CN103223160A - 胰岛素-低聚物共轭物，制剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及胰岛素-低聚物共轭物，制剂及其用途。本发明提供包括阳离子和胰岛素化合物共轭物的配合物。所述胰岛素化合物共轭物包括结合于改性部分，例如聚乙二醇部分的胰岛素化合物，例如人胰岛素或其类似物。本发明还包括含有这些配合物的固体和药物组合物，制备这些配合物的方法，以及利用这些配合物治疗胰岛素化合物缺乏和其它疾病的方法。另外，本发明还包括新型胰岛素化合物共轭物和用于制备新型胰岛素化合物共轭物的改性部分。本发明还包括用于给药本发明的药剂，例如所述新型胰岛素化合物共轭物，和/或阳离子－胰岛素化合物共轭物配合物的脂肪酸组合物。

Description

胰岛素-低聚物共轭物,制剂及其用途
本申请为国际申请PCT/US2005/025644于2007年3月19日进入中国国家阶段、申请号为200580031521.2、发明名称为“胰岛素－低聚物共轭物，制剂及其用途”的分案申请。 
相关申请 
本申请要求如下美国专利申请的优先权，并将它们的全部公开内容并入本文中作为参考：2004年7月19日提交的60/589,058、2004年10月15日提交的60/619,153、2004年12月2日提交的60/632,578、2005年2月24日提交的60/655,838和2005年2月24日提交的60/655,803。本申请还并入Radhakrishnan等人于2005年7月19日提交的如下申请作为参考：名称为“Cation complexes ofinsulin compoundconjugates,formulations and uses thereof”的美国专利申请11/184,668；名称为“Insulin-oligomer compound conjugates,formulations and usesthereof”的美国专利申请11/184,594；名称为“Fatty acid formulations fororal delivery of proteins and peptides,and uses thereof”的美国专利申请11/184,528。 
技术领域
本发明涉及新型胰岛素化合物共轭物，其中胰岛素或胰岛素类似物结合于改性部分。本发明还涉及这些胰岛素化合物共轭物的阳离子配合物，并涉及包括这种胰岛素化合物共轭物和/或改性部分的药物制剂。 
背景技术
锌配合的胰岛素化合物是可商购的，例如商品名为
Figure BDA00002516425100011
和
Figure BDA00002516425100012
锌配合的胰岛素通常以六聚体形式存在。 
对于锌在酰化胰岛素的结晶中的应用已有很多方法被描述。例如，2001年11月15日公开的Mark L.Brader等人的，名称为“Stabilizedacylated insulin formulations”的美国专利申请20010041786描述了用于非肠道递送的具有水溶液的制剂，特别是作为可注射制剂，其中pH为7.1至7.6，其包含脂肪酸酰化的胰岛素或脂肪酸酰化的胰岛素类似物，并用锌和优选的酚类化合物稳定。在2002年9月17日公告的Schaffer等人的美国专利6,451,970，其已转让给Novo Nordisk A/S，名称为“Peptide derivatives”，该专利描述了胰岛素化合物和胰岛素类似物的衍生物，其中B链的N端氨基和/或在位置B28、B29或B30的Lys的e-氨基用具有12至22个碳原子的长链烃基团酰化，及其锌配合物。 
鱼精蛋白和酚类化合物已经被描述用于酰化胰岛素的结晶。名称均为“Insoluble insulin compositions”的Brader的美国专利6,268,335（2001年7月31日）和6,465,426（2002年10月10日）描述了由酰化胰岛素鱼精蛋白配合物、六聚体稳定化的酚类化合物和二价金属阳离子组成的不溶组合物。 
已有的方法被特别改进用于天然胰岛素化合物或胰岛素化合物类似物的结晶，或者用于使酰化的胰岛素化合物相对于未酰化的胰岛素化合物具有增加的亲脂性。在本领域中需要包括衍生的胰岛素化合物，而不是酰化胰岛素，例如亲水和/或两亲胰岛素化合物衍生物的药学可接受的配合物，以及需要稳定化的非酰化亲脂性胰岛素化合物类似物。本领域还需要相对于已有共轭物而言具有增加生物利用度的或具有其它改进的药物品质的新型蛋白质共轭物。本领域需要使蛋白质和蛋白质共轭物方便口服递送的新型制剂。最后，需要改进蛋白质如胰岛素化合物的口服生物利用度的组合方法，该方法将作为固体提供的改进的口服蛋白质共轭物并入到改进的制剂中以使蛋白质的口服递送的益处最大化。 
发明内容
一般而言，本发明提供包含具有结合于改性部分的胰岛素化合物的胰岛素化合物共轭物和阳离子的配合物，其中所述胰岛素化合物共轭物与所述阳离子配位。所述的胰岛素化合物可以，例如为天然胰岛素或胰岛素类似物。胰岛素化合物的例子包括人胰岛素、赖脯胰岛素、des30胰岛素、天然胰岛素原、人工胰岛素原等。所述的阳离子组分可以，例如为选自Zn++、Mn++、Ca++、Fe++、Ni++、Cu++、Co++和Mg++的二价金属阳离子。 
所述的改性部分可被选择以使得所述的胰岛素化合物共轭物的溶解度大于、小于或等于相应的未共轭的胰岛素化合物的溶解度。优先选择所述的改性部分以使得在pH为约7.4的水溶液中，所述胰岛素化合物共轭物的溶解度比相应的未共轭的胰岛素化合物的溶解度至少大1.05、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5或15倍。优先选择所述的改性部分以使得胰岛素化合物共轭物在pH为约7.4下的水溶解度超过约1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、50g/L、75g/L、100g/L、125g/L或150g/L。另外，选择所述的改性部分以使得所述的胰岛素化合物共轭物的溶解度等于或大于相应的未共轭的胰岛素化合物的溶解度，并且所述的胰岛素化合物共轭物的水溶解度通过加入锌而降低。在另一方面，选择所述的改性部分以使得所述的胰岛素化合物共轭物的溶解度等于或大于相应的未共轭的胰岛素化合物的溶解度；所述胰岛素化合物共轭物的水溶解度通过加入锌而降低，并且所述配合物的水溶解度大于胰岛素化合物的水溶解度。在又一方面，与相应的母体胰岛素化合物相比，所述胰岛素化合物共轭物的相对亲脂性（krel）为1或小于1。 
本发明还提供具有结合于改性部分的胰岛素化合物的新型胰岛素化合物共轭物。例如，本发明提供结合于具有下式的改性部分的胰岛 素化合物： 
-X-R1-Y-PAG-Z-R2（式VI） 
其中， 
X、Y和Z为独立选择的连接基团，并且各自任选存在，并且X，当存在时，通过共价键结合于胰岛素化合物， 
R1或R2至少一个是存在的，并且为低级烷基并可任选包括羰基， 
R2为封端基团，例如-CH3、-H、甲苯磺酸酯或活性基团，和 
PAG为合并一个或多个亚烷基二醇部分（即氧基亚烷基部分）的直链或支链的碳链，并任选合并一个或多个选自-S-、-O-、-N-和-C(O)-的另外的部分，和 
其中所述的改性部分具有最大数量的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个重原子。 
在本发明的实施方案中，任何一个或多个X、Y和Z可以不存在。另外，当存在时，X、Y和/或Z可独立地选自-C(O)-、-O-、-S-、-C-和-N-。在一个实施方案中，Z为-C(O)-。在另一个实施方案中，Z不存在。 
在一些实施方案中，R1为低级烷基，并且R2不存在。在另一些实施方案中，R2为低级烷基，并且R1不存在。 
在另一个实施方案中，所述的改性部分可包括直链或支链的、取代的碳链部分，该碳链部分具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、19、20、21、22、23、24或25个选自-C、-C-、-O-、=O、-S-、-N-、-Si-原子的主链。所述的重原子将典型地包括一个或多个碳原子和一个或多个选自-O-、-S-、-N-和=O的非碳重原子。所述的碳原子和非碳重原子典型地以每个非碳重原子至少1个碳原子，优选每个非碳重原子至少2个碳原子，更优选每个非碳重原子至少3个碳原子的比例存在。所述的碳原子和氧原子典型地以每个氧 原子至少1个碳原子，优选每个氧原子至少2个碳原子，更优选每个氧原子至少3个碳原子的比例存在。所述的改性部分可包括一个或多个封端基团，例如支链或直链的C1-6，支链或直链的，或羰基。所述的改性部分将典型地包括氢，并且一个或多个氢可用氟（其是重原子但在上述式子中不认为它是重原子）替代。在一些情况下所述的改性部分可以明确不包括未取代的烷基部分。所述的改性部分可以例如通过连接基团，例如氨基甲酸酯、碳酸酯、醚、酯、酰胺或二级氨基或通过二硫键，被结合于例如在多肽的氨基酸上的可利用的基团，例如氨基、羟基或游离羧酸基团。在所述连接基团中的分子被认为是所述改性部分的一部分。在优选的实施方案中，所述改性部分的分子量小于HIM2改性部分的分子量。 
本发明包括具有如下式的改性部分的胰岛素化合物共轭物： 
Figure BDA00002516425100051
其中n为1、2、3或4，和m为1、2、3、4或5；和/或 
Figure BDA00002516425100052
其中n为1、2、3、4或5，和m为1、2、3或4。 
将理解的是，所述的新型改性部分，以及该部分在改性胰岛素和其它多肽中的应用，它们自身就是本发明的方面。 
本发明还提供包括本发明的胰岛素化合物共轭物和/或阳离子－胰岛素化合物共轭物的制剂。本发明的发明人惊奇地发现一些脂肪酸组合物是特别有用的，尤其对于多肽和多肽共轭物，例如胰岛素和胰岛素化合物共轭物的口服递送，和/或本发明的阳离子－胰岛素化合物共轭物配合物的口服递送。在一方面，本发明提供脂肪酸组合物，其 具有一种或多种饱和或不饱和C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10的脂肪酸和/或这些脂肪酸的盐。优选的脂肪酸为辛酸、癸酸、肉豆蔻酸和月桂酸。优选的脂肪酸盐为辛酸、癸酸、肉豆蔻酸和月桂酸的钠盐。所述组合物的脂肪酸含量范围典型地为低限约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0重量%，和高限约3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9或12.0重量%。在又一个实施方案中，所述组合物的脂肪酸含量范围为低限约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0重量%，和高限约3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9或12.0重量%，并且所述组合物的脂肪酸含量典型地为大于约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8或99.9重量%的单独羧酸，优选辛酸、癸酸、肉豆蔻酸或月桂酸，或其盐。 
本发明还提供在对象中用本发明的胰岛素化合物共轭物、阳离子－胰岛素化合物共轭物配合物和/或制剂治疗胰岛素缺乏或另外补充胰岛素的方法。该方法通常包括将治疗有效量的一种或多种本发明的胰 岛素化合物共轭物、阳离子－胰岛素化合物共轭物配合物和/或制剂对需要其的对象给药。 
附图说明
图1-15B为本发明的多种结晶固体的光学显微照片。图1和2为利用Zeiss Axiovert显微镜拍摄的光学显微照片，其显示晶体生长24小时，30g/L浓度的HIM2的T型Zn配合物。图3为利用Zeiss Axiovert显微镜拍摄的光学显微照片，其显示晶体生长5天，30g/L浓度的HIM2的T型Zn配合物。图4为利用Zeiss Axiovert显微镜拍摄的光学显微照片，其显示晶体生长4天，30g/L浓度的HIM2的R型Zn配合物。图5显示包含30%有机溶剂的R型结晶的IN105的Zn配合物。图6A-10B显示用有机溶剂制备的多种R型HIM2的Zn配合物。图11A-14B显示多种R型共结晶的HIM2和IN105的Zn配合物的晶体光学显微照片。图15A-15B显示多种R型共结晶的HIM2和人胰岛素的Zn配合物的晶体光学显微照片。本发明包括具有示于任何图1-15B中的形态的晶体。 
图16-20显示对于HIM2和多种Zn-HIM2配合物的小鼠血糖测定结果。图16显示对于HIM2的MBGA生物效能曲线图。图17显示对于R型Zn HIM2胰岛素化合物产物的MBGA生物效能曲线图。图18显示对于T型Zn HIM2胰岛素化合物产物的MBGA生物效能曲线图。图19显示对于具有鱼精蛋白的Zn HIM2胰岛素化合物产物的MBGA生物效能曲线图。图20显示R型鱼精蛋白配合物在给药后30和90分钟的葡萄糖降低效应。 
图21－24显示对于IN-186、IN-192、IN-190、IN-191、IN-189、IN-178、IN-193、IN-194、IN-185、IN-196和IN-197的MBGA生物效能曲线图。 
图25和26显示对于本发明的Zn-HIM2配合物的狗夹（clamp） 研究结果。图27和28显示对于本发明的Zn-IN105配合物的狗夹研究结果。 
图29和30显示对狗给药IN105的狗夹研究结果，所述IN105在没有另外赋形剂的3w/v%癸酸钠盐的磷酸盐缓冲液中。 
图31－33显示对狗给药包含如下成分的片剂的狗夹研究结果，所述的片剂包含6mg IN105和150mg甘露醇，30mgExlotab，含有143mg月桂酸盐，含有或没有143mg癸酸盐。 
图34-37显示对于给药原型片剂150mg和280mg癸酸盐片剂和给药140mg/140mg癸酸盐/月桂酸盐片剂的狗的狗夹研究结果。 
图38-42显示对于给药原型片剂150mg和280mg癸酸盐片剂和给药140mg/140mg癸酸盐/月桂酸盐片剂的另外的狗的狗夹研究结果。 
定义 
下文中为整个本说明书和权利要求中所用的术语的定义。这些被提供的定义应用于整个本说明书中，除非另外指明。本文中没有定义的术语具有所述术语所属领域中通常理解的含义。 
“附加”，当用于涉及氨基酸序列时，其包括一个或多个氨基酸在所述序列的每端或两端的扩展以及插入到所述序列之中。 
“配合物”指分子缔合，其中一个或多个胰岛素化合物或胰岛素化合物共轭物与一个或多个金属原子或离子形成配位键。配合物可存在于溶液中或作为固体，例如晶体、微晶或无定形固体。“配合物混合物”指具有两种或更多种不同配合物的混合物，无论以溶液或以固体形式。配合物混合物可以，例如，包括具有不同胰岛素化合物、不同胰岛素化合物共轭物、不同杂化配合物、不同阳离子、上述物质的组合等的配合物。“杂化配合物”指具有两种或更多种不同胰岛素化合物和/或胰岛素化合物共轭物的阳离子－胰岛素化合物共轭物配合物。 
“配位剂”指具有多重电荷并键接于或配位于胰岛素化合物共轭物的分子。适于本发明使用的配位剂的例子包括鱼精蛋白、surfen、珠蛋白、精胺、亚精胺清蛋白、氨基酸、羧酸、聚阳离子聚合物、阳离子多肽、阴离子多肽、核苷酸和反义。参见Brange,J.,Galenics of Insulincompound,Springer-Verlag,Berlin Heidelberg(1987)，其全部内容被并入本文中作为参考。 
用于涉及氨基酸的附加、缺失或置换的“保守的”，指在氨基酸链上的附加、缺失或置换没有完全减少该胰岛素化合物的治疗效果，即该效果相对于科学上可接受的对照，例如相应的天然胰岛素化合物而言，可以降低、不变或增强。 
“亲水的”指显示出的水溶性的特性，并且术语“亲水部分”指亲水的部分和/或当结合于另一个化学个体时，增加这种化学个体的亲水性的部分。例子包括但不限于，糖类和聚亚烷基部分，例如聚乙二醇。“亲脂的”指显示出的脂溶性的特性，例如在脂肪和脂肪组织中积聚，溶解于脂质的能力和/或渗透、相互作用于和/或穿过生物膜的能力，并且术语“亲脂部分”指亲脂的部分和/或当接于另一个化学个体时，增加这种化学个体的亲脂性的部分。“两亲的”指显示出的亲水和亲脂的特性，并且术语“两亲部分”指两亲的部分和/或当结合于多肽或非多肽药物时，增加所形成的共轭物，例如某些PEG－脂肪酸改性部分和糖－脂肪酸改性部分的两亲性（即既增加亲水性还增加两亲性）的部分。 
“低级烷基”指具有一个至六个碳原子，即C1、C2、C3、C4、C5或C6的取代或未取代的、直链或支链的烷基部分。“高级烷基”指具有六个或更多个碳原子，即C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20等的取代或未取代的、直链或支链的烷基部分。 
“单分散的”指这样的化合物的混合物，其中在所述混合物中化合物的约100%具有相同的分子量。“基本上单分散的”指这样的化合物的混合物，其中在所述混合物中化合物的至少约95%具有相同的分子量。“纯粹单分散的”指这样的化合物的混合物，其中在所述混合物中化合物的约100%具有相同的分子量并具有相同的分子结构。因此，纯粹单分散混合物是单分散混合物，但单分散混合物不一定是纯粹单分散混合物。“基本上纯粹单分散的”指这样的化合物的混合物，其中在所述混合物中化合物的至少约95%具有相同的分子量和相同的分子结构。因此，基本上纯粹单分散的混合物是基本上单分散的混合物，但基本上单分散的混合物不一定是基本上纯粹单分散的混合物。所述的阳离子－胰岛素化合物共轭物组合物的胰岛素化合物共轭物组分优选为单分散的、基本上单分散的、纯粹单分散的或基本上纯粹单分散的，但也可以是多分散的。“多分散的”指具有的分散性不是单分散的、基本上单分散的、纯粹单分散的或基本上纯粹单分散的。 
本文中所特定使用的“天然胰岛素化合物”指以由天然、合成或基因工程来源提供的哺乳动物的胰岛素化合物（例如人胰岛素、牛胰岛素、猪胰岛素或鲸胰岛素的化合物）。人胰岛素由通过二硫键交联的21个氨基酸的A链和30个氨基酸的B链组成。适当交联的人胰岛素包括三个二硫桥键：一个在A7和B7之间，第二个在A20和B19之间，和第三个在A6和A11之间。人胰岛素具有三个游离氨基：B1-苯丙氨酸、A1-甘氨酸和B29-赖氨酸。在位置A1和B1的游离氨基是α-氨基。在位置B29的游离氨基是e-氨基。“胰岛素类似物”指这样的多肽，其相对于相应的天然胰岛素显示出一些、全部或增强的活性，或者在体内或体外转化为相对于相应的天然胰岛素显示出一些、全部或增强活性的多肽，例如具有含有一个或多个保守氨基酸附加、缺失和/或置换的人氨基酸结构的多肽。胰岛素类似物利用已知的技术，例如描述于Dahiyat等人于2002年3月18日提交的美国专利公开20030049654，“Protein design automation for protein libraries”中的那 些技术确定。人和非人的动物的胰岛素原、前胰岛素原、胰岛素前体、单链胰岛素前体和上述任何物质的类似物也在本文中被指作胰岛素类似物，如非哺乳动物胰岛素那样。许多胰岛素类似物在本领域中是已知的（参见下文的讨论）。除非上下文中明确另外指出（例如如果涉及特定的胰岛素，例如“人胰岛素”等），术语“胰岛素化合物”被广义地使用，包括天然胰岛素和胰岛素类似物。 
“聚亚烷基二醇”或PAG指取代或未取代的、线性或支化的聚亚烷基二醇聚合物，例如聚乙二醇（PEG）、聚丙二醇（PPG）和聚丁二醇（PBG），及其组合（例如包括两种或多种不同PAG子单元，例如两种或更多种不同的选自PEG、PPG、PPG和PBG子单元的PAG单元的组合的线性或支化聚合物），以及包括所述聚亚烷基二醇的单烷基醚。术语“PAG子单元”指单个PAG单元，例如“PEG子单元”指单个聚乙二醇单元，例如，-(CH2CH2O)-，“PPG子单元”指单个聚丙二醇单元，例如，-(CH2CH2CH2O)-，和“PBG子单元”指单个聚丙二醇单元，例如，-(CH2CH2CH2CH2O)-。PAG和/或PAG子单元还包括取代的PAG或PAG子单元，例如PAG包括烷基侧链，例如甲基、乙基或丙基侧链或羰基侧链，以及PAG包括一个或多个支化的PAG子单元，例如异-PPG或异-PBG。 
“胰岛素原化合物”指这样的胰岛素化合物，其中B-链的C-端通过天然或人工的具有5个或更多个氨基酸的C-肽结合于A-链的N-端。“前胰岛素原化合物”指胰岛素原化合物，其进一步包括结合于所述B-链的N-端的前导序列，例如被选择以促进作为溶解蛋白的分泌的序列，或者被选择以防止N-端共轭的序列，或者被选择以增加纯度的序列（例如对纯化柱具有成键亲和力的序列）。“单链胰岛素化合物前体”或“微小胰岛素原化合物”指这样的胰岛素化合物，其中将B-链（或具有从所述C-端除去的1、2、3或4个氨基酸的平头的B链）的C-端结合于A-链的N-端或在N端缩短了1、2、3或4个氨基酸的平头的A链的N-端，其中没有插进C-肽，或通过具有1、2、3或4个氨基 酸的缩短的C-肽。 
“鱼精蛋白”指得自天然（例如鱼精）或重组来源的强碱性蛋白质的混合物。参见Hoffmann,J.A.等人Protein Expression andPurification,1:127-133(1990)。所述的鱼精蛋白组合物可以相对不含所述蛋白质的盐的制剂的形式提供，经常叫做“鱼精蛋白碱”，或者以包括所述蛋白质的盐的制剂的形式提供。 
“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文中可互换使用，指具有至少两个和最多至任意长度的氨基酸序列的化合物。 
“R-型”指形成于胰岛素化合物共轭物、阳离子和例如苯酚的稳定化化合物中的配合物构象。“T-型”指形成于胰岛素化合物共轭物、阳离子中，而没有例如苯酚的稳定化化合物的配合物构象。T-型或R型配合物可以包括或不包括鱼精蛋白。 
“科学上可接受的对照”指对于实验主题的领域的技术人员可接受的实验对照。 
“固体”指物体的状态，其中具有结构的三维规整性；该术语在本文中广义地用于指结晶固体、无定形固体，以及结晶固体和无定形固体的组合。“阳离子－胰岛素化合物共轭物固体”指包括优选与单价或多价阳离子配位的阳离子－胰岛素化合物共轭物的固体。“晶体”指具有规则多面体形状的固体。“结晶的”指固体具有晶体的特征。“微晶”指主要由以微观尺寸，典型的最大尺寸为1微米至100微米的结晶状态的物质组成的固体。在一些情况下，微晶组合物的单个晶体主要为单一结晶组合物。在一些实施方案中，本发明的晶体不是微晶。术语“微晶的”指状态是微晶。“无定形”指在形式上不是结晶的固体物质。本领域技术人员用标准技术，例如采用x-射线结晶学技术、扫描电子显微镜或光学显微镜可区分晶体和无定形物质。“固体 混合物”指两种不同固体的混合物。“晶体混合物”指两种不同的晶体的混合物。“共晶”指具有两种或更多种不同胰岛素化合物和/或胰岛素化合物共轭物的晶体。本发明的阳离子－胰岛素化合物共轭物配合物可以以任何上述任何形式或者两种或更多种这些形式的混合物的形式提供。 
“置换”指在所述胰岛素化合物序列中的一个或多个氨基酸残基用另一个氨基酸替代。在一些情况下，被置换的氨基酸起到功能等同物（functional equivalent）的作用，导致无征改变（silent alteration）。置换可以是保守的；例如保守的置换可选自所被置换的氨基酸属于的类的其它成员。非极性（疏水）氨基酸的例子包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸的例子包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半光氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。正电荷的（碱性）氨基酸的例子包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。负电荷的（酸性）氨基酸的例子包括天冬氨酸和谷氨酸。 
“水溶解度”或“水溶解性”除非另外指明，在pH为7.4的缓冲水溶液中测定。 
发明详述 
本发明提供阳离子－胰岛素化合物共轭物配合物和包括这些配合物的多种组合物，以及制备和使用这些配合物和组合物的方法。所述的配合物用于给药胰岛素化合物用于治疗各种内科疾病，例如特征为胰岛素化合物缺乏的疾病。这些配合物通常包括阳离子组分和胰岛素化合物共轭物组分。所述的胰岛素化合物共轭物组分通常包括结合于改性部分的胰岛素化合物。所述配合物和/或组合物的其它适当的组分的例子包括本领域中已知的用于制备阳离子－蛋白质配合物的稳定剂，配位剂，以及其它组分。本发明还提供包括这些胰岛素化合物共轭物和/或阳离子－胰岛素化合物共轭物配合物的新型胰岛素化合物共 轭物和脂肪酸的制剂。 
1.胰岛素化合物 
所述的阳离子－胰岛素化合物共轭物包括胰岛素化合物组分。该胰岛素化合物可以，例如，是哺乳动物的胰岛素化合物，例如人胰岛素，或者是胰岛素化合物类似物。 
本领域已知很多胰岛素化合物类似物。优选的胰岛素化合物类似物为包括赖氨酸的那些，优选赖氨酸在B-链的C端的5个氨基酸中，例如在位置B26、B27、B28、B29和/或B30。一组合适的类似物描述于EP-A 1227000107中（其全部公开内容被并入本文中用作参考），其具有胰岛素化合物的序列，除了在位置B28的氨基酸残基为Asp、Lys、Leu、Val或Ala；在位置B29的氨基酸残基为Lys或Pro；在位置B10的氨基酸残基为His或Asp；在位置B1的氨基酸残基为Phe、Asp，或仅被消除位置B2的残基或与在位置B2的残基的消除组合；在位置B30的氨基酸残基为Thr、Ala，或被消除；和在位置B9的氨基酸残基为Ser或Asp；只要位置B28或B29为Lys。 
其它合适的胰岛素化合物类似物的例子包括AspB28人胰岛素、LysB28人胰岛素、LeuB28人胰岛素、ValB28人胰岛素、AlaB28人胰岛素、AspB28ProB29人胰岛素、LysB28ProB29人胰岛素、LeuB28ProB29人胰岛素、ValB28ProB29人胰岛素、AlaB28ProB29人胰岛素，以及利用如上所述的置换原则提供的类似物。胰岛素化合物片段包括但不限于：B22-B30人胰岛素、B23-B30人胰岛素、B25-B30人胰岛素、B26-B30人胰岛素、B27-B30人胰岛素、B29-B30人胰岛素、B1-B2人胰岛素、B1-B3人胰岛素、B1-B4人胰岛素、B1-B5人胰岛素、人胰岛素的A链和人胰岛素的B链。 
