CN1144561A - 用于生物反应的高度特异性的表面，制备它们的方法及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明特别涉及用于生物反应的高度特异性的表面，其特征在于它包括一个支持物，在其表面至少具有基本上紧密的有机化合物层，该层外表具有在一定反应条件下对一类生物活性的分子具有吸附的乙烯双键组成的裸露基团，该层的其它部分对所述的分子在所述反应条件下基本上难以接近。

Description

用于生物反应的高度特异性的表面，制备它们的方法及其使用方法

本发明尤其涉及可用于生物学的具有很高特异性的表面以及它们的应用和制备方法。

一些生物反应的很高特异性和很高选择性，尤其抗原/抗体反应、DNA或RNA杂交反应、蛋白质间或抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素/生物素类型的反应以及配体和其受体的反应已被认识很长时间。

现已知道如何利用这些特异性的优势，尤其用于检测一样品中反应对成分之一的存在与否或作为选择从较复杂的介质中分离一个反应对成分。

然而，当需要在很复杂的介质中检测一极低浓度分子存在时，目前已知的方法有时产生很无法预料的结果，尤其在分离和/或检测阶段产生的背景噪声问题。

因而，将在下文所称的“分子捕鱼”(molecularfishing)，也就是说当浓度很低时能够检测出每个要寻找分子的可能性，到目前为止还是不可能的。

例如，DNA样品的分析需要对应于与所需序列互补的所谓“杂交”探针的使用。在这些条件下，带来的问题是从介质中分离杂交物并且用良好的信/噪(S/N)比检测阳性反应可能减少的数目。

因此，在大多数情况下，现使用试图扩增所需序列(Sought seq-uence)的中间阶段，如使用PCR方法或导致相同结果的扩增方法，在这些条件下，增加样品中待测定的序列浓度，且其检测显然更容易。

然而，扩增阶段对污染物敏感并会导致其特异性的错误。

因此，最好尽可能地不用扩增阶段就能够检测核酸序列的存在。

为了检测特异性的杂交反应，建议在具一定特异性的固体表面上使用锚定杂交产物的中间阶段。例如，可使用特定的预处理表面，它使吸附特定的被修饰或未被修饰的蛋白质或DNA成为可能。

在其表面具有如COOH，NH₂或OH基团的小珠或小井形式存在的这类表面在商业上是可得到的(如Covalink，Costar，Estapor，Bangs，Dynal)。

为了获得这样的基团，也建议使用具乙烯基的中间阶段，乙烯基然后被氧化以产生COOH或OH基团(USA 4,539,061和EP435785)。

然后，可用如胺基的反应基团活化DNA并且用这些表面完成反应。然而，这些方法需要将要被吸附的DNA特异性活化。

允许不用前面DNA处理的锚定技术也被描述。该方法在于分子5＇末端的自由磷酸基与仲胺(NH Coralink表面)起反应。

为了使其与涂有能够与P₀起特异反应的基团或蛋白质P₁的表面起反应，也可将DNA吸附到基团或蛋白质P₀上。P₀/P₁对可以是下面类型的一对：如生物素/抗生蛋白链菌素或针对异羟基毛地黄毒的异羟基毛地黄毒/抗体(抗-DIG)。

然而在大多数情况下，这样的表面没有足够的特异性(V.Lundet al.，Nucl.Acids Res.，16，1861(1988))。这样，不需要的、甚至微弱的非特异的吸附型相互作用的存在导致能够与固体形成大量弱相互作用点的长分子的有效吸附。在要检测少量分子的情况下，这些表面导致潜在应用缺乏敏感性和/或带有高水平的背景噪声。此外，这些表面中的一些具有在检测阶段中可能是破坏性的不需要的高水平荧光。

至于检测本身，尤其对于DNA的检测，法国专利78 10975描述了探针与允许用生色底物手段显示的与酶偶联的方法。此外，可通过色度测定来定量反应。

然而，这样的技术不直接适应于定量检测；因而，在这里，大多数情况下为了所需的核酸数量，也应通过扩增阶段，如通过PCR方法来完成。

为了避免放射性标记物的使用，这里发展了一种所谓用“冷探针”的检测方法，就灵敏性而言，放射性标记物产生更接近的结果，但显然带来处理上的问题，如果需要高灵敏性的话，存在放射性产物及长的显示时间的问题。

对于一些具体的应用，尤其是来自活体图像(ex vivo imaging)的方法，建议用偶联杂交产物与(尤其是PMMA)表面适于被化学处理的微珠来观察反应的直接方法。该方法基于在扫描电镜下对这些典型直径为60nm微珠存在的直接鉴定、并且此外基于上述已知的但对在固体上锚定不足够特异的技术。

上述技术显然不只限于核酸的检测。基于同样的精神，建议检测抗体。它们将在这里不被描述，并且一般来说它们是使抗体的存在与抗原分子在固体上的相关锚定的偶联成为可能的ELISA型测试。又一次，存在着特异性和不必要的反应的问题。那么，检测阶段可基于与具有自身灵敏性问题的生色反应偶联。

总之，前面的技术方法或其联合具有许多不利因素，尤其：—  或者是由于放射性产物的使用而有潜在危险，—  或者是需要太长的显示时间，—  或者是在扩增阶段的水平上为具体的问题破坏，—  或者是需要不足够特异的固体表面—  或者是太微弱的灵敏性，—  或者除了吸附于固体阶段外，最后还需显然不太方便的电子显微镜的使用。

