CN107002126A - 使用纳米结构阵列的聚合物的高效光学分析 - Google Patents

使用纳米结构阵列的聚合物的高效光学分析 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于检测来自纳米结构例如纳米孔、纳米井或纳米颗粒的阵列上的平行反应的光学信号的序列的方法和设备。根据本发明，提供了纳米结构阵列，每个纳米结构包括反应位点并且各自能够限制生成光学信号序列的反应，并且阵列的纳米结构被布置成簇，每个簇包括一定数目的纳米结构。每个不同的簇被布置在不同的分辨率有限区域内，并且每个簇中的纳米结构的数目大于一或是平均值大于零的随机变量。来自纳米结构中的反应的光学信号通过与阵列可操作地关联的光学系统被检测。

Description

使用纳米结构阵列的聚合物的高效光学分析
背景
在过去十年间开发的DNA测序技术已经彻底改革了生物科学，例如Lemer等人，TheAuk,127:4-15(2010)；Metzker,Nature Reviews Genetics,11:31-46(2010)；Holt等人，Genome Research,18:839-846(2008)；并且具有在未来几年内彻底改革医疗实践的许多方面的可能性，例如Voelkerding等人,Clinical Chemistry,55:641-658(2009)；Anderson等人,Genes,1:38-69(2010)；Freeman等人,Genome Research,19:1817-1824(2009)；Tucker等人,Am.J.Human Genet.,85:142-154(2009)。然而，要实现这种可能性，仍然存在许多必须解决的挑战，包括减少每次运行测序的成本、简化样品制备、减少运行时间、增加序列读段长度、改善数据分析等等，例如，Baker,Nature Methods,7:495-498(2010)；Kircher等人,Bioessays,32:524-536(2010)；Turner等人,Annual Review of Genomics and HumanGenetics,10:263-284(2009)。在纳米制造阵列例如纳米孔阵列上的单分子测序可以解决这些挑战中的一些，例如，Maitra等人,Electrophoresis,33:3418-3428(2012)；Venkatesan等人,Nature Nanotechnology,6:615-624(2011)；然而，这些方法具有其自身的一套技术困难，例如，可靠的纳米结构制造、DNA穿过纳米孔的移位速率的控制、核苷酸区分、对来自纳米孔传感器的大型阵列的电信号的检测等等，例如，Branton等人,NatureBiotechnology,26(10):1146-1153(2008)；Venkatesan等人(以上引用)。
核苷酸的光学检测已经作为纳米孔测序领域中的一些技术困难的潜在的解决方案被提出，例如Huber,国际专利公布WO 2011/040996；Russell,美国专利6,528,258；Pittaro,美国专利公布2005/0095599；Joyce，美国专利公布2006/0019259；Chan，美国专利6,355,420；McNally等人,Nano Lett.,10(6):2237-2244(2010)等等；并且已经在使用零模波导阵列的单分子测序领域中实现，例如Eid等人，Science，323：133-138(2009)。然而，基于光学的纳米孔和零模波导测序的限制涉及光学检测系统的分辨率限制。虽然目前的纳米尺度制造技术能够生产具有相当的孔对孔或井对井(well-to-well)间隔的小于10nm的孔和井(well)的阵列，因为光学检测系统的分辨率限制，这种阵列的全部潜力不能被用于有利地实现更高的通量速率。
鉴于上述内容，如果用于改善由检测分辨率限制所施加的限制的方法可得，这对于通常的纳米孔传感器技术和其特定应用，例如基于光学的纳米孔测序和/或零模波导测序将是有利的。
发明概述
本发明涉及使用高密度纳米结构(例如纳米孔或纳米井)阵列用于聚合物(例如多核苷酸)的高效光学检测和分析的装置和方法。
在一些实施方案中，本发明涉及用于检测来自阵列上的平行反应的光学信号的序列的方法和设备，其中本发明的设备包括以下元件：(a)纳米结构阵列，所述纳米结构各自包括反应位点，并且各自能够限制生成光学信号序列的反应，阵列的纳米结构被布置成簇，所述簇各自包括一定数目的纳米结构并且每个不同的纳米结构簇被布置在不同的分辨率有限区域内；和(b)与阵列可操作地关联的用于检测来自反应的光学信号的光学系统。在一些实施方案中，每个簇中的纳米结构的数目大于一或是平均值大于零的随机变量。在一些前述实施方案中，被分析的聚合物包括多核苷酸，并且这种多核苷酸以电泳方式从“顺式”室到“反式”室移位穿过纳米孔。
在其他实施方案中，本发明包括对多核苷酸进行测序的方法，所述多核苷酸各自具有附接至核苷酸序列的多个光学标记物，所述方法包括以下步骤：(a)以一定浓度和流通量使单链多核苷酸移位穿过纳米孔阵列，其中每个单链多核苷酸的基本上每个核苷酸具有附接的光学标记物，所述光学标记物能够生成指示其所附接的核苷酸的光学信号，并且其中纳米孔阵列包括纳米孔的簇，以使不同簇的纳米孔在不同的分辨率有限区域内；(b)在每个核苷酸离开纳米孔后将每个核苷酸的光学标记物暴露于激发辐射；(c)每当光学信号来自单个光学标记物时，在纳米孔阵列的每个分辨率有限区域中测量由离开纳米孔的光学标记物生成的这种光学信号，以鉴定光学标记物附接的核苷酸；以及(d)从单个光学标记物的光信号序列确定多核苷酸的核苷酸序列。在上述的一些实施方案中，选择分辨率有限区域内的多个纳米孔、多核苷酸的浓度、和/或通过所述纳米孔阵列的多核苷酸的流通量，以使阵列中的可测序纳米孔的数目最大化。在上述方法的其他实施方案中，控制通过纳米孔阵列的单链多核苷酸的流通量和/或移动，以通过控制跨纳米孔阵列的电势来使阵列中的可测序纳米孔的数目最大化。也就是说，在一些实施方案中，在测序操作期间，跨纳米孔阵列的电势是变化的，以使测序通量最大化，例如通过使阵列中的可测序纳米孔的总数目最大化。
本发明在许多实施方式和应用中示例，其中的一些被总结如下并且贯穿本说明书。
附图简述
图1A阐明了面对信号分辨率限制的纳米孔事件的光学检测的局限性。
图1B-1E阐明了与信号分辨率限制相关的多种纳米孔阵列配置。
图1F-1G阐明了分辨率有限区域或范围的分析物到达时间和信号采集速率。
图2A-2C阐明了杂合纳米孔的实施方案。
图2D阐明了通过使用寡核苷酸杂交来放置FRET对的成员的本发明的纳米孔的实施方案。
图2E阐明了杂合纳米孔的一个实施方案，其中固态膜(201)的表面涂覆了疏水性层(202)，脂质层(203)粘附于疏水性层(202)上。脂质与插入的纳米孔蛋白质形成千兆欧姆封接(gigaohm seal)。
图3阐明了用于本发明的纳米孔装置和方法。
图4A-4F阐明了在固相膜中跨孔眼(aperture)布置于脂质双层中的标记的蛋白质纳米孔的簇。
发明详述
虽然本发明服从于多种修改形式和替换形式，其细节已经通过举例显示于附图中并且将被详细描述。然而应该理解的是，意图并非是为了限制本发明于所描述的特定的实施方案。相反，意图覆盖落在本发明的精神和范围内的所有修改形式、等价物和替代物。例如，为了阐明的目的显示了本发明的具体的纳米孔类型和数目、具体的标记物、FRET对、检测方案、制造方法。然而应当理解的是，本公开内容并非意图被限制在这一方面，因为可以利用其他类型的纳米孔、纳米孔阵列和其他的制造技术来实施本文所讨论的系统的各个方面。本发明的方面的指导见于本领域普通技术人员众所周知的许多可获得的参考文献和论文，包括，例如Cao,Nanostructures&Nanomaterials(Imperial College Press,2004)；Levinson,Principles of Lithography,第二版(SPIE Press,2005)；Doering和Nishi,编,Handbook of Semiconductor Manufacturing Technology,第二版(CRC Press,2007)；Sawyer等人，Electrochemistry for Chemists,第二版(Wiley Interscience,1995)；Bard和Faulkner,Electrochemical Methods:Fundamentals and Applications,第二版(Wiley,2000)；Lakowicz,Principles of Fluorescence Spectroscopy,第三版(Springer,2006)；Hermanson,Bioconjugate Techniques,第二版(Academic Press,2008)等等，其相关部分通过引用特此并入。
本发明涉及使用与光学检测系统相偶联的密集纳米级结构阵列用于高效聚合物分析的方法和装置，所述纳米结构例如纳米孔、纳米井、纳米颗粒等。在一些实施方案中，感兴趣的聚合物是线性聚合物，其包括以线性链连接的至少两个不同种类的单体的序列，其中至少一个种类的单体的基本上每一个被光学标记物标记，所述光学标记物能够生成指示其所附接的单体的光学信号。在其他实施方案中，感兴趣的聚合物是线性聚合物，其包括以线性链连接的至少两个不同种类的单体的序列，每个种类的基本上每个单体被能够生成指示其所附接的单体的光学信号的光学标记物标记。在又其他实施方案中，感兴趣的聚合物是多核苷酸，该多核苷酸能够参与生成含有关于这种多核苷酸的核苷酸序列的信息的光学信号序列的反应。特别感兴趣的聚合物是多核苷酸，特别是单链DNA。也特别感兴趣的是其核苷酸用荧光染料标记的DNA聚合物，所述荧光染料例如来自互相猝灭组的荧光染料。在一个方面，本发明提供了确定样品中全部或部分聚合物的单体序列的方法和装置。在另一个方面，本发明提供了确定样品中聚合物或多核苷酸的光学特征(signature)或指纹(fingerprint)的方法。本发明的方法和装置解决了鉴于光学检测的分辨率限制，高容量纳米孔或纳米井阵列的高效使用问题。本发明的方法和装置还解决了由非功能纳米孔或纳米井引起的数据采集能力损失的问题，这可能由各种条件引起，包含但不限于膜故障或制造误差的缺陷、无活性酶例如无活性或错误连接的聚合酶，和当采用蛋白质纳米孔时，蛋白质错误折叠、亚基错误聚集、膜中的蛋白质纳米孔的不可操作取向等等。
如本文所使用的，“分辨率有限区域”是纳米孔或纳米井阵列的表面的区域，在其中的单个特征或光发射源不能被光学信号检测系统区分。不希望受理论限制，这种分辨率有限区域由光学系统的分辨率极限(有时也称为“衍射极限”或“衍射屏障”)决定。这种极限由发射源的波长和光学部件决定，并且可以由d＝λ/NA定义，其中d是可分辨的最小特征，λ是光的波长，且NA是用于聚焦光的物镜的数值孔径。因此，每当两个或更多个纳米孔在分辨率有限区域内并且在各自的纳米孔处生成两个或更多个光学信号时，光学检测系统不能区分或确定哪个光学信号来自哪个纳米孔。根据本发明，纳米孔阵列的表面可被划分或细分成对应于分辨率有限区域的非重叠区域或基本上不重叠的区域。对应于分辨率有限区域的这种细分区的大小可取决于所采用的特定光学检测系统。在一些实施方案中，每当光发射源在可见光谱内时，分辨率有限区域在300nm2至3.0μm2的范围内；在其他实施方案中，分辨率有限区域在1200nm2至0.7μm2的范围内；在其他实施方案中，分辨率有限区域在3×104nm2至0.7μm2的范围内，其中上述区域的范围是关于纳米孔或纳米井阵列的表面。在一些实施方案中，可见光谱意指在约380nm至约700nm范围内的波长。
纳米孔阵列中活跃纳米孔的平均数目可以如下估计。设α为功能纳米孔的分数；设t为聚合物穿过纳米孔的平均经过时间；并且设w为到下一个聚合物或聚合物片段的平均等待时间。如果纳米孔每当它正在移位聚合物时被定义为“活跃”，则纳米孔的活跃分数(active fraction)u的表达可如下提供：
a＝αt/(w+t)该表达式表明，u可通过增加α或t或通过降低w而增加。例如，可通过改进纳米孔阵列的制造来增加α，可通过增加分析的聚合物的长度来增加t，并且可通过增加聚合物跨纳米孔阵列的流通量来减少w，例如通过增加聚合物的浓度和/或增加聚合物驱动力，例如在DNA的情况下跨阵列的电势。如上所述，这些提高纳米孔阵列效率的方法是有限的，因为尽管它们可导致更大数目或密度的活跃纳米孔，但是只要两个或更多个纳米孔在分辨率有限区域内是活跃的，则所得到的信号不提供有用的信息。因此，在一个方面，考虑到分辨率的极限所施加的束缚，本发明的方法提供了使提供有用信息的纳米孔数目最大化的u值。在一个方面，能够提供有用的序列信息的纳米孔是在分辨率有限区域内唯一活跃的纳米孔，本文称为“可测序纳米孔”。也就是说，可测序纳米孔是在同一分辨率有限区域内同时不具有其他活跃纳米孔的纳米孔。对于以正方形阵列间隔开的纳米孔，可如下估计可测序纳米孔的数目。
