CN102264898B

CN102264898B - 微小rna的功能抑制方法

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Publication number: CN102264898B
Application number: CN200980152926XA
Authority: CN
Inventors: 伊庭英夫; 原口健
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2008-10-23
Filing date: 2009-10-02
Publication date: 2013-10-16
Anticipated expiration: 2029-10-02
Also published as: US20110245481A1; WO2010047216A1; CN102264898A; EP2363467A1; EP2363467B1; US8563709B2; EP2363467A4; JP4936343B2; JPWO2010047216A1; JP4936343B6

Abstract

本发明提供用于有效率地抑制miRNA的RNA、用于在细胞内表达该RNA的载体、该载体的构建方法、以及利用该RNA的miRNA的抑制方法等。发现利用miRNA抑制RNA复合体可以有效率地抑制miRNA，所述miRNA抑制RNA复合体包含双链结构，并且包含miRNA结合序列的至少1条RNA链与该双链结构的至少单端的2条链结合。特别是包含miRNA结合序列的2条RNA配置成夹在2个双链结构间的RNA可以强力抑制miRNA。该RNA例如可以通过Pol III启动子表达，将其整合到逆转录病毒载体中，可以长期稳定地抑制miRNA。本发明提供用于控制miRNA的有用的工具，期待应用于miRNA参与的分化、发育、肿瘤形成、以及感染症等中的基因调节或基因治疗等中。

Description

微小RNA的功能抑制方法

技术领域

本发明涉及有效率地抑制miRNA的功能的方法、以及该方法中使用的核酸。

背景技术

微小RNA(miRNA)是内源性表达的小的(约20～24核苷酸)调节性非编码RNA，作为RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencingcomplex；RISC)的成分，在转录后水平调节多个靶基因的表达。当某miRNA与位于mRNA中的其靶序列完全互补时，miRNA诱导其mRNA的切断，引起mRNA水平的快速减少。但哺乳动物的miRNA大半只与位于3’非翻译区(3’-UTR)的靶序列具有有限水平的互补性，引起翻译抑制或细质加工小体(P-bodies)中的靶mRNA的快速脱腺苷化(deadenylation)。预想人的编码基因的1/3以上是miRNA的靶(Bartel，D.P.(2004)Cell，116，281-297；Lewis，B.P.等人.(2005)Cell，120，15-20；Ambros，V.等人.(2003)Rna，9，277-279)，现在不断有证据表明：miRNA在分化、发生、肿瘤形成和抗感染的细胞防御中发挥重要作用(Li，Q.J.等人.(2007)Cell，129，147-161；Lu，J.等人.(2005)Nature，435，834-838；Lecellier，C.H.等人.(2005)Science，308，557-560)。

为了miRNA分子的综合性功能分析，有人认为特异性地抑制其活性的技术是不可缺少的。已经存在几种抑制miRNA的功能的方法，例如存在2’-O-甲基(2’-OMe)RNA等化学修饰的单链寡核苷酸(Hutvagner，G.等人.(2004)PLoS Biol，2，E98；Meister，G.等人.(2004)Rna，10，544-550)、锁定核酸(LNA)和“antagomirs”(Orom，U.A.等人.(2006)Gene，372，137-141；Krutzfeldt，J.等人.(2005)Nature，438，685-689)。由于这些试剂是使其对成熟miRNA具有互补性的化学合成的试剂，所以这些试剂对细胞性的核酸酶具有耐性，也许会发挥不被RISC切断的底物的功能。由于这些试剂设计成通过转染而导入细胞中，所以抑制活性必然是一过性的。

最近，有人报道了表达miRNA的竞争抑制剂“微小RNA海绵”的DNA载体(Ebert，M.S.等人.(2007)Nat Methods，4，721-726)。虽然微小microRNA海绵载体的一过性表达会有效地抑制miRNA的功能，但即使通过基于DNA的载体导入，其抑制效果也维持不过一个月。因此，人们希望确立更长期地抑制miRNA的方法。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Bartel，D.P.(2004)Cell，116，281-297

非专利文献2：Lewis，B.P.等人.(2005)Cell，120，15-20

非专利文献3：Ambros，V.等人.(2003)Rna，9，277-279

非专利文献4：Li，Q.J.等人.(2007)Cell，129，147-161

非专利文献5：Lu，J.等人.(2005)Nature，435，834-838

非专利文献6：Lecellier，C.H.等人.(2005)Science，308，557-560

非专利文献7：Hutvagner，G.等人.(2004)PLoS Biol，2，E98

非专利文献8：Meister，G.等人.(2004)Rna，10，544-550

非专利文献9：Orom，U.A.等人.(2006)Gene，372，137-141

非专利文献10：Krutzfeldt，J.等人.(2005)Nature，438，685-689

非专利文献11：Ebert，M.S.等人.(2007)Nat Methods，4，721-726

发明内容

发明所要解决的课题

本发明涉及用于有效率地抑制miRNA的miRNA抑制体、用于在细胞内表达该抑制体的载体、该载体的构建方法、以及利用该抑制体或载体的miRNA的抑制方法等。

解决课题的方法

为了确立miRNA的更有效率且长期的抑制，本发明人等重新设计了能够抑制miRNA的RNA，评价miRNA抑制活性。其结果，发现在双链RNA的单端的两条链上结合有miRNA结合序列(MBS)的RNA显示出强的miRNA抑制活性(图1和图2)。特别是包含2个双链RNA部分、且双链的各链上分别结合有MBS以使其被这2个双链夹持的RNA(图2、#12～#16)显示出极强的miRNA抑制活性。而且，本发明人等通过包含双链部分的这些RNA结构的其中一端形成闭合的结构(例如环结构)，以直链状单链RNA的形式构成这些miRNA抑制RNA，可以通过1个转录单元表达该RNA。另外，使MBS集中在双链结构的单侧，并使其相反侧和该双链结构部分形成恒定区，从而将包含目标MBS的套件插入包含该恒定区的表达单元中，由此产生根据目标miRNA极其简便地构建显示出特异性抑制活性的RNA的表达载体的系统。在导入有该表达载体的细胞中，可以强效抑制靶miRNA，而且可以根据目标miRNA简单地构建载体。

即，本发明涉及用于有效率地抑制miRNA的miRNA抑制体、用于在细胞内表达该抑制体的载体、该载体的构建方法、以及利用该抑制体或载体的miRNA的抑制方法等，更具体而言，本发明涉及下述[1]～[18]：

[1]抑制miRNA的复合体，其中包含RNA或其类似物，该复合体包含双链结构，并且包含miRNA结合序列的至少1条链与该双链结构的至少单端的2条链结合；

[2][1]所述的复合体，该复合体包含第2多重链结构，其中包含miRNA结合序列的链分别与该单端的2条链的每1条结合，该链的各自的另一端分别与该第2多重链结构的2条链结合，以使该链被该双链结构和多重链结构夹持；

[3][2]所述的复合体，该多重链为双链或四条链；

[4][1]～[3]中任一项所述的复合体，该单端的2条链通过该单端侧相连接；

[5][4]所述的复合体，该复合体由直链状单链RNA或其类似物构成；

[6][1]～[5]中任一项所述的复合体，该复合体包含2～5个miRNA结合序列；

[7][6]所述的复合体，该复合体包含2个miRNA结合序列；

[8][5]所述的复合体，该复合体包含图2(C)所示的结构，该结构的I和II为双链结构，该结构的a和b分别包含1个miRNA结合序列；

[9][5]所述的复合体，该复合体包含图2(D)所示的结构，该结构的I为双链结构，并在单侧具有各链的末端，该结构的II为发夹结构，该结构的a和b中分别包含1个miRNA结合序列；

[10]RNA或其类似物，其构成[1]～[9]中任一项的复合体；

[11]核酸，该核酸编码[10]所述的RNA；

[12][11]所述的核酸，该核酸与启动子的下游结合；

[13][12]所述的核酸，其中启动子为聚合酶III启动子；

[14][12]或[13]所述的核酸，该核酸被担载在逆转录病毒载体上；

[15]制作[12]所述的核酸的方法，该方法包括下述步骤：在启动子的下游编码形成至少1个双链结构的1对互补序列的核酸之间插入编码至少1个miRNA结合序列的核酸；

[16][15]所述的方法，其中，编码miRNA结合序列的核酸包含至少2个miRNA结合序列且包含在其间形成茎的序列；

[17]试剂盒，该试剂盒用于制作[12]所述的核酸，该试剂盒包含下述(a)和(b)的核酸：

(a)核酸，该核酸在启动子的下游包含形成至少1个双链结构的1对互补序列和用于将核酸插入该1对互补序列之间的位点；

(b)核酸，该核酸编码至少1个miRNA结合序列；

[18][17]所述的试剂盒，其中，编码miRNA结合序列的核酸包含至少2个miRNA结合序列且包含在其间形成茎的序列。

本发明还涉及下述[1]～[15]：

[1]抑制miRNA的复合体，其中包含RNA或其类似物，该复合体包含双链结构，并且包含miRNA结合序列的至少1条链与该双链结构的至少单端的两条链结合；

[2][1]所述的复合体，该复合体包含第2双链结构，包含miRNA结合序列的链分别与该单端的2条链的每1条结合，该链的各自的另一端分别与该第2双链结构的2条链结合，以使其被上述2个双链结构夹持；

[3][1]或[2]所述的复合体，其中，该单端的2条链通过该单端侧相连接；

[4][3]所述的复合体，该复合体由直链状单链RNA或其类似物构成；

[5][1]～[4]中任一项所述的复合体，该复合体包含2～5个miRNA结合序列；

[6][5]所述的复合体，该复合体包含2个miRNA结合序列；

[7]RNA或其类似物，其构成[1]～[6]中任一项的复合体；

[8]核酸，该核酸编码[7]所述的RNA；

[9][8]所述的核酸，该核酸与启动子的下游结合；

[10][9]所述的核酸，其中，启动子为聚合酶III启动子；

[11][9]或[10]所述的核酸，该核酸被担载在逆转录病毒载体上；

[12]制作[9]所述的核酸的方法，该方法包括下述步骤：将编码至少1个miRNA结合序列的核酸插入在启动子的下游编码形成至少1个双链结构的1对互补序列的核酸之间；

[13][12]所述的方法，其中，编码miRNA结合序列的核酸包含至少2个miRNA结合序列且包含在其间形成茎环的序列；

[14]试剂盒，其用于制作[9]所述的核酸，该试剂盒包含下述(a)和(b)的核酸：

(b)核酸，该核酸编码至少1个miRNA结合序列；

[15][14]所述的试剂盒，其中，编码miRNA结合序列的核酸包含至少2个miRNA结合序列且包含在其间形成茎环的序列。

需要说明的是，上述各项中，2个或2个以上的引用同一项的各项所记载的发明任意组合而得到的发明，已经包含在它们中所引用的上位的项所记载的发明中。另外，本说明书中记载的任意的发明要素及其任意组合包含在本说明书中。另外，在这些发明中，除本说明书所记载的任意要素或其任意组合以外的发明也包含在本说明书中。说明书中例如记载某特定方案作为优选方案时，本说明书不仅公开该方案，除该方案以外的发明也由包含该方案的更上位的本说明书所公开的发明来公开。

发明效果

通过本发明，提供可以有效率且特异性地抑制miRNA的功能的miRNA抑制剂。本发明的miRNA抑制剂，例如通过将其表达单元整合逆转录病毒载体中，可以长期稳定地抑制miRNA。这例如可以使击倒小鼠这样的体内测定成为可能。并且，由于通过Cre-loxP调节的U6启动子系统已经确立，所以还可以利用该系统时间特异性且组织特异性地实施miRNA击倒。如图6所例示，本发明的miRNA抑制RNA的表达套件可以容易地构建，所以还可以利用其构建用于综合性分析miRNA的RNA文库。这样，本发明提供对miRNA的研究非常有用的工具。例如，通过根据是否存在特定的miRNA抑制RNA的表达来全面研究培养细胞中的表达mRNA，可以将本发明用于鉴定靶mRNA候补。另外，预想生物体内的基因有相当的比例是miRNA的靶，提示miRNA在包括分化、发育、肿瘤形成、以及抗感染症的细胞防御在内的各种方面中发挥重要作用。在基因调节机制的阐明、或肿瘤或感染症的基因治疗等中，本发明的方法对控制参与上述行为的miRNA的功能有用。

附图说明

图1是显示原型诱骗RNA的茎长的效果的图。(A)原型诱骗RNA的结构。粗黑的弯箭头表示MBS(5’→3’)。(B)向保有miR-140-3p报道基因和miR140-5p/140-3p载体两者的HeLaS3细胞中分别导入表达这些诱骗RNA的慢病毒载体，在导入的6～10天后，通过FACS分析确定全集团的GFP表达水平的中值。相对于只保有miR-140-3p报道基因的HeLaS3细胞的表达水平进行校正，并以平均±SEM表示表达水平。使用以Cre重组酶基因为靶的shRNA作为阴性对照(NC)。

图2是显示具有各种茎结构的一系列诱骗RNA的抑制效果的比较的图。(A)诱骗RNA#2和#10～#16的结构。粗黑的弯箭头表示MBS。I、II、III和IV显示存在于诱骗RNA中的茎。(B)使用与图1B的说明中所示的相同的报道基因细胞系统，确定表达这些诱骗RNA的慢病毒载体的效果。与图1B同样校正表达水平。显示诱骗RNA的各茎序列(I、II、III和IV)的长度。(C)构成本发明的诱骗RNA的单元的一种形态。I表示第1双链结构，II表示第2双链结构。a和b分别包含至少一个MBS。第2双链结构的末端(图中的右端)可以形成环，也可以不形成环。形成环时，诱骗RNA成为单链。a和b可以包含多个MBS，而且，即使a和b可以不完全是单链状态，也可以部分性地形成双链结构。多个该单元可以串联相接(例如图示(panel)A的#15和#16)。(D)在图示(C)所示的单元中，第2双链结构的末端形成环时的结构。对环中所含的核苷酸数目没有特别限定，可以是0～数个、例如1、2、3、4、5、6、7个核苷酸。需要说明的是，图示(A)、(C)、(D)的双链部分的竖线表示取双链结构，核苷酸数目并不受竖线数目的限定。

图3是显示原型诱骗RNA的MBS序列给抑制效果带来显著影响的图。以图1B的说明中所示的方式确定相对GFP表达。

图4是显示诱骗RNA的接头序列长度的效果的比较的图。(A)诱骗RNA#22～#26的结构。粗黑的弯箭头表示MBS(5’→3’)。→指示接头序列。(B)以图1B的说明中所示的方式确定相对GFP表达。另外，接头序列的长度也如图示所示。

图5是显示MBS序列内的凸起和连接MBS和茎的间隙的接头的效果的图。以图1B的说明中所示的方式确定相对GFP表达。粗黑的曲线箭头表示MBS。

图6中，(A)是显示本发明的miRNA抑制RNA的代表性结构的图。MBS表示miRNA结合位点。(B)通过小鼠U6启动子驱动的miRNA抑制RNA表达用套件的生成的模式图。将约80～90mer的合成寡核苷酸对退火，再将其克隆到位于BamHI-EcoRI片段(原来的套件)中的2个BsmBI位点之间，生成miRNA抑制RNA表达套件。

图7是显示本发明的抑制miRNA的复合体的抑制效果的通用性、特异性和持续期间的图。(A)利用图1B中记载的GFP报道基因细胞系统检测的、TuD-miR140-5p-4ntin或TuD-miR140-3p-4ntin对miR140-3p活性的效果。但是，在导入后8～12天确定了GFP表达水平(图16D和E)。(B)TuD-miR140-5p-4ntin或TuD-miR140-3p-4ntin对miR140-5p活性的效果。向保有miR-140-5p报道基因和miR140-5p/140-3p载体两者的HeLaS3细胞中分别导入表达这些miRNA抑制RNA的慢病毒载体，在导入后8～12天确定了GFP表达水平。相对于只保有miR-140-5p报道基因的HeLaS3细胞的表达水平进行校正，并以平均±SEM表示表达水平。(C)图1B中记载的TuD-miR140-3p-4ntin对miR140-3p活性的抑制效果的经时性变化。相对于只保有miR-140-3p报道基因的HeLaS3细胞的相对GFP表达水平进行校正。(D)通过定量实时RT-PCR确定的、图示(B)中记载的细胞中的成熟miR140-5p的水平。相对于保有miR-140-5p报道基因和miR140-5p/140-3p载体两者的HeLaS3细胞的miR140-5p表达水平进行校正，并以平均±SEM表示miR140-5p表达水平(n＝3)。以U6 snRNA作为内源性对照。(E)miRNA抑制RNA的胞内定位的分析。用三角标记表示Y4小细胞质RNA(Y4 scRNA，93nt)和ACA1小核RNA(ACA1 snoRNA，130nt)的迁移率。以细胞组分(fraction)标志物的形式显示Y4 scRNA和ACA1snoRNA PA-1。Un、5p、3p、N、C分别表示非感染细胞、TuD-miR140-5p感染细胞、TuD-miR140-3p感染细胞、核组分、细胞质组分。

