CN1059562A

CN1059562A - 减少扩增过程中载带污染的方法

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Publication number: CN1059562A
Application number: CN91103775A
Authority: CN
Inventors: 罗德尼·M·理查德斯; 西奥多·琼斯; 戴维·L·斯尼特曼; 格雷戈里·S·布朗
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1990-05-01
Filing date: 1991-04-30
Publication date: 1992-03-18
Also published as: NO915136L; EP0481069A4; NO915136D0; PT97534B; BR9105737A; FI98932B; PT97534A; HU218095B; CA2063432A1; US5427929A; FI916171A0; US6037152A; WO1991017270A1; AU636499B2; JPH04506906A; IL97981A0; AU7987191A; IE911456A1; EP0481069A1; NO305962B1

Abstract

本发明提供了一种有效且经济的方法，该方法可用于降低扩增过程中的载带污染，本发明的方法通过向扩增产物中引入至少一种修饰物从而可以降低或消除由污染的扩增产物产生的背景值。经过修饰的扩增产物很容易与测试试样中的靶序列区分开。在将新测试试样中的靶序列扩增之前，可以对该试样进行处理，以选择性地除去该污染扩增产物，从而使之不能在新测试试样中扩增。

Description

诊断分析通常用来检测取自病人或其他主体的测试试样中存在的分析物和/或该分析物的量。典型的分析物包括抗原及抗体，它们可用免疫诊断技术进行测定，以鉴别某些疾病状态及各种类型的非疾病状态如妊娠。在大多数诊断分析中，达到高度敏感性及特异性是尤为重要的，这一点在所需的分析物以较低浓度存在时尤为重要。能使免疫诊断过程获得较高敏感性的各种改进方案，包括：在分析程序中使用单克隆抗体以及采用在这些分析过程中引入作为标志物的扩增信号的方法。

最近，分子生物学领域内的进展使得人们可以用一种称为探针诊断法的已知技术检测测试试样中特定的核酸序列。在探针诊断方法中，通过利用一个核酸序列与试样中它的互补核酸靶分析物进行特异性结合而探测该试样。这种技术使人们可以检测早期的病症，因为该核酸遗传物质常常在用于使该核酸靶转译成抗原的足够长时间之前数月，甚至数年就出现在测试试样中，这一点在某些性传递性疾病，如人体免疫缺陷病毒感染中尤为确实。Ranki等人，The Lancet，85（59）589-593（1987），除了检测各种疾病及遗传性失调症之外，利用探针诊断术也可以鉴别某些特定基因的存在以获得其它有关的遗传信息，如存在的编码负责移植排斥的抗原的基因，以及用于肿瘤及致癌基因检测和法医学中的遗传信息。

就其全部潜力而言，从理论上说，探针诊断可检测测试试样中小到一个分子的分子，阻止探针诊断术发挥其全部潜力的一个主要障碍是在检测测试试样中存在的通常为极微量的靶序列时所遇到的固有的困难。因此，为了提高探针诊断术的敏感度，最近人们一直围绕扩增靶核酸序列的方法而进行艰难尝试。靶序列的扩增过程可以利用许多种方法之一实现，这些方法包括将给定的DNA或RNA靶核酸序列重复再生或复制，根据所用的特定方法，使之呈线性或指数倍数扩增。

常用于制备多个拷贝数的核酸序列的早期方法包括将靶核酸序列克隆到合适的宿主细胞系统中。这些方法使用传统的克隆方法，其中将所需的核酸插入到一种合适的载体中，然后用该载体转化宿主。当该宿主经过培养生长时，载体得到复制，从而产生了所需要的核酸序列的其余拷贝。插入到载体中的靶核酸序列可以是自然存在的也可以是人工合成的。换句话说，可以在体外合成所需要的靶核酸序列，然后插入到可以通过生长而扩增的载体中，如美国专利No.4，293，652所述。

美国专利No.4，683，195和4，683，202中公开了一种通常称之为聚合酶链反应（PCR）的自动化方法，该方法可用于扩增测试试样中靶核酸序列的数量。PCR扩增过程采用两种寡聚核苷酸引物，这两种引物与靶序列片段的相对链的末端的不同部分相互补。在这些引物与靶杂交以后，在DNA聚合酶和过量三磷酸核苷存在下形成与靶序列互补的延伸产物，这些引物的定向应使由聚合酶进行的DNA合成在位于引物之间区域的对面进行且从头至尾经过该区域。然后将杂交后的延伸产物从靶中变性并重复此循环过程，在后面的扩增循环中延伸产物也可作为形成其余延伸产物的模板，连续循环扩增，直到产生足够量的靶核酸序列，从而可以在所选择的测定方法中获得可检测的信号。每一次成功的循环理论上将使前次循环所合成的核酸量增加一倍，结果使扩增产物呈指数增长。

国际专利申请No.89/02649描述了一种不同类型的自动化扩增方法。在这种类型的扩增过程中，预先合成的扩增探针对相连接杂交到一段靶序列上。然后将接触端连接，从而形成互补的扩增产物。连接之后，通过加热变性将产生的扩增产物与靶分离。用此靶和以产生的扩增产物作为后面循环过程的探针的模板而重复上述步骤，直到有足够量的靶核酸序列产生，而使在所选择的分析过程中获得可检测的信号。与用PCR法一样，每一次成功的循环理论上将使前一循环产生的核酸量增加一倍。通常将使用了预合成探针的扩增方法称为连接酶链反应（LCR）法，尽管可用不同于连接酶作用的其它方法，如化学或光化学连接使这些探针接合。

通过能对测试试样中极少量的核酸序列进行检测，核酸扩增法已彻底改革了探针诊断术，但它们在常规的诊断分析中也产生了它们自身的问题，即由于载带污染而产生一种假阳性，核酸分析物重复扩增至其在测试试样中正常浓度的数百万倍或数十亿倍，这将提高来自含有已扩增靶的新试样发生载带污染的可能性。换言之，这将在以后的测试试样中人为地产生强信号，包括阴性试样受污染时呈现假阳性。

出现载带污染的原因可能是试样到试样之间的机械载带或空气产生的污染。空气产生的污染是不可避免的，因为含有扩增试样的反应容器由于某种原因，例如为了加入试剂或对扩增的分析物进行取样检测时需打开。仅这种行为将会使数百万个扩增产物分子吸入到空气中，从而以每立方英寸数百个分子的量污染正常的实验工作区。虽然，不管操作人员（S）是多么的细心，人们仍不能完全防止由于与这些空气产生的拷贝接触而污染其它的标本样品。

下列用于处理因扩增靶序列而产生的污染问题的技术，尽管人们建议将它用于PCR型扩增过程中，但这些方法通常也适用于其它类型的扩增过程：（1）扩增前及扩增后试样的物理分隔（如分隔室）;（2）离析贮存的和等分试样试剂;（3）使用阳性移液管;（4）细心的实验室技术;以及（5）谨慎地选择对照物（Amplifications-A forum for PCR Users，2，4（1989）。然而，这些手段不仅费钱并且假定是处于最理想的条件。此外，即使很严格地操作这些昂贵的技术，这些预防措施仍不能彻底地消除污染问题。由实验工作人员（他们的身体上及服装上不可避免地携带污染物）以及由污染的空气通过空气管道从一个房间到另一个房间的循环，均将产生固有的困难。Kitchin，Nature，344，201（1990）。

有人已经提出用紫外光线处理试剂，以控制PCR型扩增过程中污染的扩增产物，这种建议是基于已知紫外光线能够破坏DNA的完整性。虽然这种作用的机理尚不清楚，但已经证明用紫外光线进行辐射，可以破坏在缓冲液中以及在引物、dNTP和Taq聚合酶制剂中的由PCR法产生的污染扩增产物。Sarkar等人，Nature，343，27（1990）。虽然单链PCR引物明显地能从这种处理中幸存下来，但双链的LCR探针对似乎对辐射处理更敏感，且可能会遭到破坏。此外，紫外光线辐射处理不能直接用于未检测的测试试样，这是因为这种辐射处理将破坏双链靶分子。

本发明的一个目的是提供一种价廉有效的方法，用于明显地降低在诊断探针分析中利用扩增步骤而发生的载带污染。本发明又一目的是提供一种减少污染的方法，该方法既易于实施又可适用于多种不同类型的扩增过程。

本发明提供了一种减少扩增过程中扩增产物污染的有效且经济的方法。通过修饰扩增产物，从而使修饰后的扩增产物与靶序列有区别，由此可以实施本发明的方法。在将新的测试试样中的靶核酸序列扩增之前，先用合适的方式处理这种新试样，以选择性地除去，破坏或由此使经过修饰的污染扩增产物失活，从而使之不能在后面的扩增过程中扩增，这种处理方式将减少载带污染以及由这类污染产生的假阳性，但不会影响自然存在的靶序列的含量。附图简述：

图1表示用配位基修饰由LCR产生的扩增产物的过程以及随后用固定化的特异性结合配偶体除去经过修饰的扩增产物。

图2表示用配位基修饰由PCR产生的扩增产物的过程以及随后用固定化的特异性结合配偶体除去经过修饰的扩增产物。

图3表示用交联剂修饰由LCR产生的扩增产物以及随后对经过修饰的扩增产物进行不可逆的交联。

图4表示用交联剂修饰PCR产生的扩增产物以及随后对经过修饰的扩增产物进行不可逆交联。

图5表示用限制性位点修饰由LCR产生的扩增产物以及随后用限制性内切酶切割经过修饰的扩增产物。

图6表示用限制性位点修饰由PCR产生的扩增产物以及随后用限制性内切酶切割经过修饰的扩增产物。

图7表示对一部分已经用限制性内切酶裂解的由限制性位点修饰的PCR扩增产物进行部分引发。

图8表示限制性位点修饰由PCR产生的扩增产物以及随后用远距离切割型限制性内切酶切割经过修饰的扩增产物。

图9表示对由LCR产生的扩增产物进行的限制性位点修饰过程以及随后用远距离切割型限制性内切酶裂解经过修饰的扩增产物。

图10表示插入了一个可用化学方法裂解的位点的寡聚核苷酸扩增探针或引物的制备过程。

图11表示来自实施例1和2的扩增序列，扩增探针，产生的扩增产物以及检测探针。

图12是一张放射自显影照片，它表示在用限制性内切酶处理靶序列及修饰后的扩增产物以后，靶及限制性内切酶修饰型扩增产物的相对扩增效率。

图13表示在实施例3中用于估评远距离切割型限制性内切酶的多位点DNA。

图14是一张放射自显影相片，它表示各种远距离切割型限制性内切酶作用多位点DNA时的相对切割效率。

图15表示对由PCR产生的扩增产物进行的双限制性位点修饰过程以及随后用远距离切割型限制性内切酶切割经过修饰的扩增产物。

图16表示实施例4涉及的含147个碱基对的扩增序列（包含于pUC9中），相应的经过修饰的和未经修饰的PCR扩增引物，以及一种检测引物。

图17是一张放射自显影相片，它表示用经过修饰的和未经修饰的引物进行的PCR扩增过程的相对效率，以及经过处理的修饰型扩增产物不能作为后面扩增过程中的模板的情况，如实施例4.B及4.C中所述。

图18是一张放射自显影图，它表示通过用相应的切割剂处理可有效地破坏修饰型PCR-扩增产物。如实施例4.C中所述。

图19表示在含有两种远距离切割型限制性位点修饰的PCR扩增产物上进行单一和双重切割得到的产物。

图20表示在实施例5中使用的一种含162个碱基对的HIV扩增序列，相应的经过修饰的扩增引物以及一种检测引物。

图21是一张放射自显影图，显示由PCR产生的经过修饰的扩增产物的形成及定量情况，如实施例5.A所述。

图22是一张放射自显影图，它表示“扩增前”有效破坏在PCR型扩增过程中载带污染物情况，如实施例5.B中所述。

图23表示在实施例6中使用的一种含75个碱基对的HIV扩增序列，两种核糖核苷酸修饰型PCR扩增引物，以及一种检测引物。

图24是一张放射自显影图，它表示利用在各自的3′-末端上含有单个核糖核苷酸取代物的各种PCR引物而进行的PCR扩增过程，如实施例6.A中所述。

图25是一张放射自显影图，它表示通过与标准物相比而定量测定经核糖核苷酸修饰的PCR-扩增产物，如实施例6.A中所述。

图26是一张放射自显影图，它表示用RNA酶A作为切割剂定量破坏经过核糖核苷酸修饰的PCR-扩增产物，如实施例6.B中所述。

图27是一张放射自显影图，它表示利用强碱作为切割剂，对经过核糖核苷酸修饰的PCR-扩增产物进行有效的“扩增前”破坏情况，如实施例6.C所述。

图28表示在实施例7中用于产生核糖核苷酸修饰型LCR-扩增产物的一种含45个碱基对的HIV扩增序列以及相应的核糖核苷酸修饰的扩增探针。

图29是一张放射自显影图，它表示利用在各自的3′-末端处含有单个核糖核苷酸取代的扩增探针进行的LCR扩增过程，如实施例7.A所述。

图30是一张放射自显影图，它表示通过与标准物相比而定量测定，经核糖核苷酸修饰的LCR-扩增产物，如实施例7.A中所述。

图31是一张放射自显影图，它表示利用强碱作为切割剂，对经过核糖核苷酸修饰的LCR-扩增产物进行有效的“扩增前”破坏情况，如实施例7.B中所述。

图32是一张放射自显影图，它表示利用RNA酶A作为切割剂对经过核糖核苷酸修饰的LCR-扩增产物进行定量破坏情况，如实施例7.C所述。

本发明通过向扩增产物中引入至少一种修饰物而降低或除去由污染的扩增产物引起的背景值。经过修饰的扩增产物很容易与测试试样中的靶序列区分开，可以选择性地除去。

为了更清楚地理解本发明，现在我们对本文中所用的某些术语进行定义：

扩增的意思是指增加测试试样中的核酸序列的拷贝数量，在扩增过程中产生的拷贝体是精确的或互补的拷贝体，此外，扩增过程可以以线性方式或以指数方式进行;后一种方式的扩增速度大于线性扩增的速度。这些拷贝体可借助于一种控制污染的方法进行修饰。

核酸序列是指一种脱氧核糖核苷酸或一种核糖核苷酸，它们可在下列方面进行修饰：①磷酸盐主链;②核苷;和/或，③该寡聚核苷酸中的糖部分。核酸序列可以含有标记物或其它的附着成分，并且可以因存在其它成分而彼此间断，只要它们能发生杂交。