假设面积为A的方形纳米孔簇的实施方案，簇之间的距离为d，其中d是限定分辨率有限区域的衍射极限。那么簇的数目是A/d2＝4270个簇。具有正好一个活跃纳米孔(即正好一个可测序纳米孔)的簇的分数p1由p1＝ku(1-u)k-1给出，其中u再次是纳米孔的活跃分数。可测序孔的总数平均为Ap1/d2或kAu(1-u)k-1/d2。例如，如果u固定在u＝0.2，则对于p1的上述表达式以k＝4和k＝5最大化。为了阐明，如果u固定在u＝0.2并且簇的数目为1000，则当k＝4或k＝5时p1的值最大化。以k＝4为例，孔的总数将为4000，且可测序孔的数将为平均410个。为了比较，具有相同间距d的单孔网格将仅具有1000个孔，并且可测序孔的数目将为平均仅200个。因此，在该实例中，本发明实现了超过普通网格的通量的两倍。
图1A，不意图代表与纳米孔阵列毗邻的实际物理或化学条件，显示两个固相膜：在分辨率有限区域(101)内具有单个纳米孔的膜(100)和分辨率有限区域(103)内具有多个(K个)纳米孔的膜(102)。下面，膜(100)和(102)显示由两种不同标记的单体(表示为连接的黑色和白色圆圈)组成的聚合物(108)。聚合物(108)具有跨膜(100)和(102)的平均长度、浓度和流通量。聚合物(108)的流通量可通过多种方法产生，例如当聚合物是多核苷酸时，流通量可通过电场产生。当每个单体从膜(100)和(102)的纳米孔离开时，聚合物(108)的单体上的光学标记物被激发生成光学信号。例如，当光学标记物是例如FRET受体的荧光标记物时，可使用全内反射荧光(TIRF)显微镜系统作为检测系统来实现这种激发，如(114)图解阐明的。可使用FRET供体-受体对直接或间接地激发荧光标记物。对于每个分辨率有限区域，检测器(115)和(116)收集光学信号并将其转换成可展示的值，例如代表来自分辨率有限区域X(111)的光学信号的曲线和代表来自分辨率有限区域Y(113)的光学信号的曲线。在一些实施方案中，图1A中阐明的分析系统的目标是使用由光学标记物生成的光学信号来鉴定聚合物(108)中的单体的序列。如(101)所示，在单个可操作纳米孔在分辨率有限区域内的情况下，这可容易地实现。然而，当多于一个纳米孔在分辨率有限区域内时，并且多于一个聚合物移位穿过这样的纳米孔导致生成多个光学信号，所记录的信号例如(113)，丢失可确定单体序列的信息。因此，例如，在单个纳米孔的情况下，可在2-标记物体系中成功地进行碱基(或单体)调用；即，A、B(即“非A”)、B和A(110)；而在多个纳米孔的情况下，碱基调用不能成功进行；也就是说，调用将是A、N、B和N，其中两个“N”调用对应于其组分不能被分配给分辨率有限区域(103)内的特定纳米孔的混合光学信号。
如上所述，可通过以下来解决分辨率有限区域内的多个纳米孔的问题：制造纳米孔阵列，使得纳米孔的密度足够低，以便在每个分辨率有限区域内存在最大的单个纳米孔，如图1B所阐明。纳米孔阵列(130)的一部分的纳米孔(131)被间隔开(136)使得在具有直径(139)的分辨率有限区域(134)内仅有一个纳米孔。不幸的是，这种方法不是有效的，并且不利用允许高得多的密度的纳米孔的制造能力，如图1C所阐明，其中纳米孔阵列(132)的一部分的纳米孔(131)被间隔开(137)使得在分辨率有限区域(134)内存在多个纳米孔。当采用包括这样的固相膜的杂合纳米孔时，效率的不足特别加剧：该固相膜具有包括固定于其中的蛋白质纳米孔的制造的孔眼,例如，如Huber等人的美国专利公布US2013/0203050中所描述，其通过引用并入本文。虽然杂合纳米孔由于固定的蛋白质的高度规则的孔洞(bore)或腔而非常有用，但仅一部分固定的蛋白质纳米孔可以是有功能的或可操作的；也就是说，只有一部分具有无阻塞的孔洞，该无阻塞的孔洞在由固相膜间隔的两个室之间提供流体连通路径(本文称为“可操作部分”或“功能部分”)。通常，杂合纳米孔阵列的蛋白质纳米孔具有在10-50％范围内的可操作部分，并且通常具有约25％的可操作部分。对于这种纳米孔阵列，图1B所示的布置的低效率很明显：阵列的很大一部分将无法操作并且因此是无用的。
这个问题可通过提供纳米孔簇阵列来解决，如图1D(显示直线簇阵列)和1E(显示六边形簇阵列)所阐明。部分地，本发明是基于以下认识和鉴定：可通过采用这样的纳米孔阵列来增加每单位面积的纳米孔阵列的测序通量，所述纳米孔阵列是纳米孔簇阵列，其中每个簇含有多个纳米孔并且其中簇-簇距离近似等于衍射极限距离。换句话说，不同簇中的纳米孔在不同的分辨率有限区域中。普通技术人员将会认识到，该原理可以应用于用于生成光学信号序列的任何纳米结构(例如纳米井或纳米颗粒)阵列。回到图1D和1E，纳米孔阵列(140)的一部分示出了多个纳米孔(或孔眼)(131)的簇(141)，其中簇(141)以足够大的簇间距离(142)间隔开，使得每个簇可在单独的分辨率有限区域(144)内并且不同簇的纳米孔不共享分辨率有限区域。在一个实施方案中，选择多个纳米孔以使可操作纳米孔的平均数目在1和2之间。在另一个实施方案中，簇内的多个纳米孔在2至9的范围内；在又另一个实施方案中，簇内的多个杂合纳米孔在2至6的范围内。类似地，纳米孔簇可被布置成如图1E所示的六边形阵列(140)。在这种阵列中，表面(195)，例如固相膜的表面，被划分成具有基本上等于分辨率有限区域(192)的面积并且各自含有纳米孔(194)簇的六边形区域(例如，190)。在一些实施方案中，在纳米结构簇阵列中，簇内的纳米结构间距离可以在10-200nm的范围内，并且簇间距离(例如，中心到中心距离)可以为至少500nm或至少1μm。在其他实施方案中，簇间距离可以在500nm至10μm、或1μm至10μm的范围内。
在一些实施方案中，也可通过将蛋白质纳米孔布置于由含有孔眼阵列(4000)的固相膜支撑的脂质双层中来形成簇，例如，如图4F阐明的。例如，阵列(4000)可包括在固相支撑物(图4F中的4100和图4A中的4102)中制造(例如钻孔、蚀刻等)的孔眼。这种孔眼的几何形状可根据所采用的制造技术而变化。例如，在图4F中这种孔眼(4202)被描绘为圆形,且在图4E中孔眼(4202)被描绘为矩形。在一些实施方案中，如图4F所阐明，每个这样的孔眼与独立的分辨率有限区域(4244)相关联或由其包围；然而，在其他实施方案中，多个孔眼可以在同一分辨率有限区域内。孔眼的横截面积可以变化很大，并且可以或可以不在不同簇之间相同，尽管这些区域通常与常规制造方法的结果基本上相同。在一些实施方案中，孔眼具有在10至200nm范围内的最小线性尺寸(4103)(例如在圆形孔眼的情况下的直径)，或具有在约100至3×104nm2范围内的面积。跨孔眼布置脂质双层，在图4A-4D中以横截面阐明。在一些实施方案中，这种脂质双层(4120)被布置在固相膜(4100)的一个表面上。在一些实施方案中，将蛋白质纳米孔(图4A-4F中的4104)插入跨越孔眼的脂质双层(4120)的部分，其中在一些实施方案中，例如所示的那些,蛋白质纳米孔可被例如FRE供体直接标记(4127)。在一些实施方案中，将这样的蛋白质纳米孔从固相膜(4100)的一侧上的室中的溶液中插入，这导致将蛋白质纳米孔随机放置到孔眼中，使得不同的孔眼可接收不同数目的蛋白质纳米孔，如图4A-4D所阐明，其中显示没有、有一个、两个或三个蛋白质纳米孔的孔眼。每个孔眼的蛋白质纳米孔的分布可以变化，例如通过在插入步骤期间控制蛋白质纳米孔的浓度。如图4F所阐明,在这样的实施方案中，纳米孔簇可包括随机数目的纳米孔，例如，如由代表性簇(1至4)所示，其中簇1含有单个蛋白质纳米孔(4104)，簇2不含有蛋白质纳米孔，簇3含有两个蛋白质纳米孔，以及簇4含有四个蛋白质纳米孔。在其中蛋白质纳米孔随机插入孔眼中的一些实施方案中，含有平均一个或更多个孔眼的簇具有大于零的数目的蛋白质纳米孔；在其他实施方案中，这样的簇具有大于0.25的数目的蛋白质纳米孔；在其他实施方案中，这样的簇具有大于0.5的数目的蛋白质纳米孔；在其他实施方案中，这样的簇具有大于0.75的数目的蛋白质纳米孔；在其他实施方案中，这样的簇具有大于1.0的数目的蛋白质纳米孔。
使用簇的阵列的效果可通过考虑每单位面积的可操作纳米孔的预期数目来阐明，例如图1B中的区域(133)含有四个纳米孔，每个在独立的分辨率有限区域中。在该配置中，如果可操作纳米孔的分数为0.25，则区域(133)中可操作纳米孔的预期数目简单地为E＝4x(.25)＝1。对于2个纳米孔的簇，每个簇的可操作纳米孔的预期数目遵循如下二项分布：E＝0×P[n＝0]+1×P[n＝1]+2×P[n＝2]，其中P[n＝i]是簇具有i个可操作纳米孔的概率。因此，对于2个纳米孔的簇，当可操作性率为0.25时，可操作纳米孔的预期数目为0.5。
图1F示出了具有纳米孔(152)阵列的固相膜(150)，纳米孔(152)被间隔开使得在分辨率有限区域(154)内仅有单个纳米孔(类似于图1A的(100)的配置)。在任何给定的纳米孔入口处，聚合物(153)将被捕获(155)随机次数。例如，这种聚合物(155)的到达可被建模为泊松计数过程，其中到达时距的顺序是指数分布的，这基本上意指聚合物的浓度和流通量越高，到达时距越短。在图1G(阐明由纳米孔处理的捕获聚合物序列生成的信号(181a、181b、181c))，如果假设每个聚合物具有相同的长度，则聚合物处理时间(或等效的纳米孔占据时间)可被表示为恒定长度段(182)。聚合物(183)之间的时间是纳米孔不活跃并且不生成光学信号的等待时间。在聚合物完成其纳米孔移位后，纳米孔停止生成光学信号一段时间，直到下一个聚合物到达。每个分辨率有限区域的单个纳米孔的占空比可通过提高浓度和/或流通量而达到100％，从而迫使等待时间接近零，但是由于每分辨率有限区域仅存在一个纳米孔，每纳米孔阵列的单位面积得到的信息速率是有限的。在同一区域中，通过经由调整聚合物浓度、向固相膜的聚合物流通量的量级和平均聚合物长度，使用每个分辨率有限区域的多个纳米孔，较高的信息采集速率是可能的。
在一些实施方案中，本发明涉及确定至少一种多核苷酸的核苷酸序列的方法，其包括以下步骤：(a)以一定浓度和流通量使单链多核苷酸移位穿过纳米孔阵列，其中每个单链多核苷酸的基本上每个核苷酸以光学标记物标记，所述光学标记物能够生成指示其所附接的核苷酸的光学信号，并且其中纳米孔阵列包括纳米孔的簇，每个簇包括分辨率有限区域内的多个纳米孔，以使不同簇的纳米孔在不同的分辨率有限区域内；(b)在每个核苷酸离开纳米孔后将每个核苷酸的光学标记物暴露于激发辐射；(c)每当光学信号来自单个光学标记物时，在纳米孔阵列的每个分辨率有限区域中测量由离开纳米孔的光学标记物生成的光学信号，以鉴定光学标记物附接的核苷酸；以及(d)从单个光学标记物的光信号序列确定多核苷酸的核苷酸序列。在进一步的实施方案中，选择分辨率有限区域内的多个纳米孔的密度或幅度、靶多核苷酸浓度和/或穿过纳米孔阵列的靶多核苷酸的流通量，以使阵列中的可测序纳米孔的数目最大化。
纳米孔和纳米孔测序
用于本发明的纳米孔可以是固态纳米孔、蛋白质纳米孔、或包括蛋白质纳米孔或有机纳米管例如碳纳米管的杂合纳米孔，其在固态膜或类似的框架中构造。纳米孔的重要特征包括(i)约束分析物，特别是聚合物分析物，以使其按顺序通过检测区，或换句话说，以使单体每次一个或单排地通过检测区，(ii)与移位方法(如果被使用)的相容性，即，无论使用什么方法驱动分析物通过纳米孔，例如电场，以及任选地(iii)抑制纳米孔的腔或孔洞内的荧光信号。在一些实施方案中，与本发明的方法和装置组合使用的纳米孔以阵列的形式提供，例如可规则地布置在平坦表面上的纳米孔簇阵列。在一些实施方案中，簇各自处于单独的分辨率有限区域中以使来自不同簇的纳米孔的光学信号可被所采用的光学检测系统区分，但是来自同一簇内的纳米孔的光学信号不一定由所采用的光学系统分配给这样的簇内的特定纳米孔。
