CN102439143A - 用于生产脂解酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在里氏木霉中产生脂解酶的方法以及可从所述方法获得的所述脂解酶。此外，本发明涉及木霉属用于表达脂解酶的用途。

Description

用于生产脂解酶的方法
技术领域
本发明涉及用于在里氏木霉(Trichoderma reesei)中生产脂解酶的方法以及可从该方法获得的脂解酶。此外，本发明涉及木霉属(Trichoderma)用于表达脂解酶的用途。
背景技术
脂肪酶(EC 3.1.1.3)(可定义为催化酰基甘油水解的羧酸酯酶)是在生理上十分重要的酶，是与淀粉酶和蛋白酶一起的三种主要消化酶之一。它们将脂质水解为甘油和脂肪酸，但也可在酯化反应或转酯反应中起作用。
脂肪酶在若干工业加工如油脂和脂肪的加工、去污剂生产、纸加工中以及在乳酪制备和烘焙工业中有应用。
WO 98/45453公开了源于丝状真菌塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)的脂解酶(及其变体)。该酶有时候称为“脂肪酶3”WO 98/45453表征了酯酶3的若干物理化学特性。还描述了该脂解酶用于改善面包的性质的用途，特别是，用于改善面包的性质。
WO 98/45453还描述了酯酶3及其变体在塔宾曲霉中的克隆和表达。据发现，该脂解酶可在塔宾曲霉中过表达，然而该酶在塔宾曲霉中被过糖基化，这在某些情况中可降低其活性。
存在对用于在商业规模上生产酯酶3及其变体和其他脂解酶以及利用可提供高的蛋白质表达水平和产量的表达宿主的方法的需要。此外，还需要克服由于脂解酶的过糖基化而引起的酶活性降低的问题，脂解酶的过糖基化例如在其于塔宾曲霉中过表达时发生。
发明内容
出乎意料的是，发现里氏木霉是脂解酶-特别是脂肪酶3及其变体以及其他脂解酶的高效表达宿主。
因此，在本发明的第一个方面，提供了生产脂解酶的方法，该方法包括如下步骤：
(i)提供里氏木霉细胞，该细胞包含
a)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，所述脂解酶包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；和/或
b)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列；和/或
c)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含在严格条件下与如下序列杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列或它们中任一者的互补序列；以及
(ii)在允许编码所述脂解酶的所述异源核苷酸序列表达的条件下培养该细胞。
在本发明的另一个方面，本发明提供了生产脂解酶的方法，该方法包括如下步骤：
(i)用如下序列转染或转化里氏木霉细胞：
a)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，所述脂解酶包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；和/或
b)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列；和/或
c)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含在严格条件下与如下序列杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列或它们中任一者的互补序列；
(ii)在允许编码所述脂解酶的所述异源核苷酸序列表达的条件下培养该细胞。
在本发明的另一个方面，本发明提供了生产脂解酶的方法，该方法包括如下步骤：
(i)用如下序列转染或转化里氏木霉细胞：
a)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，所述脂解酶包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或与SEQID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；和/或
b)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列；和/或
c)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含在严格条件下与如下序列杂交的核苷酸序列：SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列或它们中任一者的互补序列；
(ii)在该细胞上重复步骤(i)以依序用至少一条(i)(a)、(i)(b)或(i)(c)中所定义的额外异源核苷酸序列(例如，如编码脂解酶的异源核苷酸序列，该脂解酶包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少40％序列同一性的氨基酸序列)转染或转化所述细胞；以及
(iii)在允许编码所述脂解酶的所述异源核苷酸序列表达的条件下培养该细胞。
本发明还进一步提供了可通过本发明方法获得的脂解酶。
本发明还提供了用于人消费的食品，该食品包含可通过本发明获得的所述脂解酶。
本发明还进一步提供了转化的或转染的里氏木霉细胞，该细胞包含：
a)至少一条编码脂解酶蛋白的异源核苷酸序列，该脂解酶蛋白与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少40％的序列同一性；和/或
b)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列；和/或
c)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含在严格条件下与如下序列杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO：3或SEQID NO：4或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列或它们中任一者的互补序列。
在另一个方面本发明提供了表达载体，该表达载体包含
i)至少一条核苷酸序列，该核苷酸序列：
a)编码与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少40％序列同一性的脂解酶蛋白；和/或
b)编码脂解酶并且包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列；和/或
c)编码脂解酶，其中该核苷酸序列包含在严格条件下与如下序列杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或与SEQID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列或它们中任一者的互补序列；和
ii)至少一个纤维二糖水解酶启动子，其中所述至少一条核苷酸序列处于所述至少一个纤维二糖水解酶启动子的控制下。
在本发明的另一个方面，提供了里氏木霉细胞在如下序列的表达中的用途：
a)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，所述脂解酶包含SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；和/或
b)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列；和/或
c)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含在严格条件下与如下序列杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO：3或SEQID NO：4或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列或它们中任一者的互补序列；
用于改善如下情况中的一种或多种：脂解酶的表达、脂解酶的糖基化、酶活性或产量。
出乎意料的是，我们已发现里氏木霉能够以显著高的产量产生脂解酶。
此外，我们已发现，通过本发明方法生产的脂解酶出乎意料地没有被过糖基化并因而具有良好的酶活性。
Bradner等人(Current Genetics，44：224-230，(2003))在他们寻找此前未知的脂解酶时将里氏木霉用作表达宿主生物体。在里氏木霉中克隆并表达了来自蒜青霉(Penicillium allii)的南极分离株的脂肪酶。Bradner等人推断，所描述的方法将可用于寻找潜在新的脂肪酶基因，但没有提出里氏木霉可用于蛋白质的过表达。
在另一个方面本发明提供了产生脂解酶的方法，该方法包括如下步骤：
(i)提供转化的或转染的里氏木霉细胞，该细胞包含至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列；
(ii)在允许编码所述脂解酶的所述异源核苷酸序列表达的条件下于pH 4至pH 5.5下培养该细胞；
(iii)在pH 5.5至pH 6.5下分离、纯化或浓缩培养基中的该酶。
在该方面，优选脂解酶：
a)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；和/或
b)由包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示序列或包含与SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列的核苷酸编码；和/或
c)由包含在严格条件下与如下序列杂交的核苷酸序列的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或与SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列或它们中任一者的互补序列。
具体实施方式
优选地，异源核苷酸序列可操作地连接(直接或间接连接)至启动子序列，使得该异源核苷酸序列处于启动子序列的控制下。
启动子序列可以是任何合适的启动子-例如天然与编码脂解酶的核苷酸序列相关联的启动子和/或异源启动子，例如纤维二糖水解酶1启动子序列或Tef启动子或葡萄糖淀粉酶启动子。可将衍生自stp(系列号为12/193,614的美国专利)、cbh2、egl1、egl2、gpd1基因的其他木霉启动子序列连接至脂解酶的核苷酸序列。
对于一些实施方案，编码脂解酶的核苷酸序列可包括一个或多个内含子。
对于一些实施方案，编码脂解酶的核苷酸序列是基因组序列。
对于一些实施方案，编码脂解酶的核苷酸序列是cDNA序列。
本发明的方法可包括分离和/或纯化和/或回收脂解酶的额外步骤。
对于一些实施方案，所表达的脂解酶的水平足够高而使得可利用该酶已分泌进其中的液体培养基(优选移除细胞后)或浓缩形式的液体培养基(优选移除细胞后)。
因而，在一个优选的方面，本发明的方法包括后面的分离和/或纯化和/或回收脂解酶的额外步骤。
在一个更优选的方面，本发明的方法包括后面的从该酶已分泌进其中的培养基(例如发酵液)移除细胞的额外步骤。
在一个更优选的方面，本发明的方法包括后面的从该酶已分泌进其中的培养基(例如发酵液)移除细胞；然后浓缩该培养基的额外步骤。
可通过合适的分离技术-例如合适的过滤技术和/或离心技术，从培养基移除细胞。一个具体的实例是利用超滤来制备UFC(超滤浓缩物)。
在一个实施方案中，用于培养的培养基的pH为约pH 4至约5.5，优选约pH 4。
在一个实施方案中，用于培养的培养基的pH为约pH 4。
在一个优选的实施方案中，在该酶的分离和/或纯化和/或浓缩之前，当分泌的可溶性酶达到足够水平时在发酵操作结束时提高培养基的pH。
在一个实施方案中，用于分离和/或纯化和/或浓缩该酶的培养基的pH高于pH 5.5至约pH 6.5。
因而，在一个实施方案中，用于培养的培养基的pH为约4，然后提高培养基的pH使得用于分离和/或纯化和/或浓缩该酶的培养基的pH高于pH5.5至约pH 6.5。
因而，在一个实施方案中，用于培养的培养基的pH为约4，然后提高培养基的pH使得用于分离和/或纯化和/或浓缩该酶的培养基的pH高于pH6至约pH 6.5。
在一个优选的实施方案中，用于培养的培养基的pH为约4.5，然后提高培养基的pH使得用于分离和/或纯化和/或浓缩该酶的培养基的pH为约pH 6。
优选地，里氏木霉细胞通过利用电穿孔，例如通过WO 2008/153712A2中描述的电穿孔方法，用所述核苷酸序列对其进行转化而提供，或转化有所述核苷酸序列。
在另一个实施方案中，里氏木霉细胞可通过利用基因枪转化用所述核苷酸对其进行转化而提供，或可转化有所述核苷酸序列。
合适地，在里氏木霉细胞中可存在至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列。在一些实施方案中，在里氏木霉细胞中可存在两个或更多个拷贝(即多拷贝)的所述或每一种编码根据本发明的脂解酶的异源核苷酸序列。例如，在一个实施方案中，在里氏木霉中可存在至少两条编码脂解酶的核苷酸序列。在其它实施方案中，可存在至少三条，例如四条，例如至少五条，或例如至少六条编码所述脂解酶的异源核苷酸序列。合适地，在里氏木霉细胞中可以有最多约六条，优选最多约七条，优选最多约八条，优选最多约十条编码所述脂解酶的异源核苷酸序列。在一些实施方案中，每一条异源核苷酸序列与启动子相关联或处于启动子的控制下。合适地，每一条异源核苷酸序列可具有与之相关联的独立启动子或可处于该启动子的控制下。所述启动子可以相同或者不同。
因而，在一个实施方案中，里氏木霉细胞可包含或转染有或转化有至少2条编码脂解酶的异源核苷酸序列。在另一个实施方案中，里氏木霉细胞可包含或转染有或转化有至少3条，或至少4条，或至少5条或至少6条编码脂解酶的异源核苷酸序列。在一个实施方案中，有最多约6条编码根据本发明的脂解酶的异源核苷酸序列。在一些实施方案中，可有最多约10条编码根据本发明的脂解酶的异源核苷酸序列。在一些实施方案中，每一条异源核苷酸序列与启动子相关联或处于启动子的控制下。合适地，每一条异源核苷酸序列可具有与之相关联的独立启动子或可处于该启动子的控制下。
合适地，所述(或每一条)异源核苷酸序列可包含编码信号肽的核苷酸序列，该编码所述信号肽的核苷酸序列可操作地连接至编码所述脂解酶的所述核苷酸序列。如果有多条异源核苷酸序列并且其中不止一条具有与之关联的信号序列，则该信号序列可以相同或不同。
合适地，脂解酶可包含内源或外源信号肽。当信号肽是内源的时，其意指该信号肽是当天然产生时与该脂解酶天然连接的信号肽。例如，信号肽可以是塔宾曲霉中的信号肽，该信号肽在存在于塔宾曲霉中时与脂解酶天然连接。
本文所用的术语“异源”意指在天然情况下其不会出现在里氏木霉细胞中。换句话讲，其对里氏木霉细胞而言是外来的。例如，本文所用的术语“异源核苷酸序列”意指在天然情况下该核苷酸序列不会出现在里氏木霉细胞中。换句话讲，该核苷酸序列对里氏木霉细胞而言是外来的。该术语还包括多个拷贝的天然存在的序列，照此而言额外的多拷贝将会是异源的。
在一个实施方案中，优选地，异源核苷酸序列获自或可获自微生物，特别是真菌。
在一个实施方案中，优选地，异源核苷酸序列获自或可获自曲霉属，特别是塔宾曲霉。
在本发明的另一个方面，本发明提供了生产脂解酶的方法，该方法包括如下步骤：
(i)提供里氏木霉细胞，该细胞包含
a)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，所述脂解酶包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；和/或
b)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列；和/或
c)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含在严格条件下与如下序列杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列或它们中任一者的互补序列；以及
(ii)在允许编码所述脂解酶的所述异源核苷酸序列表达的条件下培养该细胞；并且
其中所述里氏木霉细胞有至少两个编码非脂解酶的基因受抑制。
在本发明的另一个方面，本发明提供了生产脂解酶的方法，该方法包括如下步骤：
(i)用如下序列转染或转化里氏木霉细胞：
a)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，所述脂解酶包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；和/或
b)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列；和/或
c)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含在严格条件下与如下序列杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列或它们中任一者的互补序列；
(ii)在允许编码所述脂解酶的所述异源核苷酸序列表达的条件下培养该细胞；并且
其中所述里氏木霉细胞有至少两个编码非脂解酶的基因受抑制。
在本发明的另一个方面，本发明提供了生产脂解酶的方法，该方法包括如下步骤：
(i)用如下序列转染或转化里氏木霉细胞：
a)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，所述脂解酶包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或与SEQID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少30％序列同一性的氨基酸序列；和/或
b)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列；和/或
c)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含在严格条件下与如下序列杂交的核苷酸序列：SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列或它们中任一者的互补序列；
