CN102711978A - 多孔聚合物整料、其制备方法及其用途 - Google Patents

多孔聚合物整料、其制备方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明一般性地涉及多孔聚合物整料。本发明还涉及多孔聚合物整料的制备方法、由多孔聚合物整料形成的存储介质，及其用于干燥和存储包括血液和血浆样品的体液的用途。

Description

多孔聚合物整料、其制备方法及其用途
技术领域
本发明一般性地涉及多孔聚合物整料。本发明还涉及多孔聚合物整料的制备方法、由多孔聚合物整料形成的存储介质、及其用于干燥和存储包括血液和血浆样品的体液的用途。
背景技术
已知为干血斑(dried blood spotting，DBS)的采样技术由微生物学家罗伯特·格思里在1963年开发。样品采集过程简单，涉及从脚跟或手指的小切口采集非常少量的血液。然后将一滴血直接施加于采样纸并干燥以供将来的分析物提取。DBS采样现在对于新生儿的代谢紊乱的定量和定性筛查是一种通常和一贯的做法(Edelbroek，P.M.，J.van der Heijden，和L.M.L.Stolk，Dried Blood Spot Methods in Therapeutic Drug Monitoring：Methods，Assays，and Pitfalls.Therapeutic Drug Monitoring，2009.31(3)：第327-336页)。
常规采样技术采用血浆或血清作为用于分析的首选生物基体。这些技术需要直接从测试对象的静脉采集大量的血液。相反，DBS采样需要相当少的样品量(数微升，而不是数毫升)，这允许在难以以传统方式采集样品的情况下采集样品，并且DBS采样现在常规应用于流行病学研究，例如已成功实施用于测定许多生物学标记，如氨基酸(Corso，G等，RapidCommunications in Mass Spectrometry，2007.21(23)：第3777-3784页)和微量元素(Hambidge，M.，Journal of Nutrition，2003.133(3)：第9485-9555页)。
DBS方法特别适合分析感染物，如艾滋病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)，因为减少的样品量使感染的风险最小化并且血液一旦被干燥就不再被认为是生物有害的，这大大简化了样品的存储和运输(Allanson，A.L.等，Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2007，44(4)：第963-969页)。无需专门的存储要求，样品即可被容易而成本有效地在世界各地运输。该技术提供的进一步优点在于，对于样品处理或存储无需如离心机和冷藏柜等设备。
DBS技术也被应用于药代动力学分析，例如，用于固相提取(SPE)以分析血液中的组分。
目前DBS方法(其包括在将来的提取和分析前对血液和血浆样品的干燥和存储)中使用的介质包括纸基纤维素材料。例如，已开发改性纸基材料用于简化核酸的分离；其中使用一些化合物对所述纸进行化学处理以促进DNA的长期存储。然而，纸基纤维素材料并不特别适合于加速干燥过程，特别是对于血浆，并且不适合引入特定的功能，以便从血液中提取选择性组分。
因此需要鉴别出提供这样性能的替代材料，该性能促进生物体液如血液和血浆样品的干燥和存储以供将来的提取和分析；或允许特定功能被引入到存储介质中。
发明内容
在第一个方面，本发明提供一种多孔聚合物整料作为体液的干燥和存储介质的用途。
在第二个方面，本发明提供一种存储体液以供将来的分析的方法，该方法包括将体液样品施加到多孔聚合物整料介质上并干燥所述体液使得所述样品至少部分地凝固并吸附或附着在所述多孔聚合物整料介质上。
在第三个方面，本发明提供一种存储体液以供将来的分析的方法，该方法包括：
将一个或更多个体液样品施加到多孔聚合物整料介质的一个或更多个区域上；
部分干燥施加到所述介质上的所述一个或更多个样品；
使所述多孔聚合物整料介质的其上施加有样品的任一个或更多个区域与其上未施加样品的区域相分离；
进一步干燥施加到所述介质的所述一个或更多个区域上的所述一个或更多个样品；以及
存储施加到所述介质的所述一个或更多个区域上的所述一个或更多个样品。
在一个实施方案中，使所述多孔聚合物整料介质的其上施加有样品的任一个或更多个区域与其上未施加样品的区域相分离可包括从所述样品周围大体上除去任何其上未施加体液的介质，例如修剪或切除位于或接近所述样品的周边的介质。可从所述样品周围修剪或切除所述介质使得所述样品大体上覆盖其上施加有所述样品的所述区域的表面。
该方法可还包括从施加到所述介质的存储的样品鉴定和检测分析物。在一个实施方案中，可不进行预处理和/或从所述多孔聚合物整料介质上移除而对存储的体液样品进行分析。在另一个实施方案中，该方法可包括在分析其样品之前对存储在所述多孔聚合物整料上的样品进行预处理。
在一个实施方案中，通过施加升高的温度、强制对流或减压中的至少一者来强化体液(如血液或血浆)的干燥。升高的温度可在环境温度以上、存储介质或样品的完整性受到损害的温度以下的温度范围内。在特定的实施方案中，升高的温度在30至150℃、40至120℃、更特别在约60至100℃、或在30℃以上、50℃以上、70℃以上、90℃以上、110℃以上或130℃以上的范围内。在特定的实施方案中，升高的温度为高于约90℃。在另一个特定的实施方案中，减压是在5至760毫米汞柱的范围内。
在第四个方面，本发明提供涉及从吸附或附着在多孔聚合物整料介质上的存储的体液样品鉴定和检测分析物的分析方法。
在一个实施方案中，不进行预处理和/或从所述多孔聚合物整料介质上移除而对存储的体液样品进行分析。分析通常是对于分析物。分析物可包括存在于血液或血浆样品中的小分子和低分子量的化合物，例如药剂，包括新化学实体(new chemical entity，NCE)及其任何代谢物、多肽、蛋白质、寡核苷酸、低聚糖、脂类或其他不稳定化合物。在另一个实施方案中，分析涉及对至少两种分析物的同时分析。在特定的实施方案中，所述至少两种分析物包括NCE及其代谢物。
在第五个方面，本发明提供一种体液存储介质，该介质包括具有一体化本体的多孔聚合物整料，其孔尺寸和/或比表面积调节为便于体液的干燥和存储。
根据上述实施方案的多孔聚合物整料或其介质能够接受液态形式的体液，随后被干燥以便于体液的存储、运输和/或将来的分析。在特定的实施方案中，所述多孔聚合物整料或其介质调节为存储血液和/或血浆。
在一个实施方案中，多孔聚合物整料的孔尺寸在5至10000纳米、50至5000纳米、100至2000纳米、200至1000纳米的范围内。较小的孔尺寸关联到更高的表面积，更高的表面积便于体液(如血液和血浆)吸附。在另一个实施方案中，当使用BET等温线通过氮吸附法测定时，多孔聚合物基体的比表面积在0.5至1000m2/g、1至500m2/g、5至200m2/g、10至100m2/g、20至60m2/g、30-50m2/g的范围内。
在另一个实施方案中，多孔聚合物整料包括多乙烯基单体和单乙烯基单体的共聚物。多孔聚合物整料可由一种或更多种丙烯酸单体形成，这些丙烯酸单体任选地被官能化，例如使用选自磺酰基、膦酰基、羧基、氨基和硝基的基团。在特定的实施方案中，丙烯酸单体是任选地官能化的甲基丙烯酸酯。任选地官能化的甲基丙烯酸酯可选自甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸或其组合的至少一种。
在另一个实施方案中，可在多孔聚合物整料中引入功能用于原位排除血液中阻碍检测其他特定组分(例如，分析物如药剂或新化学实体(NCE))的不利组分。在一个特定的实施方案中，多孔聚合物整料至少表面被改性，以提供离子交换性能，以便于存在于样品中的任何分析物在存储后的分析。在另一个特定的实施方案中，可对多孔聚合物整料的表面区域提供离子交换性能，以便存在于体液中的选定的药剂附着于其上或选定的污染物不附着于其上。因此，多孔聚合物整料可用于分析干燥于其上的体液而不需要基于化学品的预处理。在另一个特定的实施方案中，可通过存在于由其形成所述多孔聚合物基体的单体上的官能团、和/或包括共聚接枝或其他化学改性的聚合后的表面改性提供离子交换性能。
在另一个实施方案中，体液存储介质由聚合混合物获得，所述聚合混合物包含约10-40体积％的单乙烯基单体、10至40体积％的多乙烯基单体、约20-80体积％的致孔剂和约1体积％的引发剂。
体液存储介质也可包括多孔聚合物整料和至少柔性的聚合物层，例如柔性的聚合物背衬层。
在第六个方面，本发明提供用于制备体液存储介质的方法，通过在引发剂和致孔剂的存在下使包含至少一种多乙烯基单体的聚合混合物聚合。在一个实施方案中，聚合混合物还包含单乙烯基单体。
在第七个方面，本发明提供一种用于存储并随后分析包含遗传物质的体液样品的方法，该方法包括：
将包含一种或更多种分析物的体液样品施加到多孔聚合物整料上，所述多孔聚合物整料根据以上所述的实施方案中的任一者限定；
干燥施加到所述多孔聚合物整料上的所述样品；
存储所述样品；
回收所述样品；
任选地预处理所述样品；以及
针对所述一种或更多种分析物分析所述样品。
在以上的实施方案或方面中任一者的进一步的实施方案中，所述多孔聚合物整料用于全血的存储或干血斑(DBS)。
在以上的实施方案或方面中任一者的进一步的实施方案中，所述多孔聚合物整料用于血浆的存储或干血浆斑(dried blood plasma spotting，DPS)。
附图说明
现在将参考附图并仅通过实例进一步描述和说明本发明的优选实施方案，其中：
图1a和1b示出用作DBS和DPS的吸附剂的聚(HEMA-co-EDMA)整料的SEM图像，块整料的放大倍率为20000倍(图1a)，载玻片的放大倍率为3000倍(图1b)；
图2是示出在环境温度和升高的温度下干燥的样品回收率之间的相似性的图；
图3a-3d示出聚(EDMA-co-MAA)(图3a)、聚(HEMA-co-EDMA-co-SPMA)(图3b)、聚(GMA-co-DEDMA)(图3c)和聚(HEMA-co-EDMA)(图3d)的SEM图像，其中图3a-3c的放大倍率为4000倍，图3d的放大倍率为6000倍；
图4提供示出在结合步骤中洗脱的分析物、甲醇洗液和洗脱缓冲剂的任意MS响应，分别为WCX吸附剂(上)、MSCX(中)和SCX(底部)的MS响应；
图5示出用于SCX吸附剂的洗脱缓冲剂，依次为5％的甲酸水溶液、甲醇和两个5％氢氧化铵洗脱缓冲剂的图像；
图6a-6c提供示出双空白和空白基体样品的LC-MS/MS色谱的图；
图7a-7c提供示出血液中的LLOQ、最高校准图和IS峰(从上到下)的LC-MS/MS色谱的图。缩写的详细说明
在实例中，将引用以下缩写：
AFM    原子力显微镜
APP    应用
C      摄氏度
Cl     级
[]     浓度
EMAA   聚乙烯甲基丙烯酸
F      华氏度
FTIR   傅立叶变换红外
h      小时
