CN104072561A

CN104072561A - 信使rna帽的抗-反向硫代磷酸类似物的合成和用途

Info

Publication number: CN104072561A
Application number: CN201410246751.1A
Authority: CN
Inventors: J·杰米利迪; E·M·戈鲁德琪恩-诺加尔斯卡; J·克瓦尔斯卡; E·达琴奇维克孜; R·E·罗德斯
Original assignee: Uniwersytet Warszawski; Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College
Current assignee: Uniwersytet Warszawski; Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College
Priority date: 2007-06-19
Filing date: 2008-06-19
Publication date: 2014-10-01
Anticipated expiration: 2028-06-19
Also published as: HK1200461A1; WO2008157688A3; US8153773B2; CY1115525T1; CN101855231B; ES2500515T3; CN101855231A; HRP20140771T1; US20100233757A1; SI2167523T1; PL2167523T3; CN107501370A; PT2167523E; DK2167523T3; EP2167523B1; EA017740B1; WO2008157688A2; EP2167523A2; AU2008265683A1; CN104072561B

Abstract

本发明公开了新的RNA帽类似物，其包含一个或多个硫代磷酸基团。所述类似物还在7-甲基鸟苷的2’-O位置处包含修饰，其防止它们在mRNA的体外合成过程中以相反的方向掺入，并因此是“抗-反向帽类似物”(anti-reverse cap analog，ARCA)。所述ARCA修饰确保，S原子在翻译和脱帽机器中都准确地定位在帽结合蛋白的活性位点内。所述新的S-ARCA类似物对于体内脱帽酶具有抗性。有些S-ARCA具有相比于不包含硫代磷酸基团的相应类似物而言更高的对于eIF4E的亲和力。当将包含各种S-ARCA的mRNA引入培养的细胞中时，有些mRNA以相比于用常规类似物m⁷GpppG合成的mRNA而言高至五倍的程度有效地进行翻译。

Description

信使RNA帽的抗-反向硫代磷酸类似物的合成和用途

本申请是申请日为2008年6月19日、申请号为200880102959.9、发明名称为“信使RNA帽的抗-反向硫代磷酸类似物的合成和用途”的发明专利申请的分案申请。

Jacek Jemielity,Ewa M.Grudzien-Nogalska,Joanna Kowalska,Edward Darzynkiewicz,和Robert E.Rhoads

文件编号：Jemielity07S01W

在美国中根据35U.S.C.§119(e)，和在所有国家中根据适用的条约和公约，要求2007年6月19日提交的临时美国申请系列号60/944,842的提交日期的权益。

本发明的开发部分地在由国家综合医学研究所(National Institute of General Medical Sciences)给予的基金号R01GM20818下得到美国政府的资助。美国政府享有本发明中的某些权利。

本发明的开发部分地在由波兰科学和高等教育部(Polish Ministry of Science and Higher Education)给予的基金号2P04A00628下得到波兰政府的资助。

技术领域

合成了新的信使RNA帽的抗-反向(anti-reverse)硫代磷酸类似物，并且显示在mRNA的翻译中是有用的。

技术背景

在真核细胞中，大多数信使RNA(mRNA)的5'末端被封闭，或“帽化(加帽)”。此外，还存在有一些也被帽化的其他形式的RNA，例如核内小RNA(snRNA)。所述帽包含有在两个核苷部分之间的5'-5'三磷酸键合和远端鸟嘌呤环上的7-甲基。mRNA和snRNA的帽化促进其在细胞中的正常功能。

能够在体外合成加帽的RNA分子是有用的，因为这使得工作人员能够制备在各种生物学应用中表现适当的RNA分子。此类应用包括多肽的研究应用和商业生产，例如，在无细胞翻译体系中产生在特定位点包含“非天然”氨基酸的多肽，或在培养的细胞中产生就其活性或稳定性而言需要翻译后修饰的多肽。在后者体系中，合成进行显著更长的时间，并因此产生更多的蛋白质。

最经常用来在体外制备加帽的RNA的方法是，在所有四种核糖核苷三磷酸和帽二核苷酸例如m⁷G(5')ppp(5')G(此后，m⁷GpppG)存在下用细菌或噬菌体RNA聚合酶来转录DNA模板。聚合酶以下列方式来起始转录：m⁷GpppG的Guo部分的3'-OH对于下一个由模板所决定的核苷三磷酸上的α-磷酸发动亲核攻击，从而导致产生初始产物m⁷GpppGpN。通过在转录反应混合物中将m⁷GpppG与GTP的比率设定为在5和10之间来遏制备选的、由GTP起始的产物pppGpN。

合成RNA可以通过DNA模板的无细胞转录来合成。参见R.Contreras等人,“Simple,efficient in vitro synthesis of capped RNA useful for direct expression of cloned eukaryotic genes,”Nucl.Acids Res.,第10卷,第6353-6362页(1982)；J.Yisraeli等人,“Synthesis of long,capped transcripts in vitro by SP6and T7RNA polymerases,第42-50页,在J.Dahlberg等人(编辑),Meth.Enzymol.,第180卷,第42-50页(1989)中；和D.Melton等人,“Efficient in vitro synthesis of biologically active RNA and RNA hybridization probes from plasmids containing a bacteriophage SP6promoter,”Nucl.Acids Res.,第12卷,第7035-7056页(1984)。

如此产生的加帽的RNA在体外进行的剪接反应中是有活性的。参见M.Konarska等人,“Recognition of cap structure in splicing in vitro of mRNA precursors.Cell,第38卷,第731-736页(1984)；和 I.Edery等人,“Cap-dependent RNA splicing in a HeLa nuclear extract,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第82卷,第7590-7594页(1985)。

加帽的mRNA在无细胞翻译体系中比非加帽的mRNA更有效地被翻译。参见S.Muthukrishnan等人,“5'-Terminal7-methylguanosine in eukaryotic mRNA is required for translation,”Nature,第255卷,第33-37页(1975)；L.Chu等人,“Paradoxical observations on the5'terminus of ovalbumin messenger ribonucleic acid,”J.Biol.Chem.,第253卷,第5228-5231页(1978)；E.Darzynkiewicz等人,“β-Globin mRNAs capped with m⁷G,m₂ ^2.7G or m₃ ^2.2.7G differ in intrinsic translation efficiency,”Nucl.Acids Res.,第16卷,第8953-8962页(1988)；和E.Darzynkiewicz等人,“Inhibition of eukaryotic translation by nucleoside5'-monophosphate analogues of mRNA5'-cap:Changes in N7substituent affect analogue activity,”Biochem.,第28卷,第4771-4778页(1989)。

5'-未甲基化的mRNA在翻译上的活性比5'-甲基化的mRNA低。参见G.Both等人,“Methylation-dependent translation of viral messenger RNAs in vitro,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第72卷,第1189-1193页(1975)。

通过电穿孔引入培养的哺乳动物细胞中的加帽的mRNA比非加帽的mRNA更有效地被翻译。参见E.Grudzien等人,“Differential inhibition of mRNA degradation pathways by novel cap analogs,”J.Biol.Chem.,第281卷,第1857-1867页(2006)。

A.Pasquinelli等人,“Reverse5'caps in RNAs made in vitro by phage RNA polymerases,”RNA,第1卷,第957-967页(1995)报道了，噬菌体聚合酶使用m⁷GpppG的7-甲基鸟嘌呤部分的3'-OH来起始转录，这证明用该帽类似物制备的RNA产物中的大约三分之一至一半实际上包含相反方向的帽，即Gpppm⁷GpN。此类反向帽化的RNA分子表现异常。相同的作者报道，当将反向帽化的pre-U1snRNA转录物注射入光滑爪蟾(Xenopus laevis)细胞核中时，它们比天然转录物更慢地被输出。类似地，细胞质中的胞质反向帽化的U1snRNA不被正确地输入到细胞核中。

mRNA上帽的存在强烈地刺激mRNA转录物翻译成蛋白质。E.Grudzien等人,“Novel cap analogs for in vitro synthesis of mRNAs with high translational efficiency,”RNA,第10卷,第1479-1487页(2004)证明，包含有专一地以相反方向掺入的帽的mRNA在无细胞体系中仅以包含有专一地以正常方向掺入的帽的mRNA的效率的4％进行翻译。

J.Stepinski等人,“Synthesis and properties of mRNAs containing the novel‘anti-reverse’cap analogues7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and7-methyl(3'-deoxy)GpppG,”RNA,第7卷,第1486-1495页(2001)报道了不能以相反方向掺入的两种新型帽类似物，m⁷3'dGpppG和m₂ ^7,3’-OGpppG，的合成和用途。用这些“抗-反向帽类似物”(anti-reverse cap analog，ARCA)帽化的mRNA在体外体系中比用常规类似物m⁷GpppG帽化的mRNA更有效地被翻译。还可参见，美国专利号7,074,596，和美国专利申请公开2003/0194759。

Z.Peng等人,“Synthesis and application of a chain-terminating dinucleotide mRNA cap analog,”Org.Lett.,第4卷,第161-164页(2002)报道了m₂ ^7,3’-OGpppG的合成以及其在均一地加帽的RNA的体外转录中的用途。

J.Jemielity等人，"Novel'anti-reverse'cap analogues with superior translational properties,"RNA,第9卷,第1108-1122页(2003)报道，用-OCH₃或-H在2’位进行取代以分别产生m₂ ^7,2’-OGpppG或m⁷2’dGpppG，这产生了具有与在3’位取代的ARCA的性质相等或稍微更有利的性质的ARCA，如通过与翻译帽结合蛋白eIF4E的结合，在体外转录期间向mRNA中的正确掺入，以及在无细胞体系中所得的mRNA的翻译效率这样的标准所测量的。

从引入培养的哺乳动物细胞中的合成mRNA所产生的蛋白质的量受限于通过天然周转过程的mRNA降解。mRNA降解的主要体内途径通过由特异的焦磷酸酶Dcp1/Dcp2(其在α和β磷酸之间进行切割)从完整的mRNA上去除帽来起始。E.Grudzien等人"Differential inhibition of mRNA degradation pathways by novel cap analogs,"J.Biol.Chem.,第281卷,第1857-1867页(2006)设计并合成了其中亚甲基替代了α和β磷酸基团之间的O原子的帽类似物，m₂ ^7,3’-OGpp_CH2pG，用该类似物帽化的mRNA在体外对于通过重组人Dcp2的水解具有抗性。当引入培养的细胞中时，用m₂ ^7,3’-OGpp_CH2pG帽化的mRNA比用m₂ ^7,3’-OGpppG帽化的mRNA更为稳定。

