CN1032471C - 稳定的血红蛋白的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本说明书描述了一种由以其紧密(T)构象存在并均一地稳定化的脱氧血红蛋白单体或多聚体制取氧亲合力与人血液相似之血液代用品(以下称为“HemoSafe”)的方法，分别由动物血红蛋白和人血红蛋白制得两类HemoSafe。两种类型的HemoSafe均可依下述方法制得：即将稳定化的脱氧血红蛋白转化为其一氧化碳衍生物(CO-HemoSafe)，然后便可稳定地耐受巴氏消毒条件以使之不能传播病毒性疾病。此外，一种用于治疗氰化物中毒的可输注的正缺血红蛋白衍生物是将氧合HemoSafe转化为正铁HemoSafe而得到的。

Description

稳定的血红蛋白的制备方法
本发明总地涉及呈独特之构象状态之生物大分子的稳定作用，以及其相关活性和功能在生物医学和生物工艺学方面的应用。特别是涉及对任一种天然构象〔紧密Hb(T)或松弛Hb(R)〕之血红蛋白(Hb)进行稳定化和/或交联处理以防止解离並获得所要求的配基结合亲合力。业已发展了制备新的动物血红蛋白、人血红蛋白及用于代替红血细胞运送氧功能的遗传工程化血红蛋白基代用品，或用于治疗氰化物中毒的“血液代用品”及使氧合血红蛋白衍生物转化为正铁血红蛋白的方法及试剂。
在输液时使用血液受到严格的限制。这些限制主要是由红血细胞(RBC)的天然特性及传播疾病的危险而导致的。
临床输液中的一个主要问题在于血液和血液制品传播病毒性疾病。筛选並检验病毒感染的血液花费很大，而且也不是完全有效的。在工业生产规模上，消除由血液衍生的药品中之病毒感染的可行方法是湿热巴氏消毒法。然而RBC却是不能经受巴氏消毒的。
输血中使用全血的其他限制因素包括严格的储存要求、很短的储存期限以及RBC的复杂免疫学特性。为此，已就通过对无基质血红蛋白的化学修饰来发展无细胞血红蛋白基血液代用品进行了广泛研究。
众所周知，天然血红蛋白包含一由四个亚基构成的四聚体，而每个亚单位均由两条α链和两条β链构成。四聚体的分子量约为64千道尔顿，而每个亚单位则各有大致相同的分子量。在稀溶液中，四聚体血红蛋白很容易解离成具有半数分子置的αβ二聚体。这些二聚体的相对低的分子量表现在它们很容易经肾脏由循环血中滤出並在尿中丢失。这样便导致一不可接受的很短的半寿期(约2—3小时)。
再者，没有红细胞膜保护的血红蛋白将丢失其天然配基二磷酸甘油酯(DPG)。DPG在正常情况下可降低血红蛋白的氧亲合力，因此当其丢失后，可溶性血红蛋白将更紧密地与氧结合，而不能象红血细胞那样有效地向组织内释放氧。基于这些原因，无基质血红蛋白便不适于作为血液代用品使用。
过去已通过将5′磷酸吡啶醛(PLP)等DPD类似物连接到呈脱氧态的Hb(T)上，而产生具有接近RBC之较低氧亲合力的PLP—Hb这一事实证实了这些缺点。据此，Greenburg(Creenburg等，Surgery，Vol.86(1979)，pp13—16)试图使用有生理氧亲合力的PLP—Hb作为血液代用品，但因为没有分子内交联的PLP—Hb(如SFH)，故其仍被解离成半分子而很快由肾脏排出。此外，Hsia及其同事(MCGarrity等，Journal of Chromatography，Vol。419(1987)，pp37—50)的研究结果表明，PLP—Hb是一种经修饰的血红蛋白的混合物，每摩尔血红蛋白含有0至6摩尔的PLP，而且每个亚种都具有不同的氧亲合力。
有证据表明DPG类似物可在分子内与Hb交联。这些交联剂均可特异地结合到人血红蛋白的DPG结合位点上。它们包括对β亚单位(Benesch等，Biochem.Biophys.Res.Commun.Vol.63，No.4(1975)，pp1123—1129；Benesch等，Methods in Enzymology，Vol.76，Hemoglobins(1981)pp147—159，Academic Press)或α亚单位(Chatterjee等，Journal of Biol.Chem.Vol.261，July25，1986，pp9929—9937)特异的试剂。
借助这些特异性配基进行交联，一般得率都较低(＜70％)，而且还需要进一步提纯产品。同时已将活化的三磷酸核苷酸用于交联血红蛋白並占据DPG结合位点，产生比PLP—Hb有更低氧亲合力並有更长血浆保留时间的ATP—Hb(Greenburg等，Progress in Clinical and Biological Research，Vol.122，Advances in Blood SubstituteResearch(1983)，pp9—17，Alan R。Liss，New York；Mc Garrity等，Journal of Chromatogr-aphy，Vol.415(1987)，pp136—142)。当取代80—90％血液时，ATP—Hb将外渗到胸膜和腹膜间隙中，所以将期于高水平血液置换时也是不安全的。
有人推荐使用非特异性交联剂〔如戊二醛(GA))以形成PLP—Hb分子内交联(聚合)来延长血浆保留时间(Bonbard等，美国专利4136093号，申请日1979年1月23日)。所得聚合的PLP—Hb(14gHb/dl)具有生理性携氧能力(高达20CCO2/dl)和等渗透压。但这种聚合是不完全的，而且其各组分具有不均一的氧亲合力。
为延长血浆半寿期所试图采用的其他方法包括使PLP与聚乙二醇(Iwasaki等，Artificial Organs，Vol.10，No.5(1986)，pp411—416)、旋覆花粉(Iwasaki等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，Vol.113，No.2(1983)，pp513—518)相连接，以及使Hb与右旋糖酐连接(Tam等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，Vol.73(1976)，pp2128—2131)。但这些方法同样表现有产品不均一性及高氧亲合力等缺点。
现有技术文献中已描述了使用各种二价交联剂聚合Hb，产生多聚Hb以用作血液代用品的方法。这种方法的缺点是聚合过度(90％产物的大小超过150千道尔顿)、可变的氧亲合力、复杂的反应流程、以及所用交联剂的生物不相容性〔如使用二乙烯基砜(一种可能的致癌物)作交联剂——见美国专利4001300号、4001401号、4053590号)。在这之后，又使用了一系列此类二价交联剂生产分子内交联的Hb。另外，已显示使用二乙烯基砜所得产品也具有可变的氧亲合力及非特异的组成(见美国专利4061736号)。