纳米孔可由多种材料制造，所述材料包括但不局限于，氮化硅(Si3N4)、二氧化硅(SiO2)等等。用于分析应用例如DNA测序的纳米孔的制造和操作公开于以下通过引用并入的示例性参考文献中：Russell，美国专利6,528,258；Feier，美国专利4,161,690；Ling，美国专利7,678,562；Hu等人，美国专利7,397,232；Golovchenko等人，美国专利6,464,842；Chu等人，美国专利5,798,042；Sauer等人，美国专利7,001,792；Su等人，美国专利7,744,816；Church等人，美国专利5,795,782；Bayley等人，美国专利6,426,231；Akeson等人，美国专利7,189,503；Bayley等人，美国专利6,916,665；Akeson等人，美国专利6,267,872；Meller等人，美国专利公布2009/0029477；Howorka等人，国际专利公布WO2009/007743；Brown等人，国际专利公布WO2011/067559；Meller等人，国际专利公布WO2009/020682；Polonsky等人，国际专利公布WO2008/092760；Van der Zaag等人，国际专利公布WO2010/007537；Yan等人，Nano Letters，5(6)：1129-1134(2005)；Iqbal等人，NatureNanotechnology，2：243-248(2007)；Wanunu等人，Nano Letters，7(6)：1580-1585(2007)；Dekker，Nature Nanotechnology，2：209-215(2007)；Storm等人，Nature Materials，2：537-540(2003)；Wu等人，Electrophoresis，29(13)：2754-2759(2008)；Nakane等人，Electrophoresis,23:2592-2601(2002)；Zhe等人，J.Micromech.Microeng.，17：304-313(2007)；Henriquez等人，The Analyst，129：478-482(2004)；Jagtiani等人，J.Micromech.Microeng.,16:1530-1539(2006)；Nakane等，J.Phys.Condens.Matter，15R1365-R1393(2003)；DeBlois等人，Rev.Sci.Instruments，41(7)：909-916(1970)；Clarke等人，Nature Nanotechnology，4(4)：265-270(2009)；Bayley等人，美国专利公布2003/0215881等等。
简言之，在一些实施方案中，形成穿过基质的1-50nm的通道(channel)或孔眼，所述基质通常是平面基底例如膜，分析物例如单链DNA被引导移位穿过所述通道或孔眼。生成纳米孔的固态方法提供了稳健性和耐久性以及调整纳米孔的大小和形状的能力、在晶片规模上制造高密度的纳米孔阵列的能力、与基于液体的系统相比优越的机械、化学和热特性以及用电子或光学读出技术询问的可能性。在另一方面，生物纳米孔提供了可再现的狭窄的孔洞或腔，尤其是在1-10纳米范围内的孔洞或腔，以及提供了用于定制纳米孔的物理和/或化学性质并且用于通过常规的蛋白质工程化方法直接或间接附接基团或元件例如荧光标记物(其可以是FRET供体或受体)的技术。蛋白质纳米孔通常依赖于柔性脂质双层用于机械支撑，并且以精确的尺寸制造固态纳米孔仍然具有挑战性。在一些实施方案中，固态纳米孔可与生物纳米孔组合以形成克服其中一些缺点的所谓“杂合”纳米孔，由此提供生物孔蛋白的精确度与固态纳米孔的稳定性。对于光学读出技术，杂合纳米孔提供了纳米孔的精确位置，其极大地简化了数据的获取。
在一些实施方案中，本发明的纳米孔簇的阵列可与用于分析一种或多种聚合物分析物的方法一起使用，所述方法包括以下步骤：(a)使聚合物分析物移位穿过具有孔洞和出口的纳米孔，所述聚合物分析物包含单体序列，其中基本上每个单体用荧光标记物标记，以使毗邻单体的荧光标记物通过在纳米孔外彼此自猝灭而处于猝灭状态，并且荧光标记物处于空间束缚状态，并且不能在所述纳米孔内部生成可检测荧光信号；(b)当每个荧光标记物从空间束缚状态过渡到猝灭状态时，在纳米孔的出口处激发每个荧光标记物，以使生成指示其连接的单体的荧光信号；(c)检测所述荧光信号以鉴定所述单体。如本文所用，关于标记单体，特别是核苷酸，“基本上每个”、“基本上所有”或类似术语承认化学标记程序可能不会导致每个单体的完全标记；在可行的程度内，这些术语包括，与本发明相关的标记反应继续至完成；在一些实施方案中，此类完成的标记反应包括标记至少百分之五十的单体；在其他实施方案中，此类标记反应包括标记至少百分之八十的单体；在其他实施方案中，此类标记反应包括标记至少百分之九十五的单体；在其他实施方案中，此类标记反应包括标记至少百分之九十九的单体。
在另一个实施方案中，本发明的纳米孔簇的阵列可与用于分析一种或多种聚合物分析物的方法一起使用，所述方法包括以下步骤：(a)将一种或更多种聚合物分析物的基本上每个单体附接荧光标记物，以使毗邻单体的荧光标记物处于猝灭状态，(b)使聚合物分析物移位穿过纳米孔，以使每种聚合物分析物的单体以单排穿过纳米孔并且其中每个纳米孔具有孔洞和出口，所述孔洞空间约束所述荧光标记物在束缚状态，以使在所述孔洞内没有从其产生荧光信号；(c)在每个荧光标记物从空间束缚状态过渡到猝灭状态时，在过渡间隔期间在纳米孔出口处激发每个荧光标记物，从而产生指示其所连接的单体的荧光信号；(c)检测所述荧光信号以鉴定所述单体。
在另一个实施方案中，本发明的纳米孔簇的阵列可与用于分析一种或更多种标记的聚合物分析物的装置一起使用，所述装置例如用于确定一种或更多种标记的多核苷酸分析物的核苷酸序列的装置，所述装置包括以下元件：(a)固相膜，所述固相膜隔开第一室和第二室，所述固相膜具有至少一个通过孔洞或腔流体地连接第一室和第二室的纳米孔，所述孔洞或腔具有这样的横截面尺寸，该横截面尺寸使移位穿过其中的标记的聚合物的标记物是空间束缚的，以使得不生成可检测信号，并且使得标记的聚合物的毗邻单体的标记物是自猝灭的；(b)激发源，所述激发源用于当每个标记物离开纳米孔并进入第二室时激发每个标记物，以使得生成指示标记物所附连的单体的信号；以及(c)检测器，所述检测器用于收集由每个被激发的标记物产生的信号的至少一部分；以及(d)通过收集的信号鉴定被激发的标记物所附接的单体。
在一些实施方案中，本发明的方法和装置包括固相膜，例如SiN膜，其具有穿过其的孔眼阵列，该孔眼阵列提供第一室和第二室(有时也称为“顺式室”“反式室”)之间的连通，并在面向第二室或反式室的表面上支持脂质双层。在一些实施方案中，这种固相膜中的孔眼的直径可在10至200nm的范围内，或在20至100nm的范围内。在一些实施方案中，这种固相膜还包括在其中脂质双层跨越面向反式室的表面上的孔眼的区域中插入这种双层中的蛋白质纳米孔。在一些实施方案中，使用本文所述的技术从固相膜的顺式侧插入这种蛋白质纳米孔。在一些实施方案中，这种蛋白质纳米孔具有与α-溶血素相同或相似的结构，因为其包括沿着轴的桶、或孔洞，并且在一端具有“帽”结构，且在另一端具有“茎”结构(使用的术语来自Song等人，Science,274:1859-1866(1996))。在使用这种蛋白质纳米孔的一些实施方案中，插入到脂质双层中导致蛋白质纳米孔被定向成使得其帽结构暴露于顺式室并且其茎结构暴露于反式室。
在一些实施方案中，本发明的方法和装置包括作为单液滴或作为阵列液滴的液滴界面双层，例如，公开于Bayley等人，美国专利公布2014/0356289；Huang等人，NatureNanotechnology，10.1038/nnano.2015.189.[印刷前电子发表]；或类似的参考文献，其通过引用并入本文。简言之，将蛋白质纳米孔(1.2nM)置于200-350nl液滴(例如，1.32M KCl、8.8mM HEPES、0.4mM EDTA、pH 7.0(αHL)或8.0(MspA))中，并在例如十六烷中的3mM 1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)中孵育以形成脂质单层包衣。然后可通过移液将液滴转移到测量室中的盖玻片上，所述测量室例如，允许施加电压以移动分析物和通过例如TIRF进行光学检测。盖玻片可用琼脂糖(0.66M CaCl2、8.8mM HEPES、pH 7.0(αHL)/8.0(MspA))的薄层(约200nm)旋涂(3,000rpm，30s)，并随后与十六烷中的3mM DPhPC孵育。与琼脂糖上的单层接触时，脂质包被的液滴自发形成液滴界面双层。接地电极(Ag/AgCl)可被插入液滴中，在基底琼脂糖中具有相应的活跃电极(Ag/AgCl)。可使用膜片钳放大器(例如，Axopatch 200B，Molecular Devices)应用电压方案。液滴中存在的纳米孔自发地插入到液滴界面双层中，并且离子流可被电学和/或光学地(例如，通过离子敏感染料例如Fluo-8等)检测。
在一些实施方案中，固相膜可用低能离子束处理以漂白其自发荧光，例如，如Huber等人的美国专利公布2013/0203050中所述，其通过引用并入本文。
图2A-2C是杂合生物传感器的实施方案的图。在分隔两个室或区室顺式(2101)和反式(2107)的固态基质或固相膜(2103)中钻入纳米尺寸的孔洞(hole)(2102)。附接至带电荷的聚合物(2105)，例如单链DNA的蛋白质生物传感器(例如蛋白质纳米孔)(2104)通过电泳转运嵌入固态纳米孔洞中。在图1C中蛋白质生物传感器被插入。在纳米尺寸的孔洞中，其表面具有疏水性涂层(2106)和附接至其的脂质层(2109)。纳米孔可具有两侧或两个孔口(orifice)。一侧被称为“顺式(cis)”侧并且面对(-)负电极或带负电荷的缓冲液/离子区室或溶液。另一侧被称为“反式(trans)”侧并且面对(+)电极或带正电荷的缓冲液/离子区室或溶液。可通过施加穿过纳米孔的电场牵拉或驱动生物聚合物例如标记的核酸分子或聚合物穿过孔，例如，从纳米孔的顺式侧进入并且从纳米孔的反式侧离开。根据本发明，这样的纳米孔可被布置成这种纳米孔簇的阵列。
图2D显示了杂合纳米孔的实施方案，其中蛋白质纳米孔(2104)插入在固态膜(2103)中钻出的孔眼内。附接至蛋白质纳米孔(2104)的是寡核苷酸(2108)，互补的第二寡核苷酸(2111)与其杂交。在一些实施方案中，第二寡核苷酸(2111)具有附接至其的FRET对的一个或更多个第二成员(2110)。可选地，FRET对的成员可直接附接至蛋白质纳米孔的氨基酸，例如图2E的标记物(2123)。例如，溶血素亚基可通过常规遗传工程化技术被修饰以将半胱氨酸取代为毗邻纳米孔出口的合适定位的氨基酸，例如，苏氨酸129。寡核苷酸或FRET对的成员可使用常规的接头化学反应，例如，Hermanson(以上引用)经由半胱氨酸的巯基附接。
在一些实施方案中，本发明可采用簇中的杂合纳米孔，尤其是用于多核苷酸的基于光学的纳米孔测序。这样的纳米孔包括固态孔口或孔眼，蛋白质生物传感器例如蛋白质纳米孔稳定地插入其中。蛋白质纳米孔(例如α-溶血素)可附接至带电荷的聚合物(例如双链DNA)，该带电荷的聚合物在施加的电场中可用于引导蛋白质纳米孔进入固态膜中的孔眼中。在一些实施方案中，在固态基质中的孔眼被选择略微小于蛋白质，从而防止蛋白质移位穿过孔眼。相反，蛋白质将被嵌入固态孔口中。固态基质可被修饰以在表面产生活性位点，其允许插入的蛋白质生物传感器的共价附接，产生稳定的杂合生物传感器。
蛋白质纳米孔中聚合物的附接位点可通过蛋白质工程化产生，例如可构建将允许聚合物的特异性结合的突变体蛋白。作为一个实例，可将半胱氨酸残基插入蛋白质的期望位置。半胱氨酸可代替天然存在的氨基酸或可被掺入作为添加的氨基酸。必须小心的是不破坏蛋白质的生物功能。随后，聚合物(即，DNA)的末端的伯胺基团利用异双功能交联剂(例如，SMCC)被活化。随后，活化的聚合物被共价地附接至蛋白质生物传感器的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，聚合物与生物传感器的附接是可逆的。通过实施可切割的交联剂，引入容易断裂的化学键(例如，S-S键)并且在将生物传感器插入固态孔眼中后带电荷的聚合物可被去除。
对本领域技术人员而言明显的是，用于将带电荷的聚合物附接至蛋白质纳米孔的共价或非共价的附接方法的广泛不同的方法是可能的并且以上描述的方法仅充当实例。本领域技术人员还将意识到，多种不同的聚合物可被用作拖拽力，包括，但不局限于，单链DNA或双链DNA、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、多聚-L-赖氨酸、直链多糖等。还明显的是，这些聚合物可在给定的pH下表现出负(-)电荷或正(+)电荷，且电场的极性可相应调整以将聚合物-生物传感器复合物拉入固态孔眼中。
在一些实施方案中，供体荧光团附接至蛋白质纳米孔。随后，通过施加跨固态纳米孔洞或孔眼的电场将该复合物插入固态纳米孔洞或孔眼(例如直径3-10nm)直到蛋白质纳米孔被转运进入固态纳米孔洞中形成杂合纳米孔。杂合纳米孔的形成可通过以下来验证：(a)基于固态纳米孔洞的部分阻断，插入的蛋白质纳米孔导致电流的下降和(b)供体荧光团的光学检测。
