CN102414327B - 用于在样品中检测rna剪接形式的非靶向扩增方法 - Google Patents

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Abstract

提供了从生物样品分离RNA的方法，用于在生物样品中确定特定RNA剪接形式变体的存在的方法和手段，用于在生物样品中确定RNA比的相对比的方法和手段，和用于预测癌前子宫颈损伤的进展的方法和手段。

Description

用于在样品中检测RNA剪接形式的非靶向扩增方法
对相关申请的交叉引用
此遵照35U.S.C.§111(a)提交的非临时专利申请，要求遵照35U.S.C.§111(b)于2009年5月1日提交的美国临时专利申请61/174,938号，以及遵照35U.S.C.§111(b)于2009年5月1日提交的美国临时专利申请61/174,946号由35U.S.C.119(e)(1)规定的权益，其每一个均通过全文提述并入本文。
发明背景
1.技术领域
本公开涉及用于在样品中确定核糖核酸(RNA)的存在的方法和试剂盒。
2.相关技术描述
特定核酸序列和序列改变的检测和表征已用于检测指示感染的病毒或细菌核酸序列的存在，与疾病和癌症相关的哺乳动物基因变体或等位基因的存在，和在法医样品中发现的核酸的来源的鉴定，以及亲子鉴定(paternitydetermination)。在正常生物过程中涉及的RNA种的表征对于理解多种鲜为人知的生物过程可能是重要的。
检测
RNA(例如，信使RNA，转移RNA，核糖体RNA，小核RNA和其他RNA)的检测和表征在许多领域包括分子生物学、毒理学和生物化学中是重要的工具。信使RNA(mRNA)是细胞必需的功能组分；在基因表达过程中，合成了mRNA的功能性单链结构，其充当蛋白质合成中的翻译过程的中间模板。mRNA分子的短暂存在以DNA至RNA分子的转录起始，并最终结束于降解。在其生命期间，在翻译之前，mRNA分子可受加工、编辑和转运。剪接是用于修饰前mRNA(pre-mRNA)以去除某些段称为内含子的非编码序列的过程；留下的段可包含蛋白质编码序列，并称为外显子。有时前mRNA讯息可以以几种不同方式剪接，允许单个转录物编码多个蛋白质。
信使RNA(mRNA)的检测在诊断中是至关重要的，因为其可提供DNA检测无法提供的病毒载量和基因表达信息。这些因素常常给出关于疾病进展和预后的线索。mRNA检测的现有技术表现出多种问题，包括费用和污染的可能。
反向杂交捕获(reverse hybrid capture)是用于RNA检测的新颖非靶向扩增技术，其可用于检测来自生物样品的特定基因转录物，具有非常低的污染风险。该方法使用与RNA靶杂交的DNA探针。然后用杂交捕获抗体系统检测构建的杂交体。
最常见的mRNA检测方法包括Northern印迹，核糖核酸酶保护测定(RPA)，和逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)。然而，这些技术的每一个，尽管在敏感度方面提供了一些优点，但需要对时间和材料的需求。此外，一些技术需要扩增靶mRNA，因为总mRNA仅代表总RNA的约1％，而任何具体mRNA占显著更小的百分比。
表征
目前，逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)广泛用于表征RNA转录物。然而该方法具有下述限制：1)仅可共扩增有限数量的特定区；2)突变或选择性剪接(alternative splicing)可限制特定引物检测RNA的能力；和3)难以在连续模式方法中表征mRNA结构。
简述
本公开提供了RNA检测的非靶向扩增方法，其能够表征RNA转录物。在一个实施方案中，本公开提供了mRNA检测的非靶向扩增方法，其能够表征mRNA转录物。
本公开提供了检测靶RNA存在的方法，该方法包括：a)提供至少一种DNA捕获探针，其中所述至少一种DNA捕获探针结合于支持物；b)将靶RNA杂交至所述至少一种DNA捕获探针，得到靶RNA:DNA捕获探针复合物；c)分离所述靶RNA:DNA捕获探针复合物；d)提供至少一种DNA扩增探针，并将所述至少一种DNA扩增探针杂交至所述靶RNA:DNA捕获探针复合物，得到靶RNA:DNA捕获/扩增探针复合物；e)提供抗RNA:DNA杂交物抗体，并将所述靶RNA:DNA捕获/扩增探针复合物与所述抗体温育，得到靶RNA:DNA:抗体复合物；f)检测所述抗体，其中所述检测指示所述靶RNA的存在。在一个方面，抗体与可检测标记缀合，且检测步骤包括检测该标记。在一个方面，所述可检测标记选自下组：碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。在一个方面，检测步骤包括提供结合于所述抗RNA:DNA杂交物抗体的第二抗体，其中所述第二抗体与可检测标记缀合，且其中所述检测进一步包括检测该标记。在一个方面，所述支持物包括磁珠。在一个方面，所述磁珠与至少一个链霉亲和素分子缀合，且所述至少一种DNA捕获探针与生物素分子缀合。
靶RNA可来自病毒、细菌、分枝杆菌或疟原虫。靶RNA可来自疱疹病毒科(Herpesviridae)，人免疫缺陷病毒，细菌噬菌体(bacteriophage)，衣原体属的种(Chlamydia spp.)，奈瑟氏菌属的种(Neisseria spp.)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，分枝杆菌，SARS冠状病毒，正粘液病毒科(Orthomixoviridae)或乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)。
在一个方面，所述至少一种DNA捕获探针和所述至少一种DNA扩增探针长度为约15至约200个碱基。
在一个方面，所述靶RNA为剪接变体，且选择所述至少一种DNA捕获探针和所述至少一种DNA扩增探针以检测所述剪接变体的存在。
在一个方面，所述至少一种DNA捕获探针和所述至少一种DNA扩增探针与来自HPV高风险型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、66、73和82的RNA互补。
本公开提供了用于检测靶RNA的试剂盒，该试剂盒包含：a)至少一种DNA捕获探针，结合于磁性支持物；b)至少一种DNA扩增探针；c)抗RNA:DNA杂交物抗体；和d)检测试剂。在一个方面，所述抗RNA:DNA杂交物抗体与可检测标记缀合，且所述检测试剂包含所述可检测标记的底物。在一个方面，所述试剂盒进一步包含与所述抗RNA:DNA杂交物抗体结合的第二抗体，其中所述第二抗体与可检测标记缀合，且其中所述检测试剂包含所述可检测标记的底物。
本公开提供了提供用于检测的靶RNA的方法，该方法包括：将含有靶RNA的生物样品与羧基珠温育；分离珠；裂解附于该分离的珠的生物样品，并从裂解的生物样品分离珠，其中所得的上清含有用于检测的靶RNA。
附图简述
为了进一步理解本公开的特性，目标和优点，应参照下述详细描述，并与下述附图一同阅读，其中类似的参照号代表类似的元件。
图1是由生物素化的DNA探针(白色条形)捕获的靶RNA(带交叉线阴影的条形)的概略图。“B”代表生物素模块(moiety)；“SA”代表链霉亲和素模块；“AP”代表缀合于抗体的碱性磷酸酶，但SA可为任何其他适当的可检测模块(例如，辣根过氧化物酶等)。
图2为描述使用DNA捕获探针(白色条形)，多种DNA扩增探针(黑色条形)，和多种DNA:RNA杂交物抗体以“扩增”信号而无需扩增靶RNA(带交叉线阴影的条形)的概略图。“B”代表生物素模块；“SA”代表链霉亲和素模块，B和SA可由其他其中DNA探针缀合于珠的缀合技术替代；“AP”代表缀合于抗体的碱性磷酸酶，但AP可为任何其他适当的可检测模块(例如，辣根过氧化物酶等)。
图3是通过结合于底物(S)的不同DNA捕获探针捕获的靶RNA(虚线箭头)的概略图。亦显示了未结合的DNA扩增探针(黑色条形)和检测并结合于DNA:RNA杂交区(缀合于碱性磷酸酶或任何其他适当的可检测模块，如辣根过氧化物酶等)的多种抗体。该底物(例如，珠)可携带多种DNA捕获探针，且该DNA捕获探针可为相同的(即，相同的序列和/或长度)或不同的(即，不同的序列和/或不同的长度)。
