及选自由TpT、CpT及TpC组成的组的X₃X₄。

本发明的B类CpG寡核苷酸序列为以上所概述以及公开PCT专利申请案PCT/US95/01570及PCT/US97/19791及USP 6,194,388、6,207,646、6,214,806、6,218,371、6,239,116及6,339,068中所揭示的序列。例示性序列包括(但不限于)这些靠后的申请案及专利中所揭示的序列。

在一实施方案中，本发明的“B类”CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：

5’TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3’(SEQ ID NO：431)或

5’TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3’(SEQ ID NO：432)或

5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3’(SEQ ID NO：433)或

5’TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT 3’(SEQ ID NO：441)或

5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA 3’(SEQ ID NO：442)。

在任何这些序列中，所有键可全部均为硫代磷酸酯键。在另一实施方案中，在任何这些序列中，一或多个键可为磷酸二酯，优选位于CpG基序的“C”与“G”之间，从而产生半软CpG寡核苷酸。在任何这些序列中，乙基-尿苷或卤素可取代5’T；卤素取代的实例包括(但不限于)溴-尿苷或碘-尿苷取代。

B类寡核苷酸的一些非限制性实例包括：

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3’或

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 3’或

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’或

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’或

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C*G*A 3’，

其中*指硫代磷酸酯键。

“C类”CpG免疫刺激性寡核苷酸在功能上的特征为活化B细胞及NK细胞且诱导IFN-α的能力。在结构上，此类通常包括具有一或多个B类免疫刺激性CpG基序的区域，及使得分子形成二级(例如茎环)或三级(例如二聚体)类型结构的富含GC回文的区域或近似回文区域。一些这些寡核苷酸具有传统“刺激性”CpG序列与“富含GC”或“B细胞中和”基序。这些组合基序寡核苷酸具有免疫刺激作用，其介于与传统B类CpG寡核苷酸相关的作用(亦即B细胞活化及树突状细胞(DC)活化的强诱导)与与A类CpG ODN相关的作用(亦即IFN-α及NK细胞活化的强诱导，但B细胞及DC活化的相对弱诱导)之间。Krieg AM等人(1995)Nature 374：546-9；Ballas ZK等人(1996)J Immunol 157：1840-5；Yamamoto S等人(1992)J Immunol 148：4072-6。

C类组合基序免疫刺激性寡核苷酸可具有完全稳定(例如所有硫代磷酸酯)、嵌合(磷酸二酯中心区域)或半软(例如CpG基序中的磷酸二酯)的主链。此类已描述于2002年8月19日申请的美国专利申请案US 10/224,523中。

C类CpG寡核苷酸的一个刺激性域或基序由下式定义：5’X₁DCGHX₂ 3’。D为除C外的核苷酸。C为胞嘧啶。G为鸟嘌呤。H为除G外的核苷酸。X₁及X₂为长度为0至10个核苷酸的任何核酸序列。X₁可包括CG，在该情况下优选在紧邻此CG之前存在T。在一些实施方案中，DCG为TCG。X₁的长度优选为0至6个核苷酸。在一些实施方案中，X₂不含有任何聚G或聚A基序。在其它实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸在5’端或在3’端具有聚-T序列。如本文中所使用，“聚-A”或“聚-T”应分别指连续四个或四个以上A或T的延伸段，例如5’AAAA 3’或5’TTTT 3’。如本文中所使用，“聚-G端”应指连续四个或四个以上G的延伸段，例如5’GGGG 3’，其存在于核酸的5’端或3’端。如本文中所使用，“聚-G寡核苷酸”应指具有式5’X₁X₂GGGX₃X₄ 3’的寡核苷酸，其中X₁、X₂、X₃及X₄为核苷酸且X₃及X₄中的至少一者优选为G。根据此式，B细胞刺激性域的一些优选设计包含TTTTTCG、TCG、TTCG、TTTCG、TTTTCG、TCGT、TTCGT、TTTCGT、TCGTCGT。

C类CpG寡核苷酸的第二基序被称为P或N且紧邻X₁的5’端或X₂的3’端。

N为以CGG三核苷酸开始且长度为至少10个核苷酸的B细胞中和序列。B细胞中和基序包括至少一个CpG序列，其中C在CG之前或G在CG之后(Krieg AM等人(1998)Proc NatlAcad Sd USA 95：12631-12636)；或为含有CG的DNA序列，其中CG的C经甲基化。中和基序或序列在存在于另外非刺激性基序中时具有一定程度的免疫刺激能力，但当存在于其它免疫刺激性基序的范围内时用以降低其它基序的免疫刺激潜能。

P为含有富含GC的回文的序列，其长度为至少10个核苷酸。

如本文中所使用，“回文”及同等地“回文序列”应指反向重复，亦即诸如ABCDEE’D’C’B’A’的序列，其中A及A’、B及B’等为能够形成常见Watson-Crick碱基对(Watson-Crickbase pair)的碱基。

如本文中所使用，“富含GC的回文”应指具有至少三分之二的G及C的碱基组成的回文。在一些实施方案中，富含GC的域优选在“B细胞刺激性域”的3’端。在长度为10个碱基的富含GC的回文的情况下，该回文由此含有至少8个G及C。在长度为12个碱基的富含GC的回文的情况下，该回文亦含有至少8个G及C。在富含GC的14-聚体回文的情况下，该回文的至少10个碱基为G及C。在一些实施方案中，富含GC的回文仅由G及C构成。

在一些实施方案中，富含GC的回文具有至少81％G及C的碱基组成。在该长度为10个碱基的富含GC的回文的情况下，该回文由此仅由G及C构成。在该长度为12个碱基的富含GC的回文的情况下，优选该回文的至少10个碱基(83％)为G及C。在一些优选实施方案中，长度为12个碱基的富含GC的回文仅由G及C构成。在富含GC的14-聚体回文的情况下，该回文的至少12个碱基(86％)为G及C。在一些优选实施方案中，长度为14个碱基的富含GC的回文仅由G及C构成。富含GC的回文的C可未经甲基化或其可经甲基化。

一般而言，此域具有至少3个C及G，更优选各为4个，且最优选各为5个或5个以上。此域中C及G的数目无需相同。优选排列C及G使得其能够形成自身互补双链体或回文，诸如CCGCGCGG。此可穿插有A或T，但优选至少部分保留自身互补性，如例如基序CGACGTTCGTCG或CGGCGCCGTGCCG中。当不保留互补性时，优选非互补碱基对为TG。在一优选实施方案中，不存在超过连续3个不为回文的一部分的碱基，优选不超过2个且最优选仅为1个。在一些实施方案中，富含GC的回文包括至少一个CGG三聚体、至少一个CCG三聚体或至少一个CGCG四聚体。在其它实施方案中，富含GC的回文不为CCCCCCGGGGGG或GGGGGGCCCCCC、CCCCCGGGGG或GGGGGCCCCC。

富含GC的区域的至少一个G可经肌苷(I)取代。在一些实施方案中，P包括一个以上I。

在某些实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸具有以下各式中之一：5’NX₁DCGHX₂ 3’、5’X₁DCGHX₂N 3’、5’PX₁DCGHX₂ 3’、5’X₁DCGHX₂P 3’、5’X₁DCGHX₂PX₃ 3’、5’X₁DCGHPX₃ 3’、5’DCGHX₂PX₃ 3’、5’TCGHX₂PX₃ 3’、5’DCGHPX₃ 3’或5’DCGHP 3’。

本发明提供其它由式5’N₁PyGN₂P 3’定义的免疫刺激性寡核苷酸。N₁为长度为1至6个核苷酸的任何序列。Py为嘧啶。G为鸟嘌呤。N₂为长度为0至30个核苷酸的任何序列。P为含有长度为至少10个核苷酸的序列的富含GC的回文。

N₁及N₂可含有大于50％嘧啶且更优选大于50％T。N₁可包括CG，在该情况下优选在紧邻此CG之前存在T。在一些实施方案中，N₁PyG为TCG，且最优选为TCGN₂，其中N₂不为G。

N₁PyGN₂P可包括一或多个肌苷(I)核苷酸。N₁中的C或G可由肌苷置换，但CpI更优于IpG。对于诸如IpG的肌苷取代，最优选活性可藉助于“半软”或嵌合主链来达成，其中IG或CI之间的键为磷酸二酯。N₁可包括至少一个CI、TCI、IG或TIG基序。

在某些实施方案中，N₁PyGN₂为选自由TTTTTCG、TCG、TTCG、TTTCG、TTTTCG、TCGT、TTCGT、TTTCGT及TCGTCGT组成的组的序列。

在一实施方案中，本发明的“C类”CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：

5’TCGCGTCGTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO：443)或

5’TCGTCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO：444)或

5’TCGGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO：445)或

5’TCGGACGTTCGGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO：446)或

5’TCGCGTCGTTCGGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO：447)或

5’TCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO：448)或

5’TCGACGTTCGGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO：449)或

5’TCGCGTCGTTCGGCGCCG 3’(SEQ ID NO：450)或

5’TCGCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO：451)或

5’TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO：452)或

5’TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG 3’(SEQ ID NO：453)或

5’TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG 3’(SEQ ID NO：454)或

5’TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGT 3’(SEQ ID NO：455)。

在任何这些序列中，所有键可全部均为硫代磷酸酯键。在另一实施方案中，在任何这些序列中，一或多个键可为磷酸二酯，优选位于CpG基序的“C”与“G”之间，从而产生半软CpG寡核苷酸。

C类寡核苷酸的一些非限制性实例包括：

5’T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’或

5’T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’或

5’T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’或

5’T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’或

5’T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’或

5’T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’或

5’T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’或

5’T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G 3’或

5’T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’或

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3’或

5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G 3’或

5’T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*A*C_G*G*C*G*C*C_G*T*G*C*C*G 3’或

5’T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3’，

其中*指硫代磷酸酯键且_指磷酸二酯键。

在任何这些序列中，乙基-尿苷或卤素可取代5’T；卤素取代的实例包括(但不限于)溴-尿苷或碘-尿苷取代。

“P类”CpG免疫刺激性寡核苷酸已描述于WO 2007/095316中且特征为其含有形成双链体的区域，例如在5’与3’端处或附近的完全或不完全回文，从而使其具有形成高级结构(诸如多联体)的可能。在一些情况下，这些称为P类寡核苷酸的寡核苷酸具有诱导比C类更高水平的IFN-α分泌的能力。P类寡核苷酸具有在体外和/或体内自发地自组装成多联体的能力。在不受关于这些分子的作用方法的任何特定理论束缚的情况下，一种潜在假说是，与先前所述种类的CpG寡核苷酸相比，此性质赋予P类寡核苷酸在某些免疫细胞内更高度交联TLR9的能力，从而诱导不同的免疫活化模式。

在一实施方案中，本发明的CpG寡核苷酸为含有5’TLR活化域及至少2个回文区域的P类CpG寡核苷酸，一个回文区域为长度为至少6个核苷酸的5’回文区域且直接或经由间隔物连接于长度为至少8个核苷酸的3’回文区域，其中该寡核苷酸包括至少一个YpR二核苷酸。在一实施方案中，该寡核苷酸不为T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G。在一实施方案中，P类CpG寡核苷酸包括至少一个未经甲基化的CpG二核苷酸。在另一实施方案中，TLR活化域为TCG、TTCG、TTTCG、TYpR、TTYpR、TTTYpR、UCG、UUCG、UUUCG、TTT或TTTT。在又一实施方案中，TLR活化域在5’回文区域内。在另一实施方案中，TLR活化域紧邻5’回文区域的5’端。在又一实施方案中，5’回文区域的长度为至少8个核苷酸。在另一实施方案中，3’回文区域的长度为至少10个核苷酸。在另一实施方案中，5’回文区域的长度为至少10个核苷酸。在又一实施方案中，3’回文区域包括未经甲基化的CpG二核苷酸。在另一实施方案中，3’回文区域包括两个未经甲基化的CpG二核苷酸。在另一实施方案中，5’回文区域包括未经甲基化的CpG二核苷酸。在又一实施方案中，5’回文区域包括两个未经甲基化的CpG二核苷酸。在另一实施方案中，5’及3’回文区域的双链体稳定性值为至少25。在另一实施方案中，5’及3’回文区域的双链体稳定性值为至少30。在另一实施方案中，5’及3’回文区域的双链体稳定性值为至少35。在另一实施方案中，5’及3’回文区域的双链体稳定性值为至少40。在另一实施方案中，5’及3’回文区域的双链体稳定性值为至少45。在另一实施方案中，5’及3’回文区域的双链体稳定性值为至少50。在另一实施方案中，5’及3’回文区域的双链体稳定性值为至少55。在另一实施方案中，5’及3’回文区域的双链体稳定性值为至少60。在另一实施方案中，5’及3’回文区域的双链体稳定性值为至少65。

