CN103328532A - 用于定向生物标志信号放大的新颖试剂 - Google Patents

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Abstract

在此说明的是涉及中性共轭聚合物的制造方法、组成以及物品，包括具有沿着聚合物主链结构的连接物以及末端帽化单元的中性水溶性共轭聚合物的合成方法。此类聚合物可以用于制造新颖的光电器件并且用于研发高效的生物传感器。本发明进一步涉及这些聚合物在测定方法中的应用。

Description

用于定向生物标志信号放大的新颖试剂
交叉引用
本申请要求2010年1月19日提交的美国临时申请序列号61/296,379和2010年6月24日提交的美国临时申请序列号61/358,406的权益，将这些申请通过引用结合在此。
发明背景
荧光杂交探针已经发展成为DNA和RNA的序列特异性检测中的一种重要的工具。由附加的荧光标记(或染料)产生的信号可以被实时检测并且为生物靶标和事件的检测提供简单、快速、以及稳健的方法。从微阵列和实时PCR到荧光原位杂交(FISH)中都看到了其应用。
在多发色团领域的近期工作，特别是关于共轭共聚物(CP)的研究，已经突出显示了这些材料显著改进此类方法的检测灵敏度方面的潜力(Liu和Bazan，Chem.Mater.[化学材料]，2004)。这些材料的集光结构可以做成水溶性的并且被适配为放大多种探针标记的荧光输出量(参见2003年6月20日提交的美国专利申请号10/600,286以及Gaylord，Heeger和Bazan，Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学协会公报]，2002，将这二者通过引用以其全文结合在此)。
这些结果显示CP在核酸诊断领域中很有应用前景，特别是在样本量少时。然而，已经存在扩增(或复制)核酸靶标(即，PCR)的方法。比较而言，在蛋白质识别领域中，并不存在扩增靶标物质的此类简单的方法。这样，CP应用导致的信号增强在这个领域中具有重要意义。
染料标记的抗体在免疫组织化学、蛋白质排列、ELISA测试、以及流式细胞分析等应用中常规地用于检测蛋白质靶标。将CP材料整合到这些方法学中允许在此类试验的性能方面提供显著的提升，能达到原先用常规荧光报告物(例如，染料)无法达到的检测水平。
在另外的信号之外，在生物检测形式中其他关键驱动因素之一是在同一试验或者多重化技术中检测多种分析物的能力。这通常是通过在不同的可分辨波长下操作而使用荧光报告物来实现的。CP材料理想地适合提供用于扩增型多重化技术的平台。这可以通过调整不同CP的结构以在不同波长下进行操作或者通过将一种染料结合在聚合物-生物分子共轭物内而实现的。
产生灵敏度更高的生物测验并提高多重化技术的材料和方法在分子(核酸)和免疫测定形式中均是高度希望的。
发明概述
在此提供了具有化学式(I)的水溶性共轭聚合物：
Figure BPA00001609256400021
其中：
每个R独立地是一种非离子侧基，该侧基能够提供超过10mg/mL的水中溶解度；
MU是一种聚合物改性单元或者带隙改性单元，该单元是沿着该聚合物主链均匀或者随机分布的并且任选地被一个或多个任选取代的取代基所取代，这些取代基是选自：卤素、羟基、C1-C12烷基、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基、C1-C12卤烷基、C1-C12烷氧基、C2-C18(杂)芳氧基、C2-C18(杂)芳氨基、(CH2)x′(OCH2CH2)y′OCH3，其中每个x′独立地是从0-20的整数、y′独立地是从0到50的整数，或者一个C2-C18(杂)芳基基团；
每个任选的连接物L1和L2是沿着该聚合物主链均匀地或随机分布的芳基或杂芳基并且被一个或多个侧链所取代，这些侧链以一个官能团封端而共轭至另一个基质、分子或生物分子上，该官能团是选自：胺、氨基甲酸酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇以及其被保护基团；
G1和G2各自独立地选自：氢、卤素、胺、氨基甲酸酯、羧酸、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、卤素取代的芳基、硼酸取代的芳基、硼酸酯取代的芳基、硼酸酯、硼酸、任选取代的芴、以及被一个或多个侧链取代的芳基或杂芳基，该侧链以一个选自以下各项的官能团封端：胺、氨基甲酸酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇及其被保护基团，用于共轭至另一个基质、分子或生物分子上；
其中该聚合物在G1、G2、L1、或L2内包括至少1个选自以下各项的官能团：胺、氨基甲酸酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、以及硫醇，用于功能性共轭至另一个分子、基质、或生物分子上；
每个虚线的键------独立地是单键、三键、或任选取代的亚乙烯基(-CR5＝CR5-)，其中每个R5独立地是：氢、氰基、C1-C12烷基、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基或C2-C18(杂)芳基基团，其中每个C1-C12烷基、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基或C2-C18(杂)芳基基团任选地被一个或多个卤素、羟基、C1-C12烷基、C2-C12链烯基、C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、或C1-C12卤烷基所取代，并且
n是从1至约10,000的整数；并且
a、b、c、和d限定了在该结构内每个单元的mol％，各个单元可以均匀地或随机地重复并且其中a是从10％到100％的mol％，b是从0到90％的mol％，并且c和d各自是从0到25％的mol％。
一方面，具有化学式(I)的水溶性共轭聚合物具有化学式(Ia)的结构：
Figure BPA00001609256400041
其中R、L1、L2、G1、G2、MU、a、b、c、d以及n是如前面对化学式(I)描述的。
在一些实施方案中，每个R独立地是(CH2)x(OCH2CH2)yOCH3(其中每个x独立地是从0-20的整数，每个y独立地从0-50的整数)，或者任选地被一个或多个卤素、羟基、C1-C12烷氧基或(OCH2CH2)zOCH3(其中z是独立地从0到50的整数)所取代的苄基。在一些例子中，每个R是(CH2)3(OCH2CH2)11OCH3。
在其他实施方案中，每个R是被至少一个(OCH2CH2)10OCH3基团取代的苄基。在一些例子中，该苄基是被两个(OCH2CH2)10OCH3基团所取代的。在其他例子中，该苄基是被三个(OCH2CH2)10OCH3基团所取代的。
在一些实施方案中，任选的连接物L1或L2具有以下结构：
Figure BPA00001609256400051
*＝共价附接到不饱和主链上的位点，其中R3独立地是：氢、卤素、烷氧基(C1-C12)、C1-C12烷基、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基或C2-C18(杂)芳基基团，其中C1-C12烷基、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基或一个C2-C18(杂)芳基基团各自任选地被一个或多个卤素、羟基、C1-C12烷基、C2-C12链烯基、C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、或C1-C12卤烷基所取代；并且q是从0到4的整数。
在其他实施方案中，任选的连接物L1或L2具有以下结构：
Figure BPA00001609256400052
*＝共价附接到不饱和主链上的位点，其中A是用于共轭、链延伸或交联的位点并且是-[O-CH2-CH2]q-W、或(C1-C12)烷氧基-X或C2-C18(杂)芳基、苯氧基、酰氨基、氨基、氨基甲酸酯、羧酸酯、碳酸酯、硫化物、二硫化物、或者亚胺基的基团，这些基团以一个官能基团封端，该官能团是选自：胺、氨基甲酸酯、羧酸酯、羧酸、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇、及其被保护基团，用于共轭至另一个基质、分子或生物分子上；W是-OH或-COOH；X是-NH2、-NHCOOH、-NHCOOC(CH3)3、-NHCO(C3-C12)环烷基(C1-C4)烷基-N-马来酰亚胺；或者-NHCO[CH2-CH2-O]tNH2；q是从1到20的整数；并且t是从1到8的整数。
在另外的其他实施方案中，任选的连接物L1或L2具有以下结构：
Figure BPA00001609256400061
*＝用于共价附接到主链上的位点
其中R25各自独立地是一种键、C1-C20烷基、C1-C20烷氧基、C2-C20亚烷基、C2-C20炔、C3-C20环烷基、C1-C20卤烷基、(CH2)x(OCH2CH2)p(CH2)x(其中x各自独立地是从0到20的整数，p独立地是从0到50的整数)、芳基、C2-C18(杂)芳基、苯氧基、酰胺基、氨基、氨基甲酸酯、羧酸酯、碳酸酯、硫化物、二硫化物、或亚胺基团中的任何一种或其组合；
其中至少一个R25是以一个选自以下各项的官能团封端的：胺、氨基甲酸酯、羧酸酯、羧酸、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇、及其被保护基团，用于共轭至另一个基质、分子或生物分子上。
在另外的实施方案中，任选的连接物L1或L2具有以下结构：
Figure BPA00001609256400071
*＝用于共价附接到不饱和主链上的位点；
其中R35是一种键、C1-C20烷基、C1-C20烷氧基、C2-C20亚烷基、C2-C20炔、C3-C20环烷基、C1-C20卤烷基、(CH2)x(OCH2CH2)p(CH2)x(其中x各自独立地是从0到20的整数，p独立地是从0到50的整数)、芳基、C2-C18(杂)芳基、苯氧基、酰胺基、氨基、氨基甲酸酯、羧酸酯、碳酸酯、硫化物、二硫化物、或亚胺基的基团中的任何一种或其组合；这些基团以一个官能团封端，该官能团是选自：胺、氨基甲酸酯、羧酸酯、羧酸、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇、及其被保护基团，用于共轭至另一个基质、分子或生物分子上。
在另外的实施方案中，任选的连接物L1或L2是选自具有以下结构的a-h所组成的组：
Figure BPA00001609256400081
*＝用于共价附接到不饱和主链上的位点；
其中R’独立地是：H、卤素、C1-C12烷基、(C1-C12烷基)NH2、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基、C1-C12卤烷基、C2-C18(杂)芳基、C2-C18(杂)芳氨基、-[CH2-CH2]r’-Z1、或者(C1-C12)烷氧基-X1；并且其中Z1是-OH或-COOH；X1是-NH2、-NHCOOH、-NHCOOC(CH3)3、-NHCO(C3-C12)环烷基(C1-C4)烷基-N-马来酰亚胺；或者-NHCO[CH2-CH2-O]s’(CH2)s’NH2；r’是从1到20的整数；并且s’各自独立地是从1到20的整数；是(CH2)3(OCH2CH2)x”OCH3，其中x”独立地是从0到50的整数；或者是任选地被一个或多个卤素、羟基、C1-C12烷氧基、或者(OCH2CH2)y”OCH3所取代的苄基，其中每个y”独立地是从0到50的整数并且R’与R不同；
其中k是2、4、8、12、或24；
其中R15是选自具有以下结构的l-t组成的组：
*＝用于共价附接到主链上的位点。
在还另外的实施方案中，任选的连接物L1或L2是
在一些实施方案中，G1和G2各自独立地选自：氢、卤素、炔、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、卤素取代的芳基、硼酸取代的芳基、硼酸酯取代的芳基、硼酸酯、硼酸、任选取代的氟、以及被一个或多个侧链取代的芳基或杂芳基，该侧链是以选自以下各项的官能团、分子或生物分子封端：胺、氨基甲酸酯、羧酸酯、羧酸、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇、及其被保护基团，用于共轭至另一个基质、分子或生物分子上。
在一些实施方案中，G1和G2各自独立地具有结构
Figure BPA00001609256400093
其中R11是一种键、C1-C20烷基、C1-C20烷氧基、C2-C20亚烷基、C2-C20炔、C3-C20环烷基、C1-C20卤烷基、(CH2)x(OCH2CH2)p(CH2)x(其中x各自独立地是从0到20的整数，p独立地是从0到50的整数)、芳基、C2-C18(杂)芳基、苯氧基、酰胺基、氨基、氨基甲酸酯、羧酸酯、碳酸酯、硫化物、二硫化物、或亚胺基的基团中的任何一种或其组合，这些基团是以一种官能团封端的，该官能团是选自：胺、氨基甲酸酯、羧酸酯、羧酸、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇、及其被保护基团，用于共轭至另一个基质、分子或生物分子上。
在其他实施方案中，G1和G2各自独立地选自具有以下结构的1-31组成的组：
Figure BPA00001609256400111
*＝用于共价附接到主链上的位点
其中R15是选自具有以下结构的l-t组成的组：
Figure BPA00001609256400121
并且k是2、4、8、12、或24。
在另外的实施方案中，G1和G2是任选取代的芳基或杂芳基，其中该任选的取代基是选自：卤素、胺、氨基甲酸酯、羧酸、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇、硼酸、硼酸根基团、硼酸酯、以及任选取代的芴。
在一些实施方案中，G1和G2是相同的。在其他实施方案中，G1和G2是不同的。在另外的实施方案中，该聚合物在聚合物链G1或G2的仅一个末端处包含单一的共轭位点。
在还另外的实施方案中，G1和G2是或者
Figure BPA00001609256400123
在一些实施方案中，MU是选自具有以下结构a’-k’组成的组：
*＝用于共价附接到不饱和主链上的位点
其中，R是一种非离子侧基，该侧基能够提供超过10mg/mL的水中溶解度。
在一些实施方案中，该水溶性的共轭聚合物具有以下化学式的结构：
其中G1或G2中至少一个包括一个功能性共轭位点。
在一些实施方案中，该水溶性的共轭聚合物具有以下化学式的结构：
Figure BPA00001609256400141
其中L1包括一个功能性共轭位点。
在一些实施方案中，该水溶性的共轭聚合物具有以下化学式的结构：
Figure BPA00001609256400142
其中G1或G2中的至少一个包括一个功能性共轭位点。
在其他实施方案中，该聚合物具有以下化学式的结构：
Figure BPA00001609256400143
在其他实施方案中，该聚合物具有以下化学式的结构：
Figure BPA00001609256400144
在其他实施方案中，该聚合物具有以下化学式的结构：
Figure BPA00001609256400145
在其他实施方案中，该聚合物具有以下化学式的结构：
Figure BPA00001609256400151
在其他实施方案中，该聚合物具有以下化学式的结构：
Figure BPA00001609256400152
在其他实施方案中，该聚合物具有以下化学式的结构：
Figure BPA00001609256400153
在其他实施方案中，该聚合物具有以下化学式的结构：
Figure BPA00001609256400154
在其他实施方案中，该聚合物具有以下化学式的结构：
Figure BPA00001609256400155
在一些例子中，一种信号发色团通过NH2基团附接到该聚合物上。在某些例子中，该发信号发色团是Cy3或者Dylight 594染料。在某些例子中，连接物
Figure BPA00001609256400161
占该整个聚合物的约10％。在其他例子中，该聚合物共轭至一个第一染料报告物以及一个抗体上。
在此说明的共轭聚合物的一些实施方案中，该聚合物进一步共轭至另外的分子上。在一些实施方案中，该共聚物共轭至链亲和素、抗体、或核酸上并且被用作直接荧光报告物。在某些实施方案中，该聚合物是共轭至链亲和素上。在其他实施方案中，该聚合物是共轭至一个抗体的铰链区的硫醇基上。在另外的其他的实施方案中，该共聚物是共轭至一个蛋白上的胺基基团上，该蛋白是用杂双功能的连接物改性过的。在另外的实施方案中，该聚合物是共轭至核酸上的。在还另外的实施方案中，该聚合物是共轭至抗体上的。在某些例子中，该聚合物是共轭至单克隆抗体、第二抗体、或者第一抗体上的。在其他例子中，聚合物抗体共轭物在流式细胞术分析中是在约405nm下激发的，其中该特异性信号比共轭至太平洋蓝(Pacific Blue)上的相同抗体上大出至少3倍。
在此说明的共轭聚合物的一些实施方案中，该聚合物通过离子交换色谱进行纯化。在其他实施方案中，该聚合物是≥95％纯度的。
在此说明的共轭聚合物的一些实施方案中，该聚合物在流式细胞分析中用于确定不同的细胞标记物或者细胞类型。在其他实施方案中，该聚合物被用于将细胞进行分类。在另外的其他实施方案中，该聚合物用于将在治疗中使用的细胞进行分类。
在此说明的共轭聚合物的一些实施方案中，该聚合物被用于细胞内染色。在某些例子中，该聚合物在流式细胞分析中用于确定不同的细胞标记物或细胞类型。
在此说明的共轭聚合物的一些实施方案中，该聚合物具有大于40,000g/mol的最小数均分子量以及在纯水或磷酸盐缓冲盐水溶液中大于50mg/mL的水溶性。
在此说明的共轭聚合物的一些实施方案中，该聚合物包括至少两种独特的共轭连接物，这些连接物可以共轭至两种独特的材料上。
在此还提供了多种分析方法，这些方法包括：提供一个怀疑含有靶标生物分子的样本；提供一种传感器蛋白，该传感器蛋白是共轭至至少一个信号发色团上并且能够与靶标生物分子或者一个靶标相关生物分子相互作用；提供一种在此说明的水溶性共轭聚合物；将该样本与传感器蛋白以及该共轭聚合物在一种溶液中在以下条件下进行接触，在这些条件下该传感器蛋白可以结合到该靶标生物分子上或者靶标相关生物分子(如果存在的话)上；将一个光源施加到该样本上，该光源可以激发该共轭聚合物；并且检测是否从该信号发色团中发出了光。
在一些实施方案中，该传感器蛋白是一种抗体。在其他实施方案中，该传感器蛋白包括共轭至多个信号发色团上的多个传感器蛋白，其中该多个发色团中的至少两个在从该多发色团进行能量传递时发射不同波长的光。
还在此提供了共轭聚合物复合物，该复合物包含一种连接到至少一个生物分子上的聚合物，该生物分子是选自下组，该组由以下各项组成：传感器生物分子、生物共轭物和靶标生物分子，其中该聚合物是通过至少一个从其上悬垂的生物共轭位点而共价地结合的，并且该聚合物包括一种信号发色团，或者一种信号发色团任选地共价结合到该聚合物或者该传感器生物分子上；其中该聚合物包括以下化学式的结构：
Figure BPA00001609256400181
其中：
每个R是一种非离子侧基，该侧基能够提供超过10mg/mL的水中溶解度；
MU是一种聚合物改性单元或者带隙改性单元，该单元是沿着该聚合物主链均匀或者随机分布的并且任选地被一个或多个任选取代的取代基所取代，这些取代基是选自：卤素、羟基、C1-C12烷基、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基、C1-C12卤烷基、C1-C12烷氧基、C2-C18(杂氧)芳氧基、C2-C18(杂氧)芳氨基、(CH2)x′(OCH2CH2)y′OCH3，其中每个x′独立地是从0-20的整数，y′独立地是从0到50的整数，或者是一个C2-C18(杂氧)芳基基团；
每个任选的连接物L1和L2是沿着该聚合物主链均匀地或随机分布的芳基或杂芳基并且被一个或多个侧链所取代，该侧链以一个官能团封端而用于共轭至另一个分子、基质或生物分子上，该官能团是选自：胺、氨基甲酸酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇以及其被保护基团；
G1和G2各自独立地选自：氢、卤素、胺、氨基甲酸酯、羧酸、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、卤素取代的芳基、硼酸取代的芳基、硼酸酯取代的芳基、硼酸酯、硼酸、任选取代的芴、以及被一个或多个侧链取代的芳基或杂芳基，该侧链以一个选自以下各项的官能团封端：胺、氨基甲酸酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇及其被保护基团，用于共轭至另一个基质、分子或生物分子上；
其中该聚合物在G1、G2、L1、或L2内包括至少1个官能团，该官能团是选自：胺、氨基甲酸酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、以及硫醇，该官能团允许功能性共轭至另一个分子、基质、或生物分子上；
n是从1至约10,000的整数；并且
a、b、c、和d限定了在该结构内每个单元的mol％，每个单元可以均匀地或随机地重复并且其中a是从10％到100％的mol％，b是从0到90％的mol％，并且c和d各自是从0到25％的mol％。
在一些实施方案中，该传感器生物分子是选自下组，该组由以下各项组成：亲和素、链亲和素、中性亲和素(neutravidin)、亲和素DN、以及亲和素D。在其他实施方案中，该共轭聚合物复合物被进一步构形为结合到一种选自下组的复合物上，该组由以下各项组成：生物素标记的抗体、生物素标记的蛋白、以及生物素标记的靶标生物分子。
在另外的实施方案中，该传感器生物分子是一种抗体。在还另外的实施方案中，该信号发色团和该传感器生物分子均是通过多个连接物而共价连接到该多发色团上。在一些其他实施方案中，该信号发色团和该传感器生物分子均是通过一个中央连接位点而共价连接到聚合物上的，该中央连接位点共价地结合了该聚合物、该信号发色团和该传感器生物分子。在另外的其他实施方案中，该信号发色团当共价地结合到该聚合物或该传感器生物分子上时是一种有机染料。
还在此提供了具有以下化学式(Ia)的结构的水溶性共轭聚合物：
Figure BPA00001609256400201
其中：
每个R独立地是(CH2)x(OCH2CH2)yOCH3(其中每个x独立地是从0-20的整数，每个y独立地从0-50的整数)或者任选地被一个或多个卤素、羟基、C1-C12烷氧基、或者(OCH2CH2)zOCH3所取代的苄基，其中z是独立地从0到50的整数；
任选的连接物L1或L2各自是选自具有以下结构的a-i组成的组
Figure BPA00001609256400211
*＝用于共价附接到不饱和主链上的位点
其中R’独立地是：H、卤素、C1-C12烷基、(C1-C12烷基)NH2、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基、C1-C12卤烷基、C2-C18(杂)芳基、C2-C18(杂)芳氨基、-[CH2-CH2]r’-Z1、或者(C1-C12)烷氧基-X1；并且其中Z1是-OH或-COOH；X1是-NH2、-NHCOOH、-NHCOOC(CH3)3、-NHCO(C3-C12)环烷基(C1-C4)烷基-N-马来酰亚胺；或者-NHCO[CH2-CH2-O]s’(CH2)s’NH2；r’是从1到20的整数；并且s’各自独立地是从1到20的整数；(CH2)3(OCH2CH2)x”OCH3，其中x”独立地是从0到50的整数；或者是任选地被一个或多个卤素、羟基、C1-C12烷氧基、或(OCH2CH2)y”OCH3所取代的苄基，其中y”独立地是从0到50的整数，并且R’与R不同；
其中R15是选自具有以下结构的l-t组成的组：
Figure BPA00001609256400221
并且k是2、4、8、12、或24；
*＝用于共价附接到主链上的位点
MU是聚合物改性单元或带隙改性单元，该单元是选自具有以下结构a’-k’的组成的组中：
Figure BPA00001609256400222
*＝用于共价附接到不饱和主链上的位点；
其中，R是一种非离子侧基，该侧基能够提供超过10mg/mL的水中溶解度；
G1和G2各自独立地选自具有以下结构的1-31组成的组：
Figure BPA00001609256400231
其中该聚合物在G1、G2、L1、或L2内包括至少1个官能团，该官能团是选自：胺、氨基甲酸酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、以及硫醇，该官能团允许功能性共轭至另一个分子、基质、或生物分子上；
n是从1至约10,000的整数；并且
a、b、c、和d限定了在该结构内每个单元的mol％，每个单元可以均匀地或随机地重复并且其中a是从10％到100％的mol％，b是从0到90％的mol％，并且c和d各自是从0到25％的mol％。
还在此提供了具有以下化学式的结构的水溶性共轭聚合物：
其中，Ar是一个芳基或杂芳基并且任选地被一个或多个任选取代的取代基所取代，这些取代基是选自：卤素、羟基、C1-C12烷基、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基、C1-C12卤烷基、C1-C12烷氧基、C2-C18(杂)芳氧基、C2-C18(杂)芳氨基、(CH2)x′(OCH2CH2)y′OCH3，其中每个x′独立地是从0-20的整数，y′独立地是从0到50的整数；并且虚线的键、L1、L2、G1、G2、MU、a、b、c、d、以及n是前面关于化学式(I)描述的。
通过引用进行的结合
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用以结合在此，其程度如同对每个单独的出版物、专利或专利申请都确切地且单独地指明是通过引用结合在此的。
附图简要说明
本发明的新特征具体地在所附权利要求中列出。参考以下阐释了说明性实施方案的详细描述及其附图会更好地理解本发明的这些特征和优势，在这些说明性实施方案中应用了本发明的原理，在附图中：
图1.本发明的一个实施方案中的共轭聚合物的结合示意图。
图2.本发明的一个实施方案的生物共轭聚合物的示意图。
图3.共轭了(A)抗体；(B)亲和素；(C)核酸；(D)染料(例如发色团)的示例性共轭聚合物的示意图。
图4.(A)聚合物共轭至染料标记的抗体上而产生FRET；(B)聚合物与染料标记的链亲和素共轭而产生FRET；(C)标记有猝灭剂分子核酸探针序列共轭至共轭聚合物上；(D)标记有猝灭剂分子的核酸探针序列与聚合物染料串型复合物(tandem complex)共轭的示意图。
图5.对靶标生物分子或靶标相关生物分子进行分析的不同方法的示意图。(A)连接到生物共轭物上的共轭聚合物；(B)聚合物和染料标记的抗体识别了公共靶标；(C)同时共轭至染料和第二生物共轭物上的传感器生物分子；(D)均共轭至核酸上的第二生物共轭物和信号发色团。
图6.在该聚合物内增加第二连接位点的示意图。
图7.共轭至染料和生物分子上的聚合物以及所得的能量传递的示意图，(A)聚合物共轭至生物共轭物上；(B)聚合物被共轭至链亲和素和染料上；(C)聚合物被共轭至核酸上和染料上。
图8.与传感器生物分子或靶标相关生物分子间接相关的示意图。(A)生物素酰化抗体与该共轭聚合物的共价共轭物相互作用；(B)生物素酰化抗体与聚合物-染料串型复合物共轭；(C)生物素酰化核酸与该共轭聚合物的共价共轭物相互作用；(D)生物素酰化核酸与聚合物-染料串型复合物共轭；(E)具有洋地黄毒甙部分的核苷酸与该共轭聚合物的共价共轭物相互作用；(F)具有洋地黄毒甙部分的核苷酸与聚合物-染料串型复合物共轭。
图9.共轭至第二抗体和第一抗体(B)上的示例性共轭聚合物的示意图。
图10.一种夹心型复合物的示意图。(A)生物共轭至链亲和素上的共轭聚合物复合物；(B)用于直接探测靶蛋白的生物素标记的1°抗体被e。
图11.使一个或两个苯基帽化单元悬垂在芴聚合物上的示意图。
图12.显示一个代表性逻辑装置实例的框图。
图13.显示一个试剂盒的代表性实例的框图。
图14.与共轭聚合物进行链亲和素共轭以及所得共轭物结构(顶部)，以及考马斯染色的琼脂糖凝胶，代表附接了链亲和素的CP(下部)。
图15.单独的或者结合到Cy5-标记的链亲和素上的生物素酰化聚合物的代表性丙烯酰胺凝胶绘图。
图16.图14的附接了链亲和素的共轭聚合物结合到生物素酰化微球上的示意图(顶部)、以及对照生物素酰化微球和结合到链亲和素共轭聚合物上的微球的荧光激发曲线图。
图17.图14的附接了链亲和素的共轭聚合物被选择性地结合到生物素酰化微球上的示意图以及至共同定位的链亲和素-染料共轭物上的染料受体的能量传递(顶部)，以及从附接了链亲和素的共轭聚合物到染料受体的能量传递曲线图(底部)。
图18.图14的生物素酰化聚合物结合到链亲和素涂覆的微球上的示意图(顶部)，以及对照的链亲和素涂覆的微球和结合到生物素酰化聚合物上的微球的荧光激发曲线图。
图19.图14的生物素酰化聚合物结合到染料标记的链亲和素共轭物上以及FRET的示意图(顶部)；从生物素酰化聚合物到两个不同染料受体的能量传递曲线图(底部左侧)以及聚合物饱和度的滴定曲线(底部右侧)。
图20.用440nm聚合物-链亲和素共轭物对Cyto-trol细胞进行CD4标记的流式细胞分析。
图21.(A)共轭至(从左到右)FITC、Cy3、DyLight 594、和DyLight633上的实例38b的聚合物结构；(B)在其最大吸光度附近被激发的染料(DyLight594)的荧光(下部曲线)与在405nm处被激发的聚合物-染料共轭物的荧光(上部曲线)的对比；(C)基础聚合物(没有染料、在420nm附近具有峰值发射)的荧光信号与聚合物-染料共轭物(在620nm附近具有峰值发射)的荧光信号的对比。
图22.单克隆抗体(antiCD4)共轭物在全部的溶解的血液样本上的流动测试的曲线图。
图23.染料(DyLight594)在594nm的染料激发以及聚合物-染料共轭物在380nm的聚合物-染料共轭物激发得到的荧光曲线图。
图24.附接了链亲和素的共轭聚合物的荧光免疫测定(ELISA)的曲线图。
图25.杂交到靶标上的DNA低聚物-聚合物共轭物的荧光强度对比温度的曲线图。
图26.用于去除自由聚合物的聚合物抗体共轭物的离子交换色谱(左)和显示了最终共轭物与自由抗体分离的SEC色谱图。在这两个色谱图中吸光度中是在280nm(下部曲线)和407nm(上部曲线)监测的。
图27.Luminex分析上的夹心免疫测定(左)，以及在Luminex系统上使用共轭聚合物和PE链亲和素检测共轭物的532nm激发而获得的对应结果。
图28.左侧的数据显示了通过补偿珠粒获得的结果，而右侧的数据是来自在人血样本上的4色分析。
图29.(A)和(B)是共轭聚合物与2°抗体的共价连接的示意图。
图30.荧光免疫分析(FIA)中的共轭聚合物的示意图。(A)共价连接到检测抗体上的共轭聚合物；(B)共价连接到该共轭聚合物上并且与生物素酰化检测抗体相互作用的生物素结合蛋白；(C)共价连接到该共轭聚合物上并且与检测抗体相互作用的第二抗体。
图31.用共轭至共轭聚合物上的猝灭剂分子标记的核酸探针序列的示意图；(B)用共轭至共轭聚合物-染料串型复合物上的猝灭剂分子标记的核酸探针序列。
图32.HybProbe检测技术的修改示意图。(A)共价连接到供体探针上的共轭聚合物以及所产生的至受体探针上的能量传递；(B)HybProbe途径的“信号关闭”的改变，其中这种共轭聚合物被一种受体探针猝灭。
FIG.33.在不同聚合物中以Jurkat细胞(淋巴细胞系)模式进行的非特异性结合的对比(顶部)；(底部)在纯粹通过非特异性结合(NSB)产生的信号的意义上将聚合物分级的曲线。
图34.使用Jurkat细胞系从流式细胞分析(在BD LSR-II细胞计数器中进行405nm激发)中收集的柱状图；(左边)未染色的细胞和阴性对照、阴离子P4聚合物；(中间)在相同细胞上测试的不同聚合物及聚合物侧链组合的范围；(右边)中性聚合物P20，几乎没有显示出与未处理的细胞的偏离。
图35.凝胶电泳法，描绘亲和素随着与聚合物AA1的共轭程度而变化的相对迁移率。
图36.粗制聚合物-亲和素共轭物混合物在Superdex 200尺寸排阻层析柱上的分馏；(顶部)通过UV吸收来监测部分；(底部)选定馏分的凝胶电泳，用于将亲和素附接到聚合物上的程度可视化。
图37.用相对于链亲和素以不同摩尔数过量的聚合物进行的共轭反应的凝胶电泳；(左边)UV照射；(右侧)532nm激发。
图38.描绘与实例9中例示的多种聚合物的聚合物链亲和素共轭物的纯化作用的曲线，表示为P30，(顶部)粗制样本；(底部)纯化后的共轭物。
发明详细说明
在对本发明进行进一步详述之前，应当理解的是本发明并不局限于所描述的特定的方法学、装置、溶液、或设备，因为这些方法、装置、溶液、或设备当然可以发生改变。还应该理解的是，在此使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在对本发明的范围进行限制。
除非上下文另外明白地指出，否则使用单数形式“一个/一种(a/an)”以及“该the)”包括复数的指代物。因此，例如，提及“一个聚集传感器”包括多个聚集传感器，提及“一个探针”包括多个探针，以此类推。另外，使用具体的复数形式，诸如“二”、“三”等等，除非文本清楚指出其他意思，应理解为是同一主题的的较大数目。
除非上下文另外明白地指出，术语诸如“联接”、“附接”、“共轭”、以及“连接”在此可交换地使用，并且涵盖直接以及间接的联接、附接、连接、或共轭；在一个实例中，短语“共轭聚合物”根据其在本领域中的常规含义来使用，是指含有一系列不饱和键的聚合物，并且上下文指出术语“共轭的”应该理解为不仅单纯地是直接的或间接的联接、附加或连接。
当述及数值范围时，应该理解的是，所引用的范围的上限与下限之间的每个介于中间的整数值和每个分数、以及在这些树脂之间的每个子范围也被具体公开。任何范围的上限和下限可独立地被包括在该范围内或被排除在该范围之外，并且当上下限两者中的任何一个、两个都包括在内或都不包括时的每个范围都被涵盖在本发明之内。当所讨论的值具有内在的限值时，例如当一个组分可以按从0到100％的浓度存在时，或者当一种水溶液的pH范围可以从1到14时，这些内在的限值就被具体地公开了。当一个数值被明确地述及时，应理解的是那些与所述数值大约相同数量或量的数值也处于本发明的范围之内，基于它们的范围也是如此。当披露一种组合，这个组合内要素的每个子组合成也被确切地公开并且是处于本发明的范围之内。相反地，当不同的要素或要素组被公开时，其组合也同样被公开。当一项发明的任何要素都被公开为具有多个替代物时，每个替代物单独地或与其他替代物任意组合地被排除了的本发明的实例也同样在此被公开；一项发明的一个以上的要素可具有此类的排除，并且具有此类排除的元素的所有组合由此被公开。
除非另外定义或上下文相反地明白指出，在此使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的一样的含义。尽管任何与在此描述的类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但现在描述优选的方法和材料。
所有此处提及的出版物通过引用结合在此，目的是公开和描述所引用的参考文件的具体材料和方法学。提供此处所述的出版物仅仅因为它们的公开早于本申请的申请日。在此没有任何事物可以解释为承认本发明由于现有发明而没有权利早于此披露内容。
定义
在描述本发明的过程中，将采用下述术语，并且定义如下。
“烷基”是指一种具有1到24个碳原子的、任选地在一个或多个位置上被取代的支链的、非支链的或环状的饱和烃基，并且包括多环化合物。烷基基团的实例包括：任选取代的甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基、正癸基、己基辛基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等等，以及环烷基基团，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、金刚烷基、以及降冰片基。术语“低级烷基”是指具有1到6个碳原子、优选1到4个碳原子的烷基。在取代的烷基上的示例性取代基包括：羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、-NO2、卤素、卤烷基、杂烷基、羧基烷基、胺、酰胺、硫醚、以及-SH。
“烷氧基”是指“-O烷基”基团，其中烷基是如以上所定义的。“低级烷氧基”基团意指一到六个、更优选一到四个碳原子的烷氧基。
“链烯基”是指具有2到24个碳原子的、含至少一个碳-碳双键、任选地在一个或多个位置上被取代的支链的、非支链的、或环状烃基。链烯基的实例包括：乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基(烯丙基)、1-甲基乙烯基、环丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1，4-丁二烯基、环丁烯基、1-甲基丁2-烯基、2-甲基丁-2-烯-4-基、异戊二烯基、戊-1-烯基、戊-3-烯基、1，1-二甲基烯丙基、环戊烯基、己-2-烯基、1-甲基-1-乙基烯丙基、环己烯基、庚烯基、环庚烯基、辛烯基、环辛烯基、癸烯基、十四烯基、十六烯基、二十烯基、二十四烯基以及类似物。在此优选的链烯基包含2到12个碳原子。术语“低级链烯基”意指具有2到6个碳原子、优选2到4个碳原子的链烯基。术语“环烯基”意指具有3到8个碳原子、优选5到6个碳原子的环状链烯基。在取代的链烯基上的示例性取代基包括：羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、-NO2、卤素、卤烷基、杂烷基、胺、硫醚、以及-SH。
“链烯氧基”是指“-O链烯基”基团，其中链烯基是如以上所定义的。
“烷芳基”是指共价接合到芳基上的烷基。优选地，该烷基是低级烷基。示例性的烷芳基包括：苄基、苯乙基、苯丙基、1-苄基乙基、苯丁基、2-苄基丙基、以及类似物。
“烷基芳氧基”是指“-O烷芳基”基团，其中烷芳基是如以上所定义的。
“炔基”是指具有2到24个碳原子的、含至少一个-C/C-三键、任选地在一个或多个位置上被取代的支链的或非支链的烃基。炔基的实例包括：乙炔基、正丙炔基、异丙炔基、炔丙基、丁-2-炔基、3-甲基丁-1-炔基、辛炔基、癸炔基、以及类似物。在此优选的炔基包含2到12个碳原子。术语“低级炔基”意指具有2到6个碳原子、优选2到4个碳原子、以及一个-C＝C-三键的炔基。在取代的炔基上的示例性取代基包括：羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、-NO2、卤素、卤烷基、杂烷基、胺、硫醚、以及-SH。
在此引用的“抗体”在最广泛的意义上使用并且具体包括单克隆抗体(包括全长的单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、以及抗体片段(例如，Fab、F(ab’)2以及Fv)，只要它们对选定抗原展示出结合活性或亲和性。