靶序列是特定的分析过程中要分析的核苷酸序列。

扩增序列是指特定长度的靶序列，在扩增过程开始时这种序列作为模板序列。扩增序列可以由整个长度的靶序列组成，也可以由靶序列上有代表性的部分组成。

模板序列是指在其上形成扩增产物的核酸序列。在扩增的第一次循环中，以该扩增序列作为模板序列。在后面的扩增循环中，也可以用扩增产物作为模板序列。

扩增探针是指一种核酸序列，该序列可以是：（1）与双链扩增序列中一个单链的一部分互补;或（2）与单链扩增序列的一部分互补或相同。扩增探针以彼此完全相邻接地与扩增序列杂交，从而使探针连接在一起。可以在用来连接其它扩增探针的一个末端或两个末端对扩增探针进行修饰，但也可不对其进行修饰。此外，可以通过引入一种控制污染方法，对扩增探针进行修饰，或者也可不对其进行修饰。

本文中所用的扩增引物是指一种核酸序列，该序列与扩增序列的一个末端部分相互补，并且它能作为与扩增序列互补的引物延伸产物的合成过程的起始点。引物延伸产物是在核苷酸及一种聚合试剂例如DNA聚合酶存在下形成的。通过引入一种控制污染的手段，可以对扩增引物进行修饰，或者也可不对其进行修饰。

本文中所述的预先合成的探针或引物是指一种寡聚核苷酸序列，该序列是在加入到测试试样反应混合物之前已合成了。

扩增引物的延伸端是指扩增引物上可以受聚合酶作用而形成延伸产物的末端。该延伸端是3′-末端。

扩增产物是指扩增序列的类似拷贝和/或互补拷贝。扩增产物是在扩增过程中原位合成的。扩增产物可以是接合起来的核酸序列，该序列可以通过将一系列与扩增序列连接杂交的扩增探针连接起来得到的。扩增产物也可以是聚合酶链反应的延伸产物，术语“扩增产物”包括修饰后的扩增产物。

本文中所述的经过修饰的扩增产物是指至少含有一个修饰位点的扩增产物。

修饰位点是指扩增产物上的一个单个位置，在该位置上可实施引入的一种控制扩增产物污染方法。修饰位点包括：举例来说但不限于此，引入一个配位基，引入一种交联剂或可以化学裂解的位点，以及进行碱基交换而获得一个酶识别位点。

污染的扩增产物是指利用不同于将原始存在于测试试样中的扩增序列进行扩增的手段而引入到测试试样中的扩增产物。例如，污染的扩增产物可以是由于机械携带或空气携带由前面已扩增的一个样品或几个样品产生的扩增产物污染测试试样引起的。

“互补”是指足以使杂交发生的互补性，完全互补性是不必要的。

基本互补是指其中至少有一个碱基是错配的互补。

假限制性位点是一个核酸残余序列，在该序列中要改变至少一个核苷酸才可提供一种限制性内切酶识别位点。假限制性位点不能被识别未改变序列的限制性内切酶切割。虽然采用了术语“改变”，但假限制性位点是自然存在的，而且应意识到任何没有提供限制性位点的核苷酸序列均将是一种假限制性位点。

优选的假限制性位点是只需对一个碱基修饰就能获得限制性内切酶识别位点的假限制性位点。

本文中所述的识别位点是指由一种酶，例如限制性核酸内切酶或RNA酶识别的特定的序列。

酶切割位点是指被一种酶，例如限制性核酸内切酶或RNA酶水解的磷酸二酯键。

远距离切割型限制性核酸内切酶，或远距离切割剂是一种限制性核酸内切酶，它能在酶识别位点外侧的某个位点切割双链DNA。

本发明针对的是一种用于控制污染扩增产物中发生的载带污染的方法。作为扩增步骤的一部分，可以通过向扩增产物中引入至少一个修饰位点，从而使修饰后的扩增产物与靶序列有所区别，由此产生经过修饰的扩增产物。进行这种修饰过程，通过除去、破坏或其它使经过修饰的扩增产物失活的方法而选择性地消除在后面扩增过程中作为模板的经过修饰的污染扩增产物。当然，选择性地消除经过修饰的扩增产物的方法将随着引入到该扩增产物中的特定的修饰而变化。

可以将本发明的控制污染方法引入到对测试试样的扩增前处理、扩增后处理或扩增前后处理相结合中。在扩增后处理情况下，在扩增过程完成之后可以选择性地从已扩增试样中除去经过修饰的扩增产物。这将有效地使已修饰产物扩散到整个实验室或工作空间的机会降至最小，在这些地方该产物会污染新的测试试样，从而导致假阳性。但是扩增后处理不能完全消除污染问题，这是因为在打开反应管加入选择性除去污染产物所需的试剂（如切割剂）时，仍将会发生一定程度的空气携带的污染。

但在大多数情况下，在将新的测试试样扩增之前就对该试样进行“预处理”以选择性地除去污染的已修饰扩增产物将是可行的而且事实上也是优选的。对于扩增前处理的情况，修饰后的扩增产物可以污染新的测试试样，而污染的扩增产物将在新测试试样中基本上被全部除去或破坏掉。如果扩增试剂（例如扩增探针或引物）易于受到用于选择性消除污染的扩增产物的相同试剂破坏，就必须在对该测试试样进行扩增前处理之后加入扩增试剂。但是，当扩增试剂能够抵抗用于选择性消除污染产物的试剂的破坏时（例如当采用某些远距离限制性内切酶识别修饰位点或核糖核苷酸取代物时），在扩增之前，即在所有的必需的试剂已加入到测试试样中之后，应立即加入该破坏试剂，从而产生最大程度的污染控制。

本发明的方法以有效的、可靠的、价廉的方式对载带污染进行控制。这一点在通常需要进行扩增过程的诊断方法中显得特别重要。在这类确认方法中，同样的分析物被连续地扩增一次又一次，从而进一步增加了新试样的扩增产物污染问题。对特定分析物进行测定的时间越长，污染问题就越严重。举例来说，从已被扩增到100×10^-15摩尔扩增产物的单一100μl试样中只抽取1μl，就会向空气中释放600百万的靶拷贝。如果均匀地分布在典型的工作环境中，这将会产生在每立方英寸工作面积内污染扩增产物分子的浓度为约350个。

由本发明提供的解决载带污染的方法不需要象现有技术那样的复杂又艰苦的步骤。例如，本发明不需要使用分隔间以进行新测试试样的引入、扩增以及检测过程。而且，它也不需要采用可自由使用的服装、价格昂贵的阳性转移移液管以及特定的可随意使用的管件和试样处理装置。本文提供的这种方法没有什么特别的变化而且它不具有现有的方法所施加的自我限制，例如，对伴随扩增过程的标准物的量进行限制。对于熟悉本领域的技术人员来说，本发明的其它众多的优点将是显而易见的。

本发明的方法期望并包括将许多不同类型的修饰物引入到在扩增过程中产生的扩增产物中。在选择特定的修饰物时，重要的一点是该修饰物要能提供一种可将该扩增产物与用于后面的测试试样中的靶序列相区别和/或分离开或将它破坏的方法。由此，在将经过处理的新试样中的靶序列扩增之前就将在此过程中作为模板的污染的扩增产物除去、破坏或使之失活。

根据本发明的学说，可用于区分污染扩增产物的修饰方法对于本领域的技术人员来说是显而易见的，例如，这些修饰方法包括引入一种配位基，引入一种交联剂，或引入一种酶识别位点（包括限制性内切酶识别位点）或其它合适的可裂解部分。正如后面将要全面描述，本发明的某些修饰方法将比其它方法具有更多的限制性。因此，根据特定的分析物的特点，在特定条件下某些修饰方法将是优选的。根据要扩增的分析物的特点以及本发明的学说，对于给定的分析过程中的扩增产物来说，其优选的修饰方法对于本领域的熟练技术人员来说将是显而易见的。

通过采用预先合成的含有所选择的修饰物的扩增探针或引物而优选地将一种修饰物引入到扩增产物中。经过使用这些经过修饰的探针或引物进行扩增后，依次将该修饰物引入到已完成扩增的扩增产物中。利用本领域内的普通技术人员所熟知的许多种方法中任何一种方法均可以实现对扩增探针或引物进行修饰。例如，当采用配位基及其它类似的修饰物时，可以在寡聚核苷酸合成之后将该修饰物引入所生成的寡聚核苷酸探针或引物中。当采用酶识别位点时，在合成过程中该修饰物简单地通过取代进入寡聚核苷酸探针或引物中。对于PCR，可以在一种或多种经过修饰的三磷酸核苷存在下用聚合酶扩增靶序列，从而产生修饰型扩增产物（例如参见，Langer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78（11），6633-6637（1981））。

尽管通常一个位点就足以明显地降低污染，但引入到已修饰扩增产物中的修饰位点的数量也可以变化。事实上，在大多数情况下，由于预料中的例如由于空间障碍（因引入庞大的部分而引起的），对杂交过程的干扰（因位于互补核苷酸之间的氢键崩裂而引起的），或扩增探针或引物与靶之间丧失了完全互补性（因引入限制性内切酶识别位点而引起的）而使扩增过程的效率降低，优选的是只引入一个修饰位点。但应明白在最后一种情况下，循环效率的损失主要发生在第一次扩增循环中，在此期间，只有与经过修饰的探针或引物基本互补的扩增序列作为模板。因此，当作为模板的（且与探针或引物完全互补的）扩增产物的相对数量增加时，所预期的效率损失也将成比例地降低。

如果在最后一次扩增循环之后扩增产物未变性，此时只需修饰一种扩增探针或引物。在此情况下，所产生的修饰型扩增产物将是双链的，通过仅在其中一条链中引入一种修饰物即能除去或破坏这两条链。但是，如果在最后一次扩增循环后对测试试样反应混合物用一个变性步骤处理，则扩增引物以及至少两条相对链的扩增探针（即代表该探针对的“上”和“下”链）均需修饰，以基本上确保所有的污染扩增产物在以后的杂交过程是失活状态。

如果向扩增产物中引入配位基，通过将含有经过修饰的扩增产物的测试试样与固定化的该配位基的特异性结合配偶体相接触，可以选择性地消除所产生的配位基修饰的扩增产物。然后将固定载体与结合的配位基修饰的扩增产物一起除去。如果在一种新的测试试样上进行选择性消除（即在扩增过程开始之前），必须在向该新测试试样中加入扩增探针或扩增引物试剂之前使该固定化的特异性结合配偶体与新测试试样接触。如果在加入这些试剂之后再接触新的测试试样反应混合物，则该试剂中经过修饰的探针或引物将与污染扩增产物一起被从溶液中移走。

作为修饰物引入的配位基优选的是特异性结合对的较小的一个成员，这是因为这可以使由于在扩增探针或引物上有配位基存在而产生的空间障碍而使预期的扩增效率的降低减少到最低程度。优选的配位基的一个例子是生物素。另一种优选的配位基是萤光素。对于PCR情况，至少在一个扩增引物中引入配位基，而对于LCR的情况，至少在一个扩增探针中引入配位基。图1表示对由接合酶链反应型扩增过程产生的扩增产物（由LCR产生的扩增产物）进行的配位基修饰过程，以及随后用该配位基的固定化的特异性结合配偶体除去经过修饰的扩增产物。图2显示类似的过程，它是涉及由聚合酶链反应产生的扩增产物（由PCR产生的扩增产物）。随后通过将这些试样分别与固定化的抗生物素蛋白或抗-萤光素抗体接触，将产生的由生物素或萤光素修饰的扩增产物从测试试样中除去。

在本发明的配位基修饰实施方案中，优选的是在探针或引物上的一个位置，对扩增探针或引物进行修饰，其中的探针或引物将不含由于扩增过程中使用的任何一种酶或其它试剂;例如PCR型扩增过程中的聚合酶以及LCR型扩增过程中的连接酶的作用而受到干扰。如果在PCR型扩增过程中聚合酶能“读完”整个修饰位点时，可以在除延伸端之外的引物上的任何一个位置对该扩增引物进行修饰。但是，如果聚合酶不能读完整个修饰位点时，应在PCR引物的5′端对其进行修饰。

由于LCR型扩增过程不需用聚合酶，因此酶阅读的限制性就与配位基在该扩增探针上的修饰位点的定位没有关系。对于LCR，优选的是通常在除接触末端以外的任何一个位置对扩增探针进行修饰。对于构成扩增产物的末端片段的扩增探针，也可以在探针的非接合端处进行修饰。此外，对于所有扩增探针优选的是在差不多靠近该探针的中央区域处进行修饰。

利用本领域的技术人员熟知的方法，可用优选的萤光素或生物素配位基对扩增探针或引物进行修饰。例如，可以利用两步法用配位基修饰寡聚核苷酸探针或引物，其中在合成该寡聚核苷酸过程中首先引入一个胺基基团。经过偶合、氧化、脱保护以及从合成过程中所用的载体上除去寡聚胺引物或探针后，就能将配位基结合。

另一种用于控制污染扩增产物中的载带污染的方法包括将一种共价连接的交联剂引入到在扩增过程中使用的至少一种扩增探针或引物中。经过修饰的扩增产物上的交联剂可以用化学或光化学方法活化，从而使该修饰扩增产物与互补的核酸链共价交联结合。互补的核酸链可以来自互补的经过修饰的或未经修饰的扩增产物，或者如果经过修饰的扩增产物已变性时也可以利用载体DNA形式。但是对于后一种情况，该扩增产物的两条链必需都已经进行修饰，从而能选择性地基本上消除全部的扩增产物。

此后，通过阻止经过修饰的互补扩增产物发生完全变性，单向交联修饰的扩增产物将使修饰后的扩增产物在任何进一步的扩增过程不具活性。在某些情况下用该交联剂的合适的激活剂对试样进行处理时，还会发生破坏新测试试样中的靶核酸序列的危险。但是，如果使光交联基团吸收对核酸靶无害的波长的光线时，就可以避免这种危险。但是处理新测试试样必须在没有新扩增探针试剂存在的条件下进行，以便破坏没有与新试剂交联结合的污染产物。

利用本领域内普通技术人员已知的方法，将交联剂掺入到扩增探针或引物中。对于LCR型扩增过程，优选的是将该交联剂定位于中间扩增探针上，然后该探针将会尽可能地将该交联剂掺入到最靠近扩增产物中央的区域。对于携带交联剂的扩增探针，更优选的是将该交联剂定位于探针的中央区域，从而可以不干扰该修饰探针的末端的连接或接合。这一点已显示于图3中，在该图中，该交联结合修饰物被引入到由一套三对扩增探针中中间一对探针产生的扩增产物中。

对于PCR型扩增过程，优选的是在不明显干扰聚合酶的前提下将该交联剂尽可能近地引入到扩增产物的延伸端上。如配位基修饰过程一样，如果交联剂的存在将干扰用于引物延伸的聚合酶的阅读能力，则优选的是应将该修饰物定位于该引物的5'末端，图4表示用一种预先合成的引物将交联结合修饰物引入到PCR扩增产物的过程，其中该预先合成的引物在其中间或靠近中间处已被修饰。