最后，在大多数情况下，已知方法不能够在给定分子上识别所需单位的具体位点。现在，当需要完成作图，尤其是在基因组范围内作图，这种识别是重要的，首先就需要识别相对于给定DNA或RNA分子末端的大致空间位置。

建议克服前面方法不利因素的本发明是基于高度特异性表面的使用，在使用表面的过程中，导致极度有限的背景噪音，尤其是由于它们排除掉不需要吸附的事实。

更为特别的是，本发明涉及用于生物反应的高度特异性的表面，其特征在于其包含在其表面上至少有一基本上紧密的有机化合物层的支持物，该层外面具有在一定反应条件下(尤其是PH或离子含量)对一种生物活性分子具有吸附的乙烯双键，尤其是乙烯基，该层的其它成分在所述反应条件下对所述的分子基本上是不可接近的。

关于“亲和性”，这里应该明白是指化学反应性和任何类型的吸附，这是在所述生物分子吸附的条件下。

关于“支持物”，意思是指固体支持物和由诸如尤其具有上述紧密层的液体或气体颗粒的非固体成分组成的支持物。

表面“基本上紧密”，就是说其限制了具生物活性的分子进入到内层和/或支持物，应明白表面的涂层缺陷是可以容忍的。

这些对生物反应高度特异性的表面包含其表面具有能够进入溶液的双键(尤其乙烯基(-CH＝CH₂，下文C＝C表面))的支持物。在特定的介质PH或离子浓度条件下，它们能够直接锚定生物类(DNA、RNA、PNA、蛋白质、脂类、多糖)分子。尤其，这些表面不需要表面或待锚定的生物分子的特异性化学修饰，还没有提及具乙烯基团表面如此使用的资料。

关于“锚定”，这里应该明白是指通过由化学反应产生的共价键，或者作为选择由诸如任何类型吸附的理化相互作用产生的非共价键进行的吸附，这些是在对所述生物分子吸附的介质PH或离子强度条件下。

根据本发明，表面可通过多种方法获得。可以提及如：(A)一任选分枝的含碳多聚物层，至少1nm厚，具有：

·含乙烯双键的基团，

·由碳氢或碳氟基团组成的保留层；(B)通过在一固体或多分子层上沉积或锚定而获得的表面，后者可通过用Langmuir-Blodgett胶型非共价键吸附的连续层形成或通过分子自身装配而获得，这允许用共价键吸附的一层形成。

在第一种情况下，表面可通过至少一个单体的多聚化以在多聚体表面产生具有乙烯双键的所述基团而获得，或者作为选择，通过多聚体表面的部分解聚，以产生所述基团，或者作为选择通过多聚体的沉积产生。

在这个方法中，形成的多聚体具有类似多聚烃衍生物，尤其是合成橡胶型(如聚丁二烯，聚异戊二烯)表面的乙烯双键。

在第二种情况下，根据本发明，用于生物反应的高度特异性表面含有：—  在支持物上一个基本上具有延伸结构的有机化合物单分子紧密层，至少具有：

·对支持物具有亲和力的附着基团和

·含有在附着条件下对所述支持物和所述吸附基团具有很少或不具亲和力，但对一类生物分子具有亲和力的乙烯双键的裸露基团。

为了获得基本上紧密的层，除裸露基团外，各种有机化合物最好能相互起反应以产生交联键；这样，“基本上”紧密的单分子层通过支持物不能进行或几乎不能进行不需要的反应的特征而获得。

最好，有机化合物在一端具吸附基团，另一端具裸露基团。当然，用考虑各种如其吸附基团位于分子的中央，后者的每个末端具一个裸露基团的实施方案。

可分析表面，根据：a)支持物，b)在支持物上具裸露基团和吸附基团的分子，c)确保及附的支持物和所述分子之间的相互作用。

吸附可首先是非共价型，尤其是亲水/亲水和疏水/疏水型，如在Langmuir-Blodgett膜中(K.B.Blodgett，J.Am.Chem.Soc.57，1007(1935)和US5,102,798)。

在这种情况下，吸附基团将或者是亲水的，或者是疏水的，尤其诸如CH₃、CF₃，CHF₃、CH₂F的烷基或卤代烷基。

吸附也可以是共价型的，在这种情况下，吸附基团将与支持物起化学反应。

一些类似结构的表面在电子领域已被提及，尤其当吸附是共价的，L.Netzer and J.Sagiv，J.Am.chem.Soc.105，674(1983)and USA-4539061。

本领域的技术人员有较宽的基团范围可得到。作为非限定的例子，可提及金属烷化物型基团，如硅烷，氯硅烷、羟乙硅烷、甲氧硅烷。

吸附基团显然选作使用的支持物功能。根据本发明，支持物至少在表面可由多聚体、金属、金属氧化物、半导体元素或诸如氧化硅或其结合物的半导体元素氧化物组成。尤其可提及玻璃及表面氧化的硅。

在吸附基团中，应更特别提及金属烷化型基团，如硅烷、氯硅烷、氯硅烷、硅烷醇、甲氧硅烷、羟乙硅烷、硅氮烷、磷酸盐、羟基、酰肼、酰肼定、胺、酰胺、重氮基、吡啶、硫酸盐、磺酸、羧基、硼酸、卤素、卤酸、醛。

更具体地说，作为吸附基团，将优先选用能够与邻近等价基团起交联反应以产生交联键的基团；例如，这将是硅烷型衍生物，尤其是二氯硅烷、三氯硅烷、二甲硅烷、三甲硅烷、二羟乙基硅烷和三羟乙基硅烷。