在一实施方案中，两个回文区域直接连接。在另一实施方案中，两个回文区域经由3’-3’键连接。在另一实施方案中，两个回文区域有一个核苷酸重叠。在又一实施方案中，两个回文区域有两个核苷酸重叠。在另一实施方案中，两个回文区域不重叠。在另一实施方案中，两个回文区域由间隔物连接。在一实施方案中，该间隔物为长度为1-50个核苷酸的核酸。在另一实施方案中，间隔物为长度为1个核苷酸的核酸。在另一实施方案中，间隔物为非核苷酸间隔物。在一实施方案中，该非核苷酸间隔物为D-间隔物。在另一实施方案中，非核苷酸间隔物为接头。在一实施方案中，寡核苷酸具有式5’XP₁SP₂T 3’，其中X为TLR活化域，P₁为回文，S为间隔物，P₂为回文，且T为长度为0-100个核苷酸的3’尾。在一实施方案中，X为TCG、TTCG或TTTCG。在另一实施方案中，T的长度为5-50个核苷酸。在又一实施方案中，T的长度为5-10个核苷酸。在一实施方案中，S为长度为1-50个核苷酸的核酸。在另一实施方案中，S为长度为1个核苷酸的核酸。在另一实施方案中，S为非核苷酸间隔物。在一实施方案中，该非核苷酸间隔物为D-间隔物。在另一实施方案中，非核苷酸间隔物为接头。在另一实施方案中，寡核苷酸不为反义寡核苷酸或核糖核酸酶。在一实施方案中，P₁富含A及T。在另一实施方案中，P₁包括至少4个T。在另一实施方案中，P₂为完全回文。在另一实施方案中，P₂富含G-C。在又一实施方案中，P₂为CGGCGCX₁GCGCCG，其中X₁为T或不存在。

在一实施方案中，寡核苷酸包括至少一个硫代磷酸酯键。在另一实施方案中，寡核苷酸的所有核苷酸间键均为硫代磷酸酯键。在另一实施方案中，寡核苷酸包括至少一个磷酸二酯样键。在另一实施方案中，该磷酸二酯样键为磷酸二酯键。在另一实施方案中，亲脂性基团与寡核苷酸缀合。在一实施方案中，该亲脂性基团为胆固醇。

在一实施方案中，用于本发明的CpG寡核苷酸为P类CpG寡核苷酸，其具有5’TLR活化域及至少两个含有互补性的区域，即5’及3’含有互补性的区域，含有互补性的区域的长度各为至少8个核苷酸且直接或经由间隔物彼此连接，其中该寡核苷酸包括至少一个嘧啶-嘌呤(YpR)二核苷酸，且其中至少一个含有互补性的区域不为完全回文。在一实施方案中，寡核苷酸包括至少一个未经甲基化的CpG二核苷酸。在另一实施方案中，TLR活化域为TCG、TTCG、TTTCG、TYpR、TTYpR、TTTYpR、UCG、UUCG、UUUCG、TTT或TTTT。在另一实施方案中，TLR活化域在5’含有互补性的区域内。在另一实施方案中，TLR活化域紧邻5’含有互补性的区域的5’端。在另一实施方案中，3’含有互补性的区域的长度为至少10个核苷酸。在又一实施方案中，5’含有互补性的区域的长度为至少10个核苷酸。在一实施方案中，3’含有互补性的区域包括一个未经甲基化的CpG二核苷酸。在另一实施方案中，3’含有互补性的区域包括两个未经甲基化的CpG二核苷酸。在又一实施方案中，5’含有互补性的区域包括一个未经甲基化的CpG二核苷酸。在另一实施方案中，5’含有互补性的区域包括两个未经甲基化的CpG二核苷酸。在另一实施方案中，含有互补性的区域包括至少一个核苷酸类似物。在另一实施方案中，含有互补性的区域形成分子内双链体。在一实施方案中，该分子内双链体包括至少一个非Watson-Crick碱基对。在另一实施方案中，该非Watson-Cric碱基对为G-T、G-A、G-G或C-A。在一实施方案中，含有互补性的区域形成分子间双链体。在另一实施方案中，至少一个分子间双链体包括至少一个非Watson-Crick碱基对。在另一实施方案中，该非Watson-Crick碱基对为G-T、G-A、G-G或C-A。在又一实施方案中，含有互补性的区域含有一个错配。在又一实施方案中，含有互补性的区域含有两个错配。在另一实施方案中，含有互补性的区域含有一个间插核苷酸。在另一实施方案中，含有互补性的区域含有两个间插核苷酸。

在一实施方案中，5’及3’含有互补性的区域的双链体稳定性值为至少25。在另一实施方案中，5’及3’含有互补性的区域的双链体稳定性值为至少30。在另一实施方案中，5’及3’含有互补性的区域的双链体稳定性值为至少35。在另一实施方案中，含有互补性的区域的双链体稳定性值为至少40。在另一实施方案中，含有互补性的区域的双链体稳定性值为至少45。在另一实施方案中，含有互补性的区域的双链体稳定性值为至少50。在另一实施方案中，含有互补性的区域的双链体稳定性值为至少55。在另一实施方案中，含有互补性的区域的双链体稳定性值为至少60。在另一实施方案中，含有互补性的区域的双链体稳定性值为至少65。

在另一实施方案中，两个含有互补性的区域直接连接。在另一实施方案中，两个回文区域经由3’-3’键连接。在又一实施方案中，两个含有互补性的区域有一个核苷酸重叠。在另一实施方案中，两个含有互补性的区域有两个核苷酸重叠。在另一实施方案中，两个含有互补性的区域不重叠。在另一实施方案中，两个含有互补性的区域由间隔物连接。在另一实施方案中，该间隔物为长度为1-50个核苷酸的核酸。在另一实施方案中，间隔物为长度为1个核苷酸的核酸。在一实施方案中，间隔物为非核苷酸间隔物。在另一实施方案中，该非核苷酸间隔物为D-间隔物。在又一实施方案中，非核苷酸间隔物为接头。

在一实施方案中，P类寡核苷酸具有式5’XNSPT 3’，其中X为TLR活化域，N为不完全回文，P为回文，S为间隔物，且T为长度为0-100个核苷酸的3’尾。在另一实施方案中，X为TCG、TTCG或TTTCG。在另一实施方案中，T的长度为5-50个核苷酸。在另一实施方案中，T的长度为5-10个核苷酸。在另一实施方案中，S为长度为1-50个核苷酸的核酸。在另一实施方案中，S为长度为1个核苷酸的核酸。在另一实施方案中，S为非核苷酸间隔物。在另一实施方案中，该非核苷酸间隔物为D-间隔物。在另一实施方案中，非核苷酸间隔物为接头。在另一实施方案中，寡核苷酸不为反义寡核苷酸或核糖核酸酶。在另一实施方案中，N富含A及T。在另一实施方案中，N包括至少4个T。在另一实施方案中，P为完全回文。在另一实施方案中，P富含G-C。在另一实施方案中，P为CGGCGCX₁GCGCCG，其中X₁为T或不存在。在另一实施方案中，寡核苷酸包括至少一个硫代磷酸酯键。在另一实施方案中，寡核苷酸的所有核苷酸间键均为硫代磷酸酯键。在另一实施方案中，寡核苷酸包括至少一个磷酸二酯样键。在另一实施方案中，该磷酸二酯样键为磷酸二酯键。在另一实施方案中，亲脂性基团与寡核苷酸缀合。在一实施方案中，该亲脂性基团为胆固醇。

在一实施方案中，本发明的“P类”CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：5’TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO：456)。

在此类序列中，所有键均可为硫代磷酸酯键。在另一实施方案中，一或多个键可为磷酸二酯，优选位于CpG基序的“C”与“G”之间，从而产生半软CpG寡核苷酸。在任何这些序列中，乙基-尿苷或卤素可取代5’T；卤素取代的实例包括(但不限于)溴-尿苷或碘-尿苷取代。

P类寡核苷酸的一非限制性实例包括：

5’T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’，

其中*指硫代磷酸酯键且_指磷酸二酯键。

在一实施方案中，本文所揭示的CpG寡核苷酸的所有核苷酸间键均为磷酸二酯键(“软”寡核苷酸，如PCT申请案WO 2007/026190中所述)。在另一实施方案中，使得本发明的CpG寡核苷酸抗降解(例如稳定化)。“稳定的寡核苷酸”指相对地抗活体内降解(例如经由核酸外切酶或核酸内切酶)的寡核苷酸。核酸稳定亦可经由主链修饰来实现。具有硫代磷酸酯键的寡核苷酸提供最大活性且保护寡核苷酸不被细胞内核酸外切酶及核酸内切酶降解。

免疫刺激性寡核苷酸可具有嵌合主链，其具有磷酸二酯键与硫代磷酸酯键的组合。出于本发明的目的，嵌合主链指部分稳定的主链，其中至少一个核苷酸间键为磷酸二酯或磷酸二酯样键，且其中至少一个其它核苷酸间键为稳定的核苷酸间键，其中该至少一个磷酸二酯或磷酸二酯样键与该至少一个稳定的键不同。如PCT申请案WO 2007/026190中所述，当磷酸二酯键优先位于CpG基序中时，此类分子被称为“半软”。

其它经修饰的寡核苷酸包括磷酸二酯键、硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键、甲基硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键和/或p-乙氧基键的组合。

因为已报导硼烷膦酸酯键相对于磷酸二酯键为稳定的，所以出于主链的嵌合性质的目的，硼烷膦酸酯键可视上下文而分类为磷酸二酯样键或稳定的键。举例而言，在一些实施方案中，本发明的嵌合主链可包括至少一个磷酸二酯(磷酸二酯或磷酸二酯样)键及至少一个硼烷膦酸酯(稳定的)键。在其它实施方案中，本发明的嵌合主链可包括硼烷膦酸酯(磷酸二酯或磷酸二酯样)及硫代磷酸酯(稳定的)键。“稳定的核苷酸间键”应意谓与磷酸二酯核苷酸间键相比相对地抗活体内降解(例如经由核酸外切酶或核酸内切酶)的核苷酸间键。优选稳定的核苷酸间键包括(但不限于)硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及甲基硫代磷酸酯。其它稳定的核苷酸间键包括(但不限于)肽、烷基、去磷及如上文所述的其它键。

可使用自动化技术，采用氨基磷酸酯或H-膦酸酯化学法来合成经修饰的主链(诸如硫代磷酸酯)。芳基-膦酸酯及烷基-膦酸酯可例如如美国专利第4,469,863号中所述制备；且烷基磷酸三酯(其中带电氧部分经烷基化，如美国专利第5,023,243号及欧洲专利第092,574号中所述)可藉由自动化固相合成，使用市售试剂来制备。进行其它DNA主链修饰及取代的方法已有所描述。Uhlmann E等人(1990)Chem Rev 90：544；Goodchild J(1990)Bioconjugate Chem 1：165。制备嵌合寡核苷酸的方法亦为已知。举例而言，颁予Uhlmann等人的专利已描述此类技术。

混合的主链经修饰的ODN可如PCT申请案WO 2007/026190中所述合成。

本发明的寡核苷酸亦可包括其它修饰。这些修饰包括(但不限于)非离子DNA类似物，诸如烷基-磷酸酯及芳基-磷酸酯(其中带电膦酸酯氧由烷基或芳基置换)、磷酸二酯及烷基磷酸三酯(其中带电氧部分经烷基化)。在任一端或两端含有二醇(诸如四乙二醇或六乙二醇)的核酸亦显示实质上抗核酸酶降解。

CpG寡核苷酸的大小(亦即沿寡核苷酸的长度的核苷酸残基数目)亦可有助于寡核苷酸的刺激活性。为促进摄取至细胞中，本发明的CpG寡核苷酸的最小长度优选为6个核苷酸残基。若存在足够免疫刺激性基序，则任何大小大于6个核苷酸(甚至许多kb长)的寡核苷酸均能够诱导免疫反应，因为较大寡核苷酸在细胞内降解。在某些实施方案中，CpG寡核苷酸的长度为6至100个核苷酸，优选长度为8至30个核苷酸。在重要实施方案中，本发明的核酸及寡核苷酸不为质粒或表达载体。

在一实施方案中，本文所揭示的CpG寡核苷酸包含取代或修饰，诸如如WO 2007/026190的第134至147段中所述的碱基和/或糖中的取代或修饰。

在一实施方案中，本发明的CpG寡核苷酸以化学方式经修饰。化学修饰的实例为本领域技术人员所已知且例如描述于Uhlmann E.等人(1990)，Chem.Rev.90：543，S.Agrawal编，Humana Press，Totowa，USA 1993；Crooke，S.T.等人(1996)Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.36：107-129；及Hunziker J.等人，(1995)，Mod.Synth.Methods 7：331-417中。本发明的寡核苷酸可具有一或多种修饰，其中与由天然DNA或RNA构成的具有相同序列的寡核苷酸相比，修饰各位于特定磷酸二酯核苷间桥和/或特定β-D-核糖单元和/或特定天然核苷碱基位置。

在本发明的一些实施方案中，可根据本领域技术人员已知的方法，使含有CpG的核酸仅与免疫原性载体混合(例如参见WO 03/024480)。

在本发明的一特定实施方案中，本文所揭示的任一疫苗包含2μg至100mg CpG寡核苷酸，优选0.1mg至50mg CpG寡核苷酸，优选0.2mg至10mg CpG寡核苷酸，优选0.3mg至5mgCpG寡核苷酸，优选0.3mg至5mg CpG寡核苷酸，甚至优选0.5mg至2mg CpG寡核苷酸，甚至优选0.75mg至1.5mg CpG寡核苷酸。在一优选实施方案中，本文所揭示的任一疫苗包含约1mgCpG寡核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，可根据本领域技术人员已知的方法，使含有CpG的核酸仅与免疫原性载体混合(例如参见WO 03/024480)。在本发明的其它实施方案中，含有CpG的核酸可封闭于VLP中(例如参见WO03/024481)。