本发明的一个目的是提供新的血液代用品及其制备方法。
本发明的另一个目的是提供稳定的和经过巴氏消毒法消毒的血红蛋白，其在输液治疗中可用作治疗剂，所说的巴氏消毒法可使血红蛋白基本上没有可传播的感染因子。
本发明的再一个目的是利用交联剂和相应加工工艺，借以使血红蛋白成为按其天然分子构象(紧密的(T)或松弛的(R))产生分子内交联的，这样在交联产物中保留了构象，所得产物便可以说是构象上稳定的。这种构象稳定作用可总地适用于生物大分子。
本发明是基于一种以其四聚体形式稳定血红蛋白的新方法，其不仅可稳定血红蛋白四聚体使之不能解离成二聚体或单体，而且能使之稳定于Hb的天然构象，即脱氧血红蛋白在正常情况下所呈现的紧密构象(T)或氧合血红蛋白在正常情况下所呈现的松弛构象(R)。与使用DPG类似物来稳定和交联Hb(T)的方法不同，本发明的产品是借助各亚单位之珠蛋白链之间的共价化学连接，而产生抗解离及构象改变的稳定化作用的。无论最初四聚体血红蛋白的构象是T或R，本发明的稳定化产品均可保持这种构象。
Hb在两种构象之间转变的能力是由希尔(Hill)系数(n)表达的。系数为2或大于2表明亚单位之间通过构象改变产生协同的氧结合，而系数接近1时则表明Hb被固定于T或R构象。希尔系数接近1—1.5，表示完全稳定及在氧结合上缺乏协同性，这是本发明所独具的特征。
本发明优于现有技术的另一特征是在现有技术中是通过在亚单位的特定位点上连接亚单位的珠蛋白链以形成血红蛋白四聚体来实现血红蛋白的稳定化。这些得以稳定的产品仅仅是由于阻止四聚体单位解离成二聚体亚单位，即保持对氧的协同结合(希尔系数n约等于3)。相对地以本发明的方法稳定四聚体血红蛋白则不仅可阻止解离，而且可防止构象改变，即没有协同的氧结合作用(希尔系数n＝1～1.5)。这种构象稳定性是本发明的产品所独具的特征。
本发明的构象上稳定的四聚体血红蛋白显示了许多重要的优点。例如，其被稳定在T构象，並且在溶液中仍维持这一构象，从而赋予产品以相近于天然红血细胞的氧亲合力。因此就其在肺内的摄氧能力来说，本发明的产品基本上与红血细胞相当。另一个重要特性是它们向组织内释放氧的能力。基于对身体组织中氧分压的检测实验，证明本发明的T构象稳定的产品能比变构协同的、非构象上稳定化的血红蛋白产品释放出更多量的氧。例如在意外医学中迂到的对组织损伤病人进行输液时，这种对组织的高氧释放能力显得尤为重要。
本发明与现有技术的一个明显对照是，本发明的稳定化血红蛋白(HemoSafeI)很容易在一单一的反应步骤中以高产率(至少95％)制得，而且基本上没有残留未稳定化的血红蛋白。该产品无须进一步纯化，这样溶液中所形成的低分子量二聚产物的百分比就很小，以致也就不需要除去残留的未反应的物质。所以，该构象上稳定化的单体Hb(下文中有时称为HemoSafeI)的血浆半寿期约为无基质血红蛋白的三倍，並因此能适于用作意外情况下的血液代用品。此外，该稳定Hb(T)特别适用于制备其他新型血红蛋白基产品。Hb(T)可以相互联接在一起形成聚合的血红蛋白(Poly Hb(T)或HemoSafeII)作为血液代用品使用，並且在大多数情况下因其增大了分子量而优选如此稳定化的四聚产品，以提供更长的血浆半寿期。亦可将其共价连接到第二生物聚合物上形成结合物(Hemo-Safe I—结合物)，用作血液代用品。在所有这些转化中，血红蛋白四聚物保持了它们的特殊构象(如Hb(T))。为延长储存期可将产品冻干后储存。
再者，具有重要实践意义的是，发现本发明的含构象上稳定化血红素的四聚物可经处理以避免二价铁氧化成三价铁，如在一氧化碳或氧化氮等氧置换剂，或连二亚硫酸钠等氧清除剂存在下进行处理，然后再经巴氏消毒以破坏所有污染的病毒。本发明的产品足可以经受温度达60℃时间至少10小时的巴氏消毒法消毒，而没有蛋白质的变性或产物的分解。该方法可对四聚物如CO—HemoSafeI、聚合产品如CO—HemoSafeII及结合的产品CO—HemoSafeI结合物进行巴氏消毒。然后即可很容易地将这些CO-HemoSafe重新转化为氧合HemoSafe，以用作血液代用品进行输液治疗，而所有这些均没有失去其构象的功能和结构完整性。
此外，无论是有或没有聚合或结合的产物，均可氧化成正铁血红蛋白(即正铁HemoSafes)，以用作有效的氰化物清除剂及用于相应的预防目的。
因此，从广义上说，本发明提供了一种主要由四聚的血红蛋白单位组成的血红蛋白产品，所说的单位经稳定化而不能在制成其水溶液后解离成二聚物，且经稳定化而不能在T构象和R构象之间发生构象改变，所说的四聚单位则依靠其亚单位的珠蛋白链之间的共价化学键来达到稳定化。
在制备本发明的产品中，已发展了稳定脱氧Hb(Hb(T))之均匀组成、以及使之在冷冻或温度高达60℃条件下不失去稳定性的试剂、反应条件和方法，从而可以对终产品进行巴氏消毒、冻干，並使之具有均匀的生理性氧亲合力。
构象特异性稳定剂和交联剂(CSSC)：
依据本发明，使四聚血红蛋白单位达到预期的构象和分子内稳定化的优选方法是与一种或多种称为构象特异性稳定剂及交联剂(CSSC)的试剂进行反应。其中最常用的是二醛或多醛类试剂。它们与珠蛋白链上的伯氨基基团反应形成西夫碱键，然后被还原成仲胺键。在四聚血红蛋白分子中，α链和β链上有适当定位的仲胺基团，其将优先发生反应，並为稳定化之趋向和目的而选择性地与二醛及多醛反应，以形成预期的共价键合。
当在适宜条件下使用时，本发明中用作CSSC的二醛的一个例子是戊二醛(GA)。此前已报导过血红蛋白与GA的反应。但这些已有方法都不能从根本上完成四聚单位稳定化、而且不能在导致产物主要由稳定化四聚物组成的条件下进行反应。过去使用的戊二醛是一种非特异性试剂，其引起四聚物分子间共价联接形成聚合血红蛋白的速度，要比在其亚单位间形成分子内联接以使之稳定的速度快。结果产生一种各组分分别具有其不同氧亲合力的稳定化四聚物、不稳定四聚物以及有广泛分子量分布的稳定化聚合物的混合物。
本发明中，血红蛋白与GA的反应使用了低浓度血红蛋白(即1—4g/dl)，且GA对血红蛋白有一高摩尔比(即约6∶1至约60∶1)。在这些条件下，聚合的血红蛋白中，至少有95％，通常至少有98％呈四聚形式的Hb单位达到稳定化。从而得到一种构象上基本完全稳定的和聚合的产品。然后可使稳定的聚合体成为一氧化碳化的，以便进行巴氏消毒。
如果将动物血红蛋白基血液代用品用于人体，因具有抗原性，所以应阻止寡聚体或多聚体的形成。