图4提供了显示在RNA捕获之后添加未生物素化的DNA探针的作用的实验结果。在该实验中，将可变数量的生物素化的探针与链霉亲和素珠缀合。该靶为HPV16的E6/7基因转录物。该测定是用每组添加(黑色条形)和不添加(白色条形)未标记的信号扩增探针的珠来进行的(一步和两步测定的比较)。当未添加任何信号扩增步骤时(白色条形)，信号随着由捕获探针提供的覆盖的量的增加而增加。然而，当添加了信号扩增探针时(黑色条形)，信号在一步测定中要高得多，且仅需要3-5个捕获探针以供改善信号。
图5显示内源杂交物常常为临床背景噪音的来源。“RLU”＝相对发光度单位。
图6显示当在PreservCyt Solution中测定细胞样品时，裂解缓冲液(其中100％缓冲液包含约3M硫氰酸胍和约2％的洗涤剂)浓度对测定背景的作用，并说明了临床背景随着裂解缓冲液浓度的减少而减少。
图7显示细胞沉淀的低张度裂解(hypotonic lysis)确保了背景噪音保持稳定，且无论所用的样本量，背景并不显著变化。“PC”＝PreservCyt Solution；“PC(-)”＝不含HPV靶，固定于PreservCyt Solution中的样本(子宫颈刮取物(cervical scrape))汇集。
图8显示来自HPV阳性细胞(SiHa)的HPV E6/E7的检出限。这显示使用本公开的方法，仅需要少至1x103个细胞以供HPV E6/7 RNA检测。
图9显示来自就裂解由COOH珠捕获的细胞的能力测试多种裂解缓冲液的结果。图9的数据，与下述表1的数据一同，显示优选的裂解缓冲液为约1M的硫氰酸胍和约0.7％洗涤剂。
图10显示随时间的通过磁性羧基修饰的(COOH)珠(Sera Dyn目录号6515-2105-050350)的细胞捕获，说明约95％的细胞在温育30分钟之后已经被捕获。
图11显示COOH珠捕获与低张度裂解的比较，并表明COOH珠捕获比低张度裂解对于从细胞获得mRNA更为有效。“PC-”表示缺乏HPV存在的子宫颈刮取样本的汇集。
图12是描述捕获和信号探针设计区的概略图。HPV转录物的长度可通过用捕获特定靶的特定捕获寡聚物捕获至磁珠上，并用多组用于延长杂交区长度的未标记的寡核苷酸检测来“表征”。若捕获RNA携带互补于使用的检测探针的序列，则会产生信号。随着继续添加扩增信号探针，信号输出会增加，直至达到最大长度，此时信号会保持平稳(plateau)。显示了多种用于HPV16的HPV转录物。指定由虚线盒表示的区用于探针设计。
图13显示了随着信号扩增探针数的增加逐渐增加的信号。以此方式，RNA转录物长度可通过由增加数量的连续检测探针生成的增加信号来测量。在图13中，随着继续添加组，每组5个寡聚物彼此邻接，并导致RNA:DNA杂交物变得更长，而信号变得更强。
图14显示细胞具有高早期∶晚期HPV mRNA比例的级分可针对具有低比例的细胞的背景来检测。对于该图14，将SiHa细胞(子宫颈癌细胞系)添加至子宫颈样本(每个诊断为高等级的HPV相关损伤)的汇集。该SiHa细胞组入高比例的HPV早期转录物∶HPV晚期转录物，其为子宫颈癌的常见特征。该样品类似在癌前损伤(precancerous lesion)细胞中具有癌细胞的样本。该结果显示发明的测定法会在损伤更加良性的细胞的汇集中检测出癌细胞。
具体实施方式
在进一步描述本主题公开之前，应理解的是本公开并不限于下述公开的具体实施方案，因为可作出具体实施方案的变体而仍落在所附权利要求的范围之内。亦应理解的是采用的命名法是为了描述具体实施方案的目的，而并不旨在对其进行限定。相反，本公开的范围由所附权利要求所确立。
在本说明书和所附的权利要求中，单数形式“一种、一个、一(a，an)”和“所述，该(the)”包括对复数的指代，除非上下文明确作出相反的指示。除非另行定义，本文中所用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属的技术领域中一般技术人员通常理解相同的含意。
本公开的方法可用于从样品检测靶核酸的存在。此种核酸可为RNA，且此类样品可包括但不限于，样本或培养物(例如，细胞、微生物和病毒培养物)，其包括生物和环境样品。生物样品可来自真核生物、原核生物、古菌(archaeon)、病毒、动物(包括人)、植物、真菌、挖掘物(excavate)，且可来自流体、固体(例如粪便)或组织、细胞培养物、液体或固体培养基，以及液体和固体食物和饲料产品和成分如乳制品(dairy items)、蔬菜、肉和肉副产品和废物。环境样品包括环境材料如表面物质(surface matter)、土壤、水、空气和工业样品，以及从食物和乳制品加工器械、装置、设备、器皿、一次性(disposable)和非一次性(non-disposable)物品获得的样品。具体而言，优选的是包括但不限于子宫颈上皮细胞(例如，从子宫颈拭子或活检获得的样品)、腺样细胞、肛门上皮细胞、血液、唾液、脑脊液、胸液、乳汁、淋巴、痰和精液的生物样品。所述样品可包含核糖核酸，其包含信使RNA(mRNA)。
本公开提供了用于在样品中确定靶RNA存在的方法，其中所述方法包括：a)将靶RNA与具有互补于所述靶RNA的序列的DNA捕获探针杂交以形成靶RNA:DNA捕获探针复合物，其中所述DNA捕获探针与支持物缀合；b)将所述靶RNA:DNA捕获探针复合物与未结合的RNA分离(例如，通过洗涤)；c)任选地将至少一种扩增探针与所述靶RNA:DNA捕获探针复合物杂交，其中所述至少一种扩增探针具有互补于所述靶RNA的序列，由此形成靶RNA:DNA捕获/扩增探针复合物；d)添加识别并结合于RNA:DNA杂交物的抗体以结合所述靶RNA:DNA捕获/扩增探针复合物，由此形成靶RNA:DNA:抗体复合物，其中所述抗体用可检测标志物标记；e)检测所述抗体上的标志物，其中所述检测指示所述靶核糖核酸的存在；和f)将检测结果与从扩增探针的不同组合产生的结果相比较，其中该比较指示具体RNA剪接形式存在。
本公开提供了用于在样品中确定靶RNA的存在的方法，其中所述方法包括：a)将靶RNA与具有互补于所述靶RNA的序列的DNA捕获探针杂交以形成靶RNA:DNA捕获探针复合物，其中所述DNA捕获探针与支持物缀合；b)将所述靶RNA:DNA捕获探针复合物与未结合的RNA分离；c)任选地将至少一种扩增探针与所述靶RNA:DNA捕获探针复合物杂交，其中所述至少一种扩增探针具有互补于所述靶RNA的序列，由此形成靶RNA:DNA捕获/扩增探针复合物；d)添加识别并结合于RNA:DNA杂交物的抗体以结合所述靶RNA:DNA捕获/扩增探针复合物，由此形成靶RNA:DNA:抗体复合物；e)添加识别并结合第一抗体的第二抗体，其中所述第二抗体用可检测标志物标记；f)检测所述第二抗体上的标志物，其中所述检测指示所述靶核糖核酸的存在；和g)将检测结果与从扩增探针的不同组合产生的结果相比较，其中该比较指示具体RNA剪接形式存在。
本公开还提供了在样品中检测核糖核酸(RNA)剪接形式的存在的方法，其中所述方法包括：a)将靶RNA与具有互补于所述靶RNA的序列的DNA捕获探针在允许所述探针和所述靶核糖核酸杂交的条件下杂交，由此形成靶RNA:DNA捕获探针复合物；b)添加识别和结合于RNA:DNA杂交物的第一抗体以结合所述靶RNA:DNA捕获探针复合物，由此形成靶RNA:DNA捕获探针:抗体复合物，其中所述第一抗体与支持物缀合；c)将所述靶RNA:DNA捕获探针:抗体复合物与未结合的RNA分离；d)将至少一种扩增探针与所述靶RNA:DNA捕获探针:抗体复合物杂交，其中所述至少一种扩增探针具有互补于靶RNA的序列，并以覆盖特异性靶RNA区的组合添加，由此形成靶RNA:DNA捕获探针:抗体复合物；e)添加识别并结合于RNA:DNA双链体的第二抗体以结合所述靶RNA:DNA:抗体复合物，以形成靶RNA:DNA:抗体复合物，其中所述第二抗体用可检测标志物标记；f)检测所述第二抗体上的标志物，其中所述检测指示靶RNA的存在；和g)将检测结果与从扩增探针的不同组合产生的结果相比较，其中该比较指示具体RNA剪接形式存在。
