CN1057672A - 通过增加电泳沉积固定生物分子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了在导电底物上固定生物分子的方
法。
Description
本发明涉及在导电底物上固定生物分子的方法,更具体地说,本发明涉及的方法是先将生物分子(例如酶和抗体)电沉积在导电底物上,然后将该生物分子进行化学交联,形成不溶于水的物质。
生物分子在分析或工业上的广泛应用需要将生物分子固定在底物上。这种固定一般是通过至少将若干分子附加到不溶于水的物理载体物质上,将溶于水的生物分子(例如酶或抗体)转化为不溶于水的复合物。按此固定的生物分子通常能够应用于许多方面,但并不改变其浓度或活性。这种固定的另一个优点在于该生物分子能够仅仅保持在装置或传感器的特定所需的部位,使物质消耗降至最低程度,但可最大限度地检测生物活性。
固定的生物分子,例如酶、抗体或糖蛋白(如外源凝集素)的一个重要的分析应用是在生理配体与固定的生物分子作用后,用于检测所选择的生理分子的存在或浓度的生物传感器。令人遗憾的是将已知固定技术与按常规的半导体技术制造的微型电化学生物传感器结合使用时困难颇多。现有半导体技术所制造的传感器,其表面积仅为1.0μm2。由于所制造的生物传感器通常都要求生物分子仅仅沉积在用于监测酶反应产物的工作电极的表面上,因此这样小的面积尺寸表示在传感器制造方面存在着种种困难。沉积在生物传感器的其他面积上的生物分子发生的反应,产生了不能检测到的产物,从而经常损失了昂贵的生物分子。
解决沉积生物分子方面存在的上述问题的一个方法决定于推动带电生物分子(例如蛋白、两性分子的脂类或核酸)的移动。在适当的介质中,这类生物分子含有与产生电场的相反电极相连接的正电荷部分或负电荷部分。因此如果在介质中提供两个电极之间的电势位,则可推动介质中所含生物分子的移动和促使在具有与带电分子相反的电极上的沉积。
举例来说,Ikariyama等所使用的电泳沉淀技术(J.Electrochem.Soc.136(6),PP.702-706,1989)。该方法加速了铂粒和葡萄糖氧化酶的一起沉积。由于pH低于葡萄糖氧化酶的等电点4.3,所以在产生镀铂作用的pH时,其具有净正电荷。因此,仅仅用铂离子使葡萄糖氧化酶被吸引到相反电荷的电极上。为了增加已被沉积的酶的稳定性,将传感器浸没在清蛋白和甘油醛的溶液中,使与分子交联。然而由于用以加速酶沉淀所用pH值相当低,该技术能导致酶的失活。
Aizawa等报导了电沉淀葡萄糖氧化酶技术的研究(J.Chem.Soc.Japan(Nippon Kagaku Kaishi),11,pp.2210-2213,1987)。在控制水溶液电位的情况下,葡萄糖氧化酶吸附在铂电极表面上,最佳的沉积条件为0.1伏,Ag/AgCl和pH3。采用该方法获得的最大厚度为4分子层的葡萄糖氧化酶,约等于56×10-9m葡萄糖氧化酶的最大厚度。在pH为3-9的范围内,该技术得到的最佳沉积是在pH3。对要求在反应中配体与生物分子的反应不受速率限制因素的许多目的来说,该技术所得到的超薄沉积层并不适用,其另一个缺点是寿命有限,并且这样薄的固定分子层没有实用意义。
因此,本发明的目的之一是提供在导电底物上沉积和固定较厚层的生物分子的方法,使配体与生物分子的作用不受速率限制。
本发明的目的之二是提供在微型电子传感器上能重现的精确的沉积和固定生物分子的方法。
