CN102666879A - 模板化的纳米缀合物 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及包含模板化的纳米缀合物的组合物及其使用方法。

Description

模板化的纳米缀合物
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2009年10月30日提交的美国临时申请No.61/256,640、2010年8月17日提交的美国临时申请No.61/374,550以及2010年9月27日提交的美国临时申请No.61/386,846的优先权，其公开全部通过引用并入本文。
政府利益的声明
本发明在由美国陆军RDECOM授予的拨款号W911NF-09-1-0069以及美国国立卫生研究院(NCI-CCNE)授予的拨款号U54CA119341的政府支持下进行。政府具有本发明的某些权利。
技术领域
本公开涉及包含模板化的纳米缀合物的组合物及其使用方法。
背景技术
调节基因表达的核酸被广泛认为是潜在的疗法以及用于基因功能分析的重要工具。核酸方法的潜能在于它们通过识别和结合存在于细胞中的互补靶来调节基因途径的能力。然而，将核酸递送至哺乳动物细胞内依然是主要的挑战，因为细胞天然抵抗核酸摄取。此外，它们具有降解和破坏细胞内外外源性核酸的多种机制。因此，产生可在没有外部转染剂的辅助下无毒地渗透细胞膜以及递送程序化核酸对于这些技术延伸至治疗应用是必要的。
多价无机纳米材料是现公认的潜在体内治疗剂，并且在一些情况中已经获得FDA批准用作诊断工具[Rosi等，Chem.Rev.105(4):1547-1562(2005)；Taton等，Science 289(5485):1757-1760(2000)]。因为这些粒子的表面可通过多种连接策略与生物分子缔合，所以它们可通过其表面配体的选择而被工程化以与众所周知的生物体系和途径相互作用。例如，通过用双螺旋siRNA的稠密外壳(dense shell)来修饰金纳米粒子，有可能致使哺乳动物细胞中的RNAi基因沉默[Giljohann等，J.Am.Chem.Soc.131(6):2072-2073(2009)]。这些粒子可特别有效地作为RNAi基因调节剂，因为它们表现出在没有转染剂时的高细胞摄取[Rosi等，Science 312(5776):1027-1030(2006)]；无急性毒性；对核酸酶降解的抗性[Seferos等，Nano Lett.9(1):308-11(2009)]以及在生物媒介中的高稳定性。重要的是需注意，起作用生长体(growing body ofwork)表明金纳米粒子-多核苷酸缀合物在粒子的表面上执行它们仅源于多核苷酸的紧密排列的各种功能的能力[Giljohann等,Nano Lett.7(12):3818-21(2007)。在另一例子中，通过用磷脂和APO1A(其是生物相关蛋白)的稠密外壳修饰金纳米粒子可构造仿生合成的高密度脂蛋白(HDL)纳米缀合物[Thaxton等，J.Am.Chem.Soc.131(4):1384-5(2009)]。HDL是防止动脉粥样硬化和诸如心脏病和中风的所得疾病的发展的动态血清分子。类似于生源性HDL，该合成构建体能够在其疏水性磷脂外壳中结合胆固醇。重要的是，在这两种情况以及在许多其它情况中，在无机纳米粒子的表面上生物配体的稠密多价排列赋予它们与生物体系相互作用的独特能力，而不管其核心材料。
尽管生物-无机纳米材料杂交体具有期望的属性，例如用于诊断和治疗的那些，但产生对体内核心材料的清除/持续和毒性的担忧。因为这些担忧被广泛认为是对纳米材料体内使用的限制，所以需要通用的方法以产生具有可裁剪的表面功能性的软纳米材料，所述表面功能性将维持它们无机纳米粒子生物缀合物对应物的性质。已尝试通过包括胶束结构等的许多合成策略来解决这些问题[Li等，Nano Lett.4(6):1055-1058(2004)；Liu等，Chem-Eur J16(12):3791-3797(2010)]。
由于它们独特的化学、物理和生物性质，中空纳米缀合物近年引起重要关注，这表明在以下的广泛应用：药物/基因递送[Shu等，Biomaterials 31:6039(2010)；Kim等，Angew.Chem.Int.Ed.49:4405(2010)；Kasuya等,引自Meth.Enzymol.;Nejat,D.,Ed.;Academic Press:2009;Vol.第464卷,第147页]；成像[Sharma等,Contrast Media Mol.Imaging 5:59(2010)；Tan等,J.Chem.Commun.6240(2009)]；以及分析[Choi等,Chem.Phys.120:18(2010)]。因此，基于乳剂聚合[Anton等，J.Controlled Release 128:185(2008)；Landfester等，J.Polym.Sci.PartA:Polym.Chem.48:493(2010)；Li等，J.Am.Chem.Soc.132:7823(2010)]、逐层方法[Kondo等，J.Am.Chem.Soc.132:8236(2010)]、胶束的交联[Turner等，Nano Lett.4:683(2004)；Sugihara等，Angew.Chem.Int.第49版:3500(2010)；Moughton等，Soft Matter 5:2361(2009)]、分子或纳米粒子自组装[Kim等，Angew.Chem.Int.第46版:3471(2007)；Kim等，J.Am.Chem.Soc.132(28):9908-19(2010)]以及牺牲模板技术(sacrificial template technique)[Réthoré等,Small 6:488(2010)]已经开发多种方法以合成这些结构。在这些中，模板化方法特别有效，因为它将控制模板的尺寸和形状的能力转移至产物，所述产物的期望的均匀性和形态难以以其他方式达到。在典型的模板化合成中，选择牺牲核心(sacrificial core)，将在其上涂覆含有潜在的交联部分的优选材料。在通过化学交联稳定涂层后，去除模板，留下期望的中空纳米粒子。对于组成上简单的分子，例如聚(丙烯酸)或壳聚糖，该另外的交联步骤很容易达到[Cheng等,J.Am.Chem.Soc.128:6808(2006)；Hu等,Biomacromolecules 8:1069(2007)]。然而，对于含有敏感性和/或生物功能结构的体系，常规交联化学过程可能不充分正交以防止它们活性的损失。
发明内容
本公开提供包含模板化的纳米缀合物的组合物及其使用方法。本文公开了用于使用或不使用表面产生纳米缀合物的方法。在一方面，使包含可交联的一个或多个部分的生物分子活化，这启动生物分子之间的交联反应。在一些方面，活化是自发的。在反应完成后，表面被任选地溶解，并且所得的中空结构保留表面的形状。没有表面的中空结构表现出纳米缀合物的性质，其中表面仍然完整。
因此，本公开提供多种纳米缀合物，每种纳米缀合物具有限定的结构并且包含在单层中的多种交联生物分子、提供在其上装配所述结构的模板的表面，其中在限定所述结构后，所述表面任选至少部分地被去除。
在各方面，所述纳米粒子选自金纳米粒子、银纳米粒子、铂纳米粒子、铝纳米粒子、钯纳米粒子、铜纳米粒子、钴纳米粒子、铟纳米粒子以及镍纳米粒子。
在一个实施方案中，本公开提供纳米缀合物，其中在所述多种生物分子中每种生物分子均相同。在另一实施方案中，本公开提供纳米缀合物，其中在所述多种生物分子中至少两种生物分子不同。
在各个实施方案中，所述生物分子选自多核苷酸、肽、多肽、磷脂、寡糖、小分子、治疗剂、对比剂及其组合。
在进一步的实施方案中，所述多种纳米缀合物是单分散的。在各方面，所述单分散性使得所述多种纳米缀合物的直径有约25%的变化；或其中所述单分散性使得所述多种纳米缀合物的直径有约10%的变化；或其中所述单分散性使得所述多种纳米缀合物的直径有约1%的变化。
在一些实施方案中，所述表面上的所述交联生物分子的密度对于所述生物分子之间的协同作用是足够的。在各方面，提供多种纳米缀合物，其中所述表面上的所述交联生物分子的密度是约2pmol/cm2；或所述表面上的所述交联生物分子的密度是约100pmol/cm2。
在本公开的另一方面，提供多种纳米缀合物，其中所述多种纳米缀合物还包含另外的试剂。在各方面，所述另外的试剂选自多核苷酸、肽、多肽、磷脂、寡糖、金属络合物、小分子、治疗剂、对比剂及其组合。
在一个实施方案中，所述另外的试剂与所述多种生物分子的至少一种生物分子缔合。在各方面，所述另外的试剂通过杂交与所述多种生物分子的至少一种生物分子缔合，同时在另外的方面，所述另外的试剂与所述多种生物分子的至少一种生物分子共价或非共价缔合。在另一方面，另外的分子被包埋在所述多种纳米缀合物的至少一种的所述交联生物分子中。
在各实施方案中，本公开还提供多种纳米缀合物，其中在缺少所述表面时，所述多种纳米缀合物中至少一种纳米缀合物是中空的；或其中在缺少所述表面时，所述多种纳米缀合物中大部分纳米缀合物是中空的；或其中在缺少所述表面时，所述多种纳米缀合物中基本上所有所述纳米缀合物是中空的。
在一个实施方案中，提供多种纳米缀合物，其中在所述多种纳米缀合物的至少一种中，所述另外的试剂被封装在所述纳米缀合物中，或所述纳米缀合物是中空的。
在一个实施方案中，通过公开还提供交联有结构的纳米缀合物的方法，所述方法包括通过使第一生物分子接触表面来活化所述第一生物分子的步骤，所述活化使得所述第一生物分子交联第二生物分子。在一方面，所述表面提供所述结构在其上装配的模板，同时在另一方面，所述表面是纳米粒子。在各方面，所述纳米粒子选自球形、棒形和三棱形。
在各方面，通过本公开提供的方法还提供，纳米粒子是金属的，以及在另外的方面，所述纳米粒子是胶态金属。因此，在又另外的方面，所述纳米粒子选自金纳米粒子、银纳米粒子、铂纳米粒子、铝纳米粒子、钯纳米粒子、铜纳米粒子、钴纳米粒子、铟纳米粒子和镍纳米粒子。
本公开还提供，在本文所述的任何方法的各实施方案中，交联后所述表面被至少部分地去除。
在一些方面，还提供方法，其中所述第一生物分子和所述第二生物分子选自多核苷酸、肽、多肽、磷脂、寡糖、小分子、治疗剂、对比剂及其组合。在其他方面，所述第一生物分子和所述第二生物分子包含至少一个炔烃部分；或所述第一生物分子和所述第二生物分子各包含约10个炔烃部分。
关于炔烃部分，在各方面，本公开提供，所述炔烃部分在与所述表面接触后被活化。在一方面，所述活化使得所述炔烃易受亲核试剂影响，并且在各实施方案中，所述亲核试剂选自水、醇、胺、硫醇、酯、硫酯、尿素、酰胺、醛、碳酸酯、氨基甲酸酯、分子内羟基、甲醚基、苄醚基、羧酸、酮、亚胺、酚、2-吡咯烷酮、吲哚、乙酸、β-酮酯及其组合。
在本公开的各实施方案中，活化导致所述第一生物分子与所述第二生物分子交联。
在一些方面，所述第一生物分子是多核苷酸，并且在其他方面，所述第二生物分子是多核苷酸。在其他方面，所述多核苷酸是DNA多核苷酸或RNA多核苷酸。
本公开还提供，在各实施方案中，所述多核苷酸长度为约5至约100个核苷酸、长度为约5至约90个核苷酸、长度为约5至约80个核苷酸、长度为约5至约70个核苷酸、长度为约5至约60个核苷酸、长度为约5至约50个核苷酸、长度为约5至约45个核苷酸、长度为约5至约40个核苷酸、长度为约5至约35个核苷酸、长度为约5至约30个核苷酸、长度为约5至约25个核苷酸、长度为约5至约20个核苷酸、长度为约5至约15个核苷酸或者长度为约5至约10个核苷酸。
在另一个实施方案中，在交联步骤过程中，将另外的试剂加入到所述第一生物分子和所述第二生物分子；同时在另一实施方案中，在形成所述纳米缀合物之后但在去除所述表面之前，将另外的试剂加入到所述纳米缀合物。在进一步的实施方案中，在形成所述纳米缀合物之后并且在去除所述表面之后，将另外的试剂加入到所述纳米缀合物。
在另一方面，提供包含包括表面的多价纳米缀合物的组合物，所述纳米缀合物还包含多个多核苷酸，其中所述多个多核苷酸中的每个的间隔端(spacer end)被修饰使得所述多个多核苷酸与化学品的接触使所述多个多核苷酸交联，其中在交联后所述表面任选地至少部分被去除。在组合物的各方面，所述纳米缀合物包含纳米粒子，并且在其他方面，所述纳米粒子选自球形、棒形和三棱形。
因此，在组合物的又进一步方面，所述纳米粒子是金属的。在一方面，所述纳米粒子是胶态金属。在组合物的各实施方案中，所述纳米粒子选自金纳米粒子、银纳米粒子、铂纳米粒子、铝纳米粒子、钯纳米粒子、铜纳米粒子、钴纳米粒子、铟纳米粒子和镍纳米粒子。
在各实施方案中，所述修饰选自胺、酰胺、醇、酯、醛、酮、硫醇、二硫化物、羧酸、酚、咪唑、肼、腙、叠氮化物和炔烃。在一方面，所述修饰是胺-修饰的核苷酸，并且在另一方面，所述胺-修饰的亚磷酰胺核苷酸是胺-修饰的胸苷亚磷酰胺(TN)。
在其他实施方案中，所述化学品选自双琥珀酰亚胺戊二酸酯(Disuccinimidylglutarate)、双琥珀酰亚胺辛二酸酯(Disuccinimidyl suberate)、双[硫代琥珀酰亚胺基]辛二酸酯(Bis[sulfosuccinimidyl]suberate)、三-琥珀酰亚胺基氨基三乙酸酯(Tris-succinimidyl aminotriacetate)、琥珀酰亚胺基4-肼基烟酸盐丙酮腙(succinimidyl4-hydrazinonicotinate acetone hydrazone)、琥珀酰亚胺基4-酰肼基对苯二甲酸酯盐酸盐(succinimidyl 4-hydrazidoterephthalate hydrochloride)、琥珀酰亚胺基4-甲酰苯甲酸酯(succinimidyl 4-formylbenzoate)、二硫代双[琥珀酰亚胺基丙酸酯](Dithiobis[succinimidylpropionate])、3,3′-二硫代双[硫代琥珀酰亚胺基丙酸酯](3,3′-Dithiobis[sulfosuccinimidylpropionate])、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯(Disuccinimidyl tartarate)、双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(Bis[2-(succinimidooxycarbonyloxy)ethyl]sulfone)、乙二醇双[琥珀酰亚胺基琥珀酸酯](Ethylene glycol bis[succinimidylsuccinate])、乙二醇双[硫代琥珀酰亚胺基琥珀酸酯](Ethylene glycol bis[sulfosuccinimidylsuccinate])、二亚胺代己二酸二甲酯·2HCl(Dimethyl adipimidate·2HCl)、庚二亚氨酸二甲酯·2HCl(Dimethyl pimelimidate·2HCl)、辛二亚氨酸二甲酯·2HCl(Dimethyl Suberimidate·2HCl)、1,5-二氟-2,4-二硝基苯(1,5-Difluoro-2,4-dinitrobenzene)、β-[三(羟甲基)膦基]丙酸(β-[Tris(hydroxymethyl)phosphino]propionic acid)、双-马来酰亚胺基乙烷(Bis-Maleimidoethane)、1,4-双马来酰亚胺基丁烷(1,4-bismaleimidobutane)、双马来酰亚胺基己烷(Bismaleimidohexane)、三[2-马来酰亚胺乙基]胺(Tris[2-maleimidoethyl]amine)、1,8-双-马来酰亚胺-二乙二醇(1,8-Bis-maleimido-diethyleneglycol)、1,11-双-马来酰亚胺-三乙二醇(1,11-Bis-maleimido-triethyleneglycol)、1,4双马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷(1,4bismaleimidyl-2,3-dihydroxybutane)、二硫代-双马来酰亚胺基乙烷(Dithio-bismaleimidoethane)、1,4-二-[3′-(2′-吡啶基二硫代)-丙酰氨基]丁烷(1,4-Di-[3′-(2′-pyridyldithio)-propionamido]butane)、1,6-己烷-双-乙烯基砜(1,6-Hexane-bis-vinylsulfone)、双-[b-(4-叠氮基水杨酰氨基)乙基]二硫化物(Bis-[b-(4-Azidosalicylamido)ethyl]disulde)、N-(a-马来酰亚胺乙酰氧基)琥珀酰亚胺酯(N-(a-Maleimidoacetoxy)succinimide ester)、N-[β-马来酰亚胺丙基氧基]琥珀酰亚胺酯(N-[β-Maleimidopropyloxy]succinimide ester)、N-[g-马来酰亚胺丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯(N-[g-Maleimidobutyryloxy]succinimide ester)、N-[g-马来酰亚胺丁酰氧基]硫代琥珀酰亚胺酯(N-[g-Maleimidobutyryloxy]sulfosuccinimide ester)、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester)、琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(Succinimidyl4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate)、硫代琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(Sulfosuccinimidyl4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate)、N-e-马来酰亚胺己酰氧基]琥珀酰亚胺酯(N-e-Maleimidocaproyloxy]succinimide ester)、N-e-马来酰亚胺己酰氧基]硫代琥珀酰亚胺酯(N-e-Maleimidocaproyloxy]sulfosuccinimide ester)、琥珀酰亚胺基4-[对马来酰亚胺苯基]丁酸酯(Succinimidyl 4-[p-maleimidophenyl]butyrate)、硫代琥珀酰亚胺基4-[对马来酰亚胺苯基]丁酸酯(Sulfosuccinimidyl 4-[p-maleimidophenyl]butyrate)、琥珀酰亚胺基-6-[β-马来酰亚胺丙酰氨基]己酸酯(Succinimidyl-6-[β-maleimidopropionamido]hexanoate)、琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧基-[6-酰氨己酸酯](Succinimidyl-4-[N-Maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxy-[6-amidocaproate])、N-[k-马来酰亚胺十一酰氧基]硫代琥珀酰亚胺酯(N-[k-Maleimidoundecanoyloxy]sulfosuccinimide ester)、N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)-propionate)、琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰氨基)己酸酯(Succinimidyl6-(3-[2-pyridyldithio]-propionamido)hexanoate)、4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-甲基-a-[2-吡啶基二硫代]甲苯(4-Succinimidyloxycarbonyl-methyl-a-[2-pyridyldithio]toluene)、4-硫代琥珀酰亚胺基-6-甲基-a-(2-吡啶基二硫代)甲苯酰氨]己酸酯)(4-Sulfosuccinimidyl-6-methyl-a-(2-pyridyldithio)toluamido]hexanoate))；N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(N-Succinimidyl iodoacetate)、琥珀酰亚胺基3-[溴乙酸酯]丙酸酯(Succinimidyl 3-[bromoacetamido]propionate)、N-琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯(N-Succinimidyl[4-iodoacetyl]aminobenzoate)、N-硫代琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯(N-Sulfosuccinimidyl[4-iodoacetyl]aminobenzoate)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸(N-Hydroxysuccinimidyl-4-azidosalicylic acid)、N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰基氧基琥珀酰亚胺(N-5-Azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimide)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(N-Hydroxysulfosuccinimidyl-4-azidobenzoate)、硫代琥珀酰亚胺基[4-叠氮基水杨酰氨基]-己酸酯(Sulfosuccinimidyl[4-azidosalicylamido]-hexanoate)、N-琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(N-Succinimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate)、N-硫代琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(N-Sulfosuccinimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate)、硫代琥珀酰亚胺基-(全氟代叠氮苯甲酰氨基)-乙基-1,3'-二硫代丙酸酯(Sulfosuccinimidyl-(perfluoroazidobenzamido)-ethyl-1,3'-dithioproprionate)、硫代琥珀酰亚胺基-2-(m-叠氮基-o-硝基苯甲酰氨基)-乙基-1,3'-丙酸酯(Sulfosuccinimidyl-2-(m-azido-o-nitrobenzamido)-ethyl-1,3′-proprionate)、硫代琥珀酰亚胺基2-[7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酰氨基]乙基-1,3′二硫代丙酸酯(Sulfosuccinimidyl2-[7-amino-4-methylcoumarin-3-acetamido]ethyl-1,3′dithiopropionate)、琥珀酰亚胺基4,4'-叠氮戊酸酯(Succinimidyl 4,4'-azipentanoate)、琥珀酰亚胺基6-(4,4'-叠氮戊酰氨)己酸酯(Succinimidyl 6-(4,4'-azipentanamido)hexanoate)、琥珀酰亚胺基2-([4,4'-叠氮戊酰氨]乙基)-1,3'-二硫代丙酸酯(Succinimidyl2-([4,4'-azipentanamido]ethyl)-1,3'-dithioproprionate)、硫代琥珀酰亚胺基4,4'-叠氮戊酸酯(Sulfosuccinimidyl 4,4'-azipentanoate)、硫代琥珀酰亚胺基6-(4,4'-叠氮戊酰氨)己酸酯(Sulfosuccinimidyl 6-(4,4'-azipentanamido)hexanoate)、硫代琥珀酰亚胺基2-([4,4'-叠氮戊酰氨]乙基)-1,3'-二硫代丙酸酯(Sulfosuccinimidyl2-([4,4'-azipentanamido]ethyl)-1,3'-dithioproprionate)、二环己基碳二亚胺(Dicyclohexylcarbodiimide)、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride)；N-[4-(p-叠氮基水杨酰氨基)丁基]-3′-(2′-吡啶基二硫代)丙酰胺(N-[4-(p-Azidosalicylamido)butyl]-3′-(2′-pyridyldithio)propionamide)、N-[β-马来酰亚胺丙酸]酰肼(N-[β-Maleimidopropionic acid]hydrazide)、三氟乙酸盐(trifluoroacetic acid salt)、[N-e-马来酰亚胺己酸]酰肼([N-e-Maleimidocaproic acid]hydrazide)、三氟乙酸盐、4-(4-N-马来酰亚胺苯基)丁酸酰肼盐酸盐(4-(4-N-Maleimidophenyl)butyric acid hydrazidehydrochloride)、N-[k-马来酰亚胺十一烷酸]酰肼(N-[k-Maleimidoundecanoicacid]hydrazide)、3-(2-吡啶基二硫代)丙酰肼(3-(2-Pyridyldithio)propionyl hydrazide)、p-叠氮基苯甲酰肼(p-Azidobenzoyl hydrazide)、N-[p-马来酰亚胺苯基]异氰酸酯(N-[p-Maleimidophenyl]isocyanate)以及琥珀酰亚胺基-[4-(补骨脂素-8-基氧基)]-丁酸酯(Succinimidyl-[4-(psoralen-8-yloxy)]-butyrate)。
在另一方面，所述多种多核苷酸包括DNA多核苷酸、RNA多核苷酸或其组合，并且在各实施方案中，所述多核苷酸是的长度为约5至约100个核苷酸、长度为约5至约90个核苷酸、长度为约5至约80个核苷酸、长度为约5至约70个核苷酸、长度为约5至约60个核苷酸、长度为约5至约50个核苷酸、长度为约5至约45个核苷酸、长度为约5至约40个核苷酸、长度为约5至约35个核苷酸、长度为约5至约30个核苷酸、长度为约5至约25个核苷酸、长度为约5至约20个核苷酸、长度为约5至约15个核苷酸或者长度为约5至约10个核苷酸。
在进一步的实施方案中，本公开还提供使用本文所述方法来制备本公开的任何纳米缀合物的方法。
在本公开的另一方面，提供检测靶分子的方法，所述方法包括使靶分子接触本文所述任何纳米缀合物组合物，其中所述靶分子与所述组合物之间的接触导致可检测的变化。在各方面，所述检测是在体外或所述检测是在体内。
在各方面，本公开还提供抑制由靶多核苷酸编码的基因产物的表达的方法，所述方法包括在足以抑制所述基因产物表达的条件下使所述靶多核苷酸接触本文所述的任何纳米缀合物组合物。在各方面，所述基因产物的表达在体内被抑制或者所述基因产物的表达在体外被抑制。在另一方面，所述基因产物的表达被抑制至少约5%。
在各实施方案中，本公开另外提供通过本文所述任何方法制备的本公开的组合物。
附图说明
图1描述用炔烃-NHS酯修饰胺-修饰的DNA。
图2示出A)多种柠檬酸稳定的、DNA官能化以及炔烃-DNA官能化AuNP的溶解。B)在溶解过程中各阶段下的炔烃-DNA官能化AuNP。C)B中相应时间点的UV-Vis光谱。
图3示出在溶解过程中金纳米粒子的指定溶液的TEM图像。
图4示出A)游离链DNA与交联的结构和DNA官能化AuNP的凝胶电泳比较。B)由具有一系列密度的炔烃-DNA-AuNP获得的交联结构的凝胶电泳分析。
图5描述A)由一系列不同尺寸的模板形成的中空DNA纳米缀合物的凝胶电泳。B)由用炔烃-DNA官能化的AuNP获得的交联结构的凝胶电泳，所述炔烃-DNA用不同数量的炔烃单元修饰。
图6示出Fl和Cy3修饰的中空DNA纳米缀合物的双链体系。在60℃下，对这些粒子进行去杂交并且观察到荧光素的绿色荧光。在室温下，将粒子杂交并且从荧光素至Cy3的FRET产生Cy3的橙色荧光。在此时间后，这些粒子形成在溶液中沉淀的肉眼可见的聚集物。
图7描述在260nm处游离链DNA的作为温度的函数的消光(extinction)。DNA-AuNP聚集物在520nm处形成这些链并且中空DNA纳米缀合物聚集物在260nm处形成相同链。
图8描述A)归一化至GAPDH的用dharmafect(游离)、siRNA-AuNP以及siRNA-中空纳米粒子处理的细胞的EGFR mRNA的RT-qPCR定量。B)在用siRNA-中空纳米粒子处理的细胞中EGFR和GAPDH的蛋白质印迹。
图9示出A)聚合物涂覆的13nm AuNP的溶解过程。B)在溶解过程中各时间点的AuNP的归一化UV-Vis光谱。C)a)聚合物涂覆的AuNP、b-c)部分形成的纳米缀合物和d)完全形成的纳米缀合物的TEM图像(用0.5%乙酸双氧铀进行负染色)。
