CN102791742B - 评价肝素制剂 - Google Patents
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Abstract
评价肝素制剂例如用作一种药品或用于制备一种药品的适合性的方法，评价方式是确定一种结构标记的缺失、存在或量值，该标记指示了用于制备肝素制剂的方法。
Description
发明背景
在很多疾病过程(包括肿瘤学、炎性疾病以及血栓症)中，复合多糖已经被用作药物干预。这类药物干预的例子是透明质酸(一种创伤愈合的助剂和抗癌剂)以及肝素(一种有效的抗凝血剂和抗血栓剂)。复合多糖主要通过结合可溶蛋白信号分子(包括存在于细胞表面以及在细胞间的细胞外基质之内的生长因子、细胞因子以及形态发生素，连同它们存在于这种环境之内的同源受体)引出它们的功能。在这种情况下，这些复合多糖影响了对于细胞和组织功能重要的在细胞外和细胞内信号通路方面的关键变化。例如，肝素结合了凝血抑制因子抗凝血酶III，促进它对因子IIa和Xa的抑制能力。
发明概述
在一方面，本披露以确认某一过程是否用于制备一种肝素制剂(例如未分级肝素制剂或低分子量肝素(LMWH)制剂)为特征。该方法包括：
确定与1H1D-NMR谱图中N-乙酰基区域内的一个峰相关联的一个结构标记，例如与图9中2.08ppm处的峰和/或图1中2.10ppm处的峰相关联的一个结构标记在一种肝素制剂中的缺失或存在，其中该结构标记的存在表明该肝素制剂由一种方法(例如一种包括氧化或氧化后用酸处理的方法)制备，而该结构标记的缺失表明肝素制剂不由该方法(例如，该方法不包括氧化或者氧化后用酸处理)制备；并且
如果该肝素制剂由此方法(例如，该方法包括氧化或氧化后用酸处理)制备或如果该肝素制剂不由该方法制备(例如，该方法不包括氧化或氧化后用酸处理)，则做出关于该肝素制剂的一个决定或步骤，例如，将该肝素制剂分类、选择、接受或丢弃、放行或保留、加工成一种药物产品、装运、移至新地方、配制、标记、包装、商业化、销售或供出售。
在一个实施方案中，该方法包括如果该肝素制剂由此方法(例如，该方法包括氧化或氧化后用酸处理)制备，则做出关于该肝素制剂的一个决定或步骤，例如该决定或步骤是分类、选择、接受、放行、加工成一种药物产品、装运、配制、标记、包装、商业化、销售或供出售。
在另一个实施方案中，该方法包括如果该肝素制剂不由此方法(例如，该方法不包括氧化或氧化后用酸处理)制备，则做出关于该肝素制剂的一个决定或步骤，例如该决定或步骤是丢弃或保留该肝素样品。
在一个实施方案中，该方法可用于确定该肝素制剂用作一种药物或用于制备一种药物的适合性。在一个实施方案中，该制剂是选自下组：用于生产一种药物的起始材料，在一种药物、药品或药物产品的生产过程中的一种中间产物。
在一个实施方案中，该肝素制剂是一种未分级肝素制剂，并且该决定或步骤包括选择该未分级肝素制剂用于进一步加工，例如生产一种LMWH制剂，例如在此说明的一种LMWH制剂。在一个实施方案中，选择该肝素制剂用于解聚，例如化学和/或酶催化解聚，和/或按大小分级分离以生产一种LMWH制剂，例如在此说明的一种LMWH制剂。
在一个实施方案中，该方法进一步包括选择该肝素制剂并且加工 该肝素制剂，以便例如生产一种药物产品。在一个实施方案中，该肝素制剂是一种未分级肝素制剂，并且该方法进一步包括将该未分级肝素制剂解聚，例如通过化学和/或酶催化解聚，以生产一种LMWH制剂，例如在此说明的一种LMWH制剂。在一个实施方案中，该肝素制剂是一种未分级肝素制剂，并且该方法进一步包括将肝素制剂按大小分级分离，以生产一种LMWH制剂，例如在此说明的一种LMWH制剂。在一个实施方案中，该肝素制剂是一种未分级肝素制剂，并且该方法进一步包括将该未分级肝素制剂解聚并且按大小分级分离，以生产一种LMWH制剂，例如在此说明的一种LMWH制剂。在一个实施方案中，该肝素制剂是一种未分级肝素制剂，并且该方法进一步包括通过在此说明的一种或多种方法来加工该未分级肝素制剂。
在一个实施方案中，该肝素制剂是一种可商购的未分级肝素制剂，例如在此说明的一种可商购的未分级肝素制剂。
在一个实施方案中，该肝素制剂是一种LMWH制剂，并且该决定或步骤是将该LMWH制剂选择、接受、放行、加工成一种药物产品，装运、配制、标记、包装、商业化、销售、或供出售。
在一个实施方案中，该LMWH制剂是在此说明的一种LMWH制剂。
在一个实施方案中，该方法进一步包括记录所采取的决定或步骤。
在一个实施方案中，如果存在该结构标记，则该方法进一步包括确定存在于该肝素制剂中的结构标记的量值。
在一个实施方案中，确定了与图9中2.08ppm处的峰相关联的结构标记以及与图1中2.10ppm处的峰相关联的结构标记的缺失或存在。
在一个实施方案中，与图1中2.10ppm处的峰相关联的结构标记的 存在表明，该肝素制剂由一种包括氧化的方法制备。在一个实施方案中，与图9中2.08ppm处的峰相关联的结构标记的存在表明，该肝素制剂由一种包括氧化以及用酸处理的方法制备。
在一个实施方案中，该结构标记与N-乙酰氨基葡萄糖上或其附近的修饰相关联。在一个实施方案中，该结构标记与一种肝素制剂中在链的还原端的N-乙酰氨基葡萄糖残基上或其附近的修饰相关联。
在一个实施方案中，该结构标记是一个或多个：
其中在结构B中，X＝H或SO3。
在一个实施方案中，该结构标记的缺失或存在是通过使用高效液相色谱法(HPLC)、核磁共振(NMR)(例如1D-NMR或2D-NMR)、毛细管电泳(CE)、质谱法(例如基质辅助激光解电离-飞行时间质谱技术(MALDI-MS)、电喷雾电离质谱法(ESI-MS))以及快速蛋白液相色谱法(FPLC)中的一种或多种方法确定。
在另一方面，本披露以确认某一过程是否用于制备一种肝素制剂(例如，一种未分级肝素制剂或低分子量肝素(LMWH)制剂)的方法为特征，包括：
获取一个数值，例如通过一种分离法，该数值表明与1H1D-NMR谱图中N-乙酰基区域内的一个峰相关联的结构标记(例如与图9中2.08ppm处的峰和/或图1中2.10ppm处的峰相关联的结构标记)在一种肝素制剂中的缺失、存在或量值；
确定该肝素制剂是否由一种方法(例如一种包括将该肝素制剂氧 化或氧化后用酸处理)制备，其中该结构标记的存在表明该肝素制剂由该方法制备(例如，该方法包括氧化或氧化后用酸处理)，而该结构标记的缺失表明该肝素制剂不由该方法制备(例如，该方法不包括氧化或氧化后用酸处理)；并且
如果该肝素制剂由该方法(例如，该方法包括氧化或氧化后用酸处理)制备或者如果该肝素制剂不由该方法制备(例如，该方法不包括氧化或氧化后用酸处理)，则做出关于该肝素制剂的一个决定或步骤，例如将该肝素制剂分类、选择、接受或丢弃、放行或保留、加工成一种药物产品、装运、移至新地方、配制、标记、包装、商业化、销售或供出售。
在一个实施方案中，该方法包括如果该肝素制剂由该方法(例如，该方法包括氧化或氧化后用酸处理)制备，则做出关于该肝素制剂的一个决定或步骤，例如该决定或步骤是分类、选择、接受、放行、加工成一种药物产品、装运、配制、标记、包装、商业化、销售或供出售。
在另一个实施方案中，该方法包括如果该肝素制剂不由该方法(例如，该方法不包括氧化或氧化后用酸处理)制备，则做出关于该肝素制剂的决定或步骤，例如该决定或步骤是丢弃或保留该肝素制剂。