本公开还提供了在样品中检测核糖核酸(RNA)剪接形式的存在的方法，其中所述方法包括a)将靶RNA与具有互补于所述靶RNA的序列的DNA捕获探针在允许所述探针和所述靶核糖核酸杂交的条件下杂交，由此形成靶RNA:DNA捕获探针复合物；b)添加识别并结合于RNA:DNA杂交物的第一抗体以结合所述靶RNA:DNA捕获探针复合物，由此形成靶RNA:DNA捕获探针:抗体复合物，其中所述第一抗体与支持物缀合；c)将所述靶RNA:DNA捕获探针:抗体复合物与未结合的RNA分离；d)将至少一种扩增探针与所述靶RNA:DNA捕获探针:抗体复合物杂交，其中所述至少一种扩增探针具有互补于所述靶RNA的序列，并以覆盖特异性靶RNA区的组合添加，由此形成靶RNA:DNA捕获探针:抗体复合物；e)添加识别并结合于RNA:DNA双链体的第二抗体以结合所述靶RNA:DNA:抗体复合物，以形成靶RNA:DNA:抗体复合物；f)将所述靶RNA:DNA:抗体复合物与未结合的第二抗体分离；g)添加用可检测标志物标记的第三抗体，其中所述第三抗体识别并结合于所述第二和/或第一抗体；h)检测所述第三抗体上的标志物，其中所述检测指示所述靶核糖核酸的存在；和i)将检测结果与从至少一种扩增探针的不同组合产生的结果相比较，其中该比较指示具体RNA剪接形式存在。
RNA经常从不同的启动子转录，由此生成包括用于不同基因的编码区的多重形式。表征这些RNA的多重剪接形式对于其中检测特定mRNA同种型是重要的基础研究和应用至关重要。
本公开的一种应用是检测和表征人乳头瘤病毒(HPV)中的mRNA表达。已经显示子宫颈的癌瘤与高风险HPV类型的存在相关；目前鉴定了约13至约18种高风险类型。HPV DNA测试可鉴定高风险HPV类型，但对于癌前临床样本中的疾病进展不是好的预测方法(predictor)。因此，需要其他方法和标志物以改善HPV测试的预测价值。如本公开所提供的就E6/7癌基因和其他mRNA的存在对mRNA进行的表征，可提供精确和可靠的方法，所述方法确定这些癌基因相对其他病毒基因的表达比例。E6/E7对E2，E4和/或L1mRNA的比例可为癌前子宫颈损伤的进展的较佳预测方法(参见，例如，美国专利6,355,424号，通过提述并入本文)，然而目前可用的测定法并不检测mRNA比例。杂交捕获技术是线性信号扩增方法。因此，本公开提供了用于指导治疗策略的有价值的方法，而使得需要阴道镜检查的患者数最少化。本公开提供了使用能够杂交于不同长度/基因的RNA(特别是mRNA)的短寡核苷酸的混合物以表征剪接形式的方法。
靶核酸
在一个实施方案中，待检测的靶核糖核酸可为mRNA、核糖体RNA、核仁RNA、转移RNA、病毒RNA、异源核RNA等，其中所述一种或多种多核苷酸探针为DNA探针。靶核糖核酸包括但不限于样本或培养物(例如，细胞、微生物和病毒培养物)中存在的核酸，所述样本或培养物包括生物和环境样品。靶核糖核酸可存在于来自动物包括人的生物样品、流体、固体(例如粪便)或组织，以及液体和固体食物和饲料产品和成分如乳制品(dairy items)、蔬菜、肉和肉副产品和废物。靶核糖核酸还可存在于环境样品，并包括环境材料如表面物质、土壤、水、空气和工业样品，以及从食物和乳制品加工器械、装置、设备、器皿、一次性和非一次性物品获得的样品。具体而言，优选的是存在于生物样品的靶核酸，所述生物样品包括但不限于子宫颈样品(例如，从子宫颈拭子获得的样品)、腺样细胞、肛门上皮细胞、血液、唾液、脑脊液、胸液、乳汁、淋巴、痰和精液。
在其他实施方案中，所述靶核糖核酸来自病毒、细菌、分枝杆菌或疟原虫，例如，巨细胞病毒(CMV)，疱疹病毒科(Herpesviridae)，人免疫缺陷病毒(HIV)，衣原体属的种(Chlamydia spp.)，奈瑟氏菌属的种(Neisseria spp.)，例如淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhea))，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，分枝杆菌(例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))，SARS冠状病毒(SARS-CoV)，或正粘液病毒科(例如，流感病毒)，但不意欲限于此。
在一个实施方案中，所述靶核糖核酸为人乳头瘤病毒(HPV)，并包括HPV的遗传变体。变体包括靶核酸的多态性，突变体，衍生物，经修饰的形式，经改变的形式等形式。在一个实施方案中，所述靶核酸为HPV核酸。在另一个实施方案中，所述HPV核酸为高风险HPV类型的HPV DNA。在另一个实施方案中，所述靶核酸为高风险HPV类型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、66、73和82。
RNA可通过多种方法和试剂，包括(但不限于)硫氰酸胍-酚-氯仿提取(例如，用TRIzol试剂，亦称作TRI试剂)，低张度裂解和羧基(COOH)珠捕获，来进行分离和制备以供杂交。RNA分离的原理是基于细胞/组织裂解，接着提取、沉淀和洗涤。尽管非常有效，这些技术需要高水平的技术精密度，且不是自动化的候选。其他RNA制备方法未完全消除DNA和其他潜在的污染物，需要昂贵的酶，并需要许多—有时为费时的—洗涤步骤。开发减少多数目前的挑战并可提供关于特定基因表达的快速信息的用于mRNA检测的方法是一个挑战。针对本公开，设计了两个主要的样品制备方法：低张度细胞裂解；和羧基珠捕获。在该测定法中亦可使用利用TRIzol或QIAGEN树脂技术(例如QIAGEN RNeasy Plus Mini Kit)分离的RNA。
在某些实施方案中，所述生物样品包含子宫颈细胞，特别是人子宫颈细胞。所述样品可用任何本领域已知的方法或装置来收集，所述装置包括化学惰性的收集装置如Dacron(聚对苯二甲酸乙二酯)尖拭子(tipped swab)。可使用其他可接受的收集装置，包括但不限于棉拭子、子宫颈刷(cervical brush)、絮拭子(flocked swab)(形状类似Dacron拭子的拭子，但用尼龙纤维制成，使得能够收集更多细胞，并更容易地释放细胞)、子宫颈帚(cervical broom)、迷你帚(mini broom)、灌洗(lavage)或任何常用于PAP涂片测试(Papanikolaous测试)中的收集装置。子宫颈细胞亦可为活检样本的一部分。
样品制备
使用TRIzol分离RNA，以及其他用于RNA分离的已知方法，可在本公开的方法中采用。通过细胞沉淀的低张度裂解进行的样品制备避免释放可能干扰测定法检测步骤的内源RNA:DNA杂交物，并为优选的RNA分离方法。在该样品制备方法中，将细胞通过离心沉淀，去除上清，再重悬沉淀，并将细胞裂解。在裂解之后，将细胞碎片沉淀，并收集上清(包含RNA)。降低裂解的严格性(如通过缓冲液中的盐和洗涤剂浓度所测量的)减少了从基于甲醇的子宫颈样本的汇集产生的临床背景(图5和6)。信噪比亦较高，而多个汇集之间的背景和干扰中的变异性较低。其他研究显示低张度裂解是通过细胞和环境之间的张度差异使细胞膜破裂来起作用，但细胞器保持完整。因此，细胞中的RNA从细胞释放至溶液中，而测定法的污染物(如内源RNA:DNA杂交物)会留在不可溶的细胞碎片中。该方法可用于其中样本中的RNA量有限的情况，因为增加样本的量并不导致背景的增加。
另一种样品制备方法使用可直接添加至生物样品的磁性羧基(COOH)珠。样品中的细胞通过疏水相互作用被吸引至珠。在使用磁性架(magnetic rack)沉淀珠之后，可去除上清，并裂解细胞。亦可使用非磁性COOH珠或其他吸附性颗粒，用通过磁性架沉淀来代替离心。在裂解之后(通常在65℃进行15分钟)，再次沉淀珠，并可将剩余的上清直接用于本公开的方法。尽管在该方法中减少裂解严格性仍旧减少背景，水本身并不足以从细胞释放RNA。如此，对于本公开的所有样品制备方法优选使用包含约1M硫氰酸胍和约0.7％洗涤剂的裂解缓冲液(参见，例如，图5和6)。
杂交/捕获——捕获探针