如在此使用的“抗原”是指任何能够引发免疫应答的物质。
“酰胺”是指-C(O)NR’R”，其中R’和R”是独立地选自：氢、烷基、芳基、以及烷芳基。
“胺”是指-N(R’)R”基团，其中R’和R”是独立地选自：氢、烷基、芳基、以及烷芳基。
“芳基”是指具有至少一个环的一种芳香基团，该环具有共轭的π电子体系，包括碳环的、杂环的、桥联的和/或多环的芳基基团，并且可以任选地在一个或多个位置上被取代。典型的芳基包含1到5个芳环，这些芳环可以是稠合的和/或连接的。示例性的芳基包括：苯基、呋喃基、唑基、硫代呋喃基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、联苯基、茚基、苯并呋喃基、吲哚基、萘基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、吡啶并吡啶基、吡咯并吡啶基、嘌呤基、四氢化萘基(tetralinyl)、以及类似物。在任选取代的芳基上的示例性取代基包括：烷基、烷氧基、烷基羧基、链烯基、链烯氧基、链烯基羧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、稠合的饱和的或不饱和的任选取代的环、卤素、卤烷基、杂烷基、-S(O)R、磺酰基、-SO3R、-SR、-NO2、-NRR’、-OH、-CN、-C(O)R、-OC(O)R、-NHC(O)R、-(CH2)nCO2R或-(CH2)nCONRR’，其中，n是0-4，并且其中R和R’独立地是H、烷基、芳基、或烷芳基。
“芳氧基”是指“-O芳基”基团，其中芳基是如以上所定义的。
“碳环的”是指包含至少一个环的任选取代的化合物，并且其中所有的环原子都是碳并且可以是饱和的或不饱和的。
“碳环的芳基”是指一种任选取代的芳基基团，其中这些环原子是碳。
“卤代”或“卤素”是指：氟代、氯代、溴代、或碘代。“卤化物”是指这些卤素的阴离子形式。
“卤烷基”是指在一个或多个位置上被卤素取代的烷基，并且包括被仅一种类型的卤素原子取代的烷基以及被不同类型的卤素原子的混合形式而取代的烷基。示例性的卤烷基包括：三卤甲基，例如三氟甲基。
“杂烷基”是指其中一个或多个碳原子和缔合的一个或多个氢原子被一个任选取代的杂原子所取代的烷基，并且包括被仅一种类型的杂原子取代的烷基以及被不同类型的杂原子的混合形式而取代的烷基。杂原子包括：氧、硫、以及氮。如在此使用的，氮杂原子和硫杂原子包括氮和硫的任何氧化形式，以及具有四个共价键的任何氮形式、包括质子化的形式。任选取代的杂原子是指用烷基、芳基、烷芳基、或者羟基来取代被附接到氮原子上的一个或多个氢。
“杂环的”是指包含至少一个饱和的或不饱和的环的化合物，该环具有至少一个杂原子、并且任选地在一个或多个位置上被取代。典型的杂环基团包含1到5个环，这些环可以是稠合的和/或连接的，其中这些环各自含有五或六个原子。杂环基团的实例包括：哌啶基、吗啉基、以及吡咯烷基。任选取代的杂环基团的示例性取代基是对于烷基和芳基是在环碳处、对于杂烷基是在杂原子处。
“杂环的芳基”是指在至少一个芳族环上具有至少1个杂原子的芳基。示例性的杂环的芳基包括：呋喃基、噻吩基、吡啶基、哒嗪基、吡咯基、N-低级烷基-吡咯并、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、四嗪基、三唑基、四唑基、咪唑基、联吡啶基、三吡啶基、四吡啶基、吩嗪基、菲咯啉基、嘌呤基、二萘嵌苯、二萘嵌苯二酰亚胺、二酮吡咯并吡咯、苯并硫二唑基、苯并噁二唑基、噻吩并吡嗪、以及类似物。“烃基”是指含1到约20个碳原子的烃基取代基，包括支链的、非支链的、和环状的种类以及饱和和不饱和的种类，例如烷基、亚烷基、链烯基、烷芳基、芳基、以及类似物。术语“低级烃基”意指具有一到六个碳原子、优选一到四个碳原子的烃基。
“取代基”是指将附接到碳或氮上的一个或多个氢取代的基团。示例性的取代基包括：烷基、亚烷基、烷基羧基、烷氧基、链烯基、链烯基羧基、链烯氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、-OH、胺、甲酰胺、羧基、磺酰基、＝O、＝S、-NO2、卤素、卤烷基、稠合的饱和的或不饱和的任选取代的环、-S(O)R、-SO3R、-SR、-NRR’、-OH、-CN、-C(O)R、-OC(O)R、-NHC(O)R、-(CH2)nCO2R或-(CH2)nCONRR’，其中，n是0-4，并且其中R和R’独立地是H、烷基、芳基、或烷芳基。取代基还包括用一个任选取代的杂原子来取代碳原子和一个或多个缔合的氢原子。
“磺酰基”是指-S(O)2R，其中R是：烷基、芳基、-C(CN)＝C-芳基、-CH2CN、烷芳基、或胺。
“硫代酰胺”是指-C(S)NR’R”，其中R’和R”是独立地选自：氢、烷基、芳基、以及烷芳基。
“硫醚”是指-SR，其中R是烷基、芳基、或烷芳基。
如在此使用的，术语“结合对”是指以比样本中其他成分更高的亲和力互相特异性地结合在一起的第一和第二分子。结合对中成员之间的结合典型地是非共价的。示例性的结合对包括：免疫结合对(例如任何半抗原或抗原化合物与相应抗体或其结合部分或其片断组合，例如洋地黄毒和抗洋地黄毒甙、荧光素和抗荧光素、二硝基酚和抗二硝基酚、溴脱氧尿甙和抗溴脱氧尿甙、小鼠免疫球蛋自和山羊抗小鼠免疫球蛋自)、和非免疫结合对(例如生物素-亲和素、生物素-链亲和素、激素[例如甲状腺素和氢化可的松]-激素结合蛋自、受体-受体激动剂或桔抗剂(例如乙酞胆碱受体-乙酞胆碱或其类似物)IgG-蛋白A、凝集素-碳水化合物、酶-酶辅因子、酶-酶抑制物、和互补的能形成核酸双链的多核苷酸对)等。该结合对的一个或两个成员可以共轭至另外的分子上。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”、以及“核酸分子”在此可互换地使用，是指任何长度的核苷酸的聚合物形式并且可以包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物、以及其混合物。这些术语仅是指该分子的一级结构。因此，这些术语包括：三链、双链、和单链的脱氧核糖核酸(“DNA”)以及三链、双链、和单链的核糖核酸(“RNA”)。它还包括例如通过烷化、和/或通过帽化而改性的以及未改性形式的多核苷酸。这些术语的其他细节以及碱基对形成的细节可以在于2006年1月31日提交的美国申请序列号11/344,942中找到，将其通过引用以其全文结合在此。
“互补的”或“基本上互补的”是指在核苷酸或核酸，例如像在传感器肽核酸和靶标多核苷酸之间杂交或碱基配对的能力。互补核苷酸一般是A和T(或A和U)、或C和G。当一条链的碱基(最佳比对和比较的以及具有适当的插入或缺失的)与另一条链的至少80％、通常至少约90％到95％、并且更优选从约98％到100％的碱基配对时，两条单链多核苷酸或者PNA就被称为基本上互补的。
可替代地，当一个多核苷酸或PNA将在选择性杂交条件下与其互补物杂交时，存在基本互补性。典型地，当在至少14到25个碱基的延伸长度上存在至少约65％的互补、优选至少约75％、更优选至少约90％互补时，选择性杂交将会发生。参见M.KanehisaNucleic Acids Res.12：203(1984)。
“优先结合”或“优先杂交”是指在与样本中的非互补聚合物相比，一种多核苷酸或PNA与样本中其互补物结合的倾向增加。
多核苷酸的杂交条件典型地包括小于约1M、更通常小于约500mM并且优选小于约200mM的盐浓度。在肽核酸与多核苷酸之间杂交的情况下，该杂交可以在包含很少的或没有盐的溶液中完成。杂交温度可以是低到5℃，但典型地是大于22℃、更典型地是大于约30℃，并且优选地超过约37℃。较长片断的的特异性杂交可能需要较高的杂交温度。其他因素可以影响杂交的严格性，包括碱基组成和互补链的长度、有机溶剂的存在以及碱基错配的程度，并且所用参数的组分是比任何一个参数的绝对值更加重要的。其他可以控制的杂交条件包括缓冲液类型和浓度、溶液pH、用于降低背景结合的封闭剂(如重复序列或者封闭蛋白质溶液)的存在和浓度、清洁剂类型和浓度、诸如会增加多核苷酸的相对浓度的聚合物这些分子、金属离子及其浓度、螯合剂以及它们的浓度、以及本领域内已知的其他条件。
“多重化技术”在此是指可以对多种分析物进行同时测定的试验或其他分析方法。
“具有”是类似于“包括”和“包含”的开放式短语，并且包括其他元素被包括在内的情况和没有包括在内的情况。
“任选的”或“任选地”意思是后面描述的事件或状况可能发生或可能不发生，并且该描述包括该事件或状况发生的情况以及没有发生的情况。
在此披露的实施方案总体上涉及共轭聚合物的组合物，这些共轭聚合物包含多个用于共轭(或附接)到其他分子、基质、或类似物上的活性官能团。某些实施方案描述了对此类功能位点的结合以及后续共轭通过特别控制的方法和组合物。可以在共轭聚合物链的一端或两端结合多个连接物，或者通过在该聚合反应中使用的单体比率来在内部进行控制。此类连接物可以是相同的或不同的以允许多于一个的不同实体被附接到共轭聚合物结构上。
另外的实施方案描述了共轭聚合物组合物，这些组合物不仅提供了活性共轭位点而且还通过使用非离子侧链(非有效电荷)而被增溶。此类实施方案展示了异常的水溶性并且提供了与生物分子以及其他常见生物测定组分之间最小的相互作用。
在此披露的实施方案还总体上涉及包括共轭聚合物的测定法和复合物，该共轭聚合物通过其独特特性所提供的增强的信号而用于鉴定靶标生物分子或与靶分子相关联的生物分子。
在某些一般性实施方案中，该共轭聚合物直接用作结合到生物分子、基质或其他测定组分上的光学报告物。这些共轭聚合物作为伸展的集光结构起作用，该结构在被激发时可以吸收比常规有机染料更多的能量。该聚合物然后再次发出可以被检测或测量到的光。从此类共轭聚合物复合物产生的信号可以大于从其他荧光报告物获得的。
在其他实施方案中，一方面包括从共轭聚合物到结合至该聚合物上的染料或者到传感器的能量传递，该传感器可以是一种生物分子，包括生物共轭物(例如抗体、链亲和素或者核酸序列)。在此类实施方案中，通常会由于共轭聚合物激发以及随后能量传递而观察到放大的染料信号(相对于直接染料激发而言)。另外，有可能使用具有变化的能量的一系列染料，以便产生多色或者多重化检测形式的基础。
在某些实施方案中，这些中性共轭聚合物在流式细胞术和细胞分选分析中结合到抗体上来鉴定特异性细胞标记物和细胞类型。在其他实施方案中，这些共轭聚合物进一步结合到第二染料报告物上。在另外的实施方案中，这些聚合物和聚合物-染料结构结合到单克隆抗体上。
在其他实施方案中，这些中性共轭聚合物结合到用于各种夹心免疫测定的抗体上。
在一个实施方案中，用一种方法改变关于核酸传感器测定的形式，例如在Gaylord，Heeger，and Bazan，J.Am.Chem.Soc.，2003中说明的。确切地说，共轭聚合物的信号放大可以基于结合事件，以便指示杂交事件。任何建立的共轭聚合物可以被选作供体，并且一种或多种染料，优选地一种具有有效能量传递历史的染料，例如荧光素和Cy3，可以被选作受体。设想了该染料可以直接共轭至传感器分子上。如在图1中示意性显示的，该传感器可以是在溶液中或者在基质上的生物分子(例如抗体)，该共轭聚合物可以添加到该生物分子上。在图1中所示的实施方案中，一种染料可以共价地连接(生物共轭)到一种抗体(Y形结构)上，该抗体具有净负电荷。共轭聚合物的加入(以波浪线显示)可以导致在共轭聚合物与抗体之间的相互作用或者结合，从而使这些共轭聚合物和染料紧密接近。相互作用或结合可以通过任何已知的方法来实现，该方法包括但不限于：亲和素/生物素进行标记。因此可以满足荧光共振能量传递(FRET)的距离要求，并且用光(显示为hν)激发该聚合物导致了染料的发射放大了。设想了这些共轭聚合物可以在染料不具有显著吸收的波长下被激发。在一个实施方案中，该染料发射可以在比共轭聚合物发射更长的波长下。在使用中设想到，一种测定方法可以包括以下步骤：提供一种怀疑含有靶标生物分子的样本、提供共轭至信号发色团上并且能够与该靶标生物分子相互作用的传感器、提供与该传感物相互作用并且在激发时能够将能量传递到该传感物信号发色团的共轭聚合物、并且在传感器可以结合到该靶标生物分子(如果存在的话)上的条件下使该样本与该传感物以及共轭聚合物在一种溶液中相接触。接着，该方法可以包括对该样本施加一个可以激发该共轭聚合物的光源、并且检测是否从该信号发色团上发射出光。
如在此披露的，共轭聚合物与染料标记的抗体之间的相互作用或结合可以是一种提高例如生物分子靶标的检测灵敏度的可行途径。在另外一个实施方案中，将这些共轭聚合物共价附接到染料、生物分子(例如，抗体复合物)或两者上提供了若干优点，包括减少的背景和/或改进的能量传递。在直接连接到生物分子上的情况下，生物识别事件而不是非特异性聚合物相互用作或结合事件(如在图1中说明的那些)应该控制共轭共聚物的存在。以这种方式，共轭聚合物与生物分子的非特异性结合可以被消除，从而减少了任何由该共轭聚合物本身产生的背景发射。上述生物分子包括但不限于：蛋白、肽、亲和性配体、抗体、抗体片段、糖、脂、酶、以及核酸(如杂交探针和/或适体)。
总体上，在另一方面，本发明包括聚合物与亲和性配体(亲和性配体描述了对另一个生物分子具有亲和性的生物分子)的生物共轭。图2展示了一类物质，其中共轭聚合物(以波浪线示出)连接到染料、生物分子、或生物分子/染料复合物(标记为X)上。与该共轭聚合物的连接可以是通过在该共轭聚合物上作为生物共轭位点的第一功能性连接物A，该生物共轭位点能够与第二功能性连接物A’共价连接，该第二功能性连接物连接到一种生物分子和/或染料上(参见X)上。这种安排可以固定该共轭聚合物与X之间的距离，由此确保了在聚合物与X之间的特异性相互作用。设想了在这个实施方案中一种生物分子组分X可以是在此披露的多种生物分子上的任何一种，这些生物分子包括但不限于：抗体、蛋白、亲和性配体、酶、或核酸。
连接物A可以在该共轭聚合物上的任何地方，包括在该聚合物的末端位置、在一个重复子单元的内部、在多个重复子单元之间或以其任何组合的形式。同样地，连接物A’可以是连接在生物分子和/或染料上的任何地方。A-A’的连接化学可以包括但不限于：马来酰亚胺/硫醇；硫醇/硫醇；吡啶基二硫醇/硫醇；琥珀酰亚胺基碘醋酸酯/硫醇；N-琥珀酰亚胺基酯(NHS酯)，磺基二氯苯酚酯(SDP酯)，或者五氟苯基-酯(PFP酯)/胺；双琥珀酰亚胺基酯/胺；亚胺酸酯/胺；肼或胺/醛，二醛或苯甲醛；异氰酸酯/羟基或胺；碳水化合物-高碘酸酯/肼或胺；双吖丙啶/芳基叠氮化物化学；吡啶基二硫醇/芳基叠氮化物化学；炔/叠氮化物；羧基-碳二亚胺/胺；胺/磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯)/硫醇；以及胺/BMPH(N-[β-马来酰亚胺丙酸]酰肼·TFA)/硫醇。
设想到本文中的X可以是但不限于：染料、荧光蛋白、纳米材料(例如，量子点)、产生化学发光的分子、在染料与产生化学发光的分子之间的共轭物、荧光蛋白与产生化学发光的分子之间的共轭物、纳米材料(例如，量子点)与产生化学发光的分子之间的共轭物、链亲和素、亲和素、酶、酶底物、酶底物的类似物、受体、受体的配体、受体的配体的类似物、DNA、RNA、改性的核酸、DNA适体、RNA适体、改性的核酸适体、肽适体、抗体、抗原、噬菌体、细菌、或上述任何两种成分的共轭物。
在另一个方面，本发明包括共轭聚合物作为直接标记的用途。图3显示了标记的共轭聚合物的实例。在一个实施方案中，图3A显示了一种聚合物(显示为环绕的六边形)，该聚合物共轭至一种抗体上，该抗体可以是例如1°或2°抗体。该聚合物与该抗体的共轭物可以在例如测定法中用作直接报告物。在另外的实施方案中，来自该聚合物的信号不是通过其他测定组分来调节的，而是依赖于在该测定中在检测时随着特异性生物分析识别而变化的它的存在。用光(未显示)激发该聚合物可以导致聚合物发射，从而指示该抗体(1°或2°)在该测定或测定溶液中的存在。图3B和3C进一步例示了共轭聚合物作为能够检测特异性靶标以及靶标相关联的生物分子的生物分子标记的用途。图3B描绘了一种聚合物亲和素(链亲和素、中性亲和素等等)共轭物，该共轭物能够结合到生物素改性的分子、生物分子、或基质上。图3C描绘了一种核酸(DNA、RNA、PNA，等)共轭物，该共轭物能够与互补的核酸序列杂交。荧光共轭聚合物与一种能够识别靶标生物分子或者靶标相关分子(诸如在图3中例示的那些)的分子的连接或共轭提供了直接的检测手段。在另外的实施方案中，由共轭聚合物的激发所产生的信号并不被除了直接共轭至该聚合物上之外的其他测定组分所调节。在此类实施方案中，该聚合物复合物直接用作荧光标记。
在图3D的另一个实施方案中，该共轭聚合物用染料(例如发色团)来标记。在这种情况下，在该能量传递过程中，该共轭聚合物可以作为供体起作用并且该染料可以作为受体起作用。在此，该共轭聚合物可以作为集光剂来起作用，并且该共轭聚合物的激发之后是经由能量传递过程(包括但不限于FRET)将激传递给染料。这导致了放大的染料发射(与染料的直接激发相比)。在一个实施方案中，该供体共轭聚合物的荧光可以被淬灭(例如，＞90％淬灭)。仅举例而言，这在实例38中进行了例示并且在图21中示出。在一些例子中，图3D(以及在此披露了的类似的图)中的共轭聚合物可以具有多个染料附接点，这些附接点可以位于该聚合物结构的内部或末端处(仅为了展示的目的示出了单一染料)。
在直接连接到染料(图3D)或生物分子/染料复合物(如在图4中例示的)的情况下，供体-受体的距离可以是固定的，而非取决于相互作用或结合的强度，并且能量效率可以显著增加。这对于提高染料信号(或猝灭)和减少与供体-受体串扰(cross-talk)相关的背景荧光具有重要意义。在这种情况下的串扰是指共轭聚合物(供体)与染料(受体)发射峰之间的重叠。由于距离太远而无法产生能量传递的非特异性结合的共轭聚合物对背景荧光(或串扰)有贡献。供体与受体之间的更短的(固定的)距离不仅可以促进直接染料的放大，而且还可以大大淬灭该供体的发射，如在图21中仅作为举例而描绘的。这导致了在受体发射波长下更少的供体发射，随后减少了或者甚至消除了对于串扰校正的需要。
在另外的实施方案中，该共轭聚合物和信号发色团的定位通过识别事件而被带到一起，例如通过两个亲和对的结合或者通过同一靶表分子或靶标相关分子的共同识别(图5)。此类实施方案可以按基于溶液的形式或按以下进行，其中一个或多个要素被结合到另一个生物分子(细胞、组织、蛋白质、核酸等等)或基质(珠粒、孔板、表面、管等等)上。
总体上，在另一方面，本发明包括一种测定靶标生物分子或者靶标相关生物分子的方法。如图5A中所显示的，在一个实施方案中，一种共轭聚合物(以波浪线示出)可以连接到第一生物共轭物(显示为Y形)上，例如对于第二个染料标记的生物共轭物(例如1°抗体)是特异性的2°抗体。在此，在1°与2°抗体之间的识别事件将会导致供体共轭聚合物与受体染料之间的距离减少。在图5B描述的类似实施方案中，聚合物和染料标记的抗体识别出了一个共同的靶标。在任一识别事件之后，用光(以hν显示)激发该供体共轭聚合物将导致向受体染料的能量传递，例如FRET(显示为弯曲的箭头)，并且将观察到放大的染料发射(与该染料的直接激发相比)。在使用中设想到，一种测定方法可能包括过以下步骤来提供一个怀疑包含靶标生物分子的样本：提供第一生物共轭物，例如，共轭至信号发色团上并且能够与该靶标生物分子相互作用的1°抗体。这之后是提供共轭至聚合物上的第二生物共轭物，例如2°抗体或1°抗体，其中该第二生物共轭物可以结合到该第一生物共轭物或者靶标上并且在这样结合时，该共轭聚合物的激发能够将能量传递到该信号发色团。接下来，该方法包括在该第一生物共轭物可以结合到该靶标生物分子(如果存在)上的条件下使该样本与该第一生物共轭物在一种溶液中进行接触、并且使该溶液与该第二生物共轭物进行接触。该方法然后包括向该靶生物共轭上或者带标记的靶标生物分子施加光源，其中该光源可以激发该共轭聚合物；随后检测是否从该信号发色团中发射出光。
在另一方面，本发明包括一种使用共轭聚合物和传感器生物分子复合物来测定样本的方法。如图5C和D中所示，一种聚合物(以波浪线显示)可以共轭至第一生物共轭物上，例如对生物素具有强亲和性的链亲和素(SA)。在图5C中，一种传感器生物分子(例如，一种抗体，可以是1°或2°抗体)共轭至染料和第二生物共轭物(例如生物素部分)上。图5D中描绘了类似的实施方案，其中该第二生物共轭物(例如生物素部分)以及该信号发色团均共轭至核酸上。在第一与第二生物共轭物之间(例如，在SA与生物素之间)的生物识别事件之后，该共轭聚合物和染料将紧密靠近，并且该供体共轭聚合体的激发将导致能量传递到该受体染料上。染料发射将指示该第一生物共轭物(例如，抗体或核酸)的存在。与染料的直接激发相比，当通过能量传递过程(例如，FRET)间接激发时，将观察到染料信号强度的放大。
使用图5C和D中所示的实施方案的方法可以包括以下步骤：提供一种怀疑包含靶标生物分子的样本；提供一种包含共价连接的第一生物共轭物(例如，SA)的共轭聚合物；提供一种传感器生物分子复合物(包含能够与该靶标分子相互作用的传感器生物分子、信号发色团、以及能够与该第一生物共轭物结合的共价连接的第二生物共轭物)，其中在这样结合时，该共轭聚合物的激发能够将能量传递到该信号发色团上。该方法可以进一步包括以下步骤：在传感器生物分子可以结合至靶标生物分子(如果存在)上的条件下使该样本与该传感器生物分子复合物在一种溶液中相接触；使该溶液与该共轭聚合物相接触；对该样本施加一个光源，该光源可以激发该共轭聚合；并且检测是否从该信号发色团中发射出光。
此外，该共轭聚合物可以包含其他适合于共轭或附接到多于一个种类上的连接位点。图6例示了在该聚合物内增加第二连接位点。此类连接物A和B可以是相同的或不同的以便允许不同种类的正交共轭。这些连接物可以位于该聚合物上的任何地方，包括末端和内部的位置。A-A’和B-B’(以及任选地C-C’，D-D’等等)的连接化学可以包括但不限于：马来酰亚胺/硫醇；硫醇/硫醇；吡啶基二硫醇/硫醇；琥珀酰亚胺基碘醋酸酯/硫醇；N-琥珀酰亚胺基酯(NHS酯)，磺基二氯苯酚酯(SDP酯)，或者五氟苯基-酯(PFP酯)/胺；双琥珀酰亚胺基酯/胺；亚胺酸酯/胺；肼或胺/醛，二醛或苯甲醛；异氰酸酯/羟基或胺；碳水化合物-高碘酸酯/肼或胺；双吖丙啶/芳基叠氮化物化学；吡啶基二硫醇/芳基叠氮化物化学；炔/叠氮化物；羧基-碳二亚胺/胺；胺/磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯)/硫醇；以及胺/BMPH(N-[β-马来酰亚胺丙酸]酰肼·TFA)/硫醇。一种三官能连接物如市售的磺基-SBED磺基琥珀酰亚胺基[2-6-(生物素酰氨基)-2-(p-叠氮基苯甲酰氨基)-己酰氨基]-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯可以在X、Y、以及共轭聚合物之间的三向连接中起到很好的作用。
在图6中所展示的实施方案中，X或Y可以是但不限于：染料、荧光蛋白、纳米材料(例如，量子点)，产生化学发光的分子、染料与产生化学发光的分子之间的共轭物、荧光蛋白与产生化学发光的分子之间的共轭物、纳米材料(例如，量子点)与产生化学发光的分子之间的共轭物、链亲和素、亲和素、酶、酶底物、酶底物的类似物、受体的配体、受体的配体的类似物、DNA、RNA、改性的核酸、DNA适体、RNA适体、改性的核酸适体、肽适体、抗体、抗原、噬菌体、细菌、或上述任何两种的共轭物。
总体上，在另一个方面，本发明提供了一种共轭聚合物复合物，该复合物包括一种聚合物、一种传感器生物分子、以及一种用于鉴定靶标生物分子的信号发色团。如图6中所示，在一个实施方案中，聚合物(波浪线)可以通过连接物官能团A-A’而生物共轭至染料X上并且通过连接物官能团B-B’而生物共轭至生物分子Y上。如在图7中所描绘的，在一个实施方案中，聚合物可以同时生物共轭至染料和生物分子(例如一种生物识别分子)上。有用的生物分子可以包括但不限于抗体(图7A)、亲和素衍生物(图7B)亲和性配体、核酸(图7C)、蛋白、纳米颗粒、或者酶底物。已经在以上说明了在聚合物附近共价连接染料的好处。通过将受体染料和生物识别分子均固定到聚合物上，有两个好处：通过同时固定供体-受体距离而保证受体是处于供体共轭聚合物的附近(并且反之亦然)、并且还增加了指示出生物识别事件的聚合物结合的特异性。这些共价复合物可以通过单体、聚合物以及在此说明的连接化学过程进行制造。
在使用中，如图6中所示的这些实施方案可以是一种用于鉴定靶标生物分子的共轭聚合物复合物，其中该复合物包含一种共轭聚合物、一种共价连接到该共轭聚合物上的信号发色团、以及共价连接到该共轭聚合物上的传感器生物分子。该复合物中的信号发色团能够接收在该共轭聚合物激发时来自该共轭聚合物的能量，并且该传感器生物分子能够与该靶标生物分子相互作用。设想到了这些生物分子可以包括但不限于：抗体、蛋白、亲和性配体、肽、或者核酸。
在图7A所示的一个实施方案中，一种聚合物共轭至一种生物共轭物上，例如一种抗体(1°或2°)和染料上。供体共轭聚合物与受体染料之间的共价连接确保了紧密接近。供体共轭聚合物的激发导致了向该受体染料的能量传递，例如FRET。在该生物共轭物是一种抗体时，如果该抗体结合到其靶标(例如抗原)上，在供体聚合物激发后就会通过染料发射显示出来。在替代实施方案中，如在图7B中所示的，一种聚合物可以同时共轭至SA和染料上。再次，供体共轭聚合物与受体染料之间的共价连接确保了紧密接近，并且该供体共轭聚合物的激发导致了向受体染料的能量传递。该SA复合物可以用于标记或检测一个生物素标记的生物分子，如生物素酰化的抗体或核酸。聚合物激发后向染料标记进行的能量传递将导致检测到的信号大大增强(例如，更大的灵敏度)。
图7A中举例说明的实例是一种标记有染料受体并且进一步共轭至抗体上的共轭聚合物。这种串型构形可以按类似于对图3A中的结构描述的的方式来使用，但是可用于产生用于检测的二次信号(通常以多重化的形式)。在图7中的共轭聚合物复合物可以具有多个染料附接点，这些附接点可以位于该聚合物的内部或者末端处(仅为了展示性目的而示出单一染料)。
在如图3A和7A所示的其他实施方案中，一种传感器生物分子，例如1°抗体(Y形状)，共价地共轭连接到该共轭聚合物(环绕的六边形)或者共轭聚合物-染料串型复合物(悬垂的环绕星形的六边形)。在共轭聚合物激发时，来自该共轭聚合物(图3A)或染料(图7A)的发射将指示该生物复合物的存在，并且通过用适当的分析设计进行扩展，将至少被传感器分子识别的靶标的存在，从而允许用作一种报告物，例如在测定过程中。图29A和29B表示对比实例，其中该共轭聚合物共价连接到2°抗体上。
作为一个替代实施方案，该共轭聚合物可以间接地与该传感器生物分子或靶标相关生物分子相关联。图8C和8D展示了共价地共轭至生物素部分(水滴形状)上的一种序列特异的寡核苷酸探针(波浪线)。在此该共轭聚合物(环绕的六边形)或者共轭聚合物-染料串型复合物(具有悬垂的环绕星形的六边形)共价地结合或共轭至一种生物素识别蛋白(例如，亲和素、链亲和素、或者对配体生物素具高特异亲和性的类似物)上。图8A和8B展示了对比实例，其中生物素酰化抗体与该共轭聚合物的共价共轭物(图8A)相互作用并且共轭聚合物-染料串型复合物(图8B)连接至生物素识别蛋白上。靶标关联的生物分子与共轭聚合物的间接缔合作用并不限于生物素介导的相互作用。图8E和8F呈现了已经用洋地黄毒甙部分(7点星形)共价标记的序列特异性寡核苷酸(波浪线)。进而，该洋地黄毒甙部分已经通过共价连接到该共轭聚合物(图8E)上的第一抗体以及共轭聚合物-染料串型复合物(图8F)识别出。尽管没有绘制出，但考虑了以下实施方案：使用生物素酰化抗体和共价连接到共轭聚合物(或共轭聚合物-染料串型复合物)上的生物素识别蛋白、或者识别洋地黄毒甙的未标记的第一抗体以及共价连接到该共轭聚合物(或共轭聚合物-染料串型复合物)上的适当的第二抗体而进行洋地黄毒甙的间接检测。
关于共轭聚合物与受体染料之间的能量传递(例如但不限于FRET)还预测了多个另外的实施方案。考虑到多重化分析的潜力，设想到了该共轭聚合物可以连接到多种染料或信号发色团上，包括但不限于：萤光素、6-FAM、罗丹明、德克萨斯红、加利福尼亚红、iFluor594、四甲基罗丹明、羧基罗丹明、羧基罗丹明6G、羧基对甲氨基酚(carboxyrhodol)、羧基罗丹明110、级联蓝(Cascade Blue)、级联黄(Cascade Yellow)、香豆素、Cy2
Figure BPA00001609256400511
、Cy3
Figure BPA00001609256400512
、Cy3.5
Figure BPA00001609256400513
、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy-铬黄、DyLight 350、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 594、DyLight633、DyLight 649、DyLight 680、DyLight 750、DyLight 800、藻红蛋白、PerCP(多甲藻黄素叶绿素-一种蛋白)、PerCP-Cy5.5、JOE(6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素)、NED、ROX(5-(和-6)-羧基-X-罗丹明)、HEX、荧光黄、滨海蓝(Marina Blue)、俄勒冈绿(Oregon Green)488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、Alexa Fluor
Figure BPA00001609256400517
350、Alexa Fluor
Figure BPA00001609256400518
430、Alexa Fluor
Figure BPA00001609256400519
488、Alexa Fluor532、AlexaFluor546、Alexa Fluor568、Alexa Fluor
Figure BPA000016092564005113
594、Alexa Fluor
Figure BPA000016092564005114
633、Alexa Fluor
Figure BPA000016092564005115
647、Alexa Fluor
Figure BPA000016092564005116
660、Alexa Fluor680、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、BODIPY
Figure BPA000016092564005118
FL、BODIPY
Figure BPA000016092564005119
FL-Br2、BODIPY
Figure BPA000016092564005120
530/550、BODIPY
Figure BPA000016092564005121
558/568、BODIPY
Figure BPA000016092564005122
564/570、BODIPY
Figure BPA000016092564005123
576/589、BODIPY
Figure BPA000016092564005124
581/591、BODIPY
Figure BPA000016092564005125
630/650、BODIPY
Figure BPA000016092564005126
650/665、BODPYR6G、BODIPY
Figure BPA000016092564005128
TMR、BODIPY
Figure BPA000016092564005129
TR、其共轭物、以及其组合。这些实施方案包括对以上实例的修改，其中该受体染料用作测定的报告物(如在图3D、4D、7、8B、8D、8E、29B中举例说明的，其中该环绕的十点星形代表该染料)。
在某些实施方案中，在图2-10、29以及30中提供的共轭聚合物共轭物旨在但不限于用在流式细胞术、细胞分选、分子诊断、荧光原位杂交(FISH)、免疫组织化学(IHC)、聚合酶链式反应、显微术(荧光的、共焦的、2光子等等)、印迹法(例如，诺泽恩印迹法、索瑟恩印迹、西式印迹法)、cytomic珠粒阵列(Luminex形式等等)、荧光免疫分析(FIA或ELISA)、核酸序列和微阵列。
还设想了以下实施方案，其中共轭聚合物被用于通过使用与核酸扩增技术相结合的序列特异性荧光探针来增强核酸的检测和量化，这些技术例如但不限于：聚合酶链式反应、转录介导的扩增、滚动环扩增、重组酶聚合酶扩增、依赖解链酶的扩增、以及指数线性聚合酶链式反应。
图32呈现了对HybProbe检测技术的修改。在图32A中，常用作能量传递供体的染料用共价连接到该供体探针上的共轭聚合物(六边形链)替代(如右手边螺旋酶双链所表示的波浪螺旋状结构，是由于与核酸靶标的缔合作用，描绘为更长的螺旋波浪线)。在序列特异性杂交时，供体和受体(类似于供体探针但是核酸靶标的左手边所表示的)探针在空间上并置于足够靠近感兴趣的靶标核酸链上以允许在这些荧光剂之间发生能量传递。激发能量通过该共轭聚合物被转换的并且被该染料(环绕的十点星形)作为可读信号发射以允许进行核酸的量化、检测、和/或表征。增加的模版的存在允许探针共杂交事件的数量增加并且因此与来自该体染料的增加的特异性信号相关联。与在HybProbe试验中使用的熔解曲线技术相结合，设想到了与序列变化相对应的序列特异性信息在适当设计的试验中是可收集的。图32B呈现了HybProbe方法的一种“信号关闭”的改变，其中该共轭聚合物通过一种受体探针被猝灭，该探针由一种小分析荧光猝灭剂(例如但不限于Black Hole QuenchersTM、Iowa Black
Figure BPA00001609256400531
或Dabsyl)组成。
在另一个实施方案中，类似于在图4C和4D中说明的那些的共轭聚合物和共轭聚合物-染料串型复合物被用于核酸靶标的检测、量化、和/或表征中。标记有猝灭剂分子(黑圈，例如但不限于Black Hole QuenchersTM、Iowa Black
Figure BPA00001609256400532
、或Dabsyl)的核酸探针序列也共轭至一种共轭聚合物(图4C和31A)上以及一种共轭聚合物-染料串型复合物(图4D和31B)上。在图4C和D中，靶标序列的识别导致了杂交以及猝灭剂与该共轭聚合物或共轭聚合物-染料串型复合物的分离，并且在该聚合物激发时导致荧光信号增加。在图31A和31B中，该核酸探针共轭物将杂交到互补的靶标序列上，并且通过特异性酶的处理，该探针序列被劈开或者被水解从而该淬灭剂上释放该共轭聚合物或者共轭的共轭聚合物-染料串型复合物，并且在聚合物激发时导致荧光信号增加。在图31中说明的这些方法的最常见的实例是使用含核酸酶活性(例如，TaqMan PCR测定法)的DNA多聚酶。
图9显示了共轭至第二抗体(图9A)和第一抗体(图9B)上的共轭聚合物(六边形)的实例(抗体显示为Y形结构)。在测定过程中，未标记的1°抗体可以结合到抗原上，例如靶蛋白(显示为黑色三角形)上。加入共轭至一种聚合物上的2°抗体可以特异性地结合到该1°抗体上。在洗涤以去除未结合的2°抗体之后并且在使用具有适合激发波长的光时，观察到聚合物发射表明了特异性的结合(图9A)。在其他测定法实施方案中，一种聚合物标记的1°抗体可以直接与一种靶蛋白(显示为黑色三角形)相结合，并且在洗涤以去除未结合的1°抗体后并且在使用适当激发波长的光时，观察到聚合物发射表明了特异性的结合(图9B)。任选地，无论共轭至1°还是2°抗体上，该聚合物都可以进一步共轭至染料上。在这样的情况下，该共轭聚合物的光学激发可以导致能量传递到该染料上、以及与直接染料激发的结果相比放大的染料发射。染观察到聚合物发射表明了特异性的结合。
图10显示了本发明的一个实施方案的夹心型复合物的实例。在图10A中所示的测定法中，该共轭聚合物复合物由一种聚合物(以六边形显示)组成，该聚合物生物共轭至一种生物分子，例如链亲和素(X形状)上。在未标记的1°抗体结合了靶标(例如蛋白，显示为黑色三角形)之后，生物素标记的2°抗体特异性地结合到该1°抗体上。在一个分离的步骤中，该共轭聚合物复合物的加入将会导致该生物素与链亲和素之间的特异性结合。共轭聚合物的激发将会导致聚合物的发射，指示了靶蛋白的存在。另外在另一个实施方案中，生物素标记的1°抗体可以用于直接探测该靶蛋白(图10B)。在这个结合事件发生之后，链亲和素-聚合物复合物的加入将会导致该生物素与链亲和素之间的特异性结合，并且该共轭聚合物的激发将会导致聚合物的发射，指示了靶蛋白的存在。任选地，该聚合物可以进一步共轭至染料上。在这样的情况下，该聚合物的光学激发将会导致与该染料的直接激发相比染料的发射放大。自染料发射产生的信号将指示该靶蛋白的存在。
图30显示了关于在荧光免疫分析(FIA)中使用共轭聚合物的示例实施方案。在图30的画面A-C中，分析物抗原被固定在一个表面上，该表面可以包括但不限于一种microtitre板孔、珠粒颗粒、载玻片、塑料片、测流条、层流装置、微流体装置、病毒、噬菌体、组织或细胞表面。然后通过使用带标记的检测共轭物或传感器生物分子检测分析物分子。在图30A中，使用共价连接到检测抗体上的共轭聚合物进行于检测。在图30B中，使用被共价结合到该共轭聚合物上并且与一种生物素酰化的检测抗体相互作用的一种生物素结合蛋白(例如但不限于亲和素、链亲和素、或者其他高亲和性的生物素特异性衍生物)进行检测。在图30C中，使用被共价连接到该共轭聚合物上并且与一种检测抗体相互作用的一种第二抗体进行检测。在图5B中，还应用了均匀的、基于溶液的实例，其中两个分离的抗体各自结合到感兴趣的抗原上。一个抗体共价连接到该共轭聚合物上，另一个抗体共价连接到一种染料上。当结合到抗原上时，使这些对应的荧光团是空间上足够靠近的以便发生能量传递。在图30和图5B中的设计基础上预测的分析中，使用与该共轭聚合物的激发以及在该染料的发射波长下报告的信号相匹配的光来探询该样本。在图30A-C中体现的这些实例中，进一步披露了使用一种聚合物-染料串型复合物。在这样的情况下，该聚合物的光学激发将会导致染料发射的放大，如与该染料的直接激发相比。自染料发射所产生的信号将指示该靶蛋白的存在。
在另外一个方面，本发明提供了将供体能量传递到多个受体的多重化技术。通过在一种能量传递系统中使用共轭聚合物作为供体，其益处还包括到多重化的能力。单一的供体可以将能量传递到几种染料；因此通过单一的激发源，可以监测多种染料的强度。当不同类型的细胞可通过蛋白质-抗体识别事件被监测时，这可用于包括但并不局限于细胞成像(即免疫组化学)的应用。
在一个实施方案中，两种染料标记的抗体可以用一种生物材料(例如孵育的细胞系、组织切片或者血液样本)进行孵育。抗体能够识别在其表面表达靶蛋白的细胞并且特异性地结合至这些蛋白上。通过用不同染料标记这两种抗体，有可能同时监测两种不同的蛋白或者不同的细胞类型的表达。典型地，这将需要两次扫描、激发、或者成像，每次使用正确的激发波长。作为分析前的最后一个步骤，必须将这两个图像或数据组进行重叠或组合。通过使用同时与染料和共轭聚合物共轭的抗体，对该共轭聚合物可以使用一个激发波长来激发两种染料，并且单一的图像或扫描将包括来自这两个抗体的每一个的数据组。这可以通过任何数目的抗体组合来完成，只要具有足以分辨所得信号的能力即可。
还设想到了，在此说明的本发明可以用于提高任一种商业化测试的灵敏度，这些测试包括但不限于由奥拉休尔科技公司(OraSure Technologies，Inc.)(宾夕法尼亚州，伯利恒市)制造的OraQuick Rapid HIV-1/2抗体测试，是FDA-批准的用于口腔液体样本的HIV诊断测试。这个测试可以在短到20分钟内提供具有超过99百分比的准确度的筛查结果。