合适的胰岛素化合物类似物的其它的例子可见于2003年7月31日的，名称为“Insoluble compositions for controlling blood glucose”的 美国专利公开20030144181A1；2003年6月5日的，名称为“Stableinsulin formulations”的美国专利公开20030104983A1；2003年2月27日的，名称为“Method for making insulin precursors and insulin analogprecursors”的美国专利公开20030040601A1；2003年1月2日的，名称为“Zinc-free and low-zinc insulin preparations having improvedstability”的美国专利公开20030004096A1；2003年4月22日的，名称为“Stable insulin formulations”的美国专利6,551,992B1；2003年3月18日的，名称为“C peptide for improved preparation of insulin andinsulin analogs”的美国专利6,534,288B1；2003年3月11日的，名称为“Insoluble compositions for controlling blood glucose”的美国专利6,531,448B1；2003年1月28日的，名称为“Selective acylation ofepsilon-amino groups”的美国专利RE37,971E；2002年12月26日的，名称为“Pulmonary insulin crystals”的美国专利公开20020198140A1；2002年10月15日的，名称为“Insoluble insulin compositions”的美国专利6,465,426B2；2002年9月3日的，名称为“Fatty acid-acylated insulinanalogs”的美国专利6,444,641B1；2002年9月26日的，名称为“Methodfor making insulin precursors and insulin precursor analogues havingimproved fermentation yield in yeast”的美国专利公开20020137144A1；2002年9月19日的，名称为“Stabilized insulin formulations”的美国专利公开20020132760A1；2002年6月27日的，名称为“Insoluble insulincompositions”的美国专利公开20020082199A1；2002年1月1日的，名称为“Method for administering acylated insulin”的美国专利6,335,316B 1；2001年7月31日的，名称为“Insoluble insulincompositions”的美国专利6,268,335B 1；2001年11月15日的，名称为“Method for making insulin precursors and insulin precursor analogueshaving improved fermentation yield in yeast”的美国专利公开20010041787A1；2001年11月15日的，名称为“Stabilized acylatedinsulin formulations”的美国专利公开20010041786A1；2001年11月8日的，名称为“Pulmonary insulin crystals”的美国专利公开20010039260A1；2001年11月1日的，名称为“Insoluble insulin compositions”的美国专利公开20010036916A1；2001年7月12日的，名称为“Method for administering monomelic insulin analogs”的美国专利公开20010007853A1；2000年4月18日的，名称为“Method foradministering acylated insulin”的美国专利6,051,551A；2000年3月7日的，名称为“Stable insulin formulations”的美国专利6,034,054A；1999年10月26日的，名称为“Method of delivering insulin lispro”的美国专利5,970,973A；1999年9月14日的，名称为“Monomelic insulin analogformulations”的美国专利5,952,297A；1999年7月13日的，名称为“Acylated Insulin Analogs”的美国专利5,922,675A；1999年3月30日的，名称为“Use of monomelic insulin as a means for improving thebioavailability of inhaled insulin”的美国专利5,888,477A；1999年2月23日的，名称为“Method of maintaining a diabetic patient's blood glucoselevel in a desired range”的美国专利5,873,358A；1998年5月5日的，名称为“Monomelic insulin analog formulations”的美国专利5,747,642A；1997年12月2日的，名称为“Acylated insulin compound analogs”的美国专利5,693,609A；1997年7月22日的，名称为“Monomeric insulinanalog formulations”的美国专利5,650,486A；1997年7月8日的，名称为“Selective acylation of epsilon-amino groups”的美国专利5,646,242A；1997年1月28日的，名称为“Preparation of stable insulinanalog crystals”的美国专利5,597,893A；1996年8月20日的，名称为“Insulin analog formulations”的美国专利5,547,929A；1996年4月2日的，名称为“Preparation of stable zinc insulin compound analogcrystals”的美国专利5,504,188A；1995年12月12日的，名称为“Insulinanalog formulations”的美国专利5,474,978A；1995年10月24日的，名称为“Monomeric insulin analog formulations”的美国专利5,461,031A；1983年12月20日的，名称为“Process for producing an insulin”的美国专利4,421,685A；2001年4月24日的，名称为“Insulin derivatives withincreased zinc binding”的美国专利6,221,837；1993年1月5日的，名称为“Pharmaceutical formulation for the treatment of diabetes mellitus”的美国专利5,177,058（描述了这样的药物制剂：其包括用碱在B31改 性的胰岛素化合物衍生物，并具有5.8至8.5的等电点，和/或在药学可接受的赋形剂中至少一种其生理上可耐受的盐，以及相当高含量的为大于1μg至约200μg的锌/IU的锌离子，包括胰岛素化合物-B31-Arg-OH和人胰岛素-B31-Arg-B32-Arg-OH）。每篇上述专利文献的全部公开内容被并入本文中作为参考，特别是用于教导关于各种胰岛素化合物类似物的制备、使用和组合物。 
用于制备所述阳离子－胰岛素化合物共轭物的胰岛素化合物可通过很多公认的肽合成技术，例如经典（溶液）法、固相法、半合成法和重组DNA法中的任何一种制备。例如，Chance等人，美国专利申请07/388,201，EPO383472，Brange等人，EPO214826和Belagaje等人，美国专利5,304,473公开了多种胰岛素原化合物和胰岛素化合物类似物的制备，并且被并入本文中作为参考。所述胰岛素化合物类似物的A和B链也可通过胰岛素原化合物状前体分子或单链胰岛素化合物前体分子，利用重组DNA技术而制备。参见Frank等人，“Peptides:Synthesis-Structure-Function”Proc.Seventh Am.Pept.Symp.，编者D.Rich和E.Gross(1981)；Bernd Gutte,Peptides:Synthesis,Structures,andApplications,Academic Press(1995年10月19日)；Chan,Weng和White,Peter（编者），Finoc Solid Phase Peptide Synthesis:APractical Approach,Oxford University Press（2000年3月），其全部公开的内容被并入本文中作为参考，用于教导关于肽的合成、重组体的生产和制备。 
2.改性部分 
所述阳离子－胰岛素化合物共轭物配合物包括改性部分，其结合于（例如共价地或离子地）所述胰岛素化合物以提供所述胰岛素化合物共轭物。改性部分为结合于所述胰岛素化合物的部分，其提供给所述的胰岛素化合物如本文中所述的希望的性质。例如，所述的改性部分可降低所述胰岛素化合物在各种环境（例如肠胃道和/或血流）中的降解速率，使得在这些环境中在改性形式中的胰岛素化合物的降解的量比不存在所述改性部分的形式中的胰岛素化合物应当降解的量更 少。优选的改性部分为允许所述胰岛素化合物共轭物保持母体胰岛素化合物的生物活性的治疗学意义的百分比。另外，优选的改性部分为两亲或亲水的，和/或使得所述胰岛素化合物共轭物两亲或亲水，或比科学上可接受的对照，例如相应的胰岛素化合物或相应的未共轭的胰岛素化合物亲脂性更少的那些部分。 
合适的用于所述阳离子－胰岛素化合物共轭物组合物的改性部分和胰岛素化合物共轭物的例子可在下述专利中找到，其全部内容被并入本文中作为参考：2001年10月16日的，名称为“Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containingbioactive agents”的美国专利6,303,569；2001年4月10日的，名称为“Coumarin and related aromatic-based polymeric prodrugs”的美国专利6,214,330；2000年9月5日的，名称为“Water-soluble non-antigenicpolymer linkable to biologically active material”的美国专利6,113,906；1999年11月16日的，名称为“Substantially pure histidine-linked proteinpolymer conjugates”的美国专利5,985,263；1999年5月4日的，名称为“Method of reducing side effects associated with administration ofoxygen-carrying proteins”的美国专利5,900,402；1997年10月28日的，名称为“Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions,deliveryand diagnostic formulations comprising same,and method of making andusing the same”的美国专利5,681,811；1997年6月10日的，名称为“Aryl imidate activated polyalkylene oxides”的美国专利5,637,749；1997年3月18日的，名称为“Active carbonates ofpolyalkylene oxides formodification of polypeptides”的美国专利5,612,460；1996年10月22日的，名称为“Azlactone activated polyalkylene oxides conjugated tobiologically active nucleophiles”的美国专利5,567,422；1995年4月11日的，名称为“Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides”的美国专利5,405,877；和1994年10月25日的，名称为“Conjugation-stabilized polypeptide compositions,therapeutic deliveryand diagnostic formulations comprising same,and method of making and using the same”的美国专利5,359,030。用于本发明制剂中的共轭的多肽的另外的例子可在如下美国专利申请中找到，其全部内容被并入本文中作为参考：1998年8月14日提交的美国专利申请09/134,803；2001年12月19日提交的美国专利申请10/018,879；2002年9月5日提交的美国专利申请10/235,381；2002年9月5日提交的美国专利申请10/235,284；和2001年6月4日提交的美国专利申请09/873,797。上述每篇专利和专利申请的全部公开内容被并入本文中作为参考，用于教导关于用于改性多肽的部分。 
所述的改性部分在它们的主链中可包括弱的或可降解的键。例如，所述的PAG可包括水解不稳定的键，例如易于水解的丙交酯、乙交酯、碳酸酯、酯、氨基甲酸酯等。这个手段使得所述聚合物可被切断成较低分子量的片段。这些聚合物的例子描述于例如Hubbell等人的美国专利6,153,211，其全部内容被并入本文中作为参考。还参见Ekwuribe等人的美国专利6,309,633，其全部内容被并入本文中作为参考。 
所述的改性部分可包括任何亲水部分、亲脂部分、两亲部分、成盐部分及其组合。典型的亲水、两亲和亲脂聚合物和改性部分将在下文中更详细地描述。 
2.1亲水性部分 
适合的亲水部分的例子包括PAG部分、其它亲水聚合物、糖部分、聚山梨醇酯部分，及其组合。 
2.2聚亚烷基二醇部分 
PAG为具有重复亚烷基二醇单元的化合物。在一些实施方案中，所述的单元全都是一样的（即PEG或PPG）。在另一些实施方案中，所述的亚烷基单元是不同的（例如聚乙二醇丙二醇共聚物，或 ）。所述的聚合物可以是无规共聚物（例如，其中氧化亚乙基和氧化亚丙基是共聚合的）或支化共聚物或接枝共聚物。 
PEG是优选的PAG，并用于生物应用，因为它具有高度希望的性质并通常被食品和药品监督管理局认为是安全的（GRAS）。PEG通常具有分子式H-(CH2CH2O)n-H，其中n可以为约2至约4000或更高，尽管封端部分可以不同，例如单-甲氧基或二羟基。PEG通常为无色的、无味的、水可溶或水可混溶的（取决于分子量）、热稳定的、化学惰性的、水解稳定的和通常是无毒的。PEG还是生物适合的，并典型地不会在身体内产生免疫反应。优选的PEG部分包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个PEG子单元。 
所述的PEG可以是单分散的、基本上单分散的、纯粹单分散的或基本上纯粹单分散的（例如，如由均于2001年6月4日提交的美国专利09/873,731和美国专利09/873,797的申请人以前所描述的，这些文献的公开内容被并入本文中作为参考）或多分散的。采用相对低分子量的单分散的聚合物的一个优点是：它们易于形成已定义的共轭物分子，这可便于重现合成和FDA批准。 
所述的PEG可以是在每端都具有羟基的直链（在结合于所述胰岛素化合物剩余部分之前）。所述的PEG还可以是烷氧基PEG，例如甲氧基-PEG（或mPEG），其中一个端基是相对惰性的烷氧基（例如直链或支链的OC1-6），而另一个端基为羟基（其结合于所述的胰岛素化合物）。 
所述的PEG也可以是支化的，其在一个实施方案中可表示为R(-PEG-nOH)m，其中R表示中心（典型为多羟基的）核心试剂，例如季戊四醇、糖、赖氨酸或甘油，n表示PEG子单元的数量，并且每个臂都可以不同并典型为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50，并且m表示臂的数量并且是2至在所述核心试剂上结合位点（sitesz）的最大数量。每个分支可以相同或不同并可用例如醚和/或酯进行封端。臂的数目m可以是3至100或更多，并且可以将一个或多个末端羟基结合于所述胰岛素化合物的剩余部分，或者另外进行化学改性。 
另一些支化的PEG包括由式(CH3O-PEG-)pR-Z表示的那些，其中p等于2或3，R表示中心核，例如赖氨酸或甘油，并且Z表示经历准备好的化学活化的例如羧基的基团。另一种支化的形式，悬挂的PEG，具有反应性基团，例如羧基，这些基团沿着所述PEG主链，而不是所述PEG链的末端或除所述PEG链的末端以外。叉状的PEG可由式PEG(-LCHX2)m表示，其中L为连接基团并且X为活化的端基。 
2.3糖部分 
本文中所述的改性部分可包括糖部分。通常所述的糖部分为至少一个蔗糖基团的碳水化合物产物。典型的糖部分包括但不限于，甘油部分，单、二、三和寡糖，以及多糖例如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶。特定的单糖包括C6和以上（优选C6至C8）的糖，例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖和景天庚酮糖；二和三糖包括具有两个或三个单糖单元（优选C5至C8）的部分，例如蔗糖、纤维二糖、麦芽糖、乳糖和棉子糖。利用糖部分的共轭描述于美国专利5,681,811、5,438,040和5,359,030中，其全部内容并入本文中作为参考。 
2.4聚山梨醇酯部分 
所述的改性部分可包括一个或多个聚山梨醇酯部分。例子包括山梨聚糖的酯，以及用聚氧乙烯衍生的聚山梨醇酯。利用聚山梨醇酯的共轭描述于美国专利5,681,811、5,438,040和5,359,030中，其全部内容并入本文中作为参考。 
2.5生物适合的水溶性聚阳离子部分 
在一些实施方案中，可使用生物适合的水溶性聚阳离子聚合物。生物适合的水溶性聚阳离子聚合物包括，例如任何具有作为侧基结合的质子化的杂环的改性部分。在本文中的“水溶性”指在温度为20至37℃下，整个改性部分可溶于水溶液中，例如缓冲盐水溶液或具有少量加入的作为共溶剂的有机溶剂的缓冲盐水溶液中。在一些实施发方案中，所述的改性部分自身并不充分可溶于水溶液自身，但通过与水溶性聚合物例如PEG链接枝而带入溶液中。例子包括在改性部分的主链或改性部分的侧链上具有胺基团的多胺，例如聚-L-Lys，以及天然或合成氨基酸或氨基酸的混合物的其它带正电荷的聚氨基酸，包括聚（D-Lys）、聚(鸟氨酸)、聚(Arg)和聚(组氨酸)，和非肽的多胺，例如聚(氨基苯乙烯)、聚(氨基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基丙烯酸酯)、聚(N,N-二甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N,N-二乙基氨基丙烯酸酯)、聚(氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基甲基丙烯酸酯),聚(N-乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N,N-二甲基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N,N-二乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯亚胺)、季铵的聚合物，例如聚(N,N,N-三甲基氨基丙烯酸酯氯化物)、聚(甲基丙烯酰胺丙基三甲基氯化铵)和天然或合成的多糖，例如壳聚糖。 
2.6其它亲水性部分 
所述的改性部分还可包括其它亲水聚合物。例子包括聚(氧乙烯化的多羟基化合物)，例如聚(氧乙烯化的甘油)、聚(氧乙烯化的山梨糖醇)和聚(氧乙烯化的葡萄糖)；聚(乙烯醇)（“PVA”）；葡聚糖；碳水化合物基聚合物等。所述的聚合物可以是基于上述聚合物单体的均聚物或者无规或嵌段共聚物以及三元聚合物，可以是直链的或支链的。 
合适的另外的聚合物的特定例子包括，但不限于，聚(噁唑啉)，双官能聚(丙烯酰吗啉)（“PAcM”）和聚(乙烯吡咯烷酮)（“PVP”）。PVP和聚(噁唑啉)是本领域公知的聚合物并且它们的制备对于技术人 员而言将是显而易见的。PAcM及其合成和使用描述于美国专利5,629,384和美国专利5,631,322中，其公开内容全部被并入本文中作为参考。 
2.7生物粘附聚阴离子部分 
某些亲水聚合物明显具有潜在应用的生物粘附性质。这些聚合物的例子可在例如Mathiowitz等人的美国专利6,197,346中找到。这些包含羧基的聚合物（例如，聚(丙烯酸)）显示出生物粘附性质，并且还易于与本文中所描述的胰岛素化合物共轭。在降解时暴露羧酸的可快速生物腐蚀的聚合物，例如聚(丙交酯乙交酯共聚物)、聚酸酐和聚原酸酯，也是生物粘附性聚合物。这些聚合物可用于将所述的胰岛素化合物递送到胃肠道。随着所述聚合物的降解，它们可暴露羧酸基团以使得它们能够牢固地粘附于胃肠道，并能帮助所述胰岛素化合物共轭物的递送。 
2.8亲脂性部分 
在一些实施方案中，所述的改性部分包括一个或多个亲脂性部分，所述的亲脂性部分可以是如本领域技术人员知道的多种亲脂性部分，包括但不限于，烷基部分、烯基部分、炔基部分、芳基部分、芳烷基部分、烷芳基部分、脂肪酸部分、金刚烷基（adamantantyl）和胆甾烯基，以及亲脂性聚合物和/或低聚物。 
所述的烷基可以是饱和的或不饱和的，直链的，支链的或环状烃链。在一些实施方案中，所述的烷基部分具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个碳原子。例子包括饱和的直链烷基部分。例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十八烷基、十九烷基和二十烷基； 饱和的支链烷基部分，例如异丙基、仲丁基、叔丁基、2-甲基丁基、叔戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2-乙基己基、2-丙基戊基；和衍生于上述饱和烷基部分的不饱和烷基部分，包括但不限于，乙烯基、烯丙基、1-丁烯基、2-丁烯基、乙炔基、1-丙炔基和2-丙炔基。在另一些实施方案中，所述的烷基部分为低级烷基部分。在另一些实施方案中，所述的改性部分明确不包含烷基部分，或明确不包含低级烷基部分，或明确不包含烷烃部分，或明确不包含低级烷烃部分。 
所述的烷基可以是未取代的或用一个或多个取代基取代的，并且这些取代基优选不干扰所述共轭物的合成方法或消除所述共轭物的生物活性。潜在地干扰性功能性可用保护基适当地阻断，使得所述的功能性不具有干扰性。每个取代基可任选取代以另外的非干扰性取代基。术语“非干扰性”的特征在于所述取代基不会消除根据本发明方法而进行的任何反应的可行性。 
所述的亲脂性部分可以是脂肪酸部分，例如天然的或合成的，饱和的或不饱和的，直链的或支链的脂肪酸部分。在一些实施方案中，所述的脂肪酸部分具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个碳原子。在一些实施方案中，所述的改性部分明确不包含脂肪酸部分；或明确不包含具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个碳原子的脂肪酸部分。 
当所述的改性部分包括芳环时，该环可用亲核官能团（例如OH或SH）官能化，其中所述的亲核官能团被定位以使得它可以以分子内方式与氨基甲酸酯部分反应并参加其水解。在一些实施方案中，所述的亲核基团用能够在体内被水解或其它方式降解的保护基团保护，结果当将该保护基团脱保护时，这促进了所述共轭物的水解并导致所述的母体胰岛素化合物的释放。 
合适的改性部分的其它的例子包括-C(CH2OH)3；-CH(CH2OH)2；-C(CH3)3；-CH(CH3)2。 
2.9两亲性部分 
在一些实施方案中，所述的改性部分包括两亲性部分。许多聚合物和低聚物都是两亲的。这些经常是包括亲水和亲脂性部分的嵌段共聚物、支化共聚物或接枝共聚物，其可以是低聚物和/或聚合物的形式，例如直链、支化或嵌段聚合物或共聚物。 
所述的两亲改性部分可包括本文中所述的任何亲脂和亲水性部分的组合。这些改性部分典型地包括至少一个经常在所述改性部分的末端的反应性基团，例如卤素、羟基、胺、硫醇、磺酸、羧酸、异氰酸酯、环氧化物、酯等。这些反应性官能团可用于连接亲脂性直链或支链的烷基、烯基、炔基、芳烷基或烷芳基，或亲脂性聚合物或低聚物，因此增加所述改性部分的亲脂性（并因此使得它们通常是两亲的）。 
所述的亲脂基团可例如，衍生于单或二羧酸，或如果适合，羧酸的反应等同物，例如酸酐或酰氯。对于所述的亲脂基团的适合的前体的例子为乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸、三甲基乙酸、己酸、辛酸、庚酸、癸酸、壬酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、山萮酸、二十四烷酸、ceratic acid、montanoic acid、异硬脂酸、异壬酸、2-乙基己酸、油酸、蓖麻油酸、亚油酸、亚麻酸、芥酸、大豆脂肪酸、亚麻仁脂肪酸、脱水蓖麻脂肪酸、松浆油脂肪酸、桐油脂肪酸、向日葵脂肪酸、红花脂肪酸、丙烯酸、甲基丙烯酸、马来酸酐、邻苯二甲酸酐、对苯二酸、间苯二酸、己二酸、壬二酸、癸二酸、四氢化邻苯二甲酸酐、六氢化邻苯二甲酸酐、琥珀酸和聚烯烃羧酸。 
所述的末端亲脂性基团不必是等同物，即所形成的共聚物可包括相同或不同的末端亲脂基团。所述的亲脂性基团可衍生自一种以上如上所定义的单或双官能的烷基、烯基、炔基、环烷基、芳烷基或烷芳 基。 
2.10PAG-烷基改性部分 
所述的改性部分可以是具有一个或多个线性或支化PAG部分和/或一个或多个直链或支链的、取代或未取代的烷基部分的线性或支化的聚合物部分。在一些情况下，这些部分被认为是两亲的；然而，所述的PAG和烷基部分可以不同以使得这些部分更亲脂或更亲水。在一些实施方案中，所述的改性部分明确不包含烷基部分，和在另一些实施方案中，所述的改性部分明确不包含烷烃部分。 
在一些实施方案中的PAG部分包括以线性或支化形式排列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个PAG子单元。在一些实施方案中的PAG部分包括PEG、PPG和/或PBG子单元。在一些实施方案中的烷基部分优选具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子。所述的烷基部分优选为烷烃部分。所述的改性部分可包括封端部分，例如-OCH3。另外，所述的改性部分可包括疏水基团，例如新戊酰基。 
在一个实施方案中，所述的改性部分具有下式： 
Figure BDA00002516425100261
其中o、p和q独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50，并且o、p和q中至少一个至少为2。X、Y和Z独立地选自-C-、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NH-、-NHC(O)-和-C(O)NH-，并且R为H或烷基，优选低级烷基，更优选甲基。对变量o、p和q优先选择以产生亲水或两亲改性部分，并关于胰岛素化合物进行优先选择以产生亲水或两亲的胰岛素化合物共轭物，优选单共轭物、二共轭物或三共轭物。在一个优选的实施方案 中，对于待用于基础胰岛素化合物维持的胰岛素化合物共轭物而言，选择o、p和q以产生所述胰岛素化合物近端为PAG和所述胰岛素化合物远端为烷基部分。或者，可以选择o、p和q以产生所述胰岛素化合物远端为PAG和所述胰岛素化合物近端为烷基部分。在另一个可选的实施方案中，R为新戊酰基或烷基-新戊酰基。 
在相关的实施方案中，所述的改性部分具有下式： 
Figure BDA00002516425100271
其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25，和n为2至100，优选2至50，更优选2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25，X为-C-、-O-、-C(O)-、-NH-、-NHC(O)-或-C(O)NH-，和Y为低级烷基或-H。X优选为O和Y优选为-CH3。在一些情况下，所述的羰基（-C(O)-）可以不存在，并且所述的-(CH2)-部分可以结合于在氨基酸上可利用的基团，例如羟基或游离羧酸基团。 
在优选的实施方案中，所述的改性部分具有选自如下结构式的结构： 和 
（当将就在上面的改性部分在B29结合于人胰岛素，所形成的单共轭物被称为IN105）。 
Figure BDA00002516425100273
（当将就在上面的改性部分在B29结合于人胰岛素，所形成的单共轭物被称为HIM2）。任何上述的部分可以，例如，在亲核性残基处， 例如A1、B1或B29处结合于人胰岛素。在一些情况下，所述的羰基可以不存在或用烷基部分，优选低级烷基部分替代，并且所述的-(CH2)-部分可以结合于在氨基酸上可利用的基团，例如羟基或游离羧酸基团。 
在另一个实施方案中，所述的改性部分具有下式： 
Figure BDA00002516425100281
其中每个C被独立地选择并且是具有m个碳原子的烷基部分，并且m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；并且每个PAG被独立地选择并且是具有n个子单元的PAG部分，并且n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25；每个X被独立地选择并且是将PAG结合于C的连接部分，并且优选为-C-、-O-、-C(O)-、-NH-、-NHC(O)-或-C(O)NH-。在一些实施方案中，所述的Cm-X部分不存在，并且所述的PAGn部分用-OH部分或-OCH3部分封端。例如，所述的PAG可以是甲氧基封端的或羟基封端的PAG，其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个PAG子单元，包括PEG、PPG和/或PBG子单元。在一些情况下，所述的羰基（-C(O)-）可以用烷基部分，优选低级烷基部分替代，其可以结合于在氨基酸上可利用的基团，例如羟基或游离羧酸基团。 
所述的改性部分可以，例如具有下式： 
Figure BDA00002516425100282
其中每个C被独立地选择并且是具有m个碳原子的烷基部分，并 且m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；并且每个PAG被独立地选择并且是具有n个子单元的PAG部分，并且n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25；X为-O-、或-NH-；每个o被独立地选择并且是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。例如所述的PAG可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个PAG子单元，包括PEG、PPG和/或PBG子单元。在一些情况下，在附着点的近端的羰基（-C(O)-）可以不存在或用烷基部分，优选低级烷基部分替代，并且所述的-(CH2)-部分可以结合于在氨基酸上可利用的基团，例如羟基或游离羧酸基团。 
所述的改性部分可以，例如具有下式： 
Figure BDA00002516425100291
其中每个C被独立地选择并且是具有m个碳原子的烷基部分，并且m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；并且每个PAG被独立地选择并且是具有n个子单元的PAG部分，并且n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25；每个X被独立地选择并且是将PAG结合于C的连接部分，并且优选为-C-、-O-、-C(O)-、-NH-、-NHC(O)-或-C(O)NH-。每个o被独立地选择并且是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些实施方案中，所述的Cm-X部分不存在，并且所述的PAGn部分用-OH部分或-OCH3部分封端。例如所述的PAG可以是甲氧基封端的或羟基封端的PAG，其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个PAG子单元，包括PEG、PPG和/或PBG子单元。在一些情况下，在附着点的近端的羰基（-C(O)-）可以不存在， 并且所述的-(CH2)-部分可以结合于在氨基酸上可利用的基团，例如羟基或游离羧酸基团。 
在另一个实施方案中，所述的改性部分那可以具有下式： 
-X-R1-Y-PAG-Z-R2（式VI） 
其中， 
X、Y和Z为独立选择的连接基团，并且各自任选存在，并且X，当存在时，通过共价键结合于所述的胰岛素化合物， 
R1或R2中至少一个是存在的，并且是低级烷基并任选包括羰基， 