在制备样品和释放靶RNA之后，将其与至少一种多核苷酸DNA捕获探针在足以使得所述至少一种多核苷酸探针杂交于样品中的所述靶RNA的条件下相接触以形成双链核酸杂交物。所述DNA捕获探针可为全长、截短或合成的DNA。所述DNA捕获探针对于所述靶RNA具有序列特异性。理想地，DNA捕获探针为35个碱基长，并可互补于所述靶RNA的任何区。DNA捕获探针长度上可为约15至约200个碱基的范围。所述DNA捕获探针可结合于支持物。“结合”包括化学附着、共价结合和共价连接，但不限于此。多重DNA捕获探针，和多重不同DNA捕获探针可结合于相同支持物(例如，相同的磁珠)，如图3中概略显示。对于最优结果仅需要3-5个不同的捕获探针(参见图4)，从而提供了高度的灵活性以允许这些探针具有序列特异性，并不落入在一些变体中可能被剪接掉的区域。在一个实施方案中，所述序列特异性DNA捕获探针是生物素化的，并通过缀合而结合于磁性链霉亲和素珠。
在一个方面，本公开可任选地包括可用于检测高风险(HR)人乳头瘤病毒的DNA捕获探针组的用途，其中所述组包含用于HPV高风险类型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、66、73和82的多核苷酸捕获探针。
支持物包括但不限于珠、磁珠、柱、平板、滤纸、聚二甲基硅氧烷(PDMS)和浸渍片(dipstick)。可使用任何支持物，只要其允许提取液相并提供分离出结合和未结合的捕获探针或抗体的能力。磁珠是特别有用的，因为可将其留在溶液中，并且若施加磁场以使珠留在原位，则可提取或倾去液相。优选小的并具有大表面积的珠，如直径约1μm的珠。在某些实施方案中，所述支持物包括经修饰的磁珠，其由互补并特异于靶mRNA的DNA捕获探针所包被或附着。使用磁场从未结合的核糖核酸分离双链核酸/磁珠复合物。在某些实施方案中，所述支持物包括经修饰的磁珠，其中所述磁珠是通过用对于双链杂合核酸具有免疫特异性的第一抗体包被该珠来修饰的。使用磁场从未结合的核糖核酸分离核酸杂交物/抗体/磁珠复合物。亦可使用采用电荷转换(chargeswitching)或二氧化硅捕获(silica capture)(而非磁场)的其他珠。
在如上所述捕获了靶RNA或靶RNA:DNA杂交物之后，可将捕获的靶RNA或RNA:DNA杂交物与样品其他部分通过施加磁场(在磁珠的情况下)并洗去未捕获的核酸来进行分离。洗去不需要的干扰物质可用在多种温度使用的含盐和或洗涤剂的缓冲液来实现。当使用除了磁珠之外的支持物时，进行从样品其余部分分离捕获的杂交物的其他方法，包括但不限于洗涤。
杂交/捕获——扩增探针
在确保仅留存靶的洗涤步骤之后，将信号扩增DNA探针与靶mRNA杂交，其中所述信号扩增探针是互补和/或特异于所述靶mRNA的未标记的DNA探针。扩增探针无需对靶核酸具特异性。举例而言，DNA扩增探针可能可以结合除了设计的靶之外的其他核酸。设计互补于mRNA区的DNA信号扩增探针，并将其组合于会覆盖特异性基因的混合物中。通过延伸并改变覆盖，可确定何种基因存在以及RNA的具体剪接形式。“覆盖”定义为两侧为互补信号探针的靶序列的广度或长度。信号扩增探针长度大约为40个碱基，但因为其设计为围绕捕获探针，一些可多于或少于40个碱基。信号扩增探针可为约15至约200个碱基的长度。增加覆盖(即，使更多信号探针杂交于靶RNA的互补区)会导致信号的增加。因此，优选使用更多探针以获得放大的信号。检出限部分取决于靶核酸(即靶基因)的长度。
将扩增信号探针以会延及已知RNA剪接形式的基因序列的组合来添加。所述信号扩增探针的组合会确定对靶mRNA的覆盖程度，并因此确定信号输出。
将所得的信号输出与扩增探针的不同组合的比较会表明特定mRNA剪接形式变体的存在。以此方式，该方法是“分子尺”，因为信号输出取决于存在的剪接形式。举例而言，预期捕获探针3与E6/7靶mRNA，但并不与E1、E2、E4、E5、L1或L2杂交(参见，例如表3和图11)。在用捕获探针3的杂交之后使用的信号扩增探针1和6会从剪接的E6/7形式生成强信号，并从剪接的/整合的E6/7形式生成弱信号。通过改变捕获探针和扩增探针的组合和数量，信号输出提供了关于何种病毒基因得到表达的信息(例如，其比例)，以及这些基因的何种剪接形式得到表达。此种信息，与临床和实验数据组合，预期提供对于癌前子宫颈损伤的进展的较佳预测方法。
通过mRNA水平的测量进行的细胞中基因表达的表征是确定细胞是否受病原体感染，以及疾病进展状态的有用工具。
本公开提供了用于对于已知和未知的剪接形式变体确定基因转录物长度的方法。用于测量其他方式(alternatively)剪接的转录物的表达的可靠和稳健的(robust)方法是调查每种变体的重要性(significance)中的重要步骤。迄今，对于剪接变体的精确定量，如Northern印迹、RT-PCR和实时RT-PCR，由于常规方法的内在限制是艰巨而困难的。本公开提供了确定剪接形式变体的存在的方法。举例而言，早期HPV转录物(例如HPV E6*I)是否携带晚期基因序列的问题可通过将所述转录物用互补于早期区的捕获探针捕获，然后用互补于晚期区的检测探针来检测来加以确定；所得的信号可指示晚期区在早期基因转录物上的存在。此外，通过提供会覆盖预测的剪接形式序列的简并信号扩增探针的组合，可确定剪接变体的存在。此外，区的不存在可通过缺乏由选定DNA探针的捕获来指明。
所得的杂交物是使用识别RNA:DNA杂交物的分子来捕获/检测的。对于双链核酸杂交物具特异性的分子包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、蛋白质如RNAse H(但不限于此)、核酸包括但不限于适体(aptamer)或序列特异性核酸。适体为结合于特定靶分子的短寡核苷酸或肽分子。其通常通过从较大的随机序列汇集中选取它们来进行构建，尽管已知天然存在的适体(例如核转换适体(riboswitch aptamer))。
杂交/捕获——抗杂交物抗体
在一个实施方案中，特异于双链核酸杂交物的分子是抗体(“抗杂交物抗体”)。将杂交物与抗杂交物抗体温育足够量的时间以允许结合于所述双链核酸杂交物。所述抗杂交物抗体可为单克隆或多克隆的。在一个最优选的实施方案中，所述抗体是单克隆的。
在另一个实施方案中，所述第一抗体结合于支持物。在该实施方案中，在制备样品并释放RNA之后，将其与至少一种多核苷酸DNA捕获探针在足以使所述至少一种多核苷酸探针与样品中的靶RNA杂交的条件下相接触以形成双链核酸杂交物。将所述靶RNA以靶RNA:DNA捕获探针复合物的形式通过洗涤与未结合的RNA分离。在确保唯一残留的RNA是靶RNA的洗涤步骤之后，将信号扩增DNA探针与靶RNA杂交，其中所述信号扩增探针是互补于和/或特异于靶RNA的未结合的DNA探针。捕获和扩增探针与靶RNA的杂交构建了双链核酸杂交物。使用识别RNA:DNA杂交物的分子检测所得的杂交物。在一个优选的实施方案中，对于双链核酸杂交物具有特异性的分子是抗体(“抗杂交物抗体”)。将杂交物与抗杂交物抗体温育充足时间以允许结合于双链核酸杂交区。该抗杂交物抗体缀合于支持物并结合于所述RNA:DNA杂交物形成RNA:DNA杂交物:抗体复合物。将该复合物与未结合的抗体分离。在所述支持物是磁珠的应用中，使用磁场以分离出任何未结合的抗体。
检测
在去除了未结合的抗杂交物抗体之后，添加第二抗体，其中所述第二抗体用可检测标志物标记，并识别和结合于第一抗体。检测存在于所述第二抗体上的标记从而指示靶核糖核酸的存在。用于检测多种标记的方法在本领域是已知的。举例而言，比色法、放射性、表面等离振子共振(surface plasmonresonance)或化学发光方法描述于例如Coutlee等，J.CUn.Microbiol.27：1002-1007(1989)。
举例而言，与至少一个碱性磷酸酶分子缀合的抗体可用试剂如Lumi-PhosTM 530试剂(Lumigen，Detroit，MI)或DR2(Applied Biosystems，Foster City，CA)使用检测器如E/LuminaTM发光计(Source Scientific Systems，Inc.，Garden Grove，CA)，Optocomp ITM发光计(MGM Instruments，Hamden，CT)等通过化学发光来检测。如本文中所述，第二抗体上标记的检测指示样品中一种或多种互补于所述一种或多种探针的靶核糖核酸的存在。在洗涤之后，将样品悬于检测缓冲液中，其例如，包含用于第二抗体上的标记的底物。
