CN107303302A

CN107303302A - 溶瘤牛痘病毒组合癌症疗法

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Publication number: CN107303302A
Application number: CN201710457965.7A
Authority: CN
Inventors: D·科恩; C·布雷特巴切
Original assignee: Hilakin Ltd By Share Ltd
Current assignee: Hilakin Ltd By Share Ltd
Priority date: 2009-09-14
Filing date: 2010-09-14
Publication date: 2017-10-31
Also published as: HUE038708T2; EP3409119B1; JP2016028095A; HK1246149A1; ES2848650T3; KR20130026407A; EP2477499A4; ES2671570T3; JP6181724B2; KR101838472B1; AU2010291901B2; CN103347393A; BR112012005774A2; AU2015243020A1; DK2477499T3; AU2010291901A1; EP3409119A1; EP2477499B1; KR101759888B1; JP5879266B2

Abstract

本发明的实施方案涉及包括胸苷激酶缺乏性牛痘病毒的方法。所述方法包括在用牛痘病毒治疗之后针对再灌注评估肿瘤，如果检测到再灌注，则施用抗血管生成剂。

Description

溶瘤牛痘病毒组合癌症疗法

发明背景

I.发明领域

本发明总的涉及肿瘤学和病毒学的领域。更具体来说，其涉及痘病毒类，特别包括适于治疗癌症的溶瘤牛痘病毒及其与抗血管生成剂组合的使用。

II.背景

正常组织稳态是细胞增殖及细胞死亡的高度受调控过程。细胞增殖或细胞死亡的不平衡可以发展成癌状态(Solyanik等人,1995；Stokke等人,1997；Mumby和Walter,1991；Natoli等人,1998；Magi-Galluzzi等人,1998)。例如，宫颈癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌及脑癌就是这种结果导致的许多癌症中的几种例子(Erlandsson,1998；Kolmel,1998；Mangray和King,1998；Mougin等人,1998)。事实上，癌症的发生率很高，以至于单单美国每年死于癌症的人数就超过500,000。

当前，对于许多普通类型的癌症来说只有少数几种有效的治疗方案可供选择。给定个体的疗程取决于诊断、疾病的发展阶段以及诸如患者的年龄、性别和总体健康之类的因素。癌症治疗的最常规选择是手术、放射治疗和化疗。手术在癌症的诊断和治疗中起到重要作用。一般而言，活组织检查及去除癌性生长需要手术方法。然而，如果癌症已转移且扩散，则手术不太可能导致病愈，并且必须采取替代方法。

复制选择性溶瘤病毒有望用于治疗癌症(Kirn等人,2001)。通过直接复制依赖性和/或病毒基因表达依赖性溶瘤作用，这些病毒可导致肿瘤细胞死亡(Kirn等人,2001)。另外，病毒能够增强宿主内细胞介导的抗肿瘤免疫的诱导(Todo等人,2001；Sinkovics等人,2000)。这些病毒也可经基因工程化处理而在肿瘤内表达治疗性转基因以增强抗肿瘤功效(Hermiston,2000)。然而，该治疗方法也存在主要限制。

因此，需要用于癌症治疗的更多额外疗法。溶瘤病毒的使用代表了开发的潜在区域。

发明概述

体外研究已表明，当在培养的细胞系上组合使用时，索拉非尼和类似激酶抑制剂抑制痘病毒、牛痘病毒且特别是JX-594的有效性。与体外发现相反，临床前功效模型已显示，将索拉非尼和JX-594组合实际上显示出比这两者中任一单独使用更佳的功效。因此，本发明的各个方面涉及应用这些意外发现作为体内疗法，使用痘病毒、牛痘病毒、或JX-594病毒与抗血管生成剂(如激酶抑制剂、索拉非尼、索坦、或类似化合物)的组合。

本发明的实施方案涉及用于在先前施用痘病毒疗法的对象中治疗癌症的方法，其包括施用有效量的抗血管生成剂。在某些方面，确定正在治疗的肿瘤正在经受再血管化。在另一个方面，该痘病毒是牛痘病毒。在另一个方面，该牛痘病毒是表达GM-CSF的牛痘病毒。或者，该牛痘病毒缺乏功能性胸苷激酶基因。在某些方面，该牛痘病毒是JA-594。

某些实施方案涉及增效(potentiating)抗血管生成疗法，特别是用于已失败、已发展耐受性、未应答、或部分应答的患者的那些增效抗血管生成疗法。如本文所用，术语"增效"、"增效的"、"疗法增效的"、"疗效被增效"及"增效疗效"在本文中定义为产生一种或多种以下生理作用：通过以附加或协同的细胞毒性方式与治疗剂发挥作用，使得所述治疗剂的细胞毒活性增加或增强；使癌细胞或肿瘤对治疗剂的抗癌活性敏感；和/或恢复疗法的抗血管生成有效性或者肿瘤对该疗法的敏感性。本发明的实施方案包括作为用于治疗癌症的治疗剂的抗血管生成剂。在某些方面，使抗血管生成疗法增效的方法包括：以使抗血管生成疗法的治疗功效增效的量，将痘病毒施用至对该抗血管生成疗法不敏感的、发展了对其耐受性的、或未充分应答该抗血管生成疗法的患者。在另一方面，抗血管生成疗法是激酶抑制剂、索拉非尼、索坦、或类似化合物。本发明的方法还可以包括识别在抗血管生成疗法之后癌症复发的、抗性的或无应答的患者。在某些方面，将敏化量的痘病毒、牛痘病毒、或JX-594病毒施用至对抗血管生成疗法(抗血管生成激酶抑制剂、索拉非尼、索坦或类似化合物)不敏感、抗药的、或耐受的患者。敏化量是这样的量，其足够使对治疗未显示治疗性应答(由医师或科学家确定)的肿瘤能够对相同或类似疗法应答。

"疗法抗性"癌症及肿瘤是指已变得对抗血管生成癌症疗法有抗性的癌症。"疗法敏感的"癌症是对疗法有应答的(应答的临床参数是可检测或可测量的，例如肿瘤生长减少，肿瘤坏死，肿瘤萎缩，肿瘤血管关闭等等)。本领域的技术人员将理解，一些癌症对特定药剂是疗法敏感的而对其它药剂不敏感。

在某些方面，抗血管生成剂是激酶抑制剂。在其它方面，激酶抑制剂抑制Raf激酶途径。在特定方面，激酶抑制剂是索拉非尼、索坦、或类似的抗血管生成激酶抑制剂。

某些实施方案涉及还包括确定肿瘤是否正在经受再血管化的方法。在某些方面，再血管化是通过肿瘤的非侵袭性成像(如磁共振成像(MRI))来确定的。在某些方面，磁共振成像是动态造影增强MRI(dynamic contrast-enhanced MRI，DCE-MRI)。

在所述方法的某些方面中，该抗血管生成剂是在第一次、第二次、第三次、第四次、第五次或更多次牛痘病毒施用后至少2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更多周时(包括其间的所有值及范围)施用的。

在某些方面，该肿瘤是脑肿瘤、头和颈癌肿瘤、食管肿瘤、皮肤肿瘤、肺肿瘤、胸腺肿瘤、胃肿瘤、结肠肿瘤、肝脏肿瘤、卵巢肿瘤、子宫肿瘤、膀胱肿瘤、睾丸肿瘤、直肠肿瘤、乳腺肿瘤、肾脏肿瘤、或胰腺肿瘤。在另一个方面，该肿瘤是肝细胞癌或结肠直肠癌。

在某些方面，该方法还包括首先向对象施用痘病毒、牛痘病毒、或JX-594病毒疗法。在另一个方面，该病毒疗法可以通过注射到肿瘤块中或通过血管内给药来施用。在特定方面，将病毒注射到肿瘤脉管系统中。在某些方面，病毒疗法可以经由多种用药方式(例如血管内及瘤内等用药方式)来施用。

某些实施方案涉及用于治疗在患者的肝脏或其它器官中的肝肿瘤或转移性肿瘤的方法，其包括向该肿瘤施用索拉非尼，其中该肿瘤先前用痘病毒、牛痘病毒、或JX-594病毒治疗过。本发明的方法还可以包括确定该肿瘤是否正在经受再灌注。

某些方面涉及治疗肝肿瘤，原发性或转移性肿瘤(转移性肿瘤是发源于远离受治疗位置的器官或组织中的肿瘤)的方法，其包括施用有效量的痘病毒、牛痘病毒、或JX-594病毒，以及施用抗血管生成剂。在某些方面，抗血管生成剂将是激酶抑制剂。在其他方面，该激酶抑制剂是索拉非尼或索坦。

某些实施方案涉及治疗肝肿瘤的方法，其包括施用有效量的痘病毒、牛痘病毒、或JX-594病毒，其中将针对肿瘤的再灌注进行评估，并且如果肿瘤正在经受再灌注，则确定其为索拉非尼疗法的候选者。

其它方面涉及治疗具有肿瘤的患者的方法，其包括：(a)通过肿瘤的非侵袭性成像评估已用抗癌疗法治疗的肿瘤以检测再灌注；和(b)将有效量的抗血管生成剂(如索拉非尼或索坦、或类似激酶抑制剂)施用至其中检测到或怀疑存在再灌注的肿瘤。用JX-594和抗血管生成剂(如索拉非尼或索坦或类似激酶抑制剂)的组合治疗肿瘤不需要成像。

JX-594是靶向性溶瘤痘病毒，被设计成在癌细胞中选择性复制并且破坏癌细胞。直接瘤溶解加上粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)表达也能刺激肿瘤中的肿瘤血管关闭。

本发明的某些实施方案涉及包括施用胸苷激酶缺乏性牛痘病毒的方法。在某些方面，该方法包括向对象施用TK-缺乏、GM-CSF-表达、有复制活性的牛痘病毒载体(如JX-594)，其量足以在受治疗肿瘤或远离施用部位的其它肿瘤中诱发细胞的瘤溶解。牛痘病毒的施用之后可以施用抗血管生成剂，例如抗血管生成酪氨酸激酶抑制剂。

酪氨酸激酶抑制剂可以选自：舒尼替尼(sunitinib)(SU1 1248；索坦)、SU5416、SU6668、瓦他拉尼(vatalanib，PTK787/ZK222584)、AEE788、ZD6474、ZD4190、AZD2171、GW786034、索拉非尼(sorafenib)(BAY 43-9006)、CP-547,632、AG013736、YM-359445、吉非替尼(gefitinib)厄洛替尼(erlotinib)EKB-569、HKI-272、和CI-1033。索拉非尼(耐克沙瓦，拜耳(Nexavar,Bayer))是一种经许可用于治疗原发性肾脏癌(晚期肾细胞癌)和晚期原发性肝癌(肝细胞癌)的药物。索拉非尼是若干酪氨酸蛋白质激酶的小分子抑制剂。索拉非尼靶向Raf/Mek/Erk途径(MAP激酶途径)。因此，也包括靶向此途径的其它激酶抑制剂可有利地与JX-594组合使用。

在某些方面，对象被施用至少1×10⁷、1×10⁸、2×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、2×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×l0¹¹、5×10¹¹、1×10¹²、5×10¹²或更多个(包括其间各种值和范围)病毒颗粒或空斑形成单位(pfu)。病毒剂量可以按0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、500、1000或更多毫升(包括其间所有值和范围)施用。在一个方面，该剂量足以在患者的血清中产生可检测水平的GM-CSF，如至少约、至多约或约2、5、10、40、50、100、200、500、1,000、5,000、10,000、15,000至20,000pg/mL(包括其间所有值和范围)。可设想病毒的单次剂量是指在0.1、0.5、1、2、5、10、15、20、或24小时时间内(包括其间所有值)施用至对象或肿瘤的量。该剂量可以随时间分布或通过单独注射分布。一般而言，将多个剂量施用至相同的一般靶向区域，例如在肿瘤的附近，或在静脉内给药的情况下在对象的血流或淋巴系统中的特定进入点。在某些方面，该病毒剂量通过注射装置递送，该注射装置包含提供单个针中的多个端口或连接至注射器的多个尖头、或它们的组合。在另一个方面，牛痘病毒载体被施用2、3、4、5、或更多次。在另一个方面，该牛痘病毒是在1、2、3、4、5、6、7或更多天或周内施用的。

在某些实施方案中，该对象为人。该对象可能罹患癌症和/或肿瘤。在某些实施方案中，肿瘤在治疗之前是不可切除的，而在治疗之后是可切除的。在某些方面，该肿瘤位于肝脏上或肝脏中。在其它方面，该肿瘤可以是脑癌肿瘤、头和颈癌肿瘤、食管癌肿瘤、皮肤癌肿瘤、肺癌肿瘤、胸腺癌肿瘤、胃癌肿瘤、大肠癌肿瘤、肝脏癌肿瘤、卵巢癌肿瘤、子宫癌肿瘤、膀胱癌肿瘤、睾丸癌肿瘤、直肠癌肿瘤、乳腺癌肿瘤、或胰腺癌肿瘤。在其它实施方案中，该肿瘤是膀胱肿瘤。在其它实施方案中，该肿瘤是黑素瘤。该肿瘤可以是复发性、原发性、转移性、和/或多药物抗性肿瘤。在某些实施方案中，该肿瘤是肝细胞肿瘤或源自另一组织或位置的转移的肿瘤。在某些方面，该肿瘤在肝脏中。

在某些方面，监测该患者的肿瘤再灌注。在某些方面，监测或评估该患者将通过非侵袭性或最低程度侵袭性成像(如磁共振成像)来进行。如果检测到或怀疑存在再灌注，则患者可被施用抗血管生成剂，例如抗血管生成酪氨酸激酶抑制剂。在某些方面，酪氨酸激酶抑制剂是索拉非尼或类似药剂。抗血管生成剂可以在痘病毒病毒疗法后至少、至多、或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、或更多周时施用。

