CN102906573B - 独立式生物检测装置、方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供独立式全自动生物检测装置，包括：机壳；设置于所述机壳中的液分平台，其包括可控-活动试剂分配系统；设置于所述机壳中的试剂供给部件；气分平台，其可拆卸地设置于机壳中与液分平台共用的空间内，可拆卸地连接至流体传输层和多个槽，其中待引入的所述流体传输层、所述槽和测试样品设置于所述机壳中与液分平台分开的空间内；气动供给系统，其在机壳中与液分平台分开的空间内可拆卸地连接至气分平台；以及设置于所述机壳中的控制系统，其连接至至少一个所述液分平台和所述气动供给系统。

Description

独立式生物检测装置、方法和应用
交叉引用的相关申请
本申请要求下列美国临时专利申请的优先权：2010年5月19日递交的申请No.61/346,202；2010年6月17日递交的申请No.61/355,773；2010年10月21日递交的申请No.61/405,339；2010年2月23日递交的申请No.61/307,186；2010年2月23日递交的申请No.61/307,121；2010年10月14日递交的申请No.61/393,237；2010年8月17日递交的申请No.61/374,302；以及2010年8月12日递交的美国申请No.12/855058，该申请为2005年10月3日递交的美国申请No.11/242,694的继续申请，其为2004年10月13日递交的美国申请No.10/964,216的部分继续申请；2007年1月5日递交的美国申请No.11/650,006，其要求2006年1月19日递交的美国临时申请No.60/760,552的优先权；2008年10月10日递交的美国申请No.12/249,872，其要求2007年10月12日递交的美国临时申请No.60/979,515的优先权；所有上述申请的内容以引用的方式全文并入于此。
发明背景
1.发明领域
本发明实施方案总体上涉及微流体学领域，更具体地涉及独立式、基于微流体的生物检测装置及其相应的方法和应用。
2.技术背景
生化检测通常用于研究、临床、环境和工业设置以测定或定量某些基因序列、抗原、疾病和病原体的存在或数量。所述检测通常用于确定存在于宿主生物体或样本中的生物体包括寄生虫、真菌、细菌和病毒。在某些条件下检测可提供定量测量，其可用于计算感染或疾病的程度并随着时间监测疾病状态。通常，生化检测测定由研究、临床、环境和工业来源的样品提取的抗原(免疫检测)或核酸(基于核酸的检测或分子检测)。
分子生物学包括基于核酸的检测，其可被宽泛地定义为生物学的一个分支，该分支研究大分子如核酸和蛋白质的信息、结构和功能以及它们在细胞复制和遗传信息传递及核酸调控方面的作用，从而使其能够被测序、突变和进一步调控生物体内的基因组以研究该突变的生物学效果。
生物化学和分子生物学的常规实践需要物理方法资源，其规模通常与被研究对象的大小成反比。例如，与制备和纯化生物样品化学相关的装置和方法，如核酸片段前瞻性分析无疑需要带有无菌设施的全面的生物实验。而且，通常需要类似规模的单独环境的设施来进行已知的核酸扩增程序，如用于扩增所述核酸片段的聚合酶链反应(PCR)。
“微流体学”通常涉及处理少量流体的系统、器件和方法。微流体系统能够整合操纵流体的多种操作。这样的流体可包括化学制品或生物样品。这些系统也有很多应用领域，如生物学检测(用于如医疗诊断、药物发现和药物递送)、生化传感器或生命科学研究，通常还有环境分析、工业过程监测和食品安全检测。
微流体器件的一种类型为微流体芯片。微流体芯片可包括微尺度特征或(“微特征”)，如通道、阀门、泵、反应器和/或槽以储存流体、在所述芯片的各种不同位置来回递送流体，和/或反应试剂。然而，现有微流体系统缺乏适当机制来使得除了通过上述流动方式以外还能可控地操纵多种流体，因此，限制了这些系统在各种化学或生物学检测中的实际应用。这是因为现实中的检测通常需要重复操纵用于各种分析目的的不同试剂。
另外，许多现有的微流体器件限于一种特定用途，不经完全重新设计不容易适于或适用其他应用。这些器件缺乏模块性，因此无法共用能使一项设计实现多种功能的通用器件部件。由于每项用途需要不同系统的产品，这种缺乏灵活性导致产品成本增加。
而且，许多现有的微流体系统缺乏任何能够易于测定该检测中所产生的分析物相互作用或存在的简单的终点法检测措施。以实例的方式，检测后通常用目测样品颜色变化来评估检测结果。
因此人们需要改进的分析生物或化学样品的微流体系统，尤其是测定和分析源自这类样品，如DNA、RNA、氨基酸和蛋白质的生物活性大分子。期望该系统能够规模生产、低成本且最好易于使用。期望该系统易于操作且许多或基本上所有流体处理步骤可自动化。期望该系统可用户化和模块化，从而该系统可容易和快速地重新配置以适于需要测定大分子的各种应用。也期望该系统能提供简单而有意义的检测结果。
当进行基于核酸的检测时，样品制备是首要而最关键的步骤以释放和稳定可能存在于样品中的靶核酸。样品制备也可用于消除核酸酶活性和去除或灭活靶核酸的核酸扩增或测定的潜在抑制剂。样品制备方法可以不同且部分取决于所处理样品的特性。各种细胞裂解方法为本领域所熟知且设计为用于从悬浮于原始样品中的细胞或病毒中特异性分离核酸。
细胞裂解之后，需要对样品中释放的核酸进行纯化以将扩增反应的潜在抑制剂从核酸中去除。通常纯化是一件繁重而重复性操作的任务，其耗费大量试剂、重要设备和劳力，且通常该步骤与下游扩增反应失败最为相关。
纯化之后，通常期望用任何本领域已知的一些核酸扩增方法来扩增特定的核酸序列。具体地，核酸扩增酶法扩增核酸扩增物(多个拷贝)，其含有与扩增中的核酸序列同源的序列。本领域使用的核酸扩增方法的实例包括聚合酶链反应(PCR)、链替代扩增(SDA)、连接酶链反应(LCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录相关的扩增(TAA)、冷PCR和非酶法扩增技术(NEAT)。当存在于样品中的靶序列的量很少时，核酸扩增尤其有益。通过扩增所述靶序列并测定合成的扩增物，可大大提高检测的灵敏度，因为检测之初只需少量靶序列以更好地保证对目标生物体或病毒样品的核酸测定。
靶核酸序列的测定需要使用核酸探针，其具有基本上与靶序列或其扩增物互补的核苷酸碱基序列。在选择性的检测条件下，所述探针将以使从业者能够测定样品中靶序列存在的方式与靶序列或其扩增物杂交。有效的探针被设计为防止与可能干扰检测靶序列存在的任何核酸序列进行非特异性杂交。探针和/或扩增物可包括能够被检测的标记，其中所述标记为，例如，放射性标记、荧光染料、生物素、酶、电化学或化学发光化合物。
当手动操作时，与基于核酸的检测相关的复杂性和大量处理步骤会造成从业者-错误、暴露于病原体和检测之间交叉污染和其他的可能性。遵照操作手册格式，从业者必须安全而便利地并置测试样品、试剂、废弃的容器、检测用容器、吸管尖头、抽吸器、分配器，同时要特别小心不能弄混物品架、测试样品、测试用容器和相关尖头，或碰翻任何管、尖头、容器或仪器。另外，从业者必须小心地手持非固定仪器以要求精确操作的方式实施抽吸和分配步骤，以避免检测容器、气溶胶形成或磁性粒子的抽吸、或用于目标捕获检测的其他基板之间的不必要的接触。
人们需要一种自动化分析器，其可解决很多与手动操作方法相关的进行基于核酸检测的担忧。特别是，通过使基于核酸的检测的各种操作步骤自动化能够实现很大的优势，包括大大减少用户错误、病原体暴露、污染和泄漏的风险。基于核酸的检测步骤的自动化也将减少从业者的训练量且基本上排除由于大量手动操作应用的物理伤害来源。
发明概述
通过提供独立式基于微流体的生物检测装置、其相应的方法和应用，本发明的实施方案和细节满足了上述需求。
根据一个非限制的示例性实施方案，独立式全自动生物检测装置包括：机壳；设置于所述机壳中的液分平台，其包括可控-活动试剂分配系统；设置于所述机壳中的试剂供给部件；气分平台，其可拆卸地设置于机壳中与液分平台共用的空间内，可拆卸地连接至流体传输层和多个槽，其中待引入的所述流体传输层、所述槽和测试样品设置于所述机壳中与液分平台分开的空间内；气动供给系统，其在机壳中与液分平台分开的空间内可拆卸地连接至气分平台；以及设置于所述机壳中的控制系统，其连接至至少一个所述液分平台和所述气动供给系统。
根据一个非限制的方面，所述液分平台还包括：移动控制系统，其可操作地连接至所述试剂分配系统，其中所述试剂分配系统包括具有终端分配头的试剂分配部件；以及连接至试剂分配系统的照相机，其视场至少包括槽内目标物的选定区。
根据一个非限制的方面，所述气分平台与具有至少一种检测能力的微流体系统连接。所述微流体系统还可包括多层式、一体化、聚合材料的、非弹性微流体部件，所述微流体部件具有包括多个气动薄膜微特征的给定配置。所述气分平台下侧可具有一个或多个仅气动的(即，无“液流的”)端口，且设置于其中的一个或多个仅气动的通道流体连接至在流体传输层的一个或多个阀门和所述一个或多个仅气动的端口；其中所述一个或多个气动端口具有固定配置，且所述一个或多个仅气动的通道具有给定配置，其特定地匹配于在流体传输层的一个或多个气动薄膜的给定配置。所述气动供给系统还可包括让气动信号从其中通过的一个或多个口管，其流体连接至所述一个或多个仅气动的端口；其中所述一个或多个口管具有固定配置，其特定地匹配于所述气分平台的一个或多个仅气动的端口的固定配置并可拆卸地连接至所述气分平台。各多层式一体化微流体部件还可包括：聚合材料的、非弹性基板，其中设置有一个或多个流体通道，各所述流体通道具有入口端和出口端；至少一个试剂槽，其能够容纳试剂材料；至少一个双向薄膜泵，包括至少三个基于非弹性膜的薄膜阀结构；以及阀门，其设置为流体连接至至少一个试剂槽和至少一个入口端，其中所述阀门适于可控地引导材料从至少一个试剂槽经由至少一个连接至所述阀门的所述通道流向一个或多个槽，进一步地，其中各多层式一体化微流体部件由非弹性聚合材料构成。各基板还可包括一个或多个分析槽，各分析槽内设置有分析系统。所述分析系统可为下述之一：比色的、荧光比色的、化学发光的、电化学的、电泳的、横流的、蛋白质微阵列、核酸微阵列、荧光的分析系统。所述的装置还可包括具有一个或多个周边含凹口的紧固环结构，其中所述分析膜可操作地置于所述紧固环结构内。所述紧固环结构可包括两个各自具有一个或多个周边含凹口的相对的环结构，进一步地，其中所述分析膜设置于所述两个相对的环结构中间。所述装置还包括一个或多个设置于不同位置的加热器，以在分析过程中有效地加热所述测试样品或其部分。加热器可设置在可磁吸接合的槽附近。所述装置还可包括管安装层，其附连于包括一个或多个管的所述基板的底面，各管具有流体连接至分别的流体通道的近端和从基板上垂直向下伸出的远端；以及分别的一个或多个扩增/反应室，在其顶部区域附连有所述管安装层从而各管的远端设置为基本上靠近其底部区域。所述装置还可包括可操作地设置于槽或通道下的磁性组件，其中所述磁性组件还包括磁铁、磁铁支架、活塞杆和气动活塞组件(或者，所述活塞组件可为电机或电磁启动的)。加热器组件可操作地连接至所述磁性组件。
本发明的另一个非限制的示例性实施方案涉及用于分离、扩增和分析可能存在于流体测试样品中的靶核酸序列的自动化方法。该方法包括以下步骤：提供操作微流体系统的气分平台，所述微流体系统中设置有流体传输层和流体通道，以及与所述气分平台连接的槽；将所述流体测试样品引入至所述流体通道；从流体连接至流体传输层的至少一个分立的槽向所述通道提供至少一种试剂；在流体传输层、槽或扩增反应器的区域内混合所述流体测试样品和所述至少一种试剂；将所述流体测试样品输送至可操作地连通至流体传输层的温控扩增/反应反应器；在足以使靶核酸序列得以扩增的条件下，于所述扩增/反应反应器中孵化所述流体测试样品；将所述流体测试样品输送至分析槽；以及分析来自测试样品的扩增的靶核酸序列，其中所述测试样品从流体传输层中的起始位置被输送至分析槽，并与任何其他样品和所述气分平台及分配系统相隔离。
在一个方面，所述输送和混合步骤通过经由至少一个由所述气分平台操作的多薄膜阀的泵来泵送所述流体测试样品和一定量至少一种试剂通过所述流体传输层来完成。根据一个方面，所述分析步骤还可包括在微流体系统中的微阵列分析槽内进行微阵列分析。所述自动化方法还可包括在微阵列分析槽内提供微阵列分析膜；使流体在微阵列分析膜表面上流动；沿着微阵列分析膜外围通过流体出口路线基本上去除所述流体。所述自动化方法还可包括在微阵列分析槽内提供微阵列分析膜；并使流体在微阵列分析膜表面上向后和向前交替流动。所述自动化方法还可包括向微阵列分析膜提供热量。
在另一个非限制的实施方案中，所述用于分离、扩增和分析可能存在于流体测试样品中的靶核酸序列的自动化方法，所述靶核酸序列与目标疾病或病症、传染因子、病原体、癌症易患倾向，或对目标药物、药物组合物、化学制品或化合物的敏感倾向相关。
在另一个非限制的实施方案中，所述用于分离、扩增和分析可能存在于流体测试样品中的靶核酸序列的自动化方法，所述靶核酸序列包括SNP。
在另一个非限制的实施方案中，所述用于分离、扩增和分析可能存在于流体测试样品中的靶核酸序列的自动化方法，所述疾病或病症为HPV或败血症。
在另一个非限制的实施方案中，所述用于分离、扩增和分析可能存在于流体测试样品中的靶核酸序列的自动化方法，所述靶核酸序列与华法林敏感倾向或对华法林治疗反应的抗凝倾向相关。
在另一个非限制的实施方案中，所述用于分离、扩增和分析可能存在于流体测试样品中的靶核酸序列的自动化方法，所述分析步骤包括测定所述扩增的靶核酸序列和靶核酸序列探针之间的相互作用。
在另一个非限制的实施方案中，所述用于分离、扩增和分析可能存在于流体测试样品中的靶核酸序列的自动化方法，所述分析步骤包括测定下列情形的存在或倾向：所述目标疾病或病症，所述传染因子，所述病原体，癌症，或对所述目标药物、药物组合物、化学制品或化合物敏感。
在另一个非限制的实施方案中，所述用于分离、扩增和分析可能存在于流体测试样品中的靶核酸序列的自动化方法，根据权利要求26所述的自动化方法，其中所述分析步骤包括测定扩增的靶核酸序列的量或水平，其中所述方法还包括将所述靶核酸序列的量或水平与预选的量或水平进行比较。
根据权利要求38所述的方法，其中所述量或水平与预选的量或水平的差异表示有下列情形存在或倾向：目标疾病或病症，传染因子，病原体，癌症，或对目标药物、药物组合物、化学制品或化合物敏感。本发明这些以及附加特征和优点将在下述详细说明中陈述，并通过这些描述而对本领域技术人员来说非常明显，或通过按照该详细描述、说明书附图和所附的权利要求书实施本发明而被理解。
应理解，前述总体描述和下述详细描述仅为本发明实施方案的示例且旨在提供对要求保护的本发明特性和特征理解的概观和框架。所附附图也包括于其中以提供对要求保护的本发明各种实施方案和方面的进一步理解，且并入其中构成该申请文件的一部分。
附图说明
图1所示为本发明一个示例实施方案的独立式生物检测装置的透视图；
图2所示为图1所示的独立式生物检测装置的正视图；
图3所示为图1所示的独立式生物检测装置的俯视图；
图4所示为图1所示的独立式生物检测装置的透视图；
图5所示为本发明一个示例性方面的“6乘4”布置的槽的俯视图；
图6所示为本发明一个示例性方面的“6乘4”布置的槽的透视图，所述槽连接至流体传输层并安装在所述气分平台上；
图7所示为本发明一个示例性方面的横截面俯视图，其为“6乘4”布置的所述气分平台的顶部垫圈层和与扩增反应器结合的加热器；
图8A-C所示分别为本发明一个示例性方面的顶视透视图、俯视图和仰视透视图，其为“6乘4”布置的所述独立式生物检测装置气分平台的底部；
图9所示为本发明一个示例性方面的分层的横截面俯视图，其为“4检测单元”布置的槽、流体通道和扩增反应器，它们为流体传输层和槽层的组合；
图10A-K所示为本发明一个示例性方面的横截面俯视图，其为使用通道、反应器和槽的示例性处理阶段，当由所述气分平台操作时它们位于组合的流体传输层和槽层中；
图11所示为本发明一个示例性方面的透视图，其为包括槽层的“4检测单元”部件、包括膜层的流体传输层和扩增反应器；
图12所示为本发明一个示例性方面的横截面侧视图，其为图11所示的“4检测单元”部件；
图13A所示为本发明一个示例性方面的分解图，其为包括槽层的示例性“4检测单元”部件、流体层、膜层、包括小细管的扩增反应器，所述小细管流管用于加注和排空扩增反应器、用于分析槽的穿孔环和膜系统、二氧化硅过滤膜和穿孔的保持环；图13B所示为本发明一个示例性方面的示例性的具有流动通道的穿孔环、分析膜和膜支撑结构；
图14A所示为本发明一个示例性方面的一个替代性实施方案的透视图，其为“4检测单元”部件分析区的槽层，所述部件包括分析槽的覆盖的有通风口部件，其未使用穿孔环组件来支持分析膜；图14B所示为本发明一个示例性方面的近观透视图，其为覆盖的有通风口的分析槽特征，包括分析膜模型和用于保持分析膜的分部特征；图14C所示为本发明一个示例性方面的横截面俯视图，其为所述气分平台顶部垫圈层的4检测单元布置、与扩增反应器结合的加热器和结合于分析槽下表面的加热器；图14D所示为所述气分平台上层的内部气动通道，其显示从气动供给系统导入至所述气分平台底层的气动信号是如何进一步分开并递送至所述气分平台表面上的特定垫圈层空隙；
图15A所示为本发明一个示例性方面的分解透视图，其为气分平台的单个检测单元，结合有气动的磁铁和多功能加热器以及任选的位于流体层和气分平台之间界面的薄膜层；图15B所示为本发明一个示例性方面的分解透视图，其为图15A所示的单个检测单元，包括流体传输层的薄膜层和所述气分平台上的垫圈层；
图16所示为本发明一个示例性方面的分层的横截面俯视图，其为所述槽、流体通道和扩增反应器的“单个检测单元”布置，它们是流体传输层和槽层的组合；
图17A-O所示为本发明一个示例性方面的分层的顶视图，其为使用通道、反应器和槽的示例性处理阶段，当由所述气分平台操作时它们位于组合的流体传输层和槽层中；
图18所示为本发明一个示例性方面的横截面侧视图，其为单个检测单元的所述气分平台和微流体系统，显示了组合有包括非加热的磁性组件气动磁铁和多个加热的反应位点的功能特征；
图19所示为本发明一个示例性方面的横截面侧视图，其为单个检测单元的所述气分平台和微流体系统，包括组合有气动、加热的磁性组件和多个加热的反应位点的功能特征；
图20所示为本发明一个示例性方面的分层的横截面俯视图，其为所述槽、流体通道和扩增反应器的“双检测单元”布置，它们是流体传输层和槽层的组合；
图21A-K所示为本发明一个示例性方面的分层的顶视图，其为使用通道、反应器和槽的示例性处理阶段，当由所述气分平台操作时它们位于组合的流体传输层和槽层中；
图22所示为本发明一个示例性方面的双检测单元布置的分解图，其显示所述槽层、流体层、薄膜层和扩增反应器，包括用于加注和排空扩增反应器的细流管；
图23为本发明一个非限制的说明性方法的多功能加热器的分解图；
图24为根据本发明的一个非限制的说明性方法，其示意性说明固定用于在CARD上处理的组织样品的过程；
图25为根据本发明的一个非限制的说明性方法，其示意性说明CARD上样品细胞裂解过程；
图26A-B：引物延长方法。含有3'检测核苷酸的端氨基捕获探针共价连接至滤膜。扩增之后，所述扩增物变性，且互补链对探针退火。如果在探针的3'核苷酸和所述扩增物(A)之间完全匹配，就会发生合并生物素化核苷酸的DNA合成。如果在探针的3'核苷酸和所述扩增物(A)之间不匹配，就不会发生DNA合成，从而不会合并生物素。进一步的详情参见实施例2；
图27：华法林SNP检测的在CARD上的实施方案中来自引物延伸部件的代表性图像。变性扩增物与固相捕获探针杂交之后检测到有色的沉淀，在DNA聚合酶存在下合并生物素化的dUTP和未标记的dCTP、dATP和dGTP，最后与HRP-链霉共轭体(streptavidinylated HRP)和底物一起孵化。图例按键(key)显示了捕获探针靶向的等位基因。成像之后，用在WT点样上检测到的像素数目除以在突变体点样上检测到的像素数目。WT像素/突变体像素>1显示为纯合子WT；WT像素/突变体像素=1显示为杂合子；而WT像素/突变体像素<1显示为纯合子突变体。在该过滤膜上显示所得到的基因型为：VKORC1-杂合子；CYP2C9*2-纯合子WT；和CYP2C9*3-纯合子WT；
图28：使用华法林SNP检测结合在CARD上的实施方案中的引物延伸获得的7个个体基因型的结果。7个个体口腔粘膜拭子(buccalswab)样品在检测膜上的结果显示于该图的上部。该图的下部显示从这些检测膜中读出的基因型。另外，所有基因型通过双向测序进行验证。这些基因型在20个测试的个体中被表现出来。更为稀少的基因型组合预计不在该小样品组中；
