CN1090022C - 通过光动力疗法与免疫佐剂联合应用治疗癌症 - Google Patents

通过光动力疗法与免疫佐剂联合应用治疗癌症 Download PDF

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Abstract

公开一种治疗肿瘤如人或其他动物恶性肿瘤的方法。向肿瘤内导入生色团及免疫佐剂。该肿瘤然后用激光照射，其辐照度是以诱导恶性细胞损伤并刺激自身免疫防御系统抵抗恶性细胞扩增。

Description

通过光动力疗法与免疫佐剂联合应用治疗癌症
                       发明背景
1.技术领域
本发明广泛涉及治疗肿瘤的方法。更具体地，本发明结合光动力疗法和肿瘤免疫疗法以诱导恶变细胞损伤并刺激自身免疫防御系统抵抗残余的恶变细胞。
2.背景
肿瘤是一种由于比正常组织快得多的细胞增殖生成的异常组织。甚至在启动其生长的刺激消散后仍继续生长。肿瘤显示部分或完全丧失与正常组织的结构组织和功能协调，并通常形成可能是良性或恶性的性质不同的团块。
癌症是一个总的术语，常用来表示各种类型的恶性肿瘤，其中大多数侵袭周围组织，可能转移到几个部位，且切除后很可能再生，如果没有适当治疗的话会导致病人死亡。癌症能在任何年龄、任何器官的任何组织中产生。
一旦做出明确的癌症诊断，治疗决定是首要的。虽然没有一种治疗方法对所有癌症适用，但成功的疗法必须针对原发肿瘤及其转移，不论是临床上明显的还是细微的。
                        常规疗法
历史上，局部和区域疗法如外科或放射与系统疗法如药物已用于癌症治疗。
手术是癌症治疗的最古老有效形式。1988年，大约1,500,000人患有癌症；其中约515,000为皮肤或宫颈癌。约985,000具其它系统形式；64％具有可动手术的损伤，约有62％治愈率。如果早期发现，可只用手术进行正面影响的癌症包括宫颈、乳腺、膀胱、结肠、前列腺、喉、子宫内膜、卵巢、口腔、肾、睾丸(非精原细胞的)和肺(非小细胞)癌。但必须注意治疗成功的百分率因肿瘤部位差异很大。
放射在治疗下述疾病中起重要作用：何杰金病，结节和弥散非何杰金淋巴瘤，头颈部鳞状细胞癌，纵隔精细胞肿瘤，精原细胞瘤，前列腺癌，早期乳腺癌，早期非小细胞肺癌和成神经管细胞瘤。在前列腺癌和乳腺癌中当存在骨转移时，在多发性骨髓瘤，晚期肺和下咽部癌症，胃癌，肉瘤以及脑转移中，放疗可用作减轻病痛疗法。只用放疗可治愈的癌症包括何杰金病，早期非何杰金淋巴瘤，睾丸(精原细胞的)、前列腺、喉、宫颈癌及轻度鼻咽、鼻窦、乳腺、食管和肺癌。
抗肿瘤药物是阻止细胞分裂(有丝分裂)，发展，成熟或肿瘤细胞扩散的药物。理想的抗肿瘤药物是对正常细胞没有副作用或有毒性的破坏癌细胞的药物，但这种药不存在。尽管许多药物有较窄的治疗指数，但对某些病人可能治疗甚至治愈。已发现绒毛膜癌，何杰金病，扩散巨细胞淋巴瘤，Burkitt’s淋巴瘤和白血病的某些阶段如睾丸(非精原细胞)和肺(小细胞)癌一样对抗肿瘤药敏感。抗肿瘤药物的常见类型包括烷化剂、抗代谢剂、植物生物碱、抗生素、nitrosoureas、无机离子、酶和激素。
尽管有一些成功，但上述疗法没达到期望的有效程度，已经继续研究更有效的疗法。
                      最近进展
医学界调查研究的两种较新近的肿瘤治疗形式为光动力疗法和肿瘤免疫疗法。I.光动力疗法
许多年来已知光敏化合物当暴露于光时呈现光化学反应。光动力疗法(PDT)利用这些光敏化合物和激光使肿瘤坏死。PDT治疗实体瘤通常包括系统给予定位肿瘤的光敏化合物然后用激光来激活。吸收合适波长的光后，敏感剂从稳定的原子结构转变成激发态。在被治疗的组织中，通过敏感剂与分子氧之间相互作用介导产生细胞毒单线态氧，导致细胞毒性和最终肿瘤毁灭。
关于PDT，生物医学激光和光敏化合物，包括光发射和剂量参数的两篇好的全面性参考文献为，光敏化合物：其化学，生物学和临床应用，由John Wiley and Sons Ltd.，Chichester，U.K.，ISBN 0 471 92308 7于1989年出版；光动力疗法和生物医学激光：光动力疗法及医学激光应用国际会议文集，米兰，1992年6月24-27日，由Elsevier SciercePublishers B.V.，Amsterdam，The Netherlands，ISBN 0 444 81430 2出版，均在此引入做为参考。