图8是显示抑制miRNA的复合体对内源性miR21活性的抑制效果的图。将miRNA抑制RNA表达质粒载体或LNA/DNA反义寡核苷酸和海肾荧光素酶miR-21报道基因(白色棒图)或非靶定化的对照海肾荧光素酶报道基因(黑色棒图)和用作转染的对照的萤火虫萤光素酶报道基因一同一过性地转染到PA-1细胞(A)或HCT-116(B)中。在双荧光素酶测定后，相对于转染有TuD-NC载体的PA-1细胞或HCT-116细胞的表达水平进行校正，并以平均±SEM表示表达水平。(C)一过性转染的miRNA抑制RNA表达质粒载体对作为miR21的靶的内源性PDCD4蛋白的表达的效果。将miRNA抑制RNA表达质粒载体转染到PA-1细胞中，在转染的72小时后制备总蛋白。通过蛋白质印迹确定PDCD4(上)和β-肌动蛋白加样对照(下)。(D)通过实时RT-PCR测定进行了与(B)相同的操作的细胞中的miR21表达水平。相对于转染了TuD-NC载体的HCT-116细胞的miR21表达水平进行校正，并以平均±SEM表示miR21表达水平(n＝3)。以U6 snRNA作为内源性对照。(E)通过RNA印迹测定进行了与(B)相同的操作的细胞中的pre-miR21和成熟miR21的表达水平。以加样对照的形式显示Y4scRNA。

图9是显示miRNA抑制RNA表达质粒载体和CMV海绵表达质粒载体、H1-Antagomir表达质粒载体、miRNA Eraser表达质粒载体、LNA/DNA反义寡核苷酸的效果的比较的图。使用HCT-116细胞，自转染起72小时后进行双萤光素酶分析。相对于转染了非靶定化的对照海肾荧光素酶报道基因的HCT-116细胞的表达水平进行校正，并以平均±SEM表示表达水平。

图10是显示通过RNA印迹进行的miRNA抑制RNA表达水平的分析的图。通过RNA印迹分别分析转染了miRNA抑制RNA表达载体的PA-1细胞(A)、HCT-116细胞(B)中TuD-miR-21-4ntin和TuD-miR-21-pf的表达水平。用三角标记显示Y4 scRNA和ACA1snoRNA的迁移率。以加样对照的形式显示Y4 scRNA。

图11是显示通过导入miRNA抑制RNA而诱导的生物活性的图。(A)通过导入TuD-miR21而产生的PA-1细胞的细胞增殖活性的分析。将miRNA抑制RNA表达载体导入PA-1细胞中，自载体导入起分析细胞数达4天。(B)通过导入TuD-miR21而引起的PA-1细胞的凋亡诱导的分析。将miRNA抑制RNA表达载体导入PA-1细胞中，自载体导入起3天后分析胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7的活性。相对于各导入有miRNA抑制RNA表达载体的PA-1细胞的细胞数目进行校正，并以平均±SEM表示该活性。

图12是显示miRNA抑制RNA对靶miRNA家族的抑制效果的图。(A)显示miR-16、195、497的序列及其同源性。以括号显示的序列为seed位点，黑色棒图显示同源位点。(B)显示TuD-miR-16-4ntin、TuD-miR-195-4ntin和TuD-miR497-4ntin的MBS与miR-16的结合。黑点显示G-U结合。(C)将miRNA抑制RNA表达质粒载体与海肾荧光素酶miR-16报道基因(白色棒图)或非靶对照海肾荧光素酶报道基因(黑色棒图)和用作转染的对照的萤火虫萤光素酶报道基因一同转染到HCT-116细胞中，进行双荧光素酶测定。相对于转染了TuD-NC载体的HCT-116细胞的值进行校正，并以平均±SEM表示表达水平(n＝3)。

图13是显示用于miR140-3p的诱骗RNA的结构和序列的图。MBS表示与miR140-3p完全或部分互补的miRNA结合位点。

图14是显示用于miR140-3p的诱骗RNA的结构和序列的图(图13的续图)。

图15是显示用于构建miR-140-3p或miR-140-5p的高灵敏度测定系统的逆转录病毒载体的结构的图。(A)基于报道基因MLV的逆转录病毒载体pMXs-GIN-miR140-3pT的原病毒的结构。在紧挨着GFP基因的下游具有与成熟miR-140-3p完全互补的21bp的插入。U3、R和U5分别显示MoMLV长末端重复来源所对应的序列。Ψ：逆转录病毒载体的包装信号。(B)基于报道基因MLV的逆转录病毒载体pMXs-GIN-miR140-5pT的原病毒的结构。(C)基于MoMLV的miR140-5p/140-3p表达载体pSSCH-miR140-5p/140-3p的原病毒的结构。Pri-miR140-5p/140-3p序列被插入ΔU3序列中，使其通过内部的CMV启动子转录。ΔU3：除去了主要增强子序列(major enhancersequences)的U3序列。(D)基于HIV的自身惰性化诱骗RNA表达载体的结构。ΔU3：除去了主要增强子序列(major enhancer sequences)的U3序列。R：慢病毒的R序列。U5：慢病毒的U5序列。Ψ：慢病毒的包装信号。

图16是显示miR140-3p活性的高灵敏度测定系统的建立、以及miRNA抑制RNA的导入的效果的图(图示A～E)。HeLaS3细胞的GFP表达水平(自身荧光)的FACS分析(A)、只保有miR140-3p报道基因的HeLaS3细胞的GFP表达水平的FACS分析(B)、以及保有miR140-3p报道基因和miR140-5p/140-3p表达载体两者的HeLaS3细胞的GFP表达水平的FACS分析(C)。向miR140-3p报道基因细胞中分别导入TuD-miR140-3p-4ntin(D)或TuD-miR140-5p-4ntin(E)中的任一种，8天后的GFP表达水平的FACS分析。粗的实线和点线分别表示只保有miR140-3p报道基因的HeLaS3细胞的GFP表达分布图、保有miR140-3p报道基因和miR140-5p/140-3p表达载体两者的HeLaS3细胞的GFP表达分布图。

图17是显示萤光素酶表达载体的结构的图。(A)萤火虫萤光素酶表达质粒载体pTK4.12C.P-的结构。(B)不具有插入的海肾荧光素酶报道基因pGL4.74的结构。(C)在紧挨着海肾荧光素酶基因的下游具有与成熟miR-21完全互补的22bp的插入的海肾荧光素酶报道基因pGL4.74-miR21T的结构。(D)在紧挨着海肾荧光素酶基因的下游具有与成熟miR-16完全互补的22bp的插入的海肾荧光素酶报道基因pGL4.74-miR16T的结构。

图18是显示本发明的miRNA抑制RNA的结构和序列的图。MBS表示与对应的miRNA完全或部分互补的miRNA结合位点。

图19是显示miR-21抑制效果中的TuD-miR-21-4ntin表达载体的量依赖性的图。只变更TuD-NC、TuD-miR-21-4ntin表达质粒的量，除此之外，在与图8(B)相同的条件下将其转染到HCT-116细胞中。相对于转染了TuD-NC载体的HCT-116细胞的值进行校正，并以平均±SEM表示表达水平(n＝3)。

图20是显示抑制miRNA的复合体对内源性miR21活性的抑制效果的图。将miRNA抑制RNA表达质粒载体或LNA/DNA反义寡核苷酸和海肾荧光素酶miR-21报道基因(白色棒图)或非靶定化的对照海肾荧光素酶报道基因(黑色棒图)和用作转染的对照的萤火虫萤光素酶报道基因一同一过性地转染到SW480细胞(A)、HT29细胞(B)、TIG-3/E/TERT细胞(C)或3Y1细胞(D)中。在双荧光素酶测定后，相对于转染了TuD-NC载体的SW480细胞、HT29细胞、TIG-3/E/TERT细胞或3Y1细胞的表达水平进行校正，并以平均±SEM表示表达水平(n＝3)。

图21是显示HCT-116细胞中的miR-15a/15b/16/195/424/497家族的表达水平的图。利用Agilent公司的miRNA-微阵列分析表达水平。

图22是由2’-O-甲基合成寡核苷酸产生的本发明的miRNA抑制RNA及其效果。(A)双荧光素酶测定用报道基因质粒。实施例7～9的实验均使用HCT-116细胞来进行。(B)由2’-O-甲基合成寡核苷酸产生的本发明的miRNA抑制RNA的结构。将所有核苷酸均被2’-O-甲基化修饰的双链合成寡核苷酸退火后使用。(C)显示由2’-O-甲基合成寡核苷酸产生的合成RNA的miRNA抑制效果。改变浓度测定该抑制RNA的miRNA抑制效果，与现有的2’-O-甲基合成寡核苷酸进行比较。

图23显示将本发明的miRNA抑制RNA的miRNA抑制效果与普通的LNA、PNA和2’-O-甲基化寡核苷酸进行比较的结果。

图24显示将本发明的miRNA抑制RNA的miRNA抑制效果与miRIDIAN抑制剂等进行比较的结果。

图25是利用了鸟嘌呤四重链(G-quadruplex)的本发明的miRNA抑制RNA的转录及其效果。(A)G-quadruplex-环111的平行四重链结构和G-quadruplex-环333的平行以及反向平行四重链结构。(B)TuD-miR21-4ntin、TuD-miR21-4ntin-GqL111和TuD-miR21-4ntin-GqL333的结构的模式图。(C)各RNA的miRNA抑制活性。

图26显示miRNA抑制RNA的结构所带来的效果。(A)TuD-miR21-4ntin、TuD-miR21-4ntin-1MBS-1和TuD-miR21-4ntin-1MBS-2的结构的模式图。在1MBS-1中，虚线箭头表示MBS反向序列；在1MBS-2中，虚线箭头表示TuD-NC(对照序列)。(B)各RNA的miRNA抑制活性。

图27是通过人7SK启动子的本发明的miRNA抑制RNA的转录及其效果。(A)显示通过人7SK启动子转录本发明的miRNA抑制RNA的表达套件的结构。人7SK启动子通过紧挨着7SK RNA的转录起始点的序列(特别是第1位～第8位的核苷酸)使转录强化，所以将7SKRNA的第1位～第13位的核苷酸整合本发明的抑制RNA的茎部分。(B)HCT-116细胞中的miR-21抑制效果。通过图22(A)中记载的双荧光素酶测定来进行测定。

图28显示本发明的miRNA抑制RNA的miR200的抑制效果。构建以(A-D)miR200为靶的本发明的miRNA抑制RNA的表达质粒，使用萤光素酶报道基因测定系统，显示通过2种启动子表达的miRNA抑制RNA的效果。(E)通过TuD-miR200c-4ntin进行的上皮-间充质转换的情形。将miRNA抑制RNA表达慢病毒载体导入HCT-116细胞中，制作稳定表达miRNA抑制RNA的细胞集团，在导入的15天后制备总蛋白。通过蛋白质印迹确定作为上皮细胞、间充质细胞各自的基因标志物的E-钙粘着蛋白(上)、波形蛋白(中)、以及β-肌动蛋白加样对照(下)。

具体实施方式

本发明涉及可以有效率且特异性地抑制miRNA的miRNA抑制复合体。本发明的抑制miRNA的复合体包含双链或多重链结构，包含miRNA结合序列(MBS)的至少1条链与该双链或多重链结构的至少单端的2条链结合。需要说明的是，在本发明中，通过将该双链或多重链结构称作“第一”双链结构，有时可以和本发明的复合体所能包含的另外的双链或多重链结构区别开来(后述)。本发明的复合体可以是也可以不是单链(即通过共价键结合的1个分子)，例如可以由单链、双链或其以上的多条链构成。本发明包括例如由包含MBS的RNA链分别与双链结构的单端的2条链的每一条结合的双链RNA形成的复合体。此外，包含至少1个MBS的单链RNA链例如可以与双链结构的单端的2条链结合。此时，双链结构的单端的2条链通过包含MBS的RNA链相连接(例如图1)。连接双链结构的2条链的RNA中虽然包含至少1个MBS，但例如可以包含2个、3个或其以上(例如图2A)。双链结构包含茎环或发夹结构。即，双链结构可以是茎环或发夹结构中所含的双链结构。

本发明中，抑制miRNA的复合体可以是具有双链结构、且包含至少1条RNA或其类似物的结构体。该复合体优选包含1分子或2分子的包含RNA或其类似物的分子。

本发明中，miRNA结合序列(MBS)是指与miRNA结合的序列。MBS至少包含与miRNA互补的部分，以使其能够与miRNA结合。如实施例所示，MBS可以是也可以不是与miRNA完全互补的序列。例如，MBS可以是miRNA所靶向的天然的RNA序列。MBS例如连续或非连续地包含与miRNA互补的至少10个核苷酸、例如11个核苷酸以上、12个核苷酸以上、13个核苷酸以上、14个核苷酸以上、15个核苷酸以上、16个核苷酸以上、17个核苷酸以上、18个核苷酸以上、19个核苷酸以上、20个核苷酸以上、21个核苷酸以上、22个核苷酸以上、23个核苷酸以上或24个核苷酸以上的核苷酸。优选该互补的核苷酸连续、或者具有3处以下、2处以下、优选1处的缺口。缺口可以是MBS侧和/或miRNA侧的不配对(凸起)，关于1处的缺口，可以是只在单方的链上具有凸起核苷酸的缺口，也可以在双方的链上具有不配对的核苷酸。优选设计成至少在MBS侧包含不配对的核苷酸。凸起和错配的核苷酸数为：在每1处凸起和错配中、在每一单链上例如为6个核苷酸以下、优选5个核苷酸以下、4个核苷酸以下、3个核苷酸以下、2个核苷酸以下或1个核苷酸。在本发明中，能够形成凸起的MBS显示出较包含完全互补的序列的MBS高的miRNA抑制效果(实施例4)。因此，为了得到更高的miRNA抑制效果，优选以形成凸起的方式设计MBS。例如，从MBS的3’末端起第10位和/或第11位的核苷酸与miRNA不互补、或者在第10位和第11位之间包含多余的核苷酸的MBS(或者从miRNA中的靶序列(与MBS杂交的序列)的5’末端起第10位和/或第11位的核苷酸未形成与MBS互补的核苷酸、或者在第10位与第11位的核苷酸之间包含不配对的核苷酸的MBS)不易被分解，可以期待高的活性。此时，例如可以以包含从miRNA的5’末端起第10位和第11位的核苷酸不配对的形式设计MBS，例如可以以第9～11位、第10～12位、或第9～12位不配对的形式设计MBS。此外，在miRNA侧虽然不存在不配对的核苷酸，但在MBS侧在从3’末端起第10位与第11位之间(或者在相当于从miRNA中的靶序列(与MBS杂交的序列)的5’末端起第10位和第11位的位点之间)可以具有不配对的核苷酸。不配对的核苷酸可以存在于miRNA侧和/或MBS侧，但优选至少存在于MBS侧。各链中不配对的核苷酸的数可以适当调整，例如为1～6个核苷酸，优选为1～5个核苷酸，更优选为3～5个、例如3、4或5个核苷酸。

此外，为了识别miRNA的靶，已知从miRNA的5’端起第2～7位或第3～8位的核苷酸(称作seed区)匹配很重要(Jackson AL等人.，RNA 12(7)：1179-1187，2006；Lewis BP等人.，Cell 120：15-20，2005；Brennecke等人.PLoS BIOLOGY 3，0404-0418，2005；Lewis等人.Cell115，787-798，2003；Kiriakidou等人.Genes & Development 18，1165-1178，2004)。实际显示：即使本发明的miRNA抑制RNA是具有仅seed区匹配、与其他区只具有低的互补性的MBS的miRNA抑制RNA，也可以有效抑制miRNA(实施例6、图12)。作为本发明中的MBS，优选miRNA的seed区(从miRNA的5’端起第2～7位和/或第3～8位的核苷酸)完全互补的MBS。此时，可以认为G:U对(U:G对)也互补，但优选认为只有G:C(C:G)和A:U(U:A)互补。另外，作为本发明中的MBS，优选miRNA的seed区(从miRNA的5’端起第2～7位和/或第3～8位的核苷酸)完全互补、且连续包含与miRNA互补的至少8个核苷酸、更优选9个核苷酸、更优选10个核苷酸的MBS。并且，本发明中的MBS优选包含与miRNA互补的总计11个核苷酸以上、更优选12个核苷酸以上、更优选13个核苷酸以上的核苷酸。

MBS优选为在生理条件下与miRNA序列杂交的序列。生理条件下是指例如150mM NaCl、15mM柠檬酸钠、pH7.0、37℃。更优选MBS为在严格的条件下与miRNA序列杂交的序列。严格的条件是指例如1×SSC(1×SSC是指150mM NaCl、15mM柠檬酸钠、pH7.0)或0.5×SSC、42℃的条件，更优选为1×SSC或0.5×SSC、45℃的条件，更优选为1×SSC或0.5×SSC、50℃的条件。在杂交中，例如标记包含miRNA序列的RNA或包含MBS的RNA中的其中之一，将另一方固定在膜上，使两者杂交。杂交条件例如可以在包含5×SSC、7％(W/V)SDS、100μg/ml变性鲑精DNA、5×Denhardt’s液(1×Denhardt’s溶液包含0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％牛血清白蛋白和0.2％Ficoll)的溶液中、例如在37℃或45℃或50℃下进行。培养足够的时间(例如3、4、5或6小时以上)后，在上述条件下清洗，检测标记的核酸是否杂交，由此可以确定在该条件下核酸是否杂交。