在本发明的情形下，优选佐剂包括明矾；含有CpG的寡核苷酸，优选为CpG 7909(SEQ ID NO：433)及CpG24555(SEQ ID NO：431)；及基于皂苷的佐剂，优选为Iscomatrix，其可单独使用或组合使用。优选地，该含有CpG的核酸包含一或多个经修饰的键，优选为一或多个硫代磷酸酯键，甚至更优选地，寡核苷酸的所有核苷酸间键均为硫代磷酸酯键。

因此，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含抗原性IgE肽，该抗原性IgE肽优选包含选自由SEQ ID No：1至430组成的组的氨基酸序列，更优选选自由SEQ ID No：1至153及220至430组成的组的氨基酸序列，甚至更优选选自由SEQ ID No：220至430组成的组的氨基酸序列；及至少一种佐剂。该抗原性IgE肽优选连接于如本文所揭示的免疫原性载体，优选为VLP，更优选为HBsAg、HBcAg或Qβ VLP。在一实施方案中，该佐剂为基于皂苷的佐剂，优选为Iscomatrix。在另一实施方案中，该佐剂为明矾。在又一实施方案中，该佐剂为含有CpG的核酸。该佐剂优选为CpG7909。该佐剂更优选为CpG24555。优选地，该含有CpG的核酸包含一或多个经修饰的键，优选为一或多个硫代磷酸酯键，甚至更优选地，寡核苷酸的所有核苷酸间键均为硫代磷酸酯键。

在又一实施方案中，该至少一种佐剂包含两种佐剂，优选选自由明矾、基于皂苷的佐剂及含有CpG的核酸组成的组。在一优选实施方案中，此类佐剂为明矾及含有CpG的核酸(优选为CpG7909或CpG24555，更优选为CpG24555)。优选地，该含有CpG的核酸包含一或多个经修饰的键，优选为一或多个硫代磷酸酯键，甚至更优选地，寡核苷酸的所有核苷酸间键均为硫代磷酸酯键。在另一优选实施方案中，此类佐剂为基于皂苷的佐剂(优选为Iscomatrix)及含有CpG的核酸(优选为CpG7909，更优选为CpG24555)。优选地，该含有CpG的核酸包含一或多个经修饰的键，优选为一或多个硫代磷酸酯键，甚至更优选地，寡核苷酸的所有核苷酸间键均为硫代磷酸酯键。在另一优选实施方案中，此类佐剂为明矾及基于皂苷的佐剂(优选为Iscomatrix)。

在又一实施方案中，该至少一种佐剂包含三种佐剂，优选选自由明矾、基于皂苷的佐剂(优选为Iscomatrix)及含有CpG的核酸(更优选为CpG7909，甚至更优选为CpG24555)组成的组。优选地，该含有CpG的核酸包含一或多个经修饰的键，优选为一或多个硫代磷酸酯键，甚至更优选地，寡核苷酸的所有核苷酸间键均为硫代磷酸酯键。

本发明的药物组合物

本发明亦提供药物组合物，其包含本发明的抗原性IgE肽或其免疫原性组合物，该抗原性IgE肽或其免疫原性组合物在与一或多种医药学上可接受的赋形剂缔合及任选与一或多种佐剂(如上文所述的佐剂)组合的配制物中。术语“赋形剂”在本文中用于描述除活性成份(亦即最后与免疫原性载体偶联及任选与一或多种佐剂组合的本发明的抗原性IgE肽)外的任何成份。赋形剂的选择将在很大程度上视诸如特定施用方式、赋形剂对溶解性及稳定性的作用及剂型的性质的因素而定。如本文中所使用，“医药学上可接受的赋形剂”包括任何及所有溶剂、分散介质、涂料、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延缓剂及生理学上相容的类似物。医药学上可接受的赋形剂的一些实例为水、生理食盐水、磷酸盐缓冲生理盐水、右旋糖、甘油、乙醇及其类似物以及其组合。在多数情况下，优选该组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。医药学上可接受的物质的其它实例为湿润剂或少量辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，其增加活性成份的存放期或增强活性成份的有效性。

本发明的药物组合物及其制备方法对于本领域技术人员为显而易知。此类组合物及其制备方法可见于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第19版(MackPublishing Company，1995)中。药物组合物优选在GMP条件下制造。

本发明的药物组合物可以单一单位剂量形式或以多单一单位剂量形式整批制备、包装或出售。如本文中所使用，“单位剂量”为包含预定量活性成份的药物组合物的个别量。活性成份的量一般等于向个体施用的活性成份的剂量或该剂量的合适部分(例如该剂量的一半或三分之一)。

本领域所接受的任何施用肽或蛋白质的方法均可适当地用于本发明的肽或蛋白质。

本发明的药物组合物通常适于非经肠施用。如本文中所使用，药物组合物的“非经肠施用”包括任何特征在于物理破坏个体的组织及经由该组织的破口施用药物组合物，由此一般导致直接投入血流、肌肉或内脏器官中的施用途径。因此，非经肠施用包括(但不限于)藉由注射组合物、经由手术切口施用组合物、经由组织刺穿非手术创口施用组合物及其类似方式施用药物组合物。非经肠施用特别包括(但不限于)皮下、腹膜内、肌肉内、胸骨内、静脉内、动脉内、鞘内、室内、尿道内、颅内、滑膜内注射或输注；及肾渗析输注技术。优选实施方案包括静脉内、皮下、皮内及肌肉内途径，甚至更优选实施方案为肌肉内或皮下途径。

适于非经肠施用的药物组合物的配制物通常一般包含活性成份与医药学上可接受的载体(诸如灭菌水或灭菌等渗盐水)组合。此类配制物可以适于大丸剂(bolus)施用或连续施用的形式制备、包装或出售。可注射配制物可以单位剂型制备、包装或出售，诸如安瓿或含有防腐剂的多剂量容器。用于非经肠施用的配制物包括(但不限于)悬浮液、溶液、于油性或水性媒剂(vehicle)中的乳液、糊剂及其类似物。此类配制物可进一步包含一或多种其它成份，包括(但不限于)悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于非经肠施用的配制物的一个实施方案中，活性成份以干燥(亦即粉末或颗粒)形式提供以在用适合媒剂(例如灭菌无热原质水)复原之后非经肠施用复原组合物。非经肠配制物亦包括可含有诸如盐、碳水化合物及缓冲剂的赋形剂的水溶液(优选pH 3至9)，但对于一些应用，可更适当地配制为灭菌非水溶液或干燥形式以与适合媒剂(诸如灭菌无热原质水)结合使用。例示性非经肠施用形式包括于灭菌水溶液(例如丙二醇水溶液或右旋糖水溶液)中的溶液或悬浮液。必要时，此类剂型可适当地缓冲处理。其它适用的可非经肠施用配制物包括呈微晶形式或脂质体制剂形式的包含活性成份的配制物。用于非经肠施用的配制物可配制成立即释放和/或修饰释放。修饰释放配制物包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放及程控释放(programmed release)。

举例而言，在一方面中，无菌可注射溶液可藉由将所需量的抗IgE肽(优选与免疫原性载体偶联，最后与一或多种佐剂组合)并入具有一种上文所列举的成份或上文所列举的成份组合的适当溶剂中，根据需要随后过滤灭菌来制备。一般藉由将活性化合物并入含有基础分散介质及来自那些上文所列举的所需其它成份的无菌媒剂中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥及冻干，此自其先前无菌滤液得到活性成份加上任何其它所需成份的粉末。可例如藉由使用涂料(诸如卵磷脂)，藉由在分散液情况下维持所需粒径及藉由使用表面活性剂来维持溶液的适当流动性。可注射组合物的长时期吸收可藉由在该组合物中包括延缓吸收的药剂(例如单硬脂酸盐及明胶)来实现。

本发明的例示性、非限制性药物组合物为呈无菌水溶液的配制物，其pH值在约5.0至约6.5的范围内且包含约0.1mg/mL至约20mg/mL本发明的肽、约1毫摩尔至约100毫摩尔组氨酸缓冲液、约0.01mg/mL至约10mg/mL聚山梨醇酯80、约100毫摩尔至约400毫摩尔海藻糖及约0.01毫摩尔至约1.0毫摩尔二水合EDTA二钠。

本发明的抗原性IgE肽亦可经鼻内施用或藉由吸入来施用，通常以干粉形式(单独，以混合物形式，或以混合组份颗粒形式，例如与合适的医药学上可接受的赋形剂混合)自干粉吸入器来施用，在使用或不使用合适的推进剂的情况下以气溶胶喷雾形式自加压容器、泵、喷雾器、雾化器(优选为利用电流体动力学来产生细雾的雾化器)或喷洒器来施用，或以滴鼻剂形式施用。

该加压容器、泵、喷雾器、雾化器或喷洒器一般含有本发明的抗体的溶液或悬浮液，其包含例如适合于分散、溶解活性物质或延长活性物质释放的药剂，作为溶剂的推进剂。

在以干粉或悬浮液配制物形式使用之前，一般将药品微粒化至适合于藉由吸入送递的大小(通常小于5微米)。此可藉由任何适当磨碎方法来达成，诸如螺旋喷射研磨、流体床喷射研磨、形成纳米颗粒的超临界流体处理、高压均质化或喷雾干燥。

用于吸入器或吹入器的胶囊、发泡药及药筒可配制成含有本发明的化合物、合适的粉末基及效能调节剂的粉末混合物。

适合用于利用电流体动力学来产生细雾的雾化器的溶液配制物可含有适合每次驱动剂量的本发明的抗原性IgE肽且驱动体积可例如在1μL至100μL的范围内变化。

可将合适的芳香剂(诸如薄荷脑及左旋薄荷脑)或甜味剂(诸如糖精或糖精钠)添加至欲用于吸入/鼻内施用的本发明的配制物中。

用于吸入/鼻内施用的配制物可配制成立即释放和/或修饰释放。修饰释放配制物包括延缓释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放及程序释放。

在干粉吸入器及气溶胶的情况下，藉助于传递计量的量的阀门来确定剂量单位。本发明的单位通常配置成施用计量剂量或“喷一次剂量”(puff)的本发明的抗体。总日剂量通常将以单次剂量施用或更通常以分次剂量全天施用。

包含抗原性IgE肽的药物组合物亦可经配制用于经口途径施用。经口施用可包括吞咽，以致化合物进入胃肠道中；和/或颊内、经舌或舌下施用，藉此化合物直接自口腔进入血流中。

适合于经口施用的配制物包括固体、半固体及液体系统，诸如片剂；含有多微粒或纳米微粒、液体或粉末的软胶囊或硬胶囊；锭剂(填有液体)；咀嚼片；凝胶；快速分散剂型；薄膜；卵形栓剂(ovule)；喷雾剂；及颊内/粘膜粘着贴片。

液体配制物包括悬浮液、溶液、糖浆及酏剂。此类配制物可以软胶囊或硬胶囊(例如由明胶或羟丙基甲基纤维素制成)中的填充剂形式使用且通常包含载体(例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素或合适的油)及一或多种乳化剂和/或悬浮剂。液体配制物亦可藉由复原固体(例如来自囊剂)来制备。

本发明的组合物可用于藉由用免疫治疗刺激处于罹患IgE介导病症或症状的风险中的对象的免疫应答来治疗、减轻或预防该对象的此类病症或症状。免疫治疗可包含初始免疫，随后为另外(例如一次、两次、三次或三次以上)加强免疫。

本发明的抗原性IgE肽或其组合物的“免疫有效量”为以单次剂量形式或以一系列的一部分形式送递至哺乳动物对象的量，该量可有效诱导该个体针对IgE的免疫反应。此量视欲治疗个体的健康及身体状况、欲治疗个体的分类组、个体免疫系统合成抗体的能力、疫苗的配制物及其它相关因素而变化。预期该量将在相对宽的范围内，此可经由常规试验来测定。

“药物学有效的剂量”或“治疗有效剂量”为治疗或预防或减轻对象的一或多种IgE相关病症或症状所需的剂量。该药物学有效的剂量视欲施用的特定化合物、症状的严重程度、对象对副作用的敏感性、疾病类型、所用组合物、施用途径、所治疗哺乳动物的类型、值得考虑的特定哺乳动物的身体特征(诸如健康及身体状况)、同时使用的药物、个体免疫系统合成抗体的能力、所需预防程度及熟习医学技术者将认识到的其它因素而定。出于预防目的，选择各剂量中的肽量为诱导典型接种疫苗者的免疫保护应答而无显著不良副作用的量。在初始接种疫苗后，个体可接受一或若干次适当间隔的加强免疫作用。

应了解用于任何特定患者的特定剂量视多种因素而定，包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径及排泄率、药物组合及进行治疗的特定疾病的严重程度。

举例而言，本发明的抗原性IgE肽或药物组合物可以约0.1μg至约200mg的剂量向个体施用，例如约0.1μg至约5μg、约5μg至约10μg、约10μg至约25μg、约25μg至约50μg、约50μg至约100μg、约100μg至约500μg、约500μg至约1mg、约1mg至约2mg，其中任选在随后例如1周、2周、3周、4周、2个月、3个月、6个月和/或1年给与加强免疫。