借助于也许存在于吸附位点和裸露基团间链内的反应基团将其聚合，也可在单层深度内的任意点完成这些交联键。因此，已知联乙炔基允许单层的单维或双维的聚合。

吸附基团的选择将显然依赖于支持物的性质，硅烷型基团十分适宜在玻璃和硅上的共价结合。

最好，连系裸露基团与吸附基团的链是至少包含1个碳原子的链，最好多于6个并且一般来说从3～30个碳原子。当实际上层内的侧面偶联形成时，无论是通过离子、配位还是共价的偶联，便获得通过自我装配的高度有序面，尽管与在紧密单层获得的分子数目相比，起始的表面仅具有有限数目的活性锚定位点。

已知的用硅烷衍生物，例如：Si-OH＋Cl₃-Si-R-CH＝CH₂产生Si-O-Si-R-CH＝CH₂，(R代表如(CH₂)₄)对表面活化的技术在玻璃或硅的情况下可被优先使用。文献中已知使用超纯溶剂的这种反应。反应导致了其C＝C末端位于暴露在外界表面的分子层。

在高度特异性表面生产的范围内，本发明也涉及将带有双键的分子移植于使避免溶剂的使用成为可能的气相使用的这类反应的内容。

在使用金的情况下，后者任选地以底物上的薄层形式存在，已知的表面活化技术使用硫醇衍生物，例如：Au＋HS-R-CH＝CH₂产生Au-S-R-CH₂CH₂，R代表如(CH₂)₄。在液体介质中的这种反应被描述并且如以前的三氯硅烷一硅反应一样，导致其C＝C末端位于裸露于外界的表面的分子层。

当然，术语“支持物”也包括诸如玻片的单一表面，但也可是粒子，无论是硅粉还是多聚物小珠，并且也可是像在各种分析技术中所知的此外还可被制成磁性、荧光或有色的(如棒形、纤维状或有结构的支持物的)任何形式。

当检测是用荧光完成时，要选择的支持物最好不具有荧光或几乎不具有荧光。

通过存在来自裸露基团或吸附分子的特异性反应位点的优点，根据上述模式(A)或(B)获得的表面具有高度的特异性。

此外，根据模式(A)或(B)获得的表面具有以下的意想不到的和显著的特征：

(i)通过无需分子的特异性活化的末端伴随很低水平的非特异性反应的特异性和高度PH依赖性的DNA锚定。

(ii)没有特殊的化学修饰，将它们锚定于蛋白质或其它生物类分子上的可能性；

(iii)制备对抗原(如异羟基毛地黄毒)或配体(如生物素)特异性表面的可能性；

(iv)很低的内部荧光水平，当需要时，低于待测单分子荧光信号的荧光背景噪声(典型面积100×100μm)；

(v)用与分子数目无关的S/N比检测分离分子的可能性，用下述的并且基于鉴定对表面有微弱非特异性相互作用的肉眼可见的标记物的存在的高S/N比，通过各种技术优势是可能的。

这样获得的表面最好涂有生物活性分子，(它们)选自：—  蛋白质—  核酸—  脂类—  多糖及其衍生物。

在蛋白质中，应提及抗原和抗体，配体，受体，但也可是抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素型以及这些化合物的衍生物的产物。

在RNAs和DNAs中，应提及α、β衍生物及硫醇衍生物和诸如PNAs的混合化合物。

生物分子的吸附可以是共价的或非共价的，例如通过吸附、氢键、疏水或离子相互作用，其中如为了增加它们的粘附，优先用已知方法(“Chemistry of Protein Coijugation and Cross-Linking”，S.C.Wong，CRC Press(1991))完成嫁接的分子与吸附分子之间的交联是可能的。

有了一个含有-CH＝CH₂基团，将被在下文中称为“C＝C表面”或“带有乙烯双键的表面”的裸露基团，直接锚定，尤其是DNA或蛋白质是可能的。在本发明的框架内，已证明这些表面具有高度PH依赖性的反应性。该特征使锚定核酸或蛋白质，尤其通过其末端，用给定的PH范围并常可以PH控制的反应速度成为可能。

这样，对于PH5-5的DNA，锚定反应在一小时(如果其不受扩散限制)完成并且通过末端发生。另一方面，PH为8时，吸附很低(反应速率小5～6个大小的数量级)。与需要DNA(生物素、DIG、NHS及类似物)活化或在-NH₂和-COOH或-POOH之间形成肽或磷酰胺(phosphorimide)键的特异性试剂(碳化二亚胺、二甲庚二酸盐(dimethyl pimelidate))的其它表面相比，该PH依赖性的末端特异性吸附效果是一种改进。

根据本发明的表面可以直接锚定蛋白质(蛋白A、抗-DIG、抗体、抗生蛋白链菌素及类似物)。已观察到(i)可保留分子的活性及(ii)制备表面(起初C＝C)的反应性被完全掩盖以利于一类分子的单一反应性。因此，可以用相对较高的起始反应性开始过渡到具有高度特异反应性(如蛋白质上特异位点)的表面。

通过在表面(如抗-DIG锚定特异性抗体，产生其反应性限于抗原(如DIG基团)的表面。这意味着起初的化学基团均被锚定的抗体所掩盖。

在反应(化学或生化)表面锚定其它生物活性分子，尤其病毒或其它成分：尤其膜、膜受体、多糖、PNA，也是可能的。

在制备的表面上吸附生物类反应产物(如PCR)也是可能的。

本发明也涉及用根据本发明方法及所有使用这种类型表面的方法获得的表面，无论它们是允许对生物分子的检测和/或定量的方法，还是一些生物分子的分离，尤其是用抗原/抗体和/或DNA，DNA/RNA偶联技术对样品的分离方法。