图29：使用华法林SNP检测结合在CARD上的实施方案中的RDB获得的个体基因型的结果。4个个体口腔粘膜拭子(buccal swab)样品在检测膜上的结果显示于该图的上部。所述检测膜下部的表显示从这些检测膜中读出的基因型。该图底部的检测膜键显示了在每个4微阵列中的点样系统。
图30，表1：捕获探针序列，SEQ ID NOS：1-20。详情参见实施例4；
图31，表2：带有特异性型L1序列的正向和反向引物，SEQ IDNOS:23-46。详情参见实施例4；
图32，表3A：用于扩增所述HPV L1基因的正向引物，SEQ IDNOS:50-77。详情参见实施例4；
图33，表3B：用于扩增所述HPV L1基因的生物素化的反向引物，SEQ ID NOS:78-105。详情参见实施例4；
图34：用L1引物混合物(primer mix)确认HPV扩增。将含有质粒的全长HPV，类型6、1、16、18和52，以及含有质粒的部分HPV类型35和L1引物混合物一起用于扩增。在16ng C33A核酸背景下基于1000个拷贝的质粒DNA进行40个循环的PCR扩增。M=100bpDNA。详情参见实施例4；
图35A-D：PCR扩增梯度稀释的HPV克隆。A)用于分离2倍增长量扩增的含质粒全长HPV 16和HPV-18产物的凝胶的代表性图像；泳道如下：标记物(100bp DNA梯状条带)、0、122、244、488、977、1,953、3,906、7,813、15,625、31,250、62,500、125,000个拷贝的HPV质粒。下部图像A为代表性凝胶图像，所示为与上部图像中所示的等量样品中的球蛋白扩增产物的分离。具体地，其为上述所示HPV 16图像的伴侣凝胶。B)含质粒全长(6、11、16、18、52)或部分(35)HPV的PCR产物分离的凝胶图像分析。C)来自临床样品的HPV L1克隆的PCR产物分离的凝胶图像分析。D)图A所示的各曲线中的伴侣球蛋白凝胶图像分析。这些条形图表示在不同数目的输入HPV分子存在下球蛋白扩增的平均值和标准偏差。详情参见实施例4；
图36：在梯度稀释的C33A纯化核酸中PCR扩增β-球蛋白。上图：用于分离在2倍增长量C33A纯化核酸中的β-球蛋白扩增产物的凝胶代表性图像。M=标记物(100bp DNA梯状条带)、对应于总输入核酸0、0.025、0.5、1、2、4、8和16ng。下图：进行30(N=4)、35(N=3)或40(N=2)个循环的PCR扩增后的分离产物的凝胶图像分析。数据点为平均值+/-标准偏差。详情参见实施例4；
图37A-B：A.在1.6ng/μl基因组核酸背景下10个拷贝/μl的HPV扩增结果。上部图像所示为HPV扩增物的凝胶图像，底部图像所示为对应的球蛋白扩增物。B.HPV和球蛋白扩增物的各组合的RDB结果。详情参见实施例4；
图38：纯化自临床样品的核酸。红色条，基于在260nm处的吸光度的DNA产量ng/ul(左Y-轴)。蓝色曲线：对分离β-球蛋白PCR扩增产物的凝胶进行图像分析获得的像素强度(右Y-轴)。不考虑浓度对1μl纯化核酸进行30个循环的扩增。还显示了两个数据组的线性趋势线。详情参见实施例4；
图39A-C：临床样品基因组当量的估计。用来自选定的临床样品的稀释的纯化核酸进行β-球蛋白扩增。A)用无RNA的C33A DNARNA-DNA制作标准曲线。B)和C)基于A中的嵌入图所示的线性方程进行图像分析以计算等量的“基因组”(后面的条形)。也显示了基于在260nm处吸光度的实际输入核酸(前面的条形)。详情参见实施例4；
图40，表4：临床样品的PCR和RDB结果概述。如表中所示，表明PCR后HPV扩增条带的75%(88/117)的样品和45%(40/88)的HPV扩增物阳性被RDB上的HPV-特异性探针捕获。详情参见实施例4；
图41A-B：A：使用Digene系统，相对于实施例4描述的实施方案获得的HPV结果进行HPV高风险样品阳性比较；B：使用Digene系统，实施例4描述的实施方案检测到6个高风险的样品表现为阴性，表明了实施例4实施方案在该检测的灵敏度和特异性方面的优势。详情参见实施例4；
图42：HPV 16L1的基因序列(SEQ ID NO:106)，其含有用于扩增的对应于各种靶区域的突出序列(SEQ ID NOS:107-112)。详情参见实施例4；
图43A-C：A：HPV像素强度随相应的球蛋白像素强度增加的标图结果；B：HPV与球蛋白的像素比例标图相对从低到高的风险HPV类型；C：HPV与球蛋白的像素比例标图相对从低到高的风险HPV类型。所述“Digene”系列标绘了可市购的Digene检测与本检测相比较结果的数据。所述嵌入图显示了被标示和合并到主图中的Digene检测结果(不同刻度的Y-轴)。详情参见实施例4；
图44所示为使用实施例5描述的横流层析检测，基于CARD测定稀少靶标的结果。检测到隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)热激产生的mRNA。IMS=磁珠免疫分离。HS=热激；以及
图45所示为使用图20所示的CARD配置，根据图21-22中所示的方法，成功地对DNA进行了纯化、洗脱和扩增。
发明详述
下面将详细参照本发明的示例性实施方案，描述其实施例，并进一步在附图中进行说明。尽可能在附图中使用同样的数字标号表示同样或类似部件。
图1-4，说明了本发明一个实施方案的独立式全自动生物检测装置10。该装置包括机壳11；设置于所述机壳中的液分平台12，其包括可控的可移动试剂分配系统13；设置于所述机壳中的试剂供给部件14，其可容纳供给一种或多种试剂，并可操作地连接至与所述分配系统；气分平台15，可拆卸地设置于机壳11中与液分平台12共用的空间内，其操作影响流体传输层16中的流体输送和在所述气分平台15对面附连至流体传输层16的多个槽17，其中，待引入其中的所述流体传输层16、槽17和测试样品设置于与液分平台12分开的空间内；气动供给系统18，其作用是提供经所述气分平台15传送的气动信号(正和负(真空)压)以实现在流体传输层16及其多个槽17中的测试样品和试剂的传输，其设置于所述气分平台15上并可操作地连接至在机壳11中与液分平台12分开的空间内的气动供给系统18；以及设置于所述机壳中11中的控制系统19，其用于控制液分平台12、加热系统(29、48和48a)、冷却系统(通过从加热器处的气动供给系统18引导一股被或未被主动冷却的压缩空气或从风扇处供给气流来实施)和气动供给系统18。
对于图1-4、5、6、9、10-13、16和20，独立式生物检测装置10设计为仅需所述检测装置10的操作员将目标生物样品引入至槽层17上多个端口33n中的特定的样品输入端口33，槽层17覆盖了流体传输层16(附连有薄膜层30)，其一起由所述气分平台15操纵，然后启动控制系统19的起始顺序，从而所述样品被完全自动化地处理检测直至该检测的终点。如图中所描述，有24个以“6乘4”模式布置的分别的示例性检测单元，整个处理顺序中每个样品在其检测单元内且与所有其他样品和所述生物检测装置分开。尽管所述示例性实施方案中描述了24个检测单元，其下限为一个检测单元，没有具体的上限。
在操作中，一旦待分析的样品被引入至槽层17的样品输入槽33，样品就自动地从样品输入槽被吸入到流体传输层16，或者试剂通过流体传输层16从分开的槽传输至样品输入槽33。然后，无需操作员的干预，分析样品需要的所有步骤将在槽层17和/或流体传输层16中进行，包括在设置于流体层16的合适反应器(例如31，图11、12)中进行扩增或通过所述系统的细流管44连通至流体层16。在完成自动地分析样品需要的所有一系列处理步骤中，所述系统保持所述样品与试剂分配系统13、所述气分平台15和气动供给系统18相隔离。这一隔离的特征消除了交叉污染的问题，该问题不可避免地会增加成本并减少目前在用的其他系统的可靠性，这些系统执行类似任务但需要在一个装置内将处理中的样品从一个站点移送至另一个站点，或需要所述分配系统来使得在微流体系统内流动。
所述装置10包括机壳11，其设计为在操作中包围该系统的内部，从而该全自动处理能够在无操作员干扰下进行至完成。机壳11还包围控制系统19、液分平台12、试剂供给部件14，以及操纵所述气分平台15的气动供给系统18。
图1-4还描述了试剂分配系统13。所述试剂分配系统附连至所述X-Y-Z移动控制系统且连同液分平台12。分配系统13由分配针头23、大存储环25、小存储环26、用于每个存储环25和26的电磁阀24及照相机27组成。分配针头23由具有不同的各自选定内径的双孔管或长度为L的长针结构组成。所述小管(孔)通过专用电磁阀24附连至小存储环26，所述大管(孔)通过专用电磁阀24附连至大存储环25。不同大小的目的是为了便于精确计量由试剂分配系统13递送的试剂。所述针管的孔口越小，计量小剂量试剂就越容易。作为示例，一个试剂分配针头具有内径b1，其中0.003≤b1≤0.018英寸，另一个试剂分配针头具有内径b2，其中0.015≤b2≤0.030英寸。
用于独立式生物分析系统10的照相机27可具有多种功能。一个功能可为校正分配系统13的分配针头23对于试剂供给部件14和附连至流体传输层16的槽层17的位置，从而试剂供给部件14中的试剂能分配至槽层17中恰当的槽里。另一个功能是向控制系统19提供样品和/或分析信息。当操作员向特定检测单元的槽层17的样品输入端口33提供样品时，照相机27从光源如条形码或本领域其他可分辨的光学标记系统记录样品信息。来自样品的信息会通知控制系统19正确上样，然后其将与分析结果合并在一起。接着，经确认和正确上样的样品由独立式生物检测装置10处理，最终结果也由同样的照相机27记录。最后通过控制系统的操作员界面可将该信息传递给操作员。
大和小控制环25、26是管的线圈，其通过电磁阀24附连至其特定的双管分配针头23。当一项检测需要特定试剂时，X-Y-Z移动控制系统就将分配针头23移动至试剂供给部件14中的特定试剂。针头插入至试剂的容器，通过小或大存储环25、26和打开的电磁阀24提供负压。所需量的特定试剂就从试剂容器中抽出。然后，X-Y-Z移动控制系统就将分配系统13传送至需要试剂的槽的位置。然后，将正压提供给大或小存储环并打开恰当的电磁阀以将计量好用量的试剂分配至槽中。然后，分配系统13可重新定位至需要同样试剂的另一个槽，重复该分配过程直到为所有需要特定试剂的槽供给完毕。然后，通过用合适的冲洗液不断冲洗分配针头23和存储环25或26的管来清洁分配针头23和存储环25或26。再准备将分配系统13用于输送和提供检测需要的另一种试剂。
通过控制系统19主动控制提供给存储环25、26的正压或负压，并在排出或分配试剂时对分配系统13的电磁阀24的打开和关闭时间计时，完成对试剂的恰当计量。
设置自动清洁的单个分配针头23具有优势，因为试剂分配的可选择方法通常需要使用吸量管和大量一次性吸管针头。所述独立式生物检测装置10使用从槽层17的试剂输入槽中分离样品的流体传输层16，从而避免在可选择系统中发生的交叉污染的可能。因此，使用单个分配针头系统23，就无需吸量管系统。或者，可将所述分配系统可构建为吸量管系统并以类似方式操作，尽管是结合一次性吸管针头而不是在试剂应用之间对分配针头进行清洁。当使用吸管系统时，也可通过设置的吸管和吸管针头自动将样品分配至样品输入端口33以避免交叉污染。
如图5-14的不同图示，由两个子单元15a和15b构成所述气分平台15，其中子单元15a接受由气动供给系统18提供的气动供给，并通过其集成的气动通道32分开这些信号以将这些气动信号递送至流体传输层下侧薄膜的子单元15b的气动通道，所述气分平台15连接至多个微流体系统(组合的16、16a和17，本文称为检测单元或商业上称为(化学和试剂器件))，各CARD具有单个或多个检测能力。各CARD还包括多层式、一体化、聚合材料的、非弹性微流体芯片(微流体传输层)16，其具有包括多个气动信号-致动的薄膜阀的给定配置微特征。所述系统还包括单独的可替换气分平台，其包括流经的多个气动端口和设置于其中的流体连接至多个薄膜阀和多个气动端口的多个气动通道。所述多个气动端口和气动通道具有给定配置，其特异性对应于流体传输层16上多个薄膜阀的给定配置。所述流体传输层16可拆卸地连接至所述气分平台15。所述气动供给系统18还包括多个气动连接器，其将气动信号提供给流体连接至多个气动端口的所述气分平台15。所述多个气动连接器的配置对应于所述气分平台15的多个气动端口的配置。所述气分平台15可拆卸地连接至气动供给系统18。
各多层式、一体化的流体传输层16还包括其中设置有多个流体通道39的聚合材料的、非弹性基板16a，各流体通道39具有入口端和出口端以及至少一个双向薄膜泵，所述薄膜泵包括至少3个基于非弹性膜的阀结构，其由单独的非弹性聚合薄膜层30构成。在各种方面，各流体传输层16可包括整体的或组件的槽层17，其包括至少一个可容纳样品的样品输入槽33和至少可容纳试剂材料的试剂槽(34)。
槽层17及其附连的流体传输层16(包括传输层基板16a)可拆卸地设置于所述气分平台15上，从而在分析完成后所述组合槽层17和流体传输层16可被移开并重新放置一个未使用的或清洁后待用的、不同的组合槽层17和流体传输层16。所述气分平台15也可拆卸地设置于机壳内的气动供给系统18上。所述气分平台15也可替换为另一个气分平台15，其对应于设计用于可选择的检测或任何特定检测的更多或更少数目检测单元的组合槽层17和流体传输层16布置。
如图7、14C、15A、15B、18和19所描述，所述气分平台15可包括多功能和/或特定功能的加热器(29、48和48a)，其用于加热扩增/反应反应器31和/或其他槽或通道。在如图23的分解图所描述的非限制性方面，所述多功能加热器2301可为层压形式的铜/铝结构2303，所述铜/铝结构2303安装在弹簧支承的电触头2305上，电触头2305为电阻器2307提供电接触，电阻器2307产生热且将其传送给层压加热体。所述触头还提供与温度传感器件2309的连接以用于调控所述加热器。所述弹簧支承的电触头还提供加热器表面和待加热物体之间的均匀接触。所述层压加热器装置可为市购的金属核心(层压的铜/铝；例如，热导的PCB基板，莱尔德科技(Laird Technologies)，切斯特菲尔德(Chesterfield)，MO)板。所述金属核心板提供优异的热导性，并进一步为设置于所述电路布局中的温度传感器部件提供良好的温度均匀性。微流体系统的一个挑战是能够精确测量加热区域的温度。所述弹簧单高跷触头(例如，弹簧探针(Spring Contact Probes)，互联器件公司(Interconnect Devices Incorporated)，堪萨斯城，KS)提供电的或机械的接触面。流体传输层16与所述气动端口和加热器29、48和48a互相连接。当设置于流体层16上的薄膜泵由气动供给系统18提供给所述气分平台15的正和负的气动压操作时，所述样品和/或试剂被抽吸至流体传输层16中并传输至所进行的各种处理步骤和分析步骤，包括设置于所述气分平台15上的槽层17、扩增反应器31和其他部件，如加热器29、48和48a以及磁铁49。通过该过程所述样品和在流体传输层16、槽层17或扩增反应器31中进行的任何中间反应都在其特定检测单元中与其他检测单元分隔开。这种分隔防止样品与或来自任何其他检测单元、试剂分配系统13、所述气分平台15或气动供给系统18的交叉污染，从而提供更大的分析可靠性并减少操作成本，因为该系统的清洁需求大大减少了。气动供给系统18的作用是提供经过所述气分平台15的气动信号(正压和负压)，从而在流体传输层16内实现所述测试样品和试剂的传输。其与液分平台12协同操作，从而当通过分配系统13从试剂供给部件14向在槽层17上的特定或普通槽递送试剂时，能够正确实施所述处理过程。所述气分平台15还可整合一些区域，其中可提供加热、冷却(通过从加热器处的气动供给系统18引导一股被或未被主动冷却的压缩空气或从风扇处供给气流来实施)或磁力以有助于反应进行。气动供给系统18设置为在机壳11中与液分平台12分开的空间内可操作地连接至气分平台15，以及用于控制液分平台12的控制系统19，气动供给系统18和所述气分平台15实施的在流体传输层16、槽层17或扩增反应器31中发生的任何加热、冷却(通过从加热器处的气动供给系统18引导一股被或未被主动冷却的压缩空气或从风扇处供给气流来实施)或磁力。
图4为独立式生物检测装置10的透视图，其清晰显示了位于所述气分平台15下面的气动供给系统18的位置。气动供给系统18位于机壳11的下部内。气分平台15可拆卸地附连至气动供给系统18，从而用于需要不同的流体传输层16设计的分析，有助于容易地重新配置独立式生物检测单元10。气动供给系统18由许多子部件构成，其设计用于通过所述气分平台15在控制系统19的指令下存储、计量和按路线输送气动压力，以操作位于检测单元的流体传输层16上的薄膜。通过正压和负压调节器20将正压和负压提供给正压和负压存储槽21。从正压和负压存储槽21对正压和负压依次计量并经由气动供给电磁阀22(由气动供给电磁阀22至所述气分平台15下底面的管未清晰显示(通过气动供给系统18和所述气分平台15之间为无管的固态界面，所述配置也可构建为无管件式))供给至所述气分平台15的通道。压力计量以及电磁阀的打开和关闭由控制系统19控制，并将计量的气动力供给至所述气分平台15，从而操作位于流体传输层16的薄膜泵。
图5描述了一个阵列的6个CARD，描绘了“6乘4”布置的槽，各4检测单元CARD可拆卸地设置于所述气分平台15。在操作中，槽层17由薄膜覆盖(未示出)以保护其内容物免受临近检测单元中处理的样品交叉污染的可能，并防止槽17的内容物污染液分平台12、所述气分平台15、气动供给系统18、控制系统19或机壳11。
图6进一步描述了可拆卸地附连至所述气分平台15上的流体传输层16的一个“6乘4”CARD布置。
图7为流体传输层16和气分平台15之间的界面的顶视图。垫圈28附连至所述气分平台15的顶部，并设计用于隔离施加给流体传输层16的薄膜层30(图15B)的气动力。各垫圈空间内的末端为从气动供给系统18经由所述气分平台15的通道。当流体传输层16被置于垫圈28顶部时，通过从气动供给系统18经由所述气分平台15施加正压和/或负压并由控制系统19控制，流体传输层16的薄膜层30的未粘合部分能够弯曲进入垫圈空间或从垫圈空间出来。控制系统19能够连续施加正压或负压至选定位置，所述位置设立有如共同任用(commonly assigned)的专利US 7,832,429所描述的薄膜泵送系统。通过使用这样的驱动泵送，气分平台供给系统18和气分平台15保持与通过流体传输层16输送的流体分开，其可消除检测单元之间的交叉污染，以及气动供给系统18和气分平台15的污染。
如上所述，当CARD被放置在所述气分平台15上时，加热器29可位于扩增反应器31安装于其中的所述气分平台15内。在处理样品期间的合适时间，向扩增反应器31注入合适的试剂和从槽层17的不同槽经流体传输层16输送的处理样品。然后，通过来自控制系统19的指令以可控的方式将扩增反应器的内容物加热和冷却(通过从加热器处的气动供给系统18引导一股被或未被主动冷却的压缩空气或从风扇处供给气流来实施)。
图8A描述了独立式生物检测装置10气分平台15的“6乘4”布置15a层的透视图。气动信号经由其输送至所述气分平台15的较高层15b的孔口，以及加热器安放的凹口。
图8B描述了独立式生物检测装置10气分平台15a的“6乘4”布置的顶视分层图。气动信号从气动供给系统18经由所述气分平台15底部的孔口而流经其输送的通道32，以及图8A描述的层上的孔口。
图8C描述了独立式生物检测装置10气分平台15的“6乘4”布置的仰视透视图。图4描述的气动电磁阀22和存储槽21供给气动压或真空至位于所述气分平台15底部的孔口。存储槽21供给计量的正压和负压至图8B所示的气动通道32，其构建于所述气分平台15内。当控制系统19打开气动供给电磁阀22，气动通道32被供给计量的负压或正压，基于该压力存储槽21通过控制系统19以打开或关闭状态附连至特定气动供给电磁阀22。通过控制系统19的调控下调整存储槽21压力，调控气动供给电磁阀22的打开，或二者的结合来实施压力计量。将压力供给至通道，然后，通过所述气分平台15的垫圈界面28操纵流体传输层16。