在一些实施方案中，施用单次剂量的本发明的抗原性IgE肽或药物组合物。在其它实施方案中，施用多次剂量的本发明的抗原性IgE肽或药物组合物。施用频率可视多种因素中的任一者而变化，例如症状的严重程度、所需免疫保护程度、组合物用于预防性目的或是治愈性目的等。举例而言，在一些实施方案中，如下施用本发明的抗原性IgE肽或药物组合物：每月一次、每月两次、每月三次、每隔一周(qow)、每周一次(qw)、每周两次(biw)、每周三次(tiw)、每周四次、每周五次、每周六次、每隔一日(qod)、每日(qd)、每日两次(qid)或每日三次(tid)。当本发明的组合物用于预防目的时，其一般将以初次剂量与加强剂量施用。预期加强剂量将适当地间隔，或优选每年给与或以使得循环抗体的含量降至所需含量之下的次数给与。加强剂量可由抗原性IgE肽组成而无原始免疫原性载体分子。此类加强构建体可包含选择性免疫原性载体或可无任何载体。此类加强组合物可在佐剂存在或不存在下进行配制。

施用本发明的抗原性IgE肽的持续时间(例如施用抗原性IgE肽所经时段)可视多种因素(例如患者应答等)中的任一者而变化。举例而言，抗原性IgE肽可经如下范围的时段施用：约1日至约1周、约2周至约4周、约1个月至约2个月、约2个月至约4个月、约4个月至约6个月、约6个月至约8个月、约8个月至约1年、约1年至约2年、或约2年至约4年或更长时间。

本发明亦涵盖各种治疗方法，此类方法包含施用本发明的抗原性IgE肽。本发明治疗方法包括诱导个体对自身IgE的免疫应答的方法，及预防、减轻或治疗个体的IgE介导的病症或症状的方法。

在一方面中，本发明提供一种治疗、预防或减轻对象的IgE相关病症或症状的方法，其包含向该对象施用治疗有效量的本发明的抗原性IgE肽或其免疫原性或药物组合物。

在另一方面中，本发明提供一种在对象中诱导针对自身IgE的免疫应答的方法，其包含向该对象施用治疗有效或免疫有效量的本发明的抗原性IgE肽或其免疫原性或药物组合物。

“治疗”指减轻或消除生物学病症和/或其至少一种伴随症状的方法。如本文中所使用，“减轻”疾病、病症或病状意谓降低该疾病、病症或病状的症状的严重程度和/或出现频率。此外，本文中提及“治疗”包括提及治愈性、缓解性及预防性治疗。该对象优选为人类且可为任何年龄的男性或女性。

本发明的其它方面涉及本发明的抗原性IgE肽或其免疫原性组合物或药物组合物，其用作药物，优选用于治疗、减轻或预防IgE相关病症。

在另一方面中，本发明提供本发明的抗原性IgE肽或其免疫原性组合物或药物组合物的用途，其用于制造优选用于治疗IgE介导的病症的药物。

在本发明的用途或方法的一些方面中，该IgE介导的病症选自由以下组成的组：结膜炎、过敏性哮喘、过敏性鼻炎、异位性皮肤炎、重度过敏、哮喘、接触性皮肤炎、过敏性胃肠病、过敏性肺曲菌病、过敏性紫癜、湿疹、高IgE(乔布氏)综合症、过敏性过敏反应、IgE骨髓瘤、炎性肠病(例如克罗恩氏病(Crohn’s disease)、食物过敏、溃疡性结肠炎、未定型结肠炎且传染性结肠炎)、荨麻疹、牛皮癣，优选选自由哮喘、过敏性哮喘、过敏性鼻炎及食物过敏组成的组。

哮喘是气管的慢性发炎性病症，其引起敏感性个体的喘鸣、气喘(breathlessness)、胸闷和/或咳嗽的复发性事件。本领域技术人员可区分出各种类型的哮喘，包括：过敏性哮喘，其被认为出现在已对环境过敏原产生过敏反应的患者中；药物诱发性哮喘，通常由对阿司匹林(aspirin)或其它COX抑制剂的敏感性而引发；运动诱发性哮喘；濒死性及超急性哮喘；夜间哮喘；职业性哮喘，一般由在工作场所接触某些化学品引起。因此，哮喘可由多种刺激引发，包括：空浮过敏原，诸如尘螨、花粉、动物皮屑、真菌孢子、羽毛...(外因性哮喘)；非特定刺激，诸如烟草烟雾、化学烟尘、污染、二氧化硫...(内因性哮喘)。

过敏性鼻炎一般包括许多症状，包括主要位于鼻、鼻窦及眼睛处的发炎性症状，其在接触空气传播的颗粒后出现。症状包括打喷嚏；鼻塞；流涕(及有时流鼻血)；咳嗽；头痛；接触过敏原的鼻、口、眼睛、喉咙、皮肤或任何区域发痒；嗅觉功能受损(及因此对芳香剂敏感)；鼻子不通气(鼻充血)；结膜炎；流眼泪(watering eye)；喉咙痛；及喘鸣。

过敏性鼻炎可为常年性和/或季节性的。常年性过敏性鼻炎为持续一整年的过敏性鼻炎。其通常由连续接触诸如动物皮屑、室内霉菌孢子或室内尘螨的过敏原引起。季节性过敏性鼻炎为仅出现在一年的某些时间内的过敏性鼻炎。其通常由对季节性产生的树、草及野草花粉的过敏引起。

食物过敏为由鸡蛋、花生、牛奶或一些其它特定食物引发的过度免疫反应。任何食物均可引起过敏反应，但少数食物为罪魁祸首。在儿童中，最常见食物过敏为鸡蛋、花生、牛奶、大豆、坚果(tree nuts)、小麦、贝类(虾、蟹、龙虾、蜗牛、蛤蜊)。在大龄儿童及成人中，最常见食物过敏为：花生、坚果、贝类、鱼类。症状可主要限于胃及肠道，或在消化或吸收食物后可涉及身体许多部分。症状可包括：喉咙沙哑、重度过敏(会导致死亡的重度全身过敏反应)；腹痛；腹泻；恶心；呕吐；胃痉挛；口、喉咙、眼睛、皮肤或任何区域发痒；荨麻疹；血管性水肿(肿胀，尤其眼睑、面部、唇及舌)；头晕目眩或昏厥；鼻充血；流涕；呼吸急促；喘鸣；吞咽困难；口腔过敏综合症。该口腔过敏综合症一般包含唇、舌及喉咙发痒，及有时唇肿。

在本发明的用途或方法的其它方面中，该对象为哺乳动物，优选为人类对象。

在本发明的用途或方法的其它方面中，该对象罹患该IgE介导的病症。或者，该个体处于罹患该IgE介导的病症的风险中。

实施例

提出以下实施例以便提供一般本领域技术人员如何进行及使用本发明的完整的揭示及描述，不欲限制发明者视为其发明的范畴，其亦不欲表示以下实验为所执行的全部或唯一实验。已努力确保所用数字(例如量、温度等)的准确度，但应考虑一些实验误差及偏差。除非另外指示，否则份数为重量份，分子量为重量平均分子量，温度以℃计，且压力为大气压或接近大气压。可使用标准缩写，例如：bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌肉内(经肌肉内)；i.p.，腹膜内(经腹膜内)；s.c.，皮下(经皮下)；及其类似缩写。

实施例1.选择抗原性IgE肽

与IgE高亲和力受体FceRIα亚单位相互作用的人类IgE的恒定域CH3-CH4的结构已解出及公开(Wurzburg BA等人，(2000)Immunity，I3(3)，375-85；Garman SC等人，(2000)Nature 20，406(6793)，259-66)。此结构信息与提出两个区域发生结合的文献一起使用以将4个潜在环鉴别为关键相互作用点且设计以下4种对应于对于IgE-FceRI相互作用为重要的区域的肽(参见图1)。

紫色：ADSNPRGVSAYLSRPSP(SEQ ID No：312)、

蓝色：LVVDLAPSKGTVN(SEQ ID No：165)、

橙色：STRKEEKQRNGTLTVTSTLP(SEQ ID No：1)、

黄色：QCRVTHPHLPRALMRS(SEQ ID No：220)。

实施例2.制备紫色-VLP缀合物

使用标准Fmoc方案，在CLEAR酰胺树脂上合成出于缀合目的而添加末端半胱氨酸残基的紫色肽(SEQ ID No：312)(序列ADSNPRGVSAYLSRPSPC(SEQ ID No：434))。在HOBt(羟基苯并三唑)及NMM(N-甲基吗啉)存在下使用5倍过量的经1当量HBTU(六氟磷酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基)活化的受Fmoc保护的氨基酸进行氨基酸偶联反应。用20％哌啶/DMF脱除Fmoc基团。接着裂解结合树脂的肽且同时用试剂D(TFA/H₂O/DODT：89/3/8)移除侧链保护基。该肽制备成具有游离N端及酰胺化C端。藉由HPLC，使用BEH 130 C18柱及水/乙腈梯度，在0.1％TFA存在下纯化粗肽至均质。使用冻干器真空干燥经纯化的肽。使用质谱分析法(LC-MS)分析该肽且得到令人满意的数据(参见下文)。

表1

肽	纯度	预期质量(Da)	观察质量(Da)
				紫色+半胱氨酸(SEQ ID NO：434)	95％	1877.1	1878.1

在两个独立缀合实验中使紫色+半胱氨酸(SEQ ID NO：434)与病毒样颗粒(VLP)Qβ及B型肝炎表面抗原(HBsAg)缀合。用于此研究中的Qβ藉由在并有编码以下14kD单体蛋白质的pET28质粒的BL21(DE3)菌株中细菌大肠杆菌发酵来制造：MAKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQAYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY(SEQ ID NO：435)。在0.8的OD600下用IPTG诱导该发酵物且使其在具有卡那霉素(kanamycin)的极品肉汤(terrific broth，TB)中继续下去过夜。接着使用专利申请案EP20050105513中所述的方法，自发酵细胞团块(pellet)纯化在宿主细胞中自组装的VLP，以下为不同之处：在细胞破碎后，用50％饱和硫酸铵处理澄清的匀浆且藉由离心回收细胞团块。接着将该团块再溶解于HEPES缓冲液中且相对于HEPES缓冲液进行透析，随后进行公开方法中的第一柱步骤。在离子交换柱及羟磷灰石柱步骤后，使用另一阴离子交换柱步骤纯化物质且无菌过滤，产生最终VLP块状物质，藉由尺寸排阻层析、SDS-PAGE及电子显微术进行分析，得到可接受的结果。

用于此研究中的HBsAg(adw亚型)购自Aldevron(ND，USA)。HBsAg以直径约22nm的球状颗粒形式存在，其由包埋于脂质双层小泡中的24kD单体蛋白的多个拷贝组成。用于制造此类型的HBsAg的酿酒酵母(S.Cerevisiae)菌株亦可自ATCC菌种保藏中心获得。

使用N-γ-顺丁烯二酰亚胺基-丁酰氧基-丁二酰亚胺酯(GMBS)连接试剂活化VLP(Qβ与HBsAg)。将GMBS试剂溶解于二甲亚砜(DMSO)中且以≥10倍摩尔过量添加至VLP溶液中。使活化反应进行≥30分钟且接着使用NAP-25除盐柱，于具有5mM EDTA的Dulbeccos磷酸盐缓冲生理盐水(Dulbeccos Phosphate Buffered Saline，DPBS)中使溶液除盐。必要时，在下一结合反应之前，使用10kD旋转微量浓缩器略微浓缩蛋白质溶液。

在缀合反应之前，将紫色肽溶解于具有5mM EDTA作为添加剂的pH7.4DPBS的等分试样中。该呈溶液状态的肽的浓度为10mg/ml。将溶解的肽添加至已用含有5mM EDTA的DPBS洗涤的经TCEP固定的还原剂(Pierce Chemical)的等分试样中。藉由在TCEP凝胶存在下混合，将肽的等分试样孵育约1小时，此后在微量离心机中离心该等分试样且丢弃固体团块。将还原的含肽上清液直接添加至早已制备好的活化VLP中。

在极平缓混合下，使VLP与还原的肽之间的反应进行至少30分钟。在反应时间结束时，使用NAP-10或NAP-25除盐柱(GE Healthcare)，于Dulbeccos PBS(DPBS)中使各样品除盐。使用Bradford(考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)，Pierce Chemical)测定以及藉由SDS-PAGE及尺寸排阻层析来分析经除盐的缀合肽的蛋白质含量。使用0.22μm过滤器对缀合产物进行无菌过滤且储存于2-8℃下直至使用的时。在储存期间小心注意这些样品以防止冷冻或暴露于极端温度。

使用SDS-PAGE量测两种VLP-肽样品的缀合程度，观察到两种样品的分子量增加，此与将肽添加至VLP蛋白单体中一致。另外，在HPLC尺寸排阻层析测定(使用TosohPWXL5000HPLC管柱)中测试Qβ-肽样品且当与未缀合的VLP样品相比时发现其含有经组装的VLP。此外，利用电子显微术，使用JEOL 1230TEM，以80kV光束观察Qβ-肽样品，发现其含有经组装的均匀颗粒。使用非还原SDS-PAGE测试HBsAg-肽缀合物颗粒的完整性，因为蛋白质不进入凝胶中，所以认为样品含有高分子质量物质且适合体内使用。