为了根据(A)和(B)产生表面层，本发明也涉及制备对上述生物反应高度特异性表面的方法，及尤其该方法特征在于：—  基本上具有延伸结构的有机化合物单分子层和紧密层，至少具有：

·对支持物具有亲和力的吸附基团，及

·含有在吸附条件下对所述支持物及吸附基团不具或很少具有亲和力，但对一种生物分子具有亲和力的乙烯双键的裸露基团被吸附于支持物上。

本发明也涉及处理的表面通过特异性试剂手段和通过用与检测分子数目无关的S/N比检测方法在对分离分子检测中的应用。

因此，总的来说，本发明涉及在样品中具有生物活性分子的检测和/或分析方法，其特征在于使用了其上吸附有能够识别样品分子的具有生物活性分子的上述表面，并且在于检测或分析是用检测吸附分子存在的试剂、荧光或其它物质来完成。

在试剂中，有荧光和非荧光试剂。

荧光试剂含有荧光分子，优选的是直径大于0.1μm并且与预处理表面起直接或间接特异性反应的长分子。例如，但并不意味局限于此，通过荧光探针(溴化乙锭、YOYO、荧光核苷酸及类似物)手段染色的能够直接锚定于C＝C表面，或通过在具有互补蛋白质(抗-DIG，抗生蛋白链菌素及类似物)表面上分子(DIG、生物素及类似物)修饰的双链DNA分子。

非荧光试剂尤其由通过特异性吸附的分子、直接或间接地锚定于预处理表面的小珠组成。由于表面的处理，这些小珠与表面仅显示出微弱的非特异性相互作用。例如，但并不意味局限于此，涂有抗生蛋白链菌素并根据本发明通过生物素化DNA锚定于表面、具有能与DNA分子另一端起反应的位点的Dynal小珠。

依据所需分子是通过荧光直接检测还是通过上述试剂手段间接检测，检测将被描述为“直接检测”或“信号检测”(“flag detection”)。

为了减少与抑制性慢反应时间有关的问题，使用小的反应体积可优先减少试剂向表面的扩散时间。例如，但并不意味局限，通过在由两个表面(其中一个被根据本发明处理以产生反应位点并且另一个失活或被处理以不具有反应位点)之间的空间决定的几微升体积内完成反应。

对小数目分子(典型1～1000)发生的特异性反应数目的检测可通过既不需电子显微镜也不需放射性和PCR的低噪声宏观物理测试来完成。

检测方法可由仅具有有限实验室经验的人员来完成。

依靠试剂，对于用于锚定试剂的小数量反应的低噪声宏观检测，可使用本发明的两种实施方法(模式A和模式B)。

在本发明的所谓×模式的实施中，产生的特异性反应数目的测试可通过荧光技术直接获得，对于本发明的一些具体实施例，这将使单独地鉴定起反应位点的数目成为可能。在这种情况下，高度特异性表面被优先选用以具有很低的荧光水平；尤其支持物应具有低荧光。

锚定荧光试剂以后，可能是小数目锚定反应的检测和计数可通过借助于宽数值孔经镜头的荧光显微镜来优先完成，这使直接用肉眼，或者经信号识别后，寻找锚定荧光分子的数目成为可能。

为了搜索比仅固定的范围更大的表面，可优先完成视野的扫描。

在本发明的所谓Y模式的实施中，检测了小珠型(例如，荧光的、磁性的、有色的)宏观试剂。

这样的技术衍生自Manning et al.在此意义上，反应是通过微珠的存在与否来显示。在一实施例中，新方法包括：

(i)具特异反应性小珠的使用，

(ii)在大小方面非毫米(nanoscopic)检测的但位于0.1μm～200μm范围，可通过宏观技术检测的小珠的使用和

(iii)由于根据本发明的产物的使用，小珠和表面间非特异性反应的缺乏。

然后，每个表示锚定反应特性的这些宏观小珠的数目通过宏观物理方法测定，方法中(但并不意味局限)，可提及小珠上的光扩散，光学显微镜及小珠的荧光。

一些生物反应的特异性也许是有限的。这样，在杂交领域内，当配对数目较少并因此结合质量较低时，杂交可能是不完善的(与其它位点反应)。本发明也涵盖对获得键质量测试阶段的可能使用。该测试使分离以微弱非特异性方式，尤其通过吸附、疏水力、不完善氢键、不完善杂交配对的产物成为可能。

因而，在如上述的检测或分析方法中，本发明也涉及其具生物活性分子与样品分子间的反应产物为了破坏检测前的错配而进行强制的方法。

除了破坏错配对的可能性，该方法还提供了使测量或观察变容易的定向偶联产物的可能性。

这样，经互补成分的吸附之后，在表面上应用，强制是可能的，该强制包括单独或联合使用：

—离心，

—应用于非荧光试剂(在这种情况下，采用包括可磁化的或磁性微珠)的磁场梯度，

—搅拌，

—液体流，

—凹液面移动，

—电泳，

—温度差异和/或温度梯度。

然后，维持其整体性或要被破坏的系统数目通过下述的低噪声检测技术来测定。

应该注意到使用根据本发明的表面，在其吸附以后通过空气/水凹液面的移动，尤其是经过DNA，至少在一点定向分子是可能的。这样，观察到空气/水凹液面通过溶液中及锚定于表面的DNA的移动导致了锚定分子一致的延伸。在这种情况下，它们似乎在开放的空气中以延伸的荧光杆形式存在。延伸的分子在开放的空气中是稳定的并且甚至可在数周后观察而没有显示明显的降解。