图9描述了“4检测单元”CARD的分层顶视图，其具有流体传输层16的流体通道39和扩增反应器31。该图显示了在CARD的单独检测部分的制备和纯化区内的样品输入槽33、普通制备和纯化试剂槽34、废料槽35和二氧化硅过滤槽36，其包括二氧化硅过滤膜保持环36a，保持环36a将支承二氧化硅过滤膜36b(未清晰显示)。还显示了洗脱槽37(左和右)、扩增预混合液槽38(左和右)和扩增反应器31(左和右)，其附连于流体传输层16底部并通过细流管44连接。还显示了普通试剂输入槽40、分析槽41和废料槽42以及穿孔环系统43，其用于支撑4检测单元CARD单个检测单元的分析部分的分析膜43(未清晰显示)。
图10A至10K概述了一种用所述器件处理和分析样品的非限制性示例方法。此处提供了单个检测单元的描述，对于可并行或连续处理提供给独立式生物检测装置10样品的检测单元数目没有特定的上限。个体样品处理对顺序是基于控制系统19对于气动供给系统18和所述气分平台15的特定布置，以及试剂供给部件14供给的和分配系统13递送的特定试剂的控制能力。具体地，一个特定检测可能需要设计槽层17及其匹配的与气分平台15连接的流体传输层16。当所有的匹配部件被组合到一起后，该方法通常可按如下进行。
在图10A中，样品被注入至样品输入槽33，分配系统13提供细胞裂解试剂至普通槽34。然后，按照检测的要求，所述细胞裂解试剂被泵送至样品输入槽33，并如同时待审申请S/N 12/249,872所述的在进行或不进行轻度振荡下孵化而“抖动(fluffing)”(即，反复驱动靠近槽的薄膜以交替抽吸，然后向槽内注入流体以产生湍流和混合)。当样品在样品输入槽33中孵化时，由分配系统13将有机醇(例如乙醇)分配至普通槽34并将其泵送至样品输入槽33，进一步增加样品输入槽33中的容积；继续孵化该增大的混合物。完成所述孵化阶段后，将样品输入槽33的内容物泵送至二氧化硅过滤槽36中二氧化硅过滤膜36b的顶部上并流过二氧化硅过滤膜36b，内容物被泵送至废料槽35。
按照图10B，有机醇(例如乙醇)被分配至普通槽34，将其泵送至二氧化硅过滤槽36中二氧化硅过滤膜36b的顶部上，流过所述二氧化硅过滤膜，再被泵送至废料槽35。冲洗缓冲液被分配至普通槽34，将其泵送至二氧化硅过滤槽36中二氧化硅过滤膜36b的顶部上，流过二氧化硅过滤膜36b，再被泵送至废料槽35。同样或另一种冲洗缓冲液被分配至普通槽34，将其泵送至二氧化硅过滤槽36中二氧化硅过滤膜36b的顶部上，流过二氧化硅过滤膜36b，再被泵送至废料槽35。
在图10C中，洗脱缓冲液被分配至普通槽34并直接泵送至废料槽35以清除裂解产物残留物的通道、有机醇和洗涤缓冲液。新鲜的洗脱缓冲液被分配至普通槽34，将其泵送至二氧化硅过滤槽36中二氧化硅过滤膜36b的顶部上以清洁所述槽，然后其从二氧化硅过滤膜36b的顶部被泵送至废料槽35。
在图10D中，洗脱缓冲液被分配至洗脱槽37(右)并向上泵送流过槽36中二氧化硅过滤膜36b的底部。
在图10E中，扩增预混合液(master mix)被分配至扩增预混合液槽38(左和右)。二氧化硅过滤槽36中的起始容积被泵送至洗脱槽37(右)，然后，单独泵的材料从二氧化硅过滤槽36被泵送至扩增预混合液槽38(右)。扩增预混合液槽38(右)的内容物被空出到扩增反应器31(右)中。在左边重复同样的步骤。然后，按照该方法的特定检测方案，在控制系统19的控制下使扩增反应器31(左和右)的内容物热循环。
接着，热循环后，按照图10F，预杂交缓冲液被分配至通用试剂槽40，将其泵送至扩增反应器31(右)，然后重复提供预杂交缓冲液给扩增反应器31(左)。然后，升高扩增反应器中的温度以对早期热循环产生的扩增物进行变性。
在图10G中，在扩增物变性时，为了在分析膜47上制备微阵列以正确地与早期热循环产生的扩增物杂交，将同样的或另一种预杂交缓冲液分配至通用试剂槽40并将其泵送至悬浮于分析槽41中的分析膜47顶部(未清晰显示)，再将其泵送至废料槽42；将洗涤缓冲液分配至通用试剂槽40，将其泵送至分析槽41中的分析膜47上，再将其泵送至废料槽42(重复多次)。
在图10H中，将同样的或另一种预杂交缓冲液分配至通用试剂槽40并继续进入到扩增反应器31(左和右)中和分析槽41的分析膜47的顶部上。
在图10I中，扩增反应器31(左和右)的内容物被泵送至分析槽41的分析膜47的顶部上并循环多次，其在扩增物和附连至分析膜47的目标物之间提供了足够的接触。当进行了满意的杂交后，所述内容物被泵送至废料槽42。洗涤缓冲液被分配至通用试剂槽40，将其泵送至悬浮于分析槽41中的分析膜47顶部上，再泵送至废料槽42(重复多次)。
接着，按照图10J，将合适的扩增物可视化试剂(如，辣根过氧化物酶("HRP″))分配至通用试剂槽40并将其泵送至悬浮于分析槽41中的分析膜47顶部上，循环至反应满意地完成；然后将内容物泵送至废料槽42。将洗涤缓冲液分配至通用试剂槽40并将其泵送至悬浮于分析槽41中的分析膜47顶部上，再泵送至废料槽42(重复多次)。
按照图10K，将显色剂反应物(如，四甲基联苯胺"TMB")分配至通用试剂槽40并将其泵送至悬浮于分析槽41中的分析膜47顶部上；如上所述循环至试剂(如，TMB和HRP)完全反应，再将内容物泵送至废料槽42。将洗涤缓冲液分配至通用试剂槽40并将其泵送至悬浮于分析槽41中的分析膜47顶部上，再泵送至废料槽42(重复多次)。最后，将照相机27定位于分配系统13，在悬浮于分析槽41中的分析膜47上方，记录该图像。然后，通过控制系统19处理所述图像资料并将结果传递给操作员。
图11描述了CARD的“4检测单元”布置的透视图，其包括槽层17、包括薄膜(非弹性体膜或薄膜)层30的流体传输层16和一个扩增反应器31及其附属系统45、46，以及用于支承分析槽41中分析膜47的穿孔的紧固环43一部分。更具体地，各示例性“四方形”CARD具有4个微阵列分析槽41(图9、11)，其包括可拆卸地设置于其中的微阵列分析膜47。一种示例性分析膜47由尼龙、硝化纤维、PVDF或任何本领域已知的其他合适材料制成。分析槽41具有在所述槽底部的支持平台或沿其底部内周延伸的框架或肩状结构。穿孔的、分段的或有凹口的紧固环可用于固定分析室中的膜。图13B所示为一个示例性的具有通道1708的穿孔紧固环43，通道1708用于从分析槽内输送流体经膜周边至槽的底部，再到槽的机部。在一个方面，两个紧固环43可用于将膜夹持于其间，或如图所示一个略小于所述膜但不小于所述穿孔环43内径尺寸的支撑平台可用于支持所述膜。
图12描述了“检测单元”的侧视图，其包括槽层17、包括限制通道39的薄膜层30的流体传输层16和扩增反应器31，其包括用于加注和空出扩增反应器的细流管44。
在PCR反应期间，例如，水溶液可从约30°C低温循环至约95°C高温重复循环(20-50次)。为防止所述水溶液因蒸发或浓缩而减小容积，例如，在整个溶液上方的管侧边，最好密封该溶液的暴露的表面，从而该反应不会因为缺少足够的溶液量或未密封环境下浓度发生改变而失败。
为防止蒸发或不受控制的浓缩，通常可将蜡、硅油、矿物油或其他物质引入至溶液顶面以防止蒸发；然而，使用这些材料有一些缺点。例如，矿物油在室温下为液态，因此，它给某些自动化系统带来操作问题。蜡在室温下为固态，对自动化系统来说其融化温度非常可控，但是蜡通常妨碍更需要的复杂PCR反应。硅酮与矿物油类似，在室温为液态，因此也有类似的操作问题，但其不妨碍PCR反应。
对于自动PCR系统，当PCR反应管(例如，31，图11、12)被加注后，具有能够自动覆盖溶液的物质则尤其有益。例如，可使用高纯度硅油和少量(很少%)蜡的受控混合物作为添加剂。在一个示例性方面，该混合物的组成为：蜡=1%至20%，硅油=99%至80%。根据一个方面，该混合物的组成为：约5%蜡和95%硅油。所述蜡可为标准PCR蜡(例如，西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)石蜡，熔点为58-62°C)。该混合物在室温和期望的储藏温度为固态。该混合物可铺成一层物质，位于该管的开口下方和流管44底部开口上方的PCR管(31)的上部内表面。分析物被引入至所述管中后，当第一轮热循环实施期间温度升高时，所述混合物融化并覆盖溶液的表面以防止蒸发，同时其对所述反应没有妨碍作用。反应完成后，在将扩增反应器中温度降至该混合物熔点以下时，可在混合物再固化之前或之后，将反应物从密封物以下经流管(44，图12)移除。在一个方面，该混合物可冷却而形成位于溶液上的一层固体盖帽，细流管44将溶液从该固化层以下抽吸出去。
图13A描述了“4检测单元”CARD的分解图，其包括槽层17、包括其薄膜层30的流体传输层16和扩增反应器31，其包括用于加注和空出扩增反应器的细流管44。该图还显示了二氧化硅过滤膜保持环36a、用于二氧化硅过滤槽36的二氧化硅过滤膜36b和用于支承分析室中分析膜47的穿孔紧固环43。
图14A-D描述了槽层17分析区一部分的一个替代性布置及其所附连的流体传输层16。该替代性布置用于覆盖分析膜47以改善循环的扩增物和分析槽41中分析膜47上的靶分子之间的接触。该覆盖可有开口以使得气泡可从分析槽41中排出。通过取消前述穿孔环布置43中所用的步骤或平台，该布置还可使得能够有效加热分析槽41。在该替代性布置中，所述分析膜直接位于薄膜层30上，薄膜层30依次直接设置于加热元件48a上。在一个检测中，分析反应期间热量供给通常是个重要步骤。该覆盖系统还允许有供给和排空分析槽的通道的不同布置。在该替代性布置中，由于所述膜位于槽的最底部，可以交替的方式在膜47的顶面冲洗所述流体。为了使所述膜保持在构成槽底部的薄膜层上，在分析槽41的基板层16a上形成一个突出部分，并如图14B所示在分析槽41的各端部的该突出部分下形成的通道口。分析槽41构造为长大于宽，其在各端口与通道口结合而允许有在分析膜长度上的有效流动，并进一步与所述覆盖结合而允许有改善的所述流体与分析膜表面的接触，使得流体中的扩增物更有效地与其附连至分析膜的靶标杂交。使用流体传输层16的泵和通道，使所述流体顺时针和反时针地交替循环以交替方向流经所述膜，可进一步改善所述布置。图14C描述了4检测单元的替代性气分平台15和垫圈层28的一个示例，其对应于图14A和14B描述的分析区的替代性布置。注意位于分析槽41下方所述气分平台15上的第二加热器48a。图14D描述了气分平台层15b的内部气动通道32，其显示了从气动供给系统18引入至15a底层的气动信号是如何进一步被分离并传送至15b表面上的特定垫圈层28空间。
图15A描述了气分平台15的一个示例性单个检测单元的分解透视图，其整合了气动磁性组件51和与其连接的多功能加热器48，用于制备、扩增和分析反应的需要。该图还包括可选的薄膜层53，其为流体传输层16和所述气分平台15之间的界面。所述系统可数个(例如，"Quad并连接至气动供给系统18以通过控制系统19并行地或以随机顺序来操作多个检测单元。所述系统提供了在检测期间所需的磁力使用，用于任何特定检测所需的操纵铁的、磁的或顺磁的颗粒。实践中所需的颗粒可通过分配系统13引入至槽层17的特定槽，并在所述检测的一些步骤期间与样品结合。或者，这些颗粒可在被装入样品输入槽33之前与样品结合，再或者，所述颗粒可在制造流体传输层16或槽层17的过程中预先装入至槽或通道中。
样品和所述颗粒的混合物可预先装入至位于气动活塞组件(可选择地，所述活塞组件可为电机或电磁启动的)51上的槽或通道中，或者，所述样品/颗粒混合物可被泵送至位于气动活塞组件(可选择地，所述活塞组件可为电机或电磁启动的)51上的槽或通道中。在其中的一种情形下，所述位于气动活塞组件(可选择地，所述活塞组件可为电机或电磁启动的)51上的槽或通道可从属于磁铁49，其位于固定在气动活塞组件(可选择地，所述活塞组件可为电机或电磁启动的)51的活塞杆52末端的磁铁支架50上，通过给气动活塞组件(可选择地，所述活塞组件可为电机或电磁启动的)51的汽缸提供正压，其引导磁铁进入含有样品/颗粒混合物的加热的槽55，非加热的槽56或通道正下方的位置。当磁力传送至具有样品/颗粒混合物的位点，所述检测则利用所述颗粒的磁性实现特定的检测要求；例如，将所述颗粒用于特定生物材料的浓缩步骤，所述生物材料被本领域已知的检测步骤，即基于磁性颗粒或其他普通颗粒吸附。
可选择地或组合地，所述气动磁铁系统51可被并入所述气分平台15的区域，从而进行中的所述颗粒和样品可同时进行加热和磁力作用。这种情形的一个实施例是用所述颗粒从较大的样品容积中浓缩出生物体。在这种情况下，当所述生物体被捕获时是活的，然后可对其进行热激以使得所述生物体表达其死亡后无法正常表达或不表达的RNA。在热激后，通过施加负压至气动活塞组件(可选择地，所述活塞组件可为电机或电磁启动的)51的汽缸而移除所述磁力，从而从加热的磁性槽55下方的位置撤走磁铁49，并将所述颗粒和带有生物体的浓缩样品的溶液泵送至另一个位置，以进行从所述生物体中提取RNA，进一步以与上述方法一致的方式扩增所述提取的RNA和分析所得的扩增物。
图15A还描述了可在与扩增反应器31分隔的槽54中供热，从而在分析扩增物之前变性扩增物，孵化标记反应，或改善特定反应的过程。其还描述了定位该扩增反应器的替代性方式。尽管该图没有在先前描述的管和细流管44布置中提供扩增反应器，但没有理由表明这样的管和细流管44布置与上述气动汽缸组件51不能一起使用。如图所示，所述气分平台15和流体传输层16之间的界面包括可选的薄膜层53，而非上述讨论的垫圈层28。所述薄膜层所起的作用同样是为薄膜层30提供一个分离的空间以使得当由气动信号驱动的气分平台15将负压施加到薄膜层30的未粘合区时其可弯曲至其中，所述气动信号在控制系统19指令下来自附连至气动供给系统18的气分平台15的气动通道32。
图15B描述了如图15A所示的相同原件，但没有薄膜层。因此，垫圈层28所起的作用如上述图7所示，且流体传输层16直接与所述气分平台15界面连接。所述无薄膜层的布置是有利的，因为无薄膜层时在生产和材料上成本更低而该系统的检测性能并无区别。
图16描述了单个检测单元的视图，其用于改善的快速检测稀少的目标物、非活体的和活体的水生生物体，并显示了功能性结构，包括气动磁铁51和多个加热的反应位点，以及该系统使用的槽和通道布置。特别地，该系统描述了如何将所述气分平台15与流体传输层16及其附连的槽层17组合配置，从而将热量递送至检测的不同步骤。在特定的情形，热量用于一个制备步骤的加热的磁力分离/浓缩/反应槽55中(其中可根据需要结合在槽55中加热选择性使用磁力)。在可选的加热之后，样品经流体传输层16传输用于检测的进一步的制备步骤。根据检测需要提取DNA或RNA后，将提取的DNA或RNA与扩增预混合液混合并经流体传输层16传输至扩增反应器31。如图16中所示，所述反应器在流体传输层16的平面上，尽管其也可使用如图11、12和13所配置的流体传输层16平面外的反应器。在扩增反应器31中产生了扩增物后，将其传输至加热的分析反应器54中对其进行加热变性和/或标记它们，或要求加热的一系列组合需要。然后，将扩增物传输至分析槽41(其也被构建为用于加热)以完成所述检测。
图17A-O还描述了如下所述的示例性分析过程：
如图17A所描述，将样品放入槽33/55，将缓冲液和磁珠(beads)分配至槽33/55，通过使用临近槽33/55的大薄膜抖动而轻度振荡地孵化。选择检测的合适温度和孵化时间。将磁铁49提升至槽33/55下的位置，然后将内容物泵送至废料槽35。
如图17B所描述，使磁铁49下降而从槽33/55下的位置中出来，将洗涤缓冲液分配至普通槽34(洗涤缓冲液1)，从普通槽34(洗涤缓冲液1)将洗涤缓冲液泵送至槽33/55以重悬浮磁珠。按上述的抖动温和地振动，然后将磁铁49提升至槽33/55下的位置，再将内容物泵送至废料槽35。
如图17C所描述，将多功能加热器48设置在合适的孵化温度(如果特定检测需要的话)，在进行适当孵化后，使磁铁49下降而从槽33/55下的位置中出来；将洗涤缓冲液分配至槽37/56并将其泵送至槽33/55以重悬浮磁珠，温和地振动，将多功能加热器48设置在合适的孵化温度(如果特定检测需要的话)；将细胞裂解缓冲液分配至通用试剂槽34(细胞裂解缓冲液)，将细胞裂解缓冲液泵送至槽33/55，按上述的抖动温和地振动，根据特定检测的需要加热；将有机醇(例如乙醇)分配至通用试剂槽34(乙醇)并将其泵送至槽33/55，按上述的抖动温和地振动，根据特定检测的需要加热。
如图17D所描述，将槽33/55的内容物泵送至二氧化硅过滤槽36中二氧化硅过滤膜36b的顶部上。
如图17E所描述，抽吸二氧化硅过滤槽36的内容物使其穿过二氧化硅过滤槽36中的二氧化硅过滤膜36b，再泵送至废料槽35，然后(可选地)打开真空端口59以抽吸空气穿过所述过滤膜。
如图17F所描述，将有机醇(例如乙醇)分配至通用试剂槽34(乙醇)并将其泵送至二氧化硅过滤槽36，至二氧化硅过滤槽36中二氧化硅过滤膜36b的顶部上；然后，重复如在图17E中所描述的步骤。
如图17G所描述，将相同的或另一种洗涤缓冲液分配至通用试剂槽34(洗涤缓冲液2)并将其泵送至二氧化硅过滤槽36，至二氧化硅过滤槽36中二氧化硅过滤膜36b的顶部上；然后，重复如图17E中所描述的步骤。
如图17H所描述，将相同的或另一种洗涤缓冲液分配至通用试剂槽34(洗涤缓冲液3)并将其泵送至二氧化硅过滤槽36，至二氧化硅过滤槽36中二氧化硅过滤膜36b的顶部上；然后，重复如图17E中所描述的步骤。
重复如图17H和17E中所描述的步骤；然后，重复如图17F和17E中所描述的步骤。
如图17I所描述，将洗涤缓冲液分配至槽37/56并将其泵送至二氧化硅过滤槽36，至二氧化硅过滤槽36中二氧化硅过滤膜36b的顶部上。加以恰当孵化，然后将其泵送回到槽37/56。
如图17J所描述，将结合缓冲液分配至槽37(结合缓冲液)并将其泵送至槽37/56；然后将磁珠分配至槽37/56；恰当地孵化和摇动。将磁铁49提升至槽37/56下的位置，再将槽37/56的内容物泵送至废料槽35。
如图17K所描述，使磁铁49下降以从槽37/56下方的位置出来。将相同的或另一种洗涤缓冲液分配至槽37(洗涤缓冲液A)，并将槽37的内容物(洗涤缓冲液A)泵送至槽37/56以重悬浮所述磁珠。恰当地温和振动。将磁铁49提升至槽37/56下的位置，再将槽37/56的内容物泵送至废料槽35。重复多次。
如图17L所描述，使磁铁49下降以从槽37/56下方的位置出来。将相同的或另一种洗涤缓冲液分配至槽37(洗涤缓冲液B)，并将槽37的内容物(洗涤缓冲液B)泵送至槽37/56以重悬浮所述磁珠。恰当地温和振动。将磁铁49提升至槽37/56下的位置，再将槽37/56的内容物泵送至废料槽35。使磁铁49下降以从槽37/56下方的位置出来。将相同的或另一种洗涤缓冲液分配至槽37(洗涤缓冲液B)，并将槽37的内容物(洗涤缓冲液B)泵送至槽37/56以重悬浮所述磁珠。恰当地温和振动。将磁铁49提升至槽37/56下的位置，再将槽37/56的内容物泵送至槽37(洗涤缓冲液B)以清洁槽37/56和扩增预混合液槽38之间的通道和薄膜。
如图17M所描述，使磁铁49下降以从槽37/56下方的位置出来。将扩增预混合液分配至扩增预混合液槽38，并将扩增预混合液槽38的内容物泵送至槽37/56以重悬浮所述磁珠。恰当地温和振动。将槽37/56的内容物泵送回扩增预混合液槽38。泵送或抽吸扩增预混合液槽38的内容物至扩增反应器直至废弃以完全填满所述扩增反应器。以合适的温度和次数进行孵化用于扩增。
如图17N所描述，将杂交缓冲液分配至分析槽41(杂交缓冲液)并泵送一部分至废料槽42。将一部分槽41的内容物(杂交缓冲液)泵送至槽54(加热的分析槽)。将扩增反应器的部分内容物泵送至废料槽42。将扩增反应器的部分内容物和槽41的另一部分内容物(杂交缓冲液)泵送至槽54(加热的分析槽)。
如图17O所描述，根据需要将任何其他所需的试剂分配至槽54(加热的分析槽)。根据需要摇动、加热和孵化槽54(加热的分析槽)的内容物。将槽54(加热的分析槽)的所有或部分内容物泵送至槽41(分析槽)以进行槽54(加热的分析槽)内容物的分析。将流动的缓冲液分配至槽41(流动的缓冲液)，当所有早期泵送至槽41(分析槽)的内容物消耗完后，将槽41的内容物(流动的缓冲液)泵送至槽41(分析槽)以完成所述分析。最后，目测分析槽41(分析槽)中过滤膜上显示的结果。
图18描述了气分平台15的侧截面视图，其具有整合的气动活塞组件51，其中一个组件位于多功能加热器组件48中，其中一个组件位于所述系统的准备区。该图特别显示了用于所述系统准备区的气动活塞组件(可选择地，所述活塞组件可为电机或电磁启动的)51的内部部件。
