CN104193815A - 经修饰的人类血浆多肽或Fc骨架和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供经修饰的人类血浆多肽或Fc和其用途。

Description

经修饰的人类血浆多肽或Fc骨架和其用途
分案说明
本申请案是申请日为2007年9月7日，申请号为200780033084.7(国际申请号为PCT/US2007/019528)，发明名称为经修饰的人类血浆多肽或Fc骨架和其用途的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及经修饰以包含至少一个非天然编码氨基酸的人类血浆多肽或Fc分子。
背景技术
人类血浆包含多种执行多种功能的蛋白质。血浆的蛋白质组分是密集研究的焦点。关于人类血浆的已知蛋白质组分的描述，例如参见Anderson等人,Molecular&CellularProteomics,3.4:311-326(2004)；和Ping等人,Proteomics,5:3506-3519(2005)。人类血浆中可见的最常见蛋白质是白蛋白。
人类白蛋白(也称为血清白蛋白)是血浆中可见的多功能蛋白质。其由于有助于形成血浆的胶体渗透压而成为血浆容量和组织液平衡调控中的重要因素。白蛋白也充当血流中可见的其它分子的运载体。白蛋白通常占血浆蛋白的50-60％，且因相对较低的分子量(66,500道尔顿)而施加80-85％的血液的胶体渗透压。白蛋白调控跨血管流体通量且因此调控血管内和血管外流体容量，且转运脂质和脂溶性物质。白蛋白溶液在某些类型的休克或濒临休克的治疗中通常用于扩大血浆容量和维持心输出量，所述休克包括由灼伤、手术、出血或其它外伤或存在循环容量不足的病状引起的休克。
白蛋白具有约两周的血液循环半衰期且天生经设计为运载诸如脂质、肽以及其它蛋白质等其它分子。疏水性结合口袋和游离硫醇半胱氨酸残基(Cys34)是赋予这一功能的特征。Cys34因其低pKa(约7)而成为出现在人类血浆中的一个更具反应性的硫醇基。白蛋白的Cys34也占血浆中硫醇浓度的主要部分(超过80％)(Kratz等人,J.Med.Chem.,45(25):5523-33(2002))。白蛋白通过其反应性硫醇充当运载体的能力已用于治疗用途。举例来说，描述了使药物与白蛋白连接，从而改进药物的药理学性质(Kremer等人,Anticancer Drugs,13:(6):615-23(2002)；Kratz等人,J.Drug Target,8(5):305-18(2000)；Kratz等人,J.Med.Chem.,45(25):5523-33(2002)；Tanaka等人,Bioconjug.Chem.,2(4):261-9(1991)；Dosio等人,J.Control.Release,76(1-2):107-17(2001)；Dings等人,Cancer Lett.,194(l):55-66(2003)；Wunder等人,J.Immunol.,170(9):4793-801(2003)；Christie等人,Biochem.Pharmacol.,36(20):3379-85(1987))。也描述了使肽和蛋白质治疗剂与白蛋白连接(Holmes等人,Bioconjug.Chem.,11(4):439-44(2000)；Leger等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,13(20):3571-5(2003)；Paige等人,Pharm.Res.,12(12):1883-8(1995))。也进行了白蛋白与干扰素α(AlbuferonTM)和白蛋白与人类生长激素(AlbutropinTM)以及白蛋白与白细胞介素-2(AlbuleukinTM)的结合。所属领域也描述使用标准重组分子生物学技术来产生白蛋白-蛋白质融合物(美国专利第6,548,653号，其以引用的方式并入本文中)。所有结合物(与白蛋白形成的最后一种结合物除外)都涉及使用外源白蛋白的离体结合物形成。使用外源白蛋白的潜在缺点是污染或免疫原性反应。
也描述了治疗剂与白蛋白的活体内连接，例如其中选定肽在给予之前经修饰以允许白蛋白与肽结合。这种方法是使用二肽基肽酶IV抗性胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物来描述(Kim等人,Diabetes,52(3):751-9(2003))。使特异性连接子([2-[2-[2-马来酰亚胺基-丙酰胺基-(乙氧基)-乙氧基]-乙酰胺)连接到肽上所添加的羧基末端赖氨酸以使得白蛋白的半胱氨酸残基能够与肽结合。其它人已研究使特异性标签连接到肽或蛋白质以增加其活体内与白蛋白的结合(Koehler等人,Bioorg Med.Chem.Lett.,12(20):2883-6(2002)；Dennis等人,J.Biol.Chem.,277(38):35035-35043(2002)；Smith等人,Bioconjug.Chem.,12:750-756(2001))。已使用一种利用小分子药物的类似方法，其中药物的衍生物经特定设计以具有与白蛋白的半胱氨酸残基结合的能力。举例来说，这种前药策略已用于阿霉素(doxorubicin)衍生物，其中阿霉素衍生物在位置34的半胱氨酸残基处与内源白蛋白结合(Cys34；Kratz等人,J Med.Chem.,45(25):5523-33(2002))。治疗剂与白蛋白的活体内连接相对于上述离体方法具有优势，这是因为使用内源白蛋白，从而避免与外源白蛋白的污染或免疫原性反应相关的问题。然而，药物与内源白蛋白的结合物的活体内形成的现有技术方法涉及药物与白蛋白之间的永久性共价键。为达到可使所述键可裂解或可逆的程度，从结合物释放的药物或肽应呈最初化合物的修饰形式。
人类血清白蛋白已在包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Etcheverry等人,(1986)BioTechnology 8:726和EPA 123 544)、毕赤酵母(Pichia pastoris)(EPA 344 459)以及克鲁维酵母(Kluyveromyces)(Fleer等人,(1991)BioTechnology 9:968-975)的酵母宿主细胞和大肠杆菌(E.coli)中表达(Latta等人,(1987)BioTechnology5:1309-1314)，所述参考文献以引用的方式并入本文中。
天然产生的抗体(Ab)是由两个相同免疫球蛋白(Ig)重链和两个相同轻链组成的四聚物结构。免疫球蛋白是含有通过双硫键结合在一起的多肽链的分子，所述多肽链通常具有两个轻链和两个重链。在各链中，一个域(V)具有视分子的抗体特异性而定的可变氨基酸序列。其它域(C)具有相同种类的分子所共有的相当恒定的序列。
Ab的重链和轻链由不同域组成。各轻链具有一个可变域(VL)和一个恒定域(CL)，而各重链具有一个可变域(VH)和三个或四个恒定域(CH)。由约110个氨基酸残基组成的各域是折叠成由两个彼此堆叠的β-折叠形成的特征性β-夹层结构，即免疫球蛋白折叠。VL域各自具有三个互补决定区(CDR1-3)且VH域各自具有多达四个互补决定区(CDR1-4)，所述互补决定区为在域的一端连接β链的环或转角。轻链和重链的可变区通常对抗原特异性有贡献，但个别链对特异性的贡献不必相同。抗体分子已发展到通过使用随机CDR环与大量分子结合。
Ab的功能子结构可通过蛋白水解和通过重组方法制备。所述子结构包括包含通过单一链间双硫键连接的重链的VH-CH1域和轻链的VL-CL1域的Fab片段和仅包含VH和VL域的Fv片段以及包含分子的非抗原结合区的Fc部分。在一些情况下，单一VH域保留显著的对抗原的亲和力(Ward等人,1989,Nature341,554-546)。也已显示某种单体κ轻链将特异性结合其抗原(L.Masat等人,1994,PNAS 91:893-896)。发现分离的轻链或重链有时也保留某种抗原结合活性(Ward等人,1989,Nature 341,554-546)。
另一功能子结构是包含经由肽连接子共价连接的免疫球蛋白重链和轻链的可变区的单链Fv(scFv)(S-z Hu等人,1996,Cancer Research,56,3055-3061)。这些小(Mr25,000)蛋白质通常保留对单一多肽中的抗原的特异性和亲和力且可对较大的抗原特异性分子提供便利的结构单元。在多种情况下，scFv在循环中的短半衰期限制其治疗效用。
使用Ig VH域的一部分作为模板，设计出称为“微抗体”的小蛋白质骨架(Pessi等人,1993,Nature 362,367-369)。通过使对应于VH的CDR1和CDR2的环随机化，且然后使用噬菌体呈现方法选择突变体而鉴别出对白细胞介素-6具有高亲和力(解离常数(Kd)为约10-7M)的微抗体(Martin等人,1994,EMBO J.13,5303-5309)。
当分析来自骆驼血清的IgG样物质时，骆驼通常缺乏可变轻链域，这提示足够的抗体特异性和亲和力可能仅源自VH域(三个或四个CDR环)。已制备出具有高亲和力的“骆驼化”VH域，且通过仅随机化CDR3可产生高特异性。
“微抗体”的替代物为“双功能抗体”。双功能抗体是具有两个抗原结合位点的小型二价且具双特异性的抗体片段。所述片段包含连接到同一多肽链上的轻链可变域(VL)的重链可变域(VH)(VH-VL)。双功能抗体的大小与Fab片段类似。通过使用太短而不允许在同一链上的两个域之间配对的连接子，迫使所述域与另一链的互补域配对并产生两个抗原结合位点。这些二聚抗体片段或“双功能抗体”是二价的且具双特异性。参见P.Holliger等人,PNAS 90:6444-6448(1993)。
抗体片段包括除全长形式以外的抗体的任何形式。本文中的抗体片段包括为存在于全长抗体内的较小组分的抗体和已经工程化的抗体。抗体片段包括(但不限于)Fv、Fc、Fab以及(Fab')2、单链Fv(scFv)、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、双功能杂交抗体、CDR1、CDR2、CDR3、CDR的组合、可变区、构架区、恒定区等(Maynard和Georgiou,2000,Annu.Rev.Biomed.Eng.2:339-76；Hudson,1998,Curr.Opin.Biotechnol.9:395-402)。
已制备出CDR肽和有机CDR模拟物(Dougall等人,1994,Trends Biotechnol.12,372-379)。CDR肽是对应于抗体的CDR环的氨基酸序列的通常为环状的短肽。CDR环会引起抗体-抗原相互作用。已显示CDR肽和有机CDR模拟物保留某种结合亲和力(Smyth和von Itzstein,1994,J.Am.Chem.Soc.116,2725-2733)。已在不损失亲和力的情况下将小鼠CDR移植到人类Ig构架上(Jones等人,1986,Nature 321,522-525；Riechmann等人,1988)。
在体内，从大型文库选择特异性Ab并使其扩增(亲和力成熟)。这些过程可在活体外使用组合文库技术重现。Ab片段在噬菌体表面上的成功呈现使得有可能产生和筛选大量CDR突变(McCafferty等人,1990,Nature 348,552-554；Barbas等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,7978-7982；Winter等人,1994,Annu.Rev.Immunol.12,433-455)。通过这种技术产生数目增加的Fab和Fv(和其衍生物)。这种组合技术可与Ab模拟技术组合。
多个可潜在充当蛋白质骨架的蛋白质域已表达为与噬菌体衣壳蛋白的融合物。综述见于Clackson和Wells,Trends Biotechnol.12:173-184(1994)中。已使用这些蛋白质域中的数种作为呈现随机肽序列的骨架，所述蛋白质域包括牛胰腺胰蛋白酶抑制剂(Roberts等人,PNAS 89:2429-2433(1992))、人类生长激素(Lowman等人,Biochemistry30:10832-10838(1991)；Venturini等人,Protein Peptide Letters 1:70-75(1994))以及链球菌的IgG结合域(O'Neil等人,Techniques in Protein Chemistry V(Crabb,L编),第517-524页,Academic Press,San Diego(1994))。这些骨架已呈现单一随机化环或区。已使用淀粉酶抑肽(tendamistat)作为丝状噬菌体M13上的提呈骨架(presentationscaffold)(McConnell和Hoess,1995,J.Mol.Biol.250:460-470)。
免疫球蛋白的Fc部分包括(但不限于)通过从抗体中去除两个抗原结合区(Fab片段)获得的抗体片段。一种去除Fab片段的方法是用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白。因此，Fc部分是由来自两个重链的恒定区的大小近似相等的片段形成，所述片段通过非共价相互作用和双硫键缔合。Fc部分可包括铰链区且延伸穿过抗体的CH2和CH3域到达C-末端。人类和小鼠免疫球蛋白的代表性铰链区可见于Antibody Engineering,APractical Guide,Borrebaeck,C.A.K.编,W.H.Freeman and Co.,1992中，其教示以引用的方式并入本文中。Fc部分可进一步包括一个或一个以上糖基化位点。所属领域中熟知多种含有铰链区、CH2和CH3域以及一个N-糖基化位点的代表性Fc蛋白的氨基酸序列。
存在五种类型的具有不同效应功能和药物动力学性质的人类免疫球蛋白Fc区：IgG、IgA、IgM、IgD以及IgE。IgG是血清中最丰富的免疫球蛋白。IgG还具有任何免疫球蛋白中最长的血清半衰期(23天)。不同于其它免疫球蛋白，IgG在与Fc受体结合后可有效地再循环。存在四个IgG亚类G1、G2、G3以及G4，其各自具有不同的效应功能。G1、G2以及G3能结合C1q和固定补体，而G4则不能。虽然G3能够比G1有效地结合C1q，但G1在介导补体导向的细胞溶解中更有效。G2以极低效率固定补体。IgG中的C1q结合位点位于CH2域的羧基末端区。
所有IgG亚类都能够结合Fc受体(CD16、CD32、CD64)，其中G1和G3比G2和G4有效。IgG的Fc受体结合区是由位于CH2域的铰链区和羧基末端区中的残基形成。
IgA可以单体形式和通过J-链结合在一起的二聚物形式存在。IgA是血清中第二丰富的Ig，但其半衰期仅为6天。IgA具有三种效应功能。其结合巨噬细胞和嗜酸性粒细胞上的IgA特异性受体，所述受体分别驱动吞噬作用和脱粒作用。其也可经由未知的替代途径固定补体。
IgM是表达为通过J-链结合在一起的五聚物或六聚物。IgM具有5天的血清半衰期。其经由位于CH3域中的结合位点微弱地结合C1q。IgD具有3天的血清半衰期。尚不清楚哪些效应功能是归因于这种Ig。IgE是单体Ig且具有2.5天的血清半衰期。IgE结合驱动脱粒作用且引起促发炎剂释放的两种Fc受体。
本发明的多肽可含有上述同种型中的任一种，或可含有补体和/或Fc受体结合功能已改变、变化或消除的突变Fc区。本发明的多肽可含有上述同种型中的任一种，或可含有效应功能已改变、变化或消除的突变Fc区。因此，本发明的多肽可含有免疫球蛋白的整个Fc部分、免疫球蛋白的Fc部分的片段或其类似物。
本发明的多肽可由单链蛋白质组成或呈多链多肽形式。可产生两个或两个以上Fc蛋白，以致其通过天然形成于Fc区之间的双硫键相互作用。这些多聚物就共轭分子来说可为同源的，或其可在融合蛋白的Fc部分的N-末端含有不同的共轭分子。
Fc或Fc样区可用于延长与其融合的化合物的活体内血浆半衰期。因为由蛋白水解所产生的IgG的Fc区具有与完整IgG分子相同的活体内半衰期且Fab片段快速降解，所以认为用于延长半衰期的相关序列驻留在CH2和/或CH3域中。另外，文献中已显示不结合高亲和力Fc受体或C1q的IgG变异体的分解代谢率与亲本野生型抗体的清除速率很难区分，表明分解代谢位点不同于参与Fc受体或C1q结合的位点。[Wawrzynczak等人,(1992)Molecular Immunology 29:221]。使用鼠类IgG1 Fc区的定点诱变研究提示，控制分解代谢率的IgG1 Fc区的位点位于CH2-CH3域的界面处。Fc区可在分解代谢位点处经修饰以优化融合蛋白的半衰期。用于本发明的融合蛋白的Fc区可源自IgG1或IgG4 Fc区，且可含有CH2和CH3区(包括铰链区)。
可产生包含Fc和一个或一个以上其它分子(包括(但不限于)多肽)的嵌合分子。嵌合分子可含有Fc的特异性区或片段和其它分子。任何所述片段都可由蛋白质通过标准生物化学方法来制备，或通过表达编码所述片段的多核苷酸来制备。多肽或其片段可以包含人类血清白蛋白(HSA)、Fc或其部分的融合蛋白形式产生。可通过融合多肽与a)免疫球蛋白的Fc部分、b)免疫球蛋白的Fc部分的类似物以及c)免疫球蛋白的Fc部分的片段来产生融合物。
最近，已报导蛋白质科学中的一种全新技术，其有希望克服与蛋白质的位点特异性修饰相关的许多限制。具体来说，已向原核生物大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)(例如L.Wang等人,(2001),Science 292:498-500)和真核生物酿酒酵母(Sacchromycescerevisiae，S.cerevisiae)(例如J.Chin等人,Science 301:964-7(2003)；Drabkin等人,(1996)Mol.Cell.Biol.,16:907)以及哺乳动物细胞(Sakamoto等人,(2002)Nucleic AcidsRes.30:4692)的蛋白质生物合成机构中添加新颖组件，所述组件使得能够将非遗传编码氨基酸在活体内并入蛋白质中。已使用这种方法响应琥珀密码子TAG将多种具有新颖化学、物理或生物性质的新颖氨基酸有效且高保真地并入大肠杆菌和酵母中的蛋白质中，所述氨基酸包括光亲和标记(photoaffinity label)和光致异构化氨基酸、光交联氨基酸(例如参见Chin,J.W.等人,(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:11020-11024；和Chin,J.W.等人,(2002)J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027)、酮基氨基酸、含重原子的氨基酸以及糖基化氨基酸。例如参见J.W.Chin等人,(2002),Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027；J.W.Chin和P.G.Schultz,(2002),ChemBioChem 3(11):1135-1137；J.W.Chin等人,(2002),PNAS United States of America99:11020-11024；以及L.Wang和P.G.Schultz,(2002),Chem.Comm.,1:1-11。所有参考文献都以全文引用的方式并入本文中。这些研究已证明有可能选择性和常规地引入诸如酮基、炔基以及叠氮部分等化学官能团，其在蛋白质中未见，对20种常见的遗传编码氨基酸中可见的所有官能团来说都具有化学惰性且可用于有效地且选择性反应以形成稳定共价键。
在蛋白质中并入非遗传编码氨基酸的能力允许引入可提供天然存在的官能团的有价值替代物的化学官能团，诸如赖氨酸的ε-NH2、半胱氨酸的巯基-SH、组氨酸的亚氨基等。已知本文中所述的某些化学官能团(诸如羰基、炔以及叠氮部分)对20种常见的遗传编码氨基酸中可见的官能团来说都具有惰性，但其干净且有效地反应以形成稳定键。
发明内容
本发明提供人类血浆蛋白(human plasma protein，hPP)家族成员，包括(但不限于)充当其它分子的运载体的血浆蛋白。可适用于本发明的hPP包括(但不限于)下列公开文献中所列的那些蛋白质，这些公开文献以全文引用的方式并入本文中：Anderson等人,Molecular&Cellular Proteomics,3.4:311-326(2004)；和Ping等人,Proteomics,5:3506-3519(2005)。一些已知的hPP包括(但不限于)α1-抗胰凝乳蛋白酶、抗胰蛋白酶、α1-抗胰蛋白酶、前白蛋白、人类白蛋白(人类血清白蛋白)、α1-脂蛋白、A-γ球蛋白、α2-巨球蛋白、α1-微球蛋白、α2-微球蛋白、β2-微球蛋白、本-周蛋白(BenceJones protein)、胆汁分泌组分、补体蛋白3、胆固醇酯转移蛋白、脂肪酸结合蛋白、铁蛋白、铁蛋白H链、纤维蛋白原、抑胃肽(gastricinhibitory peptide)、球蛋白、结合球蛋白、血红蛋白、血红蛋白A、血红蛋白A1C、血红蛋白F、糖化血红蛋白、盘状血红蛋白(pan hemoglobin)、乳铁蛋白、脂肪酶、溶菌酶、mutY、肌红蛋白、心脏肌红蛋白、血清类粘蛋白(orosmucoid)、类风湿因子、胰泌素(secretin)、血清素(serotonin)、甲状腺球蛋白、甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白、三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine)、转移蛋白(transferring)、维生素D结合蛋白以及其包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的变异体形式。本发明还提供包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的人类Fc(hFc)。
在一些实施例中，hPP或hFc包含一个或一个以上翻译后修饰。在一些实施例中，hPP或hFc与连接子、聚合物或生物活性分子连接。在一些实施例中，hPP或hFc与双功能或多功能聚合物、双功能或多功能连接子或至少一个其它生物活性分子连接。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，非天然编码氨基酸经由连接子与水溶性聚合物连接，或直接与水溶性聚合物键结。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子是双功能或多功能聚合物。在一些实施例中，双功能或多功能聚合物与第二多肽连接。在一些实施例中，第二多肽是生物活性分子。
在一些实施例中，hPP或hFc包含至少两个与水溶性聚合物、连接子或生物活性分子连接的氨基酸。在一些实施例中，至少一个氨基酸是非天然编码氨基酸。
在一些实施例中，包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的hPP是人类白蛋白(hA)，其在所属领域中也称为人类血清白蛋白。hA可在多肽序列的582个位置中的一个或一个以上位置处经一个或一个以上非天然编码氨基酸取代，包括(但不限于)下列位置中的一个或一个以上位置：位置1(即，在N-末端)之前、17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、574、581以及位置582(即，在蛋白质的羧基末端)之后(SEQ ID NO:1)。
hFc可在多肽序列的一个或一个以上位置处经一个或一个以上非天然编码氨基酸取代，包括(但不限于)位置1(即，在N-末端)之前和N-末端(SEQ ID NO:22)。
在一些实施例中，hPP或hFc包含调节hPP或hFc对hPP或hFc受体或结合搭配物的亲和力的取代、添加或缺失，所述搭配物包括(但不限于)蛋白质、脂质、糖类、多肽、小分子或核酸。在一些实施例中，hPP或hFc包含当与无取代、添加或缺失的相应hPP或hFc的稳定性相比时增加hPP或hFc的稳定性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，hPP或hFc包含当与无取代、添加或缺失的相应hPP或hFc的免疫原性相比时调节hPP或hFc的免疫原性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，hPP或hFc包含当与无取代、添加或缺失的相应hPP或hFc的血清半衰期或循环时间相比时调节hPP或hFc的血清半衰期或循环时间的取代、添加或缺失。
在一些实施例中，hPP或hFc包含当与无取代、添加或缺失的相应hPP或hFc的水溶性相比时增加hPP或hFc的水溶性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，hPP或hFc包含当与无取代、添加或缺失的相应hPP或hFc的溶解性相比时增加宿主细胞中所产生的hPP或hFc的溶解性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，hPP或hFc包含当与无取代、添加或缺失的相应hPP或hFc的表达或合成相比时增加hPP或hFc在宿主细胞中的表达或增加hPP或hFc的活体外合成的取代、添加或缺失。包含这种取代的hPP或hFc保留激动活性且保留或提高宿主细胞中的表达水平。在一些实施例中，hPP或hFc包含当与无取代、添加或缺失的相应hPP或hFc的蛋白酶抗性相比时增加hPP或hFc的蛋白酶抗性的取代、添加或缺失。
在一些实施例中，hPP或hFc中的氨基酸取代可为经天然存在或非天然存在的氨基酸取代，只要至少一个取代是经非天然编码氨基酸取代即可。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、乙酰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基(semicarbazide group)、叠氮基、炔基、苯胺氨基或糖部分。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有如下结构：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2为H、烷基、芳基、经取代烷基以及经取代芳基；且R3为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R4为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含氨氧基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含酰肼基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含肼基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸残基包含叠氮基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有如下结构：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含炔基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有如下结构：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。
本发明还提供包含在严格条件下与SEQ ID NO:2、20或23杂交的多核苷酸的分离核酸，其中多核苷酸包含至少一个选择密码子。在一些实施例中，选择密码子是选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子(opal codon)、独特密码子、稀有密码子、五个碱基的密码子以及四个碱基的密码子组成的群组。
本发明还提供制备与水溶性聚合物连接的hPP或hFc的方法。在一些实施例中，所述方法包含使包含非天然编码氨基酸的分离hPP与包含与所述非天然编码氨基酸反应的部分的水溶性聚合物接触。在一些实施例中，并入hPP或hFc中的非天然编码氨基酸反而可与不与20种常见氨基酸中的任一种反应的水溶性聚合物反应。在一些实施例中，并入hPP或hFc中的非天然编码氨基酸反而可与不与20种常见氨基酸中的任一种反应的连接子、聚合物或生物活性分子反应。
在一些实施例中，通过使包含含羰基的氨基酸的hPP或hFc与包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的聚(乙二醇)分子反应来制备与水溶性聚合物连接的hPP或hFc。在一些实施例中，氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基通过酰胺键与聚(乙二醇)分子连接。
在一些实施例中，通过使包含羰基的聚(乙二醇)分子与包含包括氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的非天然编码氨基酸的多肽反应来制备与水溶性聚合物连接的hPP或hFc。
在一些实施例中，通过使包含含炔基的氨基酸的hPP或hFc与包含叠氮部分的聚(乙二醇)分子反应来制备与水溶性聚合物连接的hPP或hFc。在一些实施例中，叠氮基或炔基通过酰胺键与聚(乙二醇)分子连接。
在一些实施例中，通过使包含含叠氮基的氨基酸的hPP或hFc与包含炔部分的聚(乙二醇)分子反应来制备与水溶性聚合物连接的hPP或hFc。在一些实施例中，叠氮基或炔基通过酰胺键与聚(乙二醇)分子连接。
在一些实施例中，聚(乙二醇)分子具有约0.1kDa与约100kDa之间的分子量。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子具有0.1kDa与50kDa之间的分子量。
在一些实施例中，聚(乙二醇)分子为支化聚合物。在一些实施例中，聚(乙二醇)支化聚合物的各分支具有1kDa与100kDa之间或1kDa与50kDa之间的分子量。
在一些实施例中，与hPP连接的水溶性聚合物包含聚烷二醇部分。在一些实施例中，并入hPP或hFc中的非天然编码氨基酸残基包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。在一些实施例中，并入hPP或hFc中的非天然编码氨基酸残基包含羰基部分，且水溶性聚合物包含氨氧基、酰肼、肼或氨基脲部分。在一些实施例中，并入hPP或hFc中的非天然编码氨基酸残基包含炔部分，且水溶性聚合物包含叠氮部分。在一些实施例中，并入hPP或hFc中的非天然编码氨基酸残基包含叠氮部分，且水溶性聚合物包含炔部分。
本发明还提供包含包括非天然编码氨基酸的hPP或hFc和医药学上可接受的载剂的组合物。在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。
本发明还提供包含包括选择密码子的编码hPP或hFc的多核苷酸的细胞。在一些实施例中，细胞包含用于将非天然编码氨基酸取代到hPP或hFc中的正交RNA合成酶和/或正交tRNA。
本发明还提供制备包含非天然编码氨基酸的hPP或hFc的方法。在一些实施例中，所述方法包含在允许表达hPP或hFc的条件下培养包含编码hPP或hFc的一种或一种以上多核苷酸、正交RNA合成酶和/或正交tRNA的细胞；和从细胞和/或培养基中纯化hPP或hFc。
本发明还提供增加hPP或hFc的治疗半衰期、血清半衰期或循环时间的方法。本发明还提供调节hPP或hFc的免疫原性的方法。在一些实施例中，所述方法包含用非天然编码氨基酸取代天然存在的hPP或hFc中的任何一个或一个以上氨基酸和/或使hPP或hFc与连接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子连接。
本发明还提供用有效量的本发明的hPP或hFc分子治疗需要所述治疗的患者的方法。在一些实施例中，所述方法包含向患者给予治疗有效量的包含包括非天然编码氨基酸的hPP或hFc和医药学上可接受的载剂的医药组合物。在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。
本发明还提供包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列或其中至少一个氨基酸经非天然编码氨基酸取代的任何其它hPP多肽序列的hPP。本发明还提供包含SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列或其中至少一个氨基酸经非天然编码氨基酸取代的任何其它hFc多肽序列的hFc。在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
本发明还提供包含医药学上可接受的载剂和包含SEQ ID NO:1中所示的序列或其中至少一个氨基酸经非天然编码氨基酸取代的任何其它hPP多肽序列的hPP的医药组合物。本发明还提供包含医药学上可接受的载剂和包含SEQ ID NO:22中所示的序列或其中至少一个氨基酸经非天然编码氨基酸取代的任何其它hFc多肽序列的hFc的医药组合物。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含糖部分。在一些实施例中，水溶性聚合物经由糖部分与多肽连接。在一些实施例中，连接子、聚合物或生物活性分子经由糖部分与hPP或hFc连接。
本发明还提供包含在单个氨基酸处经由共价键与hPP或hFc连接的水溶性聚合物的hPP或hFc。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，与水溶性聚合物共价连接的氨基酸是多肽中存在的非天然编码氨基酸。
本发明提供包含至少一个连接子、聚合物或生物活性分子的hPP或hFc，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子通过经由核糖体并入多肽中的非天然编码氨基酸的官能团与多肽连接。在一些实施例中，多肽是经单聚乙二醇化。本发明还提供包含与一个或一个以上非天然编码氨基酸连接的连接子、聚合物或生物活性分子的hPP或hFc，其中所述非天然编码氨基酸在预选定位点处经由核糖体并入多肽中。
在另一实施例中，包含一个或一个以上非天然存在的氨基酸的hPP或hFc与包括(但不限于)PEG的另一分子的结合归因于与非天然氨基酸的结合所利用的独特化学反应而提供实质上纯的hPP或hFc。在另一实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入hPP或hFc的氨基酸序列中提供以下优势：利用非天然编码氨基酸的官能团来纯化hPP或hFc。包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的hPP或hFc与诸如PEG等另一分子的结合可与在结合步骤之前或之后执行以提供实质上纯的hPP或hFc的其它纯化技术一起执行。在另一实施例中，将非天然编码氨基酸取代到hPP或hFc的氨基酸序列中可调节多肽的pKa，多肽的pKa又调节hPP或hFc与其它分子结合时的结合反应条件、速率或效率。在一些实施例中，包含非天然编码氨基酸的hPP或hFc在与结合搭配物接触时展现经调节的结合特征，诸如增加或减小的结合强度。在一些实施例中，包含非天然编码氨基酸的hPP或hFc在与缺乏所述非天然编码氨基酸的相同hPP或hFc相比时展现经调节的组织结合或组织分布特征。在一些实施例中，包含非天然编码氨基酸的hPP或hFc在经调配以用于医药用途时具有经调节的稳定性质。
附图说明
图1A和1B：1A中表示成熟人类白蛋白的氨基酸序列，且1B中表示编码人类白蛋白的核苷酸序列。
图2：表示hA氨基酸的平均Cx值。
图3：表示hA的模型和某些氨基酸位置。
图4：表示hA中用于经非天然编码氨基酸取代的选定氨基酸位置的表。
图5：由考马斯蓝(coomassie)染色的聚丙烯酰胺凝胶电泳表示酵母宿主细胞中重组人类白蛋白的表达。
图6：由考马斯蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶电泳表示多肽序列中含有非天然编码氨基酸的hA的表达。
图7的A图：通过SDS-PAGE分析在存在(+)或不存在(-)5K氨氧基聚(乙二醇)(PEG)的情况下培育的纯Fc(WT)和D1pAF取代的Fc(D1pAF)的还原样品。
图7的B图：通过SDS-PAGE分析在存在(+)或不存在(-)5K氨氧基聚(乙二醇)(PEG)的情况下培育的纯Fc(WT)和D1pAF取代的Fc(D1pAF)的非还原样品。
图8A：表示野生型Fc的多核苷酸序列。
图8B：表示野生型Fc的多肽序列。
图8C：表示成熟Fc的多肽序列。
图8D：表示编码成熟Fc的多核苷酸序列。
图9A：表示tRNA的多核苷酸序列。
图9B：表示编码氨酰基tRNA合成酶的多核苷酸序列。
图10A：表示考马斯蓝染色的聚丙烯酰胶凝胶中将非天然氨基酸并入hA中。
图10B：表示Western印迹法中将非天然氨基酸并入hA中。
图10C：表示Western印迹法中将非天然氨基酸并入hA中。
图11：由Western印迹法表示聚乙二醇化hA的产生。
图12的A图和图12的B图：分别表示包含非天然氨基酸的hA和野生型hA的肽图结果。
图13A：表示包含非天然氨基酸(pAF或对乙酰基苯丙氨酸)的hA的质谱结果。
图13B：表示包含非天然氨基酸pAF(对乙酰基苯丙氨酸)的hA的氨基酸的预测离子质量。
具体实施方式
定义
应了解本发明不受本文中所述的特定方法、方案、细胞系、构筑体和试剂限制，且因此可变化。还应了解，本文中所使用的术语只是出于描述特定实施例的目的，并且不打算限制本发明的范围，本发明的范围将仅受随附权利要求书限制。
除非上下文另作明确指示，否则如本文和随附权利要求中所使用，单数形式“一”和“所述”包括多个指示物。因此，例如提及一“hPP”或“hA”或“hFc”是提及一个或一个以上所述蛋白质且包括所属领域的一般技术人员已知的其等效物，等等。
除非另作定义，否则本文中所使用的所有科技术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。虽然可将与本文中所述的方法、装置和材料类似或等价的任何方法、装置和材料用于本发明的实践或测试中，但现仅对优选方法、装置和材料加以描述。
本文中所提及的所有公开文献和专利都是以引用的方式并入本文中，以达到描述和公开例如所述公开文献中所述的可能与当前所述的发明结合使用的构筑体和方法的目的。本文中所讨论的公开文献仅提供本申请文件的申请日期之前的公开内容。本文决不应解释为承认本发明的发明者无权由于现有发明或任何其它原因使所述公开案的日期提前。
术语“实质上经纯化”在重组产生的“hPP”或“hA”或“hFc”多肽的情况下是指可实质上或基本上不含通常伴随天然存在的环境(即，天然细胞或宿主细胞)中可见的蛋白质或与所述蛋白质相互作用的组分的“hPP”或“hA”或hFc多肽。可实质上不含细胞材料的“hPP”或“hA”或“hFc”多肽包括具有小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％(以干重计)的污染蛋白质的蛋白质制剂。当“hPP”或“hA”或“hFc”多肽或其变异体是通过宿主细胞重组产生时，蛋白质可以细胞干重的约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或不足1％存在。当“hPP”或“hA”或“hFc”多肽或其变异体是通过宿主细胞重组产生时，蛋白质可以细胞干重的约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或不足1mg/L存在于培养基中。因此，如通过诸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳等适当方法所测定，由本发明方法产生的“实质上经纯化”的“hPP”或“hA”或“hFc”多肽可具有至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％的纯度水平，具体来说，至少约75％、80％、85％的纯度水平，且更具体来说，至少约90％的纯度水平、至少约95％的纯度水平、至少约99％的纯度水平或更高纯度水平。
“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指包括外源多核苷酸的细胞，而不考虑用于插入(例如直接摄取、转导、f配对)的方法或所属领域中已知的产生重组宿主细胞的其它方法。所述外源多核苷酸可维持非整合载体形式(例如质粒)，或可整合到宿主基因组中。
如本文中所使用，术语“培养基”包括任何培养基、溶液、固体、半固体或刚性支撑物，其可支撑或含有任何宿主细胞，包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核生物宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞、原核生物宿主细胞、大肠杆菌或假单胞菌(Pseudomonas)宿主细胞和细胞内容物。因此，所述术语可涵盖已生长宿主细胞的培养基，例如已分泌有“hPP”或“hA”或“hFc”多肽的培养基，包括增殖步骤之前或之后的培养基。诸如在“hPP”或“hA”或“hFc”多肽在细胞内产生且宿主细胞已溶解或受到破坏以释放“hPP”或“hA”或“hFc”多肽的情况下，所述术语还可涵盖含有宿主细胞溶解产物的缓冲剂或试剂。
如本文中所使用，“还原剂”就蛋白质再折叠来说是定义为维持巯基处于还原状态且还原分子内或分子间双硫键的任何化合物或物质。合适的还原剂包括(但不限于)二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、二硫赤藓醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和还原型谷胱甘肽。所属领域的一般技术人员将显而易见，多种还原剂适用于本发明的方法和组合物中。
如本文中所使用，“氧化剂”就蛋白质再折叠来说是定义为能够从正在经氧化的化合物中移除电子的任何化合物或物质。合适的氧化剂包括(但不限于)氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化型二硫苏糖醇、氧化型赤藓醇和氧。所属领域的一般技术人员将显而易见，多种氧化剂适用于本发明的方法中。
如本文中所使用，“变性剂”是定义为将引起蛋白质可逆展开的任何化合物或物质。变性剂的强度将由特定变性剂的性质和浓度来决定。合适的变性剂可为离液剂、清洁剂、有机溶剂、水溶性溶剂、磷脂或两种或两种以上所述试剂的组合。合适的离液剂包括(但不限于)脲、胍和硫氰酸钠。适用的清洁剂可包括(但不限于)强清洁剂(诸如十二烷基硫酸钠)或聚氧乙烯醚(例如，Tween或Triton清洁剂)、月桂酰肌氨酸钠(Sarkosyl)、温和的非离子清洁剂(例如，毛地黄皂苷(digitonin))、温和的阳离子清洁剂(诸如，N->2,3-(二油基氧基)-丙基-N,N,N-三甲基铵)、温和的离子清洁剂(例如，胆酸钠或去氧胆酸钠)或两性离子清洁剂(包括(但不限于)硫代甜菜碱(两性离子清洁剂(Zwittergent))、3-(3-胆酰胺基丙基)二甲氨基-1-丙烷硫酸盐(CHAPS)和3-(3-胆酰胺基丙基)二甲氨基-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO))。诸如乙腈、低碳烷醇(尤其诸如乙醇或异丙醇等C2-C4烷醇)或低碳烷二醇(尤其诸如乙二醇等C2-C4烷二醇)等水溶性有机溶剂可用作变性剂。适用于本发明的磷脂可为天然存在的磷脂，诸如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇；或合成磷脂衍生物或变异体，诸如二己酰基磷脂酰胆碱或二庚酰基磷脂酰胆碱。
如本文中所使用，“再折叠”就二硫键来说描述将含有二硫键的多肽从不适当折叠或展开状态转化成天然或适当折叠的构象的任何过程、反应或方法。
如本文中所使用，“共折叠”尤其是指使用至少两个多肽的再折叠过程、反应或方法，所述多肽彼此相互作用且导致展开或不适当折叠的多肽转化为天然、适当折叠的多肽。
如本文中所使用，“人类血浆蛋白或多肽”或“hPP”包括正常人类血浆中可见的那些多肽和蛋白质，包括hPP类似物、hPP同种型、hPP模拟物、hPP片段、杂交hPP蛋白、其融合蛋白、寡聚物和多聚物、同源物、糖基化模式变异体、变异体、剪接变异体以及突变蛋白，而不考虑以上各物的生物活性且更不考虑其合成或制造方法，所述方法包括(但不限于)重组(由cDNA、基因组DNA、合成DNA或核酸的其它形式制备)、活体外、活体内、微注射核酸分子、合成、转基因学以及基因激活方法。所属领域中已知多种hPP且其可见于Anderson等人,Molecular&Cellular Proteomics,3.4:311-326(2004)和Ping等人,Proteomics,5:3506-3519(2005)中，所述参考文献以引用的方式并入本文中。适用于本发明的hPP可包括(但不限于)α1-抗胰凝乳蛋白酶、抗胰蛋白酶、α1-抗胰蛋白酶、前白蛋白、人类白蛋白(人类血清白蛋白)、α1-脂蛋白、A-γ球蛋白、α2-巨球蛋白、α1-微球蛋白、α2-微球蛋白、β2-微球蛋白、本-周蛋白、胆汁分泌组分、补体蛋白3、胆固醇酯转移蛋白、脂肪酸结合蛋白、铁蛋白、铁蛋白H链、纤维蛋白原、抑胃肽、球蛋白、结合球蛋白、血红蛋白、血红蛋白A、血红蛋白A1C、血红蛋白F、糖化血红蛋白、盘状血红蛋白、乳铁蛋白、脂肪酶、溶菌酶、mutY、肌红蛋白、心脏肌红蛋白、血清类粘蛋白、类风湿因子、胰泌素、血清素、甲状腺球蛋白、甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白、三碘甲状腺原氨酸、转移蛋白、维生素D结合蛋白以及其变异体形式。
如本文中所使用，“白蛋白”总起来说是指白蛋白蛋白质或氨基酸序列，或具有白蛋白的一种或一种以上功能活性(例如生物活性)的白蛋白片段或变异体。具体来说，“白蛋白”是指人类白蛋白(“hA”)或其片段，尤其如SEQ ID NO:1中所示的人类白蛋白的成熟形式或来自诸如牛、猪、马、犬、猫或鸟类等其它脊椎动物的白蛋白或其片段，或这些分子或其片段的类似物或变异体。hA的氨基酸序列和核苷酸序列在所属领域中为已知的且公开于例如美国专利第5,879,907号、第5,756,313号、第5,707,828号、第5,986,062号、第5,521,287号、第5,612,197号、第5,440,018号、第5,759,819号以及第5,648,243号中，所述专利以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，本发明中所使用的人类血清白蛋白蛋白质含有下列各组参考SEQ ID NO:1的点突变中的一组或两组：Leu-407突变为Ala、Leu-408突变为Val、Val-409突变为Ala以及Arg-410突变为Ala；或Arg-410突变为Ala、Lys-413突变为G1n以及Lys-414突变为G1n(例如参见国际专利公开文献第WO95/23857号，其以全文引用的方式并入本文中)。在其它实施例中，含有上述各组点突变中的一组或两组的本发明的白蛋白融合蛋白具有改进的针对酵母Yap3p蛋白水解裂解的稳定性/抗性，从而使得在酵母宿主细胞中表达的重组白蛋白融合蛋白的产生增加。
如本文中所使用，足以延长治疗产品的治疗活性、循环时间或保存期的hA的部分是指长度或结构方面足以使蛋白质的治疗活性稳定或延长的hA的部分。蛋白质的白蛋白部分可包含如本文中所述的hA序列的全长，或可包括其一个或一个以上能够提供所需活性的片段。所述hA片段可为10个或10个以上氨基酸长，或可包括约15、20、25、30、50、100或100个以上来自hA序列的相邻氨基酸，或可包括hA的部分或所有特异性域。举例来说，可使用一个或一个以上横跨头两个免疫球蛋白样域的hA的片段。hA的截短形式的实例可见于美国专利第5,380,712号，其以引用的方式并入本文中。
本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可为正常hA的变异体。本发明的白蛋白融合蛋白的治疗蛋白部分也可为如本文中所述的治疗蛋白的变异体。术语“变异体”包括保守性或非保守性插入、缺失和取代，其中所述变化并不会实质上改变白蛋白的肿胀、有效配位体结合和非免疫原性质或活性位点或赋予治疗蛋白的治疗活性的有效域中的一个或一个以上。
具体来说，本发明的hA蛋白可包括hA的天然存在的多晶型变异体和hA的片段，例如EP 322 094中所公开的那些片段。白蛋白可源自任何脊椎动物，尤其任何哺乳动物，例如人类、母牛、绵羊或猪。非哺乳动物白蛋白包括(但不限于)母鸡和鲑鱼。白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可来自与可与hA偶合的分子不同的动物。hA片段或变异体也可用于本发明中。hA变异体可由hA的至少一个完全结构域组成或包含hA的至少一个完全结构域，所述结构域例如域1(SEQ ID NO:1的氨基酸1-194)、2(SEQID NO:1的氨基酸195-387)、3(SEQ ID NO:1的氨基酸388-585)、1/2(SEQ ID NO:1的氨基酸1-387)、2/3(SEQ ID NO:1的氨基酸195-585)或1/3(SEQ ID NO:1的氨基酸1-194和SEQ ID NO:1的氨基酸388-585)。各域自身是由两个同源子域(即1-105、120-194、195-291、316-387、388-491和512-585)和包含残基Lysl06到Glu 119、Glu292到Val315和Glu492到Ala511的柔性子域间连接区构成。本发明的hA蛋白的hA部分优选包含hA的至少一个子域或域，或其保守性修饰。如果hA是基于子域，那么优选将部分或所有相邻连接子用于连接诸如连接子、聚合物或生物活性分子等另一分子。
关于完全全长的天然存在的hA氨基酸序列，参见本文中的SEQ ID NO:1。在一些实施例中，本发明的hA多肽与SEQ ID NO:1实质上一致。关于编码hA的完全核酸序列，参见本文中的SEQ ID NO:2。在一些实施例中，本发明的hA多肽是由与SEQID NO:2实质上一致的核酸序列编码。
术语“hA”还包括天然存在的hA的医药学上可接受的盐和前药和所述盐的前药、多晶型物、水合物、溶剂合物、生物活性片段、生物活性变异体和立体异构体，以及天然存在的hA的激动剂、模拟物和拮抗剂变异体，以及其多肽融合物。术语“hA多肽”涵盖在氨基末端、羧基末端或两者处包含其它氨基酸的融合物。
抗体是对特定抗原展现结合特异性的蛋白质。“天然抗体”通常为包括两个相同轻(L)链及两个相同重(H)链的约150,000道尔顿的异源四聚糖蛋白。各轻链经由一个共价双硫键与重链连接，而双硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间有所不同。各重链和轻链也具有规则间隔开的链内双硫桥键。各重链在一端具有可变域(VH)，后面是若干恒定域。各轻链在一端具有可变域(VL)且在另一端具有恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对准，且轻链可变域与重链的可变域对准。认为特定氨基酸残基在轻链与重链可变域之间形成界面。
术语“可变”是指可变域的某些部分的序列在抗体间广泛不同且产生各特定抗体对其特定抗原的结合特异性的事实。然而，可变性在整个抗体的可变域中并未均匀分布。其集中在轻链与重链可变域中的三个称为互补决定区(CDR)的区段中。可变域的更高保守部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个经由三个或四个CDR连接的主要采用β-折叠构象的FR区，所述CDR形成环连接，且在一些情况下形成β-折叠结构的部分。各链中的CDR通过FR区紧密地结合在一起，且与来自另一链的CDR一起促使形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD.(1991))。
虽然恒定域并未直接参与抗体与抗原的结合，但展现各种效应功能。视重链恒定区的氨基酸序列而定，可将抗体或免疫球蛋白指定为不同种类。存在五个主要种类的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM且这些种类中的多者可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；IgA1和IgA2。对应于免疫球蛋白的不同种类的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ以及μ。在各人类免疫球蛋白种类中，仅已知人类IgG1、IgG2、IgG3和IgM激活补体。
抗体的亲和力成熟在活体内是由主要通过体细胞超诱变(hypermutagenesis)制得的更高亲和力的抗体变异体的抗原选择来驱动。通常也发生“谱系转换(repertoireshift)”，其中可见二次或三次反应的主要生殖系基因与初次或二次反应的所述基因不同。
可通过活体外在抗体基因中引入突变且使用亲和力选择来分离具有改进亲和力的突变体来复制免疫系统的亲和力成熟过程。所述突变抗体可呈现于丝状噬菌体或诸如酵母等微生物的表面上，且可通过对抗原的亲和力或通过从抗原解离的动力学(解离速率(off-rate))选择抗体。Hawkins等人,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。已使用CDR模糊诱变(walking mutagenesis)来使结合1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的人类包膜糖蛋白gpl20的人类抗体(Barbas III等人,PNAS(USA)91:3809-3813(1994)；和Yang等人,J.Mol.Biol.254:392-403(1995))和抗-c-erbB-2单链Fv片段(Schier等人,J.Mol.Biol.263:551567(1996))亲和力成熟。已使用抗体链改组和CDR诱变来使针对HIV的第三高变环的高亲和力人类抗体(Thompson等人,J.Mol.Biol.256:77-88(1996))亲和力成熟。Balint和Larrick Gene 137:109-118(1993)描述计算机辅助的寡脱氧核糖核苷酸导向的扫描诱变，由此同时且全面地搜索可变区基因的所有CDR的改进变异体。使用最初的受限制的诱变策略使αvβ 3特异性人类化抗体亲和力成熟，在所述策略中使所有六个CDR的每个位置都突变，接着表达和筛选包括最高亲和力突变体的组合文库(Wu等人,PNAS(USA)95:6037-6-42(1998))。噬菌体呈现抗体是综述于Chiswell和McCafferty TIBTECH 10:80-84(1992)以及Rader和Barbas III CurrentOpinion in Biotech.8:503-508(1997)中。上述参考文献中报导，在具有提高的亲和力的突变抗体与亲本抗体相比的各情况下，突变抗体在CDR中具有氨基酸取代。
“亲和力成熟”在本文中意思是增加抗体对其抗原的亲和力的方法。亲和力成熟的方法包括(但不限于)计算机筛选法和实验法。
“抗体”在本文中意思是由一个或一个以上实质上由所有或部分抗体基因编码的多肽组成的蛋白质。免疫球蛋白基因包括(但不限于)κ、λ、α、γ(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因以及多个免疫球蛋白可变区基因。本文中的抗体打算包括全长抗体和抗体片段，且包括天然存在于任何生物体中或经工程化(例如，为变异体)的抗体。
“抗体片段”意思是除全长形式以外的抗体的任何形式。本文中的抗体片段包括为存在于全长抗体内的较小组分的抗体和已经工程化的抗体。抗体片段包括(但不限于)Fv、Fc、Fab和(Fab')2、单链Fv(scFv)、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、双功能杂交抗体、CDR1、CDR2、CDR3、CDR的组合、可变区、框架区、恒定区等(Maynard和Georgiou,2000,Annu.Rev.Biomed.Eng.2:339-76；Hudson,1998,Curr.Opin.Biotechnol.9:395-402)。
“Fc”在本文中意思是包含免疫球蛋白域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)的抗体的部分。Fc也可包括存在于Cγ2与Cγ1(Cγ1)之间的N-末端铰链中的任何残基。Fc可指独立的这种区或抗体或抗体片段情况下的这种区。Fc还包括Fc的任何修饰形式，包括(但不限于)天然单体、天然二聚物(双硫键连接)、经修饰二聚物(二硫键和/或非共价连接)以及经修饰单体(即，衍生物)。“hFc”是指人类Fc。
“全长抗体”在本文中意思是构成抗体H和/或L链的天然生物形式的结构。在包括人类和小鼠的大多数哺乳动物中，这种形式是四聚物且由两个相同的两个免疫球蛋白链的对组成，各对具有一个轻链和一个重链，各轻链包含免疫球蛋白域VL和CL，且各重链包含免疫球蛋白域VH、Cγ1、Cγ2和Cγ3。在各对中，轻链和重链可变区(VL和VH)一起导致与抗原的结合，且恒定区(CL、Cγ1、Cγ2和Cγ3，尤其Cγ2和Cγ3)产生抗体效应功能。在一些哺乳动物中，例如在骆驼和美洲驼中，全长抗体可由仅两个重链组成，各重链包含免疫球蛋白域VH、Cγ2和Cγ3。
“免疫球蛋白(Ig)”在本文中意思是由一个或一个以上实质上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。免疫球蛋白包括(但不限于)抗体。免疫球蛋白可具有多种结构形式，包括(但不限于)全长抗体、抗体片段和个别免疫球蛋白域(包括(但不限于)VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL和CL)。
“免疫球蛋白(Ig)域”在本文中意思是由实质上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质域。Ig域包括(但不限于)VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL和CL。
如本文中所使用，“变异蛋白质序列”意思是具有氨基酸一致性与另一类似的蛋白质序列有所不同的一个或一个以上残基的蛋白质序列。所述类似的蛋白质序列可为天然野生型蛋白质序列或野生型序列的另一变异体。起始序列通常称为“亲本”序列且可为野生型或变异序列。举例来说，本发明的优选实施例可利用已进行计算机分析的人类化亲本序列来制备变异体。
本文中，抗体的“可变区”意思是包含VH免疫球蛋白域、VL免疫球蛋白域或VH和VL免疫球蛋白域的一种或一种以上多肽(包括变异体)。可变区可指独立的、呈Fv片段、呈scFv片段、呈较大抗体片段情况下的这种区或呈全长抗体或替代的非抗体骨架分子情况下的这种区的这种多肽。
本发明可用于从大量来源获得的抗体。抗体可实质上由来自任何生物体的一种或一种以上抗体基因编码，所述生物体包括(但不限于)人类、小鼠、大鼠、兔子、骆驼、美洲驼、单峰骆驼、猴，尤其哺乳动物且尤其人类且尤其小鼠和大鼠。在一个实施例中，抗体可为通过使用转基因小鼠或其它动物例如从患者或个体获得的完全人类抗体(Bruggemann和Taussig,1997,Curr.Opin.Biotechnol.8:455-458)，或从与选择方法联合的人类抗体文库获得的完全人类抗体(Griffiths和Duncan,1998,Curr.Opin.Biotechnol.9:102-108)。抗体可来自任何来源，包括人工来源或天然存在的来源。举例来说，本发明可利用工程化抗体，所述抗体包括(但不限于)嵌合抗体和人类化抗体(Clark,2000,Immunol.Today 21:397-402)或源自组合文库。另外，所优化的抗体可为实质上由一个或一个以上天然抗体基因编码的抗体的工程化变异体。举例来说，在一个实施例中，所优化的抗体是已通过亲和力成熟鉴别的抗体。