这些异常的意想不到的观察资料暗示对锚定于表面的DNA分子计数的可能性：一方面，表面没有高度荧光，信/噪(S/N)比良好，另一方面，寻求高度相关的对象(杆形)，增加S/N比很容易。就是说如果不考虑灰尘，没有与特殊空间相关的不均一性。应该注意在溶液中，以随机卷曲形式存在的分子要热运动，因而导致收集到的它们荧光信号的很大差异，一般来说，以小的场深并限制对它们的观察。本发明也涵盖序列比较并因此允许用很高的S/N比对分离分子观察的固定技术。

较显著的是该比例与锚定分子数目无关。由对分子检测而产生的S/N比相当于10,000。此外，该延伸技术使容易地区分不同长度的分子成为可能。

为了进一步提高S/N比，可优先进行以下阶段：—  分子是静止的，其荧光信号可被整合。—  显微镜观察显示一较小的视野(典型100μm×100μm，用×100油镜镜头，N.A.＝1.25)。对于1cm²样本，可进行扫描，或可设想使用低倍放大镜头(×10或×20)但具有高的数值孔径。—  杆总是平行的，为了进一步增加S/N比，可设想一光学空间滤过方法。—  可设想(使用)其它的珠形荧光方法(印^#103426)。—  在化学嫁接(C＝C)范围和免疫型键(DIG/抗-DIG)情况下，分子的线型化被观察到。—  一旦表面存在于开放的空气中，DNA分子是稳定的(它们甚至在数周后维持其整体性)和发荧光的。例如，如果该检测是通过荧光显微镜完成(但并不意味着局限于此)，为了延缓锚定分子的锚定时期和寻找/计数时期，该特性可被优先选用。本发明也涵盖这样的使用方法：—  可使用双(或多)荧光技术以改进S/N比或检测双或多官能度。—  为了将分子延伸到其它系统，尤其如油/水或水/表面活性剂/空气系统，可扩展这里使用的空气/水凹液面。

通过一个或更多个连续方向和电泳或流动，使用在溶液中一端被锚定的分子动力学定向是可能的，因此，通过对相应于给定方向(例如，但并不意味局限于此，通过使用经适当安排的允许被观察分子一些定向的优先信号获得的光学空间滤过器(filter)荧光信号暂时差异的分析，可用这样的技术导致对给定方向分子存在的同时检测。

然而，观察结果显示该技术在其最简单的形式(在单一方向伸展，没有同时检测)要比使用凹液面效果差得多。

本发明描述的表面和/或试剂和/或检测技术可用于许多应用中，其中(但并不意味局限于此)：—  用于可利于病原体诊断或遗传作图的DNA或RNA测序的一个或更多个成分的鉴定；—  对可优先用于遗传作图的DNA片段大小的测定；—  具有检测小数目(可能不到1000)免疫反应可能性的ELISA技术灵敏性的改进。

DNA/RNA序列的鉴定首先可通过在溶液体积内DNA/RNA分子与互补探针(例如，通过杂交或通过对所需片段特异的蛋白质手段)反应来完成。在这种情况下可以有两种方法。

下面的描述有些将参照附图，其中：—  图1图示了用荧光DNA分子通过与锚定分子杂交来检测病原体；—  图2图示了通过DNA延伸和使用标记DNA的遗传作图；—  图3图示了借助于“信号”分子(：用作反应标记的荧光DNA)对免疫反应的检测(ELISA)；—  图4为显示通过凹液面移动入噬菌体DNA延伸的荧光显微图谱，在左边可看到在溶液中被平行于凹液面的蒸发流延伸的DNA分子，右边可看到暴露于空气中的经垂直于凹液面延伸的DNA分子；—  图5(a)和5(b)为分别显示在涂有抗—DIG表面以异羟基毛地黄毒(DIG)标记的并被凹液面延伸的DNA和作为对照的抗DIG表面的未标记DNA的荧光显微图；可注意到表面的很高特异性及不存在非特异性锚定；—  图6为显示常规的商用表面(如NUNC)的光显微图谱，应注意导致表面不可能用于单分子荧光检测的很高的荧光不均一性。

在“诊断”模式中，探针(“锚定物”)拥有根据本发明(例如具有抗-DIG抗体或抗生蛋白链菌素作为锚定位点)的能够特异性锚定于表面的反应基团(DIG、生物素及诸如此类)。锚定反应的检测可通过用荧光分子(溴化乙锭、YOYO、荧光核苷酸)染色的DNA分子的荧光检测直接完成(图1)。锚定反应的检测也可通过“信号分子”(：根据本发明，能够吸附DNA/RNA分子(如通过杂交、蛋白质-DNA相互作用及类似方法)，但对探针锚定位点不具有亲和力的试剂)的检测间接完成。

在“作图”模式中，互补探针可根据本发明直接被偶联于荧光试剂。例如其可以是具有修饰碱基以发荧光的互补DNA单链或以荧光团A染色的且末端具有互补与所需序列的单链片段的较长双DNA链。对于不同的探针，可使用不同颜色的荧光团。也可优先染色具不同颜色荧光团的探针刚被杂交于其上的DNA分子。DNA-探针杂交物一端被锚定并按上述之一的方法被伸展。锚定点到杂交点的距离或杂交点之间的距离根据上述方法(图2)通过检测探针荧光来测定。