形成稳定的杂合纳米孔之后，添加单链的、荧光标记的(或受体标记的)DNA至顺式室(具有(+)电极的室)。施加的电场迫使带负电荷的ssDNA移位穿过杂合纳米孔，在此期间标记的核苷酸靠近供体荧光团的附近。
固态或合成的纳米孔可用多种方式制备，如在以上引用的参考文献中例证的。在一些实施方案中，可使用氦离子显微镜在多种材料中钻出合成的纳米孔，例如，如由Yang等人,Nanotechnolgy,22:285310(2011)公开的，其通过引用被并入本文。支撑已经被处理为自支撑膜的薄膜材料例如氮化硅的一个或更多个区域的芯片，被引入氦离子显微镜(HIM)室。当显微镜被设置为低放大倍数时使用HIM发动机控制以将自支撑膜引入离子束的路径。包括聚焦和消像散(stigmation)的光束参数在毗邻自支撑膜的区域但是针对固体基质被调节。适当地固定参数后，芯片位置被移动使得自支撑膜区域集中在离子束扫描区域并且光束被消隐(the beam is blanked)。HIM的视场被设置为足以包含整个预期的纳米孔模式且足以在未来的光学读出中有用(即取决于光学放大倍数、相机分辨率等)的维度(以μm计)。随后，跨越整个视场在导致足以移除所有或大部分的膜自体荧光的总离子剂量的像素停留时间(pixel dwell time)下使离子束光栅化一次。随后，将视场设置为合适的值(小于以上所用的值)以执行单个纳米孔或纳米孔阵列的刻蚀界定的铣削(lithographically-defined milling)。模式的像素停留时间被设置以产生一个或更多个预定直径的纳米孔，该预定直径通过在样品处理前使用校准样品来确定。针对单一芯片上的每一个期望的区域和/或针对引入HIM室中的每一个芯片，重复整个过程。
在一些实施方案中，可修饰固态基质以在表面产生活性位点，其允许插入的蛋白质生物传感器的共价附接；或以使其更加适合于给定的应用的方式来修饰表面性质。此类修饰可以是共价或非共价性质的。共价表面修饰包括硅烷化步骤，其中有机硅烷化合物结合至固体表面的硅醇基团。例如，烷氧基硅烷的烷氧基团被水解以形成含有硅醇的物质。这些硅烷的反应包括四个步骤。首先，不稳定基团发生水解反应。之后是寡聚物的缩合。寡聚物随后与基质的羟基形成氢键。最后，在干燥或固化期间，伴随水的损失与基质形成共价键。对于共价附接，可采用具有活性侧基的有机硅烷。这样的侧基由以下组成，但不局限于以下：环氧侧链、醛、异氰酸酯、异硫氰酸酯、叠氮化物或炔烃(点击化学反应)(仅举数例)。对于本领域技术人员明显的是，将蛋白质共价附接至表面的多种方式是可能的。例如，有机硅烷上的某些侧基在能够结合蛋白质之前可能需要被活化(例如，用N-羟基琥珀酰亚胺酯活化伯胺或羧基侧基)。
将蛋白质附接至固体表面的另一种方式可通过将一个亲和伴侣附接至蛋白质并且将第二亲和伴侣置于固体表面的亲和结合来实现。此类亲和对由以下的组组成，但不局限于以下：生物素-链霉亲和素、抗原-抗体以及适体和相应的靶分子。在优选的实施方案中，固态纳米孔的表面修饰包括用赋予表面疏水性的有机硅烷处理。此类有机硅烷包括但不局限于，烷烃硅烷(alkanesilane)(例如，十八烷基二甲基氯硅烷)或修饰的烷烃硅烷例如具有5至30个碳原子的烷烃链长的氟化烷烃硅烷。随后，可用在戊烷中的脂质的稀溶液处理疏水性表面。溶剂干燥和将表面浸入水性溶液中之后，脂质将在表面自发形成层。
在一些实施方案中，固体表面上的脂质层可有利于杂合纳米孔的形成。固相上的脂质层可减少蛋白质和固态纳米孔之间的泄漏电流并且其可增加插入的蛋白质孔的稳定性。将低电容固体基质和所述基质的脂质涂层组合可使杂合纳米孔系统服从于基于由DNA移位穿过杂合纳米孔产生的电流波动的电子读出。为用这种系统实现电子读出，必须将减少未修饰的DNA的移位速度的手段与脂质涂覆的杂合纳米孔组合。可将分子马达例如聚合酶或解旋酶与杂合纳米孔组合并且有效地减少DNA穿过杂合纳米孔的移位速度。用来涂覆表面的脂质来自鞘脂类、磷脂类或甾醇类的组。用于测序生物聚合物或分子(例如，核酸)的方法和/或系统可包括激发附接至孔或纳米孔的一种或更多种供体标记物。生物聚合物可移位穿过孔或纳米孔，其中生物聚合物的单体被一种或更多种受体标记物标记。在标记的单体经过、离开或进入孔或纳米孔时、之后，能量可从激发的供体标记物转移到单体的受体标记物。可检测由于能量转移由受体标记物发射的能量，其中由受体标记物发射的能量可与生物聚合物的单一或特定单体(例如，核苷酸)相对应或相关联。随后，基于来自单体受体标记物的发射的能量的检测可推断或测序生物聚合物的序列，所述单体受体标记物允许鉴别标记的单体。孔、纳米孔、通道或通路(passage)，例如，离子可渗透的孔、纳米孔、通道或通路可用于本文描述的系统和方法。
在一些实施方案中，纳米孔可具有附接的一种或更多种标记物。在一些实施方案中，标记物是福斯特共振能量传递(Forster Resonance Energy Transfer,FRET)对的成员。此类标记物可包括有机荧光团、化学发光标记物、量子点、金属纳米颗粒和/或荧光蛋白。核酸的每个核苷酸可具有一种独特的标记物。附接至核苷酸的标记物可选自由有机荧光团、化学发光标记物、量子点、金属纳米颗粒和荧光蛋白组成的组。孔蛋白质中的标记物附接位点可通过蛋白质工程化生成，例如，可构建将允许标记物的特异性结合的突变体蛋白质。作为实例，可将半胱氨酸残基插入蛋白质的期望的位置，其插入可以被用于附接标记物的巯基(SH)基团。半胱氨酸可代替天然存在的氨基酸或可被掺入作为添加的氨基酸。马来酰亚胺-活化的标记物随后共价地附接至蛋白质纳米孔的巯基残基。在优选的实施方案中，标记物与蛋白质纳米孔的附接或标记物在核酸上的附接是可逆的。通过实施可切割的交联剂，引入容易断裂的化学键(例如，S-S键或pH不稳定的键)并且当满足相应的条件时可将标记物去除。
纳米孔或孔可被一种或更多种供体标记物标记。例如，纳米孔的顺式侧或表面和/或反式侧或表面可被一种或更多种供体标记物标记。标记物可附接至孔或纳米孔的底部或附接至组成纳米孔或孔的其他部分或单体。标记物可附接至纳米孔跨越穿过的膜或基质的部分，或附接至接头或其他分子，所述接头或其他分子附接至膜、基质或纳米孔。纳米孔或孔的标记物可位于或附接在纳米孔、基质或膜上，使得孔标记物可接近移位穿过孔的生物聚合物例如核酸的受体标记物。供体标记物可具有相同的或不同的发射光谱或吸收光谱。可通过共价或非共价相互作用实现孔结构的标记。
供体标记物(有时在本文也被称为“孔标记物”)可被置于离纳米孔的孔眼(例如在出口处)尽可能近的位置，而不引起损害核酸移位穿过纳米孔的阻塞。孔标记物可具有多种合适的性质和/或特征。例如，孔标记物可具有满足特定需求的能量吸收性质。孔标记物可具有从例如约0至约1000nm或从约200nm至约500nm范围的大的辐射能量吸收截面。孔标记物可吸收高于核酸标记物(例如受体标记物)的能量吸收的特定能量范围内的辐射。孔标记物的吸收能量可根据核酸标记物的吸收能量调整，以控制能量转移藉以可在两种标记物之间发生的距离。孔标记物可持续至少106至109的激发和能量转移循环是稳定的且有功能的。
在一些实施方案中，用于分析各自具有附接至单体序列的光学标记物的聚合物的装置可包括以下元件：(a)分隔第一室和第二室的固相膜中的纳米孔阵列，其中所述纳米孔阵列的纳米孔各自提供第一室和第二室之间的流体连通并且被布置成簇使得纳米孔的每个不同簇被布置在不同的分辨率有限区域内，并且使得每个簇包括大于1或为平均值大于零的随机变量的数目的纳米孔；(b)用于使第一室中的聚合物穿过纳米孔阵列的纳米孔移动到第二室的聚合物移位系统；以及(c)用于在每当光学标记物在分辨率有限区域内离开纳米孔时，收集由附接至聚合物的光学标记物生成的光学信号的检测系统。
纳米孔和分析物的标记物
在一些实施方案中，可用一种或更多种量子点标记纳米孔。特别地，在一些实施方案中，一种或更多种量子点可附接至纳米孔，或附接至与纳米孔毗邻(并且在纳米孔的入口或出口的FRET距离之内)的固相支撑物上，并且被采用作为与分析物上的受体的FRET反应中的供体。量子点的此类用途是公知的并且被广泛描述于科学文献和专利文献中，例如，描述于美国专利6,252,303；6,855,551；7,235,361等等中，其通过引用被并入本文。
可被用作孔标记物的量子点的一个实例是可在水性溶液中合成的CdTe量子点。可用亲核基团例如伯胺、巯基或例如羧酸的官能团使CdTe量子点官能化。CdTe量子点可包括巯基丙酸加帽的配体，其具有可用于将量子点共价地连接至蛋白质孔外部的伯胺的羧酸官能团。可使用生物缀合领域内普通技术人员已知的标准的交联试剂(同-双功能的和异-双功能的)完成交联反应。必须小心以确保修饰不会损害或基本上不会损害核酸移位穿过纳米孔。这可通过改变用于将供体标记物附接至纳米孔的采用的交联剂分子的长度来实现。
例如，可使用天然α-溶血素蛋白的赖氨酸残基131的伯胺(Song,L.等人，Science274，(1996):1859-1866)通过1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐/N-羟基磺基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)偶联化学反应共价结合羧基修饰的CdTe量子点。可选地，氨基酸129(苏氨酸)可被交换为半胱氨酸。因为在天然α溶血素蛋白中不存在其他半胱氨酸残基，新插入的半胱氨酸的巯基侧基可被用于共价附接其他化学部分。
用于将一种或更多种的孔标记物附接至孔蛋白质的多种方法、机制和/或途径可被利用。孔蛋白质可以以将具有已知性质或多种官能团的氨基酸引入天然蛋白质序列的方式被遗传工程化。天然存在的蛋白质序列的此修饰可以有利于将量子点与孔蛋白质的生物缀合。例如，半胱氨酸残基的引入将引入巯基基团，其将允许量子点例如CdTe量子点与孔蛋白质的直接结合。并且，赖氨酸残基的引入会引入用于结合量子点的伯胺。谷氨酸或天冬氨酸的引入会引入用于结合量子点的羧酸部分。这些基团服从于使用同-或异-双功能交联剂分子与量子点的生物缀合。目的在于引入用于生物缀合的官能团的对孔蛋白质的此类修饰，是本领域普通技术人员已知的。应小心以确保修饰不会损害或基本上不会损害核酸移位穿过纳米孔。
可在将所述纳米孔插入脂质双层之前或之后将纳米孔标记物附接至蛋白质纳米孔。当标记物在插入脂质双层之前被附接的情况下，必须小心标记纳米孔的底部并且避免孔蛋白质的随机标记。这可通过孔蛋白质的遗传工程化来实现，以允许孔标记物的位点特异性附接，如以下讨论的。此方法的优点是标记的纳米孔的批量制备。可选地，预插入的纳米孔的标记反应可确保标记物与纳米孔的底部(反侧)位点特异性附接而不需要遗传工程化孔蛋白质。
生物聚合物，例如核酸分子或聚合物，可用一种或更多种受体标记物标记。对于核酸分子，核酸分子的四种核苷酸或构件(building block)的每一种可用一种受体标记物标记，从而创建每一种天然存在的核苷酸的标记的(荧光)对应物。受体标记物可以呈接受能量的分子的形式，所述接受能量的分子可被附接至转换的核酸的部分或整条链上的一个或更多个核苷酸。
多种方法可被用来标记核酸分子或聚合物的单体或核苷酸。标记的核苷酸可在使用原始样品作为模板合成新的核酸期间被掺入核酸(“通过合成标记”)。例如，核酸的标记可通过PCR、全基因组扩增、滚环扩增、引物延伸等或通过本领域普通技术人员已知的以上方法的多种组合和扩展形式来实现。
核酸的标记可通过在具有标记物的修饰的核苷酸类似物的存在下复制核酸来实现，其导致将所述标记物掺入新产生的核酸。标记过程还可通过掺入具有官能团的核苷酸类似物来实现，所述官能团可用于在第二标记步骤中共价附接接受能量的部分。这种复制可通过全基因组扩增(Zhang,L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992):5847)或链置换扩增如滚环扩增、缺口平移、转录、逆转录、引物延伸和聚合酶链式反应(PCR)、简并性寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)(Telenius,H.等人，Genomics 13(1992):718-725)或上述方法的组合来完成。
标记物可包括反应性基团，例如亲核体(胺、巯基等等)。不存在于天然核酸中的此类亲核体，随后可被用于通过胺或巯基反应化学例如NHS酯、马来酰亚胺、环氧环、异氰酸酯等附接荧光标记物。此类亲核体反应性荧光染料(即，NHS-染料)从不同来源是容易市售可得的。当使用“通过合成标记”方法时，用小的亲核体标记核酸的优点在于高效掺入此类标记的核苷酸。由于聚合过程期间标记物的空间位阻，大量荧光标记的核酸构件可能被聚合酶较差地掺入新合成的DNA。