在用GA使Hb固定于单体形式(Hb(T))的过程中存在着很强的聚合倾向。因此，本发明的一个优选实施方案使用了不同的CSSC试剂和稳定血红蛋白(Hb)的反应条件。使用这些CSSC化合物，可以完成Hb单体的稳定化，尽可能减少二聚物的形成(＜5％)並测不到多聚物，而且必要时可将不同的CSSC化合物普遍用于稳定有选择构象的大分子，以尽可能地减少聚合作用。这类CSSC化合物可通过使大分子稳定于独特的构象状态，以维持生物大分子的活性和功能。使用CSSC化合物还可以从容地操纵反应条件，以使大分子相互联接(聚合)，或者使之结合到不同的大分子如旋覆花粉分子上。特别是，在使用呈紧密(T)构象的脱氧血红蛋白(Hb(T))並用这样一种CSSC化合物作联接剂时，可根据需要来控制反应条件，使稳定的Hb(T)单体发生聚合，以及使稳定的Hb(T)与不同的大分子联接。亦可根据反应条件，用这些CSSC化合物稳定並聚合血红蛋白衍生物(如PLP—Hb)，並使这些衍生物连接到不同的大分子上。
一般用于本发明的CSSC化合物是二醛或多醛。其中一个特殊例子是化学式为HOC—COH的乙二醛。其他具体例子有苯二醛(邻、间及对位)，但因为存在残留芳香基团而有引起免疫原性反应的危险，故很少选用芳香族交联剂。作为CSSC化合物，最好选用通过单糖或寡糖的氧化开环反应所产生的醛类产物。如使用已知的高碘酸盐氧化。该反应可产生一种对于寡糖上每个糖单体来说具有两个醛基的产物。据此，例如可由棉子糖(O—棉子糖)或麦芽三糖(O—麦芽三糖)衍生出6个醛基。在同系物系列中，为使亚单位的稳定化达到使用二价醛(如葡萄糖)时所能达到的同样程度，所需多醛交联剂的摩尔当量数是与CSSC的价数成反比的。与GA相反，O—棉子糖是分子内交联特异的，为此在制备非聚合物Hb(T)时所用O—棉子糖对Hb的摩尔比例可以高些(20∶1)。这一发现证明，CSSC能使Hb单体有效地稳定于特定构象並可尽量减少分子间交联的机会。这样即可通过减缓聚合过程而更有效地控制反应，並更易于生产出基本上没有聚合物的稳定化的Hb产品。
有用的CSSC化合物包括一系列用高碘酸盐氧化葡萄糖、旋覆花粉、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽五糖、麦芽六糖及芽麦七糖所得到同系物。一般说来，由糖的开环氧化所制得的CSSC化合物均具有下列相应结构通式：
Figure C8810359600131
其中R、R1、R2、R3、R4和R5独自地选自于氢、羟基、甲氧基或羟甲基；m是0或1，Q是从二糖或有高达36个糖部分的寡糖经氧化开环反应而得到的化学基团。
当起始化合物是棉子糖(一种三糖)时，CSSC氧化产物具有下列结构式：
Figure C8810359600132
当起始化合物是旋覆花粉(一种多糖)时，CSSC氧化产物具有下列结构式：
Figure C8810359600141
n约等于35
可见，本发明中所使用的交联剂完全不同于常规用于现有技术中稳定和交联Hb使之处于四聚形式的DPG类似物。它们没有如磷酸根、羧酸根等带负电的基团，而且也不知道可与Hb的DPG位点产生特异性反应。为此，它们能够影响人及家畜之Hb的构象稳定，以使每个Hb整体维持在能与交联剂相迂和反应的构象中。最好使用水溶性交联剂，以使反应易于进行。
醛对血红蛋白的相对量最好是使醛基团对血红蛋白的摩尔比至少为12∶1，尤其是至少60∶1。因此，在使用多醛时，处理同样量血红蛋白所需的多醛量要比使用二醛时少些。摩尔比的计量是基于血红蛋白大约有50个伯胺基团这一推测。因为本发明中的珠蛋白链连接反应並不一定是位点特异的，所以可使用过量的醛(如O—棉子糖，可用5—30的摩尔比例，更好是20∶1)，从而得到高产率(至少95％)的稳定化产品。现有技术中须使用基本上是化学计算量的试剂进行位点特异性反应，结果致使产率降低。反应适于在水溶液中、于4°至37℃下且最好于室温条件下进行。应用适当缓冲液将反应混合物的pH控制在6.7～9.5之间，最好控制在8.0。
当使用GA作交联剂以制备poly Hb(T)时，应使溶液中Hb的浓度低于5～7g/dL，以便对反应进行必要的控制。但对于其他CSSC产物来说，可使用较大的Hb浓度范围，如1～20g/dL，最好是3～4g/dL，从而使这些交联剂参与的反应更易于控制。
当由红血细胞制取无基质血红蛋白时，所得血红蛋白浓度约为3—4g/dL。使用这样的血红蛋白溶液不需要稀释或浓缩，因此是很方便的。最适浓度取决于所选择的醛。可见，与二价GA相比较，这些新的CSSC的优点是不仅可同等地应用于生产无聚合物人Hb衍生物或无聚合物动物Hb衍生物，而且使用新的CSSC如O—棉子糖可防止poly Hb形成，以使动物Hb衍生的HemaSafe产品能在人体使用。
稳定化血红蛋白
在制备本发明之构象上稳定化和交联的脱氧Hb(XL—Hb(T))时，可在适当时间加入还原或抑制剂，以便在形成二聚物、三聚物、四聚物或更高聚合物的分子间交联开始之前，终止分子内交联反应。伯胺基团与CSSC的醛基团反应形成西夫碱键。加入硼氢化钠或钾或类似物，以将西夫碱键还原为仲胺键，同时将过量醛基团还原为伯醇，从而抑制了进一步的交联。可根据对反应混合物样品的高压液相层析(HPLLC)分析来确定还原的适宜时间。
可依照标准技术回收和纯化构象上稳定了的四聚Hb产物。可将其洗涤並用滤膜过滤法浓缩后，重新在生理盐水中配制，以便在紧急情况下(此时其在血管系统中只要有相对短的半寿期便是可以接受的)作为血液代用品使用。此外亦可将其用作制备本发明其他产品的原料。
聚合的稳定化血红蛋白
这类其他产品之一是聚合的Hb(HemoSafeII)，其中构象上稳定的和解离上稳定的四聚血红蛋白(HemoSafeI)分子间相互联接而形成聚合的Hb，其分子量最好是在血红蛋白浓度为14g/dL时能产生等(胶体)渗透压。可使用二醛或多醛来完成聚合作用，所说的醛可以是与提供构象稳定性者相同或不同的。按现有技术，如使用戊二醛制备的多聚(Hb)产品，因其不是由HemoSafeI制得的，所以缺乏本发明产品的基本上完全的构象稳定性。
根据本发明的聚合产品可含有彼此有不同分子量(聚合物中单位数)的各种聚合产物的混合物。但所有这种聚合产物均在构象上稳定于T构象，並都具有相同的或大致相同的氧亲合力。因此，本发明的聚合产物较之现有技术中的产品，具有氧亲合力均—及容易再现组成等优点。
产生聚合物的适当条件是在水溶液中于室温下进行反应，並且在任何情况下反应温度都不超过37℃。醛对血红蛋白的比例为2比100(基于每摩尔Hb所占有的醛基团摩尔数)。反应溶液的pH应缓冲在6.7—9.5范围内，最好是8.0。可向其中加入硼氢化钠或氰基硼氢化钠等还原剂来终止反应，以还原残留的醛基团，並使西夫碱转化为稳定的共价碳一氮键。
