CN1094977C - 具有高艾杜糖醛酸含量的多糖类 - Google Patents

具有高艾杜糖醛酸含量的多糖类 Download PDF

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    • C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof

Abstract

本发明提供了制备具有高含量艾杜糖醛酸的多糖的方法，包括：a)N-脱乙酰化从大肠杆菌得到的多糖K5或硫酸乙酰肝素，或者O-脱硫酸盐化肝素或硫酸乙酰肝素；b)N-硫酸盐化a)部所得产物；c)在C5差向异构酶存在下进行差向异构化；d)将至少某些游离羟基进行硫酸盐化，其特征是步骤c)是在由HEPES、氯化钾和EDTA形成的经典缓冲溶液，和TRITON X-100构成的并加有适当添加剂的反应介质中进行。

Description

具有高艾杜糖醛酸含量的多糖类
现有技术
葡糖胺聚糖属于含有艾杜糖醛酸的多糖类物质，它们从不同来源的动物组织提取得到，这些组织如肠粘膜，肺等。肝素，硫酸乙酰肝素，condroitin sulfates和透明质酸属于葡糖胺聚糖族系。
不同的葡糖胺聚糖具有不相同的化学结构，它们由糖醛酸和己糖胺重复构成的多糖链形成。具体讲，在肝素和硫酸乙酰肝素中，糖醛酸(uronicacid)由糖醛酸(glycuronic acid)或艾杜糖醛酸构成，而己糖胺则由葡糖胺构成。
葡糖胺可优先被N-乙酰化(硫酸乙酰肝素)或优先N-硫酸盐化(肝素)和6-O硫酸盐化。此外，还发现在葡糖胺的3位上也带有硫酸根。糖醛酸可被2-O硫酸盐化。
在临床实践中，肝素作为抗凝血剂和抗血栓形成剂具有十分重要的作用。
对肝素和硫酸乙酰肝素来讲，除上述这种治疗应用外，还希望它们在若干其它病理学方面具有有用的应用，例如具有抗血脂，抗增生，抗病毒，抗肿瘤和抗生成血管功能等作用。
肝素和硫酸乙酰肝素在这些新治疗应用方面的使用包括必需用不同于提取的方法，特别是用适应性更强的可以制备不同结构产物的方法，制得这些产物或类似产物。
并且，提取动物组织的方法不能保证得到无病毒产物。
WO92/17507专利申请中描述了通过生物合成制备抗凝血剂葡糖胺聚糖的方法。在此方法中，使用从大肠杆菌中得到的多糖K5为原料，采用下述反应顺序进行：-N-脱乙酰化作用；-N-硫酸盐化作用；-差向异构作用，以便将D-糖醛酸的至少某些残基转移到L-艾杜糖醛酸的残基上；和-至少某些游离羟基的硫酸盐化作用。
此方法中，其关键步骤在于差向异构作用，这种差向异构作用最多限于20％。差向异构是在由HEPES、氯化钾、EDTA和TRITON X-100组成的pH为7.4的经典反应介质中，于D-糖醛酸基-L-艾杜糖醛酸基-C5-差向异构酶(D-glycuronyl-L-iduronyl-C5-epimerase)存在下室温进行两天。以前已阐述了限于三分之一糖醛酸差向异构作用(M.Hook等人，生物化学(The J.of Biol.Chem.)249，12 3908-3915，1974年6月25日)。并且这种差向异构程度似乎至今仍是无法逾越的。此外，必须注意的是，在此文献中，细胞环境中的差向异构作用是在生物合成方法的各种因素存在的条件下于鼠肥大细胞瘤中进行。
但是，象从现有技术中得到的差向异构程度不允许得到具有各种治疗应用所需特征的产物。