实施例3.制备橙色-VLP、紫色-VLP、黄色-VLP及蓝色-VLP缀合物以及紫色受限制-VLP及蓝色改良-VLP缀合物

根据本领域中已知的方法及主要根据实施例2中的方案如下合成黄色肽、蓝色+半胱氨酸肽、紫色+半胱氨酸肽及橙色+半胱氨酸肽，其氨基酸序列在表2中指示。在Symphony肽合成器上，使用标准Fmoc方案，在CLEAR酰胺树脂上合成此类肽，除了在预装填的Fmoc-Ser(tBU)-Wang树脂上制备黄色肽。关于偶联反应及脱除保护基的详情，请参见实施例2。所有肽均制备成具有游离N端及酰胺化C端，除了黄色肽制备成具有乙酰化N端及羧化C端。如实施例2中，在HPLC系统上，用BEH 130 C18柱纯化粗肽。使用冻干器真空干燥经纯化的肽。最后，用LC-MS分析肽且所有肽均得到令人满意的数据(参见下表3)。

由CEM Corporation(Matthews，NC，USA)制造蓝色改良肽及紫色受限制肽。使用标准肽化学技术制造此类肽且使用层析进行纯化。使用LC-MS分析经纯化的肽且发现具有高纯度(＞95％)(参见下表3)。

表2.肽序列

下划线表示用于缀合目的的半胱氨酸残基且双下划线表示GC接头。

表3.肽的LC-MS数据。

分批使各肽与病毒样颗粒(VLP)Qβ缀合。如实施例2中，用于此研究中的Qβ藉由细菌大肠杆菌发酵及大批纯化来制造。

如以上实施例2中所述，使用来自Pierce Chemical的N-γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酰氧基-丁二酰亚胺酯(GMBS)连接试剂活化VLP(根据Bradford测定，蛋白质浓度＞1mg/ml)。

在缀合反应之前，将各肽溶解于具有5mM EDTA作为添加剂的pH 7.4Dulbeccos磷酸盐缓冲生理盐水(DPBS)的等分试样中。呈溶液状态的各肽的浓度在8-12mg/ml范围内，关于精确数据请参见下表4。如以上实施例2中所述，将溶解了的肽添加至经TCEP固定的还原剂的等分试样中。将还原的含肽上清液直接添加至早已制备好的活化VLP中。

在极平缓混合下，使VLP与还原的肽之间的反应进行至少30分钟。在反应时间结束时，使用NAP-10或NAP-25除盐柱(GE Healthcare)，于DulbeccosPBS(DPBS)中使各样品除盐。接着使用10kD MWCO旋转浓缩器来浓缩经除盐的缀合肽，且使用Bradford(考马斯亮蓝，Pierce Chemical)测定以及藉由SDS-PAGE及尺寸排阻层析来分析蛋白质含量，详情参见下文。使用0.22μm过滤器对缀合产物进行无菌过滤且储存于2-8℃下直至使用。在储存期间小心注意这些样品以防止冷冻或暴露于极端温度。如以上实施例2中所述，分析VLP-肽结合物的缀合及颗粒组装的程度(SDS-PAGE，包括密度测定法、电子显微术及尺寸排除HPLC)。

表4.VLP-肽缀合物

^*如藉由SDS-PAGE及密度测定计算所测定

实施例4：制备橙色-KLH、紫色-KLH、黄色-KLH及蓝色-KLH缀合物以及紫色受限制-KLH及蓝色改良-KLH缀合物

如下使表2的肽与购自Pierce Chemical(Rockford，Illinois，USA)的KLH缀合且纯化。如以上实施例2及3中所详述制备此类肽。所用KLH为由Pierce Chemical以冻干固体形式供应的Imject顺丁烯二酰亚胺活化KLH。在添加肽之前，用组织培养级水复原具有此KLH的小瓶。如以上实施例2及3中所述，用TCEP凝胶处理肽且将还原的含肽上清液直接添加至活化KLH溶液的等分试样中并在平缓混合下孵育。使偶联反应进行2小时，此时离心溶液以移除固体且如前述使用重力滴液除盐柱进行除盐。藉由SDS-PAGE、Bradford蛋白质测定及胰蛋白酶消化、随后MS-MALDI分析来分析经除盐的缀合物。使用0.22μm过滤器对缀合物进行无菌过滤且保持于2-8℃下直至使用，不推荐冷冻KLH溶液。

实施例5.IgE肽鉴别

此研究的目的在于评估与Qβ VLP结合的肽(如以上实施例2及3中所详述)如何有效诱导可结合于人类IgE的抗体应答。在第0、19及34天，藉由肌肉内途径注射雌性Balb/c(6-8周)(将50微升体积注入各胫前肌中)。在第46天进行尸检。尸检时，藉由心脏穿刺，自安乐死的小鼠取得400-600微升血液样品。使血液凝结过夜且次日收集血清。

针对一些或所有以下测定研究免疫动物的抗体应答：a)IgG效价测定、b)与血清游离IgE结合、c)与结合FceRI的IgE结合、d)去颗粒测定及e)IgE定量测定。

a)总IgG效价测定

概述：比色ELISA，其产生用来表示对疫苗具有特异性的总IgG分子水平的倒数效价(reciprocal titer，RT)。由血清样品制备连续稀释液且在测定中测试。使用由合并的接种Ce3的小鼠血清样品制备的血清样品作为阳性对照。使用来自Harlan Labs的Balb/c阴性血清作为阴性对照组(合并自400只动物，Harlan laboratories编号R-0131D)。涂覆测定板：用每孔25μL以0.01M PBS(pH 7.4)稀释至1μg/mL的人类Ce3Ce4蛋白储备液涂覆384孔高结合测定板(Corning International，目录号3700)且于室温下在震荡器上孵育3小时。用PBS(pH 7.4)洗涤板2次后，使用每孔80μL 0.01M PBS/1％BSA封闭板，于室温下孵育1小时，随后最后用0.01M PBS(pH 7.4)/0.05％吐温20洗涤3次。样品制备及测定：第二天，以1∶100稀释液(PBS/1％BSA稀释剂)开始制备各样品的8点1/2对数连续稀释液，将每孔25μL连续稀释液一式两份转移至涂有人类Ce3Ce4的板中，接着于室温下震荡孵育1.5小时。用0.01MPBS(pH 7.4)/0.05％吐温20洗涤3次后，每孔添加25μL以0.01M PBS(pH 7.4)/1％BSA 1∶6000稀释的总IgG检测抗体(兔抗mu IgG-Fc，目录号A90-130A，Bethyl Laboratories)，接着于室温下震荡孵育1小时。用0.01M PBS(pH 7.4)/0.05％吐温20洗涤5次后，每孔添加25μL以0.01M PBS(pH 7.4)/0.05％吐温20(pH 7.4)1∶3000稀释的Bio-Rad试剂盒山羊抗兔辣根过氧化酶缀合物(Bio-Rad，目录号172-1019)，接着于室温下震荡孵育1小时。用0.01MPBS(pH 7.4)/0.05％吐温20洗涤4次，接着用0.01M PBS(pH 7.4)仅洗涤1次后，每孔添加25μL小鼠Typer HRP底物(Bio-Rad，目录号172-1064)，接着于室温下孵育30分钟。每孔添加25μL 2％草酸，于吸光度405nm下读取。数据分析：藉由获得由适当研究阴性对照组的最低浓度产生的重复读数的平均值且将此值乘以2.5来计算截断值(吸光度405nm)。绘制各试样的滴定曲线(样品效价相对于吸光度405nm)且自计算出的截断值预测样品效价(随后转化为倒数效价)。

b)游离IgE结合效价

概述：电化学发光(ECL)测定，其产生用来表示在测试血清的连续稀释液与高浓度的人类IgE一起孵育过夜后的小鼠IgG:人类IgE复合物形成水平的倒数效价(RT)及最大值。使用由合并的接种Ce3的小鼠血清样品制备的血清样品以及以50μg/mL及1mg/mL加入来自Harlan Labs的Balb/c阴性血清(合并自400只动物，Harlan laboratories编号R-0131D)中的针对人类IgE Ce3域的区域的小鼠抗体(AbDserotec 0100-0413(E411(5H2))作为阳性对照组，该抗体亦单独用作阴性对照组。将样品与人类IgE一起孵育：以1∶3稀释液(0.01M PBS(pH 7.4)/1％BSA稀释剂)开始制备各样品(包括对照组)的8点1/2对数连续稀释液。将10μL体积的各样品浓缩物与10μL的100μg/mL人类IgE(使用0.01M PBS(pH 7.4)/1％BSA自储备液稀释)混合，接着密封板且于4℃下孵育过夜。涂覆测定板：第二天，用每孔12μL以0.01MPBS(pH 7.4)稀释至1μg/mL的针对人类IgE的绵羊pAb(Gentaur，ICL(ImmunologyConsultants Lab)，目录号SE-80A)涂覆384孔测定板(Meso-Scale Diagnostics(MSD)标准结合，目录号L11XA-1、0370PA)，接着于室温下在震荡器上孵育2小时。用0.01M PBS(pH7.4)洗涤板3次，每孔使用25μL Pierce起始封闭缓冲液(Pierce Biotech.目录号37538)封闭板且于室温下在震荡器上孵育40分钟，随后最后用0.01M PBS(pH 7.4)洗涤3次。样品制备及测定：用每孔80μL 0.01M PBS(pH 7.4)/1％BSA以1∶5稀释20μL体积的血清与人类IgE的过夜孵育混合物且接着将每孔12μL一式两份转移至经涂覆的MSD测定板中。于室温下在震荡器上孵育2小时后，用0.01M PBS(pH 7.4)/0.05％吐温20洗涤板3次。每孔添加12μL用0.01M PBS(pH 7.4)/1％BSA以1∶5000稀释的检测抗体(针对小鼠IgG H+L的驴pAb，Abcam目录号ab6707，MSD标记磺酸基的抗体，使用MSD目录号R91AN-1)，接着于室温下震荡孵育1小时。用0.01M PBS(pH 7.4)/0.05％吐温20洗涤3次后，每孔添加50μL用MQ水以1∶2稀释的具有表面活性剂的MSD读取缓冲液T(4×)(MSD目录号R92TC)。使用MSD Sector成像器6000对板进行读取。

数据分析：藉由获得由适当研究阴性对照组的最低浓度产生的重复读数的平均值且将此值乘以5来计算截断值(像素)。绘制各试样的滴定曲线(样品效价相对于像素)且自计算出的截断值预测样品效价(随后转化为倒数效价)。亦记录滴定曲线的最大峰值。

c)与结合受体的IgE结合

此测定测量来自疫苗接种的小鼠血清中的抗体是否可结合于一些结合于RBL-THE细胞表面上的FceRI受体的人类IgE，接着由与藻红蛋白缀合的抗小鼠Fc特异性抗体检测那些抗体且由流式细胞术测量荧光。使用用未疫苗接种的BALBc血清稀释的来自Biodesign的抗人类IgE抗体作为阳性对照。测定：将冷冻的RBL-THE细胞(p12，每毫升10×10⁶个细胞)解冻且用测定缓冲液(PBS-5％山羊血清)洗涤一次。将封闭缓冲液(PBS-5％山羊血清-0.1mg/ml小鼠Fab(ChromPure小鼠IgG，Fab片段-Jackson Immunoresearch))中的每孔2×10⁵个细胞接种于96孔板中且在4℃震荡器上孵育1小时30分钟。每孔添加50μl的4μg/ml人类IgE(用测定缓冲液稀释)(除了对照孔Biodesign无IgE、仅细胞及aMo-PE)且在4℃震荡器上孵育各板1小时。用测定缓冲液洗涤细胞一次，且再悬浮于30μl用5％BALBc血清稀释或具有用测定缓冲液以1∶20、1∶40及1∶80稀释的来自疫苗接种小鼠的血清样品的抗人类IgE(Biodesign10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml-阳性对照组)中。一式三份涂血清样品且对照组为一式两份。在4℃震荡器上孵育板1小时30分钟，接着用测定缓冲液洗涤，再悬浮于100μl山羊抗小鼠Fc特异性PE抗体(用测定缓冲液以1∶200稀释，Goat Jackson Immunoresearch)且在4℃震荡器上孵育45分钟。用测定缓冲液洗涤细胞3次，再悬浮于80μl 2％聚甲醛的PBS溶液中且于4℃下孵育过夜。藉由流式细胞术量测荧光强度。数据分析：使用各样品的平均荧光强度进行分析。对阴性对照(仅aMo-PE)求平均值且自各孔减去其值。对阳性对照求平均值且将各样品表示为各血清稀释度下的阳性对照(Biodesign)的百分比。接着提取1∶40血清稀释液且执行ANOVA。