Mn     数均分子量
Mw     重均分子量
MW     分子量
RH     相对湿度
SEM    扫描电子显微镜
SENB   单边缺口棒
TDCB   锥形双悬臂梁
TETA   三乙基四胺
Wt％   组合物中具体组分的重量百分率
XPS    X射线光电子能谱
DEGDMA 二甲基丙烯酸二乙二醇酯
DMPAP  2，2-二甲氧基-2-苯基-苯乙酮
EDMA   二甲基丙烯酸乙二醇酯
GMA        甲基丙烯酸缩水甘油酯
HEMA       甲基丙烯酸2-羟乙酯
MAA        甲基丙烯酸
γ-MAPS    甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯
META       甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵
SPMA       甲基丙烯酸3-磺丙酯
UK258300   参考化合物
UK280111   参考化合物
具体实施方式
在鉴别出提供这样性能的替代材料的尝试中，该性能促进生物体液如血液和血浆样品的干燥和存储以供将来的提取和分析；或鉴别出允许特定功能被引入到存储介质中的材料的尝试中，现在已发现，可由多孔聚合物整料形成体液存储介质。本发明的非限定性的特别实施方案如下所述。
本发明一般性地涉及多孔聚合物整料作为用于干燥和存储体液特别是血液和血浆的介质的用途。因此，本申请中所描述的多孔聚合物整料可提供一种用于DBS方法的适当的介质，作为目前正在使用的纸基纤维素材料的替代方案。在特定的实施方案中，多孔聚合物整料提供一种的改进介质，其用于存储生物物质以供之后的分析检验，如存储血液或血浆样品以供将来对分析物的鉴定和检测，所述分析物包括小分子如药剂及相关代谢物、和低分子量的化合物如蛋白质和核苷酸。多孔聚合物整料具有优异的性能，已证实其使得能够高效地干燥并长期地存储体液样品，包括血液和血浆。
采用所述多孔聚合物整料作为DBS吸附剂的另一个优点是，这些材料允许对材料的形态和表面化学的一定程度的控制。
术语
“多孔聚合物整料”一般是指连续的多孔聚合物基体，其包括具有特定孔尺寸范围的一体化本体。聚合物基体调节为便于体液特别是血液和血浆的吸附或附着。
“体液”是指可取自有机体作为样品的任何流体，其可含有可检测的分析物，例如，取自人或动物对象的血液或血浆。
“分析物”包括但不限于可在体液中检测的小分子和低分子量化合物，如存在于得自人或动物对象的血液或血浆样品中的药剂。例如，“分析物”可包括药剂，包括NCEs、多肽、蛋白质、寡核苷酸、低聚糖、脂类或其他不稳定化合物。
术语“多孔聚合物整料介质”、“体液存储介质”、“存储介质”或类似术语一般是指包含多孔聚合物整料的介质，其包括多孔聚合物整料本身或进一步与支持材料或基体相连。
“支持材料”、“支持基体”或类似术语是背衬层或结构，其可通过附着、可拆卸的附着或非附着而与聚合物整料相连，例如，聚合物整料可在支持材料上聚合或可仅搁置在支持材料上，其中具有或不具有其他间隔层，所述间隔层也可通过附着、可拆卸的附着或非附着方式与聚合物整料和支持材料相连。支持材料或基体可为柔性的、半刚性或刚性的，并可为任何需要的形式，如膜，并可由任何适当的材料形成，包括玻璃、聚合物、金属，陶瓷、或其组合。
术语“烷基”是指任何饱和或不饱和、支化或非支化、环化、或其组合，通常具有1-10个碳原子，其包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、环戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、环己基，其任选地被甲基取代。
术语“亚烷基”是指任何支化或非支化、环化、或其组合，通常具有1-10个碳原子，其包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、环戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、环己基，其任选地被甲基取代。
术语“聚合物”包括共聚物，术语“单体”包括共聚单体。
术语“致孔剂”、“致孔溶剂”或类似术语指能够在聚合物基体的聚合过程中在聚合物基体中形成孔的溶剂，包括但不限于脂肪烃、芳香烃、酯、酰胺、醇、酮、醚、水溶性聚合物及其混合物。
术语“引发剂”是指能够通过热引发、光引发或氧化还原引发聚合的任何自由基发生剂。
多孔聚合物整料
多孔聚合物整料通常是可作为固定的支持体的高度交联结构。聚合物整料的内部结构由微球(microglobule)的融合阵列构成，所述微球由孔分隔并且其结构刚度由大量的交联确保。聚合物整料可由含有溶解于成孔溶剂(已知为致孔剂)的引发剂和单体(包括交联单体)的混合物制造。整料的形成由通过外部源(如光引发)产生自由基而引起的引发剂的分解触发，其包括聚合物链的形成，所述聚合物链从聚合混合物中沉淀出，最终凝聚在一起形成连续的固体结构。可通过许多变量控制整料的形态：所采用的交联单体(一种或更多种)、致孔溶剂(致孔剂)的组成和百分率、自由基引发剂的浓度和引发聚合所使用的方法。
由于聚合物整料通常是连续的刚性结构，所以它们可容易地以一定范围的形式、形状或尺寸原位制造。整料已通常在用于多种色谱应用的色谱柱或毛细管柱的范围之内制造。但是，如果有适当的模具，也可将整料制造为平片的形式。平型整料片提供特别适合存储全血的介质，其允许血液样品的存储和运输的便利性。
将聚合物整料用于DBS的进一步的优点在于能够同时控制孔性质和具体的表面化学的能力。向整料表面引入特定功能的能力允许分析物(例如药剂或新化学实体(NCE))的特定提取、以及促进可能降低将来的分析效果的基体的移除。将来的分析可包括固相提取(SPE)，其基于分析物在合适的介质上的物理吸附，从而获得最大的分析物回收，介质应具有大的比表面积。介质的孔性质也可用于在一定程度上控制特定的表面化学性如表面积，因此介质的离子交换容量依赖于孔性质。分析物的检测和鉴定可包括存在于血液或血浆样品中的小分子和低分子量化合物，例如，药剂包括NCEs、多肽、蛋白质、寡核苷酸、低聚糖、脂类或其他不稳定化合物。
在一个实施方案中，多孔聚合物整料是大孔结构，其具有约45至85％、特别是约60％和75％之间的百分孔隙率。
在一个实施方案中，多孔聚合物整料的孔尺寸可在5至10000纳米、50至5000纳米、100至2000纳米、200至1000纳米的范围内。较小的孔尺寸关联到更高的表面积，更高的表面积便于体液(如血液和血浆)吸附。在另一个实施方案中，当使用BET等温线通过氮吸附法测定(AtkinsP，Physical Chemistry，牛津大学出版社)时，多孔聚合物基体的比表面积在0.5至1000m2/g、1至500m2/g、5至200m2/g、10至100m2/g、20至60m2/g、30-50m2/g的范围内。
在一个实施方案中，多孔聚合物整料可由一种或更多种丙烯酸单体形成。丙烯酸单体任选地被C2-20碳链取代，所述碳链具有选自磺酰基、膦酰基、羧基、氨基和硝基的一个或更多个官能团。在特定的实施方案中，丙烯酸单体是甲基丙烯酸酯，更特别的是选自甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸或其组合的至少一种。
在另一个实施方案中，多孔聚合物整料可包括交联的多乙烯基单体、或多乙烯基单体和单乙烯基单体的共聚物。
在一个实施方案中，可通过在引发剂和致孔剂的存在下使包含至少一种多乙烯基单体的聚合混合物聚合制备多孔聚合物整料。在特定的实施方案中，聚合混合物还包含单乙烯基单体。聚合混合物可被设置于基体支持体上并可在其上引发聚合，从而形成多孔聚合物整料，然后可用适当的溶剂对其洗涤以除去致孔剂。也可制备聚合混合物并先聚合，然后将其设置于基体支持体上。
聚合混合物可包含约10至60体积％、尤其是从约15至40体积％的多乙烯基单体、约45-85体积％的致孔剂和约1体积％的引发剂。在一个实施方案中，聚合混合物可包含约10-40体积％的单乙烯基单体、10至40体积％的多乙烯基单体、约20-80体积％的致孔剂和约1体积％的引发剂。各单体、交联剂和致孔剂的范围可根据使用目的而改变。
多乙烯基单体可包括选自以下中的一种或更多种单体：亚烷基二丙烯酸酯、亚烷基二丙烯酰胺、亚烷基二甲基丙烯酸酯、亚烷基二丙烯酰胺、亚烷基二甲基丙烯酰胺、羟基亚烷基二丙烯酸酯，其中上述各亚烷基单体中的亚烷基均包括1-10碳原子；低聚乙二醇二丙烯酸酯、低聚二甲基丙烯酸乙二醇酯、多元羧酸的乙烯基酯、二乙烯基苯、二乙烯基萘、季戊四醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇三甲基丙烯酸酯或季戊四醇四甲基丙烯酸酯、季戊四醇二丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和三羟甲基丙烷丙烯酸酯。在特定的实施方案中，多乙烯基单体可选自二甲基丙烯酸乙二醇酯和/或二乙烯基苯。在另一个特定的实施方案中，多乙烯基单体是亚甲二醇二甲基丙烯酸。
在一个实施方案中，单乙烯基单体包括但不限于苯乙烯、乙烯基萘、乙烯基蒽及其环取代衍生物，其中取代基包括氯甲基、具有最多18个碳原子的烷基、羟基、叔丁氧羰基、卤素、硝基、被保护的羟基或氨基。其他用于形成整料基体的单体包括但不限于丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺及其衍生物，其中的氮原子上取代有一个或两个C1-5烷基、C1-4烷基氨基烷基或二烷基氨基烷基、C1-4甲氧基氨基烷基、C1-4二甲氧基或二乙氧基氨基烷基、C1-4甲氧基烷基、四氢吡喃基、和四氢糠基、N-丙烯酰基哌啶和N-丙烯酰基吡咯烷酮、及其混合物。
在另一实施方案，单乙烯基单体也可选自以下物质：丙烯酸和甲基丙烯酸酯、丙烯酸烷基酯、甲基丙烯酸烷基酯、丙烯酸全氟烷基酯、甲基丙烯酸全氟烷基酯、丙烯酸羟基烷基酯、甲基丙烯酸羟基烷基酯，其中各上述烷基均包括1-10碳原子；丙烯酸磺基烷基酯、甲基丙烯酸磺基烷基酯、低聚氧化乙烯丙烯酸酯、低聚氧化乙烯甲基丙烯酸酯、以及丙烯酸酯和甲基丙烯酸甲酯衍生物，包括伯、仲、叔、季胺、环氧和两性官能、以及醋酸乙烯酯、乙烯基吡咯烷酮、乙烯基吖内酯。
在特定的实施方案中，单乙烯基单体可选自以下物质：甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸苄酯和苯乙烯。在另一个特定的实施方案中，单乙烯基单体可选自甲基丙烯酸羟乙酯和/或甲基丙烯酸。
用于形成多孔聚合物整料的合适的聚合物的例子包括聚(HEMA-co-EDMA)、聚(EDMA-co-MAA)、聚(HEMA-co-EDMA-co-SPMA)、聚(GMA-co-DEGDMA)。
平型整料片可例如通过将整料薄片通过赋予玻璃表面甲基丙烯酰官能固着在刚性玻璃板上而成功地制造。甲基丙烯酰官能参与聚合过程，导致整料在聚合过程中共价附着在载玻片上。多孔聚合物整料也可与其他支持材料相连，例如附着在柔性的半刚性或刚性聚合物膜上。