然而，更优选的是在扩增产物中引入至少一种酶识别位点，从而修饰该扩增产物而作为控制载带污染的方法。通过利用经过修饰的扩增试剂（例如经过修饰的扩增探针或引物）可以将酶识别位点引入扩增产物中。在PCR型扩增过程中，也可以通过使用既可作为一种酶识别位点又可作为聚合酶底物的经过修饰的三磷酸核苷而引入该酶识别位点。该酶识别修饰位点使所形成的修饰扩增产物能随后用一种酶将其破坏，所述的酶将选择性地切割该扩增产物但它不切割靶或扩增序列。酶识别位点的例子包括但不限于此，限制性内切酶识别位点以及RNA酶识别位点。

如同其它类型的修饰物那样，也可以向扩增产物中引入多个酶识别修饰位点。当然，优选的是在扩增产物的某个位置或某些位置处引入酶识别修饰位点，裂解时，在这些位置处将使扩增产物产生最彻底的破坏。酶识别位点的优选的位置将随着需要进行分析的分析物而变化，而且对于限制性内切酶识别位点，该优选的位置将在一定程度上受到靶序列中优选的假限制性位点的位置及数量的影响。如果只用一个酶识别位点来修饰扩增产物，典型优选的是将该酶识别位点尽可能地定位在生成的扩增产物的中央处，从而达到最有效的破坏。

与用PCR产生的扩增产物相比，用LCR产生的扩增产物更容易实现将单个酶识别位点进行中央定位。这是因为对用预先合成的LCR扩增探针构建的扩增产物比必须在扩增期间原位合成的PCR扩增产物的主要部分更能进行更大程度的控制。例如，对于PCR产生的扩增产物，典型的是必需至少将单一酶识别位点的一部分定位于该扩增产物的扩增引物部分上，而不是使整个限制性位点定位于用聚合酶延伸的部分中，该聚合酶延伸部分相当于所产生的扩增产物上的庞大的中心区域。相反用LCR型扩增过程则可以很容易地将单一酶识别位点引入扩增产物的中间部分。

将单一酶识别位点定位于PCR产生的扩增产物中本身也存在另外一些限制。最重要的一点是将单一酶识别修饰位点定位于所产生的扩增产物的最中央位置将使该修饰物处在扩增引物的延伸端。由于在PCR扩增过程中，该引物的末端是受聚合酶作用从而形成延伸产物的，因此将修饰位点放在该位置或其附近就有可能干扰聚合酶进行链的延伸而形成扩增产物，而且当用靶序列作为模板序列时还会降低扩增效率。然而，当需要多个酶识别位点时，通过在扩增过程中用一种或多种经过修饰的三磷酸核苷酯，例如三磷酸核糖核苷酯（由RNA酶识别）代替相应的三磷酸脱氧核糖核苷酯可以将这些多个修饰位点引入扩增产物的中央部分（由聚合酶进行延伸部分）。

为了用一种由RNA酶识别的酶识别修饰位点来实施本发明的方法，可以用一些RNA碱基代替形成扩增产物残余部分的DNA碱基而预先合成扩增探针或引物的选定的部分。该RNA碱基系列可以小到只有一个RNA碱基长（对于RNA酶A情况），或几个碱基长（对于RNA酶H情况），或该扩增产物的整个长度。与引入限制性内切酶识别位点不同，RNA酶识别位点不一定降低效率，因为在后一种情况下不一定损失完全互补性。用RNA碱基取代不仅完全互补存在，而且RNA/DNA杂合体形成也比DNA/DNA杂合体形成更强。根据本发明的学说再通过一些小型实验，本领域内普通技术人员很清楚这些RNA碱基的优选定位位置。通常根据所选择的作为选择性消除已修饰扩增产物的试剂的特定的RNA酶，优选的是该RNA碱基系列的长度至少为约1至3个碱基。

可以用不同种类的RNA酶破坏引入到修饰后的扩增产物中的RNA酶识别修饰位点。一种优选的RNA酶是RNA酶H，RNA酶H特异于RNA/DNA杂合体而且它只切割该两倍体的RNA碱基，而不切割DNA链。当用RNA酶H破坏经过酶识别位点修饰的扩增产物时，重要的是将RNA酶识别位点引入到修饰扩增产物的两条链中，并且将RNA酶识别位点定位于扩增产物的不同位置上。这样，每条链上的RNA酶识别位点相对面地定位于互补扩增产物的一条DNA链，从而使RNA酶H能切割经过修饰的两倍体扩增产物的两条链。由于RNA酶H酶不切割RNA/RNA或DNA/DNA两倍体，因而可以选择性除去新测试试样中携带的污染扩增产物，而不必担心无意中会破坏与经过修饰的扩增产物杂交的DNA靶序列。

已报导对单链RNA具特异性的其它几种优选的RNA酶类型包括：例如RNA酶A，RNA酶CL3，RNA酶T₂和RNA酶U₂。如果采用这些类型的酶，就不存在会切割靶DNA的危险。由于RNA酶A对单个核糖核苷酸取代物具有特异性，因而它是特别优选的。

也可以引入一种由限制性内切酶识别的酶识别修饰位点。扩增产物上的每一个限制性内切酶修饰位点将基本上与扩增序列上的假限制性位点相互补。优选的是，将限制性内切酶位点引入到与靶序列相比具有最少量错配的扩增产物中。更优选的是仅一个变换的碱基引入该识别位点，也就是说，使限制性内切酶识别位点定位于优选的假限制性位点的对面。

限制性内切酶和位于特定的扩增产物中的相应的限制性内切酶修饰位点的选择将受到许多因素的影响，这些因素包括各种限制性内切酶的费用及效力。此外，选择一种对由扩增过程中产生的合成扩增产物来说具有较高切割效率的酶也是重要的和要优先考虑的。例如，某些限制性内切酶被认为其切割合成型寡聚核苷酸序列的效率大大低于其切割野生型序列的效率。根据本发明的学说，本领域内熟练技术人员很清楚对于一种给定的分析物及扩增系统应优选的限制性内切酶。

优选的是，通过首先从靶序列中筛选出一种至少含有一个优选的假限制性位点的扩增序列而实施将限制性内切酶修饰位点引入到扩增产物中。当在特定的扩增序列中含有许多优选的假限制性位点时，对于限制性位点修饰物在修饰后的扩增产物上的定位位置可以有多种选择。在最终从扩增产物中选出限制性内切酶修饰位点之前，重要的是筛选出整个扩增序列。以证实在将要受到限制性内切酶（该限制性内切酶是选择用来选择性切割经过修饰的扩增产物的）作用的扩增序列中没有自然存在的限制性位点。如果尚存在这种天然存在的位点，必须选择另一种限制性内切酶修饰位点，否则该扩增序列将随经过修饰的扩增产物一起遭到破坏。

通常，限制性内切酶仅能切割经过修饰的双链扩增产物。因此，经过限制性位点修饰的扩增产物在与合适的限制性内切酶接触前不发生变性。但是在某些检测系统中则必须使该扩增产物变性。如果采用如国际专利申请No.89/02649所述的使用互补的探针的检测系统时，仍然可以切割已变性的产物，只要该限制性位点掺入到检测探针中而且所产生的扩增探针/检测探针两倍体未发生变性即可。

图5中显示了用单个限制性内切酶修饰位点修饰LCR产生的扩增产物。在该图中，将三对探针连接在一起以形成扩增产物，其中间一对探针上有一个限制性内切酶识别修饰位点。这将产生易受限制性内切酶作用的由LCR产生的经过修饰扩增产物，所述的限制性内切酶将会把该修饰过的扩增产物切割成约两半。从而破坏该扩增产物。该靶的扩增序列可以抵抗这种酶的作用并保持其自然状态。但是，在这种实施方案中，必须在加入新探针试剂之前对新测试试样进行处理，以除去污染的扩增产物，因为这将使在后面扩增过程所需要的经过修饰的扩增探针对也遭到破坏。

图6显示了将相同的单个位点修饰物引入到用于PCR型扩增过程的扩增引物中。所得到的由PCR产生的经过修饰的扩增产物易受到同种限制性内切酶的破坏，但对于得到的由PCR产生的经过修饰的扩增产物，切割只发生在该扩增产物的一个末端。PCR产物的这种不均匀切割的潜在缺陷显示于图7中，它表示已切割的PCR扩增产物在随后的扩增过程中只有部分被引发。发生部分引发是因为已切割的扩增产物的较大部分含有该引物的部分互补碱基。已裂解的PCR产生的污染扩增产物在随后的扩增过程中的部分引发将会导致人为地提高测试试样结果，包括假阳性。

如果将限制性内切酶修饰位点引入到十分靠近该引物的延伸端从而使所得到的识别位点实际上存在于该扩增引物的由聚合酶延伸的部分中，则在某些情况下可以避免部分引发发生。但要想做到这一点又不干扰聚合酶引发引物延伸的能力是较困难的。优选地通过采用远距离切割型限制性内切酶以及将合适的相应限制性修饰位点引入到经过修饰的由PCR型扩增过程产生的扩增产物中可以消除部分引发。图8表示了将远距离切割型限制性内切酶识别位点引入到PCR扩增产物中的过程。在此例中，远距离切割型限制性内切酶识别位点引入到预先合成的扩增引物中，但实际的由该限制性内切酶引起的裂解则发生在所形成的扩增产物延伸部分中。结果，被破坏的PCR产生的扩增产物不能参与后面的扩增过程，因为没有机会可发生部分引发。

远距离切割剂可用于修饰由LCR产生的扩增产物，且在某些情况下是优选的。当识别位点和相应的切割位点可以定位于由不同探针对提供的扩增产物区域时，即使在将该扩增探针试剂加入到含有靶的试样中之后，仍可以将新的测试试样与限制性内切酶相接触，而不会在破坏污染扩增产物的同时发生切割探针的危险。图9表示将远距离切割型限制性内切酶识别位点引入到三对探针组中末端一对探针中的过程，由此可以在靠近该产物中部的地方切割所形成的LCR扩增产物。在此情况下，该切割位点与扩增产物上相当于中间一对扩增探针部分相对应。

通过对用于扩增过程的扩增探针或引物的核酸主链进行修饰还可以将一个可以用化学方法裂解的位点引入到扩增产物中。与PCR型扩增过程相比，在LCR型扩增过程中使用这种实施方案将是更优选的，这是因为化学裂解位点的存在可能会干扰某些聚合酶的阅读能力。利用在该修饰位点进行切割的试剂进行处理，可以将含有能用化学方法裂解的修饰位点的修饰型扩增产物破坏。相对合成序列来说，引入可以用化学方法裂解的成分能够减轻由于利用某些限制性内切酶所产生的切割效率下降问题，这是因为化学切割反应不是基于生物活性酶，并且与由合成的和野生型核酸发生的化学裂解反应没有区别。此外，不管经过修饰的扩增产物是双链还是单链，仍会切割大多数可以用化学方法裂解的成分。

在该实施方案中，利用从市场买到的商品试剂可以将该裂解性位点引入到预先合成的探针或引物中，如图10所示。首先合成部分探针或引物序列，使之在该部分序列的3′-或5′-末端含有胺基基团。然后将这些胺基标记末端与具有同种双重功能的连接剂相连接，以形成完整的但被间隔的序列，该序列可用作为扩增探针或引物。例如，可以用DSP（二硫双[琥珀酰亚胺基-丙酸]）、DST（二琥珀酰亚胺基-酒石酸）、或EGS（亚乙基二醇双[琥珀酰亚胺基-琥珀酸]（如图10所示）将该部分探针或引物序列的3′-和5′-标记末端连接在一起，由此形成完整的含有该可裂解位点的探针试剂。在此例中，通过用一种还原试剂，例如二硫苏糖醇（当用DSP，作为同种双重功能的结合剂时），一种氧化试剂，例如高碘酸钠（当用DST时）、或羟基胺（当用EGS时）进行裂解时，可以破坏用这些探针或引物产生的已修饰扩增产物。

优选的是，将该可用化学方法裂解的修饰位点定位在靠近扩增探针或引物的中间位置，从而使对杂交的破坏程度降至最小。可以构建该修饰扩增探针或引物，使这些试剂与扩增序列完全互补（可裂解成分被包含在“突出环”（loop-out）中）或基本互补（可裂解成分被该探针序列中的一种核苷酸取代）。在某些例子中，例如当一种核糖核苷酸取代物可以提供该化学裂解成分时，该试剂可以与该扩增序列完全互补，而无需外突出环（loop-out）。

由于核糖核苷酸替代引入了相同的不稳定的键，可以同时将一个酶识别位点和一个可用化学方法裂解的位点引入到所产生的修饰扩增产物中。这种修饰扩增产物对下列之一或两者是不稳定的：（1）强碱（化学裂解）;和（2）某种RNA酶（酶促破坏）。在这任一种情况下，所产生的裂解产物均不再具有作为扩增模板的功能。

优选的是，利用在各自的3'末端含有单个核糖核苷酸取代物的扩增探针或引物，可以将这些不稳定的键引入到经过修饰的扩增产物中。对于PCR情况，两个扩增引物均含有该核糖核苷酸取代物。而对于LCR情况，则至少一条上链和一条下链扩增探针含有该核糖核苷酸取代物。由于该核糖核苷酸取代物位于该引物和探针的3′-末端，因此实际上，该修饰扩增产物中的不稳定键是在扩增过程中原位产生的。结果，该扩增试剂不含有该不稳定键（即不是碱基不稳定），从而可以在有这些抗处理试剂存在的同时用强碱或RNA酶处理而破坏携带的污染物，而不影响其扩增完整性。此外，野生型靶作为扩增模板的能力同样也不会受到碱或RNA酶处理的影响，从而可以在靶及扩增试剂存在下，在新测试试样中除去不稳定的载带污染扩增产物。

对于由含有核糖核苷酸取代物的修饰扩增引物或探针制备PCR或LCR产生的修饰扩增产物有两个重要的要求。首先，形成扩增产物所需的酶必须在该取代物存在下有效地工作。对于PCR来说，聚合酶必须从该已杂交引物的3′-末端的一个羟基基团处进行链延伸。而对于LCR来说，连接酶必须催化一个寡聚核苷酸探针的3′-核糖基团与另一个寡聚核苷酸探针的5′磷酸基团共价结合。其次，所产生的修饰扩增产物（包含有一个或多个内核糖核苷酸）必须作为后面扩增循环的活性模板。（即，对于PCR来说，聚合酶必须读完整个核糖核苷酸连接体）。

本发明的方法不只限于LCR和PCR型扩增过程，也可用于控制在其它类型的扩增过程，例如转录型扩增过程以及修复链反应扩增过程中发生的污染问题。

下列实施例是用来帮助理解本发明的，其真正的范围由所附的权利要求书表示。应该明白对所述的过程可以作一些修改，但并未脱离本发明的精神。

为了证明本发明的效果，采用了多种不同的合成核酸序列来模拟：（1）扩增序列;（2）扩增产物;（3）经过修饰的扩增产物;（4）扩增探针;（5）检测探针;（6）扩增引物;（7）检测引物;和（8）用于确定限制性内切酶对合成核酸序列的切割效果的多接头。这些合成序列如图11，13，16，20，23和28所示。