本发明之特别优选的聚合产物组合物分子量分布为：含有5个或5个以上四聚血红蛋白单体单位的聚合物组分占20—25％，有2—4个血红蛋白单体单位的聚合物组分占50—60％，有单个血红蛋白单位的组分(分子量约64千道尔顿)占20—25％，並且有1～2％是未完全稳定化的血红蛋白。这样一个组合物在浓度为14g/dL时为等渗的，因此其可作为血液代用品与血液以等体积混合使用，而不会引起血压问题。
稳定化血红蛋白结合物
另一类产品是“结合的HemoSafeI”，其中构象上稳定化的和解离上稳定化的血红蛋白(HemoSafeI)共价结合到生物大分子上，以形成有预期之高分子量的产物。血红蛋白与生物高聚物(旋覆花粉、葡聚糖、羟乙基淀粉等)的结合物是现有技术中已知的。在本发明中，虽然采用了现有技术中连接到血红蛋白上的同样的生物高聚物及相似方法，但血红蛋白在结合物中保持了其构象稳定性，並伴有上面讨论过的优点。
作为制备本发明之结合物的高聚物，其中优选的是旋覆花粉。其为一种是已知用于诊断的、分子量约为5,000的多糖。
巴氏消毒法消毒的产品
虽然现有技术中已述及稳定、聚合和连接的方法，但当大分子受到加热、干燥或冷冻处理时，这些方法並不能防止大分子变性，而且不能防止血红素氧化。依据本发明，现已发现含有血红素的大分子，当首先被稳定化，然后再按上述方法聚合或连接时，可使用氧置换剂或清除剂以使之免于遭受热氧化，或者最好与一氧化碳或氧化氮反应，形成保护血红素的复合物，例如，以这种方式形成一氧化碳—血红素衍生物，以使之在没有变性的情况下经受巴氏消毒法消毒和冷冻干燥。
特别是，向使用GA或CSSC产物制得的新的、稳定化的血红蛋白内加入CO，可产生本文中有时称之为CO—HemoSafe(S)的新颖产品。为此目的，可在没有从反应混合物中分离出血红蛋白时向其中加入CO。在已经稳定化的血红蛋白中，CO对血红素的保护作用及防止变构作用一起使CO—HemoSafe免于在加热和冻干条件下发生氧化和变性。现有技术中並没有述及对HemoSafeI、HemoSafeII、HemoSafeI—旋覆花粉或其他血红蛋白基血液代用品进行一氧化碳化处理及巴氏消毒的方法。
对血红蛋白衍生物进行巴氏消毒(如于60℃湿热消毒10分钟)和冻干(冷冻干燥)时，如不加适当的保护剂，则可使之沉淀和变性。用CO来保护本发明独特地稳定化之血红蛋白中的血红素，便可成功地完成产品CO—HemoSafe的加热及冷冻干燥。经巴氏消毒后即得到一种可溶性的、未变性的、並且不能传播病毒性疾病的CO—HemoSafe。经过成功地冻干则得到干燥的CO—HemoSafe产品。液体和干的CO—HemoSafe产品均可在任何合理温度下长期稳定地储存(如于56℃储存60天)。CO—HemoSafe是稳定的，但不释放氧。因此在用于输液时，可于氧存在下用光处理，使CO—HemoSafe溶液转化为氧合HemoSafe溶液。本发明的另一特征是在输液前将CO—HemoSafe经光转化变为氧合HemoSafe。
为了失活95％的所谓HTLV—III/LAV或HIV—I病毒，用于本方法之最初步骤的CA浓度(即5mM)要比现有技术中报导的浓度(1mM)高。但以巴氏消毒法消毒(即于60℃加热10小时)即可确保病毒传染的安全性，这一方法可达到消毒血浆衍生之医药产品如白蛋白所要求的标准。如果将依上述方法制得的稳定化的氧合Hb(T)于60℃消毒10小时，则会形成一种棕色沉淀物(即变性的正铁Hb(T))而不宜进一步使用。然而，如果将稳定的Hb(T)转化成它的一氧化碳衍生物(CO—HemoSafeI(T))，即可使之耐受巴氏消毒法消毒，並可在25°或60℃溶液中储存长达60天，而不会出现可测知的生理学性质的改变，如可见光谱、氧亲合力(即P50)或组成(如由其HLPC图所证明的)改变。另外，可将CO—HemoSafeI(T)冷冻干燥並于25℃或56℃下储存60天，而不会出现可测知的上述生理学性质的改变。
可转输的产品
尽管CO—HemoSafe在整个制备、消毒和冷冻干燥过程中都是稳定的，但纯的CO—HemoSafe並不能结合或运送氧，也就不适用于氧的运输和输血治疗。在无菌条件下除去CO是将其用作血液代用品的先决条件。因此本发明特别强调了可经光的作用使CO—HemoSafe转化为加氧衍生物——氧合血红蛋白。为此可将氧供入溶液内，然而使溶液通过一透光管路以暴露于可见光下。CO—HemoSafe和氧合HemoSafe的吸收光谱为两者的定性和定量提供了一种简便手段。与已知的血液代用品如目前市售的poly PLP—Hb不同，HemoSafe具有其生理性和均匀的氧亲合力的优点。它的前体CO—HemoSafe，在巴氏消毒、冻干、光转化及于高至60℃的温度下储存时，均表现出良好的稳定性。为此，本发明提供了一种生产无病毒病传播的而且有效的血液代用品的方法。
此外，根据本发明，已发现借助一氧化碘化方法以提供稳定性，可施用于现有技术中述及的所有Hb基血液代用品。例如，已经证明依照本发明制得的poly PLP—Hb、ATP—Hb和polyATP—Hb的一氧化碳衍生物(分别是poly CO—PLP—Hb、CO—ATP—Hb和poly CO—ATP—Hb)都是很稳定的、可进行巴氏消毒、冷冻干燥並可光转化为其氧合衍生物的。据此，本发明包括了用以由血红蛋白基携氧再生液体中除掉致病性病毒，並改善其储存性质的一般性必要处理的方法。所以，葡聚糖—Hb、羟乙基淀粉Hb、聚乙二醇—Hb及双阿斯匹林交联的Hb等已有血红蛋白基血液代用品均可以依照本申请中所述的同样方法处理，以使之没有传播病毒性疾病的危险。
本发明HemoSafe的优选的实际生产方法可总结为：
(I)用等渗Nacl溶液稀释收集的全血並加到膜型过滤系统中；
(II)用切向流动膜过滤法将血浆与血液的细胞成分分离开；
(III)用等渗盐水洗涤红血细胞；
(IV)用低渗磷酸盐缓冲液溶解红血细胞；然后以切向流动过
    滤法使细胞碎片及其他颗粒物质与可溶性血红蛋白分开；
(V)使用真空或气体交换装置及还原剂将氧合Hb转化为脱
   氧Hb；
(VI)在单体或多聚体组合物或结合物中加入一种构象特异性
    稳定化交联剂以稳定脱氧Hb；
(VII)用一氧化碳从物理上稳定脱氧Hb，以产生CO—
HemoSafe；
(VIII)洗涤並浓缩CO—HemoSafe或加入适当的生理盐溶
      液以重建电解质平衡；
(IX)对CO—HemoSafe进行巴氏消毒；