d)去颗粒测定

此测定藉由测量由培养基中的RBL-THE细胞释放的b-己糖胺酶的活性来测量来自疫苗接种小鼠的血清是否会诱导RBL-THE细胞的去颗粒。使用用未疫苗接种的BALBc血清稀释的E25(Xolair)作为阴性对照(40μg/ml)且使用用未疫苗接种的BALBc血清稀释的来自Sigma的山羊多克隆抗体作为阳性对照。细胞接种：将冷冻的RBL-THE p12(每小瓶10×10⁶个细胞；经人类FceRI稳定转染的大鼠嗜碱性粒细胞白血病细胞)解冻，用RBL-P培养基(具有15％FCS及2mM L-谷氨酰胺的MEM-厄尔氏(Earles)补充剂)洗涤且以每毫升8×10⁵个细胞再悬浮于具有0.25μg/ml人类IgE的RBL-P培养基中。将每孔8×10⁴个细胞接种于平底96孔板中且于37℃/5％CO₂下孵育48小时。样品及缓冲液制备：在第3天，制备台氏缓冲液(Tyrode’s buffer)1×(NaCl 135mM、KCl 5mM、CaCl₂ 1.8mM、MgCl₂ 1mM、葡萄糖5.6mM、BSA1mg/ml、Hepes 20mM(pH 7.4))。亦制备台氏缓冲液-5％BALBc血清、台氏缓冲液-2.5％BALBc血清及1％Triton的台氏溶液-5％BALBc血清。以10μg/ml至2.5μg/ml用台氏缓冲液-5％BALBc血清连续稀释阳性对照(山羊多克隆抗IgE抗体(82mg/ml，PBS溶液)-Sigma，I0632)(第一孔用台氏缓冲液-5％BALBc血清及接着用台氏缓冲液)。使阴性对照(E25)在稀释的Balbc血清(1∶20、1∶40及1∶80血清稀释液)中保持恒定于40μg/ml。以1∶20、1∶40及1∶80血清稀释度测试来自疫苗接种小鼠的测试血清样品。所有对照及测试血清样品在各板上均一式三份测试。激动剂测定：在第3天，自恒温箱移除细胞培养板。自各孔中移除95μl培养基且用200μl台氏缓冲液洗涤细胞一次，移除洗涤缓冲液且添加70μl稀释的抗体(阳性对照、阴性对照或测试血清样品)。于37℃/5％CO₂下孵育细胞1小时。在孵育结束时，自恒温箱移除板且于1200rpm下离心5分钟以沉降任何脱离的细胞。移除65μl上清液且置于无菌96孔板中。测试25μl上清液的β-己糖胺酶活性。β-己糖胺酶活性：将25μl上清液添加至96孔板中。将25μl于柠檬酸盐缓冲液中的4mM NAGA(于50mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4.5)中的4mM N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷(NAGA)(Sigma，N9376))添加至所有孔(新鲜制备)中，于37℃下孵育此类板1小时且添加150μl 0.2M甘氨酸(pH 10.7)以中止反应。使用Envision，在405nm下对板进行读取。数据分析：所有孔(经1％Triton X-100处理)的去颗粒值表示为总β-己糖胺酶活性的百分比。接着提取稀释度1∶40下的去颗粒％进行分析且对血清样品执行ANOVA。

e)还原游离人类IgE测定

概述：电化学发光(ECL)测定，其定量在测试血清的等分试样与人类IgE的连续稀释液一起孵育过夜(在此期间形成小鼠IgG:人类IgE复合物)后保持的游离人类IgE水平。为确保人类IgE定量测定的准确度，有必要首先使用涂有蛋白G的磁性Dynabead移除任何小鼠IgG:人类IgE复合物，此类Dynabead经由小鼠IgG Fc区结合任何复合物。可计算各样品的人类IgE水平相对于适当阴性对照组的％减少值。

作为阳性对照，将Xolair/E25以40μg/mL(标准治疗剂量)加入来自Harlan Labs的Balb/c阴性血清(自400只动物混合，Harlan laboratories编号R-0131D)中，其亦单独用作阴性对照。将样品与人类IgE一起孵育：将2μL体积的各浓度的人类IgE的8点1/2对数连续稀释液(0.01M PBS(pH 7.4)/1％BSA稀释剂)添加至各8×10μL体积的测试血清样品(包括阳性对照Xolair/E25(40μg/mL))中，IgE以30μg/mL的最终浓度开始。密封板且于4℃下孵育过夜。涂覆测定板：第二天，用每孔12μL用0.01M PBS(pH 7.4)稀释至5μg/mL的针对人类IgE的绵羊pAb(Gentaur，ICL(Immunology Consultants Lab)，目录号SE-80A)涂覆384孔测定板(Meso-Scale Diagnostics(MSD)标准结合，目录号L11XA-1、0370PA)，接着于室温下在震荡器上孵育2小时。用0.01M PBS(pH 7.4)洗涤3次后，每孔使用25μLPierce起始封闭缓冲液(Pierce Biotech.目录号37538)封闭板且于室温下在震荡器上孵育40分钟，随后最后用0.01M PBS(pH 7.4)洗涤3次。样品及Dynabead制备：用每孔95μL 0.01M PBS(pH 7.4)/1％BSA以1∶20稀释5μL体积的血清与人类IgE的过夜孵育混合物。[注意：在游离IgE结合测定中亦另外用0.01PBS(pH 7.4)/1％BSA以1∶2稀释10μL 1∶20稀释液以进行测试，从而得到muIgG:hu IgE复合物的测量值，随后孵育蛋白G珠]。洗涤所需体积的1倍浓度的蛋白GDynabead(Invitrogen，目录号10004D)且制备为包装内插入物(in pack insert)，接着藉由再悬浮于0.25倍初始珠体积中来浓缩4倍。将样品与Dynabead一起孵育：将各30μL的1∶20样品与每孔15μL4倍珠混合，于室温下震荡孵育1小时。使用Dynal磁棒板(Invitrogen，目录号12027)自样品移除珠且将40μL残余样品与20μL新鲜4倍珠的混合物混合，于室温下震荡孵育1小时。将每孔45μL残余样品转移至新鲜孔中且于1000rpm下离心1分钟，将板放回磁棒板上且将每孔40μL转移至新鲜孔中。[注意：在游离IgE结合测定中使用30μL残余样品进行测试，从而在蛋白G珠孵育后得到mu IgG:hu IgE复合物的测量值，确保所有复合物均已移除]。定量测定：以5μL/mL的浓度开始，制备人类IgE于80％MSD小鼠血清测定稀释剂/20％0.01M PBS(pH 7.4)/1％BSA中的12点1/2对数连续稀释液标准曲线。使用MSD小鼠血清测定稀释剂(MSD，目录号R52BB-2)以1∶5稀释来自珠孵育的之残余样品。将标准曲线及样品的连续稀释液以每孔12μL一式三份转移至经涂覆的MSD孔中且于室温下震荡孵育2小时。用0.01M PBS(pH 7.4)/0.05％吐温20洗涤板3次后，每孔添加12μL用0.01M PBS(pH 7.4)/1％BSA以1∶300稀释的检测抗体(特异性兔抗人类IgE抗体ε链，Bethyl目录号A80-109A，MSD磺基标记抗体，使用MSD目录号R91AN-1)，接着于室温下震荡孵育1小时。用0.01M PBS(pH7.4)/0.05％吐温20洗涤3次后，每孔添加50μL用MQ水以1∶2稀释的具有表面活性剂的MSD读取缓冲液T(4×)(MSD目录号R92TC)。使用MSD Sector成像器6000对板进行读取。[注意：将游离IgE结合测定与此定量测定串联操作以使用与先前所述的相同方案测试在珠孵育之前及之后的样品，除了使用用0.01M PBS(pH 7.4)/1％BSA以1∶2000稀释的驴检测抗体且仅对于E25/Xolair阳性对照使用用0.01M PBS(pH 7.4)/1％BSA以1∶4000稀释的抗人类侦测抗体(标记磺基的山羊抗人类IgG，MSD目录号R32AJ-5)]。数据分析：计算原始数据(像素)的对数，绘制标准曲线(人类IgE浓度(ng/mL)的对数相对于像素的对数)且应用不对称5参数曲线拟合。自标准曲线预测试样的IgE浓度的对数且随后计算反对数并乘以200，得到以ng/mL计的实际残余游离IgE浓度。对于各样品及对照，与适当对照组相比，计算人类IgE含量的减少％且相对于最初添加至血清样品中的人类IgE(ng/mL)进行绘图，两个轴皆为对数标尺，产生滴定曲线。

结果

结果概括于下表5中。更具体言之且令人惊讶的是，此研究显示黄色及紫色Qβ缀合的组合在以25微克缀合物的总剂量(亦即12.5微克单独缀合物)经由肌肉内途径施用时为最有效，且比使用加倍剂量的任一肽缀合物作为单一抗原更有效。我们已在此研究中显示，此组合诱导具有强结合游离IgE能力的抗体应答，且这些抗体能够使IgE含量减少至直到80％，此视IgE激发(challenge)的剂量而定。这些抗体反应不能结合受体占据的IgE且不会引起表达受体的靶细胞的去颗粒。将Qβ与佐剂明矾及CPG24555组合(其中寡核苷酸的所有核苷酸间键均为硫代磷酸酯键)高度有效诱导这些抗体反应。总体而言，可得出结论，在诱导具有强结合游离人类IgE能力的小鼠IgG抗体方面，当单独地或与紫色或橙色肽缀合物组合或与以高剂量及体积接种的紫色与橙色肽缀合物组合施用时，黄色肽为最有前途的肽。

实施例6.高免疫(hyperimmunisation)研究

此研究的目的在于评估快速免疫进程对诱导针对IgE的高亲和力抗体的作用。在第0、3、8及11天，给具有8只雌性Balb/c小鼠(6-8周龄)的组腹膜内及皮下注射肽KLH-缀合物(如以上实施例4中所详述)。使用CPG7909及Alhydrogel(20％v/v的1.3％明矾)与不完全弗氏佐剂(IFA)的组合作为此研究中的佐剂。所有肽均与KLH结合。在第22天执行尸检且如实施例5中收集血液。

使用所有或一些以下测定研究免疫动物的抗体应答：a)IgG效价测定、b)与血清游离IgE结合、c)与结合FceRI的IgE结合、d)去颗粒测定及e)IgE定量测定。所有测定均在实施例5中详述。

结果

表6概括来自实施例6的数据。此研究中的总效价比VRS-IgE-008-003中的少约10倍。来自此研究的数据显示紫色肽、紫色受限制肽、黄色肽及橙色肽具有免疫原性。令人惊讶的是，蓝色肽为极弱抗原，且限制该肽及增加溶解性显示免疫原性增加，从而显示此肽可能需要进行限制以显示可接受的免疫原性。

表6 来自实施例6的数据总结

总缀合剂量为每次注射25微克

在第0、3、8、11天给药

缀合配偶体＝KLH

佐剂：20μL CPG 7909(所有核苷酸间键均为硫代磷酸酯键)，明矾＝20％v/v的ALhydrogel^TM+IFA(不完全弗氏佐剂)

^*n＝对合并样品的1次操作

实施例7.与KLH、HBsAg及Qβ缀合的肽诱导可结合于人类IgE的抗体应答的功效

此研究的目的在于评估与KLH、HBsAg及Qβ缀合的肽(如以上实施例2、3及4中所详述)如何有效诱导可结合于人类IgE的抗体应答。在第0、19及34天，藉由肌肉内途径给雌性Balb/c(6-8周)进行注射(将50微升体积注入各胫前肌中)。在第46天进行尸检。尸检时，藉由心脏穿刺，自安乐死的小鼠取得400-600微升血液样品。使血液凝结过夜且次日收集血清。

结果

此研究显示紫色肽及黄色肽具有高免疫原性。紫色肽与KLH、Qβ及HbsAg缀合使得可诱导能够在极高程度上结合于游离IgE的高抗体应答。这些抗体应答不能结合受体占据的IgE且不会引起表达受体的靶细胞的去颗粒。两种佐剂(AbiSCO及CPG 7909与明矾的组合)有效诱导高程度的抗体应答。

实施例8：肽免疫原与KLH的组合

此研究的目的在于评估与KLH缀合的肽组合(如以上实施例4中所详述)如何有效诱导可结合于人类IgE的抗体应答。在第0、19及34天，藉由肌肉内途径给雌性Balb/c(6-8周)进行注射(将50微升体积注入各胫前肌)。在第46天进行尸检。尸检时，藉由心脏穿刺，自安乐死的小鼠取得400-600微升血液样品。使血液凝结过夜且次日收集血清。

结果

此研究显示，尽管归因于可得到有限量的肽而在此研究中使用低剂量，但黄色肽与橙色肽、蓝色肽与紫色肽、黄色肽与紫色肽的组合具有高免疫原性且诱导可有效结合游离IgE的抗体应答。这些抗体应答不能结合受体占据的IgE且不会引起表达受体的靶细胞的去颗粒。

表8 来自实施例8的数据概要

黄色剂量：每剂16微克

橙色剂量：每剂20.3微克

蓝色剂量：每剂0.5微克

紫色剂量：每剂25.3微克

在第0、21天给药

缀合配偶体＝KLH

佐剂：12μg AbiSCO

实施例9：缀合物疫苗在体内破坏耐受性的功效(动物模型)