在一个实施方案中，该方法可用于确定该肝素制剂用作一种药物或用于制备一种药物的适合性。在一个实施方案中，该制剂是选自下组：用于生产一种药物的起始材料、在一种药物、药品或药物产品的生产过程中的一种中间产物。
在一个实施方案中，该肝素制剂是一种未分级肝素制剂，并且该决定或步骤包括选择该未分级肝素制剂用于进一步加工，例如生产一 种LMWH制剂，例如在此说明的一种LMWH制剂。在一个实施方案中，选择该肝素制剂用于解聚，例如化学和/或酶催化解聚，和/或按大小分级分离以生产一种LMWH制剂，例如在此说明的一种LMWH制剂。
在一个实施方案中，该方法进一步包括选择该肝素制剂并且加工该肝素制剂，以便例如生产一种药物产品，例如通过在此说明的一种或多种方法。
在一个实施方案中，该肝素是一种可商购的分级肝素制剂，例如一种在此说明的可商购的未分级肝素制剂。
在一个实施方案中，该肝素是一种LMWH制剂，并且该决定或步骤是将该LMWH制剂选择、接受、放行、加工成一种药物产品，装运、配制、标记、包装、商业化、销售、或供出售。
在一个实施方案中，该LMWH制剂是在此说明的一种LMWH制剂。
在一个实施方案中，该方法进一步包括记录所采取的决定或步骤。
在一个实施方案中，如果存在该结构标记，则评价包括存在于该肝素制剂中的结构标记的量值。
在一个实施方案中，该评价表明与图9中2.08ppm处的峰相关联的结构标记以及与图1中2.10ppm处的峰相关联的结构标记的缺失或存在。
在一个实施方案中，与图1中2.10ppm处的峰相关联的结构标记的存在表明，该肝素制剂由一种包括氧化的方法制备。在一个实施方案中，与图9中2.08ppm处的峰相关联的结构标记的存在表明，该肝素制剂由一种包括氧化以及用酸处理的方法制备。
在一个实施方案中，该结构标记与N-乙酰氨基葡萄糖上或其附近 的修饰相关联。在一个实施方案中，该结构标记与一种肝素制剂中在链的还原端的N-乙酰氨基葡萄糖残基上或其附近的修饰相关联。
在一个实施方案中，该结构标记是一个或多个：
其中在结构B中，X＝H或SO3。
在一个实施方案中，该分离法是在此说明的一种或多种分离法。
在另一方面，本披露以确认某一过程是否用于制备一种肝素制剂(例如，一种未分级肝素制剂或低分子量肝素(LMWH)制剂)的方法为特征，包括：
使用一种分离法来确定与1H1D-NMR谱图中N-乙酰基区域内的一个峰相关联的结构标记(例如与图9中2.08ppm处的峰和/或图1中2.10ppm处的峰相关联的一个结构标记)的缺失或存在；并且
确定该肝素制剂是否由一种方法(例如，一种包括将该肝素制剂氧化或氧化后用酸处理的方法)制备，其中该结构标记的存在表明该肝素制剂由该方法(例如，该方法包括氧化或氧化后用酸处理)制备，而该结构标记的缺失表明该肝素制剂不由该方法(例如，该方法不包括氧化或氧化后用酸处理)制备。
在一个实施方案中，该方法进一步包括如果该肝素制剂由该方法(例如，该方法包括氧化或氧化后用酸处理)制备或者如果该肝素制剂不由该方法(例如，该方法不包括氧化或氧化后用酸处理)制备，则做出关于该肝素制剂的一个决定或步骤，例如将该肝素制剂分类、选择、接受或丢弃、放行或保留、加工成一种药物产品、装运、移至 新地方、配制、标记、包装、商业化、销售或供出售。
在一个实施方案中，该方法可用于确定该肝素制剂用作一种药物或用于制备一种药物的适合性。在一个实施方案中，该制剂是选自下组：用于生产一种药物的起始材料，在一种药物、药品或药物产品的生产中的一种中间产物。
在一个实施方案中，该肝素制剂是一种未分级肝素制剂，并且该方法进一步包括选择该未分级肝素制剂用于进一步加工，例如生产一种LMWH制剂，例如在此说明的一种LMWH制剂。在一个实施方案中，选择肝素制剂用于解聚，例如化学和/或酶催化解聚，和/或按大小分级分离以生产一种LMWH制剂，例如在此说明的一种LMWH制剂。
在一个实施方案中，该方法进一步包括选择该肝素制剂并且加工该肝素制剂，以便例如生产一种药物产品，例如通过在此说明的一种或多种方法。
在一个实施方案中，该肝素是一种可商购的未分级肝素制剂，例如在此说明的一种可商购的未分级肝素制剂。
在一个实施方案中，该肝素制剂是一种LMWH制剂，并且该方法进一步包括做出一个决定或步骤。例如，该决定或步骤可以是将该LMWH制剂选择、接受、放行、加工成一种药物产品，装运、配制、标记、包装、商业化、销售、或供出售。在一个实施方案中，该方法进一步包括记录所采取的决定或步骤。
在一个实施方案中，该LMWH制剂是在此说明的一种LMWH制剂。
在一个实施方案中，如果存在该结构标记，则该方法进一步包括确定存在于该肝素制剂中的结构标记的量值。
在一个实施方案中，确定了与图9中2.08ppm处的峰相关联的结构 标记以及与图1中2.10ppm处的峰相关联的结构标记的缺失或存在。
在一个实施方案中，与图1中2.10ppm处的峰相关联的结构标记的存在表明该肝素制剂由一种包括氧化的方法制备。在一个实施方案中，与图9中2.08ppm处的峰相关联的结构标记的存在表明该肝素制剂由一种包括氧化以及用酸处理的方法制备。
在一个实施方案中，该结构标记与N-乙酰氨基葡萄糖上或其附近的修饰相关联。在一个实施方案中，该结构标记与一种肝素制剂中在链的还原端的N-乙酰氨基葡萄糖残基上或其附近的修饰相关联。
在一个实施方案中，该结构标记是一个或多个：
其中在结构B中，X＝H或SO3。
在一个实施方案中，该结构标记的缺失或存在是通过在此说明的一种或多种分离法确定的。
在另一方面，本披露以确认用于制备一种肝素制剂(例如，一种未分级肝素制剂或低分子量肝素(LMWH)制剂)的方法为特征，包括：
使用一种分离法来确定与1H1D-NMR谱图中N-乙酰基区域内的一个峰相关联的结构标记(例如与图9中2.08ppm处的峰和/或图1中2.10ppm处的峰相关联的结构标记)在一种肝素制剂中的缺失或存在；并且
确定该肝素制剂是否由一种方法(例如，一种包括将该肝素制剂 氧化或氧化后用酸处理的方法)制备，其中该结构标记的存在表明该肝素制剂由该方法制备(例如，该方法包括将该肝素制剂氧化或氧化后用酸处理)，而该结构标记的缺失表明该肝素制剂不由该方法(例如，该方法不包括将该肝素制剂氧化或氧化后用酸处理该肝素制剂)制备，并且基于该确定，如果该肝素制剂由该方法(例如，该方法包括氧化或氧化后用酸处理)制备或者如果该肝素制剂不由该方法(例如，该方法不包括氧化或氧化后用酸处理)制备，则做出关于该肝素制剂的一个决定或步骤，例如将该肝素制剂分类、选择、接受或丢弃、放行或保留、加工成一种药物产品、装运、移至新地方、配制、标记、包装、商业化、销售或供出售。
在一个实施方案中，该方法可用于确定该肝素制剂用作一种药物或用于制备一种药物的适合性。在一个实施方案中，该肝素制剂是选自下组：用于生产一种药物的起始材料，在一种药物、药品或药物产品的生产中的一种中间产物。
在一个实施方案中，该肝素是一种未分级肝素制剂，并且该方法进一步包括选择该未分级肝素制剂用于进一步加工，例如生产一种LMWH制剂，例如在此说明的一种LMWH制剂。在一个实施方案中，选择该肝素制剂用于解聚，例如化学和/或酶催化解聚，和/或按大小分级分离以生产一种LMWH制剂，例如在此说明的一种LMWH制剂。
在一个实施方案中，该方法进一步包括选择该肝素制剂并且加工该肝素制剂，例如生产一种药物产品，例如通过在此说明的一种或多种方法。