或者，MBS优选与miRNA序列的互补序列显示出高同源性。高同源性是指例如具有70％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的同源性的核苷酸序列。核苷酸序列的同源性例如可以使用BLAST程序(Altschul，S.F.等人.，J.Mol.Biol.215：403-410，1990)来确定。例如在NCBI(National Center for Biothchnology Information)的BLAST的网页中，可以使用缺省参数进行检索(Altschul S.F.等人.，Nature Genet.3：266-272，1993；Madden，T.L.等人.，Meth.Enzymol.266：131-141，1996；Altschul S.F.等人.，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997；ZhangJ.& Madden T.L.，Genome Res.7：649-656，1997)。例如利用进行2个序列的比较的blast 2 sequences程序(Tatiana A等人.，FEMS MicrobiolLett.174：247-250，1999)制作2个序列的比对，可以确定序列的同源性。无视miRNA序列的核苷酸序列外侧的缺口，内侧的缺口例如与错配同样处理，计算比对中的miRNA序列相对于核苷酸序列整体(加算进入序列的内侧的缺口后的总核苷酸长度)的同源性的值。但是，如实施例所示，MBS和miRNA的错配可以提高miRNA的抑制活性。因此，例如优选无视在比对的内侧插入miRNA序列中的缺口，算出同源性。

或者，MBS优选包含在miRNA序列的互补序列中插入、取代和/或缺失1个或数个核苷酸而得到的序列。优选MBS包含相对于miRNA序列的互补序列具有8个核苷酸以内、7个核苷酸以内、6个核苷酸以内、5个核苷酸以内、4个核苷酸以内、3个核苷酸以内、2个核苷酸以内或1个核苷酸的插入、取代和/或缺失的序列。更优选MBS包含相对于miRNA序列的互补序列具有8个核苷酸以内、7个核苷酸以内、6个核苷酸以内、5个核苷酸以内、4个核苷酸以内、3个核苷酸以内、2个核苷酸以内或1个核苷酸的插入的序列。本发明中显示：和与miRNA序列完全互补的序列相比，MBS的存在错配的序列的miRNA的抑制活性高。认为这是由于：若MBS完全互补，则通过包含miRNA的RISC而受到切断，由此miRNA抑制RNA的表达水平降低。特别是MBS与miRNA杂交时，设计成从MBS的3’末端起第10位和/或第11位的核苷酸不配对(或者，从与MBS杂交的miRNA侧的靶序列的5’末端起第10位和/或第11位的核苷酸与MBS杂交时不配对)、或者在第10位与第11位的核苷酸之间包含不配对的核苷酸的MBS可以期待高的活性。这样的不配对例如可以是MBS侧的凸起，形成凸起的核苷酸为1～6个核苷酸、优选1～5个核苷酸、更优选为3～5个核苷酸(例如3、4或5个核苷酸)。

MBS可以由RNA组成、或者包含核酸类似物、或者可以由核酸类似物组成(实施例7)。特别是通过使MBS的被切断的位点(从MBS的3’末端起第10位和/或第11位的核苷酸等)形成核酸类似物以使其不发生切断，可以期待提高miRNA抑制效果。另外，还优选使用具有硫代磷酸酯或2’-O-甲基等主链或糖的核酸(Krutzfeldt，J.等人.，Nucleic Acids Res.35：2885-2892；Davis，S.等人.，2006，Nucleic AcidsRes.34：2294-2304)。

对本发明的抑制miRNA的复合体所靶向的miRNA没有特别限定。只要是它们具有miRNA结构，也可用于来自植物、线虫、脊椎动物等任何物种的miRNA。已知在以人、小鼠、鸡、斑马鱼、拟南芥(Arabidopsis thaliana)为代表的多种生物中有非常多的miRNA的序列(参照miRBase::Sequences的网页：microrna.sanger.ac.uk/sequences/)。例如可以以包括小鼠、大鼠、山羊等在内的哺乳动物、包括猴在内的灵长类、以及人的miRNA作为靶。例如可以例示：miR21(Lagos-QuintanaM等人.，Science.294：853-858，2001；Mourelatos Z等人.，Genes Dev.16：720-728，2002；Michael MZ等人.，Mol Cancer Res.1：882-891，2003；Dostie J等人.RNA.9：180-186，2003)、miR140(Lagos-Quintana M等人.，Curr Biol.12：735-739，2002；Cai X等人.，Proc Natl Acad Sci U S A.102：5570-5575，2005)、miR1995(Lagos-Quintana M等人.，RNA.9：175-179，2003；Landgraf P等人.，Cell.129：1401-1414，2007)、miR16(Lagos-Quintana M等人.，Science.294：853-858，2001；Mourelatos Z等人.，Genes Dev.16：720-728，2002；Lim LP等人.，Science.299：1540，2003；Calin GA等人.，Proc Natl Acad Sci U S A.99：15524-15529，2002；Michael MZ等人.，Mol Cancer Res.1：882-891，2003)、miR497(Bentwich I等人.，Nat Genet.37：766-770，2005；Landgraf P等人.，Cell.129：1401-1414，2007)等，但并不限于这些。

另外，本发明的上述抑制miRNA的复合体涉及下述的抑制miRNA的复合体：该复合体除了包含第1多重链结构，还包含第2多重链结构，形成包含MBS的RNA链分别与位于第1多重链结构的一端的2条链的每1条结合的结构，该RNA链的其他各端分别与位于该第2多重链结构的一端的2条链结合，使被夹在第1多重链结构与第2多重链结构之间。多重链结构可以是2条链，或者可以是G-quadruplex这样的4条链。优选第1多重链结构为2条链、第2多重链结构为2条链或4条链。例如，本发明涉及抑制miRNA的复合体，该复合体除了包含第1双链结构，还包含第2双链结构，在第1双链结构中，结合有MBS的一方的末端的2条链形成分别结合每1条包含MBS的RNA链的结构，该RNA链的各另一端分别与该第2双链结构的2条链结合，以被夹在第1双链结构与第2双链结构之间。该RNA复合体例如具有至少2个双链结构，构成该2个双链结构的4条RNA链各自未经由剩下的3条中的任一条链，而是具有与包含MBS的RNA结合的结构。说到更容易理解这样的抑制miRNA的复合体时，该抑制miRNA的复合体是包含MBS的2条RNA链与2个双链结构的各链分别结合，以被夹在2个双链结构中的复合体(图2(C))。即，本发明包含RNA，该RNA是具有图2(C)的结构的RNA复合体，RNA链a和b被夹在双链结构I和II中，该a和b中分别包含1个以上的MBS。由于包含MBS的2条RNA链与双链结构所配对的各链结合，所以RNA链的方向彼此相反(图2、#12～#16)。通过以这种方式在双链的各链上分别添加MBS，可以发挥更高的miRNA抑制活性。

以夹在2个双链结构中的方式存在的、包含MBS的2条RNA链中，分别包含1个以上的MBS。这些MBS可以是相同的序列，也可以是不同的序列。另外，可以是以相同的miRNA为靶的序列，也可以是与不同的靶miRNA结合的序列。例如，1条链上可以包含2个以上、例如2、3、4或5个MBS(图2、#12～#16)。例如，夹在2个双链结构中的各链上可以包含1个或2个MBS。例如，本发明的抑制miRNA的复合体可以是总计包含2个MBS的复合体，这2个MBS可以是相同的序列、或与同样的miRNA结合的序列。

如上所述，本发明的抑制miRNA的复合体中所含的双链所配对的各链可以是各自的RNA分子，双链中的一方或两方的末端可以相连接，可以形成直链状或环状。需要说明的是，直链状是相对于环状而言的，不过是指具有末端，当然不是指未形成二次结构。由直链状单链RNA构成的抑制miRNA的复合体例如可以通过一次的RNA合成来制作，还可以使用表达载体等通过1个表达单元表达。例如，当包含2个双链结构时，第2双链结构的一端(MBS未结合的侧)的2条链可以通过环连接，使整体形成单链。在连接双链的序列中可以包含1个或1个以上的MBS(图2、#2、#11、#13、#14、#16)。为了使序列尽可能短小，可以通过短环连接双链。例如，可以使双链通过1～10个核苷酸、优选1～8个核苷酸、2～6个核苷酸、3～5个核苷酸、例如4个核苷酸的序列结合。对序列没有特别限定。例如有5’-GUCA-3’(图6A)。例如，本发明包含RNA，该RNA具有图2(A)#13或图2(D)的结构，RNA链a和b夹在双链结构I和II中，双链结构II形成发夹结构(或茎·环)，该a和b中分别包含1个以上的MBS。

本发明的抑制miRNA的复合体中所含的双链结构，对其序列没有特别限定，但优选具有4个碱基对以上的长度。特别是本发明的RNA复合体中所含的双链结构中的至少1个(即第一双链结构)在RNA复合体的核外输送中具有重要功能。该双链的链长例如可以是15～50碱基对，优选为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个核苷酸、或它们的任一个以上、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或18个核苷酸、或它们的任一个以下。在更优选的方案中，双链结构的碱基对的长度例如为15～30、优选16～28、优选17～25、优选17～24、例如17、18、19、20、21、22、23或24。即使超过20bp，也可以发挥高的活性，但超过20bp的dsRNA在细胞质中能够成为被切酶切断的潜在的靶，所以为了避免这种情形，本发明的复合体中所含的双链结构可以是20bp以下、例如19bp以下或18bp以下。

当本发明的抑制miRNA的复合体中包含第二或其以上的双链结构时，对这些双链结构的序列或其长度没有特别限定。例如为了使抑制miRNA的复合体整体短小，这些双链结构的长度可以短于第一双链结构的长度。各双链的链长可以适当调整，例如为4bp～20bp，例如可以是5bp～15bp、5bp～12bp、5bp～10bp、6bp～9bp或7bp～8bp。

形成双链结构的碱基对的序列可以适当设计，以使在抑制miRNA的复合体中可以特异性且稳定地形成双链。例如，优选避免相同的核苷酸长(例如8个核苷酸以上、优选7个核苷酸以上、更优选5个核苷酸以上、更优选4个核苷酸以上、更优选3个核苷酸以上)且连续的同聚序列。此外，还优选避免二个核苷酸重复序列或3～4个核苷酸重复序列等多个核苷酸的序列串联重复的序列。双链部分的GC含量可以适当调整，例如为12％～85％、优选为15％～80％、20％～75％、25％～73％、32％～72％、35％～70％、37％～68％或40％～65％。若列举一例，则可以例示图6A所示的茎I和茎II的序列，但并不限于这些序列。作为4条链，可以列举G-quadruplex，具体而言，可以是GGG-环-GGG-环-GGG-环-GGG(GGG-loop-GGG-loop-GGG-loop-GGG)这样的序列。这里，环的序列可以适当选择，例如3个环可以均为1个核苷酸(例如M(A或C))、或者均为3个核苷酸(SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：168等)。

MBS与双链结构可以直接连接，也可以经由其他序列连接。例如，可以经由适当的接头或间隔区序列使MBS与双链结构的末端结合。即使将MBS与双链部分直接连接，也可以得到显著的抑制活性，但通过添加接头(或者还称作间隔区)，对miRNA的抑制效果进一步提高(实施例4)。MBS序列与双链结构之间的接头或间隔区序列有可能增加MBS与存在于RISC中的miRNA的可接近性。接头或间隔区的长度可以适当调整，例如为1～10个核苷酸、优选为1～9个核苷酸、1～8个核苷酸、1～7个核苷酸、1～6个核苷酸、1～5个核苷酸、1～4个核苷酸或1～3个核苷酸。例如，即使是连接2个以上的MBS的情况，也可以经由接头或间隔区进行连接。对接头或间隔区的序列没有特别限定，例如可以是包含A和/或C的序列、或者包含A和/或C较其他核苷酸多的序列。另外，优选注意不使接头或间隔区序列与对应的接头或间隔区序列、或MBS之间形成稳定的碱基对。若列举一例，则可以例示AAC、CAA、ACC、CCA或包含它们中的任一个的序列等。添加在MBS的两侧的一对接头或间隔区序列可以是反向序列(镜像序列)。例如，可以在MBS的5’侧添加AAC、在3’侧添加CAA。

此外，可以对构成本发明的抑制miRNA的复合体的核酸进行修饰。例如，构成核酸的核苷酸可以是天然核苷酸、被修饰的核苷酸、人工核苷酸、或它们的组合。另外，本发明的抑制miRNA的复合体中所含的核酸可以由RNA组成、或者可以是RNA/DNA嵌合体、或者可以包含其他核酸类似物，可以包含它们的任意的组合。核酸中不仅包括通过磷酸二酯键结合的核酸，还包括具有酰胺键或其他主链的核酸(肽核酸(PNA)等)。核酸类似物中例如包括天然及人工的核酸，可以是核酸衍生物、核酸类似物、核酸派生物等。这样的核酸类似物在该领域中众所周知，例如包括硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2’-O-甲基核苷酸、肽核酸(PNA)，但并不限于这些。PNA的骨架中可以包含由氨基乙基甘氨酸、聚酰胺、聚乙基、聚硫代酰胺、聚亚磺酰胺(polysulfinamide)、聚磺酰胺、或它们的组合形成的骨架(Krutzfeldt，J.等人.，Nucleic Acids Res.35：2885-2892；Davis，S.等人.，2006，Nucleic Acids Res.34：2294-2304；Boutla，A.等人.，2003)，Nucleic Acids Res.31：4973-4980；Hutvagner，G.等人.，2004，PLoS Biol.2：E98；Chan，J.A.等人.，2005，Cancer Res.65：6029-6033；Esau，C.等人.，2004，J.Biol.Chem.279：52361-52365；Esau，C.等人.，2006，Cell Metab.3：87-98)。

可以进行核酸的修饰，以抑制由内切核酸酶引起的分解。在特别优选的修饰中，2’或3’糖修饰、例如2’-O-甲基(2’-O-Me)化核苷酸或2’-脱氧核苷酸、或2’-氟、二氟甲苯酰基、5-Me-2’-嘧啶、5-烯丙基氨基-嘧啶、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-N-甲基乙酰胺(2’-O-NMA)、2’-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-DMAEOE)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-AP)、2’-羟基核苷酸、硫代磷酸酯、4’-硫代核苷酸、2’-O-三氟甲基核苷酸、2’-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2’-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸、或2’-ara-氟核苷酸、锁定核酸(LNA)、2’-O，4’-C-乙烯交联核酸(2’-O，4’-C-ethylene bridged nucleic acid(ENA))等乙烯核酸、其他交联核酸(BNA)、己糖醇核酸(hexitol nucleic acid；HNA)、吗啉代核酸、三环-DNA(tcDNA)、聚醚核酸(US Pat.No.5,908,845)、环己烯核酸(CeNA)、以及它们的组合。另外，可以进行二氟甲苯酰基(DFT)修饰、例如2，4-二氟甲苯酰基尿嘧啶，或者将胍取代成肌苷。

此外，核酸可以在其末端包含结合体。作为结合体，例如有亲油性物质、萜烯、蛋白结合物质、维生素、碳水化合物、类视黄醇和肽等。具体可以例示：C5-氨基烷基dT、萘普生、硝基吲哚、叶酸、可拉酸、布洛芬、类视黄醇、聚乙二醇(PEG)、C5嘧啶接头、甘油类脂(例如二烷基甘油酯衍生物)、维生素E、胆固醇、硫代胆固醇、dU-胆固醇、烷基链、芳基、杂环式复合体、以及修饰糖(D-核糖、脱氧核糖、葡萄糖等)。结合体与核酸例如可以经由任意的接头结合，具体可以列举：吡咯烷接头、丝氨醇接头、氨氧基或羟脯氨醇接头等。另外，可以在核酸中适当添加细胞透过信号。例如，已知有多种用于将核酸导入细胞中的细胞透过性肽(WO2008/082885)。具体可以列举：例如聚精氨酸等富含精氨酸的肽，例如可以是HIV-1 Tat(48-60)、HIV-1 Rev(34-50)、FHV Coat(35-49)、BMV Gag(7-25)、HTLV-II Rex(4-16)、它们的部分肽、或其inverso或retro-inverso等。优选的一个例子为：SEQ ID NO：152所示的HIV-1 Tat 57-49。氨基酸可以使用适当的d体。细胞透过性肽等可以通过众所周知的接头与核酸结合。