图10示出A)通过动力光散射测量的AuNP(13、20、30和40nm)、聚合物涂覆的AuNP和聚合物纳米缀合物(PNS)的数均流体动力直径。B)a)20nm PNS和b)40nm PNS的TEM图像(用0.5%乙酸双氧铀进行负染色)。在c)中，说明为什么纳米胶囊在TEM中呈现圆环形。黑色：乙酸双氧铀斑点。蓝色：在表面上塌陷的PNS。
图11示出A)1的1H-13C NMR光谱。B)4的1H-13C NMR光谱。C)4的1H-1HCOSY。D)1(虚线)和4(实线)的IR光谱。
图12示出A)5的HSQC。B)在反应后5的HSQC。C)在反应前后5的MALDI-TOFMS。
图13示出A)与AuNP孵育后DNA-炔丙醚缀合物6的MALDI-TOF。B)与6的AuNP孵育后6的琼脂糖凝胶(3%)电泳，证实用单一乙炔基(图12)使3-臂交联成为可能的所提出的交联机制的预测。
图14描述A)含有链霉亲和素和HRP的蛋白纳米缀合物的结构。B)蛋白纳米缀合物的HRP活性的基于表面的显色分析。
图15示出蛋白纳米缀合物的HRP-催化的显色分析，显示链霉亲和素和HRP成功并入纳米缀合物外壳内以及蛋白功能的保留。
图16描述通过使用炔烃部分和含有磷脂的聚合物以及APO1A蛋白来形成中空HDL纳米粒子的可能途径。
图17描述多炔烃交联的可能途径。
具体实施方式
本文提供包含多种纳米缀合物的组合物，每种纳米缀合物具有限定的结构并且包含在单层中的多种交联生物分子、所述通过表面限定结构以及为单分散的多种纳米缀合物，其中在所述结构被限定后所述表面的存在为任选的。
所公开的纳米缀合物是如在例如Rosi等,Chem.Rev.105(4):1547-1562(2005)；Taton等,Science 289(5485):1757-1760(2000),PCT/US2006/022325和美国专利号6,361,944中所述的官能化纳米粒子的有效替代选择，因为它们表现出在没有转染剂下的高细胞摄取、没有急性毒性、表现出对核酸酶降解的抗性以及具有在生物媒介中的高稳定性。这些性质的组合是重要的，因为尽管生物分子-功能化纳米粒子的极高摄取，但它们在迄今测定的细胞类型中没有表现出毒性(参见表1，如下)，并且该性质对于降低脱靶效应的治疗剂递送应用是重要的。
表1
Figure BDA00001789635800111
因此，本公开提供与纳米缀合物的产生相关的组合物和方法。在一方面，纳米缀合物包含彼此交联和连接至表面的生物分子。在一些方面，表面溶解，留下中空纳米缀合物。因此，能将包含如本文所使用的生物分子和/或非生物分子的纳米缀合物理解为意指其中表面保留的纳米缀合物或其中表面如本文所述已经溶解的纳米缀合物。本文中其中表面已经溶解的纳米缀合物称为中空纳米缀合物或中空粒子。
因此，提供多种纳米缀合物，其中每种纳米缀合物具有限定的结构并且包含在单层中的多种交联生物分子。每种纳米缀合物的结构通过以下限定：(i)在纳米缀合物的制备中使用的表面；(ii)形成纳米缀合物的生物分子类型；以及(iii)在表面上和/或周围单个生物分子之间交联的程度和类型。尽管表面是完整的以用于制备纳米缀合物，但是表面不是完整的以维持纳米缀合物的结构。因此，在可选择的实施方案中，多种纳米缀合物包括在其制备中使用的表面或者多数包括部分表面，或者多数不包括表面。
术语“表面”意思是在其上或其周围形成纳米缀合物的结构。
如本文所使用，“生物分子”理解为包括多核苷酸、肽、多肽、磷脂、寡糖、小分子、治疗剂、对比剂及其组合。
注意，如本说明书和所附权利要求中所使用，除非文本中另有清楚说明外，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数参照物。
还应注意，如本文所使用的术语“约”理解为意指近似。
另外注意，术语“连接”、“缀合”和“官能化”在本文中交换使用，并且是指多核苷酸、肽、多肽、磷脂、寡糖、金属络合物、小分子、治疗剂、对比剂及其组合与表面的连接。
如本文所使用，“大多数”意思是大于总体的50%(例如但不限于，生物分子总体或纳米缀合物总体)。而且，如本文所使用的“基本上所有”意思是总体的90%或更多。
纳米缀合物
生物分子/非生物分子
所提供的纳米缀合物的基本组分是多种生物分子。然而，在可选择的实施方案中，提供纳米缀合物，其中一种或多种非生物分子包括在多种生物分子中。因为制备方法，所得的纳米缀合物至多是生物分子的单层或者生物分子与非生物分子的混合物。如本文所使用，“单层”意思是仅生物分子和/或非生物分子的单一层在纳米缀合物的表面处交联。
如本文所使用的生物分子包括但不限于多核苷酸、肽、多肽、磷脂、寡糖、小分子、治疗剂、对比剂及其组合。
如本文所使用的非生物分子包括但不限于稀释剂分子、金属络合物和本领域已知的任何含有非-碳的分子。
在纳米缀合物的各方面，所有生物分子均相同，或可选择地，至少两种生物分子为不同的。类似地，当包括非生物分子时，在一方面，所有非生物分子均相同，并且在另一方面，至少两种非生物分子是不同的。涵盖其中所有生物分子相同且所有非生物分子相同的组合连同以下混合物：至少两种生物分子结合均相同的非生物分子，所有生物分子相同并且至少两种非生物分子不同，以及至少两种不同的生物分子结合至少两种不同的非生物分子。
如本文所使用的生物分子和/或非生物分子将理解为纳米缀合物结构一部分的结构生物分子和/或结构非生物分子，或者不是纳米缀合物结构一部分的非结构生物分子和/或非结构非生物分子。在一些方面，其中生物分子和/或非生物分子是非结构的，生物分子和/或非生物分子不含有交联部分。在该公开中，非结构生物分子和非结构非生物分子被称为另外的试剂。
结构
在各方面，纳米缀合物的“结构”理解为通过以下限定：(i)在纳米缀合物的制备中使用的表面；(ii)形成纳米缀合物的生物分子类型；和/或(iii)在表面上和/或周围单个生物分子之间交联的程度和类型。
在所提供的纳米缀合物的各方面，具有或没有非生物分子的生物分子交联。有或没有非生物分子的生物分子之间的交联是在可交联的每种生物分子部分处实现。如果纳米缀合物包含生物分子和非生物分子作为结构组分，那么在一些方面，生物分子和非生物分子缀合在一起。可理解，一定程度的分子内交联可出现在其中生物分子和/或非生物分子包括多个交联部分的纳米缀合物的形成的例子中。
在一些方面，交联部分是可变得活化以交联的部分。活化的部分意思是存在于生物分子和/或非生物分子(当存在时)的交联部分处于使该部分能够与另一生物分子和/或非生物分子(当存在时)交联的状态，所述活化的部分也含有交联部分。多种生物分子和/或非生物分子上的交联部分对于多种中每种生物分子和/或非生物分子可以是相同的，或多种中至少两种生物分子和/或非生物分子可包含不同的交联部分。也涵盖单一生物分子和/或非生物分子以包含不止一个交联部分，并且那些部分可相同或不同。
在一方面，交联部分位于每种生物分子和/或非生物分子(当存在时)中相同的位置，在一定条件下所述交联部分以相同方向定向所有生物分子和非生物分子。
在另一方面，交联部分位于生物分子和/或非生物分子的不同位置，在一定条件下所述交联部分可提供在交联后生物分子的混合定向。
形状
通过在其制备中使用的表面以及任选通过在其制备中使用的生物分子和/或非生物分子以及生物分子和/或非生物分子之间的交联的程度和类型来测定在多数中每种纳米缀合物的形状定。在各方面，表面是平面或三维的。必要地，平面表面将产生平面纳米缀合物，并且三维表面将产生模拟三维表面的三维形状。当表面被去除时，用平面表面形成的纳米缀合物仍然是平面，并且用三维表面形成的纳米缀合物将具有三维表面的形状，并且将是中空的。
密度
取决于交联的程度和起始组分的量，即，在制备性混合物中生物分子或者生物分子和非生物分子的混合物，涵盖所提供的纳米缀合物以具有不同的密度。因此，在一方面，表面完全被交联生物分子或者生物分子和非生物分子的交联混合物所覆盖；或者在可选择的方面，表面被交联生物分子或者生物分子和非生物分子的交联混合物显著覆盖；或者表面被交联生物分子或者生物分子和非生物分子的交联的混合物稀疏地覆盖。在一方面，表面覆盖密度在整个表面均匀；或者可选择地，密度在表面上不均匀。
纳米缀合物的交联生物分子或生物分子和非生物分子的交联的混合物的密度、和/或在表面上密度的均匀性或缺乏均匀性将决定纳米缀合物的孔隙率。在各方面，孔隙率决定在表面去除后纳米缀合物包埋如下所讨论非结构试剂在纳米缀合物内部的能力。
另外的试剂
关于非结构组分，所提供的纳米缀合物任选地包括另外的试剂，在如上所讨论的一方面，所述试剂包埋在中空纳米缀合物的内部。可选择地，另外的试剂嵌入或陷入在结构交联生物分子或者交联生物分子和非生物分子的混合物中或者与结构交联生物分子或者交联生物分子和非生物分子的混合物的一个或两个表面简单地缔合。设想一方面该另外的试剂共价缔合纳米缀合物或可选择地，非共价缔合纳米缀合物。然而，据理解，本公开提供其中一种或多种另外的试剂与纳米缀合物均共价和非共价缔合的纳米缀合物。还应理解，非共价缔合包括杂交(即，多核苷酸之间)、蛋白质结合(即，在可结合的蛋白质之间)和/或疏水性相互作用(即，在类脂和包含足够疏水性结构域的其它试剂之间)。在其它方面，另外的试剂包埋在中空纳米缀合物的内部。当纳米缀合物包含该另外的试剂时，设想在一方面所有另外的试剂是相同的，以及在其它方面，至少两种另外的试剂不同。
本公开所涵盖的另外的试剂包括但不限于生物分子、非生物分子、可检测标记、涂层、聚合剂、对比剂、栓塞剂、短内部互补多核苷酸(sicPN)、转录调节剂、治疗剂、抗生素和靶部分。这些类型的另外的试剂在以下中详细讨论。
生物分子/非生物分子
具有与其它生物分子和/或非生物分子交联的能力的生物分子和非生物分子(当存在时)代表纳米缀合物的结构组分。如上所述，也涵盖生物分子和非生物分子作为纳米缀合物的另外的非结构试剂。如所述，生物分子包括多核苷酸、肽、多肽、磷脂、寡糖、小分子、治疗剂、对比剂及其组合。
对于本公开的所有结构生物分子和/或非生物分子共有的是，它们包含一个或多个交联部分。涵盖具有或不具有交联能力的非结构生物分子和/或非生物分子，但是交联的非结构生物分子和/或非生物分子不是维持纳米缀合物结构的一部分。
后面讨论解决结构或非结构的生物分子和/或非生物分子。如上所述，作为另外的试剂的非结构生物分子和非生物分子还在以下单独的部分中详细讨论。
多核苷酸
由本公开涵盖的多核苷酸包括如本文所定义的DNA、RNA、修饰形式及其组合。因此，在一些方面，纳米缀合物包含DNA。在一些实施方案中，DNA是双链，以及在另外实施方案中，DNA是单链。在另外的方面，纳米缀合物包含RNA；以及在又另外的方面，纳米缀合物包含双链RNA；以及在具体的实施方案中，双链RNA试剂是小干扰RNA(siRNA)。术语“RNA”包括两条单独链的双链体以及单链结构。单链RNA还包括具有二级结构的RNA。在一方面，涵盖了具有发夹环的RNA。
在一些方面，当纳米缀合物包含多种结构多核苷酸生物分子时，多核苷酸由与多核苷酸的靶序列足够互补的序列组成，使得为纳米缀合物的一部分的多核苷酸与靶多核苷酸发生杂交。在各方面，多核苷酸是单链的或双链的，只要双链分子还包括与靶多核苷酸的单链序列杂交的单链序列。在一些方面，为纳米缀合物的一部分的多核苷酸与双链靶多核苷酸的杂交能形成三链体结构。在另一方面，通过为纳米缀合物的一部分的双链多核苷酸与单链靶多核苷酸的杂交可形成三链体结构。三链体多核苷酸复合物的进一步描述可在PCT/US2006/40124找到，其全部内容通过引用并入本文中。
在一些方面，多核苷酸含有如本文所述的间隔区。在一方面，间隔区包含促进一种多核苷酸与另一多核苷酸交联的一个或多个交联部分。
在本领域中“多核苷酸”理解为单独包含聚合的核苷酸亚单位。如本文所使用的术语“核苷酸”或其复数可与如本文所讨论的修改形式和本领域已知的其它形式交换使用。在某些情况中，本领域使用术语“核碱基”，其包括天然存在的核苷酸和非天然存在的核苷酸，其包括修饰的核苷酸。因此，核苷酸或核碱基意思是天然存在的核碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。非天然存在的核碱基包括例如但不限于，黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮杂黄嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、N4,N4-桥亚乙基胞嘧啶、N',N'-桥亚乙基-2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶(mC)、5-(C3-C6)-炔基-胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷和在Benner等，美国专利No.5,432,272以及Susan M.Freier和Karl-Heinz Altmann,1997,Nucleics Acids Research,第25卷:第4429-4443页中所述的“非天然存在的”核碱基。术语“核碱基”不仅还包括已知嘌呤和嘧啶杂环化合物，还包括杂环类似物及其互变异构体。另外的天然和非天然存在的核碱基包括在美国专利No.3,687,808(Merigan,等)；Sanghvi的AntisenseResearch and Application,Ed.S.T.Crooke和B.Lebleu,CRC Press,1993的第15章；Englisch等,1991,Angewandte Chemie,International Edition,30:613-722(特别参见第622和623页)；以及在Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering,J.I.Kroschwitz Ed.,John Wiley&Sons,1990,第858-859页；Cook,Anti-Cancer Drug Design1991,6,585-607中所公开的那些，其全部内容在此通过引用并入。在各方面，多核苷酸还包括为非天然存在的核苷酸的种类的一种或多种“核苷酸碱基(nucleosidic base)”或“碱基单位(base unit)”，其包括可用作例如核碱基的诸如杂环化合物的化合物，包括在最常规意义上不是核苷酸碱基但是用作核苷酸碱基的某些“通用碱基(universalbase)”。通用碱基包括3-硝基吡咯、任选取代的吲哚(例如，5-硝基吲哚)以及任选取代的次黄嘌呤。其它理想的通用碱基包括吡咯、二唑或二唑衍生物，包括本领域已知的那些通用碱基。
修饰的核苷酸描述在EP 1072679和WO 97/12896中，其公开通过引用并入本文中。修饰的核苷酸包括但不限于：5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物；2-硫尿嘧啶；2-硫代胸腺嘧啶和2-巯基胞嘧啶；5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶和嘧啶碱基的其它炔基衍生物；6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸苷嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤代，特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；2-F-腺嘌呤；2-氨基-腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤和3-脱氮杂鸟嘌呤以及3-脱氮杂腺嘌呤。进一步修饰的碱基包括三环嘧啶，例如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)；吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)；G-夹钳(G-clamp)，例如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并恶嗪-2(3H)-酮)；咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)；吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。修饰的碱基还可包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环取代的那些，例如7-脱氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟苷、2-氨基吡啶以及2-吡啶酮。另外的核碱基包括美国专利No.3,687,808公开的那些；ConciseEncyclopedia OfPolymer Science And Engineering,第858-859页,Kroschwitz,J.I.,编著John Wiley&Sons,1990所公开的那些；Englisch等,1991,Angewandte Chemie,International Edition,30:613所公开的那些；以及Sanghvi,Y.S.,第15章,AntisenseResearch and Applications,第289-302页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.,编著CRC Press,1993所公开的那些。这些碱基的某些可用于增加结合亲和力，并且包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已显示0.6-1.2℃下以及在某些方面与2'-O-甲氧乙基糖修饰联合的5-甲基胞嘧啶取代增加核酸双链体稳定性。参见，美国专利No.3,687,808、美国专利No.4,845,205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617、5,645,985、5,830,653、5,763,588、6,005,096、5,750,692以及5,681,941，其公开通过引用并入本文中。
制备预定序列的多核苷酸的方法是众所周知的。例如，参见Sambrook等,MolecularCloning:A Laboratory Manual(第二版，1989)和F.Eckstein(编著)Oligonucleotides andAnalogues,第一版，(Oxford University Press,New York,1991)。对于多核糖核苷酸和多脱氧核糖核苷酸，固相合成方法都是优选的(合成DNA的众所周知方法也用于合成RNA)。多核糖核苷酸可通过酶法制备。非天然存在的核碱基也可并入多核苷酸。例如，参见美国专利No.7,223,833；Katz,J.Am.Chem.Soc.,74:2238(1951)；Yamane,等,J.Am.Chem.Soc.,83:2599(1961)；Kosturko,等,Biochemistry，13:3949(1974)；Thomas,J.Am.Chem.Soc.,76:6032(1954)；Zhang,等,J.Am.Chem.Soc.,127:74-75(2005)；Zimmermann,等,J.Am.Chem.Soc.,124:13684-13685(2002)。
所提供的用于模板化多核苷酸的表面、或其修饰形式通常包含长度为约5个核苷酸至约100个核苷酸的多核苷酸。更具体而言，纳米缀合物包含多核苷酸、其长度为约5至约90个核苷酸、长度为约5至约80个核苷酸、长度为约5至约70个核苷酸、长度为约5至约60个核苷酸、长度为约5至约50个核苷酸、长度为约5至约45个核苷酸、长度为约5至约40个核苷酸、长度为约5至约35个核苷酸、长度为约5至约30个核苷酸、长度为约5至约25个核苷酸、长度为约5至约20个核苷酸、长度为约5至约15个核苷酸、长度为约5至约10个核苷酸，并且所有多核苷酸中间体的具体公开的尺寸长度为使得多核苷酸能够达到期望结果的范围。因此，涵盖5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个核苷酸长度的多核苷酸。
如本文所定义，多核苷酸还包括适配子。本领域普通技术人员已知适配子的制备和使用。通常，适配子是能够紧密结合和小心分开靶配体的核酸或肽结合种类[Yan等,RNA Biol.6(3)316-320(2009)，其全部内容通过引用并入本文中]。在一些实施方案中，适配子可通过称为指数富集的配体系统进化(SELEX)过程的技术而获得[Tuerk等,Science 249:505-10(1990)；美国专利号5,270,163和美国专利号5,637,459，其各自的全部内容通过引用并入本文中]。核酸适配子的通常讨论在以下中找到：例如但不限于Nucleic Acid and Peptide Aptamers:Methods and Protocols(由Mayer编著,Humana Press,2009)以及Crawford等,Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2(1):72–79(2003)。适配子的另外的讨论，包括但不限于RNA适配子的选择、DNA适配子的选择、能够共价连接靶蛋白的适配子的选择、修饰的适配子文库的使用以及作为诊断剂和治疗剂的适配子的使用，提供在由Molekulyarnaya Biologiya,第34卷,No.6,2000,第1097-1113页翻译的Kopylov等，分子Biology 34(6):940-954(2000)中，其全部内容通过引用并入本文中。在各方面，适配子的长度介于10-100个核苷酸之间。
间隔序列
在某些方面，涵盖这样的纳米缀合物，其包括其中纳米缀合物包含进一步含有间隔端的生物分子的那些。在各方面，间隔序列包含如下所述的一个或多个交联部分。
如本文所使用的“间隔序列”意思是用于含有一个或多个交联部分的部分；或者在其中纳米缀合物包含纳米粒子的一些方面，用于增加纳米粒子和生物分子之间的距离的部分；或者当在多拷贝中连接至纳米粒子时，用于增加单个生物分子之间的距离的部分。在其中纳米缀合物用于生物活性的本公开的方面，涵盖不直接参与其连接的生物分子的活性的间隔序列。
因此，在一些方面，本文涵盖间隔序列以通过一个或多个交联部分来促进交联。在各方面，另外涵盖如位于串联的单个生物分子之间的间隔序列，无论该生物分子是否具有相同的序列或具有不同的序列。在一方面，当存在时，间隔序列是有机部分。在另一方面，间隔序列是聚合物，包括但不限于水溶性聚合物、核酸、多肽、寡糖、糖、类脂或其组合。
在其中间隔序列是多核苷酸的情况中，在各实施方案中，间隔序列的长度为至少约5个核苷酸、至少约10个核苷酸、10-30个核苷酸或甚至大于30个核苷酸。间隔序列可具有任何序列，其不干扰多核苷酸与纳米粒子或靶多核苷酸结合的能力。间隔序列不应具有彼此互补或与多核苷酸的序列互补、但可与靶多核苷酸全部或部分互补的序列。在某些方面，多核苷酸间隔序列的碱基全部均是腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶核苷、鸟嘌呤、尿嘧啶或一些其它修饰的碱基。
修饰的多核苷酸
如上所讨论，涵盖修饰的多核苷酸以用于制备纳米缀合物，以及通过表面模板化。在各方面，在表面上模板化的多核苷酸完全被修饰或部分被修饰。因此，在各方面，在多核苷酸中一种或多种或所有糖和/或一种或多种或所有核苷酸内键合被“非天然存在的”基团取代。
在一方面，本实施方案涵盖肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，多核苷酸的糖主链被含酰胺主链取代。例如，参见美国专利No.5,539,082；5,714,331；和5,719,262；以及Nielsen等,Science,1991,254,1497-1500，其公开通过引用并入本文中。
公开的多核苷酸所涵盖的核苷酸和非天然核苷酸之间的其它键合包括在如下所述的那些：美国专利No.4,981,957；No.5,118,800；No.5,319,080；No.5,359,044；No.5,393,878；No.5,446,137；No.5,466,786；No.5,514,785；No.5,519,134；No.5,567,811；No.5,576,427；No.5,591,722；No.5,597,909；No.5,610,300；No.5,627,053；No.5,639,873；No.5,646,265；No.5,658,873；No.5,670,633；No.5,792,747；和No.5,700,920；美国专利公开No.20040219565；国际专利公开No.WO 98/39352和WO 99/14226；Mesmaeker等,Current Opinion in Structural Biology 5:343-355(1995)以及Susan M.Freier和Karl-Heinz Altmann,Nucleic Acids Research,25:4429-4443(1997),其公开通过引用并入本文中。
多核苷酸的具体例子包括含有修饰的主链或非天然的核苷酸内键合的那些。具有修饰的主链的多核苷酸包括在主链中保留磷原子的那些以及在主链中没有磷原子的那些。在它们的核苷酸内主链中没有磷原子的修饰的多核苷酸被认为是在“多核苷酸”的含义内。
含有磷原子的修饰的多核苷酸主链包括例如硫代磷酸酯；手性硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；氨基烷基磷酸三酯；甲基和其它烷基膦酸酯，包括3'-亚烷基膦酸酯、5'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、亚膦酸酯；氨基磷酸酯，包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯以及硼磷酸酯(boranophosphate)，其具有正常3'-5'键合、这些的2'-5'键合的类似物以及具有反极性的那些，其中一种或多种核苷酸内键合是3'至3'、5'至5'或2'至2′键合。也涵盖包含在最3'核苷酸内部键合处单一3'至3'键合的具有反极性的多核苷酸，即可能为碱性的单一反极性核苷残基(核苷酸缺失或在其位置上具有羟基)。也涵盖盐、混合盐和游离酸形式。
教导上述含磷键合制备的代表性美国专利包括美国专利No.3,687,808；No.4,469,863；No.4,476,301；No.5,023,243；No.5,177,196；No.5,188,897；No.5,264,423；No.5,276,019；No.5,278,302；No.5,286,717；No.5,321,131；No.5,399,676；No.5,405,939；No.5,453,496；No.5,455,233；No.5,466,677；No.5,476,925；No.5,519,126；No.5,536,821；No.5,541,306；No.5,550,111；No.5,563,253；No.5,571,799；No.5,587,361；No.5,194,599；No.5,565,555；No.5,527,899；No.5,721,218；No.5,672,697以及No.5,625,050，其公开通过引用并入本文中。
不包括磷原子的修饰的多核苷酸主链具有通过短链烷基或环烷基核苷内键合、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷内键合或一种或多种短链杂原子或杂环核苷内键合形成的主链。这些包括具有吗啉代键合；硅氧烷主链；硫化物；亚砜和砜主链；formacetyl和碱式二硫代水杨酸铋乙酰基(thioformacetyl)主链；亚甲基formacetyl和碱式二硫代水杨酸铋乙酰基主链；riboacetyl主链；含有烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚胺和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合的N、O、S和CH2组分部分的其他主链的那些。在又一其它实施方案中，提供具有硫代磷酸酯主链的多核苷酸和具有杂原子主链的寡核苷酸，并且包括在美国专利No.5,489,677和5,602,240所述的—CH2-NH—O—CH2—、—CH2-N(CH3)—O—CH2—、；—CH2—O-N(CH3)-CH2—、—CH2-N(CH3)-N(CH3)—CH2—和—O-N(CH3)—CH2—CH2—。例如，参见美国专利No.5,034,506；No.5,166,315；No.5,185,444；No.5,214,134；No.5,216,141；No.5,235,033；No.5,264,562；No.5,264,564；No.5,405,938；No.5,434,257；No.5,466,677；No.5,470,967；No.5,489,677；No.5,541,307；No.5,561,225；No.5,596,086；No.5,602,240；No.5,610,289；No.5,602,240；No.5,608,046；No.5,610,289；No.5,618,704；No.5,623,070；No.5,663,312；No.5,633,360；No.5,677,437；No.5,792,608；No.5,646,269和No.5,677,439，其公开通过引用全部并入本文中。