(ii)在该细胞上重复步骤(i)以依序用至少一条(i)(a)、(i)(b)或(i)(c)中所定义的额外异源核苷酸序列(例如，如编码脂解酶的异源核苷酸序列，该脂解酶包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少40％序列同一性的氨基酸序列)转染或转化所述细胞；以及
(iii)在允许编码所述脂解酶的所述异源核苷酸序列表达的条件下培养该细胞；并且
其中所述里氏木霉细胞有至少两个编码非脂解酶的基因受抑制。
本发明还进一步提供了可通过本发明方法获得的脂解酶。
本发明还提供了用于人消费的食品，该食品包含可通过本发明获得的所述脂解酶。
本发明还进一步提供了转化的或转染的里氏木霉细胞，该细胞包含：
a)至少一条编码脂解酶蛋白的异源核苷酸序列，该脂解酶蛋白与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少40％的序列同一性；和/或
b)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列；和/或
c)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含在严格条件下与如下序列杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO：3或SEQID NO：4或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列或它们中任一者的互补序列；以及
其中所述里氏木霉细胞有至少两个编码非脂解酶的基因受抑制。
优选地，至少三个编码非脂解酶的基因受抑制。
优选地，至少四个编码非脂解酶的基因受抑制。
“受抑制”意指细胞表达的相关非脂解酶的水平与非转化/转染细胞的水平不相同。在一些实施方案中，“受抑制”意指细胞不表达相关的非脂解酶。该抑制可通过本领域已知的技术(例如通过缺失)引起。
优选地，受抑制的编码非脂解酶的基因中的至少一种是纤维素酶基因。
优选地，受抑制的编码非脂解酶的基因中的至少两种是纤维素酶基因。
受抑制的编码非脂解酶的基因中的至少一种的实例是编码纤维二糖水解酶的基因(例如CBHI或CBHII)。
受抑制的编码非脂解酶的基因中的至少一种的另一个实例是编码内葡聚糖酶的基因(例如EGI和EGII)。
在一些实施方案中，本发明的里氏木霉细胞是其中编码一种或两种纤维二糖水解酶的内源基因(CBHI和CBHII)和/或编码内葡聚糖酶的内源基因(EGI和EGII)中的一种或二者缺失或被破坏的细胞。合适地，里氏木霉细胞可以是非GMM细胞或其衍生物，例如RL-P37株的衍生物。合适地，里氏木霉细胞可以是使用实施例10中列出的方法产生的RL-P37株的衍生物。
在一些实施方案中，异源核苷酸序列可编码脂解酶，该脂解酶包含与如下序列具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的氨基酸序列：SEQID NO：1或SEQ ID No.2或与SEQ ID NO：1或SEQ ID No.2相比包含一个或数个氨基酸添加、缺失或置换的序列。
在一些实施方案中，异源核苷酸序列可编码脂解酶并且包含与如下序列具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的核苷酸序列：SEQ IDNO：3或SEQ ID No.4或与SEQ ID NO：3或SEQ ID No.4相比包含一个或数个核苷酸添加、缺失或置换的序列。
优选地，异源核苷酸序列可编码脂解酶，该脂解酶包含与如下序列具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：1或SEQ ID No.2或与SEQID NO：1或SEQ ID No.2相比包含一个或数个氨基酸添加、缺失或置换的序列。
优选地，异源核苷酸序列可编码脂解酶，该脂解酶包含与如下序列具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的核苷酸序列：SEQ ID NO：3或SEQ ID No.4或与SEQID NO：3或SEQ ID No.4相比包含一个或数个核苷酸添加、缺失或置换的序列。
多种脂解酶与具有SEQ ID NO：3中所示序列的来自塔宾曲霉的脂肪酶(在本文中也称为脂肪酶3)的氨基酸序列同一性在下表1中示出。
表1-与来自塔宾曲霉的脂解酶(脂肪酶3)具有序列同一性的脂解 酶。
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本发明中使用的里氏木霉宿主细胞可以是任何里氏木霉细胞。该细胞可考虑为野生型里氏木霉细胞。里氏木霉细胞可以为编码一种或多种分泌性纤维二糖水解酶的基因(CBHI或CBHII)已从该细胞缺失或被破坏而使得它们不被表达的细胞。合适地，里氏木霉细胞可以是非遗传修饰细胞或其衍生物，例如RL-P37株的衍生物。合适地，里氏木霉细胞可以是使用实施例10中列出的方法产生的RL-P37株的衍生物。
本发明可以在发酵罐中进行，该发酵罐可包含约3升至约20升的培养基。在另一个实施方案中，本发明以10-16升，优选14升的发酵规模进行。在一个实施方案中，优选发酵以超过约12升，优选超过约14升进行。
里氏木霉宿主细胞优选适用于大规模发酵。
在优选的实施方案中，本发明在商业规模上进行。在该方面，本发明的发酵以超过约50,000升的规模，优选超过约80,000升的规模，优选以超过约200,000升的发酵规模进行。
在一个实施方案中，通过本发明的方法产生的总蛋白质超出约20g/升很多。
本发明中产生的总蛋白质中，大部分是所需的脂解酶。在一个实施方案中，通过本发明的方法产生的总分泌蛋白包含至少50％的所需脂解酶。在一个实施方案中，通过本发明的方法产生的总分泌蛋白包含至少60％的所需脂解酶。在一个实施方案中，通过本发明的方法产生的总分泌蛋白包含至少70％的所需脂解酶。在一个实施方案中，通过本发明的方法产生的总分泌蛋白包含至少80％的所需脂解酶。
合适地，本发明可包括对已针对脂解酶的产生进行了筛选的转化体的选择(优先选择所需酶的高产量者)。
在一个实施方案中，合适的是本发明可包括：第一转化步骤，其中用至少一条编码本文所定义的脂解酶的异源核苷酸序列转化里氏木霉细胞；对已针对脂解酶的产生进行了筛选的转化体的选择(优先选择所需酶的高产量者)；和用至少一条编码本文所定义的脂解酶的异源核苷酸序列进行的所选择的转化体的第二转化步骤(即再转化步骤)；随后的对已针对脂解酶的产生进行了筛选的新转化体的进一步选择(优先选择所需酶的高产量者)。
在一些实施方案中，通过本发明产生的脂解酶可能被糖基化。在一些实施方案中，脂解酶可在N32(当用SEQ ID NO：2编号时)处或在根据本发明的其他脂解酶的等同位置处被N-糖基化。该方面可赋予显著的优点，因为该酶的活性不被该酶的糖基化破坏或降低。不希望受理论的限制，但还是认为当脂解酶在其他宿主例如塔宾曲霉中产生时可见到该酶的活性降低并据认为是由于该酶在至少N242位点处过糖基化。
因为该酶的糖基化程度，特别是在N32位点的糖基化，通过本发明产生的脂解酶因而可与其他宿主如塔宾曲霉中产生的脂解酶相区别。在本发明的一些实施方案中，该酶在至少N32位点具有糖基化。
合适地，可产生具有信号肽的脂解酶。换句话讲，本发明中使用的异源核苷酸序列包含其编码信号肽的部分。
信号肽可用于引导脂解酶分泌透过特定的细胞膜。该信号肽序列对脂解酶编码序列而言可以是内源性的或外源性的。例如，该信号肽可以是对塔宾曲霉的脂解酶而言是内源性的信号肽。作为另外一种选择，该信号肽的编码序列可以是从里氏木霉的纤维二糖水解酶基因获得的(或可以从里氏木霉的纤维二糖水解酶基因获得)。
然而，可以使用能够将所表达的脂解酶引导进所选择的里氏木霉细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
当我们提及改善如下中的一者或多者时：脂解酶的表达、脂解酶的糖基化、酶活性和/或产量，这是与表达该脂解酶的常规方法相比较。例如，与其他宿主生物体(即除了里氏木霉外的宿主生物体)中的脂解酶的产生比较，在本发明中提供了改善的脂解酶的表达、脂解酶的糖基化、酶活性和/或产量。具体而言，与塔宾曲霉细胞中相同脂解酶的表达(例如，如WO98/45453中所教导的，将其以引用的方式并入本文)相比，通过本发明(即在里氏木霉细胞中产生)存在着改善的脂解酶的表达、脂解酶的糖基化、脂解酶的酶活性和/或产量。
本文所用的术语“改善的糖基化”意指，优选糖基化发生在N32处(当用SEQ ID NO：2编号时)。不希望受理论的限制，在一些情况下，在除里氏木霉外的宿主细胞中(特别是在塔宾曲霉中(如WO98/45453中所教导的))产生的脂解酶可被糖基化(或过糖基化)，特别是在N242处。因而，在除里氏木霉外的宿主细胞中并且特别是在塔宾曲霉中(如WO98/45453中所教导的)产生的脂解酶可在N32和N242两个位置处均被糖基化。然而，并且不希望受理论的限制，N242位点在SEQ ID No.2的活性位点残基其中之一(即His258)的附近。因此，据信在N242位点处的糖基化(或过糖基化)可导致该酶的活性(即脂肪酶活性)降低。本发明的脂解酶不具有降低的活性。本发明的脂解酶的糖基化可在N32位点处发生，该位点远离活性位点残基，如His258。
本文所用的术语“改善的酶活性”意指活性与塔宾曲霉天然产生的脂解酶的脂肪酶活性相同或高于该活性。
所谓酶活性，我们意指至少一种脂肪酶活性。酶活性(例如脂肪酶活性)可用下面实施例部分中列出的相关规程测量。
已出乎意料地发现，根据本发明产生的脂解酶易于从其已分泌于其中的培养基(即培养(发酵)液)分离，因为获得了高表达水平。图2示出了本发明的方法的示意图。
因而，根据本发明的一个优选的方面，本发明的方法可涉及针对在培养细胞后本发明的酶已分泌进其中的培养基的如下步骤中的一个或多个：稀释培养基(优选用水稀释)；从培养基分离出细胞；浓缩培养基(优选其中所述培养基是无细胞的)；对所述培养基(优选其中所述培养基是无细胞的)进行制粒。
在本发明的一个优选的方面，本发明的方法涉及针对在培养细胞后本发明的酶已分泌进其中的培养基的如下步骤：稀释培养基(优选用水稀释)；从培养基分离出细胞；浓缩培养基(优选其中所述培养基是无细胞的)；以及任选对所述培养基(优选其中所述培养基是无细胞的)进行制粒。
在本发明的一个优选的方面，本发明的方法涉及针对在培养细胞后本发明的酶已分泌进其中的培养基的如下步骤：稀释培养基(优选用水稀释)；从培养基分离出细胞；浓缩培养基(优选其中所述培养基是无细胞的)；以及对所述培养基(优选其中所述培养基是无细胞的)进行制粒。
在本发明的一个优选的方面，本发明的方法涉及针对在培养细胞后本发明的酶已分泌进其中的培养基的如下步骤：用水稀释培养基；从培养基分离出细胞；浓缩培养基，其中所述培养基是无细胞的；以及任选对所述培养基进行制粒，其中所述培养基是无细胞的。
在本发明的一个优选的方面，本发明的方法涉及在培养细胞后针对本发明的酶已分泌进其中的培养基的如下步骤：用水稀释培养基；从培养基分离出细胞；浓缩培养基，其中所述培养基是无细胞的；以及对所述培养基进行制粒，其中所述培养基是无细胞的。
根据本发明的另外的方面，将本发明的酶随后在一种方法中用于制备旨在用于人消费的食物或食品，所述方法包括将所述酶与合适的食物或食品成分混合。优选地，所述酶处于在培养细胞后本发明的酶已分泌进其中的培养基中。优选地，所述培养基是无细胞的(即已从该培养基分离了细胞)。优选地，对所述培养基进行浓缩。在一些实施方案中，优选对该培养基进行制粒。
优选地，该脂肪酶在发酵液中从溶液中沉淀出来。优选地，通过pH调节使该脂肪酶再次溶解。优选地，将pH调节至高于发酵液的pH的pH。
优点
除了上述优点，本发明的另一优点是使得脂解酶能进行商业规模生产。本发明的方法允许脂解酶能以高产量生产。
本发明的一个优点是，已出乎意料地发现，有可能直接从转化和筛选步骤(即比方说从微量滴定板)开始直接到大规模发酵(例如，至少14升发酵量)。出乎意料的是这是有可能的，因为筛选步骤(特别是微量滴定板结果)高度可预测大规模发酵中的良好性能。这与常规方法形成了对照，在常规方法中通常需要在烧瓶中培养菌株，然后转移至大规模发酵。这在缩短生产实践和/或简化整体程序和/或减少成本方面具有显著的优势。
本发明的一个另外的优点是与表达该脂解酶的常规方法相比其提供了脂解酶的增强的/增加的表达和/或改善的产量。例如，与其他宿主生物体(即除了里氏木霉外的宿主生物体)中的脂解酶的产生比较，在本发明中提供了脂解酶的增强的/增加的表达和/或改善的产量。具体而言，与塔宾曲霉细胞中相同脂解酶的表达(例如，如WO98/45453中所教导的，以引用的方式将其并入本文)相比，通过本发明(即在里氏木霉细胞中产生)存在着脂解酶的增加的表达和/或改善的产量。
本发明的另一个优点是根据本发明产生的脂解酶易于生产和分离和/或纯化和/或浓缩。
本发明的另一个优点是根据本发明产生的脂解酶易于再次溶解。
本发明的另一个优点是根据本发明产生的脂解酶可作为粒料使用或作为溶液使用。
脂解酶
本文所用的术语“脂解酶”意指具有三酰甘油水解活性的酶(分类为E.C.3.1.1.3)。
合适地，本发明的脂解酶可显示具有如下额外活性中的一种或多种：糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)、磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)、磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)或磷脂酶B活性(E.C.3.1.1.5)。本文所用的术语“糖脂酶活性”涵盖“半乳糖脂酶活性”。
合适地，根据本发明的脂解酶可具有如下活性中的至少一种或多种：糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)和/或磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)和/或磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)和/或磷脂酶B活性(E.C.3.1.1.5)。
分离的
在一个方面，优选地，根据本发明的脂解酶是分离的形式的。术语“分离的”意指脂解酶至少基本上不含与该脂解酶在自然界中天然相关联并且在自然界中存在的至少一种其他组分。术语“分离的”可意指脂解酶是至少基本上不含至少一种该脂解酶在其中产生的培养基中的其他组分。本发明的脂解酶可以基本上不含一种或多种污染物的形式提供，所述污染物质可能原本与该脂解酶相关联或该酶可与所述污染物质一起在里氏木霉宿主中产生。因而，例如，其可能基本上不含细胞或一种或多种潜在污染性的多肽和/或核酸分子。可通过在发酵期间或发酵后从发酵液分离出细胞使得脂解酶保留在发酵液中来分离脂解酶。可通过使发酵液接受通过真空过滤进行的细胞分离来分离脂解酶。
纯化的
在一个方面，优选地，根据本发明的脂解酶是纯化的形式的。术语“纯化的”意指给定组分以高水平存在。理想的是该组分为组合物中存在的主要组分。优选地，就所考虑的总组合物以干重/干重计来测定，其以至少约60％，或至少约65％，或至少约70％，或至少约75％，或至少约80％的水平存在。对于一些实施方案，就所考虑的总组合物以干重/干重计来测定，该量是至少约85％。
浓缩物
在一个方面，优选根据本发明的脂解酶是作为浓缩物使用。浓缩物可以是该酶已分泌进其中的培养基的浓缩形式。优选地，浓缩物可以是该酶已分泌进其中并且其中已移除细胞的培养基的浓缩形式。
核苷酸序列
本发明的范围涵盖编码具有本文所限定的特定性质和/或参数的蛋白质的核苷酸序列。
本文所用的术语“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其变体、同源物、片段和衍生物(如其部分)。核苷酸序列可为基因组起源的或合成或重组起源的，其可以是双链的或单链的而无论是代表有义链还是反义链。
与本发明有关的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。优选地，其意指DNA，更优选地，意指编码本发明的cDNA序列。
在一个优选的实施方案中，当与本发明的范围本身有关以及当为本发明的范围本身所涵盖时，核苷酸序列不包括处于其天然环境中时或其连接至也存在于其/它们的天然环境中的天然相关序列时的天然的根据本发明的核苷酸序列。为了易于指代，我们将称该优选的实施方案为“非天然核苷酸序列”。就这一点而言，术语“天然核苷酸序列”意指处于其天然环境中并且在可操作地连接至其天然与之相关联的整个启动子时的整个核苷酸序列，该启动子也处于其天然环境中。然而，本发明的范围所涵盖的氨基酸序列可在核苷酸序列在其天然生物体中表达后分离和/或纯化。优选地，然而，本发明的范围所涵盖的氨基酸序列可由核苷酸序列在其天然生物体中表达，但其中该核苷酸序列不处于在该生物体中其天然与之相关联的启动子的控制之下。
通常，本发明的范围所涵盖的核苷酸序列用重组DNA技术制备(即重组DNA)。然而，在本发明的备选实施方案中，核苷酸序列可用本领域所熟知的化学方法整体或分部分地合成(参见Caruthers MH等人，(1980)NucAcids Res Symp Ser 215-23和Horn T等人，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser225-232)。
核苷酸序列的制备
编码具有本文所定义的特定性质的蛋白质或适于修饰的蛋白质的核苷酸序列可从产生所述蛋白质的任何细胞或生物体鉴别和/或分离和/或纯化。多种方法是核苷酸序列鉴别和/或分离和/或纯化领域所熟知的。举个例子，一旦已鉴别和/或分离和/或纯化合适的序列后即可使用PCR扩增技术来制备更多条序列。
举另一个例子，可用来自产生酶的生物体的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果该酶的氨基酸序列是已知的话，可合成标记寡核苷酸探针并用于从该由生物体制备的基因组文库鉴别酶编码克隆。作为另外一种选择，可将含有与另一已知酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针用于鉴别酶编码克隆。在后一种情况中，使用较低严格性的杂交和洗涤条件。