R2为封端基团，例如-CH3、-H、甲苯磺酸酯或活性基团，和 
PAG为合并一个或多个亚烷基二醇部分的直链或支链的碳链（即氧基亚烷基部分），并任选合并一个或多个另外的选自-S-、-O-、-N-和-C(O)-的部分，和 
其中所述的改性部分具有最大数量的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个重原子。 
在本发明的实施方案中，任何一个或多个X、Y和Z可以是不存在的。另外，当存在时，X、Y和/或Z可独立地选自-C(O)-、-O-、-S-、和-N-。在一个实施方案中，Z为-C(O)-。在另一个实施方案中，Z是不存在的。 
在一些实施方案中，R1为低级烷基，和R2是不存在的。在另一些实施方案中，R2为低级烷基，和R1是不存在的。 
在另一个实施方案中，所述的改性部分可以包括直链或支链的，取代的碳链部分，其具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、19、20、21、22、23、24或25个选自-C、-C-、-O-、=O、-S-、-N-、-Si-原子的主链。所述的重原子典型地将包括一个或多个碳原子和一个或多个选自-O-、-S-、-N-和=O的非碳重原子。所述的 碳原子和非碳重原子典型地以每个非碳重原子至少1个碳原子，优选每个非碳重原子至少2个碳原子，更优选每个非碳重原子至少3个碳原子的比例存在。所述的碳原子和氧原子典型地以每个氧原子至少1个碳原子，优选每个氧原子至少2个碳原子，更优选每个氧原子至少3个碳原子的比例存在。所述的改性部分可包括一个或多个封端基团，例如支链或直链的C1-6，支链或直链的，或羰基。所述的改性部分将典型地包括氢，并且一个或多个氢可用氟（其是重原子但在上述式子中不认为它是重原子）替代。在一些情况下所述的改性部分目前不包含未取代的烷基部分。所述的改性部分可以例如通过连接基团，例如氨基甲酸酯、碳酸酯、醚、酯、酰胺或二级氨基或通过二硫键，结合于例如在所述多肽的氨基酸上的可利用的基团，例如氨基、羟基或游离羧酸基团。在所述连接基团中的分子被认为是所述改性部分的一部分。在优选的实施方案中，所述改性部分的分子量小于HIM2改性部分的分子量。 
本发明包括具有下式的改性部分： 
Figure BDA00002516425100311
其中n为1、2、3或4，和m为1、2、3、4或5。 
本发明包括具有下式的改性部分： 
Figure BDA00002516425100312
其中n为1、2、3、4或5，和m为1、2、3或4。 
本发明包括具有下式的改性部分： 
Figure BDA00002516425100321
其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，和n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。 
本发明还包括具有下式的改性部分： 
Figure BDA00002516425100322
其中PAG为具有m个子单元的PAG部分，并且m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20和n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。 
其它优选的改性部分包括： 
Figure BDA00002516425100323
Figure BDA00002516425100331
下述的改性部分可特别优选用于基础胰岛素化合物替代方案。 
Figure BDA00002516425100341
另一些改性部分包括如下部分： 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH 2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3, 
R-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-， 
R-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-， 
R-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-， 
R-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
R-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3， 
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R-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-O-CH2-CH2-O-CH3， 
R-CH2-O-CH2-CH3， 
R-CH2-O-CH3， 
其中R为-H、-OH、-CH2OH、-CH(OH)2、-C(O)OH、-CH2C(O)OH或活性部分，例如碳二亚胺、混合酐或N-羟基琥珀酰亚胺或封端基团。本发明还包括连接于蛋白质或肽，优选连接于胰岛素化合物的这些部分。明确的共轭策略将在下文中更详细地讨论。在这些改性部分中，优选的部分为使得所述的胰岛素化合物比相应的未共轭的胰岛素化合物具有更小的亲脂性和/或更多的亲水性的那些。本发明包括的这些改性部分进一步包括一个或多个羰基，优选1、2、3、4或5个羰基；所述的羰基可以被插入到所述的改性部分中，或者-O-或-CH2-可用羰基替代。另外，任何-CH2-或-CH3部分可例如用可以是相同或不同的低级烷基或-OH或具有1、2、3、4或5个PAG子单元的PAG链替代。选择优选的R以使得每个-O-被至少2个碳与最近的-O-分开。本发明还包括支化的改性部分，其中将该部分的两个或更多个连接于分枝部分，例如赖氨酸。 
本发明实施方案的共轭物的药学特性，例如亲水性/亲脂性，可通 过例如调节所述改性部分的亲脂和亲水的分数，例如通过增加或降低PAG单体的数量、烷基链的类型和长度、PAG－肽的键的性质和共轭点的数量而改变。所述改性部分－肽的键的确切性质可以改变以使得其对在生理pH下或在血浆中的水解是稳定的和/或敏感的。本发明还包括结合于多肽，优选结合于胰岛素化合物的任何上述改性部分。优选地，所述改性部分使得所述多肽比相应的未共轭的多肽的溶解度大例如至少1.05、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5或15倍。本发明的改性部分可以在任何可用的附着点处例如结合于胰岛素化合物，例如人胰岛素。优选的附着点为亲核性残基，例如A1、B 1和/或B29。 
此外，将理解的是本发明的一个方面包括新型改性部分，例如但不限于以羧酸形式的式VII和VIII的部分。另外，当所述的改性部分包括羧基时，它可转化为混合酐并与肽的氨基反应以形成包含酰胺键的共轭物。在另一个步骤中，所述的羧基可用水溶性碳二亚胺处理并与所述的肽反应以生成包含酰胺键的共轭物。因此，本发明包括本文中提出的新型部分的活化的形式，例如式VII和VIII的改性部分和本发明的其它新型低聚物的活化的形式，例如碳二亚胺、混合酐或N-羟基琥珀酰亚胺。 
在一些情况下，所述的改性部分可通过结合于所述多肽的C端或侧链的氨基酸或系列的2个或更多个氨基酸结合于所述的多肽。例如，在一个实施方案中，所述的改性部分在Thr的-OH或-C(O)OH处结合，并且mm-改性的Thr在羧基端基处结合于所述多肽。例如，在一个实施例中，所述的改性部分在Thr的-OH或-C(O)OH处结合，并且该改性的Thr结合于脱-Thr胰岛素化合物的B29氨基酸（例如人胰岛素的B29Lys）。在另一个实施例中，所述的mm在源于所述胰岛素化合物B-链的末端的八肽的Thr的-OH或-C(O)OH处结合，并且将所述的mm-改性的八肽结合于脱-八肽（des-octa）胰岛素化合物的B22氨基酸。根 据本说明书，其它的变体对于本领域技术人员而言是显而易见的。 
2.11成盐部分 
在一些实施方案中，所述的改性部分包含成盐部分。所述的成盐部分可以是如本领域技术人员将理解的多种适当的成盐部分，包括但不限于，羧酸盐和铵。在一些实施方案中，如果所述的稀释部分包括成盐部分，则以n盐的形式提供所述的胰岛素化合物共轭物。在这些实施方案中，所述的胰岛素化合物共轭物联系于如本领域技术人员将理解的合适的药学可接受的抗衡离子，包括但不限于，阴离子，例如氯、溴、碘、磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、硫酸盐、甲苯磺酸盐和甲磺酸盐，或者阳离子，例如钠、钾、钙、锂和铵。 
改性部分的上述例子意于是示例性的而不应以任何方式理解为限制性的。本领域技术人员将认识到用于共轭以获得特殊的官能性的合适的部分将可能落在本文中公开的和要求的共轭机制的范围内。因此，可根据本文中公开的原则选择和使用另外的部分。 
3.共轭策略 
一些因素，例如与改性部分共轭的程度、在所述分子上共轭位点的选择和改性部分的选择，可以不同以产生这样的共轭物，其例如在体内较不易于降解，并因此具有增加的血浆半衰期。例如，所述的胰岛素化合物可被改性以包括在合适的附着（即改性部分的共轭）点的，在胰岛素化合物结构上的1、2、3、4、5或更多个位点处的改性部分，所述的附着点适合于帮助改性部分结合其上。例如，这些合适的共轭位点可包括氨基酸残基，例如赖氨酸残基。 
在一些实施方案中，所述的胰岛素化合物共轭物是单共轭物。在另一些实施方案中，所述的胰岛素化合物共轭物是多共轭物，例如二共轭物、三共轭物、四共轭物、五共轭物等。在所述胰岛素化合物上的改性部分的数量仅由在该胰岛素化合物上的共轭位点的数量限制。 在又一些实施方案中，所述的胰岛素化合物共轭物是单共轭物、二共轭物、三共轭物、四共轭物和/或五共轭物的混合物。 
优选的共轭策略是产生涉及母体胰岛素化合物的一些或全部生物活性的共轭物的那些。 
优选的附着点包括A1N端、B1N端，和B29赖氨酸侧链。高度优选所述的B29单共轭物和B1、B29二共轭物。另一个优选的附着点为所述胰岛素化合物的C-肽组分或前导肽组分上的氨基官能团。 
可以将一个或多个改性部分（即单独的或多个改性部分的结构）结合于所述的胰岛素化合物。在多个改性部分中的改性部分优选是相同的。然而，应当理解在多个改性部分中的改性部分可以互不相同，或者在多个改性部分中的一些改性部分可以相同，而一些可以不同。当将多个改性部分结合于所述的胰岛素化合物时，优选将一个或多个所述的改性部分用可水解的键结合于所述胰岛素化合物，并将一个或多个所述的改性部分用不可水解的键结合于所述胰岛素化合物。或者，将多个改性部分结合于所述胰岛素化合物的所有的键都可以是可水解的，但具有不同程度的水解能力，以使得例如一个或多个所述的改性部分在体内可以相对快速地通过水解从所述的胰岛素化合物上除去，而一个或多个所述的改性部分在体内可以通过水解更慢地从所述的胰岛素化合物上除去。 
3.1改性部分对胰岛素化合物的结合 
优选将所述的改性部分共价结合于所述的胰岛素化合物。在所述改性部分上的多于一个的部分可以共价结合于所述的胰岛素化合物。结合可采用可水解的或不可水解的键或二者的混合（即在不同的共轭位点用不同的键）。 
在一些实施方案中，利用可水解的键（例如，酯、碳酸酯或可水 解的氨基甲酸酯键）将所述的胰岛素化合物结合于所述改性部分。可水解结合的应用将提供作为前体药物的胰岛素化合物共轭物。前体药物手段可能是需要的，如果所述的胰岛素化合物－改性部分的共轭物是没有活性的（即该共轭物缺少通过所述胰岛素化合物的一级作用机制而影响身体的能力），例如当所述的改性部分共轭位点在胰岛素化合物的键接区域时。可水解结合的应用还能提供缓释（time-release）或控释效果，在给定时间周期内给药所述的胰岛素化合物，随着一个或多个改性部分从各自的胰岛素化合物－改性部分共轭物上断裂可以提供活性药物。 
在另一些实施方案中，利用不可水解的键（例如不可水解的氨基甲酸酯、酰胺或醚键）将所述的胰岛素化合物结合于所述的改性部分。当希望使治疗有意义的量的胰岛素化合物共轭物在血流中循环有延长的时间周期，例如给药后至少2小时时，可优选采用不可水解的键。以不可水解方式的、用于将所述胰岛素化合物共价结合于所述改性部分的键典型地选自一个或多个共价键、酯部分、碳酸酯、氨基甲酸酯部分、酰胺部分和二级胺部分。 
所述的改性部分可在很多亲核性残基，包括但不限于，亲核性羟基官能团和/或氨基官能团处结合所述胰岛素化合物。亲核性羟基官能团可在例如丝氨酸和/或酪氨酸残基处找到，并且亲核氨基官能团可在例如组氨酸和/或Lys残基处，和/或在一个或多个所述胰岛素化合物A或B链的N端找到。当将改性部分结合于利尿钠肽的N端时，结合优选形成二级胺。 
所述的改性部分可在游离-SH基团处，例如通过形成硫酯、硫醚或磺酸酯键而结合于所述的胰岛素化合物。 
所述的改性部分可通过一个或多个氨基结合于所述的胰岛素化合物。在人胰岛素中的例子包括在A1、B1和B29处的氨基。在一个实 施方案中，将单独一个改性部分结合于在所述胰岛素化合物上的单独一个氨基。在另一个实施方案中，将两个改性部分各自结合于在所述胰岛素化合物上不同的氨基。如果有两个改性部分被结合于两个氨基，优选的排列是在B1和B29处结合。如果有多个聚合物，这些聚合物可以全部相同或者这些聚合物中的一个或多个可以彼此不同。将聚合物结合于胰岛素化合物的多种方法和类型描述于2001年6月4日提交的，名称为“Mixtures of insulin compound conjugates comprisingpolyalkylene glycol,uses thereof,and methods of making same”的美国专利申请09/873,899中，其全部公开内容并入本文中作为参考。 
在又一些实施方案中，可使用部分前体药物手段，其中将所述改性部分的一部分水解。例如参见Ekwuribe等人的美国专利6,309,633（其全部公开内容并入本文中作为参考），其描述了具有亲水和亲脂组分的改性部分，其中所述的亲脂组分在体内水解以形成微PEG化的共轭物。 
3.2改性部分的选择和所述胰岛素化合物共轭物及其配合物的性质 
所述的改性部分可被选择以提供所述胰岛素化合物共轭物及其配合物的希望的性质。对优选的改性部分进行选择以使得所述胰岛素化合物在水溶液中的溶解度比不存在所述改性部分的胰岛素化合物的水溶解度大，优选比母体胰岛素化合物（即相应的未共轭的胰岛素化合物）在水溶液中的溶解度大至少1.05、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5或15倍。例如，未配位的天然人胰岛素的溶解度在pH为约7.4时为～18mg/ml。本发明的发明人已经惊奇地发现比人胰岛素溶解度大至少1.05、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5或15倍的人胰岛素共轭物的配位方法。 
在一些实施方案中，所述的改性部分被选择以使得胰岛素化合物共轭物在pH为约4至约8，优选pH为约5至约7.5，理想的pH为约7.4下的水溶解度大于1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、20g/L、50g/L、100g/L或甚至150g/L。 
本发明的胰岛素化合物共轭物在哺乳动物中的口服生物利用度比科学上可接受的对照，例如相应的未共轭的胰岛素化合物的口服生物利用度更大。在另一些实施方案中，本发明的胰岛素化合物共轭物在人中的口服生物利用度比科学上可接受的对照，例如相应的未共轭的胰岛素化合物的口服生物利用度更大。在一些实施方案中，所述胰岛素化合物共轭物的吸收，例如由所述共轭物的血浆水平测定，是未共轭胰岛素化合物对照的吸收的至少1.5、2、2.5、3、3.5或4倍。 
将理解的是，尽管在本发明的一些方面中，所述的改性部分被选择以使得所述的胰岛素化合物共轭物比相应的未共轭的胰岛素化合物溶解度更大，但在另一些方面，所述的改性部分还可以或被另选以使得所述胰岛素化合物共轭物的疏水性等于或大于相应的未共轭的胰岛素化合物。另外，所述的改性部分可被选择以使得所述胰岛素化合物共轭物的两亲性比相应的未共轭的胰岛素化合物更大。 
在一些实施方案中，所述阳离子－胰岛素化合物共轭物配合物的水溶解度等于或大于（a）相应的未配位的胰岛素化合物共轭物，（b）相应的未配位的和未共轭的胰岛素化合物，和/或（c）相应的配位的但未共轭的胰岛素化合物的水溶解度。 
在优选的实施方案中，所述胰岛素化合物共轭物的水溶解度通过加入Zn++而降低。在一些实施方案中，所述的改性部分被选择以使得所述胰岛素化合物共轭物的溶解度等于或大于相应未共轭的胰岛素化合物，并且所述胰岛素化合物共轭物的水溶解度通过加入锌而降低。 在另一些实施方案中，所述改性部分被选择以使得所述胰岛素化合物共轭物的溶解度等于或大于相应未共轭的胰岛素化合物，并且所述胰岛素化合物共轭物的水溶解度通过加入锌而降低，并且所述阳离子配合物的水溶解度大于胰岛素化合物的水溶解度。在另一方面。所述胰岛素化合物共轭物是脂肪酸酰化的胰岛素化合物，所述阳离子是锌。并且所述胰岛素化合物共轭物的水溶解度通过加入锌而降低。在另一个实施方案中，所述胰岛素化合物共轭物是脂肪酸酰化的胰岛素化合物，其水溶解度等于或大于相应未共轭的胰岛素化合物的溶解度，所述的阳离子是锌，并且所述胰岛素化合物共轭物的水溶解度通过加入锌而降低。 
在一些优选的实施方案中，所述胰岛素化合物共轭物的亲脂性相对于相应的母体胰岛素化合物而言为1或小于1。与相应的母体胰岛素化合物相比的所述的胰岛素化合物共轭物的相对亲脂性（krel）可例如通过下式确定：krel＝（t共轭-t0）/（t人-t0），其中相对亲脂性通过在40℃下等度洗脱在LiChroSorb RP18(5μm，250×4mm)高效液相色谱柱上进行测量。下述混合物用作洗脱液：含10%乙腈的pH为7.3的0.1M磷酸钠缓冲液，和50%的乙腈水溶液。死时间（void time）（t0）通过注入0.1mM硝酸钠确定。将人胰岛素的保留时间通过改变（c）（i）和（c）（ii）混合物之间的比例而调节到至少为2t0。优选地，在这些实施方案中，所述的相对亲脂性约为等于1或小于1或基本上小于1。在优选的实施方案中，所述的胰岛素化合物为人胰岛素，并且相对亲脂性为小于1。优选所述的相对亲脂性为小于约0.99、0.98、0.97、0.96、0.95、0.94、0.93、0.92、0.91或0.90。对于测定胰岛素和胰岛素共轭物的溶解性和/或亲脂性的技术的讨论阐述于1998年5月12日发给Harelund等人的，名称为“Acylated insulin”的美国专利5,750,499，其全部公开内容被并入本文中作为参考。 
在一个实施方案中，所述的相对亲脂性为如上所述的并且所述的改性部分为具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17 或18个碳的碳链，其中所述的碳链包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个插入其中的氧基。在另一个实施方案中，所述的相对亲脂性为如上所述的并且所述的改性部分为具有5、6、7、8、9或10个碳的碳链，其中所述的碳链包含2、3或4个插入其中的氧基。在相关的实施方案中，所述的相对亲脂性为如上所述的并且所述的改性部分包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个聚亚烷基二醇单元。在另一个相关的实施方案中，所述的相对亲脂性为如上所述的并且所述的改性部分包含1、2或3个聚乙二醇单元和1、2或3个聚丙二醇单元。 
4.金属阳离子组分和配合物的特征 
所述阳离子－胰岛素化合物共轭物配合物包括金属阳离子。用作阳离子组分的适当的金属阳离子包括能够与所述胰岛素化合物共轭物配位、聚集或结晶的任何金属阳离子。优选将该金属阳离子配位于所述胰岛素化合物共轭物。可使用单个或多个阳离子。所述的阳离子优选不显著氧化所述胰岛素化合物共轭物，即不氧化到提供配合物的程度，除非这是它们想要的目的。 
在一些实施方案中，所述的金属阳离子是生物适合的。如果阳离子没有显示出对受体身体显著过度的有害作用，例如在注射点处显著的免疫反应，那么该金属阳离子就是生物适合的。然而，将理解的是，在一些情况下，所述阳离子－胰岛素化合物共轭物组合物的益处可超过毒性和其它有害作用的危险，并且因此在这种情况下是可接受的。 
所需的用于稳定生物活性剂的金属阳离子的可用性和金属阳离子对生物活性剂的比例可由本领域技术人员在粒度降低和/或胶囊化之前和之后通过对金属阳离子稳定化的生物活性剂实施多项稳定性测试，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦、反相色谱法和HPLC分析而进行测定。 
金属阳离子适当地组分包括一种或多种单价、二价或三价金属阳 离子或其组合。在优选的实施方案中，所述的金属阳离子为第II族或过渡金属阳离子。适当的二价阳离子的例子包括Zn++、Mn++、Ca++、Fe++、Ni++、Cu++、Co++和/或Mg++。如果单价阳离子被包括，其优选为Na+、Li+或K+。所述的阳离子优选作为盐，例如氯化物或乙酸盐加入，最优选以ZnCl2和ZnAc加入。 
胰岛素化合物共轭物对阳离子的摩尔比典型地为约1:1至约1:100，优选约1:2至约1:12，和更优选约1:2至约1:7或约1:2、1:3、1:4、1:5、1:6或1:7。在具体的实施方案中，Zn++被用作阳离子组分，所提供的锌阳离子组分对胰岛素化合物共轭物的摩尔比为约1:1和约1:100，优选约1:2至约1:12，和更优选约1:2至约1:7或约1:2、1:3、1:4、1:5、1:6或1:7。 
所述阳离子组分优选大于约90%的单一阳离子，例如Zn++。优选地，所述阳离子大于约95%、99%或99.9%的Zn++。 
优选地，所述配位的胰岛素化合物共轭物对胰凝乳蛋白酶的降解的耐受性大于相应的未配位的胰岛素化合物共轭物对胰凝乳蛋白酶的降解的耐受性。优选地，所述配位的胰岛素化合物共轭物对胰凝乳蛋白酶的降解的耐受性大于相应的配位的但未共轭的胰岛素化合物对胰凝乳蛋白酶的降解的耐受性。 
所述配位的胰岛素化合物共轭物在哺乳动物中的口服生物利用度比科学上可接受的对照，例如相应的未配位的胰岛素化合物共轭物的口服生物利用度大。在另一些实施方案中，所述的配位的胰岛素化合物共轭物在人中的口服生物利用度比科学上可接受的对照，例如相应的未配位的胰岛素化合物共轭物的口服生物利用度大。在一些实施方案中，所述胰岛素化合物共轭物的吸收，例如由该共轭物的血浆水平测定，是未配位的胰岛素化合物的吸收的至少1.5、2、2.5、3、3.5或4倍。 
所述配位的胰岛素化合物共轭物在哺乳动物中的口服生物利用度比科学上可接受的对照，例如相应的配位的但未共轭的胰岛素化合物的口服生物利用度大。在另一些实施方案中，所述的配位的胰岛素化合物共轭物在人中的口服生物利用度比科学上可接受的对照，例如相应的配位的但未共轭的胰岛素化合物的口服生物利用度大。在一些实施方案中，所述配位的胰岛素化合物共轭物的吸收，例如由该共轭物的血浆水平测定的，是未共轭的胰岛素化合物的吸收的至少1.5、2、2.5、3、3.5或4倍。 
5.配位剂 
在一些实施方案中，所述的阳离子－胰岛素化合物共轭物组合物包括一种或多种配位剂。适合用于本发明使用的配位剂的例子包括鱼精蛋白、surfen、珠蛋白、精胺、亚精胺清蛋白、氨基酸、羧酸、聚阳离子聚合物、阳离子多肽、阴离子多肽、核苷酸和反义。参见Brange,J.,Galenics of Insulin compound,Springer-Verlag,Berlin Heidelberg(1987)，其全部内容被并入本文中作为参考。用于稳定所述组合物的配位剂的可用性可由本领域技术人员根据已有的公开文献测定。在一些实施方案中，所述的阳离子－胰岛素化合物共轭物组合物明确不包括或基本上没有配位剂。 
优选的配位剂为鱼精蛋白。在固体剂型中，所述的鱼精蛋白优选以胰岛素化合物对鱼精蛋白为约3:1至约1:3的摩尔比，更优选约2:1至约1:2的摩尔比，理想的约1:1的摩尔比存在。在一些实施方案中，所述的阳离子－胰岛素混合共轭物组合物明确不包含或基本上没有鱼精蛋白。 
氨基酸也可用作配位剂，例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸,异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和组氨酸，以及寡肽，例如二甘氨酸。 
羧酸也适合用作配位剂；例子包括乙酸和羟基羧酸，例如柠檬酸、3-羟基丁酸和乳酸。 
6稳定剂 
在一些实施方案中，所述阳离子－胰岛素化合物共轭物组合物包括一种或多种稳定剂。优选的稳定剂包括酚类化合物和芳香族化合物。优选的酚类化合物为苯酚、间甲酚和间羟基苯甲酸酯（m-paraben）或其混合物。所提供的稳定剂的量可以是使所述的阳离子－胰岛素化合物共轭物组合物的稳定性相对于科学上可接受的对照，例如相应的没有稳定剂的阳离子－胰岛素化合物共轭物组合物的稳定性有所改进的量。 
7.配合物的表现形式 
所提供的配合物可以是干燥固体，例如基本上纯的阳离子－胰岛素化合物共轭物的粉末，或包含与其它药学可接受的组分一起的阳离子－胰岛素化合物共轭物固体的粉末。所述的配合物还可以以在水性或有机介质中的溶解状态，和/或在这些介质中的不溶解的固体而被提供。 
7.1固体组合物 
所提供的阳离子－胰岛素化合物共轭物配合物可以是固体。所述的固体可以例如为干燥状态或为在水溶液、有机溶剂、乳液、微乳中的不溶解状态，或者为oher非干燥形式。 
在一个实施方案中，阳离子胰岛素化合物共轭物配合物以纯的处理的固体组合物形式提供。在纯的处理的固体组合物中，胰岛素化合物共轭物对阳离子的摩尔比典型地为约3:4至约3:0.5（胰岛素化合物共轭物:阳离子），约3:3.5至约3:1，或理想地为约3:1。 
在处理的纯的固体T型组合物中（具有阳离子、胰岛素化合物共轭物，而没有鱼精蛋白），胰岛素化合物共轭物对阳离子的摩尔比典型地为约3:4至约3:0.5（胰岛素化合物共轭物:阳离子），约3:3.5至约3:1，或理想为约3:1。在处理的纯的固体T型鱼精蛋白组合物中（具有阳离子、胰岛素化合物共轭物和鱼精蛋白），胰岛素化合物共轭物对阳离子的摩尔比典型地为约3:6至约3:0.5（胰岛素化合物共轭物:阳离子），约3:5至约3:1，或理想为约3:2。 
在处理的纯的固体R型（慢(lente)）组合物中（具有阳离子、胰岛素化合物和稳定化合物（例如酚类化合物），而没有鱼精蛋白），胰岛素化合物共轭物对阳离子的摩尔比典型地为约3:4.5至约3:0.9，优选约3:3.9至约3:2.4。在处理的纯的固体R型（超慢(ultralente)）组合物中（具有阳离子、胰岛素化合物和稳定化合物（例如酚类化合物），而没有鱼精蛋白），胰岛素化合物共轭物对阳离子的摩尔比典型地为约3:12至大于约3:4.5，优选约3:9至约3:4.8，更优选约3:6至约3:5.4。在处理的纯的固体R型鱼精蛋白组合物中（具有阳离子、胰岛素化合物和稳定化合物（例如酚类化合物）和鱼精蛋白），胰岛素化合物共轭物对阳离子的摩尔比典型地为约3:12至约3:3，优选约3:9至约3:4.5，更优选约3:6.9至约3:5.4。 
对于单价阳离子，例如Na+，所述的固体预计具有的胰岛素化合物共轭物对阳离子的比为约3:6至约3:3。 
本发明的固体组合物，可以例如包括含有本发明的胰岛素化合物共轭物和/或阳离子－胰岛素化合物共轭物配合物的组合物，例如粉末。优选的固体组合物以药学可接受的纯度水平提供，即其中没有污染物，所述污染物不可接受地降低所述组合物用于人的适用性。 
在一些实施方案中，在所提供的组合物中，阳离子－胰岛素化合物共轭物组分为超过约90%的结晶体，优选超过约95%的结晶体，更 优选超过约99%的结晶体。在另一些实施方案中，在所提供的组合物中，阳离子－胰岛素化合物共轭物组分为超过约90%的无定形固体，优选大于约95%的无定形固体，更优选大于约99%的无定形固体。 
在又一些实施方案中，在所提供的组合物中，阳离子－胰岛素化合物共轭物组分以无定形固体和结晶的固体的混合形式存在。例如，无定形固体对结晶固体的比可以为约1:10至约10:1，或约1:9至约9:1，或约1:8至约8:1，或约1:7至约7:1，或约1:6至约6:1，或约1:5至约5:1，或约1:4至约4:1，或约1:3至约3:1，或约1:2至约2:1，或约1:1。 
另外，可利用具有不同胰岛素化合物的阳离子－胰岛素化合物的固体，例如包含天然胰岛素化合物的固体与包含胰岛素化合物共轭物的固体的混合物，或者包括一种胰岛素化合物共轭物的固体与包含不同胰岛素化合物共轭物的固体的混合物而提供组合物。 
另外，所述的固体类型和胰岛素化合物/胰岛素化合物共轭物组分都可以不同。例如，利用天然胰岛素化合物和无定形胰岛素化合物共轭物可以提供包含Zn－胰岛素化合物晶体的组合物，或者可利用天然胰岛素化合物和结晶的Zn－胰岛素化合物共轭物提供包含无定形Zn－胰岛素化合物固体的组合物。这些混合物可用于获得物理性质，例如溶解曲线和/或药物动力学曲线的不同。 
所述固体的平均粒度优选为约0.1至约100微米，更优选1至50微米，又更优选1至25微米，理想的是1至15微米。小的粒度可通过微结晶条件、喷雾干燥、研磨、真空干燥、冷冻干燥等获得。 
在一个实施方案中，所述的组合物，当干燥时，包含大于约96重量%的胰岛素化合物和约0.05、0.1、0.15或0.2至约4重量%的锌。在另一个实施方案中，所述的组合物，当干燥时，包含大于约91重量%的胰岛素化合物共轭物，约0.05、0.1、0.15或0.2至约4重量%的锌， 以及约0.2至约5重量%的苯酚。在又一个实施方案中，所述的组合物，当干燥时，包含大于约82重量%的胰岛素化合物共轭物，约0.05、0.1、0.15或0.2至约4重量%的锌，以及约0.2至约14重量%的鱼精蛋白。在又一个实施方案中，所述的组合物，当干燥时，包含大于约71重量%的胰岛素化合物共轭物，约0.05、0.1、0.15或0.2至约4重量%的锌，约0.2至约14重量%的鱼精蛋白，和约0.2至约15重量%的苯酚。 