在各形式中，在多核苷酸中两个连续单体之间的键合由2至4、期望为3个选自下列的基团/原子组成：-CH2-、-O-、-S-、-NRH-、>C=O、>C=NRH、>C=S、—Si(R")2—、—SO—、—S(O)2—、—P(O)2—、—PO(BH3)—、—P(O,S)—、—P(S)2—、-PO(R")-、-PO(OCH3)-以及-PO(NHRH)-，其中RH选自氢和C1-4-烷基，以及R"选自C1-6-烷基和苯基。这些键合的示意性例子是-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CO-CH2-、-CH2-CHOH-CH2-、-O-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-O-CH2-CH=(当用作随后单体的键合时包括R5)、-CH2-CH2-O-、-NRH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NRH-、-CH2-NRH-CH2--、-O-CH2-CH2-NRH-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-、-NRH-CS-NRH-、-NRH-C(=NRH)-NRH-、-NRH-CO-CH2-NRH-O-CO-O-、-O-CO-CH2-O-、-O-CH2-CO-O-、-CH2-CO-NRH-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CH＝N—O-、-CH2-NRH-O-、-CH2-O-N=(当用作随后单体的键合时包括R5)、-CH2-O-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-O-、-CH2-NRH-CO-、-O-NRH-CH2-、-O-NRH、-O-CH2-S-、—S—CH2—O—、—CH2—CH2—S—、—O—CH2—CH2—S—、—S—CH2—CH=(当用作随后单体的键合时包括R5)、—S—CH2—CH2—、—S—CH2—CH2—O—、—S—CH2—CH2—S—、—CH2—S—CH2—、—CH2—SO—CH2—、—CH2—SO2—CH2—、—O—SO—O—、—O—S(O)2—O—、—O—S(O)2—CH2—、—O—S(O)2-NRH—、-NRH—S(O)2—CH2—、—O—S(O)2—CH2—、—O—P(O)2—O—、—O—P(O,S)—O—、—O—P(S)2—O—、—S—P(O)2—O—、—S—P(O,S)—O—、—S—P(S)2—O—、—O—P(O)2—S—、—O—P(O,S)—S—、—O—P(S)2—S—、—S—P(O)2—S—、—S—P(O,S)—S—、—S—P(S)2—S—、—O—PO(R")—O—、—O—PO(OCH3)—O—、—O—PO(O CH2CH3)—O—、—O—PO(O CH2CH2S—R)—O—、—O—PO(BH3)—O—、—O—PO(NHRN)—O—、—O—P(O)2-NRH H—、-NRH—P(O)2—O—、—O—P(O,NRH)—O—、—CH2—P(O)2—O—、—O—P(O)2—CH2—和—O—Si(R")2—O—；其中涵盖—CH2—CO-NRH—、—CH2-NRH—O—、—S—CH2—O—、—O—P(O)2—O—O—P(-O,S)—O—、—O—P(S)2—O—、-NRH P(O)2—O—、—O—P(O,NRH)—O—、—O—PO(R")—O—、—O—PO(CH3)—O—和—O—PO(NHRN)—O—，其中RH选自氢和C1-4-烷基，以及R"选自C1-6-烷基和苯基。进一步示意性例子在Mesmaeker等,1995,Current Opinion in Structural Biology，5:343-355以及Susan M.Freier和Karl-Heinz Altmann,1997,Nucleic Acids Research,第25卷：第4429-4443页中给出。
多核苷酸的另外的修饰形式详细描述在美国专利申请No.20040219565中，其公开全部通过引用并入本文中。
修饰的多核苷酸还可含有一种或多种取代的糖部分。在某些方面，多核苷酸在2'位置包含下列中的其中之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以为取代的或未取代的C1至C10烷基或者C2至C10烯基和炔基。其它实施方案包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m是1至约10。其它多核苷酸在2'位置包含以下中的其中之一：C1至C10低级烷基；取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基；O-烷芳基或O-芳烷基；SH；SCH3；OCN；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA分裂基团；报道基团；嵌入剂；改善多核苷酸的药物代谢动力学性质的基团；或者改善多核苷酸的药效性质的基团；以及具有类似性质的其它取代基。在一方面，修饰包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH2CH2OCH3，也称为2'-O-(2-甲氧乙基)或者2'-MOE)(Martin等,1995,Helv.Chim.Acta,78:486-504)即，烷氧基烷氧基。其它修饰包括2'-二甲基氨基氧基乙氧基，即，O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2'-DMAOE和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域也称为2'-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2'-DMAEOE)即，2'-O—CH2—O—CH2-N(CH3)2。
另外的修饰包括2'-甲氧基(2'-O—CH3)；2'-氨基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)；2'-烯丙基(2'-CH2—CH=CH2)；2'-O-烯丙基(2'-O—CH2—CH=CH2)以及2'-氟(2'-F)。2'-修饰可以在阿拉伯糖(arabino)(上)或核糖(ribo)(下)位置。在一方面，2'-阿拉伯糖修饰是2'-F。在多核苷酸上其它位置处还可进行类似的修饰，例如在3'末端核苷酸或2'-5'连接的多核苷酸上糖的3'位置以及5'末端核苷酸的5'位置。多核苷酸还可具有糖模拟物，例如代替戊呋喃糖基糖的环丁基部分。例如，参见美国专利No.4,981,957；No.5,118,800；No.5,319,080；No.5,359,044；No.5,393,878；No.5,446,137；No.5,466,786；No.5,514,785；No.5,519,134；No.5,567,811；No.5,576,427；No.5,591,722；No.5,597,909；No.5,610,300；No.5,627,053；No.5,639,873；No.5,646,265；No.5,658,873；No.5,670,633；No.5,792,747；以及No.5,700,920，其公开全部通过引用并入本文中。
在一方面，糖的修饰包括锁核酸(LNA)，其中2'-羟基连接糖环的3'或4'碳原子，从而形成双环糖部分。在某些方面，键合是桥接2'氧原子和4'碳原子的亚甲基(-CH2-)n，其中n是1或2。LNA及其制备描述在WO 98/39352和WO 99/14226中，其公开通过引用并入本文中。
多核苷酸特征
所提供的每种纳米缀合物包含多种生物分子，以及在各方面，生物分子是多核苷酸。因此，每种纳米缀合物具有结合具有足够互补序列的多种靶多核苷酸的能力。例如，如果靶向具体的多核苷酸，单一纳米缀合物具有结合相同分子的多个拷贝的能力。在一方面，提供其中纳米缀合物包含相同的多核苷酸(即，各多核苷酸具有相同长度和相同序列)的方法。在其它方面，纳米缀合物包含两种或多种不是相同的多核苷酸，即，纳米缀合物的至少一种多核苷酸不同于纳米缀合物的至少一种其它多核苷酸，因为它具有不同长度和/或不同序列。在其中纳米缀合物包含不同的多核苷酸的方面，这些不同的多核苷酸结合相同的单一靶多核苷酸，但在不同位置结合，或结合编码不同基因产物的不同靶多核苷酸。因此，在各方面，在方法中可使用单一纳米缀合物以抑制不止一种基因产物的表达。因此，因可能需要实现期望水平的基因表达的抑制，无论是在靶多核苷酸的一个或多个具体区域或在靶多核苷酸的整个长度中，多核苷酸都用于靶向具体的多核苷酸。
因此，在一方面，使用靶序列的知识来设计多核苷酸。可选择地，在纳米缀合物中多核苷酸无需与靶生物分子杂交以达到如本文所述的期望的效果。无论如何，制备预定序列的多核苷酸的方法是众所周知的。例如，参见Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第二版，1989)以及F.Eckstein(编著)Oligonucleotides andAnalogues,第一版，(Oxford University Press,New York,1991)。对于寡核糖核苷酸和寡脱氧核糖核苷酸，都设想了固相合成方法(合成DNA的众所周知的方法也用于合成RNA)。还可酶法制备寡核糖核苷酸和寡脱氧核糖核苷酸。
可选择地，从文库中选择多核苷酸。该类型的文库的制备是本领域众所周知的。例如，参见Oligonucleotide libraries:2005年9月29日公开的美国专利申请20050214782。
在一方面，涵盖用于制备纳米缀合物的多核苷酸包括调节由靶多核苷酸表达的基因产物的表达的那些多核苷酸。因此，涵盖与靶多核苷酸杂交和抑制翻译的反义多核苷酸；与靶多核苷酸杂交和起始RNA酶活性(例如RNA酶H)的siRNA多核苷酸；与双链多核苷酸杂交和抑制转录的形成多核苷酸的三链体；以及与靶多核苷酸杂交和抑制翻译的核酶。
在一些方面，基于多核苷酸的纳米缀合物使得纳米缀合物足够摄取。在各方面，多核苷酸包含使得纳米缀合物的摄取效率增加的核苷酸序列。如本文所使用，“效率”是指在细胞内或通过细胞纳米缀合物的摄取数量或速率。因为纳米缀合物进出细胞的过程是动态的，可通过吸收更多纳米缀合物或通过保留那些进入细胞的纳米缀合物更长时间来增加效率。类似地，可通过吸收更少的纳米缀合物或通过保留那些进入细胞的纳米缀合物更短时间来降低效率。
因此，核苷酸序列可以是任何期望的核苷酸序列，在各方面，可选择所述核苷酸序列用于增加或降低纳米缀合物的细胞摄取或基因调节。在一些方面，核苷酸序列包含同聚序列，其影响多核苷酸与其连接的纳米粒子由细胞吸收的效率。因此，同聚序列增加或降低效率。在各方面，也设想核苷酸序列是核碱基的组合，从而它不是严格的同聚序列。在各方面，例如但不限于，核苷酸序列包含交替的胸苷和尿苷残基(两个胸苷，随后为两个尿苷)，或本公开涵盖影响摄取增加的任意组合。在一些方面，纳入影响摄取效率的核苷酸序列作为包含另外的序列的多核苷酸中的结构域。该“结构域”将用于作为影响摄取效率的特征，而另外的核苷酸序列将用于例如但不限于调节基因表达。在各方面，多核苷酸中的结构域可在相对于纳米缀合物的近端、远端或中心位置。还设想多核苷酸包含不止一个结构域。
在一些实施方案中，同聚序列增加纳米缀合物由细胞摄取的效率。在一些方面，同聚序列包含胸苷残基(polyT)或尿苷残基(polyU)的序列。在另外的方面，polyT或polyU序列包含两个胸苷或尿苷。在各方面，polyT或polyU序列包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约125、约150、约175、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500或更多个胸苷或尿苷残基。
在一些实施方案中，设想包含含有同聚序列的多核苷酸的纳米缀合物以比包含相同多核苷酸但缺乏同聚序列的纳米缀合物更高的效率由细胞吸收。在各方面，包含含有同聚序列的多核苷酸的纳米缀合物由细胞吸收的效率是包含相同多核苷酸但缺乏同聚序列的纳米缀合物的约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约100倍或更高。
在其它方面，结构域是磷酸酯聚合物(C3残基)。在一些方面，结构域包含由两种磷酸酯组成的磷酸酯聚合物(C3残基)。在各方面，C3残基包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约125、约150、约175、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500或更多种磷酸酯。
在一些实施方案中，设想包含含有结构域的多核苷酸的纳米缀合物以比包含相同多核苷酸但缺乏结构域的纳米缀合物更低的效率由细胞吸收。在各方面，包含含有结构域的多核苷酸的纳米缀合物由细胞吸收的效率是包含相同多核苷酸但缺乏结构域的纳米缀合物的约1/2、约1/3、约1/4、约1/5、约1/6、约1/7、约1/8、约1/9、约1/10、约1/20、约1/30、约1/40、约1/50、约1/100或更低。
如本文所使用，“缀合位点”理解为是指连接对比剂的多核苷酸上的位点。在某些方面，本公开还提供不包含缀合位点的作为纳米缀合物的一部分的一种或多种多核苷酸，而作为相同纳米缀合物的一部分的一种或多种多核苷酸却包含缀合位点。对比剂与纳米缀合物通过缀合位点的缀合通常描述在PCT/US2010/44844中，其全部通过引用并入本文中。在一方面，本公开提供包含多核苷酸的纳米缀合物，其中所述多核苷酸包含一至约十个缀合位点。在另一方面，多核苷酸包含五个缀合位点。通常，对于核苷酸，其主链(磷酸酯基)和核碱基可被修饰。因此，本公开设想有2n个缀合位点，其中n=多核苷酸模板的长度。在相关的方面，设想组合物包含含有多种多核苷酸的纳米缀合物。在一些方面，多种多核苷酸包含对比剂通过一个或多个缀合位点与其缔合的至少一种多核苷酸以及具有如本文所述的基因调节活性的至少一种多核苷酸。
因此，在一些实施方案中，设想作为纳米缀合物的一部分的一种或多种多核苷酸未与对比剂缀合，而作为相同纳米缀合物的一部分的一种或多种多核苷酸与对比剂缀合。
本公开还提供包含纳米缀合物的组合物，其中纳米缀合物包含多核苷酸，并且所述组合物进一步包含转录调节剂，其中转录调节剂诱导靶多核苷酸在靶细胞中的转录。
多核苷酸长度
在一些实施方案中，在所提供的组合物和方法中纳米缀合物包含长度为约5至约100个核苷酸的多核苷酸或其修饰形式。也涵盖方法，其中多核苷酸的长度为约5至约90个核苷酸、长度为约5至约80个核苷酸、长度为约5至约70个核苷酸、长度为约5至约60个核苷酸、长度为约5至约50个核苷酸、长度为约5至约45个核苷酸、长度为约5至约40个核苷酸、长度为约5至约35个核苷酸、长度为约5至约30个核苷酸、长度为约5至约25个核苷酸、长度为约5至约20个核苷酸、长度为约5至约15个核苷酸、长度为约5至约10个核苷酸，并且所有多核苷酸中间体的具体公开的尺寸长度为使得多核苷酸能够达到期望结果的范围。因此，涵盖长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100或更多个核苷酸的多核苷酸。
多核苷酸拷贝-相同/不同序列
提供纳米缀合物，其包括其中在单一多核苷酸中单一序列或在单一多核苷酸中单一序列的多拷贝是纳米缀合物的一部分的那些纳米缀合物。因此，在各方面，涵盖多核苷酸与单一序列的多个拷贝串联，例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个串联重复。
可选择地，纳米缀合物包括至少两种具有不同序列的多核苷酸。如上，在各方面，不同的多核苷酸序列串联排列(即，在单一多核苷酸上)和/或以多个拷贝排列(即，在至少两种多核苷酸上)。在其中具有不同序列的多核苷酸是纳米缀合物的一部分的方法中，本公开的方面包括其中不同多核苷酸序列与相同多核苷酸上的不同区域杂交的那些。可选择地，不同的多核苷酸序列与不同的多核苷酸杂交。
多肽
如本文所使用的“多肽”是指由氨基酸残基组成的聚合物。在本公开的一些方面，纳米缀合物包含如本文所述的多肽。多肽在本领域被理解以及包括但不限于抗体、酶、结构多肽和激素。在相关的方面，包含多肽的纳米缀合物识别靶分子以及与靶分子缔合，并且允许靶分子的检测。本公开的多肽可以是分别如本文所述的生物分子或另外的试剂。
本公开的多肽可以是天然存在的或非天然存在的。多肽任选地包含如上本文所述的间隔序列。如上所述，结构多肽具有交联部分，通过其多肽能够在纳米缀合物制备过程中与一种或多种其它生物分子交联。当多肽是另外的试剂时，多肽无需但可包含交联部分。当另外的多肽试剂包含交联部分时，多肽通常不会与纳米缀合物以纳米缀合物维持结构完整性所需的方式交联。
天然存在的多肽
天然存在的多肽包括但不限于自然界存在的或能通过诸如化学合成或重组表达技术以可在自然界中发现的方式来制备的生物活性多肽(包括抗体)。天然存在的多肽还包括脂蛋白和翻译后修饰的蛋白质，例如但不限于糖基化蛋白。
用于本公开的方法和组合物的所涵盖的抗体包括但不限于识别和缔合体内或体外靶分子的抗体。
本公开所涵盖的结构多肽包括但不限于：肌动蛋白、微管蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、肌球蛋白、驱动蛋白和动力蛋白。
非天然存在的多肽
通过本公开所涵盖的非天然存在的多肽包括但不限于：合成多肽以及如本文所定义的天然存在的或非天然存在的多肽的片段、类似物和变体。非天然存在的多肽还包括在D-或L-构型中具有D-氨基酸、修饰、衍生或非天然存在的氨基酸的蛋白质或蛋白物质和/或作为它们结构一部分的拟肽单元(peptidomimetic unit)。术语“蛋白质”通常是指大多肽。术语“肽”通常是指短多肽。
例如，使用自动多肽合成器或可选择地使用编码期望多肽的修饰的多核苷酸的重组表达技术来制备非天然存在的多肽。
如本文所使用的多肽的“片段”是指小于全长多肽或蛋白质表达产物的多肽或蛋白质的任何部分。
如本文所使用的“类似物”是指结构基本类似并且具有相同生物活性，但可具有与整个分子或其片段不同程度的活性的任意两种或多种多肽。基于一种或多种突变，涉及一种或多种氨基酸被其它氨基酸置换、缺失、插入和/或加入，类似物在它们氨基酸序列的组成上不同。基于被取代的氨基酸的物理-化学或功能相关性和取代它的氨基酸，置换可以为保守的或非保守的。
如本文所使用的“变体”是指被修饰以包含通常不是分子的一部分的另外的化学部分的多肽、蛋白质或其类似物。这些部分可调节例如但不限于：分子的溶解性、吸收和/或生物半衰期。能够调节这些作用的分子公开在Remington's PharmaceuticalSciences(1980)中。偶联这些部分的工序是本领域熟知的。在各方面，通过糖基化、聚乙二醇化和/或聚唾液酸化(polysialylation)来修饰多肽。
还涵盖融合蛋白，包括其中一种融合组分是片段或模拟物的融合蛋白。如本文所使用的“模拟物”意思是具有与其模拟物的蛋白质可比较的生物活性的多肽或蛋白质。例如，内皮生长因子模拟物是具有与天然内皮生长因子可比较的生物活性的肽或蛋白质。术语进一步包括例如通过加强目标蛋白质的天然配体的作用来间接模拟目标蛋白质的活性的肽或蛋白质。
该组的生物分子包括抗体和片段及其衍生物，包括但不限于：Fab'片段、F(ab)2片段、Fv片段、Fc片段、一个或多个互补决定区(CDR)片段、单独的重链、单独的轻链、二聚重和轻链(与在完整抗体中发现的异质四聚体重链和轻链相反)、单链抗体(scAb)、人源化抗体(以及以人源化抗体的方式修饰抗体，但是所得抗体更接近非人种类的抗体)、螯合重组抗体(CRABs)、双特异性抗体和多特异性抗体以及本领域已知的其它抗体衍生物或片段。
磷脂
本公开还涵盖包含磷脂的纳米缀合物。如对于其它生物分子的上述讨论，在某些方面，磷脂生物分子包括任选的间隔序列组分。磷脂是包含如上所述对于其它生物分子的交联部分的结构生物分子，通过所述交联部分，磷脂能够交联其它生物分子。磷脂是可包含但无需包包含交联部分的非结构生物分子。
设想类脂和磷脂衍生的激素为结构和非结构生物分子，并且这些化合物由类脂(诸如亚麻油酸和花生四烯酸)以及磷脂衍生。主要的种类是由胆固醇和类二十烷酸衍生的类固醇激素。
在一具体的实施方案中，通过用磷脂和APO1A的稠密外壳修饰金纳米粒子来构建合成高密度脂蛋白(HDL)纳米缀合物。HDL是保护以免于动脉粥样硬化和诸如心脏病和中风的所得疾病的发展的动态血清纳米缀合物。类似于天然存在的HDL，该合成结构能够在其疏水性磷脂外壳中结合胆固醇。在无机纳米粒子的表面上生物配体的稠密多价布置赋予它们无论核心材料是什么都能与生物体系相互作用的独特的能力。
金属络合物
如本文所定义的金属络合物可以为分别如本文所述的结构非生物分子和/或另外的试剂。金属络合物任选地包括如上本文所述的间隔序列。
如本文所使用的“金属络合物”是指金属并且包括但不限于如本文所述铂化合物、锗(IV)、钛(IV)、锡(IV)、钌(III)、金(III)和铜(II)。如果金属络合物是结构非生物分子，则将必须包含通过其与至其它生物分子和/或非生物分子交联的交联部分。金属络合物是可包含但不必需包含交联部分的另外的试剂。
寡糖
本公开设想寡糖为分别如本文所述的结构生物分子和/或另外的试剂。
寡糖包括含有通过α-或β-糖苷键连接的介于约两种至约十种单糖或更多的任何糖类。在自然界中发现游离和结合形式的寡糖。如对于其它生物分子的上述讨论，在某些方面，磷脂生物分子包括任选的间隔序列组分。寡糖是包含对于其它生物分子如上所述的交联部分的结构生物分子，通过所述交联部分，寡糖能够与其它生物分子交联。寡糖是可包含但无需包含交联部分的非结构生物分子。寡糖任选地包含如上本文所述的间隔序列。
其它非生物分子
如本文所使用的非生物分子选自稀释剂分子、如上所述的金属络合物以及本领域已知的任何含有非碳的分子。
纳米缀合物结构
如本文所述，每种纳米缀合物的结构通过以下限定：(i)在纳米缀合物的制备中使用的表面；(ii)形成纳米缀合物的生物分子类型；以及(iii)在表面上和/或周围单个生物分子之间交联程度和类型。而且，如本文所讨论，在所提供的纳米缀合物的各方面，交联具有或没有非生物分子的生物分子。通过使用一个或多个交联部分来实现交联。
交联
本公开所涵盖的交联部分包括但不限于：胺、酰胺、醇、酯、醛、酮、硫醇、二硫化物、羧酸、酚、咪唑、肼、腙、叠氮化物和炔烃。可使用任何交联部分，只要通过本领域技术人员已知方法可将其连接至生物分子和/或非生物分子。
在各实施方案中，炔烃与生物分子通过可降解部分缔合。例如但不限于，在各方面炔烃与生物分子通过酸不稳定性部分缔合，所述酸不稳定性部分进入细胞内核内体后即降解。
在一些方面，生物分子与其缔合的表面用作交联部分的催化剂。在适当的条件下，交联部分与表面的接触将活化交联部分，从而有时开始在结构生物分子和/或非生物分子之间的自动交联。在一个具体的方面，交联部分是炔烃并且表面由金组成。在该方面，以及如本文所述，金表面用作催化剂以激活炔烃交联部分，从而允许在包含炔烃交联部分的生物分子和包含炔烃交联部分的另一生物分子之间形成交联。
也涵盖制备方法，其中化学品用于影响生物分子之间交联。在交联生物分子中使用所涵盖的化学品讨论如下。
在本方法中使用所涵盖的多核苷酸包括通过任何方式与纳米缀合物缔合的那些多核苷酸。无论多核苷酸与纳米缀合物之间的缔合方式是什么，在各方面，通过5'键合、3'键合或一些类型的内部键合或这些连接的任意组合来实现缔合，并且缔合取决于在多核苷酸中交联部分的位置。例如，在多核苷酸的3'端上的交联部分意思是多核苷酸将在其3'端与纳米缀合物缔合。
在各方面，交联部分位于间隔序列中。间隔序列描述在以上中，并且设想在间隔序列中核苷酸构成交联部分。在另外的方面，在间隔序列中的核苷酸包含不止一个的交联部分，并且所述不止一个的交联部分相同或不同。此外，在间隔序列中各核苷酸可构成一个或多个交联部分，其可相同或不同。
在一些实施方案中，多核苷酸不包含间隔序列。在这些方面，多核苷酸沿着其长度包含一个或多个交联部分。交联部分可相同或不同，并且多核苷酸中的各核苷酸可构成一个或多个交联部分，并且它们也是可以相同或不同。
在一方面，多核苷酸包含一个交联部分，如果存在间隔序列，所述交联部分可任选地在多核苷酸的间隔序列部分中。如果多核苷酸由一个交联部分组成，则设想多核苷酸是与纳米缀合物交联的另外的试剂。
在另外的方面，多核苷酸包含约1至约500个交联部分、或约1至约100、或约5至约50、或约10至约30、或约10至约20个交联部分。在各实施方案中，多核苷酸包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或更多个交联部分。在其中间隔序列包含不止一个交联部分的方面，所述部分可以相同或它们可以不同，并且可使用交联部分的任何组合。
在一方面，在各多核苷酸中交联部分位于相同位置，在某些条件下其以相同方向定向所有多核苷酸。在一些方面，方向为使得多核苷酸的5'和3'端彼此完全相反。在这些方面，间隔序列将在相对于在纳米缀合物表面的更“近侧”，而相反端将在相对于纳米缀合物表面的更“远侧”。关于“近侧”和“远侧”及其与纳米缀合物表面的关系，理解为当存在表面时并且在任选至少部分去除前，确定位置。例如但不限于，当多核苷酸待与靶生物分子杂化时，因为纳米缀合物结构提供定位以识别和缔合靶生物分子的多核苷酸的多价网络，在纳米缀合物中相同方向的多核苷酸定向是有用的。
在另一方面，交联部分位于多核苷酸中的不同位置，在某些条件下其可提供多核苷酸交联后混合定向。
在一些实施方案中，包含交联部分的生物分子和/或非生物分子连接纳米粒子，其中连接是可替换的。因此，在一方面，与表面缔合的交联部分可仍与表面缔合，或者通过与存在于另外的生物分子和/或非生物分子上的另外的交联部分的反应，交联部分可从表面中被替换。如之前所述，在一些实施方案中，包含交联部分的生物分子和/或非生物分子与表面的缔合导致生物分子和/或非生物分子和与表面缔合的另外的生物分子和/或非生物分子的交联。
提供形状的纳米粒子
部分通过在其制备中使用的表面、以及部分通过在其制备中使用的生物分子和/或非生物分子来测定在多种中每种纳米缀合物的形状。在各方面，表面是平面或三维的。因此，在各方面，表面是纳米粒子。
通常，所涵盖的纳米粒子包括具有对生物分子的高承载能力的任何化合物或物质以实现如本文所述的纳米缀合物的制备，所述化合物或物质包括例如但不限于金属、半导体、绝缘体粒子组合物和树状分子(有机比对无机)。
因此，涵盖包含多种无机材料的纳米粒子，所述无机材料包括但不限于如美国专利申请No 20030147966中所述的金属、半导体材料或陶瓷。例如，金属基纳米粒子包括本文所描述的那些。陶瓷纳米粒子材料包括但不限于：透钙磷石、磷酸三钙、氧化铝、二氧化硅和氧化锆。由其制备纳米粒子的有机材料包括碳。纳米粒子聚合物包括：聚苯乙烯、硅酮橡胶、聚碳酸酯、聚氨酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚酯、聚醚和聚乙烯。也设想生物可降解性、生物聚合物(例如多肽，例如BSA、多糖等)、或其它生物材料(例如糖类)和/或聚合化合物用于制备纳米粒子。
在一个实施方案中，纳米粒子是金属，以及在各方面，纳米粒子是胶态金属。因此，在各实施方案中，在方法的实施中使用的纳米粒子包括金属(包括例如但不限于金、银、铂、铝、钯、铜、钴、铁、铟、镍、或用于纳米粒子形成的任何其它金属)、半导体(包括例如但不限于CdSe、CdS和涂覆有ZnS的CdS或者CdSe)、磁性(例如，铁磁)胶体材料。在本发明的实施中使用的其它纳米粒子还包括但不限于：ZnS、ZnO、Ti、TiO2、Sn、SnO2、Si、SiO2、Fe、Fe+4、Fe3O4、Fe2O3、Ag、Cu、Ni、Al、钢、钴-铬合金、Cd、钛合金、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs以及GaAs。制备ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs以及GaAs纳米粒子的方法也是本领域已知的。例如，参见Weller,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,32,41(1993)；Henglein,Top.Curr.Chem.,143,113(1988)；Henglein,Chem.Rev.,89,1861(1989)；Brus,Appl.Phys.A.,53,465(1991)；Bahncmann,在Photochemical Conversion andStorage of Solar Energy(Pelizetti和Schiavello编著1991),第251页；Wang和Herron,J.Phys.Chem.,95,525(1991)；Olshavsky，等,J.Am.Chem.Soc.,112,9438(1990)；Ushida等,J.Phys.Chem.,95,5382(1992)。
在实施中，使用适合于在方法中以它们不会干扰络合物形成的程度使用的任何合适的纳米粒子提供组合物和方法。粒子的尺寸、形状、和化学组成有助于所得纳米缀合物的性质。这些性质包括例如，光学性质、光电性质、电化学性质、电学性质、在各种溶液中稳定性、磁性以及气孔和通道尺寸变化。涵盖具有不同尺寸、形状和/或化学组成的粒子的混合物的使用；以及具有统一尺寸、形状和化学组成的纳米粒子的使用。合适的粒子的例子包括但不限于：纳米粒子、聚集粒子、各向同性(例如球形粒子)和各向异性粒子(例如非球形棒、四面体、三棱形)以及核壳粒子(core-shell particle)，例如在2002年12月28日提交的美国专利申请No.10/034,451以及2002年12月28日提交的国际申请no.PCT/US01/50825中所述的那些，其公开全部通过引用并入。