有关PDT的美国专利包括U.S.Patent Nos.5,095,030 and 5,283,255授予Levy等人；5,314,905授予Pandey等人；5,214,036授予Allison等人；and 5,258,453授予Kopecek等人，全部在此引入作为参考。Levy专利公开了与肿瘤特异抗体偶联的受670-780nm波长影响的光敏剂使用，抗体如受体特异的配基，免疫球蛋白或免疫球蛋白的免疫特异性部分。Pandey专利指用于标准光动力疗法的焦脱镁叶绿甲酯酸(pyropheophorbide)化合物。Pandey还公开了用配基和抗体偶联他的组合物。Allison专利类似于Levy专利，因为绿色卟啉被偶联到质脂复合物以增强卟啉化合物对靶肿瘤细胞的特异性。Kopecek专利还公开了处理癌组织的组合物。这些组合物由两种连接到共聚合载体的药物组成，一种是抗癌药，一种是可光激活药。该组合物通过胞饮作用进入靶细胞。靶细胞被侵袭后抗癌药物起作用。过一段时间后，用光源激活光敏取代基。II.肿瘤免疫疗法
免疫系统的主要作用是形成“自身”的概念并消除“异己”的东西。虽然微生物是每天遇到的最主要异己实体，但免疫系统还消除肿瘤和移植物。见默克诊断与治疗手册，第16版，18和103章，由Merck ResearchLaboratories of Rahway，N.J.，ISBN 0911910-16-6 and 0076-6526于1992年出版；同样在此插入作为参考。
有几种性质不同的免疫类型。非特异或先天免疫力指没有被先前的感染或疫苗免疫(敏化或变应)的物种显示的固有抵抗。其主要的细胞成分是吞噬细胞系统，其功能为摄入并消化侵入的微生物。吞噬细胞包括血液中的中性白细胞和单核细胞以及组织中的巨噬细胞。补体蛋白是非特异免疫的主要可溶性成分。忽性期反应物和细胞因子如干扰素也是先天免疫的一部分。
特异性免疫是一种免疫状态，其中只针对刺激它的抗原决定簇(感染物或其它)有改变的反应性。它有时称作获得性免疫。它可以是主动的和特异的，作为天然获得(明显的或非明显的)感染或故意接种的结果；它也可是被动的，从来自另一个人或动物的抗体转移获得。特异性免疫具有学习、适应性和记忆的标志。细胞成分为淋巴细胞(如T细胞，B细胞，自然杀伤(NK)细胞)，免疫球蛋白为可溶性成分。
T细胞和NK细胞识别和破坏寄生的或外来细胞的作用叫做细胞介导的免疫。与细胞介导的免疫相反，体液免疫与复合物识别过程后B细胞产生的循环抗体有关。
关于肿瘤免疫学，淋巴细胞在肿瘤免疫中的重要性已被反复展示。细胞介导的对肿瘤的宿主反应包括免疫监督的概念，借此与细胞介导的免疫相关的细胞机制在识别肿瘤相关抗原(在正常细胞上不出现的与肿瘤细胞相关的抗原)后破坏新转化的肿瘤细胞。这类似于来自非同一供体的移植组织的排斥过程。在人体内，肿瘤结节的生长已被病人外周血淋巴细胞和肿瘤细胞的混合悬液抑制，提示对肿瘤的细胞介导反应。体外研究已显示来自患某种肿瘤的病人的淋巴细胞对相应培养的人肿瘤细胞显示细胞毒性。这些细胞毒细胞通常是T细胞，已在成神经细胞瘤，恶性黑色素瘤，肉瘤和结肠、乳腺、宫颈、子宫内膜、卵巢、睾丸、鼻咽和肾癌中发现。当存在肿瘤相关抗原，淋巴因子或干扰素时，巨噬细胞也可参与细胞介导的对肿瘤的宿主反应。
体外与肿瘤细胞反应的体液抗体已被相应于被化学致癌剂或病毒诱导的各种动物肿瘤而产生。体外杂交瘤技术允许检测和产生直接针对各种动物和人类肿瘤的单克隆抗肿瘤抗体。体内由抗体介导的针对肿瘤生长的保护作用仅在某些动物白血病和淋巴瘤中可证明。相反，体内淋巴细胞介导的保护作用出现在广范围的动物肿瘤系统。
癌症的免疫疗法最好被认为是广泛题目的部分，叫做生物疗法或生物反应调节剂的施用。这些试剂通过一种或多种不同机制起作用：(1)通过增加效应细胞的数目或产生一种或多种可溶中介体来刺激宿主的抗肿瘤反应；(2)作为效应物或中介体；(3)减少宿主抑制机制；(4)改变肿瘤细胞以增加其免疫原性或使它们更易被免疫方法损坏；(5)改善宿主对细胞毒或放射疗法的耐受性。迄今细胞介导的肿瘤免疫疗法的中心为：病人淋巴细胞体外经白介素2处理扩增后的再灌注。一种变更方案是分离和扩增已在体内浸润了肿瘤的淋巴细胞种群，所谓肿瘤浸润淋巴细胞。另一种是与干扰素同时使用，它被认为增加肿瘤细胞上组织相容抗原和肿瘤相关抗原的表达，因而通过灌注效应细胞增强肿瘤细胞的杀伤。
在另一方面体液疗法已长期集中于将抗肿瘤抗体用作被动免疫疗法的一种形式，与宿主自身免疫系统的主动刺激形成对照。另一种变更方案是将单克隆抗肿瘤抗体与毒素如蓖麻蛋白或白喉毒素或放射性同位素偶联，因此这些抗体将特异地向肿瘤细胞释放这些有毒物。辐射、神经氨酸酶处理、半抗原偶联或杂交后，用宿主自身肿瘤细胞的主动免疫也被尝试。在如此治疗的少数病人中可见临床改善。其它的肿瘤细胞与佐剂偶联后经照射用于缓解后的急性成淋巴细胞白血病和急性成髓细胞白血病。在某些系列但不是大多数系列中，已报道缓解延长或改善的再诱导率。干扰素，肿瘤坏死因子和淋巴毒素也已被用来影响免疫介导的机制。最近使用细胞和体液机制的方法是“异源交叉连接抗体”的建立，包括与肿瘤细胞反应的抗体连接到与细胞毒效应细胞反应的第二抗体，使后者更特异地靶向肿瘤。已有报道宿主免疫细胞浸润入PDT处理的小鼠肿瘤。