在一些实施方案中，DNA可被直接化学修饰而无聚合酶介导的标记的核苷酸的掺入。修饰的一个实例包括修饰鸟嘌呤碱基的N7位置的含有顺铂的染料(Hoevel,T.等人,BioTechniques 27(1999):1064-1067)。另一个实例包括用羟胺修饰嘧啶的C6位置，其产生6-羟氨基衍生物。产生的胺基可用胺反应性染料(例如，NHS-Cy5)进一步修饰。又另一个实例是叠氮化物或炔烃修饰的核苷酸，其通过聚合酶容易地掺入(Gierlich等人,Chem.Eur.J.,2007,13,9486-0404)。遵循良好建立的点击化学反应方案，炔烃或叠氮化物修饰的多核苷酸随后用叠氮化物或炔烃修饰的荧光团标记。
如上所述，在一些实施方案中，可使用“点击化学反应”标记DNA，例如使用市售试剂盒(例如来自Life Technologies,Carlsbad,CA的“Click-It”)。点击化学反应通常是指这样的合成过程：其中两个分子通过高效的化学反应连接在一起，基本上是不可逆的，其中产率接近100％，并且产生很少或没有反应副产物。最近，意思已变成指取代的炔烃与取代的叠氮化物形成具有两个取代基的1,2,3-三唑的环化反应。当在室温下被铜催化时，反应被称为Huisgen环加成，并且完全满足点击化学反应的要求，因为在反应期间两个分子上没有其他化学官能度受到影响。因此，偶联反应已经在生物缀合化学中广泛应用，例如在DNA或蛋白质的染料标记中，其中可发现许多胺、羟基或巯基基团。关键要求是，可以容易地将炔基基团和叠氮化物引入待偶联的分子中。例如，在荧光染料与DNA寡核苷酸的偶联中，叠氮基团通常被合成地引入染料中，而在寡核苷酸合成期间将炔基掺入DNA中。在Cu+的存在下混合时，两种组分快速偶联以形成三唑，在这种情况下携带寡核苷酸作为一个取代基，染料作为另一个。另一个更新的进展提供了在应变环结构(strained ring sturcture)内的炔组分。在这种情况下与叠氮化物的反应不需要铜催化剂，由形成三唑时释放环形应变能驱动。这更被称为无铜点击反应。将点击化学反应应用于本发明方法的指导可在以下参考文献中找到，其通过引用并入本文：Rostovtsev VV,Green LG；Fokin,Valery V，SharplessKB(2002).“A Stepwise Huisgen Cycloaddition Process:Copper(I)-CatalyzedRegioseiective“Ligation”of Azides and Terminal Aikynes”.Angewandte ChemieInternational Edition41(14):2596-2599.Moses JE和Moorhouse AD(2007).“Thegrowing applications of click chemistry”.Chem.Soc:Rev.36(8):1249-1262。
每当使用两种或更多种互相猝灭的染料时，这些染料可使用正交附接化学反应附接至DNA上。例如，NHS酯可用于与伯胺非常特异地反应或马来酰亚胺将与巯基基团反应。伯胺(NH2)或巯基(SH)修饰的核苷酸均可商购。这些相对小的修饰容易地被掺入聚合酶介导的DNA合成中，并且可用于使用NHS或马来酰亚胺修饰的染料的随后的标记反应。选择和使用这种正交接头化学反应的指导可在Hermanson(上文引用)中找到。
用于典型连接位置的另外的正交附接化学反应包括用于铜催化反应和未催化反应的Huisgen型环加成；烯烃加腈氧化物环加成，例如公开在Gutsmiedl等人，Org.Lett.,11:2405-2408(2009)中；Diels-Alder环加成，例如公开在Seelig等人Tetrahedron Lett.,38:7729-7732(1997)；羰基连接，例如公开在Casi等人，J.Am.Chem.Soc.,134:5887-5892(2012)；Shao等人，J.Am.Chem.Soc.,117:3893-3899(1995)；Rideout,Science,233:561-563(1986)中；迈克尔加成，例如公开在Brinkley，Bioconjugate Chemistry,3:2-13(1992)；天然化学连接，例如公开在Schuler等人，Bioconjugate Chemistry,13:1039-1043(2002)；Dawson等人，Science,266:776-779(1994)中；或通过活性酯形成酰胺，例如公开在Hermanson(上文引用)中。
核酸分子可用N-溴代丁二酰亚胺直接修饰，其在与核酸反应后将产生5-溴半胱氨酸(5-Bromocystein)、8-溴腺嘌呤和8-溴鸟嘌呤。修饰的核苷酸可进一步与二-胺亲核试剂反应。随后，剩余的亲核试剂可与胺反应性染料(例如，NHS-染料)反应(Hermanson G.于Bioconjugate Techniques中,上文引用)。
核酸链中1、2、3或4种核苷酸的组合可被它们的标记的对应物交换。标记的核苷酸的多种组合可被平行地测序，例如，除了四种单一标记的样品外用两种标记的核苷酸的组合标记源核酸或DNA，其将产生总共10种不同标记的样品核酸分子或DNA(G、A、T、C、GA、GT、GC、AT、AC、TC)。得到的序列模式由于在冗余序列读出中重叠的核苷酸位置，可允许更准确的序列比对。在一些实施方案中，聚合物，例如多核苷酸或多肽，可被附接至单个种类单体的单个荧光标记物标记，例如，多核苷酸的每个T(或基本上每个T)被荧光标记物如花青染料标记。在这样的实施方案中，来自聚合物的荧光信号的集合或序列可形成特定聚合物的特征或指纹。在一些这样的实施方案中，这样的指纹可以或不可以为待确定的单体序列提供足够的信息。
在一些实施方案中，本发明的特征是用为互相猝灭组的成员的荧光染料或标记物标记聚合物分析物的基本上所有单体。关于标记聚合物分析物的术语“基本上所有”的使用是承认，化学和酶标记技术通常低于百分之百的有效。在一些实施方案中，“基本上所有”意味所有单体的至少百分之八十附接了荧光标记物。在其他实施方案中，“基本上所有”意味所有单体的至少百分之九十附接了荧光标记物。在其他实施方案中，“基本上所有”意味所有单体的至少百分之九十五附接了荧光标记物。
用于测序聚合物例如核酸分子的方法包括提供插入膜或膜样结构或其他基质中的纳米孔或孔蛋白质(或合成的孔)。孔的底部或其他部分可被一种或更多种孔标记物修饰。所述底部可指孔的反式侧。任选地，孔的顺式侧和/或反式侧可用一种或更多种孔标记物修饰。待分析或待测序的核酸聚合物可用作模板，用于产生标记版本的核酸聚合物，其中在所得聚合物中四种核苷酸的一种或多达所有四种核苷酸被核苷酸的标记的类似物代替。对纳米孔施加电场，其迫使标记的核酸聚合物穿过纳米孔，同时外部的单色或其他光源可被用于照明纳米孔，从而激发孔标记物。在核酸的标记的核苷酸通过、离开或进入纳米孔时、之后或之前，能量从孔标记物转移至核苷酸标记物，其导致较低能量辐射的发射。核苷酸标记物的照射然后通过共焦显微镜装置或对本领域普通技术人员已知的其他能够检测单分子的光学检测系统或光学显微术系统检测。这种检测系统的实例包括但不限于共焦显微术、落射荧光显微术和全内反射荧光(TIRF)显微术。具有标记的单体的其他聚合物(例如，蛋白质和除核酸以外的聚合物)也可根据本文描述的方法被测序。在一些实施方案中，在具有倏逝波的TIRF系统中激发荧光标记物或供体分子，有时在本文中称为“倏逝波激发”。
当聚合物的受体标记的单体(例如，核苷酸)的受体标记物在标记的单体离开、进入或通过纳米孔时、之后或之前与供体标记物反应时，能量可从孔或纳米孔供体标记物(例如，量子点)转移至聚合物(例如，核酸)上的受体标记物。例如，供体标记物可被放置于或连接到纳米孔的顺式侧或反式侧或表面上，使得供体标记物和受体标记物之间的相互作用或能量转移不发生，直到标记的单体离开纳米孔并进入纳米孔通道或开口之外的供体标记物的附近或邻近。结果，标记物之间的相互作用、从供体标记物到受体标记物的能量转移、来自受体标记物的能量发射和/或来自受体标记物的能量发射的测量或检测，可在穿过纳米孔的通路、通道或开口之外发生，例如，在纳米孔的顺式或反式侧上的顺式或反式室中。从单体的受体标记物发射的能量的测量或检测可被用来鉴定单体。
纳米孔标记物可放置于纳米孔的通路、通道或开口的外部使得标记物可以是可见的或可被暴露来促进标记物的激发或照射。供体标记物和受体标记物之间的相互作用和能量转移以及由于能量转移而从受体标记物的能量发射，可在纳米孔的通路、通道或开口的外部发生。这可促进通过例如光学检测或测量装置检测或测量来自受体标记物的能量或光发射的简便性和准确度。
供体标记物可以以多种方式和/或在纳米孔上的多个位点处附接。例如，供体标记物可直接或间接附接或连接至纳米孔的部分或单元上。可选地，供体标记物可与纳米孔毗邻放置。
聚合物(例如，核酸)的每个受体标记的单体(例如，核苷酸)可以与供体标记物顺序地相互作用，所述供体标记物放置于聚合物移位穿过的纳米孔或通道的出口上或紧邻该出口或直接或间接附节至该出口。供体和受体标记物之间的相互作用可在纳米孔通道或开口之外进行，例如，在受体标记的单体离开纳米孔后或在单体进入纳米孔之前。相互作用可发生在或部分发生在纳米孔通道或开口之内，例如当受体标记的单体经过、进入或离开纳米孔时发生。
当核酸的四种核苷酸的一种被标记时，单个核苷酸标记物发射引起的时间依赖性信号被转换为对应标记的核苷酸在核酸序列中的位置的序列。随后，对不同样品中的四种核苷酸的每一种重复该过程，并且四个部分的序列随后被比对以组装完整的核酸序列。
当分析多色标记的核酸(DNA)序列时，从一种或更多种供体标记物到可存在于核酸分子上的四种不同的受体标记物的每一种的能量转移可产生四种不同的波长或颜色的光发射(每一种与四种核苷酸中的一种相关)，这允许直接的序列读出。
移位速度
与基于纳米孔的测序方法相关的主要障碍是核酸穿过纳米孔的高移位速度(约500.000-1.000.000核苷酸/秒)，由于记录装置的受限的带宽，其不允许直接的序列读出。用两种不同纳米孔蛋白减缓核酸移位的方法最近展示于Cherf等人(NatBiotechnol.2012Feb 14；30(4)344-8)和Manrao等人(Nat Biotechnol.2012Mar 25；30(4):349-53)并且通过引用并入本文。两个研究组都使用DNA聚合酶从靶模板合成互补链，其导致模板DNA穿过纳米孔的逐步移位。因此，核酸聚合酶的合成速度(10-500核苷酸/秒)决定了DNA的移位速度，并且由于其比直接核酸移位慢大约3-4个数量级，单核苷酸的分析变得可行。然而，聚合酶辅助的移位需要大量的样品制备以产生用于聚合酶的结合位点，并且大批的核酸合成必须被阻断并且只能在核酸-聚合酶复合物被纳米孔蛋白质捕捉后才能开始。这导致相当复杂的设置，其可能阻止在商业环境中的实施。此外，聚合酶合成反应中的波动例如停滞的聚合作用(stalled polymerization)以及聚合酶从核酸上的解离可妨碍序列读出，分别导致高错误率和减小的读段长度。在一些实施方案中，靶核酸通过掺入荧光修饰的核苷酸被酶促地复制。所得的标记的核酸具有增加的标称直径，该增加的标称直径导致当被牵拉穿过纳米孔时减小的移位速度。用于光学测序的优选的移位速率处于每秒钟1-1000个核苷酸的范围内，并且更优选的范围是每秒钟200-800个核苷酸，并且最优选的移位速率是每秒钟200-600个核苷酸。
可选地，多核苷酸，特别是单链多核苷酸的移位速度可通过以下来控制：采用被定制尺寸的纳米孔以使附接至底部的加合物和/或标记物例如附接至碱基的有机染料抑制但不阻止多核苷酸的移位。移位速度可通过以预定的密度附接标记物和/或加合物被选择。此类标记物和/或加合物可具有规则间隔的附接，例如每三个核苷酸或类似物的附接，或它们可具有随机性、或伪随机性(pseudorandom)附接，例如每个C可被标记。在一些实施方案中，选定数目的不同核苷酸可被标记，例如每个A和C，或每个A和G，或每个A和T，或每个C等等，其导致平均移位速度。可通过将加合物附接至未标记的核苷酸来减小此平均速度。加合物包括可使用常规化学反应附接至核苷酸的任何分子，通常地有机分子。通常加合物具有在与普通的有机染料，例如荧光素、Cy3等相同的范围内的分子量。加合物可能或可能不能生成信号，即作为标记物。在一些实施方案中，加合物和/或标记物附接至核苷酸的碱基上。在其他实施方案中，标记物和/或加合物可附接至多核苷酸中的核苷之间的连键。在一方面，控制单链多核苷酸穿过纳米孔的移位速度的方法包括将加合物以一定密度附接至多核苷酸的步骤，其中由于附接的大量加合物或由于附接的加合物的密度，单链多核苷酸的移位速度单调减小。在一些实施方案中，并不是多核苷酸的每一种核苷酸都被标记。例如，可产生多核苷酸的四种不同的组，其中每一组的核苷酸被相同的分子例如荧光有机染料受体标记，但是在每一组中不同种类的核苷酸将被标记。因此，在组1中仅A可被标记；在组2中仅C可被标记；在组3中仅G可被标记；等等。在这样的标记之后，四组多核苷酸可随后根据本发明分别分析，并且多核苷酸的核苷酸序列从四个分析产生的数据确定。在此类实施方案以及类似实施方案中，例如两种标记物被使用，其中多核苷酸的一些核苷酸没有被标记，穿过纳米孔的移位速度将受到标记物沿着多核苷酸的分布影响。为了防止移位速度中这样的变化性，在一些实施方案中，没有被受体或供体标记用于产生信号以确定核苷酸序列的核苷酸可通过附接非产生信号的加合物被修饰，所述非产生信号的加合物具有与产生信号的标记物基本上相同的对移位速度的影响。