例如，但并不意味着局限于此，约3000碱基对并一端具有互补于所需基因单链片段的标记DNA用荧光团A(YOYO1)染色。该DNA被杂交然后联结于待作图的单链DNA，并且然后后者以第二荧光团B(POPO1)染色(经随机引物反应后以将其转换为双链DNA)。该分子然后一端被锚定(例如DIG/抗-DIG键)并通过凹液面行为被延伸。可通过双荧光显微镜(2色A和B)观察的分子末端与标记基因位置间的距离使用精确性为1000碱基对(0.3μm)数量级来建立所需基因位置成为可能。

DNA/RNA序列鉴定也可根据本发明通过所需序列和表面反应位点之间的反应来完成(例如互补寡核苷酸或对所需片段特异的蛋白质反应位点)。在这种情况下，锚定反应的检测可按上述直接或间接地(通过“信号分子”手段)完成。

应非常明白根据本发明的DNA/RNA序列的鉴定既可用于诊断目的(例如病毒或染色体抗原存在或缺失的检测)又可用于遗传作图的目的。该序列事先可经过用任何方法，尤其PCR进行扩增的阶段。

此外，如K.R.Auan et al(US 84 114)所提及的，遗传作图可通过测量DNA片段大小来完成。现在，根据本发明的表面和伸展上述分子的新技术(尤其并且优先地通过凹液面伸展)之间的偶联使测量伸展分子的长度成为可能，并且这是基于对很小的样本(几千个分子)。

例如，但并不意味局限于此，可用下面的方式完成该方法：

DNA样本被裂解(通过限制性酶手段)，荧光团染色并且然后锚定于具反应基团的表面(如C＝C表面)。分子然后通过凹液面延伸且其伸展片段的大小用分辨率及最大长度为1000bp(0.3μm)数量级的荧光光学显微镜加以测定。

根据本发明的表面可用于完成已知的允许对抗原或抗体检测和/或定量的方法，尤其是使用酶系统的ELISA方法或使用放射性标记的RIA型方法。这些技术将不作详细描述。

将根据本发明的表面用作ELISA方法中(具有根据本发明将一试剂(“信号”)锚定于ELISA中一试剂(图3)上的阶段)的免疫反应支持物也是可能的和优越的。检测可完全通过荧光测定自然完成。也可计数反应数目；这可根据本发明描述的检测方法优先完成，尤其是通过凹液面延伸，并且这是凭借本发明产物的低水平荧光和非特异性相互作用。该方法允许对小数目反应，尤其不到1000，以良好的S/N比加以测定。

因此，通过夹心ELISA方法(抗体-抗原-修饰抗体，例如生物素化的)的微小变动，根据本发明在表面上嫁接试剂，如可将荧光DNA锚定于抗生蛋白链菌素。

所有ELISA技术的变通方法的应用都更为灵敏。整体荧光测定技术已被用于测定ELISA反应的质量。然而，根据本发明的方法允许更好的测定，因为其对来自单分子的荧光信号敏感。

当然，可将这些表面用作至少吸附生物类反应的一个产物的表面，例如，但并不意味局限于此，扩增反应产物，无论PCR或相关的方法及最终，使用这种表面作为亲和色谱支持物，无论是制备型的还是用于检测的是可能的。

在这种情况下，例如将给定数量的寡核苷酸嫁接于将构成柱固定相的硅珠上是可能的。

层析阶段应允许柱相对于洗脱剂的特征性特异性，例如其中一些具有互补序列或很接近于嫁接的寡核苷酸序列的DNA混和物。

本发明最后涉及根据本发明的表面在诊断或分离试剂盒中的使用。

当阅读下面实施例时，本发明的其它特征和优势将会出现。材料和方法

λDNA和单克隆抗体(抗-DIG)获自BoehringerMannheim。三氯硅烷获自Roth-Sochiel。荧光核酸探针(YOYO1，YOYO3和POPO1)获自Molecular Probes。超净玻璃盖片获自Erie Scientific(ESCO)盖片。磁性颗粒获自Dynel。显微镜为NIKKON Diaphat倒置显微镜，配有用于表面荧光(epifluorescence)的氙灯及用于成像的Hamamatsu增强CCD相机。表面处理

玻璃盖片在有氧环境下以紫外光照射1小时来净化(通过形成臭氧)。然后立即将其置于预先用氩气流除水的干燥器内。约100～500μl体积的适当三氯硅烷(H₂C＝CH-(CH₂)_N-SiCl₃)导入干燥器内，约12小时(n＝6)或1小时(n＝1)后表面从中取出。至取出时，表面纯净且无水。

被这样活化的盖片可与蛋白质反应。300μl体积的蛋白质水溶液(20μg/ml)(蛋白质A、抗生蛋白链菌素及类似物)置于从(H₂C＝CH-)基团活化的盖片上。盖片在室温下孵育约2小时，然后以超净水冲洗三次。被这样处理的表面是干净且无水的。以蛋白A处理的表面通过在20μg/ml抗体溶液中孵育，可与抗体，如抗-DIG抗体起反应。天然DNA在双键表面上的锚定

不同浓度和处于不同缓冲液(分子总数＜10⁷)的一滴2μl荧光标记λDNA溶液(YOYO1，POPO1或YOYO3，但无具体的末端标记)置于预处理的盖片(H₂C＝CH)上并且盖以未处理的玻璃盖片(直径15mm)。制备的样品在水蒸汽饱和的环境中室温孵育1小时。在0.05M MES缓冲液中(PH＝5.5)，实质上已观察到DNA分子的总的锚定。相比之下，在0.01M Tris缓冲液(PH＝8)中，特别的是没有被锚定的分子(比率＞10⁶)。这种依赖使通过PH控制表面的活化/失活(相对于DNA而言)成为可能。通过凹液面行为对锚定的检测