本发明的目的之三是提供在导电底物上同时沉积和固定大量不同的生物分子的方法。
本发明的目的之四是提供层厚为10-8-10-5m的沉积和固定生物分子的方法。
制备具有由所需种类的生物分子涂覆的导电底物的生物传感电极的方法,包括制备至少一种用于沉积的生物分子的溶液,该溶液是在足以防止生物分子变性并且使用于沉积的不同等电点的各种生物分子都具有相同净电荷符号的范围内经过缓冲的。生物传感电极和反电极都浸没在溶液中,提供电极之间的100毫伏至1伏的电位差,从而产生电流。通过计算使电位随时间而改变,在电极之间保持基本稳定的电流,使生物分子能够移动并沉积在生物传感电极上。在生物传感电极上沉积至所需厚度的生物分子后,通过与适当的交联剂交联可以提高沉积的生物分子膜的稳定性。
在较佳的实施例中,含生物分子的溶液是水溶液,生物传感电极和反电极之间的电流选为5mA/cm2左右。在沉积过程中,将电压调高,使电流保持稳定,不受由于生物分子膜的沉积引起生物传感电极电阻增加的影响。沉积持续到膜的平均厚度比生物传感电极高5微米以上。
本发明的优点之一是其可广泛应用于具有不同几何形状的导电底物。由于生物分子的沉积是以电泳为基础,所以生物分子能够沉积在实际为各种形状或构形的任何导体或半导体上。例如,非常粗糙的导体表面可以均匀地覆盖生物分子膜,或在导体材料的内侧(例如铂管)很容易涂覆生物分子,并且将其插入到用于分析的流动的液流系统中。与许多其他膜沉积技术不同,生物分子的沉积局限于这种电泳技术,所需生物分子仅仅沉积在导体底物附近。
本发明的优点之二在于能够沉积在生物传感电极上的生物分子层较厚。许多生理测定包括较大数量的需要检测特定生理配体和沉积在生物传感电极上的生物分子间的作用。非常薄的单分子薄膜或厚度小于1微米的薄膜可以发生生理配体和生物分子间的作用,但由于用于反应的生物分子的量很少,所以速率受到限制,降低了传感器的敏感度,产生了生物分子和配体间的非线性作用函数,使测定溶液中的配体数量造成困难。
本发明的优点之三是由在生物传感电极上的沉积过程中采用稳定电流产生的。即使生物分子的沉积封阻了电极表面并且极大地提高了电阻,也能在生物传感电极上稳定地沉积生物分子。由于在整个沉积过程中生物传感电极的电阻的提高,如果不逐步提高电压,那么电流和生物分子沉积的速率则会降低。沉积速率的减低可以持续到不再沉积,即使沉积的薄膜远低于所要求的厚度。与此相反,本发明能够保持稳定的电流,并使电压随着电阻的增加而增加,以至所达到的电压值能使水还原或氧化,形成气泡,从而加速形成厚度为10微米以上的薄膜。
本发明的优点之四在于其所采用的pH值与形成生物分子的生理pH值相一致。非常厚的蛋白质生物分子(例如酶)膜能够在生理pH值(7.4)的水溶液中沉积,将酶的失活和变性问题减至最低限度,这与沉积酶膜的其他方法不能相比。
对本领域专业人员来说,通过对以下列举的实施本发明最佳方式的实施例所作的详细说明,显然可以看到本发明的其他特征和优点。
图1是在浸没在含有所需生物分子的水流体中的生物传感电极上电沉积生物分子的装置。
如图1所示,电沉积装置10适宜于实施本发明方法。装置10包括具有能装载液体30的形状的容器12。液体30可以是含有所需种类的生物分子的溶液或悬浮液。电源14供应两个电极20和22之间的基本稳定的电流,该电源具有与生物传感电极22相连接的阳极导线16和与反电极20相连接的阴极导线18。生物传感电极22构成包括生物传感电极22和非导电底物24的生物传感装置25。导线16和18是由能防止浸没在液体30中导电的非导电材料加以绝缘的。