使用互相猝灭荧光标记物的纳米孔测序
本发明涉及使用纳米孔和荧光猝灭来顺序鉴定聚合物分析物的单体。聚合物分析物的这种分析可对单个聚合物分析物或同时对多个聚合物分析物平行进行。在一些实施方案中，单体被当附接至靶聚合物上时被能够具有至少三种状态的荧光标记物所标记：(i)猝灭状态，其中附接的荧光标记物的荧光被紧邻的单体上的荧光标记物猝灭；例如，当被标记的聚合物在水性溶液中游离时，附接至根据本发明的聚合物的荧光标记物被猝灭。(ii)空间束缚状态，其中被标记的聚合物移位穿过纳米孔以使附接的荧光标记物的游离溶液运动或排列被破坏或限制，以使很少或没有可检测信号从荧光标记物生成。(iii)过渡状态(transition state)，其中在荧光标记物离开纳米孔(在“过渡间隔”期间)而聚合物移位穿过纳米孔时，附接至聚合物的荧光标记物从空间束缚状态过渡为猝灭状态。部分地，本发明是在过渡间隔期间荧光标记物能够产生可检测荧光信号的发现的应用。不希望受到这一发现潜在的任何理论的限制，据信，在过渡间隔期间生成的荧光信号是由于可自由旋转的偶极子。在空间束缚状态和猝灭状态二者中，偶极子旋转的自由度被限制，从而减少或限制发射的光子的数目。在一些实施方案中，聚合物是多核苷酸，通常是单链多核苷酸，例如DNA或RNA，但特别是DNA。在一些实施方案中，本发明包括用于通过记录当多核苷酸移位纳米孔时附接的荧光标记物一次一个地离开纳米孔时生成的信号，确定多核苷酸的核苷酸序列的方法。在离开时，每个附接的荧光标记物在过渡间隔期间由纳米孔内的束缚状态过渡成游离溶液中的多核苷酸上的猝灭状态。如以上提到的，在这个过渡间隔或时间段期间荧光标记物能够发射指示其所附接的核苷酸的可检测荧光信号。
在一些实施方案中，靶多核苷酸的核苷酸序列通过进行四个单独的反应来确定，这四个单独的反应中，靶多核苷酸的拷贝的四种不同种类的核苷酸(A、C、G和T)中的每种被单一荧光标记物标记。在这样的实施方案的变化形式中，靶多核苷酸的核苷酸序列通过进行四个单独的反应来确定，这四个单独的反应中，靶多核苷酸的拷贝的四种不同种类的核苷酸(A、C、G和T)中的每种被一种荧光标记物标记，而与此同时，在同一靶多核苷酸上的其他核苷酸被第二荧光标记物标记。例如，如果在第一反应中第一荧光标记物附接至靶多核苷酸的A，那么在第一反应中第二荧光标记物附接至靶多核苷酸的C、G和T(即，至“非A的核苷酸”)。同样地，在实例的延续中，第二反应中，第一标记附接至靶多核苷酸的C并且第二荧光标记物附接至靶多核苷酸的A、G和T(即，至“非C的核苷酸”)。且对于核苷酸G和T，以此类推。
相同的标记方案可按照核苷酸类型的子集的常规术语的方式表述；因此，在上述实例中，在第一反应中，第一荧光标记物附接至A上以及第二荧光标记物附接至B上；在第二反应中，第一荧光标记物附接至C上以及第二荧光标记物附接至D上；在第三反应中，第一荧光标记物附接至G上以及第二荧光标记物附接至H上；且在第四反应中，第一荧光标记物附接至T上以及第二荧光标记物附接至V上。
在一些实施方案中，本发明的特征是用为互相猝灭组的成员的荧光染料或标记物标记聚合物分析物的基本上所有单体。这类荧光染料组具有以下性质：(i)各成员猝灭每一成员的荧光(例如，通过FRET或通过静态或接触机制)，和(ii)当被激发时且当处于未猝灭状态时，每个成员生成不同的荧光信号。即，如果互相猝灭组由两种染料D1和D2组成，则(i)D1是自猝灭(例如通过与另一个D1分子接触猝灭)，并且其被D2猝灭(例如通过接触猝灭)并且(ii)D2是自猝灭(例如通过与另一个D2分子接触猝灭)并且其被D1猝灭(例如通过接触猝灭)。选择用于互相猝灭组的荧光染料或标记物的指导可在以下参考文献中找到，其通过引用并入本文：Johansson,Methods in Molecular Biology,335:17-29(2006)；Marras等人，Nucleic Acids Research,30:el22(2002)等等。荧光染料或标记物的示例性的互相猝灭组可选自罗丹明染料、荧光素染料和花青染料。在一个实施方案中，互相猝灭组可包含罗丹明染料TAMRA和荧光素染料FAM。在另一个实施方案中，荧光染料的互相猝灭组可通过从由以下组成的组中选择两种或更多种染料来形成：俄勒冈绿488、荧光素-EX、异硫氰酸荧光素、罗丹明红-X、丽丝胺罗丹明B、钙黄绿素、荧光素、罗丹明、一种或更多种BODIPY染料、德克萨斯红、俄勒冈绿514和一种或更多种Alexa Fluors。代表性的BODIPY染料包括BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY 581/591、BODIPY TR、BODIPY 630/650和BODIPY 650/665。代表性的Alexa Fluors包括Alexa Fluor 350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750和790。
在一些实施方案中，荧光标记物是FRET对的成员。FRET对通常是一个或更多个FRET供体和一个或更多个FRET受体，其中每一个供体能够与每一个受体发生FRET反应。在一方面，这意味着，FRET对的供体具有与受体的吸收光谱基本上重叠的发射光谱。在另一方面，供体和受体的跃迁偶极子(transition dipole)必须以允许有效能量转移的方式对齐(aligned)。在一些方面，本发明部分地基于对荧光的发现和鉴别，特别地，纳米孔的FRET抑制性质和应用该性质以使能够检测移位穿过纳米孔的标记的聚合物。相信，尽管本发明并不意图因此被限制，可选择具有定制尺寸的孔洞的纳米孔以使FRET对的标记物在移位穿过纳米孔时不能够定向参与FRET相互作用。基于纳米孔的限制的直径，纳米孔的孔洞中的多核苷酸的标记物的偶极子在其转动自由度方面被约束。偶极子对齐与附接至纳米孔的相应的FRET对的对齐的该减少极大地限制了FRET的效率。标记的多核苷酸可在离开纳米孔之后参与FRET相互作用，届时聚合物(例如多核苷酸)上的FRET受体或供体恢复转动自由度，这允许FRET事件。
取决于被检测的分析物的类型、采用的供体和受体的类型、纳米孔、供体和受体的物理布置、分析物是被供体标记还是被受体标记等等，可实施以上的广泛的实施方案。在一个实施方案中，通过本发明测量的分析物是受体标记的聚合物，特别是受体标记的多核苷酸。在后一实施方案的一个种类中，多核苷酸分析物的不同核苷酸被一种或更多种不同种类的受体标记，以使多核苷酸的核苷酸序列可通过测量当其移位穿过纳米孔时产生的FRET信号来确定。在另一个实施方案中，通过本发明测量的分析物是供体标记的聚合物，特别是供体标记的多核苷酸。多核苷酸的序列可通过测量当其移位穿过纳米孔时的FRET信号来确定。在本发明的又另一个实施方案中，多核苷酸分析物的四种核苷酸的至少一种被FRET对的成员标记。被标记的核苷酸在多核苷酸中的位置通过使标记的多核苷酸移位穿过标记的纳米孔并测量FRET事件来确定。通过标记同一多核苷酸样品的剩余的核苷酸以及随后使所述样品移位穿过标记的纳米孔，产生多核苷酸的子序列。此类子序列可被重新排列，产生多核苷酸的全部序列。
图3中示意性地阐明了本发明以上方面和实施方案的一些。聚合物分析物(3000)，例如多核苷酸，被例如电泳驱动穿过纳米孔(3002)，所述纳米孔(3002)限制聚合物(3000)的构象以使其单体单元以与其在聚合物中的一级序列相同的顺序移位穿过纳米孔。图3所示的实施方案中，荧光标记物被假设为FRET对的成员，但是这并非意图限制本发明；荧光标记物还可包括直接被激发的荧光标记物，例如使用在合适波长发射的激光，以生成荧光信号。
如以上提及的，每当受体标记的单体单元处于纳米孔(3002)的孔洞中时，此类受体与其FRET对的供体之间的FRET相互作用因为受体处于束缚状态(3014)而被抑制。此抑制通常意味着，即使此类受体处于供体的FRET距离内，由于例如受体和供体的偶极子的不利的定向，也没有可检测FRET信号生成。在另一方面，当受体标记的单体单元从纳米孔的孔洞中显露或离开，进入过渡区(3008)，FRET相互作用(3010)发生，且FRET发射(3016)产生并被检测器(3018)检测，直到受体进入与毗邻受体的自猝灭状态(3011)，并且当受体与供体间的距离随着聚合物(3000)离开FRET相互作用距离的移动而增加。当单个受体移动穿过过渡区(3008)时，其产生信号(3022)。过渡区(3008)，其为紧邻纳米孔(3002)出口(3015)的空间区域，由数个因素定义，所述因素包括聚合物(3000)移位穿过纳米孔(3002)的速度、荧光标记物的震动移动性和旋转移动性、荧光标记物的生理化学性质等等。在图3中，只有一种类型的单体单元，图示为实心圆形(3004)，携带第一荧光标记物(命名为“a”)；其余的单体单元，图示为斑点圆形(3006)，携带第二荧光标记物(命名为“b”)。在本实施方案中，第一荧光标记物猝灭毗邻的第一荧光标记物和毗邻的第二荧光标记物；同样地，第二荧光标记物猝灭毗邻的第一荧光标记物和毗邻的第二荧光标记物；此外，第一和第二荧光标记物产生彼此可区分的FRET信号，例如，图3中的标记物“a”的记录信号(3022)和标记物“b”的记录信号(3023)，以使每个荧光标记物(以及因此，单体)可通过由检测器(3018)检测的信号来被鉴定。
在一些实施方案中，纳米孔是包含插入固相膜中的孔中的蛋白质纳米孔的杂合纳米孔，如以上描述的。在杂合纳米孔中，FRET对的第一成员可直接附接至蛋白质纳米孔，或可选地，使用常规的连接化学反应直接附接至固相膜，所述常规的连接化学反应例如“点击”化学反应，例如Kolb等人,Angew.Chem.Int.Ed.,4):2004-2021(2001)等等。在一个实施方案中，FRET对的第一成员直接或间接地附接至蛋白质纳米孔，例如，如参考图2D所讨论的。在另一个实施方案中，FRET对的第一成员是供体和量子点。量子点通常比受体大的多，尤其是为有机染料的受体，其通常具有从200道尔顿至2000道尔顿范围内的分子量。
在一个实施方案中，本发明可用在用于分析一种或更多种聚合物分析物，例如确定多核苷酸的核苷酸序列的方法中，所述方法包括以下步骤：(a)使聚合物分析物移位穿过纳米孔阵列的纳米孔，每个纳米孔具有孔洞和出口，每个聚合物分析物包含单体序列，其中基本上每个单体用荧光标记物标记，以使毗邻单体的荧光标记物通过在纳米孔外彼此自猝灭而处于猝灭状态，并且荧光标记物处于空间束缚状态，并且不能在所述纳米孔内部生成可检测荧光信号；(b)当每个荧光标记物从空间束缚状态过渡到猝灭状态时，在纳米孔的出口处激发每个荧光标记物，以使生成指示其连接的单体的荧光信号；(c)检测所述荧光信号以鉴定所述单体，其中纳米孔阵列是簇的阵列。如本文所用，关于标记单体，特别是核苷酸，“基本上每个”、“基本上所有”或类似术语承认化学标记程序很少是完全的；在可行的程度内，这些术语包括，与本发明相关的标记反应继续至完成；在一些实施方案中，此类完成的标记反应包括标记至少百分之五十的单体；在其他实施方案中，此类标记反应包括标记至少百分之八十的单体；在其他实施方案中，此类标记反应包括标记至少百分之九十五的单体；在其他实施方案中，此类标记反应包括标记至少百分之九十九的单体。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于分析一种或更多种标记的聚合物分析物的装置，所述装置例如用于确定一种或更多种标记的多核苷酸分析物的核苷酸序列的装置，所述装置包括以下元件：(a)固相膜，所述固相膜隔开第一室和第二室，所述固相膜具有纳米孔的阵列，每个纳米孔通过孔洞或腔流体地连接第一室和第二室，所述孔洞或腔具有这样的横截面尺寸，该横截面尺寸使移位穿过其中的标记的聚合物的标记物是空间束缚的，以使得不生成可检测信号，并且使得标记的聚合物的毗邻单体的标记物是自猝灭的；(b)激发源，所述激发源用于当每个标记物离开每个纳米孔并进入第二室时激发每个标记物，以使得生成指示标记物所附连的单体的信号；以及(c)检测器，所述检测器用于收集由每个被激发的标记物生成的信号的至少一部分；以及(d)通过每当被激发的标记物离开可测序的纳米孔时收集的信号鉴定被激发的标记物所附接的单体；并且其中纳米孔阵列是纳米孔簇的阵列。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于分析聚合物的系统，所述系统包括聚合物和纳米孔装置，所述聚合物包含基本上全部用互相猝灭染料组标记的单体，所述纳米孔装置用于顺序检测来自附接在所述聚合物上的互相猝灭染料组的染料的光学信号。这样的用于确定多核苷酸序列的实施方案可包括以下元件：(a)固相膜，所述固相膜隔开第一室和第二室，所述固相膜具有孔眼阵列，每个孔眼连接第一室和第二室，并且在至少一个表面上具有疏水涂层；(b)被布置在疏水涂层上的脂质层；(c)被固定在孔眼中的蛋白质纳米孔，所述蛋白质纳米孔各自具有带有出口的孔洞，并且所述蛋白质纳米孔与脂质层相互作用以与孔眼中的固相膜形成密封以使第一室和第二室间的流体连通仅通过蛋白质纳米孔的孔洞发生，并且所述蛋白质纳米孔各自被定制横截面尺寸以使多核苷酸的核苷酸按顺序通过孔洞的出口，并且使附接至多核苷酸的荧光标记物在空间上被束缚；以及(d)附接至固相膜或蛋白质纳米孔的FRET对的第一成员，以使每当多核苷酸的核苷酸从孔洞中显露时，多个核苷酸在FRET对的第一成员的FRET距离内；并且其中孔眼阵列是孔眼的簇的阵列。