                     联合PDT与免疫疗法
Krobelik，Krosl，Dougherty和Chaplin探索了PDT与免疫疗法联合的可能性。见Photodynamic Therapy and Biomedical Lasers，同上，pp518-520。在他们的研究中，他们调查了对PDT免疫反应的扩增可能性以及其对被处理肿瘤更具有渗透性破坏的方向。肿瘤鳞状细胞癌SCCVII生长在雌性C3H小鼠。结束于PDT前一天或PDT后立即开始肌内给予七天免疫激活剂SPG(刺激巨噬细胞和淋巴细胞使对细胞因子和其它免疫信号具有更强反应的高分子量B-葡聚糖)。采用基于photofrin的PDT；在光疗前24小时静脉已给予photofrin。SPG免疫疗法显示增强PDT的直接杀伤作用。未接受SPG的动物的肿瘤中，间接杀伤作用(原位残余的肿瘤细胞存活减少)更明显。PDT之前或之后进行的SPG免疫疗法的效果差异提示最大相互作用在光释放的时候或紧随其后的免疫激活达到峰值时获得。PDT后开始用SPG(并在5-7天后获得最佳活化)，显然对于有益的反应太晚了。
在另一个研究中，调查了在缺氧条件下PDT对发挥细胞毒生物反应药物的作用的用途。见Photodynamic Therapy and Biomedical Lasers，同上，pp.698-701。发现这些药物的抗肿瘤活性当与加强肿瘤缺氧的治疗联合使用时，在体内可被增强。
                        目的
本发明的一个目的是通过联合使用光动力和免疫疗法而改善肿瘤的治疗，以引起直接的肿瘤细胞损伤同时刺激自身免疫防御系统，抵抗残留的或转移肿瘤细胞的增殖。
                      发明摘要
根据本发明，通过向肿瘤导入生色团和免疫佐剂来取得上述及其它目的和优点。该肿瘤然后以足够诱导肿瘤细胞破坏并刺激细胞介导的和体液免疫反应的辐照度激光照射。
按照本发明的一个方面，肿瘤如恶性肿瘤注射以含有生色团和免疫佐剂的溶液。发射与生色团互补的辐射波长的低能激光聚焦在肿瘤上一段时间，足以使肿瘤的温度升高到诱导肿瘤细胞损伤的水平，并刺激自身免疫防御系统抵抗肿瘤细胞扩增。提供了其它几种生色团和免疫佐剂及其辐照度参数。
按照本发明的另一个方面，制备吲哚花青绿(ICG)和糖化脱乙酰壳多糖溶液，浓度为ICG/脱乙酰壳多糖比为0.1∶2％。该溶液以剂量为70-400μl注射入肿瘤。然后用激光照射肿瘤，激光功率为5瓦，并且辐射波长能容易地穿透正常细胞组织而无明显损伤。照射持续1-10分钟，足以升高肿瘤温度，达到诱导肿瘤细胞损伤并刺激细胞介导的和体液免疫反应的水平。
本发明比其它常规和非常规物理疗法有一些优点。致敏剂与免疫刺激佐剂的联合是主要的。最重要的优点是一种联合的急性和慢性肿瘤破坏。急性肿瘤损伤是由广泛并可控范围内肿瘤组织的光蒸发、光消融或热杀伤引起的，在直接区域，减少肿瘤负担和随后的扩增基础，以使自身防御系统对抗较弱的敌人。当光热破坏发生时，破裂的组织和细胞分子在免疫增强物质如脱乙酰壳多糖的存在下，在宿主内分配。实际上形成原位疫苗。这种物质混合物然后在宿主内循环，由免疫监视系统监测。接着是细胞介导免疫的直接带动转移，包含NK细胞和征集的杀伤T细胞。这些细胞迁移到相似抗原或化学物质的位点。此时，细胞介导的免疫转换为体液免疫并伴随细胞毒抗体产生。这些抗体在体内自由循环，并粘附被编码的细胞和物质上。如果这种粘附发生在补体因子存在的情况下，导致细胞死亡。这两种免疫作用形式的时间范围对细胞介导的反应是0-2周，而体液臂(humoralarm)成熟大约在30天并应该保持长时间，最长可长至宿主的寿命。
由于使用的辐照波长不易被正常细胞组织吸收，伴随的损伤减少到可耐受的水平。特别是当激光能量被小心选择在某一损伤阈值之下时，激光对在光束通路中的组织如皮肤几乎没有伤害。这种特点使非侵害治疗成为可能。甚至于在疾病组织深置于体内的情况下，内窥镜和光导纤维可容易地到达治疗部位。
互补吸收波长的生色团使激光治疗高度选择。只有注射生色团的区域获得可观的组织破坏。生色团的浓度，生色团和免疫佐剂的剂量以及给药时间允许诱导光热作用的时间和空间控制。最佳给药可通过考虑生色团的物理和化学特点及对考虑光热相互作用的组织应答来得到。无任何激光刺激下，生色团与其宿主组织之间的自然反应，如分子随时间分解，以及分子通过循环和排泄系统迁移，也同样重要。本发明的优选生色团ICG是无毒的，并能容易地通过肝和肾在短期内排除。