共轭聚合物
集光共轭聚合物体系可以有效到将能量传递至邻近的发光物质。能量传递的机制包括例如共振能量传递(Forster(或荧光)共振能量传递，FRET)、量子电荷交换(Dexte能量传递)等等。然而典型地，这些能量传递机制都处于相对较近的范围内，并且集光共轭聚合物体系紧密靠近信号发色团对于有效的能量传递是必需的。当该集光共轭聚合体系中单独发色团的数目较大时可以导致发射的放大；与该荧光团直接被泵浦光激发时相比，当入射光(“泵浦光”)处于可被集光共轭聚合物体系吸收并且传递至荧光团的波长下时，来自荧光团的发射可以更强。
在本发明中使用的这些共轭聚合物可以是电荷中性的、阳离子的、或阴离子的。在一些实施方案中，这些共轭聚合物可以是聚阳离子的共轭聚合物。在其他实施方案中，这些共轭聚合物可以是聚阴离子的共轭聚合物。在另外的实施方案中，这些共轭聚合物可以在各种重复子单元中包括阳离子的、阴离子的、和/或中性的基团。在另外的其他实施方案中，这些共轭聚合物可以是中性的共轭聚合物。在一些例子中，共轭聚合物包含可以在水溶液中提供溶解性的基团，诸如乙二醇低聚物、乙二醇聚合物、ω-铵烷氧基盐类、和/或ω-磺酸盐烷氧基盐类。在一些例子中，具有非离子侧链的中性共轭聚合物在水中或磷酸盐缓冲盐水溶液中以大于10mg/mL是可溶的，并且在某些情况下该溶解度是大于50mg/mL。在一些实施方案中，这些共轭聚合物包括末端连接位点(例如，帽化单元)、内部连接位点之一或两者。
在一些实施方案中，共轭聚合物包含一定量的一种类型的“低带隙重复单元”，使得该聚合物在约450nm到约1000nm的范围内具有吸收。这些低带隙重复单在聚合之前元可以显示出或可以不显示出这种吸收，但是的确在合并到该共轭聚合物中时引入了这种吸收。这种吸收特征允许该聚合物在不同的设置下在产生更少背景荧光的波长下被激发，这些设置中包括分析生物样本以及成像和/或检测分子。共轭聚合物的吸收向更低能量和更长波长的转移因此允许更灵敏和更可靠的方法。另外，许多可商购的仪器结合了在此波长下工作的成像部件，至少部分是为了此类问题。例如，在扩增反应的过程中进行实时检测的热循环仪以及微阵列阅读器在这个区域内工作。提供在这个区域中进行吸收的聚合物允许使此类检测方法适应这些形式，也允许进行全新的方法。
结合会降低带隙的重复单元可以产生具有此类特征的聚合物。产生将此波长下吸收光的聚合物的示例性的任选取代的种类包括：2，1，3-苯并噻二唑、苯并噁二唑(benzoxidazole)、苯并硒二唑(benzoselenadiazole)、苯并碲二唑、萘并硒二唑(naphthoselenadiazole)、4，7-二(噻吩-2-基)-2，1，3-苯并噻二唑、方酸染料、喹喔啉、二萘嵌苯、二萘嵌苯二酰亚胺、二酮吡咯并吡咯、噻吩并吡嗪低带隙商品染料、烯烃、以及氰基取代的烯烃以及其异构体。关于适合的共轭聚合物的组成、结构、特性以及合成的另外细节可以在2006年1月10日提交的现在公布为US 2006-0183140 A1的美国专利申请序列号11/329,495中找到，将其通过引用以其全文结合在此。
在一个方面，在此提供了具有化学式(I)的共轭聚合物：
其中：
每个R独立地是一种非离子侧基，该侧基能够提供超过10mg/mL的水中溶解度；
MU是一种聚合物改性单元或者带隙改性单元，该单元是沿着该聚合物主链均匀或者随机分布的并且任选地被一个或多个任选取代的取代基所取代，这些取代基是选自：卤素、羟基、C1-C12烷基、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基、C1-C12卤烷基、C1-C12烷氧基、C2-C18(杂)芳氧基、C2-C18(杂)芳氨基、(CH2)x′(OCH2CH2)y″OCH3，其中每个x′独立地是从0-20的整数，y′独立地是从0到50的整数，或者是一个C2-C18(杂)芳基基团；
每个任选的连接物L1和L2是沿着该聚合物主链均匀地或随机分布的芳基或杂芳基并且被一个或多个侧链所取代，这些侧链以一个官能团封端而用于共轭至另一个基质、分子或生物分子上，该官能团是选自：胺、氨基甲酸酯、羧酸、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇以及其被保护基团；
G1和G2各自独立地选自：氢、卤素、胺、氨基甲酸酯、羧酸、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、卤素取代的芳基、硼酸取代的芳基、硼酸酯取代的芳基、硼酸酯、任选取代的芴、以及被一个或多个侧链取代的芳基或杂芳基，该侧链是以选自以下各项的一个官能团、分子或生物分子封端的：胺、氨基甲酸酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇及其被保护基团，用于共轭至另一个基质、分子或生物分子上；
其中该聚合物在G1、G2、L1、或L2内包括至少1个官能团，该官能团是选自：胺、氨基甲酸酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、以及硫醇，该官能团允许功能性共轭至另一个分子、基质、或生物分子上；
每个虚线的键------独立地是一个单键、三键、或任选取代的亚乙烯基(-CR5＝CR5-)，其中每个R5独立地是：氢、氰基、C1-C12烷基、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基或C2-C18(杂)芳基基团，其中每个C1-C12烷基、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基或C2-C18(杂)芳基基团任选地是被一个或多个卤素、羟基、C1-C12烷基、C2-C12链烯基、C2-C12炔基基团、C1-C12烷氧基、或C1-C12卤烷基所取代；并且
n是从1至约10,000的整数；并且
a、b、c、和d限定了在该结构内每个单元的mol％，每个单元可以是均匀地或随机地重复的并且其中a是从10％到100％的mol％，b是从0到90％的mol％，并且c和d各自是从0到25％的mol％。
如在此使用的能够提供水中溶解度的非离子侧基是指不带电荷的并且允许所生成的聚合物可溶解在水中或水性溶液中而没有可见颗粒的侧基。在一些实施方案中，每个R独立地是一种非离子侧基，该侧基能够提供的水中溶解度超过10mg/mL、超过15mg/mL、超过20mg/mL、超过25mg/mL、超过30mg/mL、超过35mg/mL、超过40mg/mL、超过45mg/mL、超过50mg/mL、超过60mg/mL、超过70mg/mL、超过80mg/mL、超过90mg/mL、或者超过100mg/mL。
在一些实施方案中，在此说明的共轭聚合物包括的最小数均分子量是大于5,000g/mol、大于10,000g/mol、大于15,000g/mol、大于20,000g/mol、大于25,000g/mol、大于30,000g/mol、大于40,000g/mol、大于50,000g/mol、大于60,000g/mol、大于70,000g/mol、大于80,000g/mol、大于90,000g/mol、或大于100,000g/mol。
在一些实施方案中，每个R独立地是(CH2)x(OCH2CH2)yOCH3(其中每个x独立地是从0-20的整数，每个y独立地从0-50的整数)，或者任选地被一个或多个卤素、羟基、C1-C12烷氧基、或者(OCH2CH2)zOCH3所取代的苄基，其中z是独立地从0到50的整数。在一些例子中，每个R是(CH2)3(OCH2CH2)11OCH3。
在其他实施方案中，每个R独立地是被至少一个(OCH2CH2)zOCH3基团所取代的苄基，其中每个z是从0到50的整数。在一些例子中，每个R是被至少一个(OCH2CH2)10OCH3基团取代的苄基。在其他例子中，每个R是被至少两个(OCH2CH2)10OCH3基团取代的苄基。在另外的例子中，每个R是被至少三个(OCH2CH2)10OCH3基团取代的苄基。
在另外的实施方案中，每个R独立地是：
Figure BPA00001609256400611
其中k和l是从0到25的独立整数；
*＝共价附接的位点。
在还另外的实施方案中，每个R独立地是一个1到4代(generation)的并且具有任选的末端取代基的PAMAM、PEA、PEHAM、PPI、三分支的苯甲酸酯、或甘油的树枝状化合物，所述任选的末端取代基的是(-----)(CH2CH2O)jCH3或(-----)(OCH2CH2)jCH3并且j是从0到25的整数并且虚线(-----)各自独立地选自以下各项中的任一项或其组合：C1-C12烷基、C1-C12烷氧基、C2-C12亚烷基、酰氨基、氨基、芳基、(CH2)r(OCH2CH2)s(CH2)r(其中每个r是独立地从0-20的整数，s是独立地从0-50的整数)、氨基甲酸酯、羧酸酯、C3-C12环烷基、亚胺基、苯氧基、或C4-C18(杂)芳基基团。
在替代实施方案中，每个R独立地是：
Figure BPA00001609256400621
其中k和l是从0到25的独立整数并且虚线(-----)各自是独立地选自以下各项的任一项或其组合：C1-C12烷基、C1-C12烷氧基、C2-C12亚烷基、酰氨基、氨基、芳基、(CH2)r(OCH2CH2)s(CH2)r(其中每个r是独立地从0-20的整数，s是独立地从0-50的整数)、氨基甲酸酯、羧酸酯、C3-C12环烷基、亚胺基、苯氧基、或C4-C18(杂)芳基基团，*＝共价附接的位点。
在替代实施方案中，每个R独立地是：
Figure BPA00001609256400631
其中k和l是从0到25的独立整数并且虚线(-----)各自是独立地选自以下各项的任一项或其组合：C1-C12烷基、C1-C12烷氧基、C2-C12亚烷基、酰氨基、氨基、芳基、(CH2)r(OCH2CH2)s(CH2)r(其中每个r是独立地从0-20的整数，s是独立地从0-50的整数)、氨基甲酸酯、羧酸酯、C3-C12环烷基、亚胺基、苯氧基、或C4-C18(杂)芳基基团，*＝共价附接的位点。
在一些实施方案中，在此说明的共轭聚合物不含任选的连接物L1和/或L2。在其他实施方案中，共轭聚合物包含至少约0.01mol％、至少约0.02mol％、至少约0.05mol％、至少约0.1mol％、至少约0.2mol％、至少约0.5mol％、至少约1mol％、至少约2mol％、至少约5mol％、至少约10mol％、至少约20mol％、或约25mol％的任选连接物L1和/或L2。在一些实施方案中，共轭聚合物包含高达总计50mol％的连接物L1和L2并且可以包含约40mol％或更少、约30mol％或更少、约25mol％或更少、约20mol％或更少、约15mol％或更少、约10mol％或更少、约5mol％或更少。连接物可以均匀地或随机地沿着该聚合物主链进行分布。
在一些实施方案中，任选的连接物L1或L2具有以下结构：
Figure BPA00001609256400641
*＝用于共价附接到不饱和主链上的位点
其中R3独立地是：氢、卤素、羟基、C1-C12烷基、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基或C2-C18(杂)芳基基团，其中每个C1-C12烷基、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基或C2-C18(杂)芳基基团任选地是被一个或多个卤素、羟基、C1-C12烷基、C2-C12链烯基、C2-C12炔基基团、C1-C12烷氧基、或C1-C12卤烷基所取代，并且q是从0到4的整数。
在一些实施方案中，任选的连接物L1或L2具有如下表示的结构：
Figure BPA00001609256400642
*＝用于共价附接到不饱和主链上的位点
其中A是用于共轭、链延长、或交联的位点并且是-[O-CH2-CH2]t-W、或者(C1-C12)烷氧基-X；
W是-OH或-COOH；
X是-NH2、-NHCOOH、-NHCOOC(CH3)3、-NHCO(C3-C12)环烷基(C1-C4)烷基-N-马来酰亚胺；或者-NHCO[CH2-CH2-O]uNH2；
t是从1到20的整数；并且
u是从1至8的整数。
在其他实施方案中，任选的连接物L1或L2是选自具有以下结构的a-h所组成的组：
Figure BPA00001609256400651
*＝用于共价附接到不饱和主链上的位点
其中R’独立地是：H、卤素、C1-C12烷基、(C1-C12烷基)NH2、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基、C1-C12卤烷基、C2-C18(杂)芳基、C2-C18(杂)芳氨基、-[CH2-CH2]r’-Z1、或者(C1-C12)烷氧基-X1；并且其中Z1是-OH或-COOH；X1是-NH2、-NHCOOH、-NHCOOC(CH3)3、-NHCO(C3-C12)环烷基(C1-C4)烷基-N-马来酰亚胺；或者-NHCO[CH2-CH2-O]s’(CH2)s’NH2；r’是从1到20的整数；并且s’各自独立地是从1到20的整数；(CH2)3(OCH2CH2)x”OCH3，其中x”独立地是从0到50的整数；或者是任选地被一个或多个卤素、羟基、C1-C12烷氧基、或者(OCH2CH2)y”OCH3所取代的苄基，其中y”独立地是从0到50的整数，并且R’是与R不同的；
其中R15是选自具有以下结构的l-t组成的组：
并且k是2、4、8、12或24；*＝用于共价附接到主链上的位点。
在某些实施方案中，任选的连接物L1或L2是
Figure BPA00001609256400662
在一些实施方案中，G1和G2是任选取代的芳基，其中该任选的取代基是选自：卤素、胺、氨基甲酸酯、羧酸、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硼酸、硼酸根基团、硼酸酯、以及任选取代的芴。
在其他实施方案中，G1和G2是相同的。在另外的实施方案中，G1和G2是不同的。G1和G2可以是活化的单元，这些单元允许进一步的共轭、交联、或者聚合物链延伸，或者它们可以是非活化的终止单元。
在一些实施方案中，G1和G2是独立地选自如下表示的结构：
*＝用于共价附接到主链上的位点
其中R11是一种键、C1-C20烷基、C1-C20烷氧基、C2-C20亚烷基、C2-C20炔、C3-C20环烷基、C1-C20卤烷基、(CH2)x(OCH2CH2)p(CH2)x(其中x各自独立地是从0到20的整数，p独立地是从0到50的整数)、芳基、C2-C18(杂)芳基、苯氧基、酰胺基、氨基、氨基甲酸酯、羧酸酯、碳酸酯、硫化物、二硫化物、或亚胺基的基团中的任何一种或其组合；这些基团是以一种官能团封端的，该官能团是选自：胺、氨基甲酸酯、羧酸酯、羧酸、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇、及其被保护基团，用于共轭至另一个基质、分子或生物分子上。
在其他实施方案中，G1和G2各自独立地选自具有以下结构的1-18组成的组：
Figure BPA00001609256400681
*＝用于共价附接到主链上的位点
其中R15是选自具有以下结构的l-t组成的组：
Figure BPA00001609256400691
并且k是2、4、8、12、或24。
在另外的实施方案中，G1和G2是
Figure BPA00001609256400692
或者
Figure BPA00001609256400693
在一些实施方案中，任选的连接物L1和/或L2、G1和/或G2可以进一步共轭至一种有机染料、生物分子、或者基质上。共价连接可以通过任何已知的方法来引入并且可以包括但不限于：涉及马来酰亚胺/硫醇；硫醇/硫醇；吡啶基二硫醇/硫醇；琥珀酰亚胺基碘醋酸酯/硫醇；N-琥珀酰亚胺基酯(NHS酯)，磺基二氯苯酚酯(SDP酯)，或者五氟苯基-酯(PFP酯)/胺；双琥珀酰亚胺基酯/胺；亚胺酸酯/胺；肼或胺/醛，二醛或苯甲醛；异氰酸酯/羟基或胺；碳水化合物-高碘酸酯/肼或胺；双吖丙啶/芳基叠氮化物化学；吡啶基二硫醇/芳基叠氮化物化学；炔/叠氮化物；羧基-碳二亚胺/胺；胺/磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯)/硫醇；以及胺/BMPH(N-[β-马来酰亚胺丙酸]酰肼·TFA)/硫醇的化学作用。
在一些实施方案中，MU是选自具有以下结构a’-k’组成的组：
Figure BPA00001609256400701
*＝用于共价附接到不饱和主链上的位点
其中，R是一种非离子侧基，该侧基能够提供超过10mg/mL的水中溶解度。非离子侧基包括先前对于具有化学式(I)的聚合物所描述的那些。
如在此使用的，在一些实施方案中，侧链是以下各项中的任一项或其组合：一种键、C1-C20烷基、C1-C20烷氧基、C2-C20亚烷基、C2-C20炔、C3-C20环烷基、C1-C20卤烷基、(CH2)x(OCH2CH2)p(CH2)x(其中x各自独立地是从0到20的整数，p独立地是从0到50的整数)、芳基、C2-C18(杂)芳基、苯氧基、酰胺基、氨基、氨基甲酸酯、羧酸酯、碳酸酯、硫化物、二硫化物、或亚胺基的基团，该侧链将一种聚合物与官能团进行连接从而共轭至另一个基质、分子、或生物分子上。
在一些实施方案中，具有化学式(I)的共轭聚合物具有化学式(Ia)的结构：
Figure BPA00001609256400711
其中R、L1、L2、G1、G2、MU、a、b、c、d以及n是如前面对化学式(I)描述的。
在另外一个方面，具有化学式I的共轭聚合物具有化学式(Ib)的结构：
其中G1或G2中的至少一个包括一个功能性共轭位点。
在另外一个方面，具有化学式I的共轭聚合物具有化学式(Ic)的结构：
Figure BPA00001609256400713
其中L1包括一种功能性的共轭位点。
在另外一个方面，具有化学式I的共轭聚合物具有化学式(Id)的结构：
Figure BPA00001609256400721
其中G1或G2中的至少一个包括一个功能性共轭位点。
在另外一个方面，具有化学式I的共轭聚合物具有化学式(II)的结构：
Figure BPA00001609256400722
其中L1、G1、G2、a、c、n以及虚线键是先前对于化学式(I)描述的。
在一些实施方案中，具有化学式(II)的共轭聚合物具有化学式(IIa)的结构：
Figure BPA00001609256400723
其中L1、G1、G2、a、c、以及n是先前对于化学式(I)描述的。
在另外一个方面，具有化学式I的共轭聚合物具有化学式(III)的结构：
Figure BPA00001609256400731
其中L1、G1、G2、a、c、n以及虚线键是先前对于化学式(I)描述的。
在一些实施方案中，具有化学式(III)的共轭聚合物具有化学式(IIIa)的结构：
Figure BPA00001609256400732
其中L1、G1、G2、a、c、以及n是先前对于化学式(I)描述的。
在另外一个方面，具有化学式I的共轭聚合物具有化学式(IV)的结构：
Figure BPA00001609256400733
其中R5各自独立地是：氢、氰基、C1-C12烷基、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基或C2-C18(杂)芳基基团，其中每个C1-C12烷基、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基或C2-C18(杂)芳基基团任选地被一个或多个卤素、羟基、C1-C12烷基、C2-C12链烯基、C2-C12炔基基团、C1-C12烷氧基、或C1-C12卤烷基所取代；并且
L1、G1、G2、a、c、n以及虚线键是先前对于化学式(I)描述的。
在另外一个方面，具有化学式I的共轭聚合物具有化学式(V)的结构：
Figure BPA00001609256400741
其中R5各自独立地是：氢、氰基、C1-C12烷基、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基或C2-C18(杂)芳基基团，其中C1-C12烷基、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基或C2-C18(杂)芳基基团各自任选地被一个或多个卤素、羟基、C1-C12烷基、C2-C12链烯基、C2-C12炔基基团、C1-C12烷氧基、或C1-C12卤烷基所取代；并且
L1、G1、G2、a、c、n以及虚线键是先前对于化学式(I)描述的。
还在此提供了具有以下化学式的结构的聚合物：
Figure BPA00001609256400751
其中：G1和G2各自独立地选自：氢、卤素、胺、氨基甲酸酯、羧酸、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、卤素取代的芳基、硼酸取代的芳基、硼酸酯取代的芳基、硼酸酯、以及任选取代的芴；L是一个键或一个芳基或杂芳基的基团，它是沿着该聚合物主链均匀或者随机分布的并且任选地被一个或多个任选取代的取代基所取代，这些取代基是选自：卤素、羟基、C1-C12烷基、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基、C1-C12卤烷基、C1-C12烷氧基、C2-C18(杂)芳氧基、C2-C18(杂)芳氨基、(CH2)x(OCH2CH2)pOCH3其中每个x独立地是从0-20的整数，p独立地是从0到50的整数，或者一个C2-C18(杂)芳基基团；L1、L1’、L2以及L2’各自独立地是共价键、C1-C12亚烷基、C3-C12亚环烷基、C2-C12亚链烯基、C2-C12亚炔基、(C6-C18)芳基(C1-C12)亚烷基、(C6-C18)芳基(C2-C12)亚链烯基、(C6-C18)芳基(C1-C12)亚炔基、C6-C18亚芳基、-Y1-[O-Y2]p-、-O-Y1-[O-Y2]p-，其中每个C1-C12亚烷基、C3-C12亚环烷基、(C6-C18)芳基(C1-C12)亚烷基、或者C6-C18亚芳基的基团各自任选地被一个或多个卤素、羟基、C1-C12烷基、C2-C12链烯基、C2-C12炔基团、C1-C12烷氧基、C1-C12卤烷基、-Y1-[O-Y2]p-或-O-Y1-[O-Y2]p-中的一个或多个所取代；q是0或1到8的整数；p是从1到24的整数；Y1和Y2各自独立地是共价键、或C1-12亚烷基基团、C3-C12亚环烷基、C2-C18(杂)亚芳基、(C6-C18)芳基(C1-C12)亚烷基，其中每个C1-12亚烷基基团、C3-C12亚环烷基、C2-C18(杂)亚芳基、(C6-C18)芳基(C1-C12)亚烷基各自任选地被一个或多个卤素、羟基、C1-C12烷基、C2-C12链烯基、C2-C12炔基团、C1-C12烷氧基、或C1-C12卤烷基所取代；E1和E1’各自独立地是氢、C1-C6烷基、-OH、-COOH、-SH、-SR、-SHR+、SR2 +、-SO3 -、-PO4 -、Br、-NH2、-NHR、-NR2、-NH3 +、-NH2R+、-NHR2 +或-NR3 +、其中并且每个R独立地是一个C1-C6烷基，并且-SHR+、SR2 +、-SO3 -、-PO4 -、-NH3 +、-NH2R+、-NHR2 +或-NR3 +，各自任选地具有一个缔合的抗衡离子；并且n是从1到约1000的整数。
还在此提供了具有以下化学式的结构的聚合物：
Figure BPA00001609256400761
其中R各自独立地是O(CHx)、或(CH2)3(OCH2CH2)pOCH3(其中x各自独立地是从0-20的整数，p各自独立地是从0到50的整数)或者任选地被一个或多个卤素、羟基、C1-C12烷氧基、或者(OCH2CH2)mOCH3所取代的苄基，其中m自独立地是从0到50的整数；G1是选自：氢、卤素、胺、氨基甲酸酯、羧酸、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、任选取代的芳基、卤素取代的芳基、硼酸取代的芳基、硼酸酯取代的芳基、硼酸酯、以及任选取代的芴；并且n是从1到约10000的整数。
共轭聚合物的另外的实施方案在以下实例中进行了说明。
共轭聚合物的制备
在此说明的共轭聚合物的合成可以使用在化学文献中说明的手段、使用在此说明的方法、或者它们的一种组合来完成。
在此说明的共轭聚合物可以使用本领域普通技术人员已知的标准合成技术或者使用本领域已知的方法结合在此说明的方法来进行合成。另外，在此呈现的溶剂、温度、和其他反应条件可以根据本领域普通技术人员的实践和知识进行改变。
在具有化学式(1)的共轭聚合物以及具有如在此描述的前一部分中描述的这些结构的聚合物的合成中使用的起始材料可以从商业来源获得，如奥尔德里奇化工公司(威斯康辛州，密尔沃基)、西格玛化学公司(密苏里州圣路易斯市)，或者可以合成这些起始材料。在此说明的这些聚合物、以及其他具有不同取代基的相关聚合物可以使用本领域普通技术人员已知的技术和材料进行合成，诸如像在March，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY.[高等有机化学]第四版(Wiley 1992)；Carey和Sundberg，ADVANCED ORGANICCHEMISTRY[高等有机化学]第四版，A和B卷(Plenum 2000，2001)，以及Green和Wuts，PROTECTTVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS[有机合成中的保护基团]第三版，(Wiley 1999)(将其全部通过引用以其全文结合在此)中说明的。用于制备如在此披露的聚合物的一般方法可以从该领域中的已知反应中衍生，并且这些反应可以通过使用适当的试剂和条件来进行改性，这是技术人员将认识到的，以便引入在此处提供的化学式中发现各种部分。作为一种引导，可以使用以下合成方法。
总体上，芴聚合物结构的聚合反应可以使用本领域普通技术人员已知的聚合技术或者使用本领域已知的方法结合在此说明的方法来完成。例如，聚合反应可以通过与市售的芴-二卤化物单体，例如2，7-二溴芴，以及其二硼酸或者酯的衍生物进行苏楚基偶联(Suzuki coupling)来实现：
Figure BPA00001609256400781
结构A-1和A-2通过一种金属催化剂来催化以便形成具有多个终止点的示例性聚合物A-3，终止点标记为Y。Y各自独立地是-H、-Br、-B(OH)2、或硼酸酯，例如4，4，5，5，-四甲基-1，3，2-二噁环戊硼烷基。
从一种芴-二卤化物单体合成二硼酸酯衍生物也可以通过与双(频那醇合)二硼的苏楚基偶联来来完成的：
Figure BPA00001609256400782
取代基如乙二醇低聚物或乙二醇聚合物可以在聚合之前附接到多个单体上或者在聚合之后附接到该聚合物其本身上。被mPEG化的基团取代的芴单体的合成的示例性方案如下：
Figure BPA00001609256400783
将2，7-二溴芴(B-1)和3-溴丙醇在一种强碱(如氢氧化钠、氢氧化钾、或者类似物)以及一种相转移催化剂(例如四丁基溴化铵)的存在下进行加热并且反应到完成以便形成2，7-二溴-9，9-二(3’-羟基丙烷基)芴(B-2)。B-2的-OH基团在吡啶的存在下被甲苯磺酰氯进行甲苯磺酸化(tosylated)并且允许其反应到完成而形成2，7-二溴-9，9-二(3’-甲苯磺酸基丙烷基)芴(B-3)。然后使B-3与一种mPEG(x)醇在叔丁醇钾的存在下进行反应以便形成具有附接的mPEG链的B-4。mPEG醇可以具有1-50个mPEG链。典型的大小包括但不限于mPEG5、mPEG8、mPEG11、mPEG24。在一个替代方案中，mPEG醇可以首先通过甲苯磺酰氯进行甲苯磺酸化并且然后与B-2反应而形成B-4。
取代的单体，如示例性的结构B-4，在此处披露的方案中可以进一步衍生成二硼酸酯并且随后用于诸如通过苏楚基偶联进行聚合。聚合物芴类还可以通过使用其他涉及有机金属催化的反应方案来获得。例如，Yamamoto反应使用了一种基于镍(0)的催化剂用于芳基卤单体(像，示例性的结构B-4)的均同偶联。另外，共轭聚合物可以使用史蒂勒(Stille)、赫克(Heck)、以及Sonogashira偶联反应来进行合成。参见Yamamoto等人的Macromolecules[大分子]25：1214-1223，1992；Kreyenschmidt等人的Macromolecules[大分子]28：4577-4582，1995；以及Pei等人的，J.Am.Chem.Soc.[美国化学协会会志]118：7416-7417，1996关Yamamoto反应的方案。还参见Leclerc，Polym.Sci.[聚合物科学]A部分：Polym.Chem.[聚合物化学]39：2867-2873，2001，关于史蒂勒反应的方案；Mikroyannidis等人，J.Polym.Sci.[聚合物科学杂志]A部分：Polym.Chem.[聚合物化学]45：4661-4670，2007关于赫克反应方案；以及Sonogashira等人，Tetrahedron Lett.[四面体快报]16：4467-4470，1975，以及Lee等人，Org.Lett.[有机快报]3：2005-2007，2001，关于Sonogashira反应的方案。
连接物和帽化单元可以通过与前面说明的类似的机制而共轭至芴聚合物主链上。例如，帽化单元的溴代-和硼酸酯可以用于悬垂在聚合物的一端或两端。使用帽化单元的溴-和硼酸酯将附加一种聚合物的两端上。使用仅一种形式，如帽化单元的溴代酯或硼酸酯之一，将仅仅附加以其对应互补物封端的那些末端，并且关于对称的A-A+B-B，可以用聚合反应来统计地改变一种聚合物的仅一个末端。关于不对称的聚合物，这种途径被用于在化学上确保这些聚合物仅在单一的链末端处被改性。图11描绘了对示例性的芴聚合物通过溴苯、苯基硼酸、或者两者使用苏楚基偶联而附加上带有一个或多个苯基的Y端。
帽化单元还可以通过首选使一种溴代的帽化单元与一种具有Y末端的聚合物发生反应并且随后使该聚合物与一种硼酸酯帽化单元发生反应来不对称地进行附加。示例性的溴代酯以及硼酸酯帽化单元包括但不限于以下结构：
Figure BPA00001609256400801
另外的帽化单元可以在此处或者在以下实例说明的结构1-31及其附接方法中找到。
将任选的连接物结合到共轭聚合物主链中在2007年10月8日提交的作为美国申请号2008/0293164公布的美国申请序列号11/868,870中进一步进行了说明，将该申请通过引用以其全文结合在此。
一种希望的任选连接物的并入可以通过改变任选的连接物与双官能单体的摩尔比而实现。例如，可以通过将一个百分比的这些双官能单体之一用一种类似的双官能的任选连接物(它们包括感兴趣的共轭位点)进行取代来并入一种任选的连接物。包括在该聚合物中的连接位点的数目和类型受到该聚合反应中这些单体与任选连接物的进料比率所控制。通过改变进料比，共轭聚合物可以包含至少约0.01mol％的连接物L，并且可以包含至少约0.02mol％、至少约0.05mol％、至少约0.1mol％、至少约0.2mol％、至少约0.5mol％、至少约1mol％、至少约2mol％、至少约5mol％、至少约10mol％、至少约20mol％、或者至少约30mol％。这些共轭聚合物可以包含高达100mol％的连接物L，并且可以包含约99mol％或更骚、约90mol％或更少、约80mol％或更少、约70mol％或更少、约60mol％或更少、约50mol％或更少、或约40mol％或更少。连接物可以均匀地或随机地沿着该聚合物主链进行分布。在另外的实施方案中，一种任选的连接物可以进一步允许所生成的聚合物共价附接到生物分子、第二报告物、或者其他测定成分上。
在替代实施方案中，在此说明的用于并入任选连接物的方法可以与引入具有连接位点的帽化单元的方法结合使用，以便产生具有用于共轭的内部和末端连接位点的聚合物。一种具有任选连接物和末端帽化单元(具有用于共轭的连接位点)两者的聚合物的非限制性应用是聚合物-染料-生物分子串型共轭物，其中该聚合物被用作针对一种第二染料受体的能量传递供体，如在FRET中，因此使发射波长偏向对应染料的波长。
在了解以下展示性和非限制性实例之后，本领域的普通技术人员将进一步认识到本披露的各种合成和聚合方法以及实施方案。
抗原-抗体的相互作用
抗原与抗体之间相互作用与其他非共价蛋白-蛋白的相互作用相同。总体上，在抗原与抗体之间存在四种类型的结合相互作用：(i)氢键，(ii)分散力，(iii)路易斯酸与路易斯碱之间的静电力，以及(iv)疏水性相互作用。某些物理力促进了抗原-抗体结合，例如，表位形状与不同抗体结合位点的配合或互补。此外，其他材料和抗体可以与抗体交叉反应，由此竞争可获得的自由抗体。
抗原与抗体之间结合的亲和常数和特异性的测量是决定免疫测定效率的一个关键因素，不仅用于评估最佳的抗原和抗体制备物以便使用、而且一旦确定基本的免疫测定设计就可用于维持质量控制。
抗体
抗体分子属于被称为免疫球蛋白的血浆蛋白家族，其基础构建块、免疫球蛋白折叠或域，被以不同形式用于免疫系统以及其他生物识别系统的许多分子中中。一种典型的免疫球蛋白具有四种多肽链，包含一个被称为可变区域的抗原结合区域以及一个被称为恒定区域的非变化区域。
天然抗体和免疫球蛋白通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成。每个轻链通过一个共价的二硫键连接到一个重链上，但不同免疫球蛋自同种型的重链之间二硫键的数目不同。每个重链和轻链还具有规律地间隔开的链内二硫桥。每个重链在一个末端具有一个可变区域(VH)，接着是多个恒定区域。每个轻链在一个末端具有一个可变区域(VL)，在其另一个末端具有一个恒定区域。该轻链的恒定区域与该重链的第一恒定区域相对齐，并且该轻链的可变区域与该重链的可变区域相对齐。
取决于它们的重链恒定区域中的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为不同的类别。存在至少五(5)个主要的免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG、以及IgM，并且其中几个可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3以及IgG-4；IgA-1和IgA-2。不同类别的免疫球蛋白的亚单元结构和三维构象是众所周知的。关于抗体结构、功能、使用和制备的另外细节在2006年2月14日授权的美国专利号6,998,241中进行了讨论，将其全部内容通过引用结合在此。
夹心测定
抗体或多抗体夹心测定是本领域的普通技术人员所熟知的，包括在1984年12月4日授权的美国专利号4,486,530以及其中指出的参考文件中所披露的。在图6、7、8、9、10、以及14中说明的这些结构可以直接按照描述的来使用或者以各种夹心构型来使用，包括在实例37中说明的那些。一种夹心构形或夹心测定是指使用连续的识别事件来建立起多种生物分子的层，并且使用报告元件来显示特定生物分子(例如靶标生物分子或靶标相关联的生物分子)的存在。一个标准实例将是抗体的连续使用。在这些测定中，第一抗体结合靶标，第二抗体结合第一抗体，第三抗体可结合第二抗体，以此类推。每一个接续的层都可加上额外的报告基团。另一个策略是重复加入两个(或多个)可互相识别的组分的交替层，或在链识别关系中两个以上的组分，其包含一个或这两个多聚结构形式的组分。在这样的设置中，每个多聚结构中的一个或多个官能团可用报告基团来标记且未被占据的官能团可作为其他组分的识别位点，并且这个系统将随后提供一个用于信号放大的平台。这种方法的一个典型实例是使用链亲和素-报告物共轭物和生物素酰化的抗链亲和素抗体。在此类测定中，生物素酰化的传感器分子(核酸或抗体)可以用于结合靶标生物分子，它随后被一种检测系统进行识别，该检测系统包含链亲和素-报告物共轭物和生物素酰化的抗链亲和素抗体。在这种情况下，通过连续几轮的生物素酰化抗体与被标记的链亲和素复合物的相互作用，就可以构建这种夹心结构以便实现信号放大。通过共轭聚合物与该生物素酰化抗体或者链亲和素报告物复合物的额外共轭，有可能进一步增加该信号输出。实质上，在这种类型的信号放大系统中一种共轭聚合物的整合可以进一步将信号放大到更高水平。
在图6、7、8、9、10、14、15、16、以及17中说明的这些共轭聚合物聚合体可以用于通过直接将集光共轭聚合物整合到常用的识别元件中来创建光学增强的夹心试验。该共轭聚合物的共轭结构的好处还可以直接应用到第一靶识别要素上，而无需连续的识别要素。例如，第一抗体可以直接共轭至聚合物-染料复合物上，如在图14中所示。这样一种复合物可以用于直接探查靶标生物分子的存在。
多核苷酸
扩增的靶多核苷酸可以进行扩增后处理。例如，在一些情况下，可能希望的是在杂交之前将该靶标多核苷酸破碎以便提供更容易接近的片段。通过任何会产生适合所进行试验的大小的片断的方法来进行核酸的碎裂；适合的物理、化学、以及酶方法是本领域中众所周知的。
扩增反应可以在以下条件下进行：这些条件允许该传感器多核苷酸在至少部分扩增循环中与扩增产物杂交。当以这种方式来进行测定时，该杂交事件的实时检测可以通过监测扩增过程中的光发射来进行。
实时PCR产物分析(以及相关的实时逆转录PCR)提供了一种众所周知的实时PCR监测技术，这种技术已经用于许多应用中，其可以被适配为用于在此说明的方法(参见，Laurendeau等人(1999)“TaqMan PCR-based gene dosage assay for predictive testing inindividuals from a cancer family with INK4 locus haploinsufficiency”Clin Chem[临床化学]45(7)：982-6；Laurendeau等人(1999)“Quantitation of MYC gene expression in sporadic breast tumors with areal-time reverse transcription-PCR assay[在偶发性乳腺肿瘤中使用实时逆转录PCR分析来量化MYC基因表达]”Clin Chem[临床化学]59(12)：2759-65；以及Kreuzer等人(1999)“LightCycler technologyfor the quantitation of bcr/abl fusion transcripts[用于量化bcr/abl融合转录本的LightCycler技术]”Cancer Research[癌症研究]59(13)：3171-4，将其全部通过引用进行结合)。
样本
原则上，样本可以是任何怀疑包含能够引起共轭聚合物复合物的激发的靶标生物分子(例如，抗体、蛋白、亲和性配体、肽、核酸、等等)的材料。在一些实施方案中，该样本可以是任何来源的生物材料，其包含可以从活的生命体(包括细胞、组织、或体液)中直接或间接获得的生物分子、以及由该生命体留下的沉积物，包括病毒、支原体属、以及化石。该样本可以整体或部分地包含一种通过合成手段制备的靶标生物分子。典型地，获得的样本是主要为水性的介质或分散于主要为水性的介质中。该样本的非限制性实例包括：血液、尿、精液、奶、痰、黏液、口腔拭子、阴道拭子、直肠拭子、抽出物、针吸活检组织、例如通过外科手术或尸检获得组织切片、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤外分泌物、呼吸道、消化道、以及泌尿生殖道、泪液、唾沫、肿瘤、器官、体外细胞孵育组分样本(包括但不限于，细胞在细胞孵育介质中生长而产生的条件孵育液、推定被病毒感染的细胞、重组细胞、以及细胞组分)、以及包含多核苷酸序列的重组库。