用于序列分析的零模波导的阵列
零模波导阵列已经被开发用于平行分析单个分子的群体，所述单个分子各自经历生成相应光学信号序列的一系列反应，例如Levene等人，Science，299：682-686(2003)；Korlach等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,105(4):1176-1181(2008)。这种方法已被应用于开发高通量DNA测序仪器，Eid等人，Science，323：133-138(2009)。这类应用在以下美国专利中进一步公开，其通过引用并入本文：7,302,146；7,476,503；7,906,284；8,709,725等等。通常，在用于这些应用的零模波导的阵列中，波导规则地以足够大的波导间距间隔开，以使来自毗邻波导的光学信号能够被光学地区分并且基本上不影响收集的信号的值。这种间隔通常大于构成光学信号的光的波长，以使，如以上对纳米孔阵列所述的，用于紧密放置特征的纳米工程技术的全部容量不被采用。因此，通过采用根据本发明的簇的阵列可提高这类方法的效率。
在一些实施方案中，进行涉及多个反应样品的多次化学反应的改进方法可以以下步骤进行：(a)提供纳米井阵列；(b)将包括标记的反应物的多个反应样品放置到阵列的纳米井中，其中单独的反应样品被放置于阵列中的不同纳米井中；(c)使阵列经历适合形成化学反应产物的条件；以及(d)利用与其可操作地关联的光学系统检测产物的形成，并且其中阵列的纳米井被布置成簇以使纳米井的每个不同的簇被布置在不同的分辨率有限区域内，并且以使每个簇中纳米井的平均数目大于零。在一些实施方案中，阵列的纳米井各自包括光学限制(optical confinement)和/或零模波导，如美国专利7,302,146中所述。
在一些实施方案中，对多个靶核酸分子测序的改进方法可通过以下步骤进行：(a)提供纳米井阵列，其中阵列的纳米井被布置成簇以使纳米井的每个不同的簇被布置在不同的分辨率有限区域内，并且以使每个簇中纳米井的平均数目大于零，且其中每个纳米井提供允许观察单个分子的有效观察体积；以及检测来自纳米井的有效观察体积的信号的可操作地耦合至纳米井的光学系统；(b)在纳米井中混合多个靶核酸分子、与靶核酸分子互补的引物、聚合酶以及将被掺入多个新生核苷酸链中的多于一种类型的核苷酸或核苷酸类似物，所述多个新生核苷酸链的每条链与各自的靶核酸分子互补；(c)使步骤(b)的混合物在适于通过核苷酸或核苷酸类似物的模板指导的聚合形成新生核苷酸链的条件下经历聚合反应；(d)用入射光束照射纳米井；以及(e)鉴定被掺入每个新生核苷酸链中的核苷酸或核苷酸类似物。如上所述，在一些实施方案中，阵列的纳米井各自包括光学限制和/或零模波导，如美国专利7,302,146中所述。
定义
关于纳米结构阵列的“簇”意指纳米结构的多个组或集合的分布，其中每个组占据阵列的单独区域，并且其中组内纳米结构到纳米结构的距离远小于组间纳米结构到纳米结构的距离。在一些实施方案中，这种分布是基本上平面的；也就是说，如果纳米结构相对于表面被间隔开，则这种表面的曲率在簇附近是小的。在一些实施方案中，纳米结构的簇被分辨率有限区域包围，使得不同簇的纳米结构在不同的分辨率有限区域中。簇内纳米结构的数目可很大变化。在一些实施方案中，纳米结构阵列可制造为在阵列的每个簇内具有纳米结构的预定数目。例如，阵列的簇可各自具有多个纳米结构；在其他实施方案中，阵列的簇可各自具有1至100个纳米结构；在其他实施方案中，簇可各自具有2至50个纳米结构；在其他实施方案中，簇可各自具有2至16个纳米结构。在一些实施方案中，阵列的每个簇可具有相同数目的纳米结构。在其他实施方案中，簇内的纳米结构的数目可以是随机变量，使得平均数目或预期的数目，以及可能其方差表征阵列内的簇。在一些实施方案中，纳米结构的簇是纳米孔的簇；在其他实施方案中，纳米结构的簇是纳米井的簇，所述纳米井包括但不限于为零模波导的纳米井。在一些实施方案中，例如，当纳米结构包括蛋白质纳米孔时，代表簇中纳米孔数目的随机变量可以是泊松随机变量，其平均值取决于用于加载孔眼阵列的溶液中的蛋白质纳米孔的浓度。
“FRET”或“Forster，或荧光，共振能量转移”意指非放射性的从激发的供体荧光团至基态的受体荧光团的偶极子-偶极子能量转移机制。FRET相互作用中能量转移的速率取决于供体的发射光谱与受体的吸收光谱的光谱重叠程度、供体的量子产率、供体和受体跃迁偶极子的相对取向以及供体和受体分子之间的距离，Lakowitz，Principles ofFluorescence Spectroscopy，第三版(Springer，2006)。特别感兴趣的FRET相互作用是导致以下的那些：能量的一部分被转移到受体，继而，被受体作为光子发射，其频率低于激发其供体的光的频率(即，“FRET信号”)。“FRET距离”意指FRET供体和FRET受体之间的距离，在此距离可发生FRET相互作用并且FRET受体生成可检测FRET信号。
“试剂盒”是指用于递送用于实施本发明的方法的材料或试剂的任何递送系统。在反应测定的上下文中，这种递送系统包括允许反应试剂(例如，在适当的容器内的荧光标记物，例如互相猝灭的荧光标记物、荧光标记物连接剂、酶等)和/或支撑材料(例如，缓冲液、用于进行测定的书面说明等)的储存、从一个位置到另一个位置的转运或递送的系统。例如，试剂盒包括一个或更多个包含相关反应试剂和/或支持材料的外壳(例如盒)。这样的内容物可一起或分开地传送到意图的接收者。例如，第一容器可含有用于测定的酶，而第二个或更多个容器含有互相猝灭的荧光标记物。
在本文可互换使用的“微流体”装置或“纳米流体”装置，各自意指用于捕获、移动、混合、分配或分析小体积流体的集成系统，所述流体包含样品(其继而可含有或包括感兴趣的细胞或分子分析物)、试剂、稀释剂、缓冲液等等。通常，提及“微流体”和“纳米流体”表示装置尺寸和处理的流体体积的不同尺度。在一些实施方案中，微流体装置的特征具有小于几百平方微米的横截面尺寸，并且具有毛细管尺寸的通路或通道，例如具有约500μm至约0.1μm的最大横截面尺寸。在一些实施方案中，微流体装置具有范围为1μL至几nL，例如10-100nL的体积容量。纳米流体装置中对应特征或结构的尺寸通常比微流体装置的尺寸小1至3个数量级。本领域技术人员将从特定应用的情况中知道哪种维度将是相关的。在一些实施方案中，微流体或纳米流体装置具有一个或更多个室、端口和通道，所述室、端口和通道互连并且处于流体连通，并且被设计用于单独或与提供支撑功能的设备或仪器合作执行一种或更多种分析反应或过程，所述支撑功能例如样品引入、流体和/或试剂驱动装置、诸如正压或负压、声能等、温度控制、检测系统、数据收集和/或集成系统等。在一些实施方案中，微流体和纳米流体装置还可包括阀、泵、过滤器和内壁上的专门功能涂层，例如以防止样品组分或反应物的吸附、促进通过电渗的试剂移动等。这样的装置可制造在固体基质中，或者制造为固体基质，所述固体基质可以是玻璃、塑料或其他固体聚合物材料，并且可具有易于检测和监测样品和试剂移动的平面形式，特别是通过光学或电化学方法。在一些实施方案中，这种装置在一次使用之后即可丢弃的。在一些实施方案中，微流体和纳米流体装置包含形成和控制液滴的移动、混合、分配和分析的装置，所述液滴例如浸没在不混溶流体如轻油中的水滴。微流体和纳米流体装置的制造和操作在本领域中是众所周知的，如由通过引用并入本文的以下参考文献例示：Ramsey，美国专利6,001,229；5,858,195；6,010,607；和6,033,546；Soane等人，美国专利5,126,022和6,054,034；Nelson等人，美国专利6,613,525；Maher等人，美国专利6,399,952；Ricco等人，国际专利公布WO 02/24322；Bjornson等人，国际专利公布WO 99/19717；Wilding等人，美国专利5,587,128；5,498,392；Sia等人，Electrophoresis，24：3563-3576(2003)；Unger等人，Science，288：113-116(2000)；Enzelberger等人，美国专利6,960,437；Cao，“Nanostructures&Nanomaterials:Synthesis,Properties&Applications,”(Imperial College Press，London，2004)；Haeberle等人,LabChip,7:1094-1110(2007)；Cheng等人,Biochip Technology(CRCPress,2001)等等。
“纳米孔”意指位于基质中的任何开口，其允许分析物以预定的或可辨别的顺序穿过基质，或在聚合物分析物的情况中，允许聚合物的单体单元以预定的或可辨别的顺序穿过基质。在后一种情况下，预定的或可辨别的顺序可以是聚合物中单体单元的一级序列。纳米孔的实例包括蛋白质性质的或基于蛋白质的纳米孔、合成的或固态的纳米孔、和包括其中嵌入蛋白质纳米孔的固态纳米孔的杂合纳米孔。纳米孔可具有1-10nm或1-5nm或1-3nm的内径。蛋白质纳米孔的实例包括但不限于α-溶血素、电压依赖性线粒体孔蛋白(VDAC)、OmpF、OmpC、MspA和LamB(麦芽糖孔蛋白)，例如公开在Rhee,M.等人，Trends inBiotechnology.25(4)(2007):174-181；Bayley等人(以上引用)；Gundlach等人，美国专利公布2012/0055792等等，其通过引用并入本文。可采用允许单个氨基酸分子的移位的任何蛋白孔。纳米孔蛋白质可在孔的外部的特定的位点被标记，或在组成孔形成蛋白的一个或更多个单体单元的外部的特定位点被标记。孔蛋白选自诸如但不局限于以下的蛋白质的组α-溶血素、MspA、电压依赖性线粒体孔蛋白(VDAC)、炭疽孔蛋白、OmpF、OmpC和LamB(麦芽糖孔蛋白)。将孔蛋白整合至固态孔洞是通过将带电荷的聚合物附接至孔蛋白来完成的。在施加电场后，带电荷的复合物被以电泳方式牵拉入固态孔洞。合成的纳米孔或固态纳米孔，可被创建在各种形式的固态基质中，固态基质的实例包括但不局限于硅酮(例如Si3N4、SiO2)、金属、金属氧化物(例如Al2O3)、塑料、玻璃、半导体材料和其组合。合成的纳米孔可以比置于脂双层膜中的生物蛋白孔更稳定。合成的纳米孔还可通过使用嵌入在合适的基质中的碳纳米管来创建，所述合适的基质例如但不局限于聚合的环氧树脂。碳纳米管可具有均一的并且定义明确的化学性质和结构性质。可获得各种大小的碳纳米管，范围从一至几百纳米。碳纳米管的表面电荷已知约是零，并且作为结果，核酸穿过纳米孔的电泳运输变得简单和可预测(Ito,T.,Chem.Commun.12(2003):1482-83)。合成的纳米孔的基质表面可被化学修饰以允许蛋白质孔的共价附接或以致使表面性质合适于光学纳米孔测序。此类表面修饰可以是共价的或非共价的。大多数共价修饰包括有机硅烷沉积，其最常用的方案被描述为：1)从水性乙醇中沉积。这是制备甲烷硅基化表面的最简易的方法。将95％乙醇-5％水的溶液用乙酸调整至pH 4.5-5.5。伴随搅拌添加硅烷至产生2％的终浓度。在水解作用和硅醇基团形成之后添加基质持续2-5分钟。之后,通过短暂地浸渍在乙醇中将过量材料冲洗干净。在110摄氏度持续5-10分钟使硅烷层硬化。2)气相沉积。硅烷可在干燥的疏质子条件下通过化学气相沉积方法被涂敷至基质。这些方法有利于单层沉积。在封闭的室设计中，基质被加热至足够温度以达到5mm蒸气压。可选地，可施加真空直到观察到硅烷蒸发。3)旋涂沉积。旋涂应用可在有利于最大官能化和多层沉积的水解条件下进行，或在有利于单层沉积的干燥条件下进行。在一些实施方案中，单个纳米孔被用于本发明的方法。在其他实施方案中，多个纳米孔被采用。在后一种的一些实施方案中，多个纳米孔以纳米孔阵列被采用，纳米阵列通常设置在平面基底，例如固相膜中。纳米孔阵列的纳米孔可规则地间隔开，例如以直线模式，或者可随机间隔开。在优选的实施方案中，纳米孔在平面固相基质中以直线模式规则地间隔开。