作为另外一种选择，酶编码克隆可通过这样来鉴别：将基因组DNA的片段插入表达载体(如质粒)中，用所得的基因组DNA文库转染酶阴性细菌，然后将转化细菌接种于含有酶底物(即麦芽糖)的琼脂板上，从而使得表达该酶的克隆能被鉴别。
在又一个备选方案中，编码该酶的核苷酸序列可通过确立的标准方法，例如由Beucage S.L.等人(1981)Tetrahedron Letters 22，第1859-1869页描述的亚磷酰胺方法，或由Matthes等人(1984)EMBO J.3，第801-805页描述的方法合成制备。在亚磷酰胺方法中，寡核苷酸例如在自动DNA合成仪中合成，将其纯化、退火、连接并克隆进适当的载体中。
核苷酸序列可以为混合的基因组和合成起源、混合的合成和cDNA起源或混合的基因组和cDNA起源，根据标准技术通过连接合成、基因组或cDNA起源的片段制备(视情况而定)。每一连接的片段对应整个核苷酸序列的各个部分。DNA序列还可使用特定引物通过聚合酶链反应(PCR)制备，例如如US 4,683,202或Saiki R K等人(Science(1988)239，第487-491页)中所述。
氨基酸序列
本发明的范围还涵盖具有本文所限定的特定性质的酶的氨基酸序列。
如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”是同义的。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”是同义的。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”是同义的。
氨基酸序列可从合适的来源制备/分离，或者其可通过合成制备或者其可通过利用重组DNA技术制备。
本发明中所涵盖的蛋白质可与其他蛋白质，特别是酶结合使用。因而，本发明还涵盖蛋白质的组合，其中该组合包含本发明的蛋白质/酶和其他蛋白质/酶，所述其他蛋白质/酶可以是根据本发明的其他蛋白质/酶。该方面在后面的部分中进行论述。
优选地，当与本发明的本身范围有关或当为本发明的本身范围所涵盖时氨基酸序列不是天然的酶。就这一点而言，术语“天然的酶”意指处于其天然环境中并且在其已由其天然核苷酸序列表达时的整个酶。
序列同一性或序列同源性
本发明还涵盖与具有本文所限定的特定性质的多肽的氨基酸序列具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列或编码这种多肽的任何核苷酸序列(下文称为“同源序列”)的用途。在此，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可等同于“同一性”。
该同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应该提供和/或编码保留该酶的功能活性和/或增强该酶的活性的多肽。
在该语境中，同源序列被认为包括可与主题序列具有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％或90％同一性，优选至少95％或98％同一性的氨基酸序列。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等等。尽管同源性可以以相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)考虑，但在本发明的语境中优选以序列同一性表达同源性。
在该语境中，同源序列被认为包括可与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)具有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％或90％同一性，优选至少95％或98％同一性的核苷酸序列。通常，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性可以以相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)考虑，但在本发明的语境中优选以序列同一性表达同源性。
同源性比较可通过眼，或更通常地，借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些市售的计算机程序可计算两条或更多条序列之间的％同源性。
％同源性可在连续的序列上计算，即将一条序列与另一条序列进行比对，并将一条序列中的每个氨基酸与另一条序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称为“不产生空位的”比对。通常，这种不产生空位的比对仅在相对较短数目的残基上进行。
尽管这是十分简单和可靠的方法，但其不能考虑，例如，在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而在进行全局比对时可能会导致％同源性有大的降低。因此，大多数序列比较方法被设计可产生最佳的比对，该最佳比对考虑可能的插入和缺失而不会罚掉过多的整体同源性分数。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。
然而，这些更复杂的方法给比对中出现的每一个空位赋给“空位罚分”以使得，对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少的空位的序列比对(反映两条比较序列之间相关性较高)将获得比具有许多空位的序列比对更高的分数。通常使用“仿射空位成本(Affine gap cost)”，其对空位的存在产生相对较高的成本，对空位中每一个后续的残基产生较少的罚分。这是最通常使用的空位打分系统。高的空位罚分将当然会产生具有较少空位的最佳比对。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。
最大％同源性的计算因而首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。适用于进行这种比对的计算机程序是Vector NTI AdvanceTM 11(Invitrogen Corp.)。可进行序列比较的软件的实例包括但不限于例如BLAST软件包(参见Ausubel等人，1999 Short Protocols in Molecular Biology，第4版-第18章)、BLAST 2(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)：187-8)和FASTA(Altschul等人，1990 J.Mol.Biol.403-410)以及AlignX。至少BLAST、BLAST 2和FASTA可用于离线和在线搜索(参见Ausubel等人，1999，第7-58至7-60页)。
尽管最终的％同源性可以同一性测量，但比对过程本身通常不是基于要么全有要么全无的成对比较。相反，通常使用标度相似性打分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离给每一成对比较赋给分值。通常使用的这种矩阵的实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(对于进一步的细节请参见用户手册)。对于某些应用，优选使用Vector NTI AdvanceTM 11程序包的默认值。
作为另外一种选择，百分比同一性可用Vector NTI AdvanceTM 11(Invitrogen Corp.)中的多比对功能，基于类似于CLUSTAL(Higgins DG &Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244)的算法计算。
一旦该软件产生了最佳比对，则有可能计算％同源性，优选％序列同一性。作为序列比较的一部分该软件通常进行这些计算，并产生数值结果。
当测定序列同一性时应该使用空位罚分，然后优选地将如下参数用于双序列比对：
 对于BLAST
 空位开放(GAP OPEN)  0
 空位延伸(GAP EXTENSION)  0
 对于CLUSTAL   DNA   蛋白质
 字长(WORD SIZE)   2   1   K triple
 空位罚分   15   10
 空位延伸   6.66   0.1
在一个实施方案中，可使用采用上面限定的空位罚分和空位延伸设定的CLUSTAL。
合适地，关于核苷酸序列的同一性程度是在至少20个连续核苷酸上，优选在至少30个连续核苷酸上，优选在至少40个连续核苷酸上，优选在50个连续核苷酸上，优选在至少60个连续核苷酸上，优选在至少100个连续核苷酸测定。
合适地，关于核苷酸序列的同一性程度可在整个序列上测定。
变体/同源物/衍生物
本发明还涵盖蛋白质的任何氨基酸序列或编码这种蛋白质的任何核苷酸序列的变体、同源物和衍生物。
在此，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可等同于“同一性”。
在该语境中，同源序列被认为包括可与主题序列具有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％同一性，优选至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等等。尽管同源性可以以相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)考虑，但在本发明的语境中优选以序列同一性表达同源性。
在该语境中，同源序列被认为包括可与编码本发明的酶的核苷酸序列(主题序列)具有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％同一性，优选至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。通常，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等等的序列。尽管同源性可以以相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)考虑，但在本发明的语境中优选以序列同一性表达同源性。
同源性比较可通过眼，或更通常地，借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些市售的计算机程序可计算两条或更多条序列之间的％同源性。
％同源性可在连续的序列上计算，即将一条序列与另一条序列进行比对，并将一条序列中的每个氨基酸与另一条序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称为“不产生空位的”比对。通常，这种不产生空位的比对仅在相对较短数目的残基上进行。
尽管这是十分简单和可靠的方法，但其不能考虑，例如，在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而在进行全局比对时可能导致％同源性有大的降低。因此，大多数序列比较方法被设计产生最佳的比对，该最佳比对考虑可能的插入和缺失而不会罚掉过多的整体同源性分数。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。
然而，这些更复杂的方法给比对中出现的每一个空位赋给“空位罚分”而使得，对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对(反映两条比较序列之间相关性较高)将获得比具有许多空位的序列比对更高的分数。通常使用“仿射空位成本”，其对空位的存在产生相对较高的成本，对空位中每一个后续的残基产生较少的罚分。这是最通常使用的空位打分系统。高的空位罚分将当然会产生具有较少空位的最佳比对。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit程序包时，对于氨基酸序列的默认空位罚分为：空位-12，每个空位延伸-4。
最大％同源性的计算因而首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。适用于进行这种比对的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(Devereux等人1984 Nuc.Acids Research 12第387页)。可进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel等人，1999Short Protocols in Molecular Biology，第4版-第18章)、FASTA(Altschul等人，1990 J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比较工具包。BLAST和FASTA二者均可用于离线或在线搜索(参见Ausubel等人，1999，ShortProtocols in Molecular Biology，第7-58至7-60页)。然而，对于某些应用，优选使用GCG Bestfit程序。一种称为BLAST 2 Sequences的新工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)：187-8和tatianancbi.nlm.nih.gov)。
尽管最终的％同源性可以以同一性测量，但比对过程本身通常不是基于要么全有要么全无的成对比较。相反，通常使用标度相似性打分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离给每一成对比较赋给分值。通常使用的这种矩阵的实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(对于进一步的细节请参见手册)。对于某些应用，优选使用GCG软件包的公用默认值，或者在其他软件的情形中，使用默认矩阵，如BLOSUM62。
作为另外一种选择，百分比同源性可用DNASISTM(Hitachi Software)中的多比对功能，基于类似于CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM(1988)，Gene73(1)，237-244)的算法计算。
一旦该软件产生了最佳比对，则有可能计算％同源性，优选％序列同一性。作为序列比较的一部分该软件通常进行这些计算，并产生数值结果。
序列还可具有氨基酸残基的插入或置换，该插入或置换产生了沉默改变和导致功能等价的物质。可基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性作出有意的氨基酸置换，只要该物质的二级结合活性得以保留。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似疏水性值的有不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
可例如根据下表进行保守置换。第二列同一区组中的氨基酸，优选第三列同一行中的氨基酸可彼此置换：
Figure BPA00001448067000261
Figure BPA00001448067000271
本发明还涵盖可能发生的同源置换(置换和取代二者在本文中均用于意指现有的氨基酸残基与备选残基的互换)，即对等置换，如碱性的置换碱性的，酸性的置换酸性的，极性的置换极性的等等。非同源置换也可以发生，即从一类残基置换为另一类，或者作为另外一种选择涉及包括非天然的氨基酸如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶基丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。
取代还可通过非天然氨基酸来进行，包括α*和α-二取代的*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化物衍生物(如三氟酪氨酸*、对Cl-苯丙氨酸*、对Br-苯丙氨酸*、对I-苯丙氨酸*)、L-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸*、L--氨基丁酸*、L--氨基丁酸*、L--氨基异丁酸*、L--氨基己酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜*、L-正亮氨酸*、L-正缬氨酸*、对硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟脯氨酸#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物(如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*)、L-Phe(4-氨基)#、L-Tyr(甲基)*、L-Phe(4-异丙基)*、L-Tic(1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸和L-Phe(4-苄基)*。为了上面论述的目的(与同源性或非同源性置换有关)，符号*用于指衍生物的疏水性质，而#用于指衍生物的亲水性质，#*指两亲特性。
变体氨基酸序列可包括可在序列的任何两个氨基酸残基之间插入的合适的间隔基团，这些间隔基团除了氨基酸间隔物如甘氨酸或丙氨酸残基外还包括烷基基团如甲基、乙基或丙基基团。变异的另一种形式(涉及存在类肽(peptoid)形式的一个或多个氨基酸残基)将是本领域技术人员十分了解的。为了避免疑惑，“类肽”用于指其中-碳取代基处于残基的氮原子而不是-碳上的变体氨基酸残基。用于制备类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ等人，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，TrendsBiotechnol.(1995)13(4)，132-134。
用于本发明的核苷酸序列可在它们中包括合成的或修饰的核苷酸。对寡核苷酸的多种不同类型的修饰是本领域已知的。这包括膦酸甲酯(methylphosphonate)和硫代磷酸酯(phosphorothioate)主链和/或在分子的3′和/或5′端添加吖啶或多聚赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解本文所描述的核苷酸序列可通过本领域可用的任何方法修饰。可进行这种修饰以便增强本发明的核苷酸序列的体内活性或寿命。