在某些方面，该方法还包含向对象施用额外的癌症疗法。额外的癌症疗法可以是化学疗法、生物疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、抗血管性疗法、冷冻疗法、毒素疗法和/或手术，包括它们的组合。在另一个方面，手术包括经动脉化疗栓塞。(TACE法,参见Vogl等人,European Radiology 16(6):1393,2005)。该方法还可以包括牛痘病毒载体的第二次给药。本发明的方法还可以包括在治疗之前、期间、之后评价肿瘤细胞活力，或它们的组合。在某些实施方案中，该病毒是以血管内、瘤内、或以它们的组合方式施用的。在另一个方面，给药是通过注射到肿瘤块中来进行。在另一个实施方案中，给药是通过注射到肿瘤脉管系统中或在肿瘤脉管系统的区域中注射来进行。在另一个实施方案中，给药是通过注射到邻近肿瘤的淋巴或脉管系统中来进行。在某些方面，该方法包括在给药之前或在给药期间使该肿瘤成像。在某些方面，患者采用牛痘病毒疫苗预免疫或未预免疫。在另一个方面，可以天然地或临床地使对象免疫妥协。

在某些方面，施用该病毒，其量足以诱发细胞或癌细胞死亡或坏死，死亡或坏死的细胞或癌细胞为注射肿瘤中细胞的至少15％，为注射肿瘤中细胞的至少20％，为注射肿瘤中细胞的至少30％，为注射肿瘤中细胞的至少30％，为注射肿瘤中细胞的至少40％，为注射肿瘤中细胞的至少50％，为注射肿瘤中细胞的至少60％，为注射肿瘤中细胞的至少70％，为注射肿瘤中细胞的至少80％，或为注射肿瘤中细胞的至少90％。

在本发明的另一方面，该方法可以排除用牛痘疫苗对对象预治疗，例如，对象不需要在施用本文所述的疗法前的1、2、3、4、5、或更多天、周、月、或年时接种。在一些方面，未注射的肿瘤或癌症将用治疗性病毒感染，从而通过局部给药和全身性播散来治疗患者。

本发明的其它实施方案在本申请全文中讨论。相对于本发明的一个方面讨论的任何实施方案也适用于本发明的其它方面，并且反之亦然。实施例部分中的实施方案应被理解为适用于本发明的所有方面的本发明的实施方案。

术语"抑制"、"减少"、或"防止"、或任何这些术语的变型当在权利要求书和/或说明书中使用时包括用于实现所需结果的任何可测量的降低或完全抑制。

在权利要求书和/或说明书中，词语"一"("a"或"an")当与术语"包含/包括"结合使用时可以是指"一"，但也符合"一或多"、"至少一"和"一或一以上"的含义。

本文讨论的任何实施方案可以针对本发明的任何方法或组合物来实施，反之亦然。此外，本发明的组合物和试剂盒可以用于实现本发明的方法。

在本申请中，术语"约"用于表明：值包括用于测定该值的设备或方法的误差的标准偏差。

权利要求书中术语"或"的使用是指"和/或"，除非明确指明仅为或选，或是替代性方式是相互排斥的，尽管公开内容支持所指的仅是或选和"和/或"的定义。

如本说明书和权利要求书中所用，词语"包括"(和“包括”(comprising)的任何形式，例如"comprise"和"comprises")、"具有"(和“具有”(having)的任何形式，例如"have"和"has")、"包含"(和“包含”(including)的任何形式，例如"includes"和"include")或"含有"(和“含有”(containing)的任何形式，例如"contains"和"contain")是包含性或开放式的，并且不排除附加的、未指出的要素或方法步骤。

本发明的其它目的、特征和优点从以下详细说明中变得明显。然而，应当理解的是详细说明和特定实例，当指明本发明的特定实施方案时，仅通过举例说明的方式给出，因为在本发明的范围和精神内的各种变化和修改是本领域技术人员通过此详细说明所显而易见的。

附图说明

以下附图形成本说明书的一部分并且被包括以进一步演示本发明的某些方面。本发明可以通过结合本文所示特定实施方案的详细说明参阅一幅或多幅这些附图而较好的理解。

图1：JX-594复制在体外索拉非尼存在下被抑制。以各种感染多重性(MOI)，将JX-594单独、或与10μM索拉非尼一起添加至PLC/PRF/5细胞。在24小时的感染之后，收集细胞和上清液用于在Vero细胞上通过空斑测定滴度。

图2：索拉非尼抑制JX-594空斑形成和复制。使JX-594可以在不存在或存在增加浓度的索拉非尼的情况下，感染A2780或HepG2细胞的单层。上图表示出测量原单层上空斑形成的实验，以及新病毒颗粒(释放)的产生。下图表示出细胞毒性水平以下的浓度有效抑制病毒复制。该数据表示为占对照物(无JX-594，无索拉非尼)的百分数。误差条为重复间的标准偏差。

图3：采用索拉非尼的组合疗法增强JX-594针对CT26皮下实体瘤的功效。上图示出在具有CT2皮下肿瘤的小鼠中组合功效临床前研究的研究设计。中图示出各种条件下的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线。下图示出对肿瘤体积的作用。

图4：采用索拉非尼的组合疗法在鼠B16转移性黑素瘤模型中增强JX-594的功效。上图示出在B16鼠肿瘤模型中组合功效临床前研究的研究设计。下图示出各组中发展的肺转移瘤的平均数量。

图5：JX-594继以索拉非尼在HCC异种移植模型中显示优良功效。图表描述各组的治疗时间表。图解示出各组随时间的平均肿瘤大小(mm3)(条棒为平均值的标准误差)。

图6：JX-594继以索拉非尼的抗血管性作用。上图示出在HepG2异种移植模型中JX-594继以索拉非尼的临床前研究的研究设计。下图示出肿瘤中血管的平均数量(计算三个200×区域)。误差条为标准误差。

图7：显示血管关闭的HCC患者DCE-MRI扫描图。

图8：显示在远离瘤内注射部位(injection cite)的部位内的应答的DCE-MRI扫描图。

图9：显示在远离瘤内注射部位(injection cite)的部位内的应答的DCE-MRI扫描图。

图10：示出患者应答的总结，包括Choi评价。

图11：患者1702--索拉非尼治疗后4周和8周的DCE-MRI图像(显示了3个不同平面，示出各平面的4周和8周图像)。

图12：患者1705--在JX-594治疗之前和治疗5天后的DCE-MRI图像：索拉非尼治疗之前和治疗4周后的DCE-MRI图像。

图13：患者1712--索拉非尼治疗之前和治疗4周后的DCE-MRI图像。

图14：患者11301--具有转移至肝脏的肾细胞癌的患者的评价。

图15：对相继采用JX-594和索拉非尼观察的肿瘤稳定化和降低的增强作用(患者1705)的图解说明。

图16：示出采用JX-594继以索拉非尼治疗的患者中显著的坏死诱导(患者1705)。

图17：示出采用JX-594和索拉非尼相继治疗之后减小的存活肿瘤体积。

图18：具有肝细胞癌并参加JX-594的2期临床试验的患者的DCE-MRI扫描图显示在未注射的肝外(extahepatic)肿瘤中索拉非尼起始用药10天之后的灌注损失。在完成JX-594给药之后(一剂静脉内剂量和两剂瘤内剂量)，患者接收索拉非尼。

发明详述

本发明涉及用于治疗癌症的溶瘤痘病毒的用途。具体来说，描述了表达GM-CSF的牛痘病毒在实现特定程度的瘤溶解中的用途。在另一个实施方案中，牛痘病毒可以用于更有效治疗已血管化的肿瘤或正在血管化的肿瘤的治疗方案。具体方案为在用溶瘤牛痘病毒治疗之后，使用抗血管生成剂。在某些方面，该治疗方案包括对肿瘤成像以评价再灌注，所述再灌注在牛痘病毒诱发肿瘤的血管萎陷之后由肿瘤的再血管化产生。在某些方面，牛痘病毒为JX-594病毒(TK^-、GM-CSF表达的牛痘病毒)。

I.治疗方案和药学制剂

在本发明的实施方案中，包括一种用于通过递送溶瘤牛痘病毒(例如JX-594)来治疗过度增殖性疾病(例如癌症)的方法。

所述方法包括施用有效量的包含溶瘤牛痘病毒或抗血管生成剂的药学组合物。药学有效量被定义为足以诱发瘤溶解(癌细胞破裂或溶解)和/或抑制肿瘤的血管化或破坏肿瘤的新生-脉管系统的量。该术语包括减缓、抑制、或减小肿瘤的生长或大小以及包括在某些情况下根除肿瘤。在某些方面，牛痘病毒的有效量导致治疗性病毒全身性播散至肿瘤，例如，感染未注射的肿瘤。

A.组合治疗

本发明的化合物和方法可以在过度增殖性疾病/病况(包括癌症)的背景中，并且可以各种施用间的时间间隙以特定次序施用。为了增加用本发明组合物(例如表达GM-CSF的牛痘病毒)来治疗的有效性，可取的是将这些组合物与抗血管生成剂和可有效治疗癌症的其它药剂组合。例如，可以用本发明的治疗性化合物结合抗血管生成剂来实施癌症的治疗。

可以采用各种组合；例如，痘病毒(例如牛痘病毒JX-594)为"A"，而第二抗血管生成疗法为"B"：

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B

B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A

B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

考虑到痘病毒治疗的毒性(如果存在)，对患者施用本发明的痘病毒/牛痘载体将遵循用于特定疗法的给药的一般方案。在用牛痘病毒治疗之后，施用抗血管生成剂以有效治疗用牛痘病毒治疗的肿瘤的新-血管化或再灌注。期望的是治疗周期可根据需要重复。还构思将各种标准疗法以及手术干预与所描述的癌症或肿瘤细胞疗法结合应用。

"抗血管生成"剂能够对肿瘤中的血管生成产生负面影响，例如，通过杀死细胞，诱发细胞内的细胞凋亡，降低涉及血管生成的细胞的生长速率以及有效减少对肿瘤或癌细胞的血液供给。抗血管生成剂的实例包括但不限于：索拉非尼，索坦及类似化合物，视黄酸及其衍生物，2-甲氧雌二醇、血管他丁^TM(ANGIOSTATIN^TM)，内皮他丁^TM(ENDOSTATIN^TM)，苏拉明(suramin)，角鲨胺(squalamine)，金属蛋白酶-1的组织抑制剂、金属蛋白酶-2的组织抑制剂，血浆素原激活剂抑制剂-1，血浆素原激活剂抑制剂-2，软骨来源的抑制剂、紫杉醇，血小板因子4，硫酸鱼精蛋白(鲱精蛋白)，硫酸盐化的甲壳质衍生物(由雪花蟹壳制备)，硫酸盐化的多糖肽聚糖络合物(sp-pg)，十字孢碱，基质代谢的调节剂，包括例如脯氨酸模拟物((I-吖丁啶-2-羧酸(LACA)，顺式羟基脯氨酸，d,I-3,4-脱氢脯氨酸，硫代脯氨酸(thiaproline)，α-联吡啶，β-氨基丙腈富马酸酯，4-丙基-5-(4-吡啶基)-2(3h)-噁唑酮；氨甲喋呤，米托蒽醌，肝素，干扰素、2巨球蛋白-血清，庆普-3(chimp-3)，抑糜酶素，β-环糊精十四硫酸酯，依波尼霉素(eponemycin)；烟曲霉素，硫代苹果酸金钠，d-青霉胺(CDPT)，β-1-抗胶原酶-血清，α2-抗血浆素，比山群(bisantrene)，氯苯扎利二钠，n-2-羧苯基-4-氯氨基苯甲酸二钠或"CCA"，沙立度胺(thalidomide)；抑制血管生成的类固醇(angiostaticsteroid)，羧基氨基咪唑(carboxynaminolmidazole)；金属蛋白酶抑制剂，如BB94。其它抗血管生成剂包括抗体，例如抗以下血管生成生长因子的单克隆抗体：bFGF、aFGF、FGF-5、VEGF同种型、VEGF-C、HGF/SF和Ang-l/Ang-2。Ferrara N.和Alitalo,K"Clinicalapplication of angiogenic growth factors and their inhibitors"(“血管生成生长因子及其抑制剂的临床应用”，1999)Nature Medicine5:1359-1364。其它抗血管生成剂可以包括VEGF转录的抑制剂。

血管生成(先前已存在的毛细管以外的新血管形成)是一系列对广泛的生理学和病理学过程十分重要的事件。许多疾病与新脉管系统形成相关。血管生成是各种病理学的重要特征，包括特征为细胞的异常或非受控增殖或与细胞的异常或非受控增殖相关的(如肿瘤)病理学。涉及过度血管生成的病理学包括例如癌症(实体瘤和血液肿瘤)。癌症患者可以受益于血管生成-肿瘤血管化的抑制。

血管生成是赘生组织生长的关键。100多年来，已观察到肿瘤比普通组织具有更多血管。若干实验性研究已表明，原发性肿瘤生长和转移需要新血管形成。活性肿瘤生长必需的病理学血管生成通常被维持并且是持续的，而且血管生成表型的初始获得是各种实体瘤和造血肿瘤类型发展的普通机制。不能补养并维持血管网络的肿瘤一般作为无症状病变原地维持休眠。转移灶也是血管生成依赖性的：对于要成功转移的肿瘤细胞，其通常获得进入原发性肿瘤中脉管系统的入口，在循环中存活下来，在靶器官的微脉管系统中停止，从该脉管系统离开，在靶器官中生长，以及以靶位点诱发血管生成。因此，血管生成似乎是在开始时以及转移性级联的完成时必需的。

血管生成对赘生物的生长和转移的关键性提供了用于治疗措施的靶标。通过延迟肿瘤相关的血管生成发生或者通过阻滞肿瘤的新血管形成的可持续性，适当的抗血管生成剂可以直接地或间接地作用以影响肿瘤相关的血管生成。