(X)在氧存在下，使消毒过的CO—HemoSafe光转化成
   氧合HemoSafe；
(XI)无菌过滤氧合HemoSafe並包装以用于输液。
按照本发明的方法，一旦氧合HemoSafe成为可利用的，即可将其转化为正铁HemoSafe衍生物，用作解毒剂或预防氰化物中毒，如在化学防护中用于保护性输液。因此本发明说明，在制备了氧合HemoSafe后，即可用已知方法将其氧化成正铁HemoSafe，並将后者作为一种持续有效的和长期起作用的氰化物清除剂用于输液治疗。以静脉注射途径使用正铁HemoSafe，可避免因机体利用口服的亚硝酸盐以形成正铁Hb而造成时间延迟。亚硝酸盐也必然由已有的RBC氧合血红蛋白补充正铁Hb，这样使用正铁HemoSafe便不会危及已有的携氧能力。因此，使用正铁HemoSafe治疗氰化物中毒优于现有技术中所采用的方法。
输注氧合HemoSafe还可作为血液添加技术的一种替代方法。现有技术认为向病人体内输入红血细胞可提高其携氧能力，但由于红细胞带来的血液粘度问题而使这种增加被限制在10—15％。然而，使用氧合HemoSafe並结合使用已知的血浆去除技术，即可用氧合HemoSafe代替血浆，从理论上说可使携氧能力提高50％，而又不会改变血液的血球比率或流动特性。
虽然无意使本发明或其范围限制在任何理论、产品的结构或有关制备方法的机理问题上，但据信产物的构象稳定性及解离稳定性可能是起因于由CSSC完成的四聚血红蛋白中亚单位内的共价键合。这些键的稳定性足以防止其解离成二聚物，键的强度亦足以阻止其构象改变。无论结构上作怎样的解释，HemoSafe在其构象稳定性方面是独特的。
此外，本发明的范围不仅限于对血红蛋白的处理方法及血红蛋白产品。它亦可应用于其他能够以一种或多种构象存在的蛋白质。根据本发明用CSSC化合物处理这些蛋白质(无论是在溶液中或在生物膜内)，均将使蛋白质稳定保持与CSSC相遇情况下的构象。从理论上说，这种处理方法还可以稳定那些与稳定的构象有关的生物学活性，並使分子能够耐受巴氏消毒法消毒。因此，本发明对于包括生物活性肽在内的生物大分子具有广泛实用性，而这类大分子中有许多是只有处于特殊构象时才是有用的。
下列非限制性实施例将进一步阐明本发明，並给出了涉及实施例的各种附图：
附图说明
图1是按照下述实施例3生产的稳定化人脱氧血红蛋白的分析性凝胶渗透高压液相层析(HPLC)分布图，所用对照是SFH；
图2是实施例3和4之HemoSafe(T)产物的氧解离曲线；
图3显示实施例3和15之产物的吸收光谱；
图4是对实施例3、实施例9之产物及SFH的半寿期分析结果的图解说明；
图5是按照实施例9的方法所得产物的分析性凝胶渗透高压液相层析(HPLC)分布图。
实施例1
人和动物无基质血红蛋白的制备
由得自加拿大红十字会的陈血或包装的血细胞中制备人无基质血红蛋白。首先将全血以3,000rpm离心30分钟。然后用吸管吸出并弃去血浆和血沉棕黄层(buffy coat)。将沉淀的红细胞悬浮于等体积冰冷的生理盐水中洗涤三次。每次洗涤后，均经离心重新沉淀细胞並除去上清。
然后用4倍体积的5mM磷酸盐缓冲液(pH7.6)溶解洗过的红细胞，以破坏完整的细胞壁並游离出血红蛋白。为了除掉基质和膜碎片，以Pellicon Cassette系统(Millipore)，先用碳氟聚合物滤膜(HVLP，孔隙度0.5μm)然后用聚矾滤膜(截留分子量为100,000)过滤溶血产物。将滤液中的血红蛋白浓缩到14—20g/dl，然后在装有50平方英呎膜片夹(PT系列，截留分子量为30,000)的Pellicon Cassette系统上用10倍体积的PBS缓冲液(pH7.4)洗涤。通过一0.22μm Millipore滤膜过滤除菌並于4℃储存备用。
为制备动物血红蛋白，可使用制备人血红蛋白的同样方法，不同的是在制备大鼠血红蛋白时用20mM硼酸盐缓冲液(pH9.5)代替PBS缓冲液(pH7.4)，以提高血红蛋白的增溶作用。
实施例2
用作血红蛋白之CSSC的过碘酸盐氧化的棉子糖及其他糖的制备
将各200mg的葡萄糖、蔗糖、棉子糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖及其他糖溶解于6ml蒸馏水中。並分别用对每种糖有固定摩尔比的固态间位高碘酸钠于室温下处理(用于吡喃糖苷时每份糖对高碘酸钠的摩尔比为2.2，对于呋喃糖苷则为1.1)。一小时后，在冰水浴中冷却反应混合物，于强烈搅拌下加入亚硫酸氢钠，直到沉淀的碘重新溶解而产生无色溶液。然后立即加入6N NaOH将溶液的pH调到8.0±0.1。进一步稀释所得氧化的糖溶液至终浓度为20mg/ml，通过Millipore0.45μm GB型膜式滤器过滤后置于4℃下保存备用。
实施例3
用开环的棉子糖(O—棉子糖)制备构象上稳定並交联的人HemoSafeI(T)
制备分子内交联的脱氧血红蛋白(XL—Hb(T))：将350ml溶于0.1M磷酸盐缓冲液PH8.0中的(1％W/V)无基质氧合血红蛋白(Hb(R))的溶液于室温及真空下磁力搅拌约4小时，以使之转化为脱氧血红蛋白(Hb(T))。将0.3ml其中溶有0.1mM连二亚硫酸钠的脱气缓冲液加到血红蛋白溶液中並使之反应5分钟。将溶于预先脱气之缓冲液(pH8.0)中的1.08mM交联剂O—棉子糖于真空及剧烈搅拌下加到上述反应溶液中並于室温下搅拌4小时。在冰水浴中冷却反应混合物，並于正的惰性气体压力下，加入溶于5ml脱气之1mM NaOH的15.0mM硼氧化钠。使还原作用进行45分钟。
图1是得自5μg/100ml产物(实线)和对照样品人SFH(破折线)的HPLC分布图。图中标出了β珠蛋白半分子(峰a)和(αβ)2稳定的人Hb(T)(峰b)的分子量校正标记。所用的缓冲液是50mM磷酸盐和150mM Nacl(pH7.0)。层析图谱是在装有GP.250梯度程序仪、P500泵、482型记录仪和单光道UV监测仪(带有405nm滤光片)的PharmaciaHPLC系统上得到的。
该分布图显示95％以上的血红蛋白得以稳定化並交联，而只有不到5％的XL—Hb(T)解离成半分子。在同样的实验条件下，血红蛋白完全解离成半分子。
制备XL—Hb(T)的一氧化碳(CO)衍生物並以巴氏消毒法消毒：用硼氢化钠还原后，向XL—Hb(T)反应混合物内吹入CO。洗涤並用滤膜过滤法浓缩后，于大气压及100％CO环境下，将COXLHb(T)于60℃加热10小时进行巴氏消毒，得到CO—HemoSafeI。为在室温下长期储存，可将CO—HemoSafeI冻干成干粉末，当需要时再用缓冲液重新配制。