总之，通过本发明可获得完全癌症根除的长期存活。它是由光热相互作用所致的肿瘤负担减少与脱乙酰壳多糖或其它免疫调节剂所引起的免疫系统反应增强联合的结果。
本发明的其它目的和优点对本领域技术人员从下列详述中可显而易见，其中仅通过解释试图完成本发明的最佳方式只来显示和描述本发明的优选实施方案。正如将会实现的，本发明能在多种显而易见的方面进行修改，而不背离本发明。因此，该描述实质上应被当做解释而非限制。
                       附图简述
图1是关于鼠乳腺癌研究的图，表示特定受治疗鼠随时间的肿瘤负担，其原发瘤以本发明的方式处理。
图2是类似于图1的第二个受治疗鼠的图。
图3是表示图1的受治疗鼠中未处理的继发(secondary)肿瘤随时间变化的肿瘤负担图表。
图4是表示图2的受治疗鼠中未处理的继发(secondary)肿瘤随时间变化的肿瘤负担图表。
图5是其它三种处理的受治疗鼠，随时间变化的肿瘤负担图表。
                  优选实施方案详述
本发明通过向肿瘤中导入生色团和免疫佐剂(也叫免疫调节剂或免疫强化剂)将光动力和免疫疗法结合起来。使用足够诱导肿瘤细胞损伤的激光辐照度后，免疫佐剂成分刺激(增强)针对借此释放的肿瘤抗原而发生的细胞介导的和体液免疫反应。生色团和免疫佐剂优选混合到一种溶液，再注射入肿瘤块的中央。然而应该认识到其它方法对在肿瘤部位定位生色团和免疫佐剂也是足够的。一种这类的替代转送方式是将生色团或免疫佐剂或两者与组织特异性抗体或组织特异性抗原偶联，以使向肿瘤部位的转运增强。任何一种在肿瘤部位定位生色团和免疫佐剂的方法或不同方法的组合，只要转运机制确保在肿瘤中有足够浓度的该组分便可接受。
合适生色团的选择基本上配合可接受的辐射激光波长。使用的辐射波长当然必须与生色团的光学性质(即吸收峰)互补。其它的生色团选择标准包括产生热能、发生单线态氧及其它活性分子或自身毒性如顺铂的能力。在本发明中，优选的辐射波长为808±10nm。期望的生色团对红色和近红外光谱区有强烈的吸收，因为组织对此相对可被透射。该波长的另一优点是避免了紫外光激发的致敏剂遇到的潜在致突变作用。然而，在个别情况下150-2000nm之间波长可证明是有效的。优选生色团为吲哚花青绿。也可用其它生色团，但其选择基于所期望的光物理和光化学性质，它们决定了光敏效能和光细胞毒性。其它生色团的实例包括但不限于DHE(聚血卟啉酯/醚)，m-THPP(四(间-羟苯基)卟啉)，AlPcS4(四磺酸酞菁铝)，ZnET2(原紫红素锌)和Bchla(细菌-叶绿素a)。
优选的免疫调节剂是脱乙酰壳多糖。脱乙酰壳多糖是壳多糖的衍生物，一种通常分离自某些甲壳动物如蟹、龙虾和虾的壳。壳多糖是一种通过β1→4糖苷键将N-乙酰葡糖胺单元连接而组成的线性同聚物。壳多糖，脱乙酰壳多糖(部分脱乙酰化的壳多糖)及其衍生物被赋有有趣的化学和生物性质，致使具有多种广泛的工业和医学用途。脱乙酰壳多糖中存在的伯和仲醇基团以及伯胺基团利于进行一些化学修饰，主要用来获得其溶解并为具体用途赋予具体性质。由于其降解产物可用于活组织的葡糖偶联成分的生物合成，其生物可降解性及无毒性使它们“生物学上友好的”。脱乙酰壳多糖及其衍生物已用于绷带与缝合，烧伤敷料，皮肤代用品，骨骼和牙修复，食品包装，药物密封，化妆品，金属螯合物及相关抗氧化作用，废水处理，止血，抗促凝剂(硫酸盐化作用后)和染料添加剂及其它。
可通过部分水解为寡糖而增溶壳多糖和脱乙酰壳多糖。对脱乙酰壳多糖来说，用各种有机及无机酸处理，通过游离氨基的质子化形成水溶性脱乙酰壳多糖氨盐。氨基的其它修饰包括导入化学基团如羰甲基，甘油基，N-羟丁基等。还原稳定后，糖化即脱乙酰壳多糖的游离氨基的非酶促糖基化为脱乙酰壳多糖凝胶的制备和用于本发明溶液的制备提供了一种新方法。