在一个实施方案中，该肝素是一种可商购的未分级肝素制剂，例如在此说明的一种可商购的未分级肝素制剂。
在一个实施方案中，该肝素制剂是一种LMWH制剂，并且该方法 进一步包括做出一个决定或步骤。例如，该决定或步骤可以是将该LMWH制剂选择、接受、放行、加工成一种药物产品，装运、配制、标记、包装、商业化、销售、或供出售。在一个实施方案中，该方法进一步包括记录所采取的决定或步骤。
在一个实施方案中，该LMWH制剂是在此说明的一种LMWH制剂。
在一个实施方案中，如果存在该结构标记，则该方法进一步包括确定存在于该肝素制剂中的结构标记的量值。
在一个实施方案中，确定了与图9中2.08ppm处的峰相关联的结构标记以及与图1中2.10ppm处的峰相关联的结构标记的缺失或存在。
在一个实施方案中，与图1中2.10ppm处的峰相关联的结构标记的存在表明，该肝素制剂由一种包括氧化的方法制备。在一个实施方案中，与图9中2.08ppm处的峰相关联的结构标记的存在表明，该肝素制剂由一种包括氧化以及用酸处理的方法制备。
在一个实施方案中，该结构标记与N-乙酰氨基葡萄糖上或其附近的修饰相关联。在一个实施方案中，该结构标记与一种肝素制剂中在链的还原端的N-乙酰氨基葡萄糖残基上或其附近的修饰相关联。
在一个实施方案中，该结构标记是一个或多个：
其中在结构B中，X＝H或SO3。
在一个实施方案中，该结构标记的缺失或存在是通过在此说明的一种或多种分离法确定的。
在另一方面，本披露以确定一种肝素制剂(例如，一种未分级肝素制剂或一种低分子量肝素(LMWH)制剂)是否存在着色风险的方法为特征，包括：
确定与图1中1H1D-NMR谱图内2.10ppm的峰相关联的一个结构标记在一种肝素制剂中的缺失或存在，其中该结构标记的存在表明该肝素制剂不存在着色风险，而该结构标记的缺失表明该肝素制剂存在着色风险；并且
如果该肝素制剂不存在着色风险，则做出关于该肝素制剂的一个决定或步骤，例如将该肝素制剂分类、选择、接受、放行、加工成一种药物产品、装运、移至新地方、配制、标记、包装、商业化、销售或供出售，或者如果该肝素制剂存在着色风险，则例如将该肝素制剂丢弃或保留。
在一个实施方案中，该肝素制剂是一种不存在着色风险的未分级肝素制剂，并且该决定或步骤可以是选择该未分级肝素用于进一步加工，例如通过在此说明的一种方法。在一个实施方案中，该方法进一步包括选择一种不存在着色风险的肝素制剂并且加工该肝素制剂，例如通过在此说明的一种方法。
在一个实施方案中，该肝素制剂是一种可商购的未分级肝素制剂，例如在此说明的一种可商购的未分级肝素制剂。在一个实施方案中，该肝素制剂是一种LMWH制剂，例如在此说明的一种LMWH制剂。
在一个实施方案中，该结构标记与N-乙酰氨基葡萄糖上或其附近的修饰相关联。在一个实施方案中，该结构标记与一种肝素制剂中在链的还原端的N-乙酰氨基葡萄糖残基上或其附近的修饰相关联。
在一个实施方案中，该结构标记是一个或多个：
其中在结构B中，X＝H或SO3。
在一个实施方案中，该方法进一步包括记录所采取的决定或步骤。
在一个实施方案中，如果存在该结构标记，则该方法进一步包括确定存在于该肝素制剂中的结构标记的量值。
在一个实施方案中，该结构标记的缺失或存在是使用一种分离法，例如在此说明的一种分离法确定的。
在另一方面，本披露以确定一种肝素制剂(例如，一种未分级肝素制剂或低分子量肝素(LMWH)制剂)是否存在着色风险的方法为特征，包括：
获取一个数值，例如通过一种分离法，该数值表明与图1中1H1D-NMR谱图内在2.10ppm处的峰相关联的一个结构标记在一种肝素制剂中的缺失、存在或量值；
确定该肝素制剂存在着色风险或者不存在着色风险，其中该结构标记的存在表明该肝素制剂不存在着色风险，而该结构标记的缺失表明该肝素制剂存在着色风险；并且
如果该肝素制剂不存在着色风险，则做出关于该肝素制剂的一个决定或步骤，例如将该肝素制剂分类、选择、接受、放行、加工成一种药物产品、装运、移至新地方、配制、标记、包装、商业化、销售或供出售，或者如果该肝素制剂存在着色风险，则例如将该肝素制剂丢弃或保留。
在一个实施方案中，该肝素制剂是一种不存在着色风险的未分级肝素制剂，并且该决定或步骤可以是选择该未分级肝素用于进一步加工，例如通过在此说明的一种方法。在一个实施方案中，该方法进一步包括选择一种不存在着色风险的肝素制剂并且加工该肝素制剂，例如通过在此说明的一种方法。
在一个实施方案中，该肝素制剂是一种可商购的未分级肝素制剂，例如在此说明的一种可商购的未分级肝素制剂。在一个实施方案中，该肝素制剂是一种LMWH制剂，例如在此说明的一种LMWH制剂。
在一个实施方案中，该结构标记与N-乙酰氨基葡萄糖上或其附近的修饰相关联。在一个实施方案中，该结构标记与一种肝素制剂中在链的还原端的N-乙酰氨基葡萄糖残基上或其附近的修饰相关联。
在一个实施方案中，该结构标记是一个或多个：
其中在结构B中，X＝H或SO3。
在一个实施方案中，该方法进一步包括记录所采取的决定或步骤。
在一个实施方案中，如果存在该结构标记，则该方法进一步包括确定存在于该肝素制剂中的结构标记的量值。
在一个实施方案中，该结构标记的缺失或存在是使用一种分离法，例如在此说明的一种分离法确定的。
在另一方面，本披露以确定一种肝素制剂(例如，一种未分级肝素制剂或一种低分子量肝素(LMWH)制剂)是否存在着色风险的方 法为特征，包括：
使用一种分离法来确定与图1中1H1D-NMR图谱内2.10ppm处的峰相关联的一个结构标记在一种肝素制剂中的缺失或存在；并且
确定该肝素制剂存在着色风险或者不存在着色风险，其中该结构标记的存在表明该肝素制剂不存在着色风险，而该结构标记的缺失表明该肝素制剂存在着色风险。
在一个实施方案中，该方法进一步包括如果该肝素制剂不存在着色风险，则做出关于该肝素制剂的一个决定或步骤，例如将该肝素制剂分类、选择、接受、放行、加工成一种药物产品、装运、移至新地方、配制、标记、包装、商业化、销售或供出售，或者如果该肝素制剂存在着色风险，则例如将该肝素制剂丢弃或保留。
在一个实施方案中，该肝素制剂是一种不存在着色风险的未分级肝素制剂，并且该决定或步骤可以是选择该未分级肝素用于进一步加工，例如通过在此说明的一种方法。在一个实施方案中，该方法进一步包括选择一种不存在着色风险的肝素制剂并且加工该肝素制剂，例如通过在此说明的一种方法。
在一个实施方案中，该肝素制剂是一种可商购的未分级肝素制剂，例如在此说明的一种可商购的未分级肝素制剂。在一个实施方案中，该肝素制剂是一种LMWH制剂，例如在此说明的一种LMWH制剂。
在一个实施方案中，该结构标记与N-乙酰氨基葡萄糖上或其附近的修饰相关联。在一个实施方案中，该结构标记与一种肝素制剂中在链的还原端的N-乙酰氨基葡萄糖残基上或其附近的修饰相关联。
在一个实施方案中，该结构标记是一个或多个：
其中在结构B中，X＝H或SO3。
在一个实施方案中，该方法进一步包括记录所采取的决定或步骤。
在一个实施方案中，如果存在该结构标记，则该方法进一步包括确定存在于该肝素制剂中的结构标记的量值。
在一个实施方案中，该该结构标记的缺失或存在是使用一种分离法，例如在此说明的一种分离法确定的。
在一个实施方案中，本披露以确认一种结构标记的方法为特征，该结构标记指示了用于制备一种肝素制剂(例如，一种未分级肝素制剂或低分子量肝素(LMWH)制剂)的方法，包括：