在动物模型中，使用天然表达高IgE水平(例如经由过敏)的物种，或以实验方式使用模型或真实过敏原使动物免疫来诱导高IgE水平，评估IgE肽疫苗在体内减少IgE水平的能力。举例而言，用无内毒素的卵白蛋白(OVA)作为与明矾一起配制的模型抗原以诱导对OVA的IgE反应而使小鼠免疫(实例参考Lloyd C等人，J.Immunol 2001，166，第2033-2040页)。诱导IgE反应后，给小鼠接种与载体偶联且与佐剂一起配制的抗原性肽。可使用来自小鼠IgE的同源区域的肽(小鼠中)，各别动物物种中其它物种的同源区域，以及对于非人类灵长类动物可使用人类IgE肽。接着可藉由在疫苗接种之前及之后测量血清中IgE的水平来监测疫苗接种在降低IgE含量方面的功效。另外，可藉由用鼻内或气管内OVA对小鼠进行激发(例如经连续2-5天)，且藉由评估肺中的过敏性炎症应答(藉由对肺灌洗样品中的白细胞亚组浸润计数及藉由组织学评估肺薄壁组织中的嗜酸性粒细胞募集以及杯状细胞化生及粘液产生)来而监测肽减少过敏性炎症应答的能力(例如Coyle A.等人，1996J.Exp.Med.183，1303-1310。)。

实施例10：与Qβ或HbsAg缀合的线性及化学限制肽在诱导可结合于人类IgE的抗体方面的功效及适合性

使用短的线性肽作为免疫原来诱导抗IgE应答的挑战之一为准确地呈现IgE的二级结构，由此确保藉由疫苗接种产生的抗体有效地识别游离循环IgE。将合适的二级结构引入线性亲本氨基酸序列中的化学限制可提供替代的免疫原诱导对IgE的抗体应答。

对PDB 1F6A中所存在的IgE的Cε3Cε4域的三维结构的分析(Garman等人，2000Nature 406：第259-266页)揭露Cε3Cε4与FCεRI受体之间界面处的一些靶序列采用非线性排列，其可能未由表9中所详述的线性序列充分呈现。因此，在试图评估受限制肽(在体内施用后)诱导可在游离IgE结合测定中检测出的抗IgE抗体的能力时，鉴别出为化学限制的候选物的序列。

分别藉由两种不同方法限制黄色肽序列(SEQ ID NO：220)与橙色肽+半胱氨酸序列(SEQ ID NO：436)的变体：一种方法包含使用点击化学(Click chemistry)横跨肽序列的两个相邻原子引入三唑部分。藉由此方法对肽序列施加的限制程度可藉由将亚甲基添加至三唑部分中来调节(藉由此方法制造橙色046、橙色047、黄色043、黄色044)。第二种方法包含经由在文献中指出具有β转角(β-turn)诱导潜在性的异手性双脯氨酸单元(D-Pro-L-Pro)的模板作用进行环化(Spath等人，1998，Helvetica Chimica Acta 81，第1726-1738页)；(藉由此方法制造橙色044、橙色045、黄色040、黄色041、黄色042)。这些受限制肽的化学结构在表9中显示。

执行若干研究以评估与HBsAg及Qβ缀合(缀合如实施例2及3中所详述)的具有不同长度的线性肽或受限制肽所诱导的抗人类IgE免疫应答。

使用1.5倍摩尔过量的丁二酰亚胺基-6-[β-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺基]己酸酯(SMPH)化学试剂，使受限制肽橙色+半胱氨酸(SEQ ID No：436)、黄色(SEQ ID No：220)、橙色044、橙色045、橙色046、橙色047、黄色040、黄色041、黄色042、黄色043及黄色044与Qβ病毒样颗粒缀合且在小鼠中将此类肽用作免疫原。在如下文表9所述的日期，藉由肌肉内途径(将50μl注入各胫前肌中)给雌性Balb/c(6-8周)注射抗原及Alhydrogel加CpG-24555(所有核苷酸间键均为硫代磷酸酯键)佐剂。如实施例5中所述，在IgE结合测定中测试最后加强后1周制备的血清的抗IgE抗体活性。

结果

表9中所概括的研究显示与Qβ及HbsAg缀合且与组合的佐剂Alhydrogel及CpG24555一起送递的衍生自紫色肽、橙色肽及黄色肽的线性肽诱导能够结合于游离IgE的抗体应答。

另外，大部分受限制肽免疫原诱导能够结合游离人类IgE的抗血清。蓝色003、蓝色004及蓝色005惊人地仅诱导弱抗IgE应答。橙色047及橙色048不会诱导抗IgE抗体超过背景水平。

表9 来自实施例10的数据总结

在第0及14天，在雌性BALB/c小鼠中，总缀合物剂量为每次注射25微克，每肌肉内途径施用两次，除了由*标记的组以50微克的缀合剂量给药及由^标记的组在第0、14及28天给药3次。受限制肽及由^^标记的组在第0、21及42天给药3次。

缀合配偶体＝Qβ或HBsAg VLP(由**标记)

佐剂：20μg CPG 24555(所有核苷酸间键均为硫代磷酸酯键)+20％v/v的ALhydrogel^TM

ND＝未进行

注意-c、cgg、gcc、cdddd及kgg为出于缀合目的而添加至IgE肽序列中的接头

实施例11：与Qβ、HBsAg及DT缀合的肽在诱导可结合于人类IgE的抗体应答方面的功效

此研究的目的在于评估与各种载体(诸如DT、CRM197、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)外毒素A、HBsAg及Qβ)缀合的肽(如以上实施例中所详述)如何有效诱导可结合于人类IgE的抗体应答。为产生DT缀合物，用10倍摩尔过量的丁二酰亚胺基-6-[β-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺基]己酸酯(SMPH，Thermo Fisher Scientific Inc)衍生出白喉(Diptheria)类毒素(浓度为3mg/ml)。此活化步骤后，藉由使用NAP-25除盐柱(GEHealthcare)，于具有5mM EDTA的Dulbeccos磷酸盐缓冲生理盐水(DPBS)中移除过量SMPH试剂。接着将冻干肽固体直接添加至顺丁烯二酰亚胺活化的白喉类毒素中且在平缓混合下孵育90分钟。随后将样品施加于NAP-25除盐柱(GE Healthcare)上且于Dulbeccos磷酸盐缓冲生理盐水(DPBS)中洗脱以移除游离肽。此后，使用10kD旋转微量浓缩器浓缩蛋白质溶液且使用0.22μm过滤器灭菌并保持于-80℃下直至使用。如下制造Qb-肽及HbsAg-肽缀合物：使用N-γ-顺丁烯二酰亚胺基-丁酰氧基-丁二酰亚胺酯(GMBS)连接试剂或丁二酰亚胺基-6-[β-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺基]己酸酯(SMPH)活化VLP(Qβ与HBsAg)，该两种试剂皆得自Thermo Fisher Scientific Inc。将GMBS或SMPH试剂溶解于二甲亚砜(DMSO)中且以≥5倍摩尔过量添加至VLP溶液中。使活化反应进行≥30分钟且接着使用NAP-25除盐柱(GEHealthcare)，于具有5mM EDTA的Dulbeccos磷酸盐缓冲生理盐水(DPBS)中使溶液除盐。此后，将适当量的固体冻干肽直接添加至顺丁烯二酰亚胺活化的VLP中且在极平缓混合下使VLP与肽之间的反应进行至少30分钟。在反应时间结束时，使用NAP-25除盐柱(GEHealthcare)，于Dulbeccos PBS(DPBS)中使各样品除盐。使用Bradford(考马斯亮蓝，Thermo Fisher Scientific Inc.)测定或BCA蛋白质测定(二喹啉甲酸，Thermo FisherScientific Inc.)以及藉由SDS-PAGE及尺寸排阻层析来分析经除盐的缀合肽的蛋白质含量。

如下文表10所述，在第0、19及34天，藉由肌肉内途径(将50μl注入各胫前肌中)给雌性Balb/c(6-8周)注射与Qβ、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)或白喉类毒素(DT)缀合的肽及Alhydrogel加CpG佐剂。如实施例5中所述，在IgE结合测定中测试最后加强后1周制备的血清的抗IgE抗体活性。在表10中展示应答。

结果

此研究(表10)显示紫色001肽及黄色001肽(在表9中显示序列)在与DT、Qβ或HbsAg缀合时可诱导抗人类IgE抗体。使用GMBS接头或SMPH接头可诱导抗人类IgE抗体。

表10.来自实施例11的数据总结

在第0及14天使雌性BALB/c小鼠免疫。在第21天收集及分析血清。

缀合配偶体＝Qβ、DT或HBsAg VLP(按照以上表格)，如以上表格中所概述，使用SMPH及GMBS。

实施例12：肽组合诱导可结合于人类IgE的抗体应答的功效大于使用与Qβ缀合的单一肽

进行了若干目的在于评估与Qβ缀合的肽(如以上实施例中所详述)如何诱导可结合于人类IgE的抗体应答的研究。如实施例5中所述，藉由肌肉内途径使雌性Balb/c(6-8周)免疫，其中特定时序详情如表格中所示。如实施例5中所详述测量抗IgE应答、诱导去颗粒的活性及IgE耗尽活性。

结果

如表11中所示，肽(参见表9中的序列)与Qβ的缀合诱导能够结合于游离IgE而不引起超过对照值的去颗粒作用的抗体应答。使用Alhydrogel作为单一佐剂为有效的且紫色肽与黄色肽的组合诱导较高IgE结合抗体应答。此外，肽组合诱导更有效地结合及耗尽IgE的抗体反应。将CPG 24555添加至Alhydrogel配制物中可进一步增加抗IgE抗体应答而不诱导去颗粒活性。

实施例13：紫色001及黄色001的鼠类同源物诱导抗自身IgE应答

在具有高IgE水平(藉由用无内毒素的卵白蛋白(OVA)作为与明矾一起配制的模型抗原进行预先免疫而诱导-实例参考Lloyd C等人，J.Immunol 2001，166，第2033-2040页)的小鼠中评估IgE肽疫苗活体内诱导IgG抗自身IgE抗体及减少IgE含量的能力。诱导IgE抗OVA应答后，给小鼠接种与Qβ载体偶联且与佐剂一起配制的抗原性肽。使用来自小鼠IgE的同源区域的肽(鼠类黄色001＝QCIVDHPDFPKPIVRS(SEQ ID NO：458)；鼠类紫色001＝PDHEPRGVITYLIPPSPC(SEQ ID NO：459))。藉由在疫苗接种之前及之后量测血清中IgE抗OVA的水平来监测疫苗接种在降低IgE水平方面的功效。

a)卵白蛋白特异性IgE定量测定

概述：电化学发光(ECL)测定，其测定OVA特异性鼠类IgE的浓度。使用OVA特异性IgE单克隆抗体(AbD Serotec，目录号PMP68)作为阳性对照，其中在各测定中测试此标准物的定量12点1/2对数稀释液(以30μg/mL的最高浓度加入来自Harlan Labs的Balb/c阴性血清(合并自400只动物，Harlan laboratories编号R-0131D)中)。亦单独使用此合并正常血清作为阴性对照。涂覆测定板：每孔用12μL用0.01M PBS(pH 7.4)稀释至15μg/mL的针对小鼠IgE的大鼠pAb(Invitrogen，目录号04700)涂覆384孔测定板(Meso-Scale Diagnostics(MSD)标准结合，目录号L11XA-1、0370PA)，接着于室温下在震荡器上孵育2小时。用0.01MPBS(pH 7.4)洗涤3次后，每孔使用25μL Pierce起始封闭缓冲液(Pierce Biotech.目录号37538)封闭板且于室温下在震荡器上孵育40分钟，随后最后用0.01M PBS(pH 7.4)洗涤3次。样品制备及测定：以1∶200及1∶500稀释(0.01M PBS(pH 7.4)/1％BSA稀释剂)各血清样品且将12μL各稀释液一式三份添加至经涂覆的MSD板中，同时测试标准物的稀释液。于室温下在震荡器上孵育2小时后，用0.01M PBS(pH 7.4)/0.05％吐温20洗涤板3次。每孔添加12μL用0.01M PBS(pH 7.4)/1％BSA以1∶300稀释的检测、标记磺基的卵白蛋白，接着于室温下震荡孵育1小时。用0.01M PBS(pH 7.4)/0.05％吐温20洗涤3次后，每孔添加50μL用MQ水以1∶2稀释的具有表面活性剂的MSD读取缓冲液T(4×)(MSD目录号R92TC)。使用MSD Sector成像器6000对板进行读取。数据分析：计算原始数据(像素)的对数，绘制标准曲线(小鼠IgE抗OVA浓度(ng/mL)的对数相对于像素的对数)且应用不对称5参数曲线拟合。自标准曲线预测试样的IgE浓度的对数且随后计算反对数并乘以200或500，得到以ng/mL计的实际IgE浓度。

b)抗鼠类IgE的总IgG效价测定

概述：比色ELISA，其产生用来表示对鼠类IgE具有特异性的总IgG分子水平的倒数效价(RT)。由血清样品制备连续稀释液且在测定中测试。使用以10μg/mL加入来自HarlanLabs的Balb/c阴性血清中且以8点半对数连续稀释液滴定的针对小鼠IgE的大鼠pAb(Invitrogen，目录号04700)作为阳性对照。使用来自Harlan Labs的Balb/c阴性血清以及来自研究阴性组(与样品同样处理)的合并样品作为阴性对照(合并自400只动物，Harlanlaboratories编号R-0131D)。涂覆测定板：每孔用25μL用0.01M PBS(pH 7.4)稀释至5μg/mL的针对OVA的小鼠IgE(AbD Serotec，目录号PMP68)储备液涂覆384孔高结合测定板(Corning International，目录号3700)且于室温下在震荡器上孵育2小时。用PBS(pH 7.4)洗涤2次后，每孔使用80μL 0.01M PBS/1％BSA封闭板，于室温下孵育1小时，随后最后用0.01M PBS(pH 7.4)/0.05％吐温20洗涤3次。样品制备及测定：以1∶100稀释液(PBS/1％BSA稀释剂)开始制备各样品的8点1/10连续稀释液，将每孔25μL连续稀释液一式两份转移至涂有小鼠IgE的板中，接着于室温下震荡孵育1.5小时。用0.01M PBS(pH 7.4)/0.05％吐温20洗涤3次后，每孔添加25μL用0.01M PBS(pH 7.4)/1％BSA以1∶6000稀释的总IgG检测抗体(兔抗mu IgG-Fc，目录号A90-130A，Bethyl Laboratories)，接着于室温下震荡孵育1小时。用0.01M PBS(pH 7.4)/0.05％吐温20洗涤5次后，每孔添加25μL用0.01M PBS(pH 7.4)/0.05％吐温20(pH 7.4)以1∶3000稀释的Bio-Rad试剂盒山羊抗兔辣根过氧化酶缀合物(Bio-Rad，目录号172-1019)，接着于室温下震荡孵育1小时。用0.01M PBS(pH 7.4)/0.05％吐温20洗涤4次，接着仅用0.01M PBS(pH 7.4)洗涤1次后，每孔添加25μL小鼠Typer HRP底物(Bio-Rad，目录号172-1064)，接着于室温下孵育30分钟，随后每孔添加25μL 2％草酸以中止反应且于405nm下读取吸光度。数据分析：绘制各试样的滴定曲线(样品效价相对于吸光度405nm)且自OD 1的截断值预测样品效价(随后转化为倒数效价)。