该样本可以是已知包含靶标生物分子或其替代物的阳性对照样本。还可以使用一种阴性对照样本，尽管不期望其包含该靶标生物分子，但怀疑其包含它(通过一种或多种试剂的污染)或者另一种能够产生假阳性的成分，并且其测试是为了确认在给定分析中所使用试剂没有被靶标生物分子污染、以及确定给定的一组分析条件是否产生了假阳性(甚至在样本中缺乏靶标生物分子情况下的阳性信号事件)。
可以将该样本进行稀释、溶解、悬浮、萃取、或其他处理以便溶解和/或纯化存在的任何靶标多核苷酸或者使其能够接近扩增方案中使用的试剂或接近检测试剂。当该样本包含细胞时，细胞可被裂解或通透化来释放细胞内的多核苷酸。一步通透化缓冲液可以用于溶解细胞，这允许在溶解后直接进行进一步的步骤，例如聚合酶链反应。
有机染料
有机染料包括信号发色团和荧光团。在一些实施方案中，可以采用一种信号发色团或者荧光团，例如来接收从激发态的任选活性单元传递的能量、或者与标记的探针交换能量、或者用于多个能量传递方案中。在此说明的在本发明中有用的荧光团包括任何可以吸收适当波长的能量并且发射或者传递能量的物质。对于多重化试验，多个不同的荧光团可用于可检测地不同的发射光谱。典型的荧光团包括荧光染料、半导体纳米晶体、镧系螯合物、以及荧光蛋白。
示例性的荧光染料包括萤光素、6-FAM、罗丹明、德克萨斯红、四甲基罗丹明、羧基罗丹明、羧基罗丹明6G、羧基对甲氨基酚、羧基罗丹明110、级联蓝、级联黄、香豆素、Cy2
Figure BPA00001609256400871
、Cy3
Figure BPA00001609256400872
、Cy3.5
Figure BPA00001609256400873
、Cy5
Figure BPA00001609256400874
、Cy5.5、Cy-铬、DyLight 350、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 594、DyLight 633、DyLight649、DyLight 680、DyLight 750、DyLight 800、藻红蛋白、PerCP(多甲藻黄素叶绿素——一种蛋白)、PerCP-Cy5.5、JOE(6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素)、NED、ROX(5-(和-6)-羧基-X-罗丹明)、HEX、罗氏黄、滨海蓝、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、Alexa Fluor
Figure BPA00001609256400881
350、Alexa Fluor
Figure BPA00001609256400882
430、Alexa Fluor
Figure BPA00001609256400883
488、Alexa Fluor
Figure BPA00001609256400884
532、Alexa Fluor
Figure BPA00001609256400885
546、Alexa Fluor568、AlexaFluor594、Alexa Fluor
Figure BPA00001609256400888
633、Alexa Fluor647、Alexa Fluor
Figure BPA000016092564008810
660、Alexa Fluor
Figure BPA000016092564008811
680、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、BODIPYFL、BODIPY
Figure BPA000016092564008813
FL-Br2、BODIPY
Figure BPA000016092564008814
530/550、BODIPY
Figure BPA000016092564008815
558/568、BODIPY
Figure BPA000016092564008816
564/570、BODIPY
Figure BPA000016092564008817
576/589、BODIPY
Figure BPA000016092564008818
581/591、BODIPY
Figure BPA000016092564008819
630/650、BODIPY
Figure BPA000016092564008820
650/665、BODPY
Figure BPA000016092564008821
R6G、BODIPY
Figure BPA000016092564008822
TMR、BODIPY
Figure BPA000016092564008823
TR、其共轭物、以及其组合。示例性镧系螯合物包括铕螯合物、铽螯合物、以及钐螯合物。
多种多样的荧光半导体纳米晶体(“SCNC”)在本领域内是已知的；用于生产和使用半导体纳米晶体的方法描述在：在1999年5月27日公开的PCT公开号WO 99/26299，发明人为Bawendi等人；在1999年11月23日授予Weiss等人的USPN 5,990,479；以及Bruchez等人，Science[科学]281：2013，1998中。半导体纳米晶体可以能以非常窄的发射带和明确限定的峰发射波长获得，允许使用大量不同的SCNC在同一分析中作为信号发色团，任选地与其他非-SCNC类型的信号发色团组合。
示例性多核苷酸特异性染料包括：吖啶橙、吖啶同源二聚体、放线菌素D、7-氨基放线菌素D(7-AAD)、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA)、BOBOTM-1碘化物(462/481)、BOBOTM-3碘化物(570/602)、BO-PROTM-1碘化物(462/481)、BO-PROTM-3碘化物(575/599)、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚双乳酸盐(DAPI，双乳酸盐)、二氢乙锭(dihydroethidium)(氢乙锭(hydroethidine)、二氢乙锭(氢乙锭)、二氢乙锭(氢乙锭)、溴化乙锭、二氮氯氮化乙锭(ethidium diazide chloride)、乙锭同源二聚体-1(EthD-1)、乙锭同源二聚体-2(EthD-2)、单叠氮溴化乙锭(EMA)、碘化己锭、Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580、Hoechst S769121、羟芪巴脒(hydroxystilbamidine)、甲磺酸酯、JOJOTM-1碘化物(529/545)、JO-PROTM-1碘化物(530/546)、LOLOTM-1碘化物(565/579)、LO-PROTM-1碘化物(567/580)、NeuroTraceTM 435/455、NeuroTraceTM 500/525、NeuroTraceTM515/535、NeuroTraceTM 530/615、NeuroTraceTM 640/660、OliGreen、PicoGreen
Figure BPA00001609256400891
ssDNA、PicoGreendsDNA、POPOTM-1碘化物(434/456)、POPOTM-3碘化物(534/570)、PO-PROTM-1碘化物(435/455)、PO-PROTM-3碘化物(539/567)、碘化丙锭、RiboGreen
Figure BPA00001609256400893
、SlowFade
Figure BPA00001609256400894
、SlowFade
Figure BPA00001609256400895
Light、SYBR
Figure BPA00001609256400896
绿I、SYBR
Figure BPA00001609256400897
绿II、SYBR金、SYBR101、SYBR
Figure BPA000016092564008910
102、SYBR
Figure BPA000016092564008911
103、SYBR
Figure BPA000016092564008912
DX、TO-PRO
Figure BPA000016092564008913
-1、TO-PRO
Figure BPA000016092564008914
-3、TO-PRO
Figure BPA000016092564008915
-5、TOTO-1、TOTO
Figure BPA000016092564008917
-3、YO-PRO
Figure BPA000016092564008918
-1(噁唑黄)、YO-PRO
Figure BPA000016092564008919
-3、YOYO
Figure BPA000016092564008920
-1、YOYO
Figure BPA000016092564008921
-3、TO、SYTOX
Figure BPA000016092564008922
蓝、SYTOX
Figure BPA000016092564008923
绿、SYTOX
Figure BPA000016092564008924
橙、SYTO
Figure BPA000016092564008925
9、SYTOBC、SYTO40、SYTO41、SYTO
Figure BPA000016092564008929
42、SYTO
Figure BPA000016092564008930
43、SYTO
Figure BPA000016092564008931
44、SYTO
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45、SYTO
Figure BPA000016092564008933
蓝、SYTO
Figure BPA000016092564008934
11、SYTO
Figure BPA000016092564008935
12、SYTO
Figure BPA000016092564008936
13、SYTO14、SYTO
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15、SYTO
Figure BPA000016092564008939
16、SYTO
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20、SYTO
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21、SYTO
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22、SYTO
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23、SYTO
Figure BPA000016092564008944
24、SYTO
Figure BPA000016092564008945
25、SYTO绿、SYTO
Figure BPA000016092564008947
80、SYTO81、SYTO82、SYTO
Figure BPA000016092564008950
83、SYTO
Figure BPA000016092564008951
84、SYTO
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85、SYTO
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橙、SYTO17、SYTO
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59、SYTO
Figure BPA000016092564008956
60、SYTO
Figure BPA00001609256400901
61、SYTO62、SYTO
Figure BPA00001609256400903
63、SYTO
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64、SYTO
Figure BPA00001609256400905
红、纺锤菌素、远霉素、吖啶橙、3，4-苯并芘、噻唑黄、TOMEHE、柔红霉素、吖啶、戊基-TOTAB、以及丁基-TOTIN。不对称的花菁染料可以用作该多核苷酸特异性染料。其他感兴趣的染料在以下文件中描述的那些：Geierstanger，B.H.和Wemmer，D.E.，Annu.Rev.Vioshys.Biomol.Struct.[生物物理学与生物分子结构年评]1995，24，463-493；Larson，C.J.和Verdine，G.L.，Bioorganic Chemistry[生物有机化学]：Nucleic Acids[核酸]，Hecht，S.M.，Ed.，Oxford University Press(牛津大学出版社，纽约，1996年，第324-346页；以及Glumoff，T.和Goldman，A.Nucleic Acids in Chemistry and Biology[化学和生物学中的核酸]，第二版，Blackburn，G.M.和Gait，M.J.，Eds.，牛津大学出版社：牛津，1996，第375-441页。该多核苷酸特异性染料可以是一种嵌入式染料，并且可以对于双链多核苷酸是特异的。
术语“荧光蛋白”包括已知会吸收和发射光的多种类型的蛋白。更常用的类别的此类材料之一是藻胆色素蛋白。实例包括但不限于藻红蛋白(PE和R-PE)、异藻蓝蛋白(APC)、以及PerCP。其他类别包括绿色荧光蛋白和相关形式。
术语“绿色荧光蛋白”是指天然的多管水母(Aequorea)绿色荧光蛋白和突变形式二者(它们均已被鉴定为展示了改变的荧光特性)，包括改变的激发和发射最大值，以及不同形状的激发和发射光谱(Delagrave，S.等人(1995)生物/技术13：151-154；Heim，R.等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]91：12501-12504；Heim，R.等人(1995)Nature[自然]373：663-664)。Delgrave等人分离了克隆的维多利亚多管水母(Aequorea victoria)GFP的突变体，其具有红移激发光谱。生物/技术13：151-154(1995).Heim，R等人报告了一种具有蓝色荧光的突变体(Tyr66突变到His)(Proc.Natl.Acad.Sci.[美国科学院院刊](1994)USA 91：12501-12504)。
基质
在一些实施方案中，试验组分可以置于基质上。该基质可以包括多种材料，不论是生物的、非生物的、有机的、无机的、或者这些中任何的组合。例如，该基质可以是一种聚合的朗缪尔-布罗杰特(Langmuir Blodgett)膜、功能化的玻璃、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、改性硅、或者多种凝胶或聚合物中的任一种，这些聚合物是例如(聚)四氟乙烯、(聚)偏二氟乙烯、聚苯乙烯、交联的聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(丙交酯共乙交酯)、聚酐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚硅氧烷、聚二氧化硅、胶乳、葡聚糖聚合物、环氧树脂、聚碳酸酯、或者它们的任一组合。可以使用导电聚合物和光电导材料。
基质可以是平面的结晶基质，诸如基于二氧化硅的基质(例如，玻璃、石英、或类似物)、或者用在例如半导体和微处理器工业中的结晶基质，诸如硅、砷化镓、铟掺杂的GaN等等，并且包括半导体纳米晶体。
该基质可以采取的形式为光电二极管、光电传感器，诸如光电半导体芯片或者光电薄膜半导体，或者生物芯片。质上探针的定位可以寻址；这可以通过高度密集的形式完成，且位置可以微米寻址或纳米寻址。
二氧化硅气凝胶也可以用作基质，并且可以通过本领域已知的方法来进行制备。气凝胶基质可以用作自由直立基质或者作为用于另一种基质材料的表面涂层。
该基质可以采用任何形式并且典型地是：板、薄片、珠粒、球粒、盘、颗粒、微粒、纳米颗粒、链、沉淀物、任选多孔的凝胶、薄层、管、球、容器、毛细管、垫、片、膜、小片、多孔板或皿、光纤，等等。该基质可以是任何刚性或半刚性的形式。该基质可以包含凸起的或凹陷的区域，在这些区域上定位一种分析成分。该基质的表面可以使用众所周知的技术进行蚀刻以便提供所希望的表面特征，例如，沟道、v-凹槽、台面(mesa)结构、或类似物。
基质表面可由与基质相同的材料构成或可由不同材料制成，并且可通过化学或物理方法连接至基质表面上。此类连接的表面可以由多种多样材料中的任何一种来组成，例如，聚合物、塑料、树脂、多糖类、二氧化硅或基于二氧化硅的材料、碳、金属、无机玻璃、膜、或者以上列出的基质材料中的任一种。该表面可以任选地是透明的并且可以具有表面Si-OH官能度，诸如在二氧化硅表面上找到的那些。
该基质和/或其任选的表面可以进行选择，以便为所用的合成和/或检测方法提供适当的特征。该基质和/或表面可以是透明的以便允许该基质暴露于来自多个方向的光。该基质和/或表面可以配备有反射性“镜面”结构以便增加光的回收。
该基质和/或其表面总体上对它在使用中暴露的条件有抗性并且能任选地被处理，以便在暴露到此类条件中之后移除任何抗性材料。
多核苷酸或多肽探针可以通过任何适合的方法制造在该基质上或者附接到该基质上，例如在美国专利号5,143,854、PCT公开号WO 92/10092、1990年12月6日提交的美国专利申请序列号07/624,120(现在已放弃)、Fodor等人Science[科学]，251：767-777(1991)、以及PCT公开号WO 90/15070中描述的方法。使用了机械合成策略来合成这些阵列的技术在例如PCT公开号WO 93/09668和美国专利号5,384,261中进行了说明。
还另外的技术包括基于珠粒的技术，如在PCT申请号PCT/US93/04145的那些，和基于针(pin)的方法，诸如在美国专利号5,288,514中说明的那些。
适用于将传感器多核苷酸或多肽附接到该基质上的另外的流动通道或点样(spotting)方法在1992年11月20日提交的美国专利申请序列号07/980,523、以及美国专利号5,384,261中进行了说明。试剂通过以下方法被传送至基质：(1)在预定义区域上限定的通道内流动、或者(2)在预定义区域上“点样”。一在该基质有待保护的部分上可以使用种保护性涂层，诸如，亲水或疏水涂层(取决于该溶剂的性质)，有时与通过在其他区域中有利于反应物溶液润湿的材料相结合。以此方式，进一步防止了这些流动的溶液流出其指定路径之外。
典型的分配器包括一个任选地机器控制的微量移液器、喷墨印刷机、一套试管、一个歧管、一套移液管等等，使得不同的试剂可以先后或同时递送到这些反应区域中。
该基质或其一个区域可以被编码，使得可以确定所查询的位于该基质区域中的传感物的身份。可以使用任何适合的编码方案，例如，光学编码、RFID标记、磁性编码、物理编码、荧光编码、以及多种编码的组合。
激发和检测
任何仪器，如果它能够提供一种能激发共轭聚合物复合物同时短于待检测的发射波长的一种波长，都能用于激发。市售的装置可以提供适合的激发波长以及适合的检测部件。
示例性激发源包括宽带UV光源，诸如带有适当滤光片的氘灯；来自光源的输出，该光源是例如穿过一种单色器以提取出所希望的波长的白光源的氙灯或氘灯；连续波长(cw)的气体激光器；固态二极管激光器；或者这些脉冲激光中的任一种。发出的光可以通过任何适合的装置或技术进行检测；许多适合的途径在本领域内是已知的。例如，荧光计或分光光度计可以用于检测该测试样本是否在该共轭聚合物被激发时发出一个信号发色团所特有的波长。物质的组合物
还提供了在此说明的处于任何不同形式的任何分子的物质组合物。如在此说明的该共轭聚合物和包含共轭聚合物的复合物可以按纯化的和/或分离的形式来提供。该共轭聚合物和包含共轭聚合物的复合物可以按晶体或非晶的形式来提供。
该共轭聚合物和包含共轭聚合物的复合物可以提供在溶液中，该溶液可以是主要为水的溶液，它可以包含一种或多种在此说明的另外的溶液组分，这些溶液组分包括但不限于另外的溶剂、缓冲液、生物分子、多核苷酸、荧光团等等。另外，CP在溶液中的混合物还能够提供改进的检测灵敏度，如与单一CP/染料系统的检测灵敏度相比。该共轭聚合物和包含共轭聚合物的复合物可以在溶液中按一定浓度存在，在这种浓度下来自第一光活性单元的第一发射在没有生物分子靶或者与其相关的生物分子的存在下可以被检测到。该溶液可以包括如在此说明的另外的组分，包括标记的探针，如荧光标记的抗体或多核苷酸，它们对于一类生物分子靶标或与其相关的生物分子是特异性的，用于该共轭聚合物和包含共轭聚合物的复合物。
该共轭聚合物和包含共轭聚合物的复合物可以按膜的形式来提供。物质的组合物可以通过任何在此说明的特性来要求保护，包括根据通过提出的结构、通过合成方法、通过吸收和/或发射光谱、通过元素分析、通过NMR光谱、或通过任何其他特性或特征。
在一些实施方案中，可在样本中检测基因的表达。在另外一个实施方案中，可以在流式细胞仪、细胞分类器、显微镜、平板读取器、或者荧光成像器中在样本中检测对细胞标记物或细胞类型的鉴定。在另外一个实施方案中，细胞类型或标记物的鉴定被用于淋巴瘤或其他循环癌的诊断。在另外一个实施方案中，细胞类型或标记物的鉴定被用于HIV感染的诊断和监测。在另外一个实施方案中，细胞类型或标记物的鉴定被用于分选出用于治疗应用的细胞。在另外一个实施方案中，检测生物分子靶标或与其相关的生物分子的测量结果可以用于诊断患者的疾病状态。在还另一个实施方案中，本发明的检测方法可以进一步包括一种诊断疾病状态的方法。在相关的实施方案中，诊断一种疾病的方法可以包括检查或分析关于生物分子靶标或者与其相关的生物分子是否存在数据，并且对患者、医疗服务人员或者医疗卫生管理者提供结论，该结论是基于检查或分析关于疾病诊断的数据而作出的。如在此说明的，检查或分析此类数据可通过使用此处描述的计算机或其他数字装置和网络来得到协助。设想到了关于此类数据的信息可通过网络来传递。
在实践本发明的方法的过程中，任选地使用许多分子生物学的规技术。这些技术是众所周知的并且在例如下述的出版物中阐述：Ausubel等人(Eds.)Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学中的当前科学实验计划]，第I、II、和III卷，(1997)；Ausubel等人(Eds.)，Short Protocols in Molecular Biology[分子生物学中的短期科学实验计划]：A Compendium of Methods from Current Protocols inMolecular Biology[当前分子生物学计划的方法概述]，第五版.，约翰威利父子公司(2002)；Sambrook等人，Molecular Cloning[分子克隆]：A Laboratory Manual[实验室手册]，第三版，冷泉港实验室出版社(2000)；Innis等人(Eds.)PCR Protocols[PCR计划]：A Guide toMethods and Applications[方法和应用指南]，爱思唯尔的科学与技术书籍(Elsevier Science & Technology Books)(1990)，以及Greg T.Hermanson，Bioconjugate Techniques[生物共轭技术]，第二版，学术出版公司(Academic Press)(2008)中，将它们全部通过引用结合在此。
图12是一个框图，显示了代表性逻辑装置的实例，通过该装置可以实现检查或分析关于本发明的数据。此类数据可以是与受试者中的疾病、紊乱或病情相关联的。图12显示了一个连接到设备820上的计算机系统(或数字装置)800，它们与共轭聚合物或共轭聚合物复合物824一起使用，例如用来产生结果。计算机系统800可以理解为一种可以读取来自介质811和/或网络端口805的指令的逻辑装置，该网络端可以任选地连接到具有固定介质812的服务器809上。在图12中所示的系统包括CPU 801、磁盘驱动器803、任选输入装置(如键盘)815和/或鼠标816以及任选的监视器807。数据通信可以通过指示的通信介质与本地位置或远程位置上的服务器809上来实现。该通信介质可以包括任何传输和/或接收数据的手段。例如，该通信介质可以是网络连接、无线连接、或因特网连接。设想到了关于本发明的数据可以提供此类网络或者连接来进行传输。
在一个实施方案中，一种计算机可读介质包括一种适合用于传输生物标本的分析结果的介质。该介质可以包括关于患者的疾病状况或状态的结果，其中此结果是使用此处描述的方法获得的。
试剂盒
还提供了包含用于实施所述方法的试剂的试剂盒。
在一些实施方案中，一个试剂盒包含多种试剂，这些试剂包括共轭聚合物或共轭聚合物复合物、生物共轭物，例如抗体、核酸、以及在此说明的其他组分。
该试剂盒任选地包含一种或多种下述物：一种或多种可以结合到共轭聚合物或共轭聚合物复合物中的标记；以及一种或多种可以包含或可以不包含阵列的基质等等。
试剂盒的组分可以容纳在壳体内。关于使用该试剂盒以便进行所述方法的说明可以与壳体一起提供，并且可以按任何固定的介质来提供。这些说明可以位于该壳体内部或者壳体外部，并且可以被印刷在形成该壳体的任何表面的内部或外部，使得说明清晰可见。试剂盒可以处于多重形式，用于检测一种或多种不同的靶标生物分子或与其相关的生物分子。
如在此说明的并且在图13中所示，在某些实施方案中，一个试剂盒903可以包括一个容器或壳体902用于容纳不同的组分。如在图13中所示并且如在此说明的，在一个实施方案中提供了一个试剂盒903，该试剂盒包括一种或多种共轭聚合物或共轭聚合物复合物试剂905、以及任选地一种基质900。如图13中所示并且如在此说明的，该试剂盒903可以任选地包括说明901。设想了该试剂盒903的其他实施方案，其中这些组分包括在此说明的各种额外特征。
实例
以下实例提供了用于制造和测试在此说明的这些共轭聚合物的效力的展示性方法。这些实例仅是为展示的目的而提供的并且不对在此提供的权利要求的范围进行限制。在此披露的以及提出了权利要求的方法鉴于本披露全都无需过度实验即可进行和执行。本领域普通技术人员将清楚的是，可以在此说明的方法或方法的步骤或步骤的顺序应用多种变化，而不脱离权利要求书的概念、精神和范围。本领域普通技术人员所清楚的所有此类相似的替换及变更应被认为是在所附权利要求书的精神、范围和概念之内。
实例1：具有化学式(I)的聚合物的合成
实例1a：合成单体2，7-二溴-9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)芴(A)和9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，20’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)-2，7-二(4”，4”，5”，5”-四甲基-1”，3”，2”-二噁环戊硼烷基)芴(B)以用于随后的聚合
Figure BPA00001609256400991
步骤1：2，7-二溴-9，9-二(3’-羟基丙烷基)芴
将2，7-二溴芴(9.72g，30mmol)、四丁基溴化铵(300mg，0.93mmol)、以及DMSO(100mL)在氮气(g)下加入到一个3颈烧瓶中，接着通过注射器加入50％NaOH(15mL，188mmol)。将该混合物加热到80℃，并且通过另外的漏斗逐滴加入3-溴丙醇(6.70mL，77mmol)，并且将该反应混合物在80℃搅拌另外2小时。在完成后，将该混合物冷却到室温并且用水(250mL)猝灭。用乙酸乙酯(3个150mL部分)萃取水层。将这些有机层进行合并，用水洗涤，经MgSO4干燥，并且过滤。去除该溶剂并且将残余物在氯仿中进行再结晶而产生淡黄色的针状晶体(9.20g，70％)。
步骤2：2，7-二溴-9，9-二(3’-甲苯磺酸丙烷基)芴
将2，7-二溴-9，9-二(3’-羟基丙烷基)芴(500mg，1.14mmol)在氮气(g)下溶解在0℃的二氯甲烷(5mL)中。向该混合物中加入对甲苯磺酰氯(650mg，3.40mmol)，接着加入吡啶(0.39mL，4.77mmol)。允许反应在0℃搅拌并且自然上升到室温过夜。将该反应用水(15mL)猝灭。真空去除溶剂产生了固体形式。过滤掉固体得到了白色固体(758mg，89％)。
步骤3：2，7-二溴-9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)芴(A)
将mPEG11醇(770mg，1.49mmol)在氮气下溶解在0℃的无水THF(2mL)中。向该混合物中加入叔丁醇钾(1.63mmol，1.63mL，在THF中1M)。在10分钟的搅拌之后，通过注射器加入在10mL THF中的2，7-二溴-9，9-二(3’-甲苯磺酸丙烷基)芴(504mg，0.673mmol)。允许该混合物到达室温并且搅拌过夜。将该反应混合物用THF进行稀释。将不可溶的无机盐通过过滤去除。滤液的浓缩产生了粗产物，将它通过柱色谱法(DCM-MeOH)进行纯化产生了一种无色的油(605mg，62.5％)。
步骤4：9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，20’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)-2，7-二(4”，4”，5”，5”-四甲基-1”，3”，2”-二噁环戊硼烷基)芴(B)
将2，7-二溴-9，9-di(2’，5’，8’，11’，14’，17’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)芴(1.510g，1.501mmol)、双(频那醇合)二硼(800mg，3.15mmol)、乙酸钾(619mg，6.31mmol)、Pd(dppf)Cl2[1，1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(II)](51.5mg，0.063mmol)以及DMSO(30mL)在N2下进行混合。将该混合物在80℃加热5.5小时。在完成后，将该DMF蒸馏并且加入水(50mL)。将该产品用DCM进行萃取(3x40mL)。将这些有机层进行组合并且浓缩。将该粗产物通过柱色谱法(DCM-MeOH)进行纯化以便给出无色油(1.015g，63％)。
实例1b：单体(A)和(B)的聚合反应
Figure BPA00001609256401011
将2，7-二溴-9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)芴(A)(0.084mmol，120mg)、9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，20’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)-2，7-二(4”，4”，5”，5”-四甲基-1”，3”，2”-二噁环戊硼烷基)芴(B)(0.088mmol，135mg)以及钯四(三苯基膦)(0.0035mmol，4mg)在一个装备有搅拌棒的圆底烧瓶中用进行组合。接下来，加入0.35mL的2M碳酸钾(水性)和1.9mL的四氢呋喃，并且将该烧瓶装配一个真空适配器并且置于一条史兰克线(Schlenk line)上。将该混合物使用3个冻结-泵送-解冻循环来除气。将这个除气后的混合物在氮气下剧烈搅拌加热到80℃持续18小时。然后将该反应混合物冷却并且通过旋转蒸发来去除该溶剂。将所生成的半固体使用约50mL的水进行稀释并且通过过滤穿过玻璃纤维滤纸。加入乙醇以便将该溶剂调整到在水中为20％的乙醇。用G-25脱盐介质进行预备的凝胶渗透色谱法以便从该聚合物中移除过量的盐。通过旋转蒸发去除馏分中的溶剂并且收集到100mg的聚[2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴]，为一种琥珀色的油。
实例2：通过苏楚基偶联来合成具有化学式(I)的不对称聚合物
步骤2a：合成不对称单体2-溴-9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，20’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)-7-(4”，4”，5”，5”-四甲基-1”，3”，2”-二噁环戊硼烷-2-基)芴(C)用于随后的聚合
Figure BPA00001609256401021
步骤1：2-二溴-7-碘代芴
将2-溴代芴(10.01g，40.84mmol)、乙酸(170mL)、水(8mL)、碘(4.34g，17.20mmol)，碘酸钾(2.18g，10.19mmol)以及硫酸(4mL)在氮气下进行混合。将所生成的混合物在80℃加热2h并且冷却到室温。在过滤和乙酸洗涤之后收集到所形成的作为希望的产物的沉淀物(13.68g，90％)。
步骤2：2-二溴-9，9-二(3’-羟基丙烷基)-7-碘代芴
将2-二溴-7-碘代芴(2.186g，5.892mmol)、四丁基溴化铵(60mg，0.186mmol)、以及DMSO(25mL)在氮气(g)下加入到一个3颈烧瓶中，接着通过注射器加入50％NaOH(4mL，50mmol)。将该混合物加热到80℃，并且缓慢加入3-溴丙醇(1.33mL，14.7mmol)，并且将该反应在80℃搅拌另外1小时。在完成后，将该混合物冷却到室温并且用水猝灭。在过滤后收集到作为粗产物的沉淀物。将该粗产物通过柱色谱法(洗脱液：己烷-乙酸乙酯)进行纯化以便给出淡黄固体(2.15g，75％)。
步骤3：2-溴-9，9-二(3’-羟基丙烷基)-7-(4”，4”，5”，5”-四甲基-1”，3”，2”-二噁环戊硼烷-2-基)芴
在N2下将2-二溴-9，9-二(3’羟基丙烷基)-7-碘代芴(2.454g，5.037mmol)、双(频那醇合)二硼(1.407g，5.541mmol)、乙酸钾(1.483g，15.11mmol)、Pd(dppf)Cl2(123mg，0.15mmol)以及DMSO(25mL)进行混合。将该混合物在80℃加热1.5小时。在完成后，将该混合物冷却到室温并且用水(50mL)猝灭。将该产品用DCM进行萃取(3x40mL)。将这些有机层进行组合并且浓缩。将该粗产物通过柱色谱法(洗脱液：己烷-乙酸乙酯)进行纯化以便给出浅色固体(2.09g，85％)。
步骤4：2-溴-9，9-二(3’-甲烷磺酸丙烷基)-7-(4”，4”，5”，5”-四甲基-1”，3”，2”-二噁环戊硼烷-2-基)芴
在室温下将2-溴-9，9-二(3’-羟基丙烷基)-7-(4”，4”，5”，5”-四甲基-1”，3”，2”-二噁环戊硼烷-2-基)芴(2.280g，4.694mmol)以及对甲苯磺酰氯(2.684g，14.08mmol)在N2下溶解在二氯甲烷中。通过注射器缓慢加入三乙胺(3.95mL，28.2mmol)。将该混合物在室温下搅拌过夜。然后将该混合物进行浓缩并且通过柱色谱法(己烷～EtOAc)进行纯化以便产生淡色固体(2.66g，72％)。
步骤5：2-溴-9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，20’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)-7-(4”，4”，5”，5”-四甲基-1”，3”，2”-二噁环戊硼烷-2-基)芴(C)。
将mPEG11醇(3.331g，6.448mmol)在氮气下溶解在0℃的无水THF(20mL)中。向该混合物中加入叔丁醇钾(7.74mmol，7.74mL，在THF中1M)。在10分钟的搅拌后，通过注射器加入在20mL无水THF中的2-溴-9，9-二(3’-甲烷磺酸丙烷基)-7-(4”，4”，5”，5”-四甲基-1”，3”，2”-二噁环戊硼烷-2-基)芴(2.052g，2.579mmol)。允许该混合物到达室温并且搅拌过夜。在蒸发THF之后，加入盐水(50mL)并且将粗产物用二氯甲烷(3x40mL)进行萃取。将这些组合的有机层进行浓缩并且通过柱色谱法(DCM-异丙醇)进行纯化以便给出无色的凝胶状产物(2.164g，57％)。
实例2b：通过苏楚基偶联聚合来合成不对称聚合物
Figure BPA00001609256401041
使用与实例1b中说明的聚合条件相类似的条件来合成不对称聚合物。
实例3：连接物或帽化单元的合成
实例3a：合成连接物或帽化单元：叔丁基4-(3，5-二溴苯氧基)丁基氨基甲酸酯
Figure BPA00001609256401051
步骤1：4-(3，5-二溴苯氧基)丁烷-1-胺
在氮气下将1-(4’-邻苯二甲酰亚胺基丁氧基)3，5-二溴苯(1.0g，2.20mmol)搅拌溶解在乙醇(45mL)中持续5分钟。加入一水合肼(610mg，12.1mmol)并且将该反应在80℃回流2小时。向该反应中加入水性1M HCl(17.7mL，17.7mmol)并且在105℃下回流另外2小时。用二氯甲烷(2×150mL)萃取水层。将这些有机层进行合并，用饱和的NaHCO3(3×)、水、和盐水进行洗涤，然后经MgSO4干燥，并且过滤。溶剂的去除产生了一种黄色油(560mg，78％)。
步骤2：叔丁基4-(3，5-二溴苯氧基)丁基氨基甲酸酯
在氮气下将4-(3，5-二溴苯氧基)丁烷-1-胺(397mg，1.23mmol)溶解在无水THF(24.6mL)中。将二碳酸二叔丁酯(423mL，1.84mmol)添加到该混合物中并且将该反应在40℃下回流2小时。在用二氯甲烷(2×50mL)萃取该反应之后，将这些有机层进行合并，用饱和的NaHCO3、水和盐水进行洗涤，然后经MgSO4干燥，并且进行过滤。去除该溶剂并且将该残余物通过柱色谱法(9∶1，己烷∶EtOAc)进行纯化以便给出一种白色固体(306mg，59％)。
实例3b：合成连接物或帽化单元：叔丁基-4-(2，7-二溴-9-甲基-9H-芴-9-基)丁基氨基甲酸酯
Figure BPA00001609256401061
步骤1：2.7-二溴-9-甲基-9H-芴。
在氮气下将2，7-二溴芴(30g，92.59mmol)溶解在无水THF(300mL)中并且冷却到-78℃。向-78℃的溶液中经5分钟加入正丁基锂(40.36mL，100.9mmol)并且允许该反应搅拌另外10分钟。然后向该反应中加入甲基碘(6.29mL，100.9mmol)并且允许反应在-78℃搅拌2小时。将该反应倾倒入二氯甲烷和水的混合物中。收集该有机层，并且将该水层使用二氯甲烷进行进一步萃取。合并所有的有机层并且通过真空去除溶剂。将粗材料用己烷进行研磨并且使用布氏漏斗进行过滤以便给出白色固体(22g，70％)。1HNMR(500MHz，CDCl3)：δ＝7.62(s，2H)，7.56-7.58(d，2H)，7.48-7.50(dd，2H)，3.90-3.94(q，1H)，1.49-1.51(d，3H)。
Figure BPA00001609256401062