用于本发明的糖化脱乙酰壳多糖的制备步骤如下：将3克还原单糖(如葡萄糖，半乳糖，核糖)或等量的还原寡糖在温和和磁搅拌下，溶于Erlenmeyer烧瓶的100ml蒸馏水中。加入1克脱乙酰壳多糖。当悬液均匀后，加入0.25ml甲苯，然后将烧瓶用铝箔密封。在室温继续磁搅拌24小时。搅拌后该溶液置于通风蒸汽罩，其中加入1.327克硼氢化钠于5ml 0.1M NaOH中以还原希夫碱和Amadori产物。该溶液然后用箔松散盖上，室温搅拌10分钟并冰浴中搅拌50分钟。此搅拌步骤后，烧瓶移出冰浴，在磁搅拌下滴加冰乙酸(约1.9ml)使溶液酸化至pH5.5以分解过量的硼氢化物。溶液然后在五个玻璃(Corex)离心管中以15,000rpm(在Sorval上，转头SS-34，4℃)离心15分钟。轻轻倒出上清，覆盖在沉淀上的透明凝胶层用钢铲小心刮取。用来自两个离心管中的上清重悬沉淀，并在两个管中再离心。再将上清倒出，如上收集凝胶。用一个管中的上清重悬后，汇集的沉淀第三次离心。倾去上清后再收集凝胶。汇集的凝胶然后分散在汇集的上清中得到均一悬液，并装于三个透析袋(Spectrapor，25mm扁平宽度，截断分子量12000-14000mol.)。悬液对3.5加仑蒸馏水4℃透析过夜。然后袋子置于新的蒸馏水中，再透析7小时。透析后，从袋中移出透析物并在Waring搅拌器上以高速均浆三下(每次10秒)。得到的粘性溶液冷冻贮存。在本发明使用前，冷冻材料在37℃水浴融化，然后用Waring搅拌器混合来得到均一混合物。
在优选实施方案中，ICG粉末与糖化脱乙酰壳多糖制品混合，得到ICG占糖化脱乙酰壳多糖溶液0.1～2％(0.1～2g/100ml)浓度的溶液。该溶液在使用前一直保持温热。溶液的有效剂量为70-2000μl。
虽然优选糖化脱乙酰壳多糖，也可从广泛的免疫活性剂中选择其它免疫增强剂，如细菌细胞壁或释放蛋白，减毒活细菌，各种油，修饰的脱乙酰壳多糖或对宿主为外来的但无毒的脱乙酰壳多糖样物质。
对激光参数，虽然可用其它激光，包括可能是或不全是相同波长的各种激光的汇集，但优选通过直径100-2000μm的光纤以连续波发射光的固态二极管激光。使用的激光能量介于1-60瓦，优选功率1-5瓦。辐照持久度应持续1-60分钟，最好3-6分钟。照射瘤块的温度应优选升高到(be raised to)约140°F或60℃。
在最优选实施例中，ICG和糖化脱乙酰壳多糖溶液以ICG比脱乙酰壳多糖为0.25∶2％的浓度如上制备。该溶液以70-400μl剂量注射入肿瘤中央。然后用激光照射肿瘤，激光功率约5瓦，辐照波长则能容易地穿过正常细胞组织而无明显破坏。辐照持续1-10分钟，足以将该肿瘤的温度升至诱导肿瘤细胞损伤并释放刺激细胞介导的及体液免疫反应的肿瘤抗原的水平。
本发明优选实施方案的进一步描述，包括成分、参数和程序，包含在下面鼠乳腺癌研究的摘要中。
                  鼠乳腺肿瘤的研究A.材料和方法
1.激光
此研究中用二极管激光。工业半导体激光ISL50F(McDonnellDouglas Aerospace，St.Louis，MO)采用二极管驱动作电动力的二极管阵列。激光以脉冲或连续方式发射波长808±10nm的辐射。可得到位形输出的最大近红外功率为35瓦。激光用标准电能(110/120VAC)操纵。微处理机监测和调节激光操作参数。激光能量可通过不同规格的光导纤维传送。红色激光二极管发射0.9mW 670nm光做为目标光束。在此实验中采用连续波方式。
实验中，使用不同的激光辐照功率和持续时间，从5瓦3分钟到15瓦5分钟。在过程之前期间和之后用Joule/Watt表(Ophir Optics，Israel)测量输出功率。使用两种光纤：直径600μm和1200μm。
2.动物准备
实验选择6-7周，体重100-125克的雌性Wistar Furth大鼠。模型为转移的可移植大鼠乳腺肿瘤。瘤株为DMBA-4。通过向皮肤和肌肉层之间的浅层腹腔沟区域注射，给大鼠接种肿瘤细胞(约25,000细胞)。为了同时的肿瘤生长，某些被选定的大鼠在左侧和右侧腹股沟区域均注射肿瘤细胞。
大鼠喂以高饱和脂肪饮食的特殊食物以利于肿瘤的生长。肿瘤通常在接种10-14天内长约1-4cm3。在多数情况下，等到5cm3之前处理大鼠肿瘤。
在激光处理前，进行麻醉(100μl xylazine和氯胺酮溶液IM)并修剪和刮除肿瘤上覆盖的毛。处理后，大鼠放在隔离的笼中并仍喂以相同的高脂肪饮食。每天观察大鼠，激光处理的及未处理对照组肿瘤的形态学测量每周进行再次。
3.给与致敏物
致敏物吲哚花青绿(ICG)(Sigma Chemical Co.，St.Louis)以两种形式使用：ICG溶于水和ICG溶于糖化脱乙酰壳多糖，ICG∶水或∶脱乙酰壳多糖的浓度为0.5％和1％(g/100ml)。在脱乙酰壳多糖溶液的情况下，胶从冷冻状态(-4℃)拿到37℃后，在玻璃研钵中将ICG粉末与如前所述制得的糖化脱乙脂壳多糖混合，得到均一的溶液。然后将致敏物溶液注射到靶肿瘤的中心，在激光处理前24小时或仅10分钟前注射。剂量在每瘤70-400μl之间变动。
对于两侧腹股沟区域移植原发瘤的大鼠，只有一侧肿瘤注射ICG-脱乙酰壳多糖。但两侧肿瘤均用相同激光参数处理。
4.激光治疗