事实上，艾杜糖醛酸赋予糖醛酸产物优越的柔性(Casu B.，Petitou M.，Provasoli M.，和Sinay P.(1988)构象柔性：一种解释包含艾杜糖醛酸的葡糖胺聚糖结合和生物特性的新概念。Trends Biochem.Sci.13，221-225)。因此，正如由肝素相对于硫酸乙酰肝素具有更强的抗凝和抗血栓形成活性和其它活性如对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的活性所指出的那样，含有高百分比量艾杜糖醛酸的产物较之那些含有糖醛酸的产物具有更高活性，其中艾杜糖醛酸被认为是活性部位的必需部分(Maccarana M.，Casu B，.和Lindahl U.(1993).结合碱性成纤维细胞生长因子所需要的肝素/硫酸乙酰肝素中的最低序列(Minimal sequence in Heparin/Heparan SulfateRequired for Binding of Basic Fibroblast Growth Factor).生物化学(J.Biol.Chem.)，268，23898-23905)。
化学文摘第115卷，17期，1991年，文摘号180062W描述了用对一硝基苯基-β-D-木糖苷孵化培养的成纤维细胞的实验，结果得出赖于浓度，半乳糖胺聚糖合成增加。尤其当添加的木糖苷浓度低时，在木糖苷上形成的半乳糖苷聚糖主要由L-艾杜糖醛酸组成。显然，所述实验并未给出工业方法。
因此，从工业角度来看，存在着这样难题，即寻求能得到具有可接受的产率和时间的高度差向异构作用的产物的方法。
概述
我们已发现，具有高艾杜糖醛酸含量的多糖类可通过下述方法以由大肠杆菌得到的多糖K5或以肝素或硫酸乙酰肝素为原料制得，该方法包括：
a)N-脱乙酰化所述多糖K5或硫酸乙酰肝素，或者O-脱硫酸盐化肝素或硫酸乙酰肝素；
b)N-硫酸盐化a)步所得产物；
c)在D-糖醛酸基-L-艾杜糖醛酸基-C5差向异构酶存在下进行一次或多次差向异构处理；
d)将至少某些游离羟基进行硫酸盐化，其特征在于差向异构步骤是在由由HEPES、氯化钾和EDTA形成的pH为7.4的经典缓冲溶液构成的、加有TRITON X-100和一种或多种选自乙二醇，甘油，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇和磷脂酰胆碱的添加剂的反应介质中进行。
按照本发明方法，可以制得相对于糖醛酸总含量，艾杜糖醛酸含量大于50％的多糖。发明详述
下文详尽的说明过程中基本上完全指出了本发明方法和所得多糖的特征及优点。
按Manzoni M.，Bergomi S.，Cavazzoni V.(生物活性和相容聚合物(Journal of Bioactive and Compatible Polymers).Vol VIII，1993年7月，251-257)所述由大肠杆菌得到的多糖K5特别适合用作本发明方法的起始原料。
肝素和硫酸乙酰肝素也可用作第一步中操作条件有某些改变的本发明方法的起始原料。
起始原料可以具有2,000至大于50,000D的分子量。
当使用多糖K5时，其结构首先通过N-脱乙酰化改性，这种改性可通过用肼和硫酸肼混合物处理来进行，或者在碱性环境中通过用氢氧化钠或氢氧化钾处理进行。
然后通过用三乙胺-三氧化硫或用三甲胺-三氧化硫处理，进行N-硫酸盐化。利用这些操作，可以得到各种，例如25％至100％的N-硫酸盐化产物。
N-脱乙酰化和N-硫酸盐化的反应按照已知技术进行，例如按照WO92/17507中所述方法进行。
当使用肝素作为起始原料时，先进行O-脱硫酸盐化，然后进行N-硫酸盐化，以便再硫酸盐化O-脱硫酸盐化作用期间脱去硫酸根的氨基位置。
当硫酸乙酰肝素被用作起始原料时，不仅进行N-脱乙酰化和O-脱硫酸盐化，而且还进行形成N-再硫酸盐化。
按上所述由多糖K5或硫酸乙酰肝素得到的N-硫酸盐化产物进行差向异构处理，以转化糖醛酸成艾杜糖醛酸，另一方面，为了由艾杜糖醛酸得到糖醛酸，则可用酶处理由肝素得到的产物。
差向异构作用是在D-糖醛酸基-L-艾杜糖醛酸基-C5-差向异构酶(以下用C5差向异构酶简单表示)进行，这种酶是从猫肝脏中提取出并按A.Malmstron在J.B.C.255，3878-3883(1980)中所述方法纯化得到。
本申请人惊奇地发现，用适当添加剂改性经典反应介质，能获得非常高程度的差向异构作用。