在下述的本测定法中，可使用抗杂交物抗体和/或将其偶联于磁珠和/或将其固定于支持物。在一个优选的实施方案中，用于捕获和检测靶核酸的抗体是单克隆抗体。对于捕获和检测，第一和第二抗体可为相同的(即，由相同杂交骨髓瘤细胞系产生)或可来自不同的或由不同的杂交骨髓瘤细胞系产生。在一个最优选的实施方案中，用于捕获和/或检测的第一和第二单克隆抗体是相同的，并特异于RNA/DNA杂交物。还包括特异于双链杂交物的抗体的免疫片段或衍生物，其中此类片段或衍生物包含抗体的结合区。
举例而言，可使用从融合于用RNA:DNA杂交物免疫的脾细胞的骨髓瘤细胞来源的单克隆RNA:DNA杂交物抗体。所述杂交物特异性抗体可通过针对固定于固体支持物上的RNA:DNA杂交物进行亲和纯化来纯化，例如，如描述于Kitawaga等，MoI.Immunology，19：413(1982)；和美国专利4,732,847号，两者均通过提述并入本文。
可使用其他产生或分离抗体，包括人或人工抗体的合适方法，包括，例如，从文库选择重组抗体(例如，单链Fv或Fab，或其其他片段)的方法，或依赖于对能够产生人全套抗体的转基因动物(例如小鼠)进行免疫的方法(参见，例如，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255(1993)；和美国专利5,545,806和5,545,807号)。
还在另一个方面，本公开提供了允许在生物样品或包含核酸的样品中检测核糖核酸的试剂盒。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒包含a)缀合于磁珠的DNA捕获探针；b)DNA扩增探针；c)第一抗杂交物抗体；d)包含第二抗体的检测试剂，其中所述第二抗体结合所述第一抗体，并经可检测地标记；e)基于洗涤剂的洗涤缓冲液；和f)包含用于所述第二抗体上的标记的底物的第二检测试剂。优选的基于洗涤剂的洗涤缓冲液是40mM Tris-HCl，100mM NaCl，0.5％Triton X-100。
在某些实施方案中，本公开的检测方法通过首先将靶捕获于缀合于磁性链霉亲和素珠的互补的生物素化DNA探针上来检测RNA。该探针-珠复合物可经预缀合，并在4℃在几个月内为稳定的。该捕获步骤优选在60℃伴以持续振荡进行并允许继续约30分钟(足以允许捕获的时间)。然后洗涤具有捕获的靶的珠从而去除任何非靶RNA序列。因为杂交物捕获抗体结合于单独的DNA-RNA杂交物，优选用DNA扩增探针覆盖靶区以实现最大信号(参见图1和2)。因此，然后将其他探针与靶mRNA杂交。因为此时仅捕获了靶，这些探针无需是序列特异性的，而是可以覆盖基因的全长，除了已经由生物素化的特异性探针覆盖的区。所述信号扩增探针互补于mRNA区，并设计和组合于混合物中，覆盖特定基因。通过延伸并改变覆盖，可确定具体基因和具体剪接变体。这些“信号扩增”探针优选以4.2nM的浓度使用。该杂交亦优选在60℃在7.8左右的pH进行30分钟。在杂交之后，接着用上述讨论的杂交物捕获抗体系统进行检测(使用抗杂交物抗体和检测所述抗杂交物抗体的第二抗体)。
实施例1
通过低张度裂解细胞沉淀进行样品制备
内源杂交物对检测测定表现独特的挑战，因为其可由杂交物捕获抗体所检测。因此，样品制备优选破坏或避免释放这些杂交物。低张度裂解依赖于后一策略。在该方法中，通过离心沉淀细胞，去除上清，并裂解沉淀。如图6所示，通过改变缓冲液中盐和洗涤剂浓度降低裂解的严格性减少了由基于甲醇的子宫颈样本的汇集产生的临床背景。信噪比亦较高，而汇集之间的背景中和干扰中的变异性较低(表2)。其他研究显示低张度裂解是通过因细胞张度与环境相比的差异而使细胞膜破裂来起作用，但细胞器保持完整。因此，细胞中的RNA从细胞释放至溶液中，而对测定法的污染物如杂交物会与不可溶的细胞碎片一起保留。该方法可用于其中样本中的RNA量有限的情况，因为增加样本的量不导致背景的增加(图7)。使用将HPV阳性细胞掺入(spikeinto)阴性子宫颈样本的汇集的模型，低张度裂解继以本公开的检测方法可从仅1000个细胞检测出HPV E6/7 RNA(图8)。
实施例2
通过磁性羧基珠进行的样品制备
另一种经表征用于本公开的方法的样品制备方法使用磁性羧基修饰(COOH)珠，其可直接添加至生物样品(例如Sera-MagMagneticCarboxylate-Modified Particles；Thermo Fisher Scientific，Inc.)。在样品中的细胞通过疏水相互作用被吸引至珠。在使用磁性架以沉淀珠之后，可去除上清并裂解细胞。在裂解之后，再次沉淀珠，并转移剩余的上清以供用于本公开的方法。尽管在该方法中，降低裂解严格性亦减少背景(参见表1)，水本身不足以从细胞释放RNA。相反，优选的裂解缓冲液为约1M硫氰酸胍和约0.7％洗涤剂(参见图9)，因为其支持裂解和杂交二者。可使用更强的裂解缓冲液浓度，只需将其在杂交捕获步骤之前稀释。如图10中所示，将细胞捕获于珠上为两阶段反应。将羧基珠直接掺入基于PreservCyt的子宫颈细胞样品。在暴露的第一分钟内，在样品中所有细胞的大约50-60％被吸引至珠。该过程保持平台期至少15分钟，但是大约在添加珠之后30分钟，捕获了至少95％的细胞(如通过对残留在上清中的细胞进行计数测量，参见图10)。图11显示使用本公开的方法可仅使用大约1000个HPV阳性细胞获得结果；羧基珠细胞捕获，继以本公开的检测方法，比低张度细胞裂解继以本公开的检测方法在从细胞获得mRNA方面更为有效(参见图11)。
实施例4
内源杂交物对测定背景的作用
内源杂交物常常为临床背景噪音的来源(参见图5)。当将HPV 16 E6/7RNA掺入临床汇集时(不含HPV；KPSTM(-))，背景较高，且信号被掩蔽。然而，当在添加RNA之前变性(1.75M NaOH)并中和汇集时，背景较低，且信号恢复(is rescued)。这揭示了在使用采用识别核酸杂交物的抗体的检测方法之前，消除内源核酸杂交物或防止其释放的需要。
实施例5
裂解缓冲液浓度对背景的作用
降低裂解严格性减少临床背景噪音(参见图6)。将1mL的基于甲醇的子宫颈样本旋转沉淀(spun down)，并将沉淀重悬于多种浓度的缓冲液中(100％缓冲液＝约3M硫氰酸胍+约2％洗涤剂)，如沿x轴所示。将沉淀的细胞在65℃加热15分钟。然后根据本公开的方法，将裂解缓冲液的最终浓度对于RNA的捕获调整至32.5％。如图6中所示，背景随着裂解缓冲液浓度的减少而减少。该实验提供了细胞的低张度裂解成功地防止内源核酸杂交物释放的证据。胞质中的RNA从细胞释放，而对于测定法的污染物如杂交物留存在细胞核中。
此外，水裂解与更严格的裂解相比给出更低的背景和变异性以及更高的信噪比(参见下述表2)。表2中的值为来自四个不同的子宫颈样本临床汇集的结果的平均值。通常，这些汇集在背景方面变化极大。
实施例6
细胞沉淀的低张度裂解
图7显示细胞沉淀的低张度裂解确保背景噪音保持稳定。将不同量的子宫颈样本(250ul-10ml)旋转沉淀，用水裂解，并对其进行本公开的RNA检测测定。如图7中的图所示，背景无显著变化，与使用的样本量无关。
实施例7
检出限
测试了对于来自HPV阳性细胞(SiHa)细胞的HPV 16 E6/7RNA的检出限(参见图8)。将细胞掺入1mL的阴性子宫颈样本的汇集以对临床样品建模。在旋转沉淀并用水裂解并加热之后，将缓冲液添加至细胞(至32.5％缓冲液的浓度，或约1M硫氰酸胍和约0.7％洗涤剂)，并将其置于平板中以起始本公开的RNA检测测定。结果显示使用本公开的方法，对于HPV E6/7RNA检测需要少至1x103个细胞。
实施例8
裂解由COOH珠捕获的细胞