如果需要,可通过变换连接,即将导线16和18与电源14连接,使导线16带负电,导线18带正电,从而能使电流方向相反。由于导线16和18都是绝缘的,并且生物传感电极周围的底物24是由非导电材料构成的,所以液体30中所含各种生物分子仅沉积在电荷与液体30中的生物分子相反的电极20或22上。
适宜于沉积在电极20或22的生物分子包括但不限于下列天然的或人工合成的能够作为生物体系的组分存在的分子或与之连接的分子基团,例如肽,寡肽,蛋白质,脱辅基蛋白,糖蛋白,抗原和抗体,抗体片段,半抗原和抗体,受体和其他膜蛋白,至少一个非肽链锁取代肽链锁的蛋白类似物,酶和酶前体,辅酶,酶抑制剂,氨基酸及其衍生物,激素,脂类,磷脂,糖脂,脂质体,核苷酸,寡核苷酸,多核苷酸,以及它们在专业领域上公认的和具有生物功能的类似物和衍生物,包括:甲基化多核苷酸和具有硫代磷酸酯链锁的核苷酸类似物;质粒,装配质粒,人工合成染色体,其他核酸载体;反义多核苷酸,包括基本上与一个内源性核酸互补的多核苷酸或具有与至少经过选择的病毒或还原病毒基因组部份意义相反的顺序的多核苷酸;以及其他任何生物活性分子。上述任何生物分子在装置10中占优势的条件下,具有弱极性或无极性或能诱导极性,它们能与适当的带电载体共价结合,形成能在电极20或22上沉积的带电复合物。
根据液体30的组分,采用本领域公认的技术,上述各类生物分子或其任意结合都能以胶态颗粒形式置于溶液或悬浮液中。一般说来,液体30是能够导电的水溶液,例如生理盐水。其他添加剂,例如非离子表面活性剂和抗泡沫剂,按需要也可加入到溶液中。
方向、移动速度和溶液或悬浮在液体30中的生物分子在电极20和22上的存积速率,通过适当调整液体30的pH值,都能非常灵敏地予以控制。这种控制依据可用于永久带电荷部分的常规电泳技术,该带电荷部分按液体30的pH值,使液体30中的生物分子具有净电荷。分子为0净负电荷,从而在电场影响下不发生移动的pH值被定义为它们的等电点。在pH大于等电点时,该分子具有净负电荷;反之,在pH低于等电点时,该分子具有净正电荷。因此,在附图所示的装置中,可将液体30的pH调整到大于或小于有待沉积在电极20或22上的所需生物分子的等电点。这种调整可按需要,使用已知酸或碱试剂。
关于交联剂,可以与所需生物分子同时加入到溶液中,也可以在沉积到电极20或22以后再加入。交联剂用于加速基本上不溶于水的沉积在电极上的物质的形成。交联剂通常包括能够与所需生物分子共价结合的多官能桥基,但也可包括能够加速没有桥基的生物分子间共价结合的辐射试剂或其他试剂。所用交联剂的种类视被沉积的具体生物分子而异,但可包括硅烷剂,烷基胺偶合剂,异硫氰酸盐偶合剂,三嗪偶合剂,偶氮偶合剂,苯肼偶合剂,碳化二亚胺偶合剂和酰基氯偶合剂。本发明特别可使用戊二醛,虽然其他的化学偶合剂也可用作二价交联剂,例如:
4-叠氮苯甲酰甲基溴;
二苯酮-3,3′,4,4′-四甲酸二酐;
生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯;
生物素4-硝基苯酯;
2,2′-二喹诺酮-4,4′-二甲酸;
二(4-氟-3-硝基苯)砜;
1,5-二(琥珀酰亚胺基氧羰基氧)戊烷;
4-(BOC-氨基甲基)苯基异硫氰酸酯;
N-BOC-1,6-二氨基-己烷盐酸盐;