提供(例如获取)对一种或多种结构标记的评价，这种或这些结构标记与通过一个第一方法所制备的一种第一肝素制剂的1H1D-NMR谱图中N-乙酰基区域内的一个峰相关联；
提供(例如获取)对一种或多种结构标记的评价，这种或这些结构标记与不同于该第一方法的一个第二方法所制备的一种第二肝素制剂的1H1D-NMR谱图中N-乙酰基区域内的一个峰相关联；
确认一种结构标记，该结构标记与存在于该第一肝素制剂中、连同缺失或以一个不同量值存在于该第二肝素制剂中的该第一肝素制剂的1H1D-NMR谱图中N-乙酰基区域内的一个峰相关联；并且
确认与该第一肝素制剂的1H1D-NMR谱图中N-乙酰基区域内的一个峰相关联的结构标记，或者与该第一肝素制剂的1H1D-NMR谱图 中N-乙酰基区域内的一个峰相关联的结构标记的量值，作是用于确认由该第一方法制备的肝素制剂的一个参比标准。
在一个实施方案中，记录该参比标准，例如通过打印记录或计算机可读记录。
在一个实施方案中，使用一种分离法，例如在此说明的一种分离法来获取该评价。
在一个实施方案中，该肝素制剂是一种可商购的未分级肝素制剂，例如在此说明的一种可商购的未分级肝素制剂。在一个实施方案中，该肝素制剂是一种LMWH制剂，例如在此说明的一种LMWH制剂。
在一方面，本披露以分析一种肝素制剂(例如，一种未分级肝素制剂或低分子量肝素(LMWH)制剂)的方法为特征，包括：
提供(例如获取)指示一个或多个结构标记的缺失、存在或量值的数值，这种或这些结构与一种肝素制剂的1H1D-NMR谱图中N-乙酰基区域内的一个峰相关，并且
将该数值与一个参比标准(例如由在此说明的一种方法所确认的参比标准)相比较，以确定该肝素制剂是否具有确认用于制备该肝素样品的方法的一个结构标记，其中该结构标记的存在表明该肝素样品由一种方法制备，并且该结构标记的缺失表明该肝素样品不由该方法制备；并且
任选地，如果该肝素制剂由该方法制备，则做出关于该肝素制剂的一个决定或步骤，例如将该肝素制剂分类、选择、接受或丢弃、放行或保留、加工成一种药物产品、装运、移至新地方、配制、标记、包装、商业化、销售或供出售。
在一个实施方案中，记录该决定或步骤。
在一个实施方案中，该结构标记是使用一种分离法，例如在此说 明的一种分离法确定的。
在一个实施方案中，该肝素制剂是一种可商购的未分级肝素制剂，例如在此说明的一种可商购的未分级肝素制剂。在一个实施方案中，该肝素制剂是一种LMWH制剂，例如在此说明的一种LMWH制剂。
一方面，本披露以一个数据库为特征，该数据库将一个结构标记的存在或量值与一种方法相关联，该结构标记与1H1D-NMR谱图中N-乙酰基区域内的一个峰(例如，图9中2.08ppm处的一个峰和/或图1中2.10ppm处的一个峰)相关联，该方法用于制备该肝素制剂(例如，一种包括氧化和/或用酸处理的方法)。
在一个实施方案中，该结构标记与N-乙酰氨基葡萄糖上或其附近的修饰相关联。在一个实施方案中，该结构标记与一种肝素制剂中在链的还原端的N-乙酰氨基葡萄糖残基上或其附近的修饰相关联。
在一个实施方案中，该结构标记是一个或多个：
其中在结构B中，X＝H或SO3。
在附图以及以下说明书中给出了本发明的一个或多个实施方案的细节。从本说明书和附图，并且从权利要求书中应当清楚本发明的其他特征、目标和优点。
详细说明
首先简要说明一下附图。
图1描述了一种未分级肝素钠(N-酰基区域)的1H1D-质子NMR 谱图。图1A描述了一种未分级肝素钠样品的谱图，该样品含有一种超硫酸化硫酸软骨素标准品。图1B描述了未加入该标准品的未分级肝素钠的谱图。标记星号的峰代表2.10ppm的峰。
图2描述了采用过程A(该过程不包括氧化加工步骤)生成的一种未分级肝素钠的展开1H1D-NMR谱图。
图3描述了采用过程B(该过程包括一个氧化加工步骤)当2.10ppm处信号的存在下生成的一种未分级肝素钠的展开1H1D-NMR谱图。
图4描述了一种经不同氧化操作处理的未分级肝素钠的展开1H1D-NMR谱图。图4A描述了一种用过氧化氢处理的未分级肝素钠的谱图；图4B描述了一种用高锰酸钾处理的未分级肝素制剂的谱图。
图5描述了一种LMWH制剂的中间体在用高碘酸钠处理之前和之后的展开1H1D-NMR谱图。图5A描述了一种起始LMWH(中间体1)的谱图，该物质未经历氧化过程。图5B描述了用高碘酸钠氧化后的中间体1(即中间体2)的谱图。
图6描述了一种猪肠硫酸乙酰肝素制剂以及一种富含还原端N-乙酰氨基葡萄糖残基的猪肠硫酸肝素在用高锰酸钾处理之前和之后的展开的1H1D-NMR谱图。图6A描述了一种猪肠硫酸乙酰肝素(HS)制剂的谱图。图6B描述了用高锰酸钾氧化后该HS制剂的谱图。图6C描述了一种富含还原端N-乙酰氨基葡萄糖残基的猪肠硫酸肝素(PI-HSNAc)的谱图。图6D描述了用高锰酸钾氧化后该富含还原端N-乙酰氨基葡萄糖残基的猪肠硫酸肝素(PI-HSNAcox)的谱图。
图7描述了一种在链还原端具有高GlcNAc百分比的LMWH在用高锰酸钾处理之前和之后的展开的1H1D-NMR谱图。图7A描述了该起始LMWH的谱图。图7B描述了用高锰酸钾氧化后的LMWH的谱图。 在该样品中，2.10ppm处的信号被标记，并且被大大增加。
图8描述了一种在链还原端具有高GlcNAc百分比的硫酸乙酰肝素制剂在用高锰酸钾氧化之前和之后的2D-NMR(HSQC)谱图。图8B描述了一种起始PI-HSNAc制剂的2D-NMR(HSQC)谱图。由还原端GlcNAc引起的信号被标记。图8D描述了该硫酸肝素制剂(PI-HSNAcox)在用高锰酸钾氧化后的2D-NMR(HSQC)谱图。
图9描述了一种经历高碘酸盐氧化以及随后酸处理的肝素制剂的展开1H1D-NMR谱图。
图9描述了PI-HSNAcox的2D-NMR谱图。图10A是PI-HSNAcox的HSQC-DEPT谱图。框中显示了CH交叉峰。4.37/58.9ppm处的交叉峰被高亮显示。图10B是PI-HSNAcox的HMBC谱图。显示了质子4.37ppm与一个羰基基团的长程相关性。
图11描述了PI-HSNAcox的1D-NMR谱图。图11A描述了PI-HSNAcox的1D-NMR谱图。图11B描述了PI-HSNAcox在用硼氘化钠处理以及中和处理后的谱图。
图12描述了PI-HSNAcox的2D-NMR谱图。图12A描述了PI-HSNAcox的HSQC-TOSCY谱图，其中混合时间是20ms。图12A描述了PI-HSNAcox的HSQC-TOSCY谱图，其中混合时间是90ms。
图13描述了PI-HSNAcox的HSQC谱图。用于氧化态残基的NMR归属表明接近相对等高线。
图14描述了含有四个硫酸根和一个乙酰基(Dp4、S4、Aclox)的已氧化四糖类的负离子ESI-MS谱图。插入物显示了已氧化四糖的解析良好的同位素峰。
图15描述了一种未分级肝素制剂的2D-NMR谱图。图15A描述了一种尚未被氧化的未分级肝素制剂的谱图。图15B描述了用KMnO4处 理的未分级肝素制剂。GlcNAcα还原端的H1/C1信号消失，而4.37/58.9处和3.88/81.8处的信号出现(见被圈出的信号)。由于链接区域而出现的信号(在A中用*表示)也消失。