附加的抗癌症剂包括生物学药剂(生物治疗)、化学治疗药剂和放射治疗药剂。更一般来说，这些其它组合物可以按能有效杀死细胞或抑制细胞增殖的组合量来提供。

一般而言，牛痘病毒疗法可在其它药剂之前相隔数天至数周进行。在其中其它药剂和痘病毒单独地施加至细胞的实施方案中，通常可确保每次递送之间不花费显著的时间，使得药剂和痘病毒仍能够对细胞施加有利组合作用。在这种情况下，构思的是可以用两种用药方式在彼此间2至20周内接触细胞。在一些情况下，期望显著扩展用于治疗的时间周期，其中各次给药之间经历若干天(2、3、4、5、6或7天)至若干周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。

除用牛痘病毒和抗血管生成剂治疗对象以外，可以使用包括传统癌症疗法在内的附加疗法。

1.化学疗法

癌症疗法包括具有基于化学和辐射的治疗的各种组合疗法。组合化学疗法包括(例如)：顺铂(CDDP)，卡铂，甲基苄肼，氮芥，环磷酰胺，喜树碱，异环磷酰胺，苯丙氨酸氮芥，苯丁酸氮芥，白消安(busulfan)，亚硝基脲，更生霉素(dactinomycin)，柔红霉素，阿霉素(doxorubicin)，争光霉素(bleomycin)，光辉霉素(plicomycin)，丝裂霉素(mitomycin)，表鬼臼毒(etoposide)(VP16)，三苯氧胺(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，雌激素受体结合剂，紫杉酚，吉西他滨(gemcitabien)，诺维本(navelbine)，法呢基-蛋白转移酶抑制剂，反铂(transplatinum)，5-氟尿嘧啶，长春新碱，长春花碱和氨甲喋呤，替莫唑胺(Temazolomide)(DTIC的水性形式)，或上述物质的任何模拟物或衍生物变体。化学疗法与生物疗法的组合称为生物化学治疗。

2.放射疗法

导致DNA损害并已广泛使用的其它因素包括通常所知的γ射线，X射线，和/或对肿瘤细胞的放射性同位素直接递送。还涵盖DNA损害因素的其它形式，例如微波和紫外辐射。最有可能的是，所有这些因素对DNA、DNA的前体、DNA的复制和修补以及染色体的组装和维持产生广范围的损害。X射线的剂量范围为每日剂量50至200伦琴，维持较长时间(3至4周)，至单剂量2000至6000伦琴。放射性同位素的剂量范围广泛变化，并且取决于同位素的半衰期，所发射辐射的强度和类型，以及赘生物细胞的摄取。

术语"接触"和"暴露"，当用于细胞时，在本文中是用于描述将治疗性构建体和化学治疗药剂或放射治疗药剂递送至靶标细胞或者与靶标细胞直接并列的方法。为实现细胞杀死或停滞，按能有效杀死细胞或防止其分裂的组合量将两种药剂递送至细胞。

3.免疫疗法

免疫治疗剂通常依赖于使用免疫效应器细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。免疫效应器可以是例如对肿瘤细胞的表面上的某些标记具有特异性的抗体。该抗体可以单独用作治疗的效应器或其可以募集其它细胞来实际影响细胞杀伤。抗体还可以轭合至药物或毒素(化学治疗剂，放射性核素，蓖麻毒A链，霍乱毒素，百日咳毒素等等)并且仅仅用作靶向剂。或者，该效应器可以是携带直接或间接与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应器细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。治疗性方式的组合，即直接细胞毒活性和某些痘病毒多肽的抑制或降低可在癌症治疗方面提供治疗性有益效果。

4.手术

约60％的患癌人员会进行某类手术，包括预防性、诊断性或分期、治愈性和姑息性手术。治愈性手术是一种可与其它疗法结合的癌症疗法，其它疗法例如为本发明的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代性疗法。

治愈性手术包括切除术，其中癌组织的全部或部分被物理性移除、切除、和/或破坏。肿瘤切除术是指物理移除肿瘤的至少一部分。除肿瘤切除以外，通过手术(包括激光手术、冷冻手术、电手术和显微控制手术(莫氏手术))进行治疗。还包括的是本发明可以与浅表癌、初期癌、或附带量的正常组织的移除结合来使用。

在切除部分或全部癌细胞、组织、或肿瘤之后，可能在体内形成空穴。治疗可以通过采用附加抗癌症疗法对该区域灌注、直接注射或局部施加来完成。此类治疗可以(例如)每1、2、3、4、5、6、或7天，或每1、2、3、4、和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12个月重复。这些治疗也可以具有变化的剂量。

5.其它药剂

可与本发明的方法结合使用的另一种形式的疗法包括高热疗法，这种方法中患者组织被暴露于高温(高达106°F)。局部、区域、或全身高热疗法可涉及外部或内部加热设备。局部高热疗法涉及对小区域(例如肿瘤)施加热。可以用来自体外设备的靶向肿瘤的高频波从外部产生热。内部热可以涉及无菌探针，包括细的受热线或填充温水的中空管，植入的微波天线，或射频电极。

患者的器官或肢体被加热以便区域性治疗，使用产生高能量的设备例如磁铁来完成手术治疗。或者，可以移除患者的一些血液，并在加热后灌注到将内部加热的区域中。在癌症已扩散到整个身体中的情况下，也可实施全身加热。温水毯、热蜡、电感线圈和热处理室可以用于该目的。

激素疗法也可结合本发明或结合先前所述任何其它癌症疗法来使用。激素的使用可以用在某些癌症的治疗中，例如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、或宫颈癌，从而降低某些激素(例如睾丸素或雌激素)的水平或者阻滞这些激素的影响。

B.给药

在治疗肿瘤中，本发明方法施用溶瘤牛痘病毒并随后在其后的一时间处施用包含抗血管生成剂的组合物。给药途径将自然地随肿瘤的位置和性质变化，并包括(例如)：皮内，经皮肤，胃肠道外，静脉内，肌内，鼻内，皮下，局部(例如，在肿瘤附近，特别是肿瘤的脉管系统或邻近的脉管系统)，经皮，气管内，腹膜内，动脉内，膀胱内，瘤内，吸入，灌注，灌洗，和口服给药。组合物将相对于特定给药途径而配制。

特别地涵盖瘤内注射或直接注射到肿瘤脉管系统中。局部、区域性或全身用药也可能是合适的。对于>4cm的肿瘤，待施用的体积将是约4-10ml(优选10ml)，而对于<4cm的肿瘤，将使用约1-3ml的体积(优选3ml)。作为单次剂量递送的多次注射包括约0.1至约0.5ml体积。该病毒可以经多次注射施用至肿瘤，空间间隔约1cm。在手术干预的情况下，本发明可以在手术前使用，以使不可手术的肿瘤可经受切除术。还可以在适当的情况下实施连续给药，例如通过将导管植入到肿瘤中或肿瘤脉管系统中。此类连续灌注在治疗起始之后可以进行的时间为1-2小时，至约2-6小时，至约6-12小时，至约12-24小时，至约1-2天，至约1-2周或更长。通常，在灌注发生的时间内调整剂量，经由连续灌注的治疗性组合物的剂量将等于通过单次或多次注射提供的剂量。还想到的是，可以使用肢体或器官灌注来施用本发明的治疗性组合物，特别是在肝脏肿瘤、黑素瘤和肉瘤的治疗中。

治疗方案也可以变化，并且通常取决于肿瘤类型，肿瘤位置，疾病进展，以及患者的健康情况和年龄。某些类型的肿瘤将需要更积极(aggressive)的治疗，而同时，某些患者不能耐受更有负担(taxing)的方案。临床医师将最适合基于治疗性制剂的已知功效和毒性(如果存在)而做出此类决定。

在某些实施方案中，被治疗的肿瘤可能(至少在一开始时)是不可切除的。由于在边缘处的萎缩或通过除去某些特别侵袭性的部分，采用治疗性病毒构建体的治疗可以增加肿瘤的可治愈性。在治疗之后，切除术是可能的。在切除术之后的附加治疗将用于除去肿瘤位点上的显微残留疾病。

所述治疗可以包括各种"单位剂量"。单位剂量定义为含有预定量的所述治疗性组合物。待施用的量以及具体途径和制剂是临床技术领域的技术人员所知的。单位剂量不需要作为单次注射施用，而可包括在设定时间段内的连续注入。本发明的单位剂量可以方便地依据病毒构建体的空斑形成单位(pfu)来描述。单位剂量范围为10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³pfu和更高。或者，取决于病毒种类和可达到的滴度，将向肿瘤或肿瘤位点递送1至100，10至50，100至1000，或高达约或至少约1×10⁴，1×10⁵，1×10⁶，1×10⁷，1×10⁸，1×10⁹，1×10¹⁰，1×10¹¹，1×10¹²，1×10¹³，1×10¹⁴，或1×10¹⁵个或更高的传染性病毒颗粒(vp)，包括其间的所有数值和范围。

C.血管注射剂组合物和制剂

在本发明中，用于将编码全部或部分痘病毒基因组的表达构建体或病毒递送至癌细胞或肿瘤细胞的优选方法是经由瘤内注射。然而，本文公开的药学组合物可以替代地经胃肠外地、静脉内地、皮内地、肌内地、经皮肤地或甚至经腹膜内地施用，如美国专利5,543,158；美国专利5,641,515和美国专利5,399,363中所述(各专利明确地以引用方式全文并入本文)。

核酸构建体的注射可以通过注射器或用于注射溶液的任何其它方法来递送，只要所述表达构建体可以通过注射所需的具体规格的针。新颖无针注入系统最近已有所描述(美国专利5,846,233)，其具有限定用于保持溶液的安瓿腔室的喷管和用于将所述溶液推出喷管至递送部位的能量设备。还已描述用于基因疗法中的注射器系统，其允许在任何深度精确地多次注射预定数量的溶液(美国专利5,846,225)。

可以在与表面活性剂(例如羟丙纤维素)适宜地混合的水中，制备作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液。也可在甘油、液体聚乙二醇和其混合物中以及在油类中制备分散液。在存储和使用的普通条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体、和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉剂(美国专利5,466,468，明确地以引用方式全文并入本文)。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须具有流动性，其流动性程度为存在易于注射的性能(syringability)。其在制造和储存条件下必须稳定，且必须防止微生物(诸如细菌和真菌等)的污染作用。载剂可为含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等等)、其适宜混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。例如，通过使用涂层(例如卵磷脂)、在分散体的情况下通过维持所需粒径以及通过使用表面活性剂，可以维持适当流动性。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等)来防止微生物的作用。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，延长可注射组合物的吸收。

对于水溶液形式的胃肠外给药，例如，如有必要，该溶液应适宜地缓冲，并且先采用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定水溶液尤其适用于静脉内的、肌内的、皮下的、瘤内的和腹膜内的给药。就此而论，在本发明公开内容的启示下，可以采用的无菌水性介质将是本领域技术人员已知的。例如，可以将一个剂量溶于1ml等渗NaCl溶液中，并且添加至1000ml皮下灌注流体或者注射在所欲的注入部位，(参见例如"Remington'sPharmaceutical Sciences"(《雷明顿药物科学》)第15版，第1035页至第1038页和第1570页至第1580页)。取决于被治疗对象的病况，将有必要存在某些剂量变化。负责给药的人员将在任何情况下决定用于个别对象的适当剂量。此外，对于人类给药，制剂应满足FDA生物部门(Office of Biologies)标准要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。

无菌可注射溶液通过以下方式制备：按需要，将活性化合物按所需量掺入具有上文列举的各种其它成分的适当溶剂中，随后过滤杀菌。通常，分散体通过以下方式制备：将各种无菌的活性成分掺入到无菌媒剂中，所述无菌媒剂含有碱性的分散介质和来自上文列举的那些所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其获得来自活性成分加上任何附加所需成分的经过先前无菌过滤溶液的粉末。

本文公开的组合物可以按中性或盐形式配制。药学可接受的盐包括酸加成盐(用蛋白质的游离氨基形成)，其用无机酸或有机酸形成，无机酸例如盐酸或磷酸，或有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等等。用游离羧基形成的盐还可以衍生自无机碱，例如钠、钾、铵、钙、或铁的氢氧化物，以及衍生自有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等等。在配制之后，溶液将按与剂量配方相容的方式并且以治疗有效的量来施用。所述配方容易以各种剂型施用，例如可注射溶液，药物释放胶囊等等。

如本文所用，"载剂"包括任何和所有溶剂，分散介质，媒剂，涂层，稀释剂，抗细菌剂和抗真菌剂，等渗和吸收延迟剂，缓冲剂，载体溶液，悬浮液，胶体等等。用于药物活性物质的此类介质和试剂的使用是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，本发明涵盖其在治疗性组合物中的使用。补充活性成分还可以掺入到组合物中。

短语"药学上可接受的"或"药理学上可接受的"是指当施用于人类时不产生变态或类似不良反应的分子实体和组合物。含有蛋白质作为活性成分的水性组合物的制备为本领域有充分理解。一般而言，此类组合物作为可注射剂，作为液体溶液或悬浮液而制备；也可以制备适于在注射之前形成液体中的溶液或悬浮液的固体形式。

II.牛痘病毒JX-594

痘病毒已知已几个世纪，其名称来自天花病毒所产生的特征痘痕(痘疮)。似乎天花首先于2000多年前出现在中国和远东。幸运地，这种经常致命的病毒现已被根除，最后自然暴发于1977年发生在索马里。

痘病毒病毒颗粒为椭圆形或砖形，测量长度为200-400nm。外部表面为平行成排的嵴状，有时以螺旋形排列。该颗粒非常复杂，含有超过100种不同蛋白质。胞外形式含有两种膜(EEV-胞外有包膜病毒粒子)，而胞内颗粒仅具有内膜(IMV-胞内成熟病毒粒子)。该外表面由环绕核的脂质和蛋白质构成，该核由紧密压缩的核蛋白构成。在抗原性上，痘病毒也非常复杂，诱导特异性抗体和交叉反应性抗体。在颗粒中存在至少十种酶，它们大部分与核酸代谢/基因组复制相关。