图19描述了气分平台15的侧截面视图，其具有整合的气动活塞组件(可选择地，所述活塞组件可为电机或电磁启动的)51，所述气动活塞组件51位于多功能加热器组件48中，以及其内部部件。
图20所示为双检测单元布置的分层顶视图，其显示了所述气分平台15的示例性可替代功能，整合了针对磁力分离/浓缩通道区57的气动磁性组件51而不是如图17A-O所述的槽，还包括所述系统使用的槽和通道布置。
图21A-K进一步描述了如下示例性分析过程：
如图21A所描述，将样品放入样品输入槽33，将酶分配至通用试剂槽34并将其泵送至样品输入槽33。以轻度振荡孵化。将细胞裂解缓冲液分配至通用试剂槽34并将其泵送至样品输入槽33。以轻度振荡孵化。将磁珠分配至通用试剂槽34并将其泵送至样品输入槽33。以轻度振荡孵化。将有机醇(例如异丙醇)分配至通用试剂槽34并将其泵送至样品输入槽33，以轻度振荡孵化。
如图21B中所描述，将磁铁49提升至分离/浓缩通道57下的位置，再将所述内容物泵送至废料槽35。使磁铁49下降以从分离/浓缩通道57下的位置出来。将洗涤缓冲液分配至通用试剂槽34(准备)，再将其泵送至分离/浓缩通道57，并顺时针和逆时针交替地循环多次流经分离/浓缩通道57以重悬浮和洗涤磁珠。将磁铁49提升至分离/浓缩通道57下的位置，再将所述内容物泵送至废料槽35。使磁铁49下降以从分离/浓缩通道57下的位置出来。将相同的或另一种洗涤缓冲液分配至通用试剂槽34(准备)，再泵送至分离/浓缩通道57，并顺时针和逆时针交替地循环多次流经分离/浓缩通道57以重悬浮和洗涤磁珠。将磁铁49提升至分离/浓缩通道57下的位置，再将所述内容物泵送至废料槽35。根据检测的需要继续上述洗涤步骤。将洗涤缓冲液分配至通用试剂槽34(准备)并将其泵送至废料槽35以清除准备区的槽、通道和薄膜的任何残留试剂。
如图21C中所描述，将所述溶液从分离/浓缩通道57泵送至通用试剂槽34(准备)。将高盐缓冲液分配至通用试剂槽34(准备)。将有机醇(例如乙醇)分配至通用试剂槽34(准备)。通用试剂槽34的内容物(准备)泵送至至二氧化硅过滤槽36中二氧化硅过滤膜36b的顶部上，抽吸所述内容物使其流经二氧化硅过滤槽36的二氧化硅过滤膜36b，再泵送至废料槽35。
如图21D中所描述，将相同的或另一种洗涤缓冲液分配至通用试剂槽34(洗脱)，泵送至二氧化硅过滤槽36中二氧化硅过滤膜36b的顶部上，抽吸所述内容物使其流经二氧化硅过滤槽36的二氧化硅过滤膜36b，再泵送至废料槽35。根据所述检测的需要用相同的或替代性的洗涤缓冲液重复操作。
如图21E中所描述，将洗脱缓冲液分配至槽37(洗脱)，并向上泵送其穿过二氧化硅过滤槽36中二氧化硅过滤膜36b的底部。
如图21F中所描述，抽吸二氧化硅过滤槽36的内容物使其流经二氧化硅过滤膜，再将其泵送至洗脱槽37(中心)，然后同样地泵送至洗脱槽37L和37R；或绕过洗脱槽37(中心)直接将等量物质泵送至槽37L和37R。
如图21G中所描述，将扩增预混合液分配至槽38L和38R。根据所述检测，分配至单独槽中的预混合液可含有或不含相同的引物。在所述描述中，最初的样品被分为两等份。根据特定检测和提供的进一步容纳分开的样品的槽、通道和扩增反应器布局，所述样品保持为单份、或分为多于两个等份。将槽37L和扩增预混合液槽38L中的溶液泵送至扩增反应器31L和31R(对于左侧的检测单元描述了两个反应器，尽管单个扩增反应器是必需的，也可能多于两个)。在右侧的检测单元中重复操作。以合适的温度和次数孵化用于扩增。
如图21H中所描述，将预杂交缓冲液分配至通用试剂槽40(左和右)，并由此进入扩增反应器31(左和右)，直至到分析槽41(左和右)中的分析膜47(左和右)顶部上。
如图21I中所描述，将扩增反应器31(左和右)的内容物泵送至分析槽41(左和右)中的分析膜47(左和右)的顶部上，并循环操作多次，以在扩增物和附连至分析膜47(左和右)的靶标之间提供足够的接触。当实现了满意的杂交时，将所述内容物泵送至废料槽42。将洗涤缓冲液分配至通用试剂槽40(左和右)，并泵送至悬浮于分析槽41(左和右)中的分析膜47(左和右)的顶部上，再泵送至废料槽42(重复多次)。
如图21J中所描述，将合适的扩增物显色剂(例如，辣根过氧化物酶("HRP"))分配至通用试剂槽40(左和右)，并泵送至悬浮于分析槽41(左和右)中的分析膜47(左和右)的顶部上，循环操作直至反应满意地完成，然后将内容物泵送至废料槽42。将洗涤缓冲液分配至通用试剂槽40(左和右)，并泵送至悬浮于分析槽41(左和右)中的分析膜47(左和右)的顶部上，然后将内容物泵送至废料槽42。重复多次。
如图21K中所描述，将显色剂反应物(例如，四甲基联苯胺"TMB")分配至通用试剂槽40(左和右)，并泵送至悬浮于分析槽41(左和右)中的分析膜47(左和右)的顶部上，如上所述循环操作直至试剂完全反应(例如，TMB和HRP)，再将内容物泵送至废料槽42。将洗涤缓冲液分配至通用试剂槽40(左和右)，并泵送至悬浮于分析槽41(左和右)中的分析膜47(左和右)的顶部上，再泵送至废料槽42(重复多次)。最后，将照相机27定位于分配系统13，在悬浮于分析槽41(左和右)中的分析膜47(左和右)上方，并记录该图像。然后，通过控制系统19处理所述图像资料并将结果传递给操作员。图24-25描述了如本文所述的使用CARD装置自动化分析组织样本的非限制性示例方法。图45显示使用图20中所示的CARD配置，按照根据图21-22中所示的方法，成功地将DNA纯化、洗脱和扩增。凝胶上显示的条带为扩增的假丝酵母(可导致败血症的酵母)25S rRNA。柱头样品为-Ct1，其表示标准品阴性对照。+Ct1为标准品阳性对照。S1-S4为4个CARD电泳。S1-S4的白色方框结果为来自CARD并在纯化的第二步之前扩增的样品等份。在这个实施方案中，先将所述核酸纯化，然后洗脱(纯化和2种洗脱有两个阶：一是从第一阶段至第二阶段，然后从第二阶段洗脱)、扩增、跑凝胶电泳。结果证明，纯化的第二阶段提供了显著改善的目标物扩增。这种情形下，扩增假丝酵母25S rRNA的引物进入到全血样品中。
参照图24，与通常的混合样品相反，将所述组织样品用直径3mm的刀具切割。将刀具插入至样品槽，然后开动刀具柱塞，将切割好的样品转移至分析室。更具体地，参照图25，按前述装入样品；控制器将细胞裂解缓冲液/蛋白酶K分配至试剂槽；所述细胞裂解缓冲液/蛋白酶K被泵送至样品槽；将混合物循环；控制器将乙醇分配至试剂槽；将乙醇与反应溶液混合；将反应溶液泵送至二氧化硅过滤膜顶部的纯化器；所述反应溶液被泵送经由二氧化硅膜穿过二氧化硅过滤膜进入废料槽。此外，放入样品之前可将筛子放入所述槽中，从而所述组织经过筛子而增加样本的表面积，使试剂有效地与样本反应。
图22描述了通道式磁力分离/浓缩系统的双检测单元布置的，其显示了槽层17、流体传输层16、薄膜层30，而扩增反应器31平面外显示了其组件部件。图22还包括二氧化硅过滤系统36a和36b。
核酸
在一些实施方案中，本发明提供扩增和/或分离目标核酸分子(本文也称为“目标核酸”、“靶核酸”、“靶多核苷酸”)的方法。分离的核酸分子(或“分离的核酸”)是分离自存在于核酸分子的自然来源的其他核酸分子。优选地，“分离的”核酸没有自然地位于该核酸源自的生物体基因组DNA中的核酸侧面(即，位于核酸5'和3'端的序列)的核酸序列(例如，蛋白质编码序列)。在其他实施方案中，所述分离的核酸没有内含子序列。
“目标核酸”、“靶核酸”、“靶多核苷酸”是指特定的目标多核苷酸序列分子。可用本发明方法分析的这类目标核酸包括，但不限于，DNA分子，如基因组DNA分子、cDNA分子及其片段，包括寡核苷酸、表达序列标签("ESTs")、序列标签位点("STSs")等。可用本发明方法分析的这类目标核酸还包括RNA分子，但不限于，如信使RNA(mRNA)分子、核糖体RNA(rRNA)分子、cRNA(即，由体内转录的cDNA分子制备的RNA分子)及其片段。在各种实施方案中，所述分离的核酸分子可含有小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，其自然地位于该核酸源自的细胞基因组DNA中的核酸分子侧面。另外，分离的核酸分子，如cDNA分子，可基本上没有其他细胞物质，没有用重组技术制备时的培养媒介物，或没有进行化学合成时的化学前体物或其他化学物质。
所述目标核酸可为DNA或RNA，或其嵌合混合物或衍生物或修饰版本。所述核酸可在基本部分、糖部分或磷酸骨架进行修饰，并可包括其他附加的基团或标签。
例如，在一些实施方案中，所述核酸可包括至少一个修饰的基本部分，其选自下组(包括但不限于)：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(queosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤,尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、OSYW(wybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-巯基胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶,尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯,尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2,6-二氨基嘌呤。
在另一个实施方案中，所述核酸可包括至少一个修饰的糖部分，其选自(包括但不限于)：树胶醛糖、2-氟树胶醛糖、木酮糖和己糖。
在又一个实施方案中，所述核酸可包括至少一个修饰的磷酸骨架，其选自(包括但不限于)：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酰胺酯、磷酰胺酯、磷酰二胺酯、甲基磷酸酯、烷基磷酸三酯和甲缩醛(formacetal)或其类似物。
用作引物、探针或模板的核酸可市购或由本领域已知的标准方法获得，例如，使用自动化DNA合成器(如，购买自BiosearchTechnologies公司，加利福尼亚州诺瓦托；Applied Biosystems公司，加利福尼亚州福斯特市等)和标准的亚磷酰胺化学；或使用非特异性核酸裂解化学物质或酶或位点特异性限制内切酶裂解大的核酸片段。
如果来自一个物种的目标核酸的序列是已知的，而另一个物种的对应基因是所需基因，本领域通常是根据该已知序列设计探针。所述探针与所需序列来源物种的核酸杂交，例如与来自目标物种基因组或DNA文库的核酸杂交。
在一个实施方案中，核酸分子被用作探针，其在适当的严格条件下与扩增的、分离的目标核酸互补或可杂交。
在另一个实施方案中，核酸分子被用作探针，其在适当的严格条件下与扩增的目标核酸杂交且至少95%互补。
在另一个实施方案中，核酸分子被用作探针，其至少45%(或55%、65%、75%、85%、95%、98%或99%)与目标核苷酸序列相同或互补。
在另一个实施方案中，核酸分子被用作探针，其包括目标核酸的至少25(50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800或4000)个核苷酸的片段或其互补片段。
在另一个实施方案中，核酸分子被用作探针，其在适当的严格条件下与具有目标核苷酸序列的扩增核酸分子杂交或互补。在其他实施方案中，核酸分子被用作探针，其长度可为至少25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800或4000个核苷酸，且可在适当的严格条件下与目标扩增核酸分子杂交或为其互补片段。
可用于检测扩增的目标核酸的探针(或模板)的核酸可通过本领域已知的任何方法获得，例如，通过使用可与目标核苷酸序列的3'和5'端杂交的合成引物通过聚合酶链反应(PCR)，和/或通过使用对所述核苷酸序列有特异性的寡核苷酸探针从cDNA或基因组克隆而从质粒获得。基因组克隆可通过在合适的杂交条件下探测基因组DNA文库而确定，例如，根据探针与待探测的基因组DNA的相关性的高度、低度或中度严格条件。例如，如果用于目标核苷酸序列的探针和所述基因组DNA来自相同的物种，那么可使用高度严格的杂交条件；然而，如果探针和所述基因组DNA来自不同的物种，那么可使用低度严格的杂交条件。高度、低度和中度严格条件均为本领域熟知的条件。
可使用本领域已知的标准方法对扩增的目标核酸进行可检测的标记。
所述可检测的标记可为荧光标记，例如，通过组合核苷酸类似物。适用于本发明的其他标记，包括但不限于：生物素、亚氨基生物素、抗原、辅因子、二硝基酚、硫辛酸、烯族化合物、可检测的多肽、富电子分子、通过作用于底物而能产生可检测信号的酶和放射性同位素。优选地，放射性同位素包括32P、35S、14C、15N和1251，仅举上述例子。适用于本发明的荧光分子，包括但不限于：荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、德克萨斯红、5'-羧基-荧光素("FMA")、2',7'-二甲氧基-4',5'-二氯-6-羧基-荧光素("JOE")、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基-罗丹明("TAMRA")、6'-羧基-X-罗丹明("ROX")、HEX、TET、IRD40和IRD41。适用于本发明的荧光分子还包括：菁染料(cyaminedyes)，包括但不限于：Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7和FluorX；BODIPY染料，包括但不限于：BODIPY-FL、BODIPY-TR、BODIPY-TMR、BODIPY-630/650和BODIPY-650/670；ALEXA染料，包括但不限于：ALEXA-488、ALEXA-532、ALEXA-546、ALEXA-568和ALEXA-594；以及其他本领域已知的荧光染料。适用于本发明的富电子指示剂分子，包括但不限于：铁蛋白、血蓝蛋白、胶态金。可选地，可通过为其特异性配位第一基团而标记扩增的目标核酸(靶多核苷酸)。与第一基团具有亲和力、共价连接至指示剂分子的第二基团，可间接用于检测靶多核苷酸。在这样一个实施方案中，适用于作为第一基团的化合物，包括但不限于：生物素和亚氨基生物素。
本发明方法扩增和分析(例如，检测)的目标核酸可与一个或多个探针接触，条件是多核苷酸分子具有与杂交探针互补的序列。如本文所用，“探针”是指特定序列的多核苷酸分子其能够与具有特定序列(通常为与探针序列互补的序列)的目标核酸分子杂交，从而靶多核苷酸分子和探针的杂交能够被检测到。所述探针的多核苷酸序列可为，例如DNA序列、RNA序列或DNA和RNA聚合物的序列。例如，所述探针的多核苷酸序列可为提取自细胞的基因组DNA、cDNA、mRNA或cRNA序列的全部或部分序列。所述探针的多核苷酸序列也可为合成的序列，例如通过本领域技术人员已知的寡核苷酸合成技术。所述探针序列也在体内酶法合成，体外酶法合成(例如，通过PCR)或体外非酶法合成。
优选地，将用于本发明方法的探针固定在固体载体或表面上，从而未与探针或多个探针杂交或结合的多核苷酸序列可被冲洗掉并去除，但不会去除与其结合或杂交的探针或多个探针和任何多核苷酸序列。将探针固定在固体载体或表面上的方法是本领域所熟知的。在一个特定的实施方案中，所述探针可包括一个阵列的不同多核苷酸序列，其结合至固体(或半固体)的载体或表面上，如玻璃表面或尼龙或硝化纤维薄膜。最优选地，所述阵列为可寻址的阵列，其中各不同探针位于所述载体或表面上特定的已知位点，从而根据其在所述载体或表面上的位点可确认测定出的特定探针。在一个具体的实施方案中，由Zhou等人描述于WO 2009/049268A1(公开于2009年4月16日)中的方法可用于将核酸探针固定在固体的载体或表面上。
尽管本发明所用的探针可包括任何种类的多核苷酸，在优选的实施方案中，所述探针包括寡核苷酸序列(即，长度为约4至约200个碱基的多核苷酸序列，且更优选其长度为约15至约150个碱基)。在一个实施方案中，所用的短寡核苷酸序列长度为约4至约40个碱基，且更优选其长度为约15至约30个碱基。然而，本发明更优选的实施方案所用的长寡核苷酸探针的长度为约40至约80个碱基，且尤其优选长度为约50至约70个碱基的寡核苷酸序列(例如，长度为约60个碱基的寡核苷酸序列)。
CARD的应用
对于本领域技术人员来说，显然本文公开的基于CARD的诊断检测可用于许多不同的应用，其中目前应用于台式(bench-top based)的检测。塑料CARD的设计使得可将所有需要的微流体网络、阀门、泵和槽结合至简单、便宜的一次性使用微流体器件上。由于所有检测功能(即，流动和混合速率、温度控制，包括热循环、驻留时间等)可很容易地通过软件控制，因此不同技术水平的人员可以容易地实施复杂的多个PCR检测。而且，CARD可插入至轻便的电池操作供医疗点用的（POC，point of care）控制器或具有更高产能的EncompassMDxTM工作台。无论选择何种形式，都可实现轻松操作。
本领域技术人员可通过对扩增引物的选择和检测探针的选择来调整所述CARD以用于任何目标核酸序列的检测。
在一个实施方案中，所述CARD可用于进行分子诊断检测，基于个体基因组背景，其可提供对其潜在疾病状态的掌控基础。
在另一个实施方案中，所述CARD可用于进行药物基因组学敏感性筛选，例如，遗传的药物敏感倾向、药物组合物、目标化学制品或化合物。
在另一个实施方案中，所述CARD可用于进行致癌筛选检测，即筛选与癌症易患倾向相关的目标核酸。
在另一个实施方案中，所述CARD可用于进行感染性致病剂、病原体或败血症的筛选检测。
在另一个实施方案中，所述CARD可用于单核苷酸多态性(SNPs)分析，其用于肿瘤学目的，药物基因组学目的，伴随诊断(剂量或其他对特定药物组合物特异性的需求)或检测可传染的或不传染的感染性疾病。
在另一个实施方案中，所述CARD可用于工业或环境检测，针对感染人类、动物或植物的目标生物体，或针对加工的食品或非加工的食品中腐败微生物。
在另一个实施方案中，所述CARD可用于工业上的检测，用于监测娱乐用水(海滩、泳池、公园等的水)，或饮用水、压舱水或处理后废水的水处理系统。
在另一个实施方案中，所述CARD可用于进行分布于大容量液体中的稀少靶核酸的筛选检测。
在另一个实施方案中，所述CARD可用于进行稀少靶核酸的筛选检测，其中所述稀少靶核酸区别于样品中非靶核酸的高本底。
在一些实施方案中，所述CARD可容易地调整为具有多个扩增反应器(例如，31，图11、12)，其隔离竞争性引物并注入至单个分析槽41，从而多个扩增反应器可同时对来自单个样品的核酸操作。
本领域技术人员可调整所述CARD以进行任何本领域已知的热介导的核酸扩增，包括但不限于：聚合酶链反应(PCR)、反转录酶(RT-)PCR、CDNA末端快速扩增(RACE)、滚动循环扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链反应、转录相关的扩增(TAA)、冷PCR和非酶法扩增技术(NEAT)。
除了加热CARD用于核酸扩增，可加热所述CARD以测定检测的生物体(例如，该生物体表达的热激相关的RNA的存在)的存活力。加热还可用于在进行分析如单核苷酸多态性(SNPs)检测中调整杂交的严格性。
本领域技术人员可调整所述CARD以适应任何本领域已知的扩增物的分析或检测方法，包括但不限于：比色法、荧光比色法、化学发光法、电化学法、电泳法、横流法、蛋白质微阵列法、核酸微阵列法、荧光法或上述各种检测方法的组合。
提供以下实施例用于说明而非限制本发明。
实施例
实施例1：华法林敏感性的药物基因组学检测
该实施例描述了华法林敏感性药物基因组学检测的一个特定实施方案，其已经被完全自动化地整合到CARD上。进行反向斑点杂交(RDB)以分析所述结果，尽管如下所述，也可使用引物延伸方法。通过选择引物和探针，熟练的从业者可容易地调整下述方法以用于任何目标物的单核苷酸多态性(SNP)检测，并可用于其他检测，例如致癌筛选检测。
通常，在CARD上进行的检测包括下列步骤：
1.直接将原始样本应用于CARD上(仅有的操作员步骤)。
2.化学细胞裂解。
3.通过结合到CARD中二氧化硅柱上而进行核酸提取和纯化。
4.从二氧化硅柱上洗脱纯化的核酸。
5.将一份纯化的核酸与PCR预混合物混合，所述PCR预混合物含有进行PCR扩增所需的所有试剂，包括缓冲液、引物、核苷三磷酸、氯化镁、Taq DNA聚合酶和尿嘧啶-DNA糖基酶（UNG），其用于确保不可能发生扩增物交叉污染。