图16描述了一个反应方案，该方案概括了由于在链的还原端出现高锰酸钾氧化而生成的结构A(N-乙酰基氨基葡萄糖酸；其中X＝H或SO3)的形成。可能的是，结构A(如果X＝H)进一步氧化可以导致形成一种二羧酸(结构B)。
详细说明
本披露至少部分建立于以下发现：一种肝素制剂的1H1D-NMR谱图中N-乙酰基区域内的峰与反映用于制备该肝素制剂的特征性结构标记相关联。例如，在未分级肝素的1H1D-NMR谱图中2.10ppm处的峰的存在表示一个特征性结构标记，它反映出未分级肝素生产过程中的一个氧化加工步骤。作为另一个实例，与1H1D-NMR谱图中2.08ppm处的一个峰相关联的一个结构标记的量值增加表明一种已经过酸处理的已氧化肝素制剂。因此，在一些实施方案中，在此说明的一种方法可以包括评价与一种肝素制剂的1H1D-NMR谱图中N-乙酰基区域内的峰相关联的一个结构标记的缺失、存在或量值。N-乙酰基区域是指1H1D-NMR谱图中从大约1.8ppm至2.20ppm，例如1.9ppm至2.15ppm、2.0ppm至2.12ppm、2.02ppm至2.10ppm的一个区域。存在意味着可以检测到一个结构标记。量值是指例如％按重量计或按数字计的量值。
在一些实施方案中，可以使用在此说明的一种方法来确定一种肝素制剂(例如一种未分级肝素或一种低分子量类肝素(LMWH)制剂)是否存在着色风险。一些肝素制剂的贮存期限有限，至少部分是因为 贮存期间该制剂的颜色发生变化。短语“着色”是指在加速稳定度试验中大于0.2个吸光度单位，例如在美国公开号：20080318328中说明的热量分析。
如在此所使用的，“获取一个数值”是指导致获取该数值的任何过程。在一个实施方案中，获取一个数值包括使一个样品经受一个过程，该过程导致该样品或另一种物质(例如，分析时使用的一种分析试剂或装置)的物理变化。这些方法包括分析方法，例如包括以下各项中一个或多个的步骤：将一种物质，例如一种分析物或它的一个片段或其他衍生物从另一种物质中分离；将一种分析物或它的片段或其他衍生物与另一种物质(例如，一种缓冲液、溶剂或试剂)结合；或改变一种分析物的结构或它的其他衍生物的一个片段的结构，例如通过在该分析物的第一原子与第二原子之间断裂或形成一个共价键或非共价键。典型的分析方法包括高效液相色谱法(HPLC)、核磁共振(NMR)、毛细管电泳(CE)和质谱法(如基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱技术(MALDI-MS)、电喷雾电离质谱法(ES1-MS))，和快速蛋白液相色谱法(FPLC)。
在一个实施方案中，使用该方法的团队进行了该过程。如在此所使用的，“直接获取”是指一个过程，其中使用该方法的团队进行该过程。在一个实施方案中，使用该方法的团队从另一个团队接收数值。如在此所使用的，“间接获取”是指一个过程，其中使用该方法的团队从另一个团队接收数值。通常，即使在以间接获取为特征的实施方案中，某些团队已经将样品经历如以上所说明的一个过程，导致该样品或另一种物质中的物理变化。在一个实施方案中，使用该评价方法的一个团队指导另一个团队进行该过程，并且例如使用该方法的一个团队接收数值。
肝素制剂
如在此所使用的，肝素制剂是一种含有肝素的制剂或一种由肝素衍生的制剂，并且因此包括未分级肝素肝素、低分子量肝素(LMWH)、超低分子量类肝素(ULMWH)等。
如在此所使用的，术语“未分级肝素(UFH)”是从猪肠粘膜中纯化的肝素。UFH可以用作，例如在形成LMWH过程中的一种起始材料。未分级肝素可由以下供应商购获得，包括Abbott、Organon、Riker、Invenex、Baxter、Calbiochem、Sigma或Upjohn。在一些实施方案中，该肝素通过一个包括氧化步骤的过程制备。该氧化步骤可以包括使用以下各项中的至少一个：高锰酸盐过氧化物、高碘酸盐、氯、二氧化氯及它们的组合。例如，高锰酸盐可以是高锰酸钾、高锰酸钠、高锰酸季铵盐、过氧化氢中的一个或多个。优选地，该氧化步骤包括使用一种高锰酸盐。在一些实施方案中，该肝素通过一个包括还原步骤(例如像用硼氢化钠、氢化铝锂或它们的组合处理)的过程制备。
该肝素制剂还可以是一种LMWH制剂。LMWH制剂的实例包括但不限于：依诺肝素制剂(LovenoxTM或ClexaneTM)；达肝素制剂(FragminTM)；舍托肝素制剂(SandoparinTM或Embollex)；阿地肝素制剂(NormifloTM)；那屈肝素制剂(FraxiparinTM)；帕肝素制剂(FluxumTM)；瑞肝素制剂(ClivarinTM)；亭扎肝素制剂(InnohepTM或LogiparinTM)、磺达肝素制剂(ArixtraTM)或M118-REH制剂。在一些实施方案中，该LWMH制剂可以是由通过以下方法中的一个或多个而制备的LMWH制剂：使用溶剂分级分离(法国专利号：2,440,376、美国专利号：4,692,435)；使用一种阴离子树脂分级分离(法国专利号：2,453,875)；凝胶过滤(Barrowcliffe(1977)Thromb.Res.12：27-36))； 亲和色谱法(美国专利号：4,401,758)；通过一种化学试剂控制的解聚，该化学试剂包括但不限于亚硝酸(欧洲专利号：014184B1、欧洲专利号：037319B1、欧洲专利号：076279B1、欧洲专利号：623629B1、法国专利号：2,503，714、美国专利号：4,804,652和PCT公开号：WO8I/03276)、从肝素酯中的β-消除(欧洲专利号：040144B1、美国专利号：5,389,618)、高碘酸盐(EP287477)、硼氢化钠(EP347588、EP380943)、抗坏血酸(美国专利号：4,533,549)、过氧化氢(美国专利号：4,629,699、美国专利号：4,791，195)、来自肝素季铵盐的氢氧化季铵(美国专利号：4,981,955)、氢氧化碱金属(欧洲专利号：380943、欧洲专利号：347588)、通过一种酶催化路径(欧洲专利号：064452、美国专利号：4,396,762、欧洲专利号：244235、欧洲专利号：244236、美国专利号：4,826,827、美国专利号：3,766,167)、通过照射(欧洲专利号：269981)，以及其他方法或多种方法的组合，例如美国专利号：4,303,651、美国专利号：4,757,057、美国公开号：2007/287683、PCT公开号：WO2009/059284和PCT公开号：WO2009/059283中所说明的那些。
在一些实施方案中，可以选择一种肝素制剂，例如一种未分级肝素制剂用于根据一种结构标记的缺失、存在或量值而进一步加工，该结构标记表明用于制备该肝素制剂的方法。例如，可以选择一种未分级肝素制剂用于进一步加工，例如，加工成一种LMWH制剂。可以选择该未分级肝素制剂用于进一步加工，例如通过以上所说明的方法中的一个或多个。
数据库