痘病毒的基因组为130-300Kbp的线性双链DNA。基因组的末段具有含若干串联重复序列的末端发夹环。若干痘病毒基因组已被测序，大部分重要基因位于该基因组的中央部分中，而非必需基因位于末端。在痘病毒基因组中存在约250个基因。

复制在细胞质中进行，因为病毒足够复杂，已获得用于基因组复制必需的所有功能。细胞对此有一定的贡献，但该贡献的性质尚不清楚。然而，如果痘病毒基因表达和基因组复制在无核细胞中进行，成熟过程被阻滞，这表明细胞起到的一些作用。

痘病毒的受体通常未知，但很可能数量有多个并且位于不同细胞类型上。对于牛痘，一种可能的受体为EGF受体(McFadden,2005)。侵入(penetration)也可涉及一种以上的机制。脱壳在两个阶段中发生：(a)当颗粒进入细胞并处于细胞质中时外膜的移除，和(b)颗粒进一步脱壳并且核进入细胞质。

一旦进入细胞的细胞质中，则通过与核相关的病毒酶进行基因表达。表达分为2个阶段：早期基因：其代表约50％基因组，并且在基因组复制之前被表达，以及后期基因，其在基因组复制之后被表达。表达的时序控制通过后期启动子提供，其活性取决于DNA复制。基因组复制被认为涉及自引发，导致形成高分子量连环体，其随后裂解并被修补以形成病毒基因组。病毒组装在细胞骨架中发生，并很可能涉及与细胞骨架蛋白(例如肌动蛋白结合蛋白质)的相互作用。内含体形成于细胞质中，成熟进入病毒颗粒。细胞至细胞传播可以提供感染传播的替代性机制。总体上，该复杂的大病毒的复制相当迅速，平均仅花12小时。

至少9种不同的痘病毒导致人类疾病，但天花病毒和牛痘是最为人熟知的。天花菌株分为重型天花(25-30％死亡率)和轻型天花(相同症状，但死亡率小于1％)。两种病毒的感染通过呼吸途径自然发生，并且是全身性的，产生各种症状，但最值得注意的是皮肤的天花特征脓疱和瘢痕化。

A.牛痘病毒

牛痘病毒是大的复杂被膜病毒，具有约190K bp的线性双链DNA基因组并且编码约250个基因。牛痘因其作为根除天花的疫苗的广为所知。在天花被根除后，科学家一直在研究使用牛痘作为工具用于将基因递送到生物组织中(基因疗法和基因工程)。牛痘病毒是DNA病毒中独一无二的，因为其仅在宿主细胞的细胞质中复制。因此，编码病毒DNA复制所需的各种酶和蛋白质需要较大基因组。在复制期间，牛痘产生外膜不同的若干传染性形式：胞内成熟病毒颗粒(IMV)，胞内被膜病毒颗粒(IEV)，细胞相关被膜病毒颗粒(CEV)以及胞外被膜病毒颗粒(EEV)。IMV是最大量的传染性形式并且被认为负责在宿主之间传播。另一方面，CEV被认为起到细胞至细胞传播的作用，而EEV被认为对于在宿主有机体内大范围播散很重要。

牛痘病毒与导致牛痘的病毒密切相关。牛痘的明确来源未知，但最普遍的观点为牛痘病毒(vaccinia virus)、牛-痘病毒(cowpox virus)和天花病毒(天花的病原体)都衍生自同一祖先病毒。还推测牛痘病毒原本分离自马类。牛痘病毒感染是轻度的并且在健康个体中一般无症状，但其可能导致轻度皮疹和发热，并且死亡率非常低。产生抗牛痘病毒感染的免疫应答保护人员以免致命天花感染。为此，将牛痘病毒用作抗天花的活病毒疫苗。牛痘病毒疫苗是安全的，因为其不含天花病毒，但有时可能发生某些并发症和/或疫苗副作用，尤其是当疫苗被免疫妥协时。

如上所述，已将牛痘病毒经工程化改造成表达许多异种蛋白。一种此类蛋白质是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，或GM-CSF。GM-CSF是巨噬细胞分泌的蛋白质，其刺激干细胞生产粒细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和巨噬细胞。人类GM-CSF在氨基酸残基23(亮氨酸)，27(天冬酰胺)，和39(谷氨酸)处被糖基化(参见美国专利5,073,627，其以引用方式并入)。GM-CSF也称为莫拉司亭或，当该蛋白质在酵母细胞中表达时，称为沙莫司亭(商标)，其用作在化学疗法之后刺激产生白血细胞、尤其是粒细胞和巨噬细胞的药物。表达GM-CSF的牛痘病毒先前已有报道。然而，其并非作为溶瘤剂递送，而仅仅作为GM-CSF的递送载体递送。因此，已将其施用至患者，施用剂量低于可实现显著瘤溶解的剂量。本文描述表达GM-CSF的牛痘病毒的使用，在一些实施方案中，该表达GM-CSF的牛痘病毒以大于1×10⁸pfu或颗粒的浓度施用。

牛痘病毒可以使用Earl和Moss in Ausubel等人1994年所述方法繁殖，该方法以引用方式并入本文。

III.核苷酸组合物

在某些实施方案中，本发明涉及牛痘病毒和其变体。

A.病毒多肽的变体

由本发明牛痘病毒载体编码的多肽的氨基酸序列变体可以是取代变体、插入变体或缺失变体。与野生型相比，编码病毒多肽的基因的突变可以影响多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或更多非连续或连续氨基酸。由牛痘病毒编码的的各种多肽可以参考Rosel等人(1986)、Goebel等人(1990)和GenBank登录号NC001559的文章识别，参考文献均以引用方式并入本文。

缺失变体缺乏天然或野生型蛋白质的一种或多种残基。可以缺失个别残基或者可以缺失全部或部分结构域(例如催化或结合结构域)。终止密码子可以被引入(通过取代或插入)到编码核酸序列中以产生截短的蛋白质。插入突变体一般涉及在多肽中非末端点处添加物质。这可以包括插入免疫反应表位的插入或简单地插入一个或多个残基。还可产生称为融合蛋白的末端添加。

取代变体一般包括在蛋白质内的一个或多个位点上用一种氨基酸替换另一种氨基酸，并且可以被设计成在损失或不损失其它功能或性质的情况下调节多肽的一种或多种性质。取代可以是保守的，即，用一种类似形状和电荷的氨基酸替换另一种氨基酸。保守的取代是本领域熟知的并且包括(例如)以下变化：丙氨酸至丝氨酸；精氨酸至赖氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸至谷氨酸；半胱氨酸至丝氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸至亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸至缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸至精氨酸；甲硫氨酸至亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸至苏氨酸；苏氨酸至丝氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸至异亮氨酸或亮氨酸。或者，取代可以是非保守的，使得多肽的功能或活性受到影响。非保守的变化一般包括用化学上不相似的残基取代另一个残基，例如用极性或带电氨基酸取代非极性或不带电氨基酸，反之亦然。

术语"功能上等价的密码子"在本文中是指编码相同氨基酸的密码子(参见下表1)。

表1：密码子表

还应理解，氨基酸和核酸序列可以包括添加的残基，例如添加的N-末端或C-末端氨基酸或5'或3'序列，并且仍与在本文公开的序列之一在本质上相同，只要该序列满足上文所述标准，包括其中涉及蛋白质表答的生物蛋白活性的维持。末端序列的添加特别适用于核酸序列，所述核苷酸序列可以例如包括毗邻编码区域的5'部分或3'部分的非编码序列，或可以包括各种内部序列，即内含子，其已知存在于基因内。

以下是基于改变蛋白质的氨基酸以产生等同物或甚至改进的第二代分子的讨论。例如，某些氨基酸可以在蛋白质结构中取代其它氨基酸，而没有明显损失与结构体(例如，底物分子上的结合位点或抗体的抗原结合区域)的相互作用结合能力。由于限定蛋白质的生物功能性活性的是蛋白质的相互作用能力和性质，可以在蛋白质序列以及其潜在的DNA编码序列中进行某些氨基酸取代，并且仍然产生具有类似性质的蛋白质。本发明人因此构思，可以在基因的DNA序列中进行各种改变，而不明显损失其生物实用性或活性，如下文所述。表1示出编码特定氨基酸的密码子。

在进行这种改变中，可以考虑氨基酸的亲疏水性指数(hydropathic index)。氨基酸亲疏水性指数在蛋白质上赋予相互作用生物功能中的重要性是本领域中byte和Kyte和Doolittle在1982年所一般理解的。所接受的是，氨基酸的相对亲疏水特性影响所得蛋白质的二级结构，而该二级结构反过来决定了蛋白质与其它分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等等)的相互作用。

在本领域中还理解，类似氨基酸的取代可以基于亲水性来有效地进行。美国专利4,554,101(以引用方式并入本文)描述蛋白质的最大局部平均亲水性(由其邻近氨基酸的亲水性决定)与该蛋白质的生物学性质有关。如美国专利4,554,101中详述，已将以下亲水性值指定给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸*-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。

应理解，氨基酸可以被具有类似亲水性值的另一种氨基酸取代并且仍产生生物学上等同的和免疫学上等同的蛋白质。在这种改变中，优选取代亲水性值在±2内的氨基酸，特别优选在±1内的氨基酸，且甚至更特别优选在±0.5内的氨基酸。

如上所述，氨基酸取代通常是基于氨基酸侧链取代基的相对类似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等等。将各种上述特性纳入考虑的示例性取代是本领域技术人员所熟知的，且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

B.编码天然蛋白质或修饰蛋白的多核苷酸

本发明涉及从细胞中分离且能够表达蛋白质或多肽的全部或部分的多核苷酸。在本发明的一些实施方案中，其涉及已特异性变异而产生缺乏某些功能性病毒多肽的病毒的病毒基因组。所述多核苷酸可以编码含有病毒氨基酸序列的全部或部分的肽或多肽，或者它们被工程化改造成不编码这种病毒多肽或者编码具有至少一种降低的、减少的功能或活性、或缺乏功能或活性的病毒多肽。可以从表达细胞中纯化出重组蛋白以获得活性蛋白。基因组，以及牛痘病毒的编码区域的定义可以参见Rosel等人(1986)；Goebel等人(1990)；和/或GenBank登录号NC 001559，各参考文献均以引用方式并入本文。

如本文所用，术语"DNA片段"是指已被分离而不含特定物种的全基因组DNA的DNA分子。因此，编码多肽的DNA片段是指含有野生型、多态性、或突变型多肽编码序列的DNA片段，其被分离、或被纯化而不含总的哺乳动物或人类基因组DNA。术语"DNA片段"包括一种或多种多肽、或比多肽小的DNA片段、以及重组载体，包括例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等等。

如本申请中所用，术语"痘病毒多核苷酸"是指已被分离而不含全基因组核酸的编码痘病毒多肽的核酸分子。类似地，"牛痘病毒多核苷酸"是指已被分离而不含全基因组核酸的编码牛痘病毒多肽的核酸分子。"痘病毒基因组"或"牛痘病毒基因组"是指在存在或不存在辅助病毒的情况下，可以被提供至宿主细胞以获得病毒颗粒的核酸分子。与野生型病毒相比，所述基因组可以被重组突变或可以未被重组突变。

术语"cDNA"是指使用信使RNA(mRNA)作为模板制备的DNA。与基因组DNA或由非处理或部分处理的基因组RNA模板聚合的DNA相反，使用cDNA的优点在于cDNA主要含有对应蛋白质的编码序列。可以有时优选的是完整或部分的基因组序列，例如在需要非编码区域用于最佳表答的情况下，或者在非编码区域(例如内含子)将在反义战略中被靶向的情况下。

还包括的是，来自给定物种的特定多肽可以由具有略微不同核酸序列但(尽管如此)编码相同蛋白(参见上表1)的天然变体表示。

类似地，包含分离或纯化的野生型或突变型多肽基因的多核苷酸是指包括野生型或突变型多肽的编码序列以及(在某些方面)调控序列的DNA片段，该DNA片段基本上与其它天然存在的基因或蛋白质编码序列分离。在这方面，术语"基因"是用于简化地指功能性蛋白、多肽、或编码肽的单元(包括用于正确转录、翻译后修饰、或定位(localization)所需的任何序列)。如本领域技术人员将理解，该功能性术语包括表达或可以适合于表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白和突变体的基因组序列、cDNA序列和较小的工程化改造的基因片段。

编码天然或修饰多肽的全部或部分的核苷酸可以含有以下长度的编码全部或部分这种多肽的连续核酸序列：10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、441个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、610个、620个、630个、640个、650个、660个、670个、680个、690个、700个、710个、720个、730个、740个、750个、760个、770个、780个、790个、800个、810个、820个、830个、840个、850个、860个、870个、880个、890个、900个、910个、920个、930个、940个、950个、960个、970个、980个、990个、1000个、1010个、1020个、1030个、1040个、1050个、1060个、1070个、1080个、1090个、1095个、1100个、1500个、2000个、2500个、3000个、3500个、4000个、4500个、5000个、5500个、6000个、6500个、7000个、7500个、8000个、9000个、10000个、或更多个核苷酸、核苷、或碱基对。

术语"重组体"可以结合多肽或特异性多肽的名称使用，并且这通常是指由核酸分子产生的多肽，所述核酸分子在体外制得或为这种分子的复制产物。

在本发明中所用的核酸片段(与编码序列本身的长度无关)可以与其它核酸序列组合，例如启动子、聚腺苷酸化信号、附加限制酶位点、多克隆位点、其它编码片段等等，使得其总长度可以显著变化。因此包括可采用几乎任何长度的核酸片段，其总长度优选受限于制备简便性和在预期重组DNA方案中的应用。

所包括的是，本发明的核酸构建体可以编码来自任何来源的全长多肽或编码截短型的多肽，例如截短的牛痘病毒多肽，从而使得编码区域的转录代表截短型。截短的转录物可以随后被翻译成截短的蛋白质。可以将标记物或其它异源多肽添加至修饰的编码多肽的序列，其中"异源"是指与修饰多肽不相同的多肽。