比较了多种裂解缓冲液裂解由COOH珠捕获的细胞的能力(参见图9)。结果显示水本身并不足以裂解由COOH珠捕获的细胞。将HPV阴性或HPV阳性细胞掺入1mL的阴性子宫颈汇集。在通过珠捕获细胞并去除上清之后，将不同浓度的缓冲液(包含硫氰酸胍和洗涤剂)添加至样品，然后将其在65℃加热15分钟。将缓冲液浓度调整至总共32.5％以供使用本公开的方法进行RNA检测。如用旋转沉淀方法所见，背景确实随着盐和洗涤剂的量的减少而减少。然而，需要至少32.5％缓冲液(总共大约1M盐和0.7％洗涤剂)以充分裂解细胞以释放RNA。
实施例9
由COOH珠进行的细胞捕获的时间过程显示细胞捕获于珠上是两阶段反应
进行了由COOH珠进行的细胞捕获的时间过程(参见图10)。将细胞掺入1mL阴性子宫颈汇集。对细胞的基线数量进行计数，并在添加COOH珠之后的每个时间点，将珠沉淀1.5分钟，然后将上清移出并稀释以供计数。在一分钟之内捕获了大约50％的细胞。捕获然后进入平台期，然而在30分钟时，捕获了至少95％的细胞。更多的珠提供了效率略高的捕获。
实施例10
羧基(COOH)珠捕获与低张度裂解相比更加有效
将1mL的阴性子宫颈样本汇集中的HPV18阳性(HeLa)细胞用COOH珠捕获或用沉淀和低张度裂解来制备。对于羧基珠捕获方法的检出限亦为大约1000个HPV阳性细胞，且反相杂交物捕获测定的结果显示该方法对于从细胞获取mRNA更加有效(参见图11)。尽管当使用COOH珠捕获时，背景略微更高(271RLU对低张度裂解的163RLU)，信噪比和信号-噪音(检测出的总RNA的量度)二者均比当使用低张度裂解时高得多。
实施例11
预处理步骤(低张度裂解)与靶RNA检测的组合
下述实验方案组合了样品预处理步骤(使用低张度细胞裂解)与本公开的RNA检测方法。以1500相对离心力(RCF)将细胞在试管中旋转沉淀3分钟。去除上清，并添加33.75μL水，并轻柔地吹吸(pipette)以重悬沉淀。然后，在65℃伴以轻柔振荡加热15分钟。接着，添加16.25μL缓冲液(约3M硫氰酸胍和约2％洗涤剂)，并将50μL样品转移至板上的孔中。然后，添加10μL具有生物素化的捕获探针的预缀合的链霉亲和素珠，并将板在60℃以1150转每分(RPM)的振荡温育30分钟。将板置于磁性架上，并使珠沉淀1.5分钟，然后倾倒(decant)并吸干(blot)板。用Sharp Wash缓冲液(1M Tris-HCl，0.6MNaCl，0.25％Tween-20)洗涤两次；第一洗涤应为2分钟而第二洗涤应为5分钟。在洗涤之后，倾倒并通过吸去来干燥板孔。向每个孔添加65μL在RNA杂交缓冲液中稀释至4.2nM的信号扩增探针。然后，将板在60℃伴以1150RPM的振荡温育30分钟。将板置于磁性架上3分钟，倾倒并干燥孔。将30μLDigene Hybrid Capture 2试剂盒Detection Reagent 1(检测试剂1)(在具有0.05％(w/v)叠氮化钠并不含RNase的缓冲溶液中的针对RNA:DNA杂交物的碱性磷酸酶缀合抗体)添加至每个孔，并将板在45℃温育30分钟。将板置于磁性架上，倾倒，并吸干。用包含40mM Tris-HCl、100mM NaCl、0.5％TritonX-100的缓冲液洗涤板5次，允许板在每次洗涤时静置1分钟。然后倾倒并干燥孔。接着，将45μL Digene Hybrid Capture 2试剂盒Detection Reagent 2(检测试剂2)(含Emerald IITM，一种化学发光底物的CDP-Star试剂)添加至每个孔。避免光线，并将板在室温伴以300RPM的振荡温育15分钟。在发光计上对板进行读数。
实施例12
预处理步骤(COOH珠捕获)与靶RNA检测的组合
下述实验方案组合了羧基珠捕获样品制备与本公开的RNA检测方法。向每个样品添加8μL羧基(COOH)珠(2mL孔板)并以800RPM在室温振荡30分钟。将板置于磁性架上2分钟以沉淀珠。用真空去除上清，并重悬于50μL32.5％缓冲液(约1M硫氰酸胍和约0.7％洗涤剂)。然后，以1000RPM在65℃振荡15分钟。将板置于磁性架上，沉淀珠，并将上清转移至新孔。然后，添加10μL具有生物素化的捕获探针的预缀合的链霉亲和素珠，并将板在60℃以1150RPM振荡温育30分钟。将板置于磁性架上，并使珠沉淀1.5分钟，然后倾倒并吸干板。用Sharp Wash缓冲液(1M Tris-HCl，0.6M NaCl，0.25％Tween-20)洗涤两次；第一洗涤应为2分钟而第二洗涤应为5分钟。在洗涤之后，倾倒并通过吸去来干燥板孔。向每个孔添加65μL在RNA杂交缓冲液中稀释至4.2nM的信号扩增探针。然后，将板在60℃伴以1150RPM的振荡温育30分钟。将板置于磁性架上3分钟，倾倒并干燥孔。将35μL DetectionReagent 1(在具有0.05％(w/v)叠氮化钠并不含RNase的缓冲溶液中的针对RNA:DNA杂交物的碱性磷酸酶缀合抗体)添加至每个孔，并将板在45℃温育30分钟。将板置于磁性架上，倾倒，并吸干。用包含40mM Tris-HCl、100mMNaCl、0.5％Triton X-100的缓冲液洗涤板5次，允许板在每次洗涤时静置1分钟。然后倾倒并干燥孔。接着，将45μL Digene Hybrid Capture 2试剂盒Detection Reagent 2(含Emerald IITM，一种化学发光底物的CDP-Star试剂)添加至每个孔。避免光线，并将板在室温伴以300RPM的振荡温育15分钟。在发光计上对板进行读数。
实施例13
链霉亲和素珠-生物素化探针缀合
下述实验方案提供了形成结合于磁珠的DNA捕获探针的方法。涡旋振荡并声处理Seradyn dsMag链霉亲和素珠(Seradyn part#3015210301050，ThermoFisher Scientific，Inc.)。将5μL珠添加至250μL珠缀合缓冲液(1x PBS；0.15MNaCl)。在磁性架上将珠拖下，并用珠缀合洗涤缓冲液(超过0.5％Tween-20)洗涤两次。将珠与45nM每种DNA捕获探针重悬于珠缀合缓冲液中。在37℃伴以1150RPM振荡温育30分钟。拖下珠并用珠缀合洗涤缓冲液洗涤三次。重悬于250μL来自Digene Hybrid Capture 2的封闭缓冲液(基于酪蛋白)以产生50x珠。
实施例14
反相杂交物捕获测定法
反相杂交物捕获通过首先将靶RNA捕获于缀合于磁性链霉亲和素珠的互补的生物素化DNA探针上来检测mRNA。可预缀合该探针-珠复合物，且其在4℃在数月内是稳定的。该捕获步骤需要30分钟，且应在60℃伴以持续振荡来进行。然后洗涤具有捕获的靶的珠从而去除任何非靶RNA序列。因为杂交物捕获抗体结合于单个DNA-RNA杂交物，优选用DNA探针(例如DNA捕获探针和扩增探针)覆盖靶RNA以实现最大信号(参见，例如图1和2)。因此，然后将其他探针杂交于靶mRNA。因为此时仅存在靶(因为非靶RNA已洗去)，这些探针无需具序列特异性，而是可覆盖基因的全长，除了已经由所述生物素化DNA探针覆盖的区。将这些“信号扩增”探针稀释至4.2nM的工作浓度。该杂交亦在60℃以7.8左右的pH进行30分钟。杂交之后接着用杂交捕获抗体系统检测：在45℃暴露于Detection Reagent 1(在具有0.05％(w/v)叠氮化钠并不含RNase的缓冲溶液中的针对RNA:DNA杂交物的碱性磷酸酶缀合抗体)30分钟，接着充分洗涤，并随后在室温添加Detection Reagent 2(含Emerald IITM，一种化学发光底物的CDP-Star试剂)15分钟。在发光计上对板进行读数。该测定法的分析后部分花费大约2小时15分钟。
实施例15
添加未标记的信号扩增探针的作用
对于仅用3或5个生物素化的DNA捕获探针而无未标记的信号探针捕获的RNA靶的信号相对较低。当在用杂交物捕获抗体和化学发光技术检测之前将未标记的探针与靶杂交时，信号显著更高。使用反相杂交物捕获测定法检测RNA。在该实验中，将可变数量的生物素化的DNA捕获探针缀合于链霉亲和素珠(参见图4)。靶为HPV16的E6/7基因。用添加或不添加信号扩增探针的每组珠进行测定(分别为一步对两步测定法)。当未添加未标记的DNA探针以供信号扩增时(一步测定法；灰色条形)，信号随着由生物素化的捕获探针提供的覆盖量而增加。然而，当添加了未标记的DNA探针以供信号扩增时(两步测定法；黑色条形)，当仅使用1、3或5个捕获探针时，信号比一步测定法中高得多。在两步测定法中，最优信号用少至3至5个捕获探针实现。