将CO—HemoSafeI(T)光转化为氧合HemoSafeI(T)：取15ml CO—HemoSafeI(T)置于500ml园底烧瓶中，该烧瓶接于一旋转蒸发器上並在—CGF Booder灯(C250R40/1，内部磨砂，软质玻璃)下于0℃冰水浴中连续旋转。用吸气器和真空泵抽空烧瓶以除去未结合的CO，2分钟后充入空气或100％的氧气。重复上述循环操作，直到以分光光度法检测样品组分于577和560nm之间的吸光率达到吸光比率为1.8时，即可认为CO已完全除尽(Methods in Enzymology，Vol.76，Hemoglobin，pp60，pp164)。如图1所示，如此得到的终产物没有改变凝胶渗透层析组成。
图3显示了本实施例及其他实施例之产物于林格氏缓冲液(pH7.4)中22℃下测得的相对吸收光谱。图中实线是XL—Hb(T)(即一氧化碳化以前的)、破析线是氧合HemoSafe终产物的吸收光谱曲线。图3上的这些曲线表明终产物基本上没有改变物理—化学性质。
图2是本实施例中用O—棉子糖交联並稳定化了的HemoSafe(1)的氧解离曲线(破折线)，以及氧合血红蛋白或Hb(R)的氧解离曲线(实线)；其测定是于37℃在林格氏磷酸盐缓冲液(pH7.4)中进行的，血红蛋白浓度为3.5g/dL。这些都是这类产品的典型曲线。可由曲线上直接读出50％饱和(P50)时氧分压的值。
根据图2可见本实施例的HemoSafe(1)产物在37℃、PBS缓冲液(pH7.4)中呈现一双曲氧解离曲线，且P50值(P50是当50％血红蛋白处于氧合状态时的氧分压)为27mmHg。希尔(Hill)系数约为1—1.5。
图4给出了对包括本实施例之氧合HemoSafeI(T)终产物(破折线)在内的血红蛋白基血液代用品所作典型血浆半寿期研究的结果。测定是在30％血容量过多的大鼠模型身上进行的。产物的半寿期约4—5小时，而相对的血红蛋白(破折线)的半寿期则为大约1—1.5小时。
实施例4
用开环的棉子糖(O—棉子糖)制备构象上稳定並交联的人HemoSafeI(R)
使用实施例3中所述的制备HemoSafeI(T)的相似方法，不同的是反应于氧合状态及没有连二亚硫酸钠的条件下进行。
终产物显示为双曲的氧解离曲线，在37℃PBS缓冲液(pH7.4)中P50值为2—3mmHg(图2，实线)，而且其凝胶渗透层析组成和可见光谱与HemoSafeI(T)也没有区别。
实施例5
用乙二醛制备构象上稳定並交联的人HemoSafeI(T)
用乙二醛制备分子内交联的无基质脱氧血红蛋白：于磁力搅拌下，使溶于0.1M碳酸氢钠的2.9g人无基质血红蛋白(4％W/V)在真空下经大约2小时转化为脱氧血红蛋白。向其中加入2.58mM溶于7.5ml脱气之0.1M碳酸氢钠的交联剂乙二醛並于室温下将溶液搅拌2小时。在冰水浴中冷却反应混合物並于正的惰性气体压力下加入溶于3ml脱气之1mM NaOH的6mM硼氢化钠。使还原反应进行45分钟。其HPLC凝胶渗透分布图与图1所示者相似，显示有90％的血红蛋白是分子内稳定化了的。
乙二醛稳定化的CO—HemoSafeI(T)的制备、其巴氏消毒、冻干及向氧合HemoSafeI(T)的光转化均与实施例3所述方法相似。在有30％血容量过多置换之大鼠模型体内测得终产物的半寿期约为3.5小时。
实施例6
用开环的棉子糖(O—棉子糖)制备构象上稳定並交联的牛HemoSafeI(T)
制备分子内交联的牛脱氧血红蛋白：于室温、真空下经大约2小时，使磁力搅拌下溶于0.1M磷酸盐缓冲液(pH8.0)中(1％W/V)之90ml牛无基质氧合血红蛋白的溶液转化脱氧血红蛋白。向血红蛋白溶液内加入溶于0.3ml脱气缓冲液中的400μM连二亚硫酸钠，並使之反应5分钟。于真空下加入276μM溶于6ml预先脱气之缓冲液中的交联剂O—棉子糖並于室温下将溶液搅拌3小时。在冰水浴中冷却该反应混合物，並于正的惰性气体压力下加入3.5mM溶于2ml 1mMNaOH(脱气的)中的硼氢化钠。使还原反应进行45分钟。HPLC凝胶渗透层析分布图显示有90％以上的牛血红蛋白是分子内稳定化了的。交联的牛血红蛋白的层析图谱与图1所示者相似。
制备O—棉子糖稳定的牛CO—HemoSafeI(T)的方法、其巴氏消毒、冻干及光转化为氧合HemoSafeI(T)的方法与实施例3中所述者相似。
如此制得的终产物具有未改变的凝胶渗透层析谱组成及物理—化学性质。该产物具有双曲的氧解离曲线，在37℃PBS缓冲液(pH7.2)中测得的P50值为34mmHg，希尔系数约为1.5，並且在有30％血容量过多输注的大鼠身上所测得的血浆半寿期约为4小时。
实施例7
用开环的棉子糖(O—棉子糖)制备构象上稳定並交联的羊HemoSafeII(T)
制备分子内交联的羊脱氧血红蛋白：于室温、真空下，经2小时，使溶于0.1M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)的100ml羊元基质氧合血红蛋白的溶液(1％W/V)在磁力搅拌下转化为脱氧血红蛋白。向血红蛋白溶液内加入50μM溶于100μl脱气之缓冲液中的连二亚硫酸钠。5分钟后，于真空搅拌下加入616μM溶于12.5ml预脱气之缓冲液(pH8.0)的交联剂O—棉子糖。使交联反应于4℃下进行16小时。在冰水浴上冷却反应混合物並于正的惰性气体压力下加入4.4mM溶于2.5ml已脱气之1mMNaOH中的硼氢化钠。使还原反应进行45分钟。HPLC凝胶渗透层析分布图显示95％以上的羊血红蛋白半分子是分子内稳定化了的，此与图1所示结果相似。
制备O—棉子糖稳定化之羊CO—HemoSafeI(T)的方法、其巴氏消毒、冻干及经光转化变回氧合HemoSafeI(T)的方法与实施例3中所述者相似。
如此制得的终产物具有未改变的凝胶渗透层析谱组成和物理—化学性质。于37℃在PBS缓冲液(pH7.4)中测得其P50为38mmHg。
实施例8
用开环的棉子糖(O—棉子糖)制备构象上稳定並交联的大鼠HemoSafeI(T)
制备分子内交联的大鼠脱氧血红蛋白：
在磁力搅拌下溶于20mM硼酸盐缓冲液(pH9.5)中的18mL大鼠无基质氧合血红蛋白的溶液(2％W/V)于真空及室温条件下经大约1小时转化为脱氧血红蛋白。向血红蛋白溶液内加入溶于0.1ml脱气之缓冲液的50μM连二亚硫酸钠，並使之反应5分钟。于真空搅拌下，加入溶于3ml预脱气缓冲液(pH8.0)的110μM交联剂O—棉子糖。使交联反应于4℃下进行16小时。在冰水浴中冷却反应混合物並于正的惰性气体压力下加入溶于1ml之1m MNaOH的1.2mM硼氢化钠。使还原反应进行45分钟。HPLC凝胶渗透层析分布图显示90％以上的大鼠血红蛋白半分子是分子内稳定化了的，此与图1所示结果相似。