步骤2：2-(4-(2，7-二溴-9-甲基-9H-芴-9-基)丁基)异吲哚啉-1，3-二酮
在氮气下将2，7-二溴-9-甲基-9H-芴(10.0g，29.58mmol)溶解在50mL DMSO中。向该混合物中加入KOH(2.01g，35.79mmol)、水(1.5mL)、N-(4-溴代丁基)邻苯二甲酰亚胺(9.93g，35.2mmol)，并且在室温下将该反应搅拌2小时，然后在50℃下搅拌3小时。将该反应冷却到室温并且二氯甲烷进行稀释。用盐水(2X)和水洗涤该有机层。溶剂的去除产生了一种固体，将该固体通过柱色谱法(7∶3，己烷∶EtOAc)进行纯化以便产生白色固体(3.08g，20％)。1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ＝7.81-7.83(m，2H)，7.68-7.71(m，2H)，7.48-7.51(m，4H)，7.41-7.44(dd，2H)，3.46-3.49(t，2H)，2.00-2.04(p，2H)，1.47-1.49(m，2H)，1.45(s，3H)，0.65-0.68(m，2H)。
Figure BPA00001609256401071
步骤3：4-(2，7-二溴-9-甲基-9H-芴-9-基)丁烷-1-胺
在氮气下将2-(4-(2，7-二溴-9-甲基-9H-芴-9-基)丁基)异吲哚啉-1，3-二酮(3.08，5.71mmol)溶解在乙醇(250mL)中。向该混合物中加入一水合肼(2.77mL，57.1mmol)，并且将该反应在80℃下回流3小时。将该反应冷却到室温并且加入1M HCl(约100mL)。将该混合物搅拌30分钟或者直到所有的固体都被溶解。将二氯甲烷添加到溶液中并且将该有机层用饱和的NaHCO3萃取三次，并且用水洗涤。将这些有机层进行收集并且通过真空去除溶剂以便给出黄色油(2.33g，100％)。1H NMR(500MHz，CD2Cl2)：δ＝7.57(d，2H)，7.52(d，2H)，7.46-7.48(dd，2H)，2.39-2.42(t，2H)，1.95-1.98(t，2H)，1.44(s，3H)，1.17-1.23(m，2H)，0.59-0.65(m，2H)。
Figure BPA00001609256401081
步骤4：叔丁基-4-(2，7-二溴-9-甲基-9H-芴-9-基)丁基氨基甲酸酯
在氮气下将4-(2，7-二溴-9-甲基-9H-芴-9-基)丁烷-1-胺(2.39g，5.84mmol)溶解在无水THF(20mL)中。向溶液中加入二碳酸二叔丁酯(2.01mL，8.76mmol)，并且将该反应在40℃搅拌3小时。将该反应冷却到室温并且通过真空进行浓缩。将粗固体用己烷进行研磨并且使用布氏漏斗进行过滤以便产生所希望的白色固体(2.34g，79％)。1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ＝7.53(d，2H)，7.45-7.47(d，4H)，4.30(s，1H)，2.88-2.90(q，2H)，1.93-1.96(t，2H)，1.43(s，3H)，1.41(s，9H)，1.25-1.28(m，2H)，0.59-0.66(m，2H)。
实例4：连接物或帽化单元的合成
实例4a：叔丁基4-(4-溴苯氧基)丁基氨基甲酸酯的合成
Figure BPA00001609256401082
步骤1：N(4-(4-溴苯氧基)丁基)邻苯二甲酰亚胺
将4-溴苯酚(4.64g，26.8mmol)、N-(4-溴代丁基邻苯二甲酰亚胺)(6.30g，22.33mmol)、K2CO3(11.09g，80.38mmol)、18-冠醚-6(265mg，1.00mmol)、以及丙酮(100mL)进行组合，并且将该反应在氮气下在70℃回流过夜。将该反应冷却到室温并且通过真空去除溶剂。将粗混合物用二氯甲烷(200mL)进行稀释并且用水(3X)进行洗涤然后经MgSO4干燥，并且进行过滤。去除溶剂、接着用己烷进行研磨，并且使用布氏漏斗进行过滤而产生一种白色固体(6.03g，71％)。
步骤2：4-(4-溴苯氧基)丁烷-1-胺
在氮气下将N(4-(4-溴苯氧基)丁基)邻苯二甲酰亚胺(6.01g，16.1mmol)溶解在乙醇(200mL)中，接着加入一水合肼(7.8mL，161mmol)。将该反应在80℃回流2小时。一旦反应完成(在顶层形成固体)，就将反应冷却到室温并且用1M HCl(50mL)进行中和。允许该混合物搅拌到所有的固体都完全溶解并且用二氯甲烷(150mL)进行稀释。将该溶液用两部分的饱和NaHCO3(2×)进行萃取。将这些有机层进行合并，用盐水和水洗涤，经MgSO4干燥，并且过滤。溶剂的去除产生了一种黄色油(2.93g，75％)。
步骤3：叔-丁基4-(4-溴苯氧基)丁基氨基甲酸酯
在氮气下将4-(4-溴苯氧基)丁烷-1-胺(1.0g，4.09mmol)溶解在无水THF(20mL)中并且进行搅拌直到溶液均匀。添加二碳酸二叔丁酯(1.34g，6.14mmol)并且在40℃下将该反应搅拌2小时。将该反应用水(30mL)猝灭并且在室温搅拌1.0小时。用乙酸乙酯(50mL×2)萃取水层。将这些有机层进行合并，用饱和的NaHCO3、水、和盐水进行洗涤，然后经MgSO4干燥，并且过滤。溶剂的去除产生了一种固体，将该固体通过柱色谱法(9∶1，己烷∶EtOAc)进行纯化以便产生白色固体(1.0g，71％)。
实例4b：4-(4-溴苯基)丁酸叔丁酯的合成
Figure BPA00001609256401101
允许叔丁醇熔化并且以20mL添加到圆底烧瓶中。向该溶液中加入二碳酸二叔丁酯(1.79g，8.22mmol)以及4-(4-溴苯基)丁酸(1.0g，4.11mmol)。然后向反应中加入DMAP(150.7mg，1.23mmol)并且在室温下将反应搅拌过夜。将该反应通过真空进行浓缩并且在乙酸乙酯中进行再次稀释。用1M HCl、盐水、和水洗涤该有机层。在溶剂的去除之后，将这些粗制固体通过柱色谱法(20∶1，己烷∶EtOAc)进行纯化以便给出所希望的产物(570mg，46％)，为一种透明的油。1H NMR(500MHz，CD2Cl2)：δ＝7.39-7.41(d，2H)，7.03-7.09(d，2H)，2.57-2.60(t，2H)，2.18-2.21(t，2H)，1.83-1.186(p，2H)，1.42(s，9H)。
实例4c：4-(4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二噁环戊硼烷-2-基)苯基)丁酸的合成
Figure BPA00001609256401102
将4-(4-溴苯基)丁酸(10g，41.13mmol)，双(频那醇合)二硼(15.67g，61.70mmol)、乙酸钾(12.11g，123.4mmol)、以及DMSO(100mL)进行组合，并且在室温下将混合物用氮气吹扫10分钟。在氮气下向反应中添加Pd(dppf)Cl2并且再次用氮气在室温下吹扫另外20分钟。然后将该反应在80℃回流过夜。在冷却到室温之后，将该反应用水进行猝灭并且搅拌1.0小时。将所形成的这些固体使用布氏漏斗进行过滤。将这些粗固体通过柱色谱法(8.5∶1.5，己烷∶EtOAc)进行纯化。将这些希望的馏分进行收集并且通过真空浓缩、并且通过己烷进行研磨且过滤以便给出所希望的白色固体(6.7g，56％)。
实例5：合成连接物或帽化单元：叔丁基4-(4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二噁环戊硼烷-2-基)苯氧基)丁基氨基甲酸酯
Figure BPA00001609256401111
将来自实例4a的叔丁基4-(4-溴苯氧基)丁基氨基甲酸酯(500mg，1.45mmmol)、乙酸钾(428mg，4.36mmol)、双(频那醇合)二硼(737mg，2.90mmol)以及DMSO(12mL)进行组合，并且在室温将混合物用氮气吹扫10分钟。向混合物中加入Pd(dppf)Cl2(59.3mg，0.07mmol)并且继续在氮气中在室温下将溶液搅拌另外20分钟。在80℃回流3小时后，将该反应冷却到室温并且用水(30mL)猝灭。用二氯甲烷(50mL×2)萃取水层。将这些有机层进行合并，用盐水洗涤，经MgSO4干燥，并且过滤。溶剂的去除产生了一种暗褐色的油，将其通过柱色谱法(9∶1，己烷∶EtOAc)进行纯化以便产生浅黄色的油(539mg，95％)。
实例6：合成在芳基卤苯基与FMOC保护的伯胺之间具有长的低聚醚间隔基的连接物或帽化单元
4-(4-溴苯氧基)丁烷-1-胺+低聚醚-FMOC+N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)
(9H-芴-9-基)甲基80-(4-溴苯氧基)-75-氧代-3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60，63，66，69，72-二十四氧杂-76-氮杂八十烷基氨基甲酸酯。将4-(4-溴苯氧基)丁烷-1-胺(21.5mg，0.09mmol)、1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2，7，10，13，16，19，22，25，28，31，34，37，40，43，46，49，52，55，58，61，64，67，70，73，76-二十五氧杂-4-氮杂七十九烷-79-酸(100mg，0.073mmol)以及N，N’-二甲基氨基吡啶(5.4mg，0.044mmol)在一个圆底烧瓶中合并，该圆底烧瓶用氮气冲刷并且具有一个特氟纶搅拌棒。接下来，通过注射器来添加5mL的无水二氯甲烷。将N，N-二环己基碳二亚胺(23mg，0.11mmol)转移到第二烧瓶中，将该烧瓶用氮气进行吹扫并且装有一个搅拌棒，并且通过注射器加入5mL的无水二氯甲烷。当搅拌该第一溶液时，缓慢地逐滴加该二环己基碳二亚胺溶液。然后允许该反应开始过夜。接下来的一天，从该反应过滤掉固体，并且将该滤液在二氧化硅上浓缩。在甲醇和二氯甲烷中的柱色谱法给出了一种透明的稠油(83.3mg，71％产率)。
实例7：合成聚合物：聚[2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴}-共-3，5-苯基丁-1’-氧基-4”-胺]，该聚合物具有一个内部连接位点
将内部共轭位点结合到共轭聚合物主链上在2007年10月8日提交的并且作为美国申请号2008/0293164公开的美国申请序列号11/868,870中进行了说明，将该申请通过引用以其全文结合在此。在此提供的是一种基于该方案修改后的合成。
将2，7-二溴-9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)芴(0.084mmol，120mg)、9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，20’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)-2，7-二(4”，4”，5”，5”-四甲基-1”，3”，2”-二噁环戊硼烷基)芴(0.088mmol，135mg)、叔丁基-4-(3，5-二溴苯氧基)丁基氨基甲酸酯(0.0044mmol，2.0mg)以及钯四(三苯基膦)(0.0035mmol，4mg)在一个装备有搅拌棒的圆底烧瓶中进行组合。接下来，加入0.35mL的2M碳酸钾(水性)和1.9mL的四氢呋喃，并且将该烧瓶装配一个真空适配器并且置于一条史兰克线上。将该混合物使用3个冻结-泵送-解冻循环来除气。将这个除气后的混合物在氮气下通过有力搅拌18小时而加热到80℃。然后将该反应混合物冷却并且将该溶剂通过旋转蒸发来去除。接下来，加入4mL的在二噁烷中的4M HCl，并且将该混合物搅拌不小于4小时。将该溶液使用2M的碳酸钾溶液进行中和。将该溶液的大部分再次通过旋转蒸发去除。将所生成的半固体使用约50mL的水进行稀释并且经玻璃纤维滤纸进行过滤。加入乙醇以便将该溶液调整成在水中为20％的乙醇。用G-25脱盐介质进行预备的凝胶渗透色谱法以便从该聚合物中去除过量的盐。通过旋转蒸发来出去这些馏分中的溶剂并且收集到100mg的聚[2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴]-共-3，5-叔丁基-4-(4-溴苯氧基)胺]，为一种琥珀色的油。
实例8：合成带有一个内部连接位点的亚苯基亚乙烯基共聚合物
Figure BPA00001609256401141
与实例7和15中说明的相类似的一种修改后的合成。
实例9：仅具有末端胺帽化单元的聚合物的合成
Figure BPA00001609256401142
2，7-(聚[2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴)-二苯-4-氧基丁基-4’-胺
将2，7-二溴-9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)芴(0.163mmol，235mg)、9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，20’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)-2，7-二(4”，4”，5”，5”-四甲基-1”，3”，2”-二噁环戊硼烷基)芴(0.163mmol，250mg)以及钯四(三苯基膦)(0.0065，7.5mg)在一个装备有搅拌棒的圆底烧瓶中进行组合。接下来，加入0.75mL的2M碳酸钾(水性)和3mL的四氢呋喃，并且将该烧瓶装配一个真空适配器。将该反应混合物置于一条史兰克线上并且用三次冻结-泵送-解冻循环进行脱气并且然后在氮气下通过剧烈搅拌18小时而加热到80℃。将叔丁基4-(4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二噁环戊硼烷-2-基)苯氧基)丁基氨基甲酸酯(0.064mmol，25mg)在0.5mL四氢呋喃中的一个溶液用三次冻结-泵送-解冻循环进行脱气并且然后通过插管在过量氮气压下添加到该聚合反应中。允许该反应在80℃下伴随搅拌而继续另外4小时。接下来，将叔丁基4-(4-溴苯氧基)丁基氨基甲酸酯(0.192mmol，66mg)在0.5mL THF中的一个溶液用三次冻结-泵送-解冻循环进行脱气并且然后通过插管在过量氮气压下添加到该聚合反应中。允许该反应进行至过夜。然后允许该反应混合物冷却并且将该溶剂使用旋转蒸发来去除。将4mL部分的在二噁烷中的4M HCl加入到该残余物中并且搅拌持续最少4小时。将该溶液用2M碳酸钾(水性)进行中和并且然后将该溶剂在真空中去除。将所生成的残余物用在水中的20％乙醇稀释到约30mL并且过滤。通过用G-25脱盐介质进行预备的凝胶渗透色谱法以便从该聚合物中去除过量的盐。将在这些馏分中的溶剂使用旋转蒸发去除并且收集到337mg的聚合物，为一种琥珀色的油。
可以颠倒末端连接物添加的顺序(芳基卤或硼酸酯/硼酸)。类似的方法可以用于添加替代性的连接物或末端帽化单元。实例10：合成聚合物：2-(聚[2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴)-苯-4-氧基丁基-4’-胺，在统计上富含带有单一末端胺帽化单元的链
Figure BPA00001609256401161
将2，7-二溴-9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)芴(0.163mmol，235mg)、9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，20’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)-2，7-二(4”，4”，5”，5”-四甲基-1”，3”，2”-二噁环戊硼烷基)芴(0.163mmol，250mg)以及钯四(三苯基膦)(0.0065，7.5mg)在一个装备有搅拌棒的圆底烧瓶中进行组合。接下来，加入0.75mL的2M碳酸钾(水性)和3mL的四氢呋喃，并且将该烧瓶装配一个真空适配器。将该反应混合物置于一条史兰克线上并且用三次冻结-泵送-解冻循环进行脱气并且然后在氮气下通过剧烈搅拌18小时而加热到80℃。将叔丁基4-(4-溴苯氧基)丁基氨基甲酸酯(0.049mmol，17mg)在0.5mL四氢呋喃中的一个溶液用三次冻结-泵送-解冻循环进行脱气并且然后通过插管在过量氮气压下添加到该聚合反应中。允许该反应在80C下伴随搅拌而继续另外4小时。接下来，将苯基硼酸(0.150mmol，18mg)在0.5mL THF中的一个溶液用三次冻结-泵送-解冻循环进行脱气并且然后通过插管在过量氮气压下添加到该聚合反应中。允许该反应开始过夜。然后允许该反应混合物冷却并且将该溶剂使用旋转蒸发来去除。将4mL部分的在二噁烷中的4M HCl加入到该残余物中并且搅拌至少4小时。将该溶液使用2M碳酸钾(水性)进行中和并且然后将该溶剂在真空中去除。将所生成的残余物用在水中的20％乙醇稀释到约30mL并且过滤。用G-25脱盐介质进行预备的凝胶渗透色谱法以便从该聚合物中去除过量的盐。将在这些馏分中的溶剂使用旋转蒸发去除并且收集到315mg的聚合物，为一种琥珀色的油。所生成的聚合物包含这样的链，这些链带有大分数的具有一个胺连接物的链、加上带有2个连接物以及不含连接物的链。
实例11：合成一些聚合物，该聚合物在统计上富含带有单一末端帽化单元的链、与聚合物链与伯胺连接基团之间具有长的低聚醚间隔基(24次重复)
Figure BPA00001609256401171
2-(聚[2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴)-苯-4-氧基丁基-4’-胺将2，7-二溴-9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)芴(0.163mmol，235mg)、9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，20’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)-2，7-二(4”，4”，5”，5”-四甲基-1”，3”，2”-二噁环戊硼烷基)芴(0.163mmol，250mg)以及钯四(三苯基膦)(0.0065，7.5mg)在一个装备有搅拌棒的圆底烧瓶中进行组合。接下来，加入0.75mL的2M碳酸钾(水性)和3mL的四氢呋喃，并且将该烧瓶装配一个真空适配器。将该反应混合物置于一条史兰克线上并且用三次冻结-泵送-解冻循环进行脱气并且然后在氮气下通过剧烈搅拌18小时而加热到80℃。将叔丁基4-(4-溴苯氧基)丁基氨基甲酸酯(0.049mmol，17mg)在0.5mL四氢呋喃中的一个溶液用三次冻结-泵送-解冻循环进行脱气并且然后通过插管在过量氮气压下添加到该聚合反应中。允许该反应在80℃下伴随搅拌而继续另外4小时。接下来，将苯基硼酸(0.150mmol，18mg)在0.5mL THF中的一个溶液用三次冻结-泵送-解冻循环进行脱气并且然后通过插管在过量氮气压下添加到该聚合反应中。允许该反应进行至过夜。然后允许该反应混合物冷却并且将该溶剂使用旋转蒸发来去除。将4mL部分的在二噁烷中的4M HCl加入到该残余物中并且搅拌最少4小时。将该溶液使用2M碳酸钾(水性)进行中和并且然后将该溶剂在真空中去除。将所生成的残余物用在水中的20％乙醇稀释到约30mL并且过滤。用G-25脱盐介质进行预备的凝胶渗透色谱法以便从该聚合物中去除过量的盐。将在这些馏分中的溶剂使用旋转蒸发去除并且收集到315mg的聚合物，为一种琥珀色的油。
实例12：合成一种在聚合反应过程加入了末端羧基帽化单元的不对称聚合物
Figure BPA00001609256401191
如实例9、10、11中说明的在聚合反应过程中加入连接单体。之后该羧酸基团可以转换成一种活化的酯，如N-羟基琥珀酰亚胺基，如在实例29中说明的。
实例13：合成一种在聚合后加入了末端羧酸帽化单元的不对称聚合物
Figure BPA00001609256401192
在聚合反应完成并且聚合物被纯化之后加入连接单体。连接物的添加是在与实例9、10、和11中说明的那些类似的反应条件下完成的。之后该羧酸基团可以转换成一种活化的酯，如N-羟基琥珀酰亚胺基，如在实例29中说明的。
实例14：合成一种带有支链PEG基团的聚合物
实例14a：合成单体(D)和(E)，以用于随后的聚合反应
Figure BPA00001609256401201
步骤1：2，7-二溴-9，9-双(3，5’-二甲氧基苄基)芴
将2，7-二溴芴(4.16g，12.8mmol)以及四丁基溴化铵(362mg，1.12mmol)添加到一个装有特氟纶搅拌棒的圆底烧瓶中。接下来，将60mL的二甲亚砜添加到该烧瓶中并且将该混合物搅拌5分钟。加入一部分50％NaOH水溶液(5.2mL)接着立即加入3，5-二甲氧基苄基溴(7.14g，31mmol)。经过2小时的过程，该溶液的颜色从橙色变为蓝色。将该反应搅拌过夜。将所生成的混合物缓慢倒入200mL的水中并且然后用三个100mL的二氯甲烷部分进行萃取。将这些有机层进行合并而且经硫酸镁干燥并且然后过滤。将该粗产物通过柱色谱法使用己烷和二氯甲烷作为洗脱液进行纯化以便给出一种淡黄色的固体(6.63g，79％产率)。
步骤2：2，7-二溴-9，9-双(3，5’-二羟基苄基)-9H-芴
将2，7-二溴-9，9-双(3，5-二甲氧基苄基)-9H-芴(1.3g，2.08mmol)添加到一个装有搅拌棒并且装备有橡胶隔膜的圆底烧瓶中。将该烧瓶用氮气吹扫10分钟。通过插管将无水二氯甲烷(20mL)转移到该烧瓶中并且将该混合物搅拌到这些固体完全溶解。然后将该溶液用一个干冰/丙酮浴冷却10分钟。通过插管在不断搅拌下逐滴加入BBr3(6.1mL，63.3mmol)。允许该浴升温至室温并且将该混合物搅拌过夜。将该反应通过缓慢加入125mL水来淬灭。然后将该溶液用3个乙酸乙酯部分(50mL)进行萃取。将该有机层经MgSO3干燥、过滤、并且在硅胶上干燥。使用在二氯甲烷中的乙酸乙酯对该粗产物进行的快速色谱法给出了一种灰白色结晶固体(800mg，68％产率)。
步骤3：2，7-二溴-9，9-双(3，5-(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32-十一氧杂三十四烷-34-基)苄基)-9H-芴(D)
将2，7-二溴-9，9-双(3，5-二羟基苄基)-9H-芴(537mg，0.945mmol)、2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32-十一氧杂三十四烷-34-基4-甲基苯磺酸酯(2.788g，4.156mmol)、碳酸钾(1.57g，11.34mmol)以及丙酮(80mL)转移到一个装有特氟纶搅拌棒并且装备有回流冷凝器的圆底烧瓶中。将该混合物在不断搅拌下回流过夜。然后允许该混合物冷却到室温并且在真空下去除丙酮。在用3部分的二氯甲烷来萃取之后，将该有机层经MgSO4干燥，过滤，并且将在二氧化硅上浓缩该滤液。使用甲醇和二氯甲烷的柱色谱法提供的产物为一种淡色的黏稠油(1.69g，70％产率)。
步骤4：2，7-二(4”，4”，5”，5”-四甲基-1”，3”，2”-二噁环戊硼烷基)-9，9-双(3，5-(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32-十一氧杂三十四烷-34-基)苄基)-9H-芴(E)
单体(E)是使用与实例1中说明的条件相类似的条件来合成的。
实例14b：(D)和(E)的聚合反应
Figure BPA00001609256401221
使用与实例1b中说明的聚合条件相类似的条件将(D)和(E)进行聚合。
实例15：合成一种中性碱基亚苯基亚乙烯基共聚合物
Figure BPA00001609256401222
将2，7-二溴-9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)芴(0.25mmol)、1，4-二乙烯基苯(32.3mg，0.25mmol)、乙酸钯(3mg，0.013mmol)、三-邻-甲苯基膦(10mg，0.033mmol)、以及碳酸钾(162mg，1.2mmol)与5mL的DMF在一个装有特氟纶涂覆的搅拌棒的小圆底烧瓶中进行组合。该烧瓶装配有一个针形阀并且置于一条史兰克线上。将该溶液通过三次冻结、泵送、以及解冻循环进行脱气。然后将该混合物加热到100℃过夜。可以使该聚合物随后与末端的连接物或帽化单元按照与在前述实例(9，10和11)中提供的那些相类似(原位的)的方案或者通过在聚合后作为单独的一组反应将其改性来发生反应。
实例16：合成一种支链的亚苯基亚乙烯基共聚合物
Figure BPA00001609256401231
将2，7-二溴-9，9-双(3，5-(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32-十一氧杂三十四烷-34-基)苄基)-9H-芴(636mg，0.25mmol)、1，4-二乙烯基苯(32.3mg，0.25mmol)、乙酸钯(3mg，0.013mmol)、三-邻-甲苯基膦(10mg，0.033mmol)、以及碳酸钾(162mg，1.2mmol)与5mL的DMF在一个装有特氟纶涂覆的搅拌棒的小圆底烧瓶中进行组合。该烧瓶装配有一个针形阀并且置于一条史兰克线上。将该溶液通过三次冻结、泵送、以及解冻循环进行脱气。然后将该混合物加热到100℃过夜。可以使该聚合物随后与末端的连接物或帽化单元按照与实例5中提供的那些相类似(原位的)的方案或者通过在聚合后作为单独的一组反应将其改性来发生反应。
实例17：合成一种带有用于共价共轭的功能性胺的支链亚苯基亚乙烯基共聚合物聚[2，7-二乙烯基{9，9-双(3，5-(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32-十一氧杂三十四烷-34-基)苄基)-9H-芴}-alt-1，4-苯-共-4-苯氧基丁基-N-叔丁基氨基甲酸酯]
Figure BPA00001609256401241
步骤1：聚合
将2，7-二溴-9，9-双(3，5-(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32-十一氧杂三十四烷-34-基)苄基)-9H-芴(636mg，0.25mmol)、1，4-二乙烯基苯(32.3mg，0.25mmol)、乙酸钯(3mg，0.013mmol)、三-邻-甲苯基膦(10mg，0.033mmol)、以及碳酸钾(162mg，1.2mmol)与5mL的DMF在一个装有特氟纶涂覆的搅拌棒的小圆底烧瓶中进行组合。该烧瓶装配有一个针形阀并且置于一条史兰克线上。将该溶液通过三次冻结、泵送、以及解冻循环进行脱气。然后将该混合物加热到100℃过夜。
步骤2：连接物的添加
在第二天早上将二乙烯基苯(10mg，0.077mmol)转移到一个装有1mL DMF的小圆底烧瓶中。该烧瓶装配有一个针形阀并且置于一条史兰克线上。将该溶液通过三次冻结、泵送、以及解冻循环进行脱气。通过插管将该溶液经这些针形阀转移进入到该聚合反应中。在添加之后，允许该反应在100°进行至过夜。在第二天，将叔丁基4-(4-溴苯氧基)丁基氨基甲酸酯(53mg，0.15mmol)以及1mL的DMF转移到一个小圆底烧瓶中。该烧瓶装配有一个针形阀并且置于一条史兰克线上。将该溶液通过三次冻结、泵送、以及解冻循环进行脱气。通过插管将该溶液经这些针形阀转移进入该聚合反应中。在添加之后，允许该反应在100℃继续进行至过夜。
步骤3：预备处理
然后将该反应冷却并且用100mL水稀释。将该水溶液两次过滤穿过G-6玻璃纤维滤纸。将该滤液蒸干并且使用二氯甲烷再稀释。将有机层经MgSO4干燥并且过滤。将该滤液蒸发以产生一种琥珀色的油(342mg，56％产率)。
将4mL部分的在二噁烷中的4M HCl加入到该聚合物残余物中并且搅拌最少4个小时。将该溶液使用2M碳酸钾(水性)进行中和并且然后将该溶剂在真空中去除。将所生成的残余物用在水中的20％乙醇稀释到约30mL并且过滤。用G-25脱盐介质进行预备的凝胶渗透色谱法以便从该聚合物中去除过量的盐。将在这些馏分中的溶剂使用旋转蒸发去除并且收集到该聚合物为一种琥珀色的油。
该连接物或帽化单元的添加步骤可以在以上提供的聚合反应中进行，或者替代性地在在一些实施方案中可以在聚合进程之后来在单独的一组反应中进行。在后一种情况下，使该聚合物在与该实例中提供的那些类似的条件下发生反应。在其他实施方案中，还有可能与多种末端单体的组合发生反应以便引入带有双官能度的聚合物，从而允许该聚合物共轭至一个以上的实体上。
实例18：合成带有基于甘油的树枝状化合物的芴单体
步骤1：二甲基3，3’-(2，7-二溴-9H-芴-9，9-二基)二丙酸酯。将2，7-二溴芴(1g，3.1mmol)、丙烯酸甲酯(861mg，10mmol)、四丁基溴化铵(100mg，0.3mmol)以及甲苯(5mL)添加到一个带有氟纶涂覆的搅拌棒的小圆底烧瓶中。接下来在搅拌的同时加入2mL的50％NaOH(水性)。允许该反应开始过夜。次日，将该甲苯层转移到一个烧瓶中并且将该水层用两部分甲苯进行萃取。将这些有机层进行组合、经Mg2SO4干燥，并且过滤。将二氧化硅(2g)添加到该滤液中，并且蒸发该溶液。在通过柱色谱法纯化之后获得的产品为一种白色固体(1.23g，80％产率)。
步骤2：3，3’-(2，7-二溴-9H-芴-9，9-二基)二丙酸将二甲基3，3’-(2，7-二溴-9H-芴-9，9-二基)二丙酸酯(1.23g，2.5mmol)转移到一个装备有特氟纶涂覆的搅拌棒的小圆底烧瓶中。加入THF∶MeOH∶H2O，3∶2∶1的混合物(10mL)并且将该混合物搅拌1小时。然后，加入1mL部分的1M NaOH(水性)，并且将该混合物搅拌过夜。次日，将该水层分离出并且用20mL部分的二乙醚萃取三次。接下来，将该水层酸化到约pH 2。将水层使用20mL部分的二氯甲烷萃取三次。将这些有机层进行组合、并经Mg2SO4干燥。过滤该有机溶液并且将该溶剂蒸发以获得产物，为一种灰白色固体(948mg，90％产率)。
步骤3：3，3’-(2，7-二溴-9H-芴-9，9-二基)二(N-(7，15-双((2，3-二羟基丙氧基)甲基)-1，3，19，21-四羟基-5，9，13，17-四氧杂二十一烷-11-基)丙酰胺)。将3，3’-(2，7-二溴-9H-芴-9，9-二基)二丙酸(500mg，1.1mmol)、11-氨基-7，15-双((2，3-二羟基丙氧基)甲基)-5，9，13，17-四氧杂二十一烷-1，3，19，21-四元醇(1.954，3.3mmol)(根据参考文献Heek，T.、Fasting，C.、Rest，C.、Zhang，X.、Wurthner，F.、Haag，R.Chem.Commun.[化学通讯]，2010，46，1884-1886进行制备的)、以及N，N’-二甲基氨基吡啶(61mg，0.5mmol)在一个装备有特氟纶涂覆的搅拌棒并且用橡胶隔膜进行密封的圆底烧瓶中进行组合。将该烧瓶用N2吹扫并且通过注射器加入10mL的无水二氯甲烷。将该混合物搅拌以溶解这些固体。将二环己基碳二亚胺(DCC，910mg 4.4mmol)转移到另一个装备有特氟纶涂覆的搅拌棒的圆底烧瓶中，并且将该烧瓶用一个橡胶隔膜进行密封。接着，通过注射器将5mL的无水二氯甲烷转移到该烧瓶中。通过一个注射器将该DCC溶液逐滴转移到该芴反应混合物中。允许该反应进行反应至过夜。次日，过滤该反应混合物。通过柱色谱法纯化该滤液以便提供一种透明的油(1.24g，70％产率)。
实例19：合成一种基于芴单体PAMAM、以甲基PEG链封端的树枝状侧链
步骤1：9，9’-(3，3’-二酰氨基(四甲基PAMAM G[2])-2，7-二溴芴(i)
将二甲基3，3’-(2，7-二溴-9H-芴-9，9-二基)二丙酸酯(1g，2.0mmol)转移到一个装备有搅拌棒并且用橡胶隔膜密封的圆底烧瓶中。将该烧瓶用氮气吹扫并且通过注射器将10mL的干甲醇转移到该烧瓶中，并且通过搅拌溶解该固体。通过注射器缓慢加入乙二胺(5.5mL，82mmol)，并且允许该混合物搅拌2小时。去除该隔膜并且在真空下去除该甲醇和未反应的乙二胺。加入另外10mL部分的甲醇并搅拌，然后蒸发以去除任何残余的乙二胺。然后将残留在该烧瓶中的残余物再次用隔膜密封，用氮气吹扫，并且加入干甲醇(10mL)并且进行搅拌。通过注射器缓慢加入丙烯酸甲酯(7.2mL，80mmol)，并且允许该混合物搅拌2小时。再次去除该隔膜并且在真空下去除该甲醇和丙烯酸甲酯。加入10mL部分的甲苯，搅拌该混合物，并且在真空下去除该溶剂，提供了灰白色固体(1.79g，定量产率)。
步骤2：9，9’-(3，3’-二酰氨基(PAMAM G[2]四酸)-2，7-二溴芴(ii)
将9，9’-(3，3’-二酰氨基(四甲基PAMAM G[2])-2，7-二溴芴(i)(1.79g，2mmol)转移到一个装备有特氟纶涂覆的搅拌棒的小圆底烧瓶中。加入THF∶MeOH∶H2O，3∶2∶1的混合物(10mL)并且将该混合物搅拌1小时。然后，加入1mL部分的1M NaOH(水性)，并且将该混合物搅拌过夜。次日，将该水层分离出并且用20mL部分的二乙醚萃取三次。接下来，将该水层酸化到约pH 2。将水层使用20mL部分的二氯甲烷萃取三次。将这些有机层进行组合、经Mg2SO4干燥。过滤该有机溶液并且将该溶剂蒸发以获得产物，为一种灰白色固体(1.51g，90％产率)。
步骤3：9，9’-(3，3’-二酰氨基(PAMAM G[2]N-(2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂二十五烷-25-基)丙酰胺基)-2，7-二溴芴(iii)
将9，9’-(3，3’-二酰氨基(PAMAM G[2]四酸)-2，7-二溴芴(ii)(500mg，0.6mmol)、2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂二十五烷-25-胺(1.15g，3mmol)、以及N，N’-二甲基氨基吡啶(12mg，0.1mmol)在一个装备有特氟纶涂覆的搅拌棒并且用橡胶隔膜密封的圆底烧瓶中进行组合。将该烧瓶用N2吹扫并且通过注射器加入10mL的无水二氯甲烷。将该混合物搅拌以溶解这些固体。将二环己基碳二亚胺(DCC，825mg 4.0mmol)转移到另一个装备有特氟纶涂覆的搅拌棒的圆底烧瓶中，并且将该烧瓶用一个橡胶隔膜进行密封。接着，通过注射器将5mL的无水二氯甲烷转移到该烧瓶中。通过一个注射器将该DCC溶液逐滴转移到该芴反应混合物中。允许该反应进行反应至过夜。次日，过滤该反应混合物。通过柱色谱法纯化该滤液以便提供一种透明的油(967g，70％产率)。
实例20：合成一种带有基于三羟基苯连接的高度支化的PEG化侧链的芴单体
Figure BPA00001609256401301
步骤1：甲基3，4，5-三(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32-十一氧杂三十四烷-34-基氧基)苯甲酸酯(iv)
将甲基3，4，5-三羟基苯甲酸酯(200mg，1.1mmol)、2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32-十一氧杂三十四烷-34-基4-甲基苯磺酸酯(2.58g，3.85mmol)、以及18-冠醚-6(100mg，0.38mmol)转移到一个装备有特氟纶涂覆的搅拌棒的圆底烧瓶中。加入丙酮(10mL)并且将该烧瓶装备一个回流冷凝器。将该混合物在不断搅拌下回流过夜。次日加入二氧化硅(4g)并且蒸发该溶剂。在通过柱色谱法纯化后，获得了一种透明的油(887mg，48％产率)。
步骤2：3，4，5-三(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32-十一氧杂三十四烷-34-基氧基)-N-(2-氨乙基)苯甲酰胺(v)
将甲基3，4，5-三(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32-十一氧杂三十四烷-34-基氧基)苯甲酸酯(iv)(887mg，0.52mmol)转移到一个装备有搅拌棒并且用橡胶隔膜进行密封的圆底烧瓶中。将该烧瓶用氮气吹扫并且通过注射器将10mL的干甲醇转移到该烧瓶中，并且将该固体通过搅拌进行溶解。通过注射器缓慢加入乙二胺(0.7mL，10.4mmol)，并且允许该混合物搅拌2小时。去除该隔膜并且在真空下去除该甲醇和未反应的乙二胺。获得的产物为一种油(886mg，定量的产率)。
步骤3：3，3’-(2，7-二溴-9H-芴-9，9-二基)双(N-(2-3，4，5-三(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32-十一氧杂三十四烷-34-基氧基)-苯甲酰胺基-N酰胺基乙基)丙酰胺)(vi)
将3，4，5-三(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32-十一氧杂三十四烷-34-基氧基)-N-(2-氨乙基)苯甲酰胺(v)(886mg，0.52mmol)、3，3’-(2，7-二溴-9H-芴-9，9-二基)二丙酸(112mg，0.24mmol)、以及N，N’-二甲基氨基吡啶(12mg，0.1mmol)在一个装备有特氟纶涂覆的搅拌棒并且用橡胶隔膜密封的圆底烧瓶中进行组合。将该烧瓶用N2吹扫并且通过注射器加入10mL的无水二氯甲烷。将该混合物搅拌以溶解这些固体。将二环己基碳二亚胺(DCC，148mg0.72mmol)转移到另一个装备有特氟纶涂覆的搅拌棒的圆底烧瓶中，并且将该烧瓶用一个橡胶隔膜进行密封。接着，通过注射器将5mL的无水二氯甲烷转移到该烧瓶中。通过一个注射器将该DCC溶液逐滴转移到该芴反应混合物中。允许该反应进行反应至过夜。次日，过滤该反应混合物。通过柱色谱法纯化该滤液以便提供一种透明的油(924mg，70％产率)。
实例21：用于创建聚合物-染料标记以进行生物分子或基质共轭的双端封端的聚合物
Figure BPA00001609256401321
步骤1：合成一种不对称中性水溶性聚合物，在该聚合物的一个末端处具有一个t-BOC保护的胺侧基
2-溴-7-(4”-苯氧基丁基-1-叔丁基氨基甲酸酯)-聚-2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴。
将2-溴-9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，20’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)-7-(4”，4”，5”，5”-四甲基-1”，3”，2”-二噁环戊硼烷-2-基)芴(1.0g，0.674mmol)、3mL的四氢呋喃、以及2mL的2M碳酸钾(水性)转移到一个装有特氟纶搅拌棒的小圆底烧瓶中。该烧瓶装配有一个隔膜并且将该溶液用Ar喷射15分钟进行除气。经该烧瓶的颈口加入四(三苯基膦)钯(15.6mg，0.013mmol)并且将该烧瓶转移到一个装备有针形阀的回流冷凝器中并且固定到该史兰克线上。将该溶液用液氮快速冷冻成固体并且使用冻结-泵送-解冻技术进一步进行除气。一旦除气，就将该反应在不断搅拌下加热到80℃。允许该反应进行至过夜。次日，将1mL THF中的叔丁基4-(4-溴苯氧基)丁基氨基甲酸酯(35mg，0.10mmol)用三次冻结-泵送-解冻循环进行脱气并且然后通过插管在过量氮气压下添加到该聚合反应中。该反应在80℃下继续进行至过夜。次日将该反应混合物冷却并且在真空下去除大部分溶剂。将剩余材料转移到一个装有总计约50mL二氯甲烷的小锥形瓶中。将该溶液搅拌30分钟。将约1g的MgSO4(无水的)添加到该溶液中，并且将该混合物经一个带槽的纸过滤器进行过滤。蒸发该滤液并且收集到410mg(47％产率)的琥珀色油。