实施例16
通过分子尺方法确定的mRNA转录物长度
HPV转录物的长度可通过捕获于磁珠上并以用来延长杂交区长度的未标记的寡核苷酸检测来进行“测量”。信号输出会随着继续添加扩增信号探针而增加，直至达到最大长度，此时信号将进入平台期。对于HPV16的多种HPV转录物概略地示于图12。指定编号区1至7(图12)用于探针设计。举例而言，可从样品使用DNA捕获探针3捕获E6/7基因转录物，且信号扩增探针的组合会决定信号输出。若存在的变体形式是全长的，且扩增探针的组合覆盖转录物的全长，信号会较强。若存在的变体形式E6/7是剪接的，且使用信号探针的亚组(例如，探针1和6)，则信号输出与来自全长/未剪接的E6/7的信号相比有些弱(参见表3)。若该E6/7变体形式是剪接的和整合的，其会提供弱得多的信号(参见表3)。更强的信号指示更多数量的靶和一定疾病状态。E6/7剪接的整合变体提供了更弱的信号，并指示更少的捕获的靶，并因此指示该基因的更少表达。其亦指示不同的疾病状态。表3显示来自HPV16多个区的所列探针的组合(显示于图12)使用得到的预期信号。
再次参照图12和表3，由非剪接的转录物杂交于捕获探针#2(例如)而贡献的信号可从使用其他捕获探针生成的信号减去以确定从剪接的转录物本身产生的信号的程度。信号扩增探针的组合会决定对靶mRNA的覆盖程度，并因此决定信号输出。从扩增探针的不同组合所得的信号输出的比较会指示特定mRNA剪接形式变体的存在。以此方式，该方法为“分子尺”，因为信号输出取决于存在的剪接形式并可指示疾病状态的进展。
实施例17
升高的早期∶晚期mRNA比的检测
本公开的方法使得检测早期和晚期HPV mRNA转录物的比例成为可能，其可指示正在进展的HPV相关子宫颈疾病。所述测定法针对HPV阳性样本的背景检测出SiHa细胞(癌细胞系)高的早期∶晚期mRNA比(图14)。设计了捕获和检测DNA探针以检测HPV的早期转录物和晚期转录物。这两种测定法同时对相同样品进行，而所得信号的比例指示早期和晚期HPV转录物的比例。为了模拟包含一些癌细胞与癌前损伤的细胞混合的样本，用已知数量的SiHa细胞(如沿x轴所指示)掺入HSIL样本的汇集(高等级鳞状上皮内损伤，根据Bethesda系统进行子宫颈细胞学)，然后通过本公开的方法测定(参见，例如实施例12)。如图14所示，可针对具有低E6/7mRNA比的背景检测出具有高比例的细胞级分。
所有本说明书中引用的参考文献通过提述并入本文，有如指明每个文献专门并单独地通过提述并入本文。对于任何文献的引用是因为其在申请日之前的公开，且不应视为承认本公开无权因为发明在先将申请日改为该参考文献之前。
应理解的是，上述每种所述元件，或两个或更多个一同亦可在与上述类型不同的其他类型的方法中找到有用的应用。未经进一步分析，前述会如此完整地揭示本公开的要旨从而使得其他人可通过应用现有知识，方便地将其适用于多种应用而不忽略从现有技术角度考虑，清楚地构成所附权利要求中列出的该公开的上位和下位方面的必需特征的特征。前述实施方案仅为以举例的方式表示；本公开的范围仅由所附权利要求所限定。

Claims (45)

1.一种检测靶RNA的剪接形式的存在的非诊断方法，该方法包括：
a)提供序列对靶RNA中不落入可能被剪接掉的区域的区域特异性的至少一种DNA捕获探针，其中所述至少一种DNA捕获探针结合于支持物；
b)将靶RNA杂交至所述至少一种DNA捕获探针，得到靶RNA:DNA捕获探针复合物；
c)分离所述靶RNA:DNA捕获探针复合物；
d)提供延及已知RNA剪接形式的DNA扩增探针组合，并将所述至少一种DNA扩增探针杂交至所述靶RNA:DNA捕获探针复合物，得到靶RNA:DNA捕获/扩增探针复合物；
e)提供抗RNA:DNA杂交物抗体，并将所述靶RNA:DNA捕获/扩增探针复合物与所述抗体温育，得到靶RNA:DNA:抗体复合物；
f)检测所述抗体，其中所述检测指示所述靶RNA的存在；并
g)比较来自扩增探针的不同组合的检测结果，其中所述比较指示RNA剪接形式的存在。
2.权利要求1的方法，其中所述抗体缀合于可检测标记，且其中所述检测包括检测该标记。
3.权利要求2的方法，其中所述可检测标记选自下组：碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。
4.权利要求1的方法，其中所述检测包括提供结合于所述抗RNA:DNA杂交物抗体的第二抗体，其中所述第二抗体缀合于可检测标记，且其中所述检测进一步包括检测该标记。
5.权利要求1的方法，其中所述支持物包括磁珠。
6.权利要求5的方法，其中所述至少一种DNA捕获探针缀合于生物素分子，且其中所述支持物缀合于至少一种链霉亲和素分子。
7.权利要求1的方法，其中所述靶RNA来自病毒、细菌、分枝杆菌或疟原虫。
8.权利要求1的方法，其中所述靶RNA来自疱疹病毒科(Herpesviridae)，人免疫缺陷病毒，衣原体属的种(Chlamydia spp.)，奈瑟氏菌属的种(Neisseriaspp.)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，分枝杆菌，SARS冠状病毒，正黏液病毒科(Orthomixoviridae)或乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)。
9.权利要求1的方法，其中所述至少一种DNA捕获探针和所述DNA扩增探针长度为15至200个碱基。
10.权利要求1的方法，其中所述至少一种DNA捕获探针和所述至少一种DNA扩增探针与来自HPV高风险型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、66、73和82的RNA互补。
11.一种用于检测靶RNA的剪接形式的试剂盒，该试剂盒包含：
a)序列对靶RNA中不落入可能被剪接掉的区域的区域特异性的至少一种DNA捕获探针，结合于磁性支持物；
b)延及已知RNA剪接形式的DNA扩增探针组合；
c)抗RNA:DNA杂交物抗体；和
d)检测试剂。
12.权利要求11的试剂盒，其中所述抗RNA:DNA杂交物抗体缀合于可检测标记，且其中所述检测试剂包含所述可检测标记的底物。
13.权利要求11的试剂盒，进一步包含第二抗体，其结合于所述抗RNA:DNA杂交物抗体，其中所述第二抗体缀合于可检测标记，且其中所述检测试剂包含所述可检测标记的底物。
14.一种检测靶RNA的剪接形式的存在的非诊断方法，所述方法包括：
a)提供序列对靶RNA中不落入可能被剪接掉的区域的区域特异性的至少一种DNA捕获探针；
b)提供第一抗RNA:DNA杂交物抗体，其中所述第一抗RNA:DNA杂交物抗体结合于支持物；
c)将靶RNA杂交于所述至少一种DNA捕获探针，得到靶RNA:DNA捕获探针复合物；
d)将所述靶RNA:DNA捕获探针复合物与所述抗RNA:DNA杂交物抗体温育，得到结合的靶RNA:DNA捕获探针复合物；
e)提供延及已知RNA剪接形式的DNA扩增探针组合，并将所述至少一种DNA扩增探针杂交至所述结合的靶RNA:DNA捕获探针复合物，得到结合的靶RNA:DNA捕获/扩增探针复合物；
f)提供第二抗RNA:DNA杂交物抗体，并将所述结合的靶RNA:DNA捕获/扩增探针复合物与所述第二抗RNA:DNA杂交物抗体温育，得到结合的靶RNA:DNA:抗体复合物；
g)检测所述第二抗RNA:DNA杂交物抗体，其中所述检测指示所述靶RNA的存在；并
h)比较来自扩增探针的不同组合的检测结果，其中所述比较指示RNA剪接形式的存在。
15.权利要求14的方法，其中所述第二抗RNA:DNA杂交物抗体缀合于可检测标记，且其中所述检测包括检测该标记。
16.权利要求15的方法，其中所述可检测标记选自下组：碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。