在某些其它实施方案中，本发明涉及分离的DNA片段和重组载体，其在其序列内包括来自本文所识别(和/或以引用方式并入)的序列中所示那些序列的连续核酸序列。然而，这种序列可以突变以获得活性相对于野生型有所改变的蛋白产物。

还将理解，本发明不限于这些识别的序列的特定核酸和氨基酸序列。重组载体和分离的DNA片段可以因此多样地包括编码痘病毒的区域其本身，在基本编码区域中携带所选改变或修改的编码区域，或它们可以编码仍然包括编码痘病毒的区域的较大多肽或者可以编码具有变体氨基酸序列的生物学上功能等同的蛋白质或肽。

本发明的DNA片段涵盖生物学上功能等同的痘病毒蛋白和肽。这种序列可能作为已知天然发生在核酸序列及其编码的蛋白质内的密码子冗余性和功能等同性的结果而产生。或者，功能上等同的蛋白质或肽可以通过应用重组DNA技术生成，其中蛋白质结构的改变可以基于对被交换氨基酸的性质的考虑而进行工程化改造。可以通过应用定点诱变技术引入人为设计的改变，例如，以提高蛋白质的抗原性。

C.痘病毒多核苷酸的诱变

在各种实施方式中，痘病毒多核苷酸可以被改变或被诱变。改变或突变可以包括插入、缺失、点突变、倒位等等，并且可以导致某些途径或分子机制或特定蛋白(例如胸苷激酶)的调控、激活和/或失活，以及改变基因产物的功能、定位或表答，具体来说使基因产物无功能。在采用的情况下，编码全部或部分痘病毒的多核苷酸的诱变可以通过各种标准的诱变程序(Sambrook等人,1989年)完成。

突变可以在暴露于化学或物理诱变因素之后被诱导。这种突变诱导剂包括离子化辐射、紫外光和各种化学品，例如烷化剂和多环芳烃，它们均能够与核酸直接地或者间接地(通常在一些代谢生物转变之后)相互作用。当受影响的DNA被复制或修复并因此突变时，由此类试剂诱导的DNA损伤可以导致碱基序列的改变。突变还可以通过使用特定靶向方法而定点。

D.载体

为产生痘病毒基因组中的突变，天然和修饰多肽可以通过载体所包含的核酸分子编码。术语"载体"用于指核酸分子载体，其中可以插入外源性核酸序列以便引入到可以使其复制的细胞中。核酸序列可以是"外源性"，其意味着其对其中引入载体的细胞而言是外来的，或者所述序列与细胞中的序列同源但位于所述序列通常未被发现的宿主细胞核酸内的位置中。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体，动物病毒和植物病毒)以及人工染色体(例如，YACs)。本领域的技术人员将具有充分的装备以通过标准重组技术构建载体，所述标准重组技术描述在Sambrook等人(1989)和Ausbel等人(1994)的文献中，它们以引用方式并入本文。除编码修饰多肽(例如修饰白树毒素)以外，载体可以编码非修饰多肽序列，例如标记物或靶向分子。

术语"表达载体"是指含有核酸序列的载体，该核酸序列编码能够被转录的基因产物的至少一部分。在一些情况下，RNA分子随后翻译被成蛋白质、多肽、或肽。在其它情况下，这些序列不被翻译，例如在反义分子或核酶的产生中。表达载体可以含有各种"控制序列"，其是指在特定宿主有机体中可操作性连接的编码序列的转录和可能的翻译所必需的核酸序列。除支配转录和翻译的控制序列以外，载体和表达载体可以含有也起到其它功能的核酸序列并且在下文描述。

1.启动子和增强子

"启动子"是控制序列，其为核酸序列中控制转录起始和速率的一段区域。其可以含有遗传元件，在其上调控蛋白和分子可以结合例如RNA聚合酶和其它转录因子。短语"操作地定位"、"操作地连接"、"在控制下"和"在转录控制下"意味着启动子相对于核苷酸序列处于正确的功能性位置和/或取向以控制该序列的转录起始和/或表达。启动子可以或可以不结合"增强子"使用，"增强子"是指涉及核酸序列的转录激活的顺式作用调控序列。

启动子可以是天然与基因或序列连接的启动子，其可以通过分离位于编码片段和/或外显子上游的5'非编码序列而获得。此类启动子可以称为"内源性"。类似地，增强子可以是天然与核酸序列连接的增强子，位于该序列的下游或上游。或者，通过将编码核酸片段定位在重组或异源启动子的控制下而获得某些优点，重组或异源启动子是指在其自然环境中通常不与核酸序列连接的启动子。重组或异源增强子也指在其自然环境中通常不与核酸序列连接的增强子。此类启动子或增强子可以包括其它基因的启动子或增强子，和分离自任何其它原核、病毒或真核细胞的启动子或增强子，和不是"天然存在"的启动子或增强子，即含有不同转录调控区域的不同元件，和/或改变表达的突变。除合成产生启动子和增强子的核酸序列以外，可以结合本文公开的组合物使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCR^TM)来产生这些序列(参见美国专利4,683,202、美国专利5,928,906，各自以引用方式并入本文)。此外，包括的是，也可采用在非核细胞器(例如线粒体、叶绿体等等)内引导序列的转录和/或表达的控制序列。

自然地，可能重要的是采用在选择用于表达的细胞型、细胞器和有机体中有效指导DNA片段表达的启动子和/或增强子。分子生物学领域技术人员通常了解用于蛋白质表达的启动子、增强子和细胞型组合的使用，例如，参见Sambrook等人(1989)，其以引用方式并入本文。所用启动子可以是组成型的、组织特异性的、可诱导的和/或在适当条件下可用于指导所引入的DNA片段的高水平表达，这在大规模产生重组蛋白质和/或肽方面是有利的。启动子可以是异源性的或内源性的。

组织特异性启动子或元件的同一性，以及用于表征其活性的测定是本领域技术人员熟知的。此类区域的例子包括人类LIMK2基因(Nomoto等人，1999)，生长激素抑制素受体2基因(Kraus等人，1998)，鼠附睾维甲酸结合基因(Lareyre等人，1999)，人类CD4(Zhao-Emonet等人，1998)，小鼠oc2(XI)胶原(Tsumaki,等人，1998)，D1A多巴胺受体基因(Lee,等人，1997)，胰岛素样生长因子II(Wu等人，1997)，人血小板内皮细胞粘着分子-1(Almendro等人，1996)和SM22α启动子。

2.起始信号和内部核糖体结合位点

特异性起始信号也可能是编码序列的有效翻译所需的。这些信号包括ATG起始密码子或邻近序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域的普通技术人员将容易能够决定这一点并且提供所需信号。熟知的是，起始密码子必须是在所需编码序列的阅读框的"框内(in-frame)"的，以确保整个插入物的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然或合成的。表达的效率可能通过包含适当转录增强子元件而增强。

在本发明的某些实施方案中，内部核糖体进入位点(IRES)元件的使用是用于产生多基因、或多顺反子的信使(messages)。IRES元件能够绕过5'-甲基化帽(Cap)依赖性翻译的核糖体扫描模型并且在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。来自小核糖核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件已被描述(Pelletier和Sonenberg，1988)，以及来自哺乳动物信使(Macejak和Sarnow,1991)的IRES。IRES元件可以连接至异源开放阅读框。多个开放阅读框可以一起转录，各由IRES分隔，产生多顺反子信使。依靠IRES元件，各开放阅读框可接近用于有效翻译的核糖体。可以使用单个启动子/增强子以转录单一信使而有效地表达多个基因(参见美国专利5,925,565和5,935,819，其以引用方式并入本文)。

3.多克隆位点

载体可以包括多克隆位点(NCS)，其为含有多个限制性酶切位点的核酸区域，所述多个限制性酶切位点中任一个可以结合标准重组技术使用以消化载体。(参见Carbonelli等人，1999：Levenson等人，1998；和Cocea，1997，以引用方式并入本文)。"限制性内切酶消化"是指用仅在核酸分子中的特异性位置起作用的酶催化裂解核酸分子。这些限制性内切酶中的许多是市售的。此类酶的使用为本领域技术人员所广泛理解。经常性地使用限制性内切酶使载体线性化或片段化，所述酶在MCS内切割以实现外源性序列被连接至载体。"连接"是指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的方法，其可以或可以不是互相邻近的。涉及限制性内切酶和连接反应的激素是重组技术领域技术人员熟知的。

4.剪接位点

大多数转录真核RNA分子将经历RNA剪接以从初级转录物中移除内含子。含有基因组真核序列的载体可能需要供体和/或受体剪接位点以确保正确加工用于蛋白质表达的转录物。(参见Chandler等人，1997，以引用方式并入本文)。

5.终止信号

本发明的载体或构建体将通常包含至少一种终止信号。"终止信号"或"终止子"包含涉及涉及通过RNA聚合酶特异性终止RNA转录物的DNA序列。因此，在某些实施方案中，包括了终止RNA转录物产生的终止信号。终止子可能是体内实现期望信使水平必需的。

在真核系统中，终止子区域还可包含特异性DNA序列，其允许新转录物的位点特异性裂解以便暴露聚腺苷酸化位点。这给予特异性内源性聚合酶将一段约200个A残基(多聚A，polyA)添加至转录物的3'的信号。用该多聚A尾修饰的RNA分子似乎更稳定，并且被更有效地翻译。因此，在涉及真核生物的其它实施方案中，优选的是终止子包含用于断裂RNA的信号，并且更优选的是所述终止子信号促进信使的聚腺苷酸化。终止子和/或聚腺苷酸化位点元件可以增强信使水平和/或最小化从该盒至其它序列的连读。

构想用于本发明的终止子包括本文所述的或本领域的普通技术人员已知的任何已知转录终止子，其包括但不限于例如基因的终止序列，例如牛生长激素终止子或病毒终止序列，例如SV40终止子。在某些实施方案中，终止信号可以是缺乏可转录或可翻译序列，例如由于序列截短而产生该缺乏。

6.聚腺苷酸化信号

在表达中，特别是真核表达中，一般将包括聚腺苷酸化信号以影响转录物的适当聚腺苷酸化。不认为聚腺苷酸化信号的性质对成功实施本发明是关键的，和/或可以采用任何此类序列。优选实施方案包括SV40聚腺苷酸化信号和/或牛生长激素聚腺苷酸化信号，它们在各种靶标细胞中方便地和/或已知充分起到作用。聚腺苷酸化可以增加转录物的稳定性或可以促进胞质转运。

7.复制的起点

为了在宿主细胞中繁殖载体，载体可以含有一种或多种复制位点起点(通常称为"ori")，其为复制起始的特异性核酸序列。或者，如果宿主细胞是酵母菌，可以采用自主复制序列(ARS)。

8.可选择和可筛选标记物

在本发明的某些实施方案中，可以通过在表达载体中包括标记而体外或体内识别含有本发明核酸构建体的细胞。此类标记物将赋予所述细胞可识别的改变，允许轻易识别含有表达载体的细胞。通常，可选择标记物是赋予允许选择的性质的标记物。正可选择标记物是该标记物的存在允许其选择的标记物，而负可选择标记是该标记物的存在阻止其选择的标记物。正可选择标记物的例子为药物抗性标记物。

通常，包含药物选择标记物有助于转化体的克隆和识别，例如，赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博来霉素和组氨醇的抗性的基因是可用的可选择标记物。除赋予允许基于所用条件来鉴别转化体的表型的标记物以外，还包含了其它类型的标记物，其中包括可筛选标记物(例如GFP)，其基于比色分析。或者，可以使用可筛选酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域的技术人员还了解如何使用免疫学标记物，其可能结合FACS分析来使用。并不认为所用标记物十分重要，只要其能够与编码基因产物的核酸同时被表达。可选择和可筛选标记物的其它例子是本领域的技术人员所熟知的。

E.宿主细胞

如本文所用，术语"细胞"、"细胞系"和"细胞培养物"可以互换地使用。所有这些术语还包括其子代，其为任何和所有后代。应理解，由于刻意或无意的突变，并非所有子代都可以相同。在表达异源核酸序列的背景下，"宿主细胞"是指原核或真核细胞，并且其包括可转化(transformable)的有机体，其能够复制载体和/或表达由载体编码的异源基因。宿主细胞可以并且已被用作用于载体或病毒(如果其不表达外源性多肽则不是合格载体)的受体。宿主细胞可以被"转染"或"转化"，其是指外源性核酸(例如修饰蛋白编码序列)被转移或引入到宿主细胞中的过程。转化细胞包括原代对象细胞和其子代。

宿主细胞可以衍生自原核细胞或真核细胞，包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，这取决于所需结果为载体的复制还是部分或所有的由载体编码的核酸序列的表达。可获得许多可用作宿主细胞的细胞系和培养物，它们可以通过美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)获得，ATCC是充当活培养物和遗传材料的档案馆的组织(www.atcc.org)。适当宿主可以由本领域的技术人员基于载体主链和所需结果来决定。质粒或粘粒(例如)可以引入到用于复制许多载体的原核生物宿主细胞中。用作载体的复制和/或表达的宿主细胞的细菌细胞包括DH5α、JM109和C8，以及许多市售细菌宿主，例如感受态细胞(Competent Cells)和SOLOPACK^TM金细胞(SOLOPACK^TMGoldCells，加州拉由拉市(La Jolla,Calif))。或者，细菌细胞(如大肠杆菌LE392)可以用作噬菌体病毒的宿主细胞。适合的酵母细胞包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、裂殖酵母(Saccharomyces pombe)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。

用于载体的复制和/或表达的真核宿主细胞的例子包括HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。来自各种细胞类型和有机体的许多宿主细胞是可得的并且为本领域的技术人员已知。类似地，病毒载体可以结合真核或原核宿主细胞、特别是允许该载体复制或表达的真核或原核宿主细胞来使用。