实施例1

制备合成序列

如国际专利申请No.89/02649所述，利用一种应用于生物系统（Applied Biosystems）的380B型合成器（Applied Biosystems.Inc.，Foster City，California），制备合成型扩增序列（AS），扩增探针（AP），经化学磷酸化的扩增探针（pAP），检测探针（DP），经化学磷酸化的检测探针（pDP），（如图11所示），以及多位点DNA（如图13所示），所述专利文献的相关部分作为参考文献引入本文。

利用从Glen Research Corporation（Herndon，Virginia），目录号为10-1900-90获得的磷酸化试剂将该寡聚核苷酸磷酸化。这种试剂首先由T.Horn和M.Urdea，Tetrohadron Lett.27.4705-4708（1986）描述，而且可以根据标准的胺基磷酸酯自动合成程序使用。利用该应用生物系统仪器进行自动寡聚核苷酸合成过程，是用在最后的合成循环中很容易地引入的该化学磷酸化试剂按3′→5′方向进行。通过测定在最后循环之后释放的二对甲氧三苯甲基基团的量，而定量测定磷酸化效果。采用标准的脱保护、裂解和提纯工艺分离所需的5′化学磷酸化的寡聚核苷酸。

实施例2

用单个限制性位点修饰扩增产物

将限制性位点修饰物引入扩增产物中

此实施例描述将限制性内切酶修饰位点引入LCR型扩增过程中的扩增产物。在本实施例中，通过用预先合成的含有限制性内切酶修饰位点的扩增探针去扩增含有相应的优选的假限制性位点的扩增序列，而引入限制性内切酶修饰位点。选择限制性内切酶修饰位点时应使6个扩增探针（即三对）中每一个均含有一个限制性内切酶修饰位点，并且相对该扩增序列它还含有单个碱基错配（即与该扩增序列中相对的一个优选的假限制性位点杂交）。

还需要通过证明所产生的含有该限制性内切酶修饰位点的修饰扩增产物在用合适的限制性内切酶处理后极其无效地扩增（即基本上被破坏）、而同时含有相应的假识别位点的扩增序列在用相同的限制性内切酶处理后未受影响，从而表明经过限制性内切酶修饰的扩增产物被选择性地除去了。

虽然，该修饰扩增产物（AMP1）也能被构建成含有一个HaeⅢ和两个BbⅥ限制性核酸内切酶位点，但只有HaeⅢ位点被用作选定的修饰物以证实该扩增产物的裂解。该扩增序列（AS）与扩增产物仅在三个由三对扩增探针（AP₁/pAP₁′，pAP₂/pAP₂′和pAP₃/AP₃′）引入到扩增产物（AMP₁）中的碱基对上有差别，这三对扩增探针每一对均含有该不同的三个碱基对中的一对碱基。该扩增序列含有与引入到该扩增产物中的限制性核酸内切酶相对应的假限制性位点。

A.用限制性核酸内切酶消化扩增序列，修饰后的扩增产物以及载体DNA

为了确定限制性内切酶切割扩增产物而破坏其作为后面扩增过程的模板的能力的效果，在终体积为100μl的缓冲液中进行下列限制性核酸内切酶反应，该缓冲液含有：0.05mg/ml BSA（牛血清白蛋白），50mM Tris-HCl，6.6mM MgCl₂，6.6mM DTT。

反应1：2x毫微微摩尔AMP₁+20单位活性HaeⅢ限制性内切酶

反应2：2x毫微微摩尔AMP₁+20单位加热失活的HaeⅢ限制性内切酶

反应3：2x毫微微摩尔AS+20单位活性HaeⅢ限制性内切酶

反应4：2x毫微微摩尔AS+20单位加热失活的HaeⅢ限制性内切酶

反应5：1μg人胎盘DNA+20单位活性HaeⅢ限制性内切酶

反应6：1μg人胎盘DNA+20单位加热失活的HaeⅢ限制性内切酶

将所有6种反应物在37℃下保温16小时，然后在90℃下保温10分钟，以破坏任何残余的HaeⅢ活性。

B.在用活性和失活HaeⅢ限制性内切酶处理之后将合成的扩增序列以及经限制性位点修饰的扩增产物扩增。

如图5所示，用3对扩增探针（AP₁/pAP₁′，pAP₂/pAP₂′和pAP₃/AP₃′）在15次LCR型扩增循环中将由上面6种反应得到的扩增序列（AS）、经限制性内切酶识别位点修饰的扩增产物（AMP₁），以及人类胎盘DNA（HP-DNA）以复制形式扩增，值得注意的是这些探针与扩增序列之间有3个碱基对错配，但这些探针与AMP₁完全互补。

在LCR型扩增过程中可以采用多种不同类型的连接酶来使已连接杂交的探针实现接合，例如，国际专利申请No：89/02649描述了利用大肠杆菌连接酶（例如可以从New England Biolabs，Inc.，Beverly，Massachusetts获得）连接扩增探针的技术，但是，通常优选的是用热稳定型连接酶（TSL），以避免需要在每次LCR扩增循环中持续地加入新鲜的连接酶试剂。在本实施例中，可以在整个扩增循环中使用从嗜热栖热菌（thermus thermophilus）（AACC＃27634）分离的热稳定型HB 8 DNA连接酶来连接该扩增探针，所述的连接酶由Miho Takahashi（Mitsubishi-Kasei Institute of Life Sciences，Protein Chemistry Laboratory，11 Minamiooya，Machida-shi，Tokyo 194，Japan）赠送。

可以以10x浓度制备热稳定型DNA连接酶缓冲液（TSLB），它含有500mM Tris-HCl（PH7.6），66mM MgCl₂，10mM EDTA，66mM DTT，和500μg/ml BSA。

制备载样缓冲液，使之含有11.8mM EDTA，6.3M尿素，0.02%溴酚蓝，和0.02%二甲苯苯胺。

用Perkin-Elmer/Cetus热循环仪（Perkin-Elmer Corporation，Norwalk，Connecticut）从反应1至4中每种反应得到的DNA各取100渺摩尔和从反应5和6中每种反应产生的HP-DNA各取5ng以复制形式进行扩增，每个扩增反应均在含体积为50μl的1XTSLB的0.5ml Eppendorf

试管中开始，其中的TSLB含有2x皮摩尔的每种扩增探针（AP₁/pAP₁′、pAP₂/pAP₂′，和pAP₃/AP₃′），0.03单位TSL和66μM NAD。向每个反应试管中加入两滴矿物油，以防止在热循环期间发生蒸发。扩增反应循环5次，每次循环在90℃下加热2分钟，再在50℃下加热5分钟。

C.对经过限制性位点修饰的扩增产物进行检测。

用如国际专利申请No.89/02649所述的一个用两种探针的检测系统对由实施例1B产生的扩增产物进行检测，该专利文献的相关部分作为本文的参考文献。以HB8DNA连接酶和TSLB缓冲液取代国际专利申请No.89/02649中的大肠杆菌连接酶和大肠杆菌连接酶缓冲液。用图11所示的检测探针DP₁和pDP₂检测该扩增产物。

为了为以后利用放射自显影观察该修饰扩增产物提供一种手段，可以利用比活性大约为7000Ci/毫摩尔的放射性活性磷，用γ³²p-ATP和聚核苷酸激酶（Boehringer Mannheim Bioche-micals.Indianapolis，Indiana）将检测探针DP₁磷酸化。通过利用G50/50 Sephadex

进行的凝胶过滤（Pharmacia，Uppsala，Sweden），将过量的γ³²p-ATP与该磷酸化寡聚核苷酸分离。

在终体积为16μl的1×TSLB中准备检测反应，该终体积中含有十分之一的扩增反应混合物，200x毫微微摩尔的每种检测探针（γ³²p-DP₁和pDP₂）、0.03单位TSL和66μM NAD。通过加热到90℃并保温5分钟，然后再在50℃下保温10分钟，从而完成检测反应。然后，通过加入等体积的载样缓冲液，而后在90℃再加热3分钟，从而使该反应中止。通过将该反应混合物在变性的15%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，使产物分离，并进行放射自显影观察。（参见图12）。根据LKB Ultroscan^TMXL（Pharma-cia LKB Biotech，Inc.，Piscataway，New Jersey）上的激光光度计的扫描图估计相对扩增效率。

裂解的扩增产物（反应1，泳道1.和2），其仅以未裂解的扩增产物（反应2，泳道3和4）扩增效率的7%进行扩增。这与污染扩增产物的效率降低93%相一致。

裂解的（反应3）和未裂解的（反应4）扩增序列（分别是泳道5和6，及泳道7和8），其扩增效率几乎相同。这说明用同种限制性内切酶（该酶破坏相应的修饰扩增产物）进行处理时，不会对原有假限制性内切酶识别位点和扩增序列产生影响。

裂解的（反应5）和未裂解的（反应6）载体HP-DNA（泳道9至12）没有显示信号，这说明泳道1至8中的信号不是由于反应混和物中的DNA或其它成分的任何非特异性相互作用而引起的。

值得注意的是未裂解的扩增序列（AS，反应4，泳道7和8），其扩增效率只是未切割的扩增产物（AMP₁，反应2，泳道3和4）的18%，这很可能是由于扩增探针相对扩增序列具有3个碱基错配，而且扩增探针仅与扩增产物互补的原因。

实施例3

估评远距离切割型酶的行为

从本实施例，我们将认识到，用BbvⅠ远距离切割型限制性内切酶能切割实施例2得到的已修饰的扩增产物。对于这种情况，用BbvⅠ酶不会切割实施例2中的扩增探针AP₁/pAP₁′，pAP₂/pAP₂′和pAP₃/AP₃′。也能用其它远距离切割型限制性内切酶切割PCR或LCR型扩增过程的相应的已修饰扩增产物。

为鉴定具有相对高切割效率的远距离切割型酶，选择从New Eng-land Biolabs，Inc.（Beverly，Massachusetts）购买的8个不同的酶，以测定其用作为本发明中的限制性内切酶识别修饰位点的远距离切割剂的可能性。设计一个含42个碱基的双链DNA序列，使其含有所有8个远距离切割型限制性内切酶的限制性内切酶识别位点，如图13所示。该多位点DNA序列的上链和下链是用一个AppliedBiosystems 380B型合成仪（Applied Biosystems，.Inc.，Foster City，California）合成的，如实施例1所述。将这些互补序列杂交以生成用于估评远距离切割剂的双链序列。将等克分子量的该多位点DNA的上链和下链加合在一起，且简短地加热至90℃，然后使其冷却至室温以形成适合于限制性核酸内切酶切割的双链DNA。

用γ-³²P标记20微微摩尔（10^-12摩尔）双链多位点DNA的二条链的5′末端，如实施例2描述的γ-³²p-DP₁的标记。

然后通过由200毫微微摩尔（10^-15摩尔）³²p标记的多位点DNA，1x缓冲液及下列之一种酶（反应混和物总体积为50μl）进行8个单独反应，而用所选择的8个限制性内切酶切割多位点DNA：

反应限制性内切酶限制性内切酶的量（单位）缓冲液

1 ALWⅠ 4 1X TSLB

2 BbvⅠ 2 1X TSLB

3 BspMⅠ 4 1X TSLB＊

4 FokⅠ 8 1X TSLB

5 PleⅠ 1 1X TSLB

6 HgaⅠ 8 1X TSLB

7 HphⅠ 0.8 1X TSLB

8 SfaNⅠ 3 1X TSLB＊

＊+100mM NaCl

所有8种反应均在37℃下保温4小时。保温后，将每种反应混和物的一半量与等体积的EDTA/染料试剂混合，在90℃加热3分钟以终止反应，然后用本领域内公知的标准方法在10%变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，并利用放射自显影进行观察。如图14所示，所有的远距离切割剂均使已修饰的多位点DNA分裂，且显示在该体系中FokⅠ的切割效率最高。

实施例4

用双重远距离型限制性位点修饰

由PCR产生的扩增产物

基于实例3中对远距离切割酶估评的结果，设计另一实施例以证明在PCR型扩增过程中可用FokⅠ作为远距离切割型限制性内切酶的修饰物。如图15所示方法，将2个FokⅠ远距离切割型限制性内切酶修饰位点引入由PCR产生的扩增产物中。利用2个经适当修饰的PCR引物（每一引物含有单个碱基错配，这种错配是相当于该扩增序列内的优选假FokⅠ限制性位点而言）将这些修饰位点掺入扩增产物中。与非远距离切割剂的位点不同，将远距离切割型限制性内切酶识别位点掺入已修饰的扩增引物的结果是产生在扩增产物的延伸部分中含有FokⅠ切割位点的经过修饰的扩增产物，也就是说使相应的识别位点位于引物衍生部分内。因此，用FokⅠ限制性内切酶处理这种已修饰的扩增产物的结果是使产物分裂（如图15所示），这些产物对前面所述的部分引发现象不敏感。

选用包含于pUC9中的一个含147个碱基对的序列作为本实例中的扩增序列。所选的147个碱基对区以及天然扩增引物AP6和AP7′序列（不含相对于靶序列而言的错配），单个碱基错配的AP8和AP9′（将FokⅠ限制性内切酶识别位点掺入扩增产物中）和一种检测用的引物PAD22一起显示于图16中。

A.制备用于扩增的pUC9的靶序列

用含2707个碱基对的pUC9质粒作为本实例的靶DNA源。利用FokⅠ限制性核酸内切酶切割环形质粒以得到适用于扩增的线性序列，而制备用于扩增的pUC9靶DNA。使用FokⅠ限制性内切酶很方便，因为它与已选择用来破坏经适当修饰的扩增产物的酶相同。但是也可用其它限制性内切酶使该质粒线性化或成片段，只要质粒内含有这些酶的合适的限制性位点。该pUC9质粒含有5个FokⅠ识别位点，且扩增序列存在于经线性化处理得到的最大（1340个碱基对）FokⅠ片段中。

值得注意的是，如果扩增循环反应温度保持在约低于95℃，则通常必须使测试试样中的质粒、染色体或其他靶序列成片段或线性化，以有利于在扩增的第一次循环中完全变性。如果扩增循环温度超过95℃，则在扩增过程中必然发生线性化和/或片段化。

使用下列试剂：

浓度为0.45μg/μl的质粒DNA，即从Bethesda Research Laboratories（Gaithersburg，Maryland）得到的pUC9。

反应缓冲液是将由Perkin-Elmer/Cetus提供的GeneAmp^TMDNA扩增试剂盒（Norwalk，Connecticut）中应用的[10x]反应缓冲液稀释10倍得到。该[10x]反应缓冲液含有100mM Tris.HCl，500mM KCl，15mM MgCl₂和0.1%（w/v）明胶。用于本实验中的上述反应缓冲液是1×反应缓冲液。