17.权利要求14的方法，其中所述检测包括提供结合于所述第二抗RNA:DNA杂交物抗体的第三抗体，其中所述第三抗体缀合于可检测标记，且其中所述检测进一步包括检测该标记。
18.权利要求14的方法，其中所述支持物包括磁珠。
19.权利要求18的方法，其中所述第一抗RNA:DNA杂交物抗体缀合于生物素分子，且其中所述支持物缀合于至少一种链霉亲和素分子。
20.权利要求14的方法，其中所述靶RNA来自病毒、细菌、分枝杆菌或疟原虫。
21.权利要求14的方法，其中所述靶RNA来自疱疹病毒科(Herpesviridae)，人免疫缺陷病毒，衣原体属的种(Chlamydia spp.)，奈瑟氏菌属的种(Neisseria spp.)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，分枝杆菌，SARS冠状病毒，正粘液病毒科或乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)。
22.权利要求14的方法，其中所述至少一种DNA捕获探针和所述DNA扩增探针长度为15至200个碱基。
23.权利要求14的方法，其中所述至少一种DNA捕获探针和所述至少一种DNA扩增探针与来自HPV高风险型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、66、73和82的RNA互补。
24.权利要求1或权利要求14的方法，其中所述靶RNA通过下述方法提供，所述方法包括：
a)将包含含有靶RNA的细胞的生物样品与羧基珠在足以使所述细胞结合至所述羧基珠的条件下温育；
b)分离所述珠；
c)裂解附于所述分离的珠的细胞；和
d)从裂解的生物样品分离珠，其中所得的上清含有用于检测的靶RNA。
25.(1)序列对靶RNA中不落入可能被剪接掉的区域的区域特异性的至少一种DNA捕获探针和(2)延及已知RNA剪接形式的DNA扩增探针组合在制备用于检测靶RNA的剪接形式的存在的试剂盒中的用途，该检测包括：
a)提供序列对靶RNA中不落入可能被剪接掉的区域的区域特异性的至少一种DNA捕获探针，其中所述至少一种DNA捕获探针结合于支持物；
b)将靶RNA杂交至所述至少一种DNA捕获探针，得到靶RNA:DNA捕获探针复合物；
c)分离所述靶RNA:DNA捕获探针复合物；
d)提供延及已知RNA剪接形式的DNA扩增探针组合，并将所述至少一种DNA扩增探针杂交至所述靶RNA:DNA捕获探针复合物，得到靶RNA:DNA捕获/扩增探针复合物；
e)提供抗RNA:DNA杂交物抗体，并将所述靶RNA:DNA捕获/扩增探针复合物与所述抗体温育，得到靶RNA:DNA:抗体复合物；
f)检测所述抗体，其中所述检测指示所述靶RNA的存在；并
g)比较来自扩增探针的不同组合的检测结果，其中所述比较指示RNA剪接形式的存在。
26.权利要求25的用途，其中所述抗体缀合于可检测标记，且其中所述检测包括检测该标记。
27.权利要求26的用途，其中所述可检测标记选自下组：碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。
28.权利要求25的用途，其中所述检测包括提供结合于所述抗RNA:DNA杂交物抗体的第二抗体，其中所述第二抗体缀合于可检测标记，且其中所述检测进一步包括检测该标记。
29.权利要求25的用途，其中所述支持物包括磁珠。
30.权利要求29的用途，其中所述至少一种DNA捕获探针缀合于生物素分子，且其中所述支持物缀合于至少一种链霉亲和素分子。
31.权利要求25的用途，其中所述靶RNA来自病毒、细菌、分枝杆菌或疟原虫。
32.权利要求25的用途，其中所述靶RNA来自疱疹病毒科(Herpesviridae)，人免疫缺陷病毒，衣原体属的种(Chlamydia spp.)，奈瑟氏菌属的种(Neisseria spp.)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，分枝杆菌，SARS冠状病毒，正黏液病毒科(Orthomixoviridae)或乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)。
33.权利要求25的用途，其中所述至少一种DNA捕获探针和所述DNA扩增探针长度为15至200个碱基。
34.权利要求25的用途，其中所述至少一种DNA捕获探针和所述至少一种DNA扩增探针与来自HPV高风险型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、66、73和82的RNA互补。
35.(1)序列对靶RNA中不落入可能被剪接掉的区域的区域特异性的至少一种DNA捕获探针和(2)延及已知RNA剪接形式的DNA扩增探针组合在制备用于检测靶RNA的剪接形式的存在的试剂盒中的用途，所述检测包括：
a)提供序列对靶RNA中不落入可能被剪接掉的区域的区域特异性的至少一种DNA捕获探针；
b)提供第一抗RNA:DNA杂交物抗体，其中所述第一抗RNA:DNA杂交物抗体结合于支持物；
c)将靶RNA杂交于所述至少一种DNA捕获探针，得到靶RNA:DNA捕获探针复合物；
d)将所述靶RNA:DNA捕获探针复合物与所述抗RNA:DNA杂交物抗体温育，得到结合的靶RNA:DNA捕获探针复合物；
e)提供延及已知RNA剪接形式的DNA扩增探针组合，并将所述至少一种DNA扩增探针杂交至所述结合的靶RNA:DNA捕获探针复合物，得到结合的靶RNA:DNA捕获/扩增探针复合物；
f)提供第二抗RNA:DNA杂交物抗体，并将所述结合的靶RNA:DNA捕获/扩增探针复合物与所述第二抗RNA:DNA杂交物抗体温育，得到结合的靶RNA:DNA:抗体复合物；
g)检测所述第二抗RNA:DNA杂交物抗体，其中所述检测指示所述靶RNA的存在；并
h)比较来自扩增探针的不同组合的检测结果，其中所述比较指示RNA剪接形式的存在。
36.权利要求35的用途，其中所述第二抗RNA:DNA杂交物抗体缀合于可检测标记，且其中所述检测包括检测该标记。
37.权利要求36的用途，其中所述可检测标记选自下组：碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。
38.权利要求35的用途，其中所述检测包括提供结合于所述第二抗RNA:DNA杂交物抗体的第三抗体，其中所述第三抗体缀合于可检测标记，且其中所述检测进一步包括检测该标记。
39.权利要求35的用途，其中所述支持物包括磁珠。
40.权利要求39的用途，其中所述第一抗RNA:DNA杂交物抗体缀合于生物素分子，且其中所述支持物缀合于至少一种链霉亲和素分子。
41.权利要求35的用途，其中所述靶RNA来自病毒、细菌、分枝杆菌或疟原虫。
42.权利要求35的用途，其中所述靶RNA来自疱疹病毒科(Herpesviridae)，人免疫缺陷病毒，衣原体属的种(Chlamydia spp.)，奈瑟氏菌属的种(Neisseria spp.)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，分枝杆菌，SARS冠状病毒，正粘液病毒科或乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)。
43.权利要求35的用途，其中所述至少一种DNA捕获探针和所述DNA扩增探针长度为15至200个碱基。
44.权利要求35的用途，其中所述至少一种DNA捕获探针和所述至少一种DNA扩增探针与来自HPV高风险型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、66、73和82的RNA互补。
45.权利要求25或权利要求35的用途，其中所述靶RNA通过下述方法提供，所述方法包括：
a)将包含含有靶RNA的细胞的生物样品与羧基珠在足以使所述细胞结合至所述羧基珠的条件下温育；
b)分离所述珠；
c)裂解附于所述分离的珠的细胞；和
d)从裂解的生物样品分离珠，其中所得的上清含有用于检测的靶RNA。
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