如本文中所使用，“hFc”或“人类Fc”或“hFc多肽”包括hFc类似物、hFc同种型、hFc模拟物、hFc片段、杂交hFc蛋白、融合蛋白、寡聚物和多聚物、同源物、糖基化模式变异体、变异体、剪接变异体以及其突变蛋白，而不考虑以上各物的生物活性且更不考虑其合成或制造方法，所述方法包括(但不限于)重组(由cDNA、基因组DNA、合成DNA或核酸的其它形式制备)、活体外、活体内、微注射核酸分子、合成、转基因学以及基因激活方法。所属领域中已知多种hFc。
术语“hFc”还包括hFc的医药学上可接受的盐和前药和所述盐的前药、多晶型物、水合物、溶剂合物、生物活性片段、生物活性变异体和立体异构体，以及hFc的激动剂、模拟物和拮抗剂变异体，以及其多肽融合物。术语“hFc多肽”涵盖在氨基末端、羧基末端或两者处包含其它氨基酸的融合物。
各种参考文献公开通过聚合物结合或糖基化进行的多肽修饰。术语“hPP多肽”或“hA多肽”或“hFc多肽”包括与诸如PEG等聚合物结合的多肽且可包含半胱氨酸、赖氨酸或其它残基的一种或一种以上其它衍生。另外，hPP多肽或hA或hFc多肽可包含连接子或聚合物，其中所述连接子或聚合物所结合的氨基酸可为根据本发明的非天然氨基酸，或所述多肽可利用所属领域中已知的技术(诸如与赖氨酸或半胱氨酸偶合)与天然编码氨基酸结合。
术语“hPP多肽”或“hA多肽”或“hFc多肽”还包括糖基化形式，诸如(但不限于)在任何氨基酸位置处糖基化的多肽、多肽的N-连接或O-连接糖基化形式。含有单个核苷酸变化的变异体也被视为hPP多肽或hA多肽或hFc多肽的生物活性变异体。另外，还包括剪接变异体。术语hPP多肽或hA多肽或hFc多肽还包括任何一个或一个以上hPP或hA或hFc多肽或任何其它多肽、蛋白质、碳水化合物、聚合物、小分子、连接子、配位体或任何类型的其它生物活性分子的通过化学方法连接或表达为融合蛋白的hPP或hA或hFc多肽异源二聚物、同源二聚物、异源多聚物或同源多聚物，以及例如含有仍维持生物活性的特异性缺失或其它修饰的多肽类似物。
除非另作说明，否则本文中所述的hA的所有所提及的氨基酸位置都是基于SEQID NO:1中的位置。所属领域技术人员应了解，对应于SEQ ID NO:1或任何其它hA序列中的位置的氨基酸位置都可在诸如hA融合物、变异体、片段等任何其它hA分子中容易地鉴别。举例来说，可使用诸如BLAST等序列比对程式来比对和鉴别蛋白质中的与SEQ ID NO:1、2或其它hA序列中的位置对应的特定位置。本文中参考SEQ IDNO:1或其它hA序列所述的氨基酸的取代、缺失或添加也打算指本文中所述或所属领域中已知的hA融合物、变异体、片段等中的相应位置的取代、缺失或添加，且明确涵盖在本发明中。
除非另作说明，否则本文中所述的hFc的所有所提及的氨基酸位置都是基于SEQID NO:22中的位置。所属领域技术人员应了解，对应于SEQ ID NO:22或任何其它hFc序列中的位置的氨基酸位置都可在诸如hFc融合物、变异体、片段等任何其它hFc分子中容易地鉴别。举例来说，可使用诸如BLAST等序列比对程式来比对和鉴别蛋白质中的与SEQ ID NO:20、21、22、23或其它hFc序列中的位置对应的特定位置。本文中参考SEQ ID NO:22或其它hFc序列所述的氨基酸的取代、缺失或添加也打算指本文中所述或所属领域中已知的hFc融合物、变异体、片段等中的相应位置的取代、缺失或添加，且明确涵盖在本发明中。
“非天然编码氨基酸”是指不为20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸中的一种的氨基酸。可与术语“非天然编码氨基酸”同义使用的其它术语为“非天然氨基酸(non-natural amino acid)”、“非天然存在的氨基酸”。术语“非天然编码氨基酸”还包括(但不限于)通过修饰(例如翻译后修饰)天然编码氨基酸(包括(但不限于)20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)而存在、但本身无法通过翻译复合物天然地并入正在生长的多肽链中的氨基酸。所述非天然存在的氨基酸的实例包括(但不限于)N-乙酰氨基葡萄糖基-L-丝氨酸、N-乙酰氨基葡萄糖基-L-苏氨酸以及O-磷酸酪氨酸。
“氨基末端修饰基团”是指可连接到多肽的氨基末端的任何分子。类似地，“羧基末端修饰基团”是指可连接到多肽的羧基末端的任何分子。末端修饰基团包括(但不限于)各种水溶性聚合物、诸如血清白蛋白等肽或蛋白质或增加肽的血清半衰期的其它部分。
术语“官能团”、“活性部分”、“活化基团”、“离去基团”、“反应位点”、“化学反应性基团”和“化学反应性部分”在所属领域和本文中是用于指分子的不同的可界定的部分或单元。所述术语在化学领域中在一定程度上同义且在本文中用于指示执行某种功能或活性且可与其它分子反应的分子的部分。
术语“键”或“连接子”在本文中用于指通常由化学反应所形成且通常为共价键的基团或键结。水解稳定键意思是所述键在水中实质上稳定且在适用的pH值下(包括(但不限于)在生理条件下)在延长时间内(可能甚至无限期)不与水反应。水解不稳定或可降解的键意思是所述键可在水或水溶液(例如包括血液)中降解。酶促不稳定或可降解的键意思是所述键可通过一种或一种以上酶降解。所属领域中应了解，PEG和相关聚合物可在聚合物主链内或在聚合物主链与聚合物分子的一个或一个以上末端官能团之间的连接子基团内包括可降解键。举例来说，通过PEG羧酸或经活化的PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应所形成的酯键通常在生理条件下水解以释放所述生物活性剂。其它水解可降解键包括(但不限于)碳酸酯键；由胺与醛反应所产生的亚胺键；通过使醇与磷酸酯基反应形成的磷酸酯键；作为酰肼与醛的反应产物的腙键；作为醛与醇的反应产物的缩醛键；作为甲酸盐与醇的反应产物的原酸酯键；由包括(但不限于)诸如PEG等聚合物的末端的胺基与肽的羧基形成的肽键；以及由包括(但不限于)聚合物末端的亚磷酰胺(phosphoramidite)基与寡核苷酸的5'羟基形成的寡核苷酸键。
术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”在本文中使用时意思是可影响涉及生物体(包括(但不限于)病毒、细菌、噬菌体、转座子、朊病毒、昆虫、真菌、植物、动物以及人类)的生物系统、途径、分子或相互作用的任何物理或化学性质的任何物质。具体来说，如本文中所使用，生物活性分子包括(但不限于)预期用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人类或其它动物的疾病或者以其它方式增强人类或动物的身体或精神健康状况的任何物质。生物活性分子的实例包括(但不限于)肽、蛋白质、酶、小分子药物、硬药、软药、碳水化合物、无机原子或分子、染料、脂质、核苷、放射性核素、寡核苷酸、毒素、细胞、病毒、脂质体、微粒以及胶束。适用于本发明的生物活性剂的种类包括(但不限于)药物、前药、放射性核素、显影剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、消炎剂、抗肿瘤剂、心血管剂、抗焦虑剂、激素、生长因子、类固醇剂、微生物来源的毒素等。P32生物活性分子涵盖多种多肽，包括(但不限于)。适用于本发明的多肽的代表性非限制性种类包括属于下列治疗剂类别的种类：促肾上腺皮质激素肽、肾上腺髓质素肽(adrenomedullin peptide)、咽侧体抑制素肽、胰淀素肽(amylin peptide)、淀粉样β-蛋白质片段肽、血管紧张素肽、抗菌肽、抗原多肽、抗微生物肽、细胞凋亡相关肽、心房利尿钠肽、袋细胞肽(bag cellpeptide)、铃蟾肽、骨GLA肽、缓激肽(bradykinin peptide)、脑利尿钠肽、C-肽、C型利尿钠肽、降钙素肽、降钙素基因相关肽、CART肽、酪啡肽、趋化性肽、胆囊收缩素肽、菌落刺激因子肽、促肾上腺皮质激素释放因子肽、皮质抑素肽、细胞因子肽、皮啡肽、强啡肽、内啡肽、内皮素肽、ETa受体拮抗剂肽、ETb受体拮抗剂肽、脑啡肽、纤维粘连蛋白肽、甘丙肽、胃泌素肽、胰高血糖素肽、Gn-RH相关肽、生长因子肽、生长激素肽、GTP结合蛋白片段肽、鸟苷素肽、抑制素肽、胰岛素肽、白细胞介素肽、层粘连蛋白肽、瘦素肽、白细胞激肽(leucokinin peptide)、黄体生成素释放激素肽、肥大细胞脱粒肽(mastoparan)、肥大细胞脱粒肽(mast cell degranulating peptide)、促黑素细胞激素肽、吗啡肽(morphiceptin peptide)、胃动素肽、神经肽、神经肽Y肽、嗜神经性因子肽、食欲素肽、阿片样肽(opioid peptide)、催产素肽、PACAP肽、胰抑制素肽、胰多肽、甲状旁腺激素肽、甲状旁腺激素相关肽、肽T肽、促乳激素释放肽、肽YY肽、肾素底物肽、胰泌素肽、生长抑素肽、P物质肽、速激肽(tachykininpeptide)、促甲状腺激素释放激素肽、毒素肽、血管活性肠肽、加压素肽以及病毒相关肽(参见美国专利第6,858,580号)。
作为多肽的生物活性分子的实例包括(但不限于)垂体激素，诸如加压素、催产素、促黑素细胞激素、促肾上腺皮质激素、生长激素；下丘脑激素，诸如生长激素释放因子、促肾上腺皮质素释放因子、促乳激素释放肽、促性腺激素释放激素和其相关肽、黄体激素释放激素、促甲状腺素释放激素、食欲素肽以及生长抑素；甲状腺激素，诸如降钙素、降钙素前体以及降钙素基因相关肽；甲状旁腺激素和其相关蛋白质；胰激素，诸如胰岛素和胰岛素样肽、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽、胰淀素(amylin)、肽YY以及神经肽Y；消化性激素，诸如胃泌素、胃泌素释放肽、胃泌素抑制肽、胆囊收缩素、胰泌素、胃动素以及血管活性肠肽；利尿钠肽，诸如心房利尿钠肽、脑利尿钠肽以及C型利尿钠肽；神经激肽，诸如神经激肽A、神经激肽B以及P物质；肾素相关肽，诸如肾素底物和抑制剂以及血管紧张素；内皮素，包括大内皮素、内皮素A受体拮抗剂以及角蝰毒素(sarafotoxin)肽；以及其它肽，诸如肾上腺髓质素肽、咽侧体抑制素肽、淀粉样β蛋白质片段、抗生素以及抗生物肽、细胞凋亡相关肽、袋细胞肽、铃蟾肽、骨Gla蛋白肽、CART肽、趋化性肽、皮质抑素肽、纤维粘连蛋白片段和血纤蛋白原相关肽、FMRF和类似肽、甘丙肽和相关肽、生长因子和相关肽、G治疗肽结合蛋白片段、鸟苷素和尿鸟苷素、抑制素肽、白细胞介素和白细胞介素受体蛋白、层粘连蛋白片段、瘦素片段肽、白细胞激肽、肥大细胞脱粒肽、垂体腺苷酸环化酶激活多肽、胰抑制素、肽T、多肽、病毒相关肽、信号转导试剂、毒素以及杂肽(miscellaneous peptide)，诸如佐剂肽类似物、α交配因子、抗心律不齐肽、防冻多肽、减食欲肽、牛松果抗生育肽、三肽囊素(bursin)、C3肽P16、肿瘤坏死因子、钙粘连蛋白肽、嗜铬粒蛋白A片段、避孕四肽、芋螺毒素(conantokin)G、芋螺毒素T、甲壳动物心脏活性肽、C-端肽、细胞色素b588肽、抗栓肽(decorsin)、美味肽(deliciouspeptide)、δ-睡眠肽、安定(diazempam)结合抑制剂片段、氧化氮合成酶嵌段肽、OVA肽、血小板钙蛋白酶抑制剂(P1)、纤溶酶原激活物抑制剂1、rigin、精神分裂症相关肽、血清胸腺因子、钠钾A治疗剂肽酶抑制剂-1、精子激活肽(speract)、精液激活肽、系统素、凝血酶受体激动剂、胸腺体液γ2因子、胸腺五肽(thymopentin)、胸腺素α1、胸腺因子、促吞噬肽(tuftsin)、脂肪酸释放激素、尿毒症五肽、葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-1)、艾生丁-3(exendin-3)、艾生丁-4以及其它治疗肽或其片段。肽的其它实例包括胃內激素(ghrelin)、阿片样肽(酪啡肽、皮啡肽、内啡肽、脑啡肽、δ啡肽、强啡肽以及这些肽的类似物和衍生物)、胸腺肽(胸腺生成素、胸腺九肽、胸腺五肽、胸腺素、胸腺体液因子(Thymic Humoral Factor，THF))、细胞粘着肽、补体抑制剂、凝血酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、α-1抗胰蛋白酶、海胆精液激活肽、SHU-9119 MC3-R和MC4-R拮抗剂、格拉莫德(glaspimod)(适用于细菌感染、真菌感染、免疫缺陷免疫病症、白血球减少症的免疫刺激剂)、HP-228(适用于化学疗法诱发的呕吐、毒性、疼痛、糖尿病、炎症、类风湿性关节炎、肥胖的黑色素皮质素)、α2-纤溶酶抑制剂(纤溶酶抑制剂)、APC肿瘤抑制因子(适用于赘瘤的肿瘤抑制因子)、早孕因子(免疫抑制剂)、内源性类苯甲二氮肽(endozepine)安定结合抑制剂(受体肽)、γ干扰素(适用于白血病)、腺性激肽释放酶-1(免疫刺激剂)、胎盘核糖核酸酶抑制剂、sarcolecin结合蛋白、表面活性剂蛋白质D、韦尔姆斯氏肿瘤抑制因子(Wilms'tumor suppressor)、GABAB1b受体肽、朊病毒相关肽(iPrP13)、胆碱结合蛋白片段(细菌相关肽)、端粒酶抑制剂、cardiostatin肽、內皮抑制素衍生肽(血管生成抑制剂)、朊病毒抑制肽、D-天冬氨酸N-甲基酯受体拮抗剂、C-肽类似物(适用于糖尿病并发症)、RANTES、NTY受体、NPY2-R(神经肽Y型2-受体)配位体、NC4R肽或其片段。参见美国专利6,849,714，其以引用的方式并入本文中。还包括α-1抗胰蛋白酶、血管抑制素、抗溶血因子、抗体、载脂蛋白(Apolipoprotein)、载脂蛋白(Apoprotein)、心房利尿钠因子、心房利尿钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子(例如T39765、NAP-2、ENA-78、Gro-a、Gro-b、Gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG)、降钙素、CC趋化因子(例如单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞发炎性蛋白-1α、单核细胞发炎性蛋白-1β、RANTES、I309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262)、CD40配位体、C-kit配位体、胶原蛋白、菌落刺激因子(Colonystimulating factor，CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子(例如上皮中性粒细胞激活肽-78、GROα/MGSA、GRO、GRO、MIP-1、MIP-1、MCP-1)、表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)、促红细胞生成素(Erythropoietin，“EPO”)、剥脱性毒素A及和B、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor，FGF)、纤维蛋白原、纤维粘连蛋白、G-CSF、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、刺猬蛋白(Hedgehog protein)(例如音速(Sonic)、印度(Indian)、沙漠(Desert))、血红蛋白、肝细胞生长因子(HepatocyteGrowth Factor，HGF)、水蛭素、人类血清白蛋白、胰岛素、胰岛素样生长因子(Insulin-likeGrowth Factor，IGF)、干扰素(例如IFN-α、IFN-β、IFN-γ)、白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12等)、角质细胞生长因子(Keratinocyte Growth Factor，KGF)、乳铁蛋白(Lactoferrin)、白血病抑制因子、荧光素酶、神经营养因子、中性粒细胞抑制因子(Neutrophil inhibitory factor，NIF)、抑瘤素M、成骨蛋白、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素(例如人类生长激素)、多效营养因子(Pleiotropin)、蛋白质A、蛋白质G、致热外毒素A、B或C、松弛素、肾素、SCF、可溶性补体受体I、可溶性I-CAM1、可溶性白细胞介素受体(IL-1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15)、可溶性TNF受体、生长调节素、生长抑素、生长激素、链激酶、超抗原(即，葡萄球菌肠毒素(SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE))、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素(TSST-1)、胸腺素α1、组织型纤溶酶原激活剂、肿瘤坏死因子β(TNFβ)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、血管內皮生长因子(Vascular Endothelial GrowthFactor，VEGEF)、尿激酶、T-20、SS-14、LHRH、促红细胞生成素(EPO)、G-CSF、TPO、阿索开(axokine)、瘦素等。与生物活性分子结合、连接或融合的hA的实例可见于美国专利第7,056,701号、第7,041,478号、第7,045,318号、第6,994,857号、第6,987,006号、第6,972,322号、第6,946,134号、第6,926,898号、第6,905,688号、第6,686,179号、第6,548,653号、第6,423,512号、第5,773,417号以及第5,594,110号中，其以引用的方式并入本文中。
“双官能聚合物”或“双官能连接子”是指包含两个能够与其它部分(包括(但不限于)氨基酸侧基)特异性反应以形成共价或非共价键的离散官能团的分子。具有一个与特定生物活性组分上的基团反应的官能团和另一与第二生物活性组分上的基团反应的基团的双官能连接子可用于形成包括第一生物活性组分、双官能连接子和第二生物活性组分的结合物。已知使各种化合物与肽连接的多种程序和连接分子。例如参见欧洲专利申请文件第188,256号、美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号、第4,680,338号以及第4,569,789号，所述专利以引用的方式并入本文中。“多官能聚合物”或“多官能连接子”是指包含两个或两个以上能够与其它部分(包括(但不限于)氨基酸侧基)特异性反应以形成共价或非共价键的离散官能团的分子。双官能聚合物或连接子或多官能聚合物或连接子可具有任何所需长度或分子量，且可经选择以在连接到hPP或hFc的一个或一个以上分子与其结合搭配物或hPP或hFc之间提供特定的所需间隔或构象。
当通过从左向右书写的常规化学式来说明取代基时，同样涵盖由从右向左书写的结构所得到的在化学上相同的取代基，例如，结构-CH2O-与结构-OCH2-等价。
术语“取代基”包括(但不限于)“无干扰取代基”。“无干扰取代基”是那些产生稳定化合物的基团。合适的无干扰取代基或基团包括(但不限于)卤基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C1-C10烷氧基、C1-C12芳烷基、C1-C12烷芳基、C3-C12环烷基、C3-C12环烯基、苯基、经取代苯基、甲苯基、二甲苯基、联苯基、C2-C12烷氧基烷基、C2-C12烷氧基芳基、C7-C12芳氧基烷基、C7-C12氧基芳基、C1-C6烷基亚磺酰基、C1-C10烷基磺酰基、-(CH2)m-O-(C1-C10烷基)(其中m为1至8)、芳基、经取代芳基、经取代烷氧基、氟烷基、杂环基、经取代杂环基、硝基烷基、-NO2、-CN、-NRC(O)-(C1-C10烷基)、-C(O)-(C1-C10烷基)、C2-C10烷硫基烷基、-C(O)O-(C1-C10烷基)、-OH、-SO2、＝S、-COOH、-NR2、羰基、-C(O)-(C1-C10烷基)-CF3、-C(O)-CF3、-C(O)NR2、-(C1-C10芳基)-S-(C6-C10芳基)、-C(O)-(C1-C10芳基)、-(CH2)m-O-(CH2)m-O-(C1-C10烷基)(其中m各自为1至8)、-C(O)NR2、-C(S)NR2、-SO2NR2、-NRC(O)NR2、-NRC(S)NR2、其盐等。如本文中所使用，各R为H、烷基或经取代烷基、芳基或经取代芳基、芳烷基或烷芳基。
术语“卤素”包括氟、氯、碘以及溴。
除非另作说明，否则术语“烷基”本身或作为另一取代基的部分时意思是具有指定碳原子数目(即，C1-C10意思是1到10个碳)的直链或支链或环状烃基或其组合，其可为完全饱和、单不饱和或多不饱和的且可包括二价和多价基团。饱和烃基的实例包括(但不限于)以下基团，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基；(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和异构物等。不饱和烷基是具有一个或一个以上双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及高级同系物和异构物。除非另作说明，否则术语“烷基”还打算包括下文更为详细地定义的烷基衍生物，诸如“杂烷基”。只限于烃基的烷基被称为“同系烷基(homoalkyl)”。
术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的部分时意思是衍生自烷烃的二价基团，例如(但不限于)结构-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-且进一步包括下文中描述为“杂亚烷基”的那些基团。烷基(或亚烷基)通常将具有1到24个碳原子，其中具有10个或10个以下碳原子的那些基团是本文中所述的方法和组合物的特定实施例。“低碳烷基”或“低碳亚烷基”是通常具有8个或8个以下碳原子的较短链烷基或亚烷基。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷基硫基”(或硫代烷氧基)是以其常规含义使用，且分别是指通过氧原子、氨基或硫原子与分子的其余部分连接的那些烷基。
除非另作说明，否则术语“杂烷基”本身或与另一术语组合时意思是稳定的直链或支链或环状烃基或其组合，其由规定数目的碳原子和至少一个选自由O、N、Si和S组成的群组的杂原子组成，且其中氮原子和硫原子可视情况经氧化且氮杂原子可视情况经季铵化。杂原子O、N和S以及Si可位于杂烷基的任何内部位置或位于烷基与分子的其余部分连接的位置处。实例包括(但不限于)-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3以及-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可相邻，诸如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂亚烷基”本身或作为另一取代基的部分时意思是衍生自杂烷基的二价基团，例如(但不限于)-CH2-CH2-S-CH2CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基来说，相同或不同的杂原子也可占据链的一端或两端(包括(但不限于)亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨基氧基亚烷基等)。另外，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团来说，连接基团的化学式所书写的方向并不表示连接基团的定向。举例来说，式-C(O)2R'-表示-C(O)2R'-和-R'C(O)2-。
除非另外说明，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其它术语组合时分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。因此，环烷基或杂环烷基包括饱和、部分不饱和以及完全不饱和环键。另外，对于杂环烷基来说，杂原子可占据杂环与分子的其余部分连接的位置。环烷基的实例包括(但不限于)环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括(但不限于)1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。另外，所述术语还涵盖双环和三环结构。类似地，术语“杂亚环烷基”本身或作为另一取代基的部分时意思是衍生自杂环烷基的二价基团，且术语“亚环烷基”本身或作为另一取代基的部分时意思是衍生自环烷基的二价基团。
如本文中所使用，术语“水溶性聚合物”是指可溶于水性溶剂中的任何聚合物。水溶性聚合物与hPP或hA或hFc多肽的连接可产生改变，包括(但不限于)相对于未经修饰的形式增加或经调节的血清半衰期或增加或经调节的治疗半衰期、经调节的免疫原性、经调节的物理缔合特征(诸如聚集和多聚物形成)、改变的受体结合、改变的与一种或一种以上结合搭配物的结合以及改变的受体二聚化或多聚化作用。水溶性聚合物可具有或可不具有其本身的生物活性且可用作使hPP或hA或hFc与其它物质(包括(但不限于)一种或一种以上hPP或hA或hFc多肽，或一种或一种以上生物活性分子)连接的连接子。合适的聚合物包括(但不限于)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(描述于美国专利第5,252,714号中，其以引用的方式并入本文中)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚马来酸酐、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖类衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物(包括(但不限于)甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚烷二醇和其衍生物、聚烷二醇的共聚物和其衍生物、聚乙烯基乙基醚以及α-β-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺等或其混合物。所述水溶性聚合物的实例包括(但不限于)聚乙二醇和血清白蛋白。
如本文中所使用，术语“聚烷二醇”或“聚(烷二醇)”是指聚乙二醇(聚(乙二醇))、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。术语“聚烷二醇”涵盖线性与支化聚合物且平均分子量介于0.1kDa与100kDa之间。其它例示性实施例是列于(例如)供应商目录中，诸如Shearwater Corporation的目录“用于生物医学应用的聚乙二醇和衍生物(Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications)”(2001)。
除非另作说明，否则术语“芳基”意思是可为单环或稠合在一起或共价连接的多环(包括(但不限于)1到3个环)的多不饱和芳香族烃取代基。术语“杂芳基”是指含有1到4个选自N、O以及S的杂原子的芳基(或环)，其中氮原子和硫原子视情况经氧化且氮原子视情况经季铵化。杂芳基可通过杂原子与分子的其余部分连接。芳基和杂芳基的非限定性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基以及6-喹啉基。上述芳基和杂芳基环系统中的每一个的取代基都选自下文中所述的可接受的取代基的群组。
为了简便起见，当与其它术语组合使用时(包括(但不限于)芳氧基、芳基硫氧基、芳烷基)，术语“芳基”包括如上文所定义的芳基环与杂芳基环。因此，术语“芳烷基”打算包括芳基与烷基连接的那些基团(包括(但不限于)苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等)，所述烷基包括碳原子(包括(但不限于)亚甲基)已经(例如)氧原子置换的那些烷基(包括(但不限于)苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘基氧基)丙基等)。
上述术语(包括(但不限于)“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)各自打算包括所指示的基团的经取代和未经取代形式。各类型基团的例示性取代基提供如下。
烷基和杂烷基(包括通常称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基以及杂环烯基的那些基团)的取代基可为多种选自(但不限于)以下各基团的基团中的一个或一个以上基团：-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R″′、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′C(O)NR″R″′、-NR″(O)2R′、-NR-C(NR′R″R″′)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR″′、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN以及-NO2，其数目在0到(2m′+1)(其中m′为所述基团中的碳原子的总数)的范围内。R′、R″、R″′和R″″各自独立地是指氢、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基(包括(但不限于)经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。举例来说，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，各R基团是独立地经选择，而当存在R′、R″、R″′和R″″基团中的一个以上时，这些基团同样是各自独立地经选择。当R'和R″与同一氮原子连接时，其可与氮原子组合以形成5元环、6元环或7元环。举例来说，-NR′R″打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据取代基的上述讨论，所属领域的技术人员应了解，术语“烷基”打算包括包含与除氢基以外的基团结合的碳原子的基团，诸如卤烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3,、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
类似于关于烷基所述的取代基，芳基和杂芳基的取代基可变化且是选自(但不限于)卤素、-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R″′、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′C(O)NR″R″′、-NR″(O)2R′、-NR-C(NR′R″R″′)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR″′、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN以及-NO2、-R′、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基以及氟(C1-C4)烷基，数目在零到芳环系统上的开放价态的总数的范围内；且其中R′、R″、R″′和R″″是独立地选自氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。举例来说，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，各R基团是独立地经选择，而当存在R′、R″、R″′和R″″基团中的一个以上时，这些基团同样是各自独立地经选择。
如本文中所使用，术语“经调节的血清半衰期”意思是经修饰hPP或hA或hFc的循环半衰期相对于其未经修饰的形式存在正或负改变。血清半衰期是通过在给予hPP或hA或hFc后的各个时间点获取血液样本且测定各样本中所述分子的浓度来进行测量。血清浓度与时间的相关性允许计算血清半衰期。血清半衰期的增加理想地为至少约两倍，但例如当较小增加能够促成令人满意的给药方案或避免毒性作用时，较小增加也可适用。在一些实施例中，所述增加为至少约3倍、至少约5倍或至少约10倍。
如本文中所使用，术语“经调节的治疗半衰期”意思是治疗有效量的hPP或hA或hFc的半衰期相对于其未经修饰的形式存在正或负改变。治疗半衰期是通过测量给药后各个时间点的药物动力学和/或药效性质来进行测量。增加的治疗半衰期理想地能够促成特别有益的给药方案、特别有益的总剂量或避免不合需要的作用。在一些实施例中，增加的治疗半衰期是由增加的功效、增加或降低的经修饰分子与其标靶的结合、增加或降低的酶(诸如蛋白酶)对分子的降解或未经修饰分子的另一参数或作用机理的增加或降低引起。
当术语“经分离”应用于核酸或蛋白质时，其表示所述核酸或蛋白质不含其在天然状态下缔合的细胞组分中的至少一些组分，或所述核酸或蛋白质已浓缩到高于其活体内或活体外产生浓度的程度。其可呈均质状态。经分离物质可处于干燥或半干燥状态或为溶液(包括(但不限于)水溶液)。其可为包含其它医药学上可接受的载剂和/或赋形剂的医药组合物的组分。通常使用分析化学技术来测定纯度和均质性，所述技术诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。作为制剂中所存在的主要物质的蛋白质实质上经纯化。具体来说，经分离基因是从侧接所述基因且编码除所关注的基因以外的蛋白质的开放阅读框分离。术语“经纯化”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生实质上一个条带。具体来说，其意思可能是核酸或蛋白质为至少85％纯、至少90％纯、至少95％纯、至少99％或99％以上纯。
术语“核酸”是指脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸以及其单链或双链形式的聚合物。除非特定限制，否则所述术语还涵盖含有具有与参考核酸类似的结合性质且以类似于天然存在核苷酸的方式代谢的天然核苷酸的已知类似物的核酸。除非另外特定限制，否则所述术语也是指包括PNA(肽基核酸)、反义技术中使用的DNA的类似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)的寡核苷酸类似物。除非另外指出，否则特定核酸序列也暗示性涵盖其保守性修饰变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。具体来说，可通过产生一个或一个以上所选(或全部)密码子的第三位置经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；以及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes8:91-98(1994))。
术语“多肽”、“肽”以及“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于对肽的描述和对蛋白质的描述，且反之亦然。所述术语适用于天然存在氨基酸聚合物以及一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖具有任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
术语“氨基酸”是指天然存在和非天然存在的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码氨基酸为20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸以及缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在氨基酸相同的基本化学结构(即，与氢、羧基、氨基以及R基团结合的α-碳)的化合物，诸如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。所述类似物具有经修饰R基团(诸如，正亮氨酸)或经修饰肽主链，但仍保留与天然存在氨基酸相同的基本化学结构。
氨基酸在本文中可由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来指代。同样地，核苷酸可由其通常接受的单字母代码来指代。
“保守性修饰变异体”适用于氨基酸与核酸序列。对于特定核酸序列来说，“保守性修饰变异体”是指编码一致或基本上一致的氨基酸序列的核酸，或当核酸不编码氨基酸序列时是指基本上一致的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定蛋白质。举例来说，密码子GCA、GCC、GCG以及GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每一位置处，密码子可改变为所述相应密码子中的任一个而不改变经编码的多肽。所述核酸变异为“沉默变异(silent variation)”，其为保守性修饰变异中的一种。编码多肽的本文中的每一核酸序列也描述核酸的每一种可能的沉默变异。所属领域的技术人员应认识到，核酸中的各密码子(除通常为蛋氨酸的唯一密码子的AUG和通常为色氨酸的唯一密码子的TGG外)可经修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的各沉默变异隐含在各所述序列中。
关于氨基酸序列，所属领域的技术人员应认识到，改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或少量氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加为“保守性修饰变异体”，其中所述改变将导致氨基酸的缺失、氨基酸的添加或化学上类似的氨基酸对氨基酸的取代。所属领域的一般技术人员已知提供功能类似的氨基酸的保守性取代表。所述保守性修饰变异体是在本发明的多晶型变异体、种间同源物以及等位基因的范围之外且不将其排除在外。
所属领域的一般技术人员已知提供功能类似的氨基酸的保守性取代表。下列八组各自含有彼此互为保守性取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及
8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)
(例如参见Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W H Freeman&Co.；第2版(1993年12月))。
在两个或两个以上核酸或多肽序列的情形中，术语“一致”或“一致性”百分比是指相同的两个或两个以上序列或子序列。当通过比较窗比较和比对最大对应性时，或如使用下列序列比较算法(或所属领域的一般技术人员可用的其它算法)中的一种或通过手工比对和目测检查来测量指定区域时，如果序列具有相同(即，在指定区域上具有约60％的一致性，约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％的一致性)的氨基酸残基或核苷酸百分比，那么所述序列为“实质上一致”的。这一定义也是指测试序列的互补序列。一致性可存在于长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区域中，或长度为75-100个氨基酸或核苷酸的区域中，或(在未指定时)在多核苷酸或多肽的整个序列中。
对于序列比较来说，通常使一个序列充当与测试序列相比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列与参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，且指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定替代参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。
如本文中所使用，“比较窗”包括提及选自由20到600、通常约50到约200、更通常约100到约150组成的群组的连续位置数目中的任一个的区段，其中可在将序列与具有相同数目的连续位置的参考序列最佳比对后对两个序列进行比较。所属领域中的一般技术人员已知用于比较的序列比对方法。可如下进行用于比较的序列的最佳比对，包括(但不限于)通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法；通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法；通过搜索Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444的相似方法；通过这些算法的计算机实施(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics ComputerGroup,575 Science Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA)；或通过手动比对和目测检查(例如参见Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology(1995增刊))。
适于测定序列一致性百分比和序列相似性的算法的一个实例为BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等人,(1997)Nuc.Acids Res.25:3389-3402和Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。执行BLAST分析的软件可通过在万维网的ncbi.nlm.nih.gov上获得的美国生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开获得。BLAST算法参数W、T及X将决定比对的灵敏性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4和两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列来说，BLASTP程序使用字长为3且期望值(E)为10和BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl,Acad.Sci.USA 89:10915)、比对值(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认值。BLAST算法通常在“低复杂度”过滤关闭下执行。
BLAST算法也执行两个序列之间相似性的统计分析(例如参见Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。由BLAST算法提供的一种相似性量度是最小和概率(P(N))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然会发生匹配的概率的指示。举例来说，如果在测试核酸与参考核酸的比较中，最小和概率小于约0.2，或小于约0.01，或小于约0.001，那么就认为所述核酸与参考序列相似。
短语“与…选择性(或特异性)杂交”是指当特定核苷酸序列存在于复杂混合物(包括(但不限于)总细胞或文库DNA或RNA)中时，在严格杂交条件下分子仅与所述序列结合、双联或杂交。
短语“严格杂交条件”是指DNA、RNA、PNA或其它核酸模拟物或其组合的序列在如所属领域中已知的低离子强度和高温条件下的杂交。在严格条件下，探针通常将会与核酸的复杂混合物(包括(但不限于)总细胞或文库DNA或RNA)中的其标靶子序列杂交，但不与复杂混合物中的其它序列杂交。严格条件具有序列依赖性且在不同环境下会有所不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。核酸杂交的详细指南可见于Tijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacid assays"(1993)中。严格条件通常经选择为在规定离子浓度、pH值下比特异性序列的热力学熔点(Tm)低约5℃-10℃。Tm是与标靶互补的探针的50％在平衡状态下与标靶序列杂交(当标靶序列过量存在时，在Tm下，平衡时50％的探针被占据)的温度(在规定离子强度、pH值以及核酸浓度下)。严格条件可为在pH值为7.0到8.3下盐浓度小于约1.0M钠离子、通常约0.01M到1.0M钠离子浓度(或其它盐)且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)来说为至少约30℃且对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)来说为至少约60℃的那些条件。严格条件也可通过添加去稳定剂(诸如，甲酰胺)来实现。对选择性或特异性杂交来说，阳性信号可为至少两倍背景、视情况10倍背景杂交。例示性严格杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％ SDS，在42℃下培育，或5×SSC，1％ SDS，在65℃下培育，其中在65℃下以0.2×SSC和0.1％SDS洗涤。所述洗涤可进行5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟或120分钟以上。
如本文中所使用，术语“真核细胞”是指属于系统发育域(phylogenetic domain)真核域(Eucarya)的生物体，诸如动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括(但不限于)单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子虫、原生生物等。
如本文中所使用，术语“非真核生物”是指非真核生物体。举例来说，非真核生物体可属于真细菌(Eubacteria)(其包括(但不限于)大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等)系统发育域，或古细菌(Archaea)(其包括(但不限于)詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、产甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)、诸如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferax volcanii)和嗜盐菌属NRC-1(Halobacterium NRC-1)等嗜盐菌、超嗜热古菌(Archaeoglobus fulgidus)、强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)、极端嗜热古菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜热泉生古细菌(Aeuropyrum pernix)等)系统发育域。
如本文中所使用，术语“个体”是指动物，在一些实施例中是指哺乳动物，且在其它实施例中是指人类，其是治疗、观察或实验的对象。
如本文中所使用，术语“有效量”是指会在一定程度上减轻所治疗的疾病、病状或病症的一种或一种以上症状的所给予的经修饰非天然氨基酸多肽的量。可给予含有本文中所述的经修饰非天然氨基酸多肽的组合物来进行预防性、增强性和/或治疗性治疗。
术语“增强”意思是增加或延长所需作用的效力或持续时间。因此，对于增强治疗剂的作用来说，术语“增强”是指在效力或持续时间方面增加或延长其它治疗剂对系统的作用的能力。如本文中所使用，“增强有效量”是指足以增强另一治疗剂在所需系统中的作用的量。当用于患者中时，对于此用途有效的量将视以下因素而定：疾病、病症或病状的严重性和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的反应以及主治医师的判断。
如本文中所使用，术语“经修饰”是指对给定多肽所进行的任何改变，诸如多肽的长度、多肽的氨基酸序列、化学结构、共翻译修饰或翻译后修饰的改变。形式“(经修饰)”术语意思是所讨论的多肽视情况经修饰，即，所讨论的多肽可经修饰或不经修饰。
术语“翻译后修饰”是指在将天然或非天然氨基酸并入多肽链中以后发生的对所述氨基酸的任何修饰。仅举例来说，所述术语涵盖共翻译活体内修饰、共翻译活体外修饰(诸如，在无细胞翻译系统中)、翻译后活体内修饰和翻译后活体外修饰。
在预防性应用中，将含有经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物给予易患特定疾病、病症或病状或处于患特定疾病、病症或病状的风险中的患者。所述量是定义为“预防有效量”。在这一用途中，精确量还视患者的健康状况、体重等而定。认为通过常规实验(例如，剂量递增临床试验)来确定所述预防有效量完全在所属领域的技能范围内。
术语“经保护”是指存在防止化学反应性官能团在某些反应条件下反应的“保护基”或部分。保护基将视所保护的化学反应性基团的类型而改变。举例来说，如果化学反应性基团为胺或酰肼，那么保护基可选自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群组。如果化学反应性基团为硫醇，那么保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应性基团为诸如丁酸或丙酸等羧酸或羟基，那么保护基可为苯甲基或诸如甲基、乙基或叔丁基等烷基。本文中所述的方法和组合物中也可使用所属领域中已知的其它保护基，包括对光不稳定的基团，诸如Nvoc和MeNvoc。本文中所述的方法和组合物中也可使用所属领域中已知的其它保护基。
仅举例来说，封端/保护基可选自：
其它保护基是描述于Greene和Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,第3版,John Wiley&Sons,New York,NY,1999中，其是以全文引用的方式并入本文中。
在治疗性应用中，将含有经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物以足以治愈或至少部分阻滞疾病、病症或病状的症状的量给予已患所述疾病、病状或病症的患者。所述量是定义为“治疗有效量”且将视疾病、病症或病状的严重性和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的反应以及主治医师的判断而定。认为通过常规实验(例如，剂量递增临床试验)来确定所述治疗有效量完全在所属领域的技能范围内。
术语“治疗”是用于指预防性和/或治疗性治疗。
本文中提出的非天然编码氨基酸多肽可包括一个或一个以上原子经具有与自然界中通常可见的原子质量或质量数不同的原子质量或质量数的原子置换的经同位素标记的化合物。可并入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、氟以及氯的同位素，分别诸如2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、35S、15F、36Cl。本文中所述的某些经同位素标记的化合物(例如合并有诸如3H和14C等放射性同位素的那些化合物)可适用于药物和/或底物组织分布检定。此外，用诸如氘(即2H)等同位素取代可提供某些由较高代谢稳定性产生的治疗优势，例如增加的活体内半衰期或降低的剂量需求。
所有异构体都被视作本文中所述的组合物的部分，包括(但不限于)非对映异构体、对映异构体以及其混合物。在另外或其它实施例中，非天然编码氨基酸多肽在给予需要产生代谢物的生物体之后代谢，所述代谢物然后用于产生所需效应，包括所需治疗效应。在其它或另外实施例中，其为非天然编码氨基酸多肽的活性代谢物。
在一些情形中，非天然编码氨基酸多肽可以互变异构体形式存在。另外，本文中所述的非天然编码氨基酸多肽可以非溶剂化形式以及由诸如水、乙醇等医药学上可接受的溶剂形成的溶剂化形式存在。也认为本文中公开所述溶剂化形式。所属领域的一般技术人员应认识到，本文中的一些化合物可以多种互变异构形式存在。所有这种互变异构形式都被视作本文中所述的组合物的部分。
除非另作指示，否则使用所属领域中的质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术以及药理学的常规方法。
具体实施方式
I.引言
本发明提供包含至少一个非天然氨基酸的hPP或hFc分子。在本发明的某些实施例中，具有至少一个非天然氨基酸的hPP或hFc多肽包括至少一个翻译后修饰。在一些实施例中，hPP是hA。在一个实施例中，hPP或hA或hFc的至少一个翻译后修饰包含利用所属领域的一般技术人员已知的适于特定反应性基团的化学方法学使包含第二反应性基团的分子与包含第一反应性基团的至少一个非天然氨基酸连接，所述分子包括(但不限于)标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；放射性核素、细胞毒性化合物；药物；亲和标记；光亲和标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、抑制性核糖核酸；生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼化部分；光化辐射可激发的部分；可光致异构化部分；生物素；生物素衍生物；生物素类似物；合并有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；量子点；纳米传递素；放射性核苷酸；放射性传递素；中子捕获剂；或上述物质的任何组合或任何其它所需的化合物或物质。举例来说，第一反应性基团为炔基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对炔丙氧基苯基丙氨酸中，其中炔丙基有时也称为乙炔部分)，且第二反应性基团为叠氮基部分，且利用[3+2]环加成化学方法学。在另一实例中，第一反应性基团为叠氮基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中)，且第二反应性基团为炔基部分。在本发明的经修饰hPP或hA或hFc多肽的某些实施例中，使用至少一个包含至少一个翻译后修饰的非天然氨基酸(包括(但不限于)含有酮基官能团的非天然氨基酸)，其中至少一个翻译后修饰包含糖部分。在某些实施例中，翻译后修饰是在真核细胞或非真核细胞中活体内进行。连接子、聚合物、水溶性聚合物或其它分子可使分子与多肽连接。分子可直接连接到多肽。
在某些实施例中，蛋白质包括至少一个由一种宿主细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中翻译后修饰通常无法通过另一种宿主细胞类型进行。在某些实施例中，蛋白质包括至少一个由真核细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中翻译后修饰通常无法通过非真核细胞进行。翻译后修饰的实例包括(但不限于)糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰等。在一个实施例中，翻译后修饰包含通过GlcNAc-天冬酰胺键使寡糖与天冬酰胺连接(包括(但不限于)其中寡糖包含(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等)。在另一实施例中，翻译后修饰包含通过GalNAc-丝氨酸、GalNAc-苏氨酸、GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键使寡糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸连接。在某些实施例中，本发明的蛋白质或多肽可包含分泌或定位序列、抗原决定基标记、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合物等。分泌信号序列的实例包括(但不限于)原核生物分泌信号序列、真核生物分泌信号序列、为进行细菌表达而优化5'的真核生物分泌信号序列、新颖的分泌信号序列、果胶裂解酶分泌信号序列、Omp A分泌信号序列以及噬菌体分泌信号序列。分泌信号序列的实例包括(但不限于)STII(原核生物)、Fd GUI和M13(噬菌体)、Bgl2(酵母)以及源自转座子的信号序列bla。
所关注的蛋白质或多肽可含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或十个或十个以上非天然氨基酸。所述非天然氨基酸可相同或不同，例如蛋白质中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上不同位点，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上不同的非天然氨基酸。在某些实施例中，蛋白质的天然存在形式中所存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸是经非天然氨基酸取代。
本发明提供基于hPP家族的成员(尤其hA或hFc)的包含至少一个非天然编码氨基酸的方法和组合物。在hPP或hA或hFc家族成员中引入至少一个非天然编码氨基酸可允许应用涉及特异性化学反应的结合化学，所述特异性化学反应包括(但不限于)与一个或一个以上非天然编码氨基酸反应而不与通常存在的20种氨基酸反应。在一些实施例中，包含非天然编码氨基酸的hPP或hA或hFc家族成员经由非天然编码氨基酸的侧链与诸如聚乙二醇(PEG)等水溶性聚合物连接。本发明提供通过使蛋白质与包括(但不限于)聚合物、连接子或生物活性分子的其它分子偶合来选择性修饰蛋白质的高效方法，所述方法涉及响应选择密码子在蛋白质中选择性并入非遗传编码氨基酸，所述氨基酸包括(但不限于)含有20种天然合并的氨基酸中未见的官能团或取代基(包括(但不限于)酮基、叠氮或乙炔部分)的那些氨基酸，以及随后用合适反应性分子修饰所述氨基酸。一旦并入氨基酸侧链，就可通过利用所属领域的一般技术人员已知的适于非天然编码氨基酸中所存在的特定官能团或取代基的化学方法学来修饰这些氨基酸侧链。多种已知的化学方法学适用于在本发明中使分子与蛋白质偶合。这些方法学包括(但不限于)分别利用包括(但不限于)乙炔或叠氮化物衍生物的休斯根[3+2]环加成反应(Huisgen[3+2]cycloaddition reaction)(例如参见Padwa,A.inComprehensive Organic Synthesis,第4卷,(1991)Trost,B.M编,Pergamon,Oxford,第1069-1109页；和Huisgen,R.,1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry,(1984)Padwa,A.编,Wiley,New York,第1-176页)。