结果

两项研究(表12)显示黄色001肽的鼠类同源物(鼠类黄色-001＝QCIVDHPDFPKPIVRS(SEQ ID NO：458))与紫色001的鼠类同源物(鼠类紫色-001＝PDHEPRGVITYLIPPSPC(SEQ ID NO：459)的组合可诱导可有效地降低内源性IgE含量(与QβVLP免疫对照的含量相比)的抗自身IgE抗体应答。因此，藉由显示IgE肽缀合可破坏B细胞对内源性IgE分子的耐受性且此与内源性IgE含量减少有关来证明该机制。

表12.来自实施例13的数据总结

在第0及1周用卵白蛋白使BALB/c小鼠敏感以提高内源性IgE含量。

在第3、7及11周，给小鼠接种200微克鼠类紫色001与黄色001(亦即各100微克)的组合，且在第3次免疫后1周进行测试。

缀合配偶体＝Qβ VLP，使用SMPH。

佐剂：20μL CPG 24555(所有核苷酸间键均为硫代磷酸酯键)+20％v/v的Alhydrogel^TM

ND＝未进行

实施例14：给长尾猕猴(Cynomolgus macaque)接种紫色014及黄色001或黄色014

在接种与载体(Qβ VLP)偶联且与佐剂一起配制的抗原性肽的长尾猕猴中评估人类IgE肽疫苗体内破坏对自身IgE的耐受性的能力。使用来自人类IgE的肽。接着藉由测量在疫苗接种之前及之后血清中IgG抗IgE的水平来监测疫苗接种在诱导抗自身IgE免疫应答方面的功效。

长尾猕猴测定

a)对以下抗原/VLP具有特异性的IgG的总IgG效价测定：长尾猕猴IgE Cε2-Cε4域、人类IgE Cε3Cε4域、与KLH缀合的单独肽(黄色及紫色)，及与Qβ缀合的单独肽(黄色及紫色)。

概述：电化学发光(ECL)测定，其产生用来表示对疫苗或VLP具有特异性的总IgG分子水平的倒数效价(RT)。由血清样品制备连续稀释液且在测定中测试。使用40μg/mL的外加人化抗IgE单克隆抗体(E25，Xolair)的长尾猕猴血清作为阳性对照。使用未经外加的长尾猕猴血清作为阴性对照。涂覆测定板：每孔用12μL用0.01M PBS(pH 7.4)/1％BSA稀释至1μg/mL的生物素标记的长尾猕猴IgE Cε2-Cε4或人类IgECε3Cε4涂覆384孔测定板(Meso-Scale Diagnostics(MSD)，涂有抗生蛋白链菌素，目录号L21SA-1)。每孔用12μL用0.01MPBS(pH 7.4)(无BSA)稀释至1μL/mL的单独肽(与KLH缀合)或稀释至2-5μg/mL的单独肽(与Qβ缀合)涂覆384孔测定板(Meso-Scale Diagnostics(MSD)标准结合，目录号L11XA-1、0370PA)。接着于室温下在震荡器上孵育板1小时。用0.01M PBS(pH 7.4)洗涤3次后，每孔使用25μL Pierce起始封闭缓冲液(Pierce Biotech.目录号37538)封闭板且于室温下在震荡器上孵育40分钟，随后最后用0.01M PBS(pH 7.4)洗涤3次。样品制备及测定：以1∶20稀释液(PBS/1％BSA稀释剂)开始制备各样品(包括对照组)的8点1/2对数连续稀释液，将每孔12μL连续稀释液转移至涂有测试抗原/VLP的板的孔中，接着于室温下震荡孵育1小时。用0.01MPBS(pH 7.4)/0.05％吐温20洗涤3次后，将稀释至0.02μL/mL(PBS/1％BSA稀释剂)的标记磺基的蛋白G添加至此类板中(每孔12μL)。于室温下震荡孵育板1小时，接着用0.01M PBS(pH7.4)/0.05％吐温20洗涤3次。每孔添加50μL用MQ水以1∶2稀释的具有表面活性剂的MSD读取缓冲液T(4×)(MSD，目录号R92TC)。使用MSD Sector成像器6000对板进行读取。数据分析：绘制各试样的滴定曲线(样品效价相对于像素)且自截断值(像素)预测样品效价(随后转化为倒数效价)。

b)长尾猕猴抗体亲和力测定

概述：比色ELISA，其产生用来表示对人类Cε3Cε4具有特异性的总IgG分子的结合强度的亲和力指数(AI)。将人化抗IgE抗体Xolair(E25)加入40μg/mL及4μg/mL的合并的长尾猕猴血清(由此研究的Qb-VLP对照组制备)中且以12点半对数连续稀释液滴定，作为阳性对照。使用来自研究Qb-VLP组的长尾猕猴血清以及商业长尾猕猴血清作为阴性对照。涂覆测定板：每孔用12μL用在0.01M PBS(pH 7.4)中浓度为1μg/mL的生物素标记人类Cε3Cε4涂覆具有SuperBlock封闭缓冲液(Fisher Scientific Co Ltd，PI15504)的Reacti-Bind^TM涂有抗生蛋白链菌素的HBC透明384孔板，且于室温下在震荡器上孵育1小时。用PBS(pH 7.4)洗涤3次后，每孔使用25μL 0.01M PBS/1％BSA封闭板，于室温下孵育40分钟，随后最后用0.01M PBS(pH 7.4)/0.05％吐温20洗涤3次。样品制备及测定：用0.01M PBS/1％BSA稀释样品。产生各样品的滴定曲线且自此曲线使用180,000的像素值计算用于各样品的单独倒数效价(RT)稀释度。使用此RT稀释各样品以确保亲和力测定中使用类似水平的来自各样品的抗体。将12μL各稀释样品添加至经涂覆的384孔板的24孔中且于室温下震荡孵育1小时。用0.01M PBS(pH 7.4)/0.05％吐温20洗涤5次后，将不同浓度的硫氰酸铵以每孔12μL添加至该板中，接着于室温下震荡孵育15分钟。(使用12种浓度的硫氰酸铵：12、10、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5及0M，将其添加至双份样品中)。用0.01M PBS(pH 7.4)/0.05％吐温20洗涤4次后，每孔添加12μL具有0.01M PBS/1％BSA的经HRP标记的小鼠抗人类IgG(Southern Biotech9042-05)，接着于室温下震荡孵育1小时。用0.01M PBS(pH 7.4)/0.05％吐温20洗涤5次后，每孔添加25μL TMB底物(Sigma P-8665)，接着于室温下避光孵育30分钟。为中止反应，每孔添加25μL 2％草酸且于吸光度450nm下对板进行读取。数据分析：使用平均吸光度405nm计算各硫氰酸铵浓度的各样品的减少％，其中0M硫氰酸铵样品作为0％减少。接着绘制各试样的滴定曲线(减少％相对于吸光度450nm)且自50％减少的截断值预测AI。

结果：

此研究(表13)显示黄色001或黄色014与紫色014(参见表9中的序列)的组合具有免疫原性且诱导与对特异性肽的应答有关的抗自身(长尾猕猴)IgE及抗人类IgE抗体应答。此外，其显示抗体应答的亲和力可藉由对长尾猕猴重复给药来增加。

表13.来自实施例14的数据概要

在第0、4及8周，给长尾猕猴接种600微克紫色014与黄色001或黄色014(亦即各300微克)的组合，且在第12周进行测试。

缀合配偶体＝Qβ VLP，使用SMPH。

佐剂：500μL CPG 24555(所有核苷酸间键均为硫代磷酸酯键)+600微克的Alhydrogel^TM。

ND＝未进行

Claims

1.包含第一免疫原和第二免疫原的组合物，其中所述第一免疫原和第二免疫原各自包含连接于免疫原性载体的抗原性IgE肽，其中所述第一免疫原的抗原性IgE肽由SEQ ID No:220的氨基酸序列组成且经由所述肽上的半胱氨酸残基连接于所述免疫原性载体，且其中所述第二免疫原的抗原性IgE肽由SEQ ID No:312的氨基酸序列组成。

2.权利要求1的组合物，其中所述免疫原性载体为选自由HBcAg、HBsAg及Qβ VLP组成的组的病毒样颗粒，且其中所述抗原性IgE肽经由所述免疫原性载体上的赖氨酸残基连接于所述免疫原性载体。

3.权利要求2的组合物，其中所述第一免疫原的免疫原性载体为Qβ VLP。

4.权利要求2的组合物，其中所述第二免疫原的免疫原性载体为Qβ VLP。

5.权利要求2的组合物，其中所述第一免疫原和第二免疫原两者的免疫原性载体为QβVLP。

6.权利要求1的组合物，其中所述第二免疫原还包含：

(a)与所述抗原性IgE肽C端连接且具有式(G)_nC的接头，其中n为一个选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10的整数；或

(b)与所述抗原性IgE肽N端连接且具有式C(G)_n的接头，其中n为一个选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10的整数；或

(c)与所述抗原性IgE肽C端连接且具有式(G)_nC的第一接头，其中n为一个选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10的整数，及与所述抗原性IgE肽N端连接且具有式C(G)_n的第二接头，其中n为一个选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及10的整数。

7.权利要求5的组合物，其中所述Qβ病毒样颗粒由SEQ ID NO:435的氨基酸序列组成。

8.权利要求6的组合物，其中所述接头是在所述抗原性IgE肽C端的GGC。

9.包含第一免疫原和第二免疫原的组合物，其中：

(a)第一免疫原由与SEQ ID NO:435的Qβ病毒样颗粒交联的SEQ ID No:220的抗原性IgE肽组成，其中所述抗原性IgE肽通过使用丁二酰亚胺基-6-[β-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺基]己酸酯作为交联剂经由硫醚键以化学方式与所述Qβ病毒样颗粒交联，所述键位于所述病毒样颗粒的赖氨酸残基与所述抗原性IgE肽的半胱氨酸残基之间，及

(b)第二免疫原由与SEQ ID NO:435的Qβ病毒样颗粒交联的SEQ ID No:457的多肽组成，其中所述多肽通过使用丁二酰亚胺基-6-[β-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺基]己酸酯作为交联剂经由硫醚键以化学方式与所述Qβ病毒样颗粒交联，所述键位于所述病毒样颗粒的赖氨酸残基与所述多肽的半胱氨酸残基之间。

10.权利要求1的组合物，其进一步包含至少一种选自由明矾、含有CpG的寡核苷酸及基于皂苷的佐剂组成的组的佐剂。

11.权利要求10的组合物，其中所述至少一种佐剂为含有CpG的寡核苷酸。

12.权利要求11的组合物，其中所述含有CpG的寡核苷酸由选自由SEQ ID NO:433、SEQID NO:432及SEQ ID NO:431组成的组的核苷酸序列组成。

13.权利要求1的组合物，其进一步包含至少两种选自由明矾、含有CpG的寡核苷酸及基于皂苷的佐剂组成的组的佐剂。

14.权利要求12的组合物，其中所述佐剂为明矾及SEQ ID NO:431所示的含有CpG的寡核苷酸。

15.药物组合物，其包含权利要求1的组合物及医药学上可接受的赋形剂。

16.权利要求1的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗IgE介导的病症。

17.权利要求1的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于减轻IgE介导的病症。

18.权利要求16或17的用途，其中所述IgE介导的病症为哮喘。