本发明还涵盖与本发明给出的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的核苷酸序列的用途。如果序列与其片段互补，则该序列可用作探针来鉴别其他生物体中的相似编码序列等等。
不与本发明的序列100％同源但处于本发明的范围之内的多核苷酸可以以多种方式获得。本文描述的序列的其他变体可例如通过用探针探测(probing)从一系列个体，例如来自不同种群的个体制备的DNA文库来获得。此外，可获得其他同源物并且这种同源物及其片段一般将能够选择性杂交至本文所列序列中所示的序列。这种序列可通过这样获得：从其他动物物种制备cDNA文库或基因组DNA文库，在中等至高严格性条件下用包含随附序列表中的任一条的全部或部分的探针，探测这些文库。可应用类似的考虑来获得本发明的多肽或核苷酸序列的种同源物和等位基因变体。
变体和株系/物种同源物还可用简并PCR获得，简并PCR将使用这样一种引物，该引物设计用于靶向变体和同源物内编码本发明序列内的保守氨基酸序列的序列。保守序列可例如通过将来自几种变体/同源物的氨基酸序列进行比对来预测。序列比对可用本领域已知的计算机软件来进行。例如，广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。
简并PCR中使用的引物将含有一个或多个简并位置并将在比从已知序列用单序列引物克隆序列所用的严格性条件低的严格性条件下使用。
作为另外一种选择，这种多核苷酸可通过对已表征的序列进行定点诱变来获得。在例如需要沉默密码子序列改变来优化多核苷酸序列在其中表达的特定宿主细胞的密码子偏好的情形中这可能是有用的。其他序列改变可能是期望的以便引入限制性酶识别位点，或以改变多核苷酸编码的多肽的性质或功能。
本发明的多核苷酸(核苷酸序列)可用于产生引物(例如PCR引物)、备选的扩增反应的引物、探针(例如用放射性或非放射性标记通过常规手段标记有显示标记的探针)，或者可将该多核苷酸克隆进载体中。这种引物、探针和其他片段将长为至少15个，优选至少20个，例如至少25个、30个或40个核苷酸，并且也为本文所用的术语本发明的多核苷酸所涵盖。
根据本发明的多核苷酸如DNA多核苷酸和探针可重组产生、合成产生或通过本领域技术人员可用的任何手段产生。它们还可以通过标准技术克隆。
通常，引物将通过合成手段产生，涉及所需核酸序列的逐步制备，一次一个核苷酸。利用自动化技术完成该过程的技术是本领域容易获得的。
较长的多核苷酸将通常用重组手段产生，例如用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。引物可被设计为含有合适的限制性酶识别位点使得可将扩增的DNA克隆进合适的克隆载体中。
杂交
本发明还涵盖与本发明的核酸序列互补的序列或能够杂交至本发明的序列或杂交至与之互补的序列的序列。
本文所用的术语“杂交”应包括“一条核酸链与互补链通过碱基配对接合的过程”以及在聚合酶链反应(PCR)技术中所进行的扩增过程。
本发明还涵盖能杂交至与本文给出的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的序列的核苷酸序列的用途。
术语“变体”还涵盖与能够杂交至本文给出的核苷酸序列的序列互补的序列。
优选地，术语“变体”涵盖这样的序列，该序列与能够在严格条件(例如，50℃和0.2xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH 7.0})下杂交至本文给出的核苷酸序列的序列互补。
更优选地，术语“变体”涵盖这样的序列，该序列与能够在高严格条件(例如，65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH7.0})下杂交至本文给出的核苷酸序列的序列互补。
本发明还涉及可杂交至本发明的核苷酸序列(包括本文给出的那些序列的互补序列)的核苷酸序列。
本发明还涉及这样的核苷酸序列，该核苷酸序列与可杂交至本发明的核苷酸序列(包括本文给出的那些序列的互补序列)的核苷酸序列互补。
还包括在本发明范围内的是这样的多核苷酸序列，该多核苷酸序列在中等至最高严格性条件下能够杂交至本文给出的核苷酸序列。
在一个优选的方面，本发明涵盖可在严格条件(例如50℃和0.2xSSC)下，杂交至本发明的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列。
在一个更优选的方面，本发明涵盖可在高严格条件(例如65℃和0.1xSSC)下，杂交至本发明的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列。
分子进化
作为一个非限制性实例，有可能在体内或体外在核苷酸序列中产生多个定点突变或随机突变，并随后通过多种手段针对所编码的多肽的功能性改善进行筛选。
另外，多核苷酸序列的突变或天然变体可与野生型或其他突变或天然变体重组而产生新的变体。也可以针对所编码的多肽的功能性改善对这种新的变体进行筛选。新的优选变体的产生可通过多种本领域十分确立的方法来实现，例如错误阈值诱变(Error Threshold Mutagenesis)(WO 92/18645)、寡核苷酸介导的随机诱变(US 5,723,323)、DNA改组(shuffling)(US 5,605,793)、外切核酸酶介导的基因拼装(exo-mediated gene assembly)(WO00/58517)。这些和类似随机定向分子进化方法的应用使得能在先前对蛋白质结构或功能没有任何了解的情况下鉴别和选择本发明的酶的具有优选特性的变体，以及使得能产生不可预测的但有利的突变或变体。在本领域中有许多应用分子进化用于优化或改变酶活性的实例，这些实例包括但不限于如下中的一者或多者：
优化宿主细胞中或体外的表达和/或活性，
增加酶活性，改变底物和/或产物特异性，
增加或降低酶或结构稳定性，改变在优选的环境条件(例如温度、pH、底物)下的酶活性/特异性。
定点诱变
一旦已分离了蛋白质编码核苷酸序列，或者已鉴别了推定的蛋白质编码核苷酸序列，可能有利的是使该序列突变以便制备本发明的蛋白质。
可用合成的寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸含有所需突变位点旁侧的核苷酸序列。
一种合适的方法在Morinaga等人(Biotechnology(1984)2，第646-649页)中公开。向酶编码核苷酸序列引入突变的另一种方法在Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，第147-151页)中有描述。
重组体
在一个方面，用于本发明的序列是重组序列，即用重组DNA技术制备的序列。
这些重组DNA技术是在本发明一般技术人员的能力之内。这些技术在例如如下文献中进行了解释：J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，第1-3册，Cold SpringHarbor Laboratory Press。
合成
在一个方面，用于本发明的序列是合成序列，即通过体外化学或酶合成制备的序列。其包括但不限于经制备具有宿主生物体里氏木霉最佳的密码子选择的序列。
酶的表达
可将用于本发明的核苷酸序列掺入重组体复制型载体中。该载体可用于在相容宿主细胞中和/或从相容宿主细胞复制和表达核苷酸序列(以蛋白质形式)。
可用控制序列，例如调控序列控制表达。
由宿主重组细胞通过表达核苷酸序列产生的蛋白质可被分泌或者可包含在细胞内，这取决于所使用的序列和/或载体。编码序列可被设计具有信号序列，该信号序列引导编码该物质的序列分泌透过特定的原核或真核细胞膜。
表达载体
术语“表达载体”意指能体内或体外表达的构建体。
优选地，将表达载体掺入合适的宿主生物体的基因组中。术语“掺入”优选涵盖稳定的掺入基因组中。
本发明的核苷酸序列可存在于载体中，在该载体中该核苷酸序列可操作地连接至调控序列，该调控序列能够提供由合适的宿主生物体表达该核苷酸序列。
可将用于本发明的载体转化进如下文所述的合适宿主细胞中以提供本发明的多肽的表达。
载体(例如质粒、粘粒或噬菌体载体)的选择将通常取决于待将其引入的宿主细胞。
用于本发明的载体可含有一种或多种选择性标记基因-如赋予抗生素抗性，例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。作为另外一种选择，该选择可通过共转化来完成(如WO91/17243中所描述的)。
载体可体外用于例如产生RNA，或用于转染、转化、转导或感染宿主细胞。
因而，在一个进一步的实施方案中，本发明提供了通过如下步骤制备本发明的核苷酸序列的方法：将本发明的核苷酸序列引入复制型载体中，将该载体引入相容的宿主细胞，并在引起该载体复制的条件下培养该宿主细胞。
该载体可另外包含使得该载体能在所考虑的宿主细胞中复制的核苷酸序列。这种序列的实例为质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起始区。
调控序列
在一些应用中，用于本发明的核苷酸序列可操作地连接至调控序列，该调控序列能够提供核苷酸序列的表达，例如通过所选择的宿主细胞表达。举个例子，本发明涵盖包含可操作地连接至这样一种调控序列的本发明核苷酸序列的载体，即该载体是表达载体。
术语“可操作地连接”指毗邻，其中所描述的元件处于使得它们能以其预期的方式发挥功能的关系。调控序列“可操作地连接”至编码序列是以使得该编码序列的表达能在与该控制序列相容的条件下实现的方式连接。
术语“调控序列”包括启动子和增强子以及其他表达调节信号。
术语“启动子”是以本领域的标准意义使用，例如RNA聚合酶结合位点。
编码本发明的酶的核苷酸序列的增强表达也可以通过选择异源调控区(例如，启动子、分泌引导区和终止子区)来实现。
优选地，根据本发明的核苷酸序列可操作地连接至至少一个启动子。
其他启动子还可用于引导本发明的多肽的表达。
适用于引导核苷酸序列在细菌、真菌或酵母宿主中转录的启动子的实例是本领域所熟知的。
在一个实施方案中，合适的启动子可以是纤维二糖水解酶启动子。
在一个实施方案中，合适的启动子可能是可以从里氏木霉获得(或是从里氏木霉获得的)纤维二糖水解酶启动子。
启动子可额外包括用于确保或用于增加在合适宿主中的表达的特征物。例如，该特征物可以是保守区如转录因子结合位点或缺失的阻遏蛋白结合位点。
构建体
术语“构建体”(其与诸如“结合物”、“盒”和“杂交体”之类的术语同义)包括直接或间接连接至启动子的用于根据本发明的用途的核苷酸序列。
间接连接的实例是在启动子和本发明的核苷酸序列中间提供合适的间隔基团如内含子序列，例如Sh1-内含子或ADH内含子。与本发明相关的术语“融合的”同样如此，其包括直接或间接连接。在一些情况下，该术语不涵盖这样的编码蛋白质的核苷酸序列的天然重组：通常与野生型基因启动子相关联并且当它们二者均处于其天然环境中时。
该构建体可甚至还含有或表达标志物，该标志物允许对该遗传构建体进行选择。
对于某些应用，优选地本发明的构建体至少包含可操作地连接至启动子的本发明的核苷酸序列。
宿主细胞
与本发明有关的术语“宿主细胞”包括包含所述核苷酸序列或上述表达载体并且用于重组产生具有本文所限定的特定性质的蛋白质的任何里氏木霉细胞。
因而，本发明的一个进一步的实施方案提供转化或转染有可表达本发明的蛋白质的核苷酸序列的里氏木霉宿主细胞。
里氏木霉宿主细胞的使用可提供翻译后修饰(例如豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸的磷酸化)，这些可能需要用于给本发明的重组表达产物赋予最佳的生物活性。
生物体
与本发明有关的术语“生物体”包括里氏木霉，该里氏木霉包含编码根据本发明的多肽的核苷酸序列和/或从其获得的产物，和/或其中启动子可允许根据本发明的核苷酸序列在存在于该生物体中时表达。
合适的生物体是里氏木霉。
与本发明有关的术语“转基因生物体”包括里氏木霉，该里氏木霉包含编码根据本发明的多肽的核苷酸序列和/或从其获得的产物，和/或其中启动子可允许根据本发明的核苷酸序列在该生物体内表达。优选地，所述核苷酸序列掺入生物体的基因组中。
术语“转基因生物体”不涵盖处于其天然环境中且当它们处于它们的天然启动子(也处于其天然环境中)的控制之下时的天然核苷酸编码序列。
因而，本发明的转基因生物体包括包含如下中的任一者或如下的组合的生物体：编码根据本发明的多肽的核苷酸序列、根据本发明的构建体、根据本发明的载体、根据本发明的质粒、根据本发明的细胞、根据本发明的组织或它们的产物。
例如，转基因生物体可还包含处于异源启动子的控制下的编码本发明的多肽的核苷酸序列。
宿主细胞/生物体的转化
可用本领域已知的多种方法转化丝状真菌细胞，例如涉及原生质体形成和原生质体转化以及随后的以已知的方式再生细胞壁的方法。
关于真菌转化的一般技术在下面的部分中给出。
转化的真菌
宿主生物体为里氏木霉等等。
转化丝状真菌在US-A-5741665中进行了论述，其声称用于转化丝状真菌和培养真菌的标准技术是本领域所熟知的。关于应用于粗糙链孢霉(N.crassa)的技术的详尽综述可见于例如Davis和de Serres，Methods Enzymol(1971)17A：79-143中。
还可用于转化丝状真菌的另外的技术在US-A-5674707中进行了综述。
此外，Punt等人(2002)Trends Biotechnol 2002年五月；20(5)：200-6、Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997)17(4)：273-306中教导了在丝状真菌中的基因表达。
本发明涵盖了通过使用这些标准技术制备的根据本发明的转基因丝状真菌的生产。
培养和生产
可将转化有本发明的核苷酸序列的里氏木霉宿主细胞在有利于产生所编码的多肽并且便于从细胞和/或培养基回收所述多肽的条件下培养。
在一个实施方案中，将根据本发明提供的转化的或转染的里氏木霉细胞在选择条件下培养，以允许对转化或转染有本文所定义的脂解酶的细胞分泌。
用于培育细胞的培养基可以是适于培养所考虑的宿主细胞和获得所述多肽的表达的任何常规培养基。
由重组细胞产生的蛋白质可呈现在细胞的表面。
该蛋白质可从宿主细胞分泌并且可方便地用熟知的工序从培养基回收。
分泌
通常，期望蛋白质从表达宿主分泌进培养基中，从培养基可更容易回收蛋白质。根据本发明，可根据所需的表达宿主选择分泌引导序列。杂交体信号序列也可用于本发明的该方面。
异源分泌引导序列的典型实例是衍生自真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因(glaA-18个氨基酸和24个氨基酸的形式二者，例如来自曲霉属)、a因子基因(酵母例如糖酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和汉森酵母属(Hansenula))或-淀粉酶基因(芽孢杆菌属(Bacillus))的那些。
在一个实施方案中，优选地，信号肽为在图15中在SEQ ID NO：1中以粗体显示的序列。在一个实施方案中，在图15中以粗体示出的信号肽在翻译后被切除而提供具有SEQ ID NO：2中所示的序列的肽。
检测
多种用于检测和测量氨基酸序列的表达的规程是本领域已知的。实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。
很多标签和缀合技术是本领域技术人员已知的并且可用于多种核酸和氨基酸测定法。
多个公司如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)提供商业试剂盒和用于这些程序的方案。
合适的报告分子或标签包括那些放射性核素、酶、荧光剂、化学发光剂或显色剂以及底物、辅因子、抑制剂、磁性粒子等等。教导这类标签的使用的专利包括US-A-3,817,837；US-A-3,850,752；US-A-3,939,350；US-A-3,996,345；US-A-4,277,437；US-A-4,275,149和US-A-4,366,241。
另外，也可如US-A-4,816,567中所示制备重组免疫球蛋白。
融合蛋白
供根据本发明的用途的氨基酸序列可作为融合蛋白产生，例如，用以帮助提取和纯化。融合蛋白伴侣的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)和(-半乳醣苷酶)。还可能便利的是在融合蛋白伴侣和所关注的蛋白质序列之间包括蛋白水解裂解位点，以使得能移除融合蛋白序列。
优选地，融合蛋白将不会妨碍蛋白质序列的活性。
另外的关注蛋白
供根据本发明的用途的序列还可与一种或多种另外的关注蛋白(POI)或关注核苷酸序列(NOI)一起使用。
POI的非限制性实例包括：涉及淀粉代谢的蛋白质或酶，涉及糖原的蛋白质或酶，乙酰酯酶、氨基肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、表异构酶、酯酶、-半乳醣苷酶、-半乳醣苷酶、-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、-葡萄糖苷酶、-葡萄糖苷酶、葡糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、磷脂酶、半乳糖脂酶、脂酰转移酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲基酯酶、果胶分解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(D-己糖：O2-氧化还原酶，EC1.1.3.5)或它们的组合。NOI可以甚至是那些序列任一者的反义序列。
POI可以甚至是融合蛋白，例如，用以帮助提取和纯化。
POI可甚至融合至分泌序列。
其他序列还可有利于分泌或增加分泌的POI的产量。这些序列可编码侣伴蛋白，作为例如英国专利申请9821198.0的黑曲霉cyp B基因的产物。
因为多种原因，可对NOI进行工程改造以便改变它们的活性，这些原因包括但不限于可修饰NOI的表达产物的加工和/或表达的改变。举个例子，还可修饰NOI以优化在特定宿主细胞中的表达。其他序列变化可能是所需的以便引入限制性内切酶识别位点。
NOI可在其中包括合成的或经修饰的核苷酸-例如膦酸甲酯和硫代磷酸酯主链。
可修饰NOI以增加细胞内稳定性和半衰期。可能的修饰包括但不限于：添加分子的5′和/或3′端的旁侧序列或在分子的主链内使用硫代磷酸酯或2′O-甲基而不是磷酸二酯酶键。