激光能量通过直径为600或1200μm的纤维传送到治疗部位。纤维头端与皮肤保持4mm。纤维头平稳缓慢地移动经过肿瘤的各侧面以保证均一的能量分布。治疗部位表面经常加一薄水膜(20℃)以防由于表面过热引起的不必要皮肤损伤。
对于同时用两个原发肿瘤接种的大鼠，一个肿瘤借助ICG-脱乙酰壳多糖进行激光照射，另一个仅用激光治疗。56只大鼠用不同的激光参数，偶联ICG-脱乙酰壳多糖溶液治疗。16只大鼠注射100-200μl 1％的ICG-H2O溶液，并用不同辐照度，从3-10瓦，3-5分钟进行激光照射。B.结果
1.存活率
至1995年4月1日，共有在105只大鼠用于研究。所有的大鼠在一侧或双侧腹股沟区域注射转移的可移植大鼠乳腺肿瘤细胞。大鼠分成三组：(1)对照组，(2)有ICG-H2O溶液的激光治疗，和(3)有ICG-脱乙酰壳多糖溶液的激光治疗。各组动物的存活率总结于表I。
                       表1
             具有移植肿瘤的大鼠存活率
  组别     存活天数  大鼠数量
  对照组     32.4±3.6     13
  仅用ICG的激光治疗     29.0±3.5     7
  用ICG-脱乙酰壳多糖的激光治疗     42.7±28.9     55
  ICG-脱乙酰壳多糖处理(无长期存活大鼠)     32.9±5.7     49
  ICG-脱乙酰壳多糖处理(仅长期存活大鼠)*     114.3±39.8     6
  ICG-脱乙酰壳多糖处理5w@3-6分钟(无长期存活大鼠)**     33.6±6.0     36
  ICG-脱乙酰壳多糖处理5w@3-6分钟(长期存活大鼠)     45.4±32.4     42
*  6只长期存活大鼠中，3只仍然活着。表中数据采至
   1955年1月16日
** 这6只长期存活大鼠用此激光功率和持续时间范围处理
   (详见表II)
移植肿瘤后，33只对照组大鼠的平均存活时间是31.5天；仅注射水溶性ICG并激光治疗的大鼠平均存活29.0天；注射ICG-脱乙酰壳多糖并激光治疗大鼠的总体平均存活时间45.6天。在最后一组的56只大鼠中，6只大鼠获得长期存活(至少为对照组大鼠的两倍)，除了它们之外，该组存活率为32.8天。另一方面，这6只大鼠平均存活152.0天。值得注意的是三只大鼠Srat3，Srat4和Srat6在写此报告时仍存活，到1995年4月1日分别已有存活220，192和147天。
2.肿瘤对激光治疗的反应
表I显示组2和组3的荷瘤大鼠均对激光能量呈阳性反应。几乎所有肿瘤在激光治疗后温度马上升高。注射ICG-H2O或ICG-脱乙酰壳多糖的溶液的肿瘤温度通常升高40°F，而无ICG肿瘤温度仅升高较少水平，常常高于体温20-30°F，这取决于激光功率和持续时间。
由于温度突然升高，在过程中常出现内部激增。在高功率激光，如10瓦以上更明显。在大多数情况下，即使在治疗表面不断给予小水滴，高功率仍产生皮肤损伤。
高激光功率下(10-15w)的肿瘤细胞损伤是浅层的，较深的肿瘤细胞常幸免激光的攻击。使用较低激光功率时可获得较好结果。6只长期存活大鼠均接受的5瓦治疗(4只3分钟，2只5分钟)。见表II。
                                                              表II
                                            激光-ICG-脱乙酰壳多糖处理的长期存活大鼠参数
    动物           肿瘤移植         给与ICG-脱乙酰壳多糖                 激光治疗*     存活
    动物数    日期    位置   治疗前时间   剂量    位置  日期     功率(瓦) 持续时间(分钟)   移植肿瘤后(天)
  Srat1Rat1#5/3-29-94   3-18-94   双后腿   24小时   70μl@1％   左后腿 3-29-94     5.00     3     156
  Srat1Rat2#1/6-3-94   5-23-94   双后腿   24小时   70μl@1％   左后腿 6-3-94     5.00     3     125
  Srat1Rat3#5/9-1-94   8-19-94   左后腿   24小时   150μl@0.5％   左后腿 9-1-94     5.06     5     150**as of1/16/94
  Srat1Rat4#2/9-27-94   9-16-94   双后腿   24小时   100μl@1％   右后腿 9-27-94     5.20     5     120**as of1/16/94