溴丙酮酸;
氰尿酰氯;
4,4′-二叠氮芪-2,2′-二磺酸钠盐;
二亚乙基三胺-丙乙酸二酐;
焦碳酸二亚乙酯;
1,5-二氟-2,4-二硝基苯;
1,6-二异氰基己烷;
4,4′-二异硫氰酸芪-2,2′-二磺酸二钠盐;
己二酸二甲酯二盐酸盐;
N-(二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳化二亚胺盐酸盐;
3,3′-二硫丙亚胺酸二甲酯二盐酸盐;
庚二亚酸二甲酯三盐酸盐;
辛二亚胺酸二甲酯二盐酸盐;
3,3′-二硫二丙酸二(N-羟基琥珀酰亚胺酯);
4-氟-3-硝基苯基叠氮化物;
甲醛;
富马腈;
戊二醛;
戊二腈;
乙醇醛;
1,6-己二异氰酸酯;
6-羟基-2-萘基二硫化物;
3-(4-羟苯基)丙酸;
N-羟基琥珀酰亚胺酯;
2-亚氨基硫烷盐酸盐;
4-顺丁烯二酰亚胺基丁酰胺甲基-聚苯乙烯;
N,N′-(1,4-亚苯基)马来酰亚胺;
聚乙二醇600二酸;
N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶硫基)丙酸酯;
3-顺丁烯二酰亚胺苯甲酸-N-琥珀酰亚胺酯;
4-顺丁烯二酰亚胺丁酸-N-琥珀酰亚胺;
6-顺丁烯二酰亚胺己酸-N-琥珀酰亚胺;
3-顺丁烯二酰亚胺丙酸-N-琥珀酰亚胺;
硫二甘醇;
甲代亚苯基-2,4-二异氰酸酯;
二异氰酸间亚二甲苯酯。
按本发明方法制备的生物传感电极可广泛用于各种分子检测系统,包括电流测定用的电化学生物传感器,热量测定,声音测定,电势测定,光学测定和ISFET生物传感器。
为了更好地说明本发明的某些特征,下列实施例将予以说明。
实施例1
使用磷酸盐缓冲盐水溶液(pH7.4)作为溶剂,制备5%(重量)的葡萄糖氧化酶溶液。随着缓慢搅拌,将葡萄糖氧化酶小心地溶解于盐水溶液,搅拌时注意防止溶液发泡,导致葡萄糖氧化酶变性。将电沉积池装满该溶液,并将装载着待沉积的酶的生物传感电极(仅用反电极)浸没在池中,再将其与检流计联接。在电极表面保持5mA/cm2的恒定电流密度。电流的方向应在电极表面产生净正电荷,以吸引带负电荷的葡萄糖氧化酶分子。通电流2分钟。在整个沉积过程中,施加的电压不超过0.5伏。然后从酶溶液中移去电极,再将该电极浸没在去离子的蒸馏水中5秒种,不需要搅拌,除去残余的葡萄糖氧化酶。
将电极浸没在含2.5%(体积)戊二醛的磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)的溶液中30分钟,使葡萄糖分子一起共价交联,形成不溶于水的物质。再将电极浸没在去离子的蒸馏水中5秒钟,然后在空气中干燥30分钟。
检查电极,沉积在该电极上的葡萄糖氧化酶层在干燥后,其厚度约为1.5μm。然后进行检定,证明戊二醛交联有效地防止了葡萄糖氧化酶返回到溶液中。此外,还证明生物传感器的酶组分在这一点上是起作用的。
实施例2
在电极表面上共同沉积两种或两种以上的生物分子也是可能的,只要它们的等电点都高于或低于沉积溶液的pH值。在这个实施例中,制备了含5%(重量)葡萄糖氧化酶和5%(重量)清蛋白的磷酸盐缓冲盐水溶液(pH7.4)。葡萄糖氧化酶和清蛋白的等电点分别为4.3和4.7,在pH7.4溶液中两种分子都具有负电荷。用于电极的电流密度为5mA/cm,时间2分钟,同时浸没在葡萄糖氧化酶/清蛋白溶液中。按实施例1所述,分子在戊二醛溶液中交联后,冲洗,干燥。生成的葡萄糖氧化酶/清蛋白层约厚5μm。葡萄糖氧化酶活性经过长期测定,证明葡萄糖氧化酶/清蛋白层比实施例1中形成的仅葡萄糖氧化酶层更为稳定。