6.将完整的混合物引入至PCR热循环槽中，其直接位于嵌入所述进气总管的电阻加热器上，然后启动热循环程序。
7.完成热循环程序后，将扩增物引入至测定模块进行检测，例如，通过引物延伸方法(图26A-B)或反向斑点杂交(RDB)检测(图29)。
8.对分析膜上的检测点进行摄影和分析，例如通过引物延伸方法或RDB膜。
9.将检测目标的结果提供给用户。
在这个实施方案中尽管使用了PCR扩增，应用上述方法可采用任何本领域已知的热介导的核酸扩增，包括但不限于：聚合酶链反应(PCR)、反转录酶(RT-)PCR、CDNA末端快速扩增(RACE)、滚动循环扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链反应、转录相关的扩增(TAA)、冷PCR和非酶法扩增技术(NEAT)。
参考图14A-14L和图18中槽的变形，使用下列操作和试剂进行药物基因组学研究，其涉及已知为华法林敏感性指示器的三个单独的SNP(CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1*2)的单核苷酸多态性(“SNPs”)。
探针组
使用下列探针组测定CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1*2：
CYP2C9*2_WT/5AmMC6/TGAGGACCGTGTTCA(SEQ ID NO:113)
CYP2C9*2_MUT/5AmMC6/TGAGGACTGTGTTCA(SEQ IDNO:114)
CYP2C9*3_WT/5AmMC6/A AGG TCA ATG TAT CTC T(SEQID NO:115)
CYP2C9*3_MUT/5AmMC6/AGG TCA AGG TAT CTC(SEQ IDNO:116)
VKORC1_WT/5AmMC6/CAT CGA CCC TTG GAC(SEQ ID NO:117)
VKORC1_MUT/5AmMC 6/GTC CAA GAG TCG ATG A(SEQ IDNO:118)
样品添加和细胞裂解
a.操作员将5μl血液或悬浮的口腔粘膜拭子样品加入至样品输入槽。
b.将30μl细胞存储缓冲液分配至试剂输入槽，并将其泵送至样品输入槽。
c.将30μl蛋白酶K和细胞裂解缓冲液的混合物分配至试剂输入槽，并将其泵送至样品输入槽，孵化5分钟。
d.将30μl乙醇分配至试剂输入槽，并将其泵送至样品输入槽。
e.将样品输入槽的所有内容物泵送至所述纯化槽中的过滤膜顶部，然后抽吸所述内容物穿过过滤膜，并将其泵送至废料槽。
f.将40μl乙醇分配至试剂输入槽，并将其泵送至所述纯化槽中的过滤膜顶部，然后抽吸所述内容物穿过过滤膜，并将其泵送至废料槽。
g.将70μl洗涤缓冲液1分配至试剂输入槽，并将其泵送至所述纯化槽中的过滤膜顶部，然后抽吸所述内容物穿过过滤膜，并将其泵送至废料槽。
h.将70μl洗涤缓冲液2分配至试剂输入槽，并将其泵送至所述纯化槽中的过滤膜顶部，然后抽吸所述内容物穿过过滤膜，并将其泵送至废料槽。
i.将90μl水分配至试剂输入槽并将其泵送至废料槽。
j.将70μl洗脱缓冲液分配至试剂输入槽，并将其泵送至所述纯化槽中的过滤膜顶部，然后将其泵送至废料回到其来自的通道。然后抽吸任何残留流体使其穿过所述过滤膜，并将其泵送至废料槽。
洗脱
a.将50μl洗脱缓冲液分配至一个洗脱槽，并泵送其一部分至另一个洗脱槽，然后将其剩余部分向上泵送穿过纯化槽中过滤膜底部，通过将其交替地注入和空出纯化槽至少2次来抖动。
PCR装载
a.将12μl PCR预混合液1分配至一个预混合液槽，然后重复操作将12μl PCR预混合液2分配至另一个预混合液槽。
b.将少量(3次弯曲的薄膜)纯化槽的内容物泵送至第二洗脱槽，该槽中泵送有洗脱缓冲液。
c.泵送单次弯曲的薄膜以驱动少量物质从纯化槽至一个扩增槽，然后向该同一扩增槽中加入来自该扩增槽同一侧的预混合液槽中的预混合液。重复操作以加注第二扩增槽。
PCR
a.于37°C 10分钟
b.于95°C 2分钟
c.循环40x
i.于95°C 30秒
ii.于45°C 30秒
iii.于72°C 30秒
iv.于72°C 3分钟
反向斑点杂交(RDB)过滤膜灭活处理
在PCR热循环期间进行RDB过滤膜灭活处理，从而所述两个步骤与扩增完成相协调。
a.将80μl水泵送至分析试剂槽，并将其泵送至所述分析过滤膜，然后各顺时针和反时针交替循环15次后废弃。
b.将80μl的0.1N NaOH泵送至分析试剂槽，并将其泵送至所述分析过滤膜，顺时针和反时针交替循环15次，再泵送至废料槽。
c.将80μl水泵送至分析试剂槽，并将其泵送至所述分析过滤膜，然后各顺时针和反时针交替循环15次后废弃。重复该两个步骤多次。
预杂交
a.将80μl SS缓冲液(0.15M NaCl+0.01M磷酸钠+0.001MEDTA+0.1%SDS，最终pH 7.25-7.50)分配至分析试剂槽，并将其泵送至所述分析过滤膜，进行循环；将80μl水分配至分析试剂槽，并将其泵送至所述分析过滤膜，然后顺时针和反时针交替循环5次，然后不循环地孵化10分钟。
扩增物移出
在用于预杂交的10分钟孵化期间，可开始这些步骤。
a.在加入SS缓冲液前，将扩增反应器的温度升高至95°C 30秒。
b.同时将80μl SS缓冲液分配至分析试剂槽，并将其泵送至一个扩增反应器中。对另一个扩增反应器进行重复操作。各扩增反应器孵化3分钟。
c.关闭扩增加热器，并冷却扩增反应器以使得所述蜡/硅油固化所述密封层，从而当移除扩增物时所述液相的蜡/硅油不随扩增物一起被移除。
杂交
a.进行扩增物移出步骤a-c的同时，排空所述分析槽，将分析槽下的加热器温度升高至50°C以加热所述膜。
b.向各扩增反应器泵送3次冲程，以将各反应器的一些内容物泵送至分析膜。
c.通过顺时针和反时针交替循环，孵化分析槽的内容物15分钟。最好使用覆盖的分析槽设计以改善所述反应。然后排空所述内容物至废料槽。
d.将80μl SS缓冲液泵送至分析试剂槽，并将其泵送至所述分析过滤膜，然后各顺时针和反时针交替循环15次，然后泵送至废料槽。重读操作2次。
e.将分析槽温度降至低于30°C。
f.将80μl SS缓冲液泵送至分析试剂槽，并将其泵送至所述分析过滤膜，然后循环一次并孵化5分钟，每次循环1分钟再泵送至废料槽。
结合
a.将80μl HRP分配至分析试剂槽，并将其泵送至所述分析膜，将其顺时针和反时针交替循环10分钟，再泵送至废料槽。
b.将80μl SS缓冲液泵送至分析试剂槽，并将其泵送至所述分析过滤膜，然后顺时针和反时针交替各循环15次，再泵送至废料槽。重读操作3次。
底物添加
a.将80μl TMB分配至分析试剂槽，并将其泵送至所述分析膜，将其顺时针和反时针交替循环5分钟，再泵送至废料槽。
b.将80μl水分配至分析试剂槽，并将其泵送至所述分析膜，将其顺时针和反时针交替循环15次，再泵送至废料槽。重读操作2次。
图像分析
a.将照相机置于分析膜上方并记录图像。
b.将图像发送至控制系统进行处理。
c.报告结果。
实施例2：基于CARD的快速和自动化检测单核苷酸多态性(SNPs)的方法
引言
该实施例描述了CARD的应用，其用于进化分子诊断学领域并体现了低成本分析临床原始样品的CARD技术。一旦原始样本被引入至CARD后，所有的检测功能，包括细胞裂解、核酸纯化、多重PCR和终点法分析，都会自动化实施。
所述CARD被用于药物基因组学检测以测定与华法林(warfarin)敏感性相关的单核苷酸多态性(SNPs)。分析了来自20位个体志愿者的原始口腔粘膜拭子样品，通过在CARD上实施的华法林敏感性检测确认的SNP图样经双向DNA测序证实。然而，通过选择引物和探针，熟练从业者可容易地调整下述药物基因组学方法指南以检测任何目标核酸序列或SNP。这样的检测可用于，例如，筛选病毒性病原体、致癌基因或其他目标基因突变、变异或标记，几乎可以检测任何细胞或组织。
背景
分子诊断学应用自1980年代早期兴起以来得到很大的发展，尤其是作为可检测导致感染性疾病的缓慢生长或苛养细菌的方法。分子诊断学也大大促进了病毒性病原体的检测，包括病毒载量检测。由于可获得更多的人类基因组资料，分子诊断学应用在药物基因组学、伴随诊断和其他个性化医疗应用中得到进一步的发展。尽管有其能力和多功能性，然而，需要高度训练的人员和昂贵设备限制了将分子诊断学应用于专门实验室或配备适当设备和人员的中心实验室。
尽管基于横流层析检测方式的免疫学检测(例如，妊娠检测)，已发展了许多有效的“快速现场测试”(POC)诊断法，实施更复杂的分子检测的能力还未完全达到易用且便宜的POC形式。在分子诊断学能够更广泛地应用于各种POC设置以前，该检测需要进行简化和减少所需的设备。目前“台式(bench top)”分子检测需要高度训练的人员花费很大的努力从原始临床样本开始，制备样品用于分析。随后的基因扩增和测定步骤也需要相当的技术和昂贵的设备。另外，横向流动POC检测通常依赖于对测试条上的颜色强度的主观解释，如果能够提供清晰而客观的数字化结果，那么来自更为复杂的分子检测的结果就会更有意义。如果这些过程能够以无缝连接的全自动方式被整合，那么各种不同水平的技术人员就能够进行一系列的POC分子检测，并以经济的检测方式获得对结果的客观、清晰解释。
分子POC市场面临的挑战导致引入了一些“样品-结果(sample-to-results)”平台，但在将样品引入系统中进行基因扩增和检测之前，大多数还需要对样品进行分开的“样品制备”步骤和/或设备或可观的样品“预制备”。为实现真正的“样品-结果”简单化，现已研制出一个平台，将全部所需的样品制备、检测和测定步骤整合至一个能实现全自动分子诊断检测的单独、便宜和便携的塑料器件。该实施例中描述的CARD仅需引入原始样品，则随后的步骤可自动化实施。该器件的低成本资产设备和一次性用品，以及无需“手动”操作，将有助于使分子诊断学用于全面的临界和快速现场测试成为现实。
材料和方法
检测
优化“台式”检测以建立各种可转化至CARD的全自动平台参数。使用本领域已知的方法设计引物和探针分别用于扩增和捕获。如果任何待分析的生物体难于细胞裂解，其还涉及对标准的化学性细胞裂解和核酸纯化方法进行优化。
所有序列获自美国国家生物技术信息中心(NCBI)(www.ncbi.nlm.nih.gov)。使用本领域的标准方法设计引物和探针，采用CLC Sequence Viewer软件(www.clcbio.com)，美国集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies)的SciTools,(www.idtdna.com/scitools/)和NCBI Primer Blast软件(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)。所用引物和探针在美国集成DNA技术公司(衣阿华州科尔维尔)合成。所有微生物和病毒DNA购自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)(ATCC中心，弗吉尼亚州马纳萨斯市)。
华法林敏感性检测
去识别的口腔粘膜拭子获自征得同意的志愿者，将细胞裂解后提取DNA。在CARD上使用引物进行DNA扩增，所述引物设计用于扩增已知的报告华法林敏感性CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1*2(27-32)的3个单独SNP附近的区域。所述CYP2C9*2和CYP2C9*3SNPs对应于细胞色素P450基因中的突变，VKORC1*2对应于维生素K环氧化物还原酶复合体子单元1基因中的突变。
纯化之后，所述DNA分开至两个不同的PCR反应中；一个混合物中含有用于扩增两个CYP2C9突变附近区域的引物，另一个混合物含有用于扩增VKORC1*2突变附近区域的引物。进行PCR后，将来自两个反应混合物的扩增物混合、变性，并转移至含有共价连接至所述滤膜的探针的小室(chamber)。在缓冲液、含有生物素化dUTP的dNTP、镁离子和缺乏3'-5'核酸外切酶校正读码功能的DNA聚合酶(例如，Vent牌聚合酶，New England Biolabs公司，马塞诸塞州伊普斯维奇)存在下，将变性的扩增物与捕获探针退火。
对于引物延伸检测，所述固定的探针，长约20核苷酸，在其3'末端含有信息核苷酸。在这些条件下，所述变性和退火的扩增物链作为模板，而固相探针代表待延伸的“引物”。当模板和引物之间存在准确匹配时，就会发生整合dNTP包括生物素化的dUTP的DNA合成。然而，如果在固定的“引物”的末端碱基和模板之间只要发生了一个错配，延长和生物素整合就不会发生(图26A-B)。
如在CARD上所进行，所述引物延伸检测的热循环步骤在分析槽41中实施(参见图14A-C)。
一轮延伸以后，与结合链霉亲和素的HRP和TMB底物一起孵化后，测定延伸产物。
用Image J软件(rsb.info.nih.gov/ij)对数字化捕获的图像进行分析。测量所述点的平均强度，野生型点的平均值除以突变体探针的平均值。比例大于、等于或小于1分别对应于野生型纯合子、杂合子或纯合子突变体基因型。
在康奈尔大学生命科学核心实验中心(康奈尔大学，纽约州伊萨卡)通过双向测序确认引物延伸的基因型，其使用了美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)自动化3730DNA分析器，其带有Big Dye终止剂化合物(Terminator chemistry)(Rosenblum,BB,Lee,LG,Spurgeon,SL等人，用于改善DNA测序方式的新染料标记的终止剂(New dye-labeled terminators for improved DNA sequencing patterns)，核酸研究(Nucleic Acid Res.)，1997;25:4500-4504;Heiner,CR.,Kunkapiller,KL,Chen,S-M.等人，用BigDye终止剂化合物测序多兆碱基-模板NDA(Sequencing Multimegabase-Template DNA withBigDye Terminator Chemistry)，基因组研究(Genome Research)，1998;8:557-561)和Ampli-Taq-FS DNA聚合酶(美国应用生物系统公司，加利福尼亚州福斯特市)。
结果
在CARD上进行的实所述检测被设计为通过确认影响华法林代谢的3个已知的单独SNP而实施基因型分析(华法林敏感性检测)。该单独的(VKORC1*2)和多重的(CYP2C9*2和CYP2C9*3)PCR检测被设计用于扩增各SNP附近的区域，然后将变性的扩增物用于进行各等位基因基因型的引物延伸检测。
为评估在CARD上进行的SNP检测，分析了来自总共20个志愿者的口腔粘膜拭子。使用(1)在CARD上进行的华法林SNP检测和(2)双向DNA测序评估每个样品。使用引物延伸检测，华法林敏感性检测区分出在3个不同的华法林相关SNP发现的各种等位基因。如图26A-B所示，PCR-扩增的DNA序列变性后能够用于与固定在滤膜上的特定捕获探针杂交。在该检测中，使用所示扩增物为模板，所示捕获探针最终作为引物进行延伸。如在材料和方法中所述，将生物素化的dUTP整合至引物延伸序列上使得能够结合HRP-链霉共轭体(streptavidinylated HRP)并进行颜色检测。
图27为表明如何从引物延伸过滤膜中识别出基因型的代表性图像；图28所示为获自20个个体的7个不同基因型。3个识别出的SNP每一个中存在的3个可能基因型可用肉眼检测和/或通过确定每个斑点的信号强度比例而检测。当在华法林敏感性检测上评估来自20个志愿者的各口腔粘膜拭子样品后，最初通过至少2个不同的个体识别出所述基因型。通过上述的材料和方法中的双向测序和图像分析确认这些结果。
该实施例中的华法林敏感性检测表明了CARD的多能性。除了所做的检测，仅需一个“手动”(用户操作)步骤(即，起初引入“原”样品)，随后所有步骤均为计算机自动化操作。由于其易于实施和解释结果，该检测可用于POC设置，医生希望使用其中的基因组信息以及临床信息帮助确定正确的起始华法林剂量。因此，通过重复的PT/INR测试最终确定合适的华法林治疗剂量，而不必依赖于费时而具有潜在危险性的“试错法”来确定剂量，医生可最初就以基于一些已知华法林剂量算法的更合适华法林剂量开始治疗(Daly,AK和King,BP，口服抗凝血剂的遗传药理学(Pharmacogenetics of oral anticoagulants)，遗传药理学(Pharmacogenetics)，2003;13:247-252；Takahashi,H.和Eschizen,H.，华法林消除的遗传药理学及其临床意义(Pharmacogenetics ofwarfarin elimination and its clinical implications)，Clin.Pharmacokinet2001；40:587-603；Schwarz,UI,Ritchie,MD,Bradford,Y等人，在最初抗凝作用期间对华法林反应的遗传决定因素(Genetic determinantsof response to warfarin during initial anticoagulation)，N.Eng.J.Med2008;358:999-1008；Osinbowale,O.,Al Malki,M.,Schade,A.,等人，控制华法林抗性的算法(An algorithm for managing warfarinresistance)，Clev.Clinic J.of Med.2009;76:724-730)。
在CARD上进行的检测提供了以完全免于手动的方式，方便、经济地进行复杂分子检测的方法。而且，进行该检测所需设备的低成本和低的一次性费用使该平台带来了真正的“样品-结果”分子检测的快速现场测试设置。
实施例3：基于CARD的自动化人乳头状瘤病毒(HPV)检测
该实施例描述了人乳头状瘤病毒(HPV)检测的一个特定实施方案，其已经被完全自动化地整合到CARD上。通过选择扩增引物和检测探针，熟练的从业者可容易地调整下述方法以用于其他目标核酸序列的检测。
根据需要将阴道拭子收集后置于可长期室温保存的合适运输媒介中。所述运输媒介可为，例如PBS缓冲液，其中的样品可立即引入至CARD中进行分析。所述运输媒介也可为本领域已知可防止DNA降解的任何溶液，从而可将样品保存备用。
将一份样品应用于CARD并按如下所描述的方法开始进行。无需操作员的任何进一步介入，所有以下步骤均为自动化实施：细胞裂解、核酸纯化、PCR扩增和在低密度微阵列上的多重终点法检测。下列操作和试剂用于进行再CARD上的HPV检测。参见图14A-14L。
样品添加和细胞裂解
a.操作员将样品(例如，阴道拭子)插入至样品输入槽。
b.将30μl蛋白酶K和细胞裂解缓冲液的混合物分配至试剂输入槽，并将其泵送至样品输入槽，孵化5分钟。
c.将30μl乙醇分配至试剂输入槽，并将其泵送至样品输入槽。
d.将样品输入槽的所有内容物泵送至所述纯化槽中的过滤膜顶部，然后抽吸所述内容物穿过过滤膜，并将其泵送至废料槽。
e.将40μl乙醇分配至试剂输入槽，并将其泵送至所述纯化槽中的过滤膜顶部，然后抽吸所述内容物穿过过滤膜，并将其泵送至废料槽。
f.将70μl洗涤缓冲液1分配至试剂输入槽，并将其泵送至所述纯化槽中的过滤膜顶部，然后抽吸所述内容物穿过过滤膜，并将其泵送至废料槽。
g.将70μl洗涤缓冲液2分配至试剂输入槽，并将其泵送至所述纯化槽中的过滤膜顶部，然后抽吸所述内容物穿过过滤膜，并将其泵送至废料槽。
h.将90μl水分配至试剂输入槽并将其泵送至废料槽。
i.将70μl洗脱缓冲液分配至试剂输入槽，并将其泵送至所述纯化槽中的过滤膜顶部，然后将其泵送至废料回到其来自的通道。然后抽吸任何残留流体使其穿过所述过滤膜，并将其泵送至废料槽。
洗脱
a.将50μl洗脱缓冲液分配至一个洗脱槽，并泵送其一部分至另一个洗脱槽，然后将其剩余部分向上泵送穿过纯化槽中过滤膜底部，通过将其交替地注入和空出纯化槽至少2次来抖动。
聚合酶链反应(PCR)装载
a.将12μl PCR预混合液1分配至一个预混合液槽，然后重复操作将12μl PCR预混合液2分配至另一个预混合液槽。
b.将少量(3次弯曲的薄膜)纯化槽的内容物泵送至第二洗脱槽，该槽中泵送有洗脱缓冲液。