本发明提供具有多种官能团、取代基或部分的物质与其它物质的结合物，所述其它物质包括(但不限于)标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；放射性核素；细胞毒性化合物；药物；亲和标记；光亲和标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖类；水溶性树枝状聚合物；环糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼化部分；光化辐射可激发的部分；可光致异构化部分；生物素；生物素衍生物；生物素类似物；合并有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；量子点；纳米传递素；放射性核苷酸；放射性传递素；中子捕获剂；或上述物质的任何组合或任何其它所需的化合物或物质。本发明还包括具有叠氮或乙炔部分的物质与具有相应乙炔或叠氮部分的PEG聚合物衍生物的结合物。举例来说，含有叠氮部分的PEG聚合物可在蛋白质的含有具有乙炔官能团的非遗传编码氨基酸的位置处与生物活性分子偶合。使PEG与生物活性分子偶合的键联包括(但不限于)休斯根[3+2]环加成产物。
II.人类血浆蛋白家族
如本文中所使用，“人类血浆蛋白或多肽”或“hPP”包括正常人类血浆中可见的那些多肽和蛋白质，包括hPP类似物、hPP同种型、hPP模拟物、hPP片段、杂交hPP蛋白、其融合蛋白、寡聚物和多聚物、同源物、糖基化模式变异体、变异体、剪接变异体以及突变蛋白，而不考虑以上各物的生物活性且更不考虑其合成或制造方法，所述方法包括(但不限于)重组(由cDNA、基因组DNA、合成DNA或核酸的其它形式制备)、活体外、活体内、微注射核酸分子、合成、转基因学以及基因激活方法。所属领域中已知多种hPP且其可见于Anderson等人,Molecular&Cellular Proteomics,3.4:311-326(2004)和Ping等人,Proteomics,5:3506-3519(2005)中，所述参考文献以引用的方式并入本文中。
将来很可能发现hPP家族的其它成员。hPP家族的新成员可通过预测蛋白质序列的计算机辅助的二级和三级结构分析且通过设计用于鉴别结合特定标靶的分子的选择技术来鉴别。hPP超基因家族的成员通常具有通过非螺旋氨基酸连接的四个或五个两亲螺旋(环区)。所述蛋白质可在其N-末端含有疏水性信号序列来促进从细胞分泌。这些后来发现的hPP超基因家族的成员也包括在本发明内。
因此，hPP家族或hA的描述仅是出于说明性目的且以举例的方式提供且不限制本文中所述的方法、组合物、策略以及技术的范围。另外，本申请文件中提及hPP或hA多肽是打算将此通称用作hPP家族的任何成员的实例。因此，应了解本文中参考hPP或hA多肽或蛋白质所述的修饰和化学反应同样可应用于hPP家族的任何成员，包括本文中特别列出的那些成员。
III.本发明中使用的一般重组核酸方法
在本发明的许多实施例中，将使用重组方法来分离、克隆和通常改变编码所关注的hPP多肽的核酸。所述实施例是用于包括(但不限于)蛋白质表达或产生源自hPP或hFc多肽的变异体、衍生物、表达盒或其它序列的过程中。在一些实施例中，编码本发明的多肽的序列可操作性连接到异源启动子。hPP的分离和hPP在宿主细胞中的产生例如描述于美国专利第5,648,243号、第5,707,828号和第5,521,287号中，所述参考文献以引用的方式并入本文中。
可以母体多肽的氨基酸序列(包括(但不限于)具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列)为基础来合成编码包含非天然编码氨基酸的hPP多肽的核苷酸序列，且然后改变所述核苷酸序列以实现相关氨基酸残基的引入(即，并入或取代)或移除(即，缺失或取代)。可以母体多肽的氨基酸序列(包括(但不限于)具有SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列)为基础来合成编码包含非天然编码氨基酸的hFc多肽的核苷酸序列，且然后改变所述核苷酸序列以实现相关氨基酸残基的引入(即，并入或取代)或移除(即，缺失或取代)。可根据常规方法通过定点诱变来方便地修饰核苷酸序列。或者，可通过化学合成(包括(但不限于)通过使用寡核苷酸合成器，其中寡核苷酸是基于所需多肽的氨基酸序列来设计)来制备核苷酸序列，且优先选择将产生重组多肽的宿主细胞中所偏好的那些密码子。举例来说，可通过PCR、连接或连接链式反应来合成和组装编码所需多肽的部分的若干小寡核苷酸。例如参见Barany等人,Proc.Natl.Acad.Sci.88:189-193(1991)；美国专利6,521,427，其以引用的方式并入本文中。
本发明利用重组遗传学领域中的常规技术。公开本发明中使用的一般方法的基础文章包括Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版,2001)；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；和CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel等人编,1994)。
描述分子生物技术的一般文章包括Berger和Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology第152卷Academic Press,Inc.,San Diego,CA(Berger)；Sambrook等人,Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第2版),第1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989("Sambrook")和Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等人编,Current Protocols,GreenePublishing Associates,Inc.与John Wiley&Sons,Inc.合资(1999增刊)("Ausubel")。这些文章描述诱变、载体的使用、启动子和许多其它相关主题，所述相关主题涉及包括(但不限于)包括用于产生包括非天然氨基酸、正交tRNA、正交合成酶和其对的蛋白质的选择密码子的基因或多核苷酸的产生。
本发明出于多种目的使用各种类型的诱变，所述目的包括(但不限于)产生新颖合成酶或tRNA、使tRNA分子突变、使编码合成酶的多核苷酸突变、产生tRNA文库、产生合成酶文库、产生选择密码子、在所关注的蛋白质或多肽中插入编码非天然氨基酸的选择密码子。所述诱变包括(但不限于)定点诱变、随机点诱变、同源重组、DNA改组或其它递归诱变方法、嵌合构筑、使用含尿嘧啶的模板的诱变、寡核苷酸定向诱变、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、使用缺口双螺旋DNA的诱变等，或其任何组合。其它合适的方法包括点错配修复、使用修复缺陷型宿主品系的诱变、限制性选择和限制性纯化、缺失诱变、通过总基因合成进行的诱变、双链断裂修复等。包括(但不限于)涉及嵌合构筑体的诱变也包括在本发明内。在一个实施例中，可通过天然存在的分子或已改变或突变的天然存在的分子的已知信息(包括(但不限于)序列、序列比较、物理性质、二级结构、三级结构或四级结构、晶体结构等)来指导诱变。
本文中可见的文章和实例描述这些程序。其它信息可见于下列公开文献和其中所引用的参考文献中：Ling等人,Approaches to DNA mutagenesis:an overview,Anal Biochem.254(2):157-178(1997)；Dale等人,Oligonucleotide-directed randommutagenesis using the phosphorothioate method,Methods Mol.Biol.57:369-374(1996)；Smith,In vitro mutagenesis,Ann.Rev.Genet.19:423-462(1985)；Botstein和Shortle,Strategies and applications of in vitro mutagenesis,Science 229:1193-1201(1985)；Carter,Site-directed mutagenesis,Biochem.J.237:1-7(1986)；Kunkel,The efficiency ofoligonucleotide directed mutagenesis,Nucleic Acids&Molecular Biology(Eckstein,F.和Lilley,D.M.J编,Springer Verlag,Berlin)(1987)；Kunkel,Rapid and efficient site-specificmutagenesis without phenotypic selection,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492(1985)；Kunkel等人,Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection,Methods in Enzymol.154,367-382(1987)；Bass等人,Mutant Trp repressors with newDNA-binding specificities,Science242:240-245(1988)；Zoller和Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors:an efficient and generalprocedure for the production of point mutations in any DNA fragment,Nucleic Acids Res.10:6487-6500(1982)；Zoller和Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNAfragments cloned into MB vectors,Methods in Enzymol.100:468-500(1983)；Zoller和Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis:a simple method using two oligonucleotideprimers and a single-stranded DNA template,Methods in Enzymol.154:329-350(1987)；Taylor等人,The use of phosphor othioate-modified DNA in restriction enzyme reactions toprepare nicked DNA,Nucl.Acids Res.13:8749-8764(1985)；Taylor等人,The rapidgeneration of oligonucleotide-directed mutations at high frequency usingphosphorothioate-modified DNA,Nucl.Acids Res.13:8765-8785(1985)；Nakamaye和Eckstein,Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groupsand its application to oligonucleotide-directed mutagenesis,Nucl.Acids Res.14:9679-9698(1986)；Sayers等人,5'-3'Exonu cleases in phosphorothioate-basedoligonucleotide-directed mutagenesis,Nucl.Acids Res.16:791-802(1988)；Sayers等人,Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restrictionendonucleases in the presence of ethidium bromide,(1988)Nucl.Acids Res.16:803-814；Kramer等人,The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutationconstruction,Nucl.Acids Res.12:9441-9456(1984)；Kramer和FritzOligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA,Methods in Enzymol.154:350-367(1987)；Kramer等人,Improved enzymatic in vitro reactions in thegapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations,Nucl. Acids Res.16:7207(1988)；Fritz等人,Oligonucleotide-directed construction of mutations:a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro,Nucl.Acids Res.16:6987-6999(1988)；Kramer等人,Different base/base mismatches are corrected withdifferent efficiencies by the methyl-directed DNA mismatch-repair system of E.coli,Cell38:879-887(1984)；Carter等人,Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis usingM13vectors,Nucl.Acids Res.13:4431-4443(1985)；Carter,Improvedoligonucleotide-directed mutagenesis using M13vectors,Methods in Enzymol.154:382-403(1987)；Eghtedarzadeh和Henikoff,Use of oligonucleotides to generate largedeletions,Nucl.Acids Res.14:5115(1986)；Wells等人,Importance of hydrogen-bondformation in stabilizing the transition state of subtilisin,Phil.Trans.R.Soc.Lond.A317:415-423(1986)；Nambiar等人,Total synthesis and cloning of a gene coding for theribonuclease S protein,Science 223:1299-1301(1984)；Sakmar和Khorana,Total synthesisand expression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outer segment guaninenucleotide-binding protein(transducin),Nucl.Acids Res.14:6361-6372(1988)；Wells等人,Cassette mutagenesis:an efficient method for generation of multiple mutations atdefined sites,Gene 34:315-323(1985)；等人,Oligonucleotide-directedmutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis,Nucl.Acids Res.13:3305-3316(1985)；Mandecki,Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids ofEscherichia coli:a method for site-specific mutagenesis,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:7177-7181(1986)；Arnold,Protein engineering for unusual environments,Current Opinion in Biotechnology 4:450-455(1993)；Sieber等人,Nature Biotechnology,19:456-460(2001)；W.P.C.Stemmer,Nature 370,389-91(1994)；以及I.A.Lorimer,I.Pastan,Nucleic Acids Res.23,3067-8(1995)。关于许多上述方法的其它细节可见于Methods in Enzymology第154卷中，所述文献还描述各种诱变方法对故障查找问题的有效控制。
例如用于本发明的诱变(例如使合成酶文库突变或改变tRNA)的寡核苷酸通常是根据Beaucage和Caruthers,Tetrahedron Letts.22(20):1859-1862,(1981)所描述的固相亚磷酰胺三酯方法例如使用如Needham-VanDevanter等人,Nucleic Acids Res.,12:6159-6168(1984)中所述的自动合成仪以化学方式合成。
本发明也涉及经由正交tRNA/RS对在活体内并入非天然氨基酸的真核宿主细胞、非真核宿主细胞和生物体。利用本发明的多核苷酸或包括本发明的多核苷酸的构筑体(包括(但不限于)本发明载体，其可例如为克隆载体或表达载体)使宿主细胞遗传工程化(包括(但不限于)转化、转导或转染)。举例来说，使正交tRNA、正交tRNA合成酶和欲衍生化的蛋白质的编码区与在所需宿主细胞中起作用的基因表达控制元件可操作地连接。例如，载体可呈质粒、科斯质粒(cosmid)、噬菌体、细菌、病毒、裸多核苷酸或结合多核苷酸的形式。通过标准方法将载体引入细胞和/或微生物中，所述方法包括电穿孔(Fromm等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,5824(1985))、通过病毒载体感染、由具有核酸的小粒子在小珠粒或粒子的基质内或表面上高速弹道渗透(Klein等人,Nature 327,70-73(1987))等。
可在经改良适用于诸如筛选步骤、激活启动子或选择转化株等活动的常规营养培养基中培养经工程化的宿主细胞。视情况，可将这些细胞培养到转基因生物体中。关于包括(但不限于)细胞分离和培养(例如用于后续的核酸分离)的其它有用参考文献包括Freshney(1994)Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique,第3版,Wiley-Liss,New York和其中所引用的参考文献；Payne等人,(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley&Sons,Inc.New York,NY；Gamborg和Phillips(编)(1995)Plant Cell,Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods SpringerLab Manual,Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)以及Atlas和Parks(编)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press,Boca Raton,FL。
可使用将标靶核酸引入细胞中的数种熟知的方法，其中任一种都可用于本发明中。这些方法包括：接受者细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、基因枪法(projectile bombardment)和经病毒载体(在下文中进一步论述)感染等。细菌细胞可用于扩增含有本发明的DNA构筑体的质粒的数目。使细菌生长到对数生长期且可通过所属领域中已知的多种方法分离细菌中的质粒(例如参见Sambrook)。另外，可购得试剂盒以从细菌中纯化质粒(例如参见都来自Pharmacia Biotech的EasyPrepTM、FlexiPrepTM；来自Stratagene的StrataCleanTM；以及来自Qiagen的QIAprepTM)。然后，进一步操纵经分离和纯化的质粒以产生其它质粒，将其用于转染细胞或并入相关载体中以感染生物体。典型载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列以及可用于调控特定标靶核酸的表达的启动子。载体视情况包含通用表达盒，其含有至少一个独立终止子序列、允许表达盒在真核细胞或原核细胞或两者中复制的序列(包括(但不限于)穿梭载体(shuttle vector))以及用于原核生物系统与真核生物系统的选择标记。载体适用于在原核细胞、真核细胞或两者中复制和整合。参见Gillam和Smith,Gene8:81(1979)；Roberts等人,Nature.328:731(1987)；Schneider,E.等人,Protein Expr.Purif.6(1):10-14(1995)；Ausubel,Sambrook,Berger(所有都同上文)。举例来说，ATCC(例如，由ATCC出版的The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage(1992)Gherna等人(编))提供适用于克隆的细菌和噬菌体的目录。用于测序、克隆和分子生物学的其它方面的其它基本程序以及基础理论考虑也见于Watson等人,(1992)Recombinant DNA第2版Scientific American Books,NY。另外，基本上任何核酸(和几乎任何标记核酸，无论标准或非标准)都可从多种商业来源中的任一种定制或标准定购，这些商业来源诸如Midland Certified Reagent Company(Midland,TX，在万维网的mcrc.com上获得)、The Great American Gene Company(Ramona,CA，在万维网的genco.com上获得)、ExpressGen Inc.(Chicago,IL，在万维网的expressgen.com上获得)、OperonTechnologies Inc.(Alameda,CA)和许多其它来源。
选择密码子
本发明的选择密码子将扩充蛋白质生物合成机构的遗传密码子框架。举例来说，选择密码子包括(但不限于)独特三碱基密码子、无义密码子(诸如终止密码子，包括(但不限于)琥珀密码子(UAG)、赭石密码子或蛋白石密码子(UGA))、非天然密码子、四个或四个以上碱基的密码子、稀有密码子等。所属领域的一般技术人员显而易见，可引入所需基因或多核苷酸中的选择密码子的数目范围很广，其包括(但不限于)在编码hPP多肽的至少一部分的单一多核苷酸中存在一个或一个以上、两个或两个以上、三个或三个以上、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或10个以上选择密码子。
在一个实施例中，所述方法涉及使用作为终止密码子的选择密码子，以在活体内并入一个或一个以上非天然氨基酸。举例来说，产生识别包括(但不限于)UAG的终止密码子的O-tRNA且通过O-RS利用所需非天然氨基酸使O-tRNA氨酰化。天然存在的宿主氨酰基tRNA合成酶无法识别所述O-tRNA。可使用常规定点突变在所关注的多肽的所关注位点处引入包括(但不限于)TAG的终止密码子。例如参见Sayers,J.R.等人,(1988),5'-3'Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directedmutagenesis.Nucleic Acids Res.16:791-802。当在活体内组合O-RS、O-tRNA和编码所关注的多肽的核酸时，响应UAG密码子并入非天然氨基酸以产生在特定位置处含有非天然氨基酸的多肽。
活体内并入非天然氨基酸可在不显著干扰真核宿主细胞的情况下进行。举例来说，因为UAG密码子的抑制效率取决于O-tRNA(包括(但不限于)琥珀抑制因子tRNA)与真核生物释放因子(包括(但不限于)eRF)(其结合终止密码子且起始正在生长的肽从核糖体中的释放)之间的竞争，所以抑制效率可通过包括(但不限于)增加O-tRNA和/或抑制因子tRNA的表达水平来调节。
也可利用稀有密码子来编码非天然氨基酸。举例来说，当降低活体外蛋白质合成反应中的精氨酸浓度时，已证明稀有精氨酸密码子AGG有效用于通过经丙氨酸酰化的合成tRNA插入Ala。例如参见Ma等人,Biochemistry.32:7939(1993)。在这种情况下，合成tRNA与作为大肠杆菌中的次要物质存在的天然存在tRNAArg竞争。一些生物体并不使用所有三联体密码子。已利用藤黄微球菌(Micrococcus luteus)中的未指定密码子AGA在活体外转录/翻译提取物中插入氨基酸。例如参见Kowal和Oliver,Nucl.Acid.Res.,25:4685(1997)。可产生本发明的组件以在活体内使用这些稀有密码子。
选择密码子还包含延长密码子，包括(但不限于)四个或四个以上碱基的密码子，诸如四个、五个、六个或六个以上碱基的密码子。四个碱基的密码子的实例包括(但不限于)AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五个碱基的密码子的实例包括(但不限于)AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。本发明的特征包括使用基于移码抑制(frameshift suppression)的延长密码子。四个或四个以上碱基的密码子可将包括(但不限于)一个或一个以上非天然氨基酸插入同一蛋白质中。举例来说，在存在具有反密码子环(例如，具有至少8-10nt的反密码子环)的突变O-tRNA(包括(但不限于)特定移码抑制因子tRNA)的情况下，将四个或四个以上碱基的密码子读作单一氨基酸。在其它实施例中，反密码子环可解码包括(但不限于)至少一个四个碱基的密码子、至少一个五个碱基的密码子或至少一个六个碱基的密码子或更多碱基的密码子。因为存在256种可能的四个碱基的密码子，所以可使用四个或四个以上碱基的密码子在同一细胞中编码多个非天然氨基酸。参见Anderson等人,(2002)Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size,Chemistry and Biology,9:237-244；Magliery,(2001)Expanding the Genetic Code:Selection of Efficient Suppressors ofFour-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a LibraryApproach in Escherichia coli.J.Mol.Biol.307:755-769。
举例来说，已经使用活体外生物合成方法利用四个碱基的密码子将非天然氨基酸并入蛋白质中。例如参见Ma等人,(1993)Biochemistry,32:7939；和Hohsaka等人,(1999)J.Am.Chem.Soc,121:34。使用CGGG和AGGU，从而在活体外利用两个化学酰化的移码抑制因子tRNA同时将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBD衍生物并入抗生蛋白链菌素中。例如参见Hohsaka等人,(1999)J.Am.Chem.Soc，121:12194。在活体内研究中，Moore等人检查具有NCUA反密码子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密码子(N可为U、A、G或C)的能力且发现四联体UAGA可通过具有UCUA反密码子的tRNALeu以13％到26％的效率解码，其中在0或-1框架中极少解码。参见Moore等人,(2000)J. Mol.Biol.,298:195。在一个实施例中，可在本发明中使用基于稀有密码子或无义密码子的延长密码子，其可减少其它不合需要的位点处的错义通读和移码抑制。
对于给定系统来说，选择密码子也可包括一个天然的三个碱基的密码子，其中内源性系统不使用(或很少使用)天然碱基密码子。举例来说，这包括缺乏识别天然的三个碱基的密码子的tRNA的系统和/或三个碱基的密码子为稀有密码子的系统。
选择密码子视情况包括非天然碱基对。这些非天然碱基对进一步扩充现有的遗传代码。一个额外的碱基对使三联体密码子的数目从64增加到125。第三碱基对的性质包括稳定且具选择性的碱基配对、通过聚合酶以高保真性有效地酶促并入DNA中以及在合成新的非天然碱基对之后有效的持续引物延伸。可适于方法和组合物的非天然碱基对的描述例如包括Hirao等人,(2002)An unnatural base pair for incorporatingamino acid analogues into protein,Nature Biotechnology,20:177-182。也参见Wu,Y.等人,(2002)J.Am.Chem.Soc.124:14626-14630。其它相关公开文献列于下文中。
对于活体内使用来说，非天然核苷是膜可渗透的且磷酸化以形成相应的三磷酸盐。另外，增加的遗传信息为稳定的且不受细胞酶破坏。Benner和其它人先前的工作利用不同于典型Watson-Crick配对的氢键模式，其中最值得注意的实例为iso-C:iso-G配对。例如参见Switzer等人,(1989)J.Am.Chem.Soc,111:8322；和Piccirilli等人,(1990)Nature,343:33；Kool,(2000)Curr.Opin.Chem.Biol,4:602。这些碱基通常在一定程度上与天然碱基错配且不能酶促复制。Kool和同事证实碱基之间的疏水性堆积相互作用可代替氢键来驱动碱基对的形成。参见Kool,(2000)Curr.Opin.Chem.Biol,4:602；和Guckian和Kool,(1998)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,36,2825。在研发满足所有上述要求的非天然碱基对的工作中，Schultz、Romesberg和同事已系统地合成和研究了一系列非天然疏水性碱基。发现PICS:PICS自身配对比天然碱基对稳定，且可通过大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段(Klenow fragment)(KF)有效地并入DNA中。例如参见McMinn等人,(1999)J.Am.Chem.Soc,121:11585-6；以及Ogawa等人,(2000)J. Am.Chem.Soc,122:3274。可通过KF以足以用于生物功能的效率和选择性合成3MN:3MN自身配对。例如参见Ogawa等人,(2000)J.Am.Chem.Soc,122:8803。然而，这两种碱基都充当用于进一步复制的链终止子。突变DNA聚合酶近来已得到发展，其可用于复制PICS自身配对。此外，也可复制7AI自身配对。例如参见Tae等人,(2001)J.Am.Chem.Soc,123:7439。也已研发新颖的金属碱基对Dipic:Py，其在结合Cu(II)后形成稳定配对。参见Meggers等人,(2000)J.Am.Chem.Soc,122:10714。因为延长密码子和非天然密码子固有地与天然密码子正交，所以本发明的方法可利用这一性质产生正交tRNA供其使用。
也可使用翻译旁路系统(translational bypassing system)将非天然氨基酸并入所需多肽中。在翻译旁路系统中，将大序列并入基因中，但并未将其翻译成蛋白质。所述序列含有充当诱导核糖体跳过所述序列且在插入下游重新开始翻译的提示的结构。
在某些实施例中，在本发明的方法和/或组合物中的所关注的蛋白质或多肽(或其部分)是由核酸编码。通常，核酸包含至少一个选择密码子、至少两个选择密码子、至少三个选择密码子、至少四个选择密码子、至少五个选择密码子、至少六个选择密码子、至少七个选择密码子、至少八个选择密码子、至少九个选择密码子、十个或十个以上选择密码子。
可使用所属领域的一般技术人员已知且在本文中描述的方法来诱变编码所关注的蛋白质或多肽的基因，从而使其包括例如一个或一个以上选择密码子以并入非天然氨基酸。举例来说，使所关注的蛋白质的核酸诱变以使其包括一个或一个以上选择密码子，从而提供一个或一个以上非天然氨基酸的并入。本发明包括例如包括至少一个非天然氨基酸的任何蛋白质的任何这种变异体(包括(但不限于)突变体)形式。类似地，本发明还包括相应核酸，即，具有一个或一个以上编码一个或一个以上非天然氨基酸的选择密码子的任何核酸。
可容易地使编码诸如hPP多肽等所关注的蛋白质的核酸分子突变以在多肽的任何所需位置处引入半胱氨酸。半胱氨酸广泛用于将反应性分子、水溶性聚合物、蛋白质或多种其它分子引入所关注的蛋白质上。所属领域的一般技术人员已知适于将半胱氨酸并入多肽的所需位置中的方法，所述方法诸如美国专利第6,608,183号(以引用的方式并入本文中)中所述的那些方法以及标准诱变技术。
IV.非天然编码氨基酸
多种非天然编码氨基酸适用于本发明中。可将任何数目的非天然编码氨基酸引入hPP多肽中。所引入的非天然编码氨基酸对20种常见的遗传编码氨基酸(即，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)来说通常实质上都具有化学惰性。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包括与20种常见氨基酸中未见的官能团(包括(但不限于)叠氮基、酮基、醛基和氨氧基)有效且选择性反应以形成稳定结合物的侧链官能团。举例来说，包括含有叠氮基官能团的非天然编码氨基酸的hPP多肽可与聚合物(包括(但不限于)聚(乙二醇))或者含有炔部分的第二多肽反应，以形成由于叠氮官能团与炔官能团选择性反应形成休斯根[3+2]环加成产物而引起的稳定结合物。
α-氨基酸的一般结构说明如下(式I)：
非天然编码氨基酸通常为具有以上所列结构式的任何结构，其中R基团是除20种天然氨基酸中所用的取代基以外的任何取代基且可适用于本发明中。因为本发明的非天然编码氨基酸不同于天然氨基酸之处通常仅在于侧链的结构，所以非天然编码氨基酸以与天然存在多肽中形成酰胺键相同的方式与包括(但不限于)天然或非天然编码氨基酸的其它氨基酸形成酰胺键。然而，非天然编码氨基酸具有使其区别于天然氨基酸的侧链基团。举例来说，R视情况包含烷基-、芳基-、酰基-、酮基-、叠氮基-、羟基-、肼、氰基-、卤基-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基-、磺酰基、硼酸酯(borate)、硼酸酯(boronate)、磷酸基、膦酸基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基等或其任何组合。所关注的可适用于本发明中的其它非天然存在氨基酸包括(但不限于)包含光活化交联剂的氨基酸、经自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、金属结合氨基酸、含金属氨基酸、放射性氨基酸、具有新颖官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光笼化和/或光致异构化氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸(诸如糖取代丝氨酸)、经其它碳水化合物改性的氨基酸、含酮基的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、化学可裂解和/或光可裂解氨基酸、与天然氨基酸相比具有延长侧链(包括(但不限于)聚醚或长链烃，包括(但不限于)约5个以上或约10个以上碳)的氨基酸、含碳连接的糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸以及包含一个或一个以上毒性部分的氨基酸。
可适用于本发明中且适用于与水溶性聚合物反应的例示性非天然编码氨基酸包括(但不限于)那些具有羰基、氨氧基、肼、酰肼、氨基脲、叠氮和炔反应性基团的氨基酸。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含糖部分。所述氨基酸的实例包括N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-氨基半乳糖基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-天冬酰胺和O-氨基甘露糖基-L-丝氨酸。所述氨基酸的实例还包括氨基酸与糖之间的天然存在N-或O-键联是由自然界中通常不可见的共价键(包括(但不限于)烯、肟、硫醚、酰胺等)置换的实例。所述氨基酸的实例还包括诸如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等天然存在蛋白质中通常不可见的糖类。
本文中提供的多种非天然编码氨基酸可例如从Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)、Novabiochem(EMD Biosciences的分公司,Darmstadt,Germany)或Peptech(Burlington,MA,USA)购得。无法购得的非天然编码氨基酸视情况如本文中所提供或使用所属领域的一般技术人员已知的标准方法合成。关于有机合成技术，例如参见Fessendon和Fessendon,Organic Chemistry(1982,第2版,Willard Grant Press,BostonMass.)；March,Advanced Organic Chemistry(第3版,1985,Wiley and Sons,New York)；以及Carey和Sundberg,Advanced Organic Chemistry(第3版,A部分和B部分,1990,Plenum Press,New York)。也参见美国专利申请公开文献2003/0082575和2003/0108885，其以引用的方式并入本文中。除含有新颖侧链的非天然氨基酸外，可适用于本发明的非天然氨基酸还视情况包含经修饰的主链结构，包括(但不限于)如式II和式III的结构所说明的结构：
其中Z通常包含OH、NH2、SH、NH-R'或S-R'；X和Y可相同或不同，通常包含S或O；且R和R'视情况相同或不同，通常是选自上文关于具有式I的非天然氨基酸所述的R基团的组成部分的相同清单以及氢。举例来说，本发明的非天然氨基酸视情况包含如式II和III所说明的氨基或羧基的取代。这种类型的非天然氨基酸包括(但不限于)α-羟基酸、α-硫代酸、α-氨基硫代羧酸盐，其具有包括(但不限于)对应于常见的20种天然氨基酸的侧链或非天然侧链。另外，α-碳处的取代视情况包括(但不限于)L、D或α-α-二取代氨基酸，诸如D-谷氨酸盐、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等。其它结构替代物包括环状氨基酸，诸如脯氨酸类似物以及3、4、6、7、8和9元环脯氨酸类似物；β和γ氨基酸，诸如经取代β-丙氨酸和γ-氨基丁酸。
多种非天然氨基酸是基于诸如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等天然氨基酸，且适用于本发明中。酪氨酸类似物包括(但不限于)对位取代的酪氨酸、邻位取代的酪氨酸以及间位取代的酪氨酸，其中经取代酪氨酸包含包括(但不限于)酮基(包括(但不限于)乙酰基)、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺、硫醇基、羧基、异丙基、甲基、C6-C20直链或支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基、硝基、炔基等。另外，也涵盖多取代芳基环。可适用于本发明的谷氨酰胺类似物包括(但不限于)α-羟基衍生物、γ取代衍生物、环状衍生物以及酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。可适用于本发明的例示性苯丙氨酸类似物包括(但不限于)对位取代的苯丙氨酸、邻位取代的苯丙氨酸以及间位取代的苯丙氨酸，其中取代基包含包括(但不限于)羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛、叠氮基、碘基、溴基、酮基(包括(但不限于)乙酰基)、苯甲酰基、炔基等。可适用于本发明的非天然氨基酸的特定实例包括(但不限于)对乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、L-多巴(L-Dopa)、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸以及对炔丙氧基-苯丙氨酸等。例如，可适用于本发明的多种非天然氨基酸的结构的实例是提供于标题为“In vivo incorporation ofunnatural amino acids”的WO 2002/085923中。关于其它蛋氨酸类似物，也参见Kiick等人,(2002)Incorporation ofazides into recombinant proteins for chemoselectivemodification by the Staudinger ligation,PNAS 99:19-24，其以引用的方式并入本文中。
在一个实施例中，提供包括非天然氨基酸(诸如对(炔丙氧基)-苯丙氨酸)的hPP多肽的组合物。还提供各种包含对(炔丙氧基)-苯丙氨酸和包括(但不限于)蛋白质和/或细胞的组合物。一方面，包括对(炔丙氧基)-苯丙氨酸非天然氨基酸的组合物进一步包括正交tRNA。非天然氨基酸可与正交tRNA键结(包括(但不限于)共价)，包括(但不限于)通过氨酰基键与正交tRNA共价键结，与正交tRNA的末端核糖的3'OH或2'OH共价键结等。
可借助于非天然氨基酸并入蛋白质中的化学部分提供蛋白质的多种优势和操纵性。举例来说，酮基官能团的独特反应性允许利用多种含肼或羟胺试剂中的任一个在活体外和活体内选择性修饰蛋白质。举例来说，重原子非天然氨基酸可适用于定相X射线结构数据。使用非天然氨基酸位点特异性引入重原子还为选择重原子的位置提供选择性和灵活性。举例来说，光反应性非天然氨基酸(包括(但不限于)具有二苯甲酮和叠氮芳基(包括(但不限于)叠氮苯)侧链的氨基酸)允许蛋白质的活体内和活体外有效光交联。光反应性非天然氨基酸的实例包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸和对苯甲酰基-苯丙氨酸。然后，可通过激发光反应性基团(提供时间控制)使具有光反应性非天然氨基酸的蛋白质随意交联。在一个实例中，非天然氨基酸的甲基可经作为局部结构和动力学的探针(包括(但不限于)使用核磁共振和振动光谱学)的同位素标记的(包括(但不限于))甲基取代。举例来说，炔基或叠氮基官能团允许利用分子通过[3+2]环加成反应选择性修饰蛋白质。
并入多肽的氨基末端的非天然氨基酸可包含R基团，其为除20种天然氨基酸中所用的取代基以外的任何取代基；和不同于α-氨基酸(参见式I)中通常存在的NH2基团的第二反应性基团。类似的非天然氨基酸可在羧基末端处并入不同于α-氨基酸(参见式I)中通常存在的COOH基团的第二反应性基团。
可选择或设计本发明的非天然氨基酸以提供20种天然氨基酸中不可获得的其它特征。举例来说，可视情况设计或选择非天然氨基酸以改良例如并入所述氨基酸的蛋白质的生物性质。举例来说，通过在蛋白质中包括非天然氨基酸可视情况改良下列性质：毒性、生物分布(biodistribution)、溶解性、稳定性(例如热稳定性、水解稳定性、氧化稳定性、酶促降解抗性等)、纯化和加工便利性、结构性质、光谱性质、化学和/或光化学性质、催化活性、氧化还原电势、半衰期、与其它分子例如共价或非共价反应的能力等。
非天然氨基酸的结构和合成：羰基、羰基样基团、经掩蔽羰基、经保护羰基和羟 胺基
在一些实施例中，本发明提供通过肟键与水溶性聚合物(例如PEG)连接的hPP或hA或hFc。
多种类型的非天然编码氨基酸适用于形成肟键。这些氨基酸包括(但不限于)含有羰基、二羰基或羟胺基的非天然编码氨基酸。所述氨基酸是描述于美国专利公开文献第2006/0194256号、第2006/0217532号和第2006/0217289号以及标题为“Compositions containing,methods involving,and uses of non-natural amino acids andpolypeptides”的WO 2006/069246中，所述公开文献以全文引用的方式并入本文中。非天然编码氨基酸也描述于美国专利第7,083,970号和美国专利第7,045,337号中，所述专利以全文引用的方式并入本文中。
本发明的一些实施例利用在一个或一个以上位置经对乙酰基苯丙氨酸氨基酸取代的hPP或hA或hFc多肽。对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成是描述于Zhang,Z.等人,Biochemistry 42:6735-6746(2003)中，其以引用的方式并入本文中。其它含羰基或含二羰基的氨基酸可由所属领域的一般技术人员类似地制备。另外，本文中所包括的非天然氨基酸的非限制性例示性合成是呈示于美国专利第7,083,970号的图4、24-34和36-39中，所述专利以全文引用的方式并入本文中。
具有亲电子反应性基团的氨基酸允许多种通过亲核加成反应连接分子的反应。所述亲电子反应性基团包括羰基(包括酮基和二羰基)、羰基样基团(其具有与羰基(包括酮基和二羰基)相似的反应性且在结构上与羰基相似)、经掩蔽羰基(其可容易地转化为羰基(包括酮基和二羰基))或经保护羰基(其在去保护后具有与羰基(包括酮基和二羰基)相似的反应性)。所述氨基酸包括具有式(IV)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳杂亚烷基、经取代杂亚烷基、低碳杂亚环烷基、经取代低碳杂亚环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、杂亚芳基、经取代杂亚芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的且当存在时为选自由以下各基组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳杂亚烷基、经取代低碳杂亚烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-以及-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
J为
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R"各自独立地为H、烷基、经取代烷基或保护基，或当存在一个以上R"基团时，两个R"视情况形成杂环烷基；
R1是可选的且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且
R2是可选的且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
R3和R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或R3和R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
或-A-B-J-R基团一起形成包含至少一个羰基(包括二羰基)、经保护羰基(包括经保护二羰基)或经掩蔽羰基(包括经掩蔽二羰基)的双环或三环环烷基或杂环烷基；
或-J-R基团一起形成包含至少一个羰基(包括二羰基)、经保护羰基(包括经保护二羰基)或经掩蔽羰基(包括经掩蔽二羰基)的单环或双环环烷基或杂环烷基；
其中限制条件为当A为亚苯基且R3各自为H时，B存在；且当A为-(CH2)4-且R3各自为H时，B不为-NHC(O)(CH2CH2)-；且当A和B不存在且R3各自为H时，R不为甲基。
另外，包括具有式(V)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳杂亚烷基、经取代杂亚烷基、低碳杂亚环烷基、经取代低碳杂亚环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、杂亚芳基、经取代杂亚芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的且当存在时为选自由以下各基组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳杂亚烷基、经取代低碳杂亚烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-以及-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且
R2是可选的且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
其中限制条件为当A为亚苯基时，B存在；且当A为-(CH2)4-时，B不为-NHC(O)(CH2CH2)-；且当A和B不存在时，R不为甲基。
另外，包括具有式(VI)的结构的氨基酸：
其中：
B是选自由以下各基组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳杂亚烷基、经取代低碳杂亚烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-以及-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且
R2是可选的且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
Ra是各自独立地选自由以下各基组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'以及-S(O)kR'，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
另外，包括下列氨基酸：
其中所述化合物视情况氨基经保护、羧基经保护，或其盐。另外，下列非天然氨基酸中的任一个都可并入非天然氨基酸多肽中。
另外，包括下列具有式(VII)的结构的氨基酸：
其中：
B是可选的且当存在时为选自由以下各基组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳杂亚烷基、经取代低碳杂亚烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-以及-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且
R2是可选的且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
Ra是各自独立地选自由以下各基组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'以及-S(O)kR'，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；且n为0到8；
其中限制条件为当A为-(CH2)4-时，B不为-NHC(O)(CH2CH2)-。
另外，包括下列氨基酸：
其中所述化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护且羧基也经保护，或其盐。另外，这些非天然氨基酸以及下列非天然氨基酸中的任一个都可并入非天然氨基酸多肽中。
另外，包括下列具有式(VIII)的结构的氨基酸：
其中A是可选的且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳杂亚烷基、经取代杂亚烷基、低碳杂亚环烷基、经取代低碳杂亚环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、杂亚芳基、经取代杂亚芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的且当存在时为选自由以下各基组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳杂亚烷基、经取代低碳杂亚烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-,-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-以及-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1是可选的且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且
R2是可选的且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸。
另外，包括下列具有式(IX)的结构的氨基酸：
B是可选的且当存在时为选自由以下各基组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳杂亚烷基、经取代低碳杂亚烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-以及-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且
R2是可选的且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
其中Ra是各自独立地选自由以下各基组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'以及-S(O)kR'，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
另外，包括下列氨基酸：
其中所述化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护且羧基也经保护，或其盐。另外，这些非天然氨基酸以及下列非天然氨基酸中的任一个都可并入非天然氨基酸多肽中。
另外，包括下列具有式(X)的结构的氨基酸：
其中：
B是可选的且当存在时为选自由以下各基组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳杂亚烷基、经取代低碳杂亚烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-,-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝-C(R')2-N＝N-以及-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且
R2是可选的且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
Ra是各自独立地选自由以下各基组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'以及-S(O)kR'，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；且n为0到8。
另外，包括下列氨基酸：
其中所述化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护且羧基也经保护，或其盐。另外，这些非天然氨基酸以及下列非天然氨基酸中的任一个都可并入非天然氨基酸多肽中。
除单羰基结构外，本文中所述的非天然氨基酸也可包括诸如二羰基、二羰基样基团、经掩蔽二羰基以及经保护二羰基等基团。
举例来说，包括下列具有式(XI)的结构的氨基酸：
其中A是可选的且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳杂亚烷基、经取代杂亚烷基、低碳杂亚环烷基、经取代低碳杂亚环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、杂亚芳基、经取代杂亚芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的且当存在时为选自由以下各基组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳杂亚烷基、经取代低碳杂亚烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-以及-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且
R2是可选的且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸。
另外，包括下列具有式(XII)的结构的氨基酸：
B是可选的且当存在时为选自由以下各基组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳杂亚烷基、经取代低碳杂亚烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝-C(R')2-N＝N-以及-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且
R2是可选的且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
其中Ra是各自独立地选自由以下各基组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'以及-S(O)kR'，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
另外，包括下列氨基酸：
其中所述化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护且羧基也经保护，或其盐。另外，这些非天然氨基酸以及下列非天然氨基酸中的任一个都可并入非天然氨基酸多肽中。
另外，包括下列具有式(XIII)的结构的氨基酸：
其中B是可选的且当存在时为选自由以下各基组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳杂亚烷基、经取代低碳杂亚烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-以及-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且