金属、半导体和磁性纳米粒子的制备方法是本领域众所周知的。例如，参见Schmid,G.(编著)Clusters and Colloids(VCH,Weinheim,1994)；Hayat,M.A.(编著)ColloidalGold:Principles,Methods,and Applications(Academic Press,San Diego,1991)；Massart,R.,IEEE Transactions On Magnetics,17,1247(1981)；Ahmadi,T.S.等,Science,272,1924(1996)；Henglein,A.等,J.Phys.Chem.,99,14129(1995)；Curtis,A.C.,等,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,27,1530(1988)。制备的聚烷基氰基丙烯酸酯纳米粒子的制备描述在Fattal,等,J.Controlled Release(1998)53:137-143和美国专利No.4,489,055中。制备包含聚(D-glucaramidoamine)的纳米粒子的方法描述在Liu,等,J.Am.Chem.Soc.(2004)126:7422-7423中。包含聚合的甲基丙烯酸甲酯(MMA)的纳米粒子的制备描述在Tondelli,等,Nucl.Acids Res.(1998)26:5425-5431中，以及树状分子纳米粒子的制备描述在例如Kukowska-Latallo,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93:4897-4902(星放射状的聚酰胺树状分子(Starburst polyamidoamine dendrimers))中。
而且，如在美国专利申请No 20030147966中所述，包含本文所述材料的纳米粒子可从例如Ted Pella,Inc.(金)、Amersham Corporation(金)和Nanoprobes,Inc.(金)商购；或从溶液(例如，通过胶体反应)中逐步成核或通过各种物理和化学气相沉积方法，例如溅射淀积来制备它们。例如，参见HaVashi,(1987)Vac.Sci.Technol.1987年7月/8月,A5(4):1375-84；Hayashi,(1987)Physics Today，1987年12月,第44-60页；MRSBulletin,1990年1月,第16-47页。
如在美国专利申请No 20030147966中进一步所述，使用本领域已知的方法，使用HAuCl4和柠檬酸还原剂制备所涵盖的纳米粒子。例如，参见Marinakos等,(1999)Adv.Mater.11:34-37；Marinakos等,(1998)Chem.Mater.10:1214-19；Enustun&Turkevich,(1963)J.Am.Chem.Soc.85:3317。具有约140nm分布的聚集粒子尺寸的氧化锡纳米粒子从日本千叶的Vacuum Metallurgical Co.,Ltd.商购。各种组合物和尺寸范围的其它市售纳米粒子可从加利福尼亚市，伯林格姆的Vector Laboratories,Inc.获得。
纳米粒子尺寸
在各方面，所提供的方法包括利用以下尺寸范围的纳米粒子的那些：约1nm至约250nm的平均直径、约1nm至约240nm的平均直径、约1nm至约230nm的平均直径、约1nm至约220nm的平均直径、约1nm至约210nm的平均直径、约1nm至约200nm的平均直径、约1nm至约190nm的平均直径、约1nm至约180nm的平均直径、约1nm至约170nm的平均直径、约1nm至约160nm的平均直径、约1nm至约150nm的平均直径、约1nm至约140nm的平均直径、约1nm至约130nm的平均直径、约1nm至约120nm的平均直径、约1nm至约110nm的平均直径、约1nm至约100nm的平均直径、约1nm至约90nm的平均直径、约1nm至约80nm的平均直径、约1nm至约70nm的平均直径、约1nm至约60nm的平均直径、约1nm至约50nm的平均直径、约1nm至约40nm的平均直径、约1nm至约30nm的平均直径、或者约1nm至约20nm的平均直径、约1nm至约10nm的平均直径。在其它方面，纳米粒子的尺寸是约5nm至约150nm(平均直径)、约5至约50nm、约10至约30nm。纳米粒子的尺寸是约5nm至约150nm(平均直径)、约30至约100nm、约40至约80nm。在方法中使用的纳米粒子的尺寸根据它们特定用途或应用所需要来变化。尺寸的变化有利地用于最优化纳米粒子的某些物理性质，例如光学性质或可以如本文所述衍生的总表面积。
生物分子密度
如本文所提供的纳米缀合物具有在纳米缀合物的表面上生物分子的密度，即，在各方面，所述密度足够在单一纳米缀合物上纳米缀合物之间和生物分子之间引起协同作用。在另一方面，纳米缀合物之间的协同作用增加生物分子对降解的抵抗，并且提供相对于不是纳米缀合物的一部分的生物分子的急剧的熔化转变。在一方面，纳米缀合物由细胞的摄取受与纳米粒子缔合的多核苷酸的密度影响。如在通过引用全部并入本文中的PCT/US2008/65366中所述，在多核苷酸官能化纳米粒子的表面上多核苷酸的更高的密度与纳米粒子由细胞增加的摄取相关。这方面类似地设想为纳米缀合物的性质，其中构成纳米缀合物的生物分子的更高的密度与纳米缀合物由细胞的增加到摄取相关。
适合使纳米缀合物稳定的表面密度以及获得对于纳米缀合物和生物分子的期望的组合必要的条件可通过经验确定。广泛而言，使用的生物分子和/或非生物分子越小，生物分子和/或非生物分子可达到的表面密度越大。通常，至少2pmol/cm2的表面密度足够提供稳定的纳米缀合物-组合物。在一些方面，表面密度是至少15pmol/cm2。还提供其中生物分子以以下表面密度存在于纳米缀合物中的方法：至少2pmol/cm2、至少3pmol/cm2、至少4pmol/cm2、至少5pmol/cm2、至少6pmol/cm2、至少7pmol/cm2、至少8pmol/cm2、至少9pmol/cm2、至少10pmol/cm2、至少约15pmol/cm2、至少约20pmol/cm2、至少约25pmol/cm2、至少约30pmol/cm2、至少约35pmol/cm2、至少约40pmol/cm2、至少约45pmol/cm2、至少约50pmol/cm2、至少约55pmol/cm2、至少约60pmol/cm2、至少约65pmol/cm2、至少约70pmol/cm2、至少约75pmol/cm2、至少约80pmol/cm2、至少约85pmol/cm2、至少约90pmol/cm2、至少约95pmol/cm2、至少约100pmol/cm2、至少约125pmol/cm2、至少约150pmol/cm2、至少约175pmol/cm2、至少约200pmol/cm2、至少约250pmol/cm2、至少约300pmol/cm2、至少约350pmol/cm2、至少约400pmol/cm2、至少约450pmol/cm2、至少约500pmol/cm2、至少约550pmol/cm2、至少约600pmol/cm2、至少约650pmol/cm2、至少约700pmol/cm2、至少约750pmol/cm2、至少约800pmol/cm2、至少约850pmol/cm2、至少约900pmol/cm2、至少约950pmol/cm2、至少约1000pmol/cm2或更高。
设想在纳米缀合物中多核苷酸的密度调节具体生物分子和/或非生物分子在表面上与多核苷酸和/或与纳米缀合物自身的相互作用。在各种条件下，基于由多核苷酸的密度所导致的空间位阻可抑制一些多肽与作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸相互作用。在其中期望通过空间位阻所阻止的多核苷酸与生物分子和/或非生物分子的相互作用的方面，降低在纳米缀合物中多核苷酸的密度使得生物分子和/或非生物分子与多核苷酸相互作用。
在一些方面，在纳米缀合物制备过程中涵盖更大直径的纳米粒子以用大量多核苷酸被模板化[Hurst等,Analytical Chemistry 78(24):8313-8318(2006)]。因此，在一些方面，在纳米缀合物的制备中使用的多核苷酸数目是每种纳米缀合物约10至约25,000个多核苷酸。在另外的方面，在纳米缀合物的制备中使用的多核苷酸数目是每种纳米缀合物约50至约10,000个多核苷酸，并且在又另外的方面，在纳米缀合物的制备中使用的多核苷酸数目是每种纳米缀合物约200至约5,000个多核苷酸。在各方面，在纳米缀合物的制备中使用的多核苷酸数目是每种纳米缀合物约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约105、约110、约115、约120、约125、约130、约135、约140、约145、约150、约155、约160、约165、约170、约175、约180、约185、约190、约195、约200、约205、约210、约215、约220、约225、约230、约235、约240、约245、约250、约255、约260、约265、约270、约275、约280、约285、约290、约295、约300、约305、约310、约315、约320、约325、约330、约335、约340、约345、约350、约355、约360、约365、约370、约375、约380、约385、约390、约395、约400、约405、约410、约415、约420、约425、约430、约435、约440、约445、约450、约455、约460、约465、约470、约475、约480、约485、约490、约495、约500、约505、约510、约515、约520、约525、约530、约535、约540、约545、约550、约555、约560、约565、约570、约575、约580、约585、约590、约595、约600、约605、约610、约615、约620、约625、约630、约635、约640、约645、约650、约655、约660、约665、约670、约675、约680、约685、约690、约695、约700、约705、约710、约715、约720、约725、约730、约735、约740、约745、约750、约755、约760、约765、约770、约775、约780、约785、约790、约795、约800、约805、约810、约815、约820、约825、约830、约835、约840、约845、约850、约855、约860、约865、约870、约875、约880、约885、约890、约895、约900、约905、约910、约915、约920、约925、约930、约935、约940、约945、约950、约955、约960、约965、约970、约975、约980、约985、约990、约995、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400、约1500、约1600、约1700、约1800、约1900、约2000、约2100、约2200、约2300、约2400、约2500、约2600、约2700、约2800、约2900、约3000、约3100、约3200、约3300、约3400、约3500、约3600、约3700、约3800、约3900、约4000、约4100、约4200、约4300、约4400、约4500、约4600、约4700、约4800、约4900、约5000、约5100、约5200、约5300、约5400、约5500、约5600、约5700、约5800、约5900、约6000、约6100、约6200、约6300、约6400、约6500、约6600、约6700、约6800、约6900、约7000、约7100、约7200、约7300、约7400、约7500、约7600、约7700、约7800、约7900、约8000、约8100、约8200、约8300、约8400、约8500、约8600、约8700、约8800、约8900、约9000、约9100、约9200、约9300、约9400、约9500、约9600、约9700、约9800、约9900、约10000、约10100、约10200、约10300、约10400、约10500、约10600、约10700、约10800、约10900、约11000、约11100、约11200、约11300、约11400、约11500、约11600、约11700、约11800、约11900、约12000、约12100、约12200、约12300、约12400、约12500、约12600、约12700、约12800、约12900、约13000、约13100、约13200、约13300、约13400、约13500、约13600、约13700、约13800、约13900、约14000、约14100、约14200、约14300、约14400、约14500、约14600、约14700、约14800、约14900、约15000、约15100、约15200、约15300、约15400、约15500、约15600、约15700、约15800、约15900、约16000、约16100、约16200、约16300、约16400、约16500、约16600、约16700、约16800、约16900、约17000、约17100、约17200、约17300、约17400、约17500、约17600、约17700、约17800、约17900、约18000、约18100、约18200、约18300、约18400、约18500、约18600、约18700、约18800、约18900、约19000、约19100、约19200、约19300、约19400、约19500、约19600、约19700、约19800、约19900、约20000、约20100、约20200、约20300、约20400、约20500、约20600、约20700、约20800、约20900、约21000、约21100、约21200、约21300、约21400、约21500、约21600、约21700、约21800、约21900、约22000、约22100、约22200、约22300、约22400、约22500、约22600、约22700、约22800、约22900、约23000、约23100、约23200、约23300、约23400、约23500、约23600、约23700、约23800、约23900、约24000、约24100、约24200、约24300、约24400、约24500、约24600、约24700、约24800、约24900、约25000或更多个多核苷酸。
还设想多核苷酸表面密度调节与纳米缀合物缔合的多核苷酸的稳定性。因此，在一个实施方案中，提供包含多核苷酸的纳米缀合物，其中多核苷酸具有与至少基本上与不是纳米缀合物的一部分的相同多核苷酸的半衰期相同的半衰期。在其它实施方案中，与纳米粒子缔合的多核苷酸具有比不是纳米缀合物的一部分的相同多核苷酸的半衰期长约5%至约1,000,000倍或更多的半衰期。
中空纳米缀合物
如本文所述，在各方面，本公开所提供的纳米缀合物是中空的。中空纳米缀合物的孔隙率和/或刚性部分取决于在纳米缀合物制备过程中在纳米粒子的表面上交联的生物分子和非生物分子(当存在时)的密度。通常，在纳米粒子的表面上交联的生物分子的较低的密度产生较多孔的纳米缀合物，而在纳米粒子的表面上交联的生物分子的较高的密度产生较硬的纳米缀合物。中空纳米缀合物的孔隙率和密度还取决于在生物分子和/或非生物分子之间交联的程度和类型。
在一些方面，制备中空纳米缀合物，然后用期望的另外的试剂将其承载，然后用涂层包覆纳米缀合物以防止另外的试剂流出。在一些方面，涂层也是另外的试剂，并且更详细描述如下。
另外的试剂
本公开涵盖的另外的试剂包括：生物分子、非生物分子、可检测的标志物、涂层、聚合物试剂、对比剂、栓塞剂、内部互补短多核苷酸(sicPN)、转录调节剂、治疗剂、抗生素和靶部分。
治疗剂
如本文所使用的“治疗剂”、“药物”或“活性剂”意思是用于治疗或诊断目的的任何化合物。如本文所使用的术语理解为指向患者施用用于治疗病症的任何化合物，当与本公开的纳米粒子或纳米缀合物连接时，所述化合物比缺乏本公开的纳米粒子或纳米缀合物时能更有效地穿过细胞膜。
本公开可应用于期望递送的任何治疗剂。这些活性剂以及疏水性药物的非限制性例子在美国专利7,611,728中找到，其全部通过引用并入本文中。
在各实施方案中，提供本文所公开的组合物和方法，其中纳米缀合物包含多种治疗剂。在一方面，提供其中多种治疗剂特异性连接至一种纳米缀合物的组合物和方法。在另一方面，多种治疗剂特异性连接至不止一种纳米缀合物。
可通过本领域普通技术人员测定在本公开的材料和方法中使用的治疗剂。例如但不限于，以及如本文所例证，能进行日常体外测试以确定当与纳米缀合物连接时治疗剂是否能够比缺乏纳米缀合物的连接更有效地穿过细胞的细胞膜。
在各实施方案中，提供包含纳米缀合物和治疗剂的药物递送组合物，所述治疗剂是与连接纳米缀合物的治疗剂的递送相比在缺乏治疗剂与纳米缀合物的连接时递送水平显著更低的一种治疗剂，以及其中在纳米缀合物上多核苷酸与连接至纳米缀合物的治疗剂的比率足以使得治疗剂转运至细胞内。如本文所使用，“比率”是指多核苷酸与治疗剂的数值比较。例如但不限于，1∶1比率是指对于连接纳米缀合物的每个治疗剂分子有一个多核苷酸分子。
在一个实施方案中，提供方法和组合物，其中当连接纳米缀合物时治疗剂比不连接纳米缀合物时能够更有效地穿过细胞膜的方法和组合物。在各方面，当连接纳米缀合物时治疗剂能够穿过细胞膜的效率是不连接纳米缀合物时的约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约60倍、约70倍、约80倍、约90倍或约100倍或者更高。
治疗剂包括但不限于亲水性和疏水性化合物。因此，本公开所涵盖的治疗剂包括但不限于药物样分子、生物分子和非生物分子。
蛋白治疗剂包括但不限于肽、酶、结构蛋白、受体和其它细胞或循环蛋白及其片段和衍生物，其异常表达导致一种或多种紊乱。如一个具体实施方案中，治疗剂还包括化疗剂。在各实施方案中，治疗剂还包括放射材料。
在各方面，蛋白治疗剂包括细胞因子或造血因子，包括但不限于：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、集落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素-α(IFN-α)、复合干扰素、IFN-β、IFN-γ、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、血管生成素(例如Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y)、人血管生成素样多肽、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、骨形态发生蛋白-1、骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-3、骨形态发生蛋白-4、骨形态发生蛋白-5、骨形态发生蛋白-6、骨形态发生蛋白-7、骨形态发生蛋白-8、骨形态发生蛋白-9、骨形态发生蛋白-10、骨形态发生蛋白-11、骨形态发生蛋白-12、骨形态发生蛋白-13、骨形态发生蛋白-14、骨形态发生蛋白-15、骨形态发生蛋白受体IA、骨形态发生蛋白受体IB、脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子、睫状神经营养因子受体、细胞因子诱导中性粒细胞化学趋化因子1、细胞因子诱导中性粒细胞、趋化因子2α、细胞因子诱导中性粒细胞化学趋化因子2β、β内皮细胞生长因子、内皮素1、表皮生长因子、上皮细胞源性中性粒细胞引诱剂、成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成纤维细胞生长因子6、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子8b、成纤维细胞生长因子8c、成纤维细胞生长因子9、成纤维细胞生长因子10、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胶质细胞系源性中性粒细胞因子受体α1、胶质细胞系源性中性粒细胞因子受体α2、生长相关蛋白、生长相关蛋白α、生长相关蛋白β、生长相关蛋白γ、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角质形成细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体α、神经生长因子神经生长因子受体、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、胎盘生长因子、胎盘生长因子2、血小板源性内皮细胞生长因子、血小板源性生长因子、血小板源性生长因子A链、血小板源性生长因子AA、血小板源性生长因子AB、血小板源性生长因子B链、血小板源性生长因子BB、血小板源性生长因子受体α、血小板源性生长因子受体β、B前体细胞生长刺激因子、干细胞因子受体、TNF(包括TNF0、TNF1、TNF2)、转化生长因子α、转化生长因子β、转化生长因子β1、转化生长因子β1.2、转化生长因子β2、转化生长因子β3、转化生长因子β5、潜在转化生长因子β1、转化生长因子β结合蛋白I、转化生长因子β结合蛋白II、转化生长因子β结合蛋白III、肿瘤坏死因子受体I型、肿瘤坏死因子受体II型、尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活质受体、血管内皮生长因子和嵌合蛋白及其生物或免疫活性片段。生物试剂的例子包括但不限于免疫调节蛋白(诸如细胞因子)、对抗肿瘤抗原的单克隆抗体、肿瘤抑制基因和癌症疫苗。可联合本发明的组合物和方法使用的白介素的例子包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素12(IL-12)。除了细胞因子外的其它免疫调节剂包括但不限于卡介苗、左旋咪唑和奥曲肽。
如本公开所述，在一些方面，治疗剂包括小分子。如本文所使用的术语“小分子”是指化合物，例如可任选为衍生的拟肽或者天然或合成的任何其它低分子量有机化合物。这些小分子可以是治疗可递送物质或可进一步衍生以便于递送。
所谓“低分子量”意思是具有小于1000道尔顿的分子量的化合物，通常在300至700道尔顿之间。在各方面，低分子量化合物是约100道尔顿、约150道尔顿、约200道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约350道尔顿、约400道尔顿、约450道尔顿、约500道尔顿、约550道尔顿、约600道尔顿、约650道尔顿、约700道尔顿、约750道尔顿、约800道尔顿、约850道尔顿、约900道尔顿、约1000道尔顿或更大。
术语“药物样分子”对本领域技术人员是众所周知的，并且包括具有使其适合在药物中使用的特性的化合物的意思，例如但不限于药物中活性剂。因此，例如但不限于，药物样分子是通过有机化学技术、或通过分子生物或生物化学技术合成的分子，并且在一些方面，药物样分子是如本文所定义的小分子。在各方面，药物样分子另外表现与一种或多种特定蛋白质选择性相互作用的特征，并且是可生物利用和/或能够单独或与本公开的组合物或方法组合渗透细胞膜。
在各实施方案中，涵盖在美国专利7,667,004(其全部通过引用并入本文中)中描述的治疗剂用于本文所公开的组合物和方法，并且包括但不限于烷化剂、抗菌剂、抗代谢剂、激素试剂、植物源性试剂和生物剂。
烷化剂的例子包括但不限于双氯乙胺类(氮芥类，例如苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、苯丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥)、氮杂环丙烷类(例如塞替派)、烷基酮磺酸酯类(例如白消安)、亚硝基脲(例如卡氮芥、环己亚硝脲、链脲霉素)、非经典烷化剂(六甲蜜胺、氮烯咪胺和甲基苄肼)、铂化合物(例如，卡铂、顺铂和铂(IV)(Pt(IV)))。
抗菌剂的例子包括但不限于：蒽环类(例如阿霉素、道诺菌素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)和蒽二酮(anthracenedione))、丝裂霉素C、博来霉素(bleomycin)、放线菌素D、光辉霉素(plicatomycin)。另外的抗菌剂详细在下面讨论。
抗代谢剂的例子包括但不限于氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、氨甲喋呤、甲酰四氢叶酸、羟基脲、硫鸟嘌呤(6-TG)、巯基嘌呤(6-MP)、阿糖胞苷、喷司他丁(pentostatin)、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)、克拉屈滨(cladribine)(2-CDA)、天门冬酰胺酶、甲磺酸伊马替尼(或
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)和吉西他滨(gemcitabine)。
激素试剂的例子包括但不限于合成雌激素(例如己烯雌酚)、抗雌激素(例如三苯氧胺、托瑞米芬(toremifene)、氟甲睾酮(fluoxymesterol)和雷洛昔芬(raloxifene))、抗雄激素(比卡鲁胺(bicalutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、氟他米特(flutamide))、芳香酶抑制剂(例如，氨鲁米特(aminoglutethimide)、阿那曲唑(anastrozole)和四唑)、酮康唑、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、亮丙瑞林(leuprolide)、醋酸甲地孕酮和米非司酮(mifepristone)。
植物源性试剂的例子包括但不限于长春花生物碱(例如，长春新碱、长春花碱、长春地辛(vindesine)、长春利定(vinzolidine)和长春瑞滨(vinorelbine))、鬼臼毒素(例如，依托泊苷(etoposide)(VP-16)和替尼泊苷(teniposide)(VM-26))、喜树碱化合物(例如，20(S)喜树碱、拓扑替康(topotecan)、鲁比替康(rubitecan)和依立替康(irinotecan))、紫杉烷类(例如，紫杉醇和多烯紫杉醇)。
使用所涵盖的化疗剂包括但不限于：烷化剂，包括氮芥类，例如氮芥(mechlor-ethamine)、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥和苯丁酸氮芥；亚硝基脲类，例如卡氮芥(BCNU)、环己亚硝脲(CCNU)和甲基环己亚硝脲(甲基-CCNU)；乙烯亚胺/甲基蜜胺，例如三亚乙基蜜胺(TEM)、三乙烯、三胺硫磷(噻替派)、六甲基蜜胺(HMM，六甲蜜胺)；烷基磺酸盐类，例如白消安；三嗪类，例如氮烯咪胺(dacarbazine)(DTIC)；抗代谢物，包括叶酸类似物，例如氨甲喋呤和三甲曲沙(trimetrexate)，嘧啶类似物，例如5-氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷、吉西他滨、胞嘧啶阿拉伯糖苷(AraC，阿糖胞苷)、5-氮杂胞苷、2,2′-二氟脱氧胞苷，嘌呤类似物，例如6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、2’-脱氧脱氧助间型霉素(喷司他丁)、红羟基壬基腺嘌呤(erythrohydroxynonyladenine)(EHNA)、磷酸氟达拉滨和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨，2-CdA)；包括抗有丝分裂药物的天然产物，例如紫杉醇；长春花生物碱，包括长春花碱(VLB)、长春新碱和长春瑞滨、泰索帝(taxotere)、雌氮芥和雌氮芥磷酸盐；表鬼臼毒素，例如依托泊苷和表替尼泊苷；抗生素，例如放线菌素D、道诺霉素(红比霉素)、阿霉素、米托蒽醌、伊达比星、博来霉素、光辉霉素(光神霉素)、丝裂霉素C和放线菌素；酶类，例如L-天门冬酰胺酶；生物学应答调节物，例如干扰素-α、IL-2、G-CSF和GM-CSF；混杂试剂，包括铂配位复合物例如顺铂、Pt(IV)和卡铂；蒽二酮类，例如米托蒽醌；取代的脲，例如羟基脲；甲基肼衍生物，包括N-甲基肼(MIH)和甲基苄肼；肾上腺皮质抑制剂，例如米托坦(mitotane)(o,p′-DDD)和氨鲁米特(aminoglutethimide)；激素和拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂，例如强的松和等同物、地塞米松和氨鲁米特；孕酮，例如羟基孕酮己酸酯、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮；雌激素，例如己烯雌酚和乙炔雌二醇等同物；抗雌激素，例如三苯氧胺；雄激素，包括睾酮丙酸酯和氟甲睾酮/等同物；抗雄激素例如氟他米特(flutamide)、促性腺激素释放激素类似物和亮丙瑞林；以及非甾类的抗雄激素例如氟他米特。
本公开所涵盖的另外的治疗剂包括但不限于在下表2中的治疗剂。
表2