大规模生产/应用
在本发明的一个优选的实施方案中，将脂解酶用于大规模应用和/或以大规模生产。
术语大规模意指在至少1000升的发酵罐或培养条件下。
优选地，在培养宿主生物体后脂解酶以至少5g/升总细胞培养物体积的量生产。优选地，在培养宿主生物体后脂解酶以至少10g/升总细胞培养物体积的量生产。优选地，在培养宿主生物体后脂解酶以至少15g/升总细胞培养物体积的量生产。优选地，在培养宿主生物体后脂解酶以至少20g/升总细胞培养物体积的量生产。
发酵
本发明的酶可通过固体培养或浸没培养生产，包括分批法、加料分批法和连续流动工艺。培养在培养基中完成，该培养基包含含水矿物盐培养基、有机生长因子、碳和能源物质、分子氧以及当然还有待使用的一种或多种特定微生物物种的起始种菌。
除了碳源和能源、氧气、可同化氮和微生物种菌外，还有必要以恰当比例提供合适量的矿质营养素来确保正常的微生物生长，使微生物转化过程中细胞对碳源和能源的同化最大化，以及在发酵培养基中细胞密度最大的情况下获得最大的细胞收率。
部分取决于所采用的微生物和底物，含水矿物质培养基可在宽泛的范围内变化，这是本领域已知的。除了氮以外，该矿物质培养基还应该包括合适的可溶性可同化离子形式和化合形式的合适量的磷、镁、钙、钾、硫和钠，还优选应存在某些痕量元素如酮、锰、钼、锌、铁、硼和碘等等，同样它们也为可溶性可同化形式，这些全部是本领域已知的。
该发酵反应是一有氧过程，其中所需的分子氧通过含有分子氧的气体如空气、富氧空气或甚至基本上纯的分子氧提供，只要维持发酵容器的内容物具有可有效用于帮助微生物物种旺盛生长的合适的氧分压。实际上，通过使用含氧烃底物，微生物生长的氧需求得以减少。然而，必须提供分子氧用于生长，因为底物的同化以及微生物的相应生长在一定程度上是燃烧过程。
尽管通气速率可在相当宽泛的范围内变化，通气通常以这样的速率进行，该速率在每分钟每发酵罐中的液体体积约0.5至10、优选约0.5至7体积(在所采用的压力以及在25℃下)含氧气体的范围内。该量是以提供给反应器的常氧含量的空气计的，就纯氧而言，相应的范围将会是每分钟每发酵罐中的液体体积约0.1至1.7，或优选约0.1至1.3体积(在所采用的压力下以及在25℃下)的氧。
微生物转化过程所采用的压力可很大变化。压力通常在约0至50psig、本发明优选约0至30psig的范围内，更优选至少稍高于大气压，这要权衡设备和操作费用对所实现的氧溶解度。高于大气压是有利的，因为这种压力的确趋于增加含水发酵物中的溶解氧浓度，其继而可有助于增加细胞生长速率。同时要考虑这样一个事实进行权衡：高大气压的确会增加设备和操作费用。
发酵温度可有一定程度变化，但对于丝状真菌如里氏木霉，温度通常将会在约20℃至40℃的范围内，通常优选在约25℃至34℃的范围内，这取决于所选择的微生物菌株。
微生物还需要可同化的氮源。可同化的氮源可以是任何含氮化合物或能够释放适于微生物进行代谢利用的形式的氮。虽然可采用多种有机氮源化合物，例如蛋白质水解产物，通常可利用廉价的含氮化合物如氨、氢氧化铵、尿素和多种铵盐如磷酸铵、硫酸铵、焦磷酸铵、氯化铵或多种其他氨化合物。氨气本身便于大规模操作，并且可通过鼓泡通过含水发酵物(发酵培养基)以合适的量使用。同时，还可采用这种氨来帮助进行pH控制。
含水微生物发酵物(发酵混合物)中的pH范围应该是约2.0至8.0的示例性范围内。使用丝状真菌时，pH通常在约2.5至8.0的范围内；使用里氏木霉，pH通常在约3.0至7.0的范围内。某些微生物的pH范围偏好在某种程度上取决于所采用的培养基，以及特定的微生物，因而改变pH在一定程度上可由本发明技术人员容易地确定。
虽然部分取决于所采用的发酵温度和培养物，发酵罐中的发酵混合物的平均保持时间可有相当大的变化，一般而言其将处于约24至500小时，本发明优选约24至400小时的范围内。优选地，发酵在使得含碳底物可被控制为限制性因素的方式进行，从而为细胞提供了含碳底物的良好转化并避免相当量的未转化底物对细胞的污染。后一种情况对水溶性底物而言没有问题，因为任何剩余的痕量物质均可容易地洗掉。然而，在非水溶性底物的情况下这可能是个问题，需要增加的产物处理步骤如合适的洗涤步骤。如上所述，达到该水平的时间不是关键的，可随特定的微生物和所进行的发酵过程而变化。然而，本领域熟知如何确定发酵培养基中的碳源浓度以及所需的碳源水平是否已经达到。
尽管发酵可以分批或连续操作进行，但为了易于控制、产生均一量的产物以及最经济地使用所有设备，分批补料操作是更为优选的。如果需要，可在将含水矿物质培养基供料至发酵罐之前将碳源和能源物质的部分或全部和/或可同化氮源如氨的部分添加至该含水矿物质培养基。优选以预定的速率，或者响应可通过监测例如碳和能量底物的浓度、pH、溶解氧、从发酵罐排出的废气中的氧或二氧化碳而确定的需要控制引入反应器的每一种料流。多种材料的进料速度可以变化以便获得与碳和能量源的有效利用相一致的尽可能快的细胞生长速率，以相对于底物给料获得尽可能高的微生物细胞产量。
在分批操作或优选的分批补料操作中，一开始对所有的设备、反应器或发酵手段、器皿或容器、管线、附带的循环或冷却设备等等进行灭菌，通常通过采用蒸汽例如在约121℃下进行至少约15分钟。然后在存在所有所需的营养物质，包括氧和含碳底物的情况下，用所选微生物的培养物接种灭菌过的反应器。所采用的发酵罐的类型不是关键的，但本发明优选的是在15L Biolafitte(Saint-Germain-en-Laye，France)下操作。
从发酵液收集和纯化本发明的酶也可通过本领域本身已知的程序进行。发酵液将通常含有细胞碎屑，包括细胞、多种悬浮固形物和其他生物质污染物，以及所需的本发明酶产物，优选将它们通过本领域已知的手段从发酵液除去。适用于这种移除的方法包括常规的固体-液体分离技术如，例如离心、过滤、透析、微量过滤、旋转真空过滤或其他已知的方法，以产生无细胞滤液。可能优选的是使用诸如超滤、蒸发或沉淀之类的技术进一步浓缩发酵液或无细胞滤液。沉淀上清液或滤液的蛋白质性组分可使用盐，例如硫酸铵来完成。进一步的纯化可任选通过结晶或通过多种色谱分析程序，例如离子交换色谱、亲合色谱或类似的本领域公认的程序来实现。
在用于食品之前可进一步配制所述脂肪酶。所述脂肪酶可以处于液体配制物中，为干燥的或颗粒状的。
在一个实施方案中，可使用载体，优选载体为小麦或小麦组分。
在一个实施方案中，将脂肪酶在小麦上干燥或在一种或多种小麦组分上干燥。
在一个实施方案中，脂肪酶处于适于消费的液体配制物中，优选含有缓冲剂、盐、山梨醇和/或甘油的这种液体组合物。
在一个实施方案中，将脂肪酶制粒与其他酶一起制粒。
食物
本发明的酶可用作食物或用于食物的制备。这里，“食物”意指旨在用于人消费的食物。而且，术语“食品”意指旨在用于人消费的食品。
取决于用途和/或应用的模式和/或施用的模式，食物可以为溶液的形式或作为固体。
当用作食物(如功能性食物)或用于食物的制备中时，本发明的酶可与如下物质中的一种或多种结合使用：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、营养上可接受的活性成分。
食物成分
本发明的酶可用作食物成分和/或可包括在用于人的食品添加剂组合物中。
如本文所用，术语“食物成分”包括这样的配制物，其为功能性食物或食品或可作为营养补充剂和/或纤维补充剂添加至功能性食物或食品。
取决于用途和/或应用的模式和/或施用的模式，食物成分可以为溶液的形式或作为固体。
食物补充剂
本发明的组合物可以为(或可添加至)用于人的食物补充剂。
功能性食物
本发明的组合物可以为(或可添加至)用于人的功能性食物。
如本文所用，术语“功能性食物”意指这样的食物，其不仅能够为人提供营养效果和/或口味满足，而且还能够使消费者获得进一步的有利效果。
因此，功能性食物为具有赋予该食物除了对人的纯粹营养效果之外的特定功能(例如医学或生理有益效果)的掺入其中的组分或成分(如本文描述的那些)的一般食物。
尽管对功能性食物没有法律定义，但在该领域具有利益的大多数团体同意它们为因为具有特定保健效果而销售的食物。
某些功能性食物为营养制品。这里，术语“营养制品”意指这样的食物，其不仅能提供营养效果和/或口味满足，而且还能使消费者获得治疗(或其他有利)效果。营养制品跨越食物和药物之间的分界线。
调查已提出，消费者最看重与心脏疾病相关的功能性食物声称功能。预防癌症是使消费者十分感兴趣的另一个营养学方面，但是有趣的是，这是消费者感觉他们可施加控制最少的领域。事实上，根据世界卫生组织，至少35％的癌症病例是饮食相关的。此外，与骨质疏松、肠健康和肥胖效果相关的声称功能也是有可能激起功能性食物购买和驱动市场发展的关键因素。
食物产品
本发明的组合物可用于制备用于人的食物产品如如下的一种或多种：果酱、桔子酱、果子冻、乳制品(如牛奶或乳酪)、肉制品、禽制品、鱼制品和焙烤食品。
举个例子，本发明的酶可作为成分用于如下物质：软饮料、果酱或饮料(包含乳清蛋白、保健茶、可可饮料、乳饮料和乳酸菌饮料)、酸乳和饮料型酸乳、奶酪、冰淇淋、冰糕和甜点、糖果、饼干糕点和蛋糕混合料、小吃、早餐谷类食物、速食面和方便面、速溶汤粉和杯装汤粉、均衡食物和饮品、甜品、玉米面豆卷、玉米粉圆饼、纹理改良的干棒小吃、纤维棒、耐烘烤水果馅料、保健釉、巧克力焙烤食品馅、干酪饼味馅料、水果味糕点馅料、糕点和炸面圈糖霜、耐热烘焙馅料、速食烘焙馅料奶油、饼干用馅料、即用型烘焙馅料、低卡路里馅料、成人营养饮料、酸化大豆/果汁饮料、无菌/杀菌巧克力饮料、酒吧混合饮品、饮料粉、钙强化大豆/纯的和巧克力味奶、钙强化咖啡饮料。
根据本发明的酶可进一步用作食物产品如美国奶酪酱、用于搓碎干酪和碎奶酪的抗结块剂、薯片蘸料、奶油奶酪、干混植脂无脂肪酸奶油、冻/融乳品动物性鲜奶油、耐冻/融植脂奶油(whipped tipping)、低脂肪和低卡路里天然切达干酪、低脂肪瑞士型酸奶、充气冷冻甜点，和新奇食品棒(novelty bars)、硬盒装冰淇淋(hard pack ice cream)、易贴标签的经济性和嗜好性改善的硬盒装冰淇淋(label friendly，improved economics & indulgence ofhard pack ice cream)、低脂冰淇淋、软冰淇淋、烤肉调味酱、干酪蘸料调味酱、生干酪上的稀奶油、干拌阿尔弗雷多奶香酱(Alfredo sauce)、奶酪混合酱(mix cheese sauce)、干混番茄酱等中的成分。
对于某些方面，优选食品是饮料。
对于某些方面，优选食品是烘焙产品，如面包、丹麦酥皮饼、饼干或家常小甜饼。
饲料
本发明的酶可用作(或用于制备)动物饲料或其组分。因而，本发明还涵盖包含本发明的酶或由其制备的饲料，以及制备该饲料的方法。
去污剂
本发明的酶可用作(或用于制备)去污剂或其组分。因而，本发明还涵盖包含本发明的酶或由其制备的去污剂，以及制备该去污剂的方法。
一般的重组DNA方法技术
除非另外指明，否则本发明采用常规的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫技术，这些技术均在本领域一般技术人员的能力之内。这些技术在文献中进行了解释。参见例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Lab oratory Manual，第二版，第1-3册，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.等人(1995 andperiodic supplements；Current Protocols in Molecular Biology，第9、13和16章，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree和A.Kahn，1996，DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques，John Wiley &Sons；M.J.Gait(编辑)，1984，Oligonucleotide Synthesis：A PracticalApproach，Irl Press；以及D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methods ofEnzymology：DNA Structure Part A：Synthesis and Physical Analysis of DNAMethods in Enzymology，Academic Press。藉此以引用方式将这些一般性文字并入本文。
现在将仅以举例的方式，参照如下附图和实施例来描述本发明。
附图说明
本发明进一步通过参考附图进行了示例性说明，其中：
图1示出了预测的脂解酶(在本文中有时候称为“脂肪酶3”)中的翻译修饰的模型并在本文中以SEQ ID No.2示出；活性位点残基在圆圈中示出-见Ser146、Asp201、His258；有7个半胱氨酸残基并且4个参与二硫键，在残基上面显示为虚线和实线；有两个用于N联糖基化的位点，即N32和N242，其显示为粗体并以下划线标出(后者，即N242，接近His活性位点)。注意：该图中的编号与无27个氨基酸的信号肽的显示为SEQ IDNo.2的脂解酶有关-因此当提及SEQ ID No.1(即其有信号肽)中所示的脂解酶时，关于活性位点残基的编号需要通过加27个氨基酸来调整。
图2示出了本发明的方法的示意图。
图3示出了塔宾曲霉脂解酶基因组DNA的示意图。
图4示出了表达构建体“ATlipase3Trex”。
图5示出了在来自里氏木霉转化体的上清液上进行的脂肪酶活性测定的结果。
图6示出了通过在来自里氏木霉转化体的上清液上进行的SDS-PAGE得到的蛋白质谱。用箭头指出的泳道显示了表达十分高的脂解酶(“脂肪酶3”)水平的转化体中的其中一者。
图7示出了通过来自在3升发酵罐中培养的里氏木霉转化体的上清液的SDS-PAGE得到的蛋白质谱。箭头指示了脂解酶(“脂肪酶3”)蛋白带。
图8示出了当脂解酶在不同表达宿主中表达时发酵液中脂解酶(脂肪酶3)蛋白的产量。产量表示为每一种生物体中的％产量增加：
1塔宾曲霉；
2巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；
3多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；
4里氏木霉。
图9示出了已转化有多拷贝的“脂肪酶3”脂解酶基因的转化里氏木霉菌株的DNA印记，泳道标记如下：
M-未转化的宿主菌株：
B-用基因枪转化法转化的菌株；
E-用电穿孔法转化的菌株。
图10示出了用于表征在里氏木霉中表达的脂解酶(“脂肪酶3”)的SDS-PAGE。来自在不同发酵液中培养的培养物的样品显示脂肪酶3蛋白为双带或三带。
图11a示出了两种不同的UFC(超滤浓缩物)，显示了脂解酶“脂肪酶3”的沉淀。1035UFC中浓缩程度较低的蛋白质显示了严重的沉淀，1036UFC中浓缩程度更高的蛋白质显示了十分严重的沉淀。沉淀是浓度依赖性的-蛋白质浓度较高则其更有可能沉淀。
图11b示出了SDS-PAGE，显示了脂解酶“脂肪酶3”蛋白在图11a的沉淀物中的存在。
泳道1-离心过滤的粗上清液
泳道2-再溶解的来自UFC 1035的离心沉淀物
泳道3-再溶解的来自UFC 1036的离心沉淀物
图12示出了使用不同浓度的磷酸钠缓冲液的沉淀脂解酶(“脂肪酶”3)的再溶解。样品处于pH 5.30之下。
泳道1。粗的，对照。
泳道2-6：5mM、10mM、20mM、40mM和50mM磷酸钠；
图13示出了与去糖基化脂肪酶相比较的糖基化脂肪酶的通过MALDI-TOF/MS分析对重组脂解酶“脂肪酶3”的表征。N-聚糖的大小为约1384Da，脂解酶(脂肪酶3)分子可具有在N32位点(当考虑SEQ ID No.2时)连接的聚糖；
图14示出了对经受了去糖基化的纯化脂解酶(脂肪酶3)的SDS-PAGE蛋白质分析。去糖基化酶：Endo-H，2.0mg/ml。Endo-H以1∶50和1∶100(w/w)的比率添加并在室温，pH 5.5下温育20小时。
泳道1-对照
泳道2-上清液的1∶100稀释物
泳道3-上清液的1∶50稀释物
下面表1中示出了比活性。N联糖基化对脂解酶(脂肪酶3)的比活性没有影响。使脂解酶(脂肪酶3)去糖基化不影响酶活性；
图15示出了来自塔宾曲霉的脂解酶的氨基酸序列(SEQ ID No.1)，其中内源性信号肽以粗体示出。
图16示出了来自塔宾曲霉的脂解酶的氨基酸序列(SEQ ID No.2)，除了内源性信号肽已被移除外其与SEQ ID No.1相同。
图17示出了编码塔宾曲霉脂解酶(如SEQ ID No.1中所示)的包括信号序列的核苷酸序列-该核苷酸序列是基因组DNA序列(已命名为SEQ IDNo.3)。信号序列以粗体示出，内含子以小写字母示出。
图18示出了编码塔宾曲霉脂解酶(如SEQ ID No.2中所示)的不包括信号序列的核苷酸序列-该核苷酸序列为基因组DNA序列(已命名为SEQID No.4)。内含子以小写字母示出。
图19示出了命名为SEQ ID No.5的纤维二糖水解酶1基因(cbh1)启动子的序列。
实施例1
塔宾曲霉脂肪酶3在里氏木霉中的表达
1.用于转化的表达构建体和菌株
将从Invitrogen获得的pDONRTM221质粒DNA(目录号为12536-017)用作供体载体。将含有塔宾曲霉脂肪酶3基因组DNA的DONR221::lip 3(图3)重组进里氏木霉Gateway目的载体pTrex3G(在WO 05/001036中有详细描述)中，从而得到最终的表达构建体ATlipase3Trex(图4)。
该表达盒含有里氏木霉纤维二糖水解酶1(cbh1)基因的启动子和终止子区。其还含有构巢曲霉乙酰胺酶amdS基因作为用于里氏木霉的转化的选择性标志物。
塔宾曲霉脂肪酶3基因组DNA编码具有SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的脂肪酶3脂解酶。
当在本文中使用时，术语“脂肪酶3”指包含SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列(如SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列)的脂解酶。SEQ.IDNo.1含有信号序列而SEQ.ID No.2是没有信号序列的成熟脂肪酶蛋白。
用于转化的菌株为里氏木霉，其为非GMM菌株RL-P37的衍生物，编码两种分泌性纤维二糖水解酶的基因(CBHI和CBHII)，以及编码分泌性内葡聚糖酶的基因中的两种(EGI和EGII)已从其中缺失。
表达载体pTrex3g.