本发明的抑制miRNA的复合体可以设计成由直链状的单链核酸构成(图2)。本发明特别涉及复合体，其中，所有MBS均集中在某双链结构(图2的茎I)的单侧(图2中为右侧)，该双链结构的各链在该侧形成闭合的结构(即通过包含MBS的序列连接)，在该双链结构的相反侧具有单链RNA的两端(图2)。在包含MBS的序列中，可以进一步包含多重链(例如二或四条链)结构(图2的茎II或III等)。单链RNA的长度可以适当确定，例如为500个核苷酸内、优选450个核苷酸以内、420个核苷酸以内、400个核苷酸以内、380个核苷酸以内、360个核苷酸以内、340个核苷酸以内、320个核苷酸以内、300个核苷酸以内、280个核苷酸以内、260个核苷酸以内、240个核苷酸以内、220个核苷酸以内、200个核苷酸以内、180个核苷酸以内、160个核苷酸以内、140个核苷酸以内、120个核苷酸以内、100个核苷酸以内或80个核苷酸以内。例如，形成具有2个双链结构和2个MBS的复合体的单链RNA的长度例如为60～300个核苷酸、优选为70～250个核苷酸、80～200个核苷酸、90～180个核苷酸或100～150个核苷酸。第一双链结构(接近单链RNA的两端的双链结构)例如可以为15～30bp、优选16～28bp、优选17～25bp、优选17～24bp、例如17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp或24bp，为了使整体短小，第二双链结构(包含MBS的序列中所含的另一双链结构)可以较第一双链结构的长度短，例如为4bp～20bp，例如可以是5bp～15bp、5bp～12bp、5bp～10bp、6bp～9bp或7bp～8bp。

本发明还涉及：构成本发明的抑制miRNA的复合体的RNA(这里，作为RNA，包含天然RNA和核酸类似物)、以及编码该RNA的核酸(DNA或RNA)。miRNA抑制RNA复合体由1分子的RNA构成时，通过该RNA的分子内退火，可以构建本发明的复合体；而当由2条以上的RNA分子构成时，通过使这些RNA退火，可以构建本发明的复合体。这些RNA可以适当合成。例如，可以通过RNA的化学合成来制造所期望的RNA。或者，利用表达该RNA的表达载体，也可以使RNA表达。对表达载体没有特别限定，例如可以使用在大肠杆菌等细菌、酵母等真核细胞、昆虫细胞、植物细胞或动物细胞等中表达的所期望的表达载体。例如，考虑使用在植物、昆虫、动物等高等真核生物的细胞中表达的载体，使RNA在这些细胞中表达，抑制miRNA的功能。对用于转录RNA的启动子没有特别限定，可以使用Pol I启动子、Pol II启动子、Pol III启动子、噬菌体的启动子等。例如，将噬菌体的转录酶和具有该启动子的载体同时导入后使用时，可以例示T4噬菌体或T7噬菌体的RNA聚合酶或启动子。另外，作为聚合酶II(Pol II)启动子，例如可以例示CMV启动子或β-珠蛋白启动子等。为了表达数百个核苷酸以内的较短的RNA，优选利用期望较Pol II高的表达量的聚合酶III(Pol III)启动子。作为Pol III启动子，可以例示U6启动子、H1启动子、tRNA启动子、7SK启动子、7SL启动子、Y3启动子、5S rRNA启动子、Ad2 VAI和VAII启动子等(Das，G.等人.，1988，EMBO J.7：503-512；Hernandez，N.，1992，第281-313页，In S.L.McKnight和K.R.Yamamoto(ed.)，Transcriptional regulation，第1卷.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.；Kunkel，G.R.，1991，Biochim.Biophys.Acta 1088：1-9；Lobo，S.M.，和N.Hernandez，1989，Cell 58：55-67；Mattaj，I.W.等人.，1988，Cell 55：435-442；Geiduschek，E.P.和G.A.Kassavetis，1992，第247-280页，InTranscriptional regulation.Monograph 22(ed.S.L.McKnight和K.R.Yamamoto)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York.)。特别可以例示在多个snRNA或细胞质RNA基因中发现的Class 3启动子，例如可以列举U6、7SK、hY1和hY3、H1和MRP/ThRNA基因的启动子(Hernandez，N.，1992，第281-313页，InTranscriptional regulation.Monograph 22(S.McKnight和K.R.Yamamoto编)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。例如可以优选使用人U6、人H1、人7SK或小鼠U6启动子等。特别是使用7SK启动子来表达本发明的miRNA抑制RNA时，可以以极高的效率抑制靶miRNA，这在实施例中已显示。使用Pol III启动子时，通过在编码所转录的RNA的DNA的下游添加例如约4～7个核苷酸的poly(T)tract，可以发挥转录的终止子的功能。

如此操作而构建的转录单元还可以直接用于表达，而且还可以整合到其他载体系统中使用。对载体没有特别限定，可以使用表达质粒或所期望的病毒载体等。作为病毒载体，有逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体等，但并不限于这些(Miller，A.D.等人.(1991)J.Virol.65，2220-2224；Miyake，S.等人.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，8802-8806；Samulski，R.J.等人.(1989)J.Virol.63，3822-3828)。例如，包含Pol III启动子的转录单元可以整合到逆转录病毒(包括慢病毒)的LTR中使用。通过将其整合到逆转录病毒载体中，可以以高效率将基因导入靶细胞中，此外，由于导入基因被整合到染色体中，所以可以长期稳定抑制miRNA。对使用的逆转录病毒没有特别限定，例如包括：同向性病毒载体(Kitamura，T.等人.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92，9146-9150)、兼向性病毒载体、通过VSV-G等假型化的病毒载体(Arai，T.等人.(1998)J.Virol.72，1115-1121)、HIV载体、SIV载体、FIV载体等慢病毒载体(Shimada，T.等人.(1991)J.Clin.Inv.88，1043-1047)等。例如可以使用基于MoMLV的逆转录病毒载体或基于HIV的慢病毒载体。整合到LTR中时，例如可以整合在U3区具有缺失(ΔU3)的LTR的ΔU3区中(图15)。在优选方案中，载体在导入细胞中后，经过1周以上、优选2周以上、3周以上、4周以上或1个月以上，可以表达miRNA抑制RNA，抑制miRNA的功能。

如上所述，在将miRNA抑制RNA复合体设计成由单链的直链状RNA分子构成的情况下，仅凭将转录该RNA的一种表达载体导入细胞中，即可在细胞内形成miRNA抑制RNA复合体，可以抑制目标miRNA，因此较佳。如上所述，该情况下miRNA抑制RNA复合体中所含的1个或多个MBS全部只存在于某双链结构(第一双链结构；相当于图2的茎I)的单侧，该单侧的双链设计成通过包含MBS的RNA相连接(即闭合)，该双链结构的相反侧可以成为直链状RNA链的两端。由此，形成该双链结构的部分和相当于直链状单链RNA的两端的部分可以是不依赖于MBS的恒定区，只有该单链RNA的部分可以形成能够根据MBS而变化的可变区。即，具有这样的结构的RNA兼具miRNA抑制的效率性和制造的容易性。包含该MBS的RNA可以包含2个以上的MBS，在MBS之间可以包含形成茎(或茎环)的序列。茎例如可以是2或4条链的茎。

如此设计构成miRNA抑制RNA复合体的单链RNA时，预先构建编码一对互补序列的载体(例如miRNA抑制RNA表达用套件)，所述的一对互补序列构成形成恒定区的双链结构，通过在该一对互补序列之间插入编码与目标miRNA结合的MBS的DNA，可以根据目标miRNA简便地构建表达miRNA抑制RNA复合体的载体(图6)。在一对互补序列的上游可以配置适当的启动子(图6B)。对启动子没有特别限定，优选为Pol III启动子。此外，在一对互补序列的下游可以配置终止子。表达一对互补序列的DNA对表达构成miRNA抑制RNA复合体的单链RNA极为有用。可以在一对互补序列之间设计适当的插入位点，使可以插入编码MBS的DNA。作为插入位点，可以是所期望的限制酶识别序列(可以是多克隆)或att序列等位点特异性重组序列等，或者可以预先切断使能够直接插入。

本发明还涉及制造编码构成本发明的RNA复合体的RNA的核酸(例如DNA)的方法，该方法包括以下步骤：在编码形成至少1个双链结构的1对互补序列的双链DNA之间插入编码至少1个miRNA结合序列的双链DNA。本发明还涉及制造表达构成本发明的RNA复合体的RNA的核酸(例如DNA)的方法，该方法包括以下步骤：在启动子的下游编码形成至少1个双链结构的1对互补序列的双链DNA之间插入编码至少1个miRNA结合序列的双链DNA。

本发明还涉及核酸和/或其互补链，所述核酸是用于制造编码构成本发明的RNA复合体的RNA的核酸的核酸，该核酸编码形成至少1个双链结构的1对互补序列。本发明还涉及用于制造编码构成本发明的RNA复合体的RNA的核酸的组合物，该组合物包含编码形成至少1个双链结构的1对互补序列的核酸和/或其互补链。组合物可以进一步包含适当的药学上可接受的载体。本发明还涉及核酸和/或其互补链，所述核酸是用于制造表达构成本发明的RNA复合体的RNA的载体的核酸，该核酸在启动子的下游编码形成至少1个双链结构的1对互补序列。本发明还涉及用于制造表达构成本发明的RNA复合体的RNA的载体的组合物，该组合物包含在启动子的下游编码形成至少1个双链结构的1对互补序列的核酸和/或其互补链。

本发明还涉及核酸和/或其互补链，所述核酸是用于制造编码构成本发明的RNA复合体的RNA的核酸的核酸(例如DNA)，该核酸编码至少1个miRNA结合序列。本发明还涉及用于制造编码构成本发明的RNA复合体的RNA的核酸(例如DNA)的组合物，该组合物包含编码至少1个miRNA结合序列的核酸和/或其互补链。

本发明还涉及编码形成至少1个双链结构的1对互补序列的核酸和/或其互补链在制造编码构成本发明的RNA复合体的RNA的核酸中的应用。本发明还涉及在启动子的下游编码形成至少1个双链结构的1对互补序列的核酸和/或其互补链在制造表达构成本发明的RNA复合体的RNA的载体中的应用。本发明还涉及编码至少1个miRNA结合序列的核酸和/或其互补链在制造编码构成本发明的RNA复合体的RNA的核酸中的应用。

另外，上述核酸的任意组合可以作为用于制造编码构成本发明的RNA复合体的RNA的核酸的试剂盒的要素。本发明特别涉及试剂盒，该试剂盒包含编码形成至少1个双链结构的1对互补序列的核酸及其互补链。该核酸和互补链可以形成双链DNA。另外，在包含1对互补序列的双链DNA中，启动子和/或终止子可以进行功能性连接。该核酸例如可以是表达质粒。另外，试剂盒中可以进一步包含编码至少1个miRNA结合序列的核酸和/或其互补链。例如，本发明涉及试剂盒，该试剂盒用于制造表达本发明的RNA复合体的载体，该试剂盒包含：(a)核酸，该核酸包含在启动子的下游形成至少1个双链结构的1对互补序列和用于在该一对互补序列之间插入核酸的位点；以及(b)核酸，该核酸编码至少1个miRNA结合序列。

通过在上述编码形成至少1个双链结构的1对互补序列的核酸之间插入编码至少1个miRNA结合序列的核酸，可以简便地得到编码本发明的RNA复合体的核酸。各核酸的结构如关于本发明的RNA复合体所详述的那样。例如形成双链结构的1对互补序列可以适当确定，其链长例如可以是15～50个碱基对，优选为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个核苷酸、或它们的任一个以上，或50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或18个核苷酸、或它们的任一个以下。在更优选的方案中，双链结构的碱基对的长度例如为15～30、优选16～28、优选17～25、优选17～24、例如为17、18、19、20、21、22、23或24。在优选方案中，该核酸为双链核酸，所期望的启动子进行功能性连接。启动子优选为Pol III启动子。在1对互补序列之间可以具有用于插入核酸的位点，例如可以具有限制酶识别序列，使容易插入核酸。即，本发明涉及载体，该载体用于制造表达本发明的RNA复合体的核酸，该载体包含核酸，所述核酸包含在启动子的下游形成至少1个双链结构的1对互补序列和用于在该一对互补序列之间插入核酸的位点。作为限制酶识别序列，可以例示BsmBI序列，但这只是例示而已，可以适当选择。

编码至少1个MBS的核酸可以包含2个以上的MBS，在一连续的序列中可以包含能够形成多重链(例如二或四条链)结构的1对或1对以上的互补序列的组合。例如，作为该核酸，可以例示：包含形成至少1个双链结构的1对互补序列和在该1对互补序列的两端分别包含至少1个MBS的核酸。具体而言，这样的核酸是指在2个MBS之间包含能够形成茎的一对互补序列的核酸。该茎相当于上述第二双链结构。或者，可以包含形成G-quadruplex作为第二多重链结构的序列。

另外，该核酸可以包含2个以上的结构单元，该结构单元包含在2个MBS之间能够形成双链结构的1对互补序列。可以以嵌入状包含多个该结构单元，在位于1对MBS之间的、能够形成双链结构的1对互补序列之间可以进一步包含下述序列：包含1对MBS和在其间能够形成双链结构的1对互补序列的序列(图2的#15或#16等)。所含的多个MBS的序列可以相同也可以不同。

若将这样的核酸插入上述1对互补序列之间，则得到具有下述结构的核酸：在形成第一双链结构的一对互补序列(图6的茎I)之间插入有具有“MBS-形成第二多重链结构的序列-MBS”的结构的序列的结构。具体而言，例如为具有下述结构的核酸：插入有具有“MBS-形成第二双链结构的一对互补序列(图6的茎II)-MBS”的结构的序列的结构。通过转录该核酸，可以得到编码配置成包含MBS的双链夹在2个多重链(例如双链)结构中的RNA复合体的核酸(图6)。包含2个多重链(例如双链)结构和其间的一对相向的单链(分别包含MBS)的核酸短小且显示出足够的miRNA抑制活性。

能够形成双链结构的1对互补序列和MBS可以经由适当的接头或间隔区连接。接头或间隔区的长度如说明书中所述。另外，互补序列可以经由接头或间隔区连接，当形成双链时，该接头或间隔区形成环，组合双链以形成茎环。环的长度也可适当调整，细节如说明书所述。或者，当形成4条链时，可以适当使用形成G-quadruplex的序列。

合成编码MBS的核酸及其互补链，将两者退火(例如图6B的合成寡DNA)。将已退火的2条链核酸的末端插入限制酶切识别位点时，与其组合可以形成与用适当的限制酶切断的末端相同的结构。

本发明的抑制miRNA的复合体、或构成该复合体的RNA(这里，作为RNA，包括天然RNA及其类似物)、或表达该RNA的载体可以制成用于抑制miRNA的组合物。由于本发明的组合物可以特异性且有效率地抑制靶miRNA，所以对由miRNA的抑制介导的基因的功能调节有用。本发明的组合物根据需要可以与药理学上可接受的所期望的载体或介质组合。其中，可以列举通常用于悬浮核酸的所期望的溶液，例如可以例示：蒸馏水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、氯化钠溶液、Ringer’s溶液、培养液等。此外，可以含有植物油、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、杀生物剂等。还可以添加保存剂或其他添加剂。本发明的组合物还可以与作为载体的生物聚合物等有机物、羟基磷灰石等无机物、具体有胶原间质、聚乳酸聚合物或共聚物、聚乙二醇聚合物或共聚物及其化学衍生物等组合。本发明的组合物可以用作所期望的试剂或药物组合物。本发明还提供：本发明的组合物、本发明的抑制miRNA的复合体、或构成该复合体的RNA或表达该RNA的载体在抑制miRNA中的应用。本发明还提供包含它们中的任一种的miRNA抑制剂。

向细胞内的导入，这可以在体外、先体外后体内或体内进行。经由细胞进行给药时，将其导入适当的培养细胞或由接种对象动物采集的细胞等中。作为核酸的导入，有利用磷酸钙共沉淀法、脂质转染法、DEAE葡聚糖法、使用注射针等直接向组织中注入DNA溶液的方法、使用基因枪进行的导入等。由于病毒载体可以以高效率将基因导入靶细胞中，因此优选。给药量根据疾病、患者的体重、年龄、性别、症状、给药目的、给药组合物的形态、给药方法、导入基因等而不同，但可以根据给药对象动物、给药部位、给药次数等适当调整，本领域技术人员可以适当确定。可以适当选择给药途径。给药对象优选为哺乳动物(包括人和非人哺乳类)。具体包括：人；猴等非人灵长类；小鼠、大鼠等啮齿类；兔、山羊、绵羊、猪、牛、狗、猫以及其他哺乳动物。

实施例

以下，通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。需要说明的是，本说明书中引用的文献均作为本说明书的一部分而纳入。

[实施例1]

1.1构建质粒

使下述(1)所示的寡核苷酸退火，并将其克隆到用NotI和SalI切断的pMXs-GIN(Haraguchi，T.等人.(2007)FEBS Lett，581，4949-4954)中，分别制作miR-140-5p和miR-140-3p的GFP报道基因即pMXs-GIN-miR140-5pT和pMXs-GIN-miR140-3pT。将pMXs-GFP(Kitamura，T.(1998)Int J Hematol，67，351-359)的0.7kb BamHI-EcoRI片段插入pcDNA3.1(Invitrogen)的BamHI-EcoRI位点，制作pcDNA3.1-GFP。用Klenow片段分别补平pcDNA3.1-GFP的BamHI位点和EcoRI位点。将该质粒的1.7kb BglII-EcoRV片段插入pQCXIH(Clontech)的BglII-EcoRV位点，制作pSSCG。将pIRES1Hyg(Clontech)的1.3kb HindIII-XbaI片段插入pcDNA3.1的HindIII-XbaI位点，制作pCMV-Hyg。将pCMV-Hyg的2.1kb NruI-ApaI片段插入pSSCG的NruI-EcoRV位点，制作pSSCH。为了构建miR-140-5p/140-3p表达逆转录病毒载体质粒，使用下述(1)所示的引物对，通过PCR由小鼠基因组扩增0.5-kb小鼠miR-140-5p/140-3p片段，将PCR产物克隆到pCR2.1(Invitrogen)中。将该质粒的0.5-kb BamHI-XhoI片段克隆到用BamHI和SalI消化的pSSCH中，制作pSSCH-miR140-5p/140-3p。