在一个实施方案中，多孔聚合物整料与支持材料或层相连。这种相连可通过附着、可拆卸的附着或非附着实现。在另一实施方案中，支持材料或层是柔性的。支撑材料可为背衬层。在另一实施方案中，支持材料或层包括聚合物材料，例如热塑性材料如柔性聚合物层，其可包括聚烯烃，例如选自或由聚乙烯、聚丙烯或环烯烃共聚物基材料形成的聚烯烃。聚烯烃聚合物可提供优于其他材料如玻璃的化学惰性。
在一个实施方案中，多孔聚合物整料或其介质为厚度最多约1mm、特别是厚度约300至600μm、更特别是厚度约500μm的片或膜。整料或整料介质的其他形式和厚度可拟定，并可根据具体的用途(例如能拟定在存储后进行的分析的类型)形成。
优选的聚合物整料基于丙烯酸酯/甲基丙烯酸酯和苯乙烯单体，它们提供适合从复杂的基体中提取分析物的性质。优选的聚合物整料含有甲基丙烯酸酯部分，因为这提供更高程度的柔性。此外，脂肪族甲基丙烯酰单体是紫外线透明的，因此可实施光引发聚合以制备吸附剂。
其他的优选聚合物包括沿聚合物的骨架引入官能团的聚合物，以便进一步改性或与血液或血浆相互作用。例如，多孔聚合物整料片可构造为能够在其上提供多个血斑样品，并任选地构造为便于从每个血斑样品周围移除多余的整料。
光引发聚合是合成整料的有吸引力的方法，因为它非常迅速；材料可在不到一小时内制造。在较大规模的商业化生产中，聚合和制造方法通常是连续的，并可有较短的停留时间，如在数秒钟或数分钟的数量级。此外，该方法提供了空间控制，使得能够在具体限定的空间内形成聚合整料。该机理涉及引发剂的光激发以产生自由基，其启动聚合物链的形成。聚合物链从溶液中沉淀出并最终凝聚在一起形成高度交联的聚合物整料结构。致孔剂(致孔溶剂)本质上是一种混合物，其对聚合物是一种非溶剂，其中聚合物沉淀出，在整料的聚合物基体中留下孔。
通过光引发的制备的聚合物整料的孔性质可通过一些变量控制，包括曝光时间和灯光强度。以及其他可控变量包括交联剂的百分率、引发剂和组分的浓度和致孔溶剂的百分率。改变致孔剂仅影响材料的多孔结构而改变其他参数则改变材料的组成和刚性。提高非溶剂致孔剂的浓度导致在聚合过程中沉淀早，这通常导致材料具有较大的孔尺寸。因此，选择致孔溶剂和它们的相对组成以设计具有所需的孔结构的材料。
通过改变或调整致孔溶剂混合物与共致孔剂(如环己醇、丙醇、水、或丁二醇)的百分率，致孔溶剂的组成和百分率可用于控制孔性质。这影响所产生的整料的中孔尺寸和孔体积两者。通过简单调整致孔溶剂的组成，可很容易地实现大范围的孔尺寸。
在一个实施方案中，用于制备多孔聚合物整料的致孔剂可选自各种不同类型的材料。例如，适当的液体致孔剂包括脂肪烃、芳香烃、酯、酰胺、醇、酮、醚、可溶性聚合物的溶液及其混合物。致孔剂一般以约40至90体积％、更优选约50至80体积％的量存在于聚合混合物中。在特定的实施方案中，致孔剂或致孔溶剂包括十二醇、环己醇、甲醇、己烷或其混合物。在优选的实施方案中，致孔剂是1-癸醇或环己醇。在另一个特定的实施方案中，致孔溶剂包括十二醇与环己醇的组合，其中十二醇至少为35％。
百分孔隙率是孔体积占整料基体总体积的百分率。本申请中使用的术语“孔体积”是指在1克整料中的孔的体积。在一个实施方案中，多孔聚合物整料是大孔结构，其具有约45至85％、特别是约60％和75％之间的百分孔隙率。在另一个实施方案中，多孔聚合物整料的孔尺寸可在5至10000纳米、50至5000纳米、100至2000纳米、200至1000纳米的范围内。较小的孔尺寸关联到更高的表面积，更高的表面积便于体液(如血液和血浆)吸附。在另一个实施方案中，当使用BET等温线通过氮吸附法测定(Atkins P，Physical Chemistry，牛津大学出版社)时，多孔聚合物基体的比表面积在0.5至1000m2/g、1至500m2/g、5至200m2/g、10至100m2/g、20至60m2/g、30-50m2/g的范围内。
聚合可通过自由基引发机理的各种方法进行，包括但不限于热引发、光引发、氧化还原引发。在一个实施方案中，约0.1-5重量％(相对于单体)的自由基或夺氢光引发剂可用于产生多孔聚合物整料基体。例如，1重量％(相对于单体)的夺氢光引发剂可用于引发聚合过程。夺氢光引发剂可包括二苯甲酮、2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPAP)、二甲氧基苯乙酮、氧杂蒽酮和硫杂蒽酮。如果所选的光引发剂的溶解性差，则可通过添加表面活性剂使引发剂在乳液中匀质化并具有较高的浓度来实现所需的引发剂浓度。
在另一个实施方案中，其中通过热引发进行聚合，热引发剂通常为过氧化物、过氧化氢、过氧-或偶氮化合物选自以下物质：过氧化苯甲酰、过氧焦硫酸钾、过氧焦硫酸铵、叔丁基过氧化氢、2，2′-偶氮二异丁腈(AIBN)、和偶氮二异氰基丁酸(azobisiocyanobutyric acid)，并通过将聚合混合物加热到30℃和120℃之间的温度进行热诱导聚合。
在另一个实施方案中，其中通过氧化还原引发剂引发聚合，氧化还原引发剂可选自过氧化苯甲酰-二甲基苯胺的混合物和过氧焦硫酸铵-N，N，N′，N′-四亚甲基-1，2-乙二胺。
将HEMA引入聚合物整料中增加表面的极性，从而增加润湿性。由于血液主要由水构成，所以在整料中引入极性单体有利于吸附血液。
改变致孔溶剂的种类和量，可提供对整料的孔尺寸分布的控制，这可通过压汞孔隙度测定法(mercury intrusion porosimetry，MIP)检验。HEMA是一种极性单体，增加极性较低的致孔剂如1-十二醇的浓度通常会提供孔较大的整料。
已发现，在十二醇和cyclotextarol的混合物中，增加十二醇的百分率至致孔溶剂38-100％之间会使孔尺寸分布保持在约600纳米。采用相同比率的甲醇和己烷二元致孔溶剂以在聚(HEMA-co-EDMA)整料中获得大孔。获得的孔尺寸分布为7087纳米。孔尺寸较小的整料的重现性更好，例如包含40％的十二醇和20％的环己醇的二元致孔溶剂的聚(HEMA-co-EDMA)整料，并被开发作为潜在的用于存储全血和血浆的吸附剂。
由于光散射，整料的视觉外观被认为是孔尺寸的可靠指标。研究的整料表现出白垩状，这表明为大孔材料(即，孔尺寸在约50纳米以上)。通过MIP分析证实了这一点，其中中孔尺寸测量为约600纳米，整料的孔隙度为68％。通过BET分析确定整料的比表面积。
SEM显微照片也允许直接肉眼观察材料的大孔结构。显微照片清楚地表明可实现的均匀的孔结构(图1)。使用未官能化的载玻片覆盖聚合混合物不会导致整料表面的任何严重损害。作为结构，获得了未官能化的载玻片的SEM图像(图2)。该图片清楚地表明，移除载玻片仅对整料表面造成轻微损坏。
多孔聚合物还可包括其他添加剂，如流变改性剂、填料、增韧剂、热或紫外线稳定剂、阻燃剂、润滑剂、表面活性剂。添加剂通常以占活化处理或溶剂(一种或更多种)、试剂(一种或更多种)和添加剂(一种或更多种)的组合的总重量的小于约10％的量存在。实例包括：
(a)流变改性剂，如羟丙基甲基纤维素(例如，Methocell 311，Dow)、改性尿素(例如，BYK 411、410)和多羟基羧酸酰胺(例如，BYK 405)；
(b)成膜剂，例如，二元羧酸的酯(例如，Lusolvan FBH，BASF)和二醇醚(例如，Dowanol，Dow)；
(c)润湿剂，如氟化学表面活性剂(例如，3M Fluorad)和聚醚改性的聚二甲基硅氧烷(例如，BYK 307、333)；
(d)表面活性剂，如脂肪酸衍生物(例如，Bermadol SPS 2543，Akzo)和季铵盐；
(e)分散剂，如基于伯醇的非离子表面活性剂(例如，Merpol 4481，Dupont)和烷基酚-甲醛-二硫化物缩合物(例如，Clariants 1494)；
(f)消泡剂；
(g)防腐剂，如磷酸酯(例如，ADD APT、Anticor C6)、(2-苯并噻唑硫代)琥珀酸的烷基铵盐(例如，Irgacor 153CIBA)和三嗪二巯基化物；
(h)稳定剂，如苯并咪唑衍生物(例如，Bayer，Preventol BCM，杀菌膜保护)的；
(i)流平剂，如氟碳改性聚合物(例如，EFKA 3777)；
(j)颜料或染料，如荧光剂(Royale Pigment and chemicals)；
(k)有机和无机染料，如荧光黄(fluorescein)；
(l)路易斯酸，如氯化锂、氯化锌、氯化锶、氯化钙和氯化铝。
(m)延缓火焰传播、热释放和/或烟产生的合适的阻燃剂，其可单独添加或任选地包括：
·磷衍生物，如含有磷酸盐(酯)、多聚磷酸盐(酯)、亚磷酸盐(酯)、膦嗪和膦官能团的分子，例如，磷酸三聚氰胺、磷酸二(三聚氰胺)、聚磷酸三聚氰胺、磷酸铵、聚磷酸铵、季戊四醇磷酸酯、亚磷酸三聚氰胺和三苯基膦。
·含氮衍生物，如三聚氰胺、氰尿酸三聚氰胺、邻苯二甲酸三聚氰胺、邻苯二甲酰亚胺三聚氰胺、蜜白胺、蜜勒胺、氰尿酰胺、氰尿酸蜜白胺、氰尿酸蜜勒胺、氰尿酸氰尿酰胺、六亚甲基四胺、咪唑、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。
·含有硼酸盐(酯)官能团的分子，如硼酸铵和硼酸锌。
·含有两个或两个以上的醇基团的分子，如季戊四醇、聚乙烯醇、聚乙二醇和碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖和淀粉。
·吸热并释放非可燃性分解气体的分子，如金属氢氧化物例如氢氧化镁和氢氧化铝。
·膨胀石墨
体液的制备、存储和分析
本申请中所描述的多孔聚合物整料用于存储体液(特别是血液和血浆)以供将来的分析(例如，对于包括药剂或其代谢物的分析物)血液或血浆样品可被直接施加到多孔聚合物整料上。然后干燥样品和整料的组合以形成吸附或附着于存储介质上的凝固样品。
体液样品通常包含遗传物质(例如，DNA和RNA)，并可从任何来源获得，例如，生理/病理体液(例如，血液、尿液、分泌物、排泄物、渗出液和漏出液)或细胞悬液(例如，血液、淋巴、滑膜液、精液、含有口腔细胞的唾液)。
多孔聚合物整料为存储或存储样品的后续分析作准备。多孔聚合物整料可由包含官能、和/或组合物或一种或更多种活性剂的固体基体构成，所述活性剂可防止存储于多孔聚合物整料上的遗传物质降解或促进微生物(例如，与一种样品相关的微生物，其可使样品降解或对于人类处理者而言为潜在致病的)的失活、促进特定分析物的提取、或促进基体的移除以帮助分析物的鉴定和分析。
可在稍后阶段对多孔聚合物整料上的干流体样品进行分析，例如用于存在于血液和血浆样品中的药剂的药代动力学分析。在对多孔聚合物整料上的体液样品进行干燥后，它们特别适合这些样品的存储和运输，特别是全血和血浆样品，因为在这个阶段，它们被认为是对于处理来说是相对安全的，并不具有感染性(如，就血液中可载有的感染性疾病如HIV而言)。
长期存储
多孔聚合物整料可构造或调节为能够存储体液许多年，包括以下时间段：至少一天、一星期、一个月、6个月、一年、两年、5年、10年、20年、或长达50年或更久。
在一个实施方案中，可通过将多孔聚合物整料包封在防护材料(例如，塑料材料如聚苯乙烯，其可当随后需要接触存储样品时被除去)中来促进体液在多孔聚合物整料上的长期存储。