下面描述了载体pTrex3g的构建，该载体可用于表达本发明的基因。
该载体是基于大肠杆菌载体pSL1180(Pharmacia Inc.，Piscataway，NJ，USA)，后者是基于pUC118噬粒的载体(Brosius，J.(1989)DNA 8：759)，具有含有64个六碱基限制性酶识别序列的延长多克隆位点。将其命名为Gateway目的载体(Hartley，J.L.，Temple，G.F.和Brasch，M.A.(2000)GenomeResearch 10：1788-1795)，以允许利用Gateway技术(Invitrogen)在里氏木霉cbh1基因的启动子和终止子区之间插入任何所需的开放阅读框。其还含有构巢曲霉amdS基因以在里氏木霉的转化中用作选择性标志物。
关于pTrex3g的细节如下。该载体大小为10.3kb。
插入pSL1180的多聚接头区中的是如下DNA片段：
1.来自里氏木霉cbh1基因的启动子区的2.2bp DNA片段
2.从lnvitrogen获得的1.7kb Gateway阅读框A盒，其在氯霉素抗性基因(CmR)和ccdB基因旁侧的任一端包含attR1和attR2重组位点
3.来自里氏木霉cbh1基因的终止子区的336bp DNA片段
4.含有具有其天然启动子和终止子区的构巢曲霉amdS基因的2.7kbDNA片段。
2.里氏木霉四基因缺失宿主菌株的转化
采用电穿孔或基因枪转化(通过使用PDS-1000 Helium系统(BioRad，目录号为No.165-02257)进行粒子轰击)将表达构建体ATlipase3Trex(含有塔宾曲霉脂肪酶3基因)转化进里氏木霉菌株中。通过基因枪转化和电穿孔将仅含有真菌DNA的PCR产物或整个表达质粒用于产生转化体。
A.通过电穿孔的转化
将待转化的里氏木霉宿主菌株在PDA板上培养至完全孢子形成5天。用1.2M山梨醇收获来自2个板的孢子并滤过miracloth以除去琼脂。将孢子转移至50ml falcon管并通过用50ml水反复离心5-6次来洗涤。用1.2M山梨醇溶液将孢子再悬浮于小体积(少于2x离心沉淀物体积)中。然后将孢子悬浮液保持在冰上。将90ul的孢子悬浮液等分进电穿孔杯(E-shot，0.1cm标准电穿孔杯，得自Invitrogen)中。将10-20ul DNA构建体(质粒图4或PCR产物)添加至该孢子悬浮液并将电穿孔设置为16kV/cm，25μF，50Ω。电穿孔后，让孢子悬浮液留在冰上，再悬浮于5份1.0M山梨醇和1份YEPD中，并通过在28C下伴随250rpm振荡温育过夜让其萌发。第二天，将萌发幼体接种至含有乙酰胺的琼脂板中。分选转化体并将其单独转移至乙酰胺琼脂板。
B.通过粒子轰击的转化(基因枪转化)
制备来自里氏木霉的四基因缺失菌株的孢子的悬浮液。将200ul孢子悬浮液铺展至基本培养基(MM)乙酰胺板的中央。(MM乙酰胺板具有如下组成：0.6g/l乙酰胺；1.68g/l CsCl；20g/l葡萄糖；20g/l KH2PO4，0.6g/l CaCl22H20；1ml/l 1000x痕量元素溶液；20g/l Noble琼脂，pH 5.5。1000x痕量元素溶液含有5.0g/l FeSO4 7H2O；1.6g/l MnSO4；1.4g/l ZnSO4 7H2O和1.0g/lCoCl2 6H2O。在无菌通风柜中让孢子悬浮液在MM乙酰胺培养基的表面上干燥1小时。转化按照生产商的指导。将60mg钨粒子置于微量离心管中。添加1ml乙醇并让其静置15秒。除去乙醇并用无菌dH2O洗涤三次，然后添加250ul 50％(v/v)无菌甘油。将25ul钨粒子悬浮液置于微量离心管上。在连续涡旋的同时，添加如下物质：5ul(100-200ng/ul)的质粒DNA、25ul的2.5M CaCl2和10ul的0.1M亚精胺。将粒子离心3秒。移除上清液，用200ul的100％乙醇洗涤粒子并离心3秒。除去上清液。添加24ul 100％乙醇并通过吸液混合，然后移出8ul粒子等分试样并置于保持在干燥器中的微载体盘的中心。一旦钨/DNA溶液已干燥则将微载体盘连同带有孢子的MM乙酰胺板置于轰击室中，根据生产商的指导进行轰击过程。在用钨DNA粒子轰击接种的孢子后，将板在28C下温育。将转化的菌落转移至新鲜的MM乙酰胺培养基板，在28C下温育。
3.转化体在微量滴定板中的生长
在MM乙酰胺板上生长5天后，将通过电穿孔或通过基因枪转化获得的并且显示出稳定形态的转化体接种进96孔微量滴定板中的200ul带有葡萄糖/槐糖的成分确定的培养基。带有葡萄糖/槐糖的成分确定的培养基(每升)由如下物质组成：NH42SO4 5g，PIPPS缓冲液33g，酪蛋白氨基酸9g，KH2PO4 4.5g，CaCl2(无水)1g，MgSO4.7H2O 1g，用50％NaOH将pH调节至5.50，用milli-Q H2O定容至966.5mL。灭菌后，添加如下物质：Mazu5mL，葡萄糖/槐糖60％26mL和400X里氏木霉痕量金属2.5mL。将微量滴定板在28℃的氧气生长室中温育5天。
实施例2
通过脂肪酶印记测定法和SDS-PAGE的筛选
通过离心除去菌丝并用印记测定法分析上清液的脂肪酶活性。脂肪酶平板测定法是基于在存在脂肪酶的情况下脂肪酸从底物(甘油三丁酸酯)游离。当脂肪酸游离并与罗丹明B形成复合物时形成粉红色颜色。该测定板含有2.0g Bacto琼脂(通过加热5分钟溶解于100ml 50mM磷酸钠缓冲液pH5.5中)。将该溶液保持在70℃水浴下并同时搅拌，添加0.5ml 2％罗丹明和40ml甘油三丁酸酯。让混合物经受超声处理2分钟并将10-15ml倾注至培养皿中。打孔并将培养物上清液施加至孔中。将板在37℃下温育直至形成粉红色颜色，从而指示存在脂肪分解活性。如图5中所示使用印记测定法检查来自转化体的上清液(10ul)的脂肪酶活性，箭头指示在37℃下温育30分钟后出现粉红色颜色，从而显示高的脂肪酶活性。
使用NuPAGE 4-12％聚丙烯酰胺凝胶和MES作为电泳缓冲液通过SDS-PAGE测定展现出高脂肪酶活性的那些转化体的蛋白质谱。将上清液样品与适当体积的带有还原剂的2x加样缓冲液混合。凝胶用Simply blue Safestain(Invitrogen)染色。在图6中，用箭头标记的泳道显示了表达十分高的脂肪酶3水平的转化体的其中一者，显现为双带。其余的转化体显示出截然不同的且稍模糊的单一带。在3升发酵罐中培养的最好的转化体产生了至少20g/升的总分泌蛋白滴度，并且SDS-PAGE分析显示了一宽的脂肪酶带(图7)。
实施例3
脂肪酶3转化体的大规模发酵(14升)
如WO 2004/035070所述将里氏木霉转化体在发酵罐中培养。培养通过电穿孔产生的四个不同的转化体。在移除细胞后，对培养物上清液中的总蛋白质和脂肪酶活性的测量表明，发酵160小时后存在超过20g/升的脂肪酶。还培养了通过基因枪转化的两株菌株。在发酵160小时后在培养物上清液中显示有超过20g/升的脂肪酶。由这些转化体产生的脂肪酶3的量远超过由其他微生物宿主物种产生的脂肪酶3的量(图8)。
将里氏木霉转化体在发酵罐中培养。培养通过电穿孔产生的四个不同的转化体。在移除细胞后，对培养物上清液中的总蛋白质和脂肪酶活性的测量表明，发酵160小时后存在超过20g/升的脂肪酶。还培养了通过基因枪转化的两株菌株。在发酵160小时后在培养物上清液中显示有超过20g/升的脂肪酶。由这些转化体产生的脂肪酶3的量远超过由其他微生物宿主物种产生的脂肪酶3的量(图8)。
实施例4
脂肪酶3的可溶性
出乎意料的是，本发明人已发现里氏木霉能够以十分高的水平产生脂肪酶3。发酵后对脂肪酶的下游处理要求用分子量筛截为10,000的膜通过超滤浓缩培养发酵液4次。脂肪酶3倾向于沉淀，如图11a所示。在更浓的UFC中观察到更严重的沉淀。通过SDS-PAGE确认了脂肪酶3蛋白在沉淀物中的存在。
图11a和图11b显示脂肪酶3的沉淀是浓度依赖的。
图11a示出了两种不同的超滤浓缩物(UFC)，显示了脂肪酶3的沉淀。1035UFC含有浓度较低的蛋白质，显示了严重的沉淀。1036UFC含有浓度较高的蛋白质，显示了十分严重的沉淀。
图11b示出了SDS-PAGE，显示了脂肪酶3蛋白在图11a中所示的沉淀物中的存在。
泳道1离心过滤的粗上清液
泳道2再溶解的来自UFC 1035的离心沉淀物
泳道3再溶解的来自UFC 1036的离心沉淀物
对于脂肪酶沉淀物的再溶解，使用了母缓冲液。母缓冲液由1.0M磷酸钠缓冲液，pH 8.0(添加至900ml DI水的Na2HPO4.2H2O(177.99g))组成。向10.0g粗脂肪酶3UFC 1036，pH 4.44的样品添加50、100、200、400和500μl缓冲液母液，分别至5、10、20、40和50mM磷酸钠的终浓度。将所有的小瓶混合并保留在室温下数分钟。
如图12所示，添加高于40mM的磷酸钠使沉淀的脂肪酶3变为溶液。所得的溶液是澄清的并且没有任何固形物。样品的pH测量为pH 5.3(在50mM Na-P浓度下)。
实施例5
通过MALDI-TOF/MS分析和蛋白水解消化表征重组脂肪酶3
联合使用离子交换色谱和疏水相互作用色谱从培养物上清液纯化里氏木霉表达的脂肪酶3。在由50mM柠檬酸钠，pH 5.5组成的反应缓冲液中用Endo-H进行去糖基化。以1/1000至1/100(w/w)的蛋白比将Endo-H(2.0mg/mL)添加至脂肪酶3。该去糖基化反应在37℃进行3小时。在MALDI-TOF/MS分析之前将反应过的蛋白质样品放在ZipTip
Figure BPA00001448067000501
(Micro C4反相柱)(Millipore，Bedford，MA)上用于样品净化。进行该净化处理以使样品脱盐。使用了至少五个循环的洗涤溶液(由0.1％TFA/水中的5％甲醇组成)洗涤。此后洗脱样品用于质谱分析法。
完整蛋白质的MALDI-TOF/MS分析
使用液滴干燥法(dried droplet method)，通过使等体积(1μL)的样品与芥子酸基质(在50％乙腈、0.1％甲酸中饱和)共结晶制备脱盐蛋白质样品用于MALDI-TOF/MS分析。用Voyager DE-STR MALDI-TOF质谱仪(AppliedBiosystems，Foster City，CA，USA)获得蛋白质质谱。对于20000-80000m/z的范围该MS仪的设置如下：线性操作模式，延迟提取模式，正极性，25kV加速电压，93％栅极电压，以及750纳秒提取延迟时间。将300-激光器shots/谱和BSA用作外部校准。
蛋白分解消化和通过LC/MS/MS分析的N-糖基化位点作图
将所有Endo-H处理过的液体样品用10％TCA沉淀，然后使用20mMDTT在50℃下进行还原反应15-20分钟。还用55mM碘乙酰胺进行烷化反应。让烷化反应在黑暗中室温下进行45分钟。蛋白分解消化通过与25mM碳酸氢铵中的多种蛋白酶在37℃下温育4小时来进行(酶与底物比为1∶20)。肽作图利用3种不同的蛋白分解消化(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、内切蛋白酶GluC)在通过截短和具有可信的N和C末端的完整脂肪酶蛋白质的存在确认不存在蛋白质修饰的糖基化脂肪酶上进行。
脂肪酶3具有2个潜在的N32和N242处的N-糖基化位点。对脂肪酶3(未处理的)和Endo-H处理过的脂肪酶3二者进行肽作图。为了确定N-糖基化位点，用耦接至LCQ Deca XP(ThermoFinnigan，San Jose，CA)的SurveyorTM LC系统获取MS和MS/MS数据。将HPLC梯度设定为在50分钟内从0％至70％B。溶剂A：0.1％TFA水溶液，溶剂B：0.08％TFA乙腈溶液。数据处理用TurboSEQUEST和Xcalibur(ThermoFinnigan，San Jose，CA)进行。
如图13所示，在Endo-H处理之前SDS-PAGE显示由木霉分泌的重组脂肪酶表现为双带。MALDI-TOF/MS分析显示，较高分子量的物质为脂肪酶3的糖基化形式，分子量为30,236道尔顿，较低分子量的物质为去糖基化形式，分子量为29,210道尔顿。用Endo-H产生以实验方法去糖基化的脂肪酶样品。在Endo-H处理后观察到的分子量为29,035道尔顿(推定为非糖基化形式)、29,219(推定为在N32或N242处具有1个N联N-乙酰基葡糖胺的脂肪酶3形式)和29,422(推定为在N32和N242处具有2个N-乙酰基葡糖胺残基连接至蛋白质主链的脂肪酶3的形式)。在用Endo-H去糖基化之前存在的聚糖链具有大约1384道尔顿的分子量，大部分脂肪酶分子具有仅连接至N32位点(根据SEQ ID No.2编号)的聚糖。
实施例6
使用2种不同的底物在里氏木霉中产生的脂解酶脂肪酶3的比活性
使纯化的脂肪酶3经受通过用Endo-H处理的去糖基化。使用短链(C4)和长链(C18)底物二者通过测量比活性来表征未处理的和去糖基化的样品。
如图14和表2中所示，聚糖侧链的存在对蛋白质的比活性没有影响。
表2示出了去糖基化实验的结果。样品为纯化的木霉脂肪酶3，去糖基 化酶为Endo-H。
Figure BPA00001448067000521
实施例7
DNA印记分析
图9示出了已转化有多拷贝的“脂肪酶3”脂解酶基因的转化的里氏木霉菌株的DNA印记，泳道标记如下：
M-未转化的宿主菌株：
B-用基因枪转化法转化的菌株；
E-用电穿孔法转化的菌株；
实施例8
表达研究
克隆来自绵毛嗜热丝菌的脂肪酶并在里氏木霉中表达。分离转化体并将最好的脂肪酶产生者在14升规模的发酵中测试以研究里氏木霉是否为适于表达其他脂肪酶的宿主菌株。在发酵结束时(200小时)总蛋白质估计为超过20g/L，如图14中所示。SDS-PAGE显示，脂肪酶为所产生的主要蛋白质。在发酵结束时使用DGGR测定法测量的脂肪酶活性为30,000U/mL。过滤发酵液并浓缩为高浓度UFC，脂肪酶显示出沉淀。容易通过缓冲液或盐使其恢复为溶液。
实施例9
表达研究
表3提供了一系列表达研究的结果。
本发明人已出乎意料的发现，与其他生物体中产生的相同酶相比较，里氏木霉中产生的脂解酶“脂肪酶3”糖基化较少(特别是N联糖基化较少)。
表3.与用于表达来自塔宾曲霉的脂肪酶3的其他宿主的比较。
Figure BPA00001448067000531
实施例10
适用于本发明的表达宿主细胞可以是其中编码纤维二糖水解酶I的基因(CBHI，Cel7a)、编码纤维二糖水解酶的基因(CBHII，Cel6a)、编码内葡聚糖酶I的基因(EGI，Cel7b)和编码内葡聚糖酶II的基因(EGII，Cel5a)已通过使用分子遗传技术进行缺失或破坏而失活的里氏木霉的菌株。该菌株(四基因缺失菌株)可用作宿主，用于编码其他里氏木霉分泌的蛋白质的基因的过表达。
优选地，适用于本发明的宿主细胞可使用WO 2005/001036和US28026376 A1中描述的方法衍生自菌株RL-P37的里氏木霉细胞。
适用于本发明的里氏木霉菌株可源于可公开获得的里氏木霉RL-P37菌株。可如WO 05/001036中所述修饰里氏木霉菌株RL-P37以形成里氏木霉菌株1A52。可如US 20080026376中所述修饰里氏木霉菌株1A52以形成可用于本发明的里氏木霉细胞。
可如下所述修饰RL-P37以形成里氏木霉菌株1A52。