存在两种已知的脱帽酶：Dcp1/Dcp2，其作用于完整的mRNA以起始5’→3’降解；和DcpS，其作用于由于3’→5’降解而产生的短的加帽的寡核苷酸。因为Dcp1/Dcp2或单独的Dcp2从加帽的mRNA上释放m⁷GDP，所以切割可能发生在α-和β-磷酸之间。参见Z.Wang等人,"The hDcp2protein is a mammalian mRNA decapping enzyme,"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第99卷,第12663-12668页(2002)。先前，显示了，核苷5’-单硫代磷酸以及三磷酸类似物例如ATPγS、GTPγS和GDPβS，对于磷酸酶是稳定的。参见F.Eckstein等人,"Guanosine5'-O-(2-thiodiphosphate).An inhibitor of adenylate cyclase stimulation by guanine nucleotides and fluoride ions",J.Biol.Chem.,第254卷,第9829-9834页(1979)，和D.Cassel等人，"Activation of turkey erythrocyte adenylate cyclase and blocking of the catecholamine-stimulated GTPase by guanosine5'-(gamma-thio)triphosphate",Biochem Biophys Res Commun,第77卷,第868-873页(1977)。此外，还发现包含硫代磷酸核苷酸间键合的多核苷酸比其天然对应物更缓慢地被降解。参见H.Matzura等人,"A polyribonucleotide containing alternation P＝O and P＝S linkages",Eur.J.Biochem.,第3卷,第448-452页(1968)。令人感兴趣的是，硫代磷酸的非对映异构体可以显示出不同的对于核酸酶的敏感性。核酸酶P1水解Sp非对映异构体比Rp更快。参见B.Potter等人, "Synthesis and configurational analysis of a dinucleoside phosphate isotopically chiral at phosphorus.Stereochemical course of Penicillium citrum nuclease P1reaction.",Biochemistry,第22卷,第1369-1377页(1983)。相比于Sp，核糖核酸酶T1和蛇毒磷酸二酯酶优先切割Rp非对映异构体。参见F.Eckstein等人,"Stereochemistry of the transesterification step of ribonuclease T1",Biochemistry,第11卷,第3507-3512页(1972)，和P.Burgers等人,"Absolute Configuration of the Diastereomers of Adenosine5'-O-(1-thiotriphosphate):Consequences for the stereochemistry of polymerization by DNA-dependent RNA polymerase from Escherichia coli",Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第75卷,第4798-4800页(1978)。

虽然用m₂ ^7,3’-OGpp_CH2pG帽化的mRNA在培养的细胞中更为稳定，但是它具有较低的翻译效率，推测这是因为m₂ ^7,3’-OGpp_CH2pG在体外以比m₂ ^7,3’-OGpppG显著更低的亲和力与eIF4E结合。因此，即使它在培养的细胞中更为稳定，但这个优点却被较低的翻译效率给抵消了。

J.Kowalska等人"Synthesis and properties of mRNA cap analogs containing phosphorothioate moiety in5',5'-triphosphate chain,"Nucleos.Nucleot.Nucl.Acids,第24卷,第595-600页(2005)报道了其中用S替代α、β或γ磷酸部分中的O的三种帽类似物的合成，例如m⁷Gp_sppG、m⁷Gppp_sG和m⁷Gpp_S-CH3pG。这些合成的硫代磷酸帽类似物是帽依赖性翻译的更加稳定的抑制剂，并且对于DcpS脱帽酶具有抗性。然而，无论在体外还是在体内，这些化合物并没有显示出比平常ARCA更高的翻译效率，因为它们可能在很大程度上以相反方向掺入。

存在对于这样的修饰的需要，所述修饰将可能达到更高的翻译效率和增加对于体内和体外降解的抗性。本文所报道的独特的化合物可以做到这两者。

发明内容

我们发现，在一个或多个磷酸处的S-取代连同2’-O甲基取代一起产生具有令人惊讶的性质的被称为S-ARCA的新型类似物。所述新的ARCA修饰确保，α、β和γ硫代磷酸基团在翻译和脱帽机器(machinery)中都准确地定位在帽结合蛋白的活性位点内。这些类似物中的至少一些对于Dcp1/Dcp2具有抗性。有些S-ARCA具有相比于缺乏硫代磷酸基团的相应类似物而言高得多的对于eIF4E的亲和力。当将包含各种S-ARCA的mRNA引入培养的细胞中时，有些mRNA以相比于用常规类似物m⁷GpppG合成的mRNA而言高至五倍的程度更有效地进行翻译。此外，用有些S-ARCA帽化的mRNA的半寿期长至用未修饰的帽合成的mRNA的半寿期的三倍。更有效地进行翻译的mRNA和更稳定的mRNA的组合导致在经转染的细胞中获得比使用常规的合成mRNA或者使用以早期ARCA帽化的mRNA更高的报道蛋白的总产量。S-ARCA增加了体内稳定性和令人惊讶地增加了翻译效率，这是由于与Dcp1/Dcp2抗性相组合的更高的对于eIF4E的亲和力。令人惊讶地，在生理条件下对于通过Dcp2的水解的抗性与三磷酸中的β-硫代磷酸基团相关，并且预期也与四磷酸中的γ-硫代磷酸基团相关。另一个相比于平常ARCA而言的优点是出现P-非对映异构现象，这归因于硫代磷酸部分。在当硫代磷酸部分准确地定位于α-、β-或γ-位置处时的每种情况下，仍然存在两种可能性来放置硫原子(proR和proS)，这导致获得具有可能不同的生物学活性的两种不同的非对映异构体。例如，在对应物D1和D2非对映异构体和还有用m₂ ^7,2'-OGpp_SpG(D1)帽化的mRNA之间存在有对于eIF4E的结合亲和力的显著差异，并且该D1相比于其D2对应物而言对于Dcp2易感得多。因此，可以采用非对映异构体纯的S-ARCA作为P-手性探针，其可用于研究牵涉帽的酶促工艺步骤的立体化学过程。

附图简述

图1描绘了αS-ARCA m₂ ^7,2’-OGppp_SG(D1和D2)的合成。

图2描绘了γS-ARCA m₂ ^7,2’-OGp_SppG(D1和D2)的合成。

图3描绘了βS-ARCA m₂ ^7,2’-OGpp_SpG(D1和D2)的合成。

图4描绘了四磷酸γS-ARCA，m₂ ^7,2’-OGpp_SppG(D1和D2)的合成。

图5描绘了在三磷酸桥的α和β位置处具有两个硫代磷酸部分的S-ARCA，m₂ ^7,2’-OGpp_Sp_SG(D1、D2、D3和D4)的合成。

图6A-6H描绘了用hDcp2消化的体外合成的寡核苷酸的阴离子交换HPLC分析。

图7描绘了用S-ARCA帽化的萤光素酶mRNA在HC11细胞中的衰变。

图8描绘了用S-ARCA帽化的mRNA在HC11细胞中的翻译效率。

图9A-9E描绘了用S-ARCA帽化的萤光素酶mRNA在HC11细胞中的多核糖体分布，显示为在蔗糖梯度中的沉降，通过监测260nm处的吸光度(A)，和通过使用实时PCR以显示萤光素酶mRNA(B、C和D)和GAPDH mRNA(E)的分布。

图10描绘了在用经S-ARCA帽化的mRNA对HC11细胞进行核穿孔(nucleoporation)后萤光素酶表达的时间过程。

本发明的实施方式

材料和方法

实施例1

一般的化学操作程序

使用在去离子水中的三乙基铵碳酸氢盐(TEAB)的线性梯度，在DEAD-Sephadex A-25(HCO^3-形式)柱上通过离子交换色谱法来分离开中间体核苷酸，并且在通过添加乙醇在减压下进行蒸发后，将其分离为三乙基铵盐。通过分析型或半制备型RP HPLC来分离开终产物(帽类似物)，并且在反复的冷冻干燥后，将其分离为铵盐。分析型HPLC在装备有Supelcosil LC-18-T反相柱(4.6x250mm，流速为1.3ml/分钟)的Spectra-Physics SP8800装置上进行，其中使用在pH5.9的0.05M乙酸铵缓冲液中的0-25％甲醇线性梯度，并且采用在260nm处的UV-检测。半制备型HPLC在装备有WatersHR-C-18反相柱(19x300mm，流速为5.0m/分钟)的Waters600E Multisolvent Delivery System上进行，其中使用在0.05M乙酸铵缓冲液(pH5.9)中的甲醇线性梯度，并且采用在260nm处的UV-检测。

GMP和GDP购自Sigma-Aldrich，并且通过使用Dowex50WX8离子交换树脂而转化为三乙基铵盐。如先前在J.Jemielity等人"Novel'anti-reverse'cap analogues with superior translational properties,"RNA,第9卷,第1108-1122页(2003)中所报道的那样来制备其他核苷酸，即m⁷GMP、m₂ ^7,2′-OGMP、m⁷GDP、m₂ ^7,2′-OGDP。硫代磷酸三乙基铵盐通过下列方式而从Na₃PSO₃制备：在Dowex50WX8离子交换树脂上进行转化，并且(在蒸发至干后)用贮存于-20℃的99.8％乙醇进行再度蒸发。参见J Kowalska等人“A simple and rapid synthesis of nucleotide analogues containing a phosphorothioate moiety at the terminal position of the phosphate chain”,Tetrahedron Lett.,第48卷,第5475-5479页(2007)。如先前所报道的那样来制备7-甲基鸟苷，除了使用DMF而非DMA之外(参见J.Jones等人,“Purine Nucleosides.111.Methylation Studies of Certain Naturally Occurring Purine Nucleosides”,J.Am.Chem.Soc.,第85卷,第193-201页(1963))。通过类似的操作程序，从2’-O-甲基鸟苷来合成7,2’-O-二甲基鸟苷。根据J.Kusmierek等人,“A new route to2'(3')-O-alkyl purine nucleosides”,Nucleic Acids Res.,第1卷,第73-77页,特别出版号4(1978)来制备2’-O-甲基鸟苷。