在血液的存储中，血液样品可作为血斑被施加到多孔聚合物整料上。官能、组分或一种或更多种试剂可被添加或引入多孔聚合物整料以提供适合于各种用途(如，用于使蛋白质变性、移除基体或减少或除去样品中的任何病原微生物)的特定的可任选的性质。同时，可保护血液(和其中的遗传物质和/或分析物)免受降解因素和方法的影响，使得相对稳定的干燥血液样品随后可被存储并运输到诊断实验室。分析物或遗传物质可在多孔聚合物整料上原位提取、分析或使用。
与多孔聚合物整料一同使用的组合物或活性剂可包括例如单价弱碱(如“Tris”，三羟甲基甲烷，无论是作为游离碱或碳酸盐)、螯合剂(如EDTA，乙二胺四乙酸)、阴离子洗涤剂(如SDS，十二烷基硫酸钠)、胍，或尿酸或尿酸盐。其他试剂可包括保持剂以减少分析物在随后的分析中的损失，这可能会发生在存储或预分析处理过程中。
可引入具有特定功能的单体，以帮助从样品中除去生物基体。使纸基介质的表面官能化的能力是有限的，不过良好地确立了对聚合物整料介质改性以引入功能的简单方法。
在另一个实施方案中，可在多孔聚合物整料中引入功能用于原位排除血液中阻碍检测其他特定组分(例如，分析物如药剂或其他低或小分子量的化合物)的不利组分。在另一个特定的实施方案中，可对多孔聚合物整料的表面区域提供离子交换性能，以便存在于体液中的选定的药剂附着于其上或选定的污染物不附着于其上。因此，多孔聚合物整料可用于分析干燥于其上的体液而不需要基于化学品的预处理。在另一个特定的实施方案中，可通过存在于由形成所述多孔聚合物基体的单体或共聚单体上的官能团、和/或聚合后的包括共聚接枝或其他化学改性的表面改性提供离子交换性能。
在一个实施方案中，血液样品被吸附或附着在介质之前，血液样品可被溶解以便样品附着在介质上。在替代实施方案中，可将多孔聚合物整料介质的孔尺寸提供为等于或大于红血细胞的直径(通常约6000至8000纳米)以便血液样品附着在介质上。
在一个实施方案中，本发明提供一种存储体液以供将来分析的方法，该方法包括将体液样品施加到多孔聚合物整料介质上并干燥所述体液使得所述样品至少部分地凝固并吸附或附着在所述多孔聚合物整料介质上。
在另一个实施方案中，存储体液以供将来分析的方法可包括：
将一个或更多个体液样品施加到多孔聚合物整料介质的一个或更多个区域上；
部分干燥施加到所述介质上的所述一个或更多个样品；
使所述多孔聚合物整料介质的其上施加有样品的任一个或更多个区域与其上未施加样品的区域相分离；
进一步干燥施加到所述介质的所述一个或更多个区域上的所述一个或更多个样品；以及
存储施加到所述介质的所述一个或更多个区域上的所述一个或更多个样品。
所述使所述多孔聚合物整料介质的其上施加有样品的任一个或更多个区域与其上未施加样品的区域相分离可包括从所述样品周围大体上除去任何其上未施加体液的介质，例如修剪或切除位于或接近所述样品的周边的介质。可从所述样品周围修剪或切除所述介质使得所述样品大体上覆盖其上施加有所述样品的所述区域的表面，例如通过使用直径比血斑样品窄的打孔器。换句话说，血斑样品可扩张到或接近施加样品的多孔聚合物整料介质区域的外缘。该实施方案的一个优点是可减少或防止在干燥样品时发生的样品开裂。移除样品未接触的任何介质可促进样品在干燥后的并附着和不开裂。样品通常被从多余的介质上切去或打孔冲出。
施加到介质上的样品通常直径在约5毫米和10毫米之间，例如一般为球形并且尺寸为10到100mm2。例如，所述一个或更多个样品可选自以下尺寸(mm2)中的任一者：1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100。在另一个实施方案中，所述一个或更多个区域可选自以下尺寸(mm2)中的任一者：1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100。应该理解，根据方法、应用或使用的装置，可将可变性与样品施加到介质上的方法相关联，以上范围、低于这些尺寸或在这些尺寸之间也属于本发明的范围内。也可改变介质的尺寸或形状以便用体液样品大体上覆盖其表面，例如通过在支持材料(如阵列)上提供介质的一个或更多个单独区域，所述区域具有能够向其上施加可覆盖其表面的样品的尺寸。将一个或更多个样品向一个或更多个区域施加的各种图案和排布也属于这些实施方案的范围内。例如，可将体液样品阵列施加于介质，例如通过提供约20mm2的5×5样品的单独分开的阵列。在另一个实施方案中，阵列的样品可能被应用于单个介质和/或从单个介质切除，或施加到一个或更多个单独区域介质阵列。
在一个实施方案中，通过施加升高的温度、强制对流或减压中的至少一者来强化体液(如血液或血浆)的干燥。升高的温度可在环境温度以上、存储介质或样品的完整性受到损害的温度以下的温度范围内。在特定的实施方案中，升高的温度在30至150℃、40至120℃、更特别在约60至100℃、或在30℃以上、50℃以上、70℃以上、90℃以上、110℃以上、或130℃以上的范围内。在特定的实施方案中，升高的温度为高于约90℃，对于某些类型的整料介质和样品，这可提高样品将来的分析效果，或防止干燥后样品的开裂。通常可在升高的温度下对样品进行约10到20分钟的干燥。在特定的实施方案中，减压是在5至760毫米汞柱的范围内。减压可通过真空设备施加。
本发明也提供涉及从吸附或附着在多孔聚合物整料介质上的存储的体液样品鉴定和检测分析物的分析方法。
在一个实施方案中，可分析存储的体液样品而无需预处理和/或从多孔聚合物整料介质移除。换言之，存储在整料介质上的样品可不经进一步的改性而直接用于分析。分析物可包括存在于血液或血浆样品中的小分子和低分子量的化合物，例如药剂，包括新化学实体(NCEs)及其任何代谢物、多肽、蛋白质、寡核苷酸、低聚糖、脂类或其他不稳定化合物。在另一个实施方案中，分析涉及对至少两种分析物的同时分析。在特定的实施方案中，所述至少两种分析物包括NCE及其代谢物。
用于选择性地提取的多孔聚合物整料和基体移除
对将离子交换功能引入到多孔聚合物整料进行了研究，以便选择性地提取特定的分析物如药剂或NCEs，并以便移除基体。共同聚合和表面改性技术两者均被采用以引入功能到聚合物整料。
通常多孔聚合物整料具有亲水性表面以便于体液的吸附。可将功能引入到多孔聚合物整料，以便于在原位净化样品或移除基体、便于具体的提取(例如，对于分析物)、或便于生物分析。例如通过引入磺酸型表面基团(例如，HEMA-co-SPMA)，可提供强阳离子交换(SCX)官能性；由羧酸表面基团可提供弱阳离子交换(WCX)官能性；由季胺表面基团可提供强阴离子交换(SAX)官能性；由叔胺表面基团可提供弱阴离子交换(WAX)官能性。
固相提取(SPE)方法涉及样品制备以通过吸附到介质然后用适当的溶剂洗脱来从基体纯化并浓缩分析物。分析物在固相和溶剂之间分区，只有对固相具有高亲和力的那些分析物被保留。移除基体之后可将分析物从固相洗脱并分析。
可制造具有酸性官能团的聚合物整料用于选择性地提取含有碱性官能团的NCEs，而具有碱性官能的聚合物整料允许选择性地提取偏酸性的NCEs。将官能性引入多孔聚合物整料通常已良好地确立并可使用几种不同的方法实现。
将特定的官能性引入多孔聚合物整料介质的两个可能的方法是：或者通过直接将官能性单体引入聚合混合物中，或者通过整料支架的后聚合。直接将官能性单体与结构单体一同引入聚合混合物中的方法是迄今为止最简单的方法，因为不需要后续的改性。然而，由于官能性单体是聚合混合物的一部分，有可能可电离基团的大部分将被陷在介质体中而在整料表面不可得到而不可用于与NCE的相互作用。
第二种方法是后聚合反应，其通过共价结合直接将官能团赋予单体的表面。整料支架可单独优化意味着各种官能性可被赋予到同一整料支架。采用后聚合反应的优点是，官能性被直接赋予到整料表面，意味着更容易合成更高容量的材料用于增加的样品负载。可使用两种非常不同的方法赋予表面官能性；第一种是通过化学反应来改变表面化学。这种方法需要结构单体包含反应性基团。第二个选项是在支持整料支架上完成第二聚合反应；这种技术已知为表面接枝。
本领域技术人员将懂得，可对具体实施方案示出的本发明进行大量变化和/或改变而不脱离广泛描述的本发明的精神或范围，因此，本发明的实施方案被从各方面均应认为是说明性而非限制性的。
应该理解，如果本申请引用了任何现有技术公开，该引用文献不构成承认该公开形成本领域的公知的现有技术的一部分，在澳大利亚或其他任何国家。
在所附的权利要求书中和在前面对本发明的描述中，除非上下文另有所需，由于表达语言或必然暗示，词语“包括(comprise)”或其变化如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”以开放意义使用，即用于说明所陈述的特征的存在、但不排除存在或增加本发明的各种实施方案的进一步的特征。
实验
1.设备
所有整料的大孔结构均使用Micromeritics AutoPore IV 9505(Norcross，GA，USA)孔率计测量。比表面积使用Micromeritics TriStar II3020自动氮吸附/脱附仪根据Brunauer-Emmet-Teller(BET)[Brunauer S等人，Journal of the American Chemical Society，1938.60：第309-319页]法测定。所有整料被在Micromeritics中在50℃温度下脱气24小时。
利用具有500W HgXelamp OAI LS30/5Deep UV辐照系统(SanJosé，CA，USA)用于所有UV曝光。采用OAI Model 306强度计和260nm探头将灯校准至20.0mW/cm2。
使用FEI Quanta 6000Scanning Electron Microscope(FEI，Hillsboro，Oregon，USA)在低真空模式操作、加速电压15至30千伏，从而获得扫描电子显微镜图像。
使用配有API400Triple Quadrapole质谱仪(Applied BiosystemsSciex Instruments，Foster City，CA，USA)和Applied Biosystems1.4.2软件的Aglient Technologies Liquid Chromatograph (AgilentTechnologies，Waldbronn，Germany)进行所有LC-MS/MS分析。电离使用大气压化学电离(APCI)。采用CTC PAL自动进样器(LeapTechnologies，Carrboro，NC，USA)以4℃的恒温进行所有注入。采用Onyx C18整料柱(3.00×100mm)(Phenomenex，Macclesfield Cheshire，UK)，并且温度恒定在40℃。
使用配有抑制电导检测和25μL样品环的Dionex ICS1000IonChromatography系统(Sunnyvale，CA，USA)确定阳离子交换容量的测量。采用IonPac CSI2A阳离子交换柱(5×250mm)。使用配有抑制电导检测和25μL样品环的Dionex DX600系统确定阴离子交换容量的测量。采用IonPac AS18阴离子交换柱(4×250mm)。