浓度为4单位/μl的FokⅠ限制性核酸内切酶由New England Biolabs，Inc.（Beverly，Massachusetts）提供。

将2μl（0.9μg）pUC9 DNA和2μl（8个单位）FokⅠ限制性核酸内切酶加到50μl1×反应缓冲液中，在该反应缓冲液中切割质粒DNA。将得到的反应混合物在37℃下保温45分钟，经过45分钟的保温期后，再在90℃加热10分钟，以破坏剩余的酶活性。计算得到该反应混合物中靶序列的浓度为9.25毫微微摩尔/μl。

B.用天然扩增引物与经过修饰的扩增引物

相比较而进行PCR扩增/检测

为确定含有单个碱基错配的各种经过修饰的PCR引物是否适用于PCR型扩增步骤，用天然扩增引物（AP6和AP7′，与扩增序列完全互补）或经过修饰的扩增引物（AP8和AP9′，与扩增序列基本互补）同时进行扩增反应。同时进行的扩增反应的反应混合物同时循环20次，接着将PAD22检测引物用于测定产物。

用于本实例的下列试剂是Perkin-Elmer/Cetus GeneAmp^TMDNA扩增试剂盒的一部分：10mM dNTP′s（dATP，dCTP，dGTP，dTTP），[10x]反应缓冲液（如上述实例4.A所述），以及Ampli Taq^TMDNA聚合酶（5单位/μl）。

载样缓冲液与实例2.B所述相同。

检测用引物PAD₂₂是用³²P在其5′末端标记使其比活性约为7000Ci/毫摩尔，如实例2.C所述。

将FokⅠ切割后的质粒（由实例4.A得到）用TE（10mM Tris，PH8.0，0.1mM EDTA）稀释至达到所要求的浓度从而制备靶pUC9 DNA。

所有扩增反应是在含有总体积为50μl的1×反应缓冲液的0.5ml Eppendorf

管中进行，其中的反应缓冲液含有浓度为200μM的dNTP′s和2.5单位的Ampli Taq^TMDNA聚合酶。除上成分以外，该反应混合物还含有：

扩增引物 pUC9靶

反应物1：AP₈和AP₉′各25微微摩尔 100渺摩尔

反应物2：AP₈和AP₉′各25微微摩尔 0.0渺摩尔

反应物3：AP₆和AP₇′各25微微摩尔 100渺摩尔

反应物4：AP₆和AP₇′各25微微摩尔 0.0渺摩尔

在每个管中加入2滴矿物油以免扩增过程中发生蒸发。在Perkin-Elmer/Cetus热循环仪中使反应循环20次，每次循环先加热至90℃加热2分钟，然后在50℃加热5分钟。

用下列与聚合酶相关的检测系统（PAD）选择性检测扩增产物。在此方法中，在有过量DNPs和聚合酶存在下，将已标记的PADs引物与得到的扩增产物杂交从而生成带标记的延伸（检测）产物。然后进行PAGE从过量的标记PAD引物中分离该标记的检测产物，接着通过放射自显影进行检测。由于PAD引物必须与过量扩增引物竞争与扩增产物进行杂交，因此将PAD引物设计成比扩增引物更长（即：具有较高的Tm）。因此，调节反应温度以有利于PAD引物的杂交。

在1/10（5μl）各反应混合物中加入1μl含200毫微微摩尔³²P标记的检测引物（PAD22）和0.25单位Ampli Taq^TM聚合酶的溶液。将该反应混合物加热至90℃，加热5分钟，接着在65℃加热10分钟，使PAD引物退火且延伸。冷却至室温后，加入15μl载样缓冲液，接着加热至90℃，加热5分钟使反应终止。用标准方法将反应混合物与经HpaⅡ切割后用³²P标记的 2322标志物一起在10%变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，通过放射自显影检测。

各种反应混合物中的147个碱基对的PAD产物的相对强度显示于图17中。在扩增序列的假限制性位点上含单个碱基错配的经过修饰扩增引物其扩增效率几乎与天然引物相同（将1泳道的反应混合物1与3泳道的反应物3的结果相比较）。由零对照（反应混和物2和反应混合物4）的结果证明在无靶情况下进行的循环未发生明显的产物积累。

C.经过修饰的由PCR产生的扩增产物的破坏

用活性FokⅠ限制性核酸内切酶或加热失活的FokⅠ（对照）处理实施例4.B得到的上述的4种反应混合物，然后进行PAD检测，以估测相对切割效率。

用FokⅠ限制性核酸内切酶破坏经过修饰的PCR产生的扩增产物。本实施例所用的所有其它试剂是实施例4.B所述的Perkin-Elmer/Cetus GeneAmp^TMDNA扩增试剂盒的一部分。

将浓缩的贮存酶液加热90℃，保持10分钟以制备热失活的FokⅠ限制性核酸内切酶（△FokⅠ）。若所得到的△FokⅠ不能切割质粒pUC9 DNA，则可确定其已失活。

将1×反应缓冲液的25μl等分试样加入到1/10（5μl）实施例4.B的各种扩增反应物（1，2，3和4）中，同时加入2μl（8个单位）活性FokⅠ（分别为反应混合物1A、2A、3A和4A）或2μl△FokⅠ（分别为反应物1△、2△、3△和4△）。将这些反应混和物在37℃保温16小时，接着在90℃加热5分钟。

用PAD检测法估测FokⅠ和△FokⅠ酶作用PCR产生的扩增产物的切割效率。在用限制性内切酶处理后，从各反应混和物中取出15μl等分试样，加到10.5μl的一种溶液中，将该溶液调节为0.95x反应缓冲液且含有200毫微微摩尔³²P-PAD22（比活性为7000Ci/毫摩尔），2.5单位Ampli Taq^TMDNA聚合酶，以及952μM的每种dNTP（最终浓度为392μM）。然后加热这些反应混和物至90℃保持5分钟，接着在65℃加热10分钟，以便完成延伸反应。加入25μl载体缓冲液，然后加热至90℃加热5分钟终止反应。从已终止的反应混和物中取样，在10%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳（PAGE）。通过放射自显影检测该产物。在放射自显影步骤中使胶片过分曝光以显示存在的即使痕量的分析产物。

如图18所示，用活性FokⅠ酶处理可完全破坏利用单个碱基错配的经过修饰的扩增引物（含FokⅠ位点）而得到的经过修饰的扩增产物（反应物1A）。相反，用天然引物生成的扩增产物（反应物3A）在暴露于同样的活性FokⅠ酶后不受影响，如放射自显影中147个碱基对显示的强PAD信号所示。正如所期望的，用热失活FokⅠ酶处理均不会影响经过修或未修饰的扩增产物（分别为反应物1△和3△）。在放射自显影中，无靶对照（反应物2A、4A、2△和4△）未显示有147个碱基对的产物，这证实所有观测到的147个碱基对的信号确实是由扩增产物产生的。

在反应混合物1A的PAD检测反应中显示有约127个碱基对的微弱信号。所测定的这种漂移信号是由于在经过修饰的扩增产物模板上延伸的PAD引物仅在二个有效的FokⅠ位点之一处切割（如图19描述）而产生的。如图19所示，单个FokⅠ切割，产生二个可能的产物，其中仅一个应答PAD检测步骤，产生一个127个碱基对的产物。值得注意的是，这些经部分切割修饰的扩增产物没有一个与经过修饰的二个扩增引物（这两引物作为模板参与随后的扩增过程）相互补。

D.经FokⅠ处理的扩增产物的PCR扩增

为进一步检测实例4.C反应中的切割程度，稀释上述的反应混和物，并用已修饰的扩增引物AP8和AP9′将这些稀释液进行第二轮20次PCR扩增循环，如前面实施4.B所述。然后将得到的扩增产物进行PAD检测，如实例4.C所述。对于这些“再扩增”样品，希望即使痕量的未切割扩增产物均扩增到可检测程度，正如期望载带污染产物在分析过程中产生可检测信号。用于再扩增和随后的检测过程中的所有试剂如前所述。

在TE中连续稀释实例4.C的各种切割反应物达1/100000。因为该切割反应物本身实际上是原始扩增反应混和物的1/6稀释物，1/100000稀释度相对于原始扩增反应混和物而言表示总稀释度为1/600000。此外，由于仅5μl的稀释样品用于再扩增，与最初体积为50μl的扩增反应混和物相比，再扩增只表示利用实例4.B的原始PCR扩增而进行原位合成得到的扩增产物（经过修饰和未修饰）总数的1/6000000。这1/6000000数字表示一般分析实验装置的载带污染物的含量。

5μl每种切割反应混和物的最终稀释液（1/600，000）加到45μl溶液中，该溶液已经调节为最终的溶液为在1×反应缓冲液中含有5μl稀释样品，每种dNTP各为200μM，并含有25皮摩尔的各种扩增引物（AP8和AP9′）以及2.5个单位的AmpliTaq^TM聚合酶。由反应1A、2A、3A、4A、1△、2△、3△和4△得到的反应混和物分别用反应物1A⁺、2A⁺、3A⁺、4A⁺、1△⁺、2△⁺、3△⁺和4△⁺表示（这里“+”表示该反应物是经第二轮20次PCR扩增循环的再扩增得到的）。在各反应混和物中加入2滴矿物油，然后密封该0.5ml Eppendorf

管，在Perkin-Elmer/Cetus热循环仪中循环20次，每次循环先加热到90℃加热2分钟，再在50℃加热5分钟。

将含200毫微微摩尔的³²P标记的检测引物（PAD22）和0.25单位的AmpliTaq^TM聚合酶的溶液的1μl等分试样加到1/10（5μl）的各种再扩增反应混合物中。通过将反应混和物加热到90℃，加热5分钟，接着在65℃加热10分钟而进行PAD检测反应。用15μl载样缓冲液，并加热到90℃加热5分钟抑制反应，然后在变性的10%PAGE中与³²P标记的经HpaⅡ切割的pBR322的标志物一起进行电泳，通过放射自显影进行测定。所得到的相片显示于图17中。（应注意，该凝胶和放射自显影照片的结果也包含上述实例4.B的1，2，3和4反应物的数据）。

反应物1△+和3△+显示了预期由已分别污染1/6000000的反应1和3的产物经PCR扩增的样品产生的信号类型。这些结果表明在20次PCR型扩增循环中，该含量的污染物显示出典型假阳性结果。相反，污染了经过修饰的扩增产物[该产物先前已用活性FokⅠ限制性内切酶（反应物1A+）处理]的样品扩增后不会产生可检测的147-聚体产物，换言之，不是假阳性。用FokⅠ限制性内切酶处理未修饰的扩增产物（反应物3A+）与用热失活FokⅠ酶处理该同样未修饰的扩增产物（反应物3A+）相比，结果产生相等强度信号。这说明在有天然靶序列情况下，通过用活性FokⅠ限制性核酸内切酶处理可选择性破坏经修饰的扩增产物，而天然靶序列不受这种处理影响。无靶扩增（反应物2A+、2△+、4A+4△+）未显示可检测的产物，这证明147聚体产物确实是由扩增产物模板衍生的，而不是假生成的。

实施例5

双重远距离切割型限制性位点修饰的PCR

产生的扩增产物：污染后切割

虽然实施例4证明上述扩增试样成功的后扩增处理可去除载带污染，但是如前解释的，在实验室条件下，在新测试试样扩增前立即用合适的切割剂预处理新试样更为有效。这样，只要在扩增开始前，即刻将新样品进行预保温步骤[包括在含有所有扩增试剂的封闭管中加入切割剂（如FokⅠ）]，可破坏任何污染的扩增产物。

由于新试样中污染的扩增产物的最初浓度预期是很低的，因而存在着用预处理抑制污染物的潜力。这种关系是由于观察到的这些类型的低基质浓度的一定的切割剂的催化活性损失而产生的。因此，切割剂对新试样中修饰扩增产物的破坏效率会大大降低预处理抑制污染物的效率。（实施例4显示如果经过修饰的产物浓度相对较高时，经扩增后立即用切割剂处理经过修饰的扩增产物，该切割剂是很有效的）。

为检验该方法能否控制污染，用经过修饰的扩增引物AP₁₆和AP₁₇′扩增HIV pol基因的162个碱基对部分以使FokⅠ限制性位点掺入扩增产物。将由检测引物PAD₄接到所得到的产物上而延伸得到的PAD检测信号与由标准物显示的信号相比较而定量测定该产物。用于本研究的低聚核苷酸序列如图20所示。然后稀释这种已修饰的扩增产物，并将其加到含天然靶序列的扩增反应物中，以模拟控制污染物的试验。然后在扩增前用活性切割剂（FokⅠ）或失活的切割剂（△FokⅠ）处理所得到的污染样品。比较所得到的信号，以显示切割剂处理污染产物的破坏效率。

A.用经过修饰的扩增引物将HIV进行

PCR扩增以及定量检测该修饰的产物

下列试验中用作靶和标准序列的核酸是含有约6kb HIV的10.0kb pBR322克隆[BH10分离物，Gallo等人，Nature，313，277-284（1985）]。用BamHⅠ切割使该克隆线性化以用于扩增。用上述的克隆产生作为检测过程中产品定量分析的标准物即通过用PvuⅡ和HaeⅢ切割产生含待扩增的162个碱基对的片段的255个碱基对的片段而得到。检测引物PAD₄接在该片段上而延伸，产生一个含192个碱基对的产物。然后将得到的162-聚体检测产物与由已知量标准序列产生的192-聚体产物相比较可计算PCR产物的产率。

下列试剂是Perkin-Elmer/Cetus（Norwalk，Connecticut）Gene-Amp^TMDNA扩增试剂盒的一部分：10mM dNTPs（dATP，dCTP，dGTP，和dTTP）以及[10x]反应缓冲液，如实施例4.A所述。

AmpliTaq^TMDNA聚合酶是由Perkin-Elmer/Cetus得到的，其浓度为8单位/μl。

嗜热性DNA聚合酶是由Molecular Biology Resources，Inc.（Milwaukee，Wisconsin）赠送的，其浓度为3单位/μl。

限制性核酸内切酶BamHⅠ（25个单位/μl）、PvuⅡ（50个单位/μl）、和HaeⅢ（10个单位/μl）及它们各自的[10x]切割缓冲液是由New England Biolabs，Inc.（Beverly，Massachusetts）得到的。[10x]BamHⅠ缓冲液是1500mM NaCl、60mM Tris（PH7.9）、60mM MgCl₂、60mMβ-巯基乙醇及所含的浓度为100μg/ml的BSA。[10x]HaeⅢ缓冲液是200mM Tris（PH为7.9）、100mM乙酸镁，500mM乙酸钾及10mM DTT。[10x]PvuⅡ缓冲液是100mM Tris（PH为7.9）、100mM MgCl₂、500mM NaCl和100mM DTT。

按实施例1所述方法合成和纯化低聚核苷酸序列AP₁₆、AP₁₇′和PAD₄。

用³²P在低聚核苷酸PAD₄的5′末端进行标记，以使其比活性为约7000Ci/毫摩尔，如实施例2.C所述。

用人胎盘DNA（HP-DNA，Sigma化学用品公司，St.Louis，Missouri）作载体DNA，并将其在5mM MgCl₂中浓度为10mg/ml的溶液在90℃加热10分钟进行处理。