制备O—棉子糖稳定之大鼠CO—HemoSafeI(T)的方法、其巴氏消毒、冻干及经光转化变回氧合HemoSafeI(T)的方法均与实施例3中所述者相似。
所得终产物没有改变凝胶渗透层析组成及物理—化学性质。该产物于37℃下在PBS缓冲液(pH7.4)中测得的P50为24mmHg，希尔系数约等于1.0。
实施例9
用开环的棉子糖(O—棉子糖)制备构象上稳定化並聚合的人HemoSafeII
制备分子内稳定並且分子间交联的人脱氧血红蛋白：
使77ml在磁力搅拌下溶于0.1M磷酸盐缓冲液(pH8.0)之人氧合血红蛋白的溶液(4％W/V)于室温真空下经大约4小时转化为脱氧血红蛋白。向血红蛋白溶液内加入溶于0.3ml脱气之缓冲液的0.1mM连二亚硫酸钠並使之反应5分钟。于真空下加入0.95mM溶于20ml预脱气之缓冲液的交联剂O—棉子糖並使反应进行6小时。在冰水浴中冷却反应混合物並于正的惰性气体压力下加入9.5mM溶于4ml已说气之1mM NaOH的硼氢化钠。使还原作用进行45分钟。附图5的HPLC凝胶渗透层析分布图显示，有98％的血红蛋白是得以稳定化和交联的，其中20—25％是稳定的单体，50-60％是二聚、三聚和四聚体，20—25％是五聚或更高聚合物的混合物。
该层析分布图是使用绘制图1所示分布图的装置，以50mM磷酸盐及150mM Nacl(pH7)作缓冲液制得的。在预装入Superose-12的HR10/30柱上以0.4ml/分的流速，将polyHb(T)分离成单体(峰a)、二聚、三聚和四聚体的混合物(峰b)以及五聚体或更高聚合物(峰c)。这样一种聚合产物的组合物于浓度为14g/dL时是等渗的。
制备O—棉子糖稳定之CO—HemoSafeII(T)的方法、其巴氏消毒、冻干及经光转化重新形成氧合HemoSafeII(T)的方法均与实施例3中所述方法相似。
如此制得的终产物。在进行巴氏消毒之前后有未改变的凝胶渗透层析组成及物理—化学性质，具有双曲的氧解离曲线，在37℃下PBS缓冲液(pH7.2)中P50为32mmHg，希尔系数为1.6。分离並纯化的HemoSafeII(T)部分，即单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或更高级聚合物(见图5)的P50和希尔系数几乎没有区别，並且其在有30％血容量过多置换的大鼠体内测得的半寿期为7—8小时。
实施例10
用开环的蔗糖(O—蔗糖)制备构象上稳定化並聚合的人HemoSafeII
用O—蔗糖制备分子内稳定化並在分子间交联的人脱氧血红蛋白：于磁力搅拌下使溶于0。1M磷酸盐缓冲液(pH8.0)的10ml人无基质氧合血红蛋白(13％W/V)溶液，于真空下经大约2小时转化为脱氧血红蛋白。向该血红蛋白溶液内加入溶于0.2ml脱气之缓冲液中的40μM连二亚硫酸钠。5分钟后于真空下加入200μM溶于3ml预脱气之缓冲液中的交联剂O—蔗糖，並使反应进行6小时，在冰水浴中冷却反应混合物並于正的惰性气体压力下加入2.0mM溶于1ml预脱气之1mM NaOH中的硼氢化钠。使还原反应进行45分钟。HPLC凝胶渗透层析分布图显示98％以上的血红蛋白得以稳定化並交联，且其产物组成亦与实施例9中所述者相似(图5)。
制备O—蔗糖稳定化之CO—HemoSafeII(T)的方法、其巴氏消毒、冻干及经光转化重新变为氧合HemoSafeII(T)的方法与实施例3中所述者相似。
如此获得的终产物在进行巴氏消毒之前后均没有改变其凝胶渗透层析组成和物理—化学性质。于37℃在PBS缓冲液(pH7.2)中测得产物的P50为24mmHg，希尔系数为1.3；在30％血容量过多置换之大鼠体内测得产物的半寿期为7—8小时。
实施例11
用戊二醛制备构象上稳定化並聚合的人HemoSafeII(T)
用戊二醛制备分子内稳定化並在分子间交联的人脱氧血红蛋白：在磁力搅拌下使溶于0.1M磷酸盐缓冲液(pH8.0)的78ml人无基质氧合血红蛋白(4％W/V)的溶液，在室温、真空下经大约4小时转化为脱氧血红蛋白。向血红蛋白溶液内加入溶于0.3ml已脱气之缓冲液的0.1mM连二亚硫酸钠並使之反应5分钟。于真空下加入480μM溶于2.5ml预脱气缓冲液中的交联剂戊二醛，並使反应进行6小时。在冰水浴中冷却反应混合物並于正的惰性气体压力下加入4mM溶于4ml预脱气之1mM NaOH的硼氢化钠。使还原反应进行45分钟。HPLC凝胶渗透层析分布图显示98％以上的人血红蛋白得以稳定化並交联，且产物组成与实施例9中所述者相似。
制备戊二醛稳定化之CO—HemoSafeII(T)的方法，其巴氏消毒、冻干及光转化为氧合—HemoSafeII(T)的方法与实施例3所述者相似。
如此制得的终产物在巴氏消毒前后没有改变其凝胶渗透层析组成和物理—化学性质。于37℃在PBS缓冲液(pH7.4)中测定P50约为30mmHg，希尔系数为1.5，且在30％血容过多置换的大鼠体内测得产物半寿期为7—8小时。
实施例12
用开环棉子糖(O—棉子糖)制备构象上稳定化並聚合的牛HemoSafeII(T)
用O—棉子糖制备分子内稳定化且分子间交联的牛无基质氧合血红蛋白：在0.1M磷酸盐缓冲液(pH8.0)中，使40ml牛无基质氧合血红蛋白(6％W/V)的溶液在室温、真空下经磁力搅拌约4小时转化为脱氧血红蛋白。向血红蛋白溶液内加入80μM溶于0.2ml脱气缓冲液中的连二亚硫酸钠並使之反应5分钟。于真空下加入550μM溶于10ml预脱气之缓冲液中的交联剂O—棉子糖並使反应进行6小时。在冰水浴中冷却反应混合物並于正的惰性气体压力下加入3.5mM溶于4ml已脱气之1mM NaOH中的硼氢化钠。使还原反应进行45分钟。HPLC凝胶渗透层析分布图显示95％以上的牛血红蛋白半分子得以稳定化和交联，且产物组分也与实施例9中所述者相似。
O—棉子糖稳定化之牛Co—HemoSafeII(T)的制备、其巴氏消毒、冻干及光转化为氧合—HemoSafeII(T)的方法与实施例3中所述者相似。
如此得到的终产物在巴氏消毒前后没有改变其凝胶渗透层析组成及理化性质。于37℃在PBS缓冲液(pH7.4)测得产物的P50为28mmHg，希尔系数约1.5，且在有30％血容过多置换的大鼠体内测得半寿期为7—8小时。
实施例13
用开环的棉子糖(O—棉子糖)制备构象上稳定化並聚合的大鼠HemoSafeII(T)