“纳米结构”(与“纳米级结构”和“纳米级特征”可互换使用)意指具有在几纳米至几百纳米范围内的至少一个尺寸的结构，例如1至1000纳米。在一些应用中，此范围为2至500纳米；在其他应用中，该范围为3至500纳米。纳米结构的形状和几何形状可以广泛变化并且包含但不限于纳米孔、纳米井、纳米颗粒以及特别适用于实施系列反应的任何其他方便的形状。在一些实施方案中，纳米结构可以是与固相膜可操作地关联的蛋白质纳米孔。一些纳米结构，例如纳米孔和纳米井，可在较大的普通基底例如固相膜或其他固体中形成，以形成纳米孔或纳米井阵列。特别感兴趣的纳米结构是那些能够支持或含有化学、物理(例如FRET)、酶促和/或结合反应或一系列这种反应的纳米结构。在一些实施方案中，纳米结构例如纳米孔，包围小于1纳升(10×-9升)、小于1皮升或小于1飞升的体积。在其他实施方案中，每个单独的纳米井提供的体积小于1000仄升、100仄升、80仄升、或小于50仄升、或小于1仄升、或甚至小于100yactoliters。在一些实施方案中，纳米井包括零模波导。
关于肽的“肽”、“肽片段”、“多肽”、“寡肽”或“片段”在本文中同义使用，并且是指由肽键连接的氨基酸残基的单个未分支的链组成的化合物。肽或多肽中的氨基酸可用各种部分衍生化，所述部分包括但不限于聚乙二醇、染料、生物素、半抗原或类似部分。蛋白质或多肽或肽中的氨基酸残基的数目可变化很大；然而，在一些实施方案中，本文提及的蛋白质或多肽或肽可具有2至70个氨基酸残基；并且在其他实施方案中，它们可具有2至50个氨基酸残基。在其他实施方案中，本文提及的蛋白质或多肽或肽可具有从几十个氨基酸残基，例如20,至多达一千或更多个氨基酸残基，例如1200个。在又其他实施方案中，蛋白质、多肽、肽或其片段可具有10至1000个氨基酸残基；或者它们可具有20-500个氨基酸残基；或者它们可具有20至200个氨基酸残基。
“聚合物”是指多个单体连接成直链。通常，聚合物包含多于一种类型的单体，例如，如包含A、C、G和T的多核苷酸，或包含多于一种氨基酸的多肽。单体可包括但不限于核苷及其衍生物或类似物，以及氨基酸及其衍生物和类似物。在一些实施方案中，聚合物是多核苷酸，其中核苷单体通过磷酸二酯键或其类似物连接。
“多核苷酸”或“寡核苷酸”被可互换地使用并且各自意指核苷酸单体的线性聚合物。组成多核苷酸和寡核苷酸的单体能够经由单体与单体相互作用的规则模式,例如Watson-Crick类型的碱基配对、碱基堆积、Hoogsteen或反式Hoogsteen类型的碱基配对等，特异性地结合天然多核苷酸。此类单体以及其核苷间连键可以是天然存在的或可以是其类似物，例如天然存在或非天然存在的类似物。非天然存在的类似物可包含PNA、硫代磷酸核苷间连键、含有允许标记物(例如荧光团或半抗原等)附接的连接基团的碱基。当寡核苷酸或多核苷酸的使用需要酶加工时，例如通过聚合物的延伸、通过连接酶的连接等等，普通技术人员应该理解在那些情况下寡核苷酸或多核苷酸将在任何或一些位置不包含以下的某些类似物：核苷间连键、糖部分或碱基。多核苷酸大小的范围通常从少数单体单元，例如5-40个，此时它们通常称为“寡核苷酸”，到几千个单体单元。除非另有说明或从上下文明显的，每当多核苷酸或寡核苷酸以字母(大写或小写)序列表示时，例如“ATGCCTG”，应该理解的是该核苷酸从左到右是5’→3’的顺序，并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，并且“T”表示胸苷，“I”表示脱氧肌苷，“U”表示尿苷。除非另有指出，术语和原子编号惯例将遵循公开在Strachan和Read,Human Molecular Genetics 2(Wiley-Liss，New York,1999)中的那些。通常多核苷酸包含由磷酸二酯键连接的四种天然核苷(例如，对于DNA的脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或对于RNA的它们的核糖对应物)；然而，它们还可包含非天然的核苷酸类似物，例如包含修饰的碱基、糖或核苷间连键。对本领域的技术人员很明显的是，当酶活性具有特定的寡核苷酸或多核苷酸底物的需求时，例如，单链DNA、RNA/DNA双链体(duplex)或其类似物，则选择寡核苷酸或多核苷酸底物的合适的组成在普通技术人员的知识内，尤其是在专著的指导下，例如Sambrook等人,MolecularCloning,第二版(Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989)和类似的参考文献。同样，寡核苷酸和多核苷酸可以指单链形式或双链形式(即寡核苷酸或多核苷酸与其各自的互补物的双链体)。从术语使用的上下文，对普通技术人员来说，意图哪种形式或者是否意图两种形式将是明显的。
“序列确定”、“测序”或“确定核苷酸序列”或类似的关于多核苷酸的术语包括确定多核苷酸的部分的以及全部的序列信息。即，该术语包括四种天然核苷酸A、C、G和T全组的亚组的序列，诸如，例如靶多核苷酸的仅仅A和C的序列。即，该术语包括确定靶多核苷酸中四种类型核苷酸中的一种、两种、三种或所有的身份、顺序和位置。在一些实施方案中，该术语包括确定靶多核苷酸中四种类型核苷酸中的两种、三种或所有的身份、顺序和位置。在一些实施方案中，序列确定可通过鉴定靶多核苷酸“catcgc...”内的单一类型的核苷酸例如胞嘧啶的顺序和位置来实现，以使其序列表示为二进制代码，例如“100101...”，其代表“c-(非c)(非c)c-(非c)-c...”的等等。在一些实施方案中，该术语还可包括充当靶多核苷酸的指纹的靶多核苷酸的子序列；即，在多核苷酸的组中独特地标识靶多核苷酸或一类靶多核苷酸的子序列，例如由细胞表达的所有不同的RNA序列。
本公开内容并不意图限制于所列具体形式的范围，而是意图覆盖本文描述的变化形式的替代、修饰和等价物。进一步地，本公开内容的范围充分涵盖了基于本公开内容对本领域的技术人员可变得明显的其他的变化形式。本发明的范围仅受所附的权利要求限制。

Claims (20)

1.一种用于分析聚合物的装置，所述聚合物各自具有附接至单体序列的光学标记物，所述装置包括：
纳米孔阵列，其分隔第一室和第二室，其中所述纳米孔阵列的纳米孔各自连接所述第一室和所述第二室，并且被布置成簇使得纳米孔的每个不同的簇被布置在不同的分辨率有限区域内；
聚合物移位系统，其用于将所述第一室中的聚合物穿过所述纳米孔阵列的纳米孔移动到所述第二室；和
检测系统，其用于在每当光学标记物离开分辨率有限区域内的纳米孔时收集由附接至聚合物的光学标记物生成的光学信号。
2.如权利要求1所述的装置，其中所述簇被以直线阵列或六边形阵列布置。
3.如权利要求1所述的装置，其中每个所述簇包括多个纳米孔，或者每个所述簇包括为平均值大于零的随机变量的数目的纳米孔。
4.如权利要求1所述的装置，其中所述聚合物是多核苷酸，并且其中所述检测系统从所述收集的光学信号确定每个所述分辨率有限区域内的功能性纳米孔的数目，并且改变跨所述纳米孔阵列的电场使得通过所述纳米孔阵列的序列确定的速率最大化。
5.一种分析各自具有光学标记物序列的聚合物的方法，所述方法包括：
提供纳米孔阵列，其中每个纳米孔具有能够提供第一室和第二室之间的流体连通的孔洞，并且所述纳米孔阵列具有至少一个含有多个纳米孔的分辨率有限区域；
使聚合物移位穿过所述纳米孔阵列的纳米孔；
收集和整合来自在预定间隔期间移位穿过每个所述分辨率有限区域中的纳米孔的聚合物的光学信号，以获得对于每个所述分辨率有限区域的整合信号；以及
通过其整合信号的相对水平来确定每个所述分辨率有限区域内的功能性纳米孔的数目。
6.如权利要求5所述的方法，还包括选择聚合物浓度和/或聚合物流通量以使所述纳米孔阵列的测序通量最大化的步骤。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述聚合物是多核苷酸，并且所述选择步骤包括通过改变跨所述纳米孔阵列的电场强度来调整所述聚合物流通量以使测序通量最大化。
8.一种用于分析各自具有光学标记物序列的聚合物的装置，所述装置包括：
固相膜，其分隔第一室和第二室，所述固相膜具有孔眼阵列，每个所述孔眼连接所述第一室和所述第二室，所述阵列的孔眼被布置成簇，所述簇各自具有多个孔眼，并且每个不同簇被布置在不同的分辨率有限区域内；
被固定在所述孔眼中的蛋白质纳米孔，所述固定的蛋白质纳米孔具有活跃部分，其中所述活跃部分的每个固定的蛋白质能够穿过孔洞将聚合物从所述第一室移位至所述第二室；以及
检测系统，其用于每当光学标记物离开分辨率有限区域内的蛋白质纳米孔的孔洞时收集由光学标记物生成的光学信号。
9.如权利要求8所述的装置，其中所述聚合物包括多核苷酸，并且其中所述检测系统从所述收集的光学信号来确定每个所述分辨率有限区域内的功能性纳米孔的数目，并且改变跨所述纳米孔阵列的电场以使通过所述纳米孔阵列确定所述光学标记物序列的速率最大化。
10.一种测序各自具有光学标记物序列的多核苷酸的方法，所述方法包括：
(a)使单链多核苷酸以一定浓度和流通量移位穿过纳米孔阵列，其中每个单链多核苷酸的基本上每个核苷酸被光学标记物标记，所述光学标记物能够生成指示其所附接的核苷酸的光学信号，并且其中所述纳米孔阵列包括纳米孔簇，每个簇包括一定数目的纳米孔，其中每个不同的簇被布置在不同的分辨率有限区域内，并且其中每个簇中的纳米孔的数目大于一或是平均值大于零的随机变量；
(b)使每个核苷酸的光学标记物在离开纳米孔后暴露于激发辐射；
(c)每当光学信号来自单个光学标记物时，在所述纳米孔阵列上的每个分辨率有限区域中测量由离开纳米孔的光学标记物生成的这种光学信号，以鉴定所述光学标记物所附接的核苷酸；以及
(d)由来自单个光学标记物的光学信号序列确定所述多核苷酸的核苷酸序列。
11.如权利要求10所述的方法，其中调整所述多核苷酸的浓度和/或穿过所述纳米孔阵列的所述多核苷酸的流通量，以使所述阵列中可测序纳米孔最大化。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述单链多核苷酸的所述流通量被控制以通过控制跨所述纳米孔阵列的电势来使所述阵列中的可测序纳米孔的数目最大化。
13.一种用于检测来自阵列上的平行反应的光学信号的序列的设备，所述设备包括：
纳米结构的阵列，所述纳米结构各自包括反应位点并且各自能够限制生成光学信号序列的反应，所述阵列的所述纳米结构被布置成簇，每个所述簇包括一定数目的纳米结构，并且纳米结构的每个不同的簇被布置在不同的分辨率有限区域内；以及
光学系统，其与所述阵列可操作地关联以用于检测来自反应的光学信号。
14.如权利要求13所述的设备，其中所述纳米结构选自由纳米孔、纳米井和纳米颗粒组成的组。
15.如权利要求14所述的设备，其中每个所述簇中的纳米结构的所述数目大于一或是平均值大于零的随机变量。
16.如权利要求15所述的设备，其中所述纳米结构是纳米孔，并且其中所述阵列包括分隔第一室和第二室的固相膜，所述固相膜具有多个孔眼，每个所述孔眼连接所述第一室和所述第二室并且每个所述孔眼被布置在簇中；以及被固定在所述孔眼中的蛋白质纳米孔，所述固定的蛋白质纳米孔具有活跃部分，其中所述活跃部分的每个固定的蛋白质能够穿过孔洞将聚合物从所述第一室中移位至所述第二室。
17.如权利要求16所述的设备，其中所述蛋白质纳米孔处的所述反应是FRET对的供体和受体之间的FRET相互作用，每个受体附接至所述聚合物的单体，并且每个受体能够生成指示其所附接的单体的光学信号。
18.如权利要求15所述的设备，其中所述纳米结构是纳米孔，并且其中所述阵列包括分隔第一室和第二室的固相膜，所述固相膜具有多个孔眼，每个所述孔眼连接所述第一室和所述第二室，并且每个所述孔眼被脂质双层跨越；所述脂质双层具有布置在其中的蛋白质纳米孔以形成所述簇，以使每个簇中的蛋白质纳米孔的所述数目是所述平均值大于零的所述随机变量。
19.如权利要求18所述的设备，其中在所述蛋白质纳米孔处的所述反应是FRET对的供体和受体之间的FRET相互作用，每个供体附接至蛋白质纳米孔并且每个受体附接至所述聚合物的单体，其中每个受体能够生成指示其所附接的单体的光学信号。
20.如权利要求15所述的设备，其中所述纳米结构是各自包括零模波导的纳米井。
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