步骤2：对末端连接单体在与其被保护的胺悬挂物相反的末端处添加叔丁基酯的合成
2-(4-(叔丁基1-苯氧基-3，6，9，12，15，18，21，24-八氧杂二十七烷-27-酸酯))-7-(4”-苯氧基丁基-1-叔丁基氨基甲酸酯)-聚-2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴。
将2-溴-7-(4”-苯氧基丁基-1-叔丁基氨基甲酸酯)-聚-2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴(410mg，0.32mmol的重复单元)、叔丁基1-(4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二噁环戊硼烷-2-基)苯氧基)-3，6，9，12，15，18，21-七氧杂二十四烷-24-酸酯(33mg，0.048mmol)、2mL的四氢呋喃、以及1.5mL的2M碳酸钾(水性)转移到一个装有特氟纶搅拌棒的小圆底烧瓶中。该烧瓶装配有一个隔膜并且将该溶液通过用Ar喷射15分钟进行除气。经该烧瓶的颈口加入四(三苯基膦)钯(15mg，0.013mmol)并且将该烧瓶转移到一个装备有针形阀的回流冷凝器中并且固定到该史兰克线上。将该溶液用液氮快速冷冻成固体并且使用冻结-泵送-解冻技术进一步进行除气。一旦除气，就将该反应在不断搅拌下加热到80℃。允许该反应开始过夜。将剩余材料转移到一个带有总计约50mL二氯甲烷的小锥形瓶中。将该溶液搅拌30分钟。将约1g的MgSO4(无水的)添加到该溶液中，并且将该混合物通过一个带槽的纸过滤器进行过滤。蒸发该滤液并且收集到351mg(78％产率)的琥珀色油。
步骤3：合成一种在一端带有伯胺而在另一端带有叔丁酯悬挂物的中性水溶性聚合物
2-(4-(叔丁基1-苯氧基-3，6，9，12，15，18，21，24-八氧杂二十七烷-27-酸酯))-7-(4”-苯氧基丁基-1-氨基)-聚-2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴
将2-(4-(叔丁基1-苯氧基-3，6，9，12，15，18，21，24-八氧杂二十七烷-27-酸酯))-7-(4”-苯氧基丁基-1-叔丁基氨基甲酸酯)-聚-2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴(23mg，0.018mmol)和0.5mL的在二噁烷中的4M HCl在一个带有特氟纶涂覆的搅拌棒的1打兰玻璃瓶中进行组合。将该混合物搅拌4小时。将该混合物使用2M的碳酸钾(水性)进行中和。然后将该溶液稀释到50mL的在水中约20％的乙醇并且穿过G-6玻璃纤维滤纸进行过滤。将滤液通过离心作用在一个4mL 10KDa截断式离心过滤器中进行脱盐。在真空下蒸发该渗余物，并且加入两个1mL部分的甲苯并且在真空下去除以便去除任何残留水。从该脱盐作用回收了一种浓稠的琥珀色液体(21mg，85％产率)。
步骤4：将一种NHS-功能化的染料附接到中性水溶性聚合物上的伯胺悬挂物上
2-(4-(叔丁基1-苯氧基-3，6，9，12，15，18，21，24-八氧杂二十七烷-27-酸酯))-7-(4”-苯氧基丁基-1-酰氨基-染料)-聚-2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴
将2-(4-(叔丁基1-苯氧基-3，6，9，12，15，18，21，24-八氧杂二十七烷-27-酸酯))-7-(4”-苯氧基丁基-1-氨基)-聚-2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴(518ug，0.4μM)溶解在玻璃瓶中的100μL干二氯甲烷中。加入4-N，N’-二甲基氨基吡啶小晶体。在另一个玻璃瓶中，将65μg(0.06uM)的NHS-功能化的DyLight 594(Pierce)溶解在50μL的干二氯甲烷中。将这两种溶液进行组合并且允许在以箔片密封的玻璃瓶中搅拌4小时。然后蒸发该溶剂并且将剩余材料溶解在95％乙醇中并且注入一个琼脂糖凝胶6(Sepharose 6)柱中。该剩余染料从该聚合物中分离出。从组合多个馏分获得了染料标记的聚合物的溶液(约100μg，20％产率)。
步骤5：染料标记的中性水溶性聚合物上的叔丁酯悬挂物的水解，在这些末端之一上形成了羧酸悬挂物
2-(4-(1-苯氧基-3，6，9，12，15，18，21，24-八氧杂二十七烷-27-酸))-7-(4”-苯氧基丁基-1-酰氨基-染料)-聚-2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴。
将该聚合物与ZnBr2在二氯甲烷中进行组合并且搅拌过夜。次日，添加一部分的水并且将该混合物搅拌1小时。蒸发该溶剂并且将该残余物溶解在水中的20％乙醇中。然后将滤液在一个4mL 10KDa截断式离心过滤器中通过离心作用进行脱盐。在真空下蒸发该渗余物，并且加入两个1mL部分的甲苯并且在真空下去除以便去除任何残留水。
可以使用不同的方法来实现这个实例中第二官能团(苯甲酸)的活化(用于随后的共轭)，这些方法包括在实例29以及其他实例中关于苯甲酸到胺到马来酰亚胺所说明的那些。一种这样的方法仅作为举例在以下步骤6中给出。
步骤6：染料标记的中性水溶性聚合物的羧酸悬挂物的NHS活化
2-(4-(1-苯氧基-3，6，9，12，15，18，21，24-八氧杂二十七烷-27-N-羟基琥珀酰亚胺基酯))-7-(4”-苯氧基丁基-1-酰氨基-染料)-聚-2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴。将2-(4-(1-苯氧基-3，6，9，12，15，18，21，24-八氧杂二十七烷-27-酸))-7-(4”-苯氧基丁基-1-酰氨基-染料)-聚-2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴以及O-(N-琥珀酰亚胺基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐以及DIPEA在干乙腈中进行组合并且允许其在氮气下反应30分钟。蒸发该溶液并且将该固体再悬浮在干二氯甲烷中。过滤掉固体并且蒸发该滤液以便提供该NHS酯。
在另外的实施方案中，可以将各种常用的保护基与所提供的那些官能团(胺和羧酸)一起使用。另外，不同的帽化单体和保护基组合可以用于生产带有不同的共轭官能团的聚合物。消除或取代对于另一个实体进行的染料标记步骤将产生具有两个不同的共轭官能团的聚合物。染料通过NHS/胺化学作用的附接可以在多种常用条件下进行。染料附接还可以通过其他功能化学作用来进行。
实例22：使用未调整的苏楚基条件合成不对称聚芴
步骤1：聚合
方法A：在圆底烧瓶中将在水中的K2CO3溶液(2M，4mL)添加到2-溴-9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，20’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)-7-(4”，4”，5”，5”-四甲基-1”，3”，2”-二噁环戊硼烷-2-基)芴(A)(2.3g，1.5mmol)与THF(6mL)的一种搅拌后的溶液中。将这种混合物用氩气除气15分钟。将四(三苯基膦)钯(38.5mg，0.03mmol)添加到该混合物中并且将该烧瓶附接到一个回流冷凝器上。
将该反应器通过3个冻结-泵送-解冻循环除气并且然后加热到80℃持续12小时。
然后将该反应混合物冷却到23℃并且将该溶剂使用旋转蒸发来去除。将所生成的残余物转移到一个锥形瓶中并且用20％EtOH/H2O(75mL)进行稀释。将EDTA(300mg，1.0mmol)添加到该混合物中并在23℃搅拌1小时。将该混合物穿过一张玻璃纤维滤纸进行过滤并且将该滤纸用20％EtOH/H2O进行漂洗。然后将所生成的滤液通过一个0.45um的杯状过滤器进行过滤。
将该过滤后的反应混合物使用切向流过滤(TFF)来纯化并且使用一个10,000分子量筛截膜将其渗滤成为20％乙醇(再生纤维素Prep/Scale TFF滤筒系统，马萨诸塞州比勒瑞卡市米利波尔(Millipore，Billerica，Mass))直到测得该滤液的导电性小于0.01mS/cm。然后在真空下去除该溶剂以便给出聚[2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴](B)，为一种凝胶状的产物(1.41g，71％)。分子量通过GPC分析相对于聚苯乙烯标准物来确定(Mn＝51,000，Mw＝108,000，Mp＝90,000，D＝2.1)。末端连接物并入的程度是通过首先将该酸转换为一种NHS酯(与实例29中提供的相类似的方案)然后与胺功能性染料发生反应来确定的。在自由染料纯化之后，根据吸光度测量来确定染料与聚合物之比，将消光系数和聚合物的分子量的差异考虑在内。
方法B：在圆底烧瓶中将在水中的K2CO3溶液(2M，4mL)添加到2-溴-9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，20’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)-7-(4”，4”，5”，5”-四甲基-1”，3”，2”-二噁环戊硼烷-2-基)芴(A)(2.3g，1.5mmol)与DMF(6mL)的一种搅拌后溶液中。将这种混合物用氩气除气15分钟。将四(三苯基膦)钯(38.5mg，0.03mmol)添加到该混合物中并且将该烧瓶附接到一个回流冷凝器上。将该反应器通过3个冻结-泵送-解冻循环除气并且然后加热到80℃持续12小时。预备处理(work-up)和纯化是以与前面说明的方法A相类似的方式来进行的。分子量通过GPC分析相对于聚苯乙烯标准物来确定(Mn＝96,000，Mw＝231,000，Mp＝185,000，D＝2.4)。
方法C：在圆底烧瓶中将Cs2CO3(2.08g，6.4mmol)添加到2-溴-9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，20’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)-7-(4”，4”，5”，5”-四甲基-1”，3”，2”-二噁环戊硼烷-2-基)芴(A)(200mg，0.135mmol)与DMF(7mL)的一种搅拌后的溶液中。将这种混合物用氩气除气15分钟。将四(三苯基膦)钯(15.6mg，10mol％)添加到该混合物中并且将该烧瓶附接到一个回流冷凝器上。将该反应器通过3个冻结-泵送-解冻循环除气并且然后加热到80℃持续12小时。预备处理和纯化是以与前面说明的方法A相类似的方式来进行的。分子量通过GPC分析相对于聚苯乙烯标准物来确定(Mn＝95,000，Mw＝218,000，Mp＝206,000，D＝2.3)。
步骤2：封端
使用THF(3.5mL)将-(4-碘代苯基)丁酸(227mg，0.783mmol)洗涤到一个含聚[2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴](B)(1.00g，0.783mmol)的烧瓶中。将K2CO3在水中的溶液(2M，2.3mL)添加到该烧瓶中并且将这种混合物用氩气脱气15分钟。将四(三苯基膦)钯(36mg，4mol％)添加到该混合物中并且将该烧瓶附接到一个回流冷凝器上。将该反应器通过3个冻结-泵送-解冻循环除气并且然后加热到80℃持续12小时。
然后将该反应混合物冷却到23℃并且将该溶剂使用旋转蒸发来去除。将所生成的残余物转移到一个锥形瓶中并且用20％EtOH/H2O(150mL)进行稀释。将EDTA(500mg)添加到该混合物中并在23℃搅拌1小时。将该混合物穿过一张玻璃纤维滤纸进行过滤并且将该滤纸用20％EtOH/H2O进行漂洗。然后将所生成的滤液通过一个0.45um的杯状过滤器进行过滤。
将该过滤后的反应混合物使用切向流过滤(TFF)来纯化并且使用一个10,000分子量筛截膜将其渗滤为20％乙醇(再生纤维素Prep/Scale TFF滤筒系统，马萨诸塞州比勒瑞卡市米利波尔)直到测得该滤液的导电性小于0.01mS/cm。然后在真空下去除该溶剂以便给出4-(聚[2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴]基)苯基)丁酸(C)，为一种凝胶状的产物(388mg，39％)。分子量通过GPC分析相对于聚苯乙烯物标准来确定(Mn＝89,000，Mw＝196,000，Mp＝124,000，D＝2.2)。末端连接物并入的程度是通过首先将该酸转换为一种NHS酯(与在实例29中提供的相类似的方案)然后与一种胺功能性染料发生反应来确定的。在自由染料纯化之后，根据吸光度测量来确定染料与聚合物之比，将消光系数和聚合物的分子量的差异考虑在内。
步骤3：胺活化
将4-(聚[2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴]基)苯)丁酸(C)(200mg，0.156mmol)溶解在2mL的乙醇中，然后在搅拌下逐滴加入到23mL的4℃的MES缓冲液(50mM，pH 5)中。将N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(576mg，3.00mmol)以多个部分进行添加、接着是将N-羟基琥珀酰亚胺(115mg，1.00mmol)一次性添加。将该溶液搅拌30分钟，逐滴加入乙二胺(0.501mL，7.50mmol)，并且将该反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将该反应混合物在一个G25脱盐柱上进行脱盐，并且通过旋转蒸发去除溶剂以便给出N-(2-氨乙基)-4-(聚[2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴]基)丁酰胺，为一种透明的黄色油(190mg，95％)。分子量通过GPC分析相对于聚苯乙烯标准物来确定(Mn＝89,000，Mw＝196,000，Mp＝124,000，D＝2.2)。胺转化的程度是通过将该胺聚合物与一种NHS活性染料以与实例38中说明的类似的方式发生反应来进行确定。
实例23.使用连接物改性的端帽调节苏楚基聚合来合成不对称聚芴
步骤1：聚合反应/封端/预备处理
在装备有侧壁龙头的圆底烧瓶中将在水中的K2CO3溶液(2M，4mL)添加到2-溴-9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，20’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)-7-(4”，4”，5”，5”-四甲基-1”，3”，2”-二噁环戊硼烷-2-基)芴(A)(2.3g，1.55mmol)、4-(4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二噁环戊硼烷-2-基)苯基)丁酸(B)(6.7mg，2mol％)、以及DMF(6mL)的一种搅拌后的溶液中。将这种混合物用氩气除气25分钟。然后将四(三苯基膦)钯(38.5mg，2mol％)添加到该混合物中并且将该烧瓶附接到一个回流冷凝器上。将该反应容器通过3个冻结-泵送-解冻循环进一步除气并且然后加热到80℃。
在一个装备有侧臂龙头的圆底烧瓶中，单独地将4-(4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二噁环戊硼烷-2-基)苯基)丁酸(B)(230mg，0.793mmol)溶解在DMF(3mL)中。将该溶液用氩气喷射15分钟，附接到一个回流冷凝器上并且通过三次冻结-泵送-解冻循环进行脱气。在解冻后，在两个小时的反应时间之后使用一个氩气吹扫的注射器将该溶液加入到该反应混合物中。将该反应混合物在80℃搅拌另外的12小时。
将该反应混合物冷却到23℃并且将该溶剂使用旋转蒸发来去除。将所生成的残余物转移到一个锥形瓶中并且用20％EtOH/H2O(75mL)进行稀释、将EDTA(300mg，1.00mmol)添加到该混合物中并在23℃搅拌1小时。将该混合物穿过一张玻璃纤维滤纸进行过滤并且将该滤纸用20％EtOH/H2O进行漂洗。然后将所生成的滤液通过一个0.45um的杯状过滤器进行过滤。
将该过滤后的反应混合物使用切向流过滤(TFF)来纯化并且进行大小分级并且使用一个30,000分子量筛截膜将其渗滤为20％乙醇(聚醚砜Prep/Scale TFF滤筒系统，马萨诸塞州比勒瑞卡市米利波尔)直到测得该滤液的导电性为小于0.01mS/cm并且通过GPC测得该渗余物的Mn大于70,000。然后在真空下去除该溶剂以便给出4-(聚[2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴]基)苯基)丁酸，为一种凝胶状的产物(1.41g，71％)。分子量通过GPC分析相对于聚苯乙烯标准物来确定(Mn＝68,000，Mw＝134,000，Mp＝122,000，D＝1.9)。末端连接物并入的程度是通过首先将该酸转换为一种NHS酯(与实例29中提供的相类似的方案)然后与一种胺功能性染料发生反应来确定的。在自由染料纯化之后，根据吸光度测量来确定染料与聚合物之比，将消光系数和聚合物的分子量的差异考虑在内。
尽管具有的分子量超过了50,000g/mole，但是该聚合物在水和磷酸盐缓冲盐水溶液两者中均容易以大于10mg/mL的浓度溶解。在许多共轭试验中，将所提供的聚合物(以及在此说明的具有类似结构的其他物质)浓缩到50mg/mL或更高，这对于中性的共轭聚合物而言是突出的。中等分子量也提供了大于2,500,000M-1cm-1的消光系数。大的消光系数以及60％的量子产率(PBS)提供了异常明亮的荧光报告物，用于在生物测定中使用，包括在流式细胞术中使用。
步骤2：胺活化
将4-(聚[2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴]基)苯)丁酸(C)(500mg，0.13mmol)溶解在2mL的乙醇中，然后在搅拌下逐滴加入到23mL的4℃的MES缓冲液(50mM，pH 5)中。将N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐以多个部分添加、接着一次性添加N-羟基琥珀酰亚胺(0.52g)。将该溶液搅拌30分钟，逐滴加入乙二胺(2.8mL)，并且将该反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将该反应混合物在一个G25脱盐柱上进行脱盐，并且通过旋转蒸发去除溶剂以便给出N-(2-氨乙基)-4-(聚[2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴]基)丁酰胺，为一种黄色油(450mg，90％)。胺转化的程度是通过将该胺聚合物与一种NHS活性染料以与实例38中说明的类似的方式发生反应来进行确定。
实例24：PEG改性的聚芴的Yamamoto聚合
步骤1：Yamamoto聚合/预备处理
在一个干燥箱中，将Ni(COD)2(0.387g，1.41mmol)、2，2’-联吡啶基(0.220g，1.41mmol)、COD(0.152g，1.41mmol)以及无水DMF(16ml)添加到一个长颈圆底烧瓶中。将2，7-二溴-9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)芴(A)(1.00，0.696)称重到一个40ml的玻璃瓶中并且溶解在无水DMF(8ml)中。将该烧瓶用一个隔膜进行密封并且将该玻璃瓶用一个隔膜螺帽关闭。将该催化剂混合物和该单体溶液转移出该干燥箱中并且置于静止的氩气下。将该反应烧瓶加热到70℃持续45分钟。然后将该单体溶液通过氩气吹扫的注射器迅速从该玻璃瓶中转移到该催化剂混合物烧瓶中。然后将该反应混合物加热到70℃持续6个小时。
然后将该反应混合物冷却并且将该溶剂使用旋转蒸发来去除。将所生成的黑色残余物再溶解在20％EtOH(80mL)中并在2400rpm下离心12小时。然后将上清液轻轻倒出并且通过一个0.45um的杯状过滤器进行过滤。
将该过滤后的反应混合物使用切向流过滤(TFF)来纯化并且使用一个10,000分子量筛截膜将其渗滤为20％乙醇(再生纤维素Prep/Scale TFF滤筒系统，马萨诸塞州比勒瑞卡市米利波尔)直到渗余物的GPC分析表明不存在低分子量物质。然后在真空下去除该溶剂以便给出聚[2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴](B)，为一种粘性油(0.700g，79％)。分子量通过GPC分析相对于聚苯乙烯标准物来确定(Mn＝62,000，Mw＝127,000，Mp＝93,000，D＝2.0)。
步骤2：封端：封端是以与实例22的步骤2相类似的方式来进行的。
步骤3：胺活化：胺活化是以与实例22的步骤3相类似的方式来进行的。
实例25.合成具有两个不同连接物的串型聚合物
Figure BPA00001609256401451
步骤1：聚合
在一个干燥箱中，将Ni(COD)2(0.765g，2.78mmol)、2，2’-联吡啶基(0.435g，2.78mmol)、COD(0.301g，2.78mmol)以及无水DMF(20ml)添加到一个长颈圆底烧瓶中。将2，7-二溴-9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)芴(A)(1.80，1.26mmol)和叔丁基4-(2，7-二溴-9-甲基-9H-芴-9-基)丁基氨基甲酸酯(B)(0.071g，0.126mmol)添加到一个40ml的玻璃瓶中并且溶解在无水DMF(30ml)中。将该烧瓶用一个隔膜进行密封并且将该玻璃瓶用一个隔膜螺帽关闭。将该催化剂混合物和该单体溶液转移出该干燥箱中并且置于静止的氩气下。将该反应烧瓶加热到70℃持续45分钟。然后将该单体溶液通过氩气吹扫的注射器迅速从该玻璃瓶中转移到该催化剂混合物烧瓶中。然后将该反应混合物加热到70℃持续6个小时。
然后将该反应混合物冷却并且将该溶剂使用旋转蒸发来去除。将所生成的黑色残余物再溶解在20％EtOH(80mL)中并在2400rpm下离心12小时。然后将上清液轻轻倒出并且通过一个0.45um的杯状过滤器进行过滤。
将该过滤的反应混合物使用切向流过滤(TFF)来纯化并且使用一个10,000分子量筛截膜将其渗滤为20％乙醇(再生纤维素Prep/Scale TFF滤筒系统，马萨诸塞州比勒瑞卡市米利波尔)直到渗余物的GPC分析表明不存在低分子量的物质。在真空下去除该溶剂以便给出2，7-二溴-聚-[2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴-共-2，7-(9-甲基-9’-(丁基-4-叔丁基氨基甲酸酯)芴)](C)，为一种粘性油(1.3g，45％)。分子量通过GPC分析相对于聚苯乙烯标准物来确定(Mn＝72,000，Mw＝156,000，Mp＝138,000，D＝2.1)。
步骤2：封端
在圆底烧瓶中将在水中的K2CO3溶液(2M，4mL)添加到2，7-二溴-聚-[2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴-共-2，7-(9-甲基-9’-(丁基-4-叔丁基氨基甲酸酯)芴)](C)(800mg，0.67mmol)、4-(4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二噁环戊硼烷-2-基)苯基)丁酸(D)(120mg，0.41mmol)、以及DMF(6mL)的一种搅拌后的溶液中。将这种混合物用氩气除气15分钟。将四(三苯基膦)钯(50mg，6mol％)添加到该混合物中并且将该烧瓶附接到一个回流冷凝器上。将该反应器通过3个冻结-泵送-解冻循环除气并且然后加热到80℃持续12小时。
将该反应混合物冷却到23℃并且在真空中浓缩到2mL的体积。将该粗反应混合物转移到一个锥形瓶中并且用20％EtOH/H2O(75mL)进行稀释、将EDTA(300mg，2.00mmol)添加到该混合物中并在23℃搅拌1小时。将该混合物穿过一张玻璃纤维滤纸进行过滤并且将该滤纸用20％EtOH/H2O进行漂洗。然后将所生成的滤液通过一个0.45um的杯状过滤器进行过滤。
将该过滤后的反应混合物使用切向流过滤(TFF)来纯化并且进行大小分级并且使用一个10,000分子量筛截膜将其渗滤为20％乙醇(聚醚砜Prep/Scale TFF滤筒系统，马萨诸塞州比勒瑞卡市米利波尔)直到测得该滤液的导电性为小于0.01mS/cm。在真空下去除该溶剂以便给出4-(4-(2-溴-聚-[2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴-共-2，7-(9-甲基-9’-(丁基-4-叔丁基氨基甲酸酯)芴)])苯基)丁酸(E)，为一种黄色的油(660mg，82％)。
步骤3：连接物的脱保护
在一个圆底烧瓶中将三氟乙酸(4mL)逐滴加入到4-(4-(2-溴-聚-[2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴-共-2，7-(9-甲基-9’-(丁基-4-叔丁基氨基甲酸酯)芴)])苯基)丁酸(E)(200mg，0.169mmol)和二氯甲烷(16mL)的一个搅拌后的溶液中。在室温下将该反应混合物搅拌2小时并且然后在真空下浓缩。将该残余物再溶解在最少的20％EtOH中，并且将1M HCl添加到该溶液中直到pH＝7。然后将该中和后的溶液在G25凝胶上脱盐，并且将所生成的材料浓缩到干燥以便产生一种透明的淡黄色油(F)。
染料的并入、连接物的活化、以及生物共轭的实例被包含在另外的实例38中以及相关的实例中。
实例26：使用封端单元调整聚合反应来合成一种具有两个不同连接物的串型聚合物
Figure BPA00001609256401481
步骤1：Yamamoto聚合
在一个干燥箱中，将Ni(COD)2(0.433g，8.40mmol)、2，2’-联吡啶基(0.246g，8.40mmol)、COD(0.170g，8.40mmol)以及无水DMF(15ml)添加到一个长颈圆底烧瓶中。将2，7-二溴-9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)芴(A)(1.00，0.696mmol)、叔丁基4-(2，7-二溴-9-甲基-9H-芴-9-基)丁基氨基甲酸酯(B)(0.037g，0.069mmol)以及叔丁基4-(4-溴苯基)丁酸盐酯(C)(0.004g，0.007mmol)添加到一个40ml的玻璃瓶中并且溶解在无水DMF(10ml)中。将该烧瓶用一个隔膜进行密封并且将该玻璃瓶用一个隔膜螺帽关闭。将该催化剂混合物和该单体溶液转移出该干燥箱中并且置于静止的氩气下。将该反应烧瓶加热到70℃持续45分钟。然后将该单体溶液通过氩气吹扫的注射器迅速从该玻璃瓶中转移到该催化剂混合物烧瓶中。然后将该反应混合物加热到70℃持续6个小时。
然后将该反应混合物冷却并且将该溶剂使用旋转蒸发来去除。将所生成的黑色残余物再溶解在20％EtOH(80mL)中并在2400rpm下离心12小时。然后将上清液轻轻倒出并且通过一个0.45um的杯状过滤器进行过滤。
将该过滤的反应混合物使用切向流过滤(TFF)来纯化并且使用一个10,000分子量筛截膜将其渗滤为20％乙醇(再生纤维素Prep/Scale TFF滤筒系统，马萨诸塞州比勒瑞卡市米利波尔)直到渗余物的GPC分析表明不存在低分子量的物质。然后真空下去除该溶剂以便给出叔丁基4-(4-(2-溴-聚-[2，7{9，9-双(2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十二氧杂三十八烷)芴-共-2，7-(9-甲基-9’-(丁基-4-叔丁基氨基甲酸酯)芴)])苯基)丁酸酯(D)，为一种粘性油(664g，80％)。分子量通过GPC分析相对于聚苯乙烯标准物来确定(Mn＝50,000，Mw＝88,000，Mp＝174,000，D＝1.8)。
步骤2：连接物的脱保护
在一个圆底烧瓶中将三氟乙酸(6mL)逐滴加入到聚合物(300mg，X mmol)和二氯甲烷(24mL)的一个搅拌后的溶液中。在室温下将该反应混合物搅拌2个小时并且然后在真空下浓缩。将该残余物再溶解在最少的20％EtOH中，并且将1M HCl添加到该溶液中直到pH＝7。然后将该中和后的溶液在G25凝胶上脱盐，并且将所生成的材料浓缩到干燥以便产生一种透明的淡橙色油(261mg，87％)。
染料的并入、连接物的活化、以及生物共轭的实例被包含在另外的实例38中以及相关的实例中。
实例27.同时具有内部和末端共轭位点的双官能不对称聚合物，用于产生进行生物分子或基质的共轭的聚合物-染料标记。
Figure BPA00001609256401501
在实例23中说明的这些条件下进行2-溴-9，9-二(2’，5’，8’，11’，14’，17’，20’，23’，26’，29’，32’，35’-十二氧杂三十八烷-38’-基)-7-(4”，4”，5”，5”-四甲基-1”，3”，2”-二噁环戊硼烷-2-基)芴的苏楚基聚合，其中y％是用于调整该聚合反应并且确保该连接物的高并入的这种末端连接物的mol％。在这个实例中的连接物是4-(4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二噁环戊硼烷-2-基)苯基)丁酸。在这个实例中，还将xmol％的内部连接物添加到该聚合反应中以将该第二连接位点并入到该聚合物中。这种用于并入该内部连接物的方法总体上在实例21、25和26中进行了说明。该内部连接物必须在聚合过程中如所指示的被并入，然而，期望的是有可能如在实例9、10、11和21中说明的作为一个单独的步骤来添加该末端连接物。
实例28：连接物-功能化聚合物的富集
连接物-功能化聚合物的合成可以产生具有和不具有连接物功能性的链混合物。因为，预期共轭效率会随着用于共轭的聚合物的更高纯度而改进，因此在这个实例中说明的方法通过富集含连接物的链而解决这一点。
对于含有COOH-改性的或未改性的聚合物的混合物的一个聚合物批次：将聚合物溶解在95％EtOH中，然后用水稀释到20％的最终EtOH浓度。使用10kDa MWCO过滤器将该聚合物脱盐，直到电导系数是＜0.1mS/cm。注射到Q-琼脂糖凝胶柱上，确保该聚合物负载是适合于柱容量飞。使水中的20％EtOH经过柱以便洗掉未结合的聚合物。通过对于两个柱体积将该洗脱缓冲液变成在水中的20％EtOH中的1M NaCl以便触发所结合的聚合物材料的释放，以此释放被结合的聚合物。收集富集的材料。
使该聚合物经过一个强阴离子交换剂，如Q-琼脂糖凝胶柱。带有羧酸官能团的聚合物链将结合该强阴离子交换剂，并且未经功能化的聚合物并不结合并且反而将洗涤穿过。在该未功能的聚合物已经穿过该柱之后，将该柱用1M NaCl进行洗涤，这通过从该介质中筛出酸基团而触发了该酸功能化的聚合物的释放。通过使用这种方法，显示了功能聚合物的百分比从25％的带有羧酸基团的聚合物链增加到＞80％的带有羧酸基团的聚合物链。这种在功能链上的增加已经通过分析富集前后的聚合物-染料共轭物的吸光度比率而显示出来。这个程序还在实例38中进行了说明。关于含胺聚合物的富集也确认了类似的过程。在该情况下，将一种阴离子交换树脂，SP琼脂糖凝胶(或者类似物)，以减少的电导率低于0.01mS/cm)进行加载(。
实例29：通过NHS/胺偶联来制备聚合物-链亲和素共轭物
实例29a：聚合物改性
聚合物改性-羧酸到胺的转化
Figure BPA00001609256401521
将1.35g的羧酸封端的聚合物溶解在9mL的乙醇中，然后在搅拌的同时逐滴加入80mL的4℃ 50mM MES，pH 5中。一次性加入0.52g的N-羟基琥珀酰亚胺。一旦该N-羟基琥珀酰亚胺已经溶解，则以多个部分加入2.3g N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐。在搅拌该溶液30分钟之后，逐滴加入2.8mL的乙二胺。将该溶液在室温下搅拌过夜并且通过切向流过滤来纯化(MWCO＝10kDa)。1.22g产率(90％)。
聚合物改性-胺到羧酸的转化
将70mg的胺封端的聚合物溶解在7mL DMSO中。将2.3mg DIPEA添加到该聚合物溶液中。将2.2mg DMAP溶解在220μL DMSO中并且添加到所生成的聚合物溶液中。将5.5mg琥珀酸酐溶解在550μL DMSO中并且添加到所生成的聚合物溶液中。将该溶液在室温下搅拌过夜。然后将该反应经奥米康(Amicon)超离心过滤单元(MWCO＝10kDa)使用25mM MES pH 5缓冲液进行纯化。62mg产率(89％)。
聚合物改性-羧酸到NHS-酯的转化
Figure BPA00001609256401532
将60mg的羧酸封端的聚合物溶解在600μL的乙腈中。将1.2μg DIPEA添加到该聚合物溶液中。将2.8mg N，N，N′，N′-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲鎓溶解在370μL乙腈中并且添加到该聚合物溶液中。将该溶液在室温下搅拌15分钟。在该反应完成后，在减压下蒸发该溶剂。50mg产率(83％)。
实例29b：蛋白-聚合物的共轭
将链亲和素蛋白溶解在50mM NaHCO3 pH 8.2缓冲液中以便制造1mg/mL的溶液。将来自步骤2的粗制的活化的聚合物(10-15当量或按照要求)溶液添加到该水性链亲和素蛋白溶液中；用缓冲液调整该蛋白的浓度以确保所添加的有机溶液的体积是＜10％的总体积，如果需要的话。将该溶液在室温下搅拌3小时并且将该反应转移到一个奥米康超过滤器(MWCO＝10kDa)中以便去除DMF。将该蛋白用25mM PO4 pH 6.5缓冲液恢复到初始体积。
该蛋白-聚合物共轭物的纯化
将1mL HiTrap SP琼脂糖凝胶FF柱用20mM柠檬酸钠pH 3缓冲液进行平衡。将1mL(0.3-1mg/mL)链亲和素-聚合物共轭物加载在25mM NaHPO4 pH 6.5中。将该样本穿过柱用20mM柠檬酸钠pH 3缓冲液来洗涤，直到获得稳定的基线。随后可以加载多个1mL等分的样本并且洗涤。将该柱用最少10个柱体积的20mM柠檬酸钠pH 3缓冲液进行洗涤。将该共轭物用10个柱体积的0.6MNaCl中20mM柠檬酸钠的pH 7.6缓冲液进行洗脱，并且将该柱用10个柱体积的在该洗脱缓冲液中的20％乙醇进行汽提。将该洗脱峰用奥米康超过滤器(MWCO＝10kDa)进行浓缩以便将体积减少到约200μl。将一个10x300mm Superose 12柱用0.6M NaCl中20mM柠檬酸钠的pH 7.6缓冲液进行平衡。将200μL的经浓缩的链亲和素-聚合物共混物进行加载并且用0.6M NaCl中20mM柠檬酸钠的pH 7.6缓冲液进行洗脱。将多个馏分进行收集并且使用奥米康超离心过滤器(10kD MWCO)将缓冲液更换为PBS+0.05％NaN3。将洗脱物浓缩到所希望的测试浓度；在2μM链亲和素左右。
纯化后的蛋白-聚合物共轭物的表征
制备4％-20％的丙烯酰胺Tris-HCl预制凝胶(BioRad)，并且对该凝胶在分离的泳道中加载该共轭物以及自由链亲和素和自由聚合物。凝胶电泳法是在25mM Tris 192mM、Glycine pH 8.3中进行并且通过考马斯染色剂(Coomassie)进行染色以便将该蛋白可视化。将该凝胶染色30分钟后然后通过商用脱色液来脱色过夜。琼脂糖凝胶条件还被用于表征聚合物-链亲和素共轭物，如在图29中所示的一个实例。
在多个替代实施方案中，可以将以上实例调整为允许该聚合物共轭至生物分子或染料上，包括但不限于抗体和核酸上。使用替代性交联剂或者改性剂将该聚合物上的胺转化为马来酰亚胺和羧酸(进一步被活化而形成NHS酯)。在某些实施方案中，同一聚合物共轭至其他生物分子(链亲和素、抗体片段、核酸)上是使用马来酰亚胺-硫醇化学作用(使用SATA连接物转化生物分子上的自由胺，或抗体的TCEPP(或DPP)还原而产生自由硫醇)来促进的。
实例30：通过酰肼/苯甲醛偶联来制备聚合物-链亲和素共轭物
步骤1：链亲和素-4FB改性
将链亲和素蛋白以1.7mg/mL重构并且更换为反应缓冲液(50mM NaHCO3，pH 8)。将15摩尔当量的双官能苯甲醛/琥珀酰亚胺基连接物，S-4FB(加利福尼亚州圣地亚哥，Solulink公司)，以在无水DMSO中的20mg/mL添加到链亲和素中，确保有机相小于总体积的10%。将该反应在室温下在振动器上混合4小时并且未反应的连接物随后通过奥米康超过滤器(10kD MWCO)用50mM MES缓冲液(pH 5)过滤掉；在2400rpm下离心并且重复洗涤3次。将链亲和素蛋白恢复到其初始体积，目标是在共轭缓冲液(50mMNaPO4，pH 6.5)中1.7mg/mL。
步骤2：聚合物改性
将具有末端胺基(1摩尔当量)的聚合物用DMF溶解以制造10mg/mL的溶液。将20摩尔当量的一种双官能肼/琥珀酰亚胺基连接物，SHTH(加利福尼亚州圣地亚哥，Solulink公司)，以在无水DMSO中为80mg/mL添加到该聚合物溶液中。通过一个注射器和22g针将1滴DIPEA加入到该反应中将该溶液在室温下搅拌4小时并且将该反应转移到一个填充有25mM MES pH 5缓冲液的奥米康超过滤器(MWCO＝10kDa)中。然后将该溶液进行离心。将该过滤器重新填充并且用以下洗涤缓冲液进行洗涤：
1×DI H2O+1滴1M HCl
1×DI H2O+1滴1M NaOH
3×50mM MES，pH 5
步骤3：蛋白-聚合物的共轭
将来自步骤2的15当量的改性后聚合物与希望量的来自步骤1的改性后蛋白一起添加。将苯胺添加到该反应中使最终浓度为10mM并且允许混合12个小时。将该反应用奥米康超过滤器(MWCO＝10kDa)进行纯化以便去除DMF并且使用25mM PO4pH 6.5缓冲液进行恢复。
步骤4：该蛋白-聚合物共轭物的纯化
将1mL HiTrap SP琼脂糖凝胶FF柱用20mM柠檬酸钠pH 3缓冲液进行平衡。将1mL(0.3-1mg/mL)链亲和素-聚合物共轭物加载在25mM NaHPO4 pH 6.5中。将该样本穿过柱用20mM柠檬酸钠pH 3缓冲液来洗涤直到获得稳定的基线。可以随后进行加载多个1mL等分的样本并且进行洗涤。将该柱用最少10个柱体积的20mM柠檬酸钠pH 3缓冲液进行洗涤。将该共轭物用10个柱体积的0.6M NaCl中20mM柠檬酸钠的pH 7.6缓冲液进行洗脱，并且将该柱用10个柱体积的在该洗脱缓冲液中的20％乙醇进行汽提。将该洗脱峰用奥米康超过滤器(MWCO＝10kDa)进行浓缩以便将体积减少到约200μl。将一个10x 300mm Superose 12柱用0.6M NaCl中20mM柠檬酸钠的pH 7.6缓冲液进行平衡。将200μL的经浓缩的链亲和素-聚合物共混物进行加载并且用0.6M NaCl中20mM柠檬酸钠的pH 7.6缓冲液进行洗脱。将多个馏分进行收集并且使用奥米康超离心过滤器(10kD MWCO)将缓冲液更换为PBS+0.05％NaN3。将洗脱物浓缩到所希望的测试浓度；在2μM链亲和素左右。