本披露还以一个数据库为特征，该数据库将与1H1D-NMR谱图中 N-乙酰基区域内的一个峰(例如，图9中2.08ppm处的峰和/或图1中2.10ppm处的峰)相关联的结构标记的存在或量值与一种用来制备该肝素制剂的方法(例如，一个包括氧化或氧化后用酸处理的方法)相关联，并且以这种数据库的用途(例如用于在此说明的一个方法)为特征。术语“数据库”是指一个数据集合。典型地，该数据库进行安排，这样它的内容可以很容易地被存取、管理和更新。在一个实施方案中，将该数据库进行配置或管理，以确保其完整性和质量，从而将在此说明的记录之外内容最小化并且允许受控存取。将该数据库呈现或记录在一种媒介上。该媒介可以是，例如一种传统纸媒介或呈现打印或手写符号的其他媒介，这些符合可以直接(例如，不借助计算机)被人类使用。这种数据库可以作为一组打印表格或卡片式目录存在，这些表格或目录例如显示了该结构标记与用于生产该肝素制剂的方法的关系。该数据库还可以以电子形式或其他计算机可读的形式呈现或记录。这些实施方案的范围可以从简单的电子数据表到更复杂的实施方案。该数据库无需置于单一单元的媒介上，例如置于单个表格或书中，或置于单个计算机或网络上数据库例如可将以上说明的一种传统媒介与一种计算机可读的媒介相结合。通常，该数据库会含有一个记录集合，其中各项记录将一个结构标记与一种生产方法通过一种相关函数联系起来。该数据库可以按照多种方式组织，例如作为一种关系型数据库。通常，该数据库以某种形式存在，该形式可通过对各数据库特异的技术检索特定的信息或记录。计算机数据库通常是存储在一台或多台计算机中的记录的结构化集合，这样一个程序可以查阅该记录集以回应查询。
参比值和标准品
参比标准，举例来说，可以是从一种参比肝素制剂(例如一种可商购的肝素制剂或一种由特殊方法制备的肝素制剂)确定的数值。例如，参比标准可以是用于表示存在于一种制剂(如一种参比肝素制剂)中的一个结构标记的数值。该参比标准可以是数字的或非数字的，例如，它可以是一个定性数值(例如是或否，或在一个预选的检测水平上存在或不存在)，或图解或图示的。该参比标准也可以是用于表示存在于一个样品中的多个结构标记的数值。例如，当通过在此说明的分离法分析时，该参比标准可以是存在于一种肝素制剂中的结构图(例如，与1H1D-NMR谱图中N-乙酰基区域内的峰相关联的结构)。该参比标准也可以是一种放行标准(放行标准是一个应该予以满足以便进行许商业销售某产品的标准)或生产标准，例如，由某团体(例如FDA)对一种肝素或LMWH强制要求的标准。
结构标记的检测
与1H1D-NMR谱图中N-乙酰基区域内的一个峰相关联的结构标记的缺失、存在或量值可通过允许在一个肝素制剂中确认该结构标记的任一分离法来确定。例如，可以使用以下分离法中的一个或多个：高效液相色谱法(HPLC)、核磁共振(NMR)、毛细管电泳(CE)、质谱法(如基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱技术(MALDI-MS)、电喷雾电离质谱法(ESI-MS))和快速蛋白液相色谱法(FPLC)中。
在一个实施方案中，结构标记的缺失、存在或量值是使用1D-NMR或2D-NMR确定的。可以使用同核(例如，COSY、TOCSY、NOESY和ROESY)和/或异核(例如，HSQC、HSQC-DEPT、HMQC-COSY、HSQC-TOSCY和HMBC)光谱学进行2D-NMR。很多附图中描述的峰是使用1H1D-NMR获得的。1H1D-NMR的通用操作如 下：将一个未分级肝素样品(大约20mg)溶解在0.7ml的D2O(氧化氘，99.96％原子D)中，并转移到5mm的NMR管中。在装配着5mm三谐振探针的600MHz Varian VNMRS光谱仪上获取质子(1H)1D-NMR谱图。在25℃下获得数据，其中水信号预饱和，16-32次扫描，并且延迟10秒。在14ppm至-2ppm光谱窗口下，收集NMR谱图。使用一种添加的内标物(0.1％w/v TSP；设置在0.00ppm处的甲基质子)或通过将肝素的主要N-乙酰基甲基质子信号设置在2.045ppm来校准样品。
所做的初步实验证实，2.10ppm处的峰不是超硫酸化硫酸软骨素(OSCS)，一种有时在肝素中发现的污染物。结果表明，OSCS显示出2.15ppm处的一个主特征峰，该主特征峰与2.10ppm处的峰分辨良好(图1)。
NMR还用于分析从不同来源获得的未分级肝素制剂，以便了解2.10ppm处的峰的可能起源来源。图2显示了一种由过程A制备且不包含2.10ppm处信号的未分级肝素制剂，而图3显示了一种由另一种过程(过程B)制备且不包含2.10ppm处信号的未分级肝素制剂。这表明，不同的加工条件可以对2.10ppm处的峰的观察结果产生影响。图3中分析的未分级肝素制剂经历了一个氧化加工步骤(过程B)，而图2中分析的未分级肝素没有经历氧化加工步骤(过程A)。这样，由于在生产过程中肝素已经经历氧化过程，所以出现了在未分级肝素的1H1D-NMR中观察的2.10ppm的峰。这种氧化加工修改了N-乙酰氨基葡萄糖周围的化学环境，因此产生了2.10ppm的峰。
根据这些最初的观察，评价了经历过氧化过程的低分子量肝素(LMWH)制剂。由用于制备一种LMWH制剂的过程的中间体获得的 1H1D-NMR数据表明，使用高碘酸钠的氧化生成了一种在2.10ppm区 域内显示信号出现的LMWH制剂。在图5中，上图显示起始LMWH样品(中间体1，未经历氧化且在2.10ppm没有可检测到的信号)。该LMWH中间体经历了使用高碘酸钠的氧化过程。氧化后，所得的LMWH制剂(中间体2，图5的下部)显示在2.09ppm和2.10ppm存在信号。这些信号的存在可能是由于经高碘酸盐处理而氧化的肝素中与糖醛酸残基毗邻的氨基葡萄糖残基上的N-乙酰基基团的环境方面的变化。还值得注意的是，像高锰酸盐这样的试剂遵循类似的氧化机理，并且在纯化过程中高锰酸盐经常用于肝素氧化过程。
进行进一步实验，以确定当该残基存在于该链的内部、或在该链的还原端时，是否发生N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基上或其附近的修改。为了测试这一点，将一种猪肠硫酸乙酰肝素制剂(具有很多含内部GlcNAc(PI-HS)的链)经历高锰酸钾(PI-HSox)氧化。同时，制备了一种富含还原端N-乙酰氨基葡萄糖残基(PI-HSNAc)的猪肠硫酸乙酰肝素样品，并且使其经历与猪肠硫酸肝素相同的高锰酸钾(PI-HSNAcox)氧化。
此外，使通过酶催化消化而制备的低分子量肝素制剂经历高锰酸盐氧化，该酶催化消化在样品中链还原端具有高百分比的GlcNAc。两种制剂均经历相同的氧化条件。
这些实验的结果显示在图6和图7中。硫酸乙酰肝素制剂的高锰酸盐氧化引起了2.10ppm处峰的非常小的增大(图6B)。相比之下，富含还原端N-乙酰氨基葡萄糖的硫酸肝素制剂被氧化，在2.10ppm有强烈的信号(图6D)，表明该氧化性物质对肝素链还原端位置上的N-乙酰氨基葡萄糖具有显著影响。此外，当在还原端具有高百分比GlcNAc的LMWH制剂被氧化时，2.10ppm处的峰显著增大(图7)。这些结果表明，在2.10ppm产生峰的结构是因为在该链的还原端或其 附近的N-乙酰氨基葡萄糖。
这些实验显示，在未分级肝素的1H1D-NMR谱图中N-乙酰基区域内的信号可以指示在肝素生产过程中经历的不同加工步骤。
在PI-HSNAc和PI-HSNAcox中存在还原性α和p N-乙酰氨基葡萄糖残基可通过多组实验(例如COSY、TOCSY和HSQC)证实。HSQC谱图显示，氧化后不再观察到由于还原端的GlcNAc而引起的信号(图8)。PI-HSNAc(图8B)和PI-HSNAcox(图8D)的HSQC谱图之间的比较显示，由于还原端N-乙酰氨基葡萄糖残基而出现的还原性α和β端基异构信号在高锰酸钾处理后消失，同时由于内部N-乙酰氨基葡萄糖(5.4-5.3/100.3-98.8ppm)而出现的峰在强度上没有增加。