通过在RP HPLC上的再次色谱法(re-chromatography)、使用负电喷雾电离的质谱法(MS ESI-)以及¹H NMR和³¹P NMR光谱学，来确认最终化合物的结构和均一性。(结果显示在表1中)分别在399.94MHz和161.90MHz处在Varian UNITY-plus光谱仪上于25℃记录了¹H NMR和³¹P NMR谱。报告了相对于在D₂O中的3-三甲基甲硅烷基-[2,2,3,3-D4]-丙酸钠(TSP)(作为内标)的¹H NMR化学位移。报告了相对于在D₂O中的20％磷酸(作为外标)的³¹P NMR化学位移。使用负电喷雾电离(ESI-)，在Micromass QToF1MS光谱仪上记录了质谱。

实施例2

用于核苷酸的N-酰化咪唑(imidazolide)衍生物(GMP-Im、m₂ ^7,2’-OGMP-Im、GDP-Im和m₂ ^7,2’-OGDP-Im)(7、8和12-15)的一般操作程序

参见T.Mukaiyama等人"Phosphorylation by oxidation-reduction condensation.Preparation of active phosphorylating reagents",M.Bull.Chem.Soc.Jpn,第44卷,2284(1971)。在DMF(约2.5ml/100mg核苷酸)中混合合适的核苷酸(1当量的TEA盐)、咪唑(8当量)和2,2’-联硫基二吡啶(3当量)。添加三乙胺(2当量)和三苯膦(3当量)，并搅拌混合物6-8小时。用溶解在干燥的丙酮(约8ml/1ml DMF)中的无水高氯酸钠(1当量/一个负电荷)从反应混合物中沉淀出产物。在冷却至4℃后，过滤沉淀物，用冷的干燥的丙酮反复洗涤，并在真空中通过P₄O₁₀进行干燥。产率为80-100％。在m⁷GMP的情况下，由于其较低的在DMF中的溶解度，使用2倍过量的试剂，并且将反应时间延长至24小时。

实施例3

用于核苷5′-O-硫代磷酸(9-11)的一般操作程序

将合适的核苷(1当量，在真空中通过P₄O₁₀过夜干燥)在磷酸三甲酯(1.5ml/100mg核苷)中的悬浮液在冰/水浴上冷却至0℃。添加 2,6-二甲基吡啶(3当量)和PSCl₃(1.5当量)。反应在0℃下维持过夜，然后用0.35M TEAB猝灭并在室温下搅拌1小时。使用0-0.7M TEAB的线性梯度，通过DEAE Sephadex色谱法来分离开产物。产率：(9)380mg(0.67mmol)，从257mg(0.91mmol)鸟苷开始(74％)；(10)57mg(0.10mmol)，从120mg(0.42mmol)7-甲基鸟苷开始(24％)；(11)75mg(0.13mmol)，从70mg(0.23mmol)7,2′-O-二甲基鸟苷开始(53％)。

实施例4

核苷5′-(2-O-硫代二磷酸)的合成

7,2′-O-二甲基鸟苷5’-O-(2-硫代二磷酸)(17)。向14(100mg，0.21mmol)和硫代磷酸三乙基铵盐(220mg)在5ml DMF中的悬浮液之中添加无水ZnCl₂(190mg，1.40mmol)。将所得的溶液在室温下搅拌20分钟。通过添加EDTA(520mg，1.40mmol)在50ml水中的溶液来猝灭反应，并用固体NaHCO₃进行中和。使用0-1.0M的TEAB梯度，在DEAE Sephadex上分离产物。产率：106mg(0.15mmol)的(17)，作为TEA盐(71％)。

7-甲基鸟苷5′-O-(2-硫代二磷酸)(16)。如对于(17)所描述的那样，从(13)(40mg，0.089mmol)和硫代磷酸三乙基铵盐(100mg)开始来合成该化合物。产率：31mg(0.046mmol)的(16)，作为TEA盐(52％)。

实施例5

帽S-ARCA的合成

下面是对于各种帽S-ARCA的合成的描述。合成途径描绘在图1、2和3中。(数字)是指在图1、2和3中进行编号的化合物。

m⁷Gppp_sG D1和D2(1a，1b)。向(9)(10mg，0.018mmol)和7(15mg，0.027mmol)在DMF(0.8ml)中的悬浮液之中添加无水ZnCl₂(30mg，0.22mmol)。反应在室温下维持2天。通过添加在10ml水中的90mg EDTA来猝灭反应，并用固体NaHCO₃进行中和。通过分析型RP HPLC来分离开非对映异构体(1a)和(1b)。产率：0.8mg(1a)和1.0mg(1b)，作为NH₄ ⁺盐。合成的流程图显示在图1中。

m⁷Gpp_spG D1和D2(2a，2b)。如对于1所描述的那样，从在2ml DMF中的16(20mg，0.030mmol)、15(23mg，0.053mmol)、ZnCl₂(60mg，0.44mmol)开始来合成该化合物。产率：2.2mg(2a)和1.8mg(2b)，作为NH₄ ⁺盐。合成的流程图显示在图3中。

m⁷Gp_sppG D1和D2(3a，3b)。如对于(1)所描述的那样，从在3.5ml DMF中的(10)(58mg，0.090mmol)、(12)(120mg，0.22mmol)、ZnCl₂(249mg，1.8mmol)开始来合成该化合物。产率：14.7mg(3a)和10.1mg(3b)，作为NH₄ ⁺盐。合成的流程图显示在图2中。

m₂ ^7,2′-OGppp_sG D1和D2(4a，4b)。将化合物(9)(48mg，0.084mmol)和(8)(57mg，0.10mmol)悬浮在2ml DMF中。随后，添加无水ZnCl₂(115mg，0.84mmol)。将所得的溶液在室温下维持2天。通过添加在30ml水中的350mg EDTA来猝灭反应，并用固体碳酸氢钠进行中和。在45分钟内，使用在0.05M乙酸胺(pH＝5.9)中的0-50％的甲醇线性梯度，通过半制备型RP HPLC来分离开产物。产率：5.2mg(4a)和7.4mg(4b)，作为NH₄ ⁺盐。合成的流程图显示在图1中。

m₂ ^7,2′-OGpp_spG D1和D2(5a，5b)。如对于(4)所描述的那样，从在5ml DMF中的(17)(106mg，0.16mmol)、(15)(103mg，0.24mmol)和ZnCl₂(260mg，1.9mmol)开始来合成该化合物。用在100ml水中的800mg EDTA来猝灭反应，并用固体碳酸氢钠进行中和。使用等度的0.05M乙酸铵(pH＝5.9)，通过半制备型RP HPLC来分离开产物。产率：10.0mg(5a)和12.1mg(5b)，作为NH₄ ⁺盐。合成的流程图显示在图3中。

m₂ ^7,2′-OGp_sppG D1和D2(6a，6b)。如对于(4)所描述的那样，从在3ml DMF中的(11)(70mg，0.15mmol)、(12)(107mg，0.20mmol)和无水ZnCl₂(220mg，1.6mmol)开始来合成该化合物。用在70ml水中的650mg EDTA来猝灭反应。在45分钟内，使用在0.05M乙酸铵(pH＝5.9)中的0-50％的甲醇线性梯度，通过半制备型RP HPLC来分离开产物。产率：15mg(6a)和20mg(6b)，作为NH₄ ⁺盐。合成的流程图显示在图2中。

通过在RP HPLC上的再次色谱法(re-chromatography)、使用负电喷雾电离的质谱法(MS ESI-)以及¹H NMR和³¹P NMR光谱学，来确认上述最终化合物的结构和均一性。结果显示在下表1中。

表1

相对于内标3-三甲基甲硅烷基-[2,2,3,3-²H₄]-丙酸钠的以百万分率表示的¹H NMR化学位移(±0.01)以及相对于外标H₃PO₄的以百万分率表示的³¹P NMR化学位移(±0.01)

实施例6

四磷酸S-ARCA的合成

通过m₂ ^7,2'-OGpp_SppG的合成显示了用于合成含有5',5'-四磷酸桥的S-ARCA的所开发出的策略的效用(图4)。通过类似的方法可得到三种其他四磷酸S-ARCA(即，m₂ ^7,2'-OGp_SpppG、m₂ ^7,2'-OGppp_SpG、m₂ ^7,2'-OGpppp_SG)的合成。

m₂ ^7,2′-OGpp_sppG(D1和D2)

将7,2’-O-二甲基鸟苷5’-(硫代二磷酸)(20mg，0.029mmol)和鸟苷5’-二磷酸N-酰化咪唑(30mg，0.056mmol)悬浮在2ml DMF中。随后，添加无水ZnCl₂(61mg，0.45mmol)。在室温下搅拌所得的溶液3天。通过添加在20ml水中的EDTA(166mg，0.45mmol)来猝灭反应，并用固体碳酸氢钠进行中和。使用0-1.2M的TEAB梯度，通过离子交换DEAE Sephadex色谱法来分离开产物。收集包含 m₂ ^7,2’-OGpp_SppG的非对映异构体混合物的级分，倒在一起，并在减压下通过反复添加乙醇来进行蒸发。在60分钟内，使用在0.05M乙酸铵(pH＝5.9)中的0-25％甲醇线性梯度，通过半制备型RP HPLC来达到最后的纯化。产率：7mg m₂ ^7,2′-OGpp_sppG(非对映异构体混合物)，作为NH₄ ⁺盐。

MS ESI(-):关于C₂₂H₃₀N₁₀O₁₇P₃S的计算值:897.02；测定值:879.09

D1:¹H NMR:δ(ppm)9.14(1H,s)8.08(1H,s),5.99(1H,d),5.813(1H,d)；4.70(1H；t),4.64(1H,t),4.54(1H,t),4.45(1H,m),4.35(2H,m),4.29(3H,m),4.07(3H,s),3.60(3H,s)；³¹P NMR:δ30.2(1P,t,Pγ),-11.1(1P,dd,Pδ),-11.9(1P,dd,Pα),-23.8(1P,d,Pβ)