步骤5：纯化的蛋白-聚合物共轭物的表征
制备4％-20％的丙烯酰胺Tris-HCl预制凝胶(BioRad)，并且该凝胶在分离的泳道中加载有该共轭物以及自由链亲和素和自由聚合物。凝胶电泳法是在25mM Tris 192mM、Glycine pH 8.3中进行并且通过考马斯染色剂来进行染色以便将该蛋白可视化。将该凝胶染色30分钟后然后通过商用脱色液来脱色过夜。
图14的顶部以卡通形式描绘了链亲和素共轭至具有化学式(Vb)的聚合物上。图14底部是丙烯酰胺凝胶的考马斯染色，它描绘了该共轭物的移动性相对于自由蛋白是延迟的，指示了质量的增加。一种单独的中性聚合物没有显示染色证据并且没有有效电荷，该聚合物在该电泳场在是不移动的。
在多个替代实施方案中，可以将以上实例调整为允许该聚合物共轭至生物分子或染料上，包括但不限于抗体和核酸上。使用替代性的交联剂或者改性剂将该聚合物上的胺转化为马来酰亚胺和羧酸(进一步被活化而形成该NHS酯)。在某些实施方案中，同一聚合物共轭至其他生物分子(链亲和素、抗体片段、核酸)上是使用马来酰亚胺-硫醇化学作用(使用SATA连接物转化生物分子上的自由胺，或者抗体的TCEPP还原而产生自由硫醇)以及NHS-胺的化学作用(使NHS聚合物直接与蛋白或核酸上的赖氨酸发生反应)来促进的。
实例31：生物素标记的聚合物的制备
Figure BPA00001609256401581
将具有化学式(Vc)的胺功能化聚合物以10mg/mL溶解在无水DMF中并且分成两个部分。将NHS-生物素(0.9mg在90μL中，88当量)(Pierce，20217)和10mg/mL的NHS-LC-LC-生物素(Pierce，21343)(1.5mg在150μL中，88当量)溶解在无水DMF中。将NHS-生物素和NHS-LC-LC-生物素溶液立即添加到这两部分的聚合物溶液中并且允许在一个振动器上在黑暗中混合过夜。
将过量反应物通过将该溶液用奥米康超级-4mL 10kD MWCO过滤筒以下面一系列的洗涤步骤进行洗涤来去除：首先，将该筒先用水大致填充一半，并且随后将该反应溶液(通过移液管)直接添加到该水中。接下来，将该筒装水直到全满。将该溶液通过上下移动而进行混合。然后，将该筒在2400rpm下离心30分钟，或者直到体积被减少到250μL。然后将该筒重新装水，加入1滴1M HCl；将该溶液进行混合、并且在2400rpm下离心30分钟，或者直到体积被减少到250μL。接下来，将该筒重新装水，加入1滴1MNaOH；将该溶液进行混合、并且在2400rpm下离心30分钟，或者直到体积被减少到250μL。然后，将该筒重新装水、混合、并且在2400rpm下离心30分钟，或者直到体积被减少到250μL。将最后这个步骤重复总计5次洗涤。
纯化的生物素标记的聚合物的表征
将过量的生物素标记的聚合物用在DPBS缓冲液加上0.2％BSA和0.05％ NaN3中的Cy5-标记的链亲和素进行孵育。制备一种0.8％琼脂糖凝胶，并且对该凝胶在分离的泳道中加载该共轭物以及自由Cy5-链亲和素和自由生物素酰化聚合物。在10mM NaHCO3pH 10中进行凝胶电泳并且使用Typhoon凝胶成像器以457nm和635nm的激光激发进行可视化。图15(底部)描述了聚合物-链亲和素复合物的移动性相对于自由蛋白的延迟，指示了质量的增加。该单独的聚合物显示了在其本身由于缺乏有效电荷而具有极小的移动。
将这个方案进行调整以成功地对一系列同时包含内部和末端胺连接物的共轭聚合物进行生物素-改性。
实例32：通过选择性结合到生物素酰化微球上而对共价聚合物-链亲和素共轭物进行功能测试
所需材料：
1x TBST：50mM Tris-HCl，，150mM NaCl，0.1％吐温20，pH7.5；生物素微球(10mg/mL在TBST中)；BSA(1mg/mL)；AvDN(220μM)；以及聚合物-链亲和素(SA)共轭物：(相对于SA为1μM，以5μM来提供)。
母料混合物(master mix)的制备
在带标记的1.5mL微量离心管(microfuge tube)中进行制备：
Figure BPA00001609256401601
简单地涡动这两个管并且允许在开始之前将阴性对照珠粒用过量亲和素预孵育20到30分钟。建议用变速轨道混合器在800RPM进行孵育以保持珠粒不沉降。
珠粒杂交：
将10μL的各种母料混合物移液到分离的带标记的1.5ml微量离心管中。对每个添加2μL的聚合物-SA共轭物。准备另外的含10μL母料混合物并且无聚合物的管以便用作空白。简要地涡动并且脉冲式旋转所有的管。转移到变速轨道混合器中并且在800RPM下孵育30分钟。
珠粒处理/洗涤：
将0.5ml TBST添加到所有的样本以及对照物中，并且简要地涡动。以1200g离心2分钟并且小心去除480μl的上清液而不扰动珠粒球粒。将0.5ml TBST添加到所有样本以及对照物中，并且简要地涡动。以1200g离心2分钟并且小心去除500μl的上清液而不扰动珠粒球粒。重复步骤3和4。使用P200移液管去除尽可能多的剩余上清液，而不扰动珠粒球粒。添加100μL TBST并且简要涡动以再次悬浮珠粒。
珠粒的测量
将100μL的阳性、阴性、以及空白珠粒转移到一个BLACK 96孔板中。在430nm下激发这些孔并且使用所要求的狭缝宽度和/或灵敏度设置来收集在450-650nm范围内的发射以便获得在背景上的可测量的信号。将阳性和阴性对照珠粒的发射进行对比。
图16显示，该聚合物链亲和素共轭物结合到一种生物素酰化微球上。在荧光计中440nm处的激发产生了来自该聚合物的发射，如由该实心曲线所指示的。该虚曲线代表阴性对照物，其中该生物素珠粒首先用过量亲和素进行处理以便在用该聚合物链亲和素共轭物处理之前封阻生物素结合位点。
实例33：通过选择性结合到生物素酰化微球上以及向共定位的链亲和素-染料共轭物上的染料供体进行的FRET而对共价聚合物链亲和素共轭物进行功能测试
所需材料：
1x TBST：50mM三-HCl、50mM NaCl、0.1％吐温20，pH 7.5。生物素微球(10mg/mL在TBST中)。Cy3-SA(1μM或50μg/mL)。聚合物-链亲和素(SA)共轭物：(相对于SA为μM，以5μM提供)。
珠粒的制备和杂交：
在带标记的1.5mL微量离心管中进行制备：
Figure BPA00001609256401621
简要涡动所有的管并且转移到变速轨道混合器中用于在800RPM下孵育至少30分钟。
珠粒的处理/洗涤：
将0.5ml TBST添加到所有的样本以及对照物中，并且简要涡动。以1200g离心2分钟并且小心去除480μl的上清液而不扰动珠粒球粒。将0.5ml TBST添加到所有的样本以及对照物中，并且简要涡动。以1200g离心2分钟并且小心去除500μl的上清液而不扰动珠粒球粒。重复步骤3和4。使用P200移液管去除尽可能多的剩余上清液，而不扰动珠粒球粒。添加100μL TBST并且简要涡动以再次悬浮珠粒。
珠粒的测量
将100μL的所有样本转移到一个BLACK 96孔板中。在430nm下激发这些孔并且使用所要求的狭缝宽度和/或灵敏度设置来收集在450-650nm范围内的发射以便获得在背景上的可测量的信号。检测并记录在480-500nm范围内的聚合物发射以及在预期的570nm处的Cy3发射。
图17显示，该聚合物链亲和素共轭物结合到一种生物素酰化微球上。在荧光计中440nm处的激发导致了在该聚合物与共轭至不同链亲和素蛋白上的Cy3染料之间的能量传递，如通过上部实心曲线所指示的。该虚曲线显示了单独的珠粒并且该下部实心曲线显示了440nm处该Cy3-链亲和素共轭物的直接激发。
实例34：通过选择性结合到亲和素涂覆的微球上进行生物素标记的聚合物的功能测试
所需材料：
1x TBST：50mM Tris-HCl、50mM NaCl、0.1％吐温20，pH 7。SA微球(10mg/mL在TBST中)。生物素(1mM)。440nm生物素-聚合物共轭物：(46μM)。
珠粒的制备和杂交：
在带标记的1.5mL微量离心管中进行制备：
  空白对照物   阴性对照物   阳性对照物
  16μl TBST   11μl TBST   15μl TBST
  4μl珠粒原料   4μl生物素原料   4μl珠粒原料
  4μl珠粒原料
简要涡动所有的管并且转移到变速轨道混合器中用于在800RPM下孵育20-30分钟以便确保生物素已经封阻了阴性对照珠粒上的所有SA位点。将1uL的聚合物-生物素原料添加到阳性和阴性对照管两者中。简要涡动并且转移到变速轨道混合器中并且在800RPM下孵育30分钟。
珠粒的处理/洗涤：
将0.5ml TBST添加到所有的样本以及对照物中，并且简要涡动。以1200g离心2分钟并且小心去除480μl的上清液而不扰动珠粒球粒。将0.5ml TBST添加到所有的样本以及对照物中，并且简要涡动。以1200g离心2分钟并且小心去除500μl的上清液而不扰动珠粒球粒。重复步骤3和4。使用P200移液管去除尽可能多的剩余上清液，而不扰动珠粒球粒。添加100μL TBST并且简要涡动以再次悬浮珠粒。
珠粒的测量
将100μL的所有样本转移到一个BLACK 96孔板中。在430nm下激发这些孔并且使用所要求的狭缝宽度和/或灵敏度设置来收集在450-650nm范围内的发射以便获得在背景上的可测量的信号。将阳性和阴性对照珠粒的发射进行对比。
图18显示，这种生物素改性的聚合物结合到了一种链亲和素微球上(顶部)。在图18中(底部)，在荧光计中440nm处激发产生了来自该聚合物的发射，如由该上部实心曲线所指示的。该下部实心曲线代表阴性对照物，其中该链亲和素珠粒首先用过量生物素进行处理以便在用生物素酰化聚合物处理之前封阻这些结合位点。该下部实心曲线代表单独的珠粒。
实例35：将生物素标记的聚合物选择性结合到染料标记的SA共轭物上以便确认FRET特性以及该聚合物改性的功能活性
所需材料：
生物素-聚合物共轭物：(46μM)Cy3-SA共轭物(1mg/mL或18.9μM)。BLACK 96-孔板
形成该生物素-链亲和素复合物：
在一个1.5mL微量离心管中，将9.4μL的生物素聚合物共轭物和2.9μL的Cy3-SA进行组合。涡动以便进行混合，然后在一个振动器上(在箔片下)孵育0.5小时。更长的孵育时间也是适合的。
仪器设置：
模拟实验是在一台BioTek Synergy 4上以荧光模式按以下设置来进行的：发射：400-750nm，以5nm的步阶，灵敏度水平：50。
板的布局：
如下表中在BLACK 96-孔板中制备溶液。在已经添加所有其他材料之后最后小心添加A+B溶液：
  材料   孔1   孔2   孔3
  聚合物-生物素   9.4μL*   9.4μL   -
  Cy3-SA   2.9μL*   -   2.9μL
  缓冲液   100μL   100μL   100μL
*在第一步骤中预孵育过，形成该生物素-链亲和素复合物
图19显示，这种生物素改性的聚合物结合到了一种染料标记的链亲和素(Cy3或德克萨斯红-顶部)上。在荧光剂中440nm处的激发产生了来自这些染料受体在它们的对应发射波长(分别是大致570nm和620nm-底部左侧)的发射以及来自该聚合物的一些残余发射(大致520nm)。还进行滴定以便使该聚合物到该链亲和素上的结合达到饱和(底部右侧)。该实心曲线显示了通过在440nm激发下来自该聚合物的能量传递而来自该链亲和素上的Cy3标记物的发射。该虚曲线代表阴性对照物，其中该链亲和素珠粒首先用过量生物素进行处理以便在用生物素酰化聚合物处理之前封阻这些结合位点。
实例36：用于流式细胞计量术中的聚合物-链亲和素共轭物
在流式细胞仪上通过染色指数来评估聚合物生物共轭物，如由碧迪生物科学公司(Becton Dickinson(BD)Biosciences)所定义的。例如参见H.Maeker和J.Trotter，碧迪生物科学应用文集(BDBiosciences Application Note)：“用于多色流式细胞术的试剂选择”，2009年9月。该染色指数报告了对聚合物的亮度、非特异性结合的衡量，并且还可以与流式细胞仪上的分辨指数相关联。流式细胞术提供了一种用于测量特异性表型的细胞或者微球上的感兴趣的分析物。这可以通过直接标记第一抗体来进行，或者如果希望进行信号扩增的话通过第二抗体或者与亲和素-聚合物共轭物的亲和素-生物素复合来进行。
细胞染色的程序
以足够的量来摄取感兴趣的细胞，每个测试条件至少105个。然后将细胞以250rcf下减慢旋转3分钟，在DPBS+0.2％BSA和0.05％NaN3(染色缓冲液)中洗涤，然后在染色缓冲液中以1x107个细胞/mL进行再悬浮。
对于第一孵育，将细胞用对于感兴趣的抗原是特异性的第一共轭物(报告物标记的抗体)进行孵育，阴性细胞用作阴性非特异性结合参照物。一个对照群体或一个已建立的商用共轭物被用作阳性对照。第一聚合物共轭物在4℃下用4x105个细胞等分部分以10-330nM体积稀释度的浓度孵育30分钟。在第一孵育之后，将细胞用5倍体积的染色缓冲液进行漂洗并且以250rcf减慢旋转3分钟；将这种漂洗重复三次。将细胞再悬浮以用于在DPBS+0.2％BSA、0.05％NaN3中以8x105细胞/mL进行测试。
对于第二抗体标记，将感兴趣的抗原的一种未标记的第一抗体以0.4ug/uL或者其他滴定量值在4℃下用每个测试条件4x105个细胞孵育30分钟。在第一孵育之后，将细胞用5倍体积的染色缓冲液进行漂洗并且以250rcf减慢旋转3分钟；将这种漂洗重复三次。将种类反应性的第二聚合物共轭物在4℃下用4x105个细胞等分部分以从10-330nM体积稀释度的浓度孵育30分钟。在第二孵育之后，将细胞用5倍体积的染色缓冲液进行漂洗并且以250rcf减慢旋转3分钟；将这种漂洗重复三次。将细胞再悬浮用于以8x105细胞/mL在DPBS+0.2％BSA、0.05％NaN3中进行测试。
对于链亲和素聚合物共轭物标记，多个细胞被孵育为具有一个生物素酰化第一抗体到感兴趣的标记物，如以上指出的用于第二抗体标记，而不是一种未标记的第一抗体。在第一洗涤之后，将多个细胞进行再悬浮并且分成4x105个细胞等分部分并且用在4℃处于1-100nM体积稀释中的链亲和素-聚合物共轭物孵育30分钟。在第二孵育之后，将多个细胞用5体积染色缓冲液进行漂洗并且在250rcf下旋转向下持续3分钟；将这个漂洗重复三次。将细胞再悬浮用于在DPBS+0.2％BSA、0.05％NaN3中以8x105个细胞/mL进行测试。如果希望进一步的信号放大，可以将细胞用未标记的第一抗体进行孵育并且然后在用链亲和素共轭物孵育之前用种类反应性的生物素酰化第二抗体进行孵育。这些孵育步骤、洗涤方案、以及测试方案应该按照前面详细说明的来进行。
这些流动测试程序已经开发为对于Cyto-trol细胞上的CD4标记物是特异性的。细胞准备和孵育计划可以随着细胞类型和最佳染色而变化，洗涤和处理方案应该被开发为对细胞类型是特异性的。抗体的工作浓度范围已经被鉴定为对于Cyto-trol对照淋巴细胞以及在Whole Lysed Blood上的CD4(35％-50％群体)和CD45(85％群体)标记物两者均是优选的(仅仅对于第一抗体)。具有显著不同于这些范围的群体的标记物可以落在所建议的滴定范围之外。
还在按照类似方案进行培养而生长的Jurkat细胞系上进行测试。在这些测试中，使用了一种CD45标记物。当不存在阴性细胞群体时，使用了一种不同的阴性对照程序。在这个阴性对照样本中，从该第一孵育步骤中省略第一抗体。这个步骤和所有随后的步骤都根据标准方案来进行。再次使用一种商用染料-抗体或者染料-链亲和素共轭物作为阳性对照物。
流式细胞术分析的程序
流动测试是在BD LSR II流式细胞仪上以0.5mL体积在多个测试管中来完成的。流动测试是使用以下电压设置来进行的，这些电压设置是由流动设施工作人员用校准颗粒对细胞计数器进行每日校准来确定的。在作为背景对照物的未染色的细胞样本上通过前向散射对比侧向散射进行淋巴细胞特异性门控。对前向散射和侧向散射区域相对于宽度轮廓来进行标准双门控。利用仅单个颜色，不需要补偿。对于所有的前向和侧向散射参数进行数据收集，并且使用碧迪公司的标准太平洋蓝通道来进行荧光测量。太平洋蓝数据使用了经408nm紫色激光器和450/50BP过滤器的激发。在所述门控参数内对于30,000个事件收集了样本。
代表性试验：
在Cyto-trol细胞、冻干的人类淋巴细胞上测量CD4标志，用于分析流动中的聚合物性能。将Cyto-trol细胞(贝克曼库尔特(Beckman Coulter))在所提供的重构缓冲液中进行重构并且允许其在室温下溶胀15分钟。然后将细胞以250rcf减慢旋转3分钟，在DPBS+0.2％BSA和0.05％NaN3(染色/测试缓冲液)中洗涤，然后在染色缓冲液中以1x107个细胞/mL进行再悬浮。细胞悬浮体被分成两个部分；一半的细胞用0.4ug/uL的生物素酰化的抗-CD4进行孵育，另一半细胞用染色缓冲液作为阴性对照物孵育30分钟。在第一孵育之后，将细胞用5倍体积的染色缓冲液进行漂洗并且在250rcf下减慢旋转3分钟；将这个漂洗重复三次。在染色缓冲液中以前面的体积将细胞再悬浮。在每个测试中测量4x105个细胞并且相应地将其分开，将实例19中制备的链亲和素-荧光团共轭物以100nM用每个等分部分的细胞孵育30分钟，允许该亲和素-生物素复合物形成。在该第二孵育之后，将细胞进行漂洗，如在前面详细说明的。进行最终的细胞悬浮以用于以8x105个细胞/mL进行测试。
在美国加利福利亚洲圣地亚哥的斯克利普斯研究所(TSRI)，在一台BD LSR II流式细胞仪上进行流动分析。由TSRI的员工用彩虹荧光颗粒进行路线校准，以在细胞计上对齐荧光通道，对每个员工的建议都使用所有的校准电压。所有的样本用408nm紫光激光器进行激发，在AmCyan通道中使用525/50过滤器测量这些聚合物共轭物。所有的样本都初始地参照未染色的细胞。来自图14的聚合物链亲和素共轭物显示了第一鉴别的CD4阳性细胞的特异性第二标记，其中这些阳性细胞为该群体的44％。该聚合物链亲和素共轭物证实，正的染色指数显示了相对于未染色的细胞以及其对应的阴性对照物而言低的非特异性结合(图20(A))。这证明，该聚合物尽管其峰值吸收度是440nm，但是用紫色激光器激发时是用于流式细胞术中的可行的荧光材料。
Cyto-trol细胞上的第二抗体聚合物共轭物
按照马来酰亚胺-硫醇共轭以及该抗体的TCEP部分还原的路线将胺功能化的405聚合物共轭至山羊抗-小鼠IgG κ1纯化的抗体上。该聚合物和共轭程序明确地提供在实例46中。
在Cyto-trol细胞(贝克曼库尔特(Beckman Coulter))上测试共轭物，这些细胞是一个固定的且冻干的淋巴细胞群，用于特异性人类抗原的对照测试。细胞染色按照第二细胞染色计划。将细胞用或不用(阴性对照)未标记的抗-CD4(RPA-T4克隆，碧迪生物科学公司)进行孵育，该抗-CD4是在小鼠中对抗人类抗原而生长的。在完成第一抗体孵育的洗涤之后，将细胞用聚合物标记的山羊抗小鼠共轭物进行孵育，用于第一鉴定的CD4阳性细胞的特异性标记。第二标记是通过Fc识别发生，并且小鼠第一抗体的结合是通过对抗鼠科种类而生长的第二山羊IgG而发生。用市售的太平洋蓝山羊抗小鼠IgG(Invitrogen)作为第二标记种类进行孵育来使用阳性对照物。
图20(B)描绘了第二荧光共轭物对CD4特异性细胞的特异性识别。未染色的细胞显示了阴性对照和这些细胞的天然自发荧光，并且聚合物共轭物在细胞上的孵育(无第一标记)显示了共轭物到未标记细胞上的最小的非特异性结合。阳性对照，太平洋蓝山羊抗小鼠显示了通过第二抗体以紫色激发进行CD4标记的可商购的标准。405聚合物-山羊抗小鼠共轭物(红色)显示了CD4阳性细胞的阳性鉴别、在阴性细胞群中的最小移位、以及太平洋蓝标准的最大荧光信号和分辨率。
图20(C)描绘了在Jurkat细胞上的链亲和素聚合物共轭物。共轭物是通过在实例11中提供的聚合物使用在实例29中限定的方案来生产的。该聚合物链亲和素共轭物的染色指数比可商购的太平洋蓝链亲和素对照共轭物所得的高出10倍多。
图20(D)描绘了第一单克隆抗体聚合物(抗CD4，RPA-T4)共轭物，该共轭物是使用以上限定的方案在Cyto-trol细胞上进行评估的。该共轭物是使用这些聚合物以及在实例46中限定的方案来制备的。关于该共轭物的另外细节可以在实例39中找到。
实例37：通过EDC偶联来制备共轭至-COOH珠粒上的聚合物材料(每100μL珠粒)：
LodeStars-COOH功能化的磁珠(瓦里安公司(Varian，Inc.)，PL6727-0001)(100μL的悬浮体，以30mg/mL的规格)。来自实例17的具有胺末端的聚合物((125μL，在25mM MES pH 5中为1.6μM，比理论珠粒容量过量10倍)、10mM NaOH(2mL)。DIH2O(3mL)。25mM冷MES，pH 5。EDC，在25mM冷MES中为50mg/mL，pH 5，(100μL)。NHS，在25mM冷MES中为50mg/mL，pH 5中(100μL)。100mM Tris/HCl pH 7.4(1mL)。离心机和黑色平底96-孔板。
抗体容量以10ug/mg珠粒给出，给出的胺偶联容量是2nmol聚合物/mL珠粒(在30mg/mL)。使用相对于建议的容量10倍过量的聚合物来作为Varian的方案中给出的抗体浓度。
珠粒洗涤
洗涤珠粒总计为600μL并且然后分成6x 100μL样本用于偶联。珠粒用1mL 10mM NaOH洗涤2次，然后用1mL DI H2O洗涤3次；在各次洗涤之间，将该管以3000rpm离心1分钟以便将这些珠粒作为球粒收集，丢弃上清液并且在下一次洗涤中将珠粒再次悬浮。在最终的洗涤之后，将珠粒在600μL冷25mM MES(pH 5)中进行再悬浮并且在微量离心管中等分为6x 100μL体积。再次将珠粒在3000rpm下离心1分钟并且丢弃上清液。
EDC活化
将100μL的EDC溶液添加到每个反应组中。将100μL的NHS溶液添加到每个反应组中。将珠粒通过涡动进行再悬浮并且然后允许其在旋转器上混合30分钟。将珠粒在冷25mM MES pH 5中洗涤2次，通过在3000rpm下离心1分钟来造粒，并且丢弃该上清液。将珠粒在125μL冷25mM MES(pH 5)中再悬浮。
聚合物偶联
以1.6μM添加125μL的聚合物。将样本涡动以充分混合并且然后在室温下在一台混合器上反应3个小时。通过在3000rpm下离心1分钟将珠粒造粒；丢弃上清液。将珠粒再悬浮于1mL 100mM三/HCl中以便封阻未反应的-COOH位点、进行涡动、并且混合1个小时。
通过离心来再收集珠粒并且将其再悬浮于100μL 25mM MES中。在这一点，几个管的上清液的颜色是黄色并且在440nm处具有显著的吸收度；将这些珠粒洗涤6次直到吸收度在基线处。在荧光测量之前将珠粒留置另外2天，在溶液中留置2天之后，上清液的颜色再次是黄色并且具有可测量的吸收度。将珠粒再洗涤3次，各次之间进行30分钟混合，直到测量不到吸收度。在2天时，根据荧光测量，该上清液保持是清澈的并且不含可测量的吸光度。
实例38：聚合物-染料共轭物的制备
实例38a：在聚合物末端的聚合物-染料共轭物的制备
Figure BPA00001609256401731
将0.5mg胺封端的聚合物溶解在15μL DMSO中。然后将该聚合物溶液更换到50mM NaHCO3/Na2CO3 pH 8缓冲液中，并且在缓冲液中回恢复至5mg/mL，如通过UV-VIS吸收度确定的。将50μg NHS-酯染料(DyLight 594)以10mg/mL溶解在无水DMSO中，然后将它立即添加到120μg的聚合物中。将该管在振动器上(600-800rpm)混合1小时并且随后用在水中的20％EtOH稀释到100μL。将该混合物添加到30cm Superdex 200SEC柱进入0.6MNaCl和20％EtOH中以便将聚合物-染料共轭物与未反应的染料分离。染料的添加可以用于估算连接物在该聚合物结构上的并入，是通过基于该聚合物和染料的相对消光系数来测量吸收度比值。利用该聚合物的分子量有可能估算出包含连接物的聚合物链的数目。
在另外的实施方案中，通过胺功能染料使用标准EDC共轭程序或者通过使用与实例29中说明的类似的方案首先转化为NHS酯来对具有羧酸侧链的聚合物进行改性。已经证实了共轭至马来酰亚胺封端的聚合物上的硫醇染料。预计任何范围的化学对都会以类似于共轭一种聚合物和染料的方式来工作。
实例38b：在内部位置的聚合物-染料共轭物的制备
Figure BPA00001609256401741
在一个手套箱中，在一个20mL琥珀色闪烁瓶中将100mg带有内部胺官能度的聚合物溶解在10mL无水DMSO中。将0.32mL DIPEA添加到该聚合物溶液中。将24mg的NHS-酯染料(Cy3)以2.4mL溶解在无水DMSO中并且添加到该溶液聚合物中。紧密地密封该玻璃瓶，从该手套箱中取出并且在室温下搅拌48小时。然后将该反应经奥米康超离心过滤单元(MWCO＝30kDa)通过在水中的20％乙醇进行纯化，直到去除所有的自由染料。通过使0.15mg样本流过在0.6M NaCl和20％乙醇中30cm Superdex 200SEC柱来确定纯度。90mg产率(90％)。
染料的添加可以用于估算该聚合物结构上连接物单体的并入，是通过基于该聚合物和染料的相对消光系数来测量吸光度比值。对于以上说明的聚合物，在该最终聚合物中单位芴单体的连接物单体(或者染料附接物)之比总体上与在该聚合反应中使用的单体的摩尔进料比是一致的。
也可以通过胺功能染料使用标准EDC共轭程序或者使用与实例29中说明的类似的方案首先转化为NHS酯来对具有羧酸侧链的聚合物进行改性。
类似的程序可以用于共轭一系列的染料，包括Cy3、DyLight549、DyLight 633、FAM、FITC、Alexa633、Alexa647以及其他几种。带有羧酸侧链的聚合物还可以通过氨功能染料使用标准EDC共轭程序来进行改性。
图21(A)显示了以上聚合物结构共轭至(从左到右)FITC、Cy3、DyLight 594以及DyLight633上。示出了单独的聚合物用于参照(最左边)。注意在每种情况下，残余供体(聚合物)发射的量是最小的。该数据突出了在不同波长下产生几种诊断信号以用于多重化应用的能力。在这个实施方案中，单个光源能够产生五个不同的发射波长。
实例38c：基于聚合物激发对用于聚合物串型共轭物中的聚合物-染料共轭物的能量传递评估
图21(B)描绘了染料(DyLight594)在其吸光度最大值附近被激发的荧光(下部曲线)与聚合物-染料共轭物在405nm处被激发的荧光(上部曲线)之间的对比。在相同的染料摩尔浓度对比对于直接染料激发下，620nm左右的染料发射比的聚合物-染料共轭物亮5倍多。此类实施方案突出了由在能量传递过程中所披露的这些聚合物供体提供的信号放大。在左上角的图片突出了在基于染料共轭的复合物的发射中的可见的颜色变化。该聚合物溶液在没有染料存在时发射蓝色并且在染料共轭时发射红色(在纯化之后)
图21(C)将该基础聚合物的荧光信号(没有染料，峰值发射在420nm附近)与该聚合物-染料共轭物的荧光信号(峰值发射在620nm附近)进行对比。DyLight594染料当共轭至以上聚合物上时猝灭了＞98％的聚合物发射(实例38b)。这是这些聚合物材料的一个特征，因为任何剩余供体发射都可能在多重化分析形式中作为背景信号显现。将染料直接共轭至该聚合物结构上并且改变附接位点数目的能力提供了可以通过化学设计进行调整的有效传递。
图39：单克隆抗体(抗CD4)共轭物在整个溶解的血液样本上的流动测试
抗CD4第一抗体(RPA-T4克隆)的聚合物共轭物是使用如在实例45、46、和49中提供的3种不同的共轭路线来生产的。1)胺改性的聚合物转化为马来酰亚胺反应性基团，使用SMCC(马来酰亚胺/NHS交联剂)，与该抗体上通过使SATA(硫醇/NHS交联剂)与赖氨酸(胺)基团反应而引入的硫醇基发生反应(CJ11-2，图22)。2)同一聚合物用SMCC(马来酰亚胺)进行改性但是使用TCEP部分地还原该抗体中的二硫键而在抗体上引入硫醇基(CJ13-2，图22和图20D)。3)将羧酸封端的聚合物用TSTU活化而形成NHS酯，直接与抗体上的赖氨酸(胺)基团发生反应(CJ04-2图22)。所有的共轭物是用同一聚合物结构和批次来制成的。使用在实例12中描绘的方案来合成该聚合物，其中胺封端单元取代该羧酸封端单元。该NHS/胺共轭是通过在实例45中说明的方案来完成的。这些马来酰亚胺/硫醇共轭反应是有秩序地通过在实例46和49中说明的这些方案来完成的。
Figure BPA00001609256401761
图22描绘了在如下进行的流式细胞术中这些共轭物的表现。将来自一个健康志愿受试者的100μl全血等分到多个FACS管(每个样本两个)中。将抗体共轭物稀释在洗涤缓冲液(具有0.5％BSA和0.1％叠氮化钠的PBS)中并且以规定浓度添加到血液中。将样本剧烈涡动然后在黑暗中在室温下孵育15-30分钟。将2ml的1xBD FACS Lyse溶液添加到每个样本中并且通过剧烈涡动而混入，然后在黑暗中在室温下孵育另外10分钟。将样本以500g离心5分钟并且倒出并丢弃上清液。将样本进行涡动并且加入3ml的洗涤缓冲液(具有0.5％BSA和0.1％叠氮化钠的PBS)。以500g重复离心另外5分钟。将所生成的上清液倒出并丢掉，并且将剩余细胞球粒进行涡旋。将样本在一台BD LSRII流式细胞仪上运行，该流式细胞仪要求所有紫色通道装备有紫色激光器以及450/50nm过滤器，它们已经针对BD CST珠粒进行设置并且预先校准。与未染色的细胞相对比，所有的聚合物共轭物样本(CJ04-2、CJ11-2、和CJ13-1系)都显示出最小的非特异性结合。此外，所有的聚合物共轭物都产生了显著地比可商购的具有相同抗体克隆的太平洋蓝对照共轭物更高的阳性信号，后者常用于可比波长下的流式细胞术。来自这个组的表现最佳的共轭物提供了比可商购的太平洋蓝对照抗体高出6倍多的染色指数。
实例40：聚合物-染料共轭物的制备
Figure BPA00001609256401781
将该聚合物共轭至一种染料Dylight 594上并且以一种类似于实例36中说明的方法进行纯化。图23描绘了染料(DyLight594)与聚合物染料共轭物的荧光的对比。该染料在594nm处被激发并且该聚合物-染料共轭物在380nm处被激发。
实例41：对于链亲和素共轭聚合物的荧光免疫测定(ELISA)
作为96孔板形式中的示例性系统，开发了一种用于人类IgG的免疫测定法。在另外的实施方案中，类似的功能性同等适用于包括悬浮的微球以及蛋白芯片微阵列在内的其他形式。
步骤1：试剂的制备
通过将79.2g Tris碱预设晶体(pH 7.7)、225g氯化钠、以及0.5g硫柳汞(Thimerosol)溶解在1000mL去离子水中而制备了洗涤浓缩物。通过将100mL洗涤浓缩物添加到2400mL去离子水中而制备了洗涤溶液。随后，加入10mL 10％Triton X-100。通过将14.8g Tris碱预设晶体(pH 7.7)、18g氯化钠、以及0.5g硫柳汞溶解在2000mL Milli-Q水(电导率18.2mΩcm)中而制备了碱性试验缓冲液。随后，添加2mL 10％的吐温20和10g牛血清白蛋白部分V(基本上不含γ球蛋白)。将这些溶液过滤并且储存在4℃。
步骤2：捕捉抗体涂覆的板的制备
捕捉抗体被涂覆在Nunc白色Maxisorp 96孔板的表面上，其浓度为每孔约1微克。将这些板进行密封并且在4℃储存过夜。随后，将这些板用洗涤溶液洗涤一次并且在吸收纸片上抽干。除非另外说明，在这个实例中的所有板洗涤都是在自动microtitre洗板机上进行的。向每个孔中添加两百五十(250)微升的封阻缓冲液(0.1M PBS，包含2％BSA)，将这些板再次密封并且储存在4℃直到使用。
步骤3：免疫测定
将捕捉抗体涂覆的microtitre板用该洗涤溶液洗涤两次并且在吸收纸片上抽干。将二百(200)μL的测定标准物或实验用未知样本一样四份添加到经涂覆的板的适当孔中。将这些板在一个振动器上在18℃孵育2个小时。随后将这些板用洗涤溶液洗涤三次、在吸收纸上抽干，并且将200μL生物素酰化的检测抗体以前面确定的最佳浓度(在测定缓冲液中稀释并且在使用之前进行过滤)添加到每个孔中。将这些板在定轨振荡器上在室温下孵育另外60分钟。然后将这些板洗涤三次并且在吸收纸上抽干。将两百(200)μL的、在实例30中制备的、0.2微米注射器过滤的链亲和素-聚合物共轭物稀释到先前确定适合于测定缓冲液中的一个浓度。该聚合物是带有中性PEG11侧链以及胺共轭位点的芴聚合物。将这些板在定轨振荡器上在室温下孵育另外2小时。然后将这些板洗涤六次、抽干、翻转180度，并且再洗涤另外六次。将这些板再次在吸收纸上进行抽干。使用一个多道移液器添加两百(200)μL的经过滤的释放试剂(0.1M氢氧化钠，2％Triton X-100)，将这些板在室温下振动60分钟并且使用Victor荧光计来测量荧光。然后将该板进行密封，在4℃储存过夜并且在第二天早上在Victor荧光计中再次读数。使用来自伯金埃尔默公司(Perkin Elmer)的Multicalc软件来分析荧光计数以确定该分析检测的下限以及相关的类似参数。还对替代性条件进行了评估以便从该孔板表面上释放该共轭物从而改进该荧光读数。图24中显示了一种代表性数据。还与可商购的SA-染料共轭物进行了对比。这些聚合物共轭物相对于这些染料共轭物展示出了优异的检测极限，如由于所收集的光学特性而预期的。
实例42：具有用于生物共轭的活性功能连接物的对亚苯基亚乙烯基共聚物的合成、共轭及应用
Figure BPA00001609256401811
具有苯基丁氧基氨基末端的聚(1，4-(二2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32-十一氧杂三十四烷-34-基2，5-二溴对苯二酸酯)-乙烯基-alt-对(2-甲氧基-5-2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32-十一氧杂三十四烷-34-基苯)-亚乙烯基)。
将二-2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32-十一氧杂三十四烷-34-基2，5-二溴对苯二酸酯(2.0g，1.52mmol)、34-(4-甲氧基-2，5-二乙烯基苯氧基)-2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32-十一氧杂三十四烷(1.11g，1.52mmol)、乙酸钯(13.6mg，0.061mmol)、三-o-甲苯基膦(37mg，0.121mmol)、三乙胺(1mL，7.6mmol)以及4mL的DMF在合并在一个装备有特氟纶搅拌棒、装配有针形阀的小圆底烧瓶中并且转移到一条史兰克线上。将该溶液通过三次冻结-泵送-解冻循环进行除气，置于氮气下并且伴随着恒定搅拌加热到100℃过夜。接着，将二-2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32-十一氧杂三十四烷-34-基2，5-二溴对苯二酸酯(2.0g，1.52mmol)(100mg，5mol％)、乙酸钯(5mg)、以及三-o-甲苯基膦和0.5mL的DMF在一个装配有针形阀的小圆底烧瓶中合并并且转移到一条史兰克线上。将该溶液通过三次冻结-泵送-解冻循环进行除气，并且一旦加热到室温就通过插管转移到该聚合反应上，以排除空气和湿气。允许该混合物反应过夜。接着将4-(4-溴苯氧基)丁烷-1-胺(43mg，15mol％)以及0.5mL的DMF在一个装备有特氟纶搅拌棒、装配有针形阀的小圆底烧瓶中合并并且转移到一条史兰克线上。一旦加热到室温就通过插管转移到该聚合反应上，以排除空气和湿气。允许该混合物反应过夜。次日将该反应冷却到室温并且在真空下去除大量三乙胺。将反应混合物用约30mL的水进行稀释并且通过G 6玻璃纤维滤纸进行过滤。将该滤液转移到几个奥米康过滤器(10kDa截止)中以便浓缩该聚合物并且去除DMF。在真空下去除剩余水并且将该残余物萃取到二氯甲烷中。将该二氯甲烷溶液经硫酸镁进行干燥并且过滤。去除该溶剂而留下一种暗红色黏稠油，约900mg。
发现该聚合物具有的Mn为20,400g/mol，如通过GPC分析相对于聚苯乙烯标准物来确定的。该胺连接物的并入是通过将一种染料共轭至最终聚合物上来确定的，如在实例38中说明的。
然后将如下该聚合物共轭至链亲和素蛋白上：将胺聚合物以50mg/ml进行溶解并脱盐并且将缓冲液更换为100mM磷酸盐缓冲液pH 7.5。通过吸光度来评估聚合物浓度并且添加25摩尔当量的SMCC(10mg/ml，在无水DMSO中)。将该反应在室温下混合60分钟并且然后脱盐且将缓冲液更换为PBS pH7.0+5mM EDTA，然后重复聚合物浓度测定并且通过SAMSA-萤光素染料试验确定马来酸酰亚胺的功能性。通过添加20摩尔当量的SATA(5mg/ml，在无水DMSO中)来活化链亲和素(5mg/ml，在100mM磷酸盐缓冲液pH7.5中)。在用10％(v/v)50mM EDTA、2.5M羟胺pH7.0猝灭(＞15分钟，室温)该反应之前，将该反应在室温下混合60分钟。在进行一种埃尔曼(Ellman)分析以便确认并且量化硫醇的并入之前，将活化的蛋白脱盐并且将缓冲液更换为与该活化的聚合物相同的缓冲液。该活化的聚合物以及链亲和素两者均按如下进行使用而没有延迟。将更大数量级摩尔过量的SMCC活化的聚合物添加到SATA活化的链亲和素中，并且将这两者在室温下混合2小时，然后用20摩尔当量的N-乙基马来酰亚胺(在室温下混入15分钟)猝灭。使用离子交换和大小排阻色谱法来纯化未反应的聚合物和链亲和素的生物共轭物。收集适当的馏分以便将产率和性能最大化并且然后通过超滤法进行浓缩。
Figure BPA00001609256401831
测试该共轭物并且将其性能与一种可商购的链亲和素-藻红蛋白(SA-PE)共轭物(被设计用于模型Luminex xMap分析的目的)进行对比(图27，左)。将驴抗小鼠IgG抗体共价地偶联到xMap珠粒上。然后在标准Luminex xMap分析条件下进行小鼠IgG的标准曲线滴定(图27，右)。使用4μg/mL的链亲和素-藻红蛋白或者如以上制备的链亲和素-共轭聚合物共轭物来检测样本副本(不严格控制浓度)。然后在一台Luminex仪器上读取样本。发现使用该共轭聚合物时绝对信号更低。这部分地归因于在该聚合物光谱与仪器中的激发和发射光学之间一种不理想的匹配以及所使用检测试剂与可商购的藻红蛋白产品相比公认的更低浓度。然而，来自该聚合物的成比例的背景(非特异性信号)也是显著更低的，导致了这两种检测形式(标准曲线中的荧光最高点/分析物的荧光零浓度(MFI/零)：21.8PE，26.6聚合物)的非常接近的检测下限。
实例43：合成具有DPP带隙改性单元的芴共聚物
Figure BPA00001609256401841
向25mL圆底烧瓶中加入：PEG化的二溴-DPP单体(110mmol)、PEG化的芴二硼酸酯(110mmol)、THF(2.4mL)溶剂、2M K2CO3(1.6mL)以及四(三苯基膦)钯(3.3mmol)催化剂。将该混合物通过三次冻结-泵送-解冻循环进行脱气并且然后在氩气下在80℃搅拌过夜。允许所生成的混合物到室温并且用水稀释。在二氯甲烷萃取之后收集聚合物。
发现所生成的聚合物在520nm处具有最大吸收并且在590nm处具有最大发射，其中在水中的量子产率为6％。该聚合物具有通过GPC分析法相对于聚苯乙烯标准物所估算的为16,000的MW，并且它是可溶于水、甲醇、和二氯甲烷的。