在另一个实施方案中，所述的组合物，当干燥时，包含约0.1至约2重量%的Zn++，以及约0.08至约1重量%的苯酚，优选约0.5至约1.3重量%的Zn++，以及约0.1至约0.7重量%的苯酚，更优选大于或等于1至约3.5重量%的Zn++，以及约0.1至约3重量%的苯酚，又更优选大于或等于1.3至约2.2重量%的Zn++，以及约0.4至约2重量%的苯酚。 
所述的配合物可以慢型（lente-type）制剂的形式提供。例如，在优选的干燥的慢型制剂中，所提供的Zn的量为约0.1至约2重量%，并且存在的苯酚的量为约0.08至约1重量%，其余的重量%为胰岛素化合物共轭物。理想地，对于干燥的慢型制剂，所提供的Zn的量为约0.5至约1.3重量%，并且存在的苯酚的量为约0.1至约0.7重量%，其余的重量%为胰岛素化合物共轭物。 
所述的配合物可以超慢型（ultralente-type）制剂的形式提供。例如，在优选的干燥的超慢型制剂中，所提供的Zn的量为大于或等于1至约3.5重量%，并且存在的苯酚的量为约0.1至约3重量%，其余的重量%为胰岛素化合物共轭物。理想地，对于干燥的超慢型制剂，所提供的Zn的量为大于或等于1.3至约2.2重量%，并且存在的苯酚的量为约0.4至约2重量%，其余的重量%为胰岛素化合物共轭物。 
7.2液体组合物 
所述阳离子－胰岛素化合物配合物可以液体中不溶解组分的组分 的形式提供。例如所述的液体可以是包含阳离子－胰岛素化合物共轭物作为沉淀的水溶液，或者所述的阳离子－胰岛素化合物共轭物可以悬浮液、乳液或微乳的组分的形式提供。所述的液体还可包含伴随着所述不溶解组分的溶解的组分或配合物。 
7.3混合物和共晶 
本发明的组合物可以例如包括配合物混合物、固体混合物、杂化配合物和共晶。 
因此，例如，本发明提供的组合物包括两种或更多种胰岛素化合物共轭物和/或未共轭的胰岛素化合物。另外，如果所述的组合物包括固体，该固体可具有不同形式。因此，例如一种固体可以是结晶的，而另一种固体可以是无定形固体。如其它地方所指出的，所述固体可以干燥的形式提供，或者可以液体混合物的固体组分的形式提供。在优选的实施方案中，本发明的混合物包括两种或多种不同的胰岛素化合物共轭物，并且不同的胰岛素化合物共轭物具有不同的溶解度。在一个实施方案中，所述配合物之一包含亲脂性胰岛素化合物共轭物，并且其它的包含亲水性胰岛素化合物共轭物。在又一个实施方案中，所述的配合物可包括不同的胰岛素化合物共轭物，其中一种或多种配合物的循环半衰期为约1至约4小时，并且一种或多种配合物的循环半衰期显著大于第一种配合物的循环半衰期。在相关的实施方案中，所述配合物之一具有速效特性，而所述配合物的另一种具有中效到长效特性。另外，所述配合物之一具有适合于基础胰岛素化合物控制的特性，而另一些具有适合于餐后葡萄糖控制的特性。优选的混合物为HIM2和胰岛素的混合物、HIM2和IN105的混合物、IN105和胰岛素化合物的混合物、IN105和脂肪酸酰化的胰岛素的混合物、HIM2和脂肪酸酰化的胰岛素的混合物。适当的脂肪酸酰化的胰岛素描述于如下美国专利中，其全部内容被并入本文中作为参考：2003年3月11日公告的，名称为“Insoluble compositions for controlling blood glucose”的美国专利6,531,448；2003年1月28日公告的，名称为“Selective acylation of epsilon-amino groups”的美国专利RE37,971；2002年10月15日公告的，名称为“Insoluble insulin compositions”的美国专利6,465,426；2002年9月3日公告的，名称为“Fatty acid-acylated insulin analogs”的美国专利6,444,641；2002年1月1日公告的，名称为“Method foradministering acylated insulin”的美国专利6,335,316；2001年7月31日公告的，名称为“Insoluble insulin compositions”的美国专利6,268,335；2000年4月18日公告的，名称为“Method for administeringacylated insulin”的美国专利6,051,551；1999年7月13日公告的，名称为“Acylated Insulin Analogs”的美国专利5,922,675；1997年12月23日公告的，名称为“Preparation of an acylated protein powder”的美国专利5,700,904；1997年12月2日公告的，名称为“Acylated insulinanalogs Granted”的美国专利5,693,609；1997年7月8日公告的，名称为“Selective acylation of epsilon-amino groups”的美国专利5,646,242；1997年5月20日公告的，名称为“Reducing gelation of a fattyacid-acylated protein”的美国专利5,631,347；2002年9月17日公告的，名称为“Method of acylating peptides and novel acylating agents”的美国专利6,451,974；2000年1月4日公告的，名称为“Acylated insulin”的美国专利6,011,007；1998年5月12日授权的，名称为“Acylatedinsulin”的美国专利5,750,497；1999年5月18日公告的，名称为“Selective acylation method”的美国专利5,905,140；2003年9月16日公告的，名称为“Insulin derivatives”的美国专利6,620,780；2001年1月26日公告的，名称为“Insulin derivatives”的美国专利6,251,856；2001年4月3日公告的，名称为“Stable concentrated insulin preparationsfor pulmonary delivery”的美国专利6,211,144；2001年10月30日公告的，名称为“Pulmonary insulin crystals”的美国专利6,310,038；和2001年1月16日公告的，名称为“Stabilized insulin compositions”的美国专利6,174,856。特别优选的具有12、13、14、15或16个碳的脂肪酸的单脂肪酸酰化的胰岛素共价结合于人胰岛素的Lys（B29）。 
在一个实施方案中，本发明提供具有不同胰岛素化合物和/或胰岛 素化合物共轭物的共晶。该共晶优选显示出一个或多个如下特征：基本上均匀的溶出度，单独的体内溶出度曲线，和/或单峰的药物动力学特性。优选的共晶为HIM2和胰岛素的共晶，HIM2和IN105的共晶，IN105和胰岛素化合物的共晶。 
在一个实施方案中，所述的共晶包括人胰岛素，并且与人胰岛素的共结晶降低了相对于相应胰岛素化合物共轭物晶体的溶解度的所述晶体的溶解度。在另一个实施方案中，所述的共晶包括人胰岛素，并且与人胰岛素的共结晶减少了相对于相应胰岛素化合物共轭物晶体的溶解度的所述晶体的溶解度。 
在另一个实施方案中，所述的共晶包括速效的、快速清除的和/或高效的胰岛素化合物共轭物，和长效的、缓慢清除的和/或低效的胰岛素化合物共轭物。优选所述的共晶具有适合于餐后葡萄糖控制或适合于过夜基础胰岛素化合物控制的PK/PD特性。 
在另一个实施方案中，本发明提供混合物或共晶，其中胰岛素化合物共轭物包含有人胰岛素或赖脯胰岛素。本发明的混合物可包括不同的胰岛素化合物共轭物。所述的混合物可包括胰岛素化合物共轭物和未共轭的胰岛素化合物。所述的混合物可包括具有不同胰岛素化合物的不同的胰岛素化合物共轭物。 
另外，本发明提供具有两种不同的胰岛素化合物共轭物和/或胰岛素化合物共轭物和未共轭的胰岛素化合物的配合物。本发明提供两种、三种或更多种不同胰岛素化合物共轭物的杂化共晶。本发明提供具有包含未共轭的胰岛素化合物的胰岛素化合物共轭物的配合物。本发明提供的共晶具有两种或更多种不同亲水性的胰岛素化合物共轭物；两种或更多种不同疏水性的胰岛素化合物共轭物；两种或更多种不同两亲性的胰岛素化合物共轭物；亲水性胰岛素化合物共轭物和亲脂性胰岛素化合物共轭物；亲水性胰岛素化合物共轭物和未共轭的胰岛素化 合物；HIM2和未共轭的胰岛素化合物一起；IN105和未共轭的胰岛素化合物一起；HIM2和IN105一起；HIM2与胰岛素化合物和IN105一起；以及上述成分的其它组合。如其它地方所提及的，所述配合物可以干燥固体的形式、溶液中溶解的配合物形式和/或溶液中未溶解的配合物的形式提供。各种组合可以例如用于提供具有扩展特性的配合物或共晶。 
8.本发明配合物的溶解度 
所述阳离子－胰岛素化合物共轭物配合物在pH为约7.4时的水溶解度优选为所述未配位的胰岛素化合物共轭物的水溶解度的约1/15、1/14、1/13、1/12、1/11、1/10、1/9、1/8、1/7、1/6、1/5直至约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或<10倍。上述上限和下限的任何组合落入本发明的范围内。然而，优选的范围为约1/15至<5，更优选为约1/10至约2，理想的为约1/10至<0。在本发明特别令人惊奇的方面，所述阳离子－胰岛素化合物共轭物在pH为约7.4的溶液中的水溶解度经常为基本上小于所述胰岛素化合物共轭物在pH为约7.4的溶液中的水溶解度。然而，将理解的是在一些实施方案中，所述阳离子－胰岛素化合物共轭物在pH为约7.4的溶液中的水溶解度可以等于、大于或基本上大于所述胰岛素化合物共轭物在pH为约7.4的溶液中的水溶解度。 
在一个令人惊奇的实施方案中，所述阳离子－胰岛素化合物共轭物配合物在pH为约7.4时的水溶解度为基本上小于相应的未配位的胰岛素化合物共轭物在pH为约7.4的溶液中的溶解度，并且所述阳离子－胰岛素化合物共轭物配合物在pH范围从起点约5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.1或6.9至终点约7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8或8.9的水溶液中溶解度保持大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120或130g/L。在另一个实施方案中，所述阳离子－胰岛素化合物共轭物配合物在pH为约7.4下的水溶解度为基本上小于 相应的胰岛素化合物共轭物在pH为约7.4的溶液中的溶解度，并且所述阳离子－胰岛素化合物共轭物配合物在pH范围为约5.5至约8.5，优选pH范围为约6.5至约8，更优选pH范围为约6.9至约7.8的水溶液中溶解度保持大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120或130g/L。【问题：所述的g/L溶解度是利用所述配合物的重量还是所述胰岛素化合物共轭物的重量测定的？】 
优选选择本发明的胰岛素化合物共轭物以在pH等于pI±约2.5的水溶液中生成晶体，其中胰岛素化合物共轭物的浓度为约0.5mg/ml至约50mg/ml，优选约5mg/ml至约30mg/ml，更优选约15mg/ml至约30mg/ml，并且晶体的形成开始于阳离子对胰岛素化合物共轭物的比例为3、4或5重量%，其中所述的阳离子优选为Z++。对于不含鱼精蛋白的单共轭物，晶体优选出现在pH为约4、4.1、4.2、4.3或4.4至约5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7或5.8，优选在pH为约4至<6.5，优选约4至<5.8，优选约4.2至约5.5，更优选约4.4至约5.2的水溶液中。对于不含鱼精蛋白的二共轭物，晶体优选出现在pH为约3.5至<5.8，优选约3.8至约5.5，更优选约4.0至约5.2的水溶液中。对于不含鱼精蛋白的三共轭物，晶体优选出现在pH为约3至<5.5，优选约3.3至约5，更优选约3.8至约4.8的水溶液中。 
8.1R型配合物 
所述胰岛素化合物共轭物的R型Zn配合物在pH为约7.4时的水溶解度优选为约10至约150g/L，更优选约20至约130g/L，更优选约30至约110g/L，更优选约35至约60g/L。 
具有鱼精蛋白的胰岛素化合物共轭物的R型Zn配合物在pH为约7.4时的水溶解度优选为约10至约110g/L，更优选约20至约85g/L，更优选约30至约70g/L。 
8.2T型配合物 
所述胰岛素化合物共轭物的T型Zn配合物在pH为约7.4时的水溶解度优选为约30至约175g/L，更优选约50至约160g/L，更优选约70至约150g/L。 
具有鱼精蛋白的胰岛素化合物共轭物的T型Zn配合物在pH为约7.4时的水溶解度优选为约10至约150g/L，更优选约20至约130g/L，更优选约30至约110g/L，更优选约35至约60g/L。 
8.3NPH型配合物 
所述胰岛素化合物共轭物的NPH型配合物在pH为约7.4时的水溶解度优选为约1至约150g/L，更优选约5至约120g/L，又更优选约10至约90g/L。 
9.药学性质 
所述胰岛素化合物共轭物与阳离子组成的配合物通常产生相对于科学上可接受的对照，例如相应的未配位的胰岛素化合物共轭物而言改进的胰岛素化合物共轭物的药学性质。 
在一些情况下，所述配位的胰岛素化合物共轭物将显示出相对于科学上可接受的对照，例如相应的未配位的胰岛素化合物共轭物而言扩展的或另外改变的pK曲线。在一些情况下，所述的pK曲线将显示出赖脯状曲线。利用标准体内实验，例如在小鼠、大鼠、狗或人中可获得pK曲线。本文中所描述的用于获得阳离子－胰岛素化合物共轭物配合物的分析是本发明的一个方面。 
所述的配合物可显示出改进的化学稳定性。通过将所述配合物暴露于多种分析条件，例如血浆的存在，蛋白酶的存在，肝匀浆的存在，酸性条件的存在，以及碱性条件的存在可获得多种稳定性的特性。当在任何一个或多个这些分析条件下的所述配位的胰岛素化合物共轭物 的稳定性大于在相同条件下的未配位的胰岛素化合物共轭物的稳定性时，相对于未配位的胰岛素化合物共轭物的稳定性就是改进的。用于测量在酸性环境中稳定性的优选的分析涉及将所述的配位的胰岛素化合物共轭物在pH为2的溶液中暴露至少2小时，其中该配位的胰岛素化合物共轭物相对于科学上可接受的对照，例如相应的未配位的胰岛素化合物共轭物而言，其降低的降解作用表明改进的稳定性。体内分析也可用于测试稳定性。例如，所述配位的胰岛素化合物共轭物的稳定性可通过暴露于对象的肠胃道和与适当的对照比较而进行测试。 
10.制备方法 
本发明还提供本文中所描述的阳离子－胰岛素化合物共轭物组合物的制备方法。该方法通常包括将本文中所述的一种或多种胰岛素化合物共轭物与本文中所述的一种或多种阳离子接触以形成固体。 
对于二价阳离子，例如Zn++，胰岛素化合物共轭物对阳离子的摩尔比，其用于制备在溶液中具有浓度为约2mg/ml至约50mg/ml的胰岛素化合物的组合物，通常可以为约1:15（胰岛素化合物共轭物:阳离子）至约1:0.4，优选约1:9至约1:2。 
为了制备如上所述的水溶液中的T型固体（具有阳离子和胰岛素化合物共轭物，而没有鱼精蛋白），胰岛素化合物共轭物对阳离子的摩尔比优选为约1:1.5至1:3，理想的为约1:2。为了制备如上所述的水溶液中的R型固体（具有阳离子和胰岛素化合物和稳定化合物（例如酚类化合物），而没有鱼精蛋白），胰岛素化合物共轭物对阳离子的摩尔比优选为约1:4至1:9，优选为约1:7至约1:9，理想的为约1:8。 
为了制备如上所述的水溶液中的T型鱼精蛋白固体（具有阳离子和胰岛素化合物共轭物和鱼精蛋白），胰岛素化合物共轭物对阳离子的摩尔比优选为约1:1.5至1:9，理想的为约1:2。为了制备如上所述的水溶液中的R型鱼精蛋白固体（具有阳离子、胰岛素化合物和稳定化 合物（例如酚类化合物），以及鱼精蛋白），胰岛素化合物共轭物对阳离子的摩尔比优选为约1:2至1:15，优选为约1:7至约1:9，理想的为约1:8。 
优选将所述的胰岛素化合物共轭物以如下量加入缓冲液中，所述量为经计算达到浓度为大于2至约100g/L，优选约3、4、5、6、7、8、9或10至约40g/L，更优选约10至约30g/L。 
如果所述的阳离子是二价的（例如，Zn++，Ca++），其优选以如下的量加入，所述量为经计算达到浓度为约0.04至约10g/L，优选约0.1至约5g/L，更优选约0.2至约4g/L。对于T型晶体或T型鱼精蛋白晶体，所述的阳离子的浓度优选为约0.04至约1g/L，更优选约0.1至约0.3g/L。对于R型晶体或R型鱼精蛋白晶体，所述的阳离子的浓度优选为约1至约5g/L，更优选约1.5至约4g/L。 
如果所述的阳离子是单价的，其优选以如下的量加入，所述量为经计算达到浓度为约0.08至约40g/L，优选约0.4至约20g/L，更优选约0.8至约16g/L。 
所述的方法可以进一步包括将稳定剂与阳离子和胰岛素化合物共轭物组合。优选的稳定剂如上所述。当使用时，所加的稳定剂的量为足以提供比使用相同试剂和反应条件而没有稳定剂所获得的固体形成更大程度的固体形成。如果所述的稳定剂为酚类化合物（例如苯酚、间甲酚、m-paraben），其加入的量可以是约10至约50重量%，更优选约20至约40重量%，又更优选约25至约35重量%。在更优选的实施方案中，所述的稳定剂为酚类化合物（例如苯酚、间甲酚、m-paraben），其加入的量可以是约0.01至约10重量%，更优选约0.01至约5重量%，又更优选约0.01至约1重量%。因此，在一个实施方案中，所述的方法包括将胰岛素化合物共轭物、阳离子和稳定剂在水溶液中组合以生成阳离子－胰岛素化合物共轭物组合物，其中所述的组合可产生可溶 性配合物和/或结晶的或非结晶的固体。 
所述的方法可进一步包括使用与所述阳离子和胰岛素化合物共轭物组合的配位剂，例如鱼精蛋白，并任选还包括稳定剂。 
为了在pH为约5至约8的水溶液中制备固体，提供的鱼精蛋白的量相对于胰岛素化合物共轭物优选为约4至约45重量%（鱼精蛋白/胰岛素化合物），优选约8至约25重量%，更优选约9至约20重量%，理想的是约10至约12重量%。对于T型固体，优选的pH为约5至约6，更优选约5至5.5，又更优选约5.1至约5.3，理想的为约5.2。对于R型固体，优选的pH为约6至约7，更优选约6.2至6.8，又更优选约6.4至约6.6，理想的为约6.5。 
本发明的发明人已经惊奇地发现T型配合物可在稳定剂例如苯酚不存在的情况下转化为鱼精蛋白T型配合物。所述的T型配合物通过在不存在苯酚的水溶液中将锌与所述胰岛素化合物分子配合而制备。然后将鱼精蛋白加入以将所述T型配合物转化为鱼精蛋白T型配合物。量和pH范围如上所述。 
因此，在一个实施方案中，所述的方法包括在水溶液中将胰岛素化合物共轭物、阳离子和配位剂组合以产生阳离子－胰岛素化合物共轭物组合物，其中该组合物可生成可溶性配合物和/或结晶的或无定形的固体。在另一个实施方案中，所述的方法包括在水溶液中将胰岛素化合物共轭物、阳离子、配位剂和稳定剂组合以生成阳离子－胰岛素化合物共轭物组合物，其中该组合物可生成可溶性配合物和/或结晶的或无定形的固体。 
在一些实施方案中，所述的组合物可包括防腐剂。适当的防腐剂的例子包括苄醇、对羟基苯甲酸酯、甘油。稳定剂，例如苯酚、间甲酚和m-paraben，也可用作防腐剂。甘油和苯酚适当地一起加入以增强 抗菌作用。 
用于制备所述固体的其它组分包括等渗剂，例如NaCl、甘油和单糖。 
所述的阳离子胰岛素化合物共轭物固体可典型地相对快速地形成。例如固体形成典型地在3天内，经常在24小时内完成。在一些例子中，为了改进晶体形成，希望将反应减慢。 
在本发明的一个实施方案中，所述固体在室温（25℃）下形成，而不需要温度下降诱导固体沉淀。例如，室温对于R型和T型晶体是有效的。用于形成固体的温度优选约0至约40℃，优选约17至约30℃，更优选约22至约27℃，理想的为约25℃。 
在一个实施方案中，所述的方法包括在水溶液中将胰岛素化合物共轭物和金属阳离子组合以提供结晶的或无定形的固体。将要向其中加入阳离子的包含所述胰岛素化合物共轭物的水溶液优选为缓冲溶液，该缓冲溶液的pH为所述胰岛素化合物共轭物的pI±约1.5，优选pI±约1，更优选pI±约0.75。这些范围同样也应用于T型、R型和鱼精蛋白配合物。然而，对于中性鱼精蛋白配合物（NPH型），优选的pH为约7至约8.5，更优选约7.5至约8。一旦加入所述金属阳离子，所述的pH可轻微变化，并且所述的pH可被调整至如上所述的目标pH范围。用酚类化合物，pH范围可有小的变化，并且可用酸或碱将其调至优选的范围。 
胰岛素化合物共轭物的pI值典型地要求pH小于约7，优选小于约6，更优选小于约5.5。具有中性改性部分的人胰岛素单共轭物典型地具有约4.75±.25的pI范围。对于人胰岛素二共轭物，所述的pI范围典型地为4.25±.25。对于人胰岛素三共轭物，所述的pI范围典型地为3.5±.25。 
合适的缓冲体系的例子包括乙酸铵缓冲液，磷酸钠缓冲液，三羟甲氨基甲烷缓冲液，磷酸钠和乙酸铵的混合物，乙酸钠缓冲液，乙酸钠和乙酸铵的混合物，和柠檬酸缓冲液，并且任何上述缓冲体系[A]还包含乙醇和/或乙腈[B]（例如A:B的百分比为约1:1至约10:1）。本发明令人惊奇的方面是阳离子胰岛素化合物共轭物固体可在包含有机溶剂如乙醇或乙腈的水性混合物中形成。 
本发明一个独特的特色是除了提供有用的阳离子－胰岛素化合物共轭物配合物外，本发明还提供在制备过程中将阳离子－胰岛素化合物共轭物从未共轭的胰岛素化合物中分离出来的方法。在这个过程中，例如，所述的阳离子－胰岛素化合物共轭物可从溶液中沉淀出来，而溶解的未共轭的胰岛素化合物可通过过滤除去。这一特色减少了在胰岛素化合物共轭物制备中的2个步骤：浓缩步骤和冻干步骤。 
处理的纯的固体组合物可用标准技术形成，所述的标准技术为例如离心和/或过滤，随后洗涤（例如，用乙醇/水），和冻干或真空干燥。多步洗涤可用于调节苯酚和/或阳离子含量。 
11.制剂 
可将所述配合物根据已知技术配制成用于在药物载体中给药的制剂。参见例如，Alfonso R.Gennaro,Remington:The Science and Practiceof Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins Publishers(2003年6月)，和Howard C.Ansel,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems,Lippincott Williams&Wilkins Publishers,第7版(1999年10月)，其全部内容被并入本文中用作参考，用于教导关于药物剂型的选择、制备和应用。 
所述的配合物，其典型地以无定形或结晶固体的形式，可与药学可接受的载体组合。所述的载体在与药物组合物中任何其它组分的相 容性方面的意义上必需是可接受的，并且相对于由所述一种或多种活性成分的益处而言不应对对象产生过度有害性。所述的载体可以是固体或液体，或者二者。优选配制为单位剂量制剂，例如片剂。所述单位剂型可包括，例如约0.01或0.5重量%至约95重量%或重量99%的阳离子胰岛素混合配合物。所述的药物组合物可通过任何公知的药学技术制备，所述的药学技术包括但不限于，任选包括一种或多种附加成分的组分的掺混。 
合适的药物组合物的例子包括用于口服、直肠、吸入（例如通过气溶胶）、含服（例如舌下）、阴道、非肠道（例如皮下、肌内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、脑内、动脉内或静脉内）、局部、粘膜表面（包括气道表面）、鼻表面和经皮给药。在任何给定的情况下最合适的途径将取决于被治疗的状况的性质和严重性，以及取决于所使用的具体阳离子－胰岛素化合物配合物的性质。优选的口服组合物为用于由对象摄食而制备的组合物。理想地，所述的口服组合物被制备成通过胃可保留或基本上保留和在肠中完全或基本上完全溶出而用于递送所述的活性成分的制剂。合适的经皮系统的例子包括超声导入、离子导入和贴片递送体系。 
在一个方面，本发明提供包含一种或多种饱和或不饱和C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10脂肪酸和/或这些脂肪酸的盐的脂肪酸组合物。优选的脂肪酸为辛酸、癸酸、肉豆蔻酸和月桂酸。优选的脂肪酸盐为辛酸、癸酸、肉豆蔻酸和月桂酸的钠盐。 
优选的脂肪酸组合物包括单独脂肪酸或单独脂肪酸盐，而不包括实质量的其它脂肪酸或脂肪酸盐。在本发明的一个方面，所述组合物的脂肪酸含量为大于约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8或99.9重量%的单独脂肪酸。在另一个实施方案中，所述组合物的脂肪酸含量范围为下限约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、 2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0重量%，和上限为约3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9或12.0重量%。在另一个实施方案中，所述组合物的脂肪酸含量范围为下限约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0重量%，和上限为约3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9或12.0重量%，并且所述组合物的脂肪酸含量为大于约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8或99.9重量%的单独脂肪酸。 
这些制剂的活性组分可包括共轭的或未共轭的，配位的或未配位的蛋白质和/或肽。优选的蛋白质和/或肽为本文中所描述的那些。优选的共轭物为本文中所描述的那些。优选的配合物为本文中所描述的那些。优选的口服组合物为用于由对象摄食而制备的组合物。理想地，所述的口服组合物被制备成通过胃可保留或基本上保留和在肠中完全或基本上完全溶出而用于递送所述的活性成分的制剂。在一些情况下，所述的制剂包括肠衣，和在一些情况下，所述的制剂将明确没有肠衣。所述的组合物优选提供为片剂、散剂、硬胶胶囊或软胶胶囊，尽管本 文中描述的其它形式也是适合的。 
本发明的脂肪酸组分可包括脂肪酸酰化的胰岛素。合适的脂肪酸酰化的胰岛素的例子描述于如下美国专利中，其全部内容被并入本文中作为参考：2003年3月11日公告的，名称为“Insoluble compositionsfor controlling blood glucose”的美国专利6,531,448；2003年1月28日公告的，名称为“Selective acylation of epsilon-amino groups”的美国专利RE37,971；2002年10月15日公告的，名称为“Insoluble insulincompositions”的美国专利6,465,426；2002年9月3日公告的，名称为“Fatty acid-acylated insulin analogs”的美国专利6,444,641；2002年1月1日公告的，名称为“Method for administering acylated insulin”的美国专利6,335,316；2001年7月31日公告的，名称为“Insoluble insulincompositions”的美国专利6,268,335；2000年4月18日公告的，名称为“Method for administering acylated insulin”的美国专利6,051,551；1999年7月13日公告的，名称为“Acylated Insulin Analogs”的美国专利5,922,675；1997年12月23日公告的，名称为“Preparation of anacylated protein powder”的美国专利5,700,904；1997年12月2日公告的，名称为“Acylated insulin analogs Granted”的美国专利5,693,609；1997年7月8日公告的，名称为“Selective acylation of epsilon-aminogroups”的美国专利5,646,242；1997年5月20日公告的，名称为“Reducing gelation of a fatty acid-acylated protein”的美国专利5,631,347；2002年9月17日公告的，名称为“Method ofacylating peptidesand novel acylating agents”的美国专利6,451,974；2000年1月4日公告的，名称为“Acylated insulin”的美国专利6,011,007；1998年5月12日授权的，名称为“Acylated insulin”的美国专利5,750,497；1999年5月18日公告的，名称为“Selective acylation method”的美国专利5,905,140；2003年9月16日公告的，名称为“Insulin derivatives”的美国专利6,620,780；2001年1月26日公告的，名称为“Insulinderivatives”的美国专利6,251,856；2001年4月3日公告的，名称为“Stable concentrated insulin preparations for pulmonary delivery”的美国 专利6,211,144；2001年10月30日公告的，名称为“Pulmonary insulincrystals”的美国专利6,310,038；和2001年1月16日公告的，名称为“Stabilized insulin compositions”的美国专利6,174,856。特别优选的具有12、13、14、15或16个碳的脂肪酸的单脂肪酸酰化的胰岛素，其共价结合于人胰岛素的Lys（B29）。 