用Bam HI使含约5700碱基对的HIV序列的位于pBR322中的HIV克隆（HIV 11）线性化以制备靶序列。用溶于20μl1×BamHⅠ缓冲液中的25个单位的BamHⅠ在37℃将该克隆（0.026μg）保温4小时。切割后，稀释靶序列，以使在5μl TE中含有浓度为1μg/μl的HP-DNA的所需要的靶克分子数。

用于定量测定扩增产物的标准物的制法如下：将用于制备靶序列的上述所说的克隆2μg在含250单位PvuⅡ的100μl 1×PvuⅡ切割缓冲液中在37℃保温1小时。用5.0M NaCl调节该溶液为在NaCl中浓度为0.3μM，加入3倍体积的乙醇沉淀DNA。以14000xg离心30分钟，然后倾析去上清液以分离DNA小团，在真空下干燥该DNA。然后在100μl 1×HaeⅢ限制性缓冲液中用50单位HaeⅢ限制性内切酶通过在37℃下保温1小时而切割球状DNA。加热该反应物至90℃，加热5分钟以破坏剩余的酶活性。将所得到的含有162碱基对的扩增区的255个碱基对的限制性片段应与检测引物PAD₄杂交，并在有dNTPs和聚合酶的存在下进行延伸，以生成192碱基产物，该产物能用于定量测定162碱基的扩增延伸产物。

所有扩增反应均在含有总体积为50μl的1×反应缓冲液的0.5ml Eppendrof

管中进行，其中含有浓度均为200μM的每种dNTP、25微微摩尔的每种扩增引物（AP₁₆和AP₁₇′）、5.0μg HP-DNA、及2.5单位的AmpliTaq^TMDNA聚合酶。除上述成分外，反应物还含有：

反应物1：25000克分子的靶序列

反应物2：1000克分子的靶序列

反应物3：0.0克分子的靶序列

在每个管中加入2滴矿物油以防止扩增过程中蒸发。在Perkin-Elmer/Cetus热循环仪中使反应循环25次，每次循环先在90℃加热2分钟，再在50℃加热5分钟。用PAD₄检测引物选择性检测扩增产物以及标准序列，如下所述。

检测反应是在含有浓度为333μM的每种dNTP，200毫微微摩尔的PAD₄（7000Ci/毫摩尔）和0.6单位嗜热性聚合酶（MBR）的总体积为30μl的1×反应缓冲液中进行。除上述成分外，检测反应物还含有：

反应物 PvuⅡ/HaeⅢ 扩增反应物

切割标准物

1S 50微微摩尔

2S 40微微摩尔

3S 30微微摩尔

4S 20微微摩尔

5S 10微微摩尔

6S 2.0微微摩尔

1A 5.0μl反应物1

2A 5.0μl反应物2

3A 5.0μl反应物3

将试管加热到90℃，加热5分钟，再在60℃保温10分钟进行检测反应。加入30μl载样缓冲液，并加热到90℃，加热3分钟，接着冷至室温使反应终止。在15%变性PAGE中电泳样品，接着通过放射自显影观察以分析该产物。如图21的放射自显影照片所示，标准序列（1s-6s泳道）产生的检测产物其迁移性稍慢于扩增反应物得到的检测产物（泳道1A-3A）。这分别与计算得到的大小为192和162个碱基对的结果相一致。

扩增反应物与起始靶序列的量呈性关系，无靶反应物（3A泳道）未显示任何产物的信号。通过与10毫微微摩尔标准序列（反应物5s）产生的信号相比较可测得反应物2（2A泳道）含有约10毫微微摩尔/5μl反应物。由这种扩增得到的经过修饰的反应产物可用于下文中详述的控制污染试验中。

B.在切割或未切割污染物的情况下

对HIV进行PCR扩增

在本实验中，用200000，20000或0克分子的由反应物2A得到的经过修饰的扩增产物污染野生型靶（1000或0克分子）。然后用活性切割剂（FokⅠ）或失活切割剂（△FokⅠ）处理该反应物。在密闭反应管中用切割剂保温预定时间后，使反应循环以达到扩增目的。第一次PCR循环温度为90℃，可破坏FokⅠ活性，从而新生成的经过修饰的扩增产物从未切割的野生型靶分子中以指数倍数积累。

用于本实例中的所有试剂与前面所述实例5.A相同，但还使用下列附加试剂。浓度为4单位/μl的FokⅠ限制性核酸内切酶，是由New England Biolabs，Inc.（Beverly，Massachusetts）提供的。

在沸水浴中加热部分FokⅠ酶10分钟可得到失活的切割剂：△FokⅠ。

载样缓冲液与实施例2.B所述相同。

用水连续稀释用于污染样品的由反应物2A得到的经过修饰的扩增产物（原始浓度为2毫微微摩尔/μl），以达到加入样品中所需要的污染物克分子数。

所有反应均在含总体积为50μl的1×反应缓冲液，浓度为200mM的各种dNTP，25微微摩尔的各种扩增引物（AP₁₆和AP₁₇′），5.0μl的HP-DNA和2.5单位的Ampli Taq^TMDNA聚合酶的0.5ml Eppendorf

管中进行。除上述成分外，该反应混合物还含有：

反应物靶分子数污染物分子数切割剂

1 1000 20，000 FokⅠ

2 1000 20，000 FokⅠ

3 0 20，000 FokⅠ

4 0 20，000 FokⅠ

5 1000 20，000 △FokⅠ

6 1000 20，000 △FokⅠ

7 0 20，000 △FokⅠ

8 0 20，000 △FokⅠ

9 1000 200，000 FokⅠ

10 1000 200，000 FokⅠ

11 0 200，000 FokⅠ

12 0 200，000 FokⅠ

13 1000 200，000 △FokⅠ

14 1000 200，000 △FokⅠ

15 0 200，000 △FokⅠ

16 0 200，000 △FokⅠ

17 1000 0 无

18 1000 0 无

19 0 0 无

20 0 0 无

被指定含有FokⅠ的反应混合物中含有8个单位的该活性酶。指定含有△FokⅠ的反应混和物中含有等量的热失活形式的该酶。在每个管中加入2滴矿物油，以防扩增过程中发生蒸发。将反应混合物放在Perkin-Elmer/Cetus热循环仪中，在37℃加热60分钟，以完成切割反应，接着循环25次，每次循环加热到90℃，加热2分钟，再在50℃加热5分钟以完成扩增反应。按下述方法检测反应产物：将5μl各反应物与溶于TE中的1μl³²P标记的PAD4溶液（200毫微微摩尔，7000Ci/毫摩尔）相混合，接着在90℃加热5分钟，再在60℃加热10分钟。冷至室温后，加入10μl载样缓冲液。加热反应混合物至90℃加热3分钟，再冷至室温。将样品在15%变性PAGE中电泳，接着用放射自显影测定以分析该反应混和物。

放射自显影照片（图22）表示在无靶泳道（反应物7、8、15和16）中，进行扩增前先用失活切割剂处理的已污染样品，显示假阳性（162-聚体产物）。由于背景信号大，不可能看到真阳性（反应物5、6、13和14）。相反，在扩增前用活性切割剂处理的已污染样品，相对于它们相关的零克分子对照物（反应物3、4、11和12）来说显示出强1000克分子对照物（反应物1、2、9和10）。值得注意的是对于1000克分子靶，如用FokⅠ切割污染物（反应物1、2、9和10）得到的信号比未污染的或未用FokⅠ处理的1000克分子靶所得到的信号明显强得多。对于包含FokⅠ的扩增反应中扩增信号增强的这种现象虽然我们无法解释，但常常能观测到。

这种控制污染的方法特别引人注目，因为扩增反应物用切割剂处理后不必为开始扩增反应而打开反应器。这确保未处理污染物不能在扩增前进入反应容器而产生假阳性。

实施例6

PCR产生的扩增产物的核（糖核）苷酸

的修饰：已修饰扩增产物的化学与酶裂解

在本实例中，在各扩增引物中进行单个核（糖核）苷酸替代以便将易变修饰物引入由PCR产生的扩增产物的每一链中。在所得到的扩增产物中的不稳定键可利用在各自3′末端包含有单核糖核苷酸的经修饰的扩增引物进行聚合酶延伸而产生的。这说明已修饰的扩增产物适合于酶破坏（在较低温度下用RNA酶A）和化学破坏（在高温下，存在强碱时）。

以HIV的75个碱基对区作为扩增序列，用2个15-聚体扩增引物（AP₁₈和AP₂₁′）和一个26-聚体检测引物（PAD₅）使这种75-聚体靶扩增，如图23所示。

A.用已修饰扩增引物对HIV进行PCR扩增

及定量检测所得到的已修饰扩增产物

在本例中，用在其3′末端含有单个核（糖核）苷酸修饰的已修饰扩增引物AP₁₈和AP₂₁′使HIV克隆pBH10[Hahn等人，Nature，312，166（1984）]扩增。然后通过连续稀释并且用已知量野生型靶标准物同时进行再扩增，而定量测定所得到的已修饰扩增产物。储存已定量的这些修饰扩增产物样品以用于随后的实验中。

Ampli Taq^TMDNA聚合酶由Perkin-Elmer/Cetus提供，其浓度为8单位/μl。

5′-三磷酸脱氧核苷（dATP、dCTP、dGTP和dTTP）是Perkin-Elmer/Cetus Gene Amp^TM扩增试剂盒的一部分，其浓度各为10mM。

反应缓冲液[10x]含有100mM Tris（PH8.3），500mM KCl、30mM MgCl₂和明胶（Difco Laboratories，Detroit，Michi-gan），其浓度为1μg/ml。

按实施例1所述方法合成和纯化低聚核苷酸序列AP₁₈，AP₂₁′和PAD₅，所不同之处为：AP₁₈是从鸟嘌呤核苷开始的RNA基体合成，AP₂₁′是从尿苷起始的RNA基体合成。这些RNA基体可以从Glen Research Corporation（Herndon，Virginia）购买。

用³²P在其5′端标记检测低聚核苷酸PAD₅，使其比活性约为7000Ci/毫摩尔，如实施例2.C所述。

用人胎盘DNA（HP-DNA，Sigma化学公司）作载体DNA，在沸水浴中加热存在于10mM MgCl₂中的浓度为10mg/ml的该DNA溶液10分钟而进行处理。

用TE稀释HIV克隆pBH10以达到所要的克分子浓度，加入等体积在TE中的浓度为2μg/ml的HP-DNA溶液以制备靶HIV DNA。HP-DNA的存在可防止少量靶DNA非特异性地结合到容器上。

所有扩增反应均在0.5ml Eppendorf

反应管中进行，该管中含有总体积为100μl的1×反应缓冲液，浓度为100μM的各种dNTP，50微微摩尔的每种扩增引物（AP₁₈和AP₂₁′），5.0μg的HP-DNA，和3.2个单位的Ampli Taq^TM聚合酶。此外，各个反应容器中还含有：

反应物1-4：1000克分子靶

反应物5-6：0克分子靶

在每个管中加2滴矿物油以防扩增过程中发生蒸发。在Perkin-Elmer/Cetus热循环仪中使反应循环30次，每次循环先在95℃加热30秒钟，再在50℃加热5分钟。

循环结束后，将反应物1-4（1000克分子靶）合并，反应物5和6（0克分子靶）也合并以提供经过修饰扩增产物和相应的零克分子对照的匀质的有效的样品。反应物1-4的混合物称为反应物1K，反应物5和6的混合对照物称为反应物OK。

将10μl反应物1K或反应物OK与1μl³²P标记的检测探针PAD₅（7000Ci/毫摩尔，100毫微微摩尔/μl）混合，加热至95℃加热2分钟，再在60℃加热10分钟以检测扩增产物。冷至室温后，加入10μl载样缓冲液，加热反应物至90℃加热3分钟，接着再冷却至室温。该样品在10%变性PAGE上电泳，接着进行放射自显影检测，以分析反应产物。

如图24所示，1000克分子反应物（在1泳道中的反应物1K）有很强的检测信号（由75-聚体加上PAD引物的另外4个腺嘌呤核苷残基制成的79-聚体），而0克分子反应物（在2泳道中的反应物OK）没有显示可检测的信号。这表明这类已修饰的引物适用于PCR型扩增程序。

利用反应物1K的连续稀释液和已知量的野生型靶进行PCR扩增以测定扩增产物的量。

所有扩增反应均在含有总体积为50μl的1×反应缓冲液的0.5ml Eppendorf

管中进行，其中反应缓冲液中含有浓度为200μM的各种dNTP，25微微摩尔的各种扩增引物（AP₁₈和AP₂₁′），5.0μg HP-DNA和3.2单位的Ampli Taq^TMDNA聚合酶。此外，各反应物还含有：

反应7：1000克分子靶

反应8：1000克分子靶

反应9：200克分子靶

反应10：200克分子靶

反应11：0克分子靶

反应12：0克分子靶

反应物13：5μlR×n 1K的1/3×10⁵稀释液

反应物14：5μlR×n 1K的1/3×10⁵稀释液

反应物15：5μlR×n 1K的1/3×10⁶稀释液

反应物16：5μlR×n 1K的1/3×10⁶稀释液

反应物17：5μlR×n 1K的1/3×10⁷稀释液

反应物18：5μlR×n 1K的1/3×10⁷稀释液

在每个管中加2滴矿物油以防扩增过程中发生蒸发。在Perkin-Elmer/Cetus热循环仪中使每个反应管循环反应30次（每次循环先在95℃加热30秒钟，接着在50℃加热5分钟）以完成扩增。通过从每个反应管中取10μl反应物与1μl³²P标记的低聚核苷酸PAD₅（7000Ci/毫摩尔，100毫微微摩尔/μl）溶液混合，加热到95℃，加热2分钟，接着在60℃加热10分钟而检测所得到的扩增产物。冷至室温后，在各反应物中加入10μl载样缓冲液，在90℃加热3分钟，接着冷至室温，使检测产物变性。使样品在10%变性PAGE中电泳，然后通过放射自显影测定该产物。

如图25所显示的放射自显影相片，表明由反应物1

3×10⁷稀释液产生的产物（泳道17和18）显示出与1000克分子的野生型标准序列（7和8泳道）相等的信号强度。因此，在每5μl反应体积中反应物1K含有3×10¹⁰克分子的经过修饰的扩增产物。这一结果与原始扩增中的92%的平均循环效率相一致。

B.用RNA酶A切割经过修饰的扩增产物

在本实例中，用低聚核苷酸PAD₅检测之前，立即用RNA酶A切割实施例6A的经过修饰的扩增产物。如在扩增产物中存在核糖核苷酸，则希望能看到比完整长度产物短15个碱基的检测产物。由于RNA酶A与核糖一嘧啶具特异性，所以在该反应中只有下链能裂解（即，经过修饰的扩增产物的下链含有单个尿嘧啶核糖核苷酸键，而只有上链的核糖核苷酸成分是核糖-鸟苷，一种嘌呤），再者，由于标记的检测引物杂交和延伸下链，从存在有较短（64-聚体）的检测产物，显然存在切割程度。