一些载体可以使用允许其在原核细胞和真核细胞中被复制和/或表达的控制序列。本领域的技术人员还将理解培育所有上文描述宿主细胞以维持它们且允许载体复制的条件。还理解和已知的是允许大规模产生载体，以及产生由载体编码的核酸及其同源的多肽、蛋白质、或肽的技术和条件。

F.基因转移的方法

认为用于核酸递送以影响本发明组合物的表达的适宜方法包括通过其可以将核酸(例如DNA，包括病毒和非病毒载体)引入细胞器、细胞、组织或有机体中的实际上任何方法，如本文所述或者为本领域的普通技术人员已知。此类方法包括但不限于：DNA的直接递送，诸如通过注射(美国专利5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，各自以引用方式并入本文)，包括显微注射(Harland和Weintraub,1985；美国专利5,789,215，以引用方式并入本文)；通过电穿孔(美国专利No.5,384,253，以引用方式并入本文)；通过磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb,1973；Chen和Okayama,1987；Rippe等人,1990)；通过使用DEAE-葡聚糖继以聚乙二醇(Gopal,1985)；通过直接声波加载(Fechheimer等人，1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau和Sene,1982；Fraley等人,1979；Nicolau等人,1987；Wong等人,1980；Kaneda等人,1989；Kato等人,1991)；通过微粒轰击(PCT申请No.WO 94/09699和No.95/06128；美国专利5,610,042、5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，各自以引用方式并入本文)；通过用碳化硅纤维搅动(Kaeppler等人，1990；美国专利5,302,523和5,464,765，各自以引用方式并入本文)；通过农杆菌介导的转化(美国专利5,591,616和5,563,055，各自以引用方式并入本文)；或者通过原生质体的PEG介导的转化(Omirulleh等人,1993；美国专利4,684,611和4,952,500，各自以引用方式并入本文)；通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus等人,1985)。通过应用诸如此类的技术，细胞器、细胞、组织或有机体可以被稳定或短暂地转化。

G.脂质组分和部分

在某些实施方案中，本发明涉及组合物，其包含与核酸、氨基酸分子(如肽)、或另一种小分子化合物合用的一种或多种脂质。在本文讨论的任一实施方案中，所述分子可以是痘病毒多肽或痘病毒多肽调节剂，例如编码痘病毒多肽的全部或部分的核酸，或者编码痘病毒多肽调节剂的全部或部分的氨基酸分子。脂质是一种特性上不可溶于水且可用有机溶剂提取的物质。本领域的技术人员理解作为脂质的除本文明确描述外的化合物，并且这些化合物由本发明的组合物和方法所涵盖。脂质组分和非脂质可以彼此共价或非共价连接。

脂质可以自然存在或合成(例如由人设计或制造)。然而，脂质通常为生物物质。生物脂质是本领域熟知的，并且包括例如中性脂、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜烯、溶血脂质、鞘糖脂、糖脂、硫脂、具有醚和酯连接的脂肪酸的脂质和可聚合脂质以及它们的组合。

与脂质合用的核酸分子或氨基酸分子(例如肽)可以分散于含有脂质的溶液中，用脂质溶解，用脂质乳化，与脂质混合，与脂质组合，与脂质共价键接，作为脂质中的悬浮液或以其它方式与脂质合用。本发明的脂质或脂质/痘病毒相关的组合物不限于任何特定结构。例如，它们还可简单地散布于溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。在另一个实例中，它们可以呈现双层结构，如微团，具有"萎陷"结构。在另一种非限制性实例中，还涵盖脂质体(lipofectamine，吉布可公司(Gibco BRL))-痘病毒或Superfect(恰根公司，Qiagen)-痘病毒络合物。

在某些实施方案中，脂质组合物可以包含约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、或其中可衍生的任何范围的特定脂质、脂质类型或非脂质组分，例如药物、蛋白质、糖、核酸或其它物质，它们在本文有所公开或为本领域的技术人员已知。在非限制性实例中，脂质组合物可以包含约10％至约20％的中性脂质，和约33％至约34％的脑苷脂，以及约1％的胆固醇。在另一非限制性实例中，脂质体可以包含：约4％至约12％的萜烯，其中约1％的微团明确地是番茄烯，剩下约3％至约11％的脂质体包含其它萜烯；以及约10％至约35％的磷脂酰基胆碱，和约1％的药物。因此，所涵盖的是，本发明的脂质组合物可以以任何组合或百分比范围包含脂质、脂质类型或其它组分。

IV.实施例

提供以下实施例以便说明本发明的各种实施例而不意味着以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易了解，很适于进行所述目的并且获得所述目标和优点，以及本发明固有的目的、目标和优点。所示实施例连同本文所述方法一起代表优选实施方案，是示例性的，并且不旨在限制本发明的范围。如权利要求书的范围定义的本发明的精神内所涵盖的其中变化和其它用途将根据本领域技术人员而定。

在鼠HCC模型中进行临床前研究以评价JX-594诱导血管关闭的机制和随后的再灌注。评估索拉非尼阻滞再灌注的潜力。在2期临床试验中，患有HCC的患者采用JX-594通过每两周进行瘤内注射治疗三个周期。通过动态造影增强(dce)-MRI和DW-MRI在基线处(第5天和第8周)评价肿瘤大小、血液流量和密度。具有部分肿瘤再灌注的两名患者在第8周开始标准索拉非尼疗法，并且随后进行DCE-MRI扫描。

在JX-594的IT或IV给药之后，肿瘤血管关闭在鼠HCC模型中有所展示。血管关闭取决于病毒复制；由病毒表达的mGM-CSF和中性白细胞渗入增强了该效果。肿瘤边缘的再灌注随时间展示，并且与肿瘤中增加的VEGF水平相关。佐剂索拉非尼疗法抑制血管生成，并且导致优于各药剂单独的显著提高的抗肿瘤功效。采用JX-594治疗的HCC患者在肝脏内的注射和非注射肿瘤中展示急性肿瘤血管关闭和坏死。采用索拉非尼的佐剂疗法在第8周评价之后导致两名患者中显著的和持久的肿瘤坏死和血管关闭。对单独使用索拉非尼的HCC患者的连续MRI扫描的观察证明这些发现是采用JX-594预治疗的患者特异性的。

因为肿瘤具有高突变率且因此可具有高不均一性程度，导致对任一疗法的混合应答，所以有用的是将某些抗癌药剂与其它作用机制组合。为确定溶瘤病毒疗法与索拉非尼的组合是否安全且有效，进行体外和体内临床前实验。

实施例1

体外数据-索拉非尼抑制JX-594

结合索拉非尼在人HCC细胞系PLC/PRF/5上测试JX-594。PLC/PRF/5人HCC细胞系支持JX-594复制。然而，当在JX-594感染之前2小时、在JX-594感染期间、或在JX-594感染之后2小时加入索拉非尼(10μM)时，释放量降低可达100倍(图1)。还在人卵巢癌细胞系A2780和人HCC系HepG2上结合索拉非尼测试JX-594。

细胞培养和索拉非尼制备：人肿瘤细胞系A2780(卵巢)和HepG2(HCC)得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。在补充有10％FBS和1％青霉素/链球菌的DMEM中培养细胞。使细胞在37℃下于含5％CO₂的潮湿培育箱中生长。对于体外使用，将索拉非尼在DMSO(西格玛奥德里奇公司，Sigma-Aldrich Corp.)中溶解至1mg/ml的浓度，并且在含有10％胎牛血清的DMEM中进一步稀释至适合的最终浓度(100ng/ml,250ng/ml,500ng/ml,1000ng/ml和2500ng/ml)。最终溶液中的DMSO不超过0.2％(v/v)。

空斑形成、释放分析和细胞活力：将A2780或HepG2细胞以4×10⁵个细胞/孔接种到6孔板中并且保持过夜。然后将100pfu的JX-594加入各孔并且使其感染2小时。在感染结束时，移除培养基并且添加包含最终浓度0、0.1、0.25、0.5、1.0和2.5μg/ml的索拉非尼的3％羧甲基纤维素DMEM重层(overlay)。三天后，平板用结晶紫染色和计算空斑。为评价复制(释放量)，平行地如上制备6-孔板。作为染色和计算空斑的替代，从各孔中收集细胞以用于病毒纯化。细胞通过3轮冷冻和解冻继以声裂法来裂解，然后将粗制病毒裂解物的连续稀释物添加至A2780细胞以通过空斑分析滴定病毒。此外，为评价索拉非尼对细胞活力的直接作用，将细胞接种在96孔板中并仅用索拉非尼培育。通过基于活细胞介导的四唑盐至甲臜发色团的还原反应的比色分析(细胞计数试剂盒-8，同仁化学研究所，日本熊本(CellCounting Kit-8，Donjindo Laboratories,Kumamoto,日本))，测定细胞活力。

结果：低于细胞毒性水平的索拉非尼浓度在A2780和HEPG2肿瘤细胞系上能抑制病毒生长和复制(图2)。附加实验显示，索拉非尼在其它人HCC系(包括SNU423、SNU398、SNU475、SNU449、SNU387)和人骨肉瘤系U20S中抑制JX-594复制。

索拉非尼是多激酶抑制剂并且通过抑制胞内丝氨酸/苏氨酸激酶Raf-1和B-Raf能够抑制Ras信号传导途径(RAS/RAF/MEK/ERK)。Ras/Raf途径的激活通常发生在肿瘤中，并且导致E2F-应答基因(包括S-期基因，如胸苷激酶(TK))的转录激活(Hengstschlager等人,1994)。JX-594是通过使得病毒TK基因失活而减毒的牛痘病毒。该突变被设计成提供在具有高水平的细胞TK的细胞中(即具有导致组成型E2F激活的异常激活途径的癌细胞)的选择性复制。虽然索拉非尼和JX-594因此均被设计成靶向具有激活Ras途径的癌细胞，但在体外所述疗法的同时用药可能导致依赖于激活的Ras途径的病毒复制受抑制。

实施例2

体内数据-索拉非尼增强JX-594

与体外发现相反，临床前功效模型已显示，组合索拉非尼和JX-594显示出比任一单独药剂更佳的功效。

索拉非尼增强JX-594体内抗鼠CT26原发性肿瘤的活性：在皮下植入CT26结肠直肠肿瘤细胞的免疫活性鼠模型中测试JX-594和索拉非尼的组合。Balb/c小鼠用3×10⁵个CT26细胞皮下注射，并在11天之后开始治疗，采用单独的索拉非尼(每日10mg/kg p.o.，2周)，单独的JX594(每周10⁸pfu IV 3次，1周)，或组合(JX594在索拉非尼之前，或索拉非尼在JX594之前)(每组n＝4)(图3，上图)。对照动物仅接受PBS。用于该实验，使用表达鼠GM-CSF的JX-594形式。肿瘤每周测量两次，直至终点。示出在治疗后各时间点处的各研究组的存活比例(图3，中图)。示出在治疗后各时间点处的各研究组的平均肿瘤体积(图3，下图)。与单独的JX-594相比，结合索拉非尼的JX-594提高存活率并降低肿瘤负荷。与仅索拉非尼的动物相比，结合索拉非尼的JX-594还降低肿瘤负荷。优选方案为JX-594继以索拉非尼。

索拉非尼增强JX-594体内抗鼠B16黑素瘤肺结节的活性：在B16黑素瘤肿瘤的免疫活性鼠模型中测试JX-594和索拉非尼的组合。C57BL/6小鼠采用3×l0⁵B16-F10-LacZ细胞IV注射，并且采用单独索拉非尼(HD:10mg/kg,LD:每日50μg/kg p.o.，2周)、单独JX594(10⁷pfu IV每周3次，1周)、或组合(LD或HD索拉非尼在JX-594IV之前)(每组n＝5)(图4，上图)来治疗。在治疗结束时，处死小鼠并将肺固定并染色以检测B16表面结节(每组n＝5)。显示各组在研究结束时肿瘤结节的平均数量(图4)。在50μg/kg p.o.索拉非尼+JX-594组中，与单独JX-594组或单独索拉非尼组相比，B16肿瘤显著减小。

索拉非尼增强JX-594体内抗人HCC异种移植模型的活性：用HepG2人肝细胞癌异种移植物肿瘤对SCID小鼠进行皮下移植。一旦肿瘤达到约12-14mm最大直径的大小，则将小鼠随机分配到以下六个治疗组中的一个内(每组n＝8)：(1)单独PBS，(2)单独索拉非尼(以400μg标准每日腹膜内用药)，(3)单独JX-594(每周10⁷pfu静脉内治疗，总计六个剂量)，(4)采用JX-594和索拉非尼同时治疗，(5)索拉非尼继以JX-594以及(6)JX-594(2个剂量)继以索拉非尼。

使用卡尺测量肿瘤大小，并且当肿瘤负荷达到伦理目的的容许限制时使小鼠安乐死。就肿瘤生长和时间对肿瘤进展而言，JX-594继以索拉非尼的方案优于对照物或任一单独药剂。另外，该顺序优于索拉非尼继以JX-594以及优于同时治疗(图5)。

A.血管关闭的临床前HCC肿瘤模型研究

实验方法，预试验：将预试验设计成示出在HepG2模型中的JX-594继以索拉非尼诱导急性血管关闭。采用三个组(各组动物的n＝5)。第1组仅接受PBS；第2组接受静脉(IV)施用的10⁶pfu JX-594的单剂量；第3组接受瘤内(IT)施用的10⁶pfu JX-594的单剂量。在D5收集血清样品用于测量VEGF和GM-CSF水平。在安乐死之前，用荧光微球体注射小鼠以使得肿瘤灌注可视化。将被切除肿瘤分成三个部分用于分析：1)快速冷冻(flash-frozen)样品，用于测量VEGF蛋白水平；2)冷冻肿瘤切片的OCT包埋样品制品，以使微球体和血管标记物CD31可见；和3)福尔马林固定/石蜡包埋的样品，用于组织学分析。