使用的寡核苷酸

(1)用于构建GFP报道基因载体的引物对

为了构建pMXs-GIN-miR140-3pT，使用有义链5’-GGCCGCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGGG-3’(SEQ ID NO：1)和反义链5’-TCGACCCTACCACAGGGTAGAACCACGGAGC-3’(SEQ ID NO：2)；为了构建pMXs-GIN-miR140-5pT，使用有义链5’-GGCCGCTCTACCATAGGGTAAAACCACTGGGG-3’(SEQ ID NO：3)和反义链5’-TCGACCCCAGTGGTTTTACCCTATGGTAGAGC-3’(SEQ ID NO：4)；为了构建PCR-miR140-5p/140-3p，使用有义链5’-TGCTTGCTGGTGGTGTAGTC-3’(SEQ ID NO：5)和反义链5’-ACCAACACCCACCCAATAGA-3’(SEQ ID NO：6)。

使下述(2)所示的寡引物对退火，并将其克隆到用BbsI和EcoRI消化的pmU6中，制作pmU6-TuD-shuttle。为了构建miRNA抑制RNA表达慢病毒载体质粒，合成下述(3)所示的一系列寡核苷酸对。将各寡引物对退火，并克隆到用BsmBI消化的pmU6-TuD-shuttle中。之后，如上所述，将各mU6-TuD RNA套件亚克隆到慢病毒载体质粒(pLSP)中(Haraguchi，T.等人.(2007)FEBS Lett，581，4949-4954)。将这些套件还插入pSL1180(Pharmacia)的BamHI-EcoRI位点，制作miRNA抑制RNA表达质粒载体。使下述(2)所示的寡引物对退火，并克隆到用BbsI和EcoRI消化的pmU6中，制作pmU6-protoshuttle。为了构建抑制RNA表达慢病毒载体质粒，合成下述(4)所示的一系列寡核苷酸对。将寡引物对(诱骗RNA #1-12、17-21)分别退火，并克隆到用BbsI和EcoRI消化的pmU6中。将寡引物对(诱骗RNA #13-16)分别退火，并克隆到用BsmBI消化的pmU6-protoshuttle中。将寡引物对(诱骗RNA #22-26)分别退火，并克隆到用BsmBI消化的pmU6-TuD-shuttle中。为了构建mU6-诱骗RNA #27套件，使用下述(4)所示的寡引物对作为PCR的引物和模板，将PCT产物克隆到pCR2.1中。将该质粒的0.2-kbBsmBI片段克隆到用BsmBI消化的pmU6-TuD-shuttle中。之后，如上所述，将各mU6-诱骗RNA套件亚克隆到慢病毒载体质粒(pLSP)中(Haraguchi，T.等人.(2007)FEBS Lett，581，4949-4954)。

使用的寡核苷酸

(2)用于构建本发明的RNA的穿梭载体的引物对

为了构建pmU6-TuD-shuttle，使用有义链5’-TTTGACGGCGCTAGGATCATCGGAGACGGTACCGTCTCGATGATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO：7)和反义链5’-AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATCATCGAGACGGTACCGTCTCCGATGATCCTAGCGCCGT-3’(SEQ ID NO：8)；为了构建pmU6-protoshuttle，使用有义链5’-TTTGACGGCGCTAGGATCATCGGAGACGGTACCGTCTCCGATGATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO：9)和反义链5’-AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATCATCGGAGACGGTACCGTCTCCGATGATCCTAGCGCCGT-3’(SEQ ID NO：10)。

(3)用于构建本发明的RNA的表达载体的引物对

为了构建TuD-miR-140-5p-4ntin，使用有义链5’-CATCAACCTACCATAGGGTCATCAAAACCACTGCAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACCTACCATAGGGTCATCAAAACCACTGCAAG-3’(SEQ ID NO：11)和反义链5’-TCATCTTGCAGTGGTTTTGATGACCCTATGGTAGGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGCAGTGGTTTTGATGACCCTATGGTAGGTT-3’(SEQ ID NO：12)。为了构建TuD-miR-140-3p-4ntin，使用有义链5’-CATCAACTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACAAG-3’(SEQ ID NO：13)和反义链5’-TCATCTTGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGTT-3’(SEQ ID NO：14)。为了构建TuD RNA-miR140-3p-pf，使用有义链5’-CATCAACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTACAA-3’(SEQ ID NO：15)和反义链5’-CATCTTGTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTT-3’(SEQ ID NO：16)。为了构建TuDRNA-miR21-4ntin，使用有义链5’-CATCAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAG-3’(SEQ ID NO：17)和反义链5’-TCATCTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTT-3’(SEQ ID NO：18)。为了构建TuD RNA-miR21-pf，使用有义链5’-CATCAACTCAACATCAGTCTGATAAGCTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCAACATCAGTCTGATAAGCTACAAG-3’(SEQ ID NO：19)和反义链5’-TCATCTTGTAGCTTATCAGACTGATGTTGAGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTAGCTTATCAGACTGATGTTGAGTT-3’(SEQ ID NO：20)。为了构建TuD RNA-NC，使用有义链5’-CATCAACAAGCCACAACGAATCTCTATATCATCAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACAAGCCACAACGAATCTCTATATCATCAAG-3’(SEQ ID NO：21)和反义链5’-TCATCTTGATGATATAGAGATTCGTTGTGGCTTGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGATGATATAGAGATTCGTTGTGGCTTGTT-3’(SEQ ID NO：22)。

(4)用于构建诱骗RNA表达载体的引物对

为了构建诱骗RNA #1，使用有义链5’-TTTGACGGCGCTGGATGCTTGGATCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAAGGAAGCATCCAGCGCCGTCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO：23)和反义链5’-AATTCAAAAAAGACGGCGCTGGATGCTTCCTTACCACAGGGTAGAACCACGGATCCAAGCATCCAGCGCCGT-3’(SEQ ID NO：24)。

为了构建诱骗RNA #2，使用有义链5’-TTTGACGGCGCTAGGATGCTTGGATCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAAGGAAGCATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO：25)和反义链5’-AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATGCTTCCTTACCACAGGGTAGAACCACGGATCCAAGCATCCTAGCGCCGT-3’(SEQ ID NO：26)。

为了构建诱骗RNA #3，使用有义链5’-TTTGACAGCGCTCTACGATGAAGGCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAAGGTTCATCGTAGAGCGCTGTCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO：27)和反义链5’-AATTCAAAAAAGACAGCGCTCTACGATGAACCTTACCACAGGGTAGAACCACGGAGCCTTCATCGTAGAGCGCTGT-3’(SEQ ID NO：28)。

为了构建诱骗RNA #4，使用有义链5’-TTTGACAGCGCTCTACGATGCAAGGCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAAGGTTGCATCGTAGAGCGCTGTCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO：29)和反义链5’-AATTCAAAAAAGACAGCGCTCTACGATGCAACCTTACCACAGGGTAGAACCACGGAGCCTTGCATCGTAGAGCGCTGT-3’(SEQ IDNO：30)。

为了构建诱骗RNA #5，使用有义链5’-TTTGACAGCGCTCGCAGGATGCTTGGCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAAGGAAGCATCCTGCGAGCGCTGTCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO：31)和反义链5’-AATTCAAAAAAGACAGCGCTCGCAGGATGCTTCCTTACCACAGGGTAGAACCACGGAGCCAAGCATCCTGCGAGCGCTGT-3’(SEQID NO：32)。

为了构建诱骗RNA #6，使用有义链5’-TTTGACAGCGCTCAAAGCAGGATGCTTGGCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAAGGAAGCATCCTGCTTTGAGCGCTGTCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO：33)和反义链5’-AATTCAAAAAAGACAGCGCTCAAAGCAGGATGCTTCCTTACCACAGGGTAGAACCACGGAGCCAAGCATCCTGCTTTGAGCGCTGT-3’(SEQ ID NO：34)。

为了构建诱骗RNA #10，使用有义链5’-TTTGACGGCGCTAGGATCATCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGTATTCTGGTCACAGAATACGATGATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO：35)和反义链5’-AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATCATCGTATTCTGTGACCAGAATACTACCACAGGGTAGAACCACGGAGATGATCCTAGCGCCGT-3’(SEQ ID NO：36)。

为了构建诱骗RNA #11，使用有义链5’-TTTGACGGCGCTAGGATCATCGTATTCTGGTCACAGAATACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTATCTTCTCTAACGAGAGAAGAGATGATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO：37)和反义链5’-AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATCATCTCTTCTCTCGTTAGAGAAGATACCACAGGGTAGAACCACGGAGTATTCTGTGACCAGAATACGATGATCCTAGCGCCGT-3’(SEQ ID NO：38)。

为了构建诱骗RNA #12，使用有义链5’-TTTGACGGCGCTAGGATCATCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGTATTCTGGTCACAGAATACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGATGATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO：39)和反义链5’-AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATCATCTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTATTCTGTGACCAGAATACTACCACAGGGTAGAACCACGGAGATGATCCTAGCGCCGT-3’(SEQ ID NO：40)。

为了构建诱骗RNA #13，使用有义链5’-CATCAACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTACAA-3’(SEQ ID NO：41)和反义链5’-CATCTTGTACCACAGGGTAGAACCACGGAG TTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTT-3’(SEQ ID NO：42)。

为了构建诱骗RNA #14，使用有义链5’-CATCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGTATTCTGAGATCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAAGACAGAATACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTA-3’(SEQ ID NO：43)和反义链5’-CATCTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTATTCTGTCTTACCACAGGGTAGAACCACGGATCTCAGAATACTACCACAGGGTAGAACCACGGA-3’(SEQ IDNO：44)。

为了构建诱骗RNA #15，使用有义链5’-CATCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGTATTCTGTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGTATTCTGGTCACAGAATACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTACAGAATACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTA-3’(SEQ ID NO：45)和反义链5’-CATCTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTATTCTGTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTATTCTGTGACCAGAATACTACCACAGGGTAGAACCACGGACAGAATACTACCACAGGGTAGAACCACGGA-3’(SEQ ID NO：46)。

为了构建诱骗RNA #16，使用有义链5’-CATCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGTATTCTGTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGTATTCTGAGATCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAAGACAGAATACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTACAGAATACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTA-3’(SEQ ID NO：47)和反义链5’-CATCTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTATTCTGTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTATTCTGTCTTACCACAGGGTAGAACCACGGATCTCAGAATACTACCACAGGGTAGAACCACGGACAGAATACTACCACAGGGTAGAACCACGGA-3’(SEQ ID NO：48)。

为了构建诱骗RNA #17，使用有义链5’-TTTGACGGCGCTAGGATGCTTGGATCCGTGGTTCTAACCCTGTGGTAAGGAAGCATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO：49)和反义链5’-AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATGCTTCCTTAC CACAGGGTTAGAACCACGGATCCAAGCATCCTAGCGCCGT-3’(SEQ IDNO：50)。

为了构建诱骗RNA #18，使用有义链5’-TTTGACGGCGCTAGGATGCTTGGATCCGTGGTTCTAATCCCTGTGGTAAGGAAGCATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO：51)和反义链5’-AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATGCTTCCTT ACCACAGGGATTAGAACCACGGATCCAAGCATCCTAGCGCCGT-3’(SEQ ID NO：52)。

为了构建诱骗RNA #19，使用有义链5’-TTTGACGGCGCTAGGATGCTTGGATCCGTGGTTCTAACTCCCTGTGGTAAGGAAGCATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO：53)和反义链5’-AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATGCTTCCTTACCACAGGGAGTTAGAACCACGGATCCAAGCATCCTAGCGCCGT-3’(SEQ IDNO：54)。

为了构建诱骗RNA #20，使用有义链5’-TTTGACGGCGCTAGGATGCTTGGATCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTAAGGAAGCATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO：55)和反义链5’-AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATGCTTCCTTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGATCCAAGCATCCTAGCGCCGT-3’(SEQ IDNO：56)。

为了构建诱骗RNA #21，使用有义链5’-TTTGACGGCGCTAGGATGCTTCCATCCCAGTACACATTTAAATCTGTGGTACCAAGCATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO：57)和反义链5’-AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATGCTTGGTACCACAGATTTAAATGTGTACTGGGATGGAAGCATCCTAGCGCCGT-3’(SEQ IDNO：58)。

为了构建诱骗RNA #22，使用有义链5’-CATCCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACGTATTCTGGTCACAGAATACCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACG-3’(SEQ ID NO：59)和反义链5’-TCATCGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGGTATTCTGTGACCAGAATACGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAG-3’(SEQ ID NO：60)。

为了构建诱骗RNA #23，使用有义链5’-CATCCCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACCGTATTCTGGTCACAGAATACCCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACCG-3’(SEQ ID NO：61)和反义链5’-TCATCGGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGGGTATTCTGTGACCAGAATACGGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGG-3’(SEQ ID NO：62)。

为了构建诱骗RNA #24，使用有义链5’-CATCAACTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACAAG-3’(SEQ ID NO：63)和反义链5’-TCATCTTGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGTT-3’(SEQ ID NO：64)。

为了构建诱骗RNA #25，使用有义链5’-CATCACCCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACCCAGTATTCTGGTCACAGAATACACCCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACCCAG-3’(SEQ ID NO：65)和反义链5’-TCATCTGGGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGGGTGTATTCTGTGACCAGAATACTGGGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGGGT-3’(SEQ ID NO：66)。

为了构建诱骗RNA #26，使用有义链5’-CATCAACCCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACCCAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACCCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACCCAAG-3’(SEQID NO：67)和反义链5’-TCATCTTGGGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGGGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGGGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGGGTT-3’(SEQ ID NO：68)。

为了构建诱骗RNA #27，使用有义链5’-CGTCTCACATCAACTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACAAGCGACAAGAACTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACAAGTATTCTGAACTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGT-3’(SEQ ID NO：69)和反义链5’-CGTCTCATCATCTTGTACCACAGGGAGATTAGAAC CACGGAGTTGCGACAAGTTGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGTTGTATTCTGTTGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGG-3’(SEQID NO：70)。

为了构建microRNA CMV海绵miR21表达载体质粒，使用下述(5)所示的寡引物对作为PCR的引物和模板，将PCR产物克隆到pCR2.1中。将该质粒的0.2-kb XhoI-AgeI片段克隆到用XhoI和AgeI消化的pLenti6/V5-GW/lacZ(Invitrogen)中，制作pLenti6/CMV-海绵-miR21/lacZ。将pCS2-Venus的0.3-kb XbaI-ApaI片段克隆到pSL1180的XbaI-ApaI位点中，制作pSL1180-polyA。将pLenti6/CMV-海绵-miR21/lacZ的3.9-kb HindIII-AgeI片段克隆到pSL1180-polyA的HindIII-AgeI位点中，制作pSL1180-CMV海绵21。为了构建Antagomir21表达载体质粒(Scherr，M.等人.(2007)Nucleic Acids Res，35(22)：e149)，使用下述(5)所示的寡引物对作为PCR的引物，使用pSilencer 3.1-H1 hygro(Ambion)作为模板。将PCR产物克隆到pCR2.1中，将该质粒的0.2-kb BglII-EcoRI片段克隆到pSL1180的BamHI-EcoRI片段中，制作pSL1180-H1Antagomir21。为了构建miR-21Eraser表达载体质粒(Sayed，D.等人.(2008)Mol Biol Cell，19(8)：3272-82)，使用下述(5)所示的寡引物对作为PCR的引物，使用pmU6作为模板。用BamHI和EcoRI消化PCR产物，之后克隆到pSL1180的BamHI-EcoRI片段中，制作pSL1180-miR-21 Eraser。

为了构建萤光素酶报道基因质粒，将pGL4.74(Promega)的0.8-kbKpnI-HindIII片段克隆到用KpnI和HindIII消化的pGL4.12(Promega)中，制作pTK4.12。将下述(6)所示的寡核苷酸对退火，之后将其与pTK4.12的4.9-kb EcoRI-XbaI片段连接，制作pTK4.12C.P-。使下述(6)所示的寡核苷酸对退火，之后克隆到用XbaI和FseI消化的pGL4.74中，制作pGL4.74-miR21T。