D2:¹H NMR:δ(ppm)9.16(1H,s)8.08(1H,s),6.03(1H,d),5.83(1H,d)；4.70(1H；t),4.60(1H,t),4.54(1H,t),4.45(1H,m),4.35(2H,m),4.29(3H,m),4.07(3H,s),3.58(3H,s)；³¹P NMR:δ30.2(1P,t,Pγ),-11.1(1P,dd,Pδ),-11.9(1P,dd,Pα),-23.8(1P,d,Pβ)

实施例7

具有两个硫代磷酸部分的S-ARCA的合成

所开发出的策略还提供了用于合成在5',5'-多磷酸桥中含有多个硫代磷酸部分(这可以通过图5中所建议的合成路线来达到)的化合物(例如，化合物m₂ ^7,2'-OGpp_Sp_SG)的方法。将与先前对于腺苷5′-O-硫代磷酸的N-酰化咪唑衍生物所报道的操作程序[M.Shimazu等人,"Regio-and stereocontrolled synthesis of2'-5'-linked phosphorothioate oligoadenylates by uranyl ion catalyst in aqueous solution",J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1,2002,1778-1785]相类似地来制备鸟苷5′-O-硫代磷酸的N-酰化咪唑衍生物，并用三乙基铵碳酸氢盐的线性梯度(在去离子水中的0至0.5M TEAB)在DEAE Sephadex A-25上进行纯化。关于该合成的描绘显示在图5中。

鸟苷5'-O-(1,2-二硫代二磷酸)。将鸟苷5'-O-单硫代磷酸的N-酰化咪唑衍生物(三乙基铵盐，53mg，0.1mmol)与硫代磷酸三乙基铵盐(320mg，约1.2mmol)相混合，并将所得的混合物悬浮在3.5mL DMF中。随后，添加无水氯化锌(55mg，0.4mmol)和氯化锰(50mg，0.4mmol)。通过添加EDTA溶液(270mg，0.8mmol，在35mL水中)来猝灭反应，并用碳酸氢钠调至pH7。用三乙基铵碳酸氢盐的线性梯度(在去离子水中的0至0.9M TEAB)，在DEAE-Sephadex A-25柱上进行色谱法分离。收集包含鸟苷5'-O-(1,2-二硫代二磷酸)的级分并通过添加乙醇在减压下进行蒸发，并且将所得的固体在真空中通过P₄O₁₀进行干燥。

m₂ ^7,2'-OGpp_Sp_SG。将7,2'-O-二甲基鸟苷5′-O-单磷酸的N-酰化咪唑衍生物(钠盐，23mg，0.05mmol)与鸟苷5'-O-(1,2-二硫代二磷酸)(三乙基铵盐，39mg，0.05mmol)相混合，并将所得的混合物悬浮在1.5mL DMF中。随后，添加无水氯化锌(55mg，0.4mmol)。通过添加EDTA溶液(135mg，0.4mmol，在20mL水中)来猝灭反应，并用碳酸氢钠调至pH7。m₂ ^7,2'-OGpp_Sp_SG非对映异构体(D1、D2、D3、D4)的色谱法分离和分开通过半制备型RP HPLC来进行。

实施例8

细胞培养

HC11乳腺上皮细胞以克隆方式衍生自COMMA-1D小鼠乳腺细胞系。参见，K.Danielson等人,"Epithelial mouse mammary cell line exhibiting normal morphogenesis in vivo and functional differentiation in vitro,"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第81卷,第3756-3760页(1984)。细胞在含有10％牛生长血清(HyClone)、5μg/ml牛胰岛素(Sigma)、10ng/ml重组EGF(BD Biosciences)的RPMI1640培养基中进行生长。

实施例9

mRNA的体外合成

在所有四种核苷三磷酸和不同的帽二核苷酸存在下，用T7聚合酶在编码萤光素酶的质粒(pluc-A₆₀)存在下通过体外转录来合成加帽的RNA。参见J.Jemielity等人,"Novel'anti-reverse'cap analogues with superior translational properties,"RNA,第9卷,第1108-1122页(2003)。典型的转录反应包含40mM Tris-HCl(pH7.9)、6mM MgCl₂、2mM亚精胺、10mM DTT、0.1mg/ml BSA、1U/μl的RNasin(Promega)、0.5mM ATP、0.5mM CTP、0.5mM UTP、0.1mM GTP、1mM帽类似物、15μg/ml DNA和1U/μl的T7聚合酶(Promega)。pluc-A₆₀(其包含有在pGEM4(Promega)中的整个萤火虫萤光素酶编码序列和3’-末端的60-nt poly(A)束(tract)(参见E.Grudzien等人,"Differential inhibition of mRNA degradation pathways by novel cap analogs,"J.Biol.Chem.,第281卷,第1857-1867页(2006))用HpaI进行消化以合成萤光素酶mRNA，并且用NcoI进行消化以合成加帽的寡核苷酸。

在10μCi/μl的[α-³²P]GTP(ICN)存在下，在于37℃温育45分钟的50-μl反应混合物中合成短RNA(约48nt的加帽的寡核苷酸)。用苯酚和氯仿对反应混合物进行提取，然后根据制造商的实验方案，使用旋转柱(spin column)(Ambion)将RNA与未掺入的核苷酸分离开。通过契仑科夫(Cerenkov)计数法来测定mRNA的浓度，其中将最终转录反应混合物中[α-³²P]GTP的比放射性活度用于使cpm转换为pmol。

在于37℃温育45分钟的200-μl反应混合物中合成mRNA。温育后，将200-μl反应混合物在37℃下用3个单位的DNA酶RQ1(Promega)处理20分钟，并使用制造商的实验方案，用RNeasy小型试剂盒(Qiagen)来纯化RNA。采用分光光度测定法来测定RNA的浓度。

实施例10

体外RNA脱帽测定法

使用加帽的48-nt寡核苷酸(萤光素酶mRNA的截短形式(48个核苷酸))作为底物来测量Dcp2活性。在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达GST-hDcp2并进行纯化，如Z.Wang等人,"The hDcp2protein is a mammalian mRNA decapping enzyme,"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第99卷,第12663-12668页(2002)所描述的。首先使加帽的寡核苷酸在37℃下在脱帽缓冲液(10mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM乙酸钾、2mM乙酸镁、0.5mM MnCl₂、2mM二硫苏糖醇和0.1mM精胺)中经历使用GST-hDcp2来进行的消化2小时。参见C.Piccirillo 等人,"Functional characterization of the mammalian mRNA decapping enzyme hDcp2,"RNA,第9卷,第1138-1147页(2003)。然后，将反应混合物用等体积的苯酚提取一次和用氯仿提取两次，并且用乙醇来沉淀出RNA。将脱帽反应的产物进一步用核糖核酸酶的混合物(RiboShredder；Epicentre)在37℃下消化1小时。产物在4.6×250-mm Partisil10SAX/25柱(Whatman)上通过阴离子交换HPLC进行解析。梯度的组成如下：水，1分钟；至112mM KH₂PO₄的线性梯度(pH4.5)，20分钟；112-450mM KH₂PO₄的线性梯度，15分钟；450mM至1.5M KH₂PO₄的线性梯度，15分钟；和以1.5M KH₂PO₄的等度洗脱，9分钟；全部以1ml/分钟的流速。

实施例11

在HC11细胞中的翻译效率和mRNA衰变的测量

使用两种方法(电穿孔和核穿孔)来将RNA递送入细胞中。在电穿孔的情况下，用Bio-Rad Genepulser^TM设备，以0.22kV和960μF，在Gene pulser杯池(cuvette)(4mm间隙)中，在总体积400μl的血清减少的RPMI1640培养基中，将5μg RNA引入10⁷个HC11细胞中。在放电后，细胞用PBS洗涤两次，在室温下以300×g离心2分钟，重悬浮在预热的完全培养基中，并放置于37℃。根据制造商的建议，用Amaxa Nucleofector II(Amaxa Biosystems)来进行核穿孔。使用Nucleofector溶液V和一套所建议的方案(程序T-024)，将1 微克的RNA引入10⁶个HC11细胞中。

为了测量翻译效率，将细胞划分入几个Eppendorf管中，放置在37℃的水浴中，并摇动。为了测量mRNA稳定性，将细胞分配入35-mm细胞培养皿中，并且放置于37℃和在5％CO₂潮湿气氛中。在各个不同的时间处收获细胞，并用PBS洗涤两次。

为了细胞质RNA的提取，在175μl裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.0)、140mM NaCl、1.5mM MgCl₂、0.5％(v/v)Igepal(Sigma)和1mM二硫苏糖醇)中裂解2×10⁵个细胞。RNA用RNeasy小型试剂盒来进一步进行纯化。为了蛋白质的提取，在200μl萤光素酶细胞培养物裂解试剂(Promega)中裂解2×10⁵个细胞。根据制造商的实验方案(Promega)，测量细胞提取物的萤光素酶活性。

实施例12

多核糖体的制备

为了分离开核糖体亚基和起始复合物，用包含0.1mg/ml放线菌酮的冰冷的PBS处理4×10⁶个HC11细胞2分钟，用相同的培养基洗涤两次，并且在600μl的0.3M NaCl、15mM Tris-HCl(pH7.6)、15mM MgCl₂、1％Triton X-100、1mg/ml肝素和0.1mg/ml放线菌酮中进行裂解。在以14,000×g离心10分钟后，将上清液铺层在15-45％蔗糖梯度(在相同的但缺少Triton X-100的缓冲液中)上，并且在Beckman SW41Ti转子中于4℃以38,000rpm离心2小时。通过连续监测在260nm处的吸光度来使梯度分级分离。从每个级分(1ml)中分离出RNA，并通过实时PCR来进行分析。

实施例13

实时PCR

为了测量mRNA稳定性，将从HC11细胞中分离并用RNeasy小型试剂盒(Qiagen)纯化的约2μg每种总RNA样品在37℃下用3个单位的DNA酶RQ1(Promega)处理20分钟。在包含5.5mM MgCl₂、 500μM每种dNTP、2.5μM随机六聚体、0.2个单位的RNA酶抑制剂和0.8个单位的MultiScribe反转录酶(Applied Biosystems)的20-μl反应混合物中对400ng RNA进行反转录。将反应混合物于25℃温育10分钟，于48℃温育30分钟，和于95℃温育5分钟。使用以Beacon Designer工具(Bio-Rad)对于每种mRNA而设计的特异引物来进行定量实时PCR。关于检测萤光素酶mRNA的5’-末端的序列，引物为5’-CGTTCGGTTGGCAGAAGCTA-3’(SEQ ID NO:1)和5’-ACTGTTGAGCAATTCACGTTCATT-3’(SEQ ID NO:2)。从帽结构至3’-末端同聚物束的开始处，萤光素酶mRNA由1714个核苷酸组成。这些引物扩增出核苷酸226-398。使用引物5’-CAATGTGTCCGTCGTGGATCT-3’(SEQ ID NO:3)和5’-GAAGAGTGGGAGTTGCTGTTGA-3’(SEQ ID NO:4)，通过相同的方法和在相同的RNA样品中测量小鼠GAPDH mRNA水平。