c.泵送单次弯曲的薄膜以驱动少量物质从纯化槽至一个扩增槽，然后向该同一扩增槽中加入来自该扩增槽同一侧的预混合液槽中的预混合液。重复操作以加注第二扩增槽。
聚合酶链反应(PCR)
a.于37°C 10分钟
b.于95°C 2分钟
c.循环10x
i.于95°C 30秒
ii.于46°C 30秒
iii.于72°C 30秒
d.循环30x
i.于95°C 15秒
ii.于49°C 30秒
iii.于72°C 30秒
iv.于72°C 3分钟
反向斑点杂交(RDB)过滤膜灭活处理
a.在上述PCR热循环期间进行反向斑点杂交(RDB)过滤膜灭活处理，从而所述两个步骤与扩增完成相协调。
b.将150μl的0.1N NaOH泵送至分析试剂槽，并将其泵送至所述分析过滤膜的顶部，将其从所述膜的顶部穿过穿孔环并回到所述膜的顶部循环5次，再泵送至废料槽。
c.将90μl水泵送至分析试剂槽，并将其泵送至所述分析过滤膜的顶部，然后将其从所述膜的顶部穿过穿孔环并回到所述膜的顶部各循环3次，再泵送至废料槽。再重复该步骤1次。
预杂交
a.将70μl杂交缓冲液(0.15M NaCl+0.01M磷酸钠+0.001MEDTA+0.1%SDS+15%甲酰胺，最终pH 7.25-7.50)分配至分析试剂槽，并将其泵送至所述分析过滤膜的顶部，将其从所述膜的顶部穿过穿孔环并回到所述膜的顶部循环5次，再泵送至废料槽。
扩增物移出
a.将70μl杂交缓冲液分配至分析试剂槽，并将其泵送至所述分析过滤膜的顶部。
b.将70μl杂交缓冲液分配至分析试剂槽，并将其泵送至一个扩增反应器中。对另一个扩增反应器进行重复操作。
c.关闭扩增加热器，并冷却扩增反应器以使得所述蜡/硅油固化所述密封层，从而当移除扩增物时所述液相的蜡/硅油不随扩增物一起被移除。
杂交
a.将各扩增反应器的内容物泵送至所述分析膜的顶部。
b.通过循环(从分析膜的顶部穿过穿孔环并回到分析膜的顶部)孵化所述分析槽的内容物12.5分钟。然后排空所述内容物至废料槽。
c.将90μl洗涤缓冲液分配至分析试剂槽，并将其泵送至所述分析过滤膜的顶部，然后将其从所述膜的顶部穿过穿孔环并回到所述膜的顶部各循环3次，再泵送至废料槽。重复操作2次。
结合
a.将120μl HRP分配至分析试剂槽，并将其泵送至所述分析膜的顶部，将其从所述分析膜的顶部穿过穿孔环并回到所述分析膜的顶部循环4分钟，再泵送至废料槽。
b.将90μl洗涤缓冲液泵送至分析试剂槽，并将其泵送至所述分析过滤膜的顶部。然后将其从所述分析膜的顶部穿过穿孔环并回到所述分析膜的顶部各循环3次，再泵送至废料槽。重读操作3次。
底物添加
a.将120μl TMB分配至分析试剂槽，并将其泵送至所述分析膜的顶部，将其从所述分析膜的顶部穿过穿孔环并回到所述分析膜的顶部各循环10分钟，再泵送至废料槽。
b.将90μl水分配至分析试剂槽，并将其泵送至所述分析膜的顶部。然后将其从所述分析膜的顶部穿过穿孔环并回到所述分析膜的顶部循环15次，再泵送至废料槽。重读操作3次。
图像分析
a.将照相机置于分析膜上方并记录图像。
b.将图像发送至控制系统进行处理。
c.报告结果。
实施例4：基于CARD的快速分子检测和20个临床相关的HPV种类的确认
该实施例描述了使用上述实施例3中所述的方案，直接从CARD上的临床样品中，快速、容易且自动化测定和区分至少20种临床相关的人乳头状瘤病毒(HPV)的方法。
引言
在低收入国家妇女中宫颈癌是导致癌症相关的死亡的主要原因，在世界范围内其为导致癌症相关的死亡第二大原因。在目前FDA批准的分子诊断学方法中，除了将HPV分为“高”或“低”风险类型，其中没有一种能够区分各种HPV。
目前，美国有两种FDA批准的用于直接测定HPV DNA的分子诊断测试法，杂交捕获测试(Digene HC2,Qiagen,Valencia,CA)和Cervista HPV测试(Hologic,Bedford MA)。二者均依赖于信号扩增而非目标物扩增。然而，两种FDA批准的试剂盒无法识别单独的HRHPV，而是将单独或多个HR HPV识别为同样的阳性结果。另外，有将LR HPV作为一组检测的杂交捕获试剂盒和仅特异性检测HPV 16和18的Cervista试剂盒。
尽管提供了两种确定宫颈癌可能性的高预测性测试法，低收入地区和工业化地区的宫颈癌死亡率差异依然很大。文化、社会经济和后勤保障的障碍阻碍了贫困地区的妇女受益于这些测试法的预测价值。设计一种便宜的快速现场测试器件用于HPV的分子测试，会大大改善全世界的宫颈癌检测。这样的检测将提供关于HPV状态的即时和准确结果，并告知是否需要进一步治疗或需要时间做下一步检查。该实施例描述的HPV核酸测试可排除上述障碍而提供给不同的人群。
材料和方法
基因组DNA的制备、稀释和存储
将购自美国典型培养物保藏中心(ATCC中心，弗吉尼亚州马纳萨斯市)的C-33A人宫颈癌细胞系培养并维持于含有10%胎牛血清的伊格尔氏最小必需培养基(Eagles Minimal Essential Media)，于37°C、CO2下进行水套加热孵化。将细胞培养至汇合到一起，通过直接刮擦至PBS中或通过胰蛋白酶化后再细胞计数进行收集。收集约5百万个细胞(相当于1千万个基因组)并进行细胞裂解，然后用QiagenDNeasy试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)纯化基因组DNA。通过260nm处的吸光度测定核酸的浓度。纯化的核酸于-20°C存储。
质粒DNA的制备、稀释和储存
含有HPV基因组的嵌合质粒DNA购自美国典型培养物保藏中心(ATCC中心，弗吉尼亚州马纳萨斯市)并转化至DH5α大肠杆菌中。将培养物增值，用Qiagen微型质粒试剂盒(Qiagen Plasmid MiniKit)(Qiagen,Valencia,CA)纯化粒DNA。通过260nm处的吸光度测定DNA浓度，将DNA稀释至1E6个拷贝/μl。质粒DNA储备液于-20°C存储。
从临床样品制备DNA
所有样品均为在Digene存储运输媒介中的最初作为阴道拭子收集的样品。部分样品还用Digene变性溶液做了预处理。将200μl样品用Qiagen DNAeasy或机构内部(in-house)的纯化试剂进行核酸纯化，这将在别处描述。纯化的核酸于-20°C存储。
HPV引物和探针的设计
基于对应于L2基因3'端和L1基因5'端的HPV区设计HPV L1基因引物组，其最初由Yoshikawa描述，再由其他人详细描述(Yoshikawa H,Kawana T,Kitagawa K,Mizuno M,Yoshikura H,Iwamoto A：使用通用引物进行DNA扩增检测和分类外阴人乳头状瘤病毒(Detection and typing of multiple genital human papillomavirusesby DNA amplication with consensus primers)，Jpn J Cancer Res 1991,82(5):524-531；Jeney C,Takacs T,Sebe A,Schaff Z:使用L1F/L1R引物系统基于多重PCR和杂交进行DNA扩增检测和分类46种外阴人乳头状瘤病毒(Detection and typing of 46 genital humanpapillomaviruses by the L1F/L 1R primer system based multiplex PCRand hybridization)，J Virol Methods 2007,140(1-2):32-42；Takacs T,Jeney C,Kovacs L,Mozes J,Benczik M,Sebe A:用于测定15种高风险和5种低风险HPV类型的基于分子信标的实时PCR法(Molecularbeacon-based real-time PCR method for detection of 15 high-risk and 5low-risk HPV types)，J Virol Methods 2008,149(1):153-162)。各特定HPV类型的序列获自国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology information)(www.ncbi.nlm.nih.gov)。所述HPV类型和对应的登录号如下：NC_000904;11:M14119;16:NC_001526;18:NC_001357;31:J04353;33:M12732;35:M74117;39:M62849M38185;42:M73236;43:AJ620205;44:U31788;45:X74479;5LM62877;52:X74481;53:NC_001593;56:EF177177;58:D90400;59:X77858;66:U31794;68:DQ080079。
基于Jeney等人描述的引物(Jeney C,Takacs T,Sebe A,SchaffZ：使用L1F/L1R引物系统基于多重PCR和杂交进行DNA扩增检测和分类46种外阴人乳头状瘤病毒(Detection and typing of 46 genitalhuman papillomaviruses by the L1F/L 1R primer system based multiplexPCR and hybridization)，J Virol Methods 2007,140(1-2):32-42)，使用CLC Sequence Viewer软件(www.clcbio.com)校准目标HPV基因组的正向或反向引物区。将引物归类于最相似序列。在最多10个3'核苷酸内不允许有错配，以使得在由聚合酶催化核苷酸结合处上游区域有最佳的碱基配对。序列被校准后，将其分组，从而单个引物中包含的简并核苷酸不超过2个。
除了HPV 6、11、16和18略微修改，捕获-特异性探针序列由Jeney等人描述。所述捕获探针序列如图30(表1，SEQ ID NOS:1-20)所示。探针为5'端用通过6-碳间隔臂连接的伯胺修饰。
所有的引物和探针在美国集成DNA技术公司(衣阿华州科尔维尔)合成。
球蛋白引物和探针的设计
选择人β-球蛋白基因为必需的内部阳性对照以确认临床样品的核酸纯化。所述正向和反向引物分别设计如下：5'-GAA TAA CAGTGA TAA TTT CTG GG-3′和5'-GAA GAT AAG AGG TAT GAACAT GA-3'(SEQ ID NO:21)。所述端氨基β-球蛋白捕获探针为：5'-ATCGAG CTG AAG GGC ATC GAC TTC AA-3'(SEQ ID NO:22)。
聚合酶链反应(PCR)
针对HPV 16和HPV 18，基于其显著的高风险HPV亚型，实施了含有全长病毒DNA的质粒的广谱PCR优化方案。初步实验表明，相比HPV 18，HPV 16的扩增难度更大，因此优化的重点在于HPV 16扩增。热循环条件类似于Jeney等人所描述的条件(Jeney C,Takacs T,Sebe A,SchaffZ：使用L1F/L1R引物系统基于多重PCR和杂交进行DNA扩增检测和分类46种外阴人乳头状瘤病毒(Detection and typingof 46 genital human papillomaviruses by the L1F/L 1R primer systembased multiplex PCR and hybridization)，J Virol Methods 2007,140(1-2):32-42)实施，其中进行PCR时10个循环为低温退火，其余25-35个循环为高温退火。在32ng C33A纯化核酸的背景下，使用1000个含有质粒HPV 16的拷贝进行PCR，优化MgC12浓度、引物浓度、缓冲液成分以及两次退火温度中的每次退火温度。在下列条件下最大程度地优化PCR：10mM Tris-HCl，pH 9，50mM KC1，100μg/ml BSA，1.5mM MgC12，0.2mM dATP，0.2mM dGTP，0.2mM dCTP，0.075mM dTTP，0.125mM dUTP，0.2μΜ各单独引物，0.002单位/μl热稳定的尿嘧啶-DNA糖基酶，UDG(USB公司，俄亥俄州克利夫兰市)和0.05单位/μl GoTaq Hot Start聚合酶(Promega公司，威斯康星州麦迪逊市)。热循环条件如下：37°C 10分钟(UDG激活)；95°C 2分钟；10个循环的95°C 30秒，46°C 30秒，72°30秒；25-35个循环的95°C30秒，49°C 30秒，72°C 30秒；最后72°C延伸3分钟。这些同样的条件经证明可用于β-球蛋白扩增。PCR优化在MJ Mini梯度热循环仪(Biorad公司，加利福尼亚州赫尔克里士)上实施，并进一步在Multigene II热循环仪(Labnet公司，新泽西州木桥镇)上证实。
电泳和图像分析
扩增后，将2μl 6x染料加入至10μl样品中至终体积12μl。在裂解于0.5X TAE(50X TAE为2M Tris-醋酸，100mM EDTA；0.5XTAE为20mM Tris-醋酸，1mM EDTA)缓冲液中的3%琼脂糖凝胶上分析样品，缓冲液中加有1/10,000体积的GelGreen(Biotium公司，加利福尼亚州海沃德市)。使用VWR微电泳系统(VWR公司，宾夕法尼亚州西切斯特市)，将样品在100V电压下电泳30-60分钟。加样孔用17泳道(4mm宽)或24泳道(3mm宽)梳子制备，其中分别加有5μl或3μl含染料的样品。
使用Dark Reader透射仪(Clare Chemical Research公司，科罗拉多州德罗斯)照明凝胶条带，使用索尼Cyber-shot DSCH2数字照相机照相，ISO设为80，F=3.5，快门速度=3秒，计时器=2秒。使用ImageJ软件(http://rsb.info.nih.gov/ij/)定量条带。使用设为50像素的滚球半径去掉背景，收集计量峰下面的条带面积。
从临床样品中克隆L1片段
将来自纯化自临床样品的DNA的特定类型HPV L1扩增区克隆。为此，通过扩增和反向斑点杂交技术杂交确认特定HPV类型。HPV L1区克隆自含有单独感染的样品。用特异性型L1序列设计正向和反向引物(参见图31，表2(SEQ ID NOS:23-46)，侧面分别连接有Bam HI和EcoRl限制性位点。接着将所述消化的片段进行凝胶纯化，并连接至Bam Hl/Eco Rl消化的和凝胶纯化的pBS ΠKS+(Bluescript)克隆载体。使用HPV引物混合物证实HPV插入片段的成功扩增，并通过RDB和测序证实特定类型，使用美国应用生物系统公司(AppliedBiosystems)自动化3730DNA分析器，其带有Big Dye终止剂化合物和Ampli-Taq-FS DNA聚合酶(美国应用生物系统公司，加利福尼亚州福斯特市)。
点位对照和阳性对照的设计
用于RDB过滤膜的点位对照设计为如下：
/5AmMC6/AAA AAA AAA AAA AAA AAA/3Bio/(SEQ IDNO:47)。
将阳性对照设计为含有针对HPV 6/11的正向引物序列，针对HPV 42的反向引物序列，其侧面连接来自绿色荧光蛋白的非-HPV相关序列，质粒为pEGFP-C2。为此，将引物设计为具有Bam HI和EcoRl限制性位点，侧面分别连接正向和反向引物序列，其依次侧面连接能够扩增258bp GFP插入片段的GFP特定序列。所得正向和反向引物序列分别为：5'-GCT TGG ATC CCG TAA ACG TAT TCC CTT ATTTTT TTA AAC GGC CAC AAG TTC AGC GTG-3'(SEQ ID NO:48)，以及5'-AAG CGA ATT CAC TCT AAA TAC TCT GTA CTG TCTTGT AGT TGC CGT CGT CCT TGA-3'(SEQ ID NO:49)。扩增以后，将PCR产物纯化并用Bam HI和Eco Rl限制性酶切。然后将消化的片段进行凝胶纯化，并连接至Bam Hl/Eco Rl消化的和凝胶纯化的pBS II KS+(Bluescript)克隆载体。使用HPV引物混合物证实GFP片段的成功扩增。
反向斑点杂交(RDB)
采用Zhang等人描述的方法制备滤膜(Zhang Y,Coyne MY,WillSG,Levenson CH,Kawasaki ES:使用膜结合修饰的寡核苷酸进行癌症和遗传性疾病的单碱基突变分析(Single-base mutational analysis ofcancer and genetic diseases using membrane bound modifiedoligonucleotides)，Nucleic Acids Res 1991,19(14):3929-3933)。简而言之，将带负电荷的尼龙，0.45um的Biodyne C膜(Pall Corporation,city,state)在0.1N HCl中预先湿润，然后在10%N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)中激活15分钟。将膜在水中冲洗后于空气中干燥。将端氨基核酸探针重悬浮于含0.1%吐温的0.5M碳酸氢钠中，使用BioRobotics Biogrid(马萨诸塞州波士顿)在膜上点样。将膜在空气中干燥并保持干燥至使用。使用前将膜在0.1N NaOH中孵化以淬灭任何尚未结合的激活位点。
将5μl扩增物与50μl杂交缓冲液(3XSSPE,0.1%SDS,25%甲酰胺)混合，于95°C加热5分钟，立即放到冰上以防止重新退火。所有膜的操作在室温下轻度振荡实施。将膜在250μl杂交缓冲液中预杂交15分钟，然后加入变性的扩增物并杂交1-3小时。杂交以后，在1.5ml 0.1%SDS中冲洗过滤膜两次，每次10-15分钟。将膜与1:500稀释的结合链霉亲和素的辣根过氧化物酶(Thermo Fisher Scientific公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)在1X SSPE/0.1%SDS中孵化化30分钟，然后在0.5X SSPE/0.3%SDS中冲洗3次，每次10分钟。将750μl的一步法TMB-Blotting溶液(Thermo Fisher Scientific公司)加入至膜上，显色10分钟。用5ml水冲洗膜10分钟。将显色的过滤膜用HewlettPackard Scanjet 4850扫描和/或进行照相记录。
结果
PCR引物的设计
图32(表3A，SEQ ID NOS:50-77)和图33(表3B，SEQ IDNOS:78-105)显示了按照“材料和方法”中描述的规则设计的用于扩增所述HPV L1基因的引物。从3'端开始校准以后，在最多10个3'核苷酸内不允许有任何错配，每个引物最多使用2个简并核苷酸，总共设计了8个正向和8个反向引物序列。这将Jeney等人(Jeney C,TakacsT,Sebe A,Schaff Z:使用L1F/L1R引物系统基于多重PCR和杂交进行DNA扩增检测和分类46种外阴人乳头状瘤病毒(Detection andtyping of 46 genital human papillomaviruses by the L1F/L 1R primersystem based multiplex PCR and hybridization)，J Virol Methods 2007,140(1-2):32-42)合成的引物数目减少了一半，从而减少了PCR检测的总成本。从降解序列中产生了共13个正向引物和21个反向引物。按照这种方法，其中含有的引物混合物准确匹配20HPV目标物中的16个，包括除一个外的所有高风险类型。而且，尽管试图覆盖尽可能多的引物序列，在低风险类型中错配并非是令人非常担心的问题。推断尽管期望所有相关的类型都和会这些引物一起扩增，在不大可能的事件中即低风险则没有扩增，这些条件下的假阴性并不像假阴性高风险那么重要。正向引物组中的错配包括单独的低风险42和43错配，以及3个低风险44的错配。反向引物组中的错配包括单独的低风险11和44错配，以及高风险66错配。除了一个在HPV 44正向序列中以外，所有错配都在引物的5'端内。
HPV扩增的确认
HPV L1引物组最初在含全长或部分HPV序列的嵌合质粒上测定。图34所示为各种HPV类型的质粒DNA扩增结果。将含100个拷贝/μl的含有针对HPV 6、11、16、18、52的全长DNA序列的质粒或针对HPV 35的部分序列的反应混合物进行40个循环的扩增。在所有情况下，在1.6ng/μl C33A核酸存在下扩增HPV。所有质粒与引物组一起扩增。每种质粒作为模板的效果存在差异，HPV 18比其他模板明显效果更好的。