使用的寡核苷酸

(5)用于构建AntagomiR、miRNA Eraser和CMV海绵表达载体的引物对

为了构建CMV海绵21，使用有义链5’-CTCGAGTAACTCAACATCAGGACATAAGCTAAGTCTCAACATCAGGACATAAGCTATCAGTCAACATCAGGACATAAGCTACTGATCAACATCAGGACATAAGCTA-3’(SEQ ID NO：71)和反义链5’-ACCGGTTAGCTTATGTCCTGATGTTGACCGATAGCTTATGTCCTGATGTTGACAGTTAGCTTATGTCCTGATGTTGAGTTCTAGCTTATGTCCTGATGTTGATCAG-3’(SEQ ID NO：72)。为了构建AntagomiR21，使用正向引物5’-AGATCTAATTCATATTTGCATGTCGCT-3’(SEQID NO：73)和反向引物5’-GAATTCAAAAAATAGCTTATGTCCTGATGTTGAGGATC CGAGTGGTCTCATACAGAACTTATA-3’(SEQ ID NO：74)。为了构建miR-21 Eraser，使用正向引物5’-CGGGATCCATCCGACGCCGCC ATCTCTA-3’(SEQ ID NO：133)和反向引物5’-GGAATTCAAAAAA TAGCTTATCAGACTGATGTTGATAGCTTATCAGACTGATGTTGAAAACAAGGCTTTTCTCCAA-3’(SEQ ID NO：134)。

(6)用于构建萤光素酶报道基因载体的引物对

为了构建pTK4.12C.P-的插入片段，使用有义链5’-AATTAATAATGACTCGAGT-3’(SEQ ID NO：75)和反义链5’-CTAGACTCGAGTCATTATT-3’(SEQ ID NO：76)。为了构建pGL4.74-miR21T，使用有义链5’-AATTCTCAACATCAGTCTGATAAGCTAC-3’(SEQ ID NO：77)和反义链5’-TCGAGTAGGCTTATCAGACTGATGTTGAG-3’(SEQ ID NO：78)。

1.2细胞培养和稳定细胞株的建立

将HeLaS3细胞(Puck等人.，J.Exp.Med.103：273-284(1956))、PA-1细胞(Giovanella，BC等人.，In Vitro Cell Dev.Biol.，10：382，1974，10：382；Giovanella，BC.等人.，J Natl Cancer Inst，1974，52：921-30)、HCT-116细胞(Cancer Res 1981；41：1751；J Nat Cancer Inst 1982；69：767)、SW480细胞(Leibovitz等人.，Cancer Res.36：4562-4569(1976))、HT29细胞(Fogh & Trempe in Human Tumor Cells in Vitro(ed.Fogh J.)，Plenum Press，New York，1975，第115-159页)、TIG-3/E/TERT细胞(Akagi T等人.，Proc Natl Acad Sci U S A，100，13567-13572.(2003))和3Y1细胞(Ushijima T等人.，Jpn.J.Cancer Res.85：455-458，1994；Kimura G等人.，Int.J.Cancer，15：694-706，1975)在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中、于37℃下培养。将HeLaS3细胞以1×10⁵细胞/孔接种在6孔板中，24小时后，在8μg/ml的凝聚胺(polybrene)的存在下分别导入pMXs-GIN、pMXs-GIN-miR140-5pT和pMXs-GIN-miR140-3pT病毒保存株(viral stocks)(＜1×10⁴TU)，从转导的24小时后起通过G418(1mg/ml)来选择。在两周的选择后，从培养基中除去G418。将保有miR-140-5p报道基因或miR-140-3p报道基因的HeLaS3细胞以1×10⁵细胞/孔接种在6孔板中，24小时后，在8μg/ml的凝聚胺的存在下导入pSSCH-miR140-5p/140-3p病毒保存株(＜1×10⁴TU)，从转导的24小时后起通过潮霉素(0.5mg/ml)来选择。在两周的选择后从培养基中除去潮霉素。

1.3病毒导入和FACS分析

将保有miR-140-5p报道基因和miR140-5p/140-3p载体两者的HeLaS3细胞、以及保有miR-140-3p报道基因和miR140-5p/140-3p载体两者的HeLaS3细胞在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中以1×10⁵细胞/孔接种在6孔板上，24小时后，在8μg/ml的凝聚胺的存在下导入各miRNA抑制RNA表达病毒保存株(2×10⁵TU)或各诱骗RNA表达病毒保存株(2×10⁵TU)。并且在24小时后将培养基换成含有10％胎牛血清(FBS)和嘌呤霉素(1μg/ml)的DMEM。在7天的选择后，从培养基中除去嘌呤霉素。使用FACS Calibur(BD)测定GFP表达水平。

1. 4RNA分离、miR-qRT-PCR

使用mirVana^TM miRNA分离试剂盒(Ambion)，由保有miR-140-5p报道基因和miR140-5p/140-3p载体两者、且导入有miRNA抑制RNA表达慢病毒载体的HeLaS3细胞和导入有miRNA抑制RNA表达载体的HCT-116细胞制备总RNA。通过使用miRNA特异性环式RT引物和TaqMan探针的miR-qRT-PCR，按照制造商的推荐确定成熟miRNA的表达(Applied Biosystems，Foster City，USA)。使用U6 snRNA作为内部对照。使用7300实时PCR系统(Applied Biosystems)，按照一式三份进行PCR。

1.5萤光素酶分析

在导入的前1天，将PA-1细胞、HCT-116细胞、SW480细胞、HT29细胞、TIG-3/E/TERT细胞和3Y1细胞在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中分别以1.5×10⁵细胞/孔、1.7×10⁵细胞/孔、3.5×10⁵细胞/孔、3.0×10⁵细胞/孔、7.0×10⁴细胞/孔和1.2×10⁵细胞/孔接种在24孔板上，按照一式三份转染脂质转染胺2000(Invitrogen)和10ng的pTK4.12C.P-(萤火虫萤光素酶质粒)、100ng的Rluc靶报道基因质粒、以及500ng的miRNA抑制RNA表达质粒。以50nM共转染锁定核酸(LNA/DNA)反义寡核苷酸。LNA/DNA反义寡核苷酸由ThermoELECTRON公司合成，在8个连续地位于中央的核苷酸中包含锁定核酸(Naguibneva，I.等人.(2006)Biomed Pharmacother，60，633-638)。LNA/DNA反义寡核苷酸具有下述(7)所示的序列。所有测定均在转染的48小时后通过双荧光素酶测定(Promega)并使用GLOMAX^TM(Promega)来实施。

使用的寡核苷酸

(7)LNA/DNA反义寡序列

为了构建LNA-miR21，使用5’-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’(SEQ ID NO：79)。为了构建LNA-NC，使用5’-CATTAATGTCGGACAACTCAAT-3’(SEQ ID NO：80)。LNA以下划线显示。

1.6蛋白质印迹

使用1.5×SDS缓冲液从细胞中提取总蛋白，再使用Bio-Rad蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。蛋白提取物用10％SDS-PAGE分离后转移到PVDF-膜(Milipore)上。通过将膜和抗PDCD4(ab51495，Abcam)抗体以及抗肌动蛋白(612656，BD转导)抗体在室温下培育1小时，来实施免疫印迹。用含有Tween 20的磷酸缓冲盐清洗3次，之后将膜与结合有辣根过氧化物酶的二次抗体在室温下培育1小时。使用ECL试剂(Amersham)检测信号。

1.7细胞增殖测定和凋亡活性的测定

在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中，将PA-1细胞以1×10⁴细胞/孔接种在48孔板上，24小时后，在8μg/ml的凝聚胺的存在下分别导入TuD-miR21-4ntin和TuD-NC表达慢病毒保存株(1×10⁵TU)，在转导的24小时后交换培养基。通过在临转导前和自转导起24、48、72、96小时后利用CellTiter-Glo^TM(Promega)并使用GLOMAX^TM测定细胞的代谢活性，来实施细胞增殖的测定。

在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中，将PA-1细胞以3×10³细胞/孔接种在48孔板上，18小时后，在8μg/ml的凝聚胺的存在下分别导入TuD-miR21-4ntin和TuD-NC表达慢病毒保存株(3x10⁴TU)，在转导的24小时后交换培养基。并且，在转导的72小时后，利用Caspase-Glo^TM 3/7(Promega)并使用GLOMAX^TM实施胱天蛋白酶3和7的活性的测定。

1.8 RNA印迹

自载体导入起14天后，从非感染HeLaS3细胞或表达TuD-miR-140-3p-4ntin、TuD-miR-140-5p-4ntin的HeLaS3细胞中分离、回收核组分、细胞质组分。细胞使用14枚10cm的培养皿。用冷PBS清洗培养皿2次，再向培养皿中加入2ml的冷PBS，用刮棒回收细胞，以1500rpm的转速在4℃下离心5分钟。将细胞沉淀悬浮于NP40裂解缓冲液(10mM Tris-HCl(pH7.4)、10mM NaCl、3mM MgCl₂、0.5％Nonidet P-40)中，在冰上静置10分钟后，以1500rpm的转速在4℃下离心5分钟。回收作为细胞质组分的上清，通过ISOGEN(Wako PureChemical Industries，Osaka，Japan)回收细胞质RNA。另外，用4ml的NP40裂解缓冲液清洗作为核组分的沉淀两次。使用mirVana^TM miRNA分离试剂盒(Ambion，Austin，TX)，从细胞质RNA和作为核组分的沉淀中只纯化小于200bp的RNA。为了将原始的细胞的数目一致进行比较，将5％相当量的回收的RNA用于RNA印迹分析。

使用18％变性丙烯酰胺凝胶分离小RNA。此时，在80℃的培养箱内进行电泳。之后，转移到Hybond-XL膜(Amersham BioSciences)上，通过60mJ/cm² UV进行交联。使用T4多核苷酸激酶(TAKARA)，用[γ-³²P]ATP标记DNA探针的5’端。使用Ultrahyb-Oligo缓冲液(Ambion)，在37℃下进行杂交。膜用2×SSC，0.5％SDS缓冲液清洗。使用FLA-5100(FUJIFILM)测定RI信号。另外，使用0.5％SDS水溶液进行脱探针。

使用的寡核苷酸

(8)用于RNA印迹的DNA探针的序列

作为miRNA抑制RNA检测探针，使用5’-GTTGATGATCCTAGCGCCGTC-3’(SEQ ID NO：135)。作为miR-21检测探针，使用5’-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’(SEQ ID NO：136)。作为Y4scRNA检测探针，使用5’-GCAGTGGGGGGTTGTATACCAAC-3’(SEQ ID NO：137)。作为ACA1 snoRNA检测探针，使用5’-GTGATGGAAGCATAACCTGTCTC-3’(SEQ ID NO：138)。

[实施例2]用于检测miR-140-3p活性的高灵敏度测定系统

使用仅内源性地微量表达miR-140-3p和miR-140-5p的HeLaS3(Landgraf，P.等人.(2007)Cell，129，1401-1414)，构建miR-140-3p活性的极高灵敏度的测定系统。为此，构建在紧挨着GFP基因的下游插入有与成熟miR-140-3p完全互补的21bp的基于逆转录病毒的GFP报道基因(miR-140-3p报道基因)(图15A)。将它们导入HeLaS3细胞中，建立稳定表达GFP的混合细胞群体。

接下来，构建通过Pol II启动子驱动RNA的逆转录病毒载体(miR140-5p/140-3p载体)，所述RNA包含内含miR140-5p和miR140-3p两者的pre-miRNA全体(图15C)。将其导入携带miR-140-3p报道基因的HeLaS3细胞中，建立混合细胞群体。与携带miR-140-3p报道基因的非导入的HeLaS3细胞相比，GFP的表达水平不足20％(图16A、B和C)。

[实施例3]原型诱骗RNA的设计和有效性

作为诱骗RNA的原型，设计被期待露出与成熟miR-140-3p的RNA序列完全互补的RNA序列的、具有单纯的二次结构的诱骗RNA。这些原型诱骗RNA(图1A)形成茎环结构，其环由与成熟miR-140-3p完全互补的MBS和位于其两端的3个核苷酸的接头构成。为了使这些诱骗RNA在细胞内稳定表达，选择使用担载短RNA表达用套件的慢病毒载体，该短RNA表达用套件由存在于整合后的两LTR中的聚合酶III启动子(mU6)驱动(图15D)。由于通过RNA聚合酶III得到的RNA转录产物被设计成以UU(或UUUU)结束，所以RNA诱骗被期待在茎中具有2(～4)个核苷酸的3’-突出末端(图1A)。

认为合成的诱骗RNA从细胞核输送到细胞质中，因此对对应的包含作为miRNA的miR-140-3p的RISC发挥作用。关于具有茎-环结构的小RNA的核输送，迄今为止人们详细进行了研究，结果显示：茎长对通过Exp-5进行的核外移送的效率很重要(Zeng，Y.和Cullen，B.R.(2004)Nucleic Acids Res，32，4776-4785)。研究显示：若茎序列的长度短于16bp，则发夹RNA与Exp-5的结合活性急剧下降，所以使原型RNA诱骗的茎长在17bp～24bp内变化(诱骗#1～#6，图1B)。使用以噬菌体基因Cre重组酶的编码区作为靶的shRNA(shCre)作为诱骗RNA载体的阴性对照(NC)。具有18bp的茎的原型RNA诱骗显示出较其他RNA诱骗略高的抑制效果，而且超过20bp的dsRNA在细胞质中能够成为被切酶切断的潜在性靶，所以在之后的所有试验中使用18bp的茎长。

[实施例4]原型诱骗RNA的二次结构和由MBS的改变产生的抑制力的最优化

为了提高抑制效力，将诱骗RNA设计成具有较原型更复杂的二次结构(图2A)，将其表达套件插入慢病毒载体中，再导入与图1B中使用的细胞相同的测定细胞中。这里，试验的这些RNA(诱骗#10～#16、图2A)的效率较原型诱骗RNA(诱骗RNA #2)高(图2AB)。重要的是，在诱骗RNA #12的MBS的两端插入3个核苷酸的接头序列时(诱骗RNA #13)，GFP的表达显示出几乎完全的回复，由诱骗#13的导入产生的GFP水平与只携带miR-140-3p报道基因的HeLa S3的GFP水平达到同一水平(99.5％)(图2B)。该回复显示出由miR-140-5p/miR-140-3p载体供给的miR-140-3p活性被完全抵消。

接下来，为了达成更有效率的诱骗活性，筛选用于MBS的几个序列。有报道称：哺乳动物中，在自完全互补的MBS的3’末端起第8位的核苷酸与第9位的核苷酸之间包含4个多余的核苷酸的MBS中，通过RNA切断也会引起翻译的弱化(attenuation)(Kiriakidou，M.等人.(2004)Genes Dev，18，1165-1178；Vermeulen，A.等人.(2007)RNA，13：723-730)。因此，包含4个多余的核苷酸的MBS会避免诱骗RNA分子自身的切断，因此与完全互补的MBS(MBS-pf)相比，其有可能更有效率地抑制miRNA的功能。为了筛选对抑制有效率的MBS，通过在RISC中的Ago2蛋白切断靶mRNA的位点即自完全互补的MBS的3’末端起第10位核苷酸与第11位核苷酸之间插入1～4个核苷酸的多余的序列，改变原型诱骗(图1A)。通过研究这些诱骗的效果，发现具有4个核苷酸的插入的MBS(MBS-4ntin)在所研究的诱骗中显示出最大的GFP表达的回复(52％)(图3)。

通过在原型诱骗的MBS与茎之间插入接头，也可以明显改善抑制效果(图2B、比较诱骗RNA#12和#13)，所以使用MBS被取代成MBS-4ntin的诱骗#12型RNA，小心翼翼地改变接头长度至1～5个核苷酸。1～3个核苷酸的插入会带来高的抑制效果，4个核苷酸或5个核苷酸的插入虽然带来的抑制效果较其低，但也显示出中等程度的活性(图4)。于是，在以后的分析中，MBS与茎RNA之间的接头长度为3个核苷酸。

通过综合上述结果，尝试着提高图2所示的诱骗#16的抑制效果。在茎序列与MBS之间插入3个核苷酸的接头，再将MBS-pf取代成MBS-4ntin，从而生成诱骗#27。诱骗#27大有改善(由55.2％变为80.1％、图2和5)。另一方面，根据相同原理对诱骗#13进行结构改变，制作诱骗#24，但其抑制能力并没有提高。这可能是由于：诱骗#24的诱骗活性已经基本饱和，完全抵消了外来导入的miR-140-3p活性的缘故。

暂定的结论为：由于具有诱骗#13和#24的结构的诱骗RNA(图6A)非常有效率地抑制miRNA的功能，所以非常有用。该诱骗RNA包含2个MBS，这2个MBS与2个茎结构相邻。例如，2个MBS分别夹在该2个茎结构中，各MBS的核酸链的方向相反。2个茎结构可以是2条链，也可以是4条链。如图6B所示，用于该RNA的表达套件可以容易地构建。由此判明：具有包含2个MBS、且这2个MBS被夹在2个茎结构中的结构的诱骗RNA(Tough Decoy；称作TuD)带来特别强的miRNA抑制效果。