制备分子内稳定化並且分子间交联的鼠脱氧血红蛋白：在20mM硼酸盐缓冲液(pH9.5)中，在室温真空下，将6ml浓度为9.4％W/V的鼠无基质氧合血红蛋白磁力搅拌约2小时，使之转化成脱氧血红蛋白。向血红蛋白溶液内加入20μM溶于100μl脱气之缓冲液中的连二亚硫酸钠，並使之反应5分钟。于真空下加入87μM溶于2ml预先脱气之缓冲液的交联剂O—棉子糖，並使反应于4℃下进行16小时，然后于室温下反应5小时。在冰水浴中冷却反应混合物，並于正的惰性气体压力下加入溶于10ml已脱气之1mM NaOH中的1.2mM硼氢化钠。使还原反应进行45分钟。HPLC凝胶渗透层析分布图表明98％以上的大鼠血红蛋白半分子已得以稳定化並交联，且产物组成亦与实施例9中所述者相似。
O—棉子糖稳定化之大鼠CO—HemoSafeII(T)的制备、其巴氏消毒、冻干及经光转化重新转变为氧合HemoSafeII(T)的方法与实施例3中所述者相似。
如此制得的终产物在进行巴氏消毒前后没有改变其凝胶渗透层析组成及理化性质。
实施例14
制备开环棉子糖构象上稳定了化的人HemoSafeI(T)—旋覆花粉结合物
制备分子内交联的人HemoSafeI(T)。其制备方法与实施例3所述方法相同。
制备高碘酸盐氧化的旋覆花粉(O—旋覆花粉)：开环旋覆花粉的制备方法与实施例2中所述方法相似。
制备HemoSafeI(T)一旋覆花粉结合物：将溶于0.1MNaHCO3中的35ml 4％(W/V)人氧合HemoSafeI(T)的溶液于室温真空下磁力搅拌约2小时，使之转化为脱氧HemoSafeI(T)。加入40μM溶于50μl脱气之缓冲液中的连二亚硫酸钠。5分钟后，于真空搅拌下加入溶于8.5ml预先脱气之0.1M NaHCO3中的等摩尔O—旋覆花粉。在冰水浴中冷却反应混合物，並于正的惰性气体压力下，加2.0mM溶于1.5ml已脱气之1mM NaOH中的硼氢化钠。使还原反应进行45分钟。HemoSafeI(T)—旋覆花粉结合物的HPLC凝胶渗透层析分布图及产物组成与图5所示者相似。棉子糖稳定化之人CO—HemoSafeI(T)—旋覆花粉结合物的制备、其巴氏消毒、冻干及经光转化变为人氧合HemoSafeI(T)—旋覆花粉的方法均与实施例3中所述者相似。
如此制得的终产物没有改变其凝胶渗透层析组成及理化性。于37℃在PBS缓冲液(pH7.2)中测得的产物的P50为27mmHg，希尔系数约为1.2，且在有30％血容量过多置换的大鼠体内测得产物的半寿期为7—8小时。
实施例15
制备O—棉子糖构象上稳定化了的人正铁—HemoSafeI(T)和(R)
按上述(实施例3)方法，使CO—HemoSafeI(T)和(R)分别经光转化为其氧合HemoSafe，然后再将氧合HemoSafe于37℃放置，使之转化为正铁—HemoSafe。根据吸收光谱定性分析(见图3破折线所示)，当正铁血红蛋白水平大于90％后即认为转化已完成。根据其产生相应氰基正铁血红蛋白吸收光谱(见图3中破折线一点线所示)的能力来判断其消除氰化物的效能。
实施例16
制备O—棉子糖构象上稳定化並聚合的人正铁HemoSafeII(T)和(R)
依照实施9所述的方法制备O—棉子糖构象上稳定化並聚合了的人HemoSafeII(T)和(R)。然后按实施例15所述方法使之分别转化为正铁HemoSafe。
实施例17
制备O—棉子糖构象上稳定化的人正铁HemoSafeI(T)—旋覆花粉结合物
按照实施例14的方法制备O—棉子糖构象上稳定化了的人HemoSafeI(T)一旋覆花粉结合物並按实施例15所述方法转化为正铁HemoSafe。
实施例18
棉子糖构象上稳定化並聚合的人HemoSafeII的病毒失活作用
按实施例9所述方法制备人HemoSafeII。所制得的含HemoSafeII的样品最多有104HIV单位，而且只有104HIV单位。在对照实验中，已证明溶液中存在之HemoSafeII的剂量不影响HIV—I的传染性。将这些样品于56℃湿热处理一周后，用抗原检测法检测样品的HIV传染性，结果表明所有样品均没有HIV传染性。

Claims (11)

1.一种制备血红蛋白产品的方法，该血红蛋白产品在其形成含水制品的基础上被稳定化以对抗解离成二聚体，以及被稳定化以阻止T-构象和R-象之间的构象转变，其特征在于使血红蛋白与多醛交联剂进行化学反应，以形成席夫碱与血红蛋白的珠蛋白链之间的键，接着将席夫碱键还原成仲氨基键。
2.根据权利要求1的方法，其进一步的特征在于该多醛交联剂是由糖类的氧化性开环产生的一种多醛。
3.根据权利要求1的方法，其进一步的特征在于该多醛交联剂是由低聚糖氧化性开环产生的一种多醛。
4.根据权利要求3的方法，其进一步的特征在于该多醛交联剂是由麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖和棉子糖中选出的一种低聚糖进行氧化性开环产生的一种多醛。
5.根据权利要求4的方法，其进一步的特征在于该多醛交联剂是由棉子糖氧化性开环产生的一种多醛。
6.根据权利要求4的方法，其进一步的特征在于该低聚糖的氧化性开环是由该糖与高碘酸反应来完成的。
7.根据权利要求1-6的任何一项权利要求的方法，其进一步的特征在于该血红蛋白是人血红蛋白。
8.根据权利要求1-6的任何一项权利要求的方去，其进一步的特征在于该血红蛋白与多醛交联剂的反应继续一段时间并且是在适于实现不同的血红蛋白的球蛋白链之间形成一些交联的条件下进行的，因而导致形成含有四聚的血红蛋白和多聚的血红蛋白混合物的一种交联的血红蛋白产物。
9.根据权利要求7的方法，其进一步的特征在于该血红蛋白与多醛交联剂的反应继续进行一段时间并且是在适于实现不同的血红蛋白的球蛋白链之间形成一些交联的条件下进行的，因而导致形成含有四聚的血红蛋白和多聚的血红蛋白混合物的一种交联的血红蛋白产品。
10.根据权利要求8的方法，其进一步的特征在于所产生的血红蛋白产品具有一种分子量分布，其中有20-25％组分血红蛋白单元是5个或较多一些的四聚的血红蛋白单元的聚合物，有50-60％组分血红蛋白单元是2-4个四聚的血红蛋白单元的聚合物，有20-25％组分血红蛋白单元是未聚合的四聚血红蛋单元。
11.根据权利要求9的方法，其进一步的特征在于所产生的血红蛋白产品具有一种分子量分布，其中有20-25％组分血红蛋白单元是5个或较多一些的四聚的血红蛋白单元的聚合物，有50-60％组分血红蛋白单元是2-4个四聚的血红蛋白单元的聚合物，有20-25％组分血红蛋白单元是未聚合的四聚血红蛋单元。
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