为了清除显示L1引物组的各质粒模板之间的效果差异，在2倍梯度稀释的质粒DNA中进行扩增。图35A-D所示为代表性实验的结果，其中每个反应中HPV质粒DNA以12-12,500个拷贝/μl DNA在1.6ng/μl基因组核酸的背景下扩增。上部图像为用于分离含质粒的HPV 16和HPV 18的扩增产物的凝胶，与图34所示相似，在低拷贝数量下HPV 18表现出比HPV 16更好的扩增效果。这些凝胶以及类似凝胶的图像分析数据对其余质粒的扩增产物分析如图35B所示。这些图像的数据证实HPV 18比其他质粒具有明显更好的扩增效果，类似地在这些条件下HPV 16的扩增敏感性差一些。HPV 18扩增在约200个拷贝/μl时开始稳定，HPV 11、35和52的扩增在约800个拷贝/μl时开始稳定，而效果最差的模板HPV 16的扩增在约1500个拷贝/μl时开始稳定。
除了全长和部分HPV克隆以外，将直接克隆至临床样品的L1目标区与L1引物一起扩增。图35D所示为10个拷贝/μl至10,000个拷贝/μl的12个特异性型HPV克隆的PCR图像分析结果。与在全长质粒中所见到的类似，一些模板比其他模板更敏感。在最敏感模板的扩增中，HPV 18、31、33、51、56和66在<150个拷贝/μl时开始稳定。更困难模板的扩增在>300个拷贝/μl时开始稳定，而最困难模板HPV16的扩增在1500个拷贝/μl时开始稳定。其余模板在这些较低和较高范围之间显示扩增稳定。总之，这些数据表明，HPV测定的所有目标物均为与L1引物组一起扩增的合适模板。
初步实验(数据未示出)表明，HPV和β-球蛋白不能在互相产生不利影响的情况下在同样的反应混合物中同时扩增。通常，如果一个模板大大多于另一个模板，就会存在PCR反应物竞争，从而使得其为一个最终产物效果差的检测。因此，检测被设计为β-球蛋白和HPV能够在分开的室(chamber)中进行扩增，但需要有同样的热循环条件。在图35A和35B所示的实验中，将同样的引物与β-球蛋白引物一起扩增。图35A的下部图像所示为球蛋白扩增产物的代表性凝胶。这些实验的样品含有与所示HPV扩增曲线一样的输入HPV和基因组DNA。HPV输入增加了，而基因组输入核酸稳定在1.6ng/μl。在该图像中可以看出，输入HPV的水平对球蛋白扩增的影响很小或无影响。图35D所示为图35B中所示各质粒HPV进行的伴侣球蛋白凝胶电泳的图像分析结果。这些数据表明，不考虑HPV的输入，β球蛋白扩增保持相对稳定。因此，鉴于HPV和球蛋白的共扩增导致竞争，存在其中一个模板而无特异性引物不对特定目标物的扩增产生不利影响。
球蛋白曲线
将内部对照β-球蛋白在与HPV分开的室中扩增，但处于与HPV相同的温度和循环条件下。因此，确定在这些条件下β-球蛋白扩增表现如何非常重要。为解决这一问题，将纯化至C33A细胞的梯度稀释的核酸与β-球蛋白引物一起扩增。以0.025-1.6ng/μl的纯化核酸扩增30、35或40个循环。这些实验的结果如图36所示。当PCR扩增40个循环，扩增物产物在<0.2ng/μl输入核酸时完全饱和。反之，当扩增30或35个循环，球蛋白扩增分别在0.4或0.1ng/μl时开始稳定，且分别到>1.6或>0.8ng/μl时开始稳定。这些数据来自不同天使用不同时间纯化的C33A核酸，表明了该检测的高度可重复性。
在图36中的实验中，模板存在于在纯化自C33A细胞的总核酸而不是纯化的DNA的背景下。因为这些实验的最终目标是设计用于HPV检测的快速现场测试微流体分子诊断工具，该检测的每个步骤的设计理念是实现终点法测试。因此，考虑到使用核糖核酸酶处理的核酸导致无RNA的纯化DNA。在实验中，在纯化模块核糖核酸酶被确定为没有必要且可能不利于从低细胞浓度中的实际核酸回收。也即，在DNA有限的情况下，RNA可作为载体而有助于纯化。进行了一些纯化实验以比较产量加/减核糖核酸酶处理，在C33A细胞的情况下，无核糖核酸酶处理的核酸产量通常要高4倍，表明实际基因组DNA量是通过在260nm处吸光度测定的实际产量的四分之一。
HPV/球蛋白的反向斑点杂交(RDB)
基因组和HPV DNA在分开的容器中PCR扩增后，将所述扩增物混合并在单独滤膜上进行RDB。图37A所示为在1.6ng/μl基因组核酸背景下10个拷贝/μl的HPV的扩增结果。上部图像所示为HPV扩增物的凝胶图像，底部图像所示为对应的球蛋白扩增物。相对强度表明各克隆作为模板的作用与前述对于10个拷贝/μl(图37B和数据未示出)所见的一致。图37B所示为各HPV和球蛋白扩增物组合的RDB结果。各克隆被其特异性膜结合探针捕获并产生清晰的斑点。无论扩增物图像强度，除一个以外的所有其他RDB斑点都很强。另一方面，HPV 53捕获的强度显示出类似于低强度扩增，但是仍然可鉴别。
临床样品-细胞数目的测定
确定在RDB上特定的检测后HPV和球蛋白扩增的有力和可重复条件后,使用真实的生物样本证实所述检测。将获得的117个临床样品进行核酸纯化、HPV和球蛋白扩增，最后通过RDB测定。收集所有117个样品并存储于存储运输媒介(STM,Qiagen)中。其中部分样品在存储前还用碱性变性试剂(Qiagen)处理。核酸纯化之前，将样品冷冻并存储数周。平均而言，纯化自样品的核酸存储时加入变性试剂比样品仅存储于STM中时的产量稍高。来自含变性试剂/STM溶液与仅含STM溶液的产量分别为11和4.6ng/μl，在260/280nm处的吸光度比率分别为1.8和1.6。起初，0.5μl各样品在球蛋白存在下通过PCR30个循环进行分析，无论其产生的核酸浓度，各样品可检测的扩增物条带可通过像素强度测量，并通过RDB测定证实。如图38中所示，尽管在这些条件下并非直接相关，像素强度增加的趋势与ng/μl产量增加的趋势一致。因此，甚至不存在可检出的核酸时(通过吸光度，Nanodrop检出限~1ng/μl)，30个循环的PCR后该检测产生了可检测的球蛋白扩增物，从而证实了该检测用于临床研究的敏感性和用处。
将半量PCR扩增球蛋白用于计算临床样品中基因组的数目。报告表明，阴道拭子含有约1-5百万个细胞(Depuydt CE,Benoy IH,Bailleul EJ,Vandepitte J,Vereecken AJ,Bogers JJ：改善的宫颈内取样和通过Cervex-Brush Combi宫颈刷进行HPV病毒载量测定(Improvedendocervical sampling and HPV viral load detection by Cervex-BrushCombi)，细胞病理学(Cytopathology)2006,17(6):374-381；Quint WG,Pagliusi SR,Lelie N,de Villiers EM,Wheeler CM：第一次世界卫生组织关于人乳头状瘤病毒DNA测定的国际合作研究结果(Results of thefirst World Health Organization international collaborative study ofdetection of human papillomavirus DNA)，Clin Microbiol 2006,44(2):571-579；Schellenberg J,Blake Ball T,Lane M,Cheang M,Plummer F：流式细胞仪定量由参加妇科诊疗的成人自行收集的阴道拭子样品中细菌(Flow cytometric quantification of bacteria in vaginalswab samples self-collected by adolescents attending a gynecologyclinic)，微生物学方法杂志(J Microbiol Methods)2008,73(3):216-226)相当于6.4x10-6-3.2x10-5g纯DNA。使用来自C33A细胞的无RNA的DNA，进行30个循环的PCR，产生了对于ng输入的像素强度曲线(图39A)。这类似于图36产生的曲线，然而，这种情况下总输入核酸为基因组DNA，因此直接与基因组数目相关。
为了从ng/μl转换为#基因组，使用下列公式：
((ng/nl)/1E9)/3.2E-12g/基因组
为了将基因组转换为细胞，将上述公式的结果除以2。
为了确定临床样品中存在的基因组数目，通过稀释分析了各种低、中、高产量的样品(图38)，以便扩增物的所得强度落入该检测的线性范围内。图39B中的结果显示，仅储存于STM中的样品的计算范围为1-40ng/μl。这些数目比由260nm处吸光度得到的ng/μl高约2-7倍。这并不奇怪，因为如上所述，在无核糖核酸酶存在下纯化的总核酸比核糖核酸酶处理后纯化的DNA平均高4倍。使用上述公式，该范围对应于312.5-12,500基因组/μl或156.25-6,250细胞/μl。这些样品的最初容积为1ml。因此，在这些样品中发现的细胞数目范围为156,250-6,250,000。
图39C所示为存储于STM和变性剂中的样品计算的ng/μl。在这些条件下，计算的ng/μl和由260nm处吸光度得到的ng/μl之间的差异并不像在碱存在下水解RNA那么一致。在这些条件下计算的DNA范围为0.6-20ng/μl。这对应于187.5-6250基因组/μl或93.75-3125细胞/μl。这些样品的最初容积为1.5ml。因此，在这些样品中发现的细胞数目范围为140,625-4,687,500。
总之，这些数据表明，使用该半量系统能够估计在不同条件下存储的样品的细胞数目，且不考虑该存储，计算的细胞范围与前述的报告一致。这些数据提供了在阴道样品中预期的较低(约150,000个细胞)和较高(约5,000,000个细胞)的限制，并表明该检测可兼容样品中预期的所有范围。
临床样品和HPV的证明
为表明该系统可和与当前接受的HPV测定方法一样或更好地测定和区分HPV，将由来自所有117个临床样品的纯化核酸，在所得扩增物进行RDB后，使用L1引物组进行PCR。
图40(表4)概括了临床样品的PCR和RDB结果。如表中所示，75%(88/117)的样品PCR后表现出HPV扩增条，45%(40/88)的HPV扩增物阳性通过HPV-特定探针在RDB上被捕获到。对于未检测到其他样品最可能的解释是，不存在该HPV类型的特定捕获探针。在所述的HPV RDB阳性斑点中，31/40含有高风险HPV类型，存在为单独感染(21)、多个高风险感染(5)或结合低和高风险感染(5)。其余9个RDB阳性样品均由于低风险单独(7)或多数(2)感染。
确定了与Digene HC2(Qiagen,Valencia,CA)数据相比，在测定高风险HPV上该检测具备如何的优势。如图41A的数据显示了使用Digene系统的HPV高风险阳性样品，相对于由该实施例中描述的系统获得的HPV结果的比较。该检测证实了除了一个以外的Digene高风险样品的高风险感染性。该样品(数据未示出)导致Digene阳性1.01，仅考虑Digene阳性高风险。然而，在该样品的多个重复中，从未检测到HPV扩增物。这表明这可能被识别为假阳性。另一方面，该检测系统表明在这个实施例中找出了一些其他使用Digene HC2试剂盒无法测定出的高风险样品，如图41B中所示，本检测系统找出了6个被Digene系统识别为阴性的高风险样品，表明了该实施例中所述检测的高度敏感性和特异性。
讨论
该实施例描述了测定和区分单独低和高风险HPV亚型的HPV分子诊断测试的发展。该方法开发为用于仅需在用户部位输入生物样本的全自动微流体(CARD)平台。该自动化方案从样品中释放核酸，并将其与球蛋白和HPV特异性引物一起扩增，通过反向斑点杂交和测定确认HPV的特定亚型。所述实施例表明了所述检测确认20种不同感染性HPV类型以及来自人上皮细胞的β-球蛋白的能力。另外，还表明了该检测的敏感性和可重复性。
初步研究(未示出)旨在测定以前已知的基于PCR的确认生物样品中HPV特异性亚型的方法，并确定是否任何这些方法均适合使用所述HPV检测，和/或是否任何这些方法均可被改善。用于所述CARD的良好目标物选择的标准包括：
1.在PCR期间不需要大量延伸时间的短扩增物的扩增，因而使得减少了PCR的整个时间。
2.选定高可变区作为靶标以设计用于所有目标靶标的特定捕获探针，当其变得相关时可被延长以包括新的HPV亚型。
3.在靶标位点侧面区域的高的同源性，以将扩增所有目标HPV靶标的所需的引物数目减低至最小。
尽管许多本领域已知的基于PCR的方法依赖于L1基因中的独特核酸序列的扩增，也有依赖于HPV基因组中替代性基因的方法(Josefsson A,Livak K,Gyllensten U：通过使用荧光5'外切酶检测而测定和定量人乳头状瘤病毒(Detection and quantitation of humanpapillomavirus by using the fluorescent 5'exonuclease assay)，J ClinMicrobiol 1999,37(3):490-496)。图42(SEQ ID NO:106)所示为HPV 16的L1基因序列，HPV 16含有明显对应于各种用于扩增的目标区的序列(SEQ ID NOS:107-112)。SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108分别为L1正向和反向引物；SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110为SPF引物；SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111为GP5/GP6；SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:112为PGMY1 1/09。
三个已经建立的系统扩增位于L1基因中间的所有或部分450bp区。所述MY09/MY11系统最初在1990年代早期描述为一组简并引物，其可测定多个产生约450bp扩增物的HPV类型(Hildesheim A,Schiffman MH,Gravitt PE,Glass AG,Greer CE,Zhang T,Scott DR,Rush BB,Lawler P,Sherman ME等人：特异性型人乳头状瘤病毒感染在细胞学正常妇女中的持久性(Persistence of type-specific humanpapillomavirus infection among cytologically normal women)，J InfectDis 1994,169(2):235-240)。为了避免使用简并引物可能引起的一些问题，Gravitt等人(Gravitt PE,Peyton CL,Alessi TQ,Wheeler CM,Coutlee F,Hildesheim A,Schiffman MH,Scott DR,Apple RJ：改善的人外阴乳头状瘤病毒扩增(Improved amplication of genetal humanpapillomavirus)，J Clin Microbiol 2000,38(1):357-361)改进了该MY09/MY11系统并设计了一组5个正向和13个反向引物。单独组合这些引物能够扩增任何目标HPV类型。针对该同样的区域，Snijders等人(Snijders PJ,van den Brule AJ,Schrijnemakers HF,Snow G,MeijerCJ,Walboomers JM：聚合酶链反应在通用引物中的应用使得能够进行广谱的人乳头状瘤病毒基因型测定(The use of general primers in thepolymerase chain reaction permits the detection of a broad spectrum ofhuman papillomavirus genotypes)，J Gen Virol 1990,71(Pt 1):173-181)确认了通过在3'延伸而进一步修改后的单独序列引物(de RodaHusman AM,Walboomers JM,van den Brule AJ,Meijer CJ,SnijdersPJ：使用在3'延伸的通用引物GP5和GP6和邻近的高度保守序列以改善通过PCR测定人乳头状瘤病毒(The use of general primers GP5and GP6 elongated at their 3'ends with adjacent highly conservedsequences improves human papillomavirus detection by PCR)，J GenVirol 1995,76(Pt 4):1057-1062)，并将其扩大以覆盖更广范围的HPV类型(Schmitt M,Dondog B,Waterboer T,Pawlita M：使用新的广谱GP5+和GP6+引物通过PCR均匀扩增人外阴α乳头状瘤病毒(Homogeneous amplication of genital human alpha papillomavirus byPCR using novel broad-spectrum GP5+and GP6+primers)，J ClinMicrobiol 2008,46(3):1050-1059)。该“通用引物”系统产生的扩增物的大小为150bp。