实施例3
采用硼酸缓冲溶液(pH9.0)作为溶剂,制备2.4mg/ml兔抗荧光抗体(亲和纯化)溶液。所选择的pH值能保持抗体结合活性达到最大限度。电沉积池装满该溶液,并将装载着待沉积抗体的生物传感电极(仅用反电极)浸没在池中,再将其与检流计联接。在电极表面保持5mA/cm2的恒定电流密度。电流的方向应在电极表面产生净负电荷,以吸引带正电荷的抗体分子。通电流50分种。然后从抗体溶液中移去电极,再将该电极浸没在去离子的蒸馏水中5秒种,不需要搅拌,以除去残余的抗体。
将电极浸没在含2.5%(体积)戊二醛的磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)的溶液中30分钟,使抗体分子一起共价交联,形成不溶于水的物质。再将电极浸没在去离子的蒸馏水中5秒钟,然后在空气中干燥30分钟。检查电极,沉积在该电极上的抗体层在干燥后,其厚度约为5.5μm。
虽然结合实施例对本发明已经作了详细介绍,但如权利要求中所介绍和限定的,对本发明进行改变和改进均属本发明的范围。
Claims (8)
1、制备具有生物分子组分的生物传感电极的方法,该方法包括:
制备用于沉积的至少一种生物分子的溶液,该溶液是在足以防止生物分子变性并由于它们各自不同的等电点,使各种用于沉积的生物分子都具有相同净电荷符号的范围内经过缓冲的;
将所述生物传感电极和反电极都浸没在溶液中;
通过选择随时间改变的电势,使用生物传感电极与反电极之间的可变电势小于1伏,以提供电极之间足以使用于沉积的生物分子向所述生物传感电极移动并积累在该电极上的基本稳定的电流。
2、按权利要求1的方法,该方法还包括保持电极之间基本稳定的电流,其保持时间应足以使积累在生物传感电极上的生物分子薄膜具有平均薄膜厚度大于1.0微米。
3、按权利要求2的方法,该方法进一步包括将生物传感电极和已经积累的沉积物加入到含有一定量的交联剂的溶液中,并且以足够的时间使生物分子一起交联,在生物传感电极上形成不溶于水的物质。
4、按权利要求1的方法,其中制备步骤包括制备含有需要沉积的蛋白质的溶液。
5、按权利要求4的方法,其中所述蛋白质是酶。
6、按权利要求4的方法,其中所述蛋白质是抗体。
7、制备含有蛋白质组分的生物传感电极的方法,该方法包括:
制备用于沉积的至少一种蛋白质的溶液,该溶液是在足以防止蛋白质变性的范围内进行缓冲;
将所述生物传感电极和反电极都浸没在溶液中;
通过选择随时间改变的电势,使用生物传感电极与反电极之间的可变电势小于1伏,以提供电极之间足以使用于沉积的生物分子向所述生物传感电极移动并积累在该电极上的基本稳定的电流。
将所述已经沉积在生物传感电极上的积累物与交联剂交联,在生物传感电极上形成不溶于水的物质。
8、制备酶生物传感器的方法,该方法包括:
制备用于沉积在生物传感电极上的葡萄糖氧化酶溶液;
将所述生物传感电极和反电极都浸没在溶液中;
通过选择随时间改变的电势,使用生物传感电极与反电极之间的可变电势小于1伏,以提供电极之间足以使用于沉积的葡萄糖氧化酶向所述生物传感电极移动并积累在该电极上大于10微米膜的基本稳定的电流。
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