可以使用类似于以上说明的并且包括实例9、10、和11中说明的方法在内的方法来进行末端连接物的并入。
实例44：取代的二乙烯基苯聚合物的合成
Figure BPA00001609256401851
制备以上聚合物所使用的方法是与在实例38中提供的那些类似的。用于制备如在此披露的二乙烯基苯聚合物的一般方法可以从该领域中的已知反应以及在此发现的方法中衍生，并且这些反应可以是通过使用适当的试剂和条件来改变，如技术人员所认识的，用于引入在此处提供的化学式中发现每个部分。
实例45：聚合物共轭至第一抗体上的胺上
Figure BPA00001609256401861
生产NHS酯聚合物-抗体共轭物的程序
将第一单克隆抗体-抗-CD4(RPA-T4克隆)进行脱盐并且以1mg/mL更换到50mM NaHCO3缓冲液pH 8.2中。将富集的NHS功能化的聚合物以100mg/mL溶解而在无水二甲亚砜(DMSO)中。以30倍摩尔过量的抗体将该聚合物溶液添加到抗体溶液中并且允许其在室温下搅拌3小时。在孵育之前用缓冲液来调整蛋白浓度，以便确保有机溶剂的体积是＜10％总体积。在经10KDa MWCO过滤器装置超滤之后，然后使用离子交换和尺寸排阻色谱技术来对应地纯化未反应的聚合物和抗体的生物共轭物。收集适当的馏分以便将产率最大化，并且将缓冲液更换为PBS+0.05％NaN3并且同时如以上通过超滤法进行浓缩。标记程度(如上表示为p)通过在405nm的吸收以及校正的280nm值来确定。实例39(图22)中提供的聚合物共轭物((CJ04-02)具有的F/P(每个抗体的聚合物个数#)是约2.04。这种共轭物证明了流动性能，是通过染色指数测量值来确定的，这些测量值比具有同一抗体的太平洋蓝对照共轭物高出3倍多。
实例46：使用马来酰亚胺/硫醇化学作用将聚合物共轭至抗体上聚合物到部分还原的抗体上的马来酰亚胺/硫醇共轭
Figure BPA00001609256401871
将第二抗体-山羊抗小鼠IgG(H+L)在PBS+10mM乙酸中重构并且以1.0mg/mL脱盐/更换到50mM Tris-HCl缓冲液pH 7.4中将TCEP(三(2-羧乙基)膦)溶解在50mM Tris-HCl缓冲液pH 7.4中，以6摩尔过量的值加入，其中最终TCEP浓度为10mM，并且在室温下混合30分钟。将改性的蛋白经一个PD-10脱盐柱进行纯化以便去除过量的TCEP并且更换到反应缓冲液-具有10mMEDTA的100mM NaPO4pH 6.5反应缓冲液。将胺活化的聚合物以10mg/mL溶解在无水DMSO并且与琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)连接物进行混合。将该连接物以50mg/mL、在DMSO中过量20摩尔而添加到该聚合物溶液中并且被二异丙基乙胺(DIPEA)活化。将该反应经奥米康超离心过滤器进行纯化并且更换到反应缓冲液-具有10mM EDTA的100mMNaPO4 pH 6.5反应缓冲液中。在二硫化物还原之后，立即将在反应缓冲液中的马来酰亚胺功能化的聚合物以10mg/mL添加到20摩尔过量的抗体中并且允许混合4小时。然后使用离子交换和尺寸排阻色谱技术来对应地纯化未反应的聚合物和抗体的生物共轭物。标记程度(如上表示为p)是通过在405nm的吸收以及收集的280nm值来确定的。实例36(图20B)中提供的聚合物共轭物具有的F/P(每个抗体的聚合物个数#)为约2。这种共轭物证明了流动性能，是通过染色指数测量值来确定的，这些测量值比具有同一抗体的太平洋蓝对照共轭物高出4倍多。
聚合物到硫醇改性的抗体上的马来酰亚胺/硫醇共轭
Figure BPA00001609256401891
将第二抗体-山羊抗小鼠IgG(H+L)在PBS+10mM乙酸中重构并且脱盐/更换到100mM磷酸盐pH 7.5缓冲液中。将SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯)溶解在无水DMSO中，以过量15摩尔来添加并且在室温下混合60分钟。在用羟胺溶液淬灭之后，将该改性的蛋白经过一个PD-10柱进行脱盐以便去除过量SATA并且更换到反应缓冲液-5mM EDTA的PBS pH 7.0缓冲液中。将胺活化的聚合物以10mg/mL溶解在无水DMSO并且与琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)连接物进行混合。将该连接物以50mg/mL、在DMSO中过量20摩尔的值添加到该聚合物溶液中并且通过二异丙基乙胺(DIPEA)将其活化。经奥米康超离心过滤器来纯化该反应并且更换到反应缓冲液-5mMEDTA的PBS pH 7.0缓冲液中。在抗体的活化之后，立即将在反应缓冲液中的马来酰亚胺功能化的聚合物以10mg/mL添加到20摩尔过量的抗体中并且允许混合4小时。然后使用离子交换和尺寸排阻色谱技术来对应地纯化未反应的聚合物和抗体的生物共轭物。标记程度(如上表示为p)是通过在405nm的吸收以及收集的280nm值来确定的。将所生成的纯化的共轭物以于实例36对使用TCEP还原制备的这些共轭物(未提供数据)所说明的那些相类似的方式进行流动测试。
将在实例39中限定的聚合物结构用于按照类似于上一个实例中说明的方式制备第一抗CD4(RPA-T4)抗体共轭物。使30当量的聚合物与SATA改性的抗体(CJ11-2，图22)和TCEP还原的抗体(CJ13-1，图20D和图22)发生反应以便产生聚合物共轭物而在纯化之后在流式分析中测试。还使用TCEP还原法将来自实例23和26的SMCC改性的聚合物成功地共轭至抗CD4(RPA-T4)和抗CD8(RPA-T8)抗体上。代替TCEP也成功地进行了DTT还原。抗CD4和抗CD8共轭物在流式细胞术中的性能是以类似于实例39中说明的那些的方式来进行评估的(图22)。
实例47：聚合物共轭至DNA低聚物上
Figure BPA00001609256401911
用于点击式共轭(Click conjugation)至炔封端的DNA低聚物上的 叠氮化物聚合物合成
将叠氮基己酸NHS酯(2.5mg)在无水DMF(100μL)中的溶液在氮气下添加到胺功能性聚合物(9.9mg)在无水DMF(100μL)中的溶液中。然后添加二异丙基乙胺(2μL)。将该反应在室温下搅拌15小时。然后添加水(0.8mL)并且经一个NAP-10柱来纯化叠氮化物改性的聚合物。将该洗脱液冷冻干燥过夜。产率9.4mg，95％。
用于点击式共轭至叠氮化物聚合物上的悬垂炔(己炔)的低聚物合 成
将3’丙醇低聚物A8885(序列YATTTTACCCTCTGAAGGCTCCP，其中Y＝己炔基并且P＝丙醇基团)使用3’隔离基SynBaseTM CPG 1000柱在应用生物系统公司(Applied Biosystems)的394自动DNA/RNA合成器上合成。使用酸催化的脱三苯甲基化、偶联、帽化、以及碘氧化的一种标准1.0μmole亚磷酰胺循环。这些标准单体的偶联时间是40秒，并且5’炔单体的偶联时间是10分钟。
将该低聚物从该固体支持物中分离出并且通过在室温下在浓氨水中暴露60分钟而脱保护，接着在密封管中在55℃加热5小时。然后将该低聚物通过RP-HPLC在标准条件下进行纯化。产生了34OD。
溶液相的点击共轭：探针合成
将除气后的五水硫酸铜(0.063mg)在氯化钠水溶液(0.2M，2.5μL)中的溶液添加到三苯并三唑配体(0.5mg)和抗坏血酸钠(0.5mg)在氯化钠水溶液(0.2M，12.5μL)中的一个经除气的溶液中。随后，对应地添加低聚物A8885(50nmole)在氯化钠水溶液(0.2M，30μL)中的脱气后溶液以及叠氮化物聚合物(4.5mg)在无水DMF(50μL)中的脱气后溶液。将该反应再一次用氩气脱气30秒，然后密封该管并且在55℃孵育2个小时。然后添加水(0.9mL)并且将改性的低聚物经NAP-10柱进行纯化。将该洗脱液冻结干燥过夜。将该共轭物使用PAGE纯化作用作为一个不同的带分离出，并且使用质谱法进行表征。估计产率为10％-20％。
荧光研究
将低聚物-聚合物共轭物在荧光研究中用作探针。将探针与靶标A8090(序列GGAGCCTTCAGAGGGTAAAAT-Dabcyl)进行杂交，该靶标在3’端标记有dabcyl以便用作荧光猝灭剂。将该靶标与探针进行杂交，并且在一个Peltier-受控变温荧光计中监测荧光。在30℃到80℃的温度范围上以2℃/分钟的速率每隔5℃对荧光进行扫描。图25显示了随温度增加而增加的荧光强度或发射，表明当探针-靶标对熔化时，该聚合物和猝灭剂分开并且荧光单得到恢复。
聚合物共轭到核酸上还可以使用从实例14、45、和46中说明的方案进行调整得到的方法来进行。
实例48：聚合物抗体共轭物的纯化
通过在实例45、46、和49中说明的方案生产的聚合物抗体共轭物通过使用两步法来进行纯化的。首先使用离子交换来去除自由的、未反应的聚合物。当本发明中说明的这些聚合物并不具有任何有效电荷时，它们就不会结合到离子交换介质上。然而，蛋白(抗体)不含有带电基团并且通常结合到用于纯化的各种离子交换介质上。在所提供的这些实例中，该共轭物溶液的pH和传导性(反应后)被降低以便改进该自由抗体和共轭物与阳离子交换树脂的结合。在加载该共轭物之后，将树脂洗涤到基线(测量280和407nm的吸光度)以确保去除了所有的自由聚合物。结合的抗体和聚合物抗体共轭物是通过增加pH和离子浓度来洗脱的。这种分离的一个代表性实例以下在图26中(左侧)中提供，其中左侧的峰代表自由聚合物而右侧的峰代表洗脱的共轭物和自由蛋白。自由聚合物的去除还可以使用亲和色谱法以类似的方式来实现。特异性亲和树脂可以用于结合该自由蛋白和共轭物同时去除聚合物。
在去除该聚合物之后，将该共轭物溶液进行浓缩并且加载在一个尺寸排除柱上以便从该聚合物中分离出任何未反应的或者自由的抗体。实例43和44中说明的这些聚合物组合物比抗体更早洗脱出来，尽管其具有更低的分子量。这预期是由于刚性的聚合物结构。这些共轭物因此在任何自由抗体之前很好地洗脱出来，从而提供了对所希望的共轭物的近基线分离。分离出该分布中心附近的馏分还确保了不包含任何抗体。这种分离的一个代表性实例以下在图26中(右侧)提供，其中左侧的峰代表共轭物而最右侧的小峰代表自由抗体。这些单独的组分的保留时间在一个独立的实验中进行确定。
作为整体，该纯化确保了自由抗体和自由聚合物均被去除。所生成共轭物的纯度被合理地估计是处于＞95％。可以将收集的样本进行浓缩并且通过在280和407nm处的吸光度测量其浓度，以确保对280nm处的聚合物吸光度进行校正。此类测量还允许确定聚合物与抗体的标记比率(F/P)。
实例49：串型聚合物的染料标记和连接物活化
Figure BPA00001609256401941
串型染料共轭
在一个手套箱中，将93mg的串型聚合物(来自实例26)以15mg/mL溶解在一个带有搅拌棒的玻璃瓶中的无水DMSO中。还将22.5mg Cy3-NHS酯以15mg/mL溶解在无水DMSO中并且添加到该聚合物溶液中，之后加入0.3mL二异丙基乙胺。在室温下搅拌48小时之后，将该溶液用在水中的20％EtOH稀释到90mL并且经奥米康超级-15过滤器进行浓缩。将渗余物反复稀释并且经这些过滤器进行浓缩直到去除过量的Cy3。90％产率。标记和连接物含量是通过如在实例38中说明的测量和采用聚合物与染料的吸光度之比来确认的。
Figure BPA00001609256401951
串型物的胺改性(水性条件)
将100mg的聚合物-染料共轭物以150mg/mL溶解在乙醇中。将这在4℃逐滴添加到6mL的50mM MES缓冲液(pH 5)中。一次性添加38mg N-羟基琥珀酰亚胺，并且将该溶液搅拌以溶解这些固体。在溶解完之后，在搅拌的同时分部分地添加192mg的N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐。在将该溶液搅拌30分钟之后，添加33μL的乙二胺。在室温下搅拌过夜之后，将该溶液用在水中的20％EtOH稀释到90mL并且经奥米康超级-15过滤器进行浓缩。将渗余物反复稀释并且经这些过滤器浓缩总共四次以便去除杂质。90％的产率，60％的转化率。连接物的转化是通过将一种第二染料共轭至该末端胺上(如在实例38中说明的)来进行确定。
串型物共轭至第一抗体上
将第一单克隆抗体-抗-CD8(RPA-T8克隆)进行脱盐/更换到5mM EDTA、50mM磷酸盐的150mM NaCl pH 7.0缓冲液中。将TCEP(三(2-羧乙基)膦)用水溶解并且以12摩尔过量的值添加并且在30℃混合90分钟。将改性的蛋白经PD-10脱盐柱进行纯化以便去除过量的TCEP并且更换到5mM EDTA、50mM磷酸盐、150mM NaCl的pH 7.0缓冲液中。
将胺活化的串型聚合物以50mg/mL溶解在乙醇中并且将这种溶液与两个体积的100mM磷酸盐pH 7.5缓冲液进行混合。
Figure BPA00001609256401961
然后使用一个PD-10脱盐柱将该溶液脱盐/更换到100mM磷酸盐pH 7.5洗脱液中。向这个溶液中添加25摩尔过量的琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)连接物(作为在无水DMSO中的10mg/ml溶液制备的)。将所生成的溶液在20℃进行辊混合60分钟，然后使用一个PD-10脱盐柱进行脱盐/更换到5mM EDTA、50mM磷酸盐的150mM NaCl pH 7.0缓冲液中。在二硫化物还原之后，立即以相对于抗体25摩尔过量的值来添加马来酰亚胺功能化的聚合物并且允许在20℃混合2小时。然后使用离子交换和尺寸排阻色谱技术来分别纯化该未反应的聚合物和抗体的生物共轭物。标记程度(以下表示为p)是通过吸光度和来280nm的校正值来确定的。
聚合物串型共轭物在多色试验中的流式细胞术分析
在一个流式细胞仪上在补偿珠粒和全血样本上均对所生成的抗CD8串型共轭物进行评估。使用抗小鼠IgG补偿珠粒来捕捉该抗体并量化溢出到检测通道(使用独特发射过滤器的检测器)中的信号而非旨在用于共轭物。图28(左侧)显示了当使用紫色激光器来激发该串型共轭物时所测量的信号，其中使用一个与这些共轭物发射相匹配的610nm过滤器来检测这种发射(标记的QDotA)。在该图的这个画面中也显示了进入到该流式细胞仪的与该紫色激发激光器配对的其他通道中(DAPI-A和AmCyan-A)以及偏离该488nm激光器的两个通道(FITC-A和PE-A)中的串扰。该数据显示了在450/50nm过滤器(DAPI-A)中的最小串扰，这尤其检测了残余的聚合物(供体)发射。来自该串型物上的Cy3报告物(610nm过滤器)相对于其他上述通道的显著更高的信号显示，所需的补偿最小(在这个实例中最大不超过6％，并且具体情况下经常小得多)。
该串型抗CD8共轭物随后在一个4色流动分析中用健康志愿受试者的全血上的其他标记抗体(抗CD3太平洋蓝、抗CD45藻红蛋白、以及抗CD4萤光素)来进行评估，使用符合实例39并且从其发展了的染色和测定方案。图28中的数据(右侧)清楚显示了该串型标记与常见多色流式细胞术仪器、试剂、试验计划的相容性。确切地说，观察到了CD8阳性淋巴细胞的强烈的且特异性的染色，并且在该CD4阳性子集内，CD8表达的非表达细胞的简便区分是清楚的。
该数据共同突出了该聚合物-染料串型共轭物在多色流动分析的效力，如在所披露的发明中描述的(参见，例如图20和图22)。实例50：非离子聚合物侧链的水溶性和流式细胞术应用的确认
生产了一系列不同的聚芴聚合物来研究水溶性共轭聚合物与细胞的相互作用。这是通过首先合成被不同的增溶侧链取代的一系列单体(例如，PEG-、磺酸酯-、季胺-、两性离子-取代的)然后将其用苏楚基偶联来聚合而进行的。目的是确定这些侧链对非特异细胞结合以及在生物学测定中特别是在流式细胞术中使用的典型缓冲液(例如，PBS和DPBS)中聚合物的溶解度具有什么影响。
所合成的聚合物候选物的数目和特性多样性使得生产其中每个的纯化后共轭物以用于流式细胞术测试是不切实际的。因此，发展了一种系统来对每种候选聚合物基于其对于与细胞的非特异性结合的贡献进行评分。这样一种系统能够将聚合物用关于它们是否在一旦共轭后即充分起作用的预测值进行评级。围绕一种Jurkat细胞模型(淋巴细胞系)开发了一种非特异性结合(NSB)“指数”。其中，将细胞用固定浓度的每种聚合物进行孵育、洗涤、并通过流动进行分析。图33展示了该分析之后的结果，并且展示了每种聚合物类型所产生的信号的广泛变化。将图33中的聚合物通过悬垂胺上的邻苯二酰胺保护基团来进行评估，其中P9例外。
这些数据将这些聚合物在纯粹由NSB产生的信号方面进行分级。通过以下方式能够进行相对NSB的更精确的评估：当每种形式的聚合物独立地在染色缓冲液中在荧光计上使用405nm激发被测定时通过其荧光效率(量子产率的粗略评估)的差异来调整并进一步标准化该流动信号、并监测在420-460nm范围内的发射(以在评估该荧光计中的440/40nm过滤器)。代表性聚合物P5、P2、P9和P12显示了相对于未染色的细胞而言增加的NSB(最左侧曲线，强度表示在x-轴线上)。
图34中的数据继续突出了所产生的具有中性的、非离子的PEG侧链的聚合物(指定为P20)相对于同样并入了阴离子侧链的那些(指定为P4)之间的差异。这些数据是使用图33中Jurkat细胞系从流式细胞术分析中收集的柱状图(在BD LSR-II细胞仪中405nm激发)。左侧的画面显示了未染色的细胞和阴性对照物(用非特异太平洋蓝标记的共轭物处理过的细胞)，是在最左侧的两条曲线。对太平洋蓝对照物观察到了极少的非特异性染色(如果有的话)。然而在这个相同画面中，右侧的曲线代表了用阴离子P4聚合物处理过的细胞并且在信号(x轴)上具有如图所示的清楚的偏移。相反，该中性聚合物P20几乎未显示出与未处理的细胞的偏移，这与用太平洋蓝对照物是一致的。在中间的画面代表在相同的细胞上测试的一系列不同的聚合物和聚合物侧链组合。
这些数据突出了中性侧链的优点。这个优点还同样扩展至其他测定形成中，包括基于板的免疫测定以及细胞计数的珠粒阵列(数据未显示)。这些中性侧链还出乎意料地导致了这些共轭聚合物在水溶液中的溶解度与之前以离子侧链制成的那些相比显著增加了。在含有甚至中等离子强度的缓冲液中尤其是如此(如在碱性细胞方案中使用的那些)。还看到溶液量子产率增加了，可能是由于更高的水溶解度(以及更小的聚结)。在缓冲液中差的溶解度还使得蛋白共轭更加困难，并且由P4产生的链亲和素共轭物在典型的分析缓冲液(如磷酸盐缓冲盐水(PBS))中显示出了聚结迹象。在这里披露的其他实例中产生的聚合物和共轭物并不如此。
实例51：聚合物-亲和素共轭物的纯化和表征
聚合物-亲和素共轭物的凝胶分析
为了验证与亲和素上(AvDN)的成功共轭，研发了一种琼脂糖凝胶电泳法并且将其用于评估AvDN随着与聚合物的共轭程度而变的相对迁移率(图35)。在凝胶加载之前，用生物素基-荧光素来将共轭反应进行染色，它结合了聚合物-AvDN共轭物和自由AvDN。在0.8％的琼脂糖凝胶中进行电泳、倒入10mM硼酸钠pH11的缓冲液中并且在其中操作。在UV光照(以便看得见该聚合物)下并且通过532nm激发(以便看得见荧光素)将该凝胶可视化，用于评估共轭程度。在UV光照下，对于该聚合物观察到了单个条带。在532nm激发下，对于未结合的生物素基-荧光素、未反应的AvDN、以及聚合物-AvDN共轭物观察到的条带与自由聚合物的条带重合，表明未反应的聚合物与聚合物-AvDN共轭物共同被洗脱。通过该共轭物条带的强度来证明共轭作用。
这些凝胶图像的顶部的图解(图35)表明了那些组分被包括在该共轭反应中，并且这些样本是否在加载和电泳之前用生物素基荧光素进行了预先孵育。在左侧的图像通过UV-激发来可视化聚合物，而在右侧的图像捕捉了荧光素激发的结果。在右侧的图像中，当在存在而非不存在杂双官能的NHS-乙氧基-马来酰亚胺连接物的情况下进行共轭(连接物被用于功能化该聚合物胺，而在马来酰亚胺-硫醇偶联之前使用Traut’s试剂则将蛋白胺部分地转化为硫醇)时，可以看到生物素酰化荧光素与该聚合物是相关联的。缩写：AvDN＝亲和素DN，AA1＝聚合物，连接物＝该反应中包括的杂-双官能NHS-马来酰亚胺连接物，Biot-F＝电泳之前生物素基荧光素预染色。
纯化：通过SEC色谱法去除未反应的亲和素
在一台Superdex 200尺寸排阻柱上将粗制共轭物混合物进行分馏，通过UV吸光度来监测这些馏分(图36，顶部)。为了确认该方法，通过琼脂糖凝胶电泳来分析这些馏分。如以上说明的，这种电泳方法使之可能将亲和素附接到聚合物上的程度可视化，并且在这种情况下分析来自该柱上的每个馏分的组成。在凝胶加载之前将选定的馏分用生物素基-荧光素(相对于生物素基为1摩尔当量)进行孵育，其中生物素基-荧光素单独地作为标记物来加载(最左边的泳道，图36，底部)。电泳在0.8％琼脂糖凝胶中进行，将其倒入10mM硼酸钠pH 11的缓冲液中并且在其中运行。通过532nm激发将凝胶可视化。馏分C2-C6的荧光素-可视化的条带的延迟指示了纯化的聚合物-亲和素共轭物，而对馏分C8观察到的这两个条带指示了聚合物-亲和素共轭物和自由亲和素的一种混合物。馏分C10-D2仅显示了自由的亲和素。
通过凝胶分析评估共轭效率
为了确定共轭反应中聚合物与链亲和素的最佳比率，使该聚合物与链亲和素的摩尔当量从0-24当量变化。在共轭之后，在电泳之前将这些共轭产物用生物素基-荧光素进行孵育。将该凝胶通过UV光照以及532nm激发进行可视化(图37)。在聚合物与链亲和素为0摩尔当量时，观察到了自由链亲和素，是具有相对高移动率的条带。当聚合物的摩尔当量从3当量增加到12当量时，该自由链亲和素条带的强度减小而聚合物-链亲和素共轭物条带的强度增加。在24当量的聚合物处，通过532nm的激发观察到了仅有共轭物条带。
通过流式细胞术分析纯化作用对共轭物在细胞分析上的性能的影响
对聚合物链亲和素共轭物进行纯化(聚合物结构在实例39中例示出，在图38中指示为P30)以便确定对流式细胞术性能的影响。阳离子交换色谱法是在纯化中执行的以便改进对过量自由聚合物的去除。不带电荷的聚合物在流通中洗脱，而在蛋白上质子化了的胺被该介质截留。因此，链亲和素无论是共轭至该聚合物上还是未反应的都被截留。这种纯化过程的离子交换相通过一个不连续梯度而保持简单，导致了共轭的和未反应的SA的共同洗脱。通过随后的尺寸凝胶色谱法能实现进一步的分馏，这提供了共轭物与SA的更好分离。使用以聚合物-链亲和素共轭物孵育的Jurkat细胞观察到了在这种新纯化方法的流式细胞术中的性能益处，这是通过流式细胞术来进行分析的。在粗样本(图38，顶部)与纯化后的共轭物(图38，底部)之间进行对比。可商购的太平洋蓝-链亲和素共轭物被用作亮度、非特异性结合、以及染色指数的比较物。Jurkat细胞显示了约3倍的总染色指数改善，其中基于图38中显示的柱状图，聚合物共轭物和PB-SA两者具有类似的NBR。血液中的测试(数据未显示)表明了在共轭物纯化的过程中NSB显著降低到类似于PB-SA的水平。
在一个单独的试验中，通过类似的聚合物(在实例11中例示出)，具有变化的聚合物与链亲和素之比的共轭物通过SEC而获得。具有较高比率的那些相对于具有较低标记的那些提供了流动性能。基于在385nm/280nm的吸收度比值来确定这些比率。相对于太平洋蓝对照物的性能显示了从高出太平洋蓝染色指数10.9倍(385/280比率为3.6)到是高出太平洋蓝染色指数的13.8倍(A385/280比率为4.7)的增加。
本发明优选的实施方式已经在此显示并进行了描述，但是本领域普通技术人员应当明白这些实施方式仅是以举例的方式提供的。本领域普通技术人员在不偏离本发明的情况下将会想到多种变化、改变和替换。应当理解在实践本发明的过程中可以采用此处描述的本发明实施方式的多种替代形式。意图用以下权利要求书限定本发明的范围，并且因此覆盖了在这些权利要求的范围内的方法和结构和它们的等同物。

Claims (40)

1.一种具有以下化学式(Ia)的结构的水溶性共轭聚合物：
Figure FPA00001609256300011
其中：
每个R独立地是一个非离子的侧基，该侧基能够提供超过10mg/mL的水中溶解度；
MU是一种聚合物改性单元或者带隙改性单元，该单元是沿着该聚合物主链均匀或者随机分布的并且任选地被一个或多个任选取代的取代基所取代，这些取代基是选自：卤素、羟基、C1-C12烷基、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基、C1-C12卤烷基、C1-C12烷氧基、C2-C18(杂)芳氧基、C2-C18(杂)芳氨基、(CH2)x′(OCH2CH2)y′OCH3其中每个x′独立地是从0-20的整数并且y′独立地是从0到50的整数、或者一个C2-C18(杂)芳基基团；
每个任选的连接物L1和L2是沿着该聚合物主链均匀地或随机分布的芳基或杂芳基并且被一个或多个侧链所取代的，该侧链以一个官能团封端，该官能团是选自：胺、氨基甲酸酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇以及其被保护基团，用于共轭至另一个基质、分子或生物分子上；
G1和G2各自独立地选自：氢、卤素、炔、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、卤素取代的芳基、硼酸取代的芳基、硼酸酯取代的芳基、硼酸酯、硼酸、任选取代的氟、以及被一个或多个侧链取代的芳基或杂芳基，这些侧链以一个选自以下各项的官能团、分子、或生物分子封端：胺、氨基甲酸酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇、及其被保护基团，用于共轭至另一个基质、分子或生物分子上；
其中该聚合物在G1、G2、L1、或L2内包含至少1个官能团，该官能团是选自：胺、氨基甲酸酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、以及硫醇，该官能团允许功能性共轭至另一个分子、基质、或生物分子上；
n是从1至约10,000的整数；并且
a、b、c、和d限定了在该结构内每个单元的mol％，每个单元可以是均匀地或随机地重复的并且其中a是从10％到100％的mol％，b是从0到90％的mol％，并且c和d各自是从0到25％的mol％。
2.如权利要求1所述的聚合物，其中，每个R独立地是：(CH2)x(OCH2CH2)yOCH3，其中每个x独立地是从0-20的整数，每个y独立地从0-50的整数；或者是任选地被一个或多个卤素、羟基、C1-C12烷氧基、或者(OCH2CH2)zOCH3所取代的苄基，其中z是独立地从0到50的整数。
3.如权利要求1所述的聚合物，其中，每个R是(CH2)3(OCH2CH2)11OCH3。
4.如权利要求1所述的水溶性共轭聚合物，其中，任选的连接物L1或L2是选自具有以下结构的a-h组成的组：
Figure FPA00001609256300031
*＝用于共价附接到不饱和主链上的位点；
其中R’独立地是：H、卤素、C1-CX烷基、(C1-C12烷基)NH2、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基、C1-C12卤烷基、C2-C18(杂)芳基、C2-C18(杂)芳氨基、-[CH2-CH2]r’-Z1、或者(C1-C12)烷氧基-X1；并且其中Z1是-OH或-COOH；X1是-NH2、-NHCOOH、-NHCOOC(CH3)3、-NHCO(C3-C12)环烷基(C1-C4)烷基-N-马来酰亚胺；或者-NHCO[CH2-CH2-O]s’(CH2)s’NH2；r’是从1到20的整数；并且s’各自独立地是从1到20的整数；(CH2)3(OCH2CH2)x”OCH3，其中x”独立地是从0到50的整数；或者是任选地被一个或多个卤素、羟基、C1-C12烷氧基、或者(OCH2CH2)y”OCH3所取代的苄基，其中y”独立地是从0到50的整数，并且R’是与R不同的；
其中k是2、4、8、12、或24；
其中R15是选自具有以下结构的l-t组成的组：
Figure FPA00001609256300041
*＝用于共价附接到主链上的位点。
5.如权利要求1所述的水溶性共轭聚合物，其中，任选的连接物L1或L2是
Figure FPA00001609256300042
6.如权利要求1所述的水溶性共轭聚合物，其中，G1和G2各自独立地具有结构
Figure FPA00001609256300043
其中R11是以下各项中的任何一种或其组合：一种键、C1-C20烷基、C1-C20烷氧基、C2-C20亚烷基、C2-C20炔、C3-C20环烷基、C1-C20卤烷基、(CH2)x(OCH2CH2)p(CH2)x其中x各自独立地是从0到20的整数并且p独立地是从0到50的整数、芳基、C2-C18(杂)芳基、苯氧基、酰胺基、氨基、氨基甲酸酯、羧酸酯、碳酸酯、硫化物、二硫化物、或亚胺基的基团；这些基团是通过一个官能团封端的，该官能团是选自：胺、氨基甲酸酯、羧酸酯、羧酸、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇、及其被保护基团，用于共轭至另一个基质、分子或生物分子上。
7.如权利要求1所述的水溶性共轭聚合物，其中，G1和G2各自是独立地选自具有以下结构的1-31组成的组：
Figure FPA00001609256300061
*＝用于共价附接到主链上的位点
其中R15是选自具有以下结构的l-t组成的组：
并且k是2、4、8、12、或24。
8.如权利要求1所述的聚合物，其中，该聚合物在该聚合物链G1或G2的仅一个末端处包含单一的共轭位点。
9.如权利要求1所述的聚合物，其中G1和G2是
Figure FPA00001609256300072
10.如权利要求1所述的水溶性共轭聚合物，其中，MU是选自具有以下结构的a’-k’组成的组：
Figure FPA00001609256300081
*＝用于共价附接到不饱和主链上的位点
其中，R是一种非离子侧基，该侧基能够提供超过10mg/mL的水中溶解度。
11.如权利要求1所述的水溶性共轭聚合物，具有以下化学式的结构：
Figure FPA00001609256300082
其中G1或G2中的至少一个包括一个功能性共轭位点。
12.如权利要求1所述的水溶性共轭聚合物，具有以下化学式的结构：
Figure FPA00001609256300091
其中L1包括一个功能性共轭位点。
13.如权利要求1所述的水溶性共轭聚合物，具有以下化学式的结构：
Figure FPA00001609256300092
其中G1或G2中的至少一个包括一个功能性共轭位点。
14.如权利要求1所述的水溶性共轭聚合物，具有以下化学式的结构：
Figure FPA00001609256300093
15.如权利要求1所述的水溶性共轭聚合物，具有以下结构：
Figure FPA00001609256300094
16.如权利要求1所述的水溶性共轭聚合物，具有以下结构：
Figure FPA00001609256300101
17.如权利要求1所述的水溶性共轭聚合物，具有以下结构：
Figure FPA00001609256300102
18.如权利要求1所述的聚合物，具有以下结构：
Figure FPA00001609256300103
19.如权利要求1所述的水溶性共轭聚合物，具有以下结构：
20.如权利要求1所述的水溶性共轭聚合物，具有以下结构：
Figure FPA00001609256300105
21.如权利要求20所述的水溶性共轭聚合物，其中，该聚合物进一步包含一种是Cy3或Dylight 594染料的信号发色团。
22.如权利要求20所述的水溶性共轭聚合物，其中，该聚合物是共轭至一种第二染料报告物和一种抗体上的。
23.如权利要求20所述的水溶性共轭聚合物，其中该连接物
Figure FPA00001609256300111
是占该整个聚合物的约10％。
24.如权利要求1所述的水溶性共轭聚合物，其中该聚合物是共轭至一种链亲和素、抗体、或核酸上的并且被用作一种直接的荧光报告物。
25.如权利要求1所述的水溶性共轭聚合物，其中，该聚合物是共轭至一个抗体的铰链区处的硫醇基上的。
26.如权利要求1所述的水溶性共轭聚合物，其中，该聚合物是共轭至一个通过双功能的连接物改性过的蛋白上的胺基上的。
27.如权利要求1所述的水溶性共轭聚合物，其中，该聚合物是共轭至抗体上的。
28.如权利要求27所述的聚合物抗体共轭物，其中，聚合物抗体共轭物在流式细胞术分析中在约405nm处被激发，其中该特异性信号是比共轭至太平洋蓝上的同一抗体大出至少3倍。
29.如权利要求1所述的水溶性共轭聚合物，其中该聚合物是≥95％纯度的。
30.如权利要求1所述的水溶性共轭聚合物，其中，该聚合物在流式细胞术分析中被用于鉴定不同的细胞标记物或者细胞类型。
31.如权利要求1所述的水溶性共轭聚合物，其中该聚合物被用于细胞内染色。
32.如权利要求1所述的水溶性共轭聚合物，具有大于40,000g/mol的最小数均分子量以及在纯水或磷酸盐缓冲盐水溶液中大于50mg/mL的水溶性。
33.如权利要求1所述的水溶性共轭聚合物，包含至少两种可以共轭至两种独特材料上的独特的共轭连接物。
34.一种共轭聚合物复合物，包括：连接到至少一个生物分子上的一种聚合物，该生物分子是选自下组，该组由以下各项组成：传感器生物分子、生物共轭物和靶标生物分子，其中该聚合物是通过至少一个悬垂于其上的生物共轭位点而共价地结合的，并且该聚合物包括一种信号发色团，或者一种信号发色团任选地被共价地结合到该聚合物或者该传感器生物分子上；其中该聚合物包括以下化学式的结构：
Figure FPA00001609256300131
每个R是一种非离子侧基，该侧基能够提供超过10mg/mL的水中溶解度；
MU是一种聚合物改性单元或者带隙改性单元，该单元是沿着该聚合物主链均匀或者随机分布的并且任选地被一个或多个任选取代的取代基所取代，这些取代基是选自：卤素、羟基、C1-C12烷基、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基、C1-C12卤烷基、C1-C12烷氧基、C2-C18(杂)芳氧基、C2-C18(杂)芳氨基、(CH2)x′(OCH2CH2)y′OCH3其中每个x′独立地是从0-20的整数并且y′独立地是从0到50的整数、或者一个C2-C18(杂)芳基基团；
每个任选的连接物L1和L2是沿着该聚合物主链均匀地或随机分布的芳基或杂芳基并且被一个或多个侧链所取代，该侧链以一个官能团封端以用于共轭至另一个分子、基质或生物分子上，该官能团是选自：胺、氨基甲酸酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇以及其被保护基团；
G1和G2各自独立地选自：氢、卤素、炔、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、卤素取代的芳基、硼酸取代的芳基、硼酸酯取代的芳基、硼酸酯、硼酸、任选取代的氟、以及被一个或多个侧链取代的芳基或杂芳基，这些侧链以一个选自以下各项的官能团、分子、或生物分子封端：胺、氨基甲酸酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇、及其被保护基团，用于共轭至另一个基质、分子或生物分子上；
其中该聚合物在G1、G2、L1、或L2内包括至少1个官能团，该官能团是选自：胺、氨基甲酸酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、以及硫醇，该官能团允许功能性共轭至另一个分子、基质、或生物分子上；
n是从1至约10,000的整数；并且
a、b、c、和d限定了在该结构内每个单元的mol％，各个单元可以是均匀地或随机地重复的并且其中a是从10％到100％的mol％，b是从0到90％的mol％，并且c和d各自是从0到25％的mol％。
35.如权利要求34所述的共轭聚合物复合物，其中，该传感器生物分子是选自下组，该组由以下各项组成：亲和素、链亲和素、中性亲和素、亲和素DN、以及亲和素D。
36.如权利要求34所述的共轭聚合物复合物，进一步被构形为用于结合到一种选自下组的复合物上，该组由以下各项组成：生物素标记的抗体、生物素标记的蛋白、以及生物素标记的靶标生物分子。
37.如权利要求34所述的共轭聚合物复合物，其中，该传感器生物分子是一种抗体。
38.如权利要求34所述的共轭聚合物复合物，其中，该信号发色团和该传感器生物分子两者均通过多个连接物而共价连接到该多发色团上。
39.如权利要求34所述的共轭聚合物复合物，其中，该信号发色团当共价地结合到该聚合物或该传感器生物分子上时，是一种有机染料。
40.一种具有以下化学式(Ia)的结构的水溶性共轭聚合物：
Figure FPA00001609256300151
其中：
每个R独立地是：(CH2)x(OCH2CH2)yOCH3，其中每个x独立地是从0-20的整数，每个y独立地从0-50的整数；或者是任选地被一个或多个卤素、羟基、C1-C12烷氧基、或者(OCH2CH2)zOCH3所取代的苄基，其中z是独立地从0到50的整数；
任选的连接物L1或L2各自是选自具有以下结构的a-h的组成的组
Figure FPA00001609256300161
*＝用于共价附接到不饱和主链上的位点
其中R’独立地是：H、卤素、C1-C12烷基、(C1-C12烷基)NH2、C2-C12亚烷基、C2-C12炔、C3-C12环烷基、C1-C12卤烷基、C2-C18(杂)芳基、C2-C18(杂)芳氨基、-[CH2-CH2]r’-Z1、或者(C1-C12)烷氧基-X1；并且其中Z1是-OH或-COOH；X1是-NH2、-NHCOOH、-NHCOOC(CH3)3、-NHCO(C3-C12)环烷基(C1-C4)烷基-N-马来酰亚胺；或者-NHCO[CH2-CH2-O]s’(CH2)s’NH2；r’是从1到20的整数；并且s’各自独立地是从1到20的整数；(CH2)3(OCH2CH2)x”OCH3其中x”独立地是从0到50的整数；或者是任选地被一个或多个卤素、羟基、C1-C12烷氧基、或者(OCH2CH2)y”OCH3所取代的苄基，其中y”独立地是从0到50的整数，并且R’是与R不同的；
其中R15是选自具有以下结构的l-t组成的组：
Figure FPA00001609256300162
并且k是2、4、8、12、或24；
*＝用于共价附接到主链上的位点
MU是一种选自具有以下结构a’-k’的组成的组中的聚合物改性单元或带隙改性单元：
*＝用于共价附接到不饱和主链上的位点；
其中，R是一种非离子侧基，该侧基能够提供超过10mg/mL的水中溶解度；
G1和G2各自独立地选自具有以下结构的1-31组成的组：
Figure FPA00001609256300181
其中该聚合物在G1、G2、L1、或L2内包括至少1个官能团，该官能团是选自：胺、氨基甲酸酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化的酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、以及硫醇，该官能团是允许能性共轭至另一个分子、基质、或生物分子上；
n是从1至约10,000的整数；并且
a、b、c、和d限定了在该结构内每个单元的mol％，每个单元各自可以是均匀地或随机地重复的并且其中a是从10％到100％的mol％，b是从0到90％的mol％，并且c和d各自是从0到25％的mol％。
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