相应地，高锰酸钾氧化后，在4.37/58.9ppm和3.88/81.8ppm处出现了两个显著的交叉峰(图8C)。HSQC-DEPT实验将4.37/58.9ppm处的峰归为一个-CH残基(图10A)。在10％重水中记录的COSY实验显示了7.99ppm处的一个酰胺质子(来自N-乙酰基)与4.37ppm处的峰之间的交叉峰，而在10％重水中获取的NOESY实验将7.99ppm处的酰胺质子与2.10ppm处的CH3信号相关联。这些数据表明，4.37ppm处的峰是由于已氧化的N-乙酰氨基葡萄糖残基的H2而产生的。此外，HMBC分析显示出4.37/58.9ppm处的质子和一个羰基基团之间的长程关联(图10B)。为了确定该羰基基团属于醛基基团还是属于羧基基团，进行了两个实验。首先，将样品酸化到pH4.1，并且记录HSQC实验。该实验显示，受到该溶液的pH的影响，4.37/58.9ppm处的交叉峰位移到4.47/58.3ppm，与邻近羧酸基团的一个CH基团一致。此外，在4℃下，使用硼氘化钠(10％w/w)处理PI-HSNAcox60分钟，并且在中和后，使用1HNMR分析(图11)。2.10ppm处信号的强度在还原后没有降低，表明这种已氧化的N-乙酰氨基葡萄糖残基的甲基邻近于 羧酸基团。而且，COSY和TOCSY实验没有显示该峰(4.37ppm)与存在于该端基异构区域内的信号之间存在任何相关性，这表明C1不具有相应的质子。该观察结果支持将C1归属为一个羧酸基团。
HSQC-TOCSY实验显示了4.37/58.9ppm处的峰与4.21/73.6ppm、3.88/81.8ppm和4.12/72.8ppm处的信号之间额外的相关性(图12)。这些交叉峰的归属通过分析不同混合时间记录的HMQC-COSY和HSQC-TOCSY实验而进行，并且记录在以下表1和图13中。在所有用高锰酸钾处理的样品的HSQC谱图中，还在3.80/64.4ppm和3.72/64.4ppm处观察到了另外的交叉峰。HSQC-DEPT谱图表明这些信号是由于CH2部分而引起的(图10A)。由于与其他肝素信号的严重重叠，3.80ppm和3.72ppm处的峰与这种已氧化残基的其他质子之间的相关性不能通过COSY和TOCSY实验清楚地确认。然而，3.80/64.4ppm处和3.72/64.4ppm处的HSQC峰临近6-O-脱硫N-乙酰氨基葡萄糖残基的H6,6’/C6，以及在用高锰酸钾处理后这些信号的出现，表明这些峰应归属为6-O-脱硫N-乙酰氨基葡萄糖酸的H6,6’/C6。通过高锰酸钾处理而产生的残基化学位移归属与4-取代N-乙酰氨基葡萄糖酸一致(Uchiyama et a1.(1990)J.Bio1.Chem.，265：7753-7759)。
表1.已氧化的还原端(N-乙酰氨基葡萄糖酸)的NMR归属
*这些化学位移对应于在6-O位置上的非硫酸盐化的残基
根据这些结果，已经确定了两种可以产生2.10ppm的峰的可能结构。这些结构是：
其中，在结构B中，X＝H或SO3。
质谱分析法可用作一种正交分析技术，支持这种结构归属。还原端的N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖酸之间的质量差异预计是+16Da。.PI-HSNAcox样品使用肝素酶I进行消化，并通过明胶渗透色谱法继之以质谱法进行分析。
结果显示，一些乙酰化的种类其质量比相应的非氧化N-乙酰氨基葡萄糖种类(补充图5)高16Da。这一观察结果进一步证实我们对在还原端N-乙酰氨基葡萄糖的C1处存在的已氧化-COOH基团的权利要求。
最后，为了证实我们对该模型化合物(PI-HSNAc)的观察是否可以延伸至未分级肝素，将UFH第2批经过高锰酸钾氧化。在未分级肝素样品中，还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的量值通常很低(低于总氨基葡萄糖含量的1%，如通过NMR估计)。因此，通过足够次数的扫描而获取的HSQC实验在5.20/93.4ppm检测到一个小峰，该峰属于α还原N-乙酰氨基葡萄糖(图6A)。.UFH批次2的高锰酸钾氧化导致α还原性N-乙酰氨基葡萄糖信号消失以及在4.37/58.9ppm和3.88/81.8ppm处的交叉峰的出现(图15)。这一结果显示，与PI-HSNAc的情况相似，未分级肝素的高锰酸钾氧化导致在该链的还原端形成一个N-乙酰氨基葡萄糖酸残基。
还进行实验显示，N-乙酰基区域内的某些峰可以是由于不同的肝素化学加工过程引起的。例如，高碘酸盐氧化的肝素提送酸处理。使用一种酸对一种已氧化的肝素制剂进行处理导致2.08ppm处的峰增加(图9)。2.10ppm区域内还观察到一些小峰。
以上这些实验显示，肝素1H1D-NMR谱图中2.10ppm处的峰不是OSCS，而是一种特征性结构标记，该结构标记反映了未分级肝素制备过程的一个氧化加工步骤。根据以上所说的实验，所提供的机理可能导致图16的结构A和B。氧化剂(如KMnO4)与还原性N-乙酰氨基葡萄糖部分反应以便在肝素链的还原端产生一种改性的N-乙酰氨基葡萄糖酸(结构A)。在这种情况下，HSQC谱图中4.37ppm/58.9ppm处新形成的信号可以归属为在新生成的N-乙酰氨基葡萄糖酸的C2位置上的质子。还可能的是，此结构可以发生进一步氧化，导致形成一致二元羧酸(结构B)，但是目前没有提供此结构的证实。这一方案(图16)还解释了为什么在1H-NMR图中2.10ppm处的信号的出现取决于N-乙酰氨基葡萄糖的还原端的存在。最后，由于这些结构的形成是由于氧化条件，我们预期，除高锰酸钾以外的其他氧化条件也可以潜在地导致这些结构的形成。
总之，我们发现，氧化条件导致在肝素链的还原端N-乙酰氨基葡萄糖残基转化为一种N-乙酰氨基葡萄糖酸，该N-乙酰氨基葡萄糖酸在肝素1H-NMR谱图中2.10ppm处产生一个特征性信号。因此，此信号并不因为存在于肝素中的杂质或污染物引起的，而是代表肝素链本身的一部分。
在此引用的这些参考文献、专利和专利申请通过引用结合在此。根据之前的详细说明，这些方法和产品的改变和变更对于本领域的普通技术人员应当是显而易见的，并且旨在涵盖于所附权利要求书的范围之内。
Claims (27)
1.确认一个包括氧化或氧化后用一种酸进行处理的过程是否用于制备一个肝素样品的方法，包括：
确定与图9中2.08 ppm处的峰和/或图1中2.10 ppm处的峰相关联的一种结构标记在一个肝素样品中的缺失或存在，其中该结构标记的存在表明该肝素样品由一种方法制备，而该结构标记的缺失表明该肝素样品不由该方法制备；并且
如果该肝素样品由该方法制备，则做出关于该肝素样品的一个决定或步骤，其中该决定或步骤是将该肝素制剂分类、选择、接受、丢弃、放行、保留、加工成一种药物产品、装运、配制、标记、包装、商业化、销售或供出售中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的方法，其中该肝素样品是一个未分级肝素样品或低分子量肝素（LMWH）样品。
3.如权利要求1所述的方法，其中该决定或步骤是分类、选择、接受、放行、加工成一种药物产品、装运、配制、标记、包装、商业化、销售或供出售。