  Srat1Rat5#3/11-8-94   10-31-94   左后腿   10分钟   150μl@0.5％   左后腿 11-8-94     4.95     3     65
  Srat1Rat6#4/11-11-94   10-31-94   左后腿   10分钟   100μl@0.5％   左后腿 11-11-94     5.12     3     80**as of1/16/94
*  共42只大鼠用此范围参数处理，得到14％存活率** 大鼠仍存活
总共43只大鼠用5瓦功率的激光辐照3-6分钟；在这组中导致了14％的长期存活率。在该参数下，不计算6只长期存活大鼠，平均存活达32.8±6.3天。
激光治疗后，所有肿瘤立即在最初的几天内生长较缓慢，然后又回到正常的生长速度。肿瘤经常部分被咬或咀嚼，但那不能停止或减慢肿瘤生长。除了列于表II的大鼠外，大多数大鼠约30-35天死亡。大约一半被治疗大鼠后来形成了继发肿瘤，多数如“手袋”(转移到腋下区域的淋巴结)；淋巴结中也有原发肿瘤的局部扩散。在任何一种情况下，除表II中的大鼠外，继发肿瘤继续生长直至死亡。
3.长期存活大鼠的肿瘤发生
表II中6只大鼠均用5瓦功率治疗3分钟(4只大鼠)或5分钟(2只大鼠)。更重要的是它们全部注射ICG-脱乙酰壳多糖胶溶液。移植两个原发肿瘤的大鼠，只有一个肿瘤接受ICG-脱乙酰壳多糖溶液，另一个无任何ICG致敏剂进行激光照射。只有一个原发肿瘤的大鼠采用ICG-脱乙酰壳多糖。IDG-脱乙酰壳多糖溶液为0.5-1％，剂量每个肿瘤70μl-150μl。在激光治疗前24小时或10分钟，通常直接向肿瘤注射ICG-脱乙酰壳多糖。
象所有其它大鼠一样，治疗后肿瘤继续生长，而且大多数肿瘤沿乳线向腋下淋巴结和对侧腹股沟结节转移。然而，肿瘤的发生在后来的阶段发生巨大转变。图1和图2显示Srat1和Srat2的原发肿瘤经激光治疗后的生长图表；左腹股沟肿瘤注射ICG-脱乙酰壳多糖，右腹股沟的不注射。肿瘤移植后约50天生长达峰值，然后开始退步。肿瘤继续收缩到约90天达最小体积。然后肿瘤又开始生长Srat1比Srat2生长更快。注意两种情形中(无ICG-脱乙酰壳多糖注射)右腹股沟的负担较大。
Srat1和Srat2的继发肿瘤在肿瘤移植后约第20天出现，并经过与原发相同的模式—生长/收缩/生长，见图3和4。Srat2的情况中，继发肿瘤的再出现几乎可忽略。
其它三只大鼠的肿瘤生长见图5。Srat3和Srat6仅始于一个原发肿瘤，而Srat4始于两个。图5表示更早的反应：肿瘤减小约20-25天开始。而且，甚至无继发肿瘤，原发肿瘤仅变成一个纤维组织小硬核；仅为肿瘤的残余。因为三只在此时(1995年4月1日)仍活着，所以将进一步观察。
4.实验的改进
早期实验曾主要集中在建立可工作的条件，包括激光参数以及ICG-脱乙酰壳多糖的浓度和剂量。在开始的几组中没观察到长期存活。体外和体内结果提示，实验曾以3-5瓦的激光功率范围进行。0.5％-1％的ICG-壳多糖溶液看来是有效的。得到了稳定的10％长期存活率，在最近的一组大鼠中竟达20％存活率。C.讨论
显然，当使用吸收峰约800nm的生色团ICG时，808nm二极管激光对有组织的组织的光热效应会大大增强。808nm激光能量可容易地穿透正常组织，而在调节的功率范围内使细胞结构大多完整。
当向靶组织注射时，是ICG分子强烈地吸收808nm辐射并达到激发态。当分子返回基态时，贮存的能量以热的形式释放，并被周围的组织吸收以升高温度。(激发的ICG分子还可引起其它生化反应，它们也许在我们诱导的免疫反应中是关键的)。当足够量的ICG分子在某段时间(正常地比组织热弛豫时间短)被激发时，释放的热被组织细胞吸收比其扩散更快。如果暴露于激光足够长时间，积蓄的热能可将组织温度提高到有组织的组织可发生光热破坏的水平。此损伤可用某些选择的激光功率和辐照持续时间来获得。看来3-5瓦的激光功率对引起肿瘤细胞致命损伤是足够的。
较高的功率与ICG偶联使用可对组织引起快速并更猛烈的热损伤，但可引起某些不期望的结果。高功率辐射引起更快的温度升高，常致使内部爆炸及快速组织碳化，特别是当空气中氧丰富时发生在治疗表面上。通过水膜或氦气的表面冷却步骤不能减慢碳化，碳化将表面组织性质从近乎可以穿透变为对808nm波长高度吸收。因而808nm辐照会进一步被碳化组织吸收。这将妨碍激光能量的穿透，导致指定恶变组织的表层及局限空间热损伤。