实验方法，血管分布(Vascularity)研究：该研究跟踪HepG2模型中JX-594+/-索拉非尼对血管分布的较长期作用并且评价在HepG2模型中JX-594+/-索拉非尼中的功效。将HepG2(人HCC系)肿瘤皮下移植在裸鼠中。将动物随机分配至七个治疗组(每组n＝5)以测试单独药剂，以及组合。这些组用JX-594(瘤内10⁶pfu地，D1和D8)和/或索拉非尼(每日400μgi.p.，D15-D29)或PBS(对照)按图6中详细描述的时间表治疗。使用卡尺每周两次测量肿瘤。在D1、D8、D15、D22和D29收集血清样品用于VEGF和GM-CSF水平的测量。在D22或D35使小鼠安乐死。在安乐死之前，用荧光微球体注射小鼠以使得肿瘤灌注可视化。将被切除肿瘤分成三个部分用于分析：1)快速冷冻样品，用于测量VEGF蛋白水平；2)冷冻肿瘤切片的OCT包埋样品制品，以使微球体和血管标记物CD31可见；和3)福尔马林固定/石蜡包埋的样品，用于组织学分析。

结果：在CD31染色的OCT肿瘤切片中计算血管；在200倍放大的3个视野中血管的平均数量示于图6中。单独索拉非尼导致血管数量短暂降低(第29天)，但血管数量随时间再次增加(第35天)。然而，在接受JX-594继以索拉非尼的动物中，在D35，与单独索拉非尼组相比，血管数量降低，这表明该组合对肿瘤脉管系统具有更持续作用。

B.临床数据

JX-594是一种一线(first-in-class)靶向性溶瘤痘病毒，被设计成在癌细胞中选择性复制并且破坏癌细胞。直接瘤溶解加粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)表达也刺激动物肿瘤模型中的肿瘤血管关闭。在患有肝细胞癌的患者中实施JX-594疗法之后，评价肿瘤血管关闭。另外，研究用索拉非尼的辅助抗血管生成疗法来防止在肝细胞癌(HCC)的临床前和临床研究中施用JX-594后的再灌注的可行性。

方法：在鼠HCC模型中进行临床前研究以评价JX-594诱导血管关闭的机制和随后的再灌注。评估索拉非尼阻滞再灌注的潜力。在2期临床试验中，患有HCC的患者采用JX-594通过每两周进行瘤内注射治疗三个周期。通过动态造影增强(DCE)-MRI和DW-MRI在基线处(第5天和第8周)评价肿瘤大小、血液流量和密度。对具有部分肿瘤再灌注的五名患者在第8周开始标准索拉非尼疗法，并且随后进行dce-MRI扫描。

发现：在JX-594的IT或IV给药之后，肿瘤血管关闭在鼠HCC模型中有所发生。血管关闭依赖于病毒复制；病毒的mGM-CSF表达和中性白细胞渗入增强了该效果。肿瘤边缘的再灌注随时间展示，并且与肿瘤中增加的VEGF水平相关。佐剂索拉非尼疗法抑制血管生成，并且导致优于任一单独药剂的显著提高的抗肿瘤功效。采用JX-594治疗的HCC患者在肝脏内的注射和非注射肿瘤中展示急性肿瘤血管关闭和坏死。采用索拉非尼的佐剂疗法在第8周评价之后导致至少三名患者中显著的和持久的肿瘤坏死和血管关闭。对单独索拉非尼治疗的15名HCC患者的连续MRI扫描的观察展示这些发现在采用JX-594预治疗的患者中增强并且强化。

JX-594导致HCC肿瘤中的急性血管关闭和坏死，并且使HCC对随后的采用索拉非尼的疗法敏感。示出JX-594继以索拉非尼相对于单独索拉非尼的随机化控制的试验。采用溶瘤痘病毒继以抗血管生成剂的顺序治疗方案带来了希望。

介绍：靶向性溶瘤痘病毒JX-594在癌细胞中选择性复制，导致在肿瘤组织内病毒子代产生、肿瘤细胞坏死、释放和散播。JX-594还经工程化改造成表达GM-CSF转基因，以便增强由瘤溶解产生的抗肿瘤免疫力。由于EGFR-ras途径依赖性和对干扰素的肿瘤抗性，牛痘主链固有地具有肿瘤选择性。固有治疗性系数通过TK缺失而放大；JX-594复制依赖于细胞TK，其通过癌症中的细胞循环异常而被驱动至高水平。具有顽固性肝脏肿瘤的患者中JX-594的1期临床试验的结果展示针对JX-594复制、全身性播散和生物学活性GM-CSF表达的安全性、功效和机理概念验证(mechanistic proof-of-concept)。最近出版的临床前研究展示溶瘤病毒治疗也可以诱导急性肿瘤血管关闭(Breitbach等人，2007)。

本发明人想到，溶瘤痘病毒JX-594导致肿瘤血管关闭，并且源自病毒的GM-CSF表达增强中性白细胞募集和激活，导致抗血管性作用的增强。根据临床前研究，本发明人评价患有HCC(一种血管过多的肿瘤类型)的患者中的肿瘤血管关闭。临床前和临床研究显示血管化肿瘤边缘的随后进展的可能性。

索拉非尼为经许可用于治疗肾细胞癌(RCC)和肝细胞癌(HCC)的口服多激酶抑制剂。索拉非尼抑制表面酪氨酸激酶受体(VEGF-R，PDGF-R)和胞内丝氨酸/苏氨酸激酶(Raf-1，B-Raf)，并且因此是多机理抗癌药剂。索拉非尼可以直接通过抑制Ras信号转导途径(RAS/RAF/MEK/ERK)影响肿瘤细胞，所述Ras信号转导途径通常在癌细胞中被激活并且促进细胞增殖。索拉非尼还可通过由抑制VEGF-R产生的抗血管生成作用来减少肿瘤生长。索坦(舒尼替尼/SU11248)是另一种靶向性肿瘤疗法，其抑制血管内皮生长因子(VEGF)的作用并且具有抗血管生成作用。其被批准用于治疗肾细胞癌和胃肠间质肿瘤(GIST)。

本发明人构思的是，施用JX-594后的再灌注被抗血管生成剂索拉非尼或索坦阻滞，索拉非尼经批准用于HCC患者，索坦经批准用于RCC患者。我们在HCC的临床前模型中以及在采用JX-594的疗法完成之后的五名患者中测试这一假说。

C.材料和方法

研究许可和注册：研究方案和知情同意书经美国FDA、韩国FDA和釜山国家大学医院(Pusan National University Hospital，韩国釜山(Busan,South Korea))的机构评审和传染病控制委员会(Institutional Review and Infection Control Committees)认可。方案经由万维网于clinicaltrials.gov注册。

患者选择：根据临床试验规范(Good Clinical Practice,GCP)指南，患者签署知情同意书。准入标准包括：不可切除、尽管用标准疗法治疗仍发生进展(难治)的肝脏内可注射的肝细胞肿瘤(原发HCC)、正常造血功能(白细胞计数>3,x 10⁹个细胞/升、血红蛋白>100g/L、血小板计数>60x 10⁹个细胞/升)和器官功能(包括肌酸酐≤132.6μmol/L、天冬氨酸氨基转移酶(AST)/丙氨酸氨基转移酶(ALT)≤正常上限的2·5倍、Child-Pugh评分A类或B类)、平均寿命≥16周以及卡氏身体状况(Karnofsky Performance Status，KPS)≥70。排除标准包括肝外肿瘤、肿瘤>10厘米最大直径、增加的接种并发症风险(例如，免疫抑制、湿疹)、4周内用免疫抑制或癌症治疗剂治疗、快速进展的腹水、怀孕或哺乳期。

JX-594的生产和制备：JX-594是通过将人CSF2和LacZ基因插入TK基因区域而修饰的惠氏(Wyeth)菌株牛痘，所述基因分别在合成的早期-晚期启动子和ρ7·5启动子的控制下。在Vero细胞中根据生产质量管理规范(GMP)指导产生临床试验材料(CTM)，并用蔗糖梯度离心纯化。基因组与pfu的比约为70:1。在含10％甘油、138mM氯化钠的pH 7-4的磷酸盐缓冲盐水中配制JX-594。最终产物质量控制释放检测包括对无菌性、内毒素和效力的测试。CTM还检测GM-CSF蛋白浓度，结果为阴性(检测下限<14,000pg/mL)。将JX-594在与目标肿瘤预期总体积的25％相等体积的0.9％生理盐水中稀释。

JX-594治疗程序，除11301(索坦(Sutent)患者)以外的所有IT患者：使患有不可切除的HCC的患者随机接受两种剂量水平之一(10⁸或10⁹pfu)。通过成像引导的肿瘤内注射给予JX-594，对大致为球形的肿瘤采用多齿Quadrafuse注射针头，对不规则形状的肿瘤采用21号PEIT(经皮乙醇注射、多孔；日本东京的HAKKO医疗公司)针头。对肿瘤(n＝l-5)每两周进行注射，进行三个周期。对周期1中注射过的相同肿瘤在之后的每个周期进行注射。

JX-594之后的索拉非尼治疗和肿瘤应答评估：患者在研究中的8周后完成JX-594的IT临床试验。一些患者(患者 1702、1705、1002、1712、1713)继续接受标准索拉非尼治疗(400mg每天口服两次)。然后用评估JX-594治疗应答的相同程序对这些患者的肿瘤进行DCE-MRI成像。

JX-594治疗程序，用IV JX-594再用IT JX-594然后继以索拉非尼治疗患者：患有不可切除的HCC的患者接受2剂量水平的JX-594(10⁹pfu)。对于第一剂(第1天)，通过静脉内输注60分种给予JX-594。对于第二剂和第三剂(第8天和第22天)，通过成像引导的肿瘤内注射给予JX-594，对大致为球形的肿瘤采用多齿Quadrafuse注射针头，或对不规则形状的肿瘤采用21号PEIT(经皮乙醇注射、多孔；日本东京的HAKKO医疗公司)针头。从第25天开始，患者模拟(imitated)口服索拉非尼治疗(400mg每天口服两次)。有活肿瘤组织的患者在第12周接受JX-594的IT注射(此加强注射前2-3天、注射期间和注射后4－5天暂停索拉非尼治疗)。在基线、第25天、第6周和/或第12周进行成像(CT、DECE MIR和/或PET-CT)以评估应答。

JX-594治疗，患者11301(索坦患者)：患者11301患有已转移到肝脏的肾细胞癌。用21号PEIT针头通过肿瘤内注射治疗肝脏肿瘤。所述患者隔三周接受总共4剂的JX-594(每剂10⁹pfu)(＝4个周期)。每两个治疗周期后，进行对比增强CT扫描，并用RECIST和Choi标准进行第6周应答评估。通过RECIST标准和Choi应答(HU降低42％)(Park等人,2008)确定患者经受稳定疾病(stable disease，SD)。

索坦治疗：随后，患者11301发生进展并继续接受索坦治疗。患者接受3个疗程的50毫克/天(给药4周、停药2周)然后3个疗程的37.5毫克/天(给药4周、停药2周)，并维持25毫克/天(给药2周、停药1-2周)的方案。

肿瘤血管分布和应答试验：在筛选(基线)时、第5天(任选)和第8周进行DCEMRI(动态造影增强磁共振成像)。对于继续施用索拉非尼的患者，在索拉非尼治疗开始4和/或8周后进行DCE MRI。用DCE MRI分析肿瘤大小、血管分布和坏死。将筛选/基线DCE MRI用作参考，用其确定进展时间和应答率。第5天(任选)用DCE MRI分析早期效应如急性血管关闭。在第8周就诊时通过改良的RECIST和改良的Choi标准放射学分析肿瘤进展状态和肿瘤对JX-594的应答。由具有通过MRI扫描图评估肝细胞癌经验的放射学者对图像进行独立考查。为了评估肝内肿瘤，基于改良的RECIST、和用改良的Choi标准(定义为MRI时最长直径之和减少≥10％和/或平均肿瘤信号强度降低≥15％)测量的应答确定客观上“完全”或“部分”抗肿瘤应答的对象比例。

用改良RECIST评估的肿瘤应答：对RECIST进行如下改良以测定肿瘤应答和肿瘤进展。测定治疗期间或之后在肝脏中发生的新肿瘤。它们的最大直径包括在所有肝内肿瘤的最大直径之和中。然而，肝内的新肿瘤不被认为是进展本身的证据。对该RECIST标准的合理改良如下。JX-594对最初放射学上无法检测的肿瘤块的感染可由于炎症和/或坏死使该肿瘤表现为新的和/或进展的；然而，这些变化并不代表真实的肿瘤进展。此外，由于所述治疗目的是控制肝内肿瘤负荷，所以记录(并按位置记录)肝外检测到的腹部新肿瘤，但不将其包括在总体应答的确定中。因此，肿瘤应答或进展由可测量的肝内肿瘤的最长直径之和按如下确定：完全应答(CR)：所有肿瘤消失。部分应答(PR)：肿瘤LD之和至少减少30％，以基线LD之和为基准。进展性疾病(PD)：肿瘤LD之和至少增加20％，以基线LD之和为基准。稳定疾病(SD)：没有足以满足PR的减缩，也没有足以满足PD的增加，以基线LD之和为基准。

用改良Choi标准评估的肿瘤应答：Choi应答标准除了肿瘤直径之外(与RECIST相比)，还考虑肿瘤密度的变化，已发表支持该标准应用的数据(Choi等人2004)。早期研究显示用JX-594处理的肝脏肿瘤可发生显著的内部坏死而不伴随大小的减小，如Choi等人(2004)在胃肠间质瘤中所述。因此，还测量肝内肿瘤，并用改良的Choi标准评估应答。由于DCE MRI是用于测量肿瘤应答的成像方式，必须对所述标准进行改良。由于MRI没有与CT豪恩斯弗尔德单元(Hounsfield unit)相似的对比密度测定标准化系统，用感兴趣区域(Region of interest,ROI)信号强度(SI)的测量来进行基线和治疗后的肿瘤增长百分比的比较。以筛选/基线DCE MRI为基准，由其确定应答。通过改良Choi标准评估的应答定义为MRI上注射的肿瘤的最长直径之和减少≥10％和/或注射的肿瘤的平均信号强度减少≥15％。以肿瘤的百分数的形式测量平均MRI信号强度(SI)。