适用于口服给药的药物组合物可以分立的单位形式存在，例如胶囊剂、扁胶剂、锭剂或片剂，每个包含预计量的胰岛素化合物共轭物的混合物；例如散剂或颗粒剂；例如以水性或非水液体的溶液剂或悬浮剂；或例如水包油和油包水乳剂。这些制剂可通过任何药学合适的方法制备，所述的药学合适的方法包括使胰岛素化合物共轭物的混合物和合适的载体（其可包含一种或多种如上所述的附加组分）关联的步骤。制剂可包括固体悬浮液、配位的阳离子－胰岛素化合物共轭物、未配位的活性组分（例如天然胰岛素化合物，胰岛素化合物共轭物），以及上述物质的混合物。 
通常，本发明的药物组合物的制备通过均匀和密切地将所述配合物与液体或固体载体，或二者一起掺混，以及然后如果必要将所形成的混合物成形而进行。例如，片剂的制备可通过将包含胰岛素化合物共轭物的粉末或颗粒，任选与一种或多种附加组分压制或模塑而进行。压制的片剂可通过在合适的机器中将任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或一种或多种表面活性剂/分散剂混合的以自由流动形式存在的，例如粉末或颗粒的混合物进行压制而制备。模塑的片剂可通过在合适的机器中将利用惰性液体粘合剂润湿的粉末化的组合物进行模塑而制备。 
适合于含服（舌下）给药的药物组合物包括含有在香味基质，通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶中的胰岛素化合物共轭物的混合物的锭剂（lozenges），和含有在惰性基质，通常为明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶中的胰岛素化合物共轭物的混合物的锭剂（pastilles）。合适 的制剂的例子可在美国专利公开20030229022（“Pharmaceuticalformulation”）；20030236192（“Method of modifying the release profileof sustained release compositions”）；20030096011（“Method of producingsubmicron particles of a labile agent and use thereof”）；20020037309（“Process for the preparation of polymer-based sustained releasecompositions”）；20030118660（“Residual solvent extraction method andmicroparticles produced thereby”）；以及美国专利6,180,141（“Compositegel microparticles as active principle carriers”）；6,737,045（“Methodsand compositions for the pulmonary delivery insulin compound”）；6,730,334（“Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles”）；6,685,967（“Methods and compositions for pulmonary delivery of insulincompound”）；6,630,169（“Particulate delivery systems and methods ofuse”）；6,589,560（“Stable glassy state powder formulations”）；6,592,904（“Dispersible macromolecule compositions and methods for theirpreparation and use“）；6,582,728（“Spray drying of macromolecules toproduce inhaleable dry powders”）；6,565,885（“Methods of spray dryingpharmaceutical compositions”）；6,546,929（“Dry powder dispersingapparatus and methods for their use”）；6,543,448（“Apparatus and methodsfor dispersing dry powder medicaments”）；6,518,239（“Dry powdercompositions having improved dispersivity”）；6,514,496（“Dispersibleantibody compositions and methods for their preparation and use”）；6,509,006（“Devices compositions and methods for the pulmonary deliveryof aerosolized medicaments”）；6,433,040（“Stabilized bioactivepreparations and methods of use”）；6,423,344（“Dispersiblemacromolecule compositions and methods for their preparation and use”）；6,372,258（“Methods of spray-drying a drug and a hydrophobic aminoacid”）；6,309,671（“Stable glassy state powder formulations”）；6,309,623（“Stabilized preparations for use in metered dose inhalers”）；6,294,204（“Method  of producing  morphologically  uniform  microcapsules  andmicrocapsules produced by this method”）；6,267,155（“Powder filling systems,apparatus and methods”）；6,258,341（“Stable glassy state powderformulations”）；6,182,712（“Power filling apparatus and methods for theiruse”）；6,165,463（“Dispersible antibody compositions and methods fortheir preparation and use”）；6,138,668（“Method and device for deliveringaerosolized medicaments”）；6,103,270（“Methods and system forprocessing dispersible fine powders”）；6,089,228（“Apparatus and methodsfor dispersing dry powder medicaments”）；6,080,721（“Pulmonary deliveryof active fragments of parathyroid hormone”）；6,051,256（“Dispersiblemacromolecule compositions and methods for their preparation and use”）；6,019,968（“Dispersible antibody compositions and methods for theirpreparation and use”）；5,997,848（“Methods and compositions forpulmonary delivery of insulin compound”）；5,993,783（“Method andapparatus for pulmonary  administration  of  dry powder.alpha.1-antitrypsin”）；5,922,354（“Methods and system for processing dispersiblefine powders”）；5,826,633（“Powder filling systems,apparatus andmethods”）；5,814,607（“Pulmonary delivery of active fragments ofparathyroid hormone”）；5,785,049（“Method and apparatus for dispersionof dry powder medicaments”）；5,780,014（“Method and apparatus forpulmonary administration of dry powder alpha 1-antitrypsin”）；5,775,320（“Method and device for delivering aerosolized medicaments”）；5,740,794（“Apparatus and methods for dispersing dry powdermedicaments”）；5,654,007（“Methods and system for processingdispersible fine powders”）；5,607,915（“Pulmonary delivery of activefragments of parathyroid hormone”）；5,458,135（“Method and device fordelivering aerosolized medicaments”）；6,602,952（“Hydrogels derivedfrom chitosan and poly(ethylene glycol)or related polymers”）和5,932,462（“Multiarmed,monofunctional,polymer for coupling to molecules andsurfaces”）中找到。另外，合适的缓释制剂描述于1999年10月19日公布的，Cardinal Health的，名称为“A sustained release pharmaceuticalpreparation”的美国专利5,968,554中，其全部内容被并入本文中作为 参考。合适的微粒制剂描述于2003年10月30日公开的，Spherics,Inc.的，名称为“Methods and products useful in the formation and isolation ofmicroparticles”的国际专利公开WO/2003-049,701中。合适的生物粘附制剂描述于2004年5月6日公开的，Spherics,Inc.的，名称为“Bioadhesive drug delivery system with enhanced gastric retention”的国际专利公开WO/2003-051,304中。 
适用于非肠道给药的根据本发明实施方案的药物组合物包含所述配合物的无菌水性和非水性注射溶液，该制剂优选是与目标受体的血液等渗的。这些制剂可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得所述组合物与目标受体的血液等渗的溶质。水性和非水性无菌悬浮液可包括悬浮剂和增稠剂。这些组合物可存在于单位\剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并可以储存于冷冻干燥的（冻干的）条件下，其只需要在刚好使用前加入无菌液体载体，例如盐水或注射用水。临时注射溶液和悬浮液可从前面所述的种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。例如，可以提供在密封容器中的具有单位剂型的配合物的混合物的，可注射的、稳定的、无菌的组合物。配合物的混合物可以冻干产物的形式提供，该冻干产物能与合适的药学可接受的载体重新组成以形成适用于注射入对象中的液体组合物。非肠道单位剂型典型地包含约1微克至约10微克的配合物的混合物。当所述的配合物是基本上水不可溶时，可采用生理上可接受足量的乳化剂以足够量将所述配合物乳化于含水载体中。一个有用的乳化剂为磷脂酰胆碱。 
用于口服给药的固体剂型典型地包括约2mg至约500mg，优选约10mg至约250mg，理想的约20mg至约110mg的所述配合物。 
适合于直肠给药的药物组合物优选以单位剂量栓剂的形式存在。这些制剂可通过将所述配合物与一种或多种常规固体载体，例如可可油掺混，和然后将所形成的混合物成形而制备。 
适用于向皮肤局部应用的药物组合物优选采用软膏剂、霜剂、洗剂、糊剂、凝胶剂、喷剂、气雾剂或油的形式。可用的载体包括凡士林油、羊毛脂、PEG、醇类、透皮促渗剂以及其两种或更多种的组合。 
适用于经皮给药的药物组合物可以分立的贴片的形式存在，所述的贴片适合于保持与受体的表皮紧密地接触延长的时间。适用于经皮给药的组合物还可通过离子导入递送（参见例如PharmaceuticalResearch 3(6):318(1986)）并典型地采用胰岛素化合物共轭物的任选缓冲水溶液的形式。合适的制剂包含柠檬酸盐或bis/tris缓冲液（pH 6）或乙醇/水，并包含0.1至0.2M的活性组分。 
在优选的实施方案中，所述的配合物作为固体脂肪酸制剂的成分给药，如描述于由Opawale等人于2003年8月13提交的美国专利申请60/494,821中所述的那样，其全部内容被并入本文中作为参考。 
在一些实施方案中，所述的胰岛素化合物共轭物可分别从所述阳离子和/或其它需要以形成所述固体的成分提供。例如所述的胰岛素化合物共轭物可以干燥固体，和包括所述阳离子、稳定剂、防腐剂的缓冲溶液，和/或其它可分别提供的成分的形式提供，以使得使用者可将分离的组分组合以制成所述阳离子－胰岛素化合物共轭物配合物。 
12.治疗方法 
所述阳离子－胰岛素化合物共轭物组合物及其制剂可用于病症的治疗，其中循环胰岛素化合物增加的量（相对于没有从外源给药胰岛素化合物的情况下由对象提供的量）产生希望的治疗或生理效果。例如，所治疗的病症可以是I型或II型糖尿病，前驱糖尿病和/或代谢综合症。在一个实施方案中，将所述组合物给药以减轻糖尿病的症状。在另一个实施方案中，向前驱糖尿病对象给药所述组合物以预防或延缓糖尿病的发作。 
根据本发明的方法给药的阳离子－胰岛素化合物共轭物组合物的有效的量将根据混合物和对象的不同而稍有变化，并将取决于例如对象的年龄和状况，递送的途径和待治疗的状况等因素。这些剂量可根据本领域技术人员已知的常规药理学手段确定。 
作为一般性建议，约0.025至约10mg/kg的活性成分（即所述共轭物）的口服剂量将具有治疗效果，其中所有的重量基于胰岛素化合物共轭物的混合物的重量计算。更优选的范围为约0.06至约1mg/kg，和甚至更优选的范围为约0.125至约0.5mg/kg。 
非肠道给药剂量典型地为约0.5μg/kg至约0.5mg/kg，其中所有的重量基于胰岛素化合物共轭物的混合物的重量计算。更优选的范围为约1μg/kg至约100μg/kg。 
给药的频率一般为每天一次、两次或三次。或者随所需以控制状况。或者，所述的阳离子－胰岛素化合物共轭物组合物可通过持续灌注而给药。治疗的持续时间取决于待治疗的胰岛素化合物缺乏并可能是持续对象的寿命那样长。所述的配合物可以例如在饭前0至30分钟内给药。所述的配合物可以例如在临睡前0至2小时内给药。 
具体实施方式
合成实施例 
下述实施例用于举例说明和解释本发明。 
1.被保护的MPEG6C3低聚物(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸叔丁酯)的合成 
Figure BDA00002516425100761
将甲基六乙二醇（1.0g，3.37mmol）和丙烯酸叔丁酯（0.216g，1.69mmol）溶解于无水THF（10mL）中。向该溶液中加入金属钠（0.4mg，0.016mmol）。室温下搅拌4h后，将该反应混合物通过加入1MHCl（15mL）淬灭。然后将淬灭的反应混合物用CH2Cl2萃取（1×50mL，1×25mL）。将有机层干燥（MgSO4）并浓缩。经硅胶色谱法（乙酸乙酯作为洗脱液）纯化后，获得的产物为油状物（0.832g，58%）。 
2.MPEG6C3低聚物酸(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸)的合成 
Figure BDA00002516425100762
将所述叔丁酯（0.165g，0.0389mmol）在三氟乙酸（2.0mL）中通过在室温下搅拌而脱保护。然后将内含物浓缩至恒重（0.125g，87%）。 
3.活化的MPEG6C3低聚物(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯)的合成 
Figure BDA00002516425100771
将所述酸（0.660g，1.79mmol）和N-羟基琥珀酰亚胺（0.2278g，1.97mmol）溶解于无水CH2Cl2（15mL）中。加入乙基二甲氨丙基碳二亚胺盐酸盐（EDC，0.343g，1.79mmol）。室温下搅拌过夜后，将该反应混合物用CH2Cl2稀释并用水洗涤（2×45mL）。将有机层干燥（MgSO4）并浓缩至恒重。产物为油状物（0.441g，53%）。 
4.保护的MPEG4C3低聚物(3-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸叔丁酯)的合成 
Figure BDA00002516425100772
将甲基四乙二醇（1.0g，4.80mmol）和丙烯酸叔丁酯（0.308g，2.40mmol）溶解于无水THF（10mL）中。向该溶液中加入金属钠（0.6mg，0.024mmol）。室温下搅拌4h后，将该反应混合物通过加入1MHCl（15mL）淬灭。然后将淬灭的反应混合物用CH2Cl2萃取（1×50mL，1×25mL）。将有机层干燥（MgSO4）并浓缩。经硅胶色谱法（乙酸乙酯作为洗脱液）纯化后，获得的产物为油状物（1.28g，79%）。 
5.MPEG6C3低聚物酸(3-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸)的合成 
Figure BDA00002516425100781
将所述叔丁基酯（1g，3.42mmol）在三氟乙酸（6.0mL）中通过在室温下搅拌而脱保护。然后将内含物浓缩至恒重（0.87g，91%）。 
6.活化的MPEG4C3低聚物(3-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯)的合成 
Figure BDA00002516425100782
将所述酸（0.6g，2.14mmol）和N-羟基琥珀酰亚胺（0.271g，2.35mmol）溶解于无水CH2Cl2（20mL）中。加入乙基二甲氨丙基碳二亚胺盐酸盐（EDC，0.409g，2.14mmol）。室温下搅拌过夜后，将该反应混合物用CH2Cl2稀释并用水洗涤（2×45mL）。将有机层干燥（MgSO4）并浓缩至恒重。产物为油状物（0.563g，69%）。 
7.保护的MPEG4C3低聚物(3-(2-甲氧基-乙氧基)-丙酸叔丁酯)的合成 
Figure BDA00002516425100783
将甲基四乙二醇（5.0g，41.6mmol）和丙烯酸叔丁酯（2.66g，20.8mmol）溶解于无水THF（20mL）中。向该溶液中加入金属钠（0.47mg，20.8mmol）。室温下搅拌4h后，将该反应混合物通过加入1M HCl（30mL）淬灭。然后将淬灭的反应混合物用CH2Cl2萃取（1×100mL，1×50mL）。将有机层干燥（MgSO4）并浓缩。经硅胶色谱法（乙酸乙酯作为洗脱液）纯化后，获得的产物为油状物（7.5g，89%）。 
8.MPEG6C3低聚物酸(3-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-丙酸)的合成 
Figure BDA00002516425100791
将叔丁基酯（1g，4.90mmol）通过在室温下在三氟乙酸（6.0mL）中搅拌而脱保护。然后将内含物浓缩至恒重（0.652g，89%）。 
9.2-[2-(2-丙氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙醇（1）的合成 
将三乙二醇（19.5g，0.13mol）溶解于四氢呋喃（150mL）中，并将氢化钠（2.60g，0.065mol）在0.5h内分批加入，并将反应物继续搅拌另外的1h。将溶解于四氢呋喃（30mL）中的1-溴丙醇（8.0g，0.065mol）通过滴液漏斗滴加，并将反应物在室温下搅拌过夜。将粗反应混合物通过硅藻土过滤，用CH2Cl2洗涤并蒸发至干。将所形成的油状物溶解于CH2Cl2（250mL）中，用饱和NaCl（250mL）、H2O（250mL）洗涤，MgSO4干燥，并蒸发至干。通过柱色谱（硅胶，乙酸乙酯）提供（1）为浅黄色油状物（2.24g，18%收率）。 
10.碳酸4-硝基-苯基酯2-[2-(2-丙氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙酯的合 成 
将4-硝基氯甲酸盐（3.45g，17.1mmol）和（1）（2.2g，11.4mmol）溶解于CH2Cl2（20mL）中。搅拌10min后，在室温下加入TEA（2.1mL，15mmol）并搅拌过夜，粗反应产物用CH2Cl2（50mL）稀释，用1M HCl（50mL）、H2O（50mL）洗涤，MgSO4干燥，并蒸发至干。通过柱色谱（硅胶，乙酸乙酯/己烷：3:2）提供（2）为微黄色油状物（2.57g，63%收率）。 
11.碳酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙酯的合成 
将三乙二醇单甲基醚（1.0g，6.1mmol）和碳酸N,N’-二琥珀酰亚胺基酯（1.87g,7.3mmol）溶解于乙腈（10mL）中。然后在室温下加入三乙胺（1.3mL，9.15mmol）并将反应搅拌过夜，将粗反应产物蒸发至干，溶解于饱和NaHCO3（50mL）中，乙酸乙酯（2×50mL）洗涤，MgSO4干燥，并蒸发至干。通过柱色谱（硅胶，乙酸乙酯）提供（1）为澄清油状物（0.367g，20%收率）。 
12.碳酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酯（1）的合成 
Figure BDA00002516425100803
将四乙二醇单甲基醚（1.0g，4.8mmol）和碳酸N,N’-二琥珀酰亚胺基酯（1.48g,5.8mmol）溶解于乙腈（10mL）中。然后在室温下加入三乙胺（1.0mL，7.2mmol）并将反应搅拌过夜，将粗反应产物蒸发至干，溶解于饱和NaHCO3（30mL）中，乙酸乙酯（2×30mL）洗涤， MgSO4干燥，并蒸发至干。通过柱色谱（硅胶，乙酸乙酯/MeOH：20:1）提供（1）为澄清油状物（0.462g，28%收率）。 
13.丁-3-烯酸乙酯的合成 
Figure BDA00002516425100811
将醋酸乙烯酯（10.0g，0.12mol）溶解于乙醇（200mL）中，并加入浓硫酸（0.75mL，0.014mol）。加热回流反应4小时。粗反应产物用乙酸乙酯（200mL）稀释，用H2O（200mL）、饱和NaHCO3（200mL）洗涤，MgSO4干燥，并蒸发至干，给出（1）为澄清油状物（3.17g，23%）。 
14.4-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丁酸乙酯的合成 
Figure BDA00002516425100812
将三乙二醇单甲基醚（4.27g，0.026mmol）和丁-3-烯酸乙酯（1.5g,0.013mol）溶解于四氢呋喃（10mL）中。加入块状的Na0（0.030g，0.013mmol）并将反应搅拌4h。将粗反应产物用1M HCl（20mL）淬灭，乙酸乙酯（3×20mL）洗涤。合并有机层并用H2O（2×10mL）洗涤，MgSO4干燥，并蒸发至干，给出（2）为浅黄色油状物（1.07g，30%收率）。 
15.4-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丁酸的合成 
Figure BDA00002516425100813
将4-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丁酸乙酯（1.07g，4.0mmol）溶解于1M NaOH（10mL）中并将反应搅拌2h。将粗反应产物用饱和NaCl（40mL）稀释，用浓HCl酸化至pH～2。CH2Cl2（2×50mL）洗涤，MgSO4干燥，并蒸发至干，给出（3）为澄清油状物（0.945g，94%收率）。 
16.4-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丁酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯的合成 
Figure BDA00002516425100821
将N-羟基琥珀酰亚胺（0.55g，4.8mmol）和EDCI（1.15g,6.0mmol）溶解于CH2Cl2（7mL）中。然后加入溶解于CH2Cl2（2mL）的4-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丁酸（0.940g，3.8mmol）室温下反应搅拌过夜，将粗反应产物用CH2Cl2（21mL）稀释，用1M HCl（30mL），H2O（30mL）洗涤，MgSO4干燥，并蒸发至干。柱色谱（硅胶，乙酸乙酯）给出（4）为澄清油状物（0.556g，43%收率）。 
配合物的制备 
本发明的发明人研究了胰岛素化合物共轭物的锌配合物的制备方法。该新方法，优于已公开的用于胰岛素化合物和胰岛素化合物类似物的配位/结晶的方法，其被开发以制备HIM2的锌配合物。HIM2是在B29位具有结合的改性部分的人胰岛素单共轭物，其中所述的改性部分具有如下结构： 
Figure BDA00002516425100822
其它的配合物用IN105制备，在B29位具有结合的改性部分的人胰岛素单共轭物，其中所述的改性部分具有如下结构： 
Figure BDA00002516425100823
所述方法提供三个主要类型，胰岛素化合物共轭物固体的“T型”和“R型”和“鱼精蛋白”阳离子配合物。 
1.T型固体的制备和分析 
1.1HIM2的T型Zn配合物（2g/L）的尝试性制备 
制备约为2g/L的HIM2溶液，其具有最终pH～3含有10%HCl。向上述溶液的10mL等分试样（20mg蛋白质）中加入冰醋酸至最终浓度为0.25M。向该样品中加入20（或40）μL的2重量%的ZnCl2溶液。用浓氢氧化铵将pH调至5.1（或5.5）。将该溶液在室温（或+5℃）下搅拌15分钟，然后在室温（或+5℃）下静置一天以使得固体形成。在将该反应在室温（或在+5℃）下静置一天后，没有晶体或沉淀形成。参见名称为“Preparation of stable zinc insulin compound analog crystals”的美国专利5,504,188的实施例2。 
1.2HIM2的T型Zn配合物（10g/L浓度） 
制备约为10g/L的HIM2溶液，其具有最终pH～3含有10%HCl。向上述溶液的10mL等分试样（100mg蛋白质）中加入冰醋酸至最终浓度为0.25M。向该样品中加入40μL的10重量%的ZnCl2溶液。用浓氢氧化铵将pH调至5.20。将该溶液+5℃下搅拌15分钟，然后在+5℃下静置五天以使得固体形成。 
将反应混合物转移至离心管中并在2000RMP下离心10分钟。将溶液倾出并将固体用5mL冷的DI水洗涤。将该溶液在2000RMP下离心10分钟，之后将水倾出并将固体用另外5mL冷的DI水洗涤。同样，将所述样品在约2000RMP下离心约10分钟，之后将水倾出。该样品用5mL 200proof冷的乙醇洗涤并在2000RMP下离心10分钟，之后将乙醇倾出。将样品在冻干机中干燥以给出白色固体。 
1.3HIM2的T型Zn配合物（20g/L浓度） 
制备约为20g/L的HIM2溶液，其具有最终pH～3含有10%HCl。向上述溶液的10mL等分试样（200mg蛋白质）中加入冰醋酸至最终浓度为0.25M。向该样品中加入80μL的10重量%的ZnCl2溶液。用浓氢氧化铵将pH调至5.37。将该溶液+5℃下搅拌15分钟，然后在+5 ℃下静置四天以使得固体形成。 
将该反应混合物转移至离心管中并在2600RMP下离心20分钟。将溶液倾出并将固体用5mL冷的DI水洗涤。将该溶液在2600RMP下离心20分钟，之后将水倾出并将固体用另外5mL冷的DI水洗涤。将所述样品再次在约2600RMP下离心约20分钟，之后将水倾出。该样品用5mL 200proof冷的乙醇洗涤并在2600RMP下离心20分钟，之后将乙醇倾出。将样品在冻干机中干燥以给出白色固体。 
1.4HIM2的T型Zn配合物（30g/L浓度） 
制备约为30g/L的HIM2溶液，其具有最终pH～3含有10%HCl。向上述溶液的50mL等分试样（1.5g蛋白质）中加入冰醋酸至最终浓度为0.25M。向该样品中加入600μL的10重量%的ZnCl2溶液。用浓氢氧化铵将pH调至5.34。将该溶液在+5℃下静置五天以使得固体形成。 
将反应混合物转移至离心管中并在2800RMP下离心15分钟。将溶液倾出并将固体用10mL冷的DI水洗涤3次，每次洗涤都离心和倾出H2O。然后将样品用10mL 200proof冷的乙醇洗涤3次。在2800RMP下离心15分钟，在每次洗涤后将乙醇倾出。将样品在冻干机中干燥以给出白色固体。 