仅热影响可能减慢短期的肿瘤生长，但不能改变已得肿瘤的宿主的预定命运。如表I所示，辅以ICG-H2O溶液进行激光治疗的第2组在存活率上未显示任何改善。当然，光热相互作用对肿瘤细胞的破坏是主要作用。然而，由于肿瘤的进攻性，仅通过热损伤很难完全根除；就像手术切除和放疗的情况那样。
                         结论
显然，其它机制必须用来对付恶性细胞增殖的根源。当然，理想的机制是自身免疫防御系统，它可阻止异常细胞的生长。只有当天然免疫功能衰弱或不足以对外来侵入起反应进才发生癌。假如天然免疫防御不能阻止失控的细胞生长，就需要内源或外源的刺激免疫反应。如前所述，很久已知某些化合物可增强天然防御机制，但这种增强常常是肿瘤生长后的一步或几步。这里描述的模型涉及联合的PDT和免疫疗法治疗。
其它治疗方式如化疗和放疗常无选择地杀伤细胞以致伴生的损害成为致命的。虽然PDT依赖于激光和某些光敏化剂产生的热和/或毒性单线态氧来杀死肿瘤细胞，但它仍不是影响宿主自身免疫防御系统的方法。通过联合使用激光、生色团和免疫调节剂，本发明提供了一种新的癌症疗法。
本发明对刺激宿主中细胞介导的和体液免疫反应的作用见图1-5。生长图(图1和2)表示肿瘤负担的变化。移植肿瘤后50天(激光-ICG脱乙酰壳多糖治疗后40天)原发肿瘤达到其最大体积。后来肿瘤生长和体积的减小只能由产生的免疫反应来解释，因为只有当自身防御机制完全形成时，才能减慢和停止肿瘤生长，并且无功能的肿瘤细胞可被巨噬细胞吞噬。没有这种外来特性，没有大鼠能存活超过35或40天，正如表I中前两组实验大鼠所证明的。
注射ICG-脱乙酰壳多糖的肿瘤多数在(表II中6只大鼠左腹股沟)具有较慢的生长速率、对免疫佐剂更直接影响的迹象，虽然两侧肿瘤均用相同的激光功率和持续时间治疗。总的来说注射ICG-脱乙酰壳多糖的肿瘤对激光治疗有更大反应。偶联ICG，仅热相互作用在大范围内有效地减少肿瘤负担。脱乙酰壳多糖显然增加了免疫刺激。热与免疫作用的组合似乎可用来解释为什么如图1和2所示，左腹股沟肿瘤比右侧的生长慢。
免疫防御系统反应的产生和加速进一步被长期存活大鼠继发肿瘤的演变所支持。转移通常发生在移植原发肿瘤后约15-20天的半数大鼠上。多数情况下继发肿瘤沿乳线继续生长至死亡。然而，图3和4的Srat1和Srat2的移植肿瘤显示与原发肿瘤(图1和2)完全相同的趋势，不注射ICG-脱乙酰壳多糖也不激光治疗。图5描述了三只大鼠(Srat3，Srat4和Srat6)原发肿瘤的生长，它们全遵从相同的发生—生长/治疗/生长/减小。而且，这三只大鼠较早形成了其完全反应；肿瘤移植后20-25天肿瘤生长停止并且从未出现继发肿瘤。这一诱导免疫防御机制的早期建立可解释为什么这些大鼠仍然活着并没有肿瘤复发的迹象。
总之，通过激光-生色团-佐剂诱导的免疫反应可获得全部癌症根除的长期存活。这是由于光热相互作用而减少肿瘤负担与由于加入脱乙酰壳多糖或其它免疫调节剂而加强的免疫系统反应的综合结果。实验结果正不断改善。最初几组没有产生长期存活者，而现在已获得稳定的10％长期存活率。在目前可接受的激光功率(5瓦)和辐照持续时间(3-6分钟)，长期存活率达14％。
虽然本发明以某种程度具体性来描述，但证明可在不背离此公开的精神和范围下，对上述方法进行许多改变。本发明被认为不仅限于用来举例的这里给出的实施方案，而仅受所附权利要求的范围限制，包括每一提及因素的等价的全部范围。

Claims (11)

1.含有糖化脱乙酰壳多糖的混悬液或溶液的免疫佐剂。
2.权利要求1的免疫佐剂，还含有一种生色团。
3.权利要求2的免疫佐剂，其中所述生色团选自吲哚花青绿，聚血卟啉酯/醚，四(间-羟苯基)卟啉，四磺酸酞菁铝，原紫红素锌和细菌叶绿素a。
4.权利要求2的免疫佐剂，其中所述生色团是吲哚花青绿。
5.权利要求2的免疫佐剂，所述免疫佐剂是一种注射用溶液。
6.权利要求1的免疫佐剂，其中所述糖化脱乙酰壳多糖包括羰基或羧基反应基团。
7.权利要求1的免疫佐剂在制备治疗人和其它动物的肿瘤药物中的应用。
8.一种制备权利要求1的免疫佐剂的方法，其特征在于：在NaOH和硼氢化钠存在下，使脱乙酰壳多糖与还原单糖或还原寡糖于溶剂中进行反应。
9.一种用于光物理学和免疫学协同治疗肿瘤的组合物，它含有一种生色团和一个免疫佐剂的组合，其中所述生色团和免疫佐剂与肿瘤特异抗原偶联，并且该免疫佐剂是糖化脱乙酰壳多糖。
10.一种用于光物理学和免疫学协同治疗肿瘤的组合物，它含有一种生色团和一个免疫佐剂的组合，其中所述生色团和免疫佐剂与肿瘤特异抗体偶联，并且该免疫佐剂是糖化脱乙酰壳多糖。
11.权利要求5的注射用溶液在制备光物理学和免疫学协同治疗肿瘤的药物中的应用。
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