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抗生素组合物
在一些方面，另外的试剂可以是抗生素组合物，或者在其它的方面，纳米缀合物自身用作抗生素组合物。因此，在一些实施方案中，本公开提供包含如本文所述的纳米缀合物的抗生素组合物。作为官能化纳米粒子的一部分的抗生素组合物还描述在PCT/US2010/020558中，其全部通过引用并入本文中。
在其中纳米缀合物包含作为结构生物分子或非结构另外的试剂的多核苷酸的方面，在某些方面设想多核苷酸与原核基因的靶编码或非编码序列充分互补从而在允许杂交的条件下与靶序列杂交。在各实施方案中，设想包含多核苷酸的纳米缀合物与原核基因的杂交抑制(或阻止)原核细胞的生长。因此，在其中原核生物是细菌的方面，涵盖包含多核苷酸的纳米缀合物与原核基因的杂交导致抑菌或杀菌作用。在其中杂交发生在体内的方面，与缺乏与多核苷酸修饰的纳米粒子接触的原核细胞生长相比，原核细胞的生长被抑制。
在一些实施方案中，包含多核苷酸的纳米缀合物与原核基因的杂交抑制由原核基因编码的功能性原核蛋白的表达。如本文所使用的“功能性原核蛋白”是指由原核基因编码的全长野生型蛋白，并且在某些方面，功能性蛋白对于原核细胞生长是必需的。
对于生长必需的原核蛋白包括但不限于：格兰氏阴性基因产物、格兰氏阳性基因产物、细胞周期基因产物、参与DNA复制的基因产物、细胞分裂基因产物、参与蛋白合成的基因产物、细菌促旋酶和酰基载体基因产物。这些类型在以下本文中详细讨论。
本公开还涵盖抗生素组合物，其中与原核基因的靶非编码序列的杂交导致由具有改变的活性的原核基因编码的蛋白质的表达。在一些实施方案中，抗生素组合物与赋予对抗生素抗性的原核基因的靶非编码序列杂交。这些基因是本领域普通技术人员已知的，并且讨论在例如Liu等,Nucleic Acids Research 37:D443-D447,2009(其全部通过引用并入本文中)。在一些方面，抗生素组合物与赋予对抗生素抗性的原核基因的靶非编码序列的杂交导致原核生物对抗生素的敏感性增加。在一方面，与未接触抗生素组合物的原核生物的敏感性相比，原核生物对抗生素的敏感性增加。可通过本领域普通技术人员使用如本文所述的常规技术来测定对抗生素的相对敏感性。
使用抗生素的组合治疗
在一些实施方案中，配制包含纳米缀合物的抗生素组合物以用于与抗菌剂组合施用，其中以治疗有效量施用纳米缀合物和抗菌剂。
如本文所使用的术语“抗菌剂”意思是主要在传染性疾病的治疗中使用的具有抑制细菌和其它微生物的生长或将其杀死的能力的一组化学物质。例如，参见美国专利号7,638,557(其全部通过引用并入本文中)。抗菌剂的例子包括但不限于青霉素G(Penicillin G)；甲氧苯青霉素(Methicillin)；乙氧萘胺青霉素(Nafcillin)；苯甲异恶唑青霉素(Oxacillin)；邻氯青霉素(Cloxacillin)；双氯青霉素(Dicloxacillin)；氨苄青霉素(Ampicillin)；羟氨苄青霉素(Amoxicillin)；羟基噻吩青霉素(Ticarcillin)；羧苄青霉素(Carbenicillin)；磺唑氨苄青霉素(Mezlocillin)；苯咪唑青霉素(Azlocillin)；氧哌嗪青霉素(Piperacillin)；亚胺培南(Imipenem)；氨曲南(Aztreonam)；头孢菌素(Cephalothin)；氯氨苄青霉素(Cefaclor)；头孢噻吩(Cefoxitin)；头孢呋新(Cefuroxime)；头孢尼西(Cefonicid)；头孢美唑(Cefmetazole)；头孢替坦(Cefotetan)；头孢罗齐(Cefprozil)；氯碳头孢(Loracarbef)；头孢他美(Cefetamet)；头孢哌酮(Cefoperazone)；头孢噻肟(Cefotaxime)；头孢去甲噻肟(Ceftizoxime)；头孢三嗪(Ceftriaxone)；头孢他啶(Ceftazidime)；头孢吡肟(Cefepime)；头孢克肟(Cefixime)；头孢泊肟(Cefpodoxime)；头孢磺啶(Cefsulodin)；氟罗沙星(Fleroxacin)；萘啶酮酸(Nalidixic acid)；诺氟沙星(Norfloxacin)；环丙沙星(Ciprofloxacin)；氧氟沙星(Ofloxacin)；依诺沙星(Enoxacin)；洛美沙星(Lomefloxacin)；西诺沙星(Cinoxacin)；强力霉素(Doxycycline)；二甲胺四环素(Minocycline)；四环素(Tetracycline)；阿米卡星(Amikacin)；庆大霉素(Gentamicin)；卡那霉素(Kanamycin)；奈替米星(Netilmicin)；托普霉素(Tobramycin)；链霉素(Streptomycin)；阿奇霉素(Azithromycin)；克拉霉素(Clarithromycin)；红霉素(Erythromycin)；依托红霉素(Erythromycin estolate)；琥乙红霉素(Erythromycin ethylsuccinate)；葡糖庚酸红霉素(Erythromycin glucoheptonate)；乳糖酸红霉素(Erythromycinlactobionate)；硬脂酸红霉素(Erythromycin stearate；万古霉素(Vancomycin)；替考拉宁(Teicoplanin)；氯霉素(Chloramphenicol)；氯林肯霉素(Clindamycin)；甲氧苄氨嘧啶(Trimethoprim)；磺胺甲基异噁唑(Sulfamethoxazole)；呋喃妥因(Nitrofurantoin)；利福平(Rifampin)；莫匹罗星(Mupirocin)；甲硝哒唑(Metronidazole)；头孢氨苄(Cephalexin)；罗红霉素(Roxithromycin)；Co-amoxiclavuanate；氧哌嗪青霉素和他佐巴坦(Tazobactam)的组合；以及它们各种盐、酸、碱和其它衍生物。抗细菌抗菌剂包括但不限于青霉素类、头孢菌素类、碳头孢烯类、头霉素类、碳青霉烯类、单环内酰胺类(monobactams)、氨基糖苷类、糖肽类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类以及氟喹诺酮类。
生物分子标志物/标记
在各方面，如本文所述的生物分子任选地包含可检测的标记。因此，本公开提供其中通过可检测的变化来检测生物分子复合物形成的组合物和方法。在一方面，复合物形成导致用肉眼或显微镜观察到的颜色变化。
使由生物分子复合物形成引起的可检测的变化可视化的方法还包括任何荧光检测方法，包括但不限于荧光显微术、微量滴定板读取器或荧光激活细胞分选(FACS)。
应当理解，本公开所涵盖的标记包括本文所述的任何荧光团以及本领域已知的其它可检测的标记。例如，标记还包括但不限于：氧化还原活性探针、化学发光分子、放射性标记、染料、荧光分子、磷光性分子、如下所述的显影和/或对比剂、量子点以及使用光谱方法能检测的任何标志物，即，使用显微镜检查和血细胞计数检测的那些标志物。在其中可检测的标记待检测的本公开的方面，本公开提供任何发光、荧光或磷光性分子或粒子可被贵金属表面有效猝灭。因此，涵盖各类型的分子以用于所公开的组合物和方法。
使用荧光分子来标记生物分子和测量荧光的方法是本领域众所周知的。
合适的荧光分子也是本领域众所周知的，并且包括但不限于1,8-ANS(1-苯胺基萘-8-磺酸)、1-苯胺基萘-8-磺酸(1,8-ANS)、5-(和-6)-羧基-2',7'-二氯荧光素(pH 9.0)、5-FAM(pH 9.0)、5-ROX(5-羧基-X-罗丹明,三乙基铵盐)、5-ROX(pH 7.0)、5-TAMRA、5-TAMRA(pH 7.0)、5-TAMRA-MeOH、6JOE、6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素(pH 9.0)、6-羧基罗丹明6G(pH 7.0)、6-羧基罗丹明6G、盐酸盐、6-HEX,SE(pH 9.0)、6-TE T,SE(pH9.0)、7-氨基-4-甲基香豆素(pH 7.0)、7-羟基-4-甲基香豆素、7-羟基-4-甲基香豆素(pH9.0)、Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa 488、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 555、Alexa 568、Alexa 594、Alexa 647、Alexa 660、Alexa 680、Alexa 700、Alexa Fluor 430抗体缀合物(pH 7.2)、Alexa Fluor 488抗体缀合物(pH 8.0)、Alexa Fluor 488酰肼-水、Alexa Fluor 532抗体缀合物(pH 7.2)、Alexa Fluor 555抗体缀合物(pH 7.2)、Alexa Fluor568抗体缀合物(pH 7.2)、Alexa Fluor 610R-藻红蛋白链霉亲和素(pH 7.2)、Alexa Fluor647抗体缀合物(pH 7.2)、Alexa Fluor 647R-藻红蛋白链霉亲和素(pH 7.2)、Alexa Fluor660抗体缀合物(pH 7.2)、Alexa Fluor 680抗体缀合物(pH 7.2)、Alexa Fluor 700抗体缀合物(pH 7.2)、别藻蓝素(pH 7.5)、AMCA缀合物、氨基香豆素、APC(别藻蓝素)、Atto647、BCECF(pH 5.5)、BCECF(pH 9.0)、BFP(蓝色荧光蛋白)、BO-PRO-1-DNA、BO-PRO-3-DNA、BOBO-1-DNA、BOBO-3-DNA、BODIPY 650/665-X、MeOH、BODIPYFL缀合物、BODIPY FL、MeOH、Bodipy R6G SE、BODIPY R6G、MeOH、BODIPYTMR-X抗体缀合物(pH 7.2)、Bodipy TMR-X缀合物、BODIPY TMR-X、MeOH、BODIPYTMR-X、SE、BODIPY TR-X类鬼笔环肽(pH 7.0)、BODIPY TR-X、MeOH、BODIPYTR-X、SE、BOPRO-1、BOPRO-3、钙黄绿素、钙黄绿素(pH 9.0)、Calcium Crimson、Calcium Crimson Ca2+、Calcium Green、Calcium Green-1Ca2+、Calcium Orange、CalciumOrange Ca2+、羧基萘基荧光素(pH 10.0)、Cascade Blue、Cascade Blue BSA(pH 7.0)、Cascade Yellow、Cascade Yellow抗体缀合物(pH 8.0)、CFDA、CFP(青色荧光蛋白)、CI-NERF(pH 2.5)、CI-NERF(pH 6.0)、Citrine、香豆素、Cy 2、Cy 3、Cy 3.5、Cy 5、Cy 5.5、CyQUANT GR-DNA、丹酰尸胺、丹酰尸胺、MeOH、DAPI、DAPI-DNA、Dapoxyl(2-氨基乙基)磺酰胺、DDAO(pH 9.0)、Di-8ANEPPS、Di-8-ANEPPS-脂质、DiI、DiO、DM-NERF(pH 4.0)、DM-NERF(pH 7.0)、DsRed、DTAF、dTomato、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、伊红(Eosin)、伊红抗体缀合物(pH 8.0)、赤藓红-5-异硫氰酸盐(pH 9.0)、溴化乙锭、乙锭均二聚体、乙锭均二聚体-1-DNA、eYFP(增强型黄色荧光蛋白)、FDA、FITC、FITC抗体缀合物(pH 8.0)、FlAsH、Fluo-3、Fluo-3Ca2+、Fluo-4、Fluor-Ruby、荧光素；荧光素0.1M NaOH、荧光素抗体缀合物(pH 8.0)、荧光素葡聚糖(pH 8.0)、荧光素(pH 9.0)、Fluoro-Emerald、FM 1-43、FM 1-43脂质、FM 4-64、FM 4-64、2%CHAPS、Fura Red Ca2+、Fura Red(高Ca)、Fura Red(低Ca)、Fura-2 Ca2+、Fura-2(高Ca)、Fura-2(无Ca)、GFP(S65T)、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33258-DNA、Hoechst 33342、Indo-1Ca2+、Indo-1(游离Ca)、Indo-1(饱和的Ca)、JC-1、JC-1(pH 8.2)、丽丝胺罗丹明、LOLO-1-DNA、萤光黄(Lucifer Yellow)、CH、LysoSensor Blue、LysoSensor Blue(pH 5.0)、LysoSensor Green、LysoSensor Green(pH5.0)、LysoSensor Yellow(pH 3.0)、LysoSensor Yellow(pH 9.0)、Lyso Tracker Blue、LysoTracker Green、LysoTracker Red、Magnesium Green、Magnesium Green Mg2+、Magnesium Orange、Marina Blue、mBanana、mCherry、mHoneydew、MitoTracker Green、MitoTracker Green FM(MeOH)、MitoTracker Orange、MitoTracker Orange(MeOH)、MitoTracker Red、Mito Tracker Red(MeOH)、mOrange、mPlum、mRFP、mStrawberry、mTangerine、NBD-X、NBD-X(MeOH)、NeuroTrace 500/525、绿色荧光尼氏染色-RNA、Nile Blue(EtOH)、Nile Red、Nile Red-lipid、Nissl、Oregon Green 488、Oregon Green 488抗体缀合物(pH 8.0)、Oregon Green 514、Oregon Green 514抗体缀合物(pH 8.0)、PacificBlue、Pacific Blue抗体缀合物(pH 8.0)、藻红蛋白、PicoGreen dsDNA定量试剂、PO-PRO-1、PO-PRO-1-DNA、PO-PRO-3、PO-PRO-3-DNA、POPO-1、POPO-1-DNA、POPO-3、碘化丙啶、碘化丙啶-DNA、R-藻红蛋白(pH 7.5)、ReAsH、Resorufin、Resorufin(pH 9.0)、Rhod-2、Rhod-2Ca2+、罗丹明、罗丹明110、罗丹明110(pH 7.0)、罗丹明123(MeOH)、Rhodamine Green、Rhodamine phalloidin(pH 7.0)、Rhodamine Red-X抗体缀合物(pH 8.0)、Rhodamine Green(pH 7.0)、Rhodol Green抗体缀合物(pH 8.0)、Sapphire、SBFI-Na+、Sodium Green Na+、Sulfo罗丹明101(EtOH)、SYBR Green I、SYPRO Ruby、SYTO 13-DNA、SYTO 45-DNA、SYTOX Blue-DNA、四甲基罗丹明抗体缀合物(pH 8.0)、四甲基罗丹明葡聚糖(pH 7.0)、Texas Red-X抗体缀合物(pH 7.2)、TO-PRO-1-DNA、TO-PRO-3-DNA、TOTO-1-DNA、TOTO-3-DNA、TRITC、X-Rhod-1Ca2+、YO-PRO-1-DNA、YO-PRO-3-DNA、YOYO-1-DNA以及YOYO-3-DNA。
在一些方面，本公开还设想使用荧光多肽。
任何可检测的本领域已知的多肽可用于本公开的方法中，并且在一些方面，为荧光蛋白。在一些方面，荧光蛋白选自下表3中蛋白质列表中。
表3.荧光多肽列表
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Figure BDA00001789635800751
Figure BDA00001789635800761
对比剂
在各方面，本文公开包含纳米缀合物的组合物和方法，其中生物分子是多核苷酸，并且其中多核苷酸通过缀合位点与对比剂缀合。在另外的方面，对比剂缀合至如本文所述的任何其它生物分子。如本文所使用，“对比剂”是引入细胞内的化合物或其它物质以产生在各器官和组织中视密度的差别，使得更易看到邻近组织和器官的轮廓。据理解，对比剂与本文所述的任何生物分子的缀合可用于本公开的组合物和方法中。
由本公开提供的方法包括其中与纳米缀合物缔合的对比剂的弛豫相对于未与纳米粒子缔合的对比剂的弛豫相比增加的那些。在一些方面，该增加是约1倍至约20倍。在另外的方面，增加是约2倍至约10倍，并且在又另外的方面，增加是约3倍。
在一些实施方案中，对比剂选自钆、氙、氧化铁、螯合锰(Mn-DPDP)和铜。因此，在一些实施方案中，对比剂是顺磁化合物，并且在一些方面，顺磁化合物是钆。
本公开还涵盖对比剂，其用于正电子发射断层摄影(PET)扫描。在一些方面，PET对比剂是放射性核素。在某些实施方案中，对比剂包括PET对比剂，所述PET对比剂包含选自11C、13N、18F、64Cu、68Ge、99mTc和82Ru的标记。在特定的实施方案中，对比剂是选自[11C]胆碱、[18F]氟脱氧葡萄糖(FDG)、[11C]甲硫氨酸、[11C]胆碱、[11C]乙酸盐、[18F]氟代胆碱、64Cu螯合物、99mTc螯合物、和[18F]聚乙二醇二苯乙烯(polyethyleneglycol stilbene)的PET对比剂。
本公开还提供其中在多核苷酸合成过程中将PET对比剂引入多核苷酸或者在多核苷酸合成后将PET对比剂缀合至核苷酸的方法。例如但不限于，能够合成核苷酸，其中磷原子之一被32P或33P取代；在磷酸酯基中氧原子之一被35S取代；或者氢原子的一个或多个被3H取代。含有放射性核素的官能团也可通过缀合位点缀合至核苷酸。
MRI对比剂包括但不限于阳性对比剂和/或阴性对比剂。阳性对比剂导致T1弛豫时间的减少(在T1加权图像上增加的信号强度)。它们(在MRI上呈现为明亮)通常是含有其活性元素钆、锰或铁的小分子量化合物。所有这些元素在其外壳中具有不成对的电子自旋和长弛豫。一组特殊阴性对比剂(在MRI上呈现为黑暗)包括全氟化碳(全氟代化学品)，因为它们的存在排除导致MR显像中信号的氢原子。
在各方面，设想本公开的组合物包含含有约50至约2.5×106种对比剂的纳米缀合物。在一些实施方案中，纳米缀合物包含约500至约1×106种对比剂。
靶向部分
如本文所使用的术语“靶向部分”是指辅助化合物或其它分子结合或定位至特定靶标、靶区域，进入靶细胞(s)或结合至靶受体的任何分子结构。例如但不限于，靶向部分可包括能够体内或体外结合至期望的靶位点的蛋白质(包括抗体和蛋白质片段)，肽、小分子、抗癌剂、多核苷酸结合剂、糖类、细胞表面受体的配体、适配子、类脂(包括阳离子、中性和甾族类脂、病毒颗粒和脂质体)、抗体、凝集素、配体、糖、类固醇、激素和营养素可作为靶向部分。靶向部分用于将纳米缀合物递送至特定细胞类型和/或器官以及亚细胞位置。
在一些实施方案中，靶向部分是蛋白质。在一些方面，本公开的组合物的蛋白质部分是能够使组合物靶向靶细胞的蛋白质。本公开的靶向蛋白可结合受体、底物、抗原决定簇、或在靶细胞上的其它结合位点或其它靶位点。
用作靶向蛋白的抗体可以为多克隆的或单克隆的。已经开发出大量结合特定类型细胞的单克隆抗体(MAb)。也可使用通过基因工程或蛋白工程获得的抗体。
在本公开中用作靶向剂的抗体可以是完整的分子、其片段或其功能等同物。本公开的组合物中使用的抗体片段的例子是F(ab')2、Fab'Fab和Fv片段，其可通过常规方法或通过基因或蛋白工程来制备。
在一些实施方案中，纳米缀合物的多核苷酸部分可用作另外的或辅助靶部分。可选择或设计多核苷酸部分以辅助细胞外靶向或从而用作细胞内靶向部分。即，多核苷酸部分可用作寻找靶细胞的DNA探针。该另外的靶向能力将用于改善将组合物递送至靶细胞的特异性。可另外或可选择地选择或设计多核苷酸以在靶细胞内靶向组合物，同时靶向蛋白细胞外靶向缀合物。
设想在各实施方案中，靶向部分可与纳米缀合物缔合。在其中纳米缀合物包含纳米粒子的方面，设想靶部分连接至纳米粒子、生物分子或两者。在另外的方面，靶向部分与纳米缀合物组合物缔合，并且在其它方面，在施用本公开的组合物之前、同时或之后施用靶向部分。
内部互补短多核苷酸(sicPN)
在一些方面，另外的试剂是sicPN。sicPN是多核苷酸，其与作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸缔合，并且当靶多核苷酸与作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸杂交时而被取代和/或释放。在一方面，sicPN对于作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸具有较低的结合亲和力或结合亲合力，从而靶分子与作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸的缔合引起sicPN被取代和/或从其与作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸的缔合中释放。
如本文所使用的“取代”意思是sicPN从其与多核苷酸的缔合中部分变性。取代的sicPN仍然与和其缔合的多核苷酸部分缔合。如本文所使用的“释放”意思是sicPN被完全取代(即，完全变性)，从而引起其从与其缔合的多核苷酸中离解。在其中sicPN包含可检测的标志物的一些方面，设想sicPN的释放引起可检测的标志物被检测。
使用sicPN的用于检测靶分子的方法描述在以下本文中。
转录调节剂
本公开提供包含纳米缀合物的组合物。在一些方面，纳米缀合物包含多核苷酸，其中多核苷酸进一步包含转录调节剂。在这些方面，转录调节剂诱导靶细胞中靶多核苷酸的转录。
设想如本文所使用的转录调节剂为在mRNA的转录中诱导变化的任何物质。在各方面，变化可以为转录的增加或减少。在各实施方案中，转录调节剂选自多肽、多核苷酸、人工转录因子(ATF)和已知或疑似调节转录的任何分子。
本公开的组合物和方法包括其中转录调节剂是多肽的那些。设想用于增加或减少mRNA的转录的任何多肽在本文中使用。也设想肽用作转录调节剂。
在一些实施方案中，多肽是转录因子。通常，转录因子在结构上模块化并且含有下面结构域。
DNA-结合结构域(DBD)，其连接与调节基因相邻的DNA的特定序列(例如但不限于，增强子或启动子序列)。结合转录因子的DNA序列通常称为应答元件。
反式激活结构域(TAD)，其含有其它蛋白质的结合位点，例如转录共调节剂。这些结合位点通常被称作活化功能(AF)[
Figure BDA00001789635800781
等,Mol.Endocrinol.17(10):1901-9(2003)]。
任选的信号感应结构域(SSD)(例如但不限于，配体结合结构域)，其感应外部信号，并且传送这些信号至其余转录复合物来作为应答，引起基因表达的上调或下调。而且，在一些方面，DBD和信号感应结构域位于在转录复合物内缔合的单独的蛋白质上以调节基因表达。
调节剂多核苷酸
在一些实施方案中，转录因子是调节剂多核苷酸。在某些方面，多核苷酸是RNA，以及在另外的方面，调节剂多核苷酸是非编码RNA(ncRNA)。
在一些实施方案中，非编码RNA与一般转录工具相互作用，从而抑制转录[Goodrich等,Nature Reviews Mol Cell Biol 7:612-616(2006)]。通常，具有这种调节功能的RNA不编码蛋白质并且因而被称为ncRNA。通过三种细胞核DNA-依赖性RNA聚合酶(Pol I、II或III)之一使真核ncRNA从基因组转录。然后，通过三种基本机制之一它们引起其生物应答：催化生物反应；结合和调节蛋白质活性；或与靶核酸碱基配对。
已经显示ncRNA积极参与包括基因表达的许多不同的生物反应，例如拼接、mRNA翻转、基因沉默和翻译[Storz,等,Annu.Rev.Biochem.74:199-217(2005)]。尤其，许多研究已最近揭示ncRNA也积极调节真核mRNA转录，其是控制基因表达的关键点。
在另一实施方案中，调节性多核苷酸是可与转录因子缔合从而滴定其量的一种核苷酸。在一些方面，使用增加浓度的调节性多核苷酸将占据转录因子的增加量，这导致抑制mRNA的转录。
在进一步的实施方案中，调节性多核苷酸是适配子。
涂料
涂料可以是可降解性聚合物、生物分子或非毒性的化学品的任何物质。可选择地，涂料可以是生物可吸收性涂料。如本文所使用，“涂料”是指沉积在纳米缀合物上的总组分。涂料包括在纳米缀合物上形成的所有涂覆层。通过沉积化合物、并且更通常为包括悬浮、溶解或分散在特定溶液中一种或多种化合物的组合物来形成“涂覆层”。如本文所使用，术语“生物可降解的”或“可降解的”定义为在诸如几分钟、几小时、几天、几周或几年的时间内材料或组分的崩解或者崩解或分解为产物、副产物、组分或亚组分的敏感性。如本文所使用，术语“生物可吸收的”定义为通过新陈代谢和/或排泄来降解的任何产物的生物消除。
生物可降解和/或生物可吸收材料的非限制性例子是易受腐蚀本体聚合物(均聚物、共聚物或聚合的共混物)，例如属于聚(α-羟基酸)基的聚酯任意一种。这包括脂肪族聚酯，例如聚(乳酸)、聚(羟基乙酸)、聚(己内酯)、聚(对二氧环己酮)和聚(三亚甲基碳酸酯)；和它们的共聚物和共混物。用作生物可吸收材料的其它聚合物包括但不限于：氨基酸衍生的聚合物、含磷聚合物和聚(酯酰胺)。生物可降解和/或生物可吸收材料的水解速率取决于用于制备易受腐蚀本体聚合物的单体的类型。例如，如下评估吸收时间(完成降解或完全地降解的时间)：聚(己内酯)和聚(三亚甲基碳酸酯)用多于三年；聚(乳酸)用约2年；聚(对二氧环己酮)用约7个月；以及聚(羟基乙酸)用约3个月。由诸如聚乳酸-聚乙醇酸、聚羟基乙酸-聚己内酯和聚羟基乙酸-聚三亚甲基碳酸酯的单体制备的共聚物的吸收速率取决于单体的摩尔量。
还可通过本领域普通技术人员熟知的其它控释方式或递送装置来施用纳米缀合物。这些包括，例如但不限于，羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、凝胶、可透膜、多层涂料(见下)、脂质体或以上任意的组合，从而提供以不同比例的期望的释放分布。化合物控释递送的其它方法是本领域技术人员熟知的，并且是在本发明的范围内。
方法
制备纳米缀合物的方法
本公开提供用于在纳米粒子上交联生物分子的策略。在一方面，该策略包括使用含有炔烃的配体。这些配体自身聚集至金纳米粒子的表面上，并且这些配体的炔烃部分通过金表面来激活以用于与在配体外壳内存在的亲核试剂反应。该交联反应适于形成具有任意期望表面功能性的中空纳米缀合物。而且，可连接至聚炔烃或单炔烃部分的任何生物分子或非生物分子将并入至该配体外壳内或独立形成配体外壳。
生物分子交联
聚炔烃化学
Au(I)和Au(III)离子和它们的复合物展示显著亲炔烃性(alkynophilicity)，并且逐渐被认为是有机转化的强效催化剂[Hashmi,Chem.Rev.107:3180-3211(2007)；Li等,Chem.Rev.108:3239(2008)；Fürstner等,Angew.Chem.Int.编著46:3410(2007)；Hashmi等,Angew.Chem.Int.编著45:7896(2006)]。目前，已经证实Au(0)表面也吸收末端乙炔基并且形成相对稠密包装或稳定的单层[Zhang等,J.Am.Chem.Soc.129:4876(2006)]。然而，在炔烃和金表面之间相互作用的类型还未被很好理解。
而且，还不清楚这些相互作用是否使得乙炔基对于化学反应更敏感，例如使用离子金-炔烃复合物通常观察到的亲核加成。按照Turkevich-Frens方法，因为含有多个侧臂炔丙基醚基，聚合物1(流程图1)容易吸收至在水性溶液中制备的柠檬酸盐-稳定的13nmAuNP上[Frens,Coll.Polym.Sci.250:736(1972)]。通过反复离心和后续重新悬浮步骤来去除过量的聚合物。所得的聚合物涂覆的AuNP表现出在524nm处等离子共振，其特征在于分散的粒子，并且即使在室温下储存8周后也没有聚集的迹象。因此，即使1是可能的粒子间交联剂，它也不会导致AuNP的聚集，这是通过动力光散射(DLS)和电子显微镜检查证实结论(参见以下实施例)。
在一个实施方案中，本公开提供用于由含有下垂的炔丙基醚基(1)的线性生物分子合成纳米缀合物、利用金纳米粒子(AuNP)作为形成外壳的模板和交联反应的催化剂的模板的方法(流程图1)。无需另外的交联剂或合成操作。当生物分子交联后将纳米粒子去除时，反应产生界限清楚、均匀的中空纳米缀合物。
Figure BDA00001789635800811
流程图1.多价丙炔基醚纳米缀合物的合成
在一方面，生物分子是如本文所定义的多核苷酸。在这些方面，设想多核苷酸包含炔烃。在各实施方案中，在多核苷酸上存在1至100个炔烃部分。在另外的方面，在多核苷酸上存在约5至约50个炔烃部分、或者约10至约20个炔烃部分。在一方面，在多核苷酸上存在10个炔烃部分。在另外的方面，在多核苷酸上存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个炔烃部分。