图1和图2为利用Zeiss Axiovert显微镜拍摄的光学显微照片，其显示生长24小时的晶体。在图1中，晶体大小为长约11.3μM，直径约5.3μM。在图2中，左边的晶体大小为长约15.1μM，直径约5.9μM，右边的晶体大小为长约9.1μM，直径约5.3μM。图3为利用ZeissAxiovert显微镜拍摄的光学显微照片，其显示生长5天的晶体。在一个方面，本发明包括具有如图1、2或3所示的形态的晶体。 
1.5HIM2的T型Zn配合物（50g/L浓度） 
制备约为50g/L的HIM2溶液，其具有最终pH～3含有10%HCl。 向上述溶液的10mL等分试样中加入冰醋酸至最终浓度为0.25M。向该样品中加入200μL的10%的ZnCl2溶液。用浓氢氧化铵将pH调至5.23。将该溶液在+5℃下搅拌15分钟，然后在+5℃下静置四天以使得发生固体形成。 
将该反应混合物转移至离心管中并在2600RMP下离心20分钟。将溶液倾出并将固体用5mL冷的DI水洗涤。将该溶液在2600RMP下离心20分钟，之后将水倾出并将固体用另外5mL冷的DI水洗涤。将所述溶液在约2600RMP下离心20分钟，之后将水倾出并将该固体用另外5mL冷的DI水洗涤。将所述样品再次在约2600RMP下离心20分钟，之后将水倾出。该样品用5mL 200proof冷的乙醇洗涤并在2600RMP下离心20分钟，之后将乙醇倾出。将样品在冻干机中干燥三天。 
1.6HIM2的T型Zn配合物（1g的规模） 
制备约为10g/L的HIM2溶液，其具有最终pH～3含有10%HCl。向上述溶液的50mL（500mg蛋白质）等分试样中加入冰醋酸至最终浓度为0.25M。向该样品中加入200μL 10%的ZnCl2溶液。用浓氢氧化铵将pH调至5.49。将该溶液在+5℃下搅拌15分钟，然后在+5℃下静置七天以使得发生固体形成。 
将反应混合物转移至离心管中并在2600RMP下离心20分钟。将溶液倾出并将固体用10mL冷的DI水洗涤。将该溶液在2600RMP下离心20分钟，之后将水倾出。另外再重复水洗涤两次。然后该样品用10mL 200proof冷的乙醇洗涤并在2600RMP下离心20分钟，之后将乙醇倾出。以同样方式再进行两次乙醇洗涤，之后将样品在冻干机上干燥四天。 
1.7在中性pH下HIM2的T型Zn配合物（5g的规模） 
制备约为10g/L的HIM2溶液，其具有最终pH～3含有10%HCl。 向该样品中加入2mL的10%ZnCl2溶液。用浓氢氧化铵将pH调至7.05。将该溶液在室温下搅拌过夜使得发生固体形成。 
将乳状Zn－HIM2反应混合物（500mL）部分加入350mL细烧结的（4.5-5μm）盘式漏斗（disc funnel）（ChemGlass CG1402-28，90mm直径）。在侧臂烧瓶（side-arm flask）中收集滤液，同时施加真空约4-6小时。任选的，滤饼可以用100mL冷的1%ZnCl2洗涤，并分别收集滤液。滤饼用100mL冰水洗涤，并再次收集滤液。所述滤饼同样用另外100mL 100%冰冻乙醇洗涤并再次收集滤液。最后用100mL新制的冰水洗涤所述滤饼并收集最终的滤液。将所述的滤饼在真空下干燥和/或空气干燥12-18小时。干燥后，将滤饼从漏斗上刮下，称重，并通过HPLC测量水分/蛋白质含量。从多步洗涤步骤中收集的滤液也用HPLC分析以测定在操作过程中损失的Zn－HIM2的浓度。过滤收回2.5重量%的Zn含量，其中总收率为98%。 
1.8在中性pH下HIM2的T型Zn配合物（500mg的规模） 
制备约为10g/L的HIM2溶液，其具有最终pH～3含有10%HCl。向该样品中加入200μL的10%ZnCl2溶液。用浓氢氧化铵将pH调至7.06。将该溶液在+5℃下搅拌15分钟，然后在+5℃下静置2天使得发生固体形成。 
将反应混合物转移至离心管中并在2800RMP下离心15分钟。将溶液倾出并将固体用10mL冷的DI水洗涤。将该溶液在2800RMP下离心15分钟，之后将水倾出。另外再重复水洗涤两次。然后该样品用10mL 200proof冷的乙醇洗涤并在2600RMP下离心20分钟，之后将乙醇倾出。以同样方式再进行两次乙醇洗涤，之后将样品在冻干机上干燥两天。 
1.9T型固体组合物的结果 
Figure BDA00002516425100871
NEM＝没有足够的物质 
ND＝没有数据 
2.R型固体的制备和分析 
2.1具有苯酚的在2g/L的HIM2的R型Zn配合物 
制备约为2g/L的HIM2溶液，其具有最终pH～3含有冰醋酸。向上述溶液的10mL等分试样中加入33μL液化的苯酚。用浓氢氧化铵将pH调至5.89。向该样品中加入160μL的10重量%的ZnCl2溶液。将该溶液在室温下搅拌15分钟，然后在室温下静置三天以形成更多的沉淀。 
将反应混合物转移至离心管中并在3400RMP下离心15分钟。将上清液倾出并将固体用5mL冷的DI水洗涤。将该溶液在3200RMP下离心15分钟，之后将水倾出。然后将该样品用5mL 200proof冷的乙醇洗涤并在3200RMP下离心15分钟，之后将乙醇倾出。再次将该样品用5mL冷的乙醇洗涤但不离心。使样品沉积于所述管的底部，然后放置于快速真空仪中干燥。 
2.220g/L的HIM2的R型Zn配合物的制备 
制备约为20g/L的HIM2溶液，其最终pH～3含有10%HCl。向 上述溶液的10mL等分试样中加入66μL液化的苯酚。用浓氢氧化铵将pH调至6.43。向该样品中加入320μL的10%的ZnCl2溶液。将该溶液在室温下搅拌15分钟，然后在室温下放置四天以形成更多的沉淀。 
将反应混合物转移至离心管中并在2600RMP下离心20分钟。将溶液倾出并将固体用5mL冷的DI水洗涤。将该溶液在2600RMP下离心20分钟，之后将水倾出，并将该样品用另外5mL冷的DI水洗涤。再次将样品在2600RMP下离心20分钟，之后将水倾出。将该样品用5mL 200proof冷的乙醇洗涤并在2600RMP下离心20分钟，之后将乙醇倾出。将样品冷冻干燥三天。 
2.330g/L的HIM2的R型Zn配合物的制备 
制备约为30g/L的HIM2溶液，其最终pH～3含有10%HCl。向上述溶液的10mL等分试样中加入99μL液化的苯酚。用浓氢氧化铵将pH调至6.47。然后向该样品中加入480μL的10%的ZnCl2溶液。将该溶液在室温下搅拌15分钟，然后在室温下静置四天以形成更多的沉淀。 
将反应混合物转移至离心管中并在2600RMP下离心20分钟。将溶液倾出并将固体用5mL冷的DI水洗涤。将该溶液在2600RMP下离心20分钟，之后将水倾出，并将该样品用另外5mL冷的DI水洗涤。再次将样品在2600RMP下离心20分钟，之后将水倾出。将该样品用5mL 200proof冷的乙醇洗涤并在2600RMP下离心20分钟，之后将乙醇倾出。将样品冷冻干燥三天。 
图4显示生长4天的固体。该图片用Zeiss Axiovert显微镜拍摄。晶体的平均长度为约9.7μM。 
2.450g/L的HIM2的R型Zn配合物的制备 
制备约为50g/L的HIM2溶液，其最终pH～3含有10%HCl。向 上述溶液的10mL等分试样中加入165μL液化的苯酚。用浓氢氧化铵将pH调至6.82。然后向该样品中加入800μL的10%的ZnCl2溶液。将该溶液在室温下搅拌15分钟，然后在室温下静置四天以形成更多的沉淀。 
将反应混合物转移至离心管中并在2600RMP下离心20分钟。将溶液倾出并将固体用5mL冷的DI水洗涤。将该溶液在2600RMP下离心20分钟，之后将水倾出，并将该样品用另外5mL冷的DI水洗涤。再次将样品在2600RMP下离心20分钟，之后将水倾出。将该样品用5mL 200proof冷的乙醇洗涤并在2600RMP下离心20分钟，之后将乙醇倾出。将样品冷冻干燥三天。 
2.51g规模的HIM2的R型Zn配合物的制备 
制备约为10g/L的HIM2溶液，其最终pH～3含有10%HCl。向上述溶液的50mL等分试样中加入165μL液化的苯酚。用浓氢氧化铵将pH调至6.42。然后向该样品中加入800μL的10%的ZnCl2溶液。将该溶液在室温下搅拌15分钟，然后在室温下静置七天以形成更多的沉淀。 
将反应混合物转移至离心管中并在2600RMP下离心20分钟。将溶液倾出并将固体用10mL冷的DI水洗涤。将该溶液在2600RMP下离心20分钟，之后将水倾出。以相同方式再进行两次水洗涤。然后将该样品用10mL 200proof冷的乙醇洗涤并在2600RMP下离心20分钟，之后将乙醇倾出。以相同方式再进行两次乙醇洗涤，之后将样品放置于冷冻干燥机上四天。 
2.65g规模的HIM2的R型Zn配合物 
制备约为10g/L的HIM2溶液，其最终pH～3含有10%HCl。向450mL上述溶液中加入1500μL液化的苯酚。用浓氢氧化铵将pH调至7.1。然后向该样品中加入1800μL的10%的ZnCl2溶液。将该溶液 在室温下搅拌15分钟，然后在室温下静置过夜以形成更多的沉淀。 
将上述进行的反应分成三份过滤试验。在试验一中，将反应混合物通过细烧结的漏斗过滤，然后用1%ZnCl2溶液洗涤。将所述物质通过真空过滤干燥过夜。第二个试验经过还包含滤纸的中等烧结的过滤器过滤。然后将物质用乙醇和水洗涤并通过真空过滤干燥过夜。最后，第三个试验通过细烧结漏斗过滤，用1%ZnCl2溶液洗涤，并也用乙醇和水洗涤。这些物质同样在真空过滤下干燥过夜。 
Figure BDA00002516425100901
2.7在中性pH下HIM2的R型Zn配合物 
制备约为10g/L的HIM2溶液，其最终pH～3含有10%HCl。向50mL上述溶液中加入165μL液化的苯酚。然后向该样品中加入200μL的10%的ZnCl2溶液。用浓氢氧化铵将pH调至7.18。将该溶液在室温下放置两天以形成沉淀。 
将反应混合物转移至离心管中并在2800RMP下离心20分钟。然而所述物质在开始没有沉积到所述管的底部，因此离心约2小时。将溶液倾出并将固体用5mL冷的DI水洗涤。将该溶液在2800RMP下离心60分钟，之后将水倾出。另外再重复水洗涤两次。然后该样品用5mL 200proof冷的乙醇洗涤并在2800RMP下离心60分钟，之后将乙醇倾出。以同样方式再进行两次乙醇洗涤。在第三次EtOH洗涤之后物质是混浊的，将其放置于冰箱中过夜以使反应物沉积更多。将溶剂倾出并将该物质放置于冻干机上两天。 
2.8R型固体组合物的结果 
NEM＝没有足够的物质 
ND＝没有数据 
3.鱼精蛋白固体的制备和分析 
3.1在酸性pH下具有鱼精蛋白的HIM2的T型Zn配合物的制备 
将鱼精蛋白加入最终pH～3含有10%HCl的10g/L的HIM2储备溶液中。向上述溶液的10mL等分试样(100mg蛋白质)中加入冰醋酸至最终浓度为0.25M。向该样品中加入200μL的10%的ZnCl2溶液。用浓氢氧化铵将pH调至pH～5。将该溶液在在+5℃下搅拌15分钟，然后在+5℃下静置两天以发生固体形成。 
将反应混合物转移至离心管中并在2600RMP下离心20分钟。将溶液倾出并将固体用10mL冷的DI水洗涤。将该溶液在2600RMP下离心20分钟，之后将水倾出。以同样方式再进行两次水洗涤。然后该样品用10mL 200proof冷的乙醇洗涤并在2600RMP下离心20分钟，之后将乙醇倾出。以同样方式再进行两次乙醇洗涤，之后将样品放在冻干机两天。 
3.2在中性pH下具有鱼精蛋白的HIM2的T型Zn配合物的制备 
制备约为30g/L的HIM2溶液，其最终pH～3含有10%HCl。向 上述溶液的50mL等分试样(1.5g蛋白质)中加入1毫升冰醋酸。将600μL的ZnCl2溶液加入到反应中，随后加入225毫克鱼精蛋白。用浓氢氧化铵将pH调至6.95，并将该溶液在+5℃下静置两天以发生固体形成。 
将反应混合物转移至离心管中并在2600RMP下离心20分钟。将溶液倾出并将固体用10mL冷的DI水洗涤。将该溶液在2600RMP下离心20分钟，之后将水倾出。以同样方式再进行两次水洗涤。然后该样品用10mL 200proof冷的乙醇洗涤并在2600RMP下离心20分钟，之后将乙醇倾出。以同样方式再进行两次乙醇洗涤，之后将样品放在冻干机上三天。 
3.3在酸性pH下具有鱼精蛋白的HIM2的R型Zn配合物的制备 
制备约为10g/L的HIM2溶液，其最终pH～3含有10%HCl。向上述溶液的150mL等分试样(1.5g蛋白质)中加入液化的苯酚（2.48mL）。用浓氢氧化铵将反应的pH调至pH～6.75。将12μL 10%的ZnCl2溶液加入到反应中，随后加入225毫克鱼精蛋白。将反应混合物在室温下搅拌15分钟，之后在室温下静置两天以使得发生固体形成。 
将反应混合物转移至离心管中并在2800RMP下离心15分钟。将溶液倾出并将固体用10mL冷的DI水洗涤。将该溶液在2800RMP下离心15分钟，之后将水倾出。以同样方式再进行两次水洗涤。然后该样品用10mL 200proof冷的乙醇洗涤并在2800RMP下离心15分钟，之后将乙醇倾出。以同样方式再进行两次乙醇洗涤，之后将样品放在冻干机上两天。 
3.4在中性pH下具有鱼精蛋白的HIM2的R型Zn配合物的制备 
制备约为10g/L的HIM2溶液，其pH～3含有10%HCl。向150mL反应物中加入液化的苯酚（495mL）。将600μL 10%的ZnCl2溶液加入到反应中，随后加入75毫克鱼精蛋白。用浓氢氧化铵将反应的pH调至pH为7.01。将反应混合物在室温下静置三天以使得发生固体形成。 
将反应混合物转移至离心管中并在2800RMP下离心15分钟。将溶液倾出并将固体用50mL冷的DI水洗涤。将该溶液在2800RMP下离心15分钟，之后将水倾出。以同样方式再进行两次水洗涤。然后该样品用50mL 200proof冷的乙醇洗涤并在2800RMP下离心15分钟，之后将乙醇倾出。以同样方式再进行两次乙醇洗涤，之后将样品放在冻干机上两天。 
3.5鱼精蛋白固体组合物的结果 
Figure BDA00002516425100931
NEM＝没有足够的物质 
ND＝没有数据 
4.胰岛素化合物二共轭物的制备和分析 
4.1在A1和B29处的胰岛素化合物二共轭物的T型Zn配合物 
将具有在人胰岛素的B29和A1处结合的改性部分-C(O)(CH2)5(OCH2CH2)7OCH3的胰岛素化合物二共轭物（DICON-1）加到被制成最终pH为3.15的、具有10%HCl的、约10g/L的溶液中。向上述溶液的3.75mL等分试样中加入冰醋酸至最终浓度为0.25M。然后向该样品中加入15μL 10%的ZnCl2溶液。用浓氢氧化铵将pH调至4.90。将该溶液在+5℃下搅拌15分钟，然后在+5℃下静置六天以使得固体形成（产生白色固体）。 
4.2在A1和B29处的胰岛素化合物二共轭物的R型Zn配合物 
将DICON-1加到被制成最终pH为3.15的、具有10%HCl的、约10g/L的溶液中。向上述溶液的3.75mL等分试样中加入12μL液化 的苯酚。用浓氢氧化铵将pH调至5.75。向该样品中加入60μL 10%的ZnCl2溶液。将该溶液在室温下搅拌15分钟，然后在室温下放置六天以使得更多沉淀形成（产生白色固体）。 
将反应混合物转移至离心管中并在2600RMP下离心20分钟。将溶液倾出并将固体用5mL冷的DI水洗涤。将该溶液在2600RMP下离心20分钟，之后将水倾出并将固体用另外5mL冷的DI水洗涤。再次将所述样品在2600RMP下离心20分钟，之后将水倾出。将该样品用5mL 200proof冷的乙醇洗涤并在2600RMP下离心20分钟，之后将乙醇倾出。将该样品冷冻干燥六天。 
4.3二共轭物B1，B29（10mg/mL） 
将DICON-1加到约10g/L的溶液中，并加入33μL液化的苯酚。用浓氢氧化铵将pH调至5.34。向该样品中加入160μL 10%的ZnCl2溶液。将该溶液在室温下静置两周以使得发生固体形成（产生白色固体）。 
将反应混合物转移至离心管中并在2800RMP下离心15分钟。将溶液倾出并将固体用5mL冷的DI水洗涤三次。将该溶液在2800RMP下离心15分钟，每次洗涤之后将上清液倾出。然后将该样品用5mL 200proof冷的乙醇洗涤三次。再次将该样品在2600RMP下离心15分钟，每次洗涤之后将上清液倾出。将样品冷冻干燥两天。 
4.4二共轭物B1，B29（10mg/mL） 
将DICON-1加到约20g/L的溶液中，并加入66μL液化的苯酚。用浓氢氧化铵将pH调至7.65。向该样品中加入320μL 10%的ZnCl2溶液。将该溶液在室温下放置两周以使得发生固体形成（产生白色固体）。 
将反应混合物转移至离心管中并在2800RMP下离心15分钟。将 溶液倾出并将固体用5mL冷的DI水洗涤三次。将该溶液在2800RMP下离心15分钟，每次洗涤之后将上清液倾出。然后将该样品用5mL 200proof冷的乙醇洗涤三次。再次将该样品在2600RMP下离心15分钟，每次洗涤之后将上清液倾出。将样品冷冻干燥两天。 
5.T型IN105固体的制备和分析 
5.1IN105单共轭物的T型Zn配合物（10g/L浓度） 
制备约为10g/L的IN105溶液（100mg），其具有最终pH～3含有10%HCl。向该样品中加入50μL 10重量%的ZnCl2溶液。用浓氢氧化铵将pH调至7.52。将该混浊溶液搅拌并将其在室温下静置五天以使得固体形成。 
将反应混合物转移至离心管中并在2900RMP下离心15分钟。将溶液倾出并将固体用3×10mL冷的DI水洗涤。将该溶液在2900RMP下离心10分钟，之后将水倾出并将固体用另一部分的冷的DI水洗涤。然后该样品用3×10mL 200proof冷的乙醇洗涤并在2900RMP下离心10分钟，之后将乙醇倾出。将该样品真空干燥给出白色固体（90mg）。 
5.2IN105单共轭物的T型Zn配合物（1g规模） 
制备约为10g/L的IN105溶液（1g），其最终pH为～3含有10%HCl。向该样品中加入500μL 10%的ZnCl2溶液。用浓氢氧化铵将pH调至～7.4。将该混浊溶液搅拌15分钟并将其在室温下静置～2天，之后过滤。 
将反应混合物在吸尘器真空（house vaccum）下通过烧结玻璃漏斗（细）过滤。将带有过滤物质的烧结玻璃漏斗放置于真空下在玻璃干燥器（glass dessicator）中过夜给出白色细粉（900mg）。 
5.3在中性pH下IN105单共轭物的T型Zn配合物（5g规模） 
约为10g/L的IN105溶液（5g，货号Nobex040706L）被制备为 最终pH为～3含有10%HCl。向该样品中加入2mL 10%的ZnCl2溶液。用浓氢氧化铵将pH调至～7.4。然后将该混浊溶液在室温下放置过夜以使得固体形成，之后过滤。 
将上述进行的反应分到4×50mL离心管中，并最初在3200RPM下离心共2小时。然后将所述物质在9000RPM下离心20分钟，并在5℃下储存过夜。将每只管中的上清液倾出并将固体用10mL冷的DI水洗涤。将所述管倒置并在3200RPM下离心～1小时，之后将水倾出并将固体用另外10mL冷的DI水洗涤。再次将样品在3200RPM下离心～1小时，之后将水倾出。将样品用2×10mL 200proof冷的乙醇洗涤，并在3200RPM下离心～1小时，之后将乙醇倾出。将样品真空干燥两天给出1.64g白色粉末（货号Nobex040730L-A）。 
5.4T型IN105固体组合物的结果 
6.R型IN105固体的制备和分析 
6.1在中性pH下IN105共轭物的R型Zn配合物 
制备约为10g/L的IN105溶液（500mg），其最终pH为～3含有10%HCl。向上述溶液中加入200μL 10%的ZnCl2溶液和165μL液化的苯酚。用浓氢氧化铵将pH调至7.37。然后将该混浊溶液在室温下静置两天以使得固体形成，之后过滤。 
将反应混合物在吸尘器真空（house vaccum）下通过烧结玻璃漏斗（细）过滤。将带有过滤物质的烧结玻璃漏斗放置于真空下的玻璃干燥器（glass dessicator）中过夜给出白色细粉（440mg）。 
6.25g规模的IN105共轭物的R型Zn配合物 
制备约为10g/L的IN105溶液（4.2g，货号Nobex040706L），其最终pH为～3含有10%HCl。向上述溶液中加入1.5液化的苯酚和1.8mL 10%的ZnCl2溶液。用浓氢氧化铵将pH调至～7.4。然后将该非常混浊的溶液在室温下放置过夜以使得更多的沉淀形成。 
将上述进行的反应分到4×50mL离心管中，并最初在3200RPM下离心2小时。然后将所述物质在9000RPM下离心20分钟，并在5℃下储存过夜。将每只管中的上清液倾出并将固体用10mL冷的DI水洗涤。将所述管倒置并在3200RPM下离心～1小时，之后将水倾出并将固体用另外10mL冷的DI水洗涤。再次将样品在3200RPM下离心～1小时，之后将水倾出。将样品用2×10mL 200proof冷的乙醇洗涤，并在3200RPM下离心～1小时，之后将乙醇倾出。将样品真空干燥2天给出2.34g白色粉末。 
6.3R型IN105固体组合物的结果 
Figure BDA00002516425100971
ND＝没有数据 
*：在pH约为7.4的磷酸盐缓冲液中 
7.鱼精蛋白IN105固体的制备和分析 
7.1在酸性pH下具有鱼精蛋白的IN105单共轭物的R型Zn配合物的制备 
制备约为10g/L的IN105溶液，其最终pH为～3含有10%HCl。向上述溶液的15mL等分试样（150mg蛋白质）中加入液化的苯酚（248μL）。用浓氢氧化铵将反应的pH调至pH～6.50。向该反应中加入1μL10%的ZnCl2溶液，随后加入22.5微克鱼精蛋白。然后将该反应混合物 在室温下搅拌15分钟，之后将其在室温下静置两天以使得发生固体形成。 
将反应混合物转移至离心管中并在2800RMP下离心15分钟。将溶液倾出并将固体用5mL冷的DI水洗涤，将该溶液在2800RMP下离心15分钟，之后将水倾出。以同样方式进行另外两次水洗涤。然后将样品用10mL 200proof冷的乙醇洗涤并在2800RMP下离心15分钟，之后将乙醇倾出。以同样方式进行另外两次乙醇洗涤，之后将样品真空干燥2天。 
7.2在中性pH下具有鱼精蛋白的IN105共轭物的R型Zn配合物的制备 
制备约为10g/L的IN105溶液，其最终pH为～3含有10%HCl。向15mL反应中加入液化的苯酚（49.5μL）。然后向反应中加入60μL10%的ZnCl2溶液，随后加入7.5mg鱼精蛋白。用浓氢氧化铵将pH调至pH为7.00。将该反应在室温下放置三天以使得固体形成。 
将反应混合物转移至离心管中并在2800RMP下离心15分钟。将溶液倾出并将固体用5.0mL冷的DI水洗涤，将该溶液在2800RMP下离心15分钟，之后将水倾出。以同样方式进行另外两次水洗涤。然后将样品用50mL 200proof冷的乙醇洗涤并在2800RMP下离心15分钟，之后将乙醇倾出。以同样方式进行另外两次乙醇洗涤，之后将样品真空干燥2天。 
7.3IN105的R型结晶的Zn配合物的制备 
将粗制的包含25%有机酸的15mg/mL的IN105溶液用1M HCl调节pH至3.47。将固态苯酚在40-60℃的温水浴中熔化并将0.218mL加入到反应烧瓶中。然后向反应中加入0.4mL 4%的酸化ZnCl2水溶液用1M NaOH将该溶液的pH调至最终pH为6.6。当调节pH时，在如下pH值时，抽出10mL等分试样：4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、 6.2、6.4和6.6。将这些样品不搅拌静置24小时。在显微镜下观察到针状晶体。 
7.4包含30%有机酸的IN105的R型结晶的Zn配合物的制备 
新制的15mg/mL的MPEG3丙酰基胰岛素化合物溶液在250mM乙酸铵缓冲液中制备，并将pH用1M HCl调至2.81。向该溶液中加入液化的苯酚0.040mL和95%乙醇4.25mL。然后将0.400mL的4%的酸化ZnCl2溶液加入到反应混合物中。用50%NH4OH将所述溶液的pH从3.7调至5.4，并在每个如下pH值时，抽出1mL等分试样：4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4。将该样品不搅拌下静置24小时。24小时后拍摄的显微镜照片显示针状晶体（参见图5）得自pH为4.0至5.2。 
7.5在100mM乙酸铵缓冲液（30、20和10%乙醇）中IN105的R型结晶的Zn配合物的制备 
新制的15mg/mL的MPEG3丙酰基胰岛素化合物溶液在100mM乙酸铵缓冲液中制备，并将pH用5M HCl调至2.8。向该溶液中加入液化的苯酚0.040mL和95%乙醇4.25mL。然后将0.400mL 4%的酸化ZnCl2溶液加入到反应混合物中。用5M NH4OH将所述溶液的pH从2.9调至5.6，并在每个如下pH值时，抽出0.5mL等分试样：4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6。将该样品不搅拌下静置24小时。24小时后拍摄的显微镜照片显示针状晶体得自pH为4.4至4.8。 
新制的15mg/mL的MPEG3丙酰基胰岛素化合物溶液在100mM乙酸铵缓冲液中制备，并将pH用5M HCl调至2.8。向该溶液中加入液化的苯酚0.040mL和95%乙醇2.25mL。然后将0.400mL 4%的酸化ZnCl2溶液加入到反应混合物中。用5M NH4OH将所述溶液的pH从2.9调至5.6，并在每个如下pH值时，抽出0.5mL等分试样：4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6。将该样品不搅拌下静置24小时。24小时后拍摄的显微镜照片显示环状晶体得自pH为4.8至5.4。 
新制的15mg/mL的MPEG3丙酰基胰岛素化合物在100mM乙酸铵缓冲液中制备，并将pH用5M HCl调至2.8。向该溶液中加入液化的苯酚0.040mL和95%乙醇1.15mL。然后将0.400mL 4%的酸化ZnCl2溶液加入到反应混合物中。用5M NH4OH将所述溶液的pH从2.8调至5.6，并在每个如下pH值时，抽出0.5mL等分试样：4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6。将该样品不搅拌下静置24小时。24小时后拍摄的显微镜照片显示针状晶体得自pH为5.0至5.6。 
7.6在20%有机酸中用0.1和0.2%苯酚制备IN105的R型结晶的Zn配合物 
新制的15mg/mL的MPEG3丙酰基胰岛素化合物溶液在100mM乙酸铵缓冲液中制备，并将pH用5M HCl调至3.0。向该溶液中加入液化的苯酚0.010mL和95%乙醇2.5mL。然后将0.400mL 4%的酸化ZnCl2溶液加入到反应混合物中。用5M NH4OH将所述溶液的pH从3.2调至5.6，并在每个如下pH值时，抽出0.5mL等分试样：4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6。将该样品不搅拌下静置24小时。24小时后拍摄的显微镜照片显示环状晶体得自pH为4.4至5.4。 
新制的15mg/mL的MPEG3丙酰基胰岛素化合物在100mM乙酸铵缓冲液中制备，并将pH用5M HCl调至3.0。向该溶液中加入液化的苯酚0.020mL和95%乙醇2.5mL。然后将0.400mL 4%的酸化ZnCl2溶液加入到反应混合物中。用5M NH4OH将所述溶液的pH从3.3调至5.6，并在每个如下pH值时，抽出0.5mL等分试样：4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6。将该样品不搅拌下静置24小时。24小时后拍摄的显微镜照片显示环状晶体得自pH为4.4至5.2。 
7.7以8克规模，pH为4.8和室温下制备IN105的R型结晶的Zn配合物 
新制的15mg/mL的MPEG3丙酰基胰岛素化合物溶液在250mM乙酸铵缓冲液中制备，并将pH用5M HCl调至2.0。向该溶液中加入 液化的苯酚2.13mL和95%乙醇225mL。然后将21.3mL 4%的酸化ZnCl2溶液加入到反应混合物中。用5M NH4OH将所述溶液的pH调至4.8。将该样品不搅拌下放置24小时，之后收集晶体。在显微镜照片中T＝0处看到针状晶体。 
通过将反应混合物分到6×250mL离心管中收集所述晶体。将所述管在10℃下在10,000RPM下旋转8分钟，之后将上清液倾出。然后向每个管中加入10mL冷水，之后将所述的6个管合并成2个管。离心过程用冷水再重复一次和用冷乙醇再重复2次。然后将晶体用桌式冻干机干燥2天。该过程产生的产率相对于原料为93重量%。 
7.8以1.5克规模，pH为4.8和室温下制备IN105的R型结晶的Zn配合物 
新制的MPEG3丙酰基胰岛素化合物（IN 105）溶液通过将1.52g固体IN105溶解于pH为7.5的100mL 250mM的乙酸铵中而制备。该溶液的pH用5M HCl/5M NH4OH调至2.8。将固态苯酚在40-60℃的温水浴中熔化。向反应烧瓶中加入400μL熔化的苯酚和42.5mL 95%乙醇。然后向反应烧瓶中加入4mL 4%的酸化ZnCl2水溶液。将形成的溶液的pH用5M NH4OH调至4.8。然后将该反应不搅拌静置48小时，之后收集晶体。在12小时后通过显微镜下观察到针状晶体形成。 
通过将反应浆液分到4×50mL离心管中收集所述晶体。开始，将所述管在1000RPM下旋转8分钟，然后将上清液倾出。在每个管中的晶体用1×5mL等分试样的冰水洗涤并在3000RPM下旋转8分钟。然后将上清液倾出。用1×5mL等分试样的冰水，然后用1×5mL等分试样的冷冻的乙醇重复洗涤/旋转过程。然后在真空干燥器中将晶体干燥过夜。该过程产生的产率相对于原料为73重量%。 
7.9以1.5克规模，pH为4.4和室温下制备IN105的R型结晶的Zn配合物 
新制的MPEG3丙酰基胰岛素化合物（IN 105）溶液通过将1.50g固体IN105溶解于pH为7.5的100mL 250mM的乙酸铵中而制备。该溶液的pH用5M HCl调至2.6。将固态苯酚在40-60℃的温水浴中熔化。向反应烧瓶中加入400μL熔化的苯酚和42.5mL 95%乙醇。然后向反应烧瓶中加入4mL 4%的酸化ZnCl2水溶液。将形成的溶液的pH用5MNH4OH调至4.4。然后将该反应不搅拌静置22小时，之后收集晶体。在2小时后通过显微镜下观察到针状晶体的混合物和沉淀的形成。反应混合物在21小时后通过显微镜显示完全结晶。 