本发明的反应介质为由HEPES，氯化钾，EDTA和TRITON X-100构成的pH为7.4的缓冲溶液，并加有一种或多种选自乙二醇，甘油，聚乙烯吡咯烷酮，特别是具有15,000至90,000分子量的聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇和磷脂酰胆碱的添加剂，其加入量为适于增加缓冲溶液粘度至1.1至3mm2/s(1.1至3厘沲)的量。
具体讲，所述反应介质由下述pH为7.4的缓冲溶液制备：HEPES0.04M，KCl 0.4M和EDTA 0.06M，并向25ml此缓冲溶液中加入100至1000μlTRITON  X-100，0.5ml至60ml添加剂，并加蒸馏水至100ml。
将进行差向异构作用的多糖加到所述反应介质中，其加入量为每100ml反应介质5至1000mg，得到溶液A。
将C5差向异构酶独立加到与上所述相同的反应介质中，其量为每100ml反应介质21至2000μg，得到溶液B。
以能得到每100ml进行差向异构作用的混合物含1.5至15.000μgC5差向异构酶量的比例，将溶液B加到溶液A内。搅拌均化混合物，并在恒温室中于30至40℃温度下加热90分钟至15小时。
在100℃加热混合物5分钟，停止反应。
产物通过DEAE-Sephacel柱纯化，采用0.05M(NH4)HCO3作为缓冲液，并用2M(NH4)HCO3缓冲液洗脱产物。
收集各馏份并通过Sephadex G-15柱脱盐。冻干含产物部分的馏份，并通过1H-NMR分析产物。
依据1H-NMR谱，计算D-糖醛酸和L-艾杜糖醛酸的含量。所得产物可再溶于溶液A中并用溶液B再次处理，进一步差向异构化处理后，L-艾杜糖醛酸的含量增加。
为评估抗凝和抗血栓形成活性，使用吡啶-三氧化硫作为硫酸盐化剂，按照如Ogamo等人在第XIV届国际碳水化合物讨论会文摘(1988年8月14-19日，Stockholm)中所述方法，将差向异构化产物O-硫酸盐化。如下文所报道的用本发明方法得到的，进行了O-硫酸盐化的实施例1，3，4，5，6，7和9的产物，显示出优越的抗凝和抗血栓形成活性，而按照已知技术制得的实施例2和8的产物则显示出非常低的活性。
所得结果表明，本发明产物具有适于临床使用特性的抗凝和抗血栓形成作用，因此，它们可用于制备混合有辅剂和赋形剂物质的有关药物组合物。
为说明本发明方法，报道了下述实施例。
实施例1
制备含0.04M HEPES，0.06M EDTA，0.4M KCl的缓冲溶液(pH7.4)，取4.5ml此溶液，向其中加入27μlTRITON X-100，9ml10％聚乙烯吡咯烷酮K15水溶液，1.62ml乙二醇，并加水至总体积18ml。
所得溶液的粘度为1.41mm2/s(1.41厘沲)。在此溶液中溶入1mg100％N-脱乙酰、N-硫酸盐化K5，得到溶液A。
向0.8mlpH为7.4且含有8.9μgC5差向异构酶的相同起始缓冲溶液中加入1.6ml10％聚乙烯吡咯烷酮K15水溶液、288μl乙二醇并加水至总体积3.2ml，得到溶液B。
将溶液A与1.6ml溶液B混合，混合物在37℃的温室中保持4小时。4小时后，加入1.6ml溶液B，并将反应在37℃保持过夜。通过在100℃加热5分钟使反应停止。产物通过DEAE-Sephacel柱(2×1.5cm)纯化，采用0.05M(NH4)HCO3作为缓冲液，并用2M(NH4)HCO3缓冲液洗脱产物。
将含产物馏分通过Sephadex G-15柱(0.3×5cm)脱盐并冻干。产物通过1H-NMR分析，其光谱见图1。
L-艾杜糖醛酸占糖醛酸总量的百分比为55。
实施例2(对比)
重复实施例1，区别在于不加聚乙烯吡咯烷酮和乙二醇。
所用缓冲液的粘度约等于水的粘度，即大约为0。
所得产物的1H-NMR谱见图2中报道。结果，相对于艾杜糖醛酸与糖醛酸的总和，L-艾杜糖醛酸的含量等于18％。
实施例3
重复实施例1，区别在于使用N-脱乙酰和50％N-硫酸盐化多糖K5作为起始原料。
通过1H-NMR分析所得产物，其相关光谱见图3中报道。结果，相对于局限于N-硫酸盐化葡糖胺的糖醛酸总和，L-艾杜糖醛酸含量等于51％。