在另一个实施方案中，多核苷酸上的炔烃部分是在5'端。在另一个的实施方案中，多核苷酸上的炔烃部分是在3'端。在一些方面，设想炔烃部分仅表示多核苷酸长度的一部分。例如，如果多核苷酸的长度是20个核苷酸，则设想开始10个核苷酸(在各方面从5'或3'端计数)包含炔烃部分。因此，在总20个核苷酸中包含炔烃部分的10个核苷酸导致多核苷酸中50%的核苷酸与炔烃部分缔合。在各方面，设想多核苷酸中约0.01%至约100%的核苷酸与炔烃部分缔合。在另外的方面，多核苷酸中约1%至约70%、或约2%至约60%、或约5%至约50%、或约10%至约50%、或约10%至约40%、或约20%至约50%、或约20%至约40%的核苷酸与炔烃部分缔合。在又另外的方面，设想多核苷酸中约1%、约2%、约3%、约4%、约5%、约6%、约7%、约8%、约9%、约10%、约11%、约12%、约13%、约14%、约15%、约16%、约17%、约18%、约19%、约20%、约21%、约22%、约23%、约24%、约25%、约26%、约27%、约28%、约29%、约30%、约31%、约32%、约33%、约34%、约35%、约36%、约37%、约38%、约39%、约40%、约41%、约42%、约43%、约44%、约45%、约46%、约47%、约48%、约49%、约50%、约51%、约52%、约53%、约54%、约55%、约56%、约57%、约58%、约59%、约60%、约61%、约62%、约63%、约64%、约65%、约66%、约67%、约68%、约69%、约70%、约71%、约72%、约73%、约74%、约75%、约76%、约77%、约78%、约79%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%的核苷酸与炔烃部分缔合。
在一方面，通过使用炔烃部分和含有磷脂的聚合物以及APO1A蛋白质可将该交联反应用于形成中空HDL纳米粒子(图16)。
回到使用聚炔烃交联方法进行交联的方法，包括下面步骤。首先，如本文所述(实施例1)制备纳米粒子的溶液(纳米粒子制备步骤)。使溶液与包含含有多反应基团的生物分子的溶液接触(接触步骤)。取决于使用的多反应基团，包括任选的活化步骤(活化步骤)。然后将所得的混合物孵育使得发生交联(孵育步骤)，然后分离(分离步骤)。然后进行纳米粒子核心的任选溶解(溶解步骤)以产生中空纳米缀合物。也任选地包括标记步骤(标记步骤)。
供本公开使用的所涵盖的亲核试剂包括本文所述的那些。通常，供使用的所涵盖的亲核试剂可分类为碳亲核试剂、HX亲核试剂(例如但不限于，HF和HCl)、氧和硫亲核试剂以及氮亲核试剂。也涵盖以上的任何串联组合。
纳米粒子制备步骤。如在实施例1中所述制备纳米粒子的溶液。在聚炔烃交联的情况下，在一方面制备金纳米粒子溶液。
接触步骤。使包含多反应基团或经修饰以含有多反应基团的目标生物分子与纳米粒子溶液接触。如本文所使用，多反应基团可以是炔烃，或者多反应基团可以是轻反应基团，或者通过例如但不限于超声或微波来活化的基团。无论是否使用多反应基团，使包含多反应基团的生物分子溶液与纳米粒子溶液接触以有助于交联。
在一些方面，无论使用什么交联策略，加入生物分子的量与所得的纳米缀合物的性质相关。通常，取决于用于与纳米缀合物交联的生物分子浓度，本公开提供更加稠密或疏松的纳米缀合物。较低浓度的生物分子将导致纳米粒子较低的密度，这将产生较多孔的纳米缀合物。相反，较高浓度的生物分子将导致纳米粒子的较高密度，这将产生较硬的纳米缀合物。鉴于这些方面，“较低的密度”是约2pmol/cm2至约100pmol/cm2。而且，还鉴于这些方面，“较高的密度”是约101pmol/cm2至约1000pmol/cm2。
活化步骤。在其中存在于生物分子和/或非生物分子上的多反应基团需要活化的本公开的方面，设想活化步骤包括在本方法中。在该步骤中，应用活化来源并且所述活化来源可以是但不限于激光(当多反应基团为光反应性时)、或声音(当通过声波活化多反应基团时)或微波(当通过微波活化多反应基团时)。
在一些实施方案中，表面自身可活化存在于生物分子和/或非生物分子上的多反应基团。在这些实施方案中，无需活化步骤。
孵育步骤。一旦使包含含有多反应基团的生物分子的溶液与纳米粒子溶液接触，就对混合物进行孵育以使得交联发生。孵育能发生在约4℃至约50℃的温度下。使孵育进行约1分钟至约48小时或更长的时间。设想在一些方面，可进行孵育而不不考虑时间长度。
分离步骤。然后可分离交联的纳米缀合物。对于分离，对混合物进行离心，去除上清液，并且将交联的纳米缀合物再悬浮在恰当的缓冲液中。在各方面，可进行不止一次的离心步骤以进一步纯化交联的纳米缀合物。
溶解步骤。在本文所述的任何组合物或方法中，在生物分子的交联后是否保留纳米粒子是任选的，并且取决于预期用途。
在其中本公开的组合物不包含纳米粒子的那些实施方案中，设想在纳米缀合物与生物分子交联后将纳米粒子溶解或去除。
纳米粒子核心的溶解是在本领域普通技术范围内，并且在一方面，通过在氧气存在下使用KCN而达到。在另外的方面，碘或王水(Aqua regia)用于溶解纳米粒子核心。在一方面，纳米粒子核心包含金。如本文所述，当将KCN加入柠檬酸稳定的AuNP时，溶液的颜色由红色变为紫色，这是由AuNP的不稳定和聚集造成。然而，对于聚合物涂覆的AuNP，在溶解过程中颜色慢慢变成微红橙色，直至溶液澄清(图9A)。
通过透射电子显微镜法(TEM)可将溶解过程可视化(图9C)。当AuNP的外层部分溶解时，使用TEM栅极的乙酸双氧铀染色可观察到上述保护性外壳。模板的完全去除提供以高保真度保留它们模板的尺寸和形状的中空纳米缀合物。
另外的交联方法
直接链交联(DSC)是用可通过化学方法被交联的一个或多个交联部分来修饰多核苷酸的一个或多个核苷酸的方法。在一方面，通过用可通过各种化学方法可被交联的部分修饰多核苷酸的一个或多个核苷酸来进行DSC方法。在各方面，包含交联部分的一个或多个核苷酸在间隔序列中。
在一方面，合成将胺修饰的胸苷亚磷酰胺(TN)并入间隔序列的多核苷酸。多核苷酸完全由该修饰的碱基组成以使交联效率最大化。在一方面，使用诸如Sulfo-EGS的具有两个胺反应性NHS-酯部分的同型双功能性交联剂使链交联。尽管设想胺在一个实施方案中使用，但是该设计与许多其它反应基团(例如但不限于，胺、酰胺、醇、酯、醛、酮、硫醇、二硫化物、羧酸、酚、咪唑、肼、腙、叠氮化物和炔烃)可共存。
称为表面辅助交联(SAC)的另外的方法包括在纳米粒子表面上聚集和交联在一起的修饰的核酸与反应性硫醇化分子的混合单层。
引起目标生物分子的交联的化学品是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于：双琥珀酰亚胺戊二酸酯、双琥珀酰亚胺辛二酸酯、双[硫代琥珀酰亚胺基]辛二酸酯、三-琥珀酰亚胺基氨基三乙酸酯、琥珀酰亚胺基4-肼基烟酸盐丙酮腙、琥珀酰亚胺基4-酰肼基对苯二甲酸酯盐酸盐、琥珀酰亚胺基4-甲酰苯甲酸酯、二硫代双[琥珀酰亚胺基丙酸酯]、3,3′-二硫代双[硫代琥珀酰亚胺基丙酸酯]、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯、双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜、乙二醇双[琥珀酰亚胺基琥珀酸酯]、乙二醇双[硫代琥珀酰亚胺基琥珀酸酯]、二亚胺代己二酸二甲酯·2HCl、庚二亚氨酸二甲酯·2HCl、辛二亚氨酸二甲酯·2HCl、1,5-二氟-2,4-二硝基苯、β-[三(羟甲基)膦基]丙酸、双-马来酰亚胺基乙烷、1,4-双马来酰亚胺基丁烷、双马来酰亚胺基己烷、三[2-马来酰亚胺乙基]胺、1,8-双-马来酰亚胺-二乙二醇、1,11-双-马来酰亚胺-三乙二醇、1,4双马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷、二硫代-双马来酰亚胺基乙烷、1,4-二-[3′-(2′-吡啶基二硫代)-丙酰氨基]丁烷、1,6-己烷-双-乙烯基砜、双-[b-(4-叠氮基水杨酰氨基)乙基]二硫化物、N-(a-马来酰亚胺乙酰氧基)琥珀酰亚胺酯、N-[β-马来酰亚胺丙基氧基]琥珀酰亚胺酯、N-[g-马来酰亚胺丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯、N-[g-马来酰亚胺丁酰氧基]硫代琥珀酰亚胺酯、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯、硫代琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯、N-e-马来酰亚胺己酰氧基]琥珀酰亚胺酯、N-e-马来酰亚胺己酰氧基]硫代琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基4-[对马来酰亚胺苯基]丁酸酯、硫代琥珀酰亚胺基4-[对马来酰亚胺苯基]丁酸酯、琥珀酰亚胺基-6-[β-马来酰亚胺丙酰氨基]己酸酯、琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧基-[6-酰氨己酸酯]、N-[k-马来酰亚胺十一酰氧基]硫代琥珀酰亚胺酯、N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯、琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰氨基)己酸酯、4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-甲基-a-[2-吡啶基二硫代]甲苯、4-硫代琥珀酰亚胺基-6-甲基-a-(2-吡啶基二硫代)甲苯酰氨]己酸酯)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯、琥珀酰亚胺基3-[溴乙酸酯]丙酸酯、N-琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯、N-硫代琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸、N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰基氧基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯、硫代琥珀酰亚胺基[4-叠氮基水杨酰氨基]-己酸酯、N-琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯、N-硫代琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯、硫代琥珀酰亚胺基-(全氟代叠氮苯甲酰氨基)-乙基-1,3'-二硫代丙酸酯、硫代琥珀酰亚胺基-2-(m-叠氮基-o-硝基苯甲酰氨基)-乙基-1,3'-丙酸酯、硫代琥珀酰亚胺基2-[7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酰氨基]乙基-1,3′二硫代丙酸酯、琥珀酰亚胺基4,4'-叠氮戊酸酯、琥珀酰亚胺基6-(4,4'-叠氮戊酰氨)己酸酯、琥珀酰亚胺基2-([4,4'-叠氮戊酰氨]乙基)-1,3'-二硫代丙酸酯、硫代琥珀酰亚胺基4,4'-叠氮戊酸酯、硫代琥珀酰亚胺基6-(4,4'-叠氮戊酰氨)己酸酯、硫代琥珀酰亚胺基2-([4,4'-叠氮戊酰氨]乙基)-1,3'-二硫代丙酸酯、二环己基碳化二亚胺、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸盐、N-[4-(p-叠氮基水杨酰氨基)丁基]-3′-(2′-吡啶基二硫代)丙酰胺、N-[β-马来酰亚胺丙酸]酰肼、三氟乙酸盐、[N-e-马来酰亚胺己酸]酰肼、三氟乙酸盐、4-(4-N-马来酰亚胺苯基)丁酸酰肼盐酸盐、N-[k-马来酰亚胺十一烷酸]酰肼、3-(2-吡啶基二硫代)丙酰肼、p-叠氮基苯甲酰肼、N-[p-马来酰亚胺苯基]异氰酸酯以及琥珀酰亚胺基-[4-(补骨脂素-8-基氧基)]-丁酸酯。
以上已基本讨论了生物分子的DSC和SAC交联。对于这些交联策略，除了活化步骤不是任选的，用于这些交联策略的方法步骤将大部分按照用于聚炔烃交联以上所述那些方法。如本文所述，化学品用于促进生物分子的交联。因此，进行纳米粒子制备步骤、接触步骤、活化步骤、孵育步骤、分离步骤和任选的溶解步骤。也任选包括标记步骤。这些步骤已如上本文所述。
以上方法还任选地包括其中纳米缀合物进一步包含如本文所定义的另外的试剂的步骤。在各方面，可在生物分子和/或非生物分子的交联中或者在纳米缀合物的制备后将另外的试剂加入混合物中。
治疗剂的连接
在一些实施方案中，本公开提供纳米缀合物组合物，其中组合物进一步包含治疗剂。在一些方面，治疗剂连接至作为纳米缀合物组合物一部分的生物分子。在另外的方面，生物分子是多核苷酸。治疗剂或化学治疗剂与多核苷酸的连接方法是本领域已知的，并且描述在Priest,美国专利号5,391,723；Arnold,Jr.,等,美国专利号5,585,481；Reed等,美国专利号5,512,667和PCT/US2006/022325中，其公开通过引用全部并入本文中。
在各方面，应当理解如本文所述的治疗剂连接至纳米粒子。
使用纳米缀合物的方法
使用中空纳米缀合物的方法
在一些实施方案中，中空纳米缀合物可用作递送媒介物。因此，制备中空纳米缀合物，其中，在一方面，如本文所定义的另外的试剂位于纳米缀合物中。在相关的方面，另外的试剂与如本文所述的纳米缀合物缔合。在一些方面，设想使用作递送媒介物的纳米缀合物更多孔以使得在纳米缀合物内另外的试剂的置换。根据特定应用，可按经验测定纳米缀合物的孔隙率，并且是在本领域技术范围内。将官能化纳米粒子的所有优点(例如但不限于，细胞摄取增加和对核酸酶降解的抗性)都赋予中空纳米缀合物。
在一些方面，进一步设想用作递送媒介物的纳米缀合物是使用至少部分可降解的生物分子来制备，从而一旦纳米缀合物靶向目标位置，它就会以这种方式溶解或降解来释放另外的试剂。生物分子降解途径是本领域技术人员已知的，并且可包括但不限于核酸酶途径、蛋白酶途径和泛素途径。
在一些方面，本公开的组合物用作缓释制剂。在这些方面，由于其生物相容性和宽范围的生物可降解性质，用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)来制备纳米缀合物。PLGA的降解产物，乳酸和羟基乙酸，可在人体内被快速清除。而且，取决于其分子量和组合物，该聚合物的可降解性从数月至数年被调整[Lewis,"Controlled release ofbioative agents from lactide/glycolide polymer,"引自：M.Chasin和R.Langer(编著),Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(Marcel Dekker:New York,1990),第1-41页,其全部通过引用并入本文中]。
增加杂交速率的方法
在一些实施方案中，连接至纳米粒子的生物分子是多核苷酸。因此，所提供的方法包括能够通过使用sicPN增加多核苷酸与靶多核苷酸缔合的速率的那些。在各方面，缔合速率的增加是没有sicPN的缔合速率的约2倍至约100倍。根据本公开，与靶多核苷酸缔合的多核苷酸是纳米缀合物的一部分。此外，加入sicPN，其与在用于制备纳米缀合物的多核苷酸上靶多核苷酸结合位点的部分重叠，但不是完整序列。
因此，仍然还存在作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸的单链部分。当靶多核苷酸与作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸的单链部分缔合时，它取代和/或释放sicPN，并且导致作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸与靶多核苷酸的缔合速率增加。
在一些方面，多核苷酸与靶多核苷酸的缔合另外取代和释放sicPN。在各实施方案中，sicPN或靶多核苷酸进一步包含可检测的标记。因此，在其中期望检测靶多核苷酸的方法的一方面，通过可检测的标记的作用sicPN的取代和/或释放产生可检测的变化。在其中期望检测靶多核苷酸的另一方法中，靶多核苷酸通过其自身可检测的标记产生可检测的改变。在其中期望抑制靶多核苷酸表达的方法中，作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸与靶多核苷酸的缔合通过反义机制产生靶多核苷酸表达的抑制。
本公开的组合物包含能够与多种多核苷酸缔合的多种sicPN，其可在一个或多个表面上使用以与多种靶多核苷酸特异性缔合。因此，以下所述方法的步骤或步骤的组合应用至作为一种或多种纳米缀合物的一部分的一种或多种多核苷酸、sicPN和靶多核苷酸。
在各方面，本方法包括使用与靶多核苷酸100%互补(即，完全匹配)的多核苷酸，而在其它方面，多核苷酸是在多核苷酸的长度上与多核苷酸至少(意思为大于或等于)约95%互补；在多核苷酸的长度上与多核苷酸至少约90%、至少约85%、至少约80%、至少约75%、至少约70%、至少约65%、至少约60%、至少约55%、至少约50%、至少约45%、至少约40%、至少约35%、至少约30%、至少约25%、至少约20%互补至多核苷酸能够达到对靶基因产物期望抑制的程度。本领域的那些技术人员将理解，与靶多核苷酸的结果检测或基因产物表达的抑制程度相比，杂交的程度较不重要。
检测靶多核苷酸的方法
本公开提供检测靶生物分子的方法，包括使靶生物分子接触如本文所述的组合物。在各方面，如通过本公开所提供，接触引起基因表达的调节。在另一方面，接触引起可检测的变化，其中可检测的变化指示靶生物分子的检测。通过本文所述任何方法来进行可检测的标记的检测，并且可检测的标记可在作为纳米缀合物的一部分的生物分子上或者可在靶生物分子上。
在一些方面，并且如上所述，sicPN的取代和/或释放产生可检测的变化。通过使用可检测的标记来评估可检测的变化，并且在一方面，使用可检测的标记来标记sicPN。而且，根据本方法，当接近用于模板化纳米缀合物的表面时，将可检测的标记猝灭。然而，应当理解本领域中术语“猝灭(quench)”或“使猝灭(quenching)”通常与荧光标志物相关，在本文中设想当任何标志物的信号相对不可检测时，则其被猝灭。因此，应当理解通过本描述所例证使用荧光标志物的方法仅作为所设想的方法的单个实施方案来提供，并且可被猝灭的任何标志物可被示例性荧光标志物所替代。
因此，sicPN以可检测的标记接近表面从而猝灭其检测的方式来与纳米缀合物缔合。当为纳米缀合物的一部分的多核苷酸接触和缔合靶多核苷酸时，它导致sicPN的取代和/或释放。因此，sicPN的释放增加存在于sicPN上可检测的标记和多核苷酸模板化的表面之间的距离。该距离的增加允许之前猝灭的可检测的标记的检测，并且指示靶多核苷酸的存在。
因此，在一个实施方案中，提供其中使用多种多核苷酸以通过本文所述方法来制备纳米缀合物的方法。将多核苷酸设计为在严格的条件下能够与一种或多种靶多核苷酸杂交。在本领域已知和如本文所讨论的不同严格的条件下进行杂交。在使用多种多核苷酸来制备纳米缀合物之后，将任选包含可检测的标记的多种sicPN加入并使其与作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸杂交。在一些方面，多种多核苷酸和sicPN首先彼此杂交，然后使用双链体来制备纳米缀合物。无论多种多核苷酸与多种sicPN杂交并且使用双链体来制备纳米缀合物的顺序如何，下一步骤为使纳米缀合物接触靶多核苷酸。在各方面，靶多核苷酸可以在溶液中或可以在细胞内。据理解在一些方面，测试溶液存在或不存在靶多核苷酸，而在其它方面，测试溶液中靶多核苷酸的相对量。
在使双链体接触靶多核苷酸后，由于靶多核苷酸与作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸的杂交，其将取代和/或释放sicPN。sicPN的取代和释放使得表面和sicPN之间距离的增加，因而导致在sicPN上的标记可检测。由于sicPN的取代和释放检测的标记量与溶液中存在的靶多核苷酸量相关。通常，可检测的标记量的增加与溶液中靶多核苷酸数量的增加相互关联。
在一些实施方案中，期望检测溶液中不止一种靶多核苷酸。在这些实施方案中，使用不止一种sicPN，并且各sicPN包含独特的可检测的标记。因此，基于各独特可检测的标记的检测，各靶多核苷酸以及其相对量可单独检测。
在一些实施方案中，本公开的组合物可用于纳米-闪光技术(nano-flare technology)。纳米-闪光已经在之前可利用sicPN架构用于荧光检测活细胞内生物分子水平的多核苷酸功能化纳米粒子的情况中描述。[描述在WO 2008/098248中，其全部通过引用并入本文中]。在该体系中，sicPN用作“闪光”，并且通过引入的靶多核苷酸来可检测标记和取代或从表面释放。因此，设想纳米-闪光技术用于本文所述的纳米缀合物情况中。
在另外的方面，将纳米缀合物用于检测样品中半胱氨酸的存在或量，包括提供包含含有Hg2+和纳米缀合物总体的复合物的第一混合物，其中该总体包含含有一对单链多核苷酸之一的纳米缀合物和含有该对中另一单链多核苷酸的纳米缀合物，其中在具有至少一种核苷酸错配的恰当条件下该对形成双链双螺旋，使第一混合物与疑似具有半胱氨酸的样品接触以形成第二混合物，并且检测在该第二混合物中双链双螺旋的熔点，其中熔点指示样品中半胱氨酸的存在及数量。在一些方面，核苷酸错配为内部核苷酸错配。在另外的方面，错配是T-T错配。在又另外的方面，包含半胱氨酸的样品具有比没有半胱氨酸的样品低至少约5℃的熔点。
抑制基因表达的方法
本公开所提供的另外的方法包括抑制从靶多核苷酸表达的基因产物表达的方法，包括使靶多核苷酸接触如本文所述的组合物，其中接触足够抑制基因产物的表达。基因产物的抑制由靶多核苷酸与本公开的组合物的杂交所引起。
据本领域所理解，作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸的序列不需要与其靶多核苷酸的序列100%互补，从而与靶多核苷酸特异性杂交。而且，作为纳米缀合物一部分的多核苷酸可与靶多核苷酸在一个或多个片段上杂交，使得干扰或相邻片段不包括在杂交事件中(例如但不限于，环结构或发夹结构)。在作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸的长度上测定互补百分比。例如，给定包含多核苷酸的纳米缀合物，其中多核苷酸的20个核苷酸中18个与100个核苷酸总长度的靶多核苷酸中20个核苷酸区互补，则作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸将为90%互补。在该例子中，剩余的非互补的核苷酸可以与互补核苷酸成簇或散布，并且无需彼此或与互补核苷酸连续。作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸与靶多核苷酸区的互补百分比可使用本领域已知的BLAST程序(碱基局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序常规测定(Altschul等,J.Mol.Biol.,1990,215,403-410;Zhang和Madden,Genome Res.,1997,7,649-656)。
所提供的抑制基因产物表达方法包括其中靶基因产物表达与没有包含生物分子和/或非生物分子的纳米缀合物的基因产物表达相比被抑制如下比例的那些：至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或100%。换而言之，所提供的方法包括基本上导致任何程度的靶基因产物表达抑制的那些。
从体液样品或从活检样品中或通过本领域熟知的成像技术来体内测定抑制程度。可选择地，在细胞培养分析中体外测定抑制程度，其通常作为可由本文所述的组合物的使用体内预测的抑制程度的可预测测量。本公开设想靶多核苷酸的抑制用于评估在给定细胞中抑制的作用。通过非限制性例子的方式，可研究基因产物抑制的作用，其中基因产物是信号传导途径的一部分。可选择地，可研究基因产物的抑制，其中假设基因产物包括在细胞凋亡途径中。
应当理解，本文所述任何方法可组合使用以达到期望结果。例如但不限于，可组合本文所述方法以允许检测靶多核苷酸以及调节其表达两者。在一些实施方案中，该组合可用于定量在体内或体外随时间靶多核苷酸表达的抑制。在一方面，通过在特定时间点从培养物中移除细胞以及评估在各时间点下靶多核苷酸表达相对水平来达到随时间的定量。在一方面，如通过使可检测的标记随时间可视化来评估的靶多核苷酸量减少指示靶多核苷酸的抑制速率。
因此，测定给定多核苷酸与靶多核苷酸杂交和抑制靶多核苷酸的表达的有效性、以及测定给定多核苷酸在细胞上抑制作用是所涵盖的方面。
成像方法
磁共振成像(MRI)
在某些实施方案中，与多核苷酸缀合的MRI对比剂是铁或顺磁放射指示剂和/或复合物，包括但不限于钆、氙、氧化铁和铜。
荧光
提供其中通过可观察的变化来检测本公开的组合物存在的方法。在一方面，组合物的存在引起颜色变化，其使用能够检测如本文所公开的特异性标志物的装置来观察。例如但不限于，荧光显微镜可检测与作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸缀合的荧光团的存在。
通过催化金属沉积的复合物可视化
本文所描述的方法包括使金属沉积在如本文所定义的纳米缀合物和靶分子之间形成的复合物上以增强复合物的检测。当在导致金属层沉积在复合物上的条件下纳米粒子/靶分子复合物接触金属增强性溶液时，金属被沉积在纳米粒子/靶分子上。因此，本公开还提供包含纳米缀合物的组合物，所述纳米缀合物具有单次催化金属沉积，组合物具有至少约250纳米的平均直径。在一些实施方案中，平均直径是约250纳米至约5000纳米。在一些方面，涵盖不止一次的催化金属沉积。
如本文所使用，金属增强性溶液是与纳米缀合物-靶分子复合物接触以在复合物上沉积金属的溶液。在各方面并且取决于待沉积的金属类型，金属增强性溶液包含例如但不限于HAuCl4、硝酸银、NH2OH和氢醌。
在一些实施方案中，当与纳米缀合物接触时，靶分子被固定在支撑物上。如本文所使用，支撑物包括但不限于柱、膜或者玻璃或塑料表面。玻璃表面支撑物包括但不限于玻璃珠或载玻片。本公开所涵盖的塑料表面包括但不限于载片和微量滴定板。微阵列是本公开所涵盖的另外的支撑物，并且通常为玻璃、硅基或聚合物。微阵列对本领域普通技术人员是已知的，并且包括设置在支撑物上在可寻访的位置处的靶分子。微阵列可从例如但不限于Affymetrix,Inc购买。
在一些实施方案中，靶分子在溶液中。在该类型的分析中，使纳米缀合物接触溶液中靶分子以形成纳米粒子/靶分子复合物，然后在金属沉积在复合物上之后将其检测出。无论靶分子是在溶液中或在体液中，都可使用该类型的方法。例如但不限于，如本文所使用的溶液意思是缓冲的溶液、水或有机溶液。体液包括但不限于血液(血清或血浆)、淋巴液、脑脊液、精液、尿液、滑液、泪眼、黏液和唾液，并且可通过本领域常规技术方法来获得。
本公开还涵盖本文所述组合物和方法用于检测金属离子(例如但不限于，汞离子(Hg2+))的用途。在这些方面，本方法利用包含DNA多核苷酸的纳米缀合物的协同结合和催化性质以及Hg2+的胸腺嘧啶-胸腺嘧啶错配的选择性结合[Lee等,Anal.Chem.80:6805–6808(2008)]。
本文所述的方法还涵盖与生物条码(biobarcode)分析组合使用。生物条码分析通常描述在美国专利号6,974,669和7,323,309中，其全部通过引用各自并入本文中。
本公开的方法包括其中将银或金或其组合沉积在与靶分子的复合物中的纳米缀合物上的那些。
在一个实施方案中，在单次银沉积后，在如本文所述的纳米缀合物上银沉积方法产生约3pM的靶分子检测限制。在另一方面，第二次银沉积改善检测限制至约30fM。因此，银沉积次数与靶分子检测限制相关。因此，本领域普通技术人员将理解，本公开的方法可与给定浓度的靶分子相配合。例如但不限于，对于30fM的靶分子浓度，可使用两次银沉积。通过银沉积适合检测的靶分子浓度是约3pM、约2pM、约1pM、约0.5pM、约400fM、约300fM、约200fM、约100fM或更低。
在所提供的方法中，在使复合物在纳米缀合物和第一分子之间形成的条件下使纳米缀合物接触包含第一分子的样品。
还提供其中在使纳米缀合物与第一分子接触之前在使复合物形成的条件下使第二分子接触第一分子的方法。
还涵盖其中使靶分子连接与第一纳米缀合物缔合的第二纳米缀合物的方法。在一些方面，第二纳米缀合物固定在固体支撑物上。在其它方面，第二纳米缀合物在溶液中。
所提供的方法还通常涵盖使包含纳米缀合物的组合物接触不止一种靶分子。因此，在一些方面，设想包含多于一种多肽和/或多核苷酸的纳米缀合物能够同时识别和缔合不止一种靶分子。
在进一步的实施方案中，使用“夹心(sandwich)”方案鉴定靶多核苷酸来用于高通检测和鉴定。例如但不限于，识别和选择性缔合靶多核苷酸的多核苷酸被固定在固定支撑物上。使包含靶多核苷酸的样品接触包含多核苷酸的固体支撑物，从而使得发生缔合。在去除非特异性相互作用后，将包含如本文所述的纳米缀合物的组合物加入。在这些方面，纳米缀合物包含选择性缔合靶多核苷酸的分子，从而产生多核苷酸-靶多核苷酸-纳米缀合物的“夹心结构(sandwich)”。然后将该复合物暴露于如本文所述的金属沉积过程，得到高敏感性检测。相互作用的定量使得测定相关于但不限于疾病进展、治疗有效性、疾病鉴定和疾病敏感性。
在美国申请号12/770,488中找到在如本文所定义的纳米缀合物和靶分子之间形成的复合物上金属催化沉积以增强复合物的检测的的另外的描述，所述美国申请全部通过引用并入本文中。