R2是可选的且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
Ra是各自独立地选自由以下各基组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'以及-S(O)kR'，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；且n为0到8。
另外，包括下列氨基酸：
其中所述化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护且羧基也经保护，或其盐。另外，这些非天然氨基酸以及下列非天然氨基酸中的任一个都可并入非天然氨基酸多肽中。
另外，包括下列具有式(XIV)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳杂亚烷基、经取代杂亚烷基、低碳杂亚环烷基、经取代低碳杂亚环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、杂亚芳基、经取代杂亚芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且
R2是可选的且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
X1为C、S或S(O)；且L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(经取代亚烷基)，其中R'为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外，包括下列具有式(XIV-A)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳杂亚烷基、经取代杂亚烷基、低碳杂亚环烷基、经取代低碳杂亚环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、杂亚芳基、经取代杂亚芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且
R2是可选的且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(经取代亚烷基)，其中R'为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外，包括下列具有式(XIV-B)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳杂亚烷基、经取代杂亚烷基、低碳杂亚环烷基、经取代低碳杂亚环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、杂亚芳基、经取代杂亚芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且
R2是可选的且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(经取代亚烷基)，其中R'为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外，包括下列具有式(XV)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳杂亚烷基、经取代杂亚烷基、低碳杂亚环烷基、经取代低碳杂亚环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、杂亚芳基、经取代杂亚芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且
R2是可选的且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
X1为C、S或S(O)；且n为0、1、2、3、4或5；且各CR8R9基团上的R8和R9是各自独立地选自由H、烷氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基组成的群组，或任何R8和R9可一起形成＝O或环烷基，或任何邻接R8基团的基团可一起形成环烷基。
另外，包括下列具有式(XV-A)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳杂亚烷基、经取代杂亚烷基、低碳杂亚环烷基、经取代低碳杂亚环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、杂亚芳基、经取代杂亚芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且
R2是可选的且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
n为0、1、2、3、4或5；且各CR8R9基团上的R8和R9是各自独立地选自由H、烷氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基组成的群组，或任何R8和R9可一起形成＝O或环烷基，或任何邻接R8基团的基团可一起形成环烷基。
另外，包括下列具有式(XV-B)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳杂亚烷基、经取代杂亚烷基、低碳杂亚环烷基、经取代低碳杂亚环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、杂亚芳基、经取代杂亚芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且
R2是可选的且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
n为0、1、2、3、4或5；且各CR8R9基团上的R8和R9各自独立地选自由H、烷氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基组成的群组，或任何R8和R9可一起形成＝O或环烷基，或任何邻接R8基团的基团可一起形成环烷基。
另外，包括下列具有式(XVI)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳杂亚烷基、经取代杂亚烷基、低碳杂亚环烷基、经取代低碳杂亚环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、杂亚芳基、经取代杂亚芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且
R2是可选的且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
X1为C、S或S(O)；且L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(经取代亚烷基)，其中R'为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外，包括下列具有式(XVI-A)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳杂亚烷基、经取代杂亚烷基、低碳杂亚环烷基、经取代低碳杂亚环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、杂亚芳基、经取代杂亚芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且
R2是可选的且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(经取代亚烷基)，其中R'为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外，包括下列具有式(XVI-B)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳杂亚烷基、经取代杂亚烷基、低碳杂亚环烷基、经取代低碳杂亚环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、杂亚芳基、经取代杂亚芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且
R2是可选的且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(经取代亚烷基)，其中R'为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外，包括具有式(XVII)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳杂亚烷基、经取代杂亚烷基、低碳杂亚环烷基、经取代低碳杂亚环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、杂亚芳基、经取代杂亚芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
M为-C(R3)-、 其中(a)指示与A基团键结且(b)指示与各自的羰基结合，R3和R4是独立地选自H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基，或R3和R4或两个R3基团或两个R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
T3为键、C(R)(R)、O或S；且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且
R2是可选的且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸。
另外，包括具有式(XVIII)的结构的氨基酸：
其中：
M为-C(R3)-、 其中(a)指示与A基团键结且(b)指示与各自的羰基结合，R3和R4是独立地选自H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基，或R3和R4或两个R3基团或两个R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
T3为键、C(R)(R)、O或S，且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；且
R2是可选的且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
Ra是各自独立地选自由以下各基组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'以及-S(O)kR'，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
另外，包括具有式(XIX)的结构的氨基酸：
其中：
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；且
T3为O或S。
另外，包括具有式(XX)的结构的氨基酸：
其中：
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外，包括下列具有式(XXI)的结构的氨基酸：
在一些实施例中，以化学方式修饰包含非天然氨基酸的多肽以产生反应性羰基或二羰基官能团。举例来说，可由具有邻接氨基和羟基的官能团产生适用于结合反应的醛官能团。当生物活性分子为多肽时，例如，可使用N-末端丝氨酸或苏氨酸(其通常可存在，或可经由化学或酶促消化而暴露)在温和的氧化裂解条件下使用高碘酸盐产生醛官能团。例如参见Gaertner等人,Bioconjug.Chem.3:262-268(1992)；Geoghegan,K.和Stroh,J.,Bioconjug.Chem.3:138-146(1992)；Gaertner等人,J.Biol.Chem.269:7224-7230(1994)。然而，所属领域中已知的方法局限于肽或蛋白质的N-末端的氨基酸。
在本发明中，可将具有相邻羟基和氨基的非天然氨基酸并入多肽中，作为“经掩蔽”的醛官能团。举例来说，5-羟基赖氨酸具有邻接ε胺的羟基。产生醛的反应条件通常涉及在温和条件下添加摩尔过量的偏高碘酸钠，以避免在多肽中的其它位点发生氧化。氧化反应的pH值通常为约7.0。典型反应涉及向多肽的缓冲溶液中添加约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠，接着在黑暗环境中培育约10分钟。例如参见美国专利第6,423,685号。
羰基或二羰基官能团可在温和条件下在水溶液中与含羟胺试剂选择性反应，从而形成在生理条件下稳定的相应肟键。例如参见Jencks,W.P.,J.Am.Chem.Soc.81,475-481(1959)；Shao,J.和Tarn,J.P.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)。此外，羰基或二羰基的独特反应性允许在存在其它氨基酸侧链的情况下进行选择性修饰。例如参见Cornish,V.W.等人,J.Am.Chem.Soc.118:8150-8151(1996)；Geoghegan,K.F.和Stroh,J.G.,Bioconjug.Chem.3:138-146(1992)；Mahal,L.K.等人,Science276:1125-1128(1997)。
非天然氨基酸的结构和合成：含羟胺的氨基酸
美国临时专利申请文件第60/638,418号是以全文引用的方式并入本文中。因此，美国临时专利申请文件第60/638,418号中的第V章(标题为“Non-natural Amino Acids”B部分(标题为“Structure and Synthesis of Non-Natural Amino Acids:Hydroxylamine-Containing Amino Acids”)中所提供的公开内容完全适用于制备、纯化、表征和使用本文中所述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物(包括式I-XXXV)、技术和策略，其应用程度就如同所述公开内容完全呈现于本文中。美国专利公开文献第2006/0194256号、第2006/0217532号和第2006/0217289号以及标题为“Compositions containing,methods involving,and uses ofnon-natural amino acids and polypeptides”的WO 2006/069246也是以全文引用的方式并入本文中。
非天然氨基酸的化学合成
适用于本发明的多种非天然氨基酸可例如从Sigma(USA)或Aldrich(Milwaukee,WI,USA)购得。无法购得的非天然氨基酸是视情况如本文中所提供或如各种公开文献中所提供或使用所属领域的一般技术人员已知的标准方法合成。关于有机合成技术，例如参见Fessendon和Fessendon,Organic Chemistry,(1982,第2版,Willard Grant Press,Boston Mass.)；March,Advanced Organic Chemistry(第3版,1985,Wiley and Sons,NewYork)；以及Carey和Sundberg,Advanced Organic Chemistry(第3版,A部分和B部分,1990,Plenum Press,New York)。例如，描述非天然氨基酸的合成的其它公开文献包括标题为"In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids"的WO 2002/085923；Matsoukas等人,(1995)J.Med.Chem.,38,4660-4669；King,F.E.和Kidd,D.A.A.(1949)A NewSynthesis of Glutamine and of y-Dipeptides of Glutamic Acid from PhthylatedIntermediates.J.Chem.Soc,3315-3319；Friedman,O.M.和Chatterrji,R.(1959)Synthesisof Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents.J.Am.Chem.Soc.81,3750-3752；Craig,J.C.等人,(1988)Absolute Configuration of the Enantiomers of7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-l-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine).J.Org. Chem.53,1167-1170；Azoulay,M.,Vilmont,M.和Frappier,F.(1991)Glutamineanalogues as Potential Antimalarials,Eur.J.Med.Chem.26,201-5；Koskinen,A.M.P.和Rapoport,H.(1989)Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally ConstrainedAmino Acid Analogues.J.Org.Chem.54,1859-1866；Christie,B.D.和Rapoport,H.(1985)Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine.Application to the TotalSynthesis of(+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium IonCyclization.J.Org.Chem.50:1239-1246；Barton等人,(1987)Synthesis of Novelalpha-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry:Synthesis of L-andD-alpha-Amino-Adipic Acids,L-alpha-aminopimelic Acid and Appropriate UnsaturatedDerivatives.Tetrahedron 43:4297-4308；以及Subasinghe等人,(1992)Quisqualic acidanalogues:synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and theiractivity at a novel quisqualate-sensitized site.J.Med.Chem.35:4602-7。也参见标题为"Protein Arrays"的美国专利公开文献第US 2004/0198637号，其以引用的方式并入本文。
A.羰基反应性基团
具有羰基反应性基团的氨基酸允许多种通过亲核加成或醛醇缩合反应连接分子(包括(但不限于)PEG或其它水溶性分子)的反应。
例示性含羰基的氨基酸可如下表示：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2为H、烷基、芳基、经取代烷基以及经取代芳基；且R3为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R4为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R1为苯基且R2为简单烷基(即，甲基、乙基或丙基)且酮部分是位于相对于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为1，R1为苯基且R2为简单烷基(即，甲基、乙基或丙基)且酮部分是位于相对于烷基侧链的间位。
对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成是描述于Zhang,Z.等人,Biochemistry 42:6735-6746(2003)中，其以引用的方式并入本文中。其它含羰基的氨基酸可由所属领域的一般技术人员类似地制备。
在一些实施例中，以化学方式修饰包含非天然编码氨基酸的多肽以产生反应性羰基官能团。举例来说，可由具有邻接氨基和羟基的官能团产生适用于结合反应的醛官能团。当生物活性分子为多肽时，例如，可使用N-末端丝氨酸或苏氨酸(其通常可存在，或可经由化学或酶促消化而暴露)在温和的氧化裂解条件下使用高碘酸盐产生醛官能团。例如参见Gaertner等人,Bioconjug.Chem.3:262-268(1992)；Geoghegan,K.和Stroh,J.,Bioconjug.Chem.3:138-146(1992)；Gaertner等人,J.Biol.Chem.269:7224-7230(1994)。然而，所属领域中已知的方法局限于肽或蛋白质的N-末端的氨基酸。
在本发明中，可将具有相邻羟基和氨基的非天然编码氨基酸并入多肽中，作为“经掩蔽”的醛官能团。举例来说，5-羟基赖氨酸具有邻接ε胺的羟基。产生醛的反应条件通常涉及在温和条件下添加摩尔过量的偏高碘酸钠，以避免在多肽中的其它位点发生氧化。氧化反应的pH值通常为约7.0。典型反应涉及向多肽的缓冲溶液中添加约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠，接着在黑暗环境中培育约10分钟。例如参见美国专利第6,423,685号，其以引用的方式并入本文中。
羰基官能团可在温和条件下在水溶液中与含肼、含酰肼、含羟胺或含氨基脲的试剂选择性反应，以分别形成在生理条件下稳定的相应腙、肟或半卡巴腙(semicarbazone)键。例如参见Jencks,W.P.,J.Am.Chem.Soc.81,475-481(1959)；Shao,J.和Tarn,J.P.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)。此外，羰基的独特反应性允许在存在其它氨基酸侧链的情况下进行选择性修饰。例如参见Cornish,V.W.等人,J.Am.Chem.Soc.118:8150-8151(1996)；Geoghegan,K.F.和Stroh,J.G.,Bioconjug.Chem.3:138-146(1992)；Mahal,L.K.等人,Science 276:1125-1128(1997)。
B.肼、酰肼或氨基脲反应性基团
含有诸如肼、酰肼或氨基脲等亲核基团的非天然编码氨基酸允许与多种亲电子基团反应以形成结合物(包括(但不限于)与PEG或其它水溶性聚合物反应)。
例示性含肼、含酰肼或含氨基脲的氨基酸可如下表示：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在；X为O、N或S或不存在；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。
在一些实施例中，n为4，R1不存在且X为N。在一些实施例中，n为2，R1不存在且X不存在。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X为O，且氧原子是位于芳基环上脂肪族基团的对位。
含酰肼、含肼和含氨基脲的氨基酸可购自商业来源。举例来说，L-谷氨酸-γ-酰肼可购自Sigma Chemical(St.Louis,MO)。无法购得的其它氨基酸可由所属领域的一般技术人员制备。例如参见美国专利第6,281,211号，其以引用的方式并入本文中。
含有具有酰肼、肼或氨基脲官能团的非天然编码氨基酸的多肽可与多种含有醛或其它具有类似化学反应性的官能团的分子有效且选择性反应。例如参见Shao,J.和Tarn,J.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)。酰肼、肼和氨基脲官能团的独特反应性使其对醛、酮和其它亲电子基团相比对20种常见氨基酸中存在的亲核基团(包括(但不限于)丝氨酸或苏氨酸的羟基或赖氨酸的氨基和N-末端)显著更具反应性。
C.含氨氧基的氨基酸
含有氨氧基(也称为羟胺)的非天然编码氨基酸允许与多种亲电子基团反应以形成结合物(包括(但不限于)与PEG或其它水溶性聚合物反应)。如同肼、酰肼和氨基脲，氨氧基的增加的亲核性使其与多种含有醛或其它具有类似化学反应性的官能团的分子有效且选择性反应。例如参见Shao,J.和Tarn,J.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)；H.Hang和C.Bertozzi,Ace.Chem.Res.34:727-736(2001)。尽管与肼基团的反应结果是相应的腙，但氨氧基与含羰基的基团(诸如酮)的反应通常产生肟。
例示性含氨氧基的氨基酸可如下表示：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；Y＝C(O)或不存在；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X为O，m为1且Y存在。在一些实施例中，n为2，R1和X不存在，m为0且Y不存在。
含氨氧基的氨基酸可由可容易地获得的氨基酸前体(高丝氨酸、丝氨酸和苏氨酸)制备。例如参见M.Carrasco和R.Brown,J.Org.Chem.68:8853-8858(2003)。某些含氨氧基的氨基酸(诸如L-2-氨基-4-(氨氧基)丁酸)已从天然来源分离(Rosenthal,G.,LifeSci.60:1635-1641(1997))。其它含氨氧基的氨基酸可由所属领域的一般技术人员制备。
D.叠氮和炔反应性基团
叠氮和炔官能团的独特反应性使其极适用于多肽和其它生物分子的选择性修饰。有机叠氮化物(尤其脂肪族叠氮化物)和炔对常见的反应性化学条件来说通常是稳定的。具体来说，叠氮和炔官能团对天然存在多肽中可见的20种常见氨基酸的侧链(即，R基团)来说都是惰性的。然而，当叠氮和炔基团靠近时，其“弹簧加压(spring-loaded)”性质显露且其经由休斯根[3+2]环加成反应选择性且有效地反应，从而产生相应三唑。例如参见Chin J.等人,Science301:964-7(2003)；Wang,Q.等人,J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193(2003)；Chin,J.W.等人,J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027(2002)。
因为休斯根环加成反应涉及选择性环加成反应(例如参见Padwa,A.,Comprehensive Organic Synthesis,第4卷,(Trost,B.M.编,1991),第1069-1109页；Huisgen,R.1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry,(Padwa,A.编,1984),第1-176页)而不是亲核取代，所以并入具有含叠氮和含炔的侧链的非天然编码氨基酸使得所得多肽在非天然编码氨基酸的位置处经选择性修饰。涉及含叠氮或含炔的hPP多肽的环加成反应可在室温下在水性条件下通过在存在催化量的当场将Cu(II)还原成Cu(I)的还原剂的情况下添加Cu(II)(包括(但不限于)呈催化量CUSO4的形式)进行。例如参见Wang,Q.等人,J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193(2003)；Tornoe,C.W.等人,J.Org.Chem.67:3057-3064(2002)；Rostovtsev等人,Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599(2002)。例示性还原剂包括(包括(但不限于))抗坏血酸盐、金属铜、奎宁(quinine)、氢醌、维生素K、谷胱甘肽、半胱氨酸、Fe2+、Co2+和外加电势。
在一些情况下，当需要叠氮化物与炔之间的休斯根[3+2]环加成反应时，hPP多肽包含包括炔部分的非天然编码氨基酸，且欲与氨基酸连接的水溶性聚合物包含叠氮部分。或者，也可进行倒转反应(即，叠氮部分在氨基酸上且炔部分存在于可溶性聚合物上)
也可使叠氮官能团与含有芳基酯且经芳基膦部分适当官能化的水溶性聚合物选择性反应以产生酰胺键。芳基膦基团当场还原叠氮化物，且所得胺接着与邻近酯键有效反应以产生相应酰胺。例如参见E.Saxon和C.Bertozzi,Science 287,2007-2010(2000)。含叠氮基的氨基酸可为烷基叠氮化物(包括(但不限于)2-氨基-6-叠氮基-1-己酸)或芳基叠氮化物(对叠氮基-苯丙氨酸)。
含芳基酯和膦部分的例示性水溶性聚合物可如下表示：
其中X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，W为水溶性聚合物，且R可为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。例示性R基团包括(但不限于)-CH2、-C(CH3)3、-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-C(O)R'、-CONR'R"、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-CN和-NO2。R'、R"、R"′和R""各自独立地是指氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基(包括(但不限于)经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。例如，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，R基团是各自独立地经选择，而当存在R'、R"、R"′和R""基团中的一个以上时，这些基团同样是各自独立地经选择。当R'和R"连接到同一氮原子时，其可与氮原子组合形成5、6或7元环。举例来说，-NR'R"打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据取代基的以上讨论，所属领域的技术人员应了解术语“烷基”打算包括包括结合除氢基以外的基团的碳原子的基团，诸如卤代烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
也可使叠氮官能团与含有硫酯且经芳基膦部分适当官能化的水溶性聚合物选择性反应以产生酰胺键。芳基膦基团当场还原叠氮化物，且所得胺接着与硫酯键有效反应以产生相应酰胺。含硫酯和膦部分的例示性水溶性聚合物可如下表示：
其中n为1-10；X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，且W为水溶性聚合物。
例示性含炔的氨基酸可如下表示：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X不存在，m为0且乙炔部分是位于相对于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X为O，m为1且炔丙氧基是位于相对于烷基侧链的对位(即，O-炔丙基-酪氨酸)。在一些实施例中，n为1，R1和X不存在且m为0(即，炔丙基甘氨酸)。
含炔的氨基酸可购得。举例来说，炔丙基甘氨酸可购自Peptech(Burlington,MA)。或者，含炔的氨基酸可根据标准方法制备。举例来说，可(例如)如Deiters,A.等人,J.Am.Chem.Soc.125:11782-11783(2003)中所述来合成对炔丙氧基苯丙氨酸，且可如Kayser,B.等人,Tetrahedron 53(7):2475-2484(1997)中所述来合成4-炔基-L-苯丙氨酸。其它含炔的氨基酸可由所属领域的一般技术人员制备。
例示性含叠氮基的氨基酸可如下表示：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X不存在，m为0且叠氮部分是位于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为0-4且R1和X不存在且m＝0。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X为O，m为2且β叠氮基乙氧基部分是位于相对于烷基侧链的对位。
含叠氮基的氨基酸可购自商业来源。举例来说，可从Chem-Impex International,Inc.(Wood Dale,IL)获得4-叠氮基苯丙氨酸。关于那些无法购得的含叠氮基的氨基酸，可使用所属领域的一般技术人员已知的标准方法相对容易地制备叠氮基，所述方法包括(但不限于)经由置换合适的离去基(包括(但不限于)卤基、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基)或经由打开经合适保护的内酯。例如参见March,Advanced Organic Chemistry(第3版,1985,Wiley and Sons,New York)。
E.氨基硫醇反应性基团
β取代的氨基硫醇官能团的独特反应性使其极适用于经由形成噻唑烷来选择性修饰含有醛基的多肽和其它生物分子。例如参见J.Shao和J.Tarn,J.Am.Chem.Soc.1995,117(14)3893-3899。在一些实施例中，可将β-取代的氨基硫醇氨基酸并入hPP多肽中，且然后使其与包含醛官能团的水溶性聚合物反应。在一些实施例中，可经由形成噻唑烷使水溶性聚合物、药物结合物或其它有效载荷与包含β-取代的氨基硫醇氨基酸的hPP多肽偶合。
F.其它反应性基团
可并入本发明的hPP或hA或hFc中的其它反应性基团和非天然编码氨基酸(包括(但不限于)对氨基-苯丙氨酸)是描述于下列专利申请文件中：美国专利公开文献第2006/0194256号、美国专利公开文献第2006/0217532号、美国专利公开文献第2006/0217289号、美国临时专利第60/755,338号、美国临时专利第60/755,711号、美国临时专利第60/755,018号、国际专利申请文件第PCT/US06/49397号、WO2006/069246、美国临时专利第60/743,041号、美国临时专利第60/743,040号、国际专利申请文件第PCT/US06/47822号、美国临时专利第60/882,819号、美国临时专利第60/882,500号和美国临时专利第60/870,594号，所述专利申请文件都以全文引用的方式并入本文中。这些申请文件还论述可存在于PEG或其它聚合物上的反应性基团，包括(但不限于)用于结合的羟胺基(氨氧基)。
非天然氨基酸的细胞摄取
细胞对非天然氨基酸的摄取是在设计和选择包括(但不限于)用于并入蛋白质中的非天然氨基酸时通常考虑的一个问题。举例来说，α-氨基酸的高电荷密度提示这些化合物不可能为细胞可渗透的。经由一系列基于蛋白质的转运系统将天然氨基酸吸收到真核细胞中。可进行快速筛选以分析哪些非天然氨基酸(如果存在)被细胞吸收。例如参看，例如标题为“Protein Arrays”的美国专利公开文献第2004/198637号(其以引用的方式并入本文中)以及Liu,D.R.和Schultz,P.G.(1999)Progress toward theevolution of an organism with an expanded genetic code.PNAS United States96:4780-4785中的毒性检定。尽管易于利用各种检定来分析摄取，但设计适用于细胞摄取途径的非天然氨基酸的替代方法是提供生物合成途径以在活体内产生氨基酸。
非天然氨基酸的生物合成
许多生物合成途径已存在于细胞中以供产生氨基酸和其它化合物。自然界(包括(但不限于)细胞)中可能不存在特定非天然氨基酸的生物合成方法，但本发明提供所述方法。举例来说，视情况通过加入新颖酶或改变现有宿主细胞途径而在宿主细胞中产生非天然氨基酸的生物合成途径。其它新颖酶视情况为天然存在的酶或人工开发的酶。举例来说，对氨基苯丙氨酸的生物合成(如标题为“In vivo incorporation of unnaturalamino acids”的WO 2002/085923中的实例中所提供)依赖来自其它生物体的已知酶的组合的加入。可通过利用包含这些酶的基因的质粒转化细胞来将所述基因引入真核细胞中。当在细胞中表达时，这些基因提供合成所需化合物的酶促途径。视情况加入的酶类型的实例是提供于下文实例中。其它酶序列可见于例如Genbank中。也视情况以相同方式将人工开发的酶加入细胞中。以此方式操纵细胞的细胞机构和资源，从而产生非天然氨基酸。
多种方法可用于产生用于生物合成途径或发展现有途径的新颖酶。举例来说，视情况使用包括(但不限于)如Maxygen,Inc.所开发的递归重组(recursive recombination)(可在万维网的maxygen.com上获得)来开发新颖酶和途径。例如参见Stemmer(1994),Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling,Nature 370(4):389-391；和Stemmer,(1994),DNA shuffling by random fragmentation and reassembly:In vitro recombinationfor molecular evolution,Proc.Natl.Acad.Sci.USA..91:10747-10751。类似地，视情况将Genencor所开发的DesignPathTM(可在万维网的genencor.com上获得)用于代谢途径工程化，包括(但不限于)工程化在细胞中产生O-甲基-L-酪氨酸的途径。这项技术使用新基因(包括(但不限于)通过功能性基因组学以及分子进化和设计所鉴别的基因)的组合在宿主生物体中重建现有途径。Diversa公司(可在万维网的diversa.com上获得)也提供迅速筛选基因文库和基因途径的技术，从而包括(但不限于)建立新途径。
通常，利用本发明的经工程化的生物合成途径产生的非天然氨基酸是以足以进行有效蛋白质生物合成(包括(但不限于)天然细胞量)但未达到影响其它氨基酸的浓度或耗尽细胞资源的程度的浓度来产生。在活体内以此方式产生的典型浓度为约10mM到约0.05mM。在利用包含用于产生特定途径所需的酶的基因的质粒转化细胞并且产生非天然氨基酸后，视情况使用活体内选择以针对核糖体蛋白质合成和细胞生长进一步优化非天然氨基酸的产生。
具有非天然氨基酸的多肽
非天然氨基酸的并入可出于多种目的来进行，包括(但不限于)调整蛋白质结构和/或功能的改变；改变尺寸、酸度、亲核性、氢键结、疏水性、蛋白酶标靶位点的可及性；靶向部分(包括(但不限于)用于蛋白质阵列)；添加生物活性分子；连接聚合物；连接放射性核素；调节血清半衰期；调节组织渗透(例如肿瘤)；调节主动转运；调节组织、细胞或器官特异性或分布；调节免疫原性；调节蛋白酶抗性等。包括非天然氨基酸的蛋白质可具有增强的或甚至完全新颖的催化或生物物理性质。举例来说，通过在蛋白质中包括非天然氨基酸来视情况改良下列性质：毒性、生物分布、结构性质、光谱性质、化学和/或光化学性质、催化能力、半衰期(包括(但不限于)血清半衰期)、与其它分子包括(但不限于)共价或非共价反应的能力等。包括包含至少一个非天然氨基酸的蛋白质的组合物适用于包括(但不限于)新颖治疗剂、诊断剂、催化酶、工业酶、结合蛋白(包括(但不限于)抗体)以及包括(但不限于)蛋白质结构和功能的研究。例如参见Dougherty,(2000)Unnatural Amino Acids as Probes of ProteinStructure and Function,Current Opinion in Chemical Biology,4:645-652。
在本发明的一方面，组合物包括至少一种具有至少一个，包括(但不限于)至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个或十个以上非天然氨基酸的蛋白质。非天然氨基酸可相同或不同，包括(但不限于)在蛋白质中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上不同位点，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上不同的非天然氨基酸。另一方面，组合物包括蛋白质中所存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸经非天然氨基酸取代的蛋白质。对于具有一个以上非天然氨基酸的给定蛋白质，非天然氨基酸可相同或不同(包括(但不限于)蛋白质可包括两个或两个以上不同类型的非天然氨基酸，或可包括两个相同的非天然氨基酸)。对于具有两个以上非天然氨基酸的给定蛋白质，非天然氨基酸可相同、不同或为多个相同种类的非天然氨基酸与至少一个不同非天然氨基酸的组合。
所关注的具有至少一个非天然氨基酸的蛋白质或多肽是本发明的特征。本发明还包括使用本发明的组合物和方法产生的具有至少一个非天然氨基酸的多肽或蛋白质。赋形剂(包括(但不限于)医药学上可接受的赋形剂)也可与蛋白质一起存在。
通过在真核细胞中产生所关注的具有至少一个非天然氨基酸的蛋白质或多肽，蛋白质或多肽通常将包括真核生物翻译后修饰。在某些实施例中，蛋白质包括至少一个非天然氨基酸和至少一个由真核细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰并非由原核细胞进行。举例来说，翻译后修饰包括包括(但不限于)乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰、糖基化等。一方面，翻译后修饰包括通过GlcNAc-天冬酰胺键使寡糖(包括(但不限于)(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc)与天冬酰胺连接。也参见表1，表1列出真核生物蛋白质的N-连接寡糖的一些实例(也可存在其它未表示的残基)。另一方面，翻译后修饰包括通过GalNAc-丝氨酸或GalNAc-苏氨酸键或GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键使寡糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸连接。
表1：通过GlcNAc键连接的寡糖的实例
另一方面，翻译后修饰包括前体(包括(但不限于)降钙素前体、降钙素基因相关肽前体、前甲状旁腺激素原(preproparathyroid hormone)、前胰岛素原、胰岛素原、前阿黑皮素原(prepro-opiomelanocortin)、阿黑皮素原等)的蛋白水解加工，组装成多亚单元蛋白质或大分子组装物中，翻译到细胞中的另一位点(包括(但不限于)细胞器，诸如内质网、高尔基体(Golgi apparatus)、核、溶酶体、过氧化物酶体、线粒体、叶绿体、空泡等，或通过分泌途径)。在某些实施例中，蛋白质包含分泌或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合物等。美国专利第4,963,495号和第6,436,674号(其以引用的方式并入本文中)详述可改进hPP多肽的分泌的构筑体。
非天然氨基酸的一个优势在于，其提供可用于添加其它分子的其它化学部分。这些修饰可在真核细胞或非真核细胞中活体内进行或在活体外进行。因此，在某些实施例中，翻译后修饰是通过非天然氨基酸进行。举例来说，翻译后修饰可通过亲核-亲电子反应进行。目前用于选择性修饰蛋白质的大多数反应包括亲核与亲电子反应搭配物之间的共价键形成，包括(但不限于)α-卤基酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。这些情况下的选择性是由蛋白质中亲核残基的数目和可及性决定。在本发明的蛋白质中，可在活体外和活体内使用其它更具选择性的反应，诸如非天然酮基氨基酸与酰肼或氨氧基化合物的反应。例如参见Cornish等人,(1996)Am.Chem.Soc,118:8150-8151；Mahal等人,(1997)Science,276:1125-1128；Wang等人,(2001)Science292:498-500；Chin等人,(2002)Am.Chem.Soc.124:9026-9027；Chin等人,(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.99:11020-11024；Wang等人,(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.,100:56-61；Zhang等人,(2003)Biochemistry,42:6735-6746；以及Chin等人,(2003)Science,301:964-7，所有这些文献都是以引用的方式并入本文中。这允许用许多试剂选择性标记几乎任何蛋白质，所述试剂包括荧光团、交联剂、糖类衍生物以及细胞毒性分子。也参见标题为“Glycoproteinsynthesis”的美国专利第6,927,042号，其以引用的方式并入本文中。包括(但不限于)通过叠氮基氨基酸进行的翻译后修饰也可通过斯达汀格连接反应(Staudinger ligation)(包括(但不限于)用三芳基膦试剂)进行。例如参见Kiick等人,(2002)Incorporationof azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudingerligtation,PNAS 99:19-24。
本发明提供选择性修饰蛋白质的另一种极为有效的方法，其包括响应选择密码子将包括(但不限于)含有叠氮部分或炔基部分的非天然氨基酸遗传并入蛋白质中。然后，可包括(但不限于)通过休斯根[3+2]环加成反应(例如参见Padwa,A.,Comprehensive Organic Synthesis,第4卷,(1991)Trost,B.M.编,Pergamon,Oxford,第1069-1109页；和Huisgen,R.,1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry,(1984)Padwa,A.编,Wiley,New York,第1-176页)分别用包括(但不限于)炔基或叠氮衍生物来修饰这些氨基酸侧链。因为这一方法包括环加成而不是亲核取代，所以可以极高选择性修饰蛋白质。可在室温下在水性条件下通过向反应混合物中添加催化量的Cu(I)盐而以极佳区域选择性(1,4>1,5)进行这一反应。例如参见Tornoe等人,(2002)Org.Chem.67:3057-3064；和Rostovtsev等人,(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599。可使用的另一方法为用四半胱氨酸(tetracysteine)基元对双砷化合物进行配位体交换，例如参见Griffin等人,(1998)Science 281:269-272。
可通过[3+2]环加成添加到本发明的蛋白质中的分子包括几乎任何具有叠氮化物或炔基衍生物的分子。这些分子包括(但不限于)染料、荧光团、交联剂、糖类衍生物、聚合物(包括(但不限于)聚乙二醇的衍生物)、光交联剂、细胞毒性化合物、亲和标记、生物素衍生物、树脂、珠粒、第二蛋白质或多肽(或更多)、多核苷酸(包括(但不限于)DNA、RNA等)、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物等。分别可将这些分子添加到具有炔基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对炔丙氧基苯丙氨酸)或具有叠氮基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸)中。
V.活体内产生包含非遗传编码氨基酸的hPP或hA或hFc
可使用经修饰的tRNA和tRNA合成酶在活体内产生本发明的hPP或hFc多肽，以将其添加到天然存在的系统中无法编码的氨基酸中或取代所述氨基酸。
例如，使用天然存在的系统中无法编码的氨基酸产生tRNA和tRNA合成酶的方法是描述于美国专利第7,045,337号和美国专利申请公开文献2003/0108885(第10/126,931号)中，所述专利以引用的方式并入本文中。这些方法涉及产生独立于翻译系统的内源性合成酶和tRNA起作用(且因此有时称为“正交”)的翻译机构。翻译系统通常包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)。通常，O-RS在翻译系统中优先利用至少一种非天然存在氨基酸使O-tRNA氨酰化且O-tRNA识别至少一个不被系统中的其它tRNA识别的选择密码子。因此，翻译系统响应经编码的选择密码子将非天然编码氨基酸插入系统中所产生的蛋白质中，从而“取代”氨基酸使其进入编码多肽的某一位置中。
所属领域中已描述用于将特定合成氨基酸插入多肽中的多种正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶，且其通常适用于本发明。举例来说，酮基特异性O-tRNA/氨酰基tRNA合成酶是描述于Wang,L等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:56-61(2003)和Zhang,Z.等人,Biochem.42(22):6735-6746(2003)中。例示性O-RS或其部分是由多核苷酸序列编码并且包括美国专利申请公开文献2003/0082575和2003/0108885(各自以引用的方式并入本文)中所公开的氨基酸序列。与O-RS一起使用的相应O-tRNA分子也描述于美国专利第7,045,337号和美国专利申请公开文献2003/0108885(第10/126,931号)中，所述专利以引用的方式并入本文中。
叠氮化物特异性O-tRNA/氨酰基tRNA合成酶系统的实例是描述于Chin,J.W.等人,J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027(2002)中。对叠氮基-L-苯丙氨酸的例示性O-RS序列包括(但不限于)如美国专利申请公开文献2003/0108885(第10/126,931号)中所公开的核苷酸序列SEQ ID NOs:14-16和29-32以及氨基酸序列SEQ ID NO:46-48和61-64，所述专利以引用的方式并入本文中。适用于本发明的例示性O-tRNA序列包括(但不限于)如美国专利申请公开文献2003/0108885(第10/126,931号)(其以引用的方式并入本文中)中所公开的核苷酸序列SEQ ID NOs:1-3。对特定非天然氨基酸具特异性的O-tRNA/氨酰基tRNA合成酶对的其它实例是描述于美国专利第7,045,337号中，其以引用的方式并入本文中。在酿酒酵母中并入含酮基的氨基酸与含叠氮基的氨基酸的O-RS和O-tRNA是描述于Chin,J.W.等人,Science301:964-967(2003)中。
已报导若干其它正交对。已描述用于将非天然氨基酸潜在地并入大肠杆菌中的源自酿酒酵母tRNA和合成酶的谷氨酰胺酰基(例如参见Liu,D.R.和Schultz,P.G.,(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:4780-4785)、天冬氨酰基(例如参见Pastrnak,M等人,(2000)Helv.Chim.Acta 83:2277-2286)以及酪氨酰基(例如参见Ohno,S.等人,(1998)J. Biochem.(Tokyo,Jpn.)124:1065-1068；和Kowal,A.K.等人,(2001)Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.98:2268-2273)系统。已描述用于酿酒酵母的源自大肠杆菌谷氨酰胺酰基(例如参见Kowal,A.K.等人,(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:2268-2273)和酪氨酰基(例如参见Edwards,H.和Schimmel,P.(1990)Mol.Cell.Biol.10:1633-1641)合成酶的系统。大肠杆菌酪氨酰基系统已用于将3-碘-L-酪氨酸在活体内并入哺乳动物细胞中。参见Sakamoto,K.等人,(2002)Nucleic Acids Res.30:4692-4699。
O-tRNA/氨酰基tRNA合成酶的使用涉及选择编码非天然编码氨基酸的特定密码子。尽管可使用任何密码子，但一般需要选择很少或从未用于表达O-tRNA/氨酰基tRNA合成酶的细胞中的密码子。举例来说，例示性密码子包括无义密码子，诸如终止密码子(琥珀、赭石和蛋白石)；四个或四个以上碱基的密码子；和很少使用或未经使用的其它天然的三个碱基的密码子。
可使用所属领域中已知的诱变方法(包括(但不限于)位点特异性诱变、盒式诱变、限制选择诱变等)将特定的选择性密码子引入hPP多核苷酸编码序列的适当位置中。
用于产生可用于并入非天然编码氨基酸的蛋白质合成机构的组件(诸如O-RS、O-tRNA和正交O-tRNA/O-RS对)的方法是描述于Wang,L.等人,Science 292:498-500(2001)；Chin,J.W.等人,J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027(2002)；Zhang,Z等人,Biochemistry 42:6735-6746(2003)中。用于活体内并入非天然编码氨基酸的方法和组合物是描述于美国专利第7,045,337号中，其以引用的方式并入本文中。用于选择生物体的活体内翻译系统中所使用的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法也描述于美国专利第7,045,337号和美国专利申请公开文献2003/0108885(第10/126,931号)中，其以引用的方式并入本文中。标题为“Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids intoProteins”的PCT公开文献第WO 04/035743号(其以全文引用的方式并入本文中)描述用于并入酮基氨基酸的正交RS和tRNA对。标题为“Expanding the Eukaryotic GeneticCode”的PCT公开文献第WO 04/094593号(其以全文引用的方式并入本文中)描述用于将非天然编码的氨基酸并入真核宿主细胞中的正交RS和tRNA对。
用于产生至少一种重组正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的方法包含：(a)由第一生物体产生源自至少一种氨酰基tRNA合成酶(RS)的(视情况突变)RS文库，所述第一生物体包括(但不限于)原核生物体(诸如詹氏甲烷球菌、产甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、强烈炽热球菌、极端嗜热古菌、嗜热泉生古细菌、嗜热栖热菌等)或真核生物体；(b)在RS(视情况突变RS)文库中选择(和/或筛选)在存在非天然编码氨基酸和天然氨基酸的情况下使正交tRNA(O-tRNA)氨酰化的成员，从而提供活性(视情况突变)RS池；和/或(c)在所述池中选择(视情况通过阴性选择)在不存在非天然编码氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨酰化的活性RS(包括(但不限于)突变RS)，从而提供所述至少一种重组O-RS；其中所述至少一种重组O-RS利用非天然编码氨基酸优先使O-tRNA氨酰化。
在一个实施例中，RS为无活性RS。可通过使活性RS突变来产生无活性RS。举例来说，可通过使至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个或至少约10个或10个以上氨基酸突变成不同氨基酸(包括(但不限于)丙氨酸)来产生无活性RS。
可使用所属领域已知的各种技术产生突变RS文库，所述技术包括(但不限于)基于蛋白质三维RS结构的合理设计或在随机或合理设计技术中RS核苷酸的诱变。举例来说，可通过位点特异性突变、随机突变、产生多样性的重组突变、嵌合构筑体、合理设计和本文中所述或所属领域已知的其它方法产生突变RS。
在一个实施例中，在RS(视情况突变RS)文库中选择(和/或筛选)(包括(但不限于))在存在非天然编码氨基酸和天然氨基酸的情况下使正交tRNA(O-tRNA)氨酰化的活性成员包括：将阳性选择或筛选标记(包括(但不限于)抗生素抗性基因等)和(视情况突变)RS文库引入多个细胞中，其中阳性选择和/或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)琥珀密码子、赭石密码子或蛋白石密码子)；使所述多个细胞在存在选择剂的情况下生长；通过抑制阳性选择或筛选标记中的所述至少一个选择密码子来鉴别在存在选择剂和/或筛选剂的情况下存活(或显示特异性反应)的细胞，从而提供含有活性(视情况突变)RS池的经阳性选择细胞的子集。视情况可改变选择剂和/或筛选剂浓度。
一方面，阳性选择标记为氯霉素(chloramphenicol)乙酰基转移酶(CAT)基因且选择密码子为CAT基因中的琥珀终止密码子。视情况，阳性选择标记为β-内酰胺酶基因且选择密码子为β-内酰胺酶基因中的琥珀终止密码子。另一方面，阳性筛选标记包含荧光或发光筛选标记或基于亲和性的筛选标记(包括(但不限于)细胞表面标记)。
在一个实施例中，在池中阴性选择或筛选在不存在非天然编码氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨酰化的活性RS(视情况突变体)包括：将阴性选择或筛选标记与来自阳性选择或筛选的活性(视情况突变)RS池引入第二生物体的多个细胞中，其中阴性选择或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)抗生素抗性基因，其包括(但不限于)氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因)；以及鉴别在补充有非天然编码氨基酸和筛选剂或选择剂的第一培养基中存活或显示特异性筛选反应，但在未补充非天然编码氨基酸和选择剂或筛选剂的第二培养基中不能存活或显示特异性反应的细胞，从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或筛选细胞。举例来说，CAT鉴别方案在适当O-RS重组体的确定中视情况充当阳性选择和/或阴性筛选。举例来说，视情况在存在或不存在一个或一个以上非天然编码氨基酸的情况下在含有CAT(其包含至少一个选择密码子)的生长板上复制克隆池。因此，认为仅在含有非天然编码氨基酸的平板上生长的菌落含有重组O-RS。一方面，改变选择(和/或筛选)剂的浓度。在一些方面中，第一与第二生物体是不同的。因此，第一和/或第二生物体视情况包含：原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。在其它实施例中，筛选标记包含荧光或发光筛选标记或基于亲和性的筛选标记。