4.如权利要求1所述的方法，其中该肝素样品是一个未分级肝素样品，并且该决定或步骤包括选择该未分级肝素样品用于进一步加工，以生产一个LMWH样品。
5.如权利要求1所述的方法，其中该肝素样品是一个LMWH样品，并且该决定或步骤是将该LMWH样品进行选择、接受、放行、加工成一种药物产品、装运、配制、标记、包装、商业化、销售或供出售。
6.如权利要求1所述的方法，其中该方法进一步包括选择该肝素样品并且加工该肝素样品，以生产一种药物产品。
7.如权利要求1所述的方法，其中该肝素样品是一个未分级肝素样品，并且该方法进一步包括将该未分级肝素样品解聚，以生产一个LMWH样品。
8.如权利要求1所述的方法，其中如果该结构标记存在，则该方法进一步包括确定在该肝素样品中存在的该结构标记的量值。
9.如权利要求1所述的方法，其中确定了与图9中2.08 ppm处的峰相关联的结构标记的缺失或存在，以及与图1中2.10 ppm处的峰相关联的结构标记的缺失或存在。
10.如权利要求9所述的方法，其中与图1中2.10 ppm处的峰相关联的结构标记的存在表明该肝素样品由一种方法制备，该方法包括氧化。
11.如权利要求1所述的方法，其中与图9中2.08 ppm处的峰相关联的结构标记的存在表明该肝素样品由一种方法制备，该方法包括氧化后用一种酸进行处理。
12.如权利要求1所述的方法，其中该结构标记的缺失或存在是使用核磁共振（NMR）确定的。
13.如权利要求1所述的方法，其中该结构标记与N-乙酰氨基葡萄糖上或其附近的修饰相关联。
14.如权利要求1所述的方法，其中该结构标记与一种肝素制剂中在链的还原端的N-乙酰氨基葡萄糖上或其附近的修饰相关联。
15.如权利要求1所述的方法，其中该结构标记是一个或多个以下的结构：
，
其中在结构B中，X = H或SO3。
16.确认一个包括氧化或氧化后用一种酸进行处理的过程是否用于制备一个肝素样品的一种方法，包括：
通过一种分离法获得对一种结构标记的缺失或存在的评价，该结构标记与图9中2.08ppm处的峰和/或图1中2.10 ppm处的峰相关联；
确定该肝素样品是否由一种方法制备，其中该结构标记的存在表明该肝素样品由该方法制备，而该结构标记的缺失表明该肝素样品不由该方法制备；并且
如果该肝素样品由该方法制备，则做出关于该肝素样品的一个决定或步骤，其中该决定或步骤包括将该肝素样品分类、选择、接受、丢弃、放行、保留、加工成一种药物产品、装运、移至新地方、配制、标记、包装、商业化、销售或供出售中的一种或多种。
17.如权利要求16所述的方法，其中该肝素样品是一个未分级肝素样品或低分子量肝素（LMWH）样品。
18.确认一个包括氧化或氧化后用一种酸进行处理的过程是否用于制备一个肝素样品的一种方法，包括：
通过一种分离法获得对一个结构标记的缺失或存在的评价，该结构标记与图9中2.08 ppm处的峰和/或图1中2.10 ppm处的峰相关联；
确定该肝素样品是否由一种方法制备，其中该结构标记的存在表明该肝素样品由该方法制备，而该结构标记的缺失表明该肝素样品不由该方法制备；并且
如果该肝素样品不由该方法制备，则做出关于该肝素样品的一个决定或步骤，其中该决定或步骤包括将该肝素样品分类、选择、接受、丢弃、放行、保留、加工成一种药物产品、装运、移至新地方、配制、标记、包装、商业化、销售或供出售中的一种或多种。
19.如权利要求18所述的方法，其中该决定或步骤是丢弃或保留该肝素样品。
20.确认一个包括氧化或氧化后用一种酸进行处理的过程是否用于制备一个肝素样品的一种方法，包括：
使用一种分离法来确定与图9中2.08 ppm处的峰和/或图1中2.10 ppm处的峰相关联的结构标记在一种肝素样品中的缺失或存在；并且
确定该肝素样品是否由一种方法制备，其中该结构标记的存在表明该肝素样品由该方法制备，而该结构标记的缺失表明该肝素样品不由该方法制备。
21.评价一个肝素样品是否存在着色风险的一种方法，包括：
确定与图1中2.10 ppm处的峰相关联的一种结构标记在一个肝素样品中的缺失或存在，其中该结构标记的存在表明该肝素样品不存在着色风险，而该结构标记的缺失表明该肝素样品存在着色风险；并且
如果该肝素样品不存在着色风险，则做出关于该肝素样品的一个决定或步骤，其中该决定或步骤包括将该肝素样品分类、选择、接受、丢弃、放行、保留、加工成一种药物产品、装运、移至新地方、配制、标记、包装、商业化、销售或供出售中的一种或多种。
22.确认一个包括氧化或氧化后用一种酸进行处理的过程是否用于制备一个肝素样品的一种方法，包括：
确定与1H 1D-NMR谱图中N-乙酰基区域内的一个峰相关联的一个结构标记在一个肝素样品中的缺失或存在，其中该结构标记的存在表明该肝素样品由一种方法制备，而该结构标记的缺失表明该肝素样品不由该方法制备，并且
如果该肝素样品由此方法制备，则做出关于该肝素样品的一个决定或步骤，其中该决定或步骤包括将该肝素样品分类、选择、接受、丢弃、放行、保留、加工成一种药物产品、装运、移至新地方、配制、标记、包装、商业化、销售或供出售中的一种或多种。
23.如权利要求21所述的方法，该结构标记的缺失或存在是使用核磁共振（NMR）确定的。
24.如权利要求23所述的方法，其中该结构标记的缺失或存在是使用1D-核磁共振（NMR）确定的。
25.确认一种结构标记的方法，该结构标记指示了用于制备一个肝素样品的一种包括氧化或氧化后用一种酸进行处理的方法，包括：
获取对一种或多种结构标记的评价，这种或这些结构标记与通过第一方法制备的第一肝素样品的1H 1D-NMR谱图中N-乙酰基区域内的一个峰相关联；
获取对一种或多种结构标记的评价，这种或这些结构标记与通过不同于第一方法的第二方法制备的一个第二肝素样品的1H 1D-NMR谱图中N-乙酰基区域内的一个峰相关联；
确认一种结构标记，该结构标记与存在于该第一肝素样品中、以及缺失或以一个不同的量值存在于该第二肝素样品中的第一肝素样品的1H 1D-NMR谱图中N-乙酰基区域内的一个峰相关联；并且
确认与第一肝素样品的1H 1D-NMR谱图中N-乙酰基区域内的一个峰相关联的结构标记，或者与第一肝素样品的1H 1D-NMR谱图中N-乙酰基区域内的一个峰相关联的结构标记的量值，作为用于确认由第一方法制备的一个肝素样品的参比标准。
26.如权利要求25所述的方法，其中将该参比标准记录到，例如一个数据库中。
27.分析一个肝素样品的一种方法，包括：
获取对一种或多种结构标记的评价，这种或这些结构标记与一个肝素样品的1H 1D-NMR谱图中N-乙酰基区域内的一个峰相关联，并且
将该评价与一个参比标准相比较，以确定该肝素样品是否具有确认用于制备该肝素样品的方法的结构标记，其中该结构标记的存在表明该肝素样品由一种包括氧化或氧化后用一种酸进行处理的方法制备，而该结构标记的缺失表明该肝素样品不由该包括氧化或氧化后用一种酸进行处理的方法制备；并且
任选地，如果该肝素制剂由该方法制备，则做出关于该肝素制剂的一个决定或步骤，其中该决定或步骤包括将该肝素样品分类、选择、接受、丢弃、放行、保留、加工成一种药物产品、装运、移至新地方、配制、标记、包装、商业化、销售或供出售中的一种或多种。
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