检测靶多核苷酸的转录调节
本公开所提供的方法包括检测靶多核苷酸的转录调节的方法，所述方法包括施用纳米缀合物和转录调节剂，以及策略可检测的变化，其中相对于没有转录调节剂的转录水平，转录调节剂增加或降低靶细胞中靶多核苷酸的转录。
本公开还涵盖鉴定靶多核苷酸的方法。在这些方法的一些方面，筛选多核苷酸的文库的检测靶多核苷酸的转录增加或降低的能力。在各方面，文库是多核苷酸文库。在这些方法的一些方面，包含已知序列的双链多核苷酸用于制备纳米缀合物，产生第一纳米缀合物。在一些方面，双链多核苷酸的一条链进一步包含当多核苷酸的两条链依然彼此杂交时被猝灭的可检测的标志物。然后使纳米缀合物接触靶细胞，同时接触转录调节剂。如果用于制备纳米缀合物的已知序列的多核苷酸与靶多核苷酸杂交，则它导致可检测的变化。在一些方面，可检测的变化是荧光。与通过使靶细胞接触第二纳米缀合物所观察到的可检测的变化显著不同的可检测的变化的观察指示靶多核苷酸的鉴定，其中在所述第二纳米缀合物中多核苷酸包含不同于第一纳米缀合物的序列。因此，在另外的方面，每种纳米缀合物包含已知序列的多核苷酸，并且在又另外的方面，相对于当施用在文库内包含多核苷酸的不同纳米粒子时测定的可检测的变化，当施用转录调节剂时可检测的变化的增加或降低指示靶多核苷酸的鉴定。因此，在一些方面，本方法提供通过给定转录调节剂调节的mRNA的鉴定。在各方面，增加mRNA，以及在一些方面，降低mRNA。
将包含纳米缀合物的组合物的局部递送至人涵盖在本公开的一些方面。局部递送包括组合介入性放射法和本公开的组合物来使用栓塞剂。
作为探针的纳米缀合物的用途
在一方面，纳米缀合物用作检测核酸的诊断分析中的探针。
检测靶核酸的方法的一些实施方案利用基板。可使用使可检测的变化可观察的任何基板。任何合适的基板包括透明固体表面(例如，玻璃、石英、塑料和其它聚合物)、不透明的固体表面(例如，白色固体表面，例如TLC二氧化硅板、滤纸、玻璃纤维过滤器、硝酸纤维素膜、尼龙膜)和导电性固体表面(例如，氧化铟锡(ITO))。基板可以是任何形状或厚度，但是通常为平坦的和薄的。优选为透明基板，例如玻璃(例如，载玻片)或塑料(例如，微量滴定板的孔)。使多核苷酸与基板连接的方法以及关于纳米缀合物的其使用均公开在美国专利申请20020172953中，其全部通过引用并入本文中。
通过采用基板，可将可检测的变化放大并且使分析的敏感性增加。在一方面，本方法包括使靶多核苷酸接触具有连接至其上的多核苷酸的基板的步骤，所述多核苷酸(i)具有与靶核酸的序列的第一部分互补的序列，所述接触步骤是在使在基板上的多核苷酸与靶核酸有效杂交的条件下进行；以及(ii)使与基板结合的靶核酸接触具有连接至其上的多核苷酸的第一类型的纳米缀合物，所述多核苷酸具有与靶核酸的序列的第二部分互补的序列，所述接触步骤是在使作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸与靶核酸有效杂交的条件下进行。接着，使与基板结合的第一类型的纳米缀合物接触包含多核苷酸的第二类型的纳米缀合物，在第二类型的纳米缀合物上的所述多核苷酸具有与用于制备第一类型的纳米缀合物的多核苷酸的序列的至少一部分互补的序列，所述接触步骤在使在第一和第二类型的纳米缀合物上多核苷酸有效杂交的条件下发生。最终，观察到通过这些杂交产生的可检测的变化。
在纳米缀合物上多核苷酸与核酸的杂交后发生的可检测的变化可以是颜色变化、纳米缀合物的聚集物的形成或聚集的纳米缀合物的沉淀。用肉眼或分光镜可观察颜色变化。通过电子显微镜检查或通过浊度法可观察纳米缀合物的聚集物的形成。用肉眼或显微镜可观察聚集的纳米缀合物的沉淀。优选的是用肉眼可观察的变化。特别优选的是用肉眼可观察的颜色变化。
基于用肉眼观察的颜色变化的检测靶核酸杂交的方法是便宜、快速、简单、有效的(试剂是稳定的)，无需特定的或昂贵的设备，并且需要很少或不需要使用仪器。这些优点使得它们特别适合用于例如DNA测序的研究和分析实验室、检测特定病原体存在的领域、用于快速鉴定感染以辅助处方药物治疗的医师诊室在家庭和健康中心中用于便宜的第一线筛选。
包含多核苷酸的纳米缀合物可用于分析以靶向目标靶分子。因此，包含多核苷酸的纳米缀合物可在诸如生物条码分析的分析中使用。例如，参见美国专利No.6,361,944；No.6,417,340；No.6,495,324；No.6,506,564；No.6,582,921；No.6,602,669；No.6,610,491；No.6,678,548；No.6,677,122；No.6682,895；No.6,709,825；No.6,720,147；No.6,720,411；No.6,750,016；No.6,759,199；No.6,767,702；No.6,773,884；No.6,777,186；No.6,812,334；No.6,818,753；No.6,828,432；No.6,827,979；No.6,861,221；和No.6,878,814,其公开通过引用并入本文中。
给药和药物组合物
应当理解，本文所述的任何组合物可以治疗有效量施用至哺乳动物以达到期望的治疗效果。
如本文所使用，术语“治疗有效量”是指足以治疗、缓解或预防经鉴定的疾病或病症或表现可检测的治疗、预防或抑制效果的组合物的量。通过例如临床病症的改善、症状的减少或通过本文所述分析来检测效果。对于受试者的精确有效量将取决于受试者的体重、尺寸和健康；病症的性质和程度；以及选择用于施用的抗生素组合物或组合物的组合。可通过临床医生技术和判断范围内的常规实验来测定对于给定情况的治疗有效量。
本文所述的组合物可与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂可配制成药物组合物。可通过任何治疗例如但不限于如本文所述的疾病、疾患或感染的途径来施用化合物或组合物。施用的优选途径是口服施用。此外，使用任何标准施用途径可将包含抗生素组合物的化合物或组合物递送至患者，包括胃肠外，例如静脉内、腹腔内、肺内、皮下或肌肉内、鞘内、经皮(如本文所述)、直肠；口服；经鼻或通过吸入给药。
还可由本文所述的试剂制备缓释配制物以实现与胃肠道中体液接触的活性剂的控释，并且提供在血浆中基本恒定和有效水平的活性剂。为此目的可将晶形嵌入生物可降解的聚合物、水溶性聚合物或两者混合物以及任选合适的表面活性剂的聚合物基质中。在这种情况中嵌入可以指并入聚合物基质的微粒子中。还经已知分散或乳剂涂覆技术通过分散的微粒子或乳化的微滴的囊封来获得控释配制物。
施用可采用单一剂量施用形式，或者可在一段时间内以分份剂量或以连续释放配制物或施用方法(例如，泵)来施用实施方案的化合物。然而，当将实施方案的化合物施用至受试者时，应当选择施用化合物的量和选择的施用途径以实现疾病情况的有效治疗。也涵盖治疗剂的组合的施用(即，组合治疗)，条件是至少一种治疗剂与如本文所述的纳米缀合物缔合。
在一个实施方案中，取决于施用的特定方式和剂型，可与药学上可接受的赋形剂，例如载体、溶剂、稳定剂、佐剂、稀释剂等来配制药物组合物。取决于配制物和施用途径，通常应配制药物组合物以达到生理相容pH，并且pH范围可以为约3至约11，优选为约pH 3至约pH 7。在可选择的实施方案中，优选的是pH在约pH 5.0至约pH8的范围内调节。更具体地，在各方面，药物组合物包含治疗或预防有效量的如本文所述的至少一种组合物，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。如本文所述，药物组合物可任选地包含本文所述的化合物的组合。
术语“药学上可接受的赋形剂”是指用于施用诸如本文所述的化合物的药剂的赋形剂。该术语是指在没有过度毒性下可施用的任何药物赋形剂。
部分通过待施用特定组合物以及通过用于施用组合物的特定方法来确定药学上可接受的赋形剂。因此，存在多种合适的药物组合物的配制物(例如，参见Remington'sPharmaceutical Sciences)。
合适的赋形剂可以是包括大、缓慢代谢的大分子的载体分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和非活性病毒粒子。其它示例性赋形剂包括抗氧化剂(例如，抗坏血酸)、螯合剂(例如，EDTA)、糖类(例如，糊精、羟烷基纤维素和/或羟烷基甲基纤维素)、硬脂酸、液体(例如，油、水、盐水、甘油和/或乙醇)润湿或乳化剂、pH缓冲物质等。脂质体也包括在药学上可接受的赋形剂的定义范围内。
此外，药物组合物可以是无菌可注射制剂的形式，诸如无菌可注射的水性乳剂或油质悬浮液。该乳剂或悬浮液可通过本领域普通技术人员使用合适的分散或润湿剂以及悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可以是在非毒性胃肠外可接受稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如在1,2-丙二醇中的溶液。
无菌可注射制剂可以配制为冻干粉。此外，可采用无菌非挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可采用任何温和的非挥发性油，包括合成单甘酯或双甘酯。此外，在血管注射剂的制备中同样可使用脂肪酸(例如，油酸)。
透皮递送
在本公开的一些方面，提供的纳米缀合物的真皮递送方法包括施用包含纳米缀合物的组合物和真皮媒介物至需要其的患者的皮肤的步骤。
在一方面，纳米缀合物的递送是透皮递送。在另一方面，纳米缀合物的递送是局部递送。在另一方面，纳米缀合物的递送是局部敷用后至表皮和真皮。在一些实施方案中，真皮媒介物包括软膏。在一些方面，软膏是Aquaphor。
在本方法的另外的实施方案中，组合物的施用缓解皮肤疾患。在各实施方案中，皮肤疾患选自癌症、遗传病、老化、炎症、感染和化妆品损伤。
对于纳米粒子组合物的真皮递送及其使用方法的进一步描述参见PCT/US2010/27363，其全部通过引用并入本文中。
媒介物
在一些实施方案中，本公开的组合物和方法包括媒介物。如本文所使用，“媒介物”是与纳米缀合物组合物相缔合的碱基化合物。
在本公开的组合物和方法中可使用的媒介物是本领域普通技术人员已知的，并且包括但不限于软膏、乳膏、洗剂、凝胶、泡沫剂、缓冲溶剂(例如但不限于，林格氏溶液和等张氯化钠溶液)或者水。在一些实施方案中，媒介物包含一种或多种另外的物质，包括但不限于增强通过角质层渗透的水杨酸、α-羟基酸或尿素。在各方面，在本公开的组合物和方法中涵盖使用的媒介物包括但不限于：
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愈合软膏、A+D、聚乙二醇(PEG)、甘油、矿物油、凡士林特效乳膏(VaselineIntensive Care cream)(包含矿物油和甘油)、矿脂(petroleum jelly)、DML(包含矿脂、甘油和PEG 20)、DML(包含矿脂、甘油和PEG 100)、Eucerin保湿霜、Cetaphil(包含矿脂、甘油和PEG 30)、Cetaphil、CeraVe(包含矿脂和甘油)、CeraVe(包含甘油、EDTA和胆固醇)、Jergens(包含矿脂、甘油和矿物油)和Nivea(包含矿脂、甘油和矿物油)。本领域普通技术人员从以上列表中将理解在本公开的组合物和方法中可使用的另外的媒介物。
如本文所使用，软膏是油包水配制物。如本文所使用的乳膏是水包油配制物。通常，洗剂具有比乳膏或软膏更多的水；凝胶包含醇；以及泡沫剂是通过获取液体中气泡而形成的物质。这些术语都按照本领域普通技术人员所理解。
栓塞剂
还涵盖与本公开的组合物组合的栓塞剂的施用。栓塞剂用于经有目的地引入栓子通过选择性闭塞血管来在靶位点增加局部药物浓度，同时通过降低动脉流入来减少药物洗脱。因此，相对于没有栓塞剂时组合物将保留在靶位点的时间段，与栓塞剂组合的包含含有多核苷酸的纳米粒子的组合物(其中多核苷酸通过缀合位点与对比剂缀合)保留在靶位点的时间段更长。因此，在一些实施方案中，本公开涵盖如本文所述的组合物联合栓塞剂的使用。
在本公开的组合物和方法的各方面，待使用的栓塞剂选自脂质乳剂(例如但不限于，乙碘油或碘化油)、明胶海棉、tris乙酰明胶微球、栓子形成旋管(embolization coil)、乙醇、小分子药物、生物可降解性微球、非生物可降解性微球或聚合物以及自组装栓塞性材料。
通过使期望组织或细胞成像和/或疾病或病症得以治疗的任何途径施用本文所公开的组合物。在一方面，施用途径是动脉内施用。此外，使用任何标准施用途径向患者递送包含纳米缀合物的组合物，所述标准施用途径包括但不限于口服；胃肠外，例如静脉内、腹腔内、肺内、心脏内、骨内输液(“IO”)、皮下或肌肉内、鞘内、透皮、皮内、直肠；口服施用；鼻腔或通过吸入或穿粘膜递送。也涵盖本文所提供的组合物的直接注射剂，以及在一些方面，通过皮下注射针头来递送。也由本文所述组合物配制缓释配制物以实现如本文所述的与体液接触的组合物的一种或多种组分的控释，以及从而基本上提供血浆中组合物的一种或多种组分的恒定和有效水平。
靶位点鉴定和组合物递送
本文提供向细胞递送对比剂的方法，所述方法包括在足以向细胞递送对比剂的条件下使细胞接触本公开的组合物。在递送组合物后，在一些方面，本方法进一步包括检测对比剂的步骤。通过本领域已知的任何方法(包括本文所述的那些)来进行对比剂的检测。
在具体的实施方案中，使用成像程序来检测对比剂，以及在各方面，成像程序选自MRI、CT和荧光。
所提供的方法还包括其中本公开的组合物被局部递送至靶位点的那些。在一方面，一旦已鉴定出靶位点，本公开的组合物即经动脉内递送。在另一方面，本公开的组合物经静脉内递送。在各方面，用于递送本公开的组合物的靶细胞选自癌细胞、干细胞、T-细胞和β-胰岛细胞。
在各方面，靶位点是发病部位。
在一些方面，发病部位是癌症。在各方面，癌症选自肝、胰腺、胃、直肠结肠、前列腺、睾丸、肾细胞、乳腺、膀胱、输尿管、脑、肺、结缔组织、血液、心脏血管、淋巴管、皮肤、骨骼、眼、鼻咽、喉部、食管、口膜、舌、甲状腺、腮腺、纵隔膜、卵巢、子宫、附件、小肠、阑尾、类癌瘤、胆囊、脑垂体、由转移性延伸引起的癌症以及由内胚层、中胚层或外胚层源性组织引起的癌症。
在一些实施方案中，发病的部位是实体器官疾病。实体器官选自心脏、肝脏、胰腺、前列腺、脑、眼、甲状腺、垂体、腮腺、皮肤、脾脏、胃、食管、膀胱、小肠、胆管、阑尾、结肠、直肠、乳腺、膀胱、肾脏、尿管、肺和内胚层、中胚层或外胚层源性组织。
化疗剂的活化
根据本公开，设想与如本文所述的纳米缀合物连接的化疗剂在进入细胞后被活化。在一些方面，活化的化疗剂使得与未连接多核苷酸的化疗剂相比细胞毒性增加，其中多核苷酸是纳米缀合物的部分，以及其中使用体外细胞培养分析来测定细胞毒性的增加。体外细胞培养分析为例如但不限于(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)(MTT)分析。因此，将以上所述细胞毒性增加与在其进入细胞之前连接作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸的化疗剂毒性的降低相结合。
靶分子
本公开设想本文所述任何组合物可用于检测靶分子。在各方面，靶分子是多核苷酸，并且多核苷酸是真核、原核、或病毒多核苷酸。
在一些方面，靶分子是多核苷酸。
如果多核苷酸存在于小分子中，可通过本领域已知的方法将其扩增。例如，参见Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第二版，1989)和B.D.Hames和S.J.Higgins,Eds.,Gene Probes 1(IRL Press,New York,1995)。通常但不限于，可进行聚合酶链反应(PCR)扩增以增加靶核酸的浓度至其可更容易地被检测出的程度。
在各实施方案中，所提供的方法包括以下那些：靶多核苷酸是编码基因产物的mRNA并且基因产物的翻译被抑制；或者靶多核苷酸是在编码基因产物的基因中的DNA并且基因产物的转录被抑制。在其中靶多核苷酸是DNA的方法中，在某些方面，多核苷酸是编码待抑制的基因产物的DNA。在其它方法中，DNA与基因产物的编码区互补。在另外的方面，DNA编码基因产物表达所必需的调节性元件。“调控元件”包括但不限于增强子、启动子、沉默基因、多腺苷酸化信号、调控蛋白结合元件、调控内含子、核糖体进入位点等。在又一方面，靶多核苷酸是内源性复制所需要的序列，在进一步的实施方案中，靶分子是微RNA(miRNA)。
抗原核靶多核苷酸
在各方面，对于原核靶多核苷酸，多核苷酸是由基因组DNA转录的基因组DNA或RNA。对于真核靶多核苷酸，多核苷酸是动物多核苷酸、植物多核苷酸、包括酵母多核苷酸的真菌多核苷酸。如上，靶多核苷是由基因组DNA序列转录的基因组DNA或RNA。在某些方面，靶多核苷酸是线粒体多核苷酸。对于病毒靶多核苷酸，多核苷酸是病毒基因组RNA、病毒基因组DNA或由病毒基因组DNA转录的RNA。
在一个实施方案中，将本发明的多核苷酸设计为在生理条件下与靶原核序列杂交。
应当理解，本领域技术人员可容易地测定包含多核苷酸的纳米缀合物的合适的靶，并且使用本领域已知的技术来设计和合成多核苷酸。可通过获取例如目标靶核酸(例如从GenBank)的序列以及使用例如MacVector 6.0程序、ClustalW算法、BLOSUM 30矩阵和默认参数来将其与其它核酸序列比对来鉴定靶标，所述默认参数包括对于核酸比对的开放空位罚分10和延伸空位罚分和5.0。
设想任何必要的原核基因为使用本公开的方法的靶基因。如上所述，可使用多种方法测定对于任何原核物种必要的原核基因，包括由Gerdes所描述的用于大肠杆菌(E.coli)的那些方法[Gerdes等,JBacteriol.185(19):5673-84,2003]。许多必要基因保留在细菌界中，从而提供另外的靶选择指导。可使用容易获得的生物资讯来源来鉴定靶基因序列，例如通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)所持有的那些。
然后在用于治疗人感染前，在动物模型或家畜中测试包含显示最佳活性的多核苷酸的纳米缀合物。
细胞分裂和细胞周期靶蛋白的靶序列
将本公开的多核苷酸设计为与编码必要原核基因的原核核酸的序列杂交。示例性基因包括但不限于细胞分裂所需要的那些、细胞周期蛋白或类脂生物合成或核酸复制所需的基因。
对于这三种蛋白质中每种，全部通过引用并入本文中的美国专利申请号20080194463的表1提供示例性细菌序列，其含有大量重要病原性细菌的每种的靶序列。基因序列源于各菌株的GenBank参考完整基因组序列。
原核16S核糖体RNA的靶序列
在一个实施方案中，将本发明的多核苷酸设计为在Tm基本上大于37℃，例如，至少45℃以及优选为60℃-80℃的生理条件下与编码细菌16S rRNA核酸序列的序列杂交。
示例性细菌和相关的16S rRNA序列的GenBank登录号提供在美国专利No.6,677,153的表1中，其全部通过引用并入本文中。
另外的靶分子
靶分子也可以在如本领域已知的细胞、组织样本或生物流体中。
在各实施方案中，本公开设想在靶细胞中检测不止一种靶多核苷酸。
在进一步的实施方案中，靶分子是离子。在一方面，本公开设想离子是亚硝酸盐(NO2-)。在一些方面，离子是选自汞(Hg2+)、Cu2+和UO2+的金属离子。
试剂盒
还提供包含本公开的组合物的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含至少一个容器，所述容器装有至少一种类型的如本文所述的纳米缀合物，所述纳米缀合物包含一种或多种如本文所述的多核苷酸。作为第一种类型的纳米缀合物的一部分的多核苷酸具有与靶多核苷酸的第一部分的一个或多个序列互补(或如本文所公开充分互补)的一个或多个序列。容器任选地包含一种或多种另外类型的纳米缀合物，所述纳米缀合物包含具有与靶多核苷酸的第二部分的一个或多个序列互补的序列的多核苷酸。
在另一个实施方案中，试剂盒包含至少两个容器。第一容器装有如本文所公开的一种或多种纳米缀合物，所述纳米缀合物包含可与靶生物分子和/或非生物分子的一个或多个部分缔合的如本文所述的一种或多种生物分子和/或非生物分子。第二容器装有一种或多种纳米缀合物，所述纳米缀合物包含可与靶生物分子和/或非生物分子相同或不同部分的一个或多个序列缔合的一种或多种生物分子和/或非生物分子。
在另一实施方案中，试剂盒在单独的容器中具有生物分子和/或非生物分子以及纳米粒子，并且在使用本文所述方法前制备纳米缀合物。在一方面，将生物分子和/或非生物分子和/或纳米粒子官能化，从而可产生纳米缀合物。可选择地，在试剂盒中提供没有官能团的生物分子和/或非生物分子和/或纳米粒子，在这种情况下则必须在分析前将它们进行官能化。在另外的方面，提供有助于生物分子和/或非生物分子的交联的化学品。
在所提供的试剂盒的各方面，生物分子和/或非生物分子包括标记或试剂盒包括标记，所述标记可连接至生物分子和/或非生物分子。可选择地，试剂盒包括可连接至纳米粒子的标记的纳米粒子或标记。在各实施方案中，试剂盒任选地包括说明书，各容器包含标记，试剂盒自身包括标记，试剂盒任选地包含一种或多种非特异性生物分子(用作对照)。
实施例
实施例1
材料
除非另有说明，所有材料均从Sigma-Aldrich购买，并且在没有进一步纯化的情况下使用。TEM表征是在Hitachi H8100电子显微镜上进行。使用与DCH CryoProbe偶接的Bruker Avance III 500MHz来进行NMR实验。从MALVERN Zetasizer,Nano-ZS获取DLS数据。从Bruker TENSOR 37获得IR结果，并且使用OPUS软件分析。在Bruker Autoflex III SmartBeam质谱仪上进行MALDI-TOF测量。
聚(N-(2-(3-(丙-2-炔氧基)丙酰胺)乙基)丙烯酰胺)1的合成
按照以下文献报道的方法[Zhang等,Biomaterials 31:1805(2010);Zhang等,Biomaterials 30:968(2009)]制备聚丙烯酰胺乙胺20(PAEA120)。在将含有炔丙基-dPEG1-NHS酯(150mg,660μmol,Quanta Biodesign)和二异丙基乙胺(DIPEA,204μL1.17mmol)的1mL DMSO溶液加入之前，将PAEA120(67.5mg,4.9μmol)溶解在无水DMSO(2mL)中，然后搅拌3小时。使反应混合物搅拌过夜，通过加入DMSO(10mL)稀释，转移至预先浸透的透析管(MWCO=3.5kDa)，然后在超纯水(nanopurewater)(>18.0MΩ·cm)中透析3天。然后将溶液冻干和再悬浮在水(15mL)中。观察到少量浑浊，通过0.2μm注射器式过滤器过滤而将其消除。通过茚三酮测试未检测到残余的胺基。1的IR和1H-13C HSQC NMR光谱显示在图12中。
甲基-末端聚(乙二醇)-炔丙醚缀合物5的合成
将单分散mPEG24-胺(39.0mg,34.6μmol,Quanta Biodesign)溶解在1.0mL pH=8.0磷酸缓冲液中，向其加入炔丙基-dPEG1-NHS酯(12.1mg,53.7μmol)。将混合物在4℃下摇匀12小时。通过反相HPLC(水/乙腈，Varian DYNAMAX C18柱(250×10.0mm))将期望的缀合物从反应混合物中分离。MALDI-TOF:1220.553[M+Na]+。1H-13C HSQCNMR:图11。
13nm AuNP的合成
使HAuCl4(1mM,500mL)的水性溶液在搅拌下回流，然后将柠檬酸三钠溶液(50mL,77.6mM)快速加入沸腾混合物中。将溶液另外回流15分钟，并且然后使其冷却至室温。通过TEM(12.8±1.2nm)来测定金纳米粒子的平均直径。在该研究中使用的其它尺寸的AuNP从Ted Pella处购买。
制备纳米缀合物的通用方法
向10mL AuNP溶液(10nM)中加入10μL的10%十二烷基硫酸钠。然后将含有1的水性溶液加入以得到20nM的最终浓度。在使用Eppendorf 5424离心机以15,000rpm离心分离30分钟前，将溶液搅拌2天。通过小心移液来去除上清液，然后将AuNP再悬浮在超纯水中。将该过程重复三次以确保过量聚合物的完全去除。在最后离心后，将聚合物-涂覆的AuNP浓缩至1mL，然后将50μL的1.0M KCN水性溶液加入以去除金核心。然后使用先浸透的透析管(MWCO=6-8kDa)将所得的溶液经超纯水(>18.0MΩ·cm)透析3天。使最终纳米缀合物溶液呈现清澈和微黄色。需要大量的金纳米粒子模板(>500mL)以制备用于NMR和IR分析的足够量的纳米缀合物。
实施例2
在寻找能与稠密单层DNA一起交联在金表面的合适的正交化学品中，发现包含DNA链的聚炔烃在没有任何另外的催化剂下在金纳米粒子表面上自动交联。在初始实验中，利用可使用期望的化学部分来修饰的合成修饰的碱基来合成DNA链。因为亚磷酰胺化学品的模块化性质，这些碱基在任何位置处并入多核苷酸序列内。为该体系选择的修饰的碱基是胺-修饰的胸苷残基，其可与炔烃-NHS酯反应以在序列内产生炔烃修饰的胸苷(图1)。然而，可使用可转化为炔烃的任何部分。然后合成合并硫醇部分的链，用于连接5T残基的10个胺修饰的T单体的交联区(CR)以及可程序化DNA或RNA结合区(BR)。然后用炔烃NHS酯来修饰CR，其产生BR中具有10个炔烃单元的链。使用的两个示例序列是5'TCA-CTA-TTA-TTTTT-(炔烃修饰的T)10-SH 3'(SEQID NO:1)和5'TAA-TAG-TGA-TTTTT-(炔烃修饰的T)10-SH 3'(SEQ ID NO:2)。
在典型的实验中，将1O.D.的DTT-处理的炔烃-DNA加入到浓度为约10nM的1mL的13nm金纳米粒子。然后将聚山梨醇酯20(吐温-20)和磷酸缓冲液(pH7.4)加入纳米粒子以得到0.01%吐温-20和50mM磷酸缓冲液的最终浓度。因为多核苷酸必须尽可能接近以交联，所以使纳米粒子达到1.0M的高氯化钠浓度以将装载量最大化。然后将粒子离心(13.2k rpm)并且再悬浮在PBS/SDS中三次以去除过量的DNA。
在氧气存在下通过使用KCN来达到AuNP核心的溶解。当将KCN加入柠檬酸盐稳定的AuNP时，溶液的颜色立即由红变紫，导致AuNP的不稳定和聚集(图2A)。观察到用硫醇化多核苷酸来稠密官能化的AuNP的类似效果，但过程较慢(图2A)。然而，对于炔烃-DNAAuNP，在溶解过程中颜色缓慢变为浅红橙色，直至溶液清澈(图2B)。该观察表明炔烃修饰的DNA形成稠密交联的外壳，这防止典型聚集，所述典型聚集是氧化溶解的AuNP的典型特征。而且，如从AuNP尺寸的减少所预期，紫外-可见光谱显示等离子共振从524nm至518nm的逐渐减少(图2B)。[Link等,J.Phys.Chem.B103(21):4212-4217(1999)]。
在透析后，通过使用乙酸双氧铀染色在溶解过程的不同阶段的TEM来分析结构(图3)。通过快速旋转过滤来猝灭溶解反应，其去除所有KCN以及将粒子保留在过滤器上。明显，当粒子溶解时，稠密配体外壳负责粒子在KCN中的显著稳定性。在中间时间点处，当粒子大小收缩时，染色显示在粒子表面周围的稠密外壳。在完成溶解过程后，能清楚地观察到DNA的球形粒子。
实施例3
因为这些结构由几乎完整的DNA制成，所以凝胶电泳是分析交联反应完整性和所得结构的质量的有效方法。分析后，将未反应的炔烃-DNA链与由模板化方法形成的粒子比较。中空粒子比游离链移动更为缓慢并且类似于未溶解的DNA-AuNP缀合物。接着，分析在这些中空DNA纳米缀合物的形成中DNA密度的作用(图4)。在功能化过程中使用在DNA/金纳米粒子溶液中钠离子的浓度能容易地控制在纳米粒子表面上DNA的密度。在低DNA表面密度时，清楚的是得到交联产物的分布，并且其中渐增的表面密度(交联产物尺寸的增加)显著。在由盐老化至0.5M NaCl的粒子获得的临界密度时，在高分子量下呈现尖锐的带。该带从盐老化至1.0MNaCl的粒子变为主要产物(通过密度测定法为约99%)，其具有最大表面密度。
实施例4
接着，测试由一系列大小范围的金纳米粒子获取中空DNA纳米缀合物的能力。确实，中空粒子通过凝胶的迁移与所得中空结构的尺寸直接相关，其中较大的中空粒子比较小的中空粒子迁移慢(图5A)。然后在CR中改变炔烃的数量，同时保持总残基的数目恒定，从而测定该过程的最小炔烃密度(例如，在CR中具有3个炔烃的链具有7个非修饰的T残基)。在CR中约5个炔烃的阈值下，获得与来自之前实验的粒子尺寸类似的粒子(图5b)。然而，当炔烃单元的数量从5增加至更大的数字时，粒子迁移稍微更快，这指示更为稠密的交联的纳米缀合物。
实施例5
在确立该方法可制备全部由交联的DNA组成的纳米缀合物后，研究它们的功能性质。当多核苷酸稠密排列在AuNP的表面上时，出现许多新的作用，包括但不限于：熔化转变温度升高和变窄、增强与靶的结合、可逆定向组装、无转染剂情况下高细胞摄取、显著核酸酶抗性和强效反义/RNAi衔接。由于DNA在金纳米粒子的表面上的稠密多价排列，这些性质会出现。因此，如果DNA在中空纳米缀合物中维持它们的结合能力，则可观察到多价DNA的结合特性。
因此，设计两种纳米粒子体系，其中将在纳米粒子上的链设计成使得在一个序列中没有自身互补，从而与链中的一条官能化的粒子将在溶液中稳定。然而，当将两种粒子混合至一起时，链的互补性将纳米粒子一起引入宏观聚合组装中。因为中空纳米缀合物在可见光谱中没有吸收，而相反AuNP具有非常强的可见光学性质，将系统设计为在序列末端处包含荧光共振能量转移(FRET)活性荧光团(荧光素(Fl)和Cy3)。因此，当粒子杂交时，Fl将使能量转移至Cy3，并且观察到Cy3的橙色荧光。成功合成具有这些新链的中空DNA纳米缀合物，并且其显示出通过琼脂糖凝的类似的迁移。可使用UV光源来激发荧光素，然而Cy3却不能。Fl修饰粒子的溶液呈现亮绿色荧光，并且Cy3粒子没有表现出特有的橙色荧光。然而，当将这些粒子混合至一起时，在UV灯下很容易观察到Cy3的橙色荧光。在一段时间后，这些粒子形成从溶液中析出的肉眼可见的聚集物(图6)。有趣的是，当将这些粒子加热时，可见荧光素的亮绿色荧光，这表明该步骤可逆。当DNA-AuNP类似地杂交时，该设计的绿色至橙色变化类似于明显的红色至紫色变化。