通过将反应浆液转移到1×250mL离心管中收集所述晶体。将所述管在10,000RPM下旋转8分钟。然后将上清液倾出。将晶体用冰水的1×20mL等分试样洗涤并在10,000RPM下旋转8分钟。然后将上清液倾出。用冰水的1×20mL等分试样，然后用冷冻的乙醇的2×20mL等分试样和最后用冰水的1×20mL等分试样重复洗涤/旋转过程。然后在真空干燥器中将晶体干燥过夜。该过程产生的产率相对于原料为67重量%。 
7.10以8.0克规模，pH为4.8和室温下制备IN105的R型结晶的Zn配合物 
新制的MPEG3丙酰基胰岛素化合物（IN 105）溶液通过将7.98g固体IN105溶解于pH为7.5的533mL 250mM的乙酸铵中而制备。该溶液的pH用5M HCl调至2.4。将固态苯酚在40-60℃的温水浴中熔化。向反应烧瓶中加入2.13mL熔化的苯酚和225mL 95%乙醇。然后向反应烧瓶中加入21.3mL 4%的酸化ZnCl2水溶液。将形成的溶液的pH用5M NH4OH调至4.8。然后将该反应不搅拌静置21小时，之后收集晶体。反应混合物在2小时后通过显微镜显示完全结晶。 
通过将反应浆液分到6×250mL离心管中收集所述晶体。将所述管在10,000RPM下旋转8分钟.然后将上清液倾出。在每个管中的晶体用冰水的1×10mL等分试样洗涤并然后在10,000RPM下旋转8分钟。 然后将上清液倾出。用冰水的1×10mL等分试样，然后用冷冻的乙醇的2×10mL等分试样和最后用冰水的1×10mL等分试样重复洗涤/旋转过程。然后在真空干燥器中将晶体干燥2天。该过程产生的产率相对于原料为87重量%。 
7.11以10.0克规模，pH为4.8和室温下制备IN105的R型结晶的Zn配合物 
新制的MPEG3丙酰基胰岛素化合物（IN 105）溶液通过将10.06g固体IN105溶解于pH为7.5的670mL 250mM的乙酸铵中而制备。该溶液的pH用5M HCl调至2.6。固态苯酚在40-60℃的温水浴中熔化。向反应烧瓶中加入2.7mL熔化的苯酚和285mL 95%乙醇。然后向反应烧瓶中加入27mL 4%的酸化ZnCl2水溶液。然后将形成的溶液的pH用5M NH4OH调至4.4。然后将该反应不搅拌静置21小时，之后收集晶体。在2小时后通过显微镜观察到反应混合物显示完全结晶。 
通过将反应浆液分到6×250mL离心管中收集所述晶体。最初将所述管在10℃下，在10,000RPM下旋转8分钟.然后将上清液倾出。在每个管中的晶体用冰水的1×10mL等分试样洗涤并然后在10,000RPM下旋转8分钟。然后将上清液倾出。用冰水的1×30mL等分试样，然后用冷冻乙醇的2×30mL等分试样和冰水的1×30mL等分试样重复洗涤/旋转过程。然后用台式冻干机中将所得晶体干燥3天。该过程产生的产率相对于原料为89重量%。 
8.采用有机溶剂结晶的HIM2的Zn配合物的制备和分析 
8.1HIM2的R型Zn配合物的制备 
新制的15mg/mL的HIM2溶液在250mM乙酸铵缓冲液中制备，并将溶液的pH用5M HCl调至2.95。向该溶液中加入40μL液化的苯酚和3.5mL 95%乙醇。然后向该反应混合物中加入600μL 4%的酸化ZnCl2溶液。将该溶液的pH用5M NH4OH从3.14调至6.0并在每个如下希望pH值时，抽出500μL等分试样：4.2、4.4（参见图6A）、4.6、 4.8、5.0、5.2、5.4（参见图6B）、5.6、5.8、6.0。然后将该样品不搅拌静置24小时。在24小时后拍摄的显微照片显示在pH为4.4时为针状晶体。pH为4.6-6.0范围内显示出各种形状和大小的大的，结晶状固体。 
新制的15mg/mL的HIM2溶液在250mM乙酸铵缓冲液中制备，并将溶液的pH用5M HCl调至2.95。向该溶液中加入40μL液化的苯酚和3.5mL 95%乙醇。然后向该反应混合物中加入400μL 4%的酸化ZnCl2溶液。将该溶液的pH用5M NH4OH从3.22调至6.0并在每个如下希望pH值时，抽出500μL等分试样：4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2（参见图7A）、5.4、5.6、5.8、6.0。然后将该样品不搅拌静置24小时。在24小时后拍摄的显微照片显示在pH为4.6-6.0范围内各种形状和大小的结晶状固体。 
新制的15mg/mL的HIM2溶液在250mM乙酸铵缓冲液中制备，并将溶液的pH用5M HCl调至2.95。向该溶液中加入40μL液化的苯酚和3.5mL 95%乙醇。然后向该反应混合物中加入200μL 4%的酸化ZnCl2溶液。将该溶液的pH用5M NH4OH从3.19调至6.0，并在每个如下希望pH值时，抽出500μL等分试样：4.2、4.4、4.6、4.8、5.0（参见图7B）、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0。然后将该样品不搅拌静置24小时。在24小时后拍摄的显微照片显示在pH为4.4-4.6范围内各种形状和大小的结晶状固体。在pH为4.8-5.2范围内显示更均匀的针状晶体。 
新制的15mg/mL的HIM2溶液在250mM乙酸铵缓冲液中制备，并将溶液的pH用5M HCl调至2.95。向该溶液中加入40μL液化的苯酚和2.6mL 95%乙醇。然后向该反应混合物中加入600μL 4%的酸化ZnCl2溶液。将该溶液的pH用5M NH4OH从3.04调至6.0，并在每个如下希望pH值时，抽出500μL等分试样：4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4（参见图8A）、5.6、5.8、6.0。然后将该样品不搅拌静置24小时。在24小时后拍摄的显微照片显示在pH为4.4-4.6范围内为板状、雪片状晶体。 
新制的15mg/mL的HIM2溶液在250mM乙酸铵缓冲液中制备，并将溶液的pH用5M HCl调至2.95。向该溶液中加入40μL液化的苯酚和2.6mL 95%乙醇。然后向该反应混合物中加入400μL 4%的酸化ZnCl2溶液。将该溶液的pH用5M NH4OH从3.05调至6.0，并在每个如下希望pH值时，抽出500μL等分试样：4.2、4.4、4.6、4.8、5.0（参见图8B）、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0。然后将该样品不搅拌静置24小时。在24小时后拍摄的显微照片显示在pH为5.0时为针状晶体，在pH为5.2时为结晶状固体，在pH为5.4时为板状、雪片状晶体。 
Rxn6新制的15mg/mL的HIM2溶液在250mM乙酸铵缓冲液中制备，并将溶液的pH用5M HCl调至2.95。向该溶液中加入40μL液化的苯酚和2.6mL 95%乙醇。然后向该反应混合物中加入200μL 4%的酸化ZnCl2溶液。将该溶液的pH用5M NH4OH从3.09调至6.0并在每个如下希望pH值时，抽出500μL等分试样：4.2、4.4、4.6、4.8（参见图9A）、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0。然后将该样品不搅拌静置24小时。在24小时后拍摄的显微照片显示在pH为4.8-5.6时为针状晶体和结晶状固体。 
新制的15mg/mL的HIM2溶液在250mM乙酸铵缓冲液中制备，并将溶液的pH用5M HCl调至2.76。向该溶液中加入40μL液化的苯酚和4.25mL 95%乙醇。然后向该反应混合物中加入250μL 4%的酸化ZnCl2溶液。将该溶液的pH用5M NH4OH从2.97调至5.8并在每个如下希望pH值时，抽出500μL等分试样：4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8。然后将该样品不搅拌静置24小时。在24小时后拍摄的显微照片显示在pH为4.6-5.8时为结晶状沉淀。 
新制的15mg/mL的HIM2溶液在250mM乙酸铵缓冲液中制备，并将溶液的pH用5M HCl调至2.76。向该溶液中加入40μL液化的苯酚和4.25mL 95%乙醇。然后向该反应混合物中加入200μL 4%的酸化 ZnCl2溶液。将该溶液的pH用5M NH4OH从3.06调至5.8并在每个如下希望pH值时，抽出500μL等分试样：4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4（参见图9B）、5.6、5.8。然后将该样品不搅拌静置24小时。在24小时后拍摄的显微照片显示在pH为4.6-5.6时为结晶状沉淀。 
新制的15mg/mL的HIM2溶液在250mM乙酸铵缓冲液中制备，并将溶液的pH用5M HCl调至2.76。向该溶液中加入40μL液化的苯酚和4.25mL 95%乙醇。然后向该反应混合物中加入150μL 4%的酸化ZnCl2溶液。将该溶液的pH用5M NH4OH从3.09调至5.8，并在每个如下希望pH值时，抽出500μL等分试样：4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8。然后将该样品不搅拌静置24小时。在24小时后拍摄的显微照片显示在pH为5.0-5.2时为各种大小和形状的晶体。 
新制的15mg/mL的HIM2溶液在250mM乙酸铵缓冲液中制备，并将溶液的pH用5M HCl调至2.76。向该溶液中加入40μL液化的苯酚和4.25mL 95%乙醇。然后向该反应混合物中加入100μL 4%的酸化ZnCl2溶液。将该溶液的pH用5M NH4OH从3.09调至5.8，并在每个如下希望pH值时，抽出500μL等分试样：4.4、4.6、4.8、5.0（参见图10A）、5.2、5.4、5.6、5.8。然后将该样品不搅拌静置24小时。在24小时后拍摄的显微照片显示在pH为5.0时为针状晶体，和在pH为5.2-5.6时为各种大小和形状的结晶物质。 
新制的15mg/mL的HIM2溶液在250mM乙酸铵缓冲液中制备，并将溶液的pH用5M HCl调至2.76。向该溶液中加入20μL液化的苯酚和4.25mL 95%乙醇。然后向该反应混合物中加入250μL 4%的酸化ZnCl2溶液。将该溶液的pH用5M NH4OH从3.08调至5.8，并在每个如下希望pH值时，抽出500μL等分试样：4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8。然后将该样品不搅拌静置24小时。在24小时后拍摄的显微照片显示在pH 4.8-5.8时为结晶状沉淀。 
新制的15mg/mL的HIM2溶液在250mM乙酸铵缓冲液中制备，并将溶液的pH用5M HCl调至2.76。向该溶液中加入20μL液化的苯酚和4.25mL 95%乙醇。然后向该反应混合物中加入200μL 4%的酸化ZnCl2溶液。将该溶液的pH用5M NH4OH从3.05调至5.8，并在每个如下希望pH值时，抽出500μL等分试样：4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8。然后将该样品不搅拌放置24小时。在24小时后拍摄的显微照片显示非常小的结晶状固体。 
新制的15mg/mL的HIM2溶液在250mM乙酸铵缓冲液中制备，并将溶液的pH用5M HCl调至2.76。向该溶液中加入20μL液化的苯酚和4.25mL 95%乙醇。然后向该反应混合物中加入200μL 4%的酸化ZnCl2溶液。将该溶液的pH用5M NH4OH从3.05调至5.8，并在每个如下希望pH值时，抽出500μL等分试样：4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8。然后将该样品不搅拌放置24小时。在24小时后拍摄的显微照片显示非常小的结晶状固体。 
新制的15mg/mL的HIM2溶液在250mM乙酸铵缓冲液中制备，并将溶液的pH用5M HCl调至2.76。向该溶液中加入20μL液化的苯酚和4.25mL 95%乙醇。然后向该反应混合物中加入100μL 4%的酸化ZnCl2溶液。将该溶液的pH用5M NH4OH从3.06调至5.8，并在每个如下希望pH值时，抽出500μL等分试样：4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8。然后将该样品不搅拌放置24小时。在24小时后拍摄的显微照片显示非常小的结晶状固体。 
9.HIM2和IN105与锌的共晶 
9.1HIM2和IN105的R型共晶的Zn配合物的制备 
9.250:50(HIM2:IN105) 
新制的HIM2和IN105的溶液通过将37.3mg HIM2和36.4mgIN105溶解于4mL的pH 7.5的250mM乙酸铵中而制备。该溶液的pH 用5M HCl调至2.84。将固态苯酚在40-60℃的温水浴中熔化。向该反应烧瓶中加入16μL熔化的苯酚和1.75mL 95%乙醇。然后向该反应烧瓶中加入80μL 4%的酸化ZnCl2水溶液。然后将该溶液的pH用5MNH4OH从3.19调至5.60，并在每个如下希望pH值时，抽出0.5mL等分试样：4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4和5.6。然后将该样品不搅拌静置4小时。在4小时后拍摄的显微照片显示在pH为4.4至5.6时得到各种大小和形状的晶体。 
新制的HIM2和IN105的溶液通过将37.1mg HIM2和35.9mgIN105溶解于4mL的pH 7.5的250mM乙酸铵中而制备。将该溶液的pH用5M HCl调至3.03。将固态苯酚在40-60℃的温水浴中熔化。向该反应烧瓶中加入16μL熔化的苯酚和1.75mL 95%乙醇。然后向该反应烧瓶中加入40μL 4%的酸化ZnCl2溶液。然后将该溶液的pH用5MNH4OH从3.38调至5.60，并在每个如下希望pH值时，抽出0.5mL等分试样：4.4、4.6、4.8、5.0（参见图11A）、5.2（参见图11B）、5.4和5.6（参见图12A）。然后将该样品不搅拌静置4小时。在4小时后拍摄的显微照片显示在pH为4.4至5.6时得到大部分是短的针状晶体。 
9.370:30(HIM2:IN105) 
新制的HIM2和IN105的溶液通过将53.4mg HIM2和23.2mgIN105溶解于4mL的pH 7.5的250mM乙酸铵中而制备。将该溶液的pH用5M HCl调至2.62。将固态苯酚在40-60℃的温水浴中熔化。向该反应烧瓶中加入16μL熔化的苯酚和1.75mL 95%乙醇。然后向该反应烧瓶中加入80μL 4%的酸化ZnCl2水溶液。然后将该溶液的pH用5M NH4OH从3.02调至5.60，并在每个如下希望pH值时，抽出0.5mL等分试样：4.4、4.6、4.8、5.0、5.2（参见图12B）、5.4和5.6。然后将该样品不搅拌静置1小时。在1小时后拍摄的显微照片显示在pH为4.4至5.6时得到各种大小和形状的晶体状沉淀。 
新制的HIM2和IN105的溶液通过将53.6mg HIM2和24.5mg IN105溶解于4mL的pH 7.5的250mM乙酸铵中而制备。将该溶液的pH用5M HCl调至2.89。将固态苯酚在40-60℃的温水浴中熔化。向该反应烧瓶中加入16μL熔化的苯酚和1.75mL 95%乙醇。然后向该反应烧瓶中加入40μL 4%的酸化ZnCl2水溶液。然后将该溶液的pH用5M NH4OH从3.28调至5.60，并在每个如下希望pH值时，抽出0.5mL等分试样：4.4、4.6、4.8、5.0、5.2（参见图13A）、5.4和5.6。然后将该样品不搅拌静置1小时。在1小时后拍摄的显微照片显示在pH为4.6至4.8时得到大部分各种大小和形状的晶体状沉淀，和在pH为5.0至5.4时得到许多短的针状晶体。 
9.430:70(HIM2:IN105) 
新制的HIM2和IN105的溶液通过将23.3mg HIM2和54.7mgIN105溶解于4mL的pH 7.5的250mM乙酸铵中而制备。将该溶液的pH用5M HCl调至2.84。将固态苯酚在40-60℃的温水浴中熔化。向该反应烧瓶中加入16μL熔化的苯酚和1.75mL 95%乙醇。然后向该反应烧瓶中加入80μL 4%的酸化ZnCl2水溶液。然后将该溶液的pH用5M NH4OH从3.27调至5.60，并在每个如下希望pH值时，抽出0.5mL等分试样：4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4和5.6。然后将该样品不搅拌静置1小时。在1小时后拍摄的显微照片显示在pH为4.4至5.0时得到大部分各种大小和形状的晶体状沉淀，和在pH为5.2至5.6时得到很少的针状晶体。 
新制的HIM2和IN105的溶液通过将24.8mg HIM2和54.9mgIN105溶解于4mL的pH 7.5的250mM乙酸铵中而制备。将该溶液的pH用5M HCl调至3.09。将固态苯酚在40-60℃的温水浴中熔化。向该反应烧瓶中加入16μL熔化的苯酚和1.75mL 95%乙醇。然后向该反应烧瓶中加入40μL 4%的酸化ZnCl2水溶液。然后将该溶液的pH用5M NH4OH从3.47调至5.60，并在每个如下希望pH值时，抽出0.5mL等分试样：4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4和5.6（参见图13B）。然后将该样品不搅拌静置1小时。在1小时后拍摄的显微照片显示在pH为 4.4至5.0时得到大部分各种环形大小的晶体状沉淀，和在pH为5.2至5.6时得到各种形状和大小的晶体。 
9.5HIM2和IN105的R型共晶的Zn配合物的制备 
9.650:50(HIM2:IN105) 
新制的HIM2和IN105的溶液通过将37.4mg HIM2和35.9mgIN105溶解于4mL的pH 7.5的250mM乙酸铵中而制备。将该溶液的pH用5M HCl调至2.60。将固态苯酚在40-60℃的温水浴中熔化。向该反应烧瓶中加入16μL熔化的苯酚和1.75mL 95%乙醇。然后向该反应烧瓶中加入40μL 4%的酸化ZnCl2水溶液。然后将该溶液的pH用5M NH4OH从2.15调至5.60，并在每个如下希望pH值时，抽出0.5mL等分试样：4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4和5.6。然后将该样品不搅拌静置24小时。在24小时后拍摄的显微照片显示在pH＝4.6-5.6时得到各种形状和大小的晶体固体。 
9.770:30(HIM2:IN105) 
新制的HIM2和IN105的溶液通过将57.0mg HIM2和24.5mgIN105溶解于4mL的pH 7.5的250mM乙酸铵中而制备。将该溶液的pH用5M HCl调至2.43。将固态苯酚在40-60℃的温水浴中熔化。向该反应烧瓶中加入16μL熔化的苯酚和1.75mL 95%乙醇。然后向该反应烧瓶中加入40μL 4%的酸化ZnCl2水溶液。然后将该溶液的pH用5M NH4OH从2.92调至5.60，并在每个如下希望pH值时，抽出0.5mL等分试样：4.4、4.6（参见图14A）、4.8、5.0、5.2、5.4和5.6。然后将该样品不搅拌静置24小时。在24小时后拍摄的显微照片显示在pH为5.0-5.2时得到针状晶体。 
9.830:70(HIM2:IN105) 
新制的HIM2和IN105的溶液通过将24.1mg HIM2和53.8mgIN105溶解于4mL的pH 7.5的250mM乙酸铵中而制备。将该溶液的 pH用5M HCl调至2.35。将固态苯酚在40-60℃的温水浴中熔化。向该反应烧瓶中加入16μL熔化的苯酚和1.75mL 95%乙醇。然后向该反应烧瓶中加入40μL 4%的酸化ZnCl2水溶液。然后将该溶液的pH用5M NH4OH从2.60调至5.60，并在每个如下希望pH值时，抽出0.5mL等分试样：4.4、4.6、4.8、5.0（参见图14B）、5.2、5.4和5.6。然后将该样品不搅拌静置24小时。在24小时后拍摄的显微照片显示在pH为5.0-5.2时得到针状晶体。 
9.9HIM2和人胰岛素的R型共晶的Zn配合物的制备 
9.1050:50(HIM2:胰岛素) 
新制的HIM2和胰岛素的溶液通过将39.2mg HIM2和36.7mg胰岛素溶解于4mL的pH 7.5的250mM乙酸铵中而制备。将该溶液的pH用5M HCl调至2.53。将固态苯酚在40-60℃的温水浴中熔化。向该反应烧瓶中加入16μL熔化的苯酚和1.75mL 95%乙醇。然后向该反应烧瓶中加入40μL 4%的酸化ZnCl2水溶液。然后将该溶液的pH用5M NH4OH从2.82调至5.60，并在每个如下希望pH值时，抽出0.5mL等分试样：4.4、4.6、4.8、5.0、5.2（参见图15A）、5.4和5.6。然后将该样品不搅拌静置24小时。在24小时后拍摄的显微照片显示在pH为5.2和5.4时得到各种形状和大小的晶体状固体。在pH为5.6时得到许多微小的针状晶体。 
9.1170:30(HIM2:胰岛素) 
新制的HIM2和胰岛素的溶液通过将56.5mg HIM2和20.2mg胰岛素溶解于4mL的pH 7.5的250mM乙酸铵中而制备。将该溶液的pH用5M HCl调至3.23。将固态苯酚在40-60℃的温水浴中熔化。向该反应烧瓶中加入16μL熔化的苯酚和1.75mL 95%乙醇。然后向该反应烧瓶中加入40μL 4%的酸化ZnCl2溶液。然后将该溶液的pH用5MNH4OH从2.82调至5.60，并在每个如下希望pH值时，抽出0.5mL等分试样：4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4和5.6。然后将该样品不搅拌静 置24小时。在24小时后拍摄的显微照片显示在pH为5.2和5.6时得到各种形状和大小的晶体状固体。 
9.1230:70(HIM2:胰岛素) 
新制的HIM2和胰岛素的溶液通过将21.8mg HIM2和49.2mg胰岛素溶解于4mL的pH 7.5的250mM乙酸铵中而制备。将该溶液的pH用5M HCl调至3.23。将固态苯酚在40-60℃的温水浴中熔化。向该反应烧瓶中加入16μL熔化的苯酚和1.75mL 95%乙醇。然后向该反应烧瓶中加入40μL 4%的酸化ZnCl2溶液。然后将该溶液的pH用5MNH4OH从2.93调至5.60，并在每个如下希望pH值时，抽出0.5mL等分试样：4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4（参见图15B）和5.6。然后将该样品不搅拌静置24小时。在24小时后拍摄的显微照片显示在pH为4.8时得到板状、雪花状晶体。在pH为5.0时，得到针状和雪花状晶体的混合物。在pH为5.2-5.6时，观察到许多细小的针状晶体。Zn配合物的水溶解度 
将200μL的0.1M磷酸缓冲盐（PBS，过滤过，pH＝7.4）加入到1mL锥形反应小瓶中。向该小瓶中缓慢加入少量样品直至观察到饱和。周期性地，将该溶液涡旋。在饱和时，将该小瓶放置于小离心管中并将该样品在室温下在2000RMP下离心3min。离心后，从上清液移出10μL样品并冲稀在490μL缓冲盐（0.1M PBS）中。该稀释的样品通过HPLC分析以测定其浓度。 
Zn IN105配合物的体外酶抗性实施例 
胰岛素化合物共轭物（IN105）在10mM磷酸钠缓冲液（pH约为7.4）中提供，其浓度通过HPLC测定（该溶液用缓冲液稀释使得母体化合物和共轭物为等摩尔比～0.6mg/mL）。将亲脂的胰凝乳蛋白酶重新悬浮于1mM HCl中至浓度为～7.53U/mL。将每个样品的1.53mL等分试样加入到样品管中，和将0.850mL加入到对照管中。每个样品用4个对照管一式两份地测试样品。将等分试样在37℃下在恒温混匀器中孵育15分钟。然后将17μL胰凝乳蛋白酶加入到每个样品管中。向每个对照管中加入5μL的1mM HCl。在加入后从样品管和对照管中立即移出200μL，并放入预先等分入离心管中的50μL的1%TFA中。该样品用作T＝0。 
胰岛素化合物（没有Zn）、IN105（没有锌）和胰岛素化合物（正规的胰岛素化合物）的取样过程在如下间隔重复：0、2、5、8、12、15和30分钟。所述对照的取样过程在如下间隔重复：0、8、15、30分钟。对于T型和R型样品，该过程在如下间隔重复0、5、8、12、30、40和60分钟。所述Zn配合物的对照的取样过程在如下间隔重复：0、12、40和60分钟。将样品储存在-20℃，直至可以通过HPLC进行分析。运行HPLC以确定相对于每个消化各自的T＝0分钟的降解百分比。对于每个消化，将剩余百分比的自然对数对时间作图并进行线性回归。利用下式计算半衰期：t1/2＝-0.693/斜率。 
在0.6mg/mL蛋白质的结果 
制剂实施例 
1.液体制剂实施例 
1.1R6型Zn-HIM2的缓冲溶盐的缓冲液研究 
Figure BDA00002516425101141
*通过加入氯化锌将锌的量调至基于在锌HIM2固体中的锌含量的每3.7mg/mL胰岛素的0.037mg/mL。 
**pH可以用10%HCl和/或10%氢氧化钠调节。 
1.2癸酸/月桂酸制剂的口服液体稀释剂的制备 
将约60%的需要体积的无菌水转移到合适的容器中。向该容器中加入适量的（如下表所示）氨丁三醇、三乙醇胺、柠檬酸酐和氢氧化钠丸，并很好地混合直至溶解。将温度调至21-25℃（或室温）并测量该液体的pH。随所需地用1N氢氧化钠或1N盐酸将pH调至7.7-7.9。然后通过在扁平烤盘上温热而将温度调至45-50℃并保持在该温度。然后向该温热的溶液中加入癸酸并混合直至所述癸酸溶解。将温度调至21-25℃（或室温）并测量该液体的pH。如所需的，用1N氢氧化钠或1N盐酸将pH调至7.7-7.9。然后将该溶液混合5分钟。加入适量的无菌水至100%所需的体积，并进行良好混合。 
Figure BDA00002516425101151
称出必要的IN105、HIM2或ZnHIM2的量以获得用于给药研究的合适的浓度，例如称出1mg IN105（蛋白质）并与1mL制剂结合以产生在制剂中的1mg/mL IN105。 
1.3油酸/癸酸/月桂酸/胆酸盐制剂口服液体稀释剂的制备 
将R型Zn HIM2的口服液体制剂制成具有下表所示的组成： 
Figure BDA00002516425101152
Figure BDA00002516425101161
制备口服液体样品以含有等量于1mg/mL蛋白质的R型Zn HIM2（ZnHIM2-R）。将该ZnHIM2-R从冰箱中（-20℃）移出，放置于干燥器中并使其达到室温。将等量于1mg/mL蛋白质的R型ZnHIM2按如下步骤制备到口服液体稀释溶液中。称量6.4mg ZnHIM2-R。然后将5.0mL口服液体稀释剂转移到容器中并温和地涡旋混合。该溶液需要约45分钟溶解。所形成的溶液为悬浮液（混浊外观）。给药前，将该溶液温和地涡旋60秒以确保该溶液为均匀溶液。对于ZnHIM2-R，蛋白质含量为78.6%，1mg/mL当量，量＝5mL。ZnHIM2-R的量＝(1mg/mL)/(0.786)}×(5.0mL)＝6.4mg。ZnHIM2-R的浓度＝(6.4mg)/(5.0mL)=1.28mg/mL（相当于调节到对于蛋白质含量的1mg/mL）。 
1.4癸酸液体制剂的制备 
将所需的无菌水体积的约60%转移到适当的容器中。向该容器中加入适量（如下表所指出的）的氨丁三醇、三乙醇氨、柠檬酸酐和氢氧化钠丸，并进行良好混合直至溶解。将温度调至21-25℃（或室温）并测量该液体的pH。随所需地用1N氢氧化钠或1N盐酸将pH调至7.7-7.9。然后通过在扁平烤盘上温热而将温度调至45-50℃并保持在该温度。然后向该温热的溶液中加入癸酸并混合直至所述癸酸溶解。将温度调至21-25℃（或室温）并测量该液体的pH。如所需的，用1N氢氧化钠或1N盐酸将pH调至7.7-7.9。然后将该溶液混合5分钟。加入适量的无菌水至100%所需的体积，并进行良好混合。 
Figure BDA00002516425101162
称出必要的IN105的量以获得用于给药研究的合适的浓度，例如称出1mg IN105（蛋白质）并与1mL制剂结合以产生在制剂中的1mg/mL IN105。 
1.5癸酸盐和/或月桂酸盐在磷酸缓冲液中的液体制剂 
制备100mM磷酸钠缓冲液，pH为7.8或8.2。将1.17克一水合磷酸一钠盐转移到1升烧瓶中。将约500mL无菌水加入并进行良好混合直至溶解。然后加入24.58g六水合磷酸二钠并进行良好混合直至溶解。用无菌水稀释至体积并进行良好混合。经过0.22μm过滤器过滤。用1N HCl或1NaOH将pH调至7.8或8.2。 
对于IN105，将适当体积的pH为7.8或8.2的磷酸盐缓冲液的60%转移至合适的容器中。然后加入计算量的癸酸盐以产生3%w/v的终溶液并进行良好混合直至溶解。然后用1N HCl或1NaOH将pH调至7.8或8.2。用pH为7.8或8.2的磷酸缓冲液稀释至适当的体积（例如100mL）。 
Figure BDA00002516425101172
对于BN-054，称量400克在适当容器中的pH为7.8的100mM磷酸钠缓冲液。加入9.7克癸酸钠和11.1克月桂酸钠并进行良好混合直至溶解。加入适量的pH为7.8的100mM磷酸钠缓冲液至等于净重 为500克。 
Figure BDA00002516425101181
1.6含有精氨酸或三乙醇胺的液体制剂 
制备pH为7.8的100mM磷酸钠缓冲液，将1.17克一水合磷酸一钠盐转移到1升烧瓶中。将约500mL无菌水加入并进行良好混合直至溶解。然后加入24.58g六水合磷酸二钠并进行良好混合直至溶解。用无菌水稀释至体积并进行良好混合。经过0.22μm过滤器过滤。用1NHCl或1NaOH将pH调至7.8。 
将适当体积的pH为7.8的磷酸盐缓冲液的60%转移至合适的容器中。然后向该容器中加入适量的（如下表所指出的）精氨酸或三乙醇胺并进行良好混合直至溶解。然后加入计算量的癸酸盐以产生3%w/v的终溶液并进行良好混合直至溶解。然后用1N HCl或1NaOH将pH调至7.8。用pH为7.8的磷酸缓冲液稀释至适当的体积（例如100mL）。 
Figure BDA00002516425101182
称出必要的IN105的量以获得用于给药研究的合适的浓度，例如称出1mg IN105（蛋白质）并与1mL制剂结合以产生在制剂中的1mg/mL IN105。 