所用的里氏木霉宿主菌株可源于可公开获得的菌株RL-P37，该菌株已由Genencor International，Inc.用于生产商业纤维素酶制备物。该菌株的衍生和鉴定先前已有公开(Sheir-Neiss，G.和Montenecourt，B.S.(1984)Appl.Microbiol.Biotechnol.20：46-53；美国专利4,797,361)。其为过量产生纤维素酶的突变菌株，该菌株已由野生型菌株(QM6a)通过若干诱变步骤而获得。
1)pyr4突变株的分离。
为了制备用来用质粒DNA转化的菌株RL-P37，有必要分离在pyr4基因中具有无效突变的衍生物。
该pyr4基因编码乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶，该酶是尿苷生物合成所需的。野生型细胞将毒性抑制剂5-氟乳清酸(FOA)掺入尿苷中，因而毒害该细胞。然而，pyr4基因缺陷的细胞对该抑制剂有抗性但需要尿苷用于生长。因而，有可能使用FOA选择pyr4突变株。在实施过程中，将里氏木霉菌株RL-P37的孢子铺展在含有2mg/ml尿苷和1.2mg/ml FOA的固化培养基的表面。在三至四天内出现自发的FOA抗性菌落。鉴定了需要尿苷用于生长的FOA抗性突变体。为了鉴定特定地具有缺陷pyr4基因那些突变体，产生原生质体并用含有野生型pyr4基因的质粒进行转化(Smith，J.L.，Bayliss，F.T.和Ward，M.(1991)Curr.Genet.19：27-33)。转化后，将原生质体涂布接种于缺少尿苷的培养基中。转化的菌落的随后生长证明质粒携带的pyr4基因补足了缺陷的pyr4基因。以这种方式，菌株GC69被鉴别为菌株RL-P37的pyr4突变体。
2)设计用于缺失CBH1编码基因的质粒的构建。
通过与根据该基因的公开序列设计的寡核苷酸探针杂交，从菌株RL-P37的基因组DNA克隆cbh1基因(编码CBHI蛋白)(Shoemaker，S.，Schweickart，V.，Ladner，M.，Gelfand，D.，Kwok，S.，Myambo，K.和Innis，M.(1983)Biotechnology 1：691-696)。该cbh1基因处于一6.5kb Pstl片段上，将其插入至pUC4K(Pharmacia Inc.，Piscataway，NJ，USA)的Pstl位点，替代该载体的卡那霉素抗性基因。然后将所得的质粒pUC4K::cbh1用Hindlll酶切，分离较大的片段并再连接得到pUC4K::cbh1ΔH/H。该程序移除了整个cbh1编码序列和大约1.2kb的5′和1.5kb的3′旁侧序列。从初始Pstl片段的任一末端保留了大约1kb的旁侧DNA。将里氏木霉pyr4基因作为基因组DNA的6.5kb Hindlll片段克隆进pUC18中以形成pTpyr2(Smith，J.L.，Bayliss，F.T.和Ward，M.(1991)Curr.Genet.19：27-33)。将质粒pUC4K::cbh1ΔH/H用Hindlll酶切并用牛小肠碱性磷酸酶使末端脱磷酸。将该DNA与含有pyr4基因的6.5kb Hindlll片段连接以得到pΔCBH1pyr4。
用EcoR1消化pΔCBH1pyr4释放一较大片段，其由在任一端的cbh1基因座的旁侧区与中间的替换cbh1基因的pyr4基因组成。该片段上不源于里氏木霉的唯一DNA是源于pUC4K的多克隆位点的21bp片段。
3)里氏木霉的cbh1基因的缺失。
使用Smith等人，1991概述的方法，用EcoR1消化的质粒pΔCBH1pyr4转化分离自菌株GC69的菌丝的原生质体。获取稳定的转化体并如下鉴别cbh1基因已从其中缺失的那些突变体。
从所述转化体分离总DNA，用Pstl消化，经受琼脂糖凝胶电泳并印记至膜过滤器。然后使该过滤器与P32标记的pΔCBH1pyr4杂交，通过放射自显影观察杂交图案。该探针与未转化的菌株中的天然cbh1和pyr4基因杂交。在一个转化体(菌株P37PΔCBHI)中，观察到一种杂交图案，在已发生了双交换整合事件时将可预测到该图案。也就是说，cbh1基因已通过在菌株RL-P37的cbh1基因座处整合单个拷贝的从pΔCBH1pyr4获得的较大EcoR1片段而被缺失。
还如上进行蛋白质印迹分析，不同的是所用的探针为放射性标记的plntCBHI。该质粒由在pUC4K::cbh1ΔH/H中被缺失的区域内含有来自cbh1基因座的2kb Bglll片段的pUC载体组成。该质粒杂交至菌株GC69的cbh1基因座，但不杂交至来自菌株P37PΔCBHI的DNA。这确认cbh1基因已被缺失并且来自pΔCBH1pyr4的pUC DNA片段还未被该缺失型菌株所掺入。
通过在等电聚焦凝胶上分离来分析分泌的蛋白质显示，CBH1蛋白未由菌株P37PΔCBHI产生。
4)P37PΔCBHI的pyr4无效突变体的产生。
将cbh1基因被缺失的转化体(P37PΔCBHI)的孢子铺展于含有FOA的培养基上。随后使用上面部分中描述的方法获得该转化体的pyr4缺陷型衍生物。将该pyr4缺陷型菌株命名为P37PΔCBHIPyr-26。DNA印记分析已显示，当选择菌株P37PΔCBHIPyr-26时已经发生自发的缺失。该缺失完全移除了已在菌株P37PΔCBHI中的cbh1基因座处整合的pyr4基因，以及超出初始克隆的基因组DNA的6.5kb Pstl片段的长度的来自cbh1基因座的旁侧DNA。
5)设计用于缺失cbh2基因的载体的构建。
里氏木霉的cbh2基因(编码CBH11蛋白)已作为基因组DNA的4.1kbEcoR1片段得以克隆(Chen等人，，1987，Biotechnology 5：274-278)。将该4.1kb片段插入在pUC4XL的EcoR1位点之间。后一种质粒为pUC衍生物(由R.M.Berka，Genencor International Inc.构建)，其含有具有以这里所示的次序排列的限制性内切核酸位点的对称模式的多克隆位点。EcoRI、BamHI、Sacl、Smal、Hindlll、Xhol、Bglll、Clal、Bglll、Xhol、Hindll I、Smal、Sacl、BamHI、EcoRI。构建质粒pPΔCBH11，其中在该cbh2克隆在Hindlll位点(在CBH11翻译起始位点3′的74bp处)和ClaI位点(在最后的CBHII密码子3′的265bp处)之间的1.7kb中间区已被移除并替换为如下获得的含有里氏木霉pyr4基因的1.6kb Hindlll-Clal DNA片段。从1.6kb Nhel-Sphl片段上的pTpyr2切取里氏木霉pyr4基因并插入在pUC219(通过扩展多克隆位点来包括Bglll、Clal和Xhol限制性位点而衍生自pUC119；Wilson等人，1989，Gene 77：69 78)的Sphl和Xbal位点之间，以产生p219M(Smith等人，1991，Curr.Genet.19：27-33)。然后可将pyr4基因作为在一端具有7bp的DNA且在另一端具有6bp的DNA(衍生至pUC219多克隆位点)的Hindlll-Clal片段移出并插入cbh2基因的Hindlll和Clal位点中以形成质粒pPΔCBHII。
用EcoR1消化该质粒释放一个片段，该片段在一端具有来自cbh2基因座的0.7kb旁侧DNA，在另一端具有来自cbh2基因座的1.7kb旁侧DNA以及在中间具有里氏木霉pyr4基因。该片段中不是衍生自里氏木霉的唯一DNA是在pyr4基因任一端的pUC219多克隆位点的6bp和7bp片段。
6)从菌株P37PΔCBHIPyr - 26缺失cbh2基因
根据上面3中概述的方法，产生菌株P37PΔCBHIPyr-26的原生质体并用EcoR1消化的pPΔCBHII转化。将稳定的转化体在摇瓶中培养，通过等点聚焦法检验培养物上清液中的蛋白质。鉴定了不产生任何CBH11(也不产生CBHI)蛋白的一个转化体(命名为P37PΔΔCBH67)。
从菌株P37PΔΔCBH67提取DNA，用EcoR1和Asp718消化，并将其进行琼脂糖凝胶电泳处理。将来自该凝胶的DNA印记至膜过滤器并与32P标记的pPΔCBHII杂交。在来自未转化的对照菌株的DNA中观察到含有野生型cbh2基因的4.1kb EcoR1片段。相比之下，在菌株P37PΔΔCBH67中，单个4.1kb带被消除取而代之的是大约0.9和3.1kb的两条带。如果单个拷贝的来自pPΔCBH11的较大EcoR1片段已精确地整合在cbh2基因座处并缺失了cbh2基因，则这是预期的模式。
将相同DNA样品也用EcoR1消化并如上所述进行DNA印记分析。在该实施例中，探针为32P标记的plntCBHII。该质粒含有cbh2基因编码序列的一部分，该部分来自在质粒pPΔCBHII中缺失的cbh2 DNA的片段内。与来自菌株P37PΔCBH67的DNA未见杂交，从而确认cbh2基因被缺失并且pPΔCBH1I的pUC质粒片段尚未被该菌株掺入。
7)菌株P37PΔΔCBH67的pyr4无效突变体的选择。
将缺失cbh1和cbh2基因二者的转化体(P37PΔΔCBH67)的孢子铺展在含有FOA的培养基上。随后使用上面部分1中描述的方法获得该转化体的pyr4缺陷型衍生物。将该pyr4缺陷型菌株命名为P37PΔΔCBH67Pyr-1。DNA印记分析已显示，当选择菌株P37PΔΔCBH67Pyr-1时已经发生自发的缺失。该缺失完全移除了已在菌株P37PΔCBH67中的cbh2基因座处整合的pyr4基因，以及超出初始克隆的基因组DNA的4.1kb EcoR1片段的长度的来自cbh2基因座的旁侧DNA。存在于pyr4基因任一端的衍生自pUC219多克隆位点的短(6bp和7bp)DNA片段也将通过该缺失从基因组移除。
8)设计用于破坏egl2基因的质粒的构建。
已从里氏木霉克隆了编码EGl1(此前一些人称之为EGl11)的egl2基因并公布了DNA序列。我们已获得了来自菌株RL-P37的该基因，其为插入在pUC219的Pstl和Xhol位点之间的基因组DNA大约4kb的Pstl-Xhol片段。将里氏木霉pyr4基因(存在于从pTpyr2获得的基因组DNA的2.7kbSalI片段上)插入EGl1编码序列内的Sall位点中以产生质粒pEGII::P-1。这导致EGl1编码序列的破坏但没有任何序列的缺失。可用Hindlll和BamH1消化质粒pEGII::P-1以产生除了在一端的5bp和另一端的16bp(这二者均衍生自pUC219的多克隆位点)外唯一衍生自里氏木霉的DNA线性片段。
9)菌株P37PΔCBH67Pyr - 1的egl2基因的破坏。
用先前用Hindlll和BamH1消化的pEGII::P-1转化菌株P37PΔΔCBH67Pyr-1并选择稳定的转化体。从转化体分离总DNA并将DNA印记分析用于鉴定其中含有pyr4和egl2基因的质粒DNA片段已在egl2基因座处整合并因此破坏EGl1编码序列的菌株。使用探针进行DNA印记分析，该探针为里氏木霉DNA含有egl2基因的大约4kb的Pstl片段。当用Pstl消化从菌株P37PΔΔ67P-1分离的DNA用于DNA印记分析时egl2基因座随后在放射自显影照片上显影为单条4kb带。然而，对于对egl2基因进行破坏的转化体，正如所料该带消失并被两条新带所替代。当用Bglll或EcoRV消化该DNA时，该带的大小对应于egl2基因，在未转化的P37PΔΔ67P-1菌株和egl2被破坏的转化体之间该基因的大小增加大约2.7kb(插入的pyr4片段的大小)。将该后一种转化体(现在缺失cbh1、cbh2和egl2基因)命名为菌株B31。进一步的DNA印记分析确认，pEGII::P-1的pUC DNA片段未掺入该菌株中。
10)菌株B31的pyr4无效突变体的选择。
将缺失cbh1、cbh2和egl2基因的转化体(B31)的孢子铺展在含有FOA的培养基上。随后使用上面部分1中描述的方法获得该转化体的pyr4缺陷型衍生物。将该pyr4缺陷型菌株命名为B31 P6。DNA印记分析已显示，当选择菌株B31P6时已经发生自发的缺失。该缺失除去了已在菌株B31中的egl2基因座处整合的pyr4基因的大部分，但是没有扩展至egl2基因座的旁侧DNA。
11)设计用于缺失egl1基因的质粒的构建。
已克隆了里氏木霉的egl1基因并且该基因的DNA序列已公布(Penttila等人，1986，Gene 45；253-263；van Arsdell等人，1987，Bioltechnology 5：60-64)。我们已从里氏木霉菌株RL-P37获得了该基因，其作为在pUC100(pUC18的衍生物，在多克隆位点中插入了寡核苷酸，从而添加了Bglll、Clal和Xhol的限制性位点)的Hindlll位点处插入的基因组DNA的4.2kbHindlll片段，以得到pUCEGI。从接近EGI编码序列的中间的位置延伸至超过该编码序列的3′端的位置的大约1kb EcoRV片段被移除并替换为含有从pTpyr2获得的pyr4基因的里氏木霉DNA的3.5kb Scal片段。将所得的质粒称为pPΔEGI。
可用Hindlll消化质粒pPΔEG1以释放一DNA片段，该DNA片段仅包含在任一端具有egl1基因的片段和在中间具有替换部分EGI编码序列的pyr4基因的里氏木霉基因组DNA。
12)菌株B31P6中的eal1基因的缺失。
构造了两种pPΔEG1形式，这两种形式不同之处仅在于pyr4基因相对于egl1旁侧区的取向。在已用Hindlll消化菌株B31P6后将它们用所述质粒的两种形式的混合物进行转化。从稳定转化体提取总DNA，用Hindlll消化并进行DNA印记分析。所用的探针为放射标记的pUCEGI。来自菌株B31P6的DNA的4.2kb片段观察到杂交，代表了未缺失的egl1基因。鉴定了一转化体(菌株1A52)，在该转化体中该4.2kb不再存在而是已替换为大约6.8kb的片段。如果来自pPΔEGI的较大Hindlll片段已如预测的精确地在egl1基因座处整合，从而导致EGI编码序列的部分缺失以及pyr4在该位置插入的话，这是预期的模式。使用pUC质粒作为探针用于DNA印记分析，确认pPΔEGI的pUC DNA片段还未掺入菌株1A52中。
可修饰里氏木霉菌株1A52以形成可用于本发明的里氏木霉细胞。
实施例11-测定法方案
三酰基甘油水解活性(分类为E.C.3.1.1.3)的测定法用于三酰甘油水 解活性的LIPU/LUSol测定法
通过LIPU测定脂肪酶活性是通过酶处理三丁酰基甘油的乳液来进行。脂的酶水解可释放游离脂肪酸。通过连续滴定释放的游离脂肪酸，可从碱的消耗测定脂肪酶活性。1LIPU(脂肪酶单位)(在本文中也称为1单位)定义为在给定测定条件下每分钟释放1μmol游离脂肪酸的酶量。
将酶样品溶解于去矿质水中。滴定剂为0.05M NaOH。底物为5％(v/v)三丁酸甘油(Merck，货号为1.01958)、0.10％(w/v)阿拉伯树胶(Sigma，货号为G9752)、7.5％(w/v)甘油(Merck，货号为1.04092)、51mM NaCl(购自Merck，货号为1.06404)、0.50mM KH2PO4(购自Merck，货号为1.04873)的均化乳液。反应pH为5.5，反应温度为30℃。将2.00mL样品添加至25.0mL适应至反应温度的底物。从以滴定剂消耗量对反应时间作图的线性滴定曲线的斜率计算活性。
使用的底物为三丁酸甘油酯(Lipu)和向日葵油(LUSol)。
用于三酰甘油水解活性的DGGR测定法
将该测定法用于测量在木霉中表达的绵毛嗜热丝菌脂肪酶。
该测定法中使用的底物和缓冲液如下：
溶解于DMSO中的3.32mM 1，2-二-O-月桂基-消旋-甘油-3-(戊二酸6-甲基试卤灵酯)(底物，2.5mg/mL)；