通过将上述的制品转移到干燥的环境中。当蒸发时，溶液将垂直于凹液面伸展锚定于表面上的DNA分子。DNA分子的毛细力量(几十皮可牛顿)的确足以完全地伸展分子(大于熵的弹性力)，但太微弱而不能打破分子末端和处理表面间的键。荧光标记的DNA，伸展的分子(总长约22μm)可单独地且容易的观察。表面和DNA之间的锚定可限于末端，伸展可以是λ噬菌体，YAC DNA，或者是E.coli(总长度大于400μm)DNA。该延伸的暴露于空气中发荧光的DNA制品在数天内稳定并且可通过表面荧光(Nikkon Diaphot倒置显微镜，用×100镜头，O.N.：1.25)以非破坏性方式观察。通过电泳对锚定的检测

电泳槽通过处理盖片与未处理玻璃盖片之间的石蜡环(约100μm厚)而形成，两盖片间插入铂电极。通过简单地融化石蜡环，装置被严格地铸为一起。用经过留在石蜡环上的二个开口的毛细作用将DNA溶液导入电泳槽，然后石蜡中的两开口被封闭。按上述在室温中进行温育。当在两个铂电极间加低电压(几伏)时，通过荧光观察到自由DNA分子的移动(每秒几十微米)及可因此用表面荧光显微镜容易且单独鉴定的沿着锚定分子流方向的延伸。特异性锚定和检测

通过用特异性单克隆抗体，按上述处理表面，可很精确地控制它们的特异性。这样，测试抗-DIG处理的表面相对于以互补于COS末端之一的寡核苷酸杂交的并具有异羟基毛地黄苷毒基团(DIG)的λDNA及相对于未杂交DNA的特异性。在第一种情况，通过凹液面行为，观察到锚定分子实质上总的延伸。在第二种情况，在整个样品中仅观察到几个被锚定的分子(＜10)。因此，估计根据本发明方法的特异性大于10⁶。检测的灵敏性

为了测定通过凹液面延伸的测定方法的灵敏性，含总分子数为10⁵、10⁴及1000的位于0.05M MES(PH＝5.5)的λDNA液滴2.5μl置于双键表面。锚定按上述完成。盖片后用表面荧光显微镜观察以测定锚定分子的密度。后者的确对应于预先估计的：对于总数为10⁵DNA分子，每视野(100μm×100μm)约4-6个DNA分子。对于最低浓度，可观察到约10个由凹液面行为延伸的分子。该数字实际上受需要覆盖整个样本(约25,000)的大数目视野的限制，这将使人工搜索变得困难，但其可用较弱的但视野较大的镜头优先自动完成。总之，根据本发明方法的灵敏性允许对不到1000DNA分子的检测和单独计数。

Claims (52)

1.用于生物反应的高度特异性表面，其特征在于它含有支持物，在支持物表面至少具有一基本上紧密的有机化合物层，有机化合物外层具有含有在一定反应条件下对一类具有生物活性的分子有亲和力的乙烯双键的裸露基团，该层的其它成分在所述的反应条件下对所述的分子基本上是不可接近的。

2.根据权利要求1的表面，其特征在于支持物是固体支持物。

3.根据权利要求1或权利要求2的高度特异性表面，其特征在于裸露基团是乙烯基团。

4.根据权利要求1～3之一的表面，其特征在于为了产生所述的裸露基团，通过至少一个单体的聚合在具有乙烯双键的多聚物表面产生所述裸露基团，通过多聚体在支持物上的沉积或多聚体表面的部分解聚而获得。

5.根据权利要求4的表面，其将征在于多聚体是聚烯烃或多聚烃的衍生物。

6.根据权利要求1～5之一的高度特异性的表面，特征在于其包含—  在支持物上基本上具延伸结构的有机化合物单分子紧密层，至少具有：

·对支持物具有亲和力的附着基团和

·含有在吸附条件下对所述支持物和所述吸附基团具很少或不具亲和力，但对一类生物分子具有亲和力的乙烯双键的裸露基团。

7.根据权利要求6的表面，其特征在于吸附是非其价型的。

8.根据权利要求7的表面，其特征在于吸附由亲水或疏水相互作用完成。

9.根据权利要求8的表面，其特征在于生物分子在一定的介质PH或离子浓度条件下，通过吸附能够直接地锚定于所述表面。

10.根据权利要求6～9之一的表面，其特征在于为了获得疏水键，吸附基团选自烷基及卤代烷基。

11.根据权利要求10的表面，其特征在于吸附基团选自：-CH₃、CF₃、-CH₂F、CHF₂。

12.根据权利要求6的表面，其特征在于吸附为共价型的。

13.根据权利要求1～12之一的表面，其特征在于为了产生交联键，除裸露基团外，有机化合物能够相互反应。

14.根据权利要求6～13之一的表面，其特征在于有机化合物一端具吸附基团，另一端具裸露基团。

15.根据权利要求6～14之一的表面，其特征在于吸附基团选自金属烷化物型基团，如硅烷、氯硅烷、甲氧硅烷及羟乙硅烷、硅醇、硅氮烷、磷酸盐类、羟基、酰肼、肼、胺、酰胺、重氮基、吡啶、硫酸盐、磺酸(sulfonic)、羧酸、硼酸、卤素、卤素及醛类。