在另一实施例中，在池中筛选或选择(包括(但不限于)阴性选择)活性(视情况突变)RS包括：自阳性选择步骤(b)分离活性突变RS池；将阴性选择或筛选标记和活性(视情况突变)RS池引入第二生物体的多个细胞中，其中阴性选择或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)包含至少一个选择密码子的毒性标记基因，其包括(但不限于)核糖核酸酶barnase基因)；以及鉴别在未补充非天然编码氨基酸的第一培养基中存活或显示特异性筛选反应，但在补充有非天然编码氨基酸的第二培养基中不能存活或显示特异性筛选反应的细胞，从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或筛选细胞，其中所述至少一种重组O-RS对非天然编码氨基酸具特异性。一方面，所述至少一个选择密码子包含约两个或两个以上选择密码子。这些实施例视情况可包括所述至少一个选择密码子包含两个或两个以上选择密码子的情形，以及第一与第二生物体不同(包括(但不限于)各生物体视情况为(包括(但不限于))原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等)的情形。另外，一些方面包括阴性选择标记包含核糖核酸酶barnase基因(其包含至少一个选择密码子)的情形。其它方面包括筛选标记视情况包含荧光或发光筛选标记或基于亲和力的筛选标记的情形。在本文中的实施例中，筛选和/或选择视情况包括筛选和/或选择严格度的变化。
在一个实施例中，用于产生至少一种重组正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的方法可进一步包含：(d)分离所述至少一种重组O-RS；(e)产生源自所述至少一种重组O-RS的第二组O-RS(视情况突变)；以及(f)重复步骤(b)和(c)，直到获得包含优先使O-tRNA氨酰化的能力的突变O-RS。视情况，将步骤(d)-(f)重复(包括(但不限于))至少约两次。一方面，可通过诱变(包括(但不限于)随机诱变、位点特异性诱变、重组或其组合)产生源自至少一种重组O-RS的第二组突变O-RS。
在上述方法中，选择/筛选步骤(包括(但不限于)阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性与阴性选择/筛选步骤(b)与(c))的严格度视情况包括改变选择/筛选严格度。在另一实施例中，阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性与阴性选择/筛选步骤(b)与(c)包含使用报告基因，其中报告基因是通过荧光激活细胞分类(FACS)检测或其中报告基因是通过发光检测。报告基因是视情况呈现于细胞表面、噬菌体呈现上等且根据涉及非天然编码氨基酸或类似物的亲和性或催化活性进行选择。在一个实施例中，突变合成酶是呈现于细胞表面、噬菌体呈现上等。
用于产生重组正交tRNA(O-tRNA)的方法包括：(a)由第一生物体产生源自至少一种tRNA(包括(但不限于)抑制因子tRNA)的突变tRNA文库；(b)在所述文库中选择(包括(但不限于)阴性选择)或筛选在不存在来自第一生物体的RS的情况下通过来自第二生物体的氨酰基tRNA合成酶(RS)氨酰化的(视情况突变)tRNA，从而提供tRNA(视情况突变体)池；以及(c)在所述tRNA(视情况突变体)池中选择或筛选通过引入的正交RS(O-RS)氨酰化的成员，从而提供至少一种重组O-tRNA；其中所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子且无法由来自第二生物体的RS有效识别且通过O-RS优先氨酰化。在一些实施例中，所述至少一种tRNA为抑制因子tRNA和/或包含具有天然和/或非天然碱基的独特的三个碱基的密码子，或为无义密码子、稀有密码子、非天然密码子、包含至少4个碱基的密码子、琥珀密码子、赭石密码子或蛋白石终止密码子。在一个实施例中，重组O-tRNA具有正交性的改良。应了解在一些实施例中，O-tRNA无需修饰而视情况从第二生物体引入第一生物体中。在各种实施例中，第一与第二生物体是相同或不同的且视情况选自(包括(但不限于))原核生物(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、产甲烷杆菌、大肠杆菌、嗜盐菌等)、真核生物、哺乳动物、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。另外，重组tRNA是由非天然编码氨基酸视情况氨酰化，其中非天然编码氨基酸是在活体内天然生物合成或通过基因操纵生物合成。视情况将非天然编码氨基酸添加到至少第一或第二生物体的生长培养基中。
一方面，在所述文库中选择(包括(但不限于)阴性选择)或筛选通过氨酰基tRNA合成酶氨酰化的(视情况突变)tRNA(步骤(b))包括：将毒性标记基因和(视情况突变)tRNA文库引入来自第二生物体的多个细胞中，其中毒性标记基因包含至少一个选择密码子(或导致产生毒性剂或抑制剂(static agent)的基因或生物体必需的基因，其中所述标记基因包含至少一个选择密码子)；和选择存活细胞，其中存活细胞含有包含至少一个正交tRNA或非功能性tRNA的(视情况突变)tRNA池。举例来说，可通过使用比较比率细胞密度检定来选择存活细胞。
另一方面，毒性标记基因可包括两个或两个以上选择密码子。在所述方法的另一实施例中，毒性标记基因为核糖核酸酶barnase基因，其中核糖核酸酶barnase基因包含至少一个琥珀密码子。核糖核酸酶barnase基因视情况可包括两个或两个以上琥珀密码子。
在一个实施例中，在(视情况突变)tRNA池中选择或筛选通过引入的正交RS(O-RS)氨酰化的成员可包括：将阳性选择或筛选标记基因以及O-RS和(视情况突变)tRNA池引入来自第二生物体的多个细胞中，其中阳性标记基因包含药物抗性基因(其包括(但不限于)β-内酰胺酶基因，其包含至少一个选择密码子，诸如至少一个琥珀终止密码子)或生物体必需的基因或使得毒性剂解毒的基因；以及鉴别在存在选择剂或筛选剂(包括(但不限于)抗生素)的情况下生长的存活细胞或筛选细胞，从而提供具有至少一种重组tRNA的细胞池，其中所述至少一种重组tRNA是通过O-RS氨酰化且响应所述至少一个选择密码子将氨基酸插入由阳性标记基因编码的翻译产物中。在另一实施例中，改变选择剂和/或筛选剂的浓度。
提供用于产生特异性O-tRNA/O-RS对的方法。所述方法包括：(a)由第一生物体产生源自至少一种tRNA的突变tRNA的文库；(b)在所述文库中阴性选择或筛选在不存在来自第一生物体的RS的情况下通过来自第二生物体的氨酰基tRNA合成酶(RS)氨酰化的(视情况突变)tRNA，从而提供(视情况突变)tRNA池；(c)在(视情况突变)tRNA池中选择或筛选通过引入的正交RS(O-RS)氨酰化的成员，从而提供至少一种重组O-tRNA。所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子且无法由来自第二生物体的RS有效识别且通过O-RS优先氨酰化。所述方法还包括(d)由第三生物体产生源自至少一种氨酰基tRNA合成酶(RS)的(视情况突变)RS的文库；(e)在所述突变RS文库中选择或筛选在存在非天然编码氨基酸和天然氨基酸的情况下优先使所述至少一种重组O-tRNA氨酰化的成员，从而提供活性(视情况突变)RS池；和(f)在所述池中阴性选择或筛选在不存在非天然编码氨基酸的情况下优先使所述至少一种重组O-tRNA氨酰化的活性(视情况突变)RS，从而提供至少一个特异性O-tRNA/O-RS对，其中所述至少一个特异性O-tRNA/O-RS对包含至少一种对非天然编码氨基酸具特异性的重组O-RS和所述至少一种重组O-tRNA。包括由所述方法产生的特异性O-tRNA/O-RS对。举例来说，特异性O-tRNA/O-RS对可包括(包括(但不限于))mutRNATyr-mutTyrRS对，诸如mutRNATyr-SS12TyrRS对、mutRNALeu-mutLeuRS对、mutRNAThr-mutThrRS对、mutRNAGlu-mutGluRS对等。另外，所述方法包括第一与第三生物体相同(其包括(但不限于)詹氏甲烷球菌)的情形。
本发明中也包括选择用于第二生物体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法。所述方法包括：将标记基因、tRNA和从第一生物体分离或获得的氨酰基tRNA合成酶(RS)引入来自第二生物体的第一组细胞中；将标记基因和tRNA引入来自第二生物体的复制细胞组中；和选择在复制细胞组中不能存活的第一组中的存活细胞或筛选显示特异性筛选反应但在复制细胞组中不能提供这种反应的细胞，其中第一组与复制细胞组是在存在选择剂或筛选剂的情况下生长，其中存活或筛选细胞包含用于第二生物体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对。在一个实施例中，比较和选择或筛选包括活体内互补检定。可改变选择剂或筛选剂的浓度。
本发明的生物体包含多种生物体和多种组合。举例来说，本发明方法的第一种生物体和第二种生物体可相同或不同。在一个实施例中，生物体视情况为原核生物体，其包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、产甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、强烈炽热球菌、极端嗜热古菌、嗜热泉生古细菌、嗜热栖热菌等。或者，生物体视情况包含真核生物体，其包括(但不限于)植物(包括(但不限于)复杂植物，诸如单子叶植物或双子叶植物)、藻类、原生生物、真菌(包括(但不限于)酵母等)、动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、节肢动物等)等。在另一实施例中，第二种生物体为原核生物体，其包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、产甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、嗜盐菌、强烈炽热球菌、极端嗜热古菌、嗜热泉生古细菌、嗜热栖热菌等。或者，第二种生物体可为真核生物体，其包括(但不限于)酵母、动物细胞、植物细胞、真菌、哺乳动物细胞等。在各个实施例中，第一种生物体和第二种生物体可不同。
VI.hPP或hA或hFc中非天然存在氨基酸的位置
本发明涵盖将一个或一个以上非天然存在氨基酸并入hPP或hFc多肽中。可将一个或一个以上非天然存在氨基酸并入特定位置处而不破坏多肽活性。这可以通过进行“保守”取代实现，包括(但不限于)用疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸；用庞大氨基酸取代庞大氨基酸；用亲水性氨基酸取代亲水性氨基酸；和/或将非天然存在氨基酸插入活性不需要的位置中。
可使用多种生物化学和结构方法来选择hPP或hFc多肽内供非天然编码氨基酸取代的所需位点。所属领域的一般技术人员显而易见，多肽链的任何位置都适用于选择以并入非天然编码氨基酸，并且选择可建立在合理设计的基础上或者通过随机选择来进行以实现任何目的或无特定需要的目的。所需位点的选择可用于产生具有任何所需性质或活性的hPP或hFc分子，包括(但不限于)激动剂、超激动剂、反向激动剂、拮抗剂、受体结合调节剂、受体活性调节剂、与结合搭配物结合的调节剂、结合搭配物活性调节剂、结合搭配物构象调节剂；二聚物或多聚物形成；与天然分子相比活性或性质无改变；或者操纵多肽的任何物理或化学性质(诸如，溶解性、聚集或稳定性)。举例来说，可使用所属领域已知的点突变分析、丙氨酸扫描或同系物扫描方法来鉴别hPP或hFc多肽中为多肽生物活性所需的位置。美国专利第5,580,723号、第5,834,250号、第6,013,478号、第6,428,954号和第6,451,561号(其以引用的方式并入本文中)描述通过用标靶物质鉴别影响多肽活性的活性域来系统分析诸如hGH等多肽的结构和功能的方法。除通过丙氨酸或同系物扫描诱变鉴别为对生物活性至关重要的残基外的残基可视对于多肽所寻求的所需活性而为供非天然编码氨基酸取代的良好候选物。或者，经鉴别为对生物活性至关重要的位点也可视对于多肽所寻求的所需活性而为供非天然编码氨基酸取代的良好候选物。另一替代方法将为在多肽链上的各个位置中利用非天然编码氨基酸简单地进行连续取代并且观察对多肽活性的影响。所属领域的一般技术人员显而易见，在任何多肽中选择供非天然氨基酸取代的位置的任何方式、技术或方法都适用于本发明中。
也可检查hPP多肽的含有缺失的天然存在突变体的结构和活性以确定有可能耐受非天然编码氨基酸进行的取代的蛋白质区域。在已去除可能无法耐受非天然编码氨基酸进行的取代的残基后，可自hPP或hFc和其结合蛋白的三维晶体结构检查所推荐的取代在各剩余位置处的影响。如果无法得到三维结构数据，那么可建立模型来研究多肽的二级结构和三级结构。因此，所属领域的一般技术人员可容易地鉴别可经非天然编码氨基酸取代的氨基酸位置。
在一些实施例中，本发明的hPP或hFc多肽包含一个或一个以上位于不破坏多肽的二级结构的蛋白质的区中的非天然存在氨基酸。
在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入对应于hA的二级结构的下列各区中的一个或一个以上区中的任何位置处，所述位置如下：位置1(即，在N-末端)之前、17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、574、581以及位置582(即，在蛋白质的羧基末端)之后(SEQ ID NO:1)。
可用多种非天然编码氨基酸取代hPP或hFc多肽中的给定位置，或可将所述氨基酸并入所述位置中。一般来说，根据hPP或hFc多肽与其受体或结合搭配物的三维晶体结构的检查来选择供并入的特定非天然编码氨基酸，其中优选保守取代(即，基于芳基的非天然编码氨基酸，诸如取代Phe、Tyr或Trp的对乙酰基苯丙氨酸或O-炔丙基酪氨酸)以及需要引入hPP或hFc多肽蛋白的特定结合化学(例如，如果需要利用具有炔部分的水溶性聚合物来实现休根斯[3+2]环加成，或需要利用具有芳基酯的水溶性聚合物来形成酰胺键，那么引入4-叠氮基苯丙氨酸，反之，并入膦部分)。
在一个实施例中，所述方法进一步包括将非天然氨基酸并入蛋白质中，其中所述非天然氨基酸包含第一反应性基团；和使所述蛋白质与包含第二反应性基团的分子(包括(但不限于)标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；放射性核素、细胞毒性化合物；药物；亲和标记；光亲和标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖类；水溶性树枝状聚合物；环糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼化部分；光化辐射可激发的部分；可光致异构化部分；生物素；生物素衍生物；生物素类似物；合并有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；量子点；纳米传递素；放射性核苷酸；放射性传递素；中子捕获剂；或上述物质的任何组合或任何其它所需的化合物或物质)接触。第一反应性基团与第二反应性基团反应以使分子通过[3+2]环加成与非天然氨基酸连接。在一个实施例中，第一反应性基团为炔基或叠氮基部分，且第二反应性基团为叠氮基或炔基部分。举例来说，第一反应性基团为炔基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对炔丙氧基苯丙氨酸中)且第二反应性基团为叠氮基部分。在另一实例中，第一反应性基团为叠氮基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中)，且第二反应性基团为炔基部分。
在一些情况下，将非天然编码氨基酸取代与hPP多肽内的其它添加、取代或缺失组合以影响hPP或hFc多肽的其它生物性质。在一些情况下，所述其它添加、取代或缺失可增加hPP或hFc多肽的稳定性(包括(但不限于)对蛋白水解降解的抗性)或增加hPP或hFc多肽对其受体或结合搭配物的亲和力。在一些情况下，所述其它添加、取代或缺失可增加hPP或hFc多肽的溶解性(包括(但不限于)当在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达时)。在一些实施例中，添加、取代或缺失在表达于大肠杆菌或其它重组宿主细胞中之后可增加多肽溶解性。在一些实施例中，除并入非天然氨基酸的位点外还选择另一位点以供天然编码或非天然氨基酸取代，此使得在大肠杆菌或其它重组宿主细胞中表达后增加多肽溶解性。在一些实施例中，hPP或hFc多肽包含另一添加、取代或缺失，其调节对hPP或hFc多肽受体、结合蛋白或缔合配位体的亲和力；调节(包括(但不限于)增加或降低)受体二聚化；使受体二聚物稳定；调节循环半衰期；调节释放或生物可用性；有利于纯化；或者改进或改变特定给药途径。类似地，hPP或hFc多肽可包含化学或酶裂解序列、蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域(包括(但不限于)FLAG或聚组氨酸)或其它基于亲和性的序列(包括(但不限于)FLAG、聚组氨酸、GST等)或连接分子(包括(但不限于)生物素)，其改进检测(包括(但不限于)GFP)、纯化、通过组织或细胞膜的转运、前药释放或活化、hPP或hFc尺寸减小或多肽的其它性质。
在一些情况下，用一个或一个以上非天然编码氨基酸取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上氨基酸。在一些情况下，hPP或hFc多肽进一步包括一个或一个以上非天然编码氨基酸对天然存在氨基酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上取代。举例来说，在一些实施例中，hA的下列区中的一个或一个以上残基是经一个或一个以上非天然编码氨基酸取代：位置1(即，在N-末端)之前、17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、574、581以及位置582(即，在蛋白质的羧基末端)之后(SEQ ID NO:1)。
在一些情况下，将一个或一个以上非天然编码残基与一个或一个以上较低分子量的线性或分支PEG(质量为约5-20kDa或更低)连接，从而增加结合亲和力且使血清半衰期与连接到单一较高分子量PEG的物质可相当。
hA中用于并入两个或两个以上非天然编码氨基酸的优选位置包括下列残基的组合：位置1(即，在N-末端)之前、17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、574、581以及位置582(即，在蛋白质的羧基末端)之后(SEQ ID NO:1)。
VII.非真核生物和真核生物中的表达
为获得克隆hPP或hA或hFc多核苷酸的高水平表达，通常将编码本发明的hPP或hA或hFc多肽的多核苷酸亚克隆到含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子以及(如果就编码蛋白质的核酸来说)供翻译起始的核糖体结合位点的表达载体中。合适的细菌启动子为所属领域的一般技术人员所知且描述于例如Sambrook等人和Ausubel等人中。
用于表达本发明的hPP或hA或hFc多肽的细菌表达系统可在(包括(但不限于))大肠杆菌、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌和沙门氏菌(Salmonella)中获得(Palva等人,Gene 22:229-235(1983)；Mosbach等人,Nature302:543-545(1983))。用于这些表达系统的试剂盒可购得。哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统为所属领域的一般技术人员所知且也可购得。在将正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶(如上所述)用于表达本发明的hPP或hA多肽的情况中，用于表达的宿主细胞是根据其使用正交组件的能力加以选择。例示性宿主细胞包括革兰氏阳性细菌(Gram-positive bacteria)(包括(但不限于)短小芽孢杆菌(B.brevis)、枯草杆菌(B.subtilis)或链霉菌(Streptomyces))和革兰氏阴性细菌(Gram-negativebacteria)(大肠杆菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌)，以及酵母和其它真核细胞。如本文中所述，可使用包含O-tRNA/O-RS对的细胞。
本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供合成包含大量有用的非天然氨基酸的蛋白质的能力。一方面，组合物视情况包括(包括(但不限于))至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或1克以上的包含非天然氨基酸的蛋白质，或可通过活体内蛋白质制备方法所实现的量的所述蛋白质(关于重组蛋白质制备和纯化的细节是提供于本文中)。另一方面，所述蛋白质视情况以在(包括(但不限于))细胞溶解产物、缓冲剂、医药缓冲剂或其它液体悬浮液(包括(但不限于)体积约为包括(但不限于)约1nl到约100L或100L以上)中(包括(但不限于))每升至少10微克蛋白质、每升至少50微克蛋白质、每升至少75微克蛋白质、每升至少100微克蛋白质、每升至少200微克蛋白质、每升至少250微克蛋白质、每升至少500微克蛋白质、每升至少1毫克蛋白质或每升至少10毫克或10毫克以上蛋白质的浓度存在于组合物中。在真核细胞中产生大量(包括(但不限于)大于通常用其它方法(包括(但不限于)活体外翻译)可能获得的量)蛋白质(包括至少一个非天然氨基酸)是本发明的特征。
本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供生物合成包含大量有用的非天然氨基酸的蛋白质的能力。举例来说，可在细胞提取物、细胞溶解产物、培养基、缓冲剂等中产生蛋白质浓度为(包括(但不限于))至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升或至少500微克/升、至少1毫克/升、至少2毫克/升、至少3毫克/升、至少4毫克/升、至少5毫克/升、至少6毫克/升、至少7毫克/升、至少8毫克/升、至少9毫克/升、至少10毫克/升、至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900毫克/升、1克/升、5克/升、10克/升或10克/升以上的包含非天然氨基酸的蛋白质。
多种适于表达hPP或hFc的载体都可购得。有效用于真核生物宿主的表达载体包括(但不限于)包含来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒以及细胞肥大病毒的表达控制序列的载体。这些载体包括pCDNA3.1(+)\Hyg(Invitrogen,Carlsbad,Calif,USA)和pCI-neo(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)。可使用细菌质粒，诸如来自大肠杆菌的质粒(包括pBR322、pET3a和pET12a)、较宽宿主范围质粒(诸如RP4)；噬菌体DNA，例如噬菌体λ(例如NM989)和其它DNA噬菌体(诸如M13和丝状单链DNA噬菌体)的多种衍生物。2μ质粒和其衍生物、POT1载体(美国专利第4,931,373号，其以引用的方式并入本文中)、(Okkels,Ann.New York Aced.Sci.782,202 207,1996)中述描的pJS037载体以及pPICZ A、B或C(Invitrogen)可与酵母宿主细胞一起使用。对于昆虫细胞，载体包括(但不限于)pVL941、pBG311(Cate等人,"Isolation of theBovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of theHuman Gene In Animal Cells",Cell,45,第685 98页(1986))、pBluebac4.5以及pMelbac(Invitrogen,Carlsbad,CA)。
编码hPP或hFc多肽的核苷酸序列还可包括或可不包括编码信号肽的序列。当多肽是由表达所述多肽的细胞分泌时，存在信号肽。这种信号肽可为任何序列。信号肽可为原核生物信号肽或真核生物信号肽。Coloma,M(1992)J.Imm.Methods 152:89 104描述用于哺乳动物细胞中的信号肽(鼠类Igκ轻链信号肽)。其它信号肽包括(但不限于)来自酿酒酵母的α-因子信号肽(美国专利第4,870,008号，其以引用的方式并入本文中)、小鼠唾液淀粉酶的信号肽(O.Hagenbuchle等人,Nature 289,1981,第643-646页)、经修饰的羧基肽酶信号肽(L.A.Vails等人,Cell 48,1987,第887-897页)、酵母BAR1信号肽(WO 87/02670，其以引用的方式并入本文中)以及酵母天冬氨酸蛋白酶3(yeast aspartic protease 3，YAP3)信号肽(参见M.Egel-Mitani等人,Yeast 6,1990,第127-137页)。
所属领域的一般技术人员已知合适哺乳动物宿主细胞的实例。这些宿主细胞可为中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞(例如CHO-K1；ATCC-CCL-61)、绿猴细胞(Green Monkey cell，COS)(例如COS 1(ATCC CRL-1650)、COS(ATCCCRL-1651))、小鼠细胞(例如NS/O)、幼仓鼠肾(Baby Hamster Kidney，BHK)细胞系(例如(ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)和人类细胞(例如HEK 293(ATCCCRL-1573))以及组织培养中的植物细胞。这些细胞系和其它细胞系可自诸如美国典型微生物菌种保藏中心(American Type Culture Collection,Rockville,Md)等公共寄存场所获得。为提供hPP多肽的改进的糖基化，可修饰哺乳动物宿主细胞以表达唾液酸转移酶，举例来说，如(例如)美国专利第5,047,335号中所述的1,6-唾液酸转移酶，所述专利以引用的方式并入本文中。
将外源DNA引入哺乳动物宿主细胞中的方法包括(但不限于)磷酸钙介导的转染、电穿孔、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、病毒载体以及LifeTechnologies Ltd,Paisley,UK中所述的使用Lipofectamine 2000的转染方法和RocheDiagnostics Corporation,Indianapolis,USA中所述的使用FuGENE 6的转染方法。这些方法在所属领域中为众所周知的且由Ausbel等人(编),1996,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,New York,USA描述。哺乳动物细胞的培养可根据(例如)如(Animal Cell Biotechnology,Methods and Protocols,Nigel Jenkins编,1999,Human Press Inc.Totowa,N.J.,USA；以及Harrison Mass.和Rae IF,General Techniquesof Cell Culture,Cambridge University Press 1997)中所公开的确定方法来进行。
I.表达系统、培养和分离
hPP或hA或hFc多肽可在任何数目的合适表达系统(例如包括酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞和细菌)中表达。例示性表达系统的描述是提供于下文中。
酵母：如本文中所使用，术语“酵母”包括能够表达编码hPP或hA或hFc多肽的基因的各种酵母中的任一种。这些酵母包括(但不限于)产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内孢霉目(Endomycetales))、担孢子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌(Fungi imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))类的酵母。产子囊酵母分为两个科：蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母菌科(Saccharomycetaceae)。后者包含四个亚科，即裂殖酵母亚科(Schizosaccharomycoideae)(例如，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces))、拿逊酵母亚科(Nadsonioideae)、油脂酵母亚科(Lipomycoideae)和酿酒酵母亚科(Saccharomycoideae)(例如，毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和酵母属(Saccharomyces))。担孢子酵母包括白冬孢酵母属(Leucosporidium)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、线黑粉酵母属(Filobasidium)和香灰拟锁担菌属(Filobasidiella)。属于半知菌(芽孢纲)类的酵母分为两个科：掷孢酵母科(Sporobolomycelaceae)(例如，掷孢酵母属(Sporoholomyces)和布勒掷孢酵母属(Bullera))和隐球酵母科(Cryptococcaceae)(例如，假丝酵母属(Candida))。
尤其受关注的供本发明使用的物种是毕赤酵母属、克鲁维酵母属、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)和假丝酵母属内的物种，所述物种包括(但不限于)巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、谷勒氏酵母(P.guillerimondii)、酿酒酵母、卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis)、糖化酵母(S.diastaticus)、道格拉斯酵母(S.douglasii)、克鲁维酵母(S.kluyveri)、诺本酵母(S.norbensis)、卵形酵母(S.oviformis)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、白色念珠菌(C.albicans)、麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)和汉森酵母(H.polymorpha)。
适用于表达hPP或hA或hFc多肽的酵母的选择是在所属领域的一般技术人员的技术范围内。在选择用于表达的酵母宿主时，合适宿主可包括显示具有例如良好分泌能力、低蛋白水解活性、良好分泌能力、良好可溶性蛋白质产生和总体稳固性的酵母宿主。酵母通常可自多种来源获得，包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系酵母基因保藏中心(Berkeley,CA)以及美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(Manassas,VA)。
术语“酵母宿主”或“酵母宿主细胞”包括可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的接受体的酵母。所述术语包括已接收重组载体或其它转移DNA的原始酵母宿主细胞的后代。应了解，由于偶发突变或故意突变，单一母体细胞的后代在形态上或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA方面可能未必完全相同。由这一定义所指代的后代中包括与将要以相关性质(诸如存在编码hPP或hA多肽的核苷酸序列)表征的母体足够类似的母体细胞的后代。
已研发包括染色体外复制子或整合载体的表达和转化载体，以将其转化到多种酵母宿主中。举例来说，已研发用于以下各酵母的表达载体：酿酒酵母(Sikorski等人,Genetics(1989)122:19；Ito等人,J.Bacteriol.(1983)153:163；Hinnen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75:1929)；白色念珠菌(Kurtz等人,Mol.Cell.Biol.(1986)6:142)；麦芽糖假丝酵母(Kunze等人,J.Basic Microbiol.(1985)25:141)；汉森酵母(Gleeson等人,J.Gen.Microbiol.(1986)132:3459；Roggenkamp等人,Mol.Genetics andGenomics(1986)202:302)；脆壁克鲁维酵母(Das等人,J.Bacteriol.(1984)158:1165)；乳酸克鲁维酵母(De Louvencourt等人,J.Bacteriol.(1983)154:737；Van den Berg等人,Bio/Technology(NY)(1990)8:135)；谷勒氏酵母(Kunze等人,J.Basic Microbiol.(1985)25:141)；巴斯德毕赤酵母(美国专利第5,324,639号；第4,929,555号；和第4,837,148号；Cregg等人,Mol.Cell.Biol.(1985)5:3376)；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)(Beach等人,Nature(1982)300:706)；以及耶氏酵母(Y.lipolytica)；构巢曲霉(A.nidulans)(Ballance等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.(1983)112:284-89；Tilburn等人,Gene(1983)26:205-221；和Yelton等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81:1470-74)；黑曲霉(A.niger)(Kelly和Hynes,EMBO J.(1985)4:475-479)；里氏木霉(T.reesia)(EP 0 244 234)；和丝状真菌，诸如脉孢菌(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、弯颈霉(Tolypocladium)(WO 91/00357)，其中各文献以引用的方式并入本文中。
用于酵母载体的控制序列为所属领域的一般技术人员所知且包括(但不限于)来自以下基因的启动子区域：例如，醇脱氢酶(ADH)(EP 0 284 044)；烯醇酶；葡萄糖激酶；葡萄糖-6-磷酸异构酶；甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAP或GAPDH)；己糖激酶；磷酸果糖激酶；3-磷酸甘油酸变位酶；和丙酮酸激酶(PyK)(EP 0 329 203)。编码酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也可提供适用的启动子序列(Miyanohara等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80:1)。用于酵母宿主的其它合适启动子序列可包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人,J.Biol.Chem.(1980)255:12073)和其它糖解酶(诸如丙酮酸脱羧酶、磷酸丙糖异构酶和磷酸葡萄糖异构酶(Holland等人,Biochemistry(1978)17:4900；Hess等人,J.Adv.Enzyme Reg.(1969)7:149))的启动子。具有由生长条件控制的转录的其它优势的可诱导酵母启动子可包括醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、与氮代谢相关的降解酶以及导致麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。适用于酵母表达的载体和启动子进一步描述于EP 0073 657中。
酵母增强子也可与酵母启动子一起使用。另外，合成启动子也可充当酵母启动子。举例来说，酵母启动子的上游活化序列(UAS)可与另一酵母启动子的转录活化区连接，从而产生合成杂合启动子。所述杂合启动子的实例包括与GAP转录活化区连接的ADH调控序列。参见美国专利第4,880,734号和第4,876,197号，其以引用的方式并入本文中。杂合启动子的其它实例包括由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的调控序列与糖解酶基因(诸如GAP或PyK)的转录活化区组成的启动子。参见EP 0 164 556。此外，酵母启动子可包括具有与酵母RNA聚合酶结合且起始转录的能力的非酵母来源的天然存在的启动子。
可构成酵母表达载体的部分的其它控制元件包括例如来自GAPDH或烯醇酶基因的终止子(Holland等人,J.BIOL.CHEM.(1981)256:1385)。另外，来自2μ质粒来源的复制起点适用于酵母。适用于酵母的选择基因为酵母质粒中所存在的trp1基因。参见Tschumper等人,Gene(1980)10:157；Kingsman等人,Gene(1979)7:141。trp1基因对缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母的突变菌株提供选择标记。类似地，由带有Leu2基因的已知质粒补充Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)。
将外源DNA引入酵母宿主中的方法为所属领域的一般技术人员所知且通常包括(但不限于)转化原生质球状体或转化经碱性阳离子处理的完整酵母宿主细胞。举例来说，可根据Hsiao等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)76:3829以及Van Solingen等人,J.BACT.(1977)130:946中所述的方法来进行酵母的转化。然而，也可如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Lab.Manual(2001)中通常所述来使用将DNA引入细胞中的其它方法，诸如通过核注射、电穿孔或原生质体融合。然后，可使用所属领域的一般技术人员已知的标准技术来培养酵母宿主细胞。
所属领域的一般技术人员已知在酵母宿主细胞中表达异源蛋白的其它方法。通常参见美国专利公开文献第20020055169号；美国专利第6,361,969号；第6,312,923号；第6,183,985号；第6,083,723号；第6,017,731号；第5,674,706号；第5,629,203号；第5,602,034号；和第5,089,398号；美国复审专利第RE37,343号和第RE35,749号；PCT公开专利申请文件WO 99/07862；WO 98/37208；和WO 98/26080；欧洲专利申请文件EP 0 946 736；EP 0 732 403；EP 0 480 480；WO 90/10277；EP 0 340 986；EP 0 329203；EP 0 324 274；和EP 0 164 556。也参见Gellissen等人,ANTONIE VanLEEUWENHOEK(1992)62(1-2):79-93；Romanos等人,YEAST(1992)8(6):423-488；Goeddel,METHODS IN ENZYMOLOOY(1990)185:3-7，其各自以引用的方式并入本文中。
在使用所属领域的一般技术人员已知的标准进料分批发酵方法进行的扩增阶段期间，可使酵母宿主菌株在发酵罐中生长。所述发酵方法可适用于解释特定酵母宿主的碳利用途径或表达控制模式的差异。举例来说，酵母菌酵母宿主的发酵可能需要单一葡萄糖进料、复合氮源(例如，酪蛋白水解产物)和多种维生素补充。相反，甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母可能需要甘油、甲醇和痕量矿物进料，但仅需要简单铵(氮)盐以进行最佳生长和表达。例如参见美国专利第5,324,639号；Elliott等人,J.PROTEINCHEM.(1990)9:95；和Fieschko等人,BIOTECH.BIOENG.(1987)29:1113，其各自以引用的方式并入本文中。
然而，这些发酵方法可具有与所用的酵母宿主菌株无关的某些常见特征。举例来说，在扩增阶段期间，可将限制生长的养分(通常为碳)添加到发酵罐中以允许最大生长。另外，发酵方法通常使用经设计成含有适量碳、氮、基础盐、磷和其它微量养分(维生素、痕量矿物和盐等)的发酵培养基。适用于毕赤酵母的发酵培养基的实例是描述于美国专利第5,324,639号和第5,231,178号中，其各自以引用的方式并入本文中。
感染杆状病毒的昆虫细胞：术语“昆虫宿主”或“昆虫宿主细胞”是指可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的接受体的昆虫。所述术语包括已经转染的原始昆虫宿主细胞的后代。应了解，由于偶发突变或故意突变，单一母体细胞的后代在形态上或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA方面可能未必完全相同。由这一定义所指代的后代中包括与将要以相关性质(诸如存在编码hPP或hA或hFc多肽的核苷酸序列)表征的母体充分类似的母体细胞的后代。
所属领域的一般技术人员已知适用于表达hPP或hA或hFc多肽的昆虫细胞的选择。多种昆虫物种在所属领域中得到充分描述且可购得，其包括埃及伊蚊(Aedesaegypti)、桑蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。在选择用于表达的昆虫宿主时，合适宿主可包括显示具有良好分泌能力、低蛋白水解活性和总体稳固性的那些宿主。昆虫通常可自多种来源获得，包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系昆虫基因保藏中心(Berkeley,CA)；以及美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(Manassas,VA)。
通常，感染杆状病毒的昆虫表达系统的组件包括：转移载体(通常为细菌质粒)，其含有杆状病毒基因组的片段和用于插入欲表达的异源基因的便利限制位点；野生型杆状病毒，其具有与转移载体中的杆状病毒特异性片段同源的序列(这允许将异源基因同源重组到杆状病毒基因组中)；以及合适的昆虫宿主细胞和生长培养基。所属领域中已知用于构筑载体、转染细胞、挑选斑块、使细胞在培养物中生长等的材料、方法和技术且可使用描述这些技术的手册。
在将异源基因插入转移载体中后，将载体和野生型病毒基因组转染到昆虫宿主细胞中，其中载体与病毒基因组重组。表达经包装的重组病毒，并且鉴别和纯化重组体斑块。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒形式购自例如Invitrogen Corp.(Carlsbad,CA)。这些技术通常为所属领域的一般技术人员所知且全面描述于Summers and Smith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin,第1555期,(1987)中，其以引用的方式并入本文中。还参见Richardson,39 Methods in MolecularBiology:Baculovirus Expression Protocols(1995)；Ausubel等人,Current Protocols inMolecular Biology 16.9-16.11(1994)；King和Possee,The Baculovirus System:ALaboratory Guide(1992)；以及O'Reilly等人,Baculovirus Expression Vectors:ALaboratory Manual(1992)。
实际上，使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统的各种异源蛋白质的制备为所属领域的一般技术人员所知。例如参见，美国专利第6,368,825号；第6,342,216号；第6,338,846号；第6,261,805号；第6,245,528号；第6,225,060号；第6,183,987号；第6,168,932号；第6,126,944号；第6,096,304号；第6,013,433号；第5,965,393号；第5,939,285号；第5,891,676号；第5,871,986号；第5,861,279号；第5,858,368号；第5,843,733号；第5,762,939号；第5,753,220号；第5,605,827号；第5,583,023号；第5,571,709号；第5,516,657号；第5,290,686号；WO 02/06305；WO 01/90390；WO 01/27301；WO 01/05956；WO 00/55345；WO 00/20032；WO 99/51721；WO 99/45130；WO 99/31257；WO 99/10515；WO 99/09193；WO 97/26332；WO 96/29400；WO 96/25496；WO 96/06161；WO 95/20672；WO 93/03173；WO 92/16619；WO 92/02628；WO 92/01801；WO 90/14428；WO 90/10078；WO 90/02566；WO 90/02186；WO 90/01556；WO 89/01038；WO 89/01037；WO 88/07082，其各自以引用的方式并入本文中。
适用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的载体在所属领域中为已知的且例如包括从杆状病毒苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)获得的昆虫表达和转移载体，其为不依赖于辅助细胞的病毒表达载体。从此系统得到的病毒表达载体通常使用强病毒多角体蛋白基因启动子来驱动异源基因的表达。通常参见O'Reilly等人,BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS:A LABORATORY MANUAL(1992)。
在将外来基因插入杆状病毒基因组中之前，通常将包含启动子、前导序列(必要时)、所关注的编码序列和转录终止序列的上述组件组装到中间错位构筑体(intermediate transplacement construct)(转移载体)中。中间错位构筑体通常保持在能够稳定保持在宿主(诸如细菌)中的复制子(诸如染色体外元件(例如，质粒))中。复制子将具有复制系统，因此使其保持在适用于克隆和扩增的宿主中。更具体来说，质粒可含有多角体蛋白聚腺苷酸化信号(Miller,Ann.Rev.Microbiol.(1988)42:177)和用于在大肠杆菌中选择和繁殖的原核氨比西林(ampicillin)抗性(amp)基因和复制起点。
一种将外来基因引入AcNPV中的常用转移载体为pAc373。也已经对所属领域的一般技术人员已知的许多其它载体进行设计，所述载体包括例如pVL985，其将多角体蛋白起始密码子由ATG变为ATT，且其将BamHI克隆位点引入ATT下游32个碱基对处。参见Luckow和Summers,VIROLOGY 170:31(1989)。其它可购得的载体包括例如PBlueBac4.5/V5-His、pBlueBacHis2、pMelBac、pBlueBac4.5(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)。
在插入异源基因之后，将转移载体和野生型杆状病毒基因组共转染到昆虫细胞宿主中。将异源DNA引入杆状病毒的所需位点中的方法在所属领域中为已知的。参见SUMMERS和SMITH,TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN,第1555期,(1987)；Smith等人,Mol.Cell.BIOL.(1983)3:2156；Luckow和Summers,VIROLOGY(1989)170:31中。举例来说，可通过同源双交叉重组插入诸如多角体蛋白基因等基因中；也可插入所需杆状病毒基因中经工程化的限制酶位点中。参见Miller等人,BIOESSAYS(1989)11(4):91。
可通过电穿孔来实现转染。参见TROTTER和WOOD,39 METHODS INMOLECULAR BIOLOGY(1995)；Mann和King,J.Gen.Virol.(1989)70:3501。或者，可使用脂质体以重组表达载体和杆状病毒转染昆虫细胞。例如参见Liebman等人,BIOTECHNIQUES(1999)26(1):36；Graves等人,BIOCHEMISTRY(1998)37:6050；Nomura等人,J.BIOL.CHEM.(1998)273(22):13570；Schmidt等人,PROTEINEXPRESSION AND PURIFICATION(1998)12:323；Siffert等人,Nature Genetics(1998)18:45；Tilkins等人,Cell Biology:A Laboratory Handbook 145-154(1998)；Cai等人,Protein Expression and Purification(1997)10:263；Dolphin等人,Nature Genetics(1997)17:491；Kost等人,GENE(1997)190:139；Jakobsson等人,J.BIOL.CHEM.(1996)271:22203；Rowles等人,J.BIOL.CHEM.(1996)271(37):22376；Reverey等人,J.BIOL.CHEM.(1996)271(39):23607-10；Stanley等人,J.BIOL.CHEM.(1995)270:4121；Sisk等人,J.Virol.(1994)68(2):766；以及Peng等人,BIOTECHNIQUES(1993)14(2):274。可购得的脂质体包括例如和(Invitrogen,Corp.,Carlsbad,CA)。另外，也可使用磷酸钙转染。参见Trotter和Wood,39 METHODS IN Molecular Biology(1995)；Kitts,NAR(1990)18(19):5667；以及Mann和King,J.Gen.Virol.(1989)70:3501。
杆状病毒表达载体通常含有杆状病毒启动子。杆状病毒启动子是能够与杆状病毒RNA聚合酶结合且起始编码序列(例如，结构基因)下游(3')转录成mRNA的任何DNA序列。启动子将具有通常与编码序列的5'端最接近放置的转录起始区。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。杆状病毒启动子也可具有称作增强子的第二区域，当存在所述区域时，其通常在结构基因的末梢。此外，表达可经调控或具有组成性。
在感染周期的末期大量转录的结构基因提供特别适用的启动子序列。实例包括源自编码病毒多面体蛋白的基因(Friesen等人,The Regulation of Baculovirus GeneExpression,THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES(1986)；EP 0 127 839和0155476)和编码p10蛋白的基因(Vlak等人,J.GEN.VIROL.(1988)69:765)的序列。
将新近形成的杆状病毒表达载体包装到感染性重组杆状病毒中，且随后可通过所属领域的一般技术人员已知的技术来纯化所生长的斑块。参见Miller等人,BIOESSAYS(1989)11(4):91；SUMMERS和SMITH,TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENTSTATION BULLETIN,第1555期,(1987)。
已开发用于感染到多种昆虫细胞中的重组杆状病毒表达载体。举例来说，已开发用于埃及伊蚊(ATCC第CCL-125号)、桑蚕(ATCC第CRL-8910号)、黑腹果蝇(ATCC第1963号)、草地贪夜蛾和粉纹夜蛾的重组杆状病毒。参见Wright,NATURE(1986)321:718；Carbonell等人,J.VIROL.(1985)56:153；Smith等人,MOL.CELL.BIOL.(1983)3:2156。通常参见Fraser等人,In Vitro CELL.Dev.BIOL(1989)25:225。更具体来说，用于杆状病毒表达载体系统的细胞系通常包括(但不限于)Sf9(草地贪夜蛾)(ATCC第CRL-1711号)、Sf21(草地贪夜蛾)(Invitrogen Corp.，目录号11497-013(Carlsbad,CA)、Tri-368(粉纹夜蛾)和High-FiveTM BTI-TN-5B1-4(粉纹夜蛾)。
用于杆状病毒/表达中的异源多肽的直接表达和融合表达的细胞和培养基可购得，且细胞培养技术通常为所属领域的一般技术人所知。
大肠杆菌、假单胞菌物种和其它原核生物：所属领域的一般技术人员已知细菌表达技术。多种载体可用于细菌宿主中。载体可为单拷贝或者低或高的多拷贝载体。载体可用于克隆和/或表达。鉴于关于载体的丰富文献、许多载体的商业可用性以及甚至描述载体和其限制酶图谱和特征的手册，无需在本文中广泛讨论。熟知载体通常涉及允许选择的标记，这些标记可提供细胞毒性剂抗性、原营养或免疫性。通常存在多个标记，其提供不同特征。
细菌启动子为能够结合细菌RNA聚合酶且起始编码序列(例如结构基因)下游(3″)转录成mRNA的任何DNA序列。启动子将具有通常与编码序列的5'端最接近放置的转录起始区。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可具有称作操纵基因的第二区域，其可与开始RNA合成的相邻RNA聚合酶结合位点重叠。操纵基因允许负调控(可诱导)转录，这是因为基因抑制蛋白可结合操纵基因且由此抑制特定基因的转录。在不存在负调控元件(诸如操纵基因)的情况下可发生组成性表达。另外，可通过基因活化蛋白结合序列实现正调控，当存在所述结合序列时，所述序列通常最接近RNA聚合酶结合序列的(5')。基因活化蛋白的实例为代谢物活化蛋白(CAP)，其有助于起始大肠杆菌(E.coli)中lac操纵子的转录[Raibaud等人,Annu.Rev.Genet.(1984)18:173]。因此，经调控的表达可为正调控或负调控，由此增强或减弱转录。
编码代谢途径酶的序列提供特别适用的启动子序列。实例包括源自糖代谢酶(诸如半乳糖、乳糖(lac)[Chang等人,Nature(1977)198:1056]和麦芽糖)的启动子序列。其它实例包括源自生物合成酶(诸如色氨酸(trp))的启动子序列[Goeddel等人,NUC.Acids Res.(1980)8:4057；Yelverton等人,Nucl.Acids Res.(1981)9:731；美国专利第4,738,921号；欧洲公开文献第036 776号和第121 775号，其各自以引用的方式并入本文中]。β-半乳糖苷酶(bla)启动子系统[Weissmann(1981)"The cloning ofinterferon and other mistakes."Interferon 3(I.Gresser编)]、噬菌体λPL[Shimatake等人,Nature(1981)292:128]和T5[美国专利第4,689,406号](所述文献各自以引用的方式并入本文中)启动子系统还提供适用的启动子序列。本发明的优选方法利用强启动子(诸如T7启动子)来诱导高含量的hPP或hA多肽。这些载体的实例为所属领域的一般技术人员所知且包括来自Novagen的pET29系列和WO99/05297(其以引用的方式并入本文中)中所述的pPOP载体。这些表达系统在宿主中产生高含量的hPP或hA或hFc多肽，而不损害宿主细胞生存能力或生长参数。pET19(Novagen)是所属领域中已知的另一种载体。
另外，在自然界中不存在的合成启动子也充当细菌启动子。举例来说，可将一个细菌或噬菌体启动子的转录活化序列与另一细菌或噬菌体启动子的操纵子序列连接，从而产生合成杂合启动子[美国专利第4,551,433号，其以引用的方式并入本文中]。举例来说，tac启动子是包含trp启动子与lac操纵子序列的杂合trp-lac启动子，其是由lac阻遏物调控[Amann等人,Gene(1983)25:167；de Boer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(1983)80:21]。此外，细菌启动子可包括非细菌来源的天然存在启动子，其具有与细菌RNA聚合酶结合且起始转录的能力。也可将非细菌来源的天然存在启动子与可相容的RNA聚合酶偶合以产生一些基因在原核生物中的高水平表达。噬菌体T7 RNA聚合酶/启动子系统为偶合启动子系统的实例[Studier等人,J.Mol.BIOL.(1986)189:113；Tabor等人,Proc Natl.Acad.Sci.(1985)82:1074]。另外，杂合启动子也可包含噬菌体启动子和大肠杆菌操纵基因区域(欧洲公开文献第267851号)。
除功能性启动子序列之外，有效核糖体结合位点也适用于在原核生物中表达外来基因。在大肠杆菌中，核糖体结合位点是称作Shine-Dalgarno(SD)序列且包括起始密码子(ATG)和位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的长度为3-9个核苷酸的序列[Shine等人,Nature(1975)254:34]。认为SD序列通过SD序列与大肠杆菌16S rRNA的3'端之间的碱基配对来促进mRNA与核糖体的结合[Steitz等人,"Genetic signals andnucleotide sequences in messenger RNA",Biological Regulation and Development:GeneExpression(Ed.R.F.Goldberger,1979)]。为表达具有弱核糖体结合位点的真核基因和原核基因[Sambrook等人,"Expression of cloned genes in Escherichia coli",MolecularCloning:A Laboratory Manual,1989]。