通过经过抑制剂移除珠(Aldrich)的过滤对所有甲基丙烯酸酯单体进行纯化，以除去抑制剂；对苯二酚单甲醚和对苯二酚。然后将纯化的单体存储在冰箱中，在-4℃。
2.整料DBS存储介质的制备
a.载玻片的表面改性
用0.2mol/L NaOH溶液在搅拌(Gyro-Rocker 9，Stone，UK)下将Corning显微镜用载玻片(75×50毫米，0.96至1.06毫米厚，Ted Pella Inc，California，USA)活化1小时，然后用水漂洗，直到测量的载玻片表面的pH为中性。然后用0.2mol/L HCl在搅拌下将它们洗涤1小时，用水漂洗，并在60℃干燥1小时。将甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯溶解在95％乙醇中构成20％(w/w)的溶液并用乙酸将其调至pH5，采用这样得到的溶液获得表面乙烯基化，其中该溶液被夹在两个板之间1小时。然后用丙酮洗涤改性片，在环境温度下真空干燥12小时。
b.用于介质制造的模具的制备
制备容纳聚合混合物的模具涉及用通用的环氧树脂将一片Teflon(500微米厚)附着在显微镜用载玻片上。然后将活化的玻片置于用于整料的结构顶部从而附着。用大铁夹子(bulldog clip)将模具夹住。
c.平型聚合物整料片的制备
通过将适当的试剂在在20mL的螺旋盖小瓶中混合而以5.0克的量制备用于合成聚(甲基丙烯酸2-羟乙基酯-co-二甲基丙烯酸乙二醇酯)整料的聚合混合物。通常的聚合混合物由24％的HEMA、16％的EDMA、20％的环己醇、40％的1-十二醇和相对于单体为1％的DMPAP(均为w/w)组成。
每个整料片均采用以下聚合方法制备。将该混合物振动并超声2分钟，然后通过高纯度氮气吹扫10分钟脱气。然后使用巴斯德吸管将混合物转移到模具并暴露在紫外线下900秒。此后，将模具拆卸并将附加的整料在搅拌下在甲醇浴中漂洗至少10小时以除去残留的单体和致孔剂。最后，将整料置于真空烘箱中在环境温度下干燥过夜。对于在致孔剂组合物中使用35-45％的十二醇制造的整料，中孔尺寸相对恒定在约600纳米，而使用100％的十二醇则提供约400nm的中孔尺寸。
3.官能化DBS介质的制备
a.弱阳离子交换(WCX)官能性
进行平片形状的聚(二甲基丙烯酸乙二醇酯-co-甲基丙烯酸)整料的共聚工序。以5.0克的量制备聚合混合物，其含有8.12％的MAA、20.3％的EDMA、47.4％的1-癸醇、27.3％的1，4-丁二醇(均为w/w)。引入相对于总单体为约1％(w/w)的DMPAP。
制造的另一WCE＝聚(GMA-co-EDMA)，对于包含40-45％的十二醇的致孔剂组合物，发现中孔尺寸为340-360纳米，对于100％的十二醇中孔尺寸则为约385纳米。
用于WCX的另一合适的官能性单体为丙烯酸(AAc)。
b.强阳离子交换(SCX)官能性
如下制备混合模式的强阳离子交换/极性聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯-co-二甲基丙烯酸乙二醇酯-co-甲基丙烯酸3-磺基丙酯)整料(MSCX)。通过将0.1克SPMA钾盐溶解在3毫升水中制备SPMA的水溶液。以5.0克的量制备聚合混合物，其含有24％的HEMA、16％的EDMA和6％的SPMA的水溶液(均为w/w)。所采用的致孔溶剂为43.2％的1-癸醇和10.8％的1，4-丁二醇、以及相对于单体为1％的DMPAP(均为w/w)。
制备聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-二二甲基丙烯酸乙二醇酯)整料作为强阳离子交换(SCX)整料的整料支架。使用50％的GMA、50％的DEGMA、36％的十二醇、24％的环己醇和相对于单体为1％的DMPAP(均为w/w)，制备量为5.0g的聚合混合物。
通过将干材料浸没在含1mol/L Na2SO3的水性改性溶液浴中完成表面改性反应。磺化反应允许在75℃的烘箱(Barloworld Scientific，HopeValley，England)中进行12小时，每隔一小时定期振荡。然后通过将材料浸没在10mmol/L HNO3浴中1小时漂洗，并最后在水中洗涤至少24小时。
用于SCX的另一合适的官能性单体为丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸(AMPS)。
c.弱阴离子交换(WAX)官能性
利用上面描述的聚(GMA-co-EDMA)整料作为用于弱阴离子交换(WAX)整料的支架。通过将干整料浸没在含20mmol/L Na2CO3、17mmol/L二乙胺、和3mmol/L NaCl的改性溶液浴中完成表面改性反应。在60℃下保持反应进行8小时，每隔一小时搅拌。整料用水洗涤3小时，最后用甲醇洗涤1小时。然后在真空下将整料干燥。
用于WAX的另一合适的官能性单体为甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEM)。
d.强阴离子交换(SAX)官能性
聚(HEMA-co-EDMA)材料是强阴离子交换(SAX)整料的支持支架，基于接枝法形成平片。接枝混合物含有15％的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵和相对于官能性单体为1％的光引发剂二苯甲酮(均为w/w)，其在叔丁醇和水的3∶1v/v溶液中。该溶液制备后立即使用。将干整料浸没在接枝混合物浴中30分钟并不断搅拌。以尺寸相同的载玻片覆盖该材料，并用大铁夹子夹住。将该材料暴露在紫外线下180秒。在搅拌的甲醇浴中漂洗材料3小时，以除去任何未反应的接枝溶液，从而避免自由基聚合的继续。
为了优化接枝方法，对曝光时间进行了研究。改变引入官能性单体所采用的方法，其涉及制备2.5毫升的接枝混合物，包含1％的二苯甲酮和在3∶1v/v叔丁醇∶水中的15％的官能性单体。用移液管将混合物施加到整料支架聚(HEMA-co-EDMA)表面并静置5分钟。用石英片覆盖整料，然后用大铁夹子夹住石英片。然后将其照射2、5、10、20、40和80分钟。采用单体甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(META)继续该方法。各接枝单体上的氮的百分率可通过快速元素分析(flash elemental analysis)测定，鉴定为：对于1-2分钟的曝光时间为约为0.1％的N、对于20分钟的曝光时间为约为0.4％的N、对于80分钟的曝光时间为约为0.5％的N。发现当材料曝光不到40分钟、合适的约20分钟时，点样在各经曝光的材料上的血液和血浆渗透吸附剂。
4.整料表征
a.整体多孔聚合物整料片的表征
对所有制造的整料材料进行目视检查。然后将15μL人的全血样品样在材料上，并观察吸附、扩散和任何色谱效果。使用约100毫克的样品在粉末穿透计中分析以进行压汞孔隙度测定。约100毫克的样品的比表面积通过氮气吸附/脱附等温线计算。整料的形态直接由扫描电子显微镜(SEM)成像。
b.离子交换容量
通过将阳离子交换整料浸没在搅拌的0.5mol/L HCl浴中12小时对它们预处理。然后将整料在搅拌的水浴中洗涤12小时，前4小时每小时定期换水。然后在真空下将样品干燥12小时。将约100毫克的样品浸没在10毫升100mmol/L NaCl中12小时。将阴离子交换整料浸没在0.5mol/LNaOH浴中，并采用与上文所述相同的预处理方法。
以40、60、80和100毫摩的浓度通过阳离子交换和阴离子交换色谱测量制备NaCl四点校准曲线。分析前，使用0.22微米尼龙膜(Phenomenex，NSW，Australia)对所有样品进行过滤。对于阳离子分析，采用35mmol/L的甲磺酸洗脱液，流速为1.0毫升/分钟，柱温为35℃。对施加到SCX整料上的10毫升NaCl样品进行分析，以测定Na+浓度的降低。对于阴离子，采用30mmol/L的氢氧化钾洗脱液，流速为0.9毫升/分钟，柱温为30℃。对施加到阴离子交换整料上的10毫升NaCl样品进行分析，以测定Cl-浓度的降低。
使用阳离子交换色谱制备Na2CO3的校准曲线。使用Na2CO3采用相同的方法，以测定由暴露于WCX造成的Na+浓度的降低。
5.校准标样和质量控制标样的制备
以1毫克/毫升的浓度在二甲基亚砜中制备测试药品的初始原料溶液。以100、100和1微克/毫升的浓度由初始原料溶液制备工作标准溶液。在水∶甲醇(9∶1v/v)的溶液中预备氟康唑(fluconazole)、加巴喷丁(gabapentin)和普萘洛尔(propranolol)，而在水∶甲醇(1∶1v/v)的溶液中预备布洛芬(ibuprofen)和马拉维若(maraviroc)。在水∶乙腈(1∶1v/v)的溶液中预备UK 258300。每种分析物的内标(IS)以1毫克/毫升的浓度预备在适当的水溶液中。
通过将适当的工作溶液稀释在血液中制备校准标样。校准标样在分析当天使用鼠血液或血浆以5、10、30、50、100、200、400、800和1000ng/mL的浓度制备。鼠血液或血浆中的质量控制(QC)样品由相同的工作溶液制备，浓度为5、20、70和500ng/mL。剧烈搅拌以确保样品的均匀性。
6.整料DBS存储介质的分析验证
a.样品处理
采用氟康唑验证聚(HEMA-co-EDMA)整料，其中使用排气型移液器(air displacement pipette)将每个校准标样的15μL的可分量直接点样到介质上。每个质量控制样品的八个平行测定样品也直接点样到材料上。将样品点静置以吸附约1小时，之后用打孔器(Harris Unicore，Ted Pella，California，USA)从整块材料上取下整个血斑。对于全血斑利用直径6毫米的打孔器，而对于血浆斑利用直径7毫米的打孔器。将血斑置于2毫升的方形孔过滤板(square well filter plate，Strata Impact ProteinPrecipitation Plate，Phenomenex，Cheshire，UK)又一小时，以确保它们完全干燥。
此后，向每个孔中添加含有5ng/mL氟康唑-D8IS的300毫升甲醇。氟康唑被提取到平型床混合器(flat bed mixer，Heidolph Instruments，Kelheim，荷兰)中，以1300rpm的转速提取30分钟。采用真空歧管系统(vacuum manifold system，Tomtec Inc，Hamden，CT，USA)将样品过滤到2mL的96孔聚丙烯板中。在氮气流下在15℃下蒸发滤液。然后使用200μL水∶甲醇(9∶1v/v)将样品重新构成。
b.加速干燥
将QC全血样品的可分量(15μL)直接点样到聚(HEMA-co-EDMA)材料上，平行测定样品为4个。然后将样品在100℃下在PolarathermSeries 9000烘箱(Sandra Selerity Technologies Inc.Salt Lake City，UT，USA)中干燥10分钟。使用直径6毫米的打孔器将血斑冲出。氟康唑的提取使用与以上所述相同的方法完成。