用iCycler IQ实时PCR检测系统，在包含5μl转录反应混合物(50ng cDNA)、12.5μl IQ SYBRgreen Supermix和0.3mM引物(Bio-Rad)的25-μl反应混合物中进行扩增和检测。温育条件是在95℃下3分钟以用于聚合酶活化，以及在95℃下15秒和在60℃下1分钟的40个循环。

使用如在关于ABI Prism7700Sequence Detection System的第2号用户公报中所描述的绝对标准曲线方法来计算萤光素酶mRNA水平。在从标准曲线计算出萤光素酶mRNA的量后，将其对于每个样品中小鼠GAPDH mRNA的量进行标准化。将在每个时间点处存留的萤光素酶mRNA的量转换为在零时存在的RNA的百分比，并将结果以“log₁₀([RNA])对时间”的形式进行作图以测定半寿期。为了分析来自多核糖体梯度的RNA，在RNA分离之前，向每个级分中添加体外合成的GFP mRNA作为内标以检验RNA产量的变化。使用GFP mRNA水平来使萤光素酶和GAPDH mRNA的水平标准化。

实施例14

对于eIF4E的结合亲和力

通过荧光猝灭来测定S类似物对于鼠类eIF4E的结合亲和力。在LS-50B分光荧光计(Perkin Elmer Co.)上，于20.0±0.2℃，在50mM HEPES/KOH(pH7.2)、100mM KCl、0.5mM EDTA、1mM DTT中进行荧光滴定测量。向1.4ml的0.1蛋白质溶液中添加1μl浓度递增的帽类似物溶液的等份试样。考虑到样品稀释和内滤效应，对荧光强度(用2.5nm带宽在280nm处进行激发，和用4nm带宽和290nm截止滤光片在337nm处进行检测)进行修正。通过将荧光强度对于帽类似物总浓度的理论依赖性(theoretical dependence)与根据先前所描述的方程(参见A.Niedzwiecka等人,“Biophysical studies of eIF4E cap-binding protein:recognition of mRNA5'cap structure and synthetic fragments of eIF4G and4E-BP1proteins,”J.Mol.Biol.,第319卷,第615-635页(2002))的实验数据点相拟合，来测定平衡缔合常数(K_AS)。将蛋白质浓度作为显示“活性”蛋白质的量的平衡方程的自由参数进行拟合。将最终的K_AS计算为3至10次独立滴定的加权平均值，其中将所述权重作为数值标准差平方的倒数。使用ORGIN6.0(Microcal Software Inc.,USA)来进行数值非线性最小二乘回归分析。根据标准方程ΔG°＝-RTlnK_AS，从K_AS值来计算结合的吉布斯自由能。

实施例15

通过人和秀丽隐杆线虫(C.elegans)DcpS来进行的酶促水解

根据先前所描述的操作程序(L.S.Cohen等人,“Nematode m7GpppG and m3(2,2,7)GpppG decapping:activities in Ascaris embryos and characterization of C.elegans scavenger DcpS,”RNA,第10卷,第1609-1624页(2004))，在大肠杆菌中表达人和线虫DcpS。这两种蛋白质都于-80℃在含有50mM KCl、0.2mM EDTA、1mM DTT、0.5mM PMSF和20％甘油的20mM Tris缓冲液(pH7.5)中进行贮存。在37℃下，用5.0或7.0μl的在500μl含有20mM MgCl₂ 和60mM(NH₄)₂SO₄的50mM TRIS缓冲液(pH＝7.9)中的DcpS(分别来自人或秀丽隐杆线虫)处理浓度为1mM的合适的帽类似物60-90分钟。每15-20分钟从反应混合物中收集100μl样品，并通过在90℃下温育3分钟来使其失活。不经进一步处理，通过分析型RP HPLC来分析所收集的样品，其中在15分钟内使用在0.1M KH₂PO₄(pH＝6.0)中的0-50％甲醇线性梯度，并在260nm处进行UV-检测。

实施例16

帽依赖性翻译的抑制

将经微球菌核酸酶处理的兔网织红细胞裂解物用于体外翻译(A.Cai等人,“Quantitative assessment of mRNA cap analogues as inhibitors of in vitro translation,”Biochemistry,第38卷,第8538-8547页(1999))。在100mM乙酸钾和1.4mM氯化镁时，取得最佳的帽依赖性翻译。为了测定由各种帽类似物引起的翻译的抑制，以5μg/ml的浓度向裂解物中添加天然的兔珠蛋白mRNA，并通过[³H]Leu的掺入来测量蛋白质合成。如先前所描述的(Cai等人，1999)，进行K_I数据的标准化。使用λ＝255nm和ε_M＝22.6×10^-3M，在pH7.0下通过UV吸收来测量二核苷酸帽类似物溶液的浓度。

结果

实施例17

帽类似物的合成

导致获得在三磷酸链的α、γ和β位置处拥有硫代磷酸基团的类似物的合成途径分别描绘在图1、2和3中。

我们合成了一系列的6种帽类似物，其在5’,5’-三磷酸链的α、β或γ位置处携带有单个硫代磷酸部分。(参见下文)。由于致立体性(stereogenic)P-中心的存在，每种S-类似物以两种非对映异构体(根据它们在RP HPLC期间的洗脱顺序而命名为D1和D2)的混合物形式而获得。通过RP HPLC成功地对每种S-类似物进行了拆分，从而提供了12种化合物，随后对这12种化合物在生物物理学和生物化学方面进行了表征。这些S-类似物中的6种包含ARCA修饰，即在m⁷Guo部分中的2′-O-甲基，并因此称为S-ARCA。在β位置处引入硫代磷酸基团产生了对于Dcp2的抗性，增加了半寿期，和改善了翻译效率。

n.a.-未指定

S-ARCA的该化学合成是最初对于具有未修饰的5’,5’-多磷酸桥的帽类似物所开发的化学合成的修改形式。参见M.Kadokura等人,"Efficient synthesis ofγ-methyl-capped guanosine5'-triphosphate as a5'-terminal unique structure of U6RNA via a new triphosphate bond formation involving activation of methyl phosphorimidazolidate using ZnCl₂as a catalyst in DMF under anhydrous conditions,"Tetrahedron Lett.,第38卷,第8359-8362页(1997)；J.Stepinski等人,"Synthesis and properties of mRNAs containing the novel"anti-reverse"cap analogues7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and7-methyl(3'-deoxy)GpppG,"RNA,第7卷,第1486-1495页(2001)；和J.Jemielity等人,"Novel'anti-reverse'cap analogues with superior translational properties,"RNA,第9卷,第1108-1122页(2003)。将两个单核苷酸种类(其中之一首先转化为反应性N-酰化咪唑衍生物)在DMF中进行偶联。通过8倍过量的ZnCl₂来促进反应，所述8倍过量的ZnCl₂显著地改善反应物在有机介质中的溶解度，防止N-酰化咪唑衍生物的水解，和加速反应速率。在该合成中的重要步骤是在DMF中在ZnCl₂存在下合适的N-酰化咪唑衍生物与核苷5’-硫代磷酸或核苷5’-(2-硫代二磷酸)的偶联。在类似的、最近开发出的反应(其采用硫代磷酸阴离子(PSO₃ ^3-)作为亲核体)中有效地获得中间体核苷5’-(2-硫代二磷酸)。参见J.Kowalska等人,“A simple and rapid synthesis of nucleotide analogues containing a phosphorothioate moiety at the terminal position of the phosphate chain”,Tetrahedron Lett,第48卷,2007,5475-5479。我们所开发出的反应策略使得能够在多磷酸链的所选位置处引入硫代磷酸部分，以及产生中间体核苷5’-(2-硫代二磷酸)。

如上文所显示的和如在权利要求书中所使用的，称为“α”的磷酸部分是对于7-甲基鸟苷部分来说最远端的磷酸部分。称为“β”的位置是在朝向7-甲基鸟苷部分移动的方向上的下一个磷酸，和称为“γ”的位置是在朝向7-甲基鸟苷部分移动的方向上的下一个磷酸。在三磷酸ARCA中，如上文所显示的，“γ”是最靠近7-甲基鸟苷部分的磷酸。在四磷酸ARCA中，“δ”磷酸将“γ”与7-甲基鸟苷相隔开。(在没有7-甲基鸟苷部分的ARCA中，将会理解，应当修改前面的定义以换而涉及具有这样的位置的部分，即该位置类似于在本文所给出的实施例中的7-甲基鸟苷的位置)。