术语“细菌宿主”或“细菌宿主细胞”是指可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的接受体的细菌。所述术语包括已经转染的原始细菌宿主细胞的后代。应了解，由于偶发突变或故意突变，单一母体细胞的后代在形态上或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA方面可能未必完全相同。由这一定义所指代的后代中包括与将要以相关性质(诸如存在编码hPP或hA多肽的核苷酸序列)表征的母体充分类似的母体细胞的后代。
所属领域的一般技术人员已知适用于表达hPP或hA多肽的宿主细菌的选择。在选择供表达的细菌宿主时，合适宿主可包括显示具有良好包涵体形成能力、低蛋白水解活性和总体稳固性的那些宿主。细菌宿主通常可自多种来源获得，包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系细菌基因保藏中心(Berkeley,CA)以及美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(Manassas,VA)。工业/医药发酵通常使用源自K菌株的细菌(例如W3110)或源自B菌株的细菌(例如BL21)。这些菌株因其生长参数为人熟知且稳定而特别适用。另外，这些菌株为非病原性的，出于安全性和环境原因，其在商业上相当重要。合适的大肠杆菌宿主的其它实例包括(但不限于)菌株BL21、DH10B或其衍生物。在本发明方法的另一实施例中，大肠杆菌宿主为蛋白酶缺乏菌株，其包括(但不限于)OMP-和LON-。宿主细胞菌株可为假单胞菌属，包括(但不限于)荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌。已知指定为菌株MB101的荧光假单胞菌生物变种1适用于重组产生且可用于治疗蛋白产生方法中。假单胞菌属表达系统的实例包括可以宿主菌株形式自Dow Chemical Company(Midland,MI，在万维网的dow.com上获得)获得的系统。
在形成重组宿主细胞株(即，已将表达构筑体引入宿主细胞中且分离具有合适表达构筑体的宿主细胞)后，在适于产生hPP或hA或hFc多肽的条件下培养重组宿主细胞株。所属领域的技术人员将显而易见，培养重组宿主细胞株的方法将取决于所利用的表达构筑体的性质和宿主细胞的身份。通常使用所属领域的一般技术人员所知的方法来培养重组宿主菌株。重组宿主细胞通常是在含有可吸收的碳、氮和无机盐来源且视情况含有维生素、氨基酸、生长因子和所属领域的一般技术人员所知的其它蛋白质培养补充物的液体培养基中培养。用于培养宿主细胞的液体培养基可视情况含有抗生素或抗真菌剂以防止不合需要的微生物和/或化合物(包括(但不限于)用于选择含有表达载体的宿主细胞的抗生素)的生长。
重组宿主细胞可以分批或连续形式培养，其中细胞采集(在hPP或hA或hFc多肽在细胞内积聚的情况下)或培养物上清液的采集为分批或连续形式。对于原核宿主细胞中的制备来说，优选分批培养和细胞采集。
本发明的hPP或hA或hFc多肽通常是在重组系统中表达之后纯化。可通过所属领域已知的多种方法从宿主细胞或培养基中纯化hPP或hA或hFc多肽。细菌宿主细胞中所产生的许多hPP或hA或hFc多肽可具有弱溶解性或不可溶(呈包涵体形式)。在本发明的一个实施例中，利用本文中所公开的方法以及所属领域已知的方法，可容易地在hPP或hA或hFc多肽中进行为增加重组产生的蛋白质的溶解性而选择的氨基酸取代。在不溶性蛋白质的情况下，可通过离心从宿主细胞溶解产物收集蛋白质，且接着可进一步进行细胞的均质化。在具有弱溶解性的蛋白质的情况下，可加入包括(但不限于)聚乙烯亚胺(PEI)的化合物以诱导部分可溶性蛋白质的沉淀。然后，可通过离心便利地收集沉淀的蛋白质。可使用所属领域的一般技术人员所知的多种方法使重组宿主细胞破裂或均质化以自细胞内部释放包涵体。可使用熟知的技术来进行宿主细胞的破裂或均质化，这些技术包括(但不限于)酶促细胞破裂、超声波降解法、杜恩斯均质化(dounce homogenization)或高压释放破裂。在本发明方法的一个实施例中，使用高压释放技术来使大肠杆菌宿主细胞破裂以释放hPP或hA或hFc多肽的包涵体。在处理hPP或hA或hFc多肽的包涵体时，最好使重复过程的均质化时间减到最小以使包涵体产率增到最高且不会由于诸如溶解、机械剪切或蛋白质水解等因素造成损失。
然后，可使用所属领域已知的多种合适增溶剂中的任一种来溶解不溶性或沉淀的hPP或hA或hFc多肽。可用脲或盐酸胍来溶解hPP或hA或hFc多肽。应使溶解的hPP或hA或hFc多肽的体积减到最小，从而可使用可方便操作的批量大小来制备大批量。在重组宿主可以体积为数千升的批量生长的大规模商业装置中，这个因素可为重要的。另外，当在大规模商业装置中制造hPP或hA或hFc多肽时，特别是对于人类医药用途来说，如果可能的话，应避免可损害机器和容器的苛性化学品(harshchemicals)或其蛋白质产物。本发明的方法中已显示，可使用较温和的变性剂脲代替较苛刻的变性剂盐酸胍来溶解hPP或hA或hFc多肽包涵体。脲的使用在有效溶解hPP或hA或hFc多肽包涵体的同时显著降低对在hPP或hA或hFc多肽的制造和纯化过程中所利用的不锈钢设备造成损害的风险。
在可溶性hPP或hA或hFc蛋白的情况下，可将hPP或hA或hFc分泌到周质空间或培养基中。另外，可溶性hPP或hA或hFc可存在于宿主细胞的细胞质中。在进行纯化步骤之前，可能希望浓缩可溶性hPP或hA或hFc。可使用所属领域的一般技术人员所知的标准技术来浓缩例如来自细胞溶解产物或培养基的可溶性hPP或hA或hFc。另外，所属领域的一般技术人员所知的标准技术也可用于使宿主细胞破裂并从宿主细胞的细胞质或周质空间释放可溶性hPP或hA或hFc。
当制备呈融合蛋白形式的hPP或hA或hFc多肽时，可去除融合序列。可通过酶促裂解或化学裂解来实现融合序列的去除。可使用所属领域的一般技术人员已知的方法来实现融合序列的酶促去除。所属领域的一般技术人员将显而易见，用于去除融合序列的酶的选择将由融合体的身份决定，且反应条件将根据酶的选择来指定。可使用所属领域的一般技术人员所知的试剂(包括(但不限于)溴化氰、TEV蛋白酶和其它试剂)来实现化学裂解。可通过所属领域的一般技术人员所知的方法从裂解的融合序列中纯化裂解的hPP或hA或hFc多肽。所属领域的一般技术人员将显而易见，这些方法将由融合序列和hPP或hA或hFc多肽的身份和性质决定。用于纯化的方法可包括(但不限于)尺寸排阻色谱、疏水性相互作用色谱、离子交换色谱或透析或其任何组合。
也可纯化hPP或hA或hFc多肽以从蛋白质溶液中去除DNA。虽然可通过所属领域已知的任何合适方法(诸如沉淀或离子交换色谱)去除DNA，但也可通过用核酸沉淀剂(诸如(但不限于)硫酸鱼精蛋白)沉淀来去除DNA。可使用包括(但不限于)离心或过滤的熟知的标准方法使hPP或hA或hFc多肽与沉淀的DNA分离。在将使用hPP或hA或hFc多肽来治疗人类的情况中，宿主核酸分子的去除是重要因素，且本发明的方法将宿主细胞DNA降低到医药学上可接受的水平。
用于小规模或大规模发酵的方法也可用于蛋白质表达中，所述方法包括(但不限于)发酵罐、振荡烧瓶、流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养系统和搅拌槽生物反应器系统。这些方法中的每一种都可以分批、分批馈料或连续模式方法进行。
通常，可使用所属领域中的标准方法来回收本发明的人类hPP或hA或hFc多肽。举例来说，可将培养基或细胞溶解产物离心或过滤以去除细胞碎片。可将上清液浓缩或稀释到所需体积，或者透滤到合适缓冲剂中以调节制剂以供进一步纯化。本发明的hPP或hA或hFc多肽的进一步纯化包括从完整形式分离脱酰胺化和剪短形式的hPP或hA或hFc多肽变异体。
以下例示性程序中的任一种都可用于纯化本发明的hPP或hA多肽：亲和色谱；阴离子或阳离子交换色谱(使用(包括(但不限于)DEAE SEPHAROSE)；二氧化硅色谱；高效液相色谱(HPLC)；反相HPLC；凝胶过滤(使用(包括(但不限于))SEPHADEX G-75)；疏水性相互作用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合物色谱；超滤/透滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚焦；置换色谱；电泳程序(包括(但不限于)制备型等电聚焦)；差示溶解度(包括(但不限于)硫酸铵沉淀)；SDS-PAGE；或萃取。
根据所属领域的一般技术人员已知且使用的标准程序，可将本发明的蛋白质(包括(但不限于)包含非天然氨基酸的蛋白质、包含非天然氨基酸的肽、包含非天然氨基酸的蛋白质的抗体、包含非天然氨基酸的蛋白质的结合搭配物等)部分或实质上纯化成均质。因此，可通过所属领域的一般技术人员所知的许多方法中的任一种来回收和纯化本发明的多肽，这些方法包括(但不限于)硫酸铵或乙醇沉淀、酸或碱萃取、柱色谱、亲和柱色谱、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水性相互作用色谱、羟基磷灰石色谱、凝集素色谱、凝胶电泳等。在制备正确折叠的成熟蛋白质时，必要时可使用蛋白质再折叠步骤。当需要高纯度时，在最后纯化步骤中可使用高效液相色谱(HPLC)、亲和色谱或其它合适方法。在一个实施例中，使用针对非天然氨基酸(或包含非天然氨基酸的蛋白质或多肽)制成的抗体作为纯化试剂，从而包括(但不限于)用于包含一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白质或多肽的以亲和力为基础的纯化。必要时，在部分纯化或纯化成均质后，视情况将所述多肽用于多种应用，包括(但不限于)用作检定组分、治疗剂、预防剂、诊断剂、研究试剂和/或用作抗体产生的免疫原。
除了本文中所提到的其它参考文献外，所属领域的一般技术人员已知多种纯化/蛋白质折叠方法，包括(但不限于)以下文献中所述的那些：R.Scopes,Protein Purification,Springer-Verlag,N.Y.(1982)；Deutscher,Methods in Enzymology第182卷: Guide to Protein Purification.Academic Press,Inc.N.Y.(1990)；Sandana,(1997)Bioseparation of Proteins.Academic Press,Inc.；Bollag等人,(1996)Protein Methods,第2版,Wiley-Liss,NY；Walker,(1996)The Protein Protocols Handbook Humana Press,NJ,Harris和Angal,(1990)Protein Purification Applications:A Practical Approach IRL Pressat Oxford,Oxford,England；Harris和Angal,Protein Purification Methods:A Practical Approach IRL Press at Oxford,Oxford,England；Scopes,(1993)Protein Purification: Principles and Practice,第3版,Springer Verlag,NY；Janson和Ryden,(1998)Protein Purification:Principles.High Resolution Methods and Applications,第2版,Wiley-VCH,NY；和Walker(1998),Protein Protocols on CD-ROM Humana Press,NJ；以及其中所引用的参考文献。
在真核宿主细胞或非真核宿主细胞中产生具有非天然氨基酸的所关注的蛋白质或多肽的一个优势在于，所述蛋白质或多肽通常将以其天然构象经折叠。然而，在本发明的某些实施例中，所属领域的技术人员将认识到，在合成、表达和/或纯化之后，蛋白质或多肽可能具有与相关多肽所需的构象不同的构象。在本发明的一方面，视情况使所表达的蛋白质或多肽变性，且然后使其复性。这是利用所属领域中已知的方法来实现，所述方法包括(但不限于)将伴侣蛋白(chaperonin)添加到所关注的蛋白质或多肽中、将蛋白质溶解于诸如盐酸胍等离液剂中、利用蛋白质二硫化物异构酶等。
一般来说，有时希望使所表达的多肽变性和还原，且然后使多肽再折叠成优选构象。举例来说，可将胍、脲、DTT、DTE和/或伴侣蛋白添加到所关注的翻译产物中。所属领域的一般技术人员已知使蛋白质还原、变性和复性的方法(参见上述参考文献，以及Debinski等人,(1993)J.Biol.Chem.,268:14065-14070；Kreitman和Pastan(1993)Bioconjug.Chem.,4:581-585；以及Buchner等人,(1992)Anal.Biochem.,205:263-270)。举例来说，Debinski等人描述胍-DTE中包涵体蛋白质的变性和还原。可在含有(包括(但不限于))氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲剂中使蛋白质再折叠。可使再折叠试剂流动或以其它方式移动以与一种或一种以上多肽或其它表达产物接触，或者可使一种或一种以上多肽或其它表达产物流动或以其它方式移动以与再折叠试剂接触。
在原核产生hPP或hA或hFc多肽的情况下，由此产生的hPP或hA或hFc多肽可能错误折叠且因而缺乏生物活性或具有降低的生物活性。可通过“再折叠”来恢复蛋白质的生物活性。一般来说，通过使用例如一种或一种以上离液剂(例如脲和/或胍)和能够还原二硫键的还原剂(例如二硫苏糖醇、DTT或2-巯基乙醇(2-ME))溶解(其中hPP或hA或hFc多肽也不可溶)、展开和还原多肽链而使错误折叠的hPP或hA多肽再折叠。在中等浓度的离液剂下，接着加入氧化剂(例如，氧、胱氨酸或胱胺)，这允许再形成二硫键。可使用所属领域中已知的标准方法将hPP或hA或hFc多肽再折叠，诸如美国专利第4,511,502号、第4,511,503号和第4,512,922号中所述的那些方法，所述专利各自以引用的方式并入本文中。hPP或hA或hFc多肽也可与其它蛋白质共折叠以形成异二聚物或异多聚物。
在再折叠之后，可进一步纯化hPP或hA或hFc多肽。可使用所属领域的一般技术人员已知的多种技术来实现hPP或hA或hFc的纯化，所述技术包括疏水性相互作用色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、反相高效液相色谱、亲和色谱等或其任何组合。其它纯化还可包括干燥或沉淀所纯化的蛋白质的步骤。
在纯化后，可将hPP或hA或hFc交换到不同缓冲剂中和/或通过所属领域中已知的多种方法中的任一种使其浓缩，所述方法包括(但不限于)透滤和透析。作为单一经纯化蛋白质所提供的hPP或hA或hFc可经历聚集和沉淀。
经纯化的hPP或hA或hFc可为至少90％纯(如通过反相高效液相色谱RP-HPLC或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-PAGE所测量)或至少95％纯，或至少98％纯，或至少99％纯或更纯。无论hPP或hA或hFc的纯度的确切数值如何，hPP或hA或hFc对于用作医药产品或用于进一步处理(诸如与诸如PEG等水溶性聚合物结合)来说都足够纯。
可在不存在其它活性成分或蛋白质(除赋形剂、载剂和稳定剂、血清白蛋白等外)的情况下将某些hPP或hA或hFc分子用作治疗剂，或可使其与另一种蛋白质或聚合物复合。
一般纯化方法：可以任何合适次序对包含hPP或hA或hFc多肽的细胞溶解产物、提取物、培养基、包涵体、宿主细胞的周质空间、宿主细胞的细胞质或其它材料或者对由任何分离步骤产生的任何hPP或hA或hFc多肽混合物进行多种分离步骤中的任一种，所述分离步骤包括(但不限于)亲和色谱、离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、凝胶过滤色谱、高效液相色谱(“HPLC”)、反相HPLC(“RP-HPLC”)、膨胀床吸附或其任何组合和/或重复。
用于进行本文中所述的技术的设备和其它必要材料都可购得。泵、馏分收集器、监测器、记录器和整个系统可自例如Applied Biosystems(Foster City,CA)、Bio-RadLaboratories,Inc.(Hercules,CA)和Amersham Biosciences,Inc.(Piscataway,NJ)获得。包括(但不限于)交换基质材料、培养基和缓冲剂的色谱材料也可自这些公司获得。
可使用专用设备(诸如泵)更迅速地实现平衡和本文中所述的柱色谱过程中的其它步骤(诸如洗涤和洗提)。可购得的泵包括(但不限于)泵P-50、蠕动泵P-1、泵P-901和泵P-903(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。
馏分收集器的实例包括RediFrac馏分收集器、FRAC-100和FRAC-200馏分收集器以及馏分收集器(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。也可使用混合器来形成pH值和线性浓度梯度。可购得的混合器包括梯度混合器GM-1和管道混合器(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。
可使用任何可购得的监测器来监测色谱过程。这些监测器可用于收集如UV、pH值和传导率的信息。检测器的实例包括监测器UV-1、S II、监测器UV-MII、监测器UV-900、监测器UPC-900、监测器pH/C-900和传导率监测器(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。实际上，整个系统都可购得，包括来自AmershamBiosciences(Piscataway,NJ)的各种系统。
在本发明的一个实施例中，举例来说，可通过首先在脲中使所得经纯化的hPP或hA或hFc多肽变性，接着在合适pH值下在含有还原剂(诸如DTT)的TRIS缓冲剂中稀释来还原hPP或hA或hFc多肽且使其变性。在另一实施例中，使hPP或hA或hFc多肽以介于约2M到约9M之间的浓度范围在脲中变性，接着在约5.0到约8.0的范围内的pH值下在TRIS缓冲剂中稀释。然后，可培育此实施例的再折叠混合物。在一个实施例中，在室温下将再折叠混合物培育4小时到24小时。然后，可进一步分离或纯化经还原且变性的hPP或hA或hFc多肽混合物。
如本文中所述，在进行任何后续分离步骤之前，可调整第一hPP或hA或hFc多肽混合物的pH值。另外，可使用所属领域中已知的技术来浓缩第一hPP或hA或hFc多肽混合物或其任何后续混合物。此外，可使用所属领域的一般技术人员所知的技术将包含第一hPP或hA或hFc多肽混合物或其任何后续混合物的洗提缓冲剂交换成适用于下一分离步骤的缓冲剂。
离子交换色谱：在一个实施例中且作为可选的其它步骤，可对第一hPP或hA或hFc多肽混合物进行离子交换色谱。通常参见Ion EXCHANGE CHROMATOGRAPHY:PRINCIPLES AND METHODS(目录号18-1114-21,Amersham Biosciences(Piscataway,NJ))。可购得的离子交换柱包括和柱(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。这些柱利用强阴离子交换剂，诸如Q FastFlow、Q High Performance和Q XL；强阳离子交换剂，诸如SP High Performance、SP Fast Flow和SPXL；弱阴离子交换剂，诸如DEAEFast Flow；和弱阳离子交换剂，诸如CM Fast Flow(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。可在纯化过程的任何阶段对hPP或hA或hFc多肽进行阴离子或阳离子交换柱色谱以分离实质上经纯化的hPP或hA或hFc多肽。可使用任何合适的阳离子交换基质来进行阳离子交换色谱步骤。适用的阳离子交换基质包括(但不限于)纤维状、多孔、无孔、微粒、珠粒或交联阳离子交换基质材料。这些阳离子交换基质材料包括(但不限于)纤维素、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅、聚醚或任何上述材料的复合物。
阳离子交换基质可为任何合适的阳离子交换剂，包括强和弱阳离子交换剂。强阳离子交换剂在宽pH值范围内可能仍为电离的，且因此可能能够在宽pH值范围内结合hPP或hA或hFc。然而，弱阳离子交换剂可随pH值而丧失电离能力。举例来说，弱阳离子交换剂在pH值降低到约pH4或pH5以下时可能失去电荷。合适的强阳离子交换剂包括(但不限于)带电官能团，诸如磺丙基(sulfopropyl，SP)、磺酸甲酯基(methylsulfonate，S)或磺乙基(sulfoethyl，SE)。阳离子交换基质可为优选具有约2.5到约6.0的hPP或hA或hFc结合pH值范围的强阳离子交换剂。或者，所述强阳离子交换剂可具有约pH 2.5到约pH 5.5的hPP或hA或hFc结合pH值范围。阳离子交换基质可为具有约3.0的hPP或hA或hFc结合pH值的强阳离子交换剂。或者，阳离子交换基质可为优选具有约6.0到约8.0的hPP或hA或hFc结合pH值范围的强阳离子交换剂。阳离子交换基质可为优选具有约8.0到约12.5的hPP或hA或hFc结合pH值范围的强阳离子交换剂。或者，所述强阳离子交换剂可具有约pH 8.0到约pH 12.0的hPP或hA结合pH值范围。
在负荷hPP或hA或hFc之前，可例如使用多个柱体积的稀弱酸(例如4个柱体积的20mM乙酸，pH3)来平衡阳离子交换基质。平衡后可添加hPP或hA或hFc，且在洗提实质上经纯化的hPP或hA或hFc之前，也可使用诸如弱乙酸或磷酸溶液等弱酸溶液将柱洗涤一到数次。举例来说，可使用约2-4个柱体积的20mM乙酸(pH3)来洗涤所述柱。也可使用其它洗涤，所述洗涤例如使用2-4个柱体积的0.05M乙酸钠(pH5.5)或与0.1M氯化钠混合的0.05M乙酸钠(pH5.5)。或者，使用所属领域中已知的方法，可使用多个柱体积的稀弱碱来平衡阳离子交换基质。
或者，可通过使阳离子交换剂基质与具有足够低的pH值或离子强度以从基质中置换hPP或hA的缓冲剂接触来洗提实质上经纯化的hPP或hA或hFc。洗提缓冲剂的pH值可在约pH 2.5到约pH 6.0的范围内。更具体来说，洗提缓冲剂的pH值可在约pH 2.5到约pH 5.5、约pH 2.5到约pH 5.0的范围内。洗提缓冲剂可具有约3.0的pH值。另外，洗提缓冲剂的量可广泛变化且通常将在约2个柱体积到约10个柱体积的范围内。
在使hPP或hA或hFc多肽吸附到阳离子交换剂基质上之后，可通过使所述基质与具有足够高的pH值或离子强度以从基质中置换hPP或hA或hFc多肽的缓冲剂接触来洗提实质上经纯化的hPP或hA或hFc多肽。适用于实质上经纯化的hPP或hA或hFc多肽的高pH值洗提的缓冲剂可包括(但不限于)浓度在至少约5mM到至少约100mM范围内的柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、HEPES以及MES缓冲剂。
反相色谱：可根据所属领域的一般技术人员所知的合适方案来进行RP-HPLC，从而纯化蛋白质。例如参见Pearson等人,ANAL BIOCHEM.(1982)124:217-230(1982)；Rivier等人,J.Chrom.(1983)268:112-119；Kunitani等人,J.CHROM.(1986)359:391-402。可对hPP或hA多肽进行RP-HPLC以分离实质上经纯化的hPP或hA或hFc多肽。关于这一点，可使用含有具有多种长度(包括(但不限于)至少约C3到至少约C30、至少约C3到至少约C20或至少约C3到至少约C18)的烷基官能团的二氧化硅衍生的树脂。或者，可使用聚合树脂。举例来说，可使用TosoHaas AmberchromeCG1000sd树脂，其为苯乙烯聚合物树脂。也可使用具有多种烷基链长度的氰基或聚合树脂。此外，可用诸如乙醇等溶剂洗涤RP-HPLC柱。Source RP柱是RP-HPLC柱的另一个实例。
可使用含有离子配对剂和有机改性剂(诸如甲醇、异丙醇、四氢呋喃、乙腈或乙醇)的合适洗提缓冲剂从RP-HPLC柱洗提hPP或hA或hFc多肽。最常用的离子配对剂包括(但不限于)乙酸、甲酸、高氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、四甲基铵、四丁基铵和乙酸三乙铵。可使用一种或一种以上梯度或等度条件来进行洗提，其中优选减少分离时间且降低峰宽度的梯度条件。另一种方法涉及使用两种具有不同溶剂浓度范围的梯度。适用于本文中的洗提缓冲剂的实例可包括(但不限于)乙酸铵和乙腈溶液。
疏水性相互作用色谱纯化技术：可对hPP或hA多肽进行疏水性相互作用色谱(HIC)。通常参见HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK:PRINCIPLES AND Methods(目录号18-1020-90,Amersham Biosciences(Piscataway,NJ))，其以引用的方式并入本文中。合适的HIC基质可包括(但不限于)经烷基或芳基取代的基质，诸如经丁基、己基、辛基或苯基取代的基质，包括琼脂糖、交联琼脂糖、琼脂糖凝胶(sepharose)、纤维素、二氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸酯)基质和混合模式树脂(包括(但不限于)聚乙二胺树脂或经丁基或苯基取代的聚(甲基丙烯酸酯)基质)。疏水性相互作用柱色谱的可购得的来源包括(但不限于)和柱(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。
简单地说，在装载之前，可使用所属领域的一般技术人员已知的标准缓冲剂(诸如乙酸/氯化钠溶液或含有硫酸铵的HEPES)来平衡HIC柱。可将硫酸铵用作装载HIC柱的缓冲剂。在装载hPP或hA或hFc多肽后，然后可使用标准缓冲剂和条件来洗涤所述柱以去除不合需要的材料，但将hPP或hA或hFc多肽保留在HIC柱上。可用约3到约10个柱体积的标准缓冲剂(诸如含有EDTA和浓度低于平衡缓冲剂的硫酸铵的HEPES缓冲剂，或乙酸/氯化钠缓冲剂)来洗提hPP或hA或hFc多肽。也可使用例如使用磷酸钾梯度的不断降低的线性盐梯度来洗提hPP或hA或hFc分子。然后，可例如通过过滤(诸如透滤或超滤)来浓缩洗提液。可利用透滤来去除用于洗提hPP或hA或hFc多肽的盐。
其它纯化技术：可对第一hPP或hA或hFc多肽混合物或其任何后续混合物进行使用例如凝胶过滤(Gel FILTRATION:PRINCIPLES AND Methods(目录号18-1022-18,Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)，其以引用的方式并入本文中)、羟基磷灰石色谱(合适基质包括(但不限于)HA-Ultrogel、High Resolution(Calbiochem)、CHT陶瓷羟基磷灰石(BioRad)、Bio-Gel HTP-羟基磷灰石(BioRad))、HPLC、膨胀床吸附、超滤、透滤、冻干等的另一分离步骤，以去除任何过量盐且用合适缓冲剂来代替所述缓冲剂以用于下一分离步骤或甚至最终药物产品的调配。
hPP或hA或hFc分子中所存在的非天然编码氨基酸也可用于提供与其它不含非天然编码氨基酸的细胞蛋白质的分离。因为非天然编码氨基酸可包含独特的化学官能团，所以所述独特的官能团与另一分子的偶合可提供实质纯化步骤。举例来说，可使非天然编码氨基酸与另一有利于与其它蛋白质分离的分子偶合。这些用于与非天然氨基酸偶合的分子包括(但不限于)PEG和其它聚合物、珠粒以及其它固体底物。
在本文中所述的各步骤中，可使用所属领域的一般技术人员所知的技术来监测hPP或hA或hFc多肽(包括实质上经纯化的hPP或hA或hFc多肽)的产率。也可使用这些技术在最后分离步骤后分析实质上经纯化的hPP或hA或hFc多肽的产率。举例来说，可使用具有多种烷基链长度的若干反相高压液相色谱柱(诸如氰基RP-HPLC、C18RP-HPLC)以及阳离子交换HPLC和凝胶过滤HPLC中的任一种来监测hPP或hA或hFc多肽的产率。
在本发明的特定实施例中，在各纯化步骤后hPP或hA或hFc的产率可为用于各纯化步骤的原材料中的hPP或hA或hFc的至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.9％或至少约99.99％。
可使用诸如SDS-PAGE等标准技术或通过使用Western印迹法和ELISA检定测量hPP或hA或hFc多肽来测定纯度。举例来说，可针对从阴性对照酵母发酵和阳离子交换回收分离的蛋白质来产生多克隆抗体。所述抗体也可用于探测污染性宿主细胞蛋白质的存在。
RP-HPLC材料Vydac C4(Vydac)是由硅胶粒子组成，其表面带有C4-烷基链。hPP或hA或hFc多肽与蛋白质杂质的分离是基于疏水性相互作用强度的差异。用稀三氟乙酸中的乙腈梯度来进行洗提。使用不锈钢柱(填充有2.8到3.2升Vydac C4硅胶)进行制备型HPLC。通过加入三氟乙酸来酸化羟基磷灰石Ultrogel洗提液且将其装载于Vydac C4柱上。为进行洗涤和洗提，使用稀三氟乙酸中的乙腈梯度。收集各洗提份且立即用磷酸盐缓冲剂中和。汇集在IPC限度内的hPP或hA或hFc多肽洗提份。
DEAE琼脂糖凝胶(Pharmacia)材料是由与琼脂糖凝胶珠粒的表面共价结合的二乙基氨基乙基(DEAE)基团组成。通过离子相互作用来介导hPP或hA或hFc多肽与DEAE基团的结合。乙腈和三氟乙酸无滞留地通过柱。在洗掉这些物质之后，通过用低pH值的乙酸盐缓冲剂洗涤柱来去除痕量杂质。然后，用中性磷酸盐缓冲剂洗涤柱且用具有增加的离子强度的缓冲剂洗提hPP或hA或hFc多肽。用快流速DEAE琼脂糖凝胶(DEAE Sepharose fast flow)填充所述柱。调整柱体积以确保hPP或hA多肽装载量在每毫升凝胶3-10毫克hPP或hA或hFc多肽的范围内。用水和平衡缓冲剂(磷酸钠/钾)洗涤所述柱。装载HPLC洗提液的汇集的洗提份且用平衡缓冲剂洗涤柱。然后，用洗涤缓冲剂(乙酸钠缓冲剂)洗涤柱，接着用平衡缓冲剂洗涤。接着，利用洗提缓冲剂(氯化钠、磷酸钠/钾)从柱洗提hPP或hA或hFc多肽且根据主要洗提曲线将其收集到单一洗提份中。将DEAE琼脂糖凝胶柱的洗提液调整到指定传导率。将所得药物无菌过滤到铁氟隆(Teflon)瓶中且在-70℃下储存。
可使用的其它方法包括(但不限于)去除内毒素的步骤。内毒素为位于革兰氏阴性宿主细胞(诸如，大肠杆菌)的外膜上的脂多糖(LPS)。用于降低内毒素含量的方法为所属领域的一般技术人员所知且包括(但不限于)使用二氧化硅支撑物、玻璃粉或羟基磷灰石的纯化技术；反相色谱、亲和色谱、尺寸排阻色谱、阴离子交换色谱；疏水性相互作用色谱；这些方法的组合等。可能需要修改或其它方法以从所关注的多肽中去除污染物(诸如共迁移蛋白质)。用于测量内毒素含量的方法已为所属领域的一般技术人员所知且包括(但不限于)鲎变形细胞溶解产物(Limulus Amebocyte Lysate，LAL)检定。EndosafeTM-PTS检定为利用预负荷有LAL试剂、发色底物和对照标准内毒素以及手持式分光光度计的柱体的比色单管系统。替代方法包括(但不限于)动力学LAL方法，其为比浊法且使用96孔格式。
可使用多种方法和程序来分析包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的hPP或hA蛋白质的产率和纯度，所述方法包括(但不限于)Bradford检定、SDS-PAGE、银染色SDS-PAGE、考马斯蓝染色SDS-PAGE、质谱(包括(但不限于)MALDI-TOF)和所属领域的一般技术人员已知的其它表征蛋白质的方法。
其它方法包括(但不限于)与蛋白质染色方法联合的SDS-PAGE、免疫印迹、基质辅助激光解吸附/离子化质谱(MALDI-MS)、液相色谱/质谱、等电聚焦、分析型阴离子交换、色谱聚焦和圆二色谱。
VIII.替代系统中的表达
已使用多种策略将非天然氨基酸引入非重组宿主细胞、诱变宿主细胞或无细胞系统中的蛋白质中。这些系统也适用于制备本发明的hPP或hA或hFc多肽。诸如Lys、Cys和Tyr等具有反应性侧链的氨基酸的衍生会使得赖氨酸转化为N2-乙酰基-赖氨酸。化学合成也提供并入非天然氨基酸的直接方法。利用肽片段的酶促连接和天然化学连接的新近发展，有可能制造较大蛋白质。例如参见P.E.Dawson和S.B.H.Kent,Annu. Rev.Biochem.,69:923(2000)。化学肽连接和天然化学连接是描述于美国专利第6,184,344号、美国专利公开文献第2004/0138412号、美国专利公开文献第2003/0208046号、WO 02/098902和WO 03/042235中，所述专利以引用的方式并入本文中。已使用将利用所需非天然氨基酸以化学方式酰化的抑制因子tRNA添加到能够支持蛋白质生物合成的活体外提取物中的通用活体外生物合成方法将超过100个非天然氨基酸位点特异性地并入几乎任何尺寸的多种蛋白质中。例如参见V.W.Cornish,D.Mendel和P.G.Schultz,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995,34:621(1995)；C.J.Noren,S.J.Anthony-Cahill,M.C.Griffith,P.G.Schultz,A general method for site-specific incorporation of unnaturalamino acids into proteins,Science 244:182-188(1989)；和J.D.Bain,C.G.Glabe,T.A.Dix,A.R.Chamberlin,E.S.Diala,Biosynthetic site-specific incorporation of a non-naturalamino acid into a polypeptide,J.Am.Chem.Soc.111:8013-8014(1989)。已经将多种官能团引入蛋白质中以供研究蛋白质稳定性、蛋白质折叠、酶机理和信号转导。
已提出称作选择性压力并入的活体内方法以利用野生型合成酶的杂乱性。例如参见N.Budisa,C.Minks,S.Alefelder,W.Wenger,F.M.Dong,L.Moroder和R.Huber,FASEB J.,13:41(1999)。使向细胞供应特定天然氨基酸的相关代谢路径关闭的营养缺陷型菌株在含有有限浓度的天然氨基酸的基本培养基中生长，而靶基因的转录受到阻遏。在稳定生长期开始时，天然氨基酸被耗尽且由非天然氨基酸类似物置换。对重组蛋白质的表达的诱导使得含有非天然类似物的蛋白质积聚。举例来说，已使用这种策略将邻氟苯丙氨酸、间氟苯丙氨酸和对氟苯丙氨酸并入蛋白质中，且其在UV光谱中显示两个易于鉴别的特征性肩峰，例如参见C.Minks,R.Huber,L.Moroder和N.Budisa,Anal.Biochem.,284:29(2000)；已使用三氟蛋氨酸来代替噬菌体T4溶菌酶中的蛋氨酸，从而通过19F NMR来研究其与壳寡糖配位体的相互作用，例如参见H.Duewel,E.Daub,V.Robinson和J.F.Honek,Biochemistry,36:3404(1997)；且已并入三氟亮氨酸来代替亮氨酸，从而使亮氨酸拉链蛋白的热稳定性和化学稳定性增加。例如参见Y.Tang,G.Ghirlanda,W.A.Petka,T.Nakajima,W.F.DeGrado和D.A.Tirrell,Angew.Chem.Int.Ed. Engl.,40:1494(2001)。此外，将硒代蛋氨酸和碲代蛋氨酸并入各种重组蛋白质中以促进X射线结晶学中的相溶解。例如参见W.A.Hendrickson,J.R.Horton和D.M.Lemaster,EMBO J.,9:1665(1990)；J.O.Boles,K.Lewinski,M.Kunkle,J.D.Odom,B.Dunlap,L.Lebioda和M.Hatada,Nat.Struct.Biol..1:283(1994)；N.Budisa,B.Steipe,P.Demange,C.Eckerskorn,J.Kellermann和R.Huber,Eur.J.Biochem..230:788(1995)；和N.Budisa,W.Karnbrock,S.Steinbacher,A.Humm,L.Prade,T.Neuefeind,L.Moroder和R.Huber,J.Mol.Biol..270:616(1997)。也已有效地并入具有烯或炔官能团的蛋氨酸类似物，从而允许通过化学方式对蛋白质进行其它修饰。例如参见J.C.M.van Hest和D.A.Tirrell,FEBS Lett.,428:68(1998)；J.C.M.van Hest,K.L.Kiick和D.A.Tirrell,J. Am.Chem.Soc.122:1282(2000)；以及K.L.Kiick和D.A.Tirrell,Tetrahedron,56:9487(2000)；美国专利第6,586,207号；美国专利公开文献第2002/0042097号，其以引用的方式并入本文中。
这种方法的成功是取决于氨酰基tRNA合成酶对非天然氨基酸类似物的识别，所述合成酶通常需要高选择性以确保蛋白质翻译的保真度。一种扩展这种方法的范围的方式是放宽氨酰基tRNA合成酶的底物特异性，这已在有限数目的情况下实现。举例来说，在大肠杆菌苯丙氨酰基tRNA合成酶(PheRS)中用Gly置换Ala294可增加底物结合口袋的尺寸，且导致对氯苯丙氨酸(p-Cl-Phe)使tRNAPhe酰化。参见M.Ibba,P.Kast和H.Hennecke,Biochemistry,33:7107(1994)。带有这种突变PheRS的大肠杆菌菌株允许并入对氯苯丙氨酸或对溴苯丙氨酸来代替苯丙氨酸。例如参见M.Ibba和H.Hennecke,FEBS Lett..364:272(1995)；以及N.Sharma,R.Furter,P.Kast和D.A.Tirrell,FEBS Lett.,467:37(2000)。类似地，显示接近大肠杆菌酪氨酰基tRNA合成酶的氨基酸结合位点的点突变Phe130Ser允许比酪氨酸有效地并入重氮酪氨酸。参见F.Hamano-Takaku,T.Iwama,S.Saito-Yano,K.Takaku,Y.Monden,M.Kitabatake,D.Soll和S.Nishimura,J.Biol.Chem.,275:40324(2000)。
在活体内将非天然氨基酸并入蛋白质中的另一种策略为修饰具有校对机制的合成酶。这些合成酶无法区分在结构上与同源天然氨基酸类似的氨基酸且因此使其活化。这一错误在单独位点上得到校正，这使来自tRNA的错配氨基酸去酰化以保持蛋白质翻译的保真度。如果合成酶失去校对活性，那么错误活化的结构类似物可避开编辑功能且被并入。近来已用缬氨酰基tRNA合成酶(ValRS)证实这种方法。参见V.Doring,H.D.Mootz,L.A.Nangle,T.L.Hendrickson,V.de Crecy-Lagard,P.Schimmel和P.Marliere,Science,292:501(2001)。ValRS可利用Cys、Thr或氨基丁酸(Abu)使tRNAVal错误氨酰化；随后，通过编辑域来水解这些非同源氨基酸。在使大肠杆菌染色体随机诱变之后，选择在ValRS的编辑位点中具有突变的突变大肠杆菌菌株。这种编辑缺陷型ValRS错误地使tRNAVal装有Cys。由于Abu与Cys在空间上类似(Cys的-SH基团在Abu中经-CH3置换)，因此当使这种突变大肠杆菌菌株在存在Abu的情况下生长时，突变ValRS也将Abu并入蛋白质中。质谱分析显示在天然蛋白质的各缬氨酸位置处约24％的缬氨酸经Abu置换。
固相合成和半合成方法也已允许合成含有新颖氨基酸的多种蛋白质。举例来说，参见以下公开文献和其中所引用的如下参考文献：Crick,F.H.C.,Barrett,L.Brenner,S.Watts-Tobin,R.General nature of the genetic code for proteins.Nature,192:1227-1232(1961)；Hofmann,K.,Bohn,H.Studies on polypeptides.XXXVI.The effect ofpyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptidefragment,J.Am Chem,88(24):5914-5919(1966)；Kaiser,E.T.Synthetic approaches tobiologically active peptides and proteins including enyzmes,Acc Chem Res,22:47-54(1989)；Nakatsuka,T.,Sasaki,T.,Kaiser,E.T.Peptide segment coupling catalyzed by thesemisynthetic enzyme thiosubtilisin,J Am Chem Soc.109:3808-3810(1987)；Schnolzer,M.,Kent,S B H.Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides:backbone-engineered HIV protease,Science,256(5054):221-225(1992)；Chaiken,I.M.Semisynthetic peptides and proteins,CRC Crit Rev Biochem.11(3):255-301(1981)；Offord,R.E.Protein engineering by chemical means？Protein Eng.,1(3):151-157(1987)；以及Jackson,D.Y.,Burnier,J.,Quan,C,Stanley,M.,Tom,J.,Wells,J.A.A Designed PeptideLigase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues,Science,266(5183):243(1994)。
已使用化学修饰在活体外将包括辅因子、自旋标记和寡核苷酸的多种非天然侧链引入蛋白质中。例如参见，Corey,D.R.,Schultz,P.G.Generation of a hybridsequence-specific single-stranded deoxyribonuclease,Science,238(4832):1401-1403(1987)；Kaiser,E.T.,Lawrence D.S.,Rokita,S.E.The chemical modification of enzymaticspecificity,Annu Rev Biochem,54:565-595(1985)；Kaiser,E.T.,Lawrence,D.S.Chemicalmutation of enyzme active sites,Science,226(4674):505-511(1984)；Neet,K.E.,Nanci A,Koshland,D.E.Properties of thiol-subtilisin,J Biol.Chem.243(24):6392-6401(1968)；Polgar,L.和M.L.Bender.A new enzyme containing a synthetically formed active site.Thiol-subtilisin.J.Am Chem Soc,88:3153-3154(1966)；以及Pollack,S.J.,Nakayama,G.Schultz,P.G.Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibodycombining sites,Science,242(4881):1038-1040(1988)。
或者，使用以化学方式修饰的氨酰基tRNA的生物合成方法已用于将多种生物物理探针并入在活体外合成的蛋白质中。参见以下公开文献和其中所引用的参考文献：Brunner,J.New Photolabeling and crosslinking methods,Annu.Rev Biochem,62:483-514(1993)；和Krieg,U.C.,Walter,P.,Hohnson,A.E.Photocrosslinking of the signal sequenceof nascent preprolactin of the54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle,Proc.Natl.Acad.Sci,83(22):8604-8608(1986)。
先前已证实，通过将以化学方式氨酰化的抑制因子tRNA添加到利用含有所需琥珀无义突变的基因编程的蛋白质合成反应中，可在活体外将非天然氨基酸位点特异性地并入蛋白质中。使用这些方法，可使用特定氨基酸的营养缺陷型菌株，用密切结构同源物来取代20种常见氨基酸中的多种氨基酸，例如，用氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸。例如参见Noren,C.J.,Anthony-Cahill,Griffith,M.C.,Schultz,P.G.A general method forsite-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins,Science,244:182-188(1989)；M.W.Nowak等人,Science 268:439-42(1995)；Bain,J.D.,Glabe,C.G.,Dix,T.A.,Chamberlin,A.R.,Diala,E.S.Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-naturalamino acid into a polypeptide,J.Am Chem Soc,111:8013-8014(1989)；N.Budisa等人,FASEB J.13:41-51(1999)；Ellman,J.A.,Mendel,D.,Anthony-Cahill,S.,Noren,C.J.,Schultz,P.G.Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specificallyinto proteins.Methods in Enz.,第202卷,301-336(1992)；和Mendel,D.,Cornish,V.W.&Schultz,P.G.Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code,Annu Rev Biophys.Biomol Struct.24,435-62(1995)。
举例来说，制备识别终止密码子UAG的抑制因子tRNA且用非天然氨基酸以化学方式使其氨酰化。使用常规定点诱变在蛋白质基因中的所关注位点处引入终止密码子TAG。例如参见Sayers,J.R.,Schmidt,W.Eckstein,F.5'-3'Exonucleases inphosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis,Nucleic Acids Res,16(3):791-802(1988)。当将酰化抑制因子tRNA和突变基因组合到活体外转录/翻译系统中时，响应UAG密码子而并入非天然氨基酸，这得到在指定位置处含有所述氨基酸的蛋白质。使用[3H]-Phe的实验和使用α-羟基酸的实验证实，在UAG密码子指定的位置处仅并入所需氨基酸且未在蛋白质中的任何其它位点处并入此氨基酸。例如参见，Noren等人,同上文；Kobayashi等人,(2003)Nature Structural Biology10(6):425-432；和Ellman,J.A.,Mendel,D.,Schultz,P.G.Site-specific incorporation of novel backbonestructures into proteins,Science,255(5041):197-200(1992)。
可通过任何方法或技术(包括(但不限于)化学或酶促氨酰化)利用所需氨基酸使tRNA氨酰化。
可通过氨酰基tRNA合成酶或其它酶分子(包括(但不限于)核糖酶)来实现氨酰化。术语“核糖酶”可与“催化性RNA”互换。Cech和同事(Cech,1987,Science.236:1532-1539；McCorkle等人,1987,Concepts Biochem.64:221-226)证实存在可充当催化剂的天然存在的RNA(核糖酶)。然而，尽管仅证实这些天然RNA催化剂对核糖核酸底物具有裂解和剪接作用，但核糖酶人工开发的近期发展已将催化谱系扩大到各种化学反应。研究已鉴别出可催化自身(2')3'末端的氨酰基RNA键的RNA分子(Illangakekare等人,1995 Science 267:643-647)，以及可将氨基酸从一个RNA分子转移到另一个的RNA分子(Lohse等人,1996,Nature 381:442-444)。
美国专利申请公开文献2003/0228593(其以引用的方式并入本文中)描述构筑核糖体的方法和其在利用天然编码和非天然编码氨基酸使tRNA氨酰化中的用途。可使tRNA氨酰化的酶分子(包括(但不限于)核糖酶)的底物固定形式使得能够有效地亲和纯化氨酰化产物。适当底物的实例包括琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁珠。用于氨酰化的底物固定形式的核糖酶的制备和用途是描述于Chemistry and Biology 2003,10:1077-1084和美国专利申请公开文献2003/0228593中，其以引用的方式并入本文中。
化学氨酰化方法包括(但不限于)避免在氨酰化过程中使用合成酶的由Hecht和同事(Hecht,S.M.Acc.Chem.Res.1992,25,545；Heckler,T.G.；Roesser,J.R.；Xu,C；Chang,P.；Hecht,S.M.Biochemistry 1988,27,7254；Hecht,S.M.；Alford,B.L.；Kuroda,Y.；Kitano,S.J.Biol.Chem.1978,253,4517)以及Schultz,Chamberlin,Dougherty等人(Cornish,V.W.；Mendel,D.；Schultz,P.G.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995,34,621；Robertson,S.A.；Ellman,J.A.；Schultz,P.G.J.Am.Chem.Soc.1991,113,2722；Noren,C.J.；Anthony-Cahill,S.J.；Griffith,M.C.；Schultz,P.G.Science 1989,244,182；Bain,J.D.；Glabe,C.G.；Dix,T.A.；Chamberlin,A.R.J.Am.Chem.Soc.1989,111,8013；Bain,J.D.等人,Nature 1992,356,537；Gallivan,J.P.；Lester,H.A.；Dougherty,D.A:Chem.Biol.1997,4,740；Turcatti等人,J.Biol.Chem.1996,271,19991；Nowak,M.W.等人,Science,1995,268,439；Saks,M.E.等人,J.Biol.Chem.19.96,271,23169；Hohsaka,T.等人,J. Am.Chem.Soc.1999,121,34)介绍的方法。所述方法或其它化学氨酰化方法都可用于使tRNA分子氨酰化。
产生催化性RNA的方法可涉及产生单独的随机核糖酶序列池；对所述池进行定向演化；针对所需氨酰化活性筛选所述池；和选择展现所需氨酰化活性的核糖酶序列。
核糖酶可包含促进酰化活性的基元和/或区域，诸如GGU基元和富集U的区域。举例来说，已报导富集U的区域可促进氨基酸底物的识别，且GGU基元可与tRNA的3'末端形成碱基对。GGU基元与富集U的区域的组合促进同时识别氨基酸与tRNA，且因此促进tRNA的3'末端的氨酰化。
可通过使用与tRNAAsnCCCG结合的部分随机化r24mini进行活体外选择，随后系统工程化活性克隆中所见的一致序列来产生核糖酶。通过此方法获得的例示性核糖酶是称为“Fx3核糖酶”并且描述于美国公开申请文件第2003/0228593号中，所述申请文件的内容以引用的方式并入本文中，所述核糖酶充当合成装载有同源非天然氨基酸的各种氨酰基tRNA的通用催化剂。
在底物上固定可用于促成氨酰化tRNA的有效亲和纯化。适当底物的实例包括(但不限于)琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁珠。可通过利用RNA的化学结构将核糖酶固定在树脂上，举例来说，可用高碘酸盐氧化RNA核糖上的3'-顺-二醇以得到相应的二醛，从而促进RNA在树脂上的固定。可使用各种类型的树脂，包括廉价的酰肼树脂，其中还原胺化使得树脂与核糖酶之间相互作用形成不可逆键联。可通过此项柱上氨酰化技术来显著促进氨酰基tRNA的合成。Kourouklis等人,Methods 2005；36:239-4中描述一种基于柱的氨酰化系统。
氨酰化tRNA的分离可以多种方式实现。一种适当的方法是利用缓冲剂(诸如含有10mM EDTA的乙酸钠溶液；含有50mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(3-丙烷磺酸)、12.5mM KCl(pH7.0)、10mM EDTA的缓冲剂；或者简单地，EDTA缓冲的水(pH7.0))从柱中洗提氨酰化tRNA。
可将氨酰化tRNA添加到翻译反应中以便将使tRNA氨酰化的氨基酸并入翻译反应所产生的多肽中的所选位置中。可使用本发明的氨酰化tRNA的翻译系统的实例包括(但不限于)细胞溶解产物。细胞溶解产物提供由输入mRNA活体外翻译多肽所需的反应组件。所述反应组件的实例包括(但不限于)核糖体蛋白、rRNA、氨基酸、tRNA、GTP、ATP、翻译起始因子和延长因子以及其它与翻译有关的因子。此外，翻译系统可为批量翻译或分隔翻译(compartmentalized translation)。批量翻译系统将反应组件组合到单一隔室中，而分隔翻译系统使翻译反应组件与可抑制翻译效率的反应产物分离。这些翻译系统可购得。
此外，可使用偶联式转录/翻译系统。偶联式转录/翻译系统允许将输入DNA转录成相应的mRNA，而所述mRNA又经反应组件翻译。市售偶联式转录/翻译的实例为Rapid Translation System(RTS,Roche Inc.)。所述系统包括含有大肠杆菌溶解产物的混合物以提供诸如核糖体和翻译因子等翻译组件。此外，还包括RNA聚合酶以将输入DNA转录成mRNA模板以用于翻译。RTS可经由插入反应隔室(包括供应/废料隔室和转录/翻译隔室)之间的膜来分隔反应组件。
可通过包括(但不限于)转移酶、聚合酶、催化性抗体、多功能蛋白等的其它试剂进行tRNA的氨酰化。
Stephan在Scientist,2005年10月10日第30-33页中描述将非天然编码氨基酸并入蛋白质中的其它方法。Lu等人在Mol Cell.2001年10月；8(4):759-69中描述一种以化学方式将蛋白质结合到含有非天然氨基酸的合成肽的方法(经表达的蛋白质连接)。
也已使用微注射技术将非天然氨基酸并入蛋白质中。例如参见M.W.Nowak,P.C.Kearney,J.R.Sampson,M.E.Saks,C.G.Labarca,S.K.Silverman,W.G.Zhong,J.Thorson,J.N.Abelson,N.Davidson,P.G.Schultz,D.A.Dougherty和H.A.Lester,Science,268:439(1995)；以及D.A.Dougherty,Curr.Opin.Chem.Biol.,4:645(2000)。将爪蟾卵母细胞(Xenopus oocyte)与活体外产生的以下两种RNA物质共注射：在所关注的氨基酸位置处具有UAG终止密码子的编码标靶蛋白的mRNA，和经所需非天然氨基酸氨酰化的琥珀抑制因子tRNA。随后，卵母细胞的翻译机构将非天然氨基酸插入由UAG所指定的位置处。这种方法已允许整合膜蛋白的活体内结构-功能研究，所述研究通常不适用于活体外表达系统。实例包括将荧光氨基酸并入速激肽神经激肽-2受体中以通过荧光共振能量转移来测量距离，例如参见G.Turcatti,K.Nemeth,M.D.Edgerton,U.Meseth,F.Talabot,M.Peitsch,J.Knowles,H.Vogel和A.Chollet,J.Biol. Chem.,271:19991(1996)；并入生物素化氨基酸以鉴别离子通道中表面暴露的残基，例如参见J.P.Gallivan,H.A.Lester和D.A.Dougherty,Chem.Biol.,4:739(1997)；使用笼化的酪氨酸类似物以实时监测离子通道中的构象变化，例如参见J.C.Miller,S.K.Silverman,P.M.England,D.A.Dougherty和H.A.Lester,Neuron,20:619(1998)；以及使用α羟基氨基酸以改变用于探查其门控机制的离子通道主链。例如参见P.M.England,Y.Zhang,D.A.Dougherty和H.A.Lester,Cell,96:89(1999)；以及T.Lu,A.Y.Ting,J.Mainland,L.Y.Jan,P.G.Schultz和J.Yang,Nat.Neurosci.,4:239(2001)。
在活体内直接将非天然氨基酸并入蛋白质中的能力提供多种优势，包括(但不限于)突变蛋白的高产率、技术简易性、在细胞中或可能在活生物体中研究突变蛋白的可能性以及这些突变蛋白在治疗性治疗和诊断使用中的用途。将具有各种尺寸、酸度、亲核性、疏水性和其它性质的非天然氨基酸包括在蛋白质中的能力可极大地扩展理性且系统地操纵蛋白质结构的能力，从而探查蛋白质功能并且产生具有新颖性质的新蛋白质或生物体。
在位点特异性并入para-F-Phe的一次尝试中，将酵母琥珀抑制因子tRNAPheCUA/苯丙氨酰基tRNA合成酶对用于p-F-Phe抗性、Phe营养缺陷型大肠杆菌菌株中。例如参见R.Furter,Protein Sci.,7:419(1998)。