[实施例5]本发明的RNA复合体的抑制效果的通用性、特异性和持续期间

为了研究本发明的RNA复合体的抑制效果的通用性和特异性，构建只将miR-140-3p报道基因的插入序列取代成与miR-140-5p完全互补的序列的、用于miR-140-5p的报道基因细胞系统(图15(B))。使用这两个报道基因细胞系统，确定MBS中包含4个核苷酸的多余的核苷酸的TuD-miR-140-3p(TuD-miR-140-3p-4ntin)(诱骗#24)或TuD-miR-140-5p-4ntin(图18)中任一者的抑制效果。在miR-140-3p报道基因系统中，TuD-miR-140-3p-4ntin的导入显示出GFP表达的完全恢复，但在TuD miR-140-5p-4ntin的表达中没有显示出效果(图7A)。在miR-140-5p报道基因系统中，TuD miR-140-5p-4ntin载体的导入显示出GFP表达的完全恢复，但通过TuD-miR-140-3p-4ntin载体的导入，对该报道基因没有显示出效果(图7B)。这些结果提示：这些RNA的抑制效果对于其靶miRNA是高度有效率且特异性的，本发明的RNA复合体对各种miRNA具有高的特异性，可以使用。

基于慢病毒的载体的重要优点之一在于能够长期维持诱骗RNA的表达。于是，将TuD-miR-140-3p-4ntin载体导入携带miR-140-3p报道基因和miR140-5p/140-3p载体两者的HeLaS3细胞中，用超过一个月的时间监测GFP表达水平的经时性变化(图7C)。由这些结果可知：在HeLaS3细胞中TuD-miR-140-3p-4ntin有效率地抑制作为靶的miR-140-3p超过一个月，而在TuD-miR-140-5p-4ntin中则维持一切均未被抑制的状态。

接下来，利用定量的实时RT-PCR直接研究miR-140-5p水平。只要通过该方法进行检测，TuD-miR-140-5p-4ntin就使miR-140-5p的表观上的表达水平减少约65％，但在TuD-miR-140-3p-4ntin中没有减少(图7D)。由该结果可知：游离的miR-140-5p的量减少至约1/3，但在RNA诱骗与成熟miRNA之间形成的dsRNA，例如即使是制备RNA后，利用实时PCR检测成熟miRNA时仍然有可能过于稳定。

研究在表达TuD-miR-140-3p-4ntin或TuD-miR-140-5p-4ntin的HeLaS3细胞中表达的RNA的胞内定位。自TuD-miR-140-3p-4ntin载体或TuD-miR-140-5p-4ntin载体的导入起14天后，分别制备细胞的核组分RNA和细胞质组分RNA，在高温下进行PAGE，以使分子内、分子间结合达到最小，通过RNA印迹进行分析。利用抗所表达的miRNA抑制RNA的探针，在120nt的谱带和90nt附近观察到宽的谱带(图7E)。在室温下进行PAGE，通过RNA印迹分析相同的RNA样品时，该宽的谱带变得更强，所以这是分子内结合的全长RNA。TuD-miR-140-3p-4ntin和TuD-miR-140-5p-4ntin主要存在于细胞质中，核内只存在微量的TuD-miR-140-5p-4ntin。由此确认：所转录的RNA被有效率地输送到核外。结果还显示：虽然MBS序列对RNA的核外输送效率有一定程度的影响，但其影响是轻微的。

[实施例6]本发明的RNA复合体对内源性miRNA的抑制效果

为了确认本发明的RNA复合体的抑制功能具有通用性，接下来，使用可以与现有的合成miRNA抑制剂进行比较的、不同的靶miRNA(内源性miR-21)和不同的测定系统进行若干实验。利用与TuD-miR-140-3p-4ntin和TuD-miR-140-3p-pf相同的原理，构建2个TuD-miR21、分别为TuD-miR-21-4ntin和TuD-miR21-pf(图18)。接下来，为了调查PA-1细胞中的内源性miR-21活性的抑制，将表达TuD-miR-21-4ntin或TuD-miR-21-pf(图18)的基于DNA的载体和3’-UTR中具有或不具有与成熟miR-21完全互补的21bp DNA序列的插入的Renilla luciferase报道基因以及作为转染的对照的对照萤火虫萤光素酶报道基因(图17(A-C))一同一过性地转染到PA-1细胞中。与转染了表达阴性对照的基于DNA的载体(TuD-NC)的细胞的表达相比，表达TuD-miR21-4ntin的细胞集团使miR21报道基因的表达、即根据萤火虫萤光素酶活性校正的Renilla luciferase活性上升约25倍(图8A)。TuD-miR-21-pf虽然显示出更低的抑制效果，但仍带来相当于约14倍的活性的依然显著的恢复。重要的是，恢复的报道基因活性的水平与不具有miR-21靶序列的对照报道基因的活性水平相近。如期待的那样，该对照报道基因的活性与导入的诱骗RNA独立，几乎恒定。

接下来，如实施例1之段1.5所述，将一过性转染的生成本发明的RNA复合体的表达载体的抑制效果与LNA/DNA反义寡核苷酸的抑制效果进行比较(图8A)。与转染了用作阴性对照的LNA/DNA-NC的PA-1细胞的转染相比，通过锁定核酸(LNA/DNA)反义寡核苷酸(LNA-miR21)进行的PA-1细胞的转染使miR21靶报道基因的表达上升2倍。这些结果显示：与这些现有的合成试剂相比，在上述转染条件下，本发明的RNA复合体具有高得多的抑制miRNA的能力。

将用于测定的细胞株由上述使用的PA-1换成HCT-116，如实施例1之段1.5所述，进行表达本发明的RNA复合体的质粒载体与CMV海绵表达质粒载体、H1-Antagomir表达质粒载体、miRNAEraser表达质粒载体、以及LNA/DNA反义寡核苷酸的miRNA抑制效果的比较(图9)。其结果，与其他方法相比，本发明的RNA复合体显示出极高的效果。

接下来，将用于测定的细胞株由PA-1换成HCT-116，以进行类似的实验。有报道称：HCT-116的内源性miR-21较PA-1的内源性miR-21高。除TuD-miR-21-pf的抑制效果急剧降低以外，整体结果非常类似(图8B)。这些结果也许表明：通过大量内源性miR-21极有效率地切断TuD-miR-21-pf分子，与TuD-miR-21-4ntin的浓度相比，该诱骗的物理浓度显著降低。

在转染了miRNA抑制RNA(TuD-miR-21-4ntin和TuD-miR-21-pf)的表达载体的PA-1细胞、HCT-116细胞中，通过RNA印迹分别分析TuD-miR-21-4ntin和TuD-miR-21-pf的表达水平。在PA-1细胞中，TuD-miR-21-4ntin、TuD-miR-21-pf均强烈表达(图10A)。在HCT-116细胞中，虽然TuD-miR-21-4ntin强烈表达，但与其相比，TuD-miR-21-pf只见到弱的表达(图10B)。该现象与上述假说完全一致：即在miR-21浓度高的条件下，TuD-miR-21-4ntin对miRNA的分解稳定；而TuD-miR-21-pf容易接受分解。

利用定量的实时RT-PCR研究miR-21水平。其结果，TuD-miR-21-4ntin和TuD-miR-21-pf使miR-21的表观上的表达水平大幅减少(图8D)。但是，在通过RNA印迹研究miR-21水平的结果中，pre-miR-21、成熟-miR-21均未见减少(图8E)。作为该结果的说明，认为虽然miR-21的实际的量没有减少，但由于miR-21与TuD-miR-21强力结合，所以抑制了利用RT-PCR进行的检测。这种现象也被其他研究小组指出。

研究在HCT-116细胞中miR-21抑制效果中的TuD-miR-21-4ntin表达质粒的量依赖性。虽然图8A、B和9的实验在24孔板中以500ng/孔进行，但在研究量依赖性时，在300ng/孔时效果饱和，即使10ng/孔也观察到其1/3左右的miRNA抑制效果(图19)。

本发明的RNA在大肠癌细胞(SW480，HT29)、无限增殖的人肺胚性成纤维细胞(TIG-3/E/TERT)和大鼠成纤维细胞(3Y1)中也显示出高的miRNA抑制效果(图20)。

为了直接监测miR21对作为内源性靶的PDCD4蛋白的效果，将一系列的miRNA抑制RNA表达载体分别转染到PA-1细胞中，回收总蛋白，通过蛋白质印迹研究PDCD4的表达水平(图8C)。PDCD4的表达因TuD-miR21-4ntin或TuD-miR21-pf而上升，TuD-NC未显示出效果。该结果显示：本发明的RNA复合体可以特异性地抑制内源性miRNA的功能。

在PA-1细胞株中，通过上述miRNA抑制RNA抑制miRNA的功能，研究是否诱导生物活性。将表达TuD-miR21-4ntin和TuD-NC的慢病毒载体以MOI 10导入PA-1细胞中，测定细胞增殖活性(图11A)。导入有TuD-NC的细胞4天增殖至5倍以上，而导入有TuD-miR21-4ntin的细胞只增殖至1.6倍左右。并且，进行同样的培养，测定胱天蛋白酶3和7的活性，对凋亡进行评价(图11B)。与导入有TuD-NC的细胞相比，导入有TuD-miR21-4ntin的细胞上升至3倍左右。这提示：在导入有TuD-miR21-4ntin的细胞中凋亡诱导也许是细胞增殖程度低的一个原因。以上结果显示：本发明的RNA充分抑制miRNA的功能，由此抑制miR-21的增殖刺激活性、凋亡抑制活性(Corsten，M.F.，(2007)Cancer Res.67，8994-9000)。

认为在miRNA中存在seed序列相同、并具有共通的靶基因的miRNA家族。于是，为了研究本发明的miRNA抑制RNA对靶miRNA的家族是否也具有抑制效果，以miRNA-15a、15b、16、195、424、497家族为靶进行实验。构建将miR-21萤光素酶报道基因的插入序列取代成与miR-16完全互补的序列的miR-16的萤光素酶报道基因载体(图17D)。使用通过miRNA微阵列观察到miRNA-15a、15b、16表达、而miRNA-195、424、497未表达的HCT-116细胞(图21)。如图12A所示，miRNA-16、195的同源性高，而miRNA-16、497的同源性除seed位点以外低。于是，构建TuD-miR-16-4ntin、TuD-miR-195-4ntin和TuD-miR497-4ntin(图18、12B)。在该条件下miRNA-195、497未表达，所以可以观测TuD-miR-195-4ntin和TuD-miR497-4ntin对miRNA-15a、15b、16的抑制效果。进行萤光素酶分析时，与转染了TuD-NC的细胞集团的表达相比，表达TuD-miR16-4ntin、TuD-miR-195-4ntin和TuD-miR497-4ntin的细胞集团使miR16报道基因的表达、即根据萤火虫萤光素酶活性校正的Renilla luciferase活性分别上升3.1倍、5.2倍、2.6倍(图12C)。特别是通过TuD-miR-16-4ntin和TuD-miR-195-4ntin恢复的报道基因活性的水平与不具有miR-16靶序列的对照报道基因的活性为同一水平。另外，对照报道基因的活性并不依赖于导入的miRNA抑制RNA，几乎恒定。通过该实验确认：本发明的RNA的抑制效果不仅针对靶miRNA，还针对其家族。此外，结果显示：对同源性高的家族的抑制效果较对同源性低的家族的抑制效果高，即使同源性低，也具有抑制效果。

[实施例7]由合成寡核苷酸介导的miRNA抑制

使用寡核苷酸制造本发明的RNA复合体，研究其对内源性miRNA的抑制效果。

细胞培养

将HCT-116细胞(Cancer Res 1981；41：1751；J Nat Cancer Inst1982；69：767)在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中、于37℃下培养。

萤光素酶测定

在导入的前1天，将HCT-116细胞在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中以1.0×10⁵细胞/孔接种在24孔板上，按照一式三份转染脂质转染胺2000(Invitrogen)和10ng的pTK4.12C.P-(萤火虫萤光素酶质粒；内部对照)、100ng的pGL4.74-miR21T(Rluc靶报道基因质粒)、或不具有靶序列的pGL4.74和1、3、10、50、200nM的2’-O-甲基-TuD-RNA寡核苷酸、以及2’-O-甲基-RNA反义寡核苷酸·LNA/DNA反义寡核苷酸·PNA反义寡核苷酸。LNA/DNA反义寡核苷酸由ThermoELECTRON公司合成，在8个连续位于中央的核苷酸中包含锁定核酸(Naguibneva，I.等人.(2006)Biomed Pharmacother，60，633-638)。TuD-2’-O-甲基-RNA寡核苷酸、2’-O-甲基-RNA反义寡核苷酸、LNA/DNA反义寡核苷酸、PNA反义寡核苷酸具有下述(1)所示的序列。miRIDIAN抑制剂是从Thermo scientific Dharmacon公司购入的合成寡核苷酸。所有测定均在转染的48小时后通过双荧光素酶测定(Promega)并使用GLOMAX^TM(Promega)来实施。

使用的寡核苷酸

(1)2’-O-甲基反义寡和LNA/DNA反义寡的序列

为了构建2’-O-甲基-TuD-miR21，将混合5’-GACGGCGCUAGGAUCAUCAACUCAACAUCAGUCAAUGUGAUAAGCUACAAGUAUUCUGGU-3’(SEQ ID NO：148)和5’-ACCAGAAUACAACUCAACAUCAGUCAAUGUGAUAAGCUACAAGAUGAUCCUAGCGCCGUC-3’(SEQ ID NO：149)得到的混合物退火后使用。所有核苷酸均被2’-O-甲基化。

为了构建2’-O-甲基-miR21，使用5’-GUCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3’(SEQ ID NO：150)。为了构建2’-O-甲基-NC，使用5’-AAGGCAAGCUGACCCUGAAGU-3’(SEQ ID NO：151)。所有核苷酸均被2’-O-甲基化。

为了构建LNA-miR21，使用5’-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’(SEQ ID NO：79)。为了构建LNA-NC，使用5’-CATTAATGTCGGACAACTCAAT-3’(SEQ ID NO：80)。进行了LNA修饰的序列以下划线显示。

为了构建PNA-miR21，使用5’-RRRQRRKKR-OO-ATTAATGTCGGACAA-3’(SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153)。为了构建PNA-NC，使用5’-RRRQRRKKR-OO-TCAACATCAGTCTGA-3’(SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：154)。所有核苷酸均为PNA。细胞穿透肽(cellpenetrating peptide)和AEEA接头(AEEA：8-氨基-3，6-二氧杂辛酸)以下划线显示。

结果

为了研究2’-O-甲基-TuD-RNA寡核苷酸的抑制功能，将各种反义寡和在3’-UTR中具有或不具有与成熟miR-21完全互补的21bp DNA序列的插入的Renilla luciferase报道基因和作为转染的内部对照的萤火虫萤光素酶报道基因pTK4.12C.P-一同一过性地转染到HCT-116细胞中(图22)。与转染了2’-O-甲基-NC的细胞的表达相比，转染了2’-O-甲基-TuD-miR21的细胞集团在1nM、3nM、10nM、50nM、200nM的浓度下使miR21报道基因的表达、即以萤火虫萤光素酶活性校准的Renilla luciferase活性分别上升约21倍、约43倍、约51倍、约58倍、约69倍(图22、23)。而2’-O-甲基-miR21、LNA-miR21、PNA-miR21在200nM下使miR21报道基因的表达分别上升约6倍、约2倍、约11倍左右。另外，在0.1nM、0.3nM、1nM、3nM的浓度下比较2’-O-甲基-TuD-RNA寡核苷酸和miRIDIAN抑制剂的miR-21抑制效果时，在各浓度下2’-O-甲基-TuD-miR21显示出约3.0倍、约9.1倍、约28.9倍、约45.9倍左右的上升，而miRIDIAN抑制剂-miR21显示出约2.5倍、约5.2倍、约11.6倍、约20.1倍左右的上升(图24)。另一方面，不具有靶序列的Renilla luciferase报道基因的活性在低浓度下与导入的反义寡独立，几乎恒定。这些结果显示：与现有的合成试剂相比，在上述转染条件下，2’-O-甲基-TuD-miR21具有高得多的抑制miRNA的能力。

[实施例8]使用其他启动子的miRNA抑制

质粒构建

使用下述(2)所示的引物，由人基因组DNA进行PCR，之后克隆到pCR2.1中，制作ph7SK-protoshuttle(图27(A))。用KpnI-HindIII消化ph7SK-protoshuttle，使下述(2)所示的寡核苷酸退火并进行克隆，制作ph7SK-TuD-shuttle。将下述(3)所示的各寡引物对退火，之后将其克隆到用BsmBI消化的ph7SK-TuD-shuttle中，制作ph7SK-TuD-miR21-4ntin。之后，将ph7SK-TuD-miR21-4ntin的BamHI-EcoRI片段插入pSL1180(Pharmacia)的BamHI-EcoRI位点中，制作miRNA抑制RNA表达质粒载体pSL1180-TuD-miR21-4ntin。

使用的寡核苷酸

(2)用于构建本发明的RNA的穿梭载体的引物对

为了构建ph7SK-protoshuttle，使用正向引物5’-GGATCCTGCAGTATTTAGCATGCCCCA-3’(SEQ ID NO：155)和反向引物5’-GAATTCAAAAAAGGATGTGAGGGCGTCATCGAGACGGTACCGTCTCCGATGACGCCCTCACATCCGAGGTACCCAGGCGGCGCACAAGC-3’(SEQ ID NO：156)；为了构建ph7SK-TuD-shuttle，使用有义链5’-CTCGGATGTGAGGGCGTCATCGGAGACGACACCATCCACAGCCAGCGTCTCGATGACGCCCTCACATCCTTTTTTGAATTCA-3’(SEQ ID NO：157)和反义链5’-AGCTTGAATTCAAAAAAGGATGTGAGGGCGTCATCGAGACGCTGGCTGTGGATGGTGTCGTCTCCGATGACGCCCTCACATCCGAGGTAC-3’(SEQ ID NO：158)。