c.同时分析
采用氟康唑和普萘洛尔以验证同时分析的可能性。如上文所述制备，在全血和血浆两者中的样品。使用排气型移液器将每个校准标样的可分量直接点样到介质上。每个质量控制样品的四个平行测定样品也直接点样到介质上。按如上所述的方法处理样品。对于普萘洛尔，所采用的IS是美西律(mexiletine)。
7.通用SPE方法的开发
a.WCX整料和SAX整料
将材料通过浸没在含有5％氨水的浴中进行预处理，定期搅拌浴液2小时。将材料在环境温度下静置干燥3小时。由10微克/毫升的原料溶液在全血、血浆、和水∶甲醇(9∶1v/v)的溶液中制备50ng/mL的UK 258300样品。
将每个溶液的五个斑直接点样到WCX整料上；在水性斑周围画圈。将样品在环境温度下静置干燥1小时。分别用6毫米、7毫米和8毫米直径的打孔器将血斑、血浆斑和水性斑冲出。将斑放入96孔板的各孔中，并进一步干燥1小时。
然后，该方法涉及向各孔中提供300μL 5％的氨水洗液，该洗液含有5ng/mL的IS UK 280111，将96孔板放在平型床混合器上，以1300rpm的转速旋转15分钟。将每个液体样品转移到新的96孔板的各孔中。采用相同的方法使用300μL含有5ng/mL IS的甲醇进行二次洗涤。使用1-5％甲酸的甲醇溶液以依次洗脱分析物，每个溶液含有5ng/mL的IS。使用氮气蒸干样品，并用500μL水∶甲醇(9∶1v/v)将样品重新构成。对于SAX，使用分析物布洛芬和IS布洛芬-D3重复相同的方法。
b.SCX整料和WAX整料
其方法类似上面描述的方法。然而，整料采用含5％甲酸的水溶液预处理。使用1-5％氨水的甲醇溶液以依次洗脱分析物，每个溶液含有5ng/mL的IS。用于SCX方法开发的分析物为马拉维若，IS为马拉维若-D5；用于WAX方法开发的分析物为加巴喷丁，IS为加巴喷丁-D4。
8.官能化的整料介质的分析方法验证
a.样品制备方法
初始样品的制备方法与上述相同。将冲出的血斑放在聚丙烯96孔板中又一小时，以确保它们完全干燥。SCX和WAX整料通过被浸没在5％甲酸溶液浴中2小时预处理。SAX整料通过被浸没在5％氨水溶液浴中2小时预处理。整料在环境温度下干燥2小时。
然后，该方法涉及使用300毫升5％的氨水溶液在平型床混合器上以1300rpm的转速洗涤SAX材料30分钟。将溶液从孔中除去并抛弃。使用甲醇在平型床混合器上以1300rpm的转速旋转30分钟完成了进一步的洗涤。分析物用含有5ng/mL IS的5％甲酸的甲醇溶液洗脱。将酸性洗脱液转移到单独的96孔板，样品在氮气流下蒸发。然后用500μL水∶甲醇(9∶1v/v)将样品重新构成。
用于SCX和WAX的方法与上述相似，因而不再详细描述。不过，使用了300毫升的5％甲酸溶液洗涤SCX和WAX材料，并用含有5ng/mLIS的5％甲酸的甲醇溶液洗脱分析物。
9.LC-MS/MS试验
对于每个分析方法采用了各种色谱条件。扫描方式为多反应监测(MRM)，母离子(M+1)m/z和碰撞后产物离子被用于分析物的定量。对于氟康唑、普萘洛尔、马拉维若和UK 258300的分析，MS以正离子MRM模式操作。对于布洛芬和加巴喷丁的分析，MS以负离子MRM模式操作。表1给出了用于分析物定量的扫描MRM离子范围。
表1：用于分析物定量的扫描MRM离子范围
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10.多孔聚合物整料的改性
可采用致孔溶剂如1-十二醇和环己醇的混合物对整料的孔性质进行改性。改变致孔溶剂的种类和量，可改变整料的分布，这可通过压汞孔隙度测定法(MIP)检验。HEMA是极性单体，增加极性较低的致孔剂如1-十二醇的浓度通常会提供孔较大的整料。
已发现，在十二醇和环己醇的混合物中增加十二醇的百分率至致孔溶剂的38-100％之间没有可测量的效果并且孔尺寸分布保持不变：在约600纳米。采用比率相等的甲醇和己烷二元致孔溶剂以在聚(HEMA-co-EDMA)整料中获得大孔。获得的孔尺寸分布为7087纳米。孔尺寸较小的整料的重现性更好，例如开发包含40％的十二醇和20％的环己醇的二元致孔溶剂的聚(HEMA-co-EDMA)整料作为潜在的用于存储全血和血浆的吸附剂。
由于光散射，所以整料的视觉外观被认为是孔尺寸的可靠指标。研究的整料表现出白垩状，这表明为大孔材料。通过MIP分析证实了这一点，其中中孔尺寸测量为600.1纳米，整料的孔隙度为68％。通过BET分析确定整料的比表面积。
SEM显微照片也允许直接肉眼观察材料的大孔结构。显微照片清楚地表明使用该聚合混合物可实现的均匀的孔结构(图1a和1b)。使用未官能化的载玻片覆盖聚合混合物不会导致整料表面的任何严重损害。作为结构，获得了未官能化的载玻片的SEM图像(图2)。该图片清楚地表明，移除载玻片仅对整料表面造成轻微损坏。
11.全血和血浆存储可能性的研究
为了研究聚(HEMA-co-EDMA)整料作为存储全血和血浆样品的介质或吸附剂，将15μL人的全血和血浆直接施加到整料上。全血和血浆样品两者均渗透吸附剂的整个500微米的厚度，并且斑的尺寸和形状两者均显示出良好的均匀性。此外，在该整料吸附剂上完全干燥。对于DBS和DPS两者进行尺寸分析(n＝6)，血斑的近似尺寸是直径6毫米，而血浆斑的尺寸是直径约7毫米。
不幸的是，当在吸附剂上干燥全血样品时，整料在斑的范围内显示开裂。这一开裂在血浆斑中并不发生。因此，提出的假设是，开裂与细胞碎片的存在相关。这一理论被认为是合理的，因为聚(HEMA-co-EDMA)整料的中孔尺寸为约600纳米，这显著小于红血细胞(RBC)的固有孔尺寸。可看出，RBC淤积于吸附剂表面，据信它们的存在赋予整料物理压力，这导致它开裂。
支持这一假设的进一步的证据还见于当含有物理裂解RBC的全血样品被施加到吸附剂上时。肉眼观察，整料显示出开裂的显著减少。因此，制造含有比RBC大的大孔的聚合物整料被视为优选的。含有甲醇和正己烷的二元致孔溶剂产生约7.0微米的孔尺寸。将全血的可分量点样到该吸附剂上，血液样品渗透吸附剂的整个厚度，并且在整料表面没有显示RBC淤积。尽管这样，当血液样品干燥时，吸附剂仍然显示了相当程度的开裂。
幸运的是，整料的开裂可通过简单地使用打孔器从整块材料上取下样品圆片而完全消除。据推理，开裂是由于吸附剂材料当湿润时膨胀而当干燥时收缩而发生的。这发生在整块整料的范围内并随后引起导致开裂的物理压力。虽然整料的开裂可能不会影响分析物从吸附剂的回收，但是它使得一些样品处理困难，也意味着必须采样全血斑以保持分析的有效性。
聚合物整料样品圆片，至少在特定的实施方案中，与液体测量相比可提供体积测量，尤其是作为样品圆片，可容易地和干净地从整料块上取下。
12.用于DBS的整料的分析验证
a)测试的细节和分析
制造合适的整料以作为用于全血的吸附剂，其允许简化地存储和运输样品，对整料进一步测试，以验证存储后的样品分析。按照产业指南(Guidance for Induxtry，.2001：Rockville)验证了新技术。生物分析方法开发的基本参数是准确度、精密度、选择性、灵敏度和稳定性。采用商业化的药物氟康唑测定从整料吸附剂的药物回收率的准确度、精密度和灵敏度。在本研究排除了氟康唑在全血或血浆中的选择性和稳定性，因为这两者可良好地建立。
分析物氟康唑可成功地使用有机溶剂甲醇从整料吸附剂中提取。以分析物/内标峰比(峰面积比)对氟康唑标称浓度的关系构建校准图，其中定量下限(LLOQ)为5ng/mL。在5-1000ng/mL范围内对于从全血样品的回收率观察到优异的线性响应，r2＝0.998。
因此，对于四个QC标准的每一个，采用这个校准曲线使用八个平行测定样品测定整料吸附剂的批间的准确度和精密度。准确度通过计算相对于标称浓度的百分偏差测定，精密度由每个平行测定样品组的变动百分率。
产业指南规定，分析方法的准确度的平均值应在实际值的15％范围内，LLOQ除外，LLOQ偏离不应该超过20％。指南进一步规定，精密度不应超过变动系数的15％，就LLOQ而言则不应超过20％。由氟康唑结果获得的准确度和精密度数据显示在表2中，所有的准确度和精密度均符合要求的标准。
表2：从整料吸附剂回收的鼠全血中的氟康唑的批间准确度和精密度
Figure BDA00001867503100301
使用得自纸基材料(其作为新比较技术的参比)的数据采用建立的DBS方法进行交叉验证。由表3可看出氟康唑在纸基介质上的回收率数据的准确度和精密度。这些值与得自整料吸附剂的回收率是直接可比的，可看出两种吸附剂的性能没有显著差异。
表3：从纸吸附剂回收的鼠全血中的氟康唑的批间准确度和精密度
Figure BDA00001867503100302
然而，与纸吸附剂相比，整料吸附剂提供很大的优点，因为分析物可从吸附剂中提取，而生物基体仍然附着。提取分析物时生物基体从纸吸附剂上洗脱，因此样品必须在分析前进一步制备，通常采用良好确立的SPE方法。
已确认对于从全血中提取分析物整料是有效的吸附剂，因此研究将该技术用于血浆样品的可能性。再次使用甲醇从整料吸附剂成功提取分析物氟康唑，而血浆样品仍然附着。以峰面积比对氟康唑标称浓度的关系构建校准图，其中LLOQ为5ng/mL。校准曲线表现出线性响应r2＝0.996。对于血浆样品，使用校准曲线测定批间的准确度和精密度(n＝4)(表4)。
表4：从整料吸附剂回收的鼠血浆中的氟康唑的批间准确度和精密度
Figure BDA00001867503100311
对于血浆样品，LLOQ显著较高，因为没有足够的平行测定样品以在低水平下获得有意义的结果。然而，准确度和精密度再次符合用于验证技术的标准。
b)同时定量的可能性
同时分析提供可同时定量NCEs和它们的代谢物的优点。因此可减少ADME分析所需的样品采集和样品制备的量。提供NCEs的高通量分析的可能性，并进一步减少潜伏期品种的测试。使用两种商品化药物氟康唑和普萘洛尔研究同时定量分析物的可能性。
再次使用甲醇从整料吸附剂成功回收两种分析物。对于氟康唑和普萘洛尔两者，校准曲线在5ng/mL至800ng/mL的浓度范围内为线性，其中相关系数r2分别为0.998和0.997。在干燥鼠血液中的氟康唑和普萘洛尔的批间性能总结于表5。
表5：从整料吸附剂回收的鼠全血中的氟康唑和普萘洛尔的批间准确度和精密度
Figure BDA00001867503100321
获得的准确度和精密度不符合指定标准。然而，没有足够的平行测定样品以结论性地确定整料吸附剂不适合同时分析。相反，这些结果强烈暗示同时分析是很有可能的。
c)加速干燥技术
纸吸附剂用于DBS采样的一个显著的缺点是，不能采用加速干燥以减少样品制备所需的时间。样品必须在环境温度下完全干燥，这通常需要两小时。