这些粒子随着时间形成肉眼可见的聚集物，表明类似于DNA-AuNP聚集物，它们以协同方式结合。进行紫外-可见熔化测定以分析粒子间协同性程度。众所周知在纳米粒子的表面上DNA的密度与所得聚集物的熔化转变的幅度和温度直接相关[Jin等,J.Am.Chem.Soc.125(6):1643-1654(2003)]。
在260nm的光下监测游离链、DNA-AuNP和中空DNA聚集物的消光作为温度的函数(图7)。在该体系中游离链具有约23℃的熔化转变。当用这些链将AuNP官能化并且将其混合至一起时，发生典型红色至紫色等离子改变，并且形成聚集物[Mirkin等,Nature 382(6592):607-609(1996)]。预期在约43℃下这些聚集物急剧熔化(熔化转变的衍生物的半峰时全宽度(FWHM)为约2℃)。由中空纳米缀合物中形成的聚集物表现出在约40℃下类似的急剧熔化转变，其中熔化转变的衍生物的FWHM的跨度约2℃。该极其类似的熔化性质是在配体外壳交联和金核心溶解后保留与DNA-AuNP缀合物相关的多价熔化性质的直接指示。
实施例6
已经证明中空DNA纳米缀合物维持它们DNA-AuNP对应物的尺寸、形状和功能，接下来研究它们作为基因调节剂的有效性。以与DNA中空粒子相同方式来合成RNA中空粒子，但在这种情况中，使用DNA/RNA嵌合体，其中该链的CR仍然含有10个炔烃-T单元，并且合成的CPG转移至RNA合成以完成合成。此外，用Cy5标记反义RNA链，从而用荧光显微术使中空粒子在细胞中可视化。在透析中空粒子后，将交联链的反义补体以超过100倍加入中空粒子中，从而在粒子的表面上形成双链体。用这些粒子转染HeLa细胞24小时，并且用共焦点显微镜检查成像。如与未处理的细胞相比较，在转染后收集的粒子可见为蓝色，这表明在细胞内有非常多数目的粒子。
然后合成靶向EGFR的RNA序列。EGFR是与癌症相关的重要的靶。在各时间段(48、72、96小时)转染SCC12(人鳞状细胞癌)细胞，并且收集它们的蛋白质和mRNA内容物。初始实验显示归一化至参照基因GAPDH的EGFR的显著敲低(图8A)。而且，蛋白质印迹显示如与未处理的细胞相比EGFR的显著敲低(图8B)。
实施例7
以上例子显示可产生中空纳米缀合物，接着研究在该过程中的化学性质。为此，建立多个模型体系以研究这些结构形成的机制。所有这些模型体系将炔烃并入配体外壳用于交联。设计聚合物体系、单一炔烃DNA体系和单一炔烃PEG体系。
通过窄多分散性指数为1.10的聚丙烯酰胺乙胺20的聚合后修饰容易地制备炔烃部分1的聚合物[Zhang等,Biomaterials 30(5),968-977(2009)]。因不含有带电基团，1表现在室温下水中中等溶解性。在较低温度下溶解性增加。因含有多个侧臂炔丙基醚基，1通过Turkevich-Frens法容易吸吸附到在水性溶液中制备的柠檬酸盐稳定的13nm AuNP内(参见流程图1)。通过多次离心-再悬浮步骤将过量的聚合物去除。所得的聚合物-涂覆的AuNP保留在524nm的等离子共振下，并且稳定数月，与在相同条件下立即撞击粒子的未修饰的多胺聚合物形成对照。
在氧气的存在下使用1mM KCN达到AuNP核心的溶解。当将KCN加入柠檬酸稳定的AuNP时，溶液颜色立即从红色变为紫色，这是由AuNP的不稳定和聚集造成。然而，对于聚合物涂覆的AuNP，在溶解过程中颜色缓慢变为浅红橙色直至溶液澄清(图9A)。该观察表明1形成稠密交联的外壳，其防止典型聚集，所述典型聚集为氧化溶解的AuNP的特点。而且，如从AuNP尺寸的降低所预期，紫外-可见光谱显示从524nm至517nm的等离子共振的逐渐降低(图9B)。
通过透射电子显微镜检查(TEM)将溶解过程可视化(图9C)。当AuNP的外层被部分溶解时，用TEM格栅的乙酸双氧铀染色来观察上述保护性外壳。模板的完全去除得到以高保真性保留它们模板尺寸和形状的中空纳米缀合物。当使用一定范围尺寸(10、20、30和40nm)的AuNP模板时，如通过动力光散射(DLS)和TEM测定，所得的聚合物纳米缀合物(PNS)的尺寸与初始模板的尺寸直接相关(图10)。这些结果表明AuNP不仅用作模板，还用作通过炔烃部分形成PNS的催化剂。然而，它们提出关于使用什么类型的化学途径将1转化为所得的PNS的问题。
实施例8
在13nmAuNP的表面上交联前后的IR光谱显示乙炔C≡C伸缩(2114cm-1)、C-H伸缩(3805cm-1)和弯曲(1274,646cm-1)振动的完全消失，这表明丙炔基醚基包括在反应中。不太可能得到由13nm AuNP中制成的PNS的NMR光谱，可能是由于相对大结构的溶剂更难获得(图11D)。
然而，5nmAuNP制备适合分析的PNS。1H和13C NMR光谱显示炔丙基的共振损失，其通过丙烯醛的消除可能保留在羟基之后(图11B)[Fukuda等,Bull.Chem.Soc.Jpn.64:2013-2015(1991)]。然后所得的羟基可用作新的亲核试剂，用于保留炔烃-Au复合物以产生乙缩醛键合[Fukuda等,J.Org.Chem.56(11):3729-3731(1991)]。事实上，1H-13C HSQC光谱显示出现伯醇(δ3.81ppm,1H)、烷基醚(δ3.74ppm,1H)和乙缩醛(δ4.32ppm,1H)基团的α-H的共振。之前已知这些转变仅在用金离子催化剂下才有可能。不受任何理论限制，可提议可能的途径(图17)。
亲炔性AuNP与1的配位之后为水的亲核加成以产生中间体2，其通过消除形成3。因为在AuNP的表面上的高局部浓度，在没有高温下羟基与Au-炔基复合物之间的反应是可能的，使得乙缩醛和醚与4交联重新产生催化AuNP表面位点。然而，AuNP不能进一步催化反应，因为形成的稠密外壳应防止游离聚合物的进入。事实上，发现在溶液中保留的聚合物完全是初始材料1。而且，该途径还指示单一炔烃部分可形成3-臂交联。
为了支持所提议的机制，合成单分散聚(乙二醇)24-炔丙醚缀合物5，其可方便地进行质谱和NMR分析(图11B)。在与AuNP孵育时，如通过基质辅助激光解吸/离子飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)和NMR光谱(图12)所证实，5定量转化为伯醇。为了证实该化学物质与含有各种官能团的复杂分子可相容，合成DNA-衍生的炔烃6，并且与AuNP孵育。再次，发现6损失38个质量单位以得到伯醇。更有趣的是，观察琼脂糖凝胶电泳和MALDI-TOF MS、二聚体和三聚体(图13)。
实施例9
接着，合成的聚合物用于功能性模型体系中。通过在AuNP模板上与多价丙炔基醚1共同形成外壳可将功能性蛋白合并至聚合物纳米缀合物的外壳内(图14A)。这些结构称之为蛋白纳米缀合物。作为证明，将链霉亲和素和辣根过氧化物酶(HRP)用作模型蛋白。链霉亲和素可与束缚生物素部分结合至表面，从而固定蛋白纳米缀合物。如果存在，通过催化在四甲基联苯胺(TMB)和过氧化氢之间的发色反应，然后HRP能提供读出的方式。原则上，仅当两种蛋白均存在于蛋白纳米缀合物中时，并且在AuNP溶解过程之后当两种蛋白仍然保留活性时，将观察到信号(图14B)。事实上，仅当链霉亲和素、HRP和聚合物1在蛋白纳米缀合物外壳的产生下使用时，才观察到信号(图15)。缺乏HRP或聚合物1都会导致体系没有功能。
实施例10
在各方面，本公开提供用于在纳米缀合物上交联多核苷酸的方法。该实施例提供用于影响交联的另外的方法。如上所述，另外的方法包括DSC和SAC。
在典型的实验中，将1O.D.的DNA加入在浓度约10nM的1mL的13nm金纳米粒子中。然后分别将聚山梨酯20(吐温-20)和磷酸缓冲液(pH 7.4)加入纳米粒子，得到0.01%和50mM的最终浓度。因为对于交联多核苷酸必须尽可能接近，所以使纳米粒子达到1.0M的高氯化钠浓度以使装载量最大化。然后将粒子离心(13.2k rpm)并且再悬浮在PBS/SDS中三次以去除过量的DNA。
通过缓慢加入Sulfo-EGS至1μM的最终浓度来进行交联步骤。缓慢加入是必要的以防粒子间交联，并且还能防止使用交联剂的DNA链的饱和，这将导致没有交联。溶液保持其亮红色，并且未观察到聚集。然后通过离心(在13.2k rpm下3次)来纯化粒子，然后准备溶解。
为了溶解金核心，将氰化钾加入至纳米粒子溶液。当粒子溶解时，溶液的亮红色完全褪色，得到清澈的溶液。有趣的是，与已经使用胺-修饰的链官能化但未交联的粒子相比，交联的粒子用更长的时间溶解。非交联的粒子在一分钟内溶解，但是交联的粒子可能用达10分钟以完全溶解，甚至需要一些轻度加热。在其它处也观察到相同作用(Langmuir,2008,24(19),第11169–11174页)，其是交联结构的证据。
为了进一步测试中空结构的性质，使用zeta电位测定值(zeta potential measurement)分析存在于表面上总库伦电荷。由于在表面上带负电荷DNA链的紧密排列，金纳米粒子-DNA缀合物是带高负电荷的。如果交联是有效的，中空结构应当保持该性质。分析三种样品：DNA-纳米粒子缀合物、未交联的溶解的DNA-纳米粒子缀合物和已经交联的溶解的DNA-纳米粒子-中空结构。如所预期，溶解的粒子显示如下表4所表示的与纯金纳米粒子-DNA缀合物基本相同并且在测量值误差内的zeta电位测定值。
表4:ZETA电位测定值
  AuNP-DNA   非交联溶解的   交联溶解的
  -38±3mV   -5±3mV   -36±4mV
最终，通过凝胶电泳测试中空结构的结构性质。在电泳分析中，可收集关于分子或纳米缀合物的尺寸和电荷的信息。在120V下使用具有溴化乙锭染色剂的2%琼脂糖凝胶，比较溶解未交联和交联(中空)粒子的DNA移动。来自交联的结构的DNA比从未交联的粒子中释放的游离链移动更快。这可以通过以下事实解释，可在类似中空粒子的球形中的超螺旋的DNA比更小尺寸的游离链DNA通过凝胶的移动更快。
在另外的途径中，合成含有两种不同多核苷酸纳米缀合物的多核苷酸。第一种是对靶特异性的核苷酸序列。另一区是包含大量悬垂的烷基胺的间隔区。如流程图2(以下)所显示，这些胺用作合成柄(synthetic handle)以使多核苷酸与胺反应性同双同官能接头(homobifunctional linker)交联。可选择地，通过含有那些基团的NHS酯这些胺可转化为叠氮化物和炔烃。在此种情况中，“点击(click)”化学可用于交联多核苷酸。在没有金纳米粒子下合成稠密多核苷酸纳米缀合物的另外的途径是将多核苷酸与聚(酰氨胺基)(PAMAM)树状分子缀合。用EDC和NHS将用末端癸酸部分官能化的多核苷酸激活，然后与PAMAM树状分子混合。可选择地，用EDC和NHS将以羧酸酯基团为末端的PAMAM树状分子活化，并且与胺-末端多核苷酸反应。
Figure BDA00001789635801071
流程图2.用含有胺的多核苷酸和同双官能交联剂产生多核苷酸纳米缀合物的可能途径
用凝胶电泳来表征多核苷酸纳米缀合物以测量其质量和多分散性。接下来，使用解链实验、酶测定和细胞研究来研究多核苷酸纳米缀合物的协同性质。在解链研究中，使用互补序列来合成两种多核苷酸纳米缀合物。在退火后，将多核苷酸纳米缀合物解链，并且将解链温度分布与相同游离多核苷酸序列的解链温度分布相比较。与游离多核苷酸相比，多核苷酸纳米缀合物具有尖锐和升高的解链转变。使用核酸酶测定来研究多核苷酸纳米缀合物的协同性质。在这些实验中，测量链降解的速率并且将其与纳米缀合物和游离多核苷酸比较。
当与游离多核苷酸比较时，以这种方式设计的所有模板化体系均抵抗酶降解。进行细胞摄取研究以检查这些结构内吞作用的增强。此外，进行基因敲低研究以测定所述结构调节蛋白表达的能力。
在一方面，通过使用在纳米粒子表面上模板化组装、交联和同双官能团交联剂，本实施例提供另外的方法以获取中空和更少核心的多核苷酸纳米缀合物。通过使用DNA和siRNA策略，这些物质可用在针对细胞内靶的基因调节方法中。
Figure IDA00001789636300011
Figure IDA00001789636300021
Figure IDA00001789636300031

Claims (69)

1.多种纳米缀合物，每种纳米缀合物具有限定的结构并且包含在单层中的多种交联生物分子、提供在其上装配所述结构的模板的表面，其中在限定所述结构后，所述表面任选地至少部分被去除。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述表面是纳米粒子。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述纳米粒子选自球形、棒形和三棱形。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的组合物，其中所述纳米粒子是金属的。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述纳米粒子是胶态金属。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述纳米粒子选自金纳米粒子、银纳米粒子、铂纳米粒子、铝纳米粒子、钯纳米粒子、铜纳米粒子、钴纳米粒子、铟纳米粒子和镍纳米粒子。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中在所述多种生物分子中每种生物分子均相同。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中在所述多种生物分子中至少两种所述生物分子不同。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述生物分子选自多核苷酸、肽、多肽、磷脂、寡糖、小分子、治疗剂、对比剂及其组合。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述多种生物分子是单分散的。
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述单分散性使得所述多种纳米缀合物的直径有约25%的变化。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述单分散性使得所述多种纳米缀合物的直径有约10%的变化。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述单分散性使得所述多种纳米缀合物的直径有约1%的变化。
14.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述表面上的交联生物分子的密度对于所述生物分子之间的协同作用是足够的。
15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述表面上的交联生物分子的密度是约2pmol/cm2。
16.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述表面上的交联生物分子的密度是约100pmol/cm2。
17.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述多种纳米缀合物还包含另外的试剂。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述另外的试剂选自多核苷酸、肽、多肽、磷脂、寡糖、金属络合物、小分子、治疗剂、对比剂及其组合。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的组合物，其中所述另外的试剂与所述多种生物分子的至少一种生物分子缔合。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述另外的试剂通过杂交与所述多种生物分子的至少一种生物分子缔合。
21.根据权利要求19所述的组合物，其中所述另外的试剂与所述多种生物分子的至少一种生物分子共价缔合。
22.根据权利要求19所述的组合物，其中所述另外的试剂与所述多种生物分子的至少一种生物分子非共价缔合。
23.根据权利要求19所述的组合物，其中所述另外的试剂被包埋在所述多种纳米缀合物的至少一种的所述交联生物分子中。
24.根据前述权利要求任中一项所述的组合物，其中在缺少所述表面时，所述多种纳米缀合物中至少一种纳米缀合物是中空的。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中在缺少所述表面时，所述多种纳米缀合物中大部分所述纳米缀合物是中空的。
26.根据权利要求24所述的组合物，其中在缺少所述表面时，所述多种纳米缀合物中基本上所有所述纳米缀合物是中空的。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的组合物，其中所述另外的试剂被封装在所述纳米缀合物中，或所述纳米缀合物是中空的。
28.一种交联有结构的纳米缀合物的方法，所述方法包括通过使第一生物分子接触表面来活化所述第一生物分子的步骤，所述活化使得所述第一生物分子交联第二生物分子。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述表面提供所述结构在其上装配的模板。
30.根据权利要求28或权利要求29所述的方法，其中所述表面是纳米粒子。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述纳米粒子选自球形、棒形和三棱形。
32.根据权利要求30或权利要求31所述的方法，所述纳米粒子是金属的。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述纳米粒子是胶态金属。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述纳米粒子选自金纳米粒子、银纳米粒子、铂纳米粒子、铝纳米粒子、钯纳米粒子、铜纳米粒子、钴纳米粒子、铟纳米粒子和镍纳米粒子。
35.根据权利要求28至34中任一项所述的方法，其中在所述交联后所述表面被至少部分地去除。
36.根据权利要求28至35中任一项所述的方法，其中所述第一生物分子和所述第二生物分子选自多核苷酸、肽、多肽、磷脂、寡糖、小分子、治疗剂、对比剂及其组合。
37.根据权利要求28至36中任一项所述的方法，其中所述第一生物分子和所述第二生物分子包含至少1个炔烃部分。
38.根据权利要求28至37中任一项所述的方法，其中所述第一生物分子和所述第二生物分子各包含约10个炔烃部分。
39.根据权利要求37或权利要求38所述的方法，其中所述炔烃部分在与所述表面接触后被活化。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述活化使得所述炔烃易受亲核试剂影响。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述亲核试剂选自水、醇、胺、硫醇、酯、硫酯、尿素、酰胺、醛、碳酸酯、氨基甲酸酯、分子内羟基、甲醚基、苄醚基、羧酸、酮、亚胺、酚、2-吡咯烷酮、吲哚、乙酸、β-酮酯及其组合。
42.根据权利要求39至41中任一项所述的方法，其中活化导致所述第一生物分子与所述第二生物分子交联。
43.根据权利要求28至42中任一项所述的方法，其中所述第一生物分子是多核苷酸。
44.根据权利要求28至42中任一项所述的方法，其中所述第二生物分子是多核苷酸。
45.根据权利要求43或权利要求44所述的方法，其中所述多核苷酸是DNA多核苷酸或RNA多核苷酸。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述多核苷酸长度为约5至约100个核苷酸、长度为约5至约90个核苷酸、长度为约5至约80个核苷酸、长度为约5至约70个核苷酸、长度为约5至约60个核苷酸、长度为约5至约50个核苷酸、长度为约5至约45个核苷酸、长度为约5至约40个核苷酸、长度为约5至约35个核苷酸、长度为约5至约30个核苷酸、长度为约5至约25个核苷酸、长度为约5至约20个核苷酸、长度为约5至约15个核苷酸或者长度为约5至约10个核苷酸。
47.根据权利要求17至46中任一项所述的方法，其中在所述活化步骤过程中，将所述另外的试剂加入到所述第一生物分子和所述第二生物分子。
48.根据权利要求17至46中任一项所述的方法，其中在形成所述纳米缀合物之后但在至少部分去除所述表面之前，将所述另外的试剂加入到所述纳米缀合物。
49.根据权利要求17至46中任一项所述的方法，其中在形成所述纳米缀合物之后并且在至少部分去除所述表面之后，将所述另外的试剂加入到所述纳米缀合物。
50.一种包含包括表面的多价纳米缀合物的组合物，所述纳米缀合物还包含多个多核苷酸，其中所述多个多核苷酸中的每个的间隔端被修饰使得所述多个多核苷酸与化学品的接触使所述多个多核苷酸交联，其中在所述交联后所述表面任选地至少部分被去除。
51.根据权利要求50所述的组合物，其中所述修饰选自胺、酰胺、醇、酯、醛、酮、硫醇、二硫化物、羧酸、酚、咪唑、肼、腙、叠氮化物和炔烃。
52.根据权利要求51所述的组合物，其中所述修饰是胺-修饰的核苷酸。
53.根据权利要求52所述的组合物，其中所述胺-修饰的亚磷酰胺核苷酸是胺-修饰的胸苷亚磷酰胺(TN)。
54.根据权利要求50至53中任一项所述的组合物，其中所述化学品选自双琥珀酰亚胺戊二酸酯、双琥珀酰亚胺辛二酸酯、双[硫代琥珀酰亚胺基]辛二酸酯、三-琥珀酰亚胺基氨基三乙酸酯、琥珀酰亚胺基4-肼基烟酸盐丙酮腙、琥珀酰亚胺基4-酰肼基对苯二甲酸酯盐酸盐、琥珀酰亚胺基4-甲酰苯甲酸酯、二硫代双[琥珀酰亚胺基丙酸酯]、3,3′-二硫代双[硫代琥珀酰亚胺基丙酸酯]、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯、双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜、乙二醇双[琥珀酰亚胺基琥珀酸酯]、乙二醇双[硫代琥珀酰亚胺基琥珀酸酯]、二亚胺代己二酸二甲酯·2HCl、庚二亚氨酸二甲酯·2HCl、辛二亚氨酸二甲酯·2HCl、1,5-二氟-2,4-二硝基苯、β-[三(羟甲基)膦基]丙酸、双-马来酰亚胺基乙烷、1,4-双马来酰亚胺基丁烷、双马来酰亚胺基己烷、三[2-马来酰亚胺乙基]胺、1,8-双-马来酰亚胺-二乙二醇、1,11-双-马来酰亚胺-三乙二醇、1,4双马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷、二硫代-双马来酰亚胺基乙烷、1,4-二-[3′-(2′-吡啶基二硫代)-丙酰氨基]丁烷、1,6-己烷-双-乙烯基砜、双-[b-(4-叠氮基水杨酰氨基)乙基]二硫化物、N-(a-马来酰亚胺乙酰氧基)琥珀酰亚胺酯、N-[β-马来酰亚胺丙基氧基]琥珀酰亚胺酯、N-[g-马来酰亚胺丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯、N-[g-马来酰亚胺丁酰氧基]硫代琥珀酰亚胺酯、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯、硫代琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯、N-e-马来酰亚胺己酰氧基]琥珀酰亚胺酯、N-e-马来酰亚胺己酰氧基]硫代琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基4-[对马来酰亚胺苯基]丁酸酯、硫代琥珀酰亚胺基4-[对马来酰亚胺苯基]丁酸酯、琥珀酰亚胺基-6-[β-马来酰亚胺丙酰氨基]己酸酯、琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧基-[6-酰氨己酸酯]、N-[k-马来酰亚胺十一酰氧基]硫代琥珀酰亚胺酯、N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯、琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰氨基)己酸酯、4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-甲基-a-[2-吡啶基二硫代]甲苯、4-硫代琥珀酰亚胺基-6-甲基-a-(2-吡啶基二硫代)甲苯酰氨]己酸酯、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯、琥珀酰亚胺基3-[溴乙酸酯]丙酸酯、N-琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯、N-硫代琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸、N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰基氧基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯、硫代琥珀酰亚胺基[4-叠氮基水杨酰氨基]-己酸酯、N-琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯、N-硫代琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯、硫代琥珀酰亚胺基-(全氟代叠氮苯甲酰氨基)-乙基-1,3'-二硫代丙酸酯、硫代琥珀酰亚胺基-2-(m-叠氮基-o-硝基苯甲酰氨基)-乙基-1,3'-丙酸酯、硫代琥珀酰亚胺基2-[7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酰氨基]乙基-1,3′二硫代丙酸酯、琥珀酰亚胺基4,4'-叠氮戊酸酯、琥珀酰亚胺基6-(4,4'-叠氮戊酰氨)己酸酯、琥珀酰亚胺基2-([4,4'-叠氮戊酰氨]乙基)-1,3'-二硫代丙酸酯、硫代琥珀酰亚胺基4,4'-叠氮戊酸酯、硫代琥珀酰亚胺基6-(4,4'-叠氮戊酰氨)己酸酯、硫代琥珀酰亚胺基2-([4,4'-叠氮戊酰氨]乙基)-1,3'-二硫代丙酸酯、二环己基碳化二亚胺、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸盐、N-[4-(p-叠氮基水杨酰氨基)丁基]-3′-(2′-吡啶基二硫代)丙酰胺、N-[β-马来酰亚胺丙酸]酰肼、三氟乙酸盐、[N-e-马来酰亚胺己酸]酰肼、三氟乙酸盐、4-(4-N-马来酰亚胺苯基)丁酸酰肼盐酸盐、N-[k-马来酰亚胺十一烷酸]酰肼、3-(2-吡啶基二硫代)丙酰肼、p-叠氮基苯甲酰肼、N-[p-马来酰亚胺苯基]异氰酸酯以及琥珀酰亚胺基-[4-(补骨脂素-8-基氧基)]-丁酸酯。
55.根据权利要求50至54中任一项所述的组合物，其中所述表面包括纳米粒子。
56.根据权利要求55所述的组合物，其中所述纳米粒子选自球形、棒形和三棱形。
57.根据权利要求55或权利要求56所述的组合物，其中所述纳米粒子是金属的。
58.根据权利要求57所述的组合物，其中所述纳米粒子是胶态金属。
59.根据权利要求58所述的组合物，其中所述纳米粒子选自金纳米粒子、银纳米粒子、铂纳米粒子、铝纳米粒子、钯纳米粒子、铜纳米粒子、钴纳米粒子、铟纳米粒子和镍纳米粒子。
60.根据权利要求50至59中任一项所述的组合物，其中所述多种多核苷酸包括DNA多核苷酸、RNA多核苷酸或其组合。
61.根据权利要求60所述的组合物，其中所述多核苷酸长度为约5至约100个核苷酸、长度为约5至约90个核苷酸、长度为约5至约80个核苷酸、长度为约5至约70个核苷酸、长度为约5至约60个核苷酸、长度为约5至约50个核苷酸、长度为约5至约45个核苷酸、长度为约5至约40个核苷酸、长度为约5至约35个核苷酸、长度为约5至约30个核苷酸、长度为约5至约25个核苷酸、长度为约5至约20个核苷酸、长度为约5至约15个核苷酸或长度为约5至约10个核苷酸。
62.一种使用根据权利要求28所述的方法来制备根据权利要求1所述的纳米缀合物的方法。
63.一种检测靶分子的方法，所述方法包括使所述靶分子接触根据权利要求1至28或权利要求50至61中任一项所述的组合物，其中所述靶分子与所述组合物之间的接触导致可检测的变化。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述检测是在体外。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述检测是在体内。
66.一种抑制由靶多核苷酸编码的基因产物的表达的方法，所述方法包括在足以抑制所述基因产物表达的条件下使所述靶多核苷酸接触根据权利要求1至28或权利要求50至61中任一项所述的组合物。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述基因产物的表达在体内被抑制。
68.根据权利要求66所述的方法，其中所述基因产物的表达在体外被抑制。
69.根据权利要求66至68中任一项所述的方法，其中所述基因产物的表达被抑制至少约5%。
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