16.根据权利要求15的表面，其特征在于吸附基团选自硅烷，如单-、二-或三氯硅烷，单-、二-或三羟乙硅烷及单-、二-或三甲氧硅烷。

17.根据权利要求1～16之一的表面，其特征在于裸露基团直接连到吸附基团，或者通过含有至少1个碳原子并且优选3～30个碳原子的链。

18.根据权利要求1～17之一的表面，其特征在于支持物至少在其表面由多聚体、金属或金属氧化物、半导体元素、半导体元素氧化物、尤其是氧化硅或其结合物所组成。

19.根据权利要求1～18之一的表面，其特征在于支持物至少在表面由玻璃或硅所组成。

20.根据权利要求1～19之一的表面，其特征在于支持物以平板、小珠、纤维或颗粒形式存在。

21.根据权利要求20的表面，其特征在于所述颗粒是磁性、发荧光或有色的。

22.根据权利要求1～20之一的表面，其特征在于具有生物活性的分子选自：—  蛋白质，—  核酸，—  脂类，—  多糖及其衍生物。

23.根据权利要求1～22之一的表面，其特征在于具有生物活性的分子是具有生物活性的化学化合物。

24.根据权利要求1～23之一的表面，其特征在于具有生物活性的分子选自：—  蛋白质—  DNA—  RNA和其衍生物。

25.根据权利要求24的表面，其特征在于具有生物活性的分子是选自：—  抗体—  抗原—  DNA和RNA—  配体或其受体及其衍生物。

26.根据权利要求1～25之一的制备用于生物反应的高度特异性表面的方法，其特征在于：—  基本上单分子的和基本上紧密的具延伸结构的有机化合物层，至少具有：

·对支持物具有亲和性的吸附基团和

·在吸附条件下对所述支持物和吸附基团不具有或具有很小亲和力，但对一种具有生物活性的分子具有亲和力的裸露基团被吸附于固体支持物上。

27.覆盖有生物活性分子的表面，特征在于它含有用于根据权利要求1～26之一的所述的生物活性分子锚定于其上的生物反应的高度特异性表面。

28.根据权利要求27的表面，其特征在于生物活性的分子是选自：—  蛋白质，—  核酸，—  脂类，—  多糖及其衍生物。

29.根据权利要求28的表面，其特征在于吸附的DNA含有互补于样品中待分离的DNA序列的序列。

30.根据权利要求28的表面，其特征在于吸附的蛋白质能够特异性地识别和吸附样品中待分离的蛋白质。

31.根据权利要求28和29两者之一的表面，其特征在于所述的生物活性分子是选自生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或其衍生物。

32.用根据权利要求1～31之一的表面鉴定DNA或RNA存在的方法。

33.用根据权利要求1～31之一的表面鉴定蛋白质或抗体存在的方法。

34.检测和/或分析样品中具生物活性的分子的方法，其特征在于使用了根据权利要求27～31之一的其上吸附有能够识别样品分子的生物活性分子的表面，并且其特征在于检测或分析是用检测吸附分子存在的试剂、荧光或其它物质来完成。

35.根据权利要求34的方法，其特征在于表面具有诋荧光并且在于试剂是发荧光的。

36.根据权利要求35的方法，其特征在于试剂由小珠组成。

37.根据权利要求34～36之一的方法，特征在于检测由显微镜完成。

38.根据权利要求34～37之一的方法，其特征在于对生物活性分子与样品分子之间的反应产物进行强制以破坏检测前的错配。

39.检测样品中DNA序列或蛋白质的方法，其特征在于：—  使用根据权利要求1～31之一的高度特异性表面。—  在形成DNA/DNA、DNA/RNA或蛋白质/蛋白质杂交物条件下使样品与表面接触，—  杂交物被标记，为了定向分子并且完成对由此定向的分子的测量和观察，杂交物通过任何理化手段被延伸。

40.根据权利要求38和39两者之一的方法，其特征在于杂交或反应产物通过凹液面移动沿着伸展方向被延伸。

41.根据权利要求40的方法，其特征在于凹液面是空气/水凹液面。

42.根据权利要求38和39两者之一的方法，其特征在于延伸是通过作用于分子上的电场或作用于可磁化的或磁性颗粒上的磁场来完成。

43.根据权利要求38和39两者之一的方法，其特征在于延伸是用机械力完成的。

44.根据权利要求38～43之一的方法，其特征在于吸附的DNA和样品DNA被区别“着色”，并且在于延伸以后，测量互补序列相对于样品DNA末端的位置。

45.根据权利要求44的方法，试图用于基因作图。

46.根据权利要求44～45之一的方法，其特征在于它是ELISA或RIA方法。

47.根据权利要求44～45之一的方法，其特征在于样品是核酸扩增的产物。

48.在具有双键的表面吸附核酸或蛋白质的方法，其中锚定是通过DNA或蛋白质的吸附，尤其通过一个末端，用使DNA或蛋白质与表面在测定的PH范围内接触来完成。

49.根据权利要求48的在具有乙烯双键基团的表面吸附DNA的方法，其特征在于使DNA与表面在PH小于8的情况下接触。

50.根据权利要求49的吸附方法，其特征在于反应在PH5～6之间完成，然后在PH8时终止。

51.诊断试剂盒，其特征在于它至少包括一个根据权利要求1～33之一的高度特异性表面。

52.根据权利要求51的诊断试剂盒，其特征在于它还包含荧光试剂或含有小珠的试剂。

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