MRI成像方案：各患者会在所述方案规定的时间点进行腹部MRI，包括动态造影增强磁共振成像(DCE MRI)。成像会在1.5T或 3.0T MR系统上进行，采用放置用于肝完整成像覆盖的身体/躯干阵线圈，并将患者置于仰卧位。电解质垫可放于肝脏上方。

通常，在患者随访期间固定成像参数。虽然下述序列(sequences)列出了一定范围的可接受参数，但一旦患者已进行初始扫描，则这些参数应在所有后续扫描中使用。此外，患者应使用相同MRI扫描器扫描。

检查前启用静脉置管(intravenous line)，将尽可能大号的导管置于外周静脉内，使生理盐水以KVO流动。或者，对于有与自动造影剂注射器相容的PICC管或外部静脉导管口的患者，这些可用于静脉入口。通过静脉内推注以0.1mmol/kg剂量和通过自动注射器以每秒2cc的速率给予胞外钆螯合物造影剂，然后立即注射20cc盐水。注射速率或剂量的任何变化，或造影剂的渗出都会在CRF中记录。

1.5特斯拉MR系统的成像方案：进行下述脉冲序列(pulse sequence)：

造影前成像:(1)2D轴向同相位和反相位Tl:Tl–加权扰相梯度回波(weightedspoiled gradient echo，SPGR)双相位轴向图(TR:尽可能短；TE:2.1和4.2；翻转角(flipangle，FA):80-90度,切片厚度5-7mm,切片间隙最大1mm；相位编码 160-192内插至256x256；根据患者体质优化视野,300-450mm。(2)2DFSE T2轴向：TR:3500-5000毫秒(有效)；TE:60-88毫秒；相位编码 160-256x256；根据患者体质优化视野,300-450mm；切片厚度5-7mm；最大切片间隙1mm；需用脂肪抑制进行成像。鼓励使用呼吸触发或其它运动抑制技术。

DCE-MRI:(3)3D Tl动态成像:共进行6组所述序列:一组造影前、4组造影后立即、和一组5分钟延迟的成像设置。3D Tl–加权脂肪抑制采集(acquisition)的参数如下：TR＝2.0-4.5毫秒；TE＝1.42-2.0毫秒；翻转角,8-12°；相位编码160-192内插至 512x 512；根据患者体质优化视野,300-450mm；内插切片厚度,1.5-3mm；平板厚度确保肝脏的完全覆盖。

为了确定首次造影增强采集(肝动脉相)的时间，给予1-2mL造影材料的检测推注，且将循环时间(动脉峰值增强的时间)设为所述采集的延迟时间。或者，若可获得自动计时软件以确定动脉相增强，则也可使用。进行所述4组造影后动态序列，各采集之间有40秒的间隙。还在注射后5分钟采集额外的延迟序列(对于总共5组造影后序列)。基于机构评审实践(institutional practices)在呼吸(吸气或呼出)暂停期间进行所有采集。所述系统在造影前和造影后序列之间不经过任何调谐变化。该成像方案的任何变化会在CRF中记录。

3.0特斯拉MR系统的成像方案:进行下述脉冲序列：

造影前成像:(1)Tlw 2D轴向同相位(IP)和异相位(OP):双相扰相梯度回波(SPGR)。FOV:根据体质优化,300-450mm；TR:覆盖肝脏的最小值；TE:同相位和反相位TE's中的默认；翻转角:80-90度；切片厚度:5-7mm；间隙:0-1mm(优选0-mm间隙)；频率矩阵:320；相位编码:160-224,内插至 512x 512；脂肪饱和:关闭；带宽:默认设置。

(2)T2w 2D轴向SSFSE.FOV:与上述(1)相同；TR:使整个肝脏成像的最短有效TR；有效TE:60-88毫秒；切片厚度:与(1)相同；间隙:与(1)相同；频率矩阵:320；相位编码:160-224,内插至 512x 512；脂肪饱和:关闭。

(3)T2w 2D轴向FSE.在此可使用呼吸触发的自由呼吸或屏气成像。然而，在患者的检查中其可被标准化。例如，若患者用呼吸触发在基线扫描，则所有后续MR检查均会使用此序列的呼吸触发。若使用呼吸触发，应使用12-20的回波链长度，其应足以激发/采集相对噪声的最优信号。若进行屏气T2成像，则使用24-32的回波链长度和1次采集。FOV:与上述(1)相同；有效TR:3500-5000；切片厚度:与(1)相同；间隙:与(1)相同；频率矩阵:320；相位编码:160-224,内插至 512x512；脂肪饱和:开启，DCE MRI。

(4)Tl w 3D轴向扰相梯度回波(SPGR)。FOV:与上述(1)相同；TR:2-5毫秒；TE:1.4-2.5；翻转角:8-15；切片厚度:1.5-3mm内插；平板厚度:覆盖整个肝脏；频率矩阵:288-320；相位编码:160-224,内插至 512x 512；脂肪饱和:开启。扫描数量:共计5组(1组造影前和4组造影后扫描，然后在造影注射后5分钟时进行第5组扫描)。按照标准机构评审实践在呼吸(呼出结束或吸气结束)暂停期间进行所有扫描。

D.临床试验数据:JX-594治疗后第5天肿瘤和结直肠癌肿瘤内的血管关闭

之前在用JX-594通过肿瘤内注射直接治疗的肿瘤中观察到由灌注CT测量的急性血管关闭(Liu等人,2008)。本发明人应用DCE MRI分析来跟踪肿瘤灌注的下降、跟踪应答JX-594治疗的血管关闭和肿瘤坏死的过程。参与在第5天任选用DCE-MRI扫描的新临床试验的16名患者中，有13个接受了该扫描，且肝细胞癌(HCC)患者中有血管关闭的额外例子(图7)。

在之前分析的HCC例子中，似乎直接肿瘤注射为引起肿瘤灌注下降所必需(图1,Liu等人,2008)。根据此数据，不能预测血管关闭会在未注射的肿瘤中应答JX-594的远端应用而发生。在此，本发明人首次显示没有必要注射每个肿瘤以产生此应答，且远端、未注射的肿瘤也可显示血管关闭(图8和9)。

此外，本发明人证明JX-594可引起非HCC肿瘤中的血管关闭，这在结直肠癌(CRC)的肝基转移灶患者中得到证实，结直肠癌的肝基(liver-based)转移灶被认为是比HCC血管化差(图9)的肿瘤类型，因此其可能更难发生血管变化。

实施例1703：患者1703患有肝细胞癌并参与JX-594的2期临床试验。将JX-594注射入单个大肿瘤(每剂10⁹pfu)。5天后，DCE MRI显示急性血管关闭(上方黑色和白色图)(图9)。下图显示用于定量血管关闭/肿瘤坏死程度的分段分析的例子(下图)(图7)。

实施例1708：患者1708患有肝细胞癌，肝脏中存在多处肿瘤，其参与JX-594的2期临床试验。将JX-594注射入一些但不是全部肝脏肿瘤中(总剂量为10pfu/剂)。5天后，DCEMRI显示注射和未注射的肝基肿瘤中的急性坏死/血管关闭。图8显示两个视图平面，包括JX-594治疗前和后的图像。

实施例0204:患者0204患有结直肠癌，肝、肺和淋巴结中存在转移灶，其参与JX-594的2期临床试验。将JX-594注射入一些但不是全部肝脏转移灶中(总剂量为10⁹pfu/剂)。5天后，DCE MRI显示注射和未注射的肝基肿瘤中的急性坏死/血管关闭(图9)。

E.临床试验数据：JX-594加强索拉非尼和索坦抗VEGF治疗

完成JX-594治疗后在第8周显示再灌注的5名患者随后接受标准索拉非尼给药(400mg每天两次)。观察到Choi应答增加(表A)。这些应答比针对单独JX-594治疗的任何初始Choi应答都有所增加(图11、12和13)。

表A：用JX-594继以索拉非尼治疗的患者中Choi应答增强。

实施例仅索拉非尼"对照组"(图中包括):历史上，对仅索拉非尼的RECIST应答率为1-2％(Llovet等人,2008；Cheng等人,2009)。对于用Choi标准评估的局部对照组，对没有接受JX-594但接受索拉非尼的HCC患者进行Choi应答评估。在医院中对5名JX-594患者中的4名进行治疗，26名其他患者在相同时期接受索拉非尼。应答评估前有7名患者死亡，对15名患者进行Choi应答评估。仅索拉非尼患者中仅2名显示Choi+应答(共26名，有15名进行Choi应答评估)。应注意到这些患者都接受与索拉非尼治疗结合的放射治疗。相比之下，索拉非尼治疗前接受JX-594治疗的2名患者在此期间有Choi+应答(图10)，这是索拉非尼对肿瘤的效果中惊人且意外的改善。

使用MRI扫描评估肿瘤坏死的仅索拉非尼临床试验中，一些肝团块(hepaticmass)显示中央肿瘤坏死，且平均肿瘤坏死从基线的9.8％稳健增加到数个疗程后的27％(Abou-Alfa等人,2006)。

实施例1702：患者1702患有肝细胞癌，且参与JX-594的2期临床试验，并接受肿瘤内3剂的JX-594(隔2周给予，每剂10⁹pfu)。该患者不可用改良的Choi标准评价对JX-594的应答，然而第8周扫描显示注射的肿瘤为稳定疾病(SD)，但用改良的RECIST标准时由于新肿瘤的出现而为进展性疾病(PD)。因此，患者1702继续接受8周的标准索拉非尼疗程(200mg每天口服两次)。索拉非尼治疗开始后的4周和8周进行的DCE MRI扫描显示急性肿瘤坏死。图片显示3种不同平面，左图来自索拉非尼治疗后4周，而右图来自索拉非尼治疗后8周(图11)。

实施例1705：患者1705患有肝细胞癌，并参与JX-594的2期临床试验。JX-594首次剂量5天后，通过DCE MRI检测的灌注显著下降证实了所述肿瘤中发生血管关闭(上图)。完成JX-594给药后(肿瘤内3剂，每剂10⁸pfu，隔2周给予)，第8周的扫描用改良的CHOI标准显示应答(-36％)，但用改良的RECIST标准显示进展性疾病(PD)。因此，患者1705继续接受4周的标准索拉非尼疗程(400mg每天口服两次)。第4周进行的DCE MRI扫描显示急性肿瘤坏死(下方右图)。(图12、图15、图16))

实施例1712：患者1712患有肝细胞癌，并参与JX-594的2期临床试验。完成JX-594给药后(肿瘤内3剂，每剂10⁹pfu，隔2周给予)，第8周的扫描用改良的CHOI标准显示应答(-33％)，但用改良的RECIST标准显示进展性疾病(PD)。患者1712接受4周的标准索拉非尼疗程(400mg每天口服两次)。第4周进行的DCEMRI扫描显示急性肿瘤坏死。(图13)

实施例11301，索坦患者：索坦是另一种批准用于肾细胞癌(RCC)的靶向性癌症疗法，其抑制VEGF活性和血管生成。患者11301患有RCC且肝脏中有转移灶，其参与用于治疗肝基肿瘤的JX-594的1期临床试验。完成2疗程的JX-594给药后(肿瘤内剂量为每剂10⁹pfu，隔3周给予)，第6周用RECIST评估显示稳定疾病。所述患者再接受2疗程的JX-594，但一肝团块和大(14cm)腹部团块发生进展。因此，患者1705继续接受索坦治疗。基于较低的血红蛋白和肝转移灶程度，该患者预后较差(Motzer等人,2006)。令人惊讶的是，在所有跟踪的患者肿瘤有完全应答(图14)。全身PET扫描显示无信号。JX-594治疗后存活为3年+(患者仍存活)。相比之下，大于10cm的肿瘤中仅施用索坦的历史RCC完全应答率为0％。较差预后的RCC患者中少于5％能存活3年。

实施例JX16-HCC-03，IV+IT+IT+索拉非尼患者:患者JX16-HCC-03患有肝细胞癌，并参与JX-594的2期临床试验。完成JX-594给药后(静脉内1剂和肿瘤内2剂)患者接受索拉非尼。DCE-MRI扫描显示在未注射的肝外肿瘤中开始施用索拉非尼后10天输注丧失(图18)。

***

根据本文公开的内容，本文描述和要求的所有组合物和/或方法无需过多实验即可进行和执行。虽然参考优选的实施方式描述了本发明的组合物和方法，但本领域技术人员应理解，可将各种改变施用于本文所述的组合物和/或方法以及本文所述方法的各个步骤或各步骤的顺序，而并不背离本发明的概念、精神和范围。更具体说，应理解，某些化学和生理相关试剂可代替本文所述的试剂，同时实现相同或类似的结果。认为本领域技术人员所明白的所有这些类似的替代或改进都在所附权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念内。

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Claims

1.一种用于治疗先前施用过痘病毒疗法的患者的癌症的方法，所述方法包括施用有效量的抗血管生成剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述牛痘病毒疗法包括表达GM-CSF的牛痘病毒。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述牛痘病毒缺乏功能性胸苷激酶基因。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗血管生成剂是激酶抑制剂。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述激酶抑制剂抑制Raf激酶途径。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述激酶抑制剂是索拉非尼。

7.根据权利要求1所述的方法，还包含确定肿瘤是否发生再血管化。

8.根据权利要求7所述的方法，其中确定肿瘤再血管化是通过所述肿瘤的非侵袭性成像进行的。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述非侵袭性成像是磁共振成像(MRI)。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述磁共振成像是动态造影增强MRI(dce-MRI)。