(3)用于构建本发明的RNA的表达载体的引物对

为了构建TuD RNA-miR21-4ntin，使用有义链5’-CATCAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAG-3’(SEQID NO：17)和反义链5’-TCATCTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTT-3’(SEQ ID NO：18)。

结果

mU6启动子和h7SK启动子的抑制效果的比较

为了进行mU6启动子和h7SK启动子的抑制效果的比较，将miRNA抑制RNA表达质粒载体和在3’-UTR中具有或不具有与成熟miR-21完全互补的21bp DNA序列的插入的Renilla luciferase报道基因(分别为pGL4.74-miR21T和pGL4.74)和作为转染的内部对照的萤火虫萤光素酶报道基因(pTK4.12C.P-)一同一过性地转染到HCT-116细胞中。转染了mU6启动子-TuD-miR21的细胞集团使miR21报道基因的表达、即根据萤火虫萤光素酶活性校正的Renilla luciferase活性较转染了mU6启动子-TuD-NC的细胞的表达上升约59倍(图27(B))。另一方面，h7SK启动子-TuD-miR21较转染了h7SK启动子-TuD-NC的细胞的表达也上升约77倍。这些结果显示：在上述转染的条件下，h7SK启动子具有高的能力。

[实施例9]高次结构的效果

质粒构建

将下述(4)所示的各寡引物对退火，之后将其克隆到用BsmBI消化的pmU6-TuD-shuttle中，制作pmU6-TuD-miR21-4ntin-GqL111、pmU6-TuD-miR21-4ntin-GqL333、pmU6-TuD-miR21-4ntin-1MBS-1、pmU6-TuD-miR21-4ntin-1MBS-2。将这些质粒的BamHI-EcoRI片段插入pSL1180(Pharmacia)的BamHI-EcoRI位点中，制作miRNA抑制RNA表达质粒载体pSL1180-TuD-miR21-4ntin-GqL111、pSL1180-TuD-miR21-4ntin-GqL333、pSL1180-TuD-miR21-4ntin-1MBS-1、pSL1180-TuD-miR21-4ntin-1MBS-2。

使用的寡核苷酸

(4)用于构建本发明的RNA的表达载体的引物对

为了构建TuD RNA-miR21-4ntin-GqL111，使用有义链5’-CATCAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAGGGAGGGCGGGAGGGAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAG-3’(SEQ ID NO：159)和反义链5’-TCATCTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTTCCCTCCCGCCCTCCCTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTT-3’(SEQ ID NO：160)。

为了构建TuD RNA-miR21-4ntin-GqL333，使用有义链5’-CATCAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAGGGAGAGGGGCGGGGCGCGGGAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAG-3’(SEQ ID NO：161)和反义链5’-TCATCTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTTCCCGCGCCCCGCCCCTCTCCCTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTT-3’(SEQ ID NO：162)。

为了构建TuD RNA-miR21-4ntin-1MBS-1，使用有义链5’-CATCAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACATCGAATAGTGTAACTGACTACAACTCAAG-3’(SEQ ID NO：163)和反义链5’-TCATCTTGAGTTGTAGTCAGTTACACTATTCGATGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTT-3’(SEQ ID NO：164)。

为了构建TuD RNA-miR21-4ntin-1MBS-2，使用有义链5’-CATCAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACAAGCCACAACGAATCTCTATATCATCAAG-3’(SEQ ID NO：165)和反义链5’-TCATCTTGATGATATAGAGATTCGTTGTGGCTTGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTT-3’(SEQ ID NO：166)。

结果

(i)比较各结构对抑制效果的影响(G-quadruplex)

制作用作为强固的结构而已知的G-quadruplex取代了2个茎结构中长度短的茎结构的miRNA抑制RNA(图25)。G-quadruplex是GGG-环-GGG-环-GGG-环-GGG序列。该环的序列长度为1-1-1的结构形成被称作平行的结构，而该环的序列长度为3-3-3的结构迁移在平行结构与反向平行结构之间。将它们分别称为GqL111、GqL333。利用使用HCT-116细胞的萤光素酶报道基因测定系统，比较各结构的miRNA抑制RNA的效果。与mU6 promoter-TuD-NC相比，mU6-TuD-miR21-4ntin使miR21报道基因的表达上升约40倍。另一方面，mU6-TuD-miR21-4ntin-GqL111、mU6-TuD-miR21-4ntin-GqL333分别使miR21报道基因的表达上升约33倍、约20倍(图25(C))。

(ii)比较各结构对抑制效果的影响(1MBS)

将1分子中相互对向存在的2个MBS中的一方取代成不与靶miRNA结合的序列，制作MBS为1个的2种miRNA抑制RNA(图26(A))。利用使用HCT-116细胞的萤光素酶报道基因测定系统，比较各结构的miRNA抑制RNA的效果。与mU6启动子-TuD-NC相比，mU6启动子-TuD-miR21使miR21报道基因的表达上升约59倍。另一方面，mU6-TuD-miR21-4ntin-1MBS-1、mU6-TuD-miR21-4ntin-1MBS-2分别使miR21报道基因的表达上升约22倍、约6.5倍(图26(B))。

由以上结果可知：MBS的数目对抑制效果的影响大。MBS为1个或3个的miRNA抑制RNA也显示出高的抑制效果，但具有2个MBS的miRNA抑制RNA最有效。特别是具有2个MBS的TuD-miR21，与具有1个MBS的TuD-miR21-4ntin-1MBS-1或TuD-miR21-4ntin-1MBS-2相比，发挥显著超过2倍的高的抑制作用。当与MBS对向存在的区不是MBS时，显示其核苷酸序列能够对抑制效果带来大的影响。

[实施例10]由miR-200家族抑制产生的生物学活性

1.1质粒的构建

将下述(5)所示的各寡引物对退火，之后将其克隆到用BsmBI消化的pmU6-TuD-shuttle和ph7SK-TuD-shuttle中，制作pmU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、pmU6-TuD-miR200c-4ntin-3pL、ph7SK-TuD-miR200c-4ntin-3L、ph7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL。将这些质粒的BamHI-EcoRI片段插入pSL1180(Pharmacia)的BamHI-EcoRI位点中，制作miRNA抑制RNA表达质粒载体pSL1180-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、pSL1180-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3pL、pSL1180-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3L、pSL1180-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL。将同样的BamHI-EcoRI片段插入pLCG(担载HIV-1基盘的GFP基因的慢病毒载体)的BamHI-EcoRI位点中，制作miRNA抑制RNA表达慢病毒载体pLCG-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、pLCG-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL。

为了构建萤光素酶报道基因质粒，使下述所示的寡核苷酸对退火，之后将其克隆到用XbaI和FseI消化的pGL4.74(Promega)中，制作pGL4.74-miR200cT。

1.2细胞培养和稳定细胞株的建立

在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中、于37℃下培养HCT-116细胞(Cancer Res 1981；41：1751；J Nat Cancer Inst 1982；69：767)。

将HCT-116细胞以1×10⁵细胞/孔接种在6孔板上，24小时后，在8μg/ml的凝聚胺的存在下分别导入pLCG-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、pLCG-mU6-TuD-NC、pLCG-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL、pLCG-h7SK-TuD-NC病毒保存株(1×10⁶TU)，在转导的8天后，使用FACS Area分离收集GFP表达细胞。

1.3萤光素酶测定

在导入的前一天，将HCT-116细胞在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中以1.0×10⁵细胞/孔接种在24孔板上，按照一式三份转染脂质转染胺2000(Invitrogen)和10ng的pTK4.12C.P-(萤火虫萤光素酶质粒；内部对照)、100ng的pGL4.74-miR200cT(Rluc靶报道基因质粒)或不具有靶序列的pGL4.74(图28A)、1ng和10ng的pSL1180-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L和pSL1180-mU6-TuD-NC·pSL1180-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL·pSL1180-h7SK-TuD-NC。此外，将自pLCG-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、pLCG-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL慢病毒导入起21天后分别导入的细胞在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中、以1.0×10⁵细胞/孔接种在24孔板上，按照一式三份转染脂质转染胺2000(Invitrogen)和10ng的pTK4.12C.P-(萤火虫萤光素酶质粒；内部对照)、100ng的pGL4.74-miR200cT(Rluc靶报道基因质粒)或不具有靶序列的pGL4.74(图28A)。所有测定均在转染的48小时后通过双荧光素酶测定(Promega)并使用GLOMAX^TM(Promega)来实施。

1.4蛋白质印迹

自慢病毒导入起15天后，利用1.5×SDS缓冲液从细胞中提取总蛋白，使用Bio-Rad蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。用10％SDS-PAGE分离蛋白提取物，之后转移到PVDF-膜(Milipore)上。通过将膜与抗E-钙粘着蛋白(ab76055，Abcam)抗体、抗波形蛋白(sc6260，Santa cruz)抗体和抗肌动蛋白(612656，BD转导)抗体在室温下培育2小时，实施免疫印迹。用含有Tween 20的磷酸缓冲盐清洗膜3次，之后将膜与辣根过氧化物酶结合二次抗体在室温下培育1小时。使用ECL试剂(Amersham)检测信号。

使用的寡核苷酸

(5)用于构建本发明的RNA的表达载体的引物对

为了构建pmU6-TuD-miR200c-4ntin-3L和ph7SK-TuD-miR200c-4ntin-3L，使用有义链5’-CATCAACTCCATCATTACCCCACTGGCAGTATTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCCATCATTACCCCACTGGCAGTATTACAAG-3’(SEQ ID NO：179)和反义链5’-TCATCTTGTAATACTGCCAGTGGGGTAATGATGGAGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTAATACTGCCAGTGGGGTAATGATGGAGTT-3’(SEQ ID NO：180)。

为了构建pmU6-TuD-miR200c-4ntin-3pL和ph7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL，使用有义链5’-CATCTCCATCATTACCCCACTGGCAGTATTACGTATTCTGGTCACAGAATACTCCATCATTACCCCACTGGCAGTATTACG-3’(SEQ ID NO：181)和反义链5’-TCATCGTAATACTGCCAGTGGGGTAATGATGGAGTATTCTGTGACCAGAATACGTAATACTGCCAGTGGGGTAATGATGGA-3’(SEQID NO：182)。

为了构建pGL4.74-miR200cT，使用有义链5’-CTAGACCGGAATTCTCCATCATTACCCGGCAGTATTACTCGAGCGGAGGCCGG-3’(SEQ ID NO：183)和反义链5’-CCTCCGCTCGAGTAATACTGCCGGGTAATGATGGAGAATTCCGGT-3’(SEQ ID NO：184)。

结果

通过萤光素酶测定来研究TuD200的miR200抑制效果

使用萤光素酶报道基因测定系统，研究由mU6启动子和h7SK启动子这2种启动子表达的miRNA抑制RNA的效果。并且，对接头序列的长度不同的2种miRNA抑制RNA、TuD-miR200c-4ntin-3L和TuD-miR200c-4ntin-3pL进行试验。在转染了1ng的以miR200为靶的本发明的miRNA抑制RNA(TuD200)表达质粒载体的实验中，mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、mU6-TuD-miR200c-4ntin-3pL、h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3L、h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL的miR200c报道基因的表达较mU6-TuD-NC分别上升约5.7倍、约6.7倍、约6.1倍、约6.7倍。而h7SK-TuD-NC几乎同等(图28B)。在转染了10ng的TuD RNA表达质粒载体的实验中，mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、mU6-TuD-miR200c-4ntin-3pL、h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3L、h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL的miR200c报道基因的表达较mU6-TuD-NC分别上升约8.2倍、约8.7倍、约8.0倍、约8.5倍。而h7SK-TuD-NC几乎同等。另外，即使是转染1ng，与转染10ng的结果相比，也发挥大致相同的效果(图28C)。由以上结果可知：TuD-200c以少的导入量即可充分抑制内源性miR-200。另外，在使用miR-200的实验中也表明：mU6启动子、h7SK启动子和TuD-miR200c-4ntin-3L、TuD-miR200c-4ntin-3pL均显示出高的抑制活性。

并且，在导入TuD-miR200c表达慢病毒载体而制作的TuD RNA稳定表达细胞中，自病毒导入起23天后进行萤光素酶报道基因测定时，与mU6-TuD-NC表达细胞相比，mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL表达细胞的miR200c报道基因的表达也分别上升约6.9倍、约6.9倍。而h7SK-TuD-NC表达细胞几乎同等(图28D)。该结果显示：通过使用TuD-miR200c表达慢病毒载体，可以长期、高效率地抑制miR-200。

通过miR200抑制进行的上皮-间充质转换的诱导

将miRNA抑制RNA表达慢病毒载体pLCG-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、pLCG-mU6-TuD-NC、pLCG-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL和pLCG-h7SK-TuD-NC分别导入作为上皮系细胞的HCT116细胞中，分离收集GFP表达细胞。回收这些细胞的蛋白，利用蛋白质印迹法分析作为上皮细胞·间充质细胞的基因标志物的E-cadherin、波形蛋白的表达量。与导入有pLCG-mU6-TuD-NC、pLCG-h7SK-TuD-NC的细胞相比，在导入有pLCG-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、pLCG-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL的细胞中，E-cadherin的表达量显著减少；在导入有pLCG-mU6-TuD-NC、pLCG-h7SK-TuD-NC的细胞中，没有确认到波形蛋白的表达，但在导入有pLCG-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、pLCG-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL的细胞中，波形蛋白表达(图28E)。以上结果显示：通过由TuD-miR200c介导的miR-200家族的抑制，上皮系细胞HCT116转换成间充质系细胞。

产业实用性

通过本发明，提供可以有效率且特异性地抑制miRNA的miRNA抑制复合体。本发明的miRNA抑制复合体例如通过逆转录病毒载体表达，由此可以长期稳定地抑制miRNA，例如可以进行击倒小鼠这样的体内测定。并且，还可以利用Cre-loxP来时间特异性且组织特异性地实施miRNA击倒。如图6所例示，本发明的miRNA抑制RNA的表达套件可以容易地构建，因此还可以构建用于综合性分析miRNA的RNA文库。这样，本发明提供对miRNA的研究极为有用的工具。此外，预想生物体内的基因有相当的比例是miRNA的靶，提示miRNA在包括分化、发生、肿瘤形成和抗感染症的细胞防御的各种场面中发挥重要作用。在基因调节机制的解明或肿瘤或感染症的基因治疗等中，本发明的方法对于控制这些miRNA的功能有用。

Claims

1.抑制miRNA的复合体，该复合体包含RNA或其类似物，包含双链结构，包含miRNA结合序列的链分别与该双链结构的单端的2条链的每1条结合，包含选自双链或四条链的第2多重链结构，该包含miRNA结合序列的2条链的各自的另一端与该第2多重链结构的单端的2条链分别结合，以使该包含miRNA结合序列的链被该双链结构和该第2多重链结构夹持，由此，包含图2(C)所示的结构，图2(C)的I为该双链结构，II为第2多重链结构、为双链或四条链，图2(C)的a和b中分别包含至少1个miRNA结合序列。

2.权利要求1所述的复合体，该包含miRNA结合序列的2条链通过该第2多重链结构相连接。

3.权利要求2所述的复合体，该复合体包含图2(D)所示的结构，图2(D)的I为该双链结构，II为第2多重链结构、为双链或四条链，图2(D)的a和b中分别包含至少1个miRNA结合序列。

4.权利要求1所述的复合体，该第2多重链结构为双链。

5.权利要求2所述的复合体，该复合体由直链状单链RNA或其类似物构成。

6.权利要求1～5中任一项所述的复合体，该复合体包含2～5个miRNA结合序列。

7.权利要求6所述的复合体，该复合体包含2个miRNA结合序列。

8.RNA或其类似物，其构成权利要求1～7中任一项的复合体。

9.核酸，该核酸编码权利要求8所述的RNA。

10.权利要求9所述的核酸，该核酸与启动子的下游结合。

11.权利要求10所述的核酸，其中启动子为聚合酶III启动子。

12.权利要求10或11所述的核酸，该核酸被担载在逆转录病毒载体上。

13.制作权利要求10所述的核酸的方法，该方法包括下述步骤：在启动子的下游编码形成至少1个双链结构的1对互补序列的核酸之间插入下述的核酸，所述核酸包含至少2个miRNA结合序列，且在该2个miRNA结合序列之间包含形成选自双链或四条链的多重链结构的序列。

14.权利要求13所述的方法，其中，该多重链结构为双链。

15.试剂盒，该试剂盒用于制作权利要求10所述的核酸，该试剂盒包含下述(a)和(b)的核酸：

(b)核酸，该核酸包含至少2个miRNA结合序列，且在该2个miRNA结合序列之间包含形成选自双链或四条链的多重链结构的序列。

16.权利要求15所述的试剂盒，其中，该多重链结构为双链。