RNA酶A从Sigma化学公司购买，并将其溶于TE/150mM NaCl中，终浓度为10mg/ml。在沸水浴中加热该溶液15分钟，以破坏DNA酶活性。将用150mM NaCl稀释该原始溶液得到的1/200（50μg/ml）稀释液，再在沸水浴中加热15分钟，冷至室温，以用于下列试验。

检测引物PAD₅与上述实例6.A所述相同。

用上述实例中的反应物1K和反应物OK作为经过修饰的扩增产物来源。

切割反应按如下所述进行：

反应产物 RNA酶

1 10μl反应物1K 1μl

2 10μl反应物1K 0μl

3 10μl反应物0K 1μl

4 10μl反应物0K 0μl

在室温下进行切割反应2小时，加入1μl³²P标记的PAD₅（7000Ci/毫摩尔，100毫微微摩尔/μl）在95℃加热2分钟，然后在60℃加热10分钟以检测所得到的产物。冷至室温后，加入1μl载样缓冲液，在90℃加热3分钟，然后冷至室温使该样品变性。然后在10%变性PAGE中将样品电泳，接着通过放射自显影测定而分析反应产物。

放射自显影照片显示于图26中。比较用RNA酶处理和未处理的经过修饰扩增产物（分别为反应物1，泳道1和反应物2，泳道2）可证实RNA酶是在核糖核苷酸位点切割，正如在泳道1中存在较短的检测产物所证实。而且该反应明显是定量的。不出所料，在二个0克分子对照（泳道3和4）中都没有检测信号。

C.用或不用强碱切割存在有污染物的HIV的PCR扩增

在本实施例中，用反应物1K的经过修饰的扩增产物污染野生型靶分子（质粒pBH10），然后用KOH（切割剂）或KCl（对照）处理。切割破坏污染物后中和样品，将该样品进行PCR扩增以证实该污染的分子已被破坏。

污染物是由反应物1K提供的，它含有已修饰扩增产物，其浓度为6×10⁹克分子/μl，由实例6.A中定量测得。连续稀释该样品，以得到每5μl含1000克分子已修饰扩增产物的工作样液。该工作样液还含有浓度为0.25μg/μl的HP-DNA，以免由于非特异性结合而损失产物分子。

靶DNA、HP-DNA、反应缓冲液、dNTPs、扩增引物AP₁₈和AP₂₁′，及带标记的检测引物PAD₅与上述实例6.A相同。

Ampli Taq^TMDNA聚合酶由Perkin-Elmer/Cetus提供，其浓度为5单位/μl。

将氢氧化钾（KOH）溶于去离子水中以得到浓度为600mM的工作液。

将氯化钾（KCl）溶于去离子水中以得到浓度为600mM的工作液。

用去离子水稀释盐酸以得到浓度为600mM的工作液。

将5μl靶（1000或0克分子）与5μl污染物的工作液（1000克分子）混合而污染靶分子。然后将5μl KOH或KCl工作液（600mM，最终钾的浓度为200mM）处理这些样品，在94℃加热60分钟完成切割反应。然后将5μl HCl加到用KOH处理的样品中或将5μl H₂O加到用KCl处理的样品中以中和该样品。这些反应物如下所示：

反应物 KOH KCl HCl H₂O 靶

1 0μl 5μl 0μl 5μl 1000

2 0μl 5μl 0μl 5μl 1000

3 0μl 5μl 0μl 5μl 0

4 0μl 5μl 0μl 5μl 0

5 5μl 0μl 5μl 0μl 1000

反应物 KOH KCl HCl H₂O 靶

6 5μl 0μl 5μl 0μl 1000

7 5μl 0μl 5μl 0μl 0

8 5μl 0μl 5μl 0μl 0

然后使所有反应物的最终体积为100μl，并用1×反应缓冲液调节溶液，并且含有浓度为100μM的每种dNTP，50微微摩尔的各种扩增引物（AP₁₈和AP₂₁′），及3.2单位的Ampli Taq^TMDNA聚合酶。然后在Perkin-Elmer/Cetus热循环仪中循环反应30次，每次循环先在95℃加热2分钟，再在50℃加热5分钟。通过将10μl各反应物与1μl³²P标记的低聚核苷酸PAD₅溶液（7000Ci/毫摩尔，100毫微微摩尔/μl）混合，在95℃加热2分钟，再在60℃加热10分钟而检测所得到的扩增产物。冷至室温后，在各反应物中加10μl载样缓冲液，先在90℃加热3分钟，然后冷至室温以使该反应变性。将样品在10%变性PAGE中电泳，接着利用放射自显影进行测定而分析该产物。

放射自显影照片显示于图27中。正如所期望的，用KCl处理样品（反应物1-4，分别为1-4泳道）时，则1000克分子的靶反应物与0克分子靶对照没有区别。这是因为所含的1000克分子污染物（该污染物不受KCl处理的影响）能产生强假阳性信号。相反，扩增前用KOH处理样品时，1000克分子靶扩增物（反应物5和6，分别为5和6泳道）易与相应的0克分子对照（反应物7和8，分别为7和8泳道）相区别。这是因为用KOH处理能有效消除1000克分子污染物的干扰信号。

实施例7

核糖核苷酸修饰的LCR产生的扩增产物：

污染物的化学和酶裂解

在本实施例中，将几个不稳定修饰物引入由LCR型扩增产生的扩增产物的每条链中。本实例中的不稳定键是通过扩增探针（在其3′末端含有单个核糖核苷酸）连接而产生的。与实例6的经过修饰的PCR产生的扩增产物相类似，在经过修饰的扩增产物中引入这类不稳定键可使它适于酶破坏（在低温下用RNA酶）和化学破坏（在高温下，有强碱存在）。

用HIV的一个含45个碱基对区域作本实例中的扩增序列。用三对扩增探针（AP₁₈/pAP₁₈′、pAP₁₉/pAP₁₉′、和pAP₂₀/pAP₂₀′）扩增45-聚体靶，如图28所示。

A.用经过修饰的扩增探针进行的HIV的

LCR扩增及该修饰探针的定量检测

在本实例中，用3对扩增探针（AP₁₈/pAP₁₈′、pAP₁₉/pAP₁₉′和pAP₂₀/pAP₂₀′）使HIV克隆，pBH10的45碱基对区扩增，如图28所示。扩增探针AP₁₈、pAP₁₉、pAP₁₉′、pAP₂₀和pAP₂₀′在3′-端含有单个核糖核苷酸残基，因此连接后产生含有不稳定核糖核苷酸键的经过修饰的扩增产物。然后通过与标准相比较，并连续稀释，再用已知量野生型HIV靶作标准再扩增从而定量测定所得到的修饰扩增产物。然后将这种定量测定的扩增产物用于后面实验中用作被控制的载带污染物。

来自嗜热栖热菌（Thermus thermophilus），HB8（ATCC No.27634）的热稳定连接酶和热稳定DNA连接酶缓冲液（TSLB）与实例2.B中所用的相同。

低聚核苷酸AP₁₈与实例6.A相同，在其3′-末端含有一个核糖鸟苷残基。

按实施例1所示方法合成和纯化5′末端经化学方法磷酸化的低聚核苷酸pAP₁₈′。

合成低聚核苷酸pAP₁₉、pAP₁₉′、pAP₂₀和pAP₂₀′，使其5′端含一个磷酸基，其3′端含单个核糖核苷酸残基。通过化学磷酸化引入磷酸基，如实例1所述。通过从合适的RNA基体开始而引入3′核糖核苷酸（即pAP₁₉由RNA-G基体合成，pAP₁₉′由RNA-C基体合成，pAP₂₀由RNA-A基体合成，pAP₂₀′由RNA-U基体合成）。RNA基体从Glen Research Corpora-tion（Herndon，Virginia）购买。合成后，将低聚核苷酸进行标准的脱保护和纯化步骤，如实施例1所述。值得注意的是下列试验中pAP₂₀在其3′端含一个核糖核苷酸不是必需的，低聚核苷酸pAP₂₀′在其5′端磷酸化也不是必需的。将这些修饰物引入以使该系统适用于作为下面试验中使用的较大数目的扩增探针。

扩增探针对AP₁₈/pAP₁₈′是用γ-³²P-三磷酸脱氧腺苷和T₄激酶的³²P标记的，其比活性约为7000Ci/毫摩尔，如实施例2.C所述。应注意，仅扩增探针AP₁₈被标记，因为低聚核苷酸pAP₁₈′的5′末端已磷酸化。

HP-DNA与实例6.A相同。

将靶DNA（pBH10克隆）在HP-DNA溶液（1μg/μl）中稀释到合适浓度，然后在沸水浴中加热15分钟，使该质粒DNA成片段和变性。

所有扩增反应在0.5ml Eppendorf

管中进行，该管中含有总体积为40μl 1x TSLB中进行，其中含有2微微摩尔的每种扩增探针（AP₁₈、pAP₁₈′、pAP₁₉、pAP₁₉′、pAP₂₀和pAP₂₀′），还含有另外的1000毫微微摩尔³²P标记的扩增对AP₁₈/pAP₁₈′，0.06单位的TSL，10μgHP-DNA，66μM NAD。各反应物含有平均比活性为333Ci/毫摩尔的总量为2.10微微摩尔的扩增对AP₁₈/pAP₁₈′。该标记提供一种检测所得到扩增产物的方法。除上述成分外，该反应物还含有：

反应物1：20渺（10^-18）摩尔靶

反应物2：20渺摩尔靶

反应物3：2渺摩尔靶

反应物4：2渺摩尔靶

反应物5：0.2渺摩尔靶

反应物6：0.2渺摩尔靶

反应物7：0.0渺摩尔靶

反应物8：0.0渺摩尔靶

在每个管中加2滴矿物油以防扩增过程中发生蒸发。在Perkin-Elmer/Cetus热循环仪中使反应循环15次，每次循环先加热到90℃，加热2分钟，接着在50℃加热5分钟。取出各反应物的1/8（5μl），加到10μl载样缓冲液中。在90℃加热3分钟，接着冷至室温使样品变性。在15%变性PAGE中电泳样品，接着进行放射自显影以分析扩增反应物。在电泳分离完成前约5分钟，在凝胶中加入已知量的低聚核苷酸对AP₁₈/pAP₁₈′（其比活性与实验中所用的相同），以作为测定扩增产物产率的标准物。这些标准物在泳道9（25毫微微摩尔）、泳道10（2.5毫微微摩尔）和泳道11（0.25毫微微摩尔）中出现。

放射自显影相片（图29）显示生成了45-聚体扩增产物且该产物与扩增反应开始时所含的靶的量直接有关。在零克分子对照中（反应物7和8，泳道7和8）没有可检测的信号，而即使由最低靶含量反应物得到的45碱基扩增产物（0.2渺摩尔，反应物5和6，分别为泳道5和6）从放射自显影相片中也可看到。通过将反应物1-6（泳道1-6）中生成的45-聚体扩增产物产生的信号与标准物（9-11泳道）相比较，测得该反应物已扩增10000倍。这表示平均循环效率为85%。

为确定经过修饰的扩增产物的量，连续稀释反应物1（基于已测定的修饰扩增产物的产率），并与野生型靶标准物一起再扩增。

所有扩增反应均在0.5ml Eppendorf

管中进行，该管中含有总体积为40μl的1×TSLB，2微微摩尔的各种扩增探针（AP₁₈、pAP₁₈′、pAP₁₉、pAP₁₉′、pAP₂₀和pAP₂₀′），以及另外的100毫微微摩尔³²P-标记的扩增探针对AP₁₈/pAP₁₈′（最终比活性为333Ci/毫摩尔），以及0.06单位TSL，5μg HP-DNA，66μM NAD。除上述成分以外，该反应物还含有如下成分：

反应物靶经过修饰的扩增

（渺摩尔）产物（渺摩尔）

12 10 0

13 10 0

14 1 0

15 1 0

16 0 0

17 0 0

18 0 100

19 0 100

20 0 10

21 0 10

22 0 1

23 0 1

在各反应管中加2滴矿物油以防扩增过程中发生蒸发。在Perkin-Elmer/Cetus热循环仪中使反应循环15次，每次循环先加热到90℃加热2分钟，再在50℃加热5分钟。将各反应物取出1/4（10μl），加到10μl载样缓冲液中。在90℃加热3分钟，接着冷至室温，使样品变性。在15%变性PAGE中电泳样品，接着进行放射自显影以分析扩增反应物。

放射自显影相片（图30）显示计算得出量为10渺摩尔的经过修饰扩增产物再扩增（分别为反应物20和21，泳道20和21）产生的信号与由10渺摩尔野生型靶（反应物12和13，分别为泳道12和13）产生的信号相等。这证明测得的反应物1中产物的产率是准确的。由反应物1产生的经过修饰的扩增产物在后面实例中作为污染的扩增产物。

B.用和不用强碱切割的含有污染物的HIV的LCR扩增

在本实例中，用来自反应1的经过修饰扩增产物污染野生型靶分子（pBH10质粒），然后用KOH（切割剂）或KCl（对照）处理。切割破坏污染物后，中和样品，用于进行LCR扩增，以证实污染分子被破坏。

加入反应混合物中的污染物是反应物1产生的经过修饰的扩增产物形式提供（在实例7.A中定量），其浓度为每1μl反应混合物为5毫微微摩尔产物。稀释该产物，将其以所需要浓度加到反应混和物中。

将氢氧化钾（KOH）溶于去离子水中，以得到浓度为700mM的工作原液。

将氯化钾（KCl）溶于去离子水中，以得到浓度为700mM的工作原液。

将盐酸（HCl）溶于去离子水中，以得到浓度为700mM的工作原液。

所有其它试剂与实例7A相同。

然后将总体积为18μl的含有靶（10渺摩尔或0渺摩尔）、污染物（10渺摩尔）、HP-DNA（5μg）和扩增探针（AP₁₈/pAP₁₈′、pAP₁₉/pAP₁₉′、和pAP₂₀/pAP₂₀′各2.0微微摩尔及³²P-标记的AP₁₈/pAP₁₈′0.10微微摩尔）的各种反应物用4μl KOH或KCl工作原液（700mM，最终反应浓度为127mM）处理，并在90℃加热30分钟以完成切割反应。然后用4μl HCl或水中和该反应物，以用于LCR扩增，如下所述。该反应物如下所表示：