1.7含有辛酸的液体制剂 
将所需的无菌水体积的约60%转移到适当的容器中。向该容器中加入适量（如下表所指出的）的氨丁三醇、三乙醇氨、柠檬酸酐和氢氧化钠丸，并进行良好混合直至溶解。将温度调至21-25℃（或室温）并测量该液体的pH。随所需地用1N氢氧化钠或1N盐酸将pH调至7.7-7.9。然后通过在扁平烤盘上温热而将温度调至45-50℃并保持在该温度。然后向该温热的溶液中加入辛酸并混合直至所述辛酸溶解。将温度调至21-25℃（或室温）并测量该液体的pH。如所需的，用1N氢氧化钠或1N盐酸将pH调至7.7-7.9。然后将该溶液混合5分钟。加入适量的无菌水至100%所需的体积，并进行良好混合。 
Figure BDA00002516425101191
称出必要的IN105的量以获得用于给药研究的合适的浓度，例如称出1mg IN105（蛋白质）并与1mL制剂结合以产生在制剂中的1mg/mL IN105。 
1.8含有亚油酸的液体制剂 
制备pH为7.8的100mM磷酸钠缓冲液，将1.17克一水合磷酸一钠盐转移到1升烧瓶中。将约500mL无菌水加入并进行良好混合直至溶解。然后加入24.58g六水合磷酸二钠并进行良好混合直至溶解。用无菌水稀释至体积并进行良好混合。经过0.22μm过滤器过滤。用1NHCl或1NaOH将pH调至7.8。 
将适当体积的pH为7.8的磷酸盐缓冲液的60%转移至合适的容器中。然后加入计算量的亚油酸钠盐以产生3%w/v的终溶液并进行良好混合直至溶解。然后用1N HCl或1NaOH将pH调至7.8。用pH为7.8的磷酸缓冲液稀释至适当的体积（例如100mL）。 
1.9癸酸盐和/或月桂酸液体制剂的制备 
将所需的无菌水体积的约60%转移到适当的容器中。向该容器中加入适量（如下表所指出的）的氨丁三醇、三乙醇氨、柠檬酸酐和氢氧化钠丸，并进行良好混合直至溶解。将温度调至21-25℃（或室温）并测量该液体的pH。随所需地用1N氢氧化钠或1N盐酸将pH调至7.7-7.9。然后通过在扁平烤盘上温热而将温度调至45-50℃并保持在该温度。然后向该温热的溶液中加入癸酸和/或月桂酸并混合直至所述癸酸和/或月桂酸溶解。将温度调至21-25℃（或室温）并测量该液体的pH。如所需的，用1N氢氧化钠或1N盐酸将pH调至7.7-7.9。然后将该溶液混合5分钟。加入适量的无菌水至100%所需的体积，并进行良好混合。 
Figure BDA00002516425101202
称出必要的IN105的量以获得用于给药研究的合适的浓度，例如称出1mg IN105（蛋白质）并与1mL制剂结合以产生在制剂中的1mg/mL IN105。 
2.固体制剂实施例 
2.1利用Nobex-IN105-[854]-的癸酸盐/月桂酸盐固体剂型的制备和溶出特性 
将约58mg癸酸钠、57mg月桂酸钠、286mg甘露醇、30mg羟基乙酸淀粉钠和6mg（蛋白质）Nobex-IN105转移到一片称重纸上并充分混合。将该掺混物转移到压具上并在约350psi下压制以形成片剂。 
固体剂型（片剂）制剂Nobex-IN105-[854]，每片58mg癸酸盐和57mg月桂酸盐 
利用USP仪的2个溶出单元进行溶出测试。溶出介质为水，桨速为50rmp，介质体积为500mL。溶出试样通过HPLC利用梯度体系进行分析。流动相为含有0.1%TFA的水（流动相A）和含有0.1%TFA的乙腈（流动相B）。应用的梯度为：0分钟100%流动相A，11分钟65%流动相A，15分钟20%流动相A，16分钟20%流动相A，17分钟100%流动相A。检测波长为214nm和色谱柱为C18（150×2mm）。下表和图总结了对于包含6mg Zn-IN105（蛋白质）、286mg甘露醇、 58mg癸酸钠、57mg月桂酸钠和30mg羟基乙酸淀粉钠（Explotab）的Nobex-Zn-IN105片剂[854]的溶出试验的溶出数据： 
Nobex-Zn-IN105片剂[854]的溶出特性数据总结，溶出的IN105% 
Figure BDA00002516425101221
Nobex-Zn-IN105片剂[854]的溶出特性数据总结，溶出的癸酸盐% 
Figure BDA00002516425101222
Nobex-Zn-IN105片剂[854]的溶出特性数据总结，溶出的月桂酸盐% 
2.2固体剂型（片剂）配方制剂，每片143mg癸酸盐和140mg月桂酸盐 
制剂Nobex-IN105-[856]的制备 
将约143mg癸酸钠、140mg月桂酸钠、150mg甘露醇、30mg羟基乙酸淀粉钠和6mg（蛋白质）Nobex-IN105转移到一片称重纸上并充分混合。将该掺混物转移到压具上并在约350psi下压制以形成片剂。 
固体剂型（片剂）制剂Nobex-IN105-[854]，每片143mg癸酸盐和140mg月桂酸盐 
利用USP仪的2个溶出单元进行溶出测试。溶出介质为水，桨速为50rmp，介质体积为500mL。溶出试样通过HPLC利用梯度体系进行分析。流动相为含有0.1%TFA的水（流动相A）和含有0.1%TFA的乙腈（流动相B）。应用的梯度为：0分钟100%流动相A，11分钟65%流动相A，15分钟20%流动相A，16分钟20%流动相A，17分钟100%流动相A。检测波长为214nm和色谱柱为C18（150×2mm）。下表和图总结了对于包含6mg Zn-IN105（蛋白质）、150mg甘露醇、143mg癸酸钠、140mg月桂酸钠和30mg羟基乙酸淀粉钠（Explotab）的Nobex-Zn-IN105片剂[854]的溶出试验的溶出数据： 
Nobex-Zn-IN105片剂[856]的溶出特性数据总结，溶出的IN105% 
Figure BDA00002516425101241
Nobex-Zn-IN105片剂[856]的溶出特性数据总结，溶出的癸酸盐% 
Figure BDA00002516425101242
Nobex-Zn-IN105片剂[856]的溶出特性数据总结，溶出的月桂酸盐% 
2.3固体剂型（片剂）配方制剂，每片143mg癸酸盐 
制剂Nobex-IN105-[859]的制备 
将约143mg癸酸钠、150mg甘露醇、30mg羟基乙酸淀粉钠和6mg（蛋白质）Nobex-IN105转移到一片称重纸上并充分混合。将该掺混物转移到压具上并在约350psi下压制以形成片剂。 
固体剂型（片剂）制剂Nobex-IN105-[854]，每片143mg癸酸盐 
Figure BDA00002516425101251
利用USP仪的2个溶出单元进行溶出测试。溶出介质为水，桨速为50rmp，介质体积为500mL。溶出试样通过HPLC利用梯度体系进行分析。流动相为含有0.1%TFA的水（流动相A）和含有0.1%TFA的乙腈（流动相B）。应用的梯度为：0分钟100%流动相A，11分钟65%流动相A，15分钟20%流动相A，16分钟20%流动相A，17分钟100%流动相A。检测波长为214nm和色谱柱为C18（150×2mm）。下表和图总结了对于包含6mg Zn-IN105（蛋白质）、150mg甘露醇、143mg癸酸钠和30mg羟基乙酸淀粉钠（Explotab）的Nobex-Zn-IN105片剂的溶出试验的溶出数据： 
Nobex-Zn-IN105片剂[859]的溶出特性数据总结，溶出的IN105% 
Nobex-Zn-IN105片剂[859]的溶出特性数据总结，溶出的癸酸盐% 
Figure BDA00002516425101261
2.4固体剂型（片剂）配方制剂，每片286mg癸酸盐 
制剂Nobex-IN105-[860]的制备 
将约286mg癸酸钠、150mg甘露醇、30mg羟基乙酸淀粉钠和6mg（蛋白质）Nobex-IN105转移到一片称重纸上并充分混合。将该掺混物转移到压具上并在约350psi下压制以形成片剂。 
固体剂型（片剂）制剂Nobex-IN105-[860]，每片286mg癸酸盐 
Figure BDA00002516425101262
利用USP仪的2个溶出单元进行溶出测试。溶出介质为水，桨速为50rmp，介质体积为500mL。溶出试样通过HPLC利用梯度体系进行分析。流动相为含有0.1%TFA的水（流动相A）和含有0.1%TFA的乙腈（流动相B）。应用的梯度为：0分钟100%流动相A，11分钟65%流动相A，15分钟20%流动相A，16分钟20%流动相A，17分钟100%流动相A。检测波长为214nm和色谱柱为C18（150×2mm）。下表和图总结了对于包含6mg Zn-IN105（蛋白质）、150mg甘露醇、286mg癸酸钠和30mg羟基乙酸淀粉钠（Explotab）的Nobex-Zn-IN105 片剂的溶出试验的溶出数据： 
Nobex-Zn-IN105片剂[860]的溶出特性数据总结，溶出的IN105% 
Nobex-Zn-IN105片剂[860]的溶出特性数据总结，溶出的癸酸盐% 
2.5固体剂型（片剂）配方制剂，每片100mg癸酸盐 
制剂Nobex-IN105-[861]的制备 
将约100mg癸酸钠、150mg甘露醇、25mg羟基乙酸淀粉钠和6mg（蛋白质）Nobex-IN105转移到一片称重纸上并充分混合。将该掺混物转移到压具上并在约350psi下压制以形成片剂。 
固体剂型（片剂）制剂Nobex-IN105-[861]，每片100mg癸酸盐 
Figure BDA00002516425101273
Figure BDA00002516425101281
利用USP仪的2个溶出单元进行溶出测试。溶出介质为水，桨速为50rmp，介质体积为500mL。溶出试样通过HPLC利用梯度体系进行分析。流动相为含有0.1%TFA的水（流动相A）和含有0.1%TFA的乙腈（流动相B）。应用的梯度为：0分钟100%流动相A，11分钟65%流动相A，15分钟20%流动相A，16分钟20%流动相A，17分钟100%流动相A。检测波长为214nm和色谱柱为C18（150×2mm）。下表和图总结了对于包含6mg Zn-IN105（蛋白质）、150mg甘露醇、100mg癸酸钠和25mg羟基乙酸淀粉钠（Explotab）的Nobex-Zn-IN105片剂的溶出试验的溶出数据： 
Nobex-Zn-IN105片剂[861]的溶出特性数据总结，溶出的IN105% 
Figure BDA00002516425101282
Nobex-Zn-IN105片剂[861]的溶出特性数据总结，溶出的癸酸盐% 
Figure BDA00002516425101283
2.6固体剂型（片剂）配方制剂，每片150mg癸酸盐 
制剂Nobex-IN105-[862]的制备 
将约150mg癸酸钠、150mg甘露醇、25mg羟基乙酸淀粉钠和6mg（蛋白质）Nobex-IN105转移到一片称重纸上并充分混合。将该掺混物转移到压具上并在约350psi下压制以形成片剂。 
固体剂型（片剂）制剂Nobex-IN105-[862]，每片100mg癸酸盐 
Figure BDA00002516425101291
利用USP仪的2个溶出单元进行溶出测试。溶出介质为水，桨速为50rmp，介质体积为500mL。溶出试样通过HPLC利用梯度体系进行分析。流动相为含有0.1%TFA的水（流动相A）和含有0.1%TFA的乙腈（流动相B）。应用的梯度为：0分钟100%流动相A，11分钟65%流动相A，15分钟20%流动相A，16分钟20%流动相A，17分钟100%流动相A。检测波长为214nm和色谱柱为C18（150×2mm）。下表和图总结了对于包含6mg Zn-IN105（蛋白质）、150mg甘露醇、150mg癸酸钠和25mg羟基乙酸淀粉钠（Explotab）的Nobex-Zn-IN105片剂的溶出试验的溶出数据： 
Nobex-Zn-IN105片剂[862]的溶出特性数据总结，溶出的IN105% 
Figure BDA00002516425101292
Figure BDA00002516425101301
Nobex-Zn-IN105片剂[862]的溶出特性数据总结，溶出的癸酸盐% 
Figure BDA00002516425101302
体外酶抗性实施例 
将胰岛素化合物共轭物（HIM2）在10mM磷酸钠缓冲液（pH为约7.4）中提供，并且它们的浓度通过HPLC测定（所述溶液用缓冲液稀释以使得母体化合物和共轭物为等摩尔比～0.6mg/mL）。将冻干的胰凝乳蛋白酶悬浮于1mM HCl中至浓度为7.53U/mL。将每个样品的1.53mL等分试样加入到样品管中，和将0.850mL加入到对照管中。每个样品用4个对照管一式两份地测试样品。将等分试样在37℃下在恒温混匀器中孵育15分钟。然后将17μL胰凝乳蛋白酶加入到每个样品管中。向每个对照管中加入5μL的1mM HCl。在加入后从样品管和对照管中立即移出200μL，并放入预先等分入离心管中的50μL的1%TFA中。该样品用作T＝0。 
胰岛素（没有Zn）、HIM2（没有Zn）和胰岛素（正规的胰岛素化合物）的取样过程在如下间隔重复：0、2、5、8、12、15和30分钟。所述对照的取样过程在如下间隔重复：0、8、15、30分钟。对于T型和R型样品，该过程在如下间隔重复0、5、8、12、30、40和60分钟。所述Zn配合物的对照的取样过程在如下间隔重复：0、12、40和60分钟。将样品储存在-20℃，直至可以通过HPLC进行分析。运行HPLC 以确定相对于每个消化各自的T＝0分钟的降解百分比。对于每个消化，将剩余百分比的自然对数对时间作图并进行线性回归。利用下式计算半衰期：t1/2＝-0.693/斜率。 
在0.6mg/mL蛋白质下的结果 
Figure BDA00002516425101311
在0.3mg/mL蛋白质下的结果 
Figure BDA00002516425101312
体内实施例 
1.长期小鼠血糖分析（MBGA） 
5只雄性小鼠（Charles River Laboratories;25-30g）的六对给药组接受皮下注射胰岛素化合物共轭物（测试物）或重组人胰岛素。所述的测试物用含有0.1重量%的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（0.01M，pH约为7.4）重新组成，并以100、66.6、43.3、30、20和13.3μg/kg给药。胰岛素用含有0.1重量%的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（0.01M，pH约为7.4）重新组成，并以50、33.3、21.7、15、10和6.7μg/kg给药。在由大腿和腹股沟形成的袋中接受皮下给药后，动物在室温下返回笼子30分钟，然后快速麻醉并进行终端放血。将血样收集在肝素试管中用于血糖测定。如果推迟进行血糖测定，则所述试管要储存在冰水中，并在分析之前重新温热至室温。 
血浆葡萄糖采用血糖仪（例如One
Figure BDA00002516425101321
Basic;Lifescan）进行测量，该仪器每天开始使用时根据制造商的说明书进行校准。然后胰岛素化合物共轭物功效相对于标准曲线进行计算，所述的标准曲线被形成用于所述重组人胰岛素响应。计算基于重组人胰岛素具有27.4IU/mg的功效的假设。 
结果示于图16-20中。图16显示HIM2的MBGA生物效能曲线。图17显示Zn-HIM2胰岛素化合物产物R型的MBGA生物效能曲线。图18显示Zn-HIM2胰岛素化合物产物T型的MBGA生物效能曲线。图19显示具有鱼精蛋白的Zn-HIM2胰岛素化合物产物的MBGA生物效能曲线。图20显示R型鱼精蛋白配合物在给药后30和90分钟的葡萄糖降低效果。这些结果显示HIM2的生物效能没有由于与Zn++配位而显著性降低。所述的R型鱼精蛋白配合物（参见图17[7]）显示在30分钟比在90分钟更大的葡萄糖下降。 
另外，图21-24显示具有如下结构的IN-186、IN-192、IN-190、IN-191、IN-189、N-178、IN-193、IN-194、IN-185、IN-196和IN-197 的生物效能曲线： 
B1单共轭物，IN-186： 
B29单共轭物，IN-194： 
Figure BDA00002516425101332
B29单共轭物，IN-197： 
Figure BDA00002516425101333
B29单共轭物，IN-178： 
B29单共轭物，IN-190： 
Figure BDA00002516425101335
B29单共轭物，IN-196： 
Figure BDA00002516425101341
B29单共轭物，IN-191： 
Figure BDA00002516425101342
B29单共轭物，IN-189： 
Figure BDA00002516425101343
2.狗夹（clamp）研究 
2.1初始HIM2研究 
通过外科手术（异氟烷麻醉）在股动脉中放置导管而制备狗（n＝3或6）。让这些动物恢复16-17天，之后将它们禁食过夜并在清醒状态下进行研究。60分钟平衡期后，有20分钟控制期，之后通过口腔给药。Zn++-HIM2R型胰岛素化合物在缓冲液中测试，所述的缓冲液如在实施例中所示的那样制备。另外，R型和NPH型配合物在包含癸酸和月桂酸的口服液体制剂中测试，所述的口服液体制剂如在实施例中所示的那样制备。 
所有3个测试样品只在一剂量水平（所述的剂量水平基于前述试验结果确定）下测试。然后通过4小时下肢静脉灌注D-20而将血浆葡萄糖水平夹在血糖恒定（euglycemic）值。在-20、0、5、10、20、30、45、90、120、180和240分钟采集血样（4mL）用于测量葡萄糖、胰岛素化合物和C-肽。动脉血血样随所需的获得以夹住所述血浆葡萄糖水平。在每个实验中共采集72mL血。 
进行如下测定：葡萄糖灌注速率、胰岛素化合物浓度、C-肽浓度和血浆C-肽水平（以估计内源性胰岛素化合物的释放）。所需的用以维持高血糖的葡萄糖灌注速率提供胰岛素化合物作用的指标。 
在实验后，所述导管的空的一端进行皮下埋植并让这些狗恢复2星期，之后进行另一项使用不同测试物的研究。随机对动物给药并且这些动物被给药总共3次，狗的总数为6只。 
图25和26显示研究结果 
2.2初始IN105研究 
本研究在禁食过夜的清醒的杂种狗身上进行，所述的杂种狗已经给食基于干重的34%蛋白质、46%糖类、14.5%脂肪和5.5%纤维。每只动物在实验前约3星期如另外地方（1）所述的将硅橡胶导管插入到股动脉中。在实验日，在局部麻醉的情况下将所述导管从其皮下袋中取出。测试物：Nobex-IN105（货号KJ-173-095&KJ-173-116）在口服脂肪酸制剂中（Nobex-IN-[753]-040422）提供，浓度为1.0mg/mL。每只狗接受0.25mg/kg口服剂量的Nobex-IN105（1.0mg/ml0.25ml/kg给药体积）。在t＝0时给药Nobex-IN105，并且通过头静脉灌注葡萄糖（D-20）以保持血糖恒定。如前所述（1）的那样抽取动脉血样品用于测量胰岛素和葡萄糖。实验完成后，将动脉导管皮下埋值，如在初始外科手术过程中那样。 
在实验过程中，一只狗在给药后立即呕吐，并只有一部分狗被给药。因此，该实验结果以包含和不包含得自这只狗的数据而进行报导。 
在口服给药Nobex-IN105之后，在所有6只狗中，动脉血浆胰岛素水平上升，包括异常值（口服-2i）。给药10分钟后，平均动脉胰岛素从6.0±1.4μU/mL（6.3±1.7μU/mL，n＝5）上升至峰值的109.4±31.4μU/mL（127.8±30.1μU/mL，n＝5），然后下降以使得经过150 分钟后，所有的狗恢复到基线胰岛素水平（图27和28）。 
通过葡萄糖灌注维持血糖恒定。在动脉胰岛素（图27和28）平均葡萄糖灌注速率曲线下面积（AUC0-240）较大上升的动物中所需的维持最大血糖恒定的葡萄糖灌注速率是578.5±144.5mg/kg/min（669.4±137.7mg/kg/min，n＝5）。 
2.3固体制剂 
利用葡萄糖夹模型筛选制剂的研究在禁食过夜的清醒杂种狗身上进行，所述狗已经给食基于干重的34%蛋白质、46%糖类、14.5%脂肪和5.5%纤维。在实验前约3周，每只动物如另外地方所描述的（参见1）将硅橡胶导管插入到股动脉中。在实验日，在局部麻醉的情况下将所述导管从其皮下袋中取出。所用测试物包含在不同液体制剂中的1.0mg/mL Zn IN105，或每胶囊或片含有5-6mg的IN105。在每个实验中的每只狗连续两次接受约0.25mg/kg的口服液体剂量或包含5或6mg的胶囊或片，第一次在t＝0时，第二次在t＝120分钟时。通过头静脉灌注葡萄糖（D-20）以保持血糖恒定。在一些情况下，研究时间在给药后延长，其中所述的作用持续超过120分钟。如前所述（参见1）的那样抽取动脉血样品用于测量胰岛素、葡萄糖和C肽。实验完成后，动脉导管被放置于皮下组织中。 
制剂，无论溶液剂和固体剂型，都是用不同水平的脂肪酸、缓冲液、稀释剂和崩解剂制备的。为了使变量最小化，所述的液体和固体制剂包含相同水平IN105和每种赋形剂（癸酸、月桂酸、辛酸、肉豆蔻酸、亚油酸），因此变化只有相对量的脂肪酸含量、缓冲液、稀释剂（甘露醇和微晶纤维素），和/或崩解剂（Explotab）。对葡萄糖灌注速率和IN105吸收（血浆胰岛素免疫反应）数据进行评估和与每个给药的制剂进行比较。 
最初，进行实验以将优化的液体制剂（参见2）简化和改进为可 以更易于转化为固体剂型的液体制剂。这通过将所述游离脂肪酸替代为相应的钠盐（例如将癸酸替代为癸酸钠），以及除去被认为是不再需要的缓冲组分（柠檬酸、三乙醇胺、氨丁三醇、氢氧化钠）而进行。另外，对其它脂肪酸，例如亚油酸、辛酸和肉豆蔻酸，以及所述氨基酸，精氨酸的对于IN105吸收作用的作用进行检测。 
在每个实验用一只或两只狗进行原型筛选的初始设定后，几乎没有原型制剂在另外的狗中被选择和测试，以更好地确定制剂和个体动物之间的可变性和一致性。 
对很多候选制剂开发溶出方法和进行溶出研究以评价IN105和所述脂肪酸含量的溶出特性。 
结果 
在初步实验中，用在3%w/v的癸酸钠的磷酸盐缓冲液的溶液中的IN105给药，而没有另外的赋形剂，显示出（图29-30）与优化的液体制剂相比类似的反应，所述的优化的液体制剂包含在三乙醇胺/柠檬酸/氨丁三醇/氢氧化钠缓冲液中的3%w/v的癸酸。这说明所述脂肪酸的钠盐形式显示与所述酸形式相当的性质，并说明另外的缓冲组分对所述制剂没有贡献。 
在评价用3%辛酸或3%亚油酸代替3%癸酸盐的备选脂肪酸的单独研究中，没有备选物显示出显著的效果。辛酸的使用导致对于低至中等水平的葡萄糖的需要，而亚油酸的使用没有导致任何葡萄糖灌注的需要，这说明没有作用。这两种制剂都显示相对低水平的动脉胰岛素。包含精氨酸的液体制剂没有显示对于GIR或IN105的相关的益处。 
在初级研究中，固体制剂作为填充入硬胶胶囊的粉末掺混物和利用Carver压具手工压制的片剂进行评价。所述的胶囊，6mg的IN105（胰岛素等同物，0.25mg/Kg）与57mg癸酸盐/57mg月桂酸盐的粉末 掺混物，显示在第一次给药最长至120分钟时没有显著的效果，而在第二次给药观察到GIR与IN105同时吸收的显著的效果，其中其水平从0至120分钟很好的大于基线。该数据说明在胶囊剂型中的IN105中可变的但潜在的延迟应答。胶囊相对于片剂溶出仅微小地延迟，尽管可能几乎没有体外/体内相关性。 
在初始的原型片剂筛选研究中，包含6mg的IN105和150mg的甘露醇，30mg羟基乙酸淀粉钠，含有143mg癸酸盐，含有或不含有143mg月桂酸盐的片剂显示比含有54mg癸酸盐或/和54mg月桂酸盐的相同的片剂显著更高的GIR和IN105吸收（图31、32和33）。这说明相对于增加癸酸盐和月桂酸盐的水平，较高的GIR和IN105水平具有合理的剂量反应。所述片剂显示对IN105填充的胶囊早的和相同的GIR反应时间。另外，所述的IN105片剂显示在所有给药的狗中胰岛素的动脉血浆上升。 
在一系列的最终实验中，3种原型片剂制剂（包含143mg癸酸盐和140mg月桂酸盐的制剂[856]；包含286mg癸酸盐的[860]和包含150mg癸酸盐的[862]）被选择用于在5只狗中（对每个制剂3只不同的狗）进行评价以估算性能一致性（图34-37）。在所有3只狗和在所有18个剂量（3只狗×3片×2剂量每只）中动脉血浆胰岛素水平随着相应的，在口服给药6mg（胰岛素等同物）的被配制到包含150mg或280mg癸酸盐或143mg/140mg癸酸盐/月桂酸盐的片剂中的IN105之后的，GIR反应而上升。所述的C-肽水平（ng/ml），在用150mg和280mg癸酸盐片剂的情况下，其平均值（n＝2）显示在第一次给药期间从初始水平的0.30±0.05降低至0.22±0.02，和在第二次给药期间从初始水平的0.1±0.05降低至0.02±0.0，和在用140mg/140mg癸酸/月桂酸片剂的情况下，显示在第一次给药期间从初始水平的0.21±0.05降低至0.05±0.02，和0.18±0.05降低至0.18±0.01。这说明由外源性IN105胰岛素对从胰腺分泌产生的C肽产生抑制。 
IN105的所有三种原型片剂在剂量之间和在狗中和在狗之间，包括在不同的天，显示相同的IN105吸收水平和导致的葡萄糖灌注速率。 
在最终的研究中，其中采用6只狗的组，一只狗（3号狗）用所有的液体和固体剂量几乎没有反应。为了更准确地表现这样的结果，所示的数据用和不用得自3号狗的结果都被提出。没有采集全部剂量的（不好的强饲法、呕吐等）或具有内源性胰岛素的狗的数据被忽略。 
溶出研究：片剂和胶囊剂的典型的样品经历溶出测试（如上所述）。 
讨论 
这些研究表明包含癸酸钠盐，或者癸酸钠和月桂酸钠盐的原型IN105片剂，其含有甘露醇和崩解剂羟基乙酸淀粉钠和含有6mg IN105（约0.25mg/kg），将其口服给药导致显著的和一直提高的动脉血浆胰岛素，这需要葡萄糖灌注以维持血糖恒定。 
这些原型片剂导致IN105水平和GIR速率与包含相当水平的癸酸盐或月桂酸盐的液体制剂相比至少一样好和好像更好。所述的原型片剂形式维持口服液体制剂的吸收曲线。所选择的原型片剂（例如含有280mg和150mg癸酸盐的片剂，n＝6，GIR的AUC＝496±117和500±275）的口服相对生物利用度显然比液体制剂（例如，3%w/v癸酸液体制剂，n＝5，GIR的AUC＝189±92和198±119）更好。 
所示的数据说明包含癸酸钠作为唯一脂肪酸，并含有甘露醇和崩解剂，羟基乙酸淀粉钠的片剂在固体剂型的进一步发展中用于临床研究。数据还说明胰岛素水平在口服给药在选择的原型癸酸盐片剂形式（癸酸钠为150mg或286mg）中的IN105后稳定地达到峰值，其中典型的Tmax为在给药后约20分钟，和在两个剂量中，Cmax为约59.0±20.1和62.9±25.4μ单位/mL。在每次给药后，所述的血浆胰岛素水平保持升高接近于Cmax水平10-15分钟，并且在整个120分钟内都超 过基础水平。利用这些片剂的需要维持血糖恒定的GIR在两个剂量都在约30至40分钟时达到Tmax，并且GIR的Cmax达到平均8.4±1.99和7.41±2.18mg/kg/分钟。所述的片剂剂型比所述优化的液体制剂需要较高的GIR Cmax（7.4-8.4对4.5-5.4）和需要较长的葡萄糖灌注时间（100-120分钟对60-90分钟）才能维持血糖恒定。 
与历史性SQ和吸入胰岛素的动脉血浆胰岛素水平相比，这些原型片剂明显提供类似于SQ和吸入给药的最大胰岛素水平，并且其胰岛素曲线相似于吸入胰岛素的胰岛素曲线（图34-37）。 
所述的原型片剂实验说明所选择的原型片剂适合作为固体剂型用于进一步的105未来发展的评价，以聚焦到产生可利用片剂压具生产的临床制剂。 
本说明书被分成章节，其目的仅是用于更容易地参考。章节和标题不意于限制本发明的范围。这里所描述的实施例的目的是用来举例说明本发明的许多方面和特点，而不意于限制本发明的范围。 

Claims (12)

1.固体或液体药物组合物，其被配制成用于通过摄食而口服给药的制剂，其包含：
（a）约40至约60w/v%的脂肪酸组分，其中所述的脂肪酸组分包含饱和或不饱和的C4-12的脂肪酸和/或这些脂肪酸的盐；
（b）治疗剂，其中所述治疗剂为共轭的蛋白质或肽、酰化的蛋白质或肽、或PEG基化的蛋白质或肽，其中所述的蛋白质或肽是胰岛素或胰岛素类似物。
2.权利要求1的药物组合物，其还包含至少一种选自以下的组分：粘合剂、崩解剂、填充剂、稀释剂、润滑剂、助流剂、流动性增强剂、压缩助剂、着色剂、甜味剂、防腐剂、悬浮剂、分散剂、成膜剂、涂料、调味剂、印刷墨水、纤维素、糖类、甘露醇、乳糖、溶出增强剂和crosscarmaloses。
3.权利要求1的药物组合物，其被制成选自片剂、小片剂、粉剂、硬胶胶囊或软胶胶囊的剂型。
4.权利要求1的药物组合物，其中所述脂肪酸组分为癸酸和/或月桂酸，和/或癸酸和/或月桂酸的盐。
5.权利要求1的药物组合物，其包含选自磷酸盐缓冲盐、磷酸钠、三羟甲氨基甲烷缓冲盐、柠檬酸缓冲盐和乙醇氨缓冲盐的缓冲盐。
6.权利要求5的药物组合物，其包含的缓冲盐被选择以获得在吸收位点的缓冲能力保持局部pH为约4.8至约9.5、或约5至约8。
7.权利要求1的药物组合物，其中所述共轭物包含在A1、B1和/或B29处结合到具有如下结构的改性部分的人胰岛素：
Figure FDA00002516425000021
其中PAG为具有m个子单元的PAG部分，并且m为1-20和n为1-20；
Figure FDA00002516425000022
8.权利要求1的药物组合物，其中所述的胰岛素共轭物在A1、B1和/或B29处结合到具有2至15个PEG或2至10个PEG子单元的直链或支链PEG部分。
9.权利要求8的药物组合物，其被制备成选自半固体、悬浮液、微乳和乳液的制剂。
10.权利要求1的药物组合物，其中所述脂肪酸组分为癸酸和/或月桂酸的盐。
11.权利要求1的药物组合物，其包含选自磷酸盐缓冲盐、磷酸钠、三羟甲氨基甲烷缓冲盐、柠檬酸缓冲盐、乙醇氨缓冲盐和三乙胺缓冲盐的缓冲盐。
12.权利要求7的药物组合物，其还包含至少一种选自以下的组分：粘合剂、崩解剂、填充剂、稀释剂、润滑剂、助流剂、流动性增强剂、压缩助剂、着色剂、甜味剂、防腐剂、悬浮剂、分散剂、成膜剂、涂料、调味剂、印刷墨水、纤维素、糖类、甘露醇、乳糖、溶出增强剂和crosscarmaloses。
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