导致获得在5′,5′-三磷酸桥的α-位置处经修饰的类似物1和4(即，m⁷Gppp_SG和m₂ ^7,2′-OGppp_SG)的合成途径描绘在图1中。在这两个最后的偶联反应中，都使用了1.5至2倍过量的磷酸N-酰化咪唑(phosphorimidazolide)以确保核苷5′-硫代磷酸的完全消耗。偶联稳步地进行，这导致在1-2天内几乎完全消耗掉底物。在γ位置处经修饰的类似物3和6(即，m⁷Gp_SppG和m₂ ^7,2′-OGp_SppG)的合成(描绘在图2中)与上文所描述的相似。在每种情况下，如图2中所显示的那样，通过RP HPLC来指示两种非对映异构体的形成。中间体核苷5′-硫代磷酸9、10和11经过合适的核苷的硫代磷酸化来合成，所述硫代磷酸化于0℃在2,6-二甲基吡啶存在下在磷酸三甲酯中通过PSCl₃来进行，类似于先前报道的操作程序(J.R.Moran等人,“A practical enzymatic synthesis of(S[P])-adenosine5'-O-(1-thiotriphosphate)((S[P])-ATP-á-S),”J.Org.Chem.,第49卷,第704-706页(1984))。在化合物10和11的情况下，N7位处的甲基化必须在硫代磷酸化步骤之前在核苷阶段进行，这是因为否则甲基碘优先使硫原子烷基化(未发表的发现)。通过采用2,2′-联硫基二吡啶/三苯膦活化体系，经过与咪唑的反应而容易地达到将核苷5′-二磷酸转化为其N-酰化咪唑衍生物(7、8和12-15)(T.Mukaiyama等人,“Phosphorylation by oxidation-reduction condensation.Preparation of active phosphorylating reagents,”Bull.Chem.Soc.Jpn.,第44卷,第2284页(1971))。如图3中所描绘的那样，合成在β-位置处经修饰的类似物，即m⁷Gpp_SpG(2)和m₂ ^7,2′-OGpp_SpG(5)。最终的偶联的HPLC分析揭示了两种P-非对映异构体的形成。但是，它们的保留时间非常相似。为了获得中间体核苷5′-O-(2-硫代二磷酸)16和17，我们采用了最近开发出的在核苷5′-单磷酸N-酰化咪唑和作为亲核体的硫代磷酸(PSO₃ ^3-)三乙基铵盐之间的偶联反应(J.Kowalska等人,“A simple and rapid synthesis of nucleotide analogues containing a phosphorothioate moiety at the terminal position of the phosphate chain”,Tetrahedron Lett,第48卷,2007,5475-5479)。

在所有导致获得帽类似物1-6的反应中，HLPC分析都揭示，作为主要产物形成了所希望的化合物，只有适度量的副产物。尽管如此，制备性的产量令人惊讶地低于由HPLC所指示的那些，在总体10-20％的范围内。这可能是由于在长时间的通过RP HPLC来分离开非对映异构体的过程中材料的大量损失所致，RP HPLC在许多情况下重复进行以便获得非对映异构体纯的样品。

实施例18

体外脱帽反应

我们就通过重组hDcp2的水解而测试了用任一种S-ARCA帽化的寡核苷酸，以测试用m₂ ^7,2’-OGppp_SG和m₂ ^7,2’-OGpp_SpG的各种非对映异构体帽化的mRNA在它们对于通过Dcp1/Dcp2的切割的敏感性方面是否不同。一般地，参见，Z.Wang等人,"The hDcp2protein is a mammalian mRNA decapping enzyme,"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第99卷,第12663-12668页(2002)；和Z.Wang等人,"An mRNA Stability Complex Functions with Poly(A)-Binding Protein To Stabilize mRNA In Vitro",Mol.Cell.Biol.,第19卷,第4552-4560页(1999)。所使用的帽类似物在最初是未标记的，因此为了追踪消化反应的产物，我们在[α-³²P]GTP和DNA模板(其中G是在启动子之后指定的第一个核糖核苷酸)存在下合成了加帽的寡核苷酸。用所述S-ARCA中的任一种帽化的寡核苷酸经历体外Dcp2消化，之后用核糖核酸酶混合物(来自Epicenter的RiboShredder)进一步消化所述产物。通过最近邻转移(nearest-neighbor transfer)，在核糖核酸酶消化后，在G残基的5’-侧处的任意核苷酸获得³²P-标记的3’-磷酸基团。然后，使用阴离子交换色谱法将在RNA中的内部位置处的经标记的3’-核苷单磷酸(3’-NMP*)与经标记的5’-末端产物解析开(图6)。后者分别包括源自未帽化的转录物的p₃Gp*和m₂ ^7,2’-OGp₃Gp*(当使用m₂ ^7,2’-OGp₃G时)，或者由对于酶促切割具有抗性或不具有抗性的帽化的RNA而产生的pGp*。所使用的所有帽类似物是ARCA，其确保它们仅以正确的方向掺入RNA中。这进一步保证了，在核糖核酸酶处理后只观察到一种5’-末端产物(m₂ ^7,2’-OGp₃Gp*)。未帽化的RNA不是Dcp2的底物，这解释了为什么在Dcp2消化后观察到p₃Gp*产物。

为了确定哪些帽类似物保护mRNA免于hDcp2切割，我们用重组hDcp2消化加帽的、³²P-标记的短RNA，其中采用这样的条件，即在所述条件下(i)用m₂ ^7,2’-OGp₃G帽化的寡核苷酸完全被hDcp2消化(图6A)，和(ii)用m₂ ^7,3’-OGpp_CH2pG帽化的寡核苷酸具有抗性(图6B)。先前显示，m₂ ^7,3’-OGpp_CH2pG保护mRNA免于hDcp2降解。参见E.Grudzien等人,"Differential inhibition of mRNA degradation pathways by novel cap analogs,"J.Biol.Chem.,第281卷,第1857-1867页(2006)。我们发现，只有m₂ ^7,2’-OGpp_SpG的D2异构体使RNA对于hDcp2水解保持稳定(图6F)。用m₂ ^7,2’-OGppp_SG和m₂ ^7,2’-OGp_SppG的异构体帽化的寡核苷酸不显示在对于hDcp2的稳定性方面的增加(图6C、6D、6G和6H)。

实施例19

用硫代磷酸帽类似物帽化的mRNA的5’降解

由于用m₂ ^7,2’-OGpp_SpG(D2)帽化的短RNA对于hDcp2水解具有抗性，我们预测，该帽类似物的存在会影响细胞中mRNA的稳定性。我们使用核穿孔或电穿孔来将合成的萤光素酶mRNA引入HC11小鼠乳腺上皮细胞中。这些方法允许几乎紧接在放电后，就测量细胞中的萤光素酶合成和萤光素酶mRNA水平。对于电穿孔，我们使用先前优化的条件。参见E.Grudzien等人，"Differential inhibition of mRNA degradation pathways by novel cap analogs,"J.Biol.Chem.,第281卷,第1857-1867页(2006)。对于核穿孔，我们遵循由Amaxa Biosystems建议的条件(参见“材料和方法”)。由于Amaxa实验方案给出了最高的转染效率以及还有最高的细胞生存力，因而其被用于本文所描述的大多数实验。

在体外合成了包含各种5’-末端帽和3’-末端60-nt poly(A)束的萤光素酶mRNA(Luc-A₆₀)。在核穿孔后，以直至90分钟的间隔取出细胞以便测量翻译效率，其中使用萤光素酶活性增加的速率；或者以直至8小时的间隔取出细胞以通过实时PCR来测量萤光素酶mRNA稳定性。如果从包含经翻译的和未翻译的mRNA两者的细胞中回收mRNA，那么翻译效率和mRNA稳定性的测定可能会是错误的。为了解决这个问题，我们测定了总胞质mRNA的降解速率，相比于多核糖体mRNA。将用m₂ ^7,2’-OGp₃G帽化的萤光素酶mRNA核穿孔入HC11细胞中，然后在各个不同时间处裂解所述细胞并且铺层在蔗糖梯度上以将多核糖体与起始复合物分离开。合并多核糖体级分，并纯化RNA。为了追踪胞质mRNA降解，我们使用从总细胞提取物中分离出的mRNA。在这两种情况下，均使用针对荧光素酶mRNA的5’-末端的引物对，通过实时PCR来定量萤光素酶mRNA。

与多核糖体相联合的转录物以大约与总胞质mRNA相同的速率被降解(数据未显示)。这暗示，即使在任何给定时间处存在经翻译的和未翻译的荧光素酶mRNA池(pool)，但mRNA在它们之间自由交换。该观察结果验证了翻译效率和降解速率的测量结果。

在核穿孔入HC11细胞中后，测定了用各种S-ARCA帽化的Luc-A₆₀的稳定性。通过实时PCR测定了在各个不同时间处存留在细胞中的mRNA。用m₂ ^7,2’-OGpp_SpG(D2)帽化的Luc-A₆₀(t_1/2＝257分钟)比用天然帽m⁷Gp₃G(t_1/2＝86分钟)或亲本化合物m₂ ^7,2’-OGp₃G(t_1/2＝155分钟)帽化的mRNA更为稳定(图7和表2)。这暗示，mRNA稳定性的增加是由于对于通过Dcp1/Dcp2的水解的抗性而引起的。m₂ ^7,2’-OGppp_SG(D1)(t_1/2＝169分钟)和m₂ ^7,2’-OGpp_SpG(D1)(t_1/2＝185分钟)都没有赋予比m₂ ^7,2’-OGp₃G(t_1/2＝155分钟)显著更大的稳定性(表2)。值得注意的是，m₂ ^7,2’-OGppp_SG(D1)和m₂ ^7,2’-OGpp_SpG(D1)对于eIF4E的亲和力都为m₂ ^7,2’-OGp₃G的3倍。人们可能预期，用这些类似物帽化的mRNA将会更稳定，如果关于eIF4E和Dcp1/Dcp2之间的竞争的假说是正确的话。参见E.Grudzien等人,"Differential inhibition of mRNA degradation pathways by novel cap analogs,"J.Biol.Chem.,第281卷,第1857-1867页(2006)。对于用这些类似物帽化的mRNA，我们没有观察到稳定性或翻译效率的增加(参见下文)。这可以表明，虽然m₂ ^7,2’-OGppp_SG(D1)和m₂ ^7,2’-OGpp_SpG(D1)更强地结合eIF4E，但存在有上限，超过了该上限，对于eIF4E的高亲和力不加速总体翻译。根据这个解释，当帽结合的速率变得足够高时，蛋白质合成起始中的一些其他步骤就成为是限速的。

实施例20

在HC11细胞中用S-ARCA帽化的萤光素酶mRNA的翻译效率

对于用S-ARCA帽化萤光素酶mRNA，我们还测定了在培养的细胞中的翻译效率。这涉及在核穿孔后的各个不同时间处进行的两个测量：在经澄清的细胞裂解物中通过发光测定法而测量的萤光素酶活性，和通过实时PCR而测量的Luc-A₆₀水平。通过已被递送入细胞中的萤光素酶mRNA的量来使萤光素酶活性标准化。为了测定在紧接于核穿孔后的时间处(即在出现任何衰变之前)在细胞中存在的RNA的量，在核穿孔后2至8小时的各个不同时间处收获细胞，并且提取胞质RNA。使用扩增5’-末端附近序列的引物，通过实时PCR来测量萤光素酶mRNA的量。将在每个时间点处存留的萤光素酶mRNA以“log₁₀([RNA])对时间”的形式进行作图以测定t_1/2。将曲线外推至0小时，并计算出递送入细胞中的RNA的量。我们定义了这样的条件，在所述条件下，在～30分钟的最初的延滞期后，萤光素酶的积累随着时间是线性的，所述延滞期用于将mRNA募集至核糖体，完成第一条多肽链，和将萤光素酶释放到细胞溶胶中。