反应物 KOH KCl HCl H₂O 靶（渺摩尔）

1 4μl 0μl 4μl 0μl 10

2 4μl 0μl 4μl 0μl 10

3 4μl 0μl 4μl 0μl 0

4 4μl 0μl 4μl 0μl 0

5 0μl 4μl 0μl 4μl 10

6 0μl 4μl 0μl 4μl 10

7 0μl 4μl 0μl 4μl 0

8 0μl 4μl 0μl 4μl 0

然后将所有反应物最终体积调节为40μl，这样，它们是1×TSLB，66μM NAD和含有0.06单位TSL。在各反应物中加2滴矿物油以防扩增过程中发生蒸发。然后在Perkin-Elmer/Cetus热循环控制装置中使反应循环15次，每次循环先加热到90℃加热2分钟，接着再在50℃加热5分钟。各反应物取出1/8（5μl），加到10μl载样缓冲液中，在90℃加热3分钟使其变性。在15%变性PAGE中电泳该样品，接着进行放射自显影，以分析所得到的产物。

放射自显影相片（图31）显示用KCl处理的污染样品出现10渺摩尔靶信号（反应物5和6分别为泳道5和6），该信号与0渺摩尔靶的信号（反应物7和8分别为泳道7和8）没有区别。这是可预料的，因为干扰信号是由10渺摩尔污染物产生的。相反，用KOH处理的样品没有显示出由0渺摩尔靶反应物（反应物3和4，分别为泳道3和4）产生的信号，而10渺摩尔靶信号（反应物1和2分别为泳道1和2）明显是0以上的正信号。这说明KOH切割剂有效地消除了由于污染物的存在而产生的任何干扰信号。

C.HIV经LCR扩增后用RNA酶A切割

在本实例中，用与上述实例相同的经过修饰的扩增探针（图28）使部分HIV扩增，用RNA酶A作切割剂切割所得到的产物。因为RNA酶A与嘧啶残基具特异性，这种处理只能切割扩增产物的下链。所得到的修饰扩增产物的下链含有两个内核糖-嘧啶键，而上链含有两个内核糖嘌呤残基。因此，用³²P标记扩增探针pAP₂₀′，结果只有所得扩增产物的下链被标记。

因为pAP₂₀′已含有5′-磷酸基团，用下述方法通过Kina-tion交换程序引入³²P-标记。将10单位T₄聚核苷酸激酶（New England Biolabs，Inc.）加到含有存在于10μl缓冲液（40mM Tris，PH7.6/10mM MgCl₂/12.5mM DTT）的1.0皮摩尔低聚核苷酸pAP₂₀′、2.5毫微摩尔5′-磷酸腺苷（ADP，Sigma化学公司）和100微微摩尔γ-³²P5′-三磷酸腺苷（ATP，7000Ci/毫摩尔）的溶液中。在37℃保温该反应混和物30分钟，接着在90℃加热5分钟，以停止该交换反应。然后将反应物通过Sephadex

G-50柱（Sigma化学公司），用10mM三乙基碳酸氢铵作洗脱液，从过量标记物中分离经过标记的低聚核苷酸。合并含低聚核苷酸的部分，用真空快速（Speedvac

）浓缩器（Savant Ins-truments，Inc.，Farmingdale，New York）蒸发。将产物重新悬浮于20μl TE（50毫微微摩尔/μl）中，测定其比活性约为3500Ci/毫摩尔。

扩增探针（AP₁₈/pAP₁₈′、pAP₁₉/pAP₁₉′和pAP₂₀/pAP₂₀′）、热稳定连接酶（TSL），热稳定DNA连接酶缓冲液（TSLB）、载体DNA（HP-DNA）和靶DNA（质粒pBH10）与实施例7.A所述相同。

将RNA酶A（Sigma化学公司）溶于TE/150mM NaCl中，其浓度为10mg/ml。在沸水浴中加热该溶液15分钟以破坏污染的DNA酶活性。用TE稀释该样液的1/20稀释液用于下列实验中。

所有扩增反应均在0.5ml Eppendrof

管中进行，该管中含总体积为20μl 1×TSLB，其中含1.0微微摩尔的每种扩增探针（AP₁₈、pAP₁₈′、pAP₁₉、pAP₁₉′、pAP₂₀和pAP₂₀′），还含有另外50毫微微摩尔³²P标记的扩增探针pAP₂₀′、0.03单位TSL、5μg HP-DNA以及66μM NAD。这样，各反应物总共含有最终比活性约为167Ci/毫摩尔的1.05微微摩尔pAP₂₀′。这种标记提供了一种检测所得到扩增产物下链的方法。除上述成分以外，该反应物还含有：

反应物1：0.0渺摩尔靶

反应物2：0.0渺摩尔靶

反应物3：10.0渺摩尔靶

反应物4：10.0渺摩尔靶

在每个管中加2滴矿物油以防扩增过程中发生蒸发。在Perkin-Elmer/Cetus热循环控制仪中使反应循环15次，每次循环先在90℃加热2分钟，再在50℃加热5分钟。将1/4（5μl）反应物加到5μl载样缓冲液中，然后在90℃加热3分钟，并冷至室温使其变性。再从每一反应物中另外取出1/4（5μl），用2μl RNA酶A溶液（1.0μg）处理。各反应物在室温下保温60分钟，接着在各样品中加入5μl载样缓冲液，然后在90℃加热3分钟，再冷至室温而终止反应。用RNA酶A处理的反应物称为反应物1R，2R，3R和4R。

在10%变性PAGE中电泳样品，接着进行放射自显影以分析反应产物。放射自显影相片（图32）显示在10渺摩尔靶反应物（反应物3和4，分别为泳道3和4）中有45-聚体扩增产物，而相应的无靶对照（反应物1和2，分别为泳道1和2）未显示扩增产物信号。相反，用RNA酶A处理的样品没有显示任何45-聚体扩增产物（反应物1R、2R、3R和4R，分别为泳道5、6、7和8）的信号。这证明RNA酶A切割剂能有效破坏经过修饰的扩增产物。

Claims

1、一种用于降低扩增过程中扩增产物污染的方法，它包括：

(a)将至少一个修饰物引入所述的扩增产物中，从而使所产生的修饰扩增产物与所述的靶序列有区别；

(b)利用一种工具作用于所述的修饰扩增产物，以选择性除去该修饰扩增产物。

2、根据权利要求1所述的方法，其中所述的修饰物选自由下列物质组成的组：配位基，交联剂，酶识别位点，和可用化学方法裂解的位点。

3、根据权利要求2所述的方法，其中所述的修饰物是一种酶识别位点以及所述的用来选择性除去该修饰扩增产物的工具是一种酶。

4、根据权利要求3所述的方法，其中所述的酶识别位点是RNA酶识别位点，所述的用来选择性除去该修饰扩增产物的工具是一种RNA酶。

5、根据权利要求4所述的方法，其中所述的RNA酶选自由RNA酶H和RNA酶A组成的组。

6、根据权利要求5所述的方法，其中所述的RNA酶是RNA酶A。

7、根据权利要求3所述的方法，其中所述的酶识别位点是一种限制性内切酶识别位点，所述的用于选择性除去该修饰扩增产物的工具是一种限制性内切酶。

8、根据权利要求7所述的方法，其中所述的限制性内切酶识别位点由一种远距离切割型限制性内切酶识别。

9、根据权利要求8所述的方法，其中所述的远距离切割型限制性内切酶是FckⅠ。

10、根据权利要求2所述的方法，其中所述的修饰物是一种配位基，所述的用于选择性除去该修饰扩增产物的工具是所述配基的一种固定化的特异性结合配合体。

11、根据权利要求10所述的方法，其中所述的配位基选自由生物素和萤光素组成的组。

12、根据权利要求2所述的方法，其中所述的修饰物是一种交联剂，所述的用于选择性除去该修饰扩增产物的工具是该交联剂的活化剂。

13、根据权利要求2所述的方法，其中所述的修饰物是一种可用化学方法裂解的位点。

14、根据权利要求13所述的方法，其中所述的化学裂解位点通过用一种同源双功能连接剂连接部分探针序列3′-和5′-末端而引入到扩增探针中，所述的连接剂选自由下列物质组成的组：二硫双（琥珀酰亚胺基-丙酸）、二琥珀酰亚胺基-酒石酸和亚乙基二醇双（琥珀酰亚胺基-琥珀酸）。

15、根据权利要求13所述的方法，其中所述的化学裂解位点包含一个内核糖核苷酸键。

16、根据权利要求1所述的方法，其中所述的扩增过程是聚合酶链反应型扩增过程或连接酶链反应型扩增过程。

17、一种用于聚合酶链反应型扩增过程中的试剂盒，它包括：

（a）至少一种经过修饰的扩增引物，它能将至少一个修饰物引入PCR扩增产物中，从而使所产生的修饰的PCR扩增产物与靶顺序有区别;

（b）一种用于选择性除去所述的修饰PCR扩增产物的工具。

18、根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述的经过修饰的扩增引物选自由下列物质组成的组：配位基修饰的扩增引物。交联剂修饰的扩增引物，酶识别位点修饰的扩增引物，以及在一种可化学裂解位点的存在下修饰的扩增引物。

19、根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述的经过修饰的扩增引物是一种酶识别位点修饰的扩增引物，所述的用于选择性除去该PCR修饰扩增产物的工具是一种酶。

20、根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述的酶识别位点是一种RNA酶识别位点，所述的用来选择性除去该修饰PCR扩增产物的工具是一种RNA酶。

21、根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述的RNA酶选自由RNA酶H和RNA酶A组成的组。

22、根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述的RNA酶是RNA酶A。

23、根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述的酶识别位点是一种限制性内切酶识别位点，所述的用于选择性除去该修饰PCR扩增产物的工具是一种限制性内切酶。

24、根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述的限制性内切酶识别位点是由一切割型限制性内切酶识别的。

25、根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述的远距离切割型限制性内切酶是FokⅠ。

26、根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述的经过修饰的扩增引物是一种在一种可化学裂解位点存在下被修饰的扩增引物，所述的用于选择性除去由PCR产生的修饰型扩增产物的工具是一种强碱。

27、根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述的经过修饰的扩增引物含有一种核糖核苷酸取代物。

28、根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述的核糖核苷酸取代物是在所述的经过修饰的扩增引物的3′-末端上。

29、一种用于聚合酶链反应型扩增过程中的试剂盒，它包括：

（a）一种三磷酸脱氧核苷酯混合物，其中至少有一种所述的三磷酸脱氧核苷酯被修饰，从而至少将一种修饰物引入PCR扩增产物中，使所产生的经过修饰的PCR扩增产物可以与靶序列区分开，以及

（b）一种用于选择性除去所述的修饰PCR扩增产物的工具。

30、根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述的经过修饰的三磷酸脱氧核苷酯选自由下列物质组成的组：配位基修饰的三磷酸脱氧核苷酯，交联剂修饰的三磷酸脱氧核苷酯，酶识别位点修饰的三磷酸脱氧核苷酯，以及在一种可化学裂解位点的存在下而修饰的三磷酸脱氧核苷酯。

31、根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述的酶识别位点是一种三磷酸脱氧核糖核苷酯，所述的用于选择性除去该经过修饰的PCR扩增产物的工具是一种RNA酶。

32、根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述的经过修饰的三磷酸脱氧核苷酯是一种三磷酸脱氧核糖核苷酯，所述的用于选择性除去该经过修饰的PCR扩增产物的工具是一种强碱。

33、一种用于连接酶链反应型扩增过程中的试剂盒，它包括：

（a）至少一种经过修饰的扩增探针，该探针能至少将一个修饰物引入到LCR扩增产物中，从而使所产生的经过修饰的LCR扩增产物可与靶序列相区分;

（b）一种用于选择性除去所述的经过修饰的LCR扩增产物的工具。

34、根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述的经过修饰的扩增探针选自由下列物质组成的组：配位基修饰型扩增探针，交联剂修饰型扩增探针，酶识别位点修饰型扩增探针，以及在一种可化学裂解位点的存在而修饰的扩增探针。

35、根据权利要求34所说的试剂盒，其中所说的经过修饰的扩增探针是一种酶识别位点修饰的扩增探针，所说的用于选择性除去所述经过修饰的LCR产生的扩增产物的工具是一种酶。

36、根据权利要求35所述的试剂盒，其中所述的酶识别位点是一种RNA酶识别位点，所述的用于选择性除去该经过修饰的LCR扩增产物的工具是一种RNA酶。

37、根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述的RNA酶选自由RNA酶H和RNA酶A组成的组。

38、根据权利要求37所述的试剂盒，其中所述的RNA酶是RNA酶A。

39、根据权利要求35所述的试剂盒，其中所述的酶识别位点是限制性内切酶识别位点，所述的用于选择性除去该经过修饰的LCR扩增产物的工具是一种限制性内切酶。

40、根据权利要求39所述的试剂盒，其中所述的限制性内切酶识别位点是由一种远距离切割型限制性内切酶识别的。

41、根据权利要求40所述的试剂盒，其中所述的远距离切割型限制性内切酶是FokⅠ。

42、根据权利要求34所述的试剂盒，其中所述的经过修饰的扩增探针是一种在一种可化学裂解位点存在而修饰的扩增探针，所述的用于选择性除去该经过修饰的LCR扩增产物的工具是一种强碱。

43、根据权利要求34所述的试剂盒，其中所述的经过修饰的扩增探针含有一个核糖核苷酸取代物。

44、根据权利要求43所述的试剂盒，其中所述的核糖核苷酸取代物位于所述的经过修饰的扩增的探针的3′末端上。

45、一种用于扩增一个靶序列的扩增序列的方法，它包括下列步骤：

（a）在一种聚合试剂存在下，在有利于所述扩增引物与所述的扩增序列杂交的条件下将所述的扩增序列与过量的至少两种扩增引物以及过量的三磷酸脱氧核苷酯相接触，其中至少一种所述的扩增引物和/或所述的三磷酸脱氧核苷酯中被引入了一种修饰物，该修饰物选自由下列物质组成的组：配位基、交联剂、酶识别位点以及可以化学裂解的位点;

（b）经过修饰的扩增产物的生成;

（c）使所述的经过修饰的扩增产物与所述的靶序列分离;

（d）重复步骤（a）至（d）;以及

（e）将所述的经过修饰的扩增产物与用于选择性除去该修饰扩增产物的工具相接触。

46、根据权利要求45所述的方法，其中步骤（e）在该扩增过程开始时进行。

47、一种用于扩增一种靶序列的扩增序列的方法，它包括下列步骤：

（a）在一种连接剂存在下，在有利于扩增探针与所述的扩增序列杂交的条件下将所述的扩增序列与过量的至少两对扩增探针接触，其中至少一对所述的扩增探针中被引入了一种修饰物，该修饰物选自由下列物质组成的组：配位基，交联剂，酶识别位点和可以化学裂解的位点;

（b）使经过修饰的扩增产物形成;

（c）将所述的经过修饰的扩增产物与所述的靶序列分离;

（d）重复步骤（a）至（d）;以及

（e）将所述的经过修饰的扩增产物与用于选择性除去该修饰扩增产物的工具接触。

48、根据权利要求47所述的方法，其中步骤（e）在该扩增过程开始时进行。