使用无细胞(活体外)翻译系统获得本发明的hPP或hA或hFc多核苷酸的表达也是可能的。翻译系统可为细胞或无细胞翻译系统，并且可为原核或真核翻译系统。细胞翻译系统包括(但不限于)全细胞制剂，诸如可将所需核酸序列转录成mRNA并且翻译所述mRNA的渗透细胞或细胞培养物。无细胞翻译系统可购得，并且众所周知多种不同的类型和系统。无细胞系统的实例包括(但不限于)原核细胞溶解产物，诸如大肠杆菌溶解产物；和真核细胞溶解产物，诸如麦胚提取物、昆虫细胞溶解产物、兔网织红细胞溶解产物、兔卵母细胞溶解产物和人类细胞溶解产物。当所得蛋白质经糖基化、磷酸化或以其它方式经修饰时，由于许多这种修饰只可能在真核系统中发生，所以真核细胞提取物或溶解产物可为优选的。这些提取物和溶解产物中有一些可购得(Promega；Madison,Wis.；Stratagene；La Jolla,Calif.；Amersham；Arlington Heights,Ill.；GIBCO/BRL；Grand Island,N.Y.)。膜提取物(诸如含有微粒体膜的犬胰腺提取物)也可用，其可用于翻译分泌蛋白质。在可包括mRNA作为模板(活体外翻译)或包括DNA作为模板(组合式活体外转录与翻译)的这些系统中，由核糖体指导活体外合成。已进行相当多的尝试来研发无细胞蛋白质表达系统。例如参见，Kim,D.M.和J.R.Swartz,Biotechnology and Bioengineering,74:309-316(2001)；Kim,D.M.和J.R.Swartz,Biotechnology Letters,22,1537-1542,(2000)；Kim,D.M.和J.R.Swartz,BiotechnologyProgress,16,385-390,(2000)；Kim,D.M.和J.R.Swartz,Biotechnology andBioengineering,66,180-188,(1999)；以及Patnaik,R.和J.R.Swartz,Biotechniques 24,862-868,(1998)；美国专利第6,337,191号；美国专利公开文献第2002/0081660号；WO 00/55353；WO 90/05785，其以引用的方式并入本文中。另一种可用于表达包含非天然编码氨基酸的hPP或hA或hFc多肽的方法包括mRNA-肽融合技术。例如参见R.Roberts和J.Szostak,Proc.Natl Acad.Sci.(USA)94:12297-12302(1997)；A.Frankel等人,Chemistry&Biology 10:1043-1050(2003)。在本方法中，在核糖体上将与嘌呤霉素(puromycin)连接的mRNA模板翻译成肽。如果已对一个或一个以上tRNA分子进行修饰，那么也可将非天然氨基酸并入肽中。在已读取最后一个mRNA密码子后，嘌呤霉素捕获肽的C末端。如果发现所得mRNA-肽结合物在活体外检定中具有引人关注的性质，那么可容易地由mRNA序列公开其身份。以此方式，可筛选包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的hPP或hA或hFc多肽的文库，以鉴别具有所需性质的多肽。最近，已报导利用经纯化组分的活体外核糖体翻译，其允许合成经非天然编码氨基酸取代的肽。例如参见A.Forster等人,Proc.Natl Acad.Sci.(USA)100:6353(2003)。
还可使用重构翻译系统。已成功地使用经纯化翻译因子的混合物以及溶解产物或补充有经纯化翻译因子(诸如，起始因子-1(IF-1)、IF-2、IF-3(α或β)、延长因子T(EF-Tu)或终止因子)的溶解产物的组合将mRNA翻译成蛋白质。无细胞系统也可为偶联式转录/翻译系统，其中如Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑,Wiley Interscience,1993)(其以引用的方式特别并入本文中)中所述，将DNA引入所述系统中，转录成mRNA并翻译所述mRNA。在真核转录系统中转录的RNA可为异核RNA(hnRNA)或者5'端戴帽(7-甲基鸟苷)且3'端加聚腺苷酸尾的成熟mRNA(其可在某些翻译系统中具有优势)的形式。举例来说，在网织红细胞溶解产物系统中，以高效率翻译戴帽的mRNA。
IX.与hPP或hA或hFc多肽偶合的大分子聚合物
本文中所述的针对非天然氨基酸多肽的各种修饰可使用本文中所述的组合物、方法、技术以及策略来实现。这些修饰包括在多肽的非天然氨基酸组分上并入其它官能团，所述官能团包括(但不限于)标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；放射性核素；细胞毒性化合物；药物；亲和标记；光亲和标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖类；水溶性树枝状聚合物；环糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼化部分；光化辐射可激发的部分；可光致异构化部分；生物素；生物素衍生物；生物素类似物；合并有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；量子点；纳米传递素；放射性核苷酸；放射性传递素；中子捕获剂；或上述物质的任何组合，或任何其它所需的化合物或物质。作为本文中所述的组合物、方法、技术以及策略的说明性非限制性实例，以下描述将集中在将大分子聚合物添加到非天然氨基酸多肽中，同时应了解相关组合物、方法、技术以及策略也适用于(必要时利用适当修饰，且所属领域的技术人员可利用本文中的公开内容来进行)添加其它官能团，包括(但不限于)以上所列的官能团。
多种大分子聚合物和其它分子可与本发明的hPP或hA多肽连接来调节hPP或hA多肽的生物性质，和/或对hPP或hA或hFc分子提供新颖的生物性质。这些大分子聚合物可经由天然编码氨基酸、经由非天然编码氨基酸或天然或非天然氨基酸的任何官能取代基或添加到天然或非天然氨基酸中的任何取代基或官能团与hPP或hA或hFc多肽连接。聚合物的分子量可具有宽范围，包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或100,000Da以上之间。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da以及100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与40,000Da之间。
本发明提供实质上均质的聚合物:蛋白质结合物制剂。如本文中所使用，“实质上均质”意思是据观察聚合物:蛋白质结合物分子大于总蛋白质的一半。聚合物:蛋白质结合物具有生物活性且本文中所提供的本发明的“实质上均质”的聚乙二醇化hPP或hA或hFc多肽制剂为足够均质以致展现均质制剂的优势(例如，在临床应用中预计各批次之间的药物动力学的简便性)的多肽制剂。
还可选择制备聚合物:蛋白质结合物分子的混合物，且本文中所提供的优势在于可选择欲包括在所述混合物中的单一聚合物:蛋白质结合物的比例。因此，必要时，可制备各种蛋白质与各种数目的所连接的聚合物部分(即，二、三、四等)的混合物且将所述结合物与使用本发明的方法制备的单一聚合物:蛋白质结合物组合，且得到具有预定的单一聚合物:蛋白质结合物比例的混合物。
所选择的聚合物可为水溶性的，以致其所连接的蛋白质在诸如生理环境等水性环境中不沉淀。聚合物可为分支的或不分支的。对于最终产品制剂的治疗使用来说，聚合物将为医药学上可接受的。
聚合物的实例包括(但不限于)聚烷基醚和其经烷氧基封端的类似物(例如，聚氧乙二醇、聚氧乙烯/丙二醇和其经甲氧基或乙氧基封端的类似物，尤其聚氧乙二醇，后者也称为聚乙二醇或PEG)；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯烷基醚；聚噁唑啉、聚烷基噁唑啉和聚羟基烷基噁唑啉；聚丙烯酰胺、聚烷基丙烯酰胺和聚羟基烷基丙烯酰胺(例如，聚羟基丙基甲基丙烯酰胺和其衍生物)；聚羟基烷基丙烯酸酯；聚唾液酸和其类似物；亲水性肽序列；多糖和其衍生物，包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖、氨基葡聚糖、纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素、羟基烷基纤维素；甲壳质和其衍生物，例如壳聚糖、琥珀酰基壳聚糖、羧甲基甲壳质、羧甲基壳聚糖；透明质酸和其衍生物；淀粉；海藻酸酯；硫酸软骨素；白蛋白；支链淀粉(pullulan)和羧甲基支链淀粉；聚氨基酸和其衍生物，例如聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬酰胺；马来酸酐共聚物，诸如苯乙烯马来酸酐共聚物、二乙烯基乙基醚马来酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物；其三聚物；其混合物；和上述物质的衍生物。
聚乙二醇分子与蛋白质分子的比例将变化，其在反应混合物中的浓度也将变化。一般来说，最佳比率(就存在最小过量的未反应蛋白质或聚合物的反应的效率来说)可通过所选择的聚乙二醇的分子量和可利用的可利用性反应性基团的数目来确定。至于分子量，通常聚合物的分子量越高，可与蛋白质连接的聚合物分子的数目越少。类似地，当优化这些参数时，应考虑聚合物的分支。通常，分子量越高(或分支越多)，聚合物:蛋白质比率越高。
如本文中所使用且当涵盖PEG:hPP或hA或hFc多肽结合物时，术语“治疗有效量”是指产生患者所需益处的量。所述量将随个体而变化且将取决于许多因素，包括患者的总体身体状况和待治疗的病状的潜伏病因。用于疗法的hPP或hA或hFc多肽的量产生可接受的变化速率且将所需反应维持在有益水平。本发明组合物的治疗有效量可由所属领域的一般技术人员使用可公开获得的物质和程序容易地确定。
水溶性聚合物可为任何结构形式，包括(但不限于)线性、叉状或分支形式。水溶性聚合物通常为聚(烷二醇)，诸如聚(乙二醇)(PEG)，但也可使用其它水溶性聚合物。举例来说，使用PEG来描述本发明的某些实施例。
PEG为熟知的水溶性聚合物，其可购得或可根据所属领域的一般技术人员所知的方法通过使乙二醇开环聚合来制备(Sandler和Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,New York,第3卷,第138-161页)。术语“PEG”广泛用于涵盖任何聚乙二醇分子(不考虑PEG的尺寸或其末端的修饰)，且可由下式表示为与hPP或hA或hFc多肽连接：
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y，
其中n为2到10,000且X为H或末端修饰，包括(但不限于)C1-4烷基、保护基或末端官能基。
在一些情况下，本发明中所使用的PEG在一端以羟基或甲氧基封端，即，X为H或CH3(“甲氧基PEG”)。或者，PEG可以反应性基团封端，从而形成双官能聚合物。典型反应性基团可包括通常用于与20种常见氨基酸中所见的官能团反应的反应性基团(包括(但不限于)马来酰亚胺基、活化碳酸酯(包括(但不限于)对硝基苯酯)、活化酯(包括(但不限于)N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酯)和醛)以及对20种常见氨基酸呈惰性但与非天然编码氨基酸中所存在的互补官能团特异性反应的官能团(包括(但不限于)叠氮基、炔基)。应注意，上式中由Y显示的PEG的另一端将直接与hPP或hA或hFc多肽连接或经由天然存在或非天然编码氨基酸间接与hPP或hA或hFc多肽连接。举例来说，Y可为与多肽的胺基(包括(但不限于)赖氨酸的ε胺或N-末端)连接的酰胺键、氨基甲酸酯键或脲键。或者，Y可为与硫醇基(包括(但不限于)半胱氨酸的硫醇基)连接的马来酰亚胺键。或者，Y可为与通过20种常见氨基酸通常不可及的残基连接的键。举例来说，PEG上的叠氮基可与hPP或hA或hFc多肽上的炔基反应以形成休斯根[3+2]环加成产物。或者，PEG上的炔基可与非天然编码氨基酸中所存在的叠氮基反应以形成类似的产物。在一些实施例中，强亲核体(包括(但不限于)肼、酰肼、羟胺、氨基脲)可与非天然编码氨基酸中所存在的醛或酮基反应以形成腙、肟或半卡巴腙，在一些情况下，适当时可通过用适当还原剂处理使腙、肟或半卡巴腙进一步还原。或者，强亲核体可经由非天然编码氨基酸并入hPP或hA或hFc多肽中且可用于优先与水溶性聚合物中所存在的酮或醛基反应。
按实际需要，可使用PEG的任何分子质量，视需要包括(但不限于)约100道尔顿(Da)到100,000Da或100,000Da以上(有时包括(但不限于)0.1-50kDa或10-40kDa)。PEG的分子量可具有宽范围，包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或100,000Da以上之间。PEG可介于约100Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da以及100Da。在一些实施例中，PEG介于约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中，PEG介于约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG介于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG介于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG介于约10,000Da与40,000Da之间。也可使用分支链PEG，包括(但不限于)各链具有介于1-100kDa(包括(但不限于1-50kDa或5-20kDa))范围内的MW的PEG分子。分支链PEG的各链的分子量可介于包括(但不限于)约1,000Da与约100,000Da或100,000Da以上之间。分支链PEG的各链的分子量可介于约1,000Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da以及1,000Da。在一些实施例中，分支链PEG的各链的分子量介于约1,000Da与50,000Da之间。在一些实施例中，分支链PEG的各链的分子量介于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，分支链PEG的各链的分子量介于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，分支链PEG的各链的分子量介于约5,000Da与20,000Da之间。多种PEG分子是描述于包括(但不限于)Shearwater Polymers,Inc.目录、Nektar Therapeutics目录中，所述目录以引用的方式并入本文中。
通常，PEG分子的至少一个末端可用于与非天然编码氨基酸反应。举例来说，可使用具有与氨基酸侧链反应的炔和叠氮部分的PEG衍生物来使PEG与如本文中所述的非天然编码氨基酸连接。如果非天然编码氨基酸包含叠氮化物，那么PEG通常将含有炔部分以实现[3+2]环加成产物的形成，或含有膦基团的活化PEG物质(即，酯、碳酸酯)以实现酰胺键的形成。或者，如果非天然编码氨基酸包含炔，那么PEG通常将含有叠氮部分以实现[3+2]休斯根环加成产物的形成。如果非天然编码氨基酸包含羰基，那么PEG通常将包含有效亲核体(包括(但不限于)酰肼、肼、羟胺或氨基脲官能团)以分别实现相应腙、肟以及半卡巴腙键的形成。在其它替代方案中，可使用上述反应性基团的定向的反向定向，即，可使非天然编码氨基酸中的叠氮部分与含有炔的PEG衍生物反应。
在一些实施例中，具有PEG衍生物的hPP或hA或hFc多肽变异体含有与非天然编码氨基酸侧链上所存在的化学官能团反应的化学官能团。
在一些实施例中，本发明提供包含平均分子量为约800Da到约100,000Da的水溶性聚合物主链的含叠氮和乙炔的聚合物衍生物。水溶性聚合物的聚合物主链可为聚(乙二醇)。然而，应理解多种水溶性聚合物也适用于本发明的实施，包括(但不限于)聚(乙二醇)和其它相关聚合物，包括聚(葡聚糖)和聚(丙二醇)，且术语PEG或聚(乙二醇)的使用打算涵盖且包括所有这些分子。术语PEG包括(但不限于)呈任何形式的聚(乙二醇)，包括双官能PEG、多臂PEG、衍生PEG、叉状PEG、分支PEG、侧接PEG(即，具有一个或一个以上侧接到聚合物主链上的官能团的PEG或相关聚合物)或其中具有可降解键的PEG。
PEG通常是透明的，无色，无味，可溶于水，对热稳定，对许多化学试剂呈惰性，不水解或退化且通常无毒。认为聚(乙二醇)是生物相容的，也就是说PEG能够与生命组织或生物体共存而不引起危害。更具体来说，PEG实质上为非免疫原性的，也就是说PEG不倾向于在体内产生免疫反应。当与体内具有某种所需功能的分子(诸如生物活性剂)连接时，PEG倾向于遮蔽所述试剂且可减少或消除任何免疫反应，从而使有机体可耐受所述试剂的存在。PEG结合物不倾向于产生实质免疫反应或引起凝固或其它不合需要的作用。具有式-CH2CH2O-(CH2GH2O)n-CH2CH2-(其中n为约3到约4000，通常约20到约2000)的PEG适用于本发明中。在本发明的一些实施例中，分子量为约800Da到约100,000Da的PEG尤其适用作聚合物主链。PEG的分子量可具有宽范围，包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或100,000Da以上之间。PEG的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200D以及100Da。在一些实施例中，PEG的分子量介于约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约10,000Da与40,000Da之间。
聚合物主链可为线性或分支的。所属领域中通常已知分支聚合物主链。分支聚合物通常具有一个中心分支核心部分和与所述中心分支核心连接的多个线性聚合物链。PEG通常以可通过将氧化乙烯添加到各种多元醇(诸如甘油、甘油寡聚物、季戊四醇以及山梨糖醇)中制备的分支形式使用。中心分支部分也可源自多种氨基酸，诸如赖氨酸。分支聚(乙二醇)可以一般形式R(-PEG-OH)m(其中R源自核心部分，诸如甘油、甘油寡聚物或季戊四醇；且m表示臂的数目)表示。也可使用多臂PEG分子作为聚合物主链，诸如美国专利第5,932,462号、第5,643,575号、第5,229,490号、第4,289,872号；美国专利申请文件第2003/0143596号；WO 96/21469和WO 93/21259中所述的多臂PEG分子，所述专利各自以全文引用的方式并入本文中。
分支PEG也可呈由PEG(-YCHZ2)n(其中Y为连接基团且Z为经由规定长度的原子链连接于CH的经活化末端基)表示的叉状PEG形式。
另一种分支形式侧接PEG沿PEG主链而不是在PEG链的末端处具有诸如羧基等反应性基团。
除这些PEG形式外，也可制备主链中具有弱或可降解键的聚合物。举例来说，可制备聚合物主链中具有经受水解作用的酯键的PEG。如下所示，这一水解作用引起聚合物裂解成较低分子量的片段：
-PEG-CO2-PEG-+H2O→PEG-CO2H+HO-PEG-。所属领域的一般技术人员应了解，术语聚(乙二醇)或PEG表示或包括所属领域中已知的所有形式，包括(但不限于)本文中所公开的这些形式。
许多其它聚合物也适用于本发明。在一些实施例中，具有2到约300个末端的水可溶性聚合物主链尤其适用于本发明。合适的聚合物的实例包括(但不限于)其它聚(烷二醇)(诸如聚(丙二醇)(“PPG”))、其共聚物(包括(但不限于)乙二醇与丙二醇的共聚物)、其三聚物、其混合物等。虽然聚合物主链的各链的分子量可不同，但其通常在约800Da到约100,000Da、通常约6,000Da到约80,000Da的范围内。聚合物主链的各链的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da,65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da,25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da,300Da、200Da以及100Da。在一些实施例中，聚合物主链的各链的分子量介于约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链的各链的分子量介于约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链的各链的分子量介于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链的各链的分子量介于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链的各链的分子量介于约10,000Da与40,000Da之间。
所属领域的一般技术人员将认识到，实质上水溶性主链的上述清单无论如何不是详尽的且仅是说明性的，且预期具有上述质量的所有聚合材料都适用于本发明中。
在本发明的一些实施例中，聚合物衍生物为“多官能”的，意思是所述聚合物主链具有至少两个经官能团官能化或活化的末端且可能具有多达约300个所述末端。多官能聚合物衍生物包括(但不限于)具有两个末端的线性聚合物，其中各末端与可相同或不同的官能团键结。
在一个实施例中，聚合物衍生物具有如下结构：
X-A-POLY-B-N＝N＝N，
其中：
N＝N＝N为叠氮部分；
B为可存在或不存在的连接部分；
POLY为水可溶性非抗原性聚合物；
A为可存在或不存在且可与B相同或不同的连接部分；且
X为第二官能团。
A和B的连接部分的实例包括(但不限于)含有至多18个且可含有1-10个碳原子的多官能烷基。烷基链中可包括诸如氮、氧或硫等杂原子。烷基链也可在杂原子处分支。A和B的连接部分的其它实例包括(但不限于)含有至多10个且可含有5-6个碳原子的多官能芳基。芳基的一个或一个以上碳原子可经氮、氧或硫原子取代。合适连接基团的其它实例包括美国专利第5,932,462号、第5,643,575号和美国专利申请公开文献2003/0143596中所述的连接基团，所述专利以引用的方式并入本文中。所属领域的一般技术人员将认识到，连接部分的上述清单无论如何不是详尽的且仅是说明性的，且预期具有上述质量的所有连接部分都适用于本发明中。
适用作X的官能团的实例包括(但不限于)羟基、经保护羟基、烷氧基、诸如N-羟基琥珀酰亚胺酯和1-苯并三唑酯等活性酯、诸如N-羟基琥珀酰亚胺碳酸酯和1-苯并三唑碳酸酯等活性碳酸酯、缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫代氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘代乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟甲磺酸酯、烯烃、酮以及叠氮化物。所属领域的一般技术人员所了解，所选择的X部分应与叠氮基相容以便不发生与叠氮基的反应。含叠氮基的聚合物衍生物可具有同双官能性，意思是第二官能团(即，X)也是叠氮部分；或具有异双官能性，意思是第二官能团是不同的官能团。
术语“经保护”是指存在防止化学反应性官能团在某些反应条件下反应的保护基或保护部分。保护基将视所保护的化学反应性基团的类型而改变。举例来说，如果化学反应性基团是胺或酰肼，那么保护基可选自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群组。如果化学反应性基团是硫醇，那么保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应性基团是诸如丁酸或丙酸等羧酸或羟基，那么保护基可为苯甲基或诸如甲基、乙基或叔丁基等烷基。所属领域中已知的其它保护基也可用于本发明中。
文献中的末端官能团的特定实例包括(但不限于)N-琥珀酰亚胺碳酸酯(例如参见美国专利第5,281,698号、第5,468,478号)、胺(例如参见Buckmann等人,Makromol.Chem.182:1379(1981)；Zalipsky等人,Eur.Polym.J.19:1177(1983))、酰肼(例如参见Andresz等人,Makromol.Chem.179:301(1978))、琥珀酰亚胺丙酸酯和琥珀酰亚胺丁酸酯(例如参见Olson等人,Poly(ethylene glycol)Chemistry&Biological Applications,第170-181页，Harris和Zalipsky编,ACS,Washington,D.C.,1997；也参见美国专利第5,672,662号)、琥珀酰亚胺琥珀酸酯(例如参见Abuchowski等人,Cancer Biochem.Biophys.7:175(1984)和Joppich等人,Makromol.Chem.180:1381(1979))、琥珀酰亚胺酯(例如参见美国专利第4,670,417号)、苯并三唑碳酸酯(例如参见美国专利第5,650,234号)、缩水甘油醚(例如参见Pitha等人,Eur.J Biochem.94:11(1979)；Elling等人,Biotech.Appl.Biochem.13:354(1991))、氧羰基咪唑(例如参见，Beauchamp等人,Anal.Biochem.131:25(1983)；Tondelli等人,J.Controlled Release1:251(1985))、对硝基苯基碳酸酯(例如参见Veronese等人,Appl.Biochem.Biotech.,11:141(1985)和Sartore等人,Appl.Biochem.Biotech.,27:45(1991))、醛(例如参见Harris等人,J.Polym.Sci.Chem.Ed.22:341(1984)；美国专利第5,824,784号、美国专利第5,252,714号)、马来酰亚胺(例如参见Goodson等人,Biotechnology(NY)8:343(1990)；Romani等人,Chemistry of Peptides and Proteins2:29(1984)以及Kogan,Synthetic Comm.22:2417(1992))、邻吡啶基二硫化物(例如参见Woghiren等人,Bioconj.Chem.4:314(1993))、丙烯醇(例如参见，Sawhney等人,Macromolecules,26:581(1993))、乙烯砜(例如参见美国专利第5,900,461号)。上述所有参考文献和专利都以引用的方式并入本文中。
在本发明的某些实施例中，本发明的聚合物衍生物包含具有如下结构的聚合物主链：
X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-N＝N＝N，
其中：
X为如上所述的官能团；且
n为约20到约4000。
在另一实施例中，本发明的聚合物衍生物包含具有如下结构的聚合物主链：
X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-W-N＝N＝N，
其中：
W为包含1-10个碳原子的脂肪族或芳香族连接部分；
n为约20到约4000；且
X为如上所述的官能团。m介于1与10之间。
本发明的含叠氮基的PEG衍生物可通过所属领域中已知和/或本文中所公开的多种方法制备。在下文所示的一种方法中，使平均分子量为约800Da到约100,000Da的水溶性聚合物主链(所述聚合物主链具有与第一官能团键结的第一末端和与合适离去基键结的第二末端)与叠氮阴离子(其可与许多合适的平衡离子(包括钠、钾、叔丁基铵等)中的任一种配对)反应。离去基经历亲核置换且由所述叠氮部分置换，从而得到所需的含叠氮基的PEG聚合物。
X-PEG-L+N3 -→X-PEG-N3。
如上所示，适用于本发明的聚合物主链具有式X-PEG-L，其中PEG为聚(乙二醇)且X为不与叠氮基反应的官能团且L为合适离去基。合适官能团的实例包括(但不限于)羟基、经保护羟基、缩醛、烯基、胺、氨氧基、经保护胺、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、马来酰亚胺、二硫代吡啶和乙烯基吡啶以及酮。合适离去基的实例包括(但不限于)氯离子、溴离子、碘离子、甲磺酸酯基、三氟乙磺酸酯基以及甲苯磺酸酯基。
在另一种制备本发明的含叠氮基的聚合物衍生物的方法中，使具有叠氮官能团的连接剂与平均分子量为约800Da到约100,000Da的水溶性聚合物主链接触，其中连接剂具有将与PEG聚合物上的化学官能团选择性反应的化学官能团，以形成通过连接基团使叠氮基与聚合物主链分隔开的含叠氮基的聚合物衍生物产物。
例示性反应流程如下所示：
X-PEG-M+N-连接子-N＝N＝N→PG-X-PEG-连接子-N＝N＝N，
其中：
PEG为聚(乙二醇)且X为诸如烷氧基等封端基团或如上所述的官能团；且
M为不与叠氮官能团反应但将与N官能团有效且选择性地反应的官能团。
合适官能团的实例包括(但不限于)：如果N为胺，那么M为羧酸、碳酸酯或活性酯；如果N为酰肼或氨氧基部分，那么M为酮；如果N为亲核体，那么M为离去基。
粗产物的纯化可通过已知方法来实现，所述方法包括(但不限于)使产物沉淀，必要时接着进行色谱法。
以下展示在PEG二胺情况下的更特定实例，其中一个胺经诸如叔丁基-Boc等保护基部分保护且使所得经单保护的PEG二胺与具有叠氮官能团的连接部分反应：
BocHN-PEG-NH2+HO2C-(CH2)3-N＝N＝N。
在这种情况下，可使用诸如亚硫酰氯或碳二亚胺试剂和N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基苯并三唑等多种活化剂使胺基与羧酸基团偶合以在单胺PEG衍生物与具有叠氮基的连接部分之间产生酰胺键。在成功形成酰胺键后，所得经N-叔丁基-Boc保护的含叠氮基的衍生物可直接用于修饰生物活性分子，或其可进一步经精细修饰以安装其它适用的官能团。举例来说，可通过用强酸处理使N-t-Boc基团水解以产生Ω-氨基-PEG-叠氮化物。可使用所得胺作为合成手柄(synthetic handle)来安装诸如马来酰亚胺基、经活化二硫化物、活性酯等其它适用的官能团以产生有价值的异双官能性试剂。
当希望使不同分子与聚合物的各末端连接时，异双官能性衍生物尤其适用。举例来说，Ω-N-氨基-N-叠氮基PEG将允许具有诸如醛、酮、活性酯、活性碳酸酯等活性亲电子基团的分子与PEG的一个末端连接，且将允许具有乙炔基团的分子与PEG的另一末端连接。
在本发明的另一实施例中，聚合物衍生物具有如下结构：
X-A-POLY-B-C≡C-R，
其中：
R可为H或烷基、烯基、烷氧基或芳基或经取代芳基；
B为可存在或不存在的连接部分；
POLY为水可溶性非抗原性聚合物；
A为可存在或不存在且可与B相同或不同的连接部分；且
X为第二官能团。
A和B的连接部分的实例包括(但不限于)含有至多18个且可含有1-10个碳原子的多官能烷基。烷基链中可包括诸如氮、氧或硫等杂原子。烷基链也可在杂原子处分支。A和B的连接部分的其它实例包括(但不限于)含有至多10个且可含有5-6个碳原子的多官能芳基。芳基的一个或一个以上个碳原子原子可经氮、氧或硫原子取代。合适连接基团的其它实例包括美国专利第5,932,462号和第5,643,575号和美国专利申请公开文献2003/0143596中所述的连接基团，所述专利以引用的方式并入本文中。所属领域的一般技术人员将认识到，连接部分的上述清单无论如何不是详尽的且打算仅是说明性的，且预期具有上述质量的多种连接部分都适用于本发明中。
适用作X的官能团的实例包括羟基、经保护羟基、烷氧基、诸如N-羟基琥珀酰亚胺酯和1-苯并三唑酯等活性酯、诸如N-羟基琥珀酰亚胺碳酸酯和1-苯并三唑碳酸酯等活性碳酸酯、缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫代氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘代乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟甲磺酸酯、烯烃、酮以及乙炔。应了解，所选择的X部分应与乙炔基相容以致不发生与乙炔基的反应。含乙炔的聚合物衍生物可具有同双官能性，意思是第二官能团(即，X)也是乙炔部分；或具有异双官能性，意思是第二官能团是不同的官能团。
在本发明的另一实施例中，聚合物衍生物包含具有如下结构的聚合物主链：
X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-C≡CH，
其中：
X为如上所述的官能团；
n为约20到约4000；且
m介于1与10之间。
各异双官能性PEG聚合物的实例如下所示。
本发明的含乙炔的PEG衍生物可使用所属领域的一般技术人员所已和/或本文中所公开的方法制备。在一种方法中，使平均分子量为约800Da到约100,000Da的水溶性聚合物主链(所述聚合物主链具有与第一官能团键结的第一末端和与合适亲核基团键结的第二末端)与具有乙炔官能团和适于与PEG上的亲核基团反应的离去基的化合物反应。当使具有亲核部分的PEG聚合物和具有离去基的分子组合时，离去基经历亲核置换且由所述亲核部分置换，从而产生所需含乙炔的聚合物。
X-PEG-Nu+L-A-C→X-PEG-Nu-A-C≡CR'。
如上所示，用于反应中的优选聚合物主链具有式X-PEG-Nu，其中PEG为聚(乙二醇)，Nu为亲核部分且X为不与Nu、L或乙炔官能团反应的官能团。
Nu的实例包括(但不限于)将主要经由SN2型机理反应的氨基、烷氧基、芳氧基、巯基、亚氨基、羰酸酯基、酰肼基、氨氧基。Nu基的其它实例包括将主要经由亲核加成反应来反应的官能团。L基团的实例包括氯离子、溴离子、碘离子、甲磺酸酯基、三氟乙磺酸酯基和甲苯磺酸酯基和预期经历亲核置换的其它基团以及酮、醛、硫酯、烯烃、α-β不饱和羰基、碳酸酯基和预期经历亲核体加成的其它亲电子基团。
在本发明的另一实施例中，A为具有1-10个碳原子的脂肪族连接子或具有6-14个碳原子的经取代芳环。X为不与叠氮基反应的官能团；且L为合适离去基。
在另一种制备本发明的含乙炔的聚合物衍生物的方法中，使平均分子量为约800Da到约100,000Da的在一个末端具有经保护官能团或封端剂且在另一个末端具有合适离去基的PEG聚合物与乙炔阴离子接触。
例示性反应流程如下所示：
X-PEG-L+-OCR'→X-PEG-OCR'，
其中：
PEG为聚(乙二醇)且X为诸如烷氧基等封端基或如上所述的官能团；且
R'为H、烷基、烷氧基、芳基或芳氧基或经取代烷基、烷氧基、芳基或芳氧基。
在上述实例中，离去基L应具有足够反应性以在与足够浓度的乙炔阴离子接触时经历SN2型置换。所属领域的一般技术人员已知由乙炔阴离子对离去基进行SN2置换所需的反应条件。
粗产物的纯化通常可通过所属领域中已知的方法来实现，所述方法包括(但不限于)使产物沉淀，必要时接着进行色谱法。
水溶性聚合物可与本发明的hPP或hA或hFc多肽连接。水溶性聚合物可经由并入hPP或hA或hFc多肽中的非天然编码氨基酸或非天然编码或天然编码氨基酸的任何官能团或取代基或添加到非天然编码或天然编码氨基酸中的任何官能团或取代基连接。或者，水溶性聚合物经由天然存在氨基酸(包括(但不限于)半胱氨酸、赖氨酸或N-末端残基的氨基)与并入非天然编码氨基酸中的hPP或hA或hFc多肽连接。在一些情况下，本发明的hPP或hA或hFc多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个非天然氨基酸，其中一个或一个以上非天然编码氨基酸与水溶性聚合物(包括(但不限于)PEG和/或寡糖)连接。在一些情况下，本发明的hPP或hA或hFc多肽进一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上与水溶性聚合物连接的天然编码氨基酸。在一些情况下，本发明的hPP或hA或hFc多肽包含一个或一个以上与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸和一个或一个以上与水溶性聚合物连接的天然存在氨基酸。在一些实施例中，本发明中所使用的水溶性聚合物相对于非结合形式增加hPP或hA或hFc多肽的血清半衰期。
可调整与本发明的hPP或hA或hFc多肽连接的水溶性聚合物的数目(即，聚乙二醇化或糖基化程度)以提供改变的(包括(但不限于)增加或减小的)药理学、药物动力学或药效特征，诸如活体内半衰期。在一些实施例中，hPP或hA或hFc的半衰期比未经修饰的多肽增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍或至少约100倍。
含强亲核基团(即，酰肼、肼、羟胺或氨基脲)的PEG衍生物
在本发明的一个实施例中，用含有直接与PEG主链连接的末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基的非天然编码氨基酸的hPP或hA或hFc多肽。
在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物将具有如下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。
在一些实施例中，含肼或含酰肼的PEG衍生物将具有如下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X-NH-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000且X视情况为可存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些实施例中，含氨基脲的PEG衍生物将具有如下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000。
在本发明的另一实施例中，用含有借助于酰胺键与PEG主链连接的末端羟胺、酰肼、肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基的氨基酸的hPP或hA或hFc多肽。
在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物具有如下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。
在一些实施例中，含肼或含酰肼的PEG衍生物具有如下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-X-NH-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，n为100-1,000且X视情况为可存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些实施例中，含氨基脲的PEG衍生物具有如下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000。
在本发明的另一实施例中，用含有末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的分支PEG衍生物修饰包含含羰基的氨基酸的hPP或hA或hFc多肽，其中分支PEG的各链具有介于10-40kDa范围内且可为5-20kDa的MW。
在本发明的另一实施例中，用具有分支结构的PEG衍生物修饰包含非天然编码氨基酸的hPP或hA或hFc多肽。举例来说，在一些实施例中，肼或酰肼末端PEG衍生物将具有如下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-NH-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000，且X视情况为可存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些实施例中，含有氨基脲基的PEG衍生物将具有如下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X视情况为NH、O、S、C(O)或不存在，m为2-10且n为100-1,000。
在一些实施例中，含有羟胺基的PEG衍生物将具有如下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X视情况为NH、O、S、C(O)或不存在，m为2-10且n为100-1,000。
水溶性聚合物与hPP或hA多肽连接的程度和位点可调节hPP或hA或hFc多肽与hPP或hA或hFc多肽受体结合搭配物的结合。在一些实施例中，键是经安置以使hPP或hA或hFc多肽以如通过平衡结合检定(诸如Spencer等人,J.Biol.Chem.,263:7862-7867(1988)中所述的检定)所测量约400nM或400nM以下的Kd、以150nM或150nM以下的Kd且在一些情况下以100nM或100nM以下的Kd结合hPP或hA多肽受体或结合搭配物。
聚合物激活以及肽结合的方法和化学是描述于文献中且在所属领域中为已知的。聚合物激活的常用方法包括(但不限于)用溴化氰、高碘酸盐、戊二醛、二环氧化物(biepoxide)、氯甲代氧丙环(epichlorohydrin)、二乙烯基砜(divinylsulfone)、碳二亚胺、磺酰卤、三氯三嗪等激活官能团(参见R.F.Taylor,(1991),Protein Immobilisation.Fundamental and Applications,Marcel Dekker,N.Y.；S.S.Wong,(1992),Chemistry ofProtein Conjugation and Crosslinking,CRC Press,Boca Raton；G.T.Hermanson等人,(1993),Immobilized Affinity Ligand Techniques,Academic Press,N.Y.；Dunn,R.L.等人编,POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,ACS Symposium Series,第469卷,American Chemical Society,Washington,D.C.1991)。
可利用若干关于PEG的官能化和结合的综述和专题论文。例如参见Harris,Macromol.Chem.Phys.C25:325-373(1985)；Scouten,Methods in Enzymology135:30-65(1987)；Wong等人,Enzyme Microb.Technol.14:866-874(1992)；Delgado等人,CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems9:249-304(1992)；Zalipsky,BioconjugateChem.6:150-165(1995)。
关于聚合物激活的方法也可见于WO 94/17039、美国专利第5,324,844号、WO94/18247、WO 94/04193、美国专利第5,219,564号、美国专利第5,122,614号、WO90/13540、美国专利第5,281,698号以及WO 93/15189中，且关于经活化聚合物与酶之间的结合的方法可见于以下对应不同酶的参考文献中，所述酶包括(但不限于)凝血因子VIII(WO 94/15625)、血红蛋白(WO 94/09027)、载氧分子(美国专利第4,412,989号)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人,App.Biochem.Biotech.11:141-52(1985))。所引用的所有参考文献和专利都以引用的方式并入本文中。
通过任何便利方法来进行含有诸如对叠氮基-L-苯丙氨酸等非天然编码氨基酸的hPP或hA或hFc多肽的聚乙二醇化(即，添加任何水溶性聚合物)。举例来说，用经炔封端的mPEG衍生物使hPP或hA或hFc多肽聚乙二醇化。简单来说，在室温下在搅拌下向含有对叠氮基-L-苯丙氨酸的hPP或hA或hFc多肽中添加过量固体mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH。通常，用具有接近进行反应的pH值(通常约pH4-10)的pKa的缓冲剂缓冲水溶液。例如，适于在pH7.5下聚乙二醇化的缓冲剂的实例包括(但不限于)HEPES、磷酸盐、硼酸盐、TRIS-HCl、EPPS以及TES。连续监测pH值且必要时进行调整。通常使反应继续约1-48小时。
随后，使反应产物经受疏水性相互作用色谱，以使聚乙二醇化hPP或hA或hFc多肽变异体与游离mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH以及当在分子的两端使未阻断PEG活化从而使hPP或hA或hFc多肽变异体分子交联时可形成的聚乙二醇化hPP或hA或hFc多肽的任何高分子量复合物分离。疏水性相互作用色谱期间的条件使得游离mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH流经色谱柱，而任何经交联的聚乙二醇化hPP或hA或hFc多肽变异体复合物在含有一个与一个或一个以上PEG基团结合的hPP或hA或hFc多肽变异体分子的所需形式之后洗提。合适条件视交联复合物相对于所需结合物的相对大小而改变，且可由所属领域的一般技术人员容易地确定。通过超滤来浓缩含有所需结合物的洗提液且通过渗滤使其脱盐。
必要时，可通过所属领域的一般技术人员已知的一个或一个以上程序进一步纯化由疏水性色谱获得的聚乙二醇化hPP或hA或hFc多肽，所述程序包括(但不限于)亲和色谱；阴离子或阳离子交换色谱(使用包括(但不限于)DEAE琼脂糖凝胶)；二氧化硅色谱；逆相HPLC；凝胶过滤(使用包括(但不限于)SEPHADEX G-75)；疏水性相互作用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合物色谱；超滤/渗滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚焦；置换色谱；电泳程序(包括(但不限于)制备型等电位聚焦)；差异溶解性(包括(但不限于)硫酸铵沉淀)；或萃取。表观分子量可由GPC通过与球状蛋白标准物比较来估算(Preneta,AZ in Protein purification methods,a practical approach(Harris和Angal编)IRL Press1989,293-306)。hPP或hA-PEG结合物的纯度可通过蛋白水解降解(包括(但不限于)胰蛋白酶裂解)，接着质谱分析来评定。Pepinsky RB.等人,J.Pharmcoh&Exp.Ther.297(3):1059-66(2001)。
与本发明的hPP或hA或hFc多肽的氨基酸连接的水溶性聚合物可进一步不受限制地衍生或经取代。
含叠氮基的PEG衍生物
在本发明的另一实施例中，用含有叠氮部分的PEG衍生物修饰hPP或hA或hFc多肽，所述叠氮部分将与非天然编码氨基酸侧链上所存在的炔部分反应。一般来说，PEG衍生物将具有介于1-100kDa范围内且在一些实施例中介于10-40kDa范围内的平均分子量。
在一些实施例中，叠氮末端PEG衍生物将具有如下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。
在另一实施例中，叠氮末端PEG衍生物将具有如下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。
在本发明的另一实施例中，用含有末端叠氮部分的分支PEG衍生物修饰包含含炔的氨基酸的hPP或hA或hFc多肽，其中分支PEG的各链具有介于10-40kDa范围内且可为5-20kDa的MW。举例来说，在一些实施例中，叠氮末端PEG衍生物将具有如下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pN3，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10，且n为100-1,000且X视情况为O、N、S或羰基(C＝O)，在各情况下，X都可存在或不存在。
含炔的PEG衍生物
在本发明的另一实施例中，用含有炔部分的PEG衍生物修饰hPP或hA或hFc多肽，所述炔部分将与非天然编码氨基酸侧链上所存在的叠氮部分反应。
在一些实施例中，炔末端PEG衍生物将具有如下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-C≡CH，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。
在本发明的另一实施例中，用含有借助于酰胺键与PEG主链连接的末端叠氮部分或末端炔部分的PEG衍生物修饰包含含炔的非天然编码氨基酸的hPP或hA或hFc多肽。
在一些实施例中，炔末端PEG衍生物将具有如下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-C≡CH，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10且n为100-1,000。
在本发明的另一实施例中，用含有末端炔部分的分支PEG衍生物修饰包含含叠氮基的氨基酸的hPP或hA或hFc多肽，其中分支PEG的各链具有介于10-40kDa范围内且可为5-20kDa的MW。举例来说，在一些实施例中，炔末端PEG衍生物将具有如下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pC≡CH，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10，且n为100-1,000且X视情况为O、N、S或羰基(C＝O)或不存在。
含膦的PEG衍生物
在本发明的另一实施例中，用含有进一步包含将与非天然编码氨基酸侧链上所存在的叠氮部分反应的芳基膦基团的经活化官能团(包括(但不限于)酯、碳酸酯)的PEG衍生物修饰hPP或hA或hFc多肽。一般来说，PEG衍生物将具有介于1-100kDa范围内且在一些实施例中介于10-40kDa范围内的平均分子量。
在一些实施例中，PEG衍生物将具有如下结构：
其中n为1-10；X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，且W为水溶性聚合物。
在一些实施例中，PEG衍生物将具有如下结构：
其中X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，W为水溶性聚合物，且R可为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。例示性R基团包括(但不限于)-CH2、-C(CH3)3、-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-C(O)R'、-CONR'R"、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-CN以及-NO2。R'、R"、R"′和R""各自独立地是指氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基(包括(但不限于)经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。例如，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，R基团是各自独立地经选择，而当存在R'、R"、R"′和R""基团中的一个以上时，这些基团同样是各自独立地经选择。当R'和R"是连接到同一氮原子时，其可与氮原子组合形成5、6或7元环。举例来说，-NR'R"打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据取代基的以上讨论，所属领域的技术人员应了解术语“烷基”打算包括包括结合除氢基以外的基团的碳原子的基团，诸如卤代烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
其它PEG衍生物和一般聚乙二醇化技术
例如，可与hPP或hA或hFc多肽连接的其它例示性PEG分子以及聚乙二醇化方法包括以下文献中所述的分子和方法：美国专利公开文献第2004/0001838号、第2002/0052009号、第2003/0162949号、第2004/0013637号、第2003/0228274号、第2003/0220447号、第2003/0158333号、第2003/0143596号、第2003/0114647号、第2003/0105275号、第2003/0105224号、第2003/0023023号、第2002/0156047号、第2002/0099133号、第2002/0086939号、第2002/0082345号、第2002/0072573号、第2002/0052430号、第2002/0040076号、第2002/0037949号、第2002/0002250号、第2001/0056171号、第2001/0044526号、第2001/0021763号；美国专利第6,646,110号、第5,824,778号、第5,476,653号、第5,219,564号、第5,629,384号、第5,736,625号、第4,902,502号、第5,281,698号、第5,122,614号、第5,473,034号、第5,516,673号、第5,382,657号、第6,552,167号、第6,610,281号、第6,515,100号、第6,461,603号、第6,436,386号、第6,214,966号、第5,990,237号、第5,900,461号、第5,739,208号、第5,672,662号、第5,446,090号、第5,808,096号、第5,612,460号、第5,324,844号、第5,252,714号、第6,420,339号、第6,201,072号、第6,451,346号、第6,306,821号、第5,559,213号、第5,747,646号、第5,834,594号、第5,849,860号、第5,980,948号、第6,004,573号、第6,129,912号；WO 97/32607；EP 229,108；EP 402,378；WO 92/16555；WO 94/04193；WO 94/14758；WO 94/17039；WO 94/18247；WO 94/28024；WO 95/00162；WO 95/11924；WO 95/13090；WO 95/33490；WO 96/00080；WO 97/18832；WO 98/41562；WO 98/48837；WO 99/32134；WO 99/32139；WO 99/32140；WO 96/40791；WO 98/32466；WO 95/06058；EP 439 508；WO 97/03106；WO 96/21469；WO 95/13312；EP 921 131；WO 98/05363；EP 809 996；WO 96/41813；WO 96/07670；EP 605 963；EP 510 356；EP 400 472；EP 183 503以及EP 154 316；其以引用的方式并入本文中。本文中所述的任何PEG分子都可以任何形式使用，所述形式包括(但不限于)单链、分支链、多臂链、单官能、双官能、多官能形式或其任何组合。
增强生物活性分子对hA的亲和力
也可使各种生物活性分子与本发明的hA多肽融合以调节生物活性分子的半衰期或调节生物活性分子的另一性质。在一些实施例中，使生物活性分子与本发明的hA多肽连接或融合以增强对内源性结合搭配物的亲和力。
举例来说，在一些情况下，制备生物活性分子和hA的重组融合物。例示性白蛋白结合序列包括(但不限于)来自链球菌蛋白G的白蛋白结合域(例如参见Makrides等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.277:534-542(1996)；和Sjolander等人,J,Immunol.Methods201:115-123(1997))或白蛋白结合肽，诸如在例如Dennis等人,J.Biol Chem.277:35035-35043(2002)中所述的白蛋白结合肽。
在其它实施例中，用脂肪酸使本发明的生物活性分子酰化。在一些情况下，脂肪酸促进与hA的结合。例如参见Kurtzhals等人,Biochem.J.312:725-731(1995)。
在其它实施例中，本发明的生物活性分子多肽直接与hA融合。所属领域的技术人员将认识到，也可使多种其它生物活性分子与本发明的其它hPP连接来调节与结合搭配物的结合。
X.hPP或hA或hFc多肽的糖基化
本发明包括并入一个或一个以上具有糖残基的非天然编码氨基酸的hPP或hA或hFc多肽。糖残基可为天然残基(包括(但不限于)N-乙酰基葡糖胺)或非天然残基(包括(但不限于)3-氟半乳糖)。糖可通过N-或O-连接的糖苷键(包括(但不限于)N-乙酰基半乳糖-L-丝氨酸)或非天然键(包括(但不限于)肟或相应C-或S-连接的糖苷)与非天然编码氨基酸连接。
可在活体内或活体外向hPP或hA或hFc多肽中添加糖(包括(但不限于)糖基)部分。在本发明的一些实施例中，用由氨氧基衍生的糖修饰包含含羰基的非天然编码氨基酸的hPP或hA或hFc多肽以产生经由肟键连接的相应糖基化多肽。在糖与非天然编码氨基酸连接后，可通过用糖基转移酶和其它酶处理来进一步精细修饰糖以产生与hPP或hA或hFc多肽结合的寡糖。例如参见H.Liu,等人,J.Am.Chem.Soc.125:1702-1703(2003)。
在本发明的一些实施例中，直接用以氨氧基衍生物形式制备的具有预定结构的聚糖修饰包含含羰基的非天然编码氨基酸的hPP或hA或hFc多肽。所属领域的一般技术人员将认识到，可使用包括叠氮、炔、酰肼、肼和氨基脲的其它官能团使糖与非天然编码氨基酸连接。
在本发明的一些实施例中，然后可通过包括(但不限于)休斯根[3+2]环加成反应分别用包括(但不限于)炔基或叠氮衍生物修饰包含含叠氮或炔基的非天然编码氨基酸的hPP或hA或hFc多肽。这种方法允许以极高选择性修饰蛋白质。
XI.测量生物活性分子活性
无论使用什么方法来产生hPP或hA或hFc，都使hPP或hA或hFc经受生物活性检定。适当时，可进行氚化胸腺嘧啶检定来确定细胞分裂的程度。然而，可使用其它生物检定来确定所需活性。诸如测量抑制抗原的生物活性(诸如酶促、增生性或代谢活性)的能力的生物检定也提供hPP或hFc活性的指示。可使用其它活体外检定来确定生物活性。一般来说，生物活性的测试应提供对所需结果的分析，视抗原的生物活性的情况而定，诸如生物活性的增加或减小(与未改变的hPP或hFc相比)、不同生物活性(乳与未改变的hPP或hFc相比)、受体或结合搭配物的亲和力分析、hPP或hFc本身或结合搭配物的构象或结构变化(与未改变的hPP或hFc相比)或血清半衰期分析。
关于检定方法学的参考文献的上述汇编并不详尽，且所属领域的一般技术人员将认可适用于测试所需最终结果的其它检定。
XIII.测量效价、功能性活体内半衰期和药物动力学参数
本发明的一个重要方面是通过在使多肽与水溶性聚合物部分结合或不结合的情况下构筑hPP或hA或hFc多肽获得的延长的生物半衰期。hPP或hA或hFc多肽血清浓度的快速降低使得评估对用结合和未结合hPP或hA或hFc多肽和其变异体进行治疗的生物反应变得重要。本发明的结合和未结合hPP或hA或hFc多肽和其变异体在皮下或静脉内给药后也可具有延长的血清半衰期，从而使例如通过ELISA方法或通过初级筛选检定进行测量成为可能。可使用来自BioSource International(Camarillo,CA)或Diagnostic Systems Laboratories(Webster,TX)的ELISA或RIA试剂盒。活体内生物半衰期的测量是如本文中所述来进行。
包含非天然编码氨基酸的hPP或hA或hFc多肽的效价和功能性活体内半衰期可根据Clark,R.等人,J.Biol.Chem.271(36):21969-21977(1996)中所述的方案来测定。