用m₂ ^7,2’-OGpp_SpG(D1)和m₂ ^7,2’-OGpp_SpG(D2)帽化的Luc-A₆₀mRNA以分别为用m⁷Gp₃G帽化的mRNA的2.8倍和5.1倍的程度更有效地进行翻译(图8和表2)。对于在兔网织红细胞裂解物体系中的无细胞翻译，用m₂ ^7,2’-OGpp_SpG(D1)和m₂ ^7,2’-OGpp_SpG(D2)帽化的Luc-A₆₀mRNA仅以为用m⁷Gp₃G帽化的Luc-A₆₀mRNA的2.3 倍的程度更有效地进行翻译(数据未显示)。该差异暗示，在培养的细胞中翻译效率的增加与更高的mRNA稳定性(其不是无细胞翻译体系的因素)相关，这是因为只有用对于hDcp2具有抗性的类似物帽化的mRNA被更有效地翻译。

表2

在HC11细胞中具有硫代磷酸帽类似物的萤光素酶mRNA的翻译效率和稳定性

^a在20℃下小鼠eIF4E(氨基酸28-217)与各种帽类似物的相互作用的平衡缔合常数。在大肠杆菌中表达小鼠eIF4E(残基28-217)，并且进行荧光时间同步滴定(fluorescence time-synchronized titration)，如在J.Zuberek等人,"Phosphorylation of eIF4E attenuates its interaction with mRNA cap analogs by electrostatic repusion:Intein-mediated protein ligation strategy to obtain phosphorylated protein,"RNA,第9卷,第52-61页(2003)；和A.Niedzwiecka等人,"Biophysical studies of eIF4E cap-binding protein:recognition of mRNA5'cap structure and synthetic fragments of eIF4G and4E-BP1proteins,"J.Mol.Biol.,第319卷,第615-635页(2002)中所描述的。

^b使用图4的数据来估计用各种类似物帽化的寡核苷酸对于hDcp2水解的易感性。将在44分钟处(未消化的帽)和在38分钟处(pGp*)洗脱出的峰中的放射性活度对于背景放射性活度进行修正，并相加以代表帽中的总放射性活度。通过作为总放射性活度的百分比来表示的在pGp*中的放射性活度来给出Dcp2易感性。(ND)未测定。

^c通过实时PCR(其使用针对萤光素酶mRNA的5’-末端的引物)来测定用所示的类似物帽化的Luc-A₆₀mRNA中5’-末端序列的降解。

^d显示了在HC11细胞中用所示的帽类似物帽化的Luc-A₆₀mRNA的翻译效率。通过细胞中萤光素酶RNA的量来对萤光素酶活性进行标准化。如由J.Jemielity等人,"Novel'anti-reverse'cap analogues with superior translational properties"RNA,第9卷,第1108-1122页(2003)所描述的，计算出相对翻译效率。

*指明了与用m₂ ^7,2’-OGp₃G帽化的mRNA显著不同(p<0.05)的半寿期。

实施例21

在HC11细胞中用S-ARCA帽化的萤光素酶mRNA更有效地被募集至多核糖体

我们采用了独立的方法来验证这样的观察结果：用m₂ ^7,2’-OGpp_SpG帽化的mRNA更有效地被翻译，即它们的多核糖体分布(图9A-9E)。相对于延伸或终止而言起始的速率的增加导致mRNA从较轻的多核糖体移动至较重的多核糖体。参见H.Lodish,"Model for the regulation of mRNA translation applied to haemoglobin synthesis,"Nature,第251卷,第385-388页(1974)。未预期帽结构的类型会影响延伸的速率。因此，移动至更高的多核糖体表明了更快的起始。

将用m⁷Gp₃G、m₂ ^7,2’-OGp₃G或m₂ ^7,2’-OGpp_SpG(D2)帽化的Luc A₆₀mRNA电穿孔入HC11细胞中。在电穿孔后4小时，裂解这些细胞，并将经澄清的上清液铺层在蔗糖梯度上以将多核糖体与起始复合物分离开。萤光素酶mRNA主要地存在于多核糖体中(图9A和9B，级分6-11)，尽管有些也存在于起始复合物的区域中(级分3-5)。小的萤光素酶mRNA存在于未翻译的信使核糖核蛋白复合物(mRNP)池中(图9A和9B，级分1-2)。用标准ARCA即m₂ ^7,2’-OGp₃G帽化的mRNA移动至更高的多核糖体(图9C)。然而，用m₂ ^7,2’-OGpp_SpG(D2)帽化的mRNA移动至更加高的多核糖体，并且同时从mRNP区域中丢失(图9D)。在相同的实验条件下，内源的GAPDH mRNA被有效地翻译(图9E)，尽管有些也沉积在起始复合物的区域中。总之，这些结果暗示，萤光素酶转录物的5’-末端处m₂ ^7,2’-OGpp_SpG(D2)的存在增加它们的起始速率，从而确认了基于萤光素酶活性的积累的结果。

实施例22

S-ARCA萤光素酶mRNA的更大的稳定性和更大的翻译效率的组合在HC11细胞中产生更多的总体蛋白质表达

我们还测定了通过其酶促活性来测量的总的萤光素酶积累，作为关于用m₂ ^7,2’-OGp₃G、m₂ ^7,2’-OGpp_SpG(D1)和m₂ ^7,2’-OGpp_SpG(D2)帽化的mRNA的时间的函数。对HC11细胞进行核穿孔，然后在直至10小时的各个不同时间处进行裂解。将在上清液中测量得到的萤光素酶活性对于递送入细胞中的Luc-A₆₀的量进行标准化。如图10中所显示的，HC11细胞中的萤光素酶活性在3小时处达到最大，然后在经过10小时下降至1/10。表达的动力学与荧光素酶蛋白质的半寿期(其为约180分钟)(参见J.Thompson等人,"Modulation of firefly luciferase stability and impact on studies of gene regulation,"Gene,第103卷,第171-177页(1991))和各种萤光素酶mRNA的半寿期(其分别为155、185和257分钟)相一致。对于用m₂ ^7,2’-OGpp_SpG(D2)帽化的Luc-A₆₀(其具有最高的翻译效率和最大的稳定性)来说，大多数萤光素酶发生积累。预测对于具有更长半寿期的蛋白质来说，来自用该类似物帽化的mRNA的总体蛋白质表达的增加是更加大的。

实施例23

对于eIF4E的结合亲和力

所述S-类似物的K_AS值和结合自由能(ΔG°)，以及关于它们的未修饰的亲本化合物的同样的数据显示在表3中。令人惊讶地，不但硫代磷酸部分的存在没有降低对于eIF4E的结合亲和力，而且在有些情况下，亲和力还显著增加了。K_AS值强烈地依赖于硫代磷酸修饰的位置和在不对称P-中心周围的绝对构型。有趣的是，在每对非对映异构体中，D1成员以D2成员或亲本类似物的2.3至4.5倍的亲和力与eIF4E结合。例如，m₂ ^7,2'-OGp_SppG的D1异构体的K_AS为D2或m₂ ^7,2'-OGpppG的3倍。类似地，m₂ ^7,2'-OGpp_SpG的D1异构体的K_AS为D2的2倍和为m₂ ^7,2'-OGpppG的4.5倍。对于γ-修饰的类似物，观察到最大的在D1/D2非对映异构体之间的结合亲和力的差异。在另一个方面，对于β-取代的类似物，观察到最大的在经修饰的和未修饰的对之间的差异。

表3

鼠类eIF4E(28-217)与硫代磷酸帽类似物的结合的平衡缔合常数(K_AS)和结合自由能(ΔG°)，其通过荧光猝灭来测定。

**对于非对映异构体混合物所测定的

实施例24

对于通过人和秀丽隐杆线虫DcpS的酶促水解的易感性

使新系列的S-类似物经历由来自人和秀丽隐杆线虫来源的DcpS所催化的体外酶促水解。在所有实验中，将相应的未修饰的帽类似物用作阳性对照，即对于非ARCA S-类似物来说为m⁷GpppG，和对于S-ARCA来说为m₂ ^7,2′-OGpppG。优化DcpS酶的量以提供在40-90分钟内对照底物的完全降解。通过RP HPLC来分析以各个不同时间间隔从反应混合物中收集的样品(如在“材料和方法”中所描述的)。

在表4中，在导致于40-90分钟内未修饰的亲本化合物(即，对于非ARCA S-类似物来说为m⁷GpppG，和对于ARCA来说为m₂ ^7,2′-OGpppG)完全降解的条件下，使4μM浓度的帽类似物经历通过DcpS的酶促消化。如在“材料和方法”中所描述的，采用在260nm处的UV检测通过RP HPLC来分析以各个不同时间间隔从反应混合物中收集的样品。在表4中，被指定为“具有抗性”的类似物在所应用的条件下保持完全未被消化，而被指定为“被水解”的类似物以与各自未修饰的亲本化合物相当的效率被DcpS水解。发现在γ-位置处经修饰的S-类似物对于水解具有抗性，这不依赖于P-中心绝对构型(表4)。即使将反应时间延长至24小时，使用各种不同的酶量，和修改反应缓冲液的组成，结果也不变。所有其他S-类似物以与未修饰的亲本类似物相当的效率被hDcpS水解。对于通过来自人和秀丽隐杆线虫来源的DcpS来进行的S-类似物水解，没有观察到显著的差异。

对在α-位置处经修饰的类似物的DcpS降解产物的分析使得我们能够确定它们在不对称P-中心周围的绝对构型。我们发现，通过DcpS 来进行的m⁷Gppp_SG(D1)或m⁷Gppp_SG(D2)的水解导致获得m⁷GMP和鸟苷5′-O-(1-硫代二磷酸)(GDPαS)的D1或D2异构体，而m₂ ^7,2′-OGppp_SG(D1)或m₂ ^7,2′-OGppp_SG(D2)的水解导致获得m₂ ^7,2′-OGMP和GDPαS的D1或D2异构体(数据未显示)。