实施例4
将0.06M EDTA，0.4M KCl(pH7.4)，30μlTRITON X-100，10.6ml10％聚乙烯吡咯烷酮K15水溶液，0.85ml乙二醇和4.42ml水加到5.3ml含0.04M HEPES的缓冲溶液中。
所得溶液的粘度为1.2mm2/s(1.2厘沲)。在9ml此溶液中溶入2mg100％N-脱乙酰、N-硫酸盐化K5，得到溶液A。
在8ml相同溶液中溶入1.7μgC5差向异构酶，得到溶液B。
混合溶液A和B，混合物在37℃的温室中保持4小时。通过在100℃加热5分钟使反应停止。
产物如实施例1所述纯化。
冷冻干燥后，将纯化产物溶于1ml溶液A中并与含8.9μgC5差向异构酶的3.2ml溶液B混合。
混合物于37℃保持过夜，在100℃加热5分钟使酶失活。按实施例1所述纯化产物并通过1H-NMR分析，光谱如图4所示。
L-艾杜糖醛酸占糖醛酸总量的百分比为53。
实施例5
制备含0.04M HEPES，0.06M EDTA，0.4M KCl，pH为7.4的缓冲溶液，取2ml此溶液，向其中加入22.8μlTRITON X-100，1mg100％N-脱乙酰，N-硫酸盐化K5，4ml20％含40％乙二醇的聚乙烯吡咯烷酮K15溶液，并加水至总体积8ml。向6ml此溶液内加入6ml含下述组成的溶液：0.01M HEPES，0.015M EDTA，0.01MKCl，0.015％TRITON X-100和134.4μgC5差向异构酶。
所得溶液的粘度为1.36mm2/s(1.36厘沲)。
混合物在37℃保持1小时。通过在100℃沸腾5分钟使反应停止。
产物按实施例1所示纯化。
冷冻干燥后，产物溶于含有下述组分的缓冲溶液内：6.25ml pH7.4的0.04M HEPES，0.06M EDTA，0.4M KCl溶液，2.5g聚乙烯吡咯烷酮K15，2.5ml乙二醇，71.2μlTRITON X-100，加水至总体积25ml。
将1.9μgC5差向异构酶溶于12ml含0.015％TRITON X-100的0.01M HEPES，0.015M EDTA，0.1M KCl溶液(pH7.4)内，并将它们加到12ml上面所得混合物中。
混合物的粘度为1.4mm2/s(1.4厘沲)。
反应在37℃保持过夜。在反应最后，于100℃加热溶液5分钟使酶失活。产物如实施例1所述纯化，并测定1H-NMR谱(图5)。
L-艾杜糖醛酸占糖醛酸总量的百分比为52。
实施例6
重复实施例5，只是在第一步中，将反应于37℃保持4小时。
在与实施例1相同的条件下纯化和冷冻干燥后，将产物溶于1ml水中，并加到含有下述组成的缓冲溶液内：50ml(pH7.4)的0.04M HEPES，0.06MEDTA，0.4M KCl溶液，283.5μlTRITON  X-100，100ml10％聚乙烯吡咯烷酮K15，20ml乙二醇，2ml90％甘油，1.9μgC5差向异构酶，并加水至总体积200ml。混合物的粘度为1.41mm2/s(1.41厘沲)。
反应在37℃保持4小时，于100℃加热5分钟失活酶。
如实施例1所述纯化产物并测定1H-NMR谱(图6)。
L-艾杜糖醛酸占糖醛酸总量的百分比为55。
实施例7
将1.5mg100％N-脱乙酰，N-硫酸盐化K5溶于含有下述组分的缓冲溶液内：7mlpH7.4的0.04M HEPES，0.06M EDTA，0.4MKCl溶液，210μlTRITON X-100，1.4g聚乙烯吡咯烷酮K15，2.8ml乙二醇，1.5mgC5差向异构酶和至总体积28ml量的水。
溶液的粘度为1.36mm2/s(1.36厘沲)。
反应在37℃保持4小时，于100℃加热5分钟失活酶。
如实施例1所述纯化产物并冷冻干燥。
然后将产物溶于24ml含1.3mgC5差向异构酶的相同溶液内，将反应在37℃保持4小时，并在100℃加热5分钟使酶失活。
如实施例1所述纯化产物并冷冻干燥。
然后将产物溶于8.4ml含1mgC5差向异构酶的相同溶液内，将反应在37℃保持4小时。