包含非天然编码氨基酸的hPP或hA或hFc多肽的药物动力学参数可在正常Sprague-Dawley雄性大鼠(N＝每处理组5只动物)中评估。动物将接受静脉内每只大鼠25微克或皮下每只大鼠50微克的单剂量，且将根据预定时程采集约5-7个血液样品，对包含非天然编码氨基酸的未与水溶性聚合物结合的hPP或hA或hFc多肽来说通常覆盖约6小时，且对包含非天然编码氨基酸且与水溶性聚合物结合的hPP或hA多肽来说通常覆盖约4天。在若干物种中透彻研究hPP或hA或hFc多肽的药物动力学数据且可将其直接与包含非天然编码氨基酸的hPP或hA或hFc多肽所获得的数据比较。关于与hPP或hA或hFc相关的研究，参见Mordenti J.等人,Pharm.Res.8(11):1351-59(1991)。
药物动力学参数也可在例如猕猴的灵长类动物中评估。通常，皮下或静脉内给予单一注射液，且随时间监测血清hPP或hA或hFc含量。
根据本发明的hPP或hA或hFc多肽的比活性可由所属领域中已知的各种检定来确定。根据本发明获得和纯化的hPP或hA或hFc多肽蛋白变异体或其片段的生物活性可由本文中描述或参考或所属领域的一般技术人员已知的方法测试。
XIV.给药和医药组合物
本发明的多肽或蛋白质(包括(但不限于)hPP或hA或hFc、合成酶、包含一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白质等)视情况可包括(但不限于)与合适的医药载剂组合用于治疗用途中。例如，这些组合物包含治疗有效量的化合物和医药学上可接受的载剂或赋形剂。所述载剂或赋形剂包括(但不限于)生理食盐水、缓冲盐水、葡聚糖、水、甘油、乙醇和/或其组合。进行调配以适合给药模式。一般来说，所属领域的一般技术人员已知给予蛋白质的方法，且可将其用于给予本发明的多肽。
视情况根据所属领域的一般技术人员已知的方法在疾病的一种或一种以上适当的活体外和/或活体内动物模型中测试包含一种或一种以上本发明的多肽的治疗组合物，从而证实功效、组织代谢和估算剂量。具体来说，最初可通过本文的非天然氨基酸同源物相对于天然氨基酸同源物(包括(但不限于)比较经修饰包括一个或一个以上非天然氨基酸的hPP或hA或hFc多肽与天然氨基酸hPP或hA或hFc多肽)的活性、稳定性或其它合适的量度(即，在相关测定中)确定剂量。
给予借助于通常用于引导分子与血液或组织细胞的最终接触的任何途径。本发明的非天然氨基酸多肽视情况与一种或一种以上医药学上可接受的载剂一起以任何合适的方式给予。可利用在本发明的情况下向患者给予所述多肽的合适方法，且虽然可使用超过一种途径给予特定组合物，但特定途径通常可提供比另一途径即时且有效的作用或反应。
医药学上可接受的载剂部分地由所给予的特定组合物以及用于给予组合物的特定方法决定。因此，存在本发明的医药组合物的多种合适调配物。
本发明的hPP或hA或hFc多肽可通过适于蛋白质或肽的任何常规途径给予，所述途径包括(但不限于)肠外，例如注射，包括(但不限于)皮下或静脉内或任何其它形式的注射或输注。多肽组合物可通过许多途径给予，所述途径包括(但不限于)口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、眼用、眼内、颅内、硬膜下、投入CSF内、经皮、皮下、局部、舌下或直肠方式。包含经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物也可经由脂质体给予。所属领域的技术人员通常己知所述给药途径和适当的调配物。包含非天然编码氨基酸的hPP或hA或hFc多肽可单独使用或与诸如医药载剂等其它合适组分组合使用。包含非天然编码氨基酸的hPP或hA或hFc多肽也可与调节活性剂的释放或可利用性的生物可降解或生物可溶解的医药载剂组合使用。
单独或与其它合适组分组合的包含非天然氨基酸的hPP或hA或hFc多肽也可制成气雾剂调配物(即，其可“成雾状”)以经由吸入给予。可将气雾剂调配物放入诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等加压可接受推进剂中。
适于肠外给药(诸如通过关节内(在关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、眼内、颅内和皮下途径)的调配物包括水性和非水性等张无菌注射液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物与预定受体的血液等张的溶质，以及可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。可在单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)中提供经hPP或hA或hFc的调配物。
肠外给药和静脉内给药是优选的给药方法。具体来说，已经用于天然氨基酸同源物治疗剂的给药途径(包括(但不限于)通常用于白蛋白、白蛋白与其它多肽的融合物、EPO、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN、白细胞介素、抗体、抗体片段和/或任何其它医药学上传递蛋白质的途径)以及当前使用的调配物提供本发明的多肽的优选给药途径和调配物。
在本发明的情况中，给予患者的剂量足以在患者体内视施用而定随时间引起有益的治疗反应。通过特定载体或调配物的功效和所使用的非天然氨基酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期和患者的病状以及欲治疗患者的体重或表面积来确定剂量。剂量大小也通过在特定患者体内伴随特定载体、组合物的给药的任何不利副作用的存在、性质和程度等来确定。
在确定疾病(包括(但不限于)癌症、遗传疾病、糖尿病、AIDS等)的治疗或预防中欲给予的载体或调配物的有效量时，医师评价循环血浆含量、调配物毒性、疾病进展和/或(相关时)抗非天然氨基酸多肽抗体的产生。
例如给予70公斤患者的剂量通常在等于当前使用的治疗性蛋白质的剂量的范围内，所述范围可针对相关组合物的活性或血清半衰期的改变而进行调整。本发明的载体或医药调配物可通过任何已知的常规疗法来补充治疗条件，包括抗体给予、疫苗给予、给予细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物、生物反应调节剂等。
对于给药，本发明的调配物是以由相关调配物的LD-50或ED-50确定的速率给予，和/或包括(但不限于)当应用于患者的质量和总体健康状况时，观察各种浓度的非天然氨基酸多肽的任何副作用。给药可以单次剂量或分剂量实现。
如果经历调配物输注的患者出现发烧、寒战或肌肉疼痛，那么其接收适当剂量的阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、对乙酰氨基酚(acetaminophen)或其它疼痛/发烧控制药物。在将进行输注之前30分钟，对经历输注反应(诸如发烧、肌肉疼痛和寒战)的患者预先给予阿司匹林、布洛芬、对乙酰氨基酚或(包括(但不限于))苯海拉明(diphenhydramine)。将哌替啶(Meperidine)用于不能对解热剂和抗组织胺快速反应的更为严重的寒战和肌肉疼痛。视反应的严重程度减缓或中断细胞输注。
本发明的hPP或hA或hFc多肽可直接给予哺乳动物个体。给药可通过通常用于将hPP或hA或hFc多肽引入个体的任何途径。根据本发明的实施例的hPP或hA或hFc多肽组合物包括适于口服、经直肠、局部、吸入(包括(但不限于)经由气雾剂)、口腔(包括(但不限于)舌下)、经阴道、肠外(包括(但不限于)皮下、肌肉内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、大脑内、动脉内或静脉内)、局部(即，皮肤与粘膜表面，包括气道表面)和透皮给药，但在任何指定情况下最适合的途径将视所治疗病状的性质和严重程度而定。给药可为局部的或全身的。化合物的调配物可以单位剂量呈递或在多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)中呈递。本发明的hPP或hA或hFc多肽可与医药学上可接受的载剂一起制备成单位剂量可注射形式(包括(但不限于)溶液、悬浮液或乳液)的混合物。本发明的hPP或hA或hFc多肽还可通过连续输注(包括(但不限于)使用微型泵，诸如渗透泵)、单次团注或缓释储槽式调配物给予。
适于给药的调配物包括水溶液和非水溶液、等张无菌溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。溶液和悬浮液可由先前所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备而来。
冷冻干燥是用于将水从所关注的蛋白质制剂中去除的提供蛋白质的常用技术。冷冻干燥或冻干是首先将欲干燥的材料冷冻且随后通过在真空环境中升华来去除冰或冷冻溶剂的过程。预先冻干的调配物中可包括赋形剂以在冷冻干燥过程中增强稳定性和/或改进储存时冻干产物的稳定性。Pikal,M.Biopharm.3(9)26-30(1990)和Arakawa等人,Pharm.Res.8(3):285-291(1991)。
所属领域的一般技术人员也已知药物的喷雾干燥。举例来说，参见Drug Dev.Ind.Pharm,18(11和12),1169-1206(1992)中,Broadhead,J.等人,"The Spray Drying ofPharmaceuticals"。除小分子药物外，也已将多种生物材料喷雾干燥并且这些材料包括：酶、血清、血浆、微生物和酵母。由于喷雾干燥可将液态医药制剂以单步骤工艺转化成无粉尘或团聚细粉，所以喷雾干燥为有用技术。基本技术包含以下四个步骤：a)使进料溶液雾化成喷雾液；b)喷雾液-空气接触；c)干燥喷雾液；和d)使干燥产物与干燥空气分离。美国专利第6,235,710号和第6,001,800号(其以引用的方式并入本文中)中描述通过喷雾干燥制备重组促红细胞生成素。
本发明的医药组合物和调配物可包含医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。医药学上可接受的载剂是由所给予的特定组合物以及用于给予组合物的特定方法部分地决定。因此，存在本发明的医药组合物的多种合适调配物(包括可选的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂)(例如参见Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,1985)。
合适的载剂包括(但不限于)缓冲剂，其含有琥珀酸盐、磷酸盐、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐、组氨酸、咪唑、乙酸盐、碳酸氢盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括(但不限于)抗坏血酸；低分子量多肽，包括(但不限于)小于约10个残基的多肽；蛋白质，包括(但不限于)血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，包括(但不限于)聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，包括(但不限于)甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸或组氨酸衍生物、蛋氨酸、谷氨酸盐或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括(但不限于)海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，包括(但不限于)EDTA和依地酸二钠(edentate disodium)；二价金属离子，包括(但不限于)锌、钴或铜；糖醇，包括(但不限于)甘露糖醇或山梨糖醇；成盐平衡离子，包括(但不限于)钠和氯化钠；和/或非离子表面活性剂，包括(但不限于)TweenTM(包括(但不限于)Tween 80(聚山梨醇酯80)和Tween 20(聚山梨醇酯20))、PluronicsTM和其它普流尼克酸(pluronic acid)(包括(但不限于)普流尼克酸F68(泊洛沙姆188(poloxamer188))或PEG。例如，合适的表面活性剂包括(但不限于)以聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)(即，(PEO-PPO-PEO))或聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)(即，(PPO-PEO-PPO))或其组合为基础的聚醚。PEO-PPO-PEO和PPO-PEO-PPO在市面上以商品名PluronicsTM、R-PluronicsTM、TetronicsTM和R-TetronicsTM(BASFWyandotte Corp.,Wyandotte,Mich.)销售并且进一步描述于美国专利第4,820,352号中，所述专利以全文引用的方式并入本文中。其它乙烯/聚丙烯嵌段聚合物可为合适的表面活性剂。表面活性剂或表面活性剂的组合可用于使聚乙二醇化hPP或hA或hFc对一种或一种以上应力(包括(但不限于)由搅动产生的应力)稳定。上述一些物质可称为“增积剂(bulking agent)”。一些也可称为“张力改变剂(tonicity modifier)”。抗菌防腐剂也可应用于产物稳定性和抗菌效率；合适的防腐剂包括(但不限于)苯甲醇、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸丙酯、甲酚和酚或其组合。
本发明的hPP或hA或hFc多肽(包括与诸如PEG等水溶性聚合物连接的多肽)还可以通过持续释放系统或作为持续释放系统的部分给予。持续释放组合物包括(包括但不限于)成形物件形式的半渗透性聚合物基质，包括(但不限于)薄膜或微囊。持续释放基质包括生物可相容材料，诸如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)(Langer等人,J.Biomed.Mater.Res.,15:267-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上文)或聚D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)、聚丙交酯(聚乳酸)(美国专利第3,773,919号；EP 58,481)、聚乙交酯(乙醇酸聚合物)、聚丙交酯共聚乙交酯(乳酸与乙醇酸的共聚物)、聚酐、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人,Biopolymers,22,547-556(1983))、聚(原酸)酯、多肽、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(诸如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。持续释放组合物还包括脂质体包埋的化合物。可通过以下本身已知的方法来制备含有化合物的脂质体：DE3,218,121；Eppstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:3688-3692(1985)；Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci..U.S.A.,77:4030-4034(1980)；EP52,322；EP 36,676；美国专利第4,619,794号；EP 143,949；美国专利第5,021,234号；日本专利申请文件83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP102,324。所引用的所有参考文献和专利是以引用的方式并入本文中。
可通过例如DE 3,218,121；Eppstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:3688-3692(1985)；Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci..U.S.A.,77:4030-4034(1980)；EP52,322；EP 36,676；美国专利第4,619,794号；EP 143,949；；美国专利第5,021,234号；日本专利申请文件83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP102,324中所述的方法来制备脂质体包埋的hPP或hA或hFc多肽。脂质体的组成和尺寸已为人们所熟知，或者能够凭所属领域的一般技术人员的经验容易地确定。脂质体的一些实例是描述于例如Park JW等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:1327-1331(1995)；Lasic D和Papahadjopoulos D(编):Medical Applications OF Liposomes(1998)；Drummond DC等人,Liposomal drug delivery systems for cancer therapy,Teicher B(编):Cancer Drug Discovery and Development(2002)；Park JW等人,Clin.Cancer Res.8:1172-1181(2002)；Nielsen UB等人,Biochim.Biophys.Acta1591(1-3):109-118(2002)；Mamot C等人,Cancer Res.63:3154-3161(2003)中。所引用的所有参考文献和专利是以引用的方式并入本文中。
在本发明的情况中，给予患者的剂量应足以随时间在个体体内引起有益的反应。一般来说，每剂肠外给予的本发明的hPP或hA或hFc多肽的总的医药有效量在每天每公斤患者体重约0.01微克到每公斤患者体重约100微克，或者每天每公斤体重约0.05毫克到每公斤患者体重约1毫克的范围内，但这是以治疗判断为依据。给药频率也是以治疗判断为依据且可以比批准用于人类的可购得的hPP或hA或hFc多肽产品的频率更高或更低。一般来说，本发明的聚乙二醇化hPP或hA或hFc多肽可通过上述给药途径中的任一种给予。
实例
提供下列实例以说明但不限制所主张的发明。
实例1
这一实例描述选择将非天然编码氨基酸并入hA中的优选位点的许多组可能的标准中的一组。使用下文所述的标准，用于将对乙酰基-苯丙氨酸(pAF)位点特异性并入HSA中的氨基酸位置是：34、82、172、301、364、505。使用多种HSA晶体结构来确定可引入一个或一个以上非天然编码氨基酸的优选位置：这些结构的坐标可经由www.rcsb.org中的The Research Collaboratory for Structural Bioinformatics从蛋白质数据库(Protein Data Bank，PDB)获得(PDB ID为1A06、1E78和1BMO)。使用X射线晶体结构信息，利用Cx程序(Pintar等人,Bioinformatics,2002,第18卷,第980卷)对HSA分子进行溶剂可及性计算。计算所有原子的溶剂可及性且确定各氨基酸残基的复合Cx值，且将所述Cx值表示于图2中。根据Cx值对氨基酸排序且使这些氨基酸与其在HSA结构中的三维位置相关联，且将这些位点中的某些表示于图3中。HSA含有总计582个氨基酸：检查用于pAF取代的前51个Cx值。选择位点以将pAF放入将最可能发生共价结合的HSA结构的溶剂暴露区中。使用下列标准来评估用于引入非天然编码氨基酸的HSA的前51个Cx位置：所选择的残基(a)应具有最大的Cx值，从而证明溶剂可及性和与周围残基的最小范德华(van der Waals)或氢键结相互作用，b)应来自蛋白质的不同表面暴露区，且c)应位于具有刚性和可挠性的蛋白质结构的区域中。适于将非天然编码氨基酸并入hA中的氨基酸位置的部分清单是表示于图4中。
实例2
这一实例详述有和无非天然编码氨基酸的hA多肽在酵母中的克隆和表达。[白蛋白DNA在表达载体中的克隆，酵母的转化]
使用包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的所引入翻译系统来表达含有非天然编码氨基酸的hA。O-RS优先利用非天然编码氨基酸使O-tRNA氨酰化。翻译系统又响应经编码的选择密码子将非天然编码氨基酸插入hA中。
表2：hA、O-RS和O-tRNA序列
用含有经修饰的hA基因和正交氨酰基tRNA合成酶/tRNA对(对所需的非天然编码氨基酸具有特异性)的质粒转化酵母允许将非天然编码氨基酸位点特异性地并入hA多肽中。在37℃下在含有0.01-100mM特定非天然编码氨基酸的培养基中生长的转化酵母以高保真性和效率表达经修饰的hA。
在YPD中将携带pGADHSA或pGADGAL4(对照)的酿酒酵母菌株MaV203培养23小时。通过在4℃下在4000g下离心5分钟来收集细胞和上清液。通过溶解约10毫克湿细胞小球产生细胞提取物。通过10kDa MWCO离心柱(spin column)使上清液浓缩约30倍。将16微升还原样品加载到4-12％Bis-Tris PAGE凝胶的各孔中，在200V下跑胶50分钟且用考马斯蓝染色或将其转移到硝酸纤维素膜上(25V，70分钟)。用初级抗HSA IgY pAb(200ng/ml)和HRP结合山羊抗IgY IgG(10ng/ml)探查印迹，然后使用Supersignal ECL底物(Sigma)和Biorad Fluor-S成像系统检测。结果表示于图5中。
纯化hA的方法为所属领域的一般技术人员所知且由SDS-PAGE、西方印迹(Western Blot)分析或电喷雾-电离离子阱(ion trap)质谱等得到证实。
白蛋白DNA在表达载体中的克隆，酵母转化
如下将野生型hA编码序列(CDS)克隆到酵母穿梭/表达载体pGADGAL4中。获得可购得的hA cDNA，且通过PCR使用对hA CDS的5'和3'端具有特异性的引物扩增；将HindIII限制位点整合到引物端中。在PCR之后，用HindIII(37℃，60分钟)消化正确片段，使其纯化且与HindIII-切割pGADGAL4连接。使连接产物转化到TOP10化学耐久性大肠杆菌中；使用小量提取试剂盒从所选择的转化体中分离质粒DNA。通过所选择的各质粒克隆的独立的EcoRV和PstI限制消化来进行所需质粒产物的筛选；通过测序来核实琼脂糖凝胶电泳(130伏，30分钟)和EtBr染色之后展现预期带型的克隆。如果克隆具有替代pGADGAL4的GAL4区的hA CDS的拷贝，那么认为克隆是‘阳性’；用于其它实验中的特异性质粒是称为‘pGADHSA’。
通过定点诱变Quickchange方法在hA CDS内对指定密码子进行琥珀突变(Stratagene,La Jolla,CA)。简单来说，在PCR反应中使用对待突变的区具有特异性的重叠引物和含有产生突变区所必需的核苷酸碱基改变以产生半突变的杂交质粒DNA分子。在裂解和破坏亲本甲基化DNA链的DpnI限制分解之后，使产物转化到TOP10化学耐久性大肠杆菌中。选择转化体；分离质粒DNA且通过核苷酸测序证实含有所需突变体的质粒DNA。
根据R.D.Geitz(http://www.umanitoba.ca/faculties/medicine/biochem/gietz/Trafo.html)详述的方案进行酿酒酵母转化。简单来说，以约50微升等分试样从YPD琼脂板刮取刚生长的酿酒酵母，用无菌水洗涤，且使其再悬浮于含有33％聚(乙二醇)-3350、100mM LiOAc、300微克/毫升单链鲑鱼精液DNA和5-10微克转化质粒DNA的转化混合物中。使细胞在42℃下热休克40-60分钟，洗涤并使其再悬浮于1.0毫升无菌水中，且将其涂铺到选择性琼脂板上的稀释液中。然后，将转化体用于后续表达和抑制实验中。
具有非天然氨基酸的HSA蛋白的表达和表征
用以下物质转化酿酒酵母菌株InvSc1：
1)仅pGADHSA(琥珀)，
2)pGADHSA(琥珀)加含有大肠杆菌酪氨酸tRNA合成酶基因和tRNACUA基因的质粒，
3)pGADHSA(琥珀)加含有大肠杆菌对乙酰基苯丙氨酸tRNA合成酶基因和tRNACUA基因的质粒。
在50毫升SD培养基(缺乏亮氨酸，缺乏色氨酸)中培养转化体且在上述(3)的情况下，在30℃下在振荡下在存在1mM对乙酰基苯丙氨酸的情况下，直到OD600为1.0。此时，通过在3000×g下离心5分钟使各培养物的30OD600等效物变成小球且将其再悬浮于30ml YPD(再次在上述(3)的情况下，也在存在1mM对乙酰基苯丙氨酸的情况下)中。再次使培养物在30℃下在250rpm振荡下再生长24小时。然后，如上所述使各培养物的50OD600等效物变成小球；分离培养上清液，且使用10kDaMWCO离心柱使其一部分浓缩约30倍。
通过免疫印迹法来检定hA蛋白质的存在，且免疫印迹法描述如下。将16微升各还原样品加载到4-12％Bis-Tris PAGE凝胶的各孔中，在200V下跑胶50分钟且用考马斯蓝染色或将其转移到硝酸纤维素膜上(25V，70分钟)。用初级抗HSA IgY pAb(200ng/ml)和HRP结合山羊抗IgY IgG(10ng/ml)探查印迹，然后使用SupersignalECL底物(Sigma)和Biorad Fluor-S成像系统检测。结果表示于图6中，且证明将非天然编码氨基酸并入hA多肽中。
HSA-C34的非天然编码氨基酸抑制
使经编码WT HSA、HSA-C34或HSA-C34的质粒加编码tRNA合成酶(RS)/tRNA对[酪氨酸(Y)RS、pAFRS、pAzRS、pBzRS、OMeRS]的质粒转化的酿酒酵母Y187菌株在HC-Leu培养基或HC-Leu-Trp培养基中生长过夜(30℃，200rpm)。使细胞在4℃下在5000×g下历时5分钟变成小球，且使其再悬浮于YPAD中直到OD600为0.5。在存在(+)或不存在(-)适当的新颖氨基酸(pAF、pAZ-Phe、pBz-Phe、OMe-Tyr，1mM)的情况下培育含有外源tRNA/RS对的菌株。pAF＝对乙酰基苯丙氨酸；pAZ-Phe＝对叠氮基苯丙氨酸；pBz-Phe＝对苯甲酰基-L-苯丙氨酸；OMe-Tyr＝O-甲基酪氨酸。在培育24小时(30℃，200rpm)之后，通过离心收集所有培养物；通过SDS-PAGE用4-12％ Bis-Tris凝胶来分解15mL还原上清液且通过(图10A)考马斯蓝以及(图10B和C)抗HSA Western印迹法来观察。HSA标准物为从人类血清纯化的200ng HSA。
HSA-C34-pAF与5K氨氧基PEG的结合
将经纯化的wt HSA或HSA-C34-pAF以缓冲剂交换到反应缓冲剂(20mM乙酸钠、20g/L甘氨酸、5g/L甘露糖醇、1mM EDTA(pH4.0))中，最终浓度为约2mg/ml。通过添加20摩尔当量的5K氨氧基衍生的PEG(+)或通过添加反应缓冲剂(-)来起始HSA-C34-pAF的反应；向所有反应中添加乙酸酰肼(催化剂：最终浓度为50mM)。使反应在28℃下在不受干扰下进行48小时。然后，在4-12％bis-tris聚丙烯酰胶凝胶上分离每个泳道1微升反应混合物且通过α-HSA Western印迹法加以分析。参见图11。
HSA分析方法
样品的胰蛋白酶化
将WT HSA(Sigma-Aldrich，2mg/ml)或经纯化的pAF抑制的HSA(约2mg/ml)稀释到6M盐酸胍和50mM Tris(pH7.5)中(最终浓度)。在37℃下用20mM DTT使样品还原1小时，接着在室温下在黑暗环境中用40mm碘乙酸(iodoacetic acid，IAA)使其烷基化40分钟。用40mm DTT中止反应，且将样品透析到50mM Tris、1mM CaC12(pH7.5)中并在37℃下用胰蛋白酶1:20(酶:蛋白质)处理4小时。通过添加TFA直到占0.1％使反应中止。
LC-MS/MS：
将100μL胰蛋白酶化样品以0.2mL/min加载到Zorbax SB-C18柱(2.1×150mm，3.5μm，40℃)上。经60分钟，用0到100％乙腈的每分钟1.38％的梯度将肽洗提到0.05％TFA中。将所洗提的肽直接地电喷雾到施加15V毛细管电压和4.5kV喷雾电压的ThermoElectron LCQ Deca上。在整个肽洗提过程中，以35％的标准化碰撞能量进行一个全扫描质谱(300-2000m/z)、接着数据相关的级联MS谱图截获的循环。
HSA-C34pAF的肽质量图
使经纯化的wt HSA和HSA-C34pAF(约60μg)经受胰蛋白酶的蛋白水解消化，且用LCQ Deca(Thermoelectron)对样品进行LC-MS/MS以获得肽质量图。基于序列分析，WT HSA中从N-末端开始的第五个胰蛋白酶肽(T5)含有Cys34；pAF抑制的HSA中的T5应展现对应于Cys34pAF氨基酸取代的质量差。WT T5肽(M2H+m/z计算值＝1246.95)在37.3分钟时从反相柱洗提，其中m/z观察值为1246.4；HSA-C34pAF的胰蛋白酶质量图在37.3分钟时不产生m/z为1246+/-2的肽。相反地，pAF取代的T5(M2H+m/z计算值＝1260.63)在39.1分钟时洗提，其中m/z观察值为1260.4(图12A)。wt HSA的胰蛋白酶质量图在39.1分钟时未观察到m/z为1246+/-2的肽(图12B)。(A)中的39.1min峰(m/z＝1260.4)具有与预期的pAF取代的T5肽一致的MS/MS谱图(参见图13)。
含pAF的HSA多肽的MS/MS
pAF-T5母体离子的MS/MS谱图(m/z＝1260.4)。通过碰撞诱导的双电荷母体离子的解离产生单电荷离子片段。谱图中指示对应于预测的m/z间隔的峰(y"系列)。峰间隔与含有Cys34-pAF取代的HSA T5肽一致。参见图13。
实例3
这一实例详述含羰基的氨基酸的引入和随后与含氨氧基的PEG的反应。
这一实例证明产生并入含酮的非天然编码氨基酸的hA多肽的方法，所述非天然编码氨基酸随后与约5,000MW的含氨氧基的PEG反应。使根据实例1(hA)的标准鉴别的各残基17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、574、581单独经具有如下结构的非天然编码氨基酸取代：
用于将对乙酰基-苯丙氨酸位点特异性并入hA中的序列为SEQ ID NO:1。
使包含含羰基的氨基酸的hA多肽变异体与具有如下形式的含氨氧基的PEG衍生物反应：
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2，
其中R为甲基，n为3且N为约5,000MW。另一种与hA结合的PEG衍生物具有30,000的分子量。使以10mg/mL溶解于25mM MES(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(pH6.0)、25mM Hepes(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(pH7.0)或10mM乙酸钠(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(pH4.5)中的含有对乙酰基苯丙氨酸的经纯化hA与10到100倍过量的含氨氧基的PEG反应，然后在室温下搅拌10-16小时(Jencks,W.J.Am.Chem.Soc.1959,81,第475页)。然后，将PEG-hA稀释到适当缓冲剂中以立即纯化和分析。
实例4
与由经由酰胺键与PEG连接的羟胺基组成的PEG的结合
使用实例3中所描述的程序，使具有如下结构的PEG试剂与含酮的非天然编码氨基酸偶合：
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-O-NH2，
其中R＝甲基，n＝4且N为约20,000MW。反应、纯化和分析条件是如实例3中所述。
实例5
这一实例详述将两种不同的非天然编码氨基酸引入hA多肽中。
这一实例证明产生在下列残基中的两个位置处并入包含酮官能团的非天然编码氨基酸的hA多肽的方法：E30、E74、Y103、K38、K41、K140以及K145。如实例1和2中所述来制备hA多肽，其中例外为在核酸内的两个不同位点处引入选择密码子。
实例6
这一实例详述hA多肽与含酰肼的PEG的结合和随后的当场还原。
根据实例2和3中所述的程序来制备并入含羰基的氨基酸的hA多肽。具有如下结构的含酰肼的PEG在修饰后与hA多肽结合：
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-X-NH-NH2，
其中R＝甲基，n＝2且N＝10,000MW且X为羰基(C＝O)。将含有对乙酰基苯丙氨酸的经纯化hA以0.1-10mg/mL溶解于25mM MES(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(pH 6.0)、25mM Hepes(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(pH 7.0)或10mM乙酸钠(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(pH 4.5)中，使其与1到100倍过量的含酰肼的PEG反应，且通过添加1 M NaCNBH3储备液(Sigma Chemical,St.Louis,MO)当场还原相应的腙，将其溶解于H2O中，直到最终浓度为10-50mM。在4℃到室温下，在黑暗环境中进行反应18-24小时。通过添加1 M Tris(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(pH值约为7.6)使反应中止，直到最终Tris浓度为50mM，或将反应稀释到适当缓冲剂中以立即纯化。
实例7
这一实例详述将含炔的氨基酸引入hA多肽中以及用mPEG-叠氮化物使其衍生。
使下列残基17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、574、581经以下非天然编码氨基酸取代(hA；SEQ ID NO:1)：
用于将对炔丙基-酪氨酸位点特异性并入hA中的序列为以上实例2中所述的SEQID NO:2(hA)、SEQ ID NO:3(muttRNA，詹氏甲烷球菌)和8、9或10。使含有炔丙基酪氨酸的hA多肽在大肠杆菌中表达且使用实例3中所述的条件加以纯化。
向反应混合物中添加以0.1-10mg/mL溶解于PB缓冲剂(100mM磷酸钠、0.15MNaCl(pH＝8))和10到1000倍过量的含叠氮基的PEG中的含有炔丙基-酪氨酸的经纯化hA。然后，向反应混合物中添加催化量的CuSO4和Cu线。在培育混合物(包括(但不限于)在室温下或在37℃下培育约4小时或在4℃下培育过夜)后，添加H2O且经由透析膜过滤混合物。根据包括(但不限于)实例3中所述的类似程序来分析样品的添加。
在这一实例中，PEG将具有如下结构：
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-N3，
其中R为甲基，n为4且N为10,000MW。
实例8
这一实例详述用炔丙基酪氨酸取代hA多肽中的大的疏水性氨基酸。
如实例7中所述，使hA的下列位置17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、574、581(SEQ ID NO:1)中的一个位置内存在的Phe、Trp或Tyr残基经以下非天然编码氨基酸取代：
PEG在修饰后与包含含炔的氨基酸的hA多肽变异体连接。PEG将具有如下结构：
Me-PEG(N)-O-(CH2)2-N3，
且偶合程序将遵循实例7中的程序。这将产生包含与一个天然存在的大的疏水性氨基酸大致等排的非天然编码氨基酸且在多肽内的不同位点处经PEG衍生物修饰的hA多肽变异体。
实例9
这一实例详述由一个或一个以上PEG连接子分隔开的hA多肽同源二聚物、异源二聚物、同源多聚物或异源多聚物的产生。
使实例7中所产生的含炔的hA多肽变异体与具有如下形式的双官能PEG衍生物反应：
N3-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)2-O-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)n-N3，
其中n为4且PEG具有约5,000的平均MW，以产生两个hA分子由PEG以物理方式分隔开的相应hA多肽同源二聚物。可以类似方式使hA多肽与一个或一个以上其它多肽偶合，从而形成异源二聚物、同源多聚物或异源多聚物。偶合、纯化和分析将如实例7和3中进行。
实例10
这一实例详述糖部分与hA多肽的偶合。
如实例3中所述，使下列残基17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、574、581(hA，SEQ ID NO:1)中的一个残基经以下非天然编码氨基酸取代。
包含含羰基的氨基酸的hA多肽变异体在修饰后与N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的β-连接氨氧基类似物反应。将hA多肽变异体(10mg/mL)和氨氧基糖(21mM)混合到100mM乙酸钠缓冲水溶液(pH5.5)中，且在37℃下培育7到26小时。通过在周围温度下在150mM HEPES缓冲剂(pH7.4)中将糖结合的hA多肽(5mg/ml)与UDP-半乳糖(16mM)和β-1,4-半乳糖基转移酶(0.4单位/毫升)一起培育48小时使第二种糖与第一种糖酶促偶合(Schanbacher等人,J.Biol.Chem.1970,245,5057-5061)。
实例11
hA分子直接连接的hA多肽同源二聚物、异源二聚物、同源多聚物或异源多聚物的产生
可使包含含炔的氨基酸的hA多肽变异体与包含含叠氮基的氨基酸的另一种hA多肽变异体直接偶合，各hA多肽变异体在(不限于)实例10中所述的位点处包含非天然编码氨基酸取代。这将产生两个hA多肽变异体在位点II结合界面处以物理方式连接的相应hA多肽同源二聚物。可以类似方式使hA多肽与一个或一个以上其它多肽偶合，从而形成异源二聚物、同源多聚物或异源多聚物。偶合、纯化和分析是如实例3、6和7中进行。
实例12
这一实例描述包含非天然编码氨基酸的hA与其它生物活性分子的结合。使本文实例2中所产生的hA与具有一个、两个、三个或三个以上官能团的所需生物活性分子(诸如合成肽、小有机分子、聚合物、连接子)反应，所述官能团可用于与hA或其它生物活性分子、除hA以外的蛋白质或多肽、另一种hA分子偶合，或使生物活性分子与非天然氨基酸以及在SEQ ID NO:1的位置34处与半胱氨酸连接的另一种生物活性分子结合。在允许在hA的非天然编码氨基酸的官能团与生物活性分子的互补官能团之间形成共价键的条件下，使所需生物活性分子与包含非天然编码氨基酸的hA反应。必要时，利用所属领域中已知或本文中所述的方法进一步纯化共价键结的hA和所需生物活性分子。
实例13
这一实例详述有和无非天然编码氨基酸的Fc在哺乳动物细胞中的克隆和表达。[Fc DNA在表达载体中的克隆，哺乳动物细胞的转化]SEQ ID NO:20表示野生型Fc多核苷酸序列。这一多核苷酸序列编码具有经纯化蛋白质中不存在的信号序列的人类IgG1-Fc。使这一序列中加下划线的密码子经选择密码子琥珀密码子置换，从而获得突变蛋白质。加下划线的密码子编码为成熟蛋白质的第一个氨基酸的天冬氨酸(Asp；D)氨基酸。SEQ ID NO:21表示具有信号序列的Fc的多肽序列。SEQ ID NO:22表示成熟Fc蛋白质的序列。SEQ ID NO:23表示编码成熟Fc蛋白质的多核苷酸序列。参见图8A-D。
使用包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的所引入的翻译系统来表达含有非天然编码氨基酸的Fc。O-RS优先利用非天然编码氨基酸使O-tRNA氨酰化。翻译系统又响应经编码的选择密码子将非天然编码氨基酸插入Fc中。
瞬时产生WT和D1pAF-Fc
在转染之前24小时，将CHO-S FreestyleTM细胞(第10代；Invitrogen,Carlsbad,CA)以每毫升5×105个细胞接种到300毫升FreestyleTM CHO培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。根据制造商的说明书进行转染。简单来说，将375毫升Freestyle MAXTM试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)与编码野生型(WT)Fc(415μg)的质粒或编码正交tRNA(SEQ ID NO:24)、正交tRNA合成酶(5μg)(以SEQ ID NO:25表示的编码多核苷酸序列)和Fc-D1TAG(140μg)的质粒一起培育15分钟。关于tRNA和RS序列，参见图9A和9B。非天然编码氨基酸将代替Fc序列的位置1中所存在的天冬氨酸(Asp；D)氨基酸。将DNA转染混合物添加到总计300毫升的3.2×108个细胞中。关于蛋白质从Fc-D1TAG的细胞表达，添加对乙酰基苯丙氨酸(pAF)直到最终浓度为1mM。在34℃下在8％CO2中且在100rpm下培育细胞。在转染后24小时，添加选择植物蛋白胨UF水解产物(Becton,Dickinson and Company,Franklin Lakes,New Jersey)直到最终浓度为0.1％。在转染后72小时，通过离心(10分钟，4,000rpm)收集培养物，且使用0.22μm过滤器对上清液进行过滤杀菌。
从CHO-S培养上清液纯化WT和D1pAF-Fc
将澄清的培养上清液加载到5mL HiTrap rProteinA FF预填充柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上。用10个柱体积的PBS(pH7.4)洗涤柱，接着用0.1M甘氨酸(pH3.0)洗提。用0.03体积的0.5M Tris碱中和含有Fc的洗提份，直到pH值约为7。基于SDS-PAGE分析来汇集洗提份，且用10,000分子量截断点离心装置(Amicon)浓缩所述池，且在4℃下相对于PBS(pH7.4)+10％甘油透析过夜。使用280nm下的吸光度来确定Fc浓度。用于并入对乙酰基苯丙氨酸的Fc(D1pAF)的消光系数为1.35。用于WT Fc的消光系数为1.40。N-末端测序和质谱证明pAF适当并入D1TAG的N-末端处。这一蛋白质是称为D1pAF(位置1处经pAF取代的Fc)。
5K氨氧基PEG与D1pAF-Fc的结合
将经纯化的WT-Fc和D1pAF以缓冲剂交换到结合缓冲剂(20mM乙酸钠、20g/L甘氨酸、5g/L甘露糖醇、1mM EDTA(pH4.0))中且将其浓缩到约1.5mg/mL。将样品在仅结合缓冲剂中或与最终浓度为15g/L(相对Fc单体50倍摩尔过量)的5K氨氧基聚(乙二醇)(PEG)一起培育。向所有反应中添加最终浓度为50mM的乙酸酰肼来催化结合反应。使反应在28℃下进行48小时。在24小时时，移出5μl等分试样。根据SDS PAGE分析3微克各样品。在还原和非还原条件下进行4-12％bis-tris SDS-PAGE且进行考马斯蓝染色。使用MES缓冲系统来分离还原样品，且用MOPS缓冲系统来分离非还原样品。
图7表示5K PEG与人类IgG1-Fc的氨基末端pAF残基的结合。在28℃下将经纯化的Fc(WT)和D1pAF取代的Fc(D1pAF)在存在(+)或不存在(-)5K氨氧基聚(乙二醇)(PEG)的情况下培育24或48小时。通过对SDS-PAGE分离的蛋白质进行考马斯蓝染色来分析还原(图7A)或非还原(图7B)样品。
图7A表示D1pAF+PEG与无PEG下培育的D1pAF相比展现质量移动(相应为泳道7对5)。相反，将WT Fc与5K PEG(泳道3和6)一起培育后未观察到质量移动，表明质量移动与pAF有关。非还原样品的SDS-PAGE分析证明完整Fc二聚物与分子的一个(PEG-D1pAF+D1pAF)或两个(PEG-D1pAF+PEG-D1pAF)臂结合(图7B)。染色强度指示大部分物质为双聚乙二醇化Fc二聚物(泳道7)。图(图7B)中所存在的下部条带是聚乙二醇化和未聚乙二醇化Fc单体的还原形式。
作为本文中所述的组合物、方法、技术以及策略的说明性非限制性实例，所述描述论述将大分子聚合物添加到包含非天然编码氨基酸的Fc中，同时应了解相关组合物、方法、技术以及策略也适用于(必要时利用适当修饰，且所属领域的技术人员可利用本文中的公开内容来进行)添加其它官能团(包括(但不限于)以上所列的官能团)和/或其它Fc分子。
应了解，本文中所述的实例和实施例仅出于说明性目的且将提示给所属领域的一般技术人员根据其作出的各种修饰和变化且所述修饰和变化包括在本申请文件的精神和权限和附加权利要求书的范围内。本申请文件中所引用的所有公开文献、专利、专利申请文件和/或其它文献出于所有目的以全文引用的方式并入本文中，引用的程度就如同已个別地将各个公开文献、专利案、专利申请文件和/或其它文献出于所有目的以引用的方式并入一般。

Claims (75)

1.一种hPP或hA多肽，其包含一个或一个以上非天然编码氨基酸。
2.根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一个或一个以上翻译后修饰。
3.根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述多肽与连接子、聚合物或生物活性分子连接。
4.根据权利要求3所述的hPP或hA多肽，其中所述多肽与水溶性聚合物连接。
5.根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述多肽与双官能聚合物、多官能聚合物、双官能连接子、多官能连接子或至少一个生物活性分子连接。
6.根据权利要求5所述的hPP或hA多肽，其中所述连接子或聚合物与第二种多肽连接。
7.根据权利要求6所述的hPP或hA多肽，其中所述第二种多肽为生物活性分子。
8.根据权利要求4所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
9.根据权利要求4所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物与所述hPP或hA多肽中存在的非天然编码氨基酸连接。
10.根据权利要求1所述的hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由以下残基组成的群组的位置处经取代：SEQ ID NO:1的17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、574、581。
11.根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一个或一个以上调节所述hPP或hA的至少一种生物活性的氨基酸取代、添加或缺失。
12.根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一个或一个以上增加所述hPP或hA多肽的稳定性或溶解性的氨基酸取代、添加或缺失。
13.根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一个或一个以上增加所述hPP或hA多肽在重组宿主细胞中的表达或活体外合成的所述hPP或hA多肽的氨基酸取代、添加或缺失。
14.根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一个或一个以上增加所述hPP或hA多肽的蛋白酶抗性的氨基酸取代、添加或缺失。
15.根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸与不与所述多肽中的20种常见氨基酸中的任一种反应的连接子、聚合物或生物活性分子反应。
16.根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
17.根据权利要求16所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基。
18.根据权利要求17所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有如下结构：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2为H、烷基、芳基、经取代烷基以及经取代芳基；且R3为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R4为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。
19.根据权利要求16所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含氨氧基。
20.根据权利要求16所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含酰肼基。
21.根据权利要求16所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含肼基。
22.根据权利要求16所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基。
23.根据权利要求16所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸残基包含叠氮基。
24.根据权利要求23所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有如下结构：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。
25.根据权利要求16所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含炔基。
26.根据权利要求25所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有如下结构：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。
27.根据权利要求4所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物具有约0.1kDa与约100kDa之间的分子量。
28.根据权利要求27所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物具有约0.1kDa与约50kDa之间的分子量。
29.根据权利要求4所述的hPP或hA多肽，其是通过使包含含羰基的氨基酸的hPP或hA多肽与包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的水溶性聚合物反应来制备。
30.根据权利要求29所述的hPP或hA多肽，其中所述氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基通过酰胺键与所述水溶性聚合物连接。
31.根据权利要求4所述的hPP或hA多肽，其是通过使包含羰基的水溶性聚合物与包含包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的非天然编码氨基酸的多肽反应来制备。
32.根据权利要求4所述的hPP或hA多肽，其是通过使包含含炔的氨基酸的hPP或hA多肽与包含叠氮部分的水溶性聚合物反应来制备。
33.根据权利要求4所述的hPP或hA多肽，其是通过使包含含叠氮基的氨基酸的hPP或hA多肽与包含炔部分的水溶性聚合物反应来制备。
34.根据权利要求17所述的hPP或hA多肽，其中所述叠氮基或炔基通过酰胺键与水溶性聚合物连接。
35.根据权利要求4所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物为分支或多臂聚合物。
36.根据权利要求35所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物的各分支具有约1kDa与约100kDa之间的分子量。
37.根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含糖部分。
38.根据权利要求3所述的hPP或hA多肽，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子经由糖部分与所述多肽连接。
39.一种编码SEQ ID NO:1中所述的氨基酸序列的经分离多核苷酸分子，其包含选择密码子，其中所述选择密码子是选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子(opal codon)、独特密码子、稀有密码子以及四个碱基的密码子组成的群组。
40.一种制备根据权利要求3所述的hPP或hA多肽的方法，所述方法包含使包含非天然编码氨基酸的经分离hPP或hA多肽与包含与所述非天然编码氨基酸反应的部分的连接子、聚合物或生物活性分子接触。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚(乙二醇)组成的群组的部分。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
43.根据权利要求40所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基部分且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含氨氧基、肼、酰肼和氨基脲部分。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分通过酰胺键与所述连接子、聚合物或生物活性分子连接。
45.根据权利要求40所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含炔部分且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含叠氮部分。
46.根据权利要求40所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含叠氮部分且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含炔部分。
47.根据权利要求41所述的方法，其中所述叠氮部分或炔部分通过酰胺键与连接子、聚合物或生物活性分子连接。
48.根据权利要求41所述的方法，其中所述聚(乙二醇)部分具有约0.1kDa与约100kDa之间的平均分子量。
49.根据权利要求41所述的方法，其中所述聚(乙二醇)部分为分支或多臂聚合物。
50.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的hPP或hA多肽和医药学上可接受的载剂。
51.根据权利要求50所述的组合物，其中所述非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。
52.一种治疗患有由hPP或hA调节的病症的患者的方法，所述方法包含向所述患者给予治疗有效量的根据权利要求50所述的组合物。
53.一种细胞，其包含根据权利要求39所述的核酸。
54.根据权利要求53所述的细胞，其中所述细胞包含正交tRNA合成酶或正交tRNA。
55.一种制备包含非天然编码氨基酸的hPP或hA多肽的方法，所述方法包含在允许所述包含非天然编码氨基酸的hPP或hA多肽表达的条件下培养包含一种或一种以上编码hPP或hA多肽的包含选择密码子、正交RNA合成酶和正交tRNA的多核苷酸的细胞；和纯化所述hPP或hA多肽。
56.一种调节hPP或hA多肽的血清半衰期或循环时间的方法，所述方法包含用一个或一个以上非天然编码氨基酸取代所述hPP或hA多肽中的任何一个或一个以上天然存在氨基酸。
57.一种由具有SEQ ID NO:1中所示的序列的多核苷酸编码的hPP或hA多肽，其中所述多核苷酸包含选择密码子且其中所述多肽包含至少一种非天然编码氨基酸。
58.根据权利要求57所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸与连接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子连接。
59.根据权利要求58所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
60.根据权利要求57所述的hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自由以下残基组成的群组的位置处经取代：SEQ ID NO:1的17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、574、581和其任何组合。
61.根据权利要求57所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
62.根据权利要求59所述的hPP或hA多肽，其中所述聚(乙二醇)部分具有约0.1kDa与约100kDa之间的分子量。
63.根据权利要求59所述的hPP或hA多肽，其中所述聚(乙二醇)部分为分支或多臂聚合物。
64.根据权利要求63所述的hPP或hA多肽，其中所述聚(乙二醇)部分具有约1kDa与约100kDa之间的分子量。
65.一种组合物，其包含根据权利要求57所述的hPP或hA多肽和医药学上可接受的载剂。
66.一种hPP或hA多肽，其包含一个或一个以上增加所述hPP或hA多肽在重组宿主细胞中的表达的氨基酸取代、添加或缺失。
67.一种包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸与选自由小有机分子、以化学方式合成的肽、用核糖体合成的多肽、聚合物和连接子组成的群组的分子键结。
68.一种hPP或hA多肽，其包含在单个氨基酸处通过共价键与所述hPP或hA多肽连接的水溶性聚合物。
69.根据权利要求68所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
70.根据权利要求68所述的hPP或hA多肽，其中所述与所述水溶性聚合物共价连接的氨基酸为非天然编码氨基酸。
71.根据权利要求70所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在选自如下群组的位置处经取代：对应于SEQ ID NO:1的17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、574、581。
72.一种包含至少一个连接子、聚合物或生物活性分子的hPP或hA多肽，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子通过经核糖体并入所述多肽中的非天然编码氨基酸的官能团与所述多肽连接。
73.根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一个或一个以上调节所述hPP或hA多肽的免疫原性的氨基酸取代、添加或缺失。
74.根据权利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一个或一个以上调节生物活性分子的血清半衰期或循环时间的氨基酸取代、添加或缺失。
75.一种调节生物活性分子的免疫原性的方法，所述方法包含用一个或一个以上非天然编码氨基酸取代所述hPP或hA多肽中的任何一个或一个以上天然存在氨基酸。
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