将由添加至20mL DMSO的50mg底物组成的母溶液进行超声处理，分成等份试样并在-80摄氏度下保存直至使用。所用的缓冲液为0.5M HEPESpH 8+60gpg 3∶1 Ca∶Mg水硬度(见CAM300)和4％阿拉伯树胶。脂肪酶母液(1mg/L)用作标准品。
对于该测定，通过将5mL HEPES+硬度和25mL 4％阿拉伯树胶添加至10mL水制备50mL测定缓冲液。将该测定缓冲液温育至所需的测定温度(通常是25摄氏度)。在测定温度下将10uL酶样品添加进96孔板中。推荐样品中活性酶为1-10ppm。
为了得到最好的结果，使未知的浓度与标准品的+/-两倍活性相配。
测定背景速率(无酶，即测定缓冲液)。
将10mL DMSO中的3.32mM DGGR底物添加至测定缓冲液并利用涡旋充分混合。使用多道吸移管从试剂槽(reagent reservoir)将200uL测定缓冲液中的底物立即加至微孔板中的酶样品。将微量滴定板搅匀并立即转移至酶标仪。在所需温度(通常为25摄氏度)下测量580nm下的OD持续最多10分钟。通过从未知浓度和标准浓度减去背景速率以获得差值速率来进行酶活性的计算。确定未知浓度与标准浓度的差值速率之比并乘以标准浓度。全部稀释物均包括在该计算中：
未知浓度＝(未知比率*标准浓度)/标准速率。
三酰甘油酯脂肪酶活性的测定：基于甘油三酯(甘油三丁酸酯)作为 底物的测定法(LIPU)：
基于甘油三丁酸酯的脂肪酶活性是根据Food Chemical Codex，第四版，National Academy Press，1996，第803页测量，进行了如下修改：将样品溶解于去离子水中而不是甘氨酸缓冲液，pH开始设置点为5.5而不是7。
1LIPU定义为在测定条件下每分钟可游离1mol丁酸的酶量。
用于磷脂酶活性的测定法
磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)
磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)
磷脂酶B活性(E.C.3.1.1.5)
底物
溶解于50mM HEPES缓冲液pH 7.0中的1.75％L-植物卵磷脂95％(441601，Avanti Polar Lipids)、6.3％Triton X-100(#T9284，Sigma)和5mMCaCl2。
测定程序
将样品、校正品和对照稀释于10mM HEPES pH 7.0、0.1％Triton X-100(#T9284，Sigma)中。用Konelab自动分析仪(Thermo，Finland)进行分析。该测定在30C下进行。将34μL底物恒温180秒，然后添加4μL样品。酶处理持续600秒。用NEFA C试剂盒(999-75406，WAKO，Germany)测量酶处理期间释放的游离脂肪酸的量。添加56μL NEFA A，将混合物温育300秒。随后添加113μL NEFA B，将混合物温育300秒。随后添加113μl NEFAB，将混合物温育300秒。然后测量OD 520nm。根据标准酶制备物计算酶活性LATU(μmol FFA/minmL)。
用于糖脂酶(半乳糖脂酶)活性的测定法
底物
溶解于50mM HEPES缓冲液pH 7.0中的1.75％双半乳糖甘油二酯(DGDG，从小麦脂类纯化)、6.3％Triton X-100(#T9284，Sigma)和5mMCaCl2。
测定程序
将样品、校正品和对照稀释于10mM HEPES pH 7.0、0.1％Triton X-100(#T9284，Sigma)中。用Konelab自动分析仪(Thermo，Finland)进行分析。该测定在30C下进行。将34μL底物恒温180秒，然后添加4μL样品。酶处理持续600秒。用NEFA C试剂盒(999-75406，WAKO，Germany)测量酶处理期间释放的游离脂肪酸的量。添加56μL NEFA A，将混合物温育300秒。随后添加113μL NEFA B，将混合物温育300秒。随后添加113μl NEFAB，将混合物温育300秒。然后测量OD 520nm。根据标准酶制备物计算酶活性GLU-K(μmol FFA/minmL)。
藉此将上面说明书中提及的所有出版物以引用的方式并入本文。对本领域的技术人员将显而易见的是，可在不背离本发明的范围和精神的条件下对所描述的本发明方法和系统作出多种修改和变型。尽管本发明已结合特定的优选实施方案进行了说明，但应该理解受权利要求书保护的本发明不应该不当地受限于这些特定的实施方案。实际上，对生物化学和生物技术或相关领域的技术人员明显的用于执行本发明的所述模式的多种修改旨在处于如下权利要求书的范围内。

Claims (32)

1.一种产生脂解酶的方法，所述方法包括如下步骤：
(i)提供转化的或转染的里氏木霉细胞，所述细胞包含：
a)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，所述脂解酶包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或与SEQID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；和/或
b)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列；和/或
c)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含在严格条件下与如下序列杂交的核苷酸序列：SEQID NO：3或SEQ ID NO：4或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列或它们中任一者的互补序列；以及
(ii)在允许编码所述脂解酶的所述异源核苷酸序列表达的条件下培养所述细胞。
2.一种产生脂解酶的方法，所述方法包括如下步骤：
(i)用如下序列转染或转化里氏木霉细胞：
a)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，所述脂解酶包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或与SEQID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；和/或
b)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列；和/或
c)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含在严格条件下与如下序列杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或与SEQ ID NO：3或SEQID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列或它们中任一者的互补序列；
(ii)任选在所述细胞上重复步骤(i)以依序用至少一条(i)(a)、(i)(b)或(i)(c)中所定义的额外异源核苷酸序列转染或转化所述细胞；以及
(iii)在允许编码所述脂解酶的所述异源核苷酸序列表达的条件下培养所述细胞。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述异源核苷酸序列还包含启动子序列，所述启动子序列是纤维二糖水解酶启动子序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述脂解酶以至少20g/升培养物上清液的量产生。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括浓缩和/或分离和/或回收所述脂解酶的额外步骤。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述里氏木霉细胞通过用所述核苷酸序列转化或转染里氏木霉细胞制备。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述里氏木霉细胞通过利用基因枪转化用所述核苷酸序列对其进行转化而提供或所述里氏木霉细胞利用基因枪转化而转化有所述核苷酸序列。
8.一种脂解酶，所述脂解酶可通过前述权利要求中任一项所述的方法获得。
9.一种食品，所述食品包含根据权利要求8的所述脂解酶。
10.一种里氏木霉细胞，所述细胞包含：
a)至少一条编码脂解酶蛋白的异源核苷酸序列，所述脂解酶蛋白与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少40％的序列同一性；和/或
b)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列；和/或
c)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含在严格条件下与如下序列杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列或它们中任一者的互补序列。
11.根据权利要求10所述的里氏木霉细胞，其中所述细胞包含至少两条(如至少三条，如至少四条，如至少五条或如至少六条)编码所述脂解酶的异源核苷酸序列。
12.一种表达载体，所述表达载体包含：
i)至少一条核苷酸序列，所述核苷酸序列：
a)编码与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少40％序列同一性的脂解酶蛋白；和/或
b)编码脂解酶并且包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列；和/或
c)编码脂解酶，其中所述核苷酸序列包含在严格条件下与如下序列杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列或它们中任一者的互补序列；和
ii)至少一个纤维二糖水解酶启动子，其中所述至少一条核苷酸序列处于所述至少一个纤维二糖水解酶启动子的控制下。
13.根据权利要求12所述的表达载体，其中所述载体还包含编码信号肽的核苷酸序列，所述编码所述信号肽的核苷酸序列可操作地连接至编码所述脂解酶的所述核苷酸序列。
14.里氏木霉细胞在表达如下序列中的用途：
a)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，所述脂解酶包含SEQID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；和/或
b)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列；和/或
c)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含在严格条件下与如下序列杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列或它们中任一者的互补序列；
用于改善如下情况中的一种或多种：脂解酶的表达、脂解酶的糖基化、酶活性或产量。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的发明，其中所述里氏木霉细胞包含一种或多种受抑制的编码非脂解酶的基因，优选两种或更多种受抑制的编码非脂解酶的基因，优选三种或更多种受抑制的编码非脂解酶的基因，优选四种或更多种受抑制的编码非脂解酶的基因。
16.根据权利要求15所述的发明，其中所述受抑制的编码非脂解酶的基因中的至少一种或每一种为受抑制的编码纤维素酶的基因。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的发明，其中在所述核苷酸序列表达后将所述里氏木霉细胞从所述酶已分泌进其中的培养基移除。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的发明，其中在所述核苷酸序列表达后将所述里氏木霉细胞从所述酶已分泌进其中的培养基移除；然后浓缩所述无细胞的培养基。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的发明，其中在一段时间以产生足够水平的所述分泌的酶之后且在分离和/或纯化和/或浓缩所述酶之前升高所述酶分泌进其中的培养基的pH。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的发明，其中针对在培养所述细胞后本发明的酶已分泌进其中的培养基进行如下步骤：调节所述培养基的pH，用水稀释所述培养基；从所述培养基分离出所述细胞；浓缩所述培养基，其中所述培养基是无细胞的；以及任选对所述培养基进行制粒，其中所述培养基是无细胞的。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的发明，其中所述酶在一种方法中使用以制备旨在用于人消费的食物或食品，所述方法包括将所述酶与合适的食物或食品成分混合。
22.根据权利要求21所述的发明，其中所述酶处于在培养所述细胞后本发明的酶已分泌进其中的培养基中。
23.根据权利要求21或权利要求22所述的发明，其中所述培养基是无细胞的。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的发明，其中将所述培养基进行浓缩。
25.根据权利要求21至24中任一项所述的发明，其中将所述培养基进行制粒。
26.一种方法，所述方法是如本文结合实施例和附图总体描述的。
27.一种里氏木霉细胞，所述细胞是如本文结合实施例和附图总体描述的。
28.一种表达载体，所述载体是如本文结合实施例和附图总体描述的。
29.一种用途，所述用途是如本文结合实施例和附图总体描述的。
30.一种产生脂解酶的方法，所述方法包括如下步骤：
(i)提供转化的或转染的里氏木霉细胞，所述细胞包含至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列；
(ii)在允许编码所述脂解酶的所述异源核苷酸序列表达的条件下于pH 4至pH 5.5下培养所述细胞；
(iii)在pH 5.5至pH 6.5下分离、纯化或浓缩培养基中的所述酶。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述脂解酶：
a)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；和/或
b)由包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示序列或包含与SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列的核苷酸编码；和/或
c)由包含在严格条件下与如下序列杂交的核苷酸序列的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或与SEQ ID NO：3或SEQID NO：4具有至少40％序列同一性的核苷酸序列或它们中任一者的互补序列。
32.一种方法，所述方法基本上是如本文并结合附图描述的。
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