如实施例1所述纯化产物并测定1H-NMR谱(图7)。
L-艾杜糖醛酸占糖醛酸总量的百分比为80。
实施例8(对比)
将1mg100％N-脱乙酰，N-硫酸盐化K5溶于含有下述组分的缓冲溶液内：3mlpH7.4的0.04M HEPES，0.06M EDTA，0.4MKCl液，18μlTRITON X-100，1.2ml丙酮，1.9μgC5差向异构酶和至总体积12ml量的水。
溶液的粘度为0.09mm2/s(0.09厘沲)。
反应在37℃保持4小时。
如实施例1所述纯化产物并测定1H-NMR谱(图8)。
L-艾杜糖醛酸占糖醛酸总量的百分比为0。
实施例9
将1mg100％N-脱乙酰，N-硫酸盐化K5溶于含有下述组分的缓冲溶液内：2mlpH7.4的0.04M HEPES，0.06M EDTA，0.4MKCl液，12μlTRITON X-100，1.336ml2.4％聚乙烯吡咯烷酮K90，304μgC5差向异构酶和至总体积8ml量的水。
溶液的粘度为1.29mm2/s(1.29厘沲)。
反应在37℃保持4小时，于100℃加热5分钟失活酶，溶液通过0.22μm装置过滤。
取8ml含304μgC5差向异构酶的相同混合物，加到过滤后溶液内，并将反应在37℃保持4小时，于100℃加热5分钟使酶失活并用0.22μm装置过滤溶液。
取8ml含304μgC5差向异构酶的相同混合物，加到此溶液内，并将反应在37℃保持4小时，于100℃加热5分钟使酶失活，溶液通过0.22μm装置过滤。
如实施例1所述纯化产物并测定1H-NMR谱(图9)。
L-艾杜糖醛酸占糖醛酸总量的百分比为59。

Claims (8)

1.以大肠杆菌得到的多糖K5或由肝素或硫酸乙酰肝素为原料，制备相对于糖醛酸总含量而言L-艾杜糖醛酸含量大于50％的多糖的方法，该方法包括：
a)N-脱乙酰化所述多糖K5或硫酸乙酰肝素，或者O-脱硫酸盐化肝素或硫酸乙酰肝素；
b)N-硫酸盐化a)步所得产物；
c)在C5差向异构酶存在下进行一次或多次差向异构处理；
d)将至少某些游离羟基进行硫酸盐化，其特征是差向异构步骤是在由HEPES、氯化钾和EDTA构成的pH为7.4的经典缓冲溶液组成的、加有适于增加所述缓冲溶液的粘度值至1.1至3mm2/s量的TRITON X-100和一种或多种添加剂的反应介质中进行，所述添加剂选自乙二醇，甘油，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇和磷脂酰胆碱。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述添加剂为分子量为15,000至90,000的聚乙烯吡咯烷酮。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是，相对于每25ml所述缓冲溶液，所述的一种或多种添加剂以0.5-60ml的量加入到所述缓冲溶液内。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是，相对于每100ml反应介质，所述原料化合物以5至1000mg的量溶于所述反应介质中。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是，相对于每100ml反应介质，C5差向异构酶以21至2000μg的量溶于所述反应介质中。
6.如权利要求1所述的方法，其特征是，每100ml进行差向异构作用的混合物含有1.5至15,000μgC5差向异构酶。
7.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述差向异构反应是在恒温室中于30至40℃的温度下进行。
8.如权利要求1所述的方法，其特征是，通过步骤b)的N-硫酸盐化得到了25％至100％N-硫酸盐化的产物。
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