针对L1基因的同样区域，Kleter和同事(Kleter B,van Doom LJ,Schrauwen L,Molijn A,Sastrowijoto S,ter Schegget J,Lindeman J,terHarmsel B,Burger M,Quint W：用于测定和确认肛门和外阴人乳头状瘤病毒的高度敏感PCR反向杂交线性探针检测的发展和临床评估(Development and clinical evaluation of a highly sensitive PCR-reversehybridization line probe assay for detection and identification ofanogenital human papillomavirus)，J Clin Microbiol 1999,37(8):2508-2517；Kleter B,van Doom LJ,ter Schegget J,Schrauwen L,van Krimpen K,Burger M,ter Harmsel B,Quint W：用于高度敏感广谱测定肛门和外阴人乳头状瘤病毒的新短片段PCR检测(Novelshort-fragment PCR assay for highly sensitive broad-spectrum detectionof anogenital human papillomavirus)，Am J Pathol 1998,153(6):1731-1739)设计了一个通过结合“通用碱基”、肌苷而能够识别所有HPV类型的4个正向和2个反向引物的系统。这些引物扩增一个65bp区域，该扩增物内包括可直接针对特异性型捕获的高可变区。集中于上游L1序列,Yoshikawa,等人(Yoshikawa H,Kawana T,Kitagawa K,Mizuno M,Yoshikura H,Iwamoto A：使用通用引物进行DNA扩增检测和分类外阴人乳头状瘤病毒(Detection and typing of multiple genitalhuman papillomaviruses by DNA amplication with consensus primers)，Jpn J Cancer Res 1991,82(5):524-531)描述了后来修改为包括多达46个独特HPV类型的L1C1/L1C2引物(Jeney C,Takacs T,Sebe A,SchaffZ:使用L1F/L1R引物系统基于多重PCR和杂交进行DNA扩增检测和分类46种外阴人乳头状瘤病毒(Detection and typing of 46 genitalhuman papillomaviruses by the L1F/L 1R primer system based multiplexPCR and hybridization)，J Virol Methods 2007,140(1-2):32-42；Takacs T,Jeney C,Kovacs L,Mozes J,Benczik M,Sebe A:用于测定15种高风险和5种低风险HPV类型的基于分子信标的实时PCR法(Molecularbeacon-based real-time PCR method for detection of 15 high-risk and 5low-risk HPV types)，J Virol Methods 2008,149(1):153-162)。该研究由Jeney承担(Jeney C,Takacs T,Sebe A,SchaffZ:使用L1F/L1R引物系统基于多重PCR和杂交进行DNA扩增检测和分类46种外阴人乳头状瘤病毒(Detection and typing of 46 genital human papillomavirusesby the L1F/L 1R primer system based multiplex PCR and hybridization)，J Virol Methods 2007,140(1-2):32-42；Takacs T,Jeney C,Kovacs L,Mozes J,Benczik M,Sebe A：用于测定15种高风险和5种低风险HPV类型的基于分子信标的实时PCR法(Molecular beacon-based real-timePCR method for detection of 15 high-risk and 5 low-risk HPV types)，JVirol Methods 2008,149(1):153-162)以确认能够更敏感地测定更多类型的新区域，在HPV L1序列内确认了一个与通过X射线晶体学研究确定的蛋白的一个高可变区一致的区域(Chen XS,Garcea RL,Goldberg I,Casini G,Harrison SC：组装自人乳头状瘤病毒16的L1蛋白的小病毒样颗粒的结构(Structure of small virus-like particlesassembled from the L1 protein of human papillomavirus 16)，Mol Cell2000,5(3):557-567)，并通过域交换实验进一步证实(Olcese VA,ChenY,Schlegel R,Yuan H：HPV16L1环域在形成特异性型构象表位中的特征(Characterization of HPV 16 L1 loop domains in the formation of atype-specific,conformational epitope)，BMC Microbiol 2004,4:29)。该引物的应用描述于Jeney C,Takacs T,Sebe A,SchaffZ(使用L1F/L1R引物系统基于多重PCR和杂交进行DNA扩增检测和分类46种外阴人乳头状瘤病毒(Detection and typing of 46 genital humanpapillomaviruses by the L1F/L1R primer system based multiplex PCRand hybridization)，J Virol Methods 2007,140(1-2):32-42)和Takacs T,Jeney C,Kovacs L,Mozes J,Benczik M,Sebe A(用于测定15种高风险和5种低风险HPV类型的基于分子信标的实时PCR法(Molecularbeacon-based real-time PCR method for detection of 15 high-risk and 5low-risk HPV types)，J Virol Methods 2008,149(1):153-162)，其产生了而一个-250bp扩增物。
对前述的各L1扩增方法进行检测。各系统均获得成功。针对上游L1250bp区而选择做进一步研究，由于其扩增物大小和捕获探针区内的高度可变性，该捕获探针区允许更好地设计能够在室温下杂交的捕获探针。
随着对HPV感染和宫颈癌潜在发展的了解增多，越来越清楚的是，除了确定高风险HPV类型的存在，理解每个细胞中病毒载量或HPV颗粒数目，还将有益于诊断。为检验该检测的应用，评估了来自同样样品的HPV和球蛋白的像素强度。图43A所示为HPV像素强度随对应的球蛋白像素强度增加的曲线图结果。如图43A所示，球蛋白像素强度和HPV像素强度增加之间没有关联。
然后，将HPV和球蛋白像素的比率与高风险HPV类型的存在进行比较。图43B显示了HPV和球蛋白像素的比率，并针对至高风险HPV类型绘制曲线。这些比率从<1至>6变化，但与HPV类型的存在没有明显的关联。图43C显示了HPV和球蛋白像素的比率，并针对至高风险HPV类型绘制曲线。该“Digene”系列曲线描述了，与本发明检测相比，商业上的Digene检测结果数据。该插入图显示了随后整合主图中的Digene检测结果(不同刻度的Y-轴)。
总之，在CARD上进行的所述HPV检测提供了用于快速可靠地分子检测临床相关HPV类型的全自动系统。而且，由于所述CARD的便携性，该实施例中描述的方法在工业化国家和发展中国家均有广泛的应用。
实施例5：基于CARD的稀少目标物检测
该实施例描述了稀少目标物的检测。在该实施例中，所述稀少靶核酸与水生病原体相关。稀少靶核酸的测定显示了其在水供给中的存在。该检测可用于测定大容积液体样品中存在的稀少目标物(来自少量的生物体或细胞核)。
参照图20A-20P，下列操作和试剂用于进行活水生病原体隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)检测
样品添加和免疫磁力分离
所有试剂均为商业购买自Dynal用于免疫磁力捕获隐孢子虫。将容积调整为用于CARD上的自动化操作。
a.操作员将1ml预浓缩的含水样品加入至样品输入槽。
b.将100μl缓冲液1、100μl缓冲液2和10μl磁珠分配至样品所在的相同管中。轻度振荡或抖动下孵化30分钟。
c.提升样品输入槽下的磁铁，并将槽中的内容物泵送至废料槽。
d.将200μl缓冲液1分配至缓冲液1槽，将磁铁降低后将所述缓冲液泵送至样品输入槽以重悬浮所述磁珠。
e.提升样品输入槽下的磁铁，并将槽中的内容物泵送至废料槽。
热激
热激为可选地实施以测定在以上描述的免疫磁力分离步骤中捕获的活生物体。(否则，按如下的详细描述用标准PCR方法进行DNA扩增。)
RNA扩增试剂和RNA扩增技术(例如，RT-PCR或NASBA或本领域已知的等同技术)进行扩增。
a.将磁铁降低。
b.将40μl不含核酸酶的水分配至非加热的磁力分离槽，将所有内容物泵送至加热的磁力分离槽，并轻轻抖动以重悬浮所述磁珠。
c.打开加热器至42°C保持5分钟。活的隐孢子虫(Crypto)将开始表达编码热激蛋白的RNA。
细胞裂解和纯化
所有试剂均为商业购买自Qiagen公司。将容积调节为用于CARD上的自动化操作。
a.将100μl Qiagen公司的细胞裂解缓冲液RLT分配至细胞裂解缓冲液槽，并将其泵送至样品输入槽，抖动摇晃6次。然后，将加热器温度升高至60°C并孵化10分钟。10分钟期间抖动两次，到5分钟时抖动一次，然后是恰好到10分钟之前抖动一次。
b.将100μl乙醇分配至乙醇槽，将其泵送至样品输入槽并抖动6次。
c.将样品输入槽的全部内容物泵送至二氧化硅过滤膜的顶部，然后抽吸所述内容物穿过所述过滤膜，将其泵送至废料槽。通过打开连接至真空端口的阀门并提供30秒的真空抽吸空气穿过所述过滤膜。
d.将100μl乙醇分配至乙醇槽，并将其泵送至二氧化硅过滤膜的顶部，然后抽吸所述内容物穿过所述过滤膜，将其泵送至废料槽。通过打开连接至真空端口的阀门并提供30秒的真空抽吸空气穿过所述过滤膜。
e.将100μl缓冲液2分配至缓冲液2槽，并将其泵送至二氧化硅过滤膜的顶部，然后抽吸所述内容物穿过所述过滤膜，将其泵送至废料槽。通过打开连接至真空端口的阀门并提供30秒的真空抽吸空气穿过所述过滤膜。
f.将100μl缓冲液3分配至缓冲液3槽，并将其泵送至二氧化硅过滤膜的顶部，然后抽吸所述内容物穿过所述过滤膜，将其泵送至废料槽。通过打开连接至真空端口的阀门并提供30秒的真空抽吸空气穿过所述过滤膜，并重复一次。
g.将100μl乙醇分配至乙醇槽，并将其泵送至二氧化硅过滤膜的顶部，然后抽吸所述内容物穿过所述过滤膜，将其泵送至废料槽。通过打开连接至真空端口的阀门并提供30秒的真空抽吸空气穿过所述过滤膜。
h.将40μl不含核酸酶的水分配至非加热的磁力分离槽，将所有内容物泵送穿过二氧化硅过滤膜的底部并孵化2分钟，然后将所有内容物泵送回到所述非加热的磁力分离槽。
mRNA分离
所有试剂均为商业购买自Dynal，将容积调整为用于CARD上的自动化操作。
a.先将100μl结合缓冲液、再将20μl磁珠分配至非加热的磁力分离槽，然后将结合缓冲液泵送至所述非加热的磁力分离槽。在轻轻抖动下孵化5分钟。
b.提升非加热的磁力分离槽下的磁铁，并将槽中的内容物泵送至废料槽。
c.将100μl洗涤缓冲液A分配至洗涤缓冲液A槽，并将其泵送至非加热的磁力分离槽。将磁铁降低并在轻轻抖动下重悬浮磁珠。
d.提升非加热的磁力分离槽下的磁铁，并将槽中的内容物泵送至废料槽。
e.再次重复步骤c和步骤d。
f.将100μl洗涤缓冲液B分配至洗涤缓冲液B槽，并将其泵送至所述非加热的磁力分离槽。将磁铁降低并在轻轻抖动下重悬浮所述磁珠。
g.提升非加热的磁力分离槽下的磁铁，并将槽中的内容物泵送至废料槽。
h.再次重复步骤f和步骤g。
i.当所述非加热的磁力分离槽被排空(除磁珠以外)，往回泵送空气至洗涤缓冲液B槽以清洁通道和薄膜的任何残留流体。
NASBA扩增
a.降低非加热的磁力分离槽下的磁铁。
b.将30μl NASBA预混合液分配至扩增预混合液槽，并将其泵送至非加热的磁力分离槽。抖动非加热的磁力分离槽中的内容物以重悬浮所述磁珠。
c.将非加热的磁力分离槽中的内容物泵送回扩增预混合液槽。
d.将多功能加热器温度升高至41°C。
e.抽吸扩增预混合液槽中的内容物穿过扩增反应器，并泵送其少量至废料槽。该过程完全以流体加注扩增反应器(无气泡)。
f.将扩增反应器的内容物于41°C孵化90分钟。
横向流动分析
a.将20μl杂交缓冲液分配至杂交缓冲液槽，并泵送最初其中的4μl部分至废料以清洁通道和薄膜。
b.将4μl杂交缓冲液泵送至加热的分析槽。
c.从扩增反应器中泵送最初其中的14μl容积至废料以清洁通道和薄膜。
d.然后从扩增反应器中泵送2μl至加热的分析槽，再从杂交缓冲液槽中泵送6μl至加热的分析槽。
e.将4μl标记物(此处为用与所述扩增物同源的寡核苷酸标记的脂质体，加入在横向流动分析的终点时可见的标记物)分配至加热的分析槽。在轻度振荡下于41°C孵化5分钟。
f.将8μl加热的分析槽中内容物泵送至分析槽中的横向流动条。
g.在来自加热的分析槽的最初8μl容积或溶液被泵送至横向流动条后，同时将35μl流动的缓冲液分配至流动的缓冲液槽，并将其泵送至横向流动条。
h.标记的脂质体如果与扩增物进行了杂交，将被另一条附连至横向流动测试条是互补寡核苷酸捕获，而脂质体内部所含的染料在该相同位点上可以看见。
图像分析
a.将照相机置于分析膜上方并记录图像。
b.将图像发送至控制系统进行处理。
c.报告结果。
图44显示了基于CARD测定获得的结果。测定了来自隐孢子虫的热激mRNA。IMS=免疫磁力分离。HS=热激。
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利均以参考形式并入本文中，如同各参考文献独立地和特别地表明其如前文所述以参考方式全文并入本文中。
所用术语“一”、“一个”和“所述”以及本发明上下文中提到的类似指示(特别是在所附权利要求书上下文中)将解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或明显与上下文抵触。术语“包含”、“具有”、“包括”、“含有”均解释为开放式术语(即，意思为“包括但不限于”)，除非另有说明。术语“连接的”解释为部分或全部地容纳于其中、连接至或连接在一起，甚至是中间有某种东西。
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本申请文件中没有语言应被解释为表示作为实施本发明关键的不要求保护的要素。
对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神和保护范围的情况下，显然可以对本发明做出各种修改和变化。无意将本发明限制于特定形式或已公开的形式，但相反，其旨在涵盖所有落入所附权利要求书限定的本发明精神和保护范围内的修改、替代性构造和等效物。因此，本发明旨在涵盖本发明提供的落入所附权利要求书和其等效物范围内的修改和变化。

Claims (34)

1.独立式生物检测装置，包括：
机壳；
设置于所述机壳中的液分平台，其包括可控-活动试剂分配系统；
设置于所述机壳中的试剂供给部件；
气分平台，其可拆卸地设置于机壳中与液分平台共用的空间内，可拆卸地连接至流体传输层和多个槽，其中待引入的所述流体传输层、所述槽和测试样品设置于所述机壳中与液分平台分开的空间内；
气动供给系统，其在机壳中与液分平台分开的空间内可拆卸地连接至气分平台；以及
设置于所述机壳中的控制系统，其连接至至少一个所述液分平台和所述气动供给系统；
其中所述装置的特征在于，其为独立式全自动生物检测装置。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述液分平台还包括：
移动控制系统，其可操作地连接至所述试剂分配系统，其中所述试剂分配系统包括具有终端分配头的试剂分配部件；以及
连接至试剂分配系统的照相机，其视场至少包括槽内目标物的选定区。
3.根据权利要求2所述的装置，其中所述试剂分配部件为具有长度L和选定内径的长针结构。
4.根据权利要求3所述的装置，其中所述试剂分配系统还包括流体连接至所述试剂分配部件的试剂存储结构；其中所述试剂存储结构具有选定的尺寸，所述尺寸可操作地与选定的内径匹配。
5.根据权利要求4所述的装置，其中所述试剂存储结构为一段管子的长度。
6.根据权利要求2所述的装置，其中所述试剂分配部件为多个分别具有不同的选定内径、长度为L的长针结构。
7.根据权利要求6所述的装置，其中所述试剂分配系统还包括多个试剂存储结构，所述试剂存储结构分别流体连接至所述多个试剂分配部件；其中各试剂存储结构具有选定的尺寸，所述尺寸可操作地与各自选定的内径匹配。
8.根据权利要求7所述的装置，其中各试剂存储结构为一段管子的长度。
9.根据权利要求7所述的装置，仅具有两个试剂存储结构，所述试剂存储结构分别流体连接至两个试剂分配部件；其中一个试剂分配部件具有内径b1，0.003≤b1≤0.018英寸，另一个试剂分配部件具有内径b2，0.015≤b2≤0.030英寸。
10.根据权利要求1所述的装置，其中所述气分平台与具有至少一种检测能力的微流体系统连接。
11.根据权利要求10所述的装置，其中所述微流体系统还包括多层式、一体化、聚合材料的、非弹性微流体部件，所述微流体部件具有包括多个气动薄膜微特征的给定配置。
12.根据权利要求11所述的装置，其中所述气分平台下侧具有多个仅气动的端口，且设置于所述气分平台中的多个仅气动的通道流体连接至在流体传输层的多个阀门和所述多个仅气动的端口；其中所述多个气动端口具有固定配置，且所述多个仅气动的通道具有给定配置，其特定地匹配于在流体传输层的多个气动薄膜的给定配置。
13.根据权利要求12所述的装置，其中所述气动供给系统还包括让气动信号从其中通过的多个口管，其流体连接至所述多个仅气动的端口；其中所述多个口管具有固定配置，其特定地匹配于所述气分平台的多个仅气动的端口的固定配置并可拆卸地连接至所述气分平台。
14.根据权利要求11所述的装置，其中各多层式、一体化、聚合材料的、非弹性微流体部件还包括：
聚合的、非弹性基板，其中设置有多个流体通道，各所述流体通道具有入口端和出口端；
至少一个试剂槽，其能够容纳试剂材料；
至少一个双向薄膜泵，包括至少三个基于非弹性膜的薄膜阀结构；以及
阀门，其设置为流体连接至至少一个试剂槽和至少一个入口端，
其中所述阀门适于可控地引导材料从至少一个试剂槽经由至少一个连接至所述阀门的所述通道流向多个槽。
15.根据权利要求14所述的装置，其中各基板还包括多个分析槽，各分析槽内设置有分析系统。
16.根据权利要求14所述的装置，其中所述分析系统为下述之一：比色的、化学发光的、电化学的、电泳的、横流的、蛋白质微阵列、核酸微阵列、荧光的分析系统。
17.根据权利要求14所述的装置，还包括具有多个周边含凹口的紧固环结构，其中分析膜可操作地置于所述紧固环结构内。
18.根据权利要求17所述的装置，其中所述多个槽包括分析槽，该分析槽具有至少部分的内周框架，所述分析膜设置于该框架上。
19.根据权利要求17所述的装置，其中所述紧固环结构包括两个各自具有多个周边含凹口的相对的环结构，进一步地，其中所述分析膜设置于所述两个相对的环结构中间。
20.根据权利要求15所述的装置，还包括加热器。
21.根据权利要求20所述的装置，其中所述加热器设置在可加热、可磁吸接合的槽附近加热。
22.根据权利要求14所述的装置，还包括：
流管安装层，其附连于包括多个流管的所述基板的底面，各流管具有流体连接至分别的流体通道的近端和从基板上垂直向下伸出的远端；以及
分别的多个扩增/反应室，在其顶部区域附连有所述管安装层从而各管的远端设置为基本上靠近其底部区域。
23.根据权利要求22所述的装置，还包括加热器，其用于升高各扩增/反应室的温度。
24.根据权利要求11所述的装置，还包括可操作地设置于槽或通道下的磁性组件，其中所述磁性组件还包括磁铁、磁铁支架、活塞杆和气动活塞组件。
25.根据权利要求24所述的装置，还包括可操作地连接至所述磁性组件的加热器组件。
26.用于分离、扩增和分析可能存在于流体测试样品中的靶核酸序列的自动化方法，包括：
提供操作微流体系统的气分平台，所述微流体系统中设置有流体传输层和流体通道，以及与所述气分平台连接的槽；
将所述流体测试样品引入至所述流体通道；
从流体连接至流体传输层的至少一个分立的槽向所述通道提供至少一种试剂；
在流体传输层、槽或扩增反应器的区域内混合所述流体测试样品和所述至少一种试剂；
将所述流体测试样品输送至可操作地连通至流体传输层的温控扩增/反应反应器；
在足以使靶核酸序列得以扩增的条件下，于所述扩增/反应反应器中孵化所述流体测试样品；
将所述流体测试样品输送至分析槽；以及
分析来自测试样品的扩增的靶核酸序列，
其中所述测试样品从流体传输层中的起始位置被输送至分析槽，与任何其他样品和所述气分平台及分配系统相隔离。
27.根据权利要求26所述的自动化方法，其中所述输送和混合步骤通过经由至少一个由所述气分平台操作的多薄膜阀的泵来泵送所述流体测试样品和一定量至少一种试剂通过所述流体传输层来完成。
28.根据权利要求26所述的自动化方法，其中所述分析步骤还包括在微流体系统中的微阵列分析槽内进行微阵列分析。
29.根据权利要求28所述的自动化方法，还包括在微阵列分析槽内提供微阵列分析膜；使流体在微阵列分析膜表面上流动；沿着微阵列分析膜外围通过流体出口路线基本上去除所述流体。
30.根据权利要求28所述的自动化方法，还包括在微阵列分析槽内提供微阵列分析膜；使流体在微阵列分析膜表面上向后和向前交替流动。
31.根据权利要求28所述的自动化方法，还包括向微阵列分析膜提供热量。
32.根据权利要求26所述的自动化方法，其中所述靶核酸序列包括SNP。
33.根据权利要求26所述的自动化方法，其中所述分析步骤包括测定所述扩增的靶核酸序列和靶核酸序列探针之间的相互作用。
34.根据权利要求26所述的自动化方法，其中所述分析步骤包括测定扩增的靶核酸序列的量或水平，其中所述方法还包括将所述靶核酸序列的量或水平与预选的量或水平进行比较。
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Denomination of invention: Self-contained biological assay apparatus, methods, and applications

Granted publication date: 20150218

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