为了研究对整料吸附剂实施加速干燥技术的可能性，采用高温。将样品放置在100℃下的通用炉中直到样品完全干燥，这需要不到10分钟。施加高温以加速整料吸附剂上的样品的干燥具有另一优点，即当在90℃以上干燥时DBS斑没有显示开裂。在升高的温度下干燥的样品中，将分析物氟康唑的回收率与在环境温度下干燥的样品的分析物回收率进行了比较(图2)。据推理，观察到的灵敏度增加是由于RBC完全裂解，这意味着分配在RBC中的任何分析物均能够被定量。
13.选择性提取和基体移除
a)背景细节
通常，采用LC-MS/MS进行NCEs生物分析，因为它同时提供高灵敏度和选择性，且分析时间短。不幸的是，LC-MS/MS分析的灵敏度可被降低，这是由于在离子化期间由干扰性的非挥发性基体组分的优先离子化造成的对分析物响应的抑制。因此，需要良好的样品制备方法以选择性地从生物样品中提取目标分析物。对于DBS采样实施的纸基吸附剂的主要缺点之一是，纸提供的官能化的范围有限，因此必须采用额外的提取工序以在DBS样品已从纸上洗脱后移除基体。
建立的SPE技术通过选择性地将NCEs与吸附剂结合并用一系列洗涤洗脱基体组分来减少MS/MS检测过程中引起离子抑制的基体组分的存在。各种材料可被用作用于SPE的吸附剂；这些包括多孔和非多孔的组装二氧化硅和聚合物颗粒以及琼脂糖凝胶、葡聚糖和多孔的整料。通过将官能性引入到吸附剂中确保选择性提取。酸性官能团提供对碱性NCEs的选择性地提取，而碱性官能团允许对酸性NCEs的选择性地提取。对于医药工业多孔聚合物整料是尤其有利的，因为它们可以圆片形式制造，并且96块这些圆片可在档块歧管(block manifold)中绑定在一起，其尺寸为96孔酶标板的尺寸。这种形式可完全自动化，意味着可同时制备多于一个样品。
多孔聚合物整料可为二氧化硅整料或聚合物整料的形式。聚合物整料提供直接地原位制造的优点，多孔结构允许对于洗脱溶剂具有高渗透性。可使用已建立的相对简单的技术赋予整料官能性。
原位共聚是最简单的赋予多孔聚合物整料官能性的方法。它涉及将官能性单体引入到聚合混合物中。例如，一种方法包括弱阳离子交换(WCX)整料的光引发聚合，用于毛细管形式的在线SPE，利用官能性单体甲基丙烯酸。另一种方法可使用官能性单体甲基丙烯酸磺基丙酯的引入，可用于实现混合模式的强阳离子交换(MSCX)整料。然而，这种简单的方法的缺点是，整料通常提供低离子交换容量，由于官能团被引入整体聚合物中而不能全部贡献给表面电荷。
可通过聚合后的改性增加大孔整料表面可用的官能团数，由此提高离子交换容量。不幸的是，这种方法需要至少两步的制造过程，但该缺点可实现的高离子交换容量抵销。可采用两种非常不同的方法直接将官能性赋予到整料表面。一种方法是通过化学反应改变表面化学，这要求结构单体包括反应性基团。通常，单体GMA被引入整料支架，GMA提供环氧部分，其易于受到开环亲核攻击，产生用于进一步的官能团共价附着的位点。另一种方法是在支持用的整料支架上完成第二个聚合反应；这种技术被称为表面接枝。
b)物理表征
视觉上，所有制造的整料，无论是用于进一步表面改性的整料支架还是通过共聚制备的那些，表现为白垩状，这暗示大孔。进一步通过MIP和BET分析所有制造的整料的孔性质，作为这种视觉评价的形式。表6包含所有整料的多孔性的总结。
表6：本研究中所用的整料的孔性质的总结
获得两个整料式支架聚(GMA-co-DEGMA)(图3a)和聚(HEMA-co-EDMA)(图3b)的SEM图像以可视化这些整料的形态。SEM图像还包括共同聚的材料聚(EDMA-co-MAA)(图3c)和聚(HEMA-co-EDMA-co-SPMA)(图3d)。这些图像清楚地表明微球的匀质层和不同直径的孔。
采用离子交换色谱官测定能化的吸附剂的离子交换容量，结果待定。
表7证实，与通过聚合后的表面改性制备的吸附剂相比，采用共聚制备的吸附剂具有低得多的离子交换容量。可以理解发生这一结果是因为一定百分率的官能性单体被直接引入聚合混合物中，因此在孔表面将无法获得并将无助于表面电荷。
c)用于测定选择性提取和基体移除的可能性的通用SPE方法
采用建立的SPE方法研究制造的离子交换吸附剂从全血和血浆选择性提取目标分析物的可能性。最初，对所有的吸附剂进行预处理使表面基团离子化，从而使得能够与目标分析物相互作用。SCX和MSCX吸附剂含有磺酸官能团，使得能够与碱性药物发生特定的相互作用，并且官能团在含有5％的甲酸的水溶液中被离子化。WCX吸附剂含有羧酸官能团；使用含有5％的氢氧化铵的水溶液将这些基团离子化。
使用含5％氢氧化铵水溶液对含季铵官能团的SAX吸附剂预处理，而使用5％甲酸的水溶液对含叔铵官能团的WAX吸附剂预处理。这使得能够选择性地提取酸性药物。预处理仅仅涉及将吸附剂浸泡在搅拌的适当水溶液浴中两小时，然后在升高的温度下干燥吸附剂。
用于研究SCX和MSCX吸附剂的选择性提取可能性的目标分析物是马拉维若，一种含有胺基的适度碱性的药物。使用含有季铵的UK 258300研究使用WCX吸附剂的选择性提取可能性。样品被装载于适当预处理的吸附剂上并通过实施水性洗涤提高亲和力，其中对于SCX吸附剂水性洗液含有5％的甲酸，对于WCX吸附剂水性洗液含有5％的氢氧化铵。然后采用甲醇洗来洗脱可能由于疏水相互作用而已经附着在吸附剂上的任何基体组分。一旦基体组分被成功除去，目标分析物可从吸附剂洗脱。SCX方法利用碱性洗脱缓冲液5％氢氧化铵的甲醇溶液通过将吸附剂的磺酸官能团质子化来洗脱目标分析物。WCX方法采用酸性洗脱缓冲液5％甲酸的甲醇溶液通过直接将分析物去质子化来洗脱目标分析物。
通过共聚制备的阳离子交换吸附剂的有限的离子交换能力进一步在图4得到了证实。WCX和MSCX吸附剂证实了低的离子交换容量，由于任意MS响应暗示目标分析物在第一次洗涤中被洗脱。
通过采用两个洗涤步骤，大多未结合或弱结合的基体组分可成功地从整料吸附剂移除。这在图5中得到证实，图5描述了三个连续的洗涤步骤。
d)官能化的整料吸附剂用于选择性地提取NCEs的分析
i)SCX吸附剂的分析验证
已经在制造的适合整料中引入阳离子交换官能性用于从全血和血浆中选择性地提取碱性药物，必须根据产业指南(.2001：Rockville)验证该技术。既使用全血又使用血浆研究药品马拉维若从SCX吸附剂上的回收率的准确度、精密度和灵敏度。
以分析物/内标峰比(峰面积比)对马拉维若标称浓度的关系构建校准图，其中定量下限(LLOQ)为5ng/mL。对于从全血和血浆在5ng/mL-800ng/mL范围内观察到对于MS响应的线性响应，其中r2分别为＝0.995和0.983。
对于四个QC标样中的每个，使用五个平行测定样品确定马拉维若的批间的准确度和精密度。全血分析和血浆分析结果列于表7和表8。
这种探索性研究强烈暗示选择性地提取碱性NCEs是很可能的。样品被不断运送至96孔板之间，其在所得到的结果中引入大程度的误差。此外，没有足够的平行测定样品以结论性地确定SCX官能化的整料吸附剂不适合碱性NCEs的选择性地提取。
表7：从SCX吸附剂回收的鼠全血中的马拉维若的批间准确度和精密度
Figure BDA00001867503100361
表8：从SCX吸附剂回收的鼠血浆中的马拉维若的批间准确度和精密度
Figure BDA00001867503100362
ii)阴离子交换吸附剂的分析验证
以类似的方式使用阴离子交换吸附剂研究酸性药物的选择性提取的可能性。用于研究SAX吸附剂的可能性的目标分析物是布洛芬，而加巴喷丁被用于研究WAX吸附剂的可能性。所有样品已制备以用于分析，结果结果待定。这些吸附剂通过整料支架的聚合后改性制备，两种吸附剂均提供高的离子交换容量。这些吸附剂可合适酸性NCEs的选择性提取。
14.聚(HEMA-co-EDMA)用于干燥的血斑采样的验证
a.标样的制备
以1毫克/毫升的浓度在二甲基亚砜(DMSO)中预备测试药品的初始原料。以1000、100和1微克/毫升的浓度由初始原料在水∶甲醇(9∶1v/v)中制备工作标样。内标(IS)氘代氟康唑(d8)也以1微克/毫升的浓度在二甲基亚砜中预备。内标(IS)的工作溶液以10000和1000ng/mL的浓度在水溶液中制备。原料溶液存储在4℃并在使用前使其达到环境温度。所有工作标样在同一天制备作为分析。
通过将适当的工作溶液稀释在生物基体(全血和血浆)中制备校准标样。校准浓度分别为10、30、50、100、200、400、800、1000和2000ng/mL，并且每个校准物含有100ng/mL的IS。校准曲线还包括空白的整料样品圆片(双空白)、空白基体样品圆片(空白)和仅含IS的基体圆片(零空白)。从各个初始原料溶液到用于校准标样的那些制备质量控制(QC)标样。QC样品在适当的基体中以20、70、500和800ng/mL的浓度制备。在水∶甲醇溶液(9∶1v/v)中添加60ng/mL的分析物和7.5ng/mL的IS(称为“溶液A”)。剧烈搅拌以确保所有样品的均匀性。
b.样品处理
将每个标样的可分量(15μL)直接点样到吸附剂上。将样品点在室温下静置以吸附约1小时，之后用打孔器(Harris Unicore，Ted Pella)从整块材料上取下整个血斑。将样品圆片置于2mL的方形96孔过滤板(Strata Impact Protein Precipitation Plate，Phenomenex)又一小时，以确保它们完全干燥。使用300μL甲醇在平型床混合器(HeidolphInstruments)上以1300rpm的转速提取分析物30分钟。采用真空歧管系统(Tomtec Inc)将样品过滤到2mL的96孔聚丙烯板中。在氮气流下在55℃下蒸发滤液。然后使用200μL水∶甲醇(9∶1v/v)将样品重新构成。
c.HPLC-MS/MS分析
分析系统由CTC HTS PAL自动进样器(Presearch)、Agilent 1100系列二元泵(Agilent)和4000QTRAP质谱仪(Applied Bioscience，Sciex)组成。该系统使用软件Analyst 1.4.2操作。
使用标准反相整料柱Onyx C18(3.00x 100mm)(Phenomenex)实现色谱分离。采用简单的溶剂梯度(水性、有机性、水性)洗脱分析物，采用的流动相为流动相A(水∶甲醇9∶1v/v)和流动相B(水∶甲醇1∶9v/v)。样品注入(40μL)之后，流动相保持恒定在90A％和10％B从0到0.10分钟。在0.10到1.10分钟采用弹道梯度，当流动相组成为5％A和95％B时停止。此后，从1.10至3.10分钟，它被返回到90A％和10％B。流动相，然后保持不变从3.10至3.50分。以1.00mL/分钟的流速将流动相泵送通过该系统，柱被保持在室温下。
质谱仪检测器配备有TurboSpayIon源，源温度设置在700℃的温度。检测器以正离子多反应监测(MRM)模式操作。扫描MRM转换对于分析物和IS分别为307.00至238.00m/z和315.00至244.00m/z。优化的停留时间分别为76毫秒和71毫秒，对于两种分析物碰撞能量均在23eV进行优化。
d.生物分析验证
选择性(干拢化合物)、回收率、基体效果和灵敏度。如上所述由六个独立源制备双空白样品和空白样品。对这些样品进行分析以了解可能具有与分析物相近的保留时间干扰化合物的存在。对整料和两种基体的干扰的可能性进行了评价。可通过将提取的高QC样品与未提取的样品(在溶液A中重新构成的空白样品圆片)的峰面积进行比较来测定回收率。基体效果通过将直接注入的溶液A的分析物/IS的峰面积与未提取的样品的峰面积比较来考虑。至少采用两种独立的基体源。通过比较双空白和黑色(空白)样品与低浓度的非零样品来确定灵敏度、或定量下限(LLOQ)的测定。