表4

S-类似物在体外对于通过DcpS(来自人和秀丽隐杆线虫)的酶促水解的易感性

实施例25

作为帽依赖性翻译的抑制剂的帽类似物

在用天然兔珠蛋白mRNA进行规划的兔网织红细胞裂解物体系中检验了所述新的S-类似物抑制帽依赖性翻译的能力。在所述12种S-类似物中，选择出在γ-位置处经修饰的两种，即m⁷Gp_SppG(D1)和m⁷Gp_SppG(D2)，这是因为发现它们对于DcpS具有抗性和因为它们在体内可能更稳定。将关于翻译抑制的数据与理论曲线相拟合，所述理论曲线描述了作为mRNA结合的竞争性抑制剂的函数的帽依赖性翻译(Cai等人,1999)。这使得我们能够测定K_I，即在帽依赖性翻译被抑制50％时的帽类似物浓度(表5)。发现这两种S-类似物都是比m⁷GpppG更好的帽依赖性翻译的抑制剂，这构成了关于硫代磷酸部分通常使帽-eIF4E相互作用稳定化的额外的证据。此外，m⁷Gp_SppG(D1)比其D2对应物显著地更具有抑制性(K_I＝4.1±0.2μM对K_I＝12.1±3.2μM)，这与其更高的对于eIF4E的结合亲和力(K_AS＝30.8±0.5对K_AS＝10.0±0.2)相一致。

表5

在兔网织红细胞切割液翻译体系中通过γ-修饰的S-类似物的帽依赖翻译的抑制的抑制常数(K_I)

实施例26

作为帽依赖性翻译的体内抑制剂的用S-ARCA帽化的mRNA片段

S-ARCA，尤其是其中硫代磷酸修饰出现在γ位置处的三磷酸，例如在实施例17下的化合物6a和6b的未来应用可能是作为帽依赖性翻译的抑制剂。已充分证明，在癌细胞中帽依赖性翻译被上调，并且eIF4E的下调逆转恶性表型。在可能出现完全降解成核苷酸之前，当它们达到小于25nt的长度时，由于加帽的mRNA的3’→5’降解而产生的片段必须进行脱帽。预期用在γ位置处包含硫代磷酸修饰的三磷酸S-ARCA帽化的此类片段对于DcpS具有抗性，类似于对于帽二核苷酸自身所显示的(表4，见上)。因此，预期他们在细胞中积累并且与正常mRNA竞争募集至翻译机器。我们将用在γ位置处进行取代的三磷酸S-ARCA(在实施例17下的化合物6a和6b)帽化的mRNA或mRNA片段引入培养的细胞中。然后，我们使用报道构建体来测量帽依赖性翻译对帽非依赖性翻译。我们预期前者优先被抑制。应当注意的是，ARCA修饰是在掺入mRNA中后这些S-ARCA的正确方向所必需的，这是因为否则硫代磷酸部分可能不处于使得mRNA片段对于DcpS具有抗性的正确位置。

类似地，我们分析作为帽依赖性翻译的潜在抑制剂的四磷酸S-ARCA。我们预期，四磷酸S-ARCA，尤其是包含δ-硫代磷酸基团的那些，将不会在生理条件下被DcpS水解，并且将会抑制帽依赖性翻译。

实施例27

权利要求书详细说明了三磷酸和四磷酸帽类似物二核苷酸的硫代磷酸修饰的所有组合，类似于下面所列出的那些。m⁷Guo的核糖部分的修饰是2’-脱氧、3’-脱氧、阿拉伯糖、2’-O-乙基和3’-O-乙基。G的7-取代基的修饰是甲基、乙基、丙基、丁基、苄基、经取代的苄基、萘基甲基、经取代的萘基甲基和其他经取代或未取代的C1至C10脂肪族或芳香族基团。鸟嘌呤部分的修饰是使用腺嘌呤、尿苷、胞嘧啶或m⁷G。可以合成这些各种修饰物，如本申请中所公开的和另外从本领域(例如美国专利申请公开2003/0194759)已知的方法改编的。

本说明书中所引用的所有参考文献的全部公开内容通过提及而合并入本文。还通过提及而合并入了关于本发明者自己工作的下列出版物的全部公开内容，其不是本申请的现有技术：J.Kowalska等人,“Synthesis and characterization of mRNA cap analogs containing phosphorothioate substitutions that bind tightly to eIF4E and are resistant to the decapping pyrophosphatase DcpS,”RNA,第14卷,第1119-1131页(2008)；E.Grudzien-Nogalska等人,“Phosphorothioate cap analogs stabilize mRNA and increase translational efficiency in mammalian cells,”RNA,第13卷,第1745-1755页(2007)；和E.Darzynkiewicz等人,“Methylene and phosphorothioate cap dinucleotides:useful tools to study decapping and translantion”,提交给RNA Meeting,Seattle,Washington,June20-25,2006的摘要和海报。但是，在另外出现相矛盾的冲突的情形下，应当以本说明书为准。

Claims

1.组合物，其包含

其中：

每个Y选自O和S；各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S；

R1选自H、OH、OCH₃和OCH₂CH₃；

R2选自H、OH、OCH₃和OCH₂CH₃；

n是3或4；和

如果R1是OH，那么R2不是OH。

2.权利要求1中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。

3.权利要求1中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。

4.RNA分子，其5'末端掺入有权利要求1的组合物。

5.用于在体外合成权利要求4中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。

6.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译权利要求2中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。

7.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求4中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。

8.权利要求1中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被Dcp2水解。

9.权利要求1中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。

10.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5'末端掺入有权利要求8中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。

11.组合物，其包含

其中：

R1选自H、OH、OCH₃和OCH₂CH₃；

R2选自H、OH、OCH₃和OCH₂CH₃；

n是3或4；和

如果R1是OH，那么R2不是OH；

和B选自

12.权利要求11中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。

13.权利要求11中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。

14.RNA分子，其5'末端掺入有权利要求11的组合物。

15.用于在体外合成权利要求14中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。

16.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译权利要求14中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。

17.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求14中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。

18.权利要求11中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被Dcp2水解。

19.权利要求11中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。

20.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5'末端掺入有权利要求17中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。

21.组合物，其包含

其中：

R1选自H、OH、OCH₃和OCH₂CH₃；

R2选自H、OH、OCH₃和OCH₂CH₃；

n是3或4；和

如果R1是OH，那么R2不是OH；和

B选自鸟嘌呤、腺嘌呤、尿苷、胞嘧啶；和

X选自甲基、乙基、丙基、丁基、苄基、经取代的苄基、萘基甲基、经取代的萘基甲基、以及其他经取代和未取代的C1至C10脂肪族或芳香族基团。

22.权利要求21中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。

23.权利要求21中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。

24.RNA分子，其5'末端掺入有权利要求21的组合物。

25.用于在体外合成权利要求24中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。

26.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译权利要求24中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。

27.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求24中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。

28.权利要求21中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被Dcp2水解。

29.权利要求21中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。

30.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5'末端掺入有权利要求28中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。

31.组合物，其包含

其中：

n是3或4；

B选自鸟嘌呤、腺嘌呤、尿苷、胞嘧啶；和

X选自甲基、乙基、丙基、丁基、苄基、经取代的苄基、萘基甲基、经取代的萘基甲基、以及经取代或未取代的C1至C10脂肪族或芳香族基团。

32.权利要求31中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。

33.权利要求31中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。

34.RNA分子，其5'末端掺入有权利要求31的组合物。

35.用于在体外合成权利要求34中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。

36.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译权利要求34中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。

37.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求34中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。

38.权利要求31中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被Dcp2水解。

39.权利要求31中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。

40.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5'末端掺入有权利要求38中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。

41.组合物，其包含

其中：

每个Y选自O和S；各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S；和

n是3或4；和

X选自甲基、乙基、丙基、丁基、苄基、经取代的苄基、萘基甲基、经取代的萘基甲基、以及经取代或未取代的C1至C10脂肪族或芳香族基团；各个X可以是相同的或不同的。

42.权利要求41中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。

43.权利要求41中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。

44.RNA分子，其5'末端掺入有权利要求41的组合物。

45.用于在体外合成权利要求44中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。

46.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译权利要求44中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。

47.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求44中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。

48.权利要求41中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被Dcp2水解。

49.权利要求41中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。

50.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5'末端掺入有权利要求48中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。

51.组合物，其包含

其中：

n是3或4。

52.权利要求51中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。

53.权利要求51中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。

54.RNA分子，其5'末端掺入有权利要求51的组合物。

55.用于在体外合成权利要求54中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。

56.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译权利要求54中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。

57.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求54中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。

58.权利要求51中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被Dcp2水解。

59.权利要求51中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。

60.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5'末端掺入有权利要求58中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。

61.组合物，其包含一种或多种选自下列的化合物：m₂ ^7,2′-OGpp_spG；m₂ ^7,3′-OGpp_spG；m₂ ^7,2′-OGppp_spG；m₂ ^7,3′-OGppp_spG；m₂ ^7,2′-OGpp_sppG；m₂ ^7,3′-OGpp_sppG；m₂ ^7,2′-OGp_sp_spG；m₂ ^7,3′-OGp_sp_spG；m₂ ^7,2′-OGpp_sp_sG；m₂ ^7,3′-OGpp_sp_sG；bn⁷m^2′-OGpp_spG；bn⁷m^3′-OGpp_spG；bn⁷m^2′-OGppp_spG；bn⁷m^3′-OGppp_spG；bn⁷m^2′-OGpp_sppG；bn⁷m^3′-OGpp_sppG；bn⁷m^2′-OGp_sp_spG；bn⁷m^3′-OGp_sp_spG；bn⁷m^2′-OGpp_sp_sG；和bn⁷m^3′-OGpp_sp_sG。

62.权利要求61中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由所述化合物之一的单种立体异构体组成。

63.权利要求61中所描述的组合物，其中所述组合物包含所述化合物之一的至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。

64.RNA分子，其5'末端掺入有权利要求61的组合物。

65.用于在体外合成权利要求64中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。

66.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译权利要求64中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。

67.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求64中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。