校准曲线、重现性和带出物(carry over)。重复制备双空白、空白和零空白、以及九个非零点校准标样，以确定重复性。将1/x2回归模型应用于数据。仪器带出物通过在最高校准标样后直接注入空白样品而进行，而样品制备带出物通过在最高校准标样后包括从整块整料中冲出的空白样品圆片评价。
准确度和精密度。批内的准确度和精密度通过对于4个质量控制浓度的每一个检测6个平行测定样品而测定。批间的准确度和精密度通过在每个QC水平检测6个平行测定样品3次而测定。
定量上限(HLQ)上的稀释。将生物基体添加至20000纳克/毫升(10×HLQ)。将6个平行测定样品点样到吸附剂上。如上所述对样品进行处理。通过使用7.2毫升9∶1v/v水∶甲醇提取36样品空白样品圆片制备稀释剂样品。然后在390μL稀释剂中稀释每个浓缩样品的10μL可分量。
e.生物分析方法验证的结果和讨论
选择性和灵每度聚(HEMA-co-EDMA)吸附剂和生物基体两者均具有包含可提高或抑制离子化从而干扰氟康唑定量的共洗脱组分的可能性。使用所选的MRM转换m/z 307-238(分析物)和m/z 315-244(IS)对色谱图进行了评价。图6a-6c显示血液和血浆两者的双空白、空白样品的LC-MS/MS图。氟康唑及其氘代IS的典型保留时间为1.8分钟(图7a-7c)，并从这些图可看出，在该区域有没有显著的干扰。对双空白和空白样品(n＝9)的至少6个不同源进行评价，以测定样品的论点结果是否一致。对于双空白、血浆空白和血液空白，在1.8分钟时的平均检测器响应分别为82、254和101(图6a-6c)。对于分析物浓度测定的色谱方法，用于生物分析方法验证的标准操作方法(SOP)规定：与分析物类似的保留时间的任何响应必须≤定量下限(LLOQ)校准标样的响应的≤20％。对于目前的验证，LLOQ对于血液和血浆分别为2ng/mL和5ng/mL。在这些浓度下，整体平均检测器响应为血液中1176次计数、血浆中8814次计数(n＝18)。这些结果洗提到进一步降低定量水平的可能性。在零空白中氘代IS的平均检测器响应对于血液为4.255x 104次计数、对于血浆为4.205x 104次计数(n＝2)。SOP规定，与IS类似的保留时间的任何响应必须≤IS的5％。
基体效果和回收率。可由式1计算提取回收率，而采用式2测定整体回收率。
提取回收率＝提取QC样品未提取的样品x 100(1)
整体回收率＝提取QC样品溶/液A×100(2)
氟康唑和氟康唑-d8从干血斑(DBS)样品的平均提取回收率分别为85％和77％，平均整体回收率为76％和71％。这些结果表明，在提取过程中分析物没有严重损失。对于分析物和IS，DPS提取回收率的结果分别为108％和52％，而整体79％和32％的药物被回收，这被认为是没有对于DBS结果那么可靠。
使用式3计算由整料和生物样品产生的基体效果。
基体效果＝(未提取的样品圆片/溶液A-1)×100(3)
这一分析的结果可见于表9，这些结果暗示发生基体抑制。20次测试的样品中没有样品表明发生任何信号增强。而整料和血液样品显示没有显著的基体抑制迹象，血浆结果比预期的要高得多。
表9.基体效果(n＝20)
  样品   氟康唑   氟康唑-d8
  整料   -5   -3
  血浆   -28   -26
  血液   -10   -6
DBS和DPS检测性能特征。以在血液和血浆两者中分析物/IS峰面积比对校准标样的标称浓度的关系构建校准图。在浓度范围内观察DBS和DPS样品两者的线性响应，该线性响应对于检测的所有校准曲线(血＝4，血浆＝2)均可重现。对分析处理的带出物进行评价，其中对来自样品制备方法的带出物和分析的带出物两者进行分析。在这两种情况下，对于血浆和血液两者，带出物降低到不足1％，因此测定为微不足道的。DBS的批内和批间检测的准确度和精密度总结于表10。得到的所有值均符合国际公认的试验验证验收标准(即，在各QC水平，准确度和精密度应落入标称值的15％的范围内，而在LLOQ，准确度和精密度可能会有20％的变化)。
表10.在各浓度水平下在DBS样品(n＝6)中氟康唑的批内和批间性能数据
  标称浓度(ng/mL)   20   70   500   800
  批次1   平均浓度(ng/mL)   17.35   66.33   488.67   724.00
  SD   0.965   3.637   13.938   23.512
  准确度   13   5   2   10
  精密度   6   5   3   3
  批次2   平均浓度(ng/mL)   20.32   66.33   530.00   878.80
  SD   0.941   3.637   7.849   45.730
  准确度   2   5   6   10
  精密度   5   5   1   5
  批次3   平均浓度(ng/mL)   18.25   71.12   465.60   787.83
  SD   0.989   1.376   44.405   22.275
  准确度   9   2   7   2
  精密度   5   2   10   3
  整体批间检测 平均浓度(ng/mL) 18.25 71.12 465.60 803.21
  SD   1.11   2.50   85.00   29.43
  准确度   7   3   6   0
  精密度   6   4   5   4
表11总结了DPS样品的批内和批间检测的准确度和精密度。只完成了一个批次的检测，不过进一步的支持试验正在进行中。
血液样品(n＝3)的平均浓度为1483ng/mL，而血浆样品(n＝6)的平均浓度为1360ng/mL。对于血液，检测的准确度和精密度分别为26％和16％；对于血浆，检测的准确度和精密度分别为32％和7％。
表11.在各浓度水平下在DPS样品(n＝6)中氟康唑的批内和批间性能数据
Figure BDA00001867503100421
也得到了氟康唑和氟康唑-d8的稳定性的初步数据。正在研究化合物在初始原料溶液和工作溶液中的稳定性以求获得所要的使用期限。这可通过评价样品(t0和t∞)之间的分析物峰面积而简单地评价。也对分析物/IS在生物基体(液体)中的稳定性、以及分析物/IS在DBS和DPS样品中短期和长期存储(通常存储在干燥器中)的稳定性进行评价。可通过基于新制校准曲线的分析并与新制样品比较来评价这些参数。化合物的任何降解均通过QC样品的浓度减少测定。

Claims (20)

1.一种体液存储介质，包括具有一体化本体的多孔聚合物整料，所述多孔聚合物整料的孔尺寸和/或比表面积调节为便于体液的干燥和存储。
2.根据权利要求1所述的体液存储介质，其中所述多孔聚合物整料的孔尺寸在5至10000纳米的范围内，所述多孔聚合物基体的比表面积当使用BET等温线通过氮吸附法测定时在0.5至1000m2/g的范围内。
3.根据权利要求1或2所述的体液存储介质，其中所述多孔聚合物整料包括多乙烯基单体和单乙烯基单体的共聚物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的体液存储介质，其中所述多孔聚合物整料由一种或更多种丙烯酸单体形成，所述丙烯酸单体任选地利用选自磺酰基、膦酰基、羧基、氨基和硝基中的基团官能化。
5.根据权利要求4所述的体液存储介质，其中所述丙烯酸单体为选自甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸或其组合中的至少一种的任选地官能化的甲基丙烯酸酯。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的体液存储介质，其中至少所述多孔聚合物整料的表面被改性以提供离子交换性能，以便于存在于样品中的任何分析物在存储后的分析。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的体液存储介质，其中所述介质由聚合混合物获得，所述聚合混合物包含约10-40体积％的单乙烯基单体、10至40体积％的多乙烯基单体、约20-80体积％的致孔剂和约1体积％的引发剂。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的体液存储介质，其中所述体液存储介质包括所述多孔聚合物整料和至少柔性的聚合物层。
9.一种多孔聚合物整料作为体液干燥和存储介质的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述多孔聚合物整料由根据权利要求1至8中任一项所述的体液存储介质提供。
11.根据权利要求9或10所述的用途，其中所述体液是血液或血浆。
12.一种存储体液以供将来分析的方法，包括：
将体液样品施加到多孔聚合物整料介质上；
干燥所述体液使得所述样品至少部分地凝固并吸附或附着在所述多孔聚合物整料介质上；以及
存储施加到所述介质上的所述样品。
13.一种存储体液以供将来分析的方法，包括：
将一个或更多个体液样品施加到多孔聚合物整料介质的一个或更多个区域上；
部分干燥施加到所述介质上的所述一个或更多个样品；
使所述多孔聚合物整料的其上施加有样品的任一个或更多个区域与其上未施加样品的区域相分离；
进一步干燥施加到所述介质的所述一个或更多个区域上的所述一个或更多个样品；以及
存储施加到所述介质的所述一个或更多个区域上的所述一个或更多个样品。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中通过施加升高的温度和/或强制对流中的至少一者来强化所述体液的干燥。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述升高的温度为90℃或更高。
16.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，还包括鉴定和检测来自吸附或附着在所述多孔聚合物整料介质上的存储的体液样品的分析物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述分析物为药剂或其代谢物。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中对所述存储的体液样品进行分析而不进行预处理和/或从所述多孔聚合物整料介质上移除。
19.根据权利要求12至18中任一项所述的方法，其中所述多孔聚合物整料由根据权利要求1至8中任一项所述的体液存储介质提供。
20.根据权利要求12至19中任一项所述的